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▶ ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-13
(45)【発行日】2024-02-21
(54)【発明の名称】免疫刺激オリゴヌクレオチドを含む組合せ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/117 20100101AFI20240214BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20240214BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20240214BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240214BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240214BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240214BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240214BHJP
A61P 35/00 20060101ALN20240214BHJP
【ＦＩ】
C12N15/117 Z ZNA
A61K31/711
A61K39/39
A61K39/395 U
A61P37/02
A61P43/00 121
C07K16/28
A61P35/00
【請求項の数】
18
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022023832
(22)【出願日】2022-02-18
(62)【分割の表示】P 2020210230の分割
【原出願日】2016-09-09
(65)【公開番号】P2022060368
(43)【公開日】2022-04-14
【審査請求日】2022-02-18
(31)【優先権主張番号】92821
(32)【優先日】2015-09-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】LU
(73)【特許権者】
【識別番号】500029420
【氏名又は名称】ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(72)【発明者】
【氏名】シュロフ，マティアス
(72)【発明者】
【氏名】シュミット，マヌエル
(72)【発明者】
【氏名】カップ，カースチン
(72)【発明者】
【氏名】ズーロ，アルフレッド
【審査官】山▲崎▼ 真奈
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００４／０１９８６８０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】DURAISWAMY, J. et al.，Cancer Research，2013年12月01日，Vol.73, No.23，pp.6900-6912.
【文献】WONG, R.M. et al.，Immunology Letters，2009年09月12日，Vol.127, No.1，pp.60-67.
【文献】FOURCADE, J. et al.，Cancer Research，2014年02月15日，Vol.74, No.4，pp.1045-1055.
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ａ６１Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
非コード配列を含む直鎖状オリゴヌクレオチドであって、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１１からなり、前記直線状オリゴヌクレオチドがＤＮＡである、直鎖状オリゴヌクレオチド。
【請求項2】
配列番号７からなる、請求項１に記載の直鎖状オリゴヌクレオチド。
【請求項3】
配列番号８からなる、請求項１に記載の直鎖状オリゴヌクレオチド。
【請求項4】
配列番号９からなる、請求項１に記載の直鎖状オリゴヌクレオチド。
【請求項5】
配列番号１１からなる、請求項１に記載の直鎖状オリゴヌクレオチド。
【請求項6】
ａ．ＰＤ１またはＰＤ－Ｌ１に結合する抗体を含む第１の群であって、前記抗体が、免疫チェックポイント阻害剤として抗体を含む、第１の群、およびｂ．配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１１からなる非コード配列を含むオリゴヌクレオチドを含む第２の群であって、前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡである、第２の群
の構成成分を含む、免疫調節のための組合せ物。
【請求項7】
前記抗体が、ＰＤ１に結合する、請求項６に記載の組合せ物。
【請求項8】
前記抗体が、ＰＤ－Ｌ１に結合する、請求項６に記載の組合せ物。
【請求項9】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号７からなる、請求項６に記載の組合せ物。
【請求項10】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号８からなる、請求項６に記載の組合せ物。
【請求項11】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号９からなる、請求項６に記載の組合せ物。
【請求項12】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号１１からなる、請求項６に記載の組合せ物。
【請求項13】
前記の両群からの構成成分が、最大１５ｍｇ／ｋｇ体重で適用するための、固体、液体、または気体の形態である、請求項６から１２のいずれか一項に記載の組合せ物。
【請求項14】
前記組合せ物の構成成分が、同時に、交互に、または連続して投与される、請求項６から１３のいずれか一項に記載の組合せ物。
【請求項15】
前記ＰＤ１またはＰＤ－Ｌ１を阻害するための前記抗体の投与より先に、前記オリゴヌクレオチドが投与される、請求項１４に記載の組合せ物。
【請求項16】
前記組合せ物を含む医薬組成物の製造のための、請求項６から１３のいずれか一項に記載の組合せ物の使用。
【請求項17】
前記医薬組成物が前記組合せ物の前記構成成分を、投与時に同時に、交互に、または連続して放出する、請求項１６に記載の使用。
【請求項18】
治療的または予防的ワクチン接種のアジュバントとして使用するための、請求項６から１５のいずれか一項に記載の組合せ物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、疾患の治療のための組合せおよびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
「免疫療法」という用語は、免疫応答を刺激、誘導、増強、または抑制することによって、疾病を治療することを定義している。免疫療法の戦略は、がん、感染症、アレルギー、および喘息のような疾患と闘うことである。
【0003】
免疫療法に用いることができる様々な活性薬剤、いわゆる免疫調節剤は公知である。最も確立された免疫調節剤は、低分子または核酸に属し、その多くがＴｏｌｌ様受容体系と相互作用する。最も知られている免疫を調節する短いＤＮＡ配列は、非メチル化シトシングアニンモチーフ（ＣＧモチーフ）を含有し、これはＫｒｉｅｇ他によって記載されている（Ｎａｔｕｒｅ１９９５ ３７４：６５２２ ５４６～５４９）。原核生物またはウイルスと比較して真核生物のゲノムでは、非メチル化ＣＧモチーフの出現が、大幅に抑制されている。したがって、このようなモチーフを有するＤＮＡ分子は、自然の「危険信号」となり、原核生物またはウイルスの病原体との闘いにおいて免疫系を誘発させる。このことは、免疫療法で感染症を治療または予防するために、このような配列を使用することによって、治療的または予防的に利用できる。近年、特に重視されていることは、腫瘍と闘うために患者自身の免疫系を活性化することを目的としたがん治療において、このような免疫調節剤を使用することである。
【0004】
非メチル化ＣＧモチーフを有するＤＮＡ構築物は、樹状細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＮＫＴ細胞を含む先天性免疫系のエフェクター細胞を強く刺激することによって、顕著な生理学的作用を引き起こすことが可能である。非メチル化ＣＧモチーフは、先天性免疫のパターン認識受容体であるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）９によって検出される。正確な認識機構は未だ完全には理解されていないが、その基礎となる経路の解明に著しい進歩を遂げている（Ａ．Ｋｒｉｅｇ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．、５：４７１～４８４、２００６）。
【0005】
非メチル化ＣＧを有するＤＮＡ構築物と上記受容体との結合によって、応答細胞における複数のシグナルカスケードが活性化すると想定される。特徴的な表面分子のアップレギュレーションおよびサイトカインの分泌によって、Ｔｈ１パターンが優位な適応免疫が誘導される。このような構築物は、例えば、抗体、化学療法もしくは放射線治療、ワクチン、またはサイトカインと組み合わせて使用することができる。アレルギー疾患および喘息は、大半がＴｈ２媒介性である。Ｔｈ１／Ｔｈ２の比率を増加させることによって、該Ｔｈ２媒介性応答が低下し、それによってこれらの種類の疾患の治療または予防が可能である。
【0006】
ＴＬＲ９経路によって調節されない表面分子として、細胞の種類に応じて、例えば、ＣＤ４０、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはＣＤ１６９が挙げられる。増加したサイトカインの分泌も細胞の種類の違いによって特徴的である；サイトカインとして、例えば、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）－１α、ＭＩＰ－１β、インターロイキン（ＩＬ）－６、ＩＬ－８、インターフェロン（ＩＦＮ）－α、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α、ＩＦＮ－γ、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）－１、または１０ｋＤａのＩＦＮ－γ誘導タンパク質（ＩＰ－１０）が挙げられる。
【0007】
疾患を予防または治療するため、予防接種は非常に有効な手法であることが証明されている。強力で永続的な免疫応答を確保するため、樹状細胞のような抗原提示細胞を刺激することが可能なアジュバントが、通常、その抗原と共に投与され、この目的において、ＴＬＲ９アゴニストは強力な免疫賦活剤であることが示されている。
【0008】
前臨床試験および進行中の臨床試験によって、免疫調節剤および／またはアジュバントとしてのＴＬＲ９アゴニストの使用が支持されており、液性および細胞性応答の両方を増強することから、その抗腫瘍効果が証明されている。
【0009】
非メチル化ＣＧモチーフが免疫応答に影響を及ぼすまたは免疫応答を調節する根本的な機序に関するいかなる説明とも関係なく、このようなモチーフを使用することによって免疫系を調節するための多くの手法が開発された。ＷＯ１９９８／０１８８１０では、非メチル化ＣＧモチーフを有する免疫刺激配列は、それが一本鎖の一部である場合、さらにより効果的であることが開示されている。しかし、開鎖した一本鎖ＤＮＡ分子を投与することは、一本鎖核酸の分解が早いため、実用的ではない。したがって、非メチル化ＣＧモチーフを有する一本鎖または二本鎖ＤＮＡ構築物を保護するための別の方法が開発された。
【0010】
ＤＮＡヌクレアーゼによる分解に対する耐性を得るため、核酸ポリマーの主鎖におけるホスホジエステル結合をホスホロチオエートに修飾することが多い。このようなホスホロチオエート保護核酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ－ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）の刺激活性が幾分低いことに加え、臨床試験の最後の数年に、ホスホロチオエート保護（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ－ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）の毒性によって、医薬組成物または医薬品へのこのような核酸のいかなる使用も除外または厳しく制限されることが示された。
【0011】
異なる免疫調節プロファイルを有する公知の活性化剤の４つのクラスから、２つを除くすべてのメンバーは、直鎖ＤＮＡ分子を有する。１つの例外はＥＰ１ １９６ １７８に開示されている。本文献は、全体が天然ＤＮＡから成るＣＧモチーフを有する、部分的に一本鎖でダンベル型をしている、ヌクレオチド残基の共有結合閉鎖配列（「ｄＳＬＩＭ」）を含む、短いデオキシリボ核酸分子を開示している。ＥＰ１ １９６ １７８の開示によると、該ＣＧモチーフは、開示された分子の二本鎖ステムの両末端にある一本鎖ループ中または該二本鎖ステム中に位置する。該一本鎖ヘアピンループは、細胞内または細胞外において、ＤＮＡヌクレアーゼによる分解から二本鎖ステムを保護する。ＧＢ１４０２８４７．６は、異なる配列を用いた幾分類似したダンベル構造を開示している。
【0012】
直鎖オリゴヌクレオチドからの別の例外は、ＷＯ２０１２／０８５２９１に開示されている。本文献は、Ｌ－立体配座のヌクレオチドを有するＤＮＡ構築物を教示している。ＷＯ２０１２／０８５２９１に開示されているデータによると、Ｌ－立体配座のヌクレオチドの数およびＤＮＡ構築物中のそれらの位置は、ＤＮＡ構築物の免疫調節能（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）に影響を及ぼす。Ｌ－立体配座のヌクレオチドのみを含むＤＮＡ構築物は、例えば、免疫系を効率的には刺激しない。
【0013】
文献ＷＯ２０１０／０３９１３７は、免疫刺激モチーフに隣接する配列および／または修飾がなければ免疫刺激性であろうオリゴヌクレオチドモチーフに１つまたは複数の化学修飾を有する、ＴＬＲ媒介疾患に対するアンタゴニストとして、免疫調節オリゴヌクレオチドを開示している。したがって、ＷＯ２０１０／０３９１３７で開示されたオリゴヌクレオチドの目的は、ＴＬＲによって誘導された免疫応答を抑制することである。
【0014】
ＷＯ２００５／０４２０１８は、新規のいわゆるＣ－クラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドについて記載されており、ｃ－クラスのオリゴヌクレオチドは、該分子の５’末端もしくは３’末端に、またはその近くに通常位置するＣｐＧ配列、および該分子の他方の末端に、またはその近くに通常位置するＧＣリッチパリンドロームモチーフを特徴とする。本文献は、ｃ－クラスのＤＮＡが有するパリンドローム配列の変形形態を開示している。
【0015】
文献ＷＯ２０１５／１２４６１４は、免疫系を調節するための共有結合閉鎖ＤＮＡ構築物（covalently closed DNA construct）、医薬組成物、およびワクチンならびにそれらの使用を開示しており、ここで、該ＤＮＡ構築物は特殊なＤＮＡ配列を有する。
【0016】
細胞免疫応答の強い刺激は、調節回路（ｒａｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｉｒｃｕｉｔｓ）に影響を及ぼすことを可能にし、このような介入なく、患者に十分な免疫活性が生じることはないであろう。これには、「弱い」抗原、すなわち、ＭＨＣ－Ｉによる提示を活性化しない抗原、例えば、染色体転座からのブレークポイントペプチドまたは腫瘍性疾患で多発する突然変異した癌遺伝子に対する応答の誘導が含まれる（Ｍｅｌｉｅｆ ＣＪ、Ｋａｓｔ ＷＭ；Ｔ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ；Ｒｅｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ１９９１Ｊｕｎ－Ａｕｇ；１４２（５－６）：４２５－９；同じく：Ｐａｓｔｅｒｎａｋ Ｇ、Ｈｏｃｈｈａｕｓ Ａ、Ｓｃｈｕｌｔｈｅｉｓ Ｂ、Ｈｅｈｌｍａｎｎ Ｒ；Ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ；Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ１９９８；１２４（１２）：６４３－６０）。悪性黒色腫の腫瘍細胞で発現され、ＭＨＣ－Ｉで提示されるチロシナーゼまたはチロシンヒドロキシラーゼのような自己抗原に対する寛容性を壊すことも望ましいと思われる。（Ｗｅｂｅｒ ＬＷ、Ｂｏｗｎｅ ＷＢ、Ｗｏｌｃｈｏｋ ＪＤ、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ Ｒ、Ｑｉｎ Ｊ、Ｍｏｒｏｉ Ｙ、Ｃｌｙｎｅｓ Ｒ、Ｓｏｎｇ Ｐ、Ｌｅｗｉｓ ＪＪ、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ＡＮ；Ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ＤＮＡ；Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ１９９８Ｓｅｐ１５；１０２（６）：１２５８－６４；Ｓｕｒｍａｎ ＤＲ、Ｉｒｖｉｎｅ ＫＲ、Ｓｈｕｌｍａｎ ＥＰ、Ａｌｌｗｅｉｓ ＴＭ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ、Ｒｅｓｔｉｆｏ ＮＪ；Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｓｅｒａ ｔｏ ｍｏｕｓｅ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅ ｇｕｎ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ；Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ；１９９８Ｍａｙ１；２１４（１－２）：５１～６２）。
【0017】
別の極めて重要な側面は、予防的ワクチン接種におけるＩＳＳのアジュバント効果に加え、既存の感染症の反応を２型応答から１型応答に再極性化し、これによって、病原体を制御し得る可能性である（Ｋｏｖａｒｉｋ Ｊ他、ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃａｎ ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ ｔｈｅ Ｔｈ２ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏｎａｔａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｂｕｔ ｍａｙ ｆａｉｌ ｔｏ ｆｕｌｌｙ ｒｅｄｉｒｅｃｔ Ｔｈ２ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｎｅｏｎａｔａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ；Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９Ｆｅｂ１；１６２（３）：１６１１－７）。免疫応答の型は、感染症の経過または患者の生存能力に決定的な影響を及ぼすことが、多くの病原体で証明されている。アレルギー反応が２型の過剰応答を示す限り、ＩＳＳは、この種の適応症にも治療効果をもたらすことが期待される。
【0018】
ＣｐＧを有する特定の配列は、ＩＳＳ誘導性の刺激を中和する、すなわち、この種の配列を加えた場合、ＩＳＳの刺激作用を抑制することが可能になる特性を有することが認められている（Ｋｒｉｅｇ ＡＭ、Ｗｕ Ｔ、Ｗｅｅｒａｔｎａ Ｒ、Ｅｆｌｅｒ ＳＭ、Ｌｏｖｅ－Ｈｏｍａｎ Ｌ、Ｙａｎｇ Ｌ、Ｙｉ ＡＫ、Ｓｈｏｒｔ Ｄ、Ｄａｖｉｓ ＨＬ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ＤＮＡ ｂｌｏｃｋ ｉｍｍｕｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ＣｐＧ ｍｏｔｉｆｓ；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ１９９８Ｏｃｔ１３；９５（２１）：１２６３１－６）。中和ＣｐＧモチーフ（ｎｅｕｔｒａｌｉｓｉｎｇ ＣｐＧ ｍｏｔｉｆｓ）（「ＣｐＧ－Ｎ」）として記載されたこれらの配列モチーフの作用の根本的な機序が十分に説明されておらず、ここに引用した公報の著者らは、この作用はＩＳＳによる刺激を遮断することに限定されると暗示している。ＩＳＳによる免疫誘導の機序が説明されない限り、これらのＣｐＧ－Ｎモチーフが、治療上有意義な免疫を調節する他の特性も有する可能性を否定することはできない。
【0019】
患者の血清中に抗ＤＮＡ抗体の存在が確認されることを特徴とし、細菌のＩＳＳに対する反応を病因とすることが疑われる、少なくとも１つのヒトの疾患として、全身性エリテマトーデスがある（Ｋｒｉｅｇ ＡＭ、ＣｐＧ ＤＮＡ：ａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ？、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ１９９５Ｎｏｖ；１５（６）：２８４－９２）。これらの場合および他の適応症において、ＣｐＧ－Ｎモチーフを使用する根本的な機序を遮断することは有益であると思われる。
【0020】
上記根本的な機序のいかなる説明とも関係なく、ＣｐＧ配列が上記免疫応答に影響を及ぼす潜在性は、注目に値し、該現象に対する、さらに感染症、腫瘍、および免疫不全症に関する治療的および予防的適用の可能性を探ることに対する、思いがけない広範囲な科学的興味を引き起こした。
【0021】
ＣｐＧを含む免疫刺激配列が一本鎖として存在する場合、より有効であることは、ＩＳＳに関する文献で述べられており（例えば、ＷＯ０９８１８８１０Ａ１、１７ページ、ＩＩ ２９～３０参照）、また記載されている本発明によって確認されている（下記参照）。免疫修飾の目的で、短い開鎖した一本鎖ＩＳＳオリゴデオキシヌクレオチドを投与することは、論理的にとられる次の段階であり、感染症、腫瘍、および自己免疫疾患を治療するための多くの実験的手法の対象である。しかし、開鎖した一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドは、細胞外および細胞内エキソヌクレアーゼによって極めて速やかに分解され、このため、ｉｎ ｖｉｖｏで適用することは非常に困難である。核酸ポリマーの主鎖における修飾されたリン酸－エステル結合と比較すると、前述のヌクレアーゼの酵素活性は、かなり低下し；これによって、一本鎖核酸分子を患者に投与することに適用されるキラル体またはアキラル体のリン酸チオエステル化（「チオエート」）またはリン酸結合（ホスホネート）の減少化が導かれた。これらの修飾された化合物は、固相合成によって、またある程度、古典的なＤＮＡアミダイト合成と比較するとかなり複雑な方法によってのみ製造することが可能である。これらの化合物はアンチセンス研究において知られているが、アンチセンス戦略の臨床試験において、これらの化合物は、特に血液凝固系および補体系に対する重篤な副作用を有することも明らかにされた（例えば、Ｓｈｅｅｈａｎ ａｎｄ Ｌａｎ、Ｂｌｏｏｄ９２、１６１７～１６２５（１９９８）参照）。ＩＳＳのヌクレアーゼ保護のためにチオリン酸誘導体を使用することに関連して、該配列は、活性自体に必要な隣接する配列によって、実際に有効なそのシトシン－グアノシン残基自体を保護する場合、刺激活性がより低下することも明らかにされた（ＷＯ９８／１８８１０参照）。
【0022】
ＣｐＧを含む免疫刺激ＩＳＳの使用および製造に関する教示は、ＷＯ９８／１８８１０に加え、その中で引用されている文献に包括的に記載されている。エキソヌクレアーゼからオリゴデオキシヌクレオチドを保護する必要性は、ＷＯ９８／１８８１０に詳細に記載されている。ｉｎ ｖｉｖｏでの安定性が不十分である問題を解決するため、多くの解決策が提案されているが、これらは一本鎖の直鎖状ＯＤＮに明確に限定されており；チオリン酸エステル、ジチオリン酸エステル、またはホスホネートについて言及されている。二次構造、具体的にはステムループを形成することでＯＤＮを安定化する可能性は、ＷＯ９８／１８８１０に記載されている。免疫刺激配列に関連したホスホロチオエートオリゴマーの製造および使用は、ＵＳ５，６６３，１５３、ＵＳ５，７２３，３３５、およびＵＳ５，８５６，４６２に記載されている。
【0023】
一本鎖配列を保護するための別の戦略は、ＵＳ５，７５０，６６９に記載されている。本文献では、該オリゴマーの末端が、５’－５’結合および３’－３’結合によって連結されたヌクレオシド残基と結合しており、これによってエキソヌクレアーゼ分解を阻害する。
【0024】
２つのステムループまたは共有結合で閉鎖したダンベル型ＯＤＮは、ＤＮＡ結合タンパク質、さらに転写因子の結合部位における競合を研究の焦点とした実験的手法において知られている（Ｌｉｍ他、１９９７、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５、５７５～５８１；Ｂｌｕｍｅｎｆｅｌｄ他、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９３、２１、３４０５～３４１１）。
【0025】
ヒト免疫系のＴ細胞応答は、種々のＴ細胞を調節する分子によって調節され、正常細胞における免疫系の過剰活性を防ぐ（Ｐａｒｄｏｌｌ ＤＭ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２０１２；１２（４）：２５２～２６４；Ｓｈａｒｍａ Ｐ、Ｗａｇｎｅｒ Ｋ、Ｗｏｌｃｈｏｋ ＪＤ、Ａｌｌｉｓｏｎ ＪＰ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２０１１；１１（１１）：８０５～８１２）。このようなＴ細胞を調節する分子は、本開示の文脈内では「Ｔ細胞調節因子」としてまとめられており、チェックポイント阻害剤および共刺激剤を含む。腫瘍細胞は、このような調節系を利用し、免疫系による検出を回避する。免疫系のチェックポイントの阻害およびＴ細胞系の共刺激は、抗腫瘍免疫応答を増強すると思われる。免疫チェックポイントの遮断、これに伴う腫瘍特異的Ｔ細胞の遊離は、腫瘍細胞に対するそのエフェクター機能が発揮されるため、がん状態（ｃａｎｃｅｒ ｓｅｔｔｉｎｇｓ）における有効性が明らかにされており、臨床試験は進行中である（Ｈｏｄｉ ＦＳ、Ｏ’Ｄａｙ ＳＪ、ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ ＤＦ、他、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１０；３６３（８）：７１１～７２３；Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ、Ｔｈｏｍａｓ Ｌ、Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ Ｉ、他、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１；３６４（２６）：２５１７～２５２６；Ｗｏｌｃｈｏｋ ＪＤ、Ｈ．Ｋｌｕｇｅｒ、Ｍ．Ｋ．Ｃａｌｌａｈａｎ、他、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３６９（２０１３）、１２２～１３３ページ）。
【0026】
細胞傷害性Ｔリンパ球抗原（ＣＴＬＡ）－４およびプログラム細胞死（ＰＤ）－１は、２つのチェックポイントに相当し、これまでに、がん治療の標的として最も広く研究されてきた。ＣＴＬＡ－４は、特定のがんにおいてＴ細胞の表面で異常にアップレギュレートされることが認められている強力な共阻害因子である。これは、腫瘍細胞に応答したＴ細胞の活性化を低下させ、ひいては早期のＴリンパ球耐性に関わる。ＰＤ－１は、特定の腫瘍でアップレギュレートされ、Ｔ細胞の機能を阻害し、末梢血Ｔリンパ球耐性を維持する役割を果たすことによって該腫瘍が免疫系から逃れることを助けていることが認められている（Ｋｅｉｒ ＭＥ、Ｂｕｔｔｅ ＭＪ、Ｆｒｅｅｍａｎ ＧＪ、Ｓｈａｒｐｅ ＡＨ、他、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；２６：６７７～７０４；Ｍａｈｏｎｅｙ ＫＭ、Ｆｒｅｅｍａｎ ＧＪ、ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ ＤＦ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ３７（４）：７６４～７８２、２０１５）。
【0027】
２０１１年に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された最初の免疫チェックポイント阻害剤は、転移性黒色腫の治療のためにＣＴＬＡ－４を遮断するモノクローナル抗体であるイピリムマブであった。ＰＤ－１とそのリガンドの１つであるＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１およびＣＤ２７４としても公知）の間の相互作用を遮断することによって、抗腫瘍応答が引き起こされることが報告されている（、Ｐａｒｄｏｌｌ ＤＭ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２０１２；１２（４）：２５２～２６４）。
【0028】
別の阻害分子であり、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するＣＤ４相同体であるリンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ－３）は、活性化したＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および腫瘍浸潤リンパ球上に発現し、Ｔ細胞の活性を制限することによってＴ細胞の増殖を負に調節すると考えられている（Ｐａｒｄｏｌｌ ＤＭ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２０１２；１２（４）：２５２～２６４；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ＭＶ、Ｄｒａｋｅ ＣＧ．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ２０１１；３４４：２６９－７８）。その遮断によって、Ｔ細胞の増殖が増大し、抗腫瘍Ｔ細胞応答が増強する（Ｎｇｕｙｅｎ ＬＴ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１５）。
【0029】
さらに、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン－３（ＴＩＭ－３）は、そのリガンドがガレクチン９であり（様々な種類のがんでアップレギュレートされる）、ＩＦＮを分泌するヘルパーＴ（ＴＨ１）細胞、さらに樹状細胞、単球、およびＴ細胞によって発現される［Ｎｇｉｏｗ ＳＦ、Ｔｅｎｇ ＭＷ、Ｓｍｙｔｈ ＭＪ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１；７１（２１）：６５６７－７１］。これは、Ｔヘルパー１細胞応答を阻害し、ＴＩＭ－３抗体は、抗腫瘍免疫を増強する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＡＣ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ２０１２；２４：２１３－６）。そのリガンドであるガレクチン－９と結合した際、ＴＩＭ－３は、ＴＨ１細胞死を誘導する（Ｚｈｕ Ｃ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＡＣ、Ｓｃｈｕｂａｒｔ Ａ、他、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；６（１２）：１２４５－５２）。ＴＩＭ－３欠損マウスを用いた試験によって、ＴＩＭ－３経路は、ＴＨ１細胞の増殖およびエフェクター機能を阻害し、またＴＨ１細胞に対する耐性の誘導にとって重要である可能性が示されている（Ｓａｂａｔｏｓ ＣＡ、Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉ Ｓ、Ｃｈａ Ｅ、他、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；４（１１）：１１０２－１０）。さらに、ＴＩＭ－３は、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＰＤ－１と共発現されることが報告されており、両分子の二重遮断によって、ヒトＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖およびサイトカイン産生が著しく増強する。動物モデルにおいて、ＰＤ－１とＴＩＭ－３の協調的遮断によって、抗腫瘍免疫応答および腫瘍拒絶が増強すると報告された（Ｐａｒｄｏｌｌ ＤＭ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２０１２；１２（４）：２５２～２６４）。
【0030】
ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２）は、Ｔ細胞上の阻害性受容体として同定され、腫瘍細胞に加え、腫瘍関連血管内皮細胞上に発現するＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４は、ＢＴＬＡリガンドであることが示された。ＢＴＬＡ発現レベルは、黒色腫患者由来の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）において高く、ＢＴＬＡを発現するＴ細胞は、そのリガンドであるＨＶＥＭの存在下で阻害される。ＢＴＬＡは、腫瘍特異的ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を阻害することができる（Ｐａｕｌｏｓ ＣＭ、Ｊｕｎｅ ＣＭ．Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ２０１０；１２０：７６～８０）。したがって、ＢＴＬＡは、腫瘍の微小環境におけるＴ細胞の妥当な阻害性受容体でもあり、チェックポイント阻害戦略の標的でもあると考えられる（Ｐａｒｄｏｌｌ ＤＭ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２０１２；１２（４）：２５２－２６４）。
【0031】
ＯＸ４０（ＣＤ１３４／ＴＮＦＲＳＦ４）は、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーであり、抗原特異的なプライミング中、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞によって発現する。ＣＤ８およびＣＤ４Ｔ細胞におけるＯＸ４０のライゲーションによって、これらの細胞の生存および増殖が促進される。さらに、ＯＸ４０の活性化によって、腫瘍反応性エフェクターＴ細胞の産生が促進し、Ｔ細胞の機能を阻害する。前臨床試験では、ＯＸ４０アゴニストを用いた癌宿主の治療によって、一部の前臨床モデルにおいて腫瘍退縮が得られたことが明らかにされた（Ｌｉｎｃｈ ＳＮ、ＭｃＮａｍａｒａ ＭＪ、Ｒｅｄｍｏｎｄ ＷＬ．Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１５ ５：３４）。
【0032】
共刺激受容体ＣＤ１３７（４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９）は、抗腫瘍リンパ球の活性化および炎症誘発性極性化の両方に対する比類なき能力を有する。ＣＤ１３７／４－１ＢＢ受容体を介した共刺激は、Ｔ細胞内の複数のシグナル伝達カスケードを活性化し、Ｔ細胞の活性化を強力に増強する。抗原感作Ｔリンパ球上のＣＤ１３７の刺激によって、腫瘍免疫が増強し、ＣＤ１３７の単独療法は、著しい腫瘍退縮を媒介する能力があり、多くの種類の定着したマウス腫瘍を治癒させることさえある（Ｂａｒｔｋｏｗｉａｋ Ｔ、Ｃｕｒｒａｎ ＭＡ．Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ．２０１５ ５：１１７）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0033】
本開示の目的は、この技術水準に基づいて、免疫刺激ＤＮＡ構築物を含む効率的な組合せおよび医薬としてのその使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0034】
従来技術に関して、本開示の目的は、Ｔ細胞調節因子に結合する分子と非コード配列のデオキシリボヌクレオチドの形の免疫調節性ＤＮＡ構築物の組合せを提供することである。
【0035】
本開示は、チェックポイント阻害剤または共刺激剤として、その機能に影響を与えるため、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＯＸ４０、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）を含む群から選択される少なくとも１つの分子に結合する化学物質または分子と少なくとも１つの配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４（ここで、ＮはＡ、Ｃ、Ｔ、またはＧを含むヌクレオチドであり、ならびにＣはデオキシシチジン、Ｇはデオキシグアノシン、Ａはデオキシアデノシン、およびＴはデオキシチミジンである）を有する非コード配列のデオキシリボ核酸の構成成分を含む組合せを教示する。
【0036】
Ｔ細胞調節因子に結合する上記分子は、合成的にまたは生化学的に製造される、抗体のようなタンパク質またはペプチドであってよい。
【0037】
本開示の組合せは、Ｎ１Ｎ２として、ＧＴ、ＧＧ、ＧＡ、ＡＴ、およびＡＡの群から選択した要素、ならびにＮ３Ｎ４として、ＣＴ、ＴＧ、およびＴＴの群から選択した要素を含んでよい。
【0038】
上記非コード配列のデオキシリボ核酸は、両側が直鎖状で開鎖している、二本鎖部分の片側が直鎖状で開鎖しており該二本鎖の他方側が一本鎖ヘアピンである、またはダンベル型で部分的に一本鎖の共有結合で閉鎖したデオキシリボ核酸の鎖のいずれかであってよい。
【0039】
上記組合せは、さらに、上記配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４の少なくとも３つを含んでよい。
【0040】
直鎖状で開鎖した非コード配列のデオキシリボ核酸について、少なくとも１個のＬ－立体配座のヌクレオチドを含んでよく、該直鎖状で開鎖した非コード配列のデオキシリボ核酸のＤＮＡ一本鎖の５’－および／または３’－末端に位置した、５個の末端ヌクレオチドの１個がＬ－立体配座であってよいことが意図されている。
【0041】
本開示の組合せは、さらに、次の非コード配列のデオキシリボヌクレオチド
a. GTTCCTGGAG ACGTTCTTAG GAACGTTCTC CTTGACGTTG GAGAGAAC（配列番号１）、または
b. ACCTTCCTTG TACTAACGTT GCCTCAAGGA AGGTTGATCT TCATAACGTT GCCTAGATCA（配列番号２）、または
c. AACGTTCTTCGGGG CGTT（配列番号３）、または
d. AGGTGGTAAC CCCTAGGGGT TACCACCTTC ATCGTCGTTT TGTCGTTTTG TCGTTCTT（配列番号４）
を少なくとも１つ含んでよい。
a. GTTCCTGGAG ACGTTCTTAG GAACGTTCTC CTTGACGTTG GAGAGAAC（配列番号１）、または
b. ACCTTCCTTG TACTAACGTT GCCTCAAGGA AGGTTGATCT TCATAACGTT GCCTAGATCA（配列番号２）、または
c. AACGTTCTTCGGGG CGTT（配列番号３）、または
d. AGGTGGTAAC CCCTAGGGGT TACCACCTTC ATCGTCGTTT TGTCGTTTTG TCGTTCTT（配列番号４）
を少なくとも１つ含んでよい。
【0042】
上記組合せは、さらに、長さが４０～２００ヌクレオチドまたは４８～１１６ヌクレオチドの非コード配列のデオキシリボ核酸を含んでよい。
【0043】
配列ＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧ ＣＧＴＴ（配列番号３）は、配列CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC（配列番号５）の一部であってよいこともさらに意図されている。
【0044】
上記配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４は、本開示に記載される組合せの一部である非コード配列のデオキシリボヌクレオチドの一本鎖領域の一部であり得る。
【0045】
上記組合せは、最大１５ｍｇ／ｋｇ体重で適用するため、両群の構成成分を固体、液体、または気体の形態で提供してよい。これは、該投与量が、該組合せを適用すべき生体の体重に適合し得ることを意味する。
【0046】
本開示の組合せの構成成分を、同時に、交互に、または連続して提供するステップを含む方法は、本発明の別の目的である。上記非コード配列のデオキシリボ核酸は、Ｔ細胞調節因子に影響を与えるための化学物質または分子の前に提供されてよく、またはその逆でもよい。
【0047】
本開示の追加の目的は、医薬としてまたはがんのような疾患、自己免疫疾患、および炎症の治療のための開示される組合せの使用である。
【0048】
開示される組合せの化合物は、がん、自己免疫疾患、および炎症の治療のため、同時に、交互に、または連続して投与されてよい。
【0049】
許容し得る薬剤の塩を含有する、ワクチンなどの医薬品または医薬製剤の製造のための開示される組合せの使用は、本発明の追加の目的である。該医薬品は、開示される組合せの化合物を、同時に、交互に、または連続して放出してよい。
【0050】
最後に、治療的または予防的ワクチン接種のアジュバントとしての本開示の組合せの使用は、本開示の目的である。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
ａ．Ｔ細胞調節因子としての機能に影響を与えるため、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＯＸ４０、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）を含む群から選択される少なくとも１つの分子に結合する化学物質または分子を含む第１の群、および
ｂ．少なくとも１つの配列モチーフＮ １ Ｎ ２ ＣＧＮ ３ Ｎ ４ （ここで、ＮはＡ、Ｃ、Ｔ、またはＧを含むヌクレオチドであり、ならびにＣはデオキシシチジン、Ｇはデオキシグアノシン、Ａはデオキシアデノシン、およびＴはデオキシチミジンである）を含む非コード配列のデオキシリボ核酸を含む第２の群
の構成成分を含む組合せ。
（項目２）
Ｎ １ Ｎ ２ がＧＴ、ＧＧ、ＧＡ、ＡＴ、およびＡＡの群からの要素であり、Ｎ ３ Ｎ ４ がＣＴ、ＴＧ、およびＴＴの群からの要素である、項目１に記載の組合せ。
（項目３）
前記非コード配列のデオキシリボ核酸は、両側が直鎖状で開鎖している、二本鎖部分の片側が直鎖状で開鎖しており該二本鎖の他方側が一本鎖ヘアピンである、またはダンベル型で部分的に一本鎖の共有結合で閉鎖したデオキシリボ核酸の鎖のいずれかである、項目１または２に記載の組合せ。
（項目４）
Ｔ細胞調節因子に免疫系のチェックポイント阻害剤および免疫系の共刺激分子が含まれる、項目１から３のいずれか一項に記載の組合せ。
（項目５）
前記配列モチーフＮ １ Ｎ ２ ＣＧＮ ３ Ｎ ４ を少なくとも３つ含む、項目１から４のいずれか一項に記載の組合せ。
（項目６）
直鎖状で開鎖した非コード配列のデオキシリボ核酸が、少なくとも１個のＬ－立体配座のヌクレオチドを有する、項目１から５のいずれか一項に記載の組合せ。
（項目７）
前記直鎖状で開鎖した非コード配列のデオキシリボ核酸のＤＮＡ一本鎖の５’－および／または３’－末端に位置した５個の末端ヌクレオチドの１個が、Ｌ－立体配座である、項目６に記載の組合せ。
（項目８）
a. GTTCCTGGAG ACGTTCTTAG GAACGTTCTC CTTGACGTTG GAGAGAAC（配列番号１）、または
b. ACCTTCCTTG TACTAACGTT GCCTCAAGGA AGGTTGATCT TCATAACGTT GCCTAGATCA（配列番号２）、または
c. AACGTTCTTCGGGG CGTT（配列番号３）、または
d. AGGTGGTAAC CCCTAGGGGT TACCACCTTC ATCGTCGTTT TGTCGTTTTG TCGTTCTT（配列番号４）
の配列を少なくとも１つ含む、項目１から７のいずれか一項に記載の組合せ。
（項目９）
前記非コード配列のデオキシリボ核酸の長さが４０～２００ヌクレオチドである、項目１から８のいずれか一項に記載の組合せ。
（項目１０）
項目８ｃ）の前記配列が、配列CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC（配列番号５）の一部である、項目８または９に記載の組合せ。
（項目１１）
前記非コード配列のデオキシリボ核酸の長さが４８～１１６ヌクレオチドである、項目１から１０のいずれか一項に記載の組合せ。
（項目１２）
前記配列モチーフＮ １ Ｎ ２ ＣＧＮ ３ Ｎ ４ が、一本鎖領域の一部である、項目１から１１のいずれか一項に記載の組合せ。
（項目１３）
Ｔ細胞調節因子に結合する分子が抗体である、項目１から１２のいずれか一項に記載の組合せ。
（項目１４）
前記の両群からの構成成分を、最大１５ｍｇ／ｋｇ体重で適用するため、固体、液体、または気体の形態で提供する、項目１から１３のいずれか一項に記載の組合せ。
（項目１５）
項目１から１３のいずれか一項に記載の組合せの構成成分を、同時に、交互に、または連続して提供するステップを含む方法。
（項目１６）
前記Ｔ細胞調節因子に影響を与えるための前記化学物質または前記分子より先に、前記非コード配列のデオキシリボ核酸を提供する、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
医薬として使用するための、項目１から１３のいずれか一項に記載の組合せの使用。
（項目１８）
がん、自己免疫疾患、および炎症の治療のための、項目１から１３のいずれか一項に記載の組合せの使用。
（項目１９）
前記組合せの化合物を、同時に、交互に、または連続して投与する、項目１６または１７に記載の使用。
（項目２０）
前記組合せを含む医薬組成物の製造のための、項目１から１３のいずれか一項に記載の組合せの使用。
（項目２１）
医薬品が前記組合せの前記化合物を、同時に、交互に、または連続して放出する、項目１９に記載の使用。
（項目２２）
治療的または予防的ワクチン接種のアジュバントとしての、項目１から１３のいずれか一項に記載の組合せの使用。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
ａ．Ｔ細胞調節因子としての機能に影響を与えるため、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＯＸ４０、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）を含む群から選択される少なくとも１つの分子に結合する化学物質または分子を含む第１の群、および
ｂ．少なくとも１つの配列モチーフＮ １ Ｎ ２ ＣＧＮ ３ Ｎ ４ （ここで、ＮはＡ、Ｃ、Ｔ、またはＧを含むヌクレオチドであり、ならびにＣはデオキシシチジン、Ｇはデオキシグアノシン、Ａはデオキシアデノシン、およびＴはデオキシチミジンである）を含む非コード配列のデオキシリボ核酸を含む第２の群
の構成成分を含む組合せ。
（項目２）
Ｎ １ Ｎ ２ がＧＴ、ＧＧ、ＧＡ、ＡＴ、およびＡＡの群からの要素であり、Ｎ ３ Ｎ ４ がＣＴ、ＴＧ、およびＴＴの群からの要素である、項目１に記載の組合せ。
（項目３）
前記非コード配列のデオキシリボ核酸は、両側が直鎖状で開鎖している、二本鎖部分の片側が直鎖状で開鎖しており該二本鎖の他方側が一本鎖ヘアピンである、またはダンベル型で部分的に一本鎖の共有結合で閉鎖したデオキシリボ核酸の鎖のいずれかである、項目１または２に記載の組合せ。
（項目４）
Ｔ細胞調節因子に免疫系のチェックポイント阻害剤および免疫系の共刺激分子が含まれる、項目１から３のいずれか一項に記載の組合せ。
（項目５）
前記配列モチーフＮ １ Ｎ ２ ＣＧＮ ３ Ｎ ４ を少なくとも３つ含む、項目１から４のいずれか一項に記載の組合せ。
（項目６）
直鎖状で開鎖した非コード配列のデオキシリボ核酸が、少なくとも１個のＬ－立体配座のヌクレオチドを有する、項目１から５のいずれか一項に記載の組合せ。
（項目７）
前記直鎖状で開鎖した非コード配列のデオキシリボ核酸のＤＮＡ一本鎖の５’－および／または３’－末端に位置した５個の末端ヌクレオチドの１個が、Ｌ－立体配座である、項目６に記載の組合せ。
（項目８）
a. GTTCCTGGAG ACGTTCTTAG GAACGTTCTC CTTGACGTTG GAGAGAAC（配列番号１）、または
b. ACCTTCCTTG TACTAACGTT GCCTCAAGGA AGGTTGATCT TCATAACGTT GCCTAGATCA（配列番号２）、または
c. AACGTTCTTCGGGG CGTT（配列番号３）、または
d. AGGTGGTAAC CCCTAGGGGT TACCACCTTC ATCGTCGTTT TGTCGTTTTG TCGTTCTT（配列番号４）
の配列を少なくとも１つ含む、項目１から７のいずれか一項に記載の組合せ。
（項目９）
前記非コード配列のデオキシリボ核酸の長さが４０～２００ヌクレオチドである、項目１から８のいずれか一項に記載の組合せ。
（項目１０）
項目８ｃ）の前記配列が、配列CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC（配列番号５）の一部である、項目８または９に記載の組合せ。
（項目１１）
前記非コード配列のデオキシリボ核酸の長さが４８～１１６ヌクレオチドである、項目１から１０のいずれか一項に記載の組合せ。
（項目１２）
前記配列モチーフＮ １ Ｎ ２ ＣＧＮ ３ Ｎ ４ が、一本鎖領域の一部である、項目１から１１のいずれか一項に記載の組合せ。
（項目１３）
Ｔ細胞調節因子に結合する分子が抗体である、項目１から１２のいずれか一項に記載の組合せ。
（項目１４）
前記の両群からの構成成分を、最大１５ｍｇ／ｋｇ体重で適用するため、固体、液体、または気体の形態で提供する、項目１から１３のいずれか一項に記載の組合せ。
（項目１５）
項目１から１３のいずれか一項に記載の組合せの構成成分を、同時に、交互に、または連続して提供するステップを含む方法。
（項目１６）
前記Ｔ細胞調節因子に影響を与えるための前記化学物質または前記分子より先に、前記非コード配列のデオキシリボ核酸を提供する、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
医薬として使用するための、項目１から１３のいずれか一項に記載の組合せの使用。
（項目１８）
がん、自己免疫疾患、および炎症の治療のための、項目１から１３のいずれか一項に記載の組合せの使用。
（項目１９）
前記組合せの化合物を、同時に、交互に、または連続して投与する、項目１６または１７に記載の使用。
（項目２０）
前記組合せを含む医薬組成物の製造のための、項目１から１３のいずれか一項に記載の組合せの使用。
（項目２１）
医薬品が前記組合せの前記化合物を、同時に、交互に、または連続して放出する、項目１９に記載の使用。
（項目２２）
治療的または予防的ワクチン接種のアジュバントとしての、項目１から１３のいずれか一項に記載の組合せの使用。
【図面の簡単な説明】
【0051】
本発明は、図面に基づいて記載される。図面に記載された本発明の実施形態および態様は例に過ぎず、いかなる場合においても本請求項の保護範囲を限定するものではないことは理解されるであろう。本発明は、本請求項およびそれに相当するものによって定義される。当業者には当然のことながら、本発明のある態様またはある実施形態の特徴は、本発明の別の態様または他の実施形態の態様の特徴と組み合わせることができる。図面は以下を示す：
【0052】
【0053】
【図2】ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるリコール抗原のＨＬＡクラスＩ－拘束性Ｔ細胞エピトープから選択されるペプチドによるヒトＰＢＭＣの刺激。
【0054】
【0055】
【0056】
【図5】ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるリコール抗原のＨＬＡクラスＩ－拘束性Ｔ細胞エピトープから選択されるペプチド、配列番号６、および抗ＰＤ－によるヒトＰＢＭＣの刺激。
【0057】
【0058】
【0059】
【図8A】ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるリコール抗原のＨＬＡクラスＩ－拘束性Ｔ細胞エピトープから選択されるペプチド、配列番号９、および抗ＰＤ－によるヒトＰＢＭＣの刺激。
【図8B】ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるリコール抗原のＨＬＡクラスＩ－拘束性Ｔ細胞エピトープから選択されるペプチド、配列番号９、および抗ＰＤ－によるヒトＰＢＭＣの刺激。
【図8C】ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるリコール抗原のＨＬＡクラスＩ－拘束性Ｔ細胞エピトープから選択されるペプチド、配列番号９、および抗ＰＤ－によるヒトＰＢＭＣの刺激。
【0060】
【0061】
【0062】
【図11】ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるリコール抗原のＨＬＡクラスＩ－拘束性Ｔ細胞エピトープから選択されるペプチド、配列番号１０、および抗ＰＤ－によるヒトＰＢＭＣの刺激。
【0063】
【図12】ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるリコール抗原のＨＬＡクラスＩ－拘束性Ｔ細胞エピトープから選択されるペプチド、配列番号１１、および抗ＰＤ－１によるヒトＰＢＭＣの刺激。
【0064】
【図13】ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるリコール抗原のＨＬＡクラスＩ－拘束性Ｔ細胞エピトープから選択されるペプチド、ＥｎａｎＤＩＭ３６２、および抗ＰＤ－１によるヒトＰＢＭＣの刺激。
【発明を実施するための形態】
【0065】
本発明は、いわゆるＴ細胞調節因子に結合する分子と非コード配列デオキシリボ核酸の組合せを提供する。
【0066】
本開示の意味において、直鎖状で開鎖したＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド、略してＯＤＮと表記される。上記ＤＮＡ配列は、一本鎖または部分的もしくは完全に二本鎖であってよい。オリゴ、オリゴヌクレオチド、およびオリゴデオキシヌクレオチドという用語は、同じ意味で使用されるが、対応するＤＮＡ配列の長さを制限するものではない。オリゴヌクレオチドの１つの構成成分はヌクレオチドである。
【0067】
オリゴは、合成によって製造してよく、または部分的もしくは完全に生物由来であってよく、ここで、生物由来には、ＤＮＡ配列の遺伝学に基づく製造方法が含まれる。
【0068】
Ｌ－ＤＮＡまたはＬ－立体配座のヌクレオチドは、天然に存在するＤ－デオキシリボースの代わりに糖残基としてＬ－デオキシリボースを有するヌクレオチドを指す。Ｌ－デオキシリボースは、Ｄ－デオキシリボースのエナンチオマー（鏡像）である。部分的または完全にＬ－立体配座のヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドは、部分的または完全に一本鎖または二本鎖であってよいが、Ｌ－立体配座のヌクレオチドは、Ｄ－立体配座のヌクレオチドにハイブリダイズすることはできない（Ｈａｕｓｅｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２００６ ３４：５１０１－１１）。Ｌ－ＤＮＡは、Ｄ－ＤＮＡと同等に可溶性であり選択的である。さらに、Ｌ－ＤＮＡは、天然に存在する酵素、特にエキソヌクレアーゼによる酵素のエキソ活性に対する耐性があり、このため、Ｌ－ＤＮＡは、細胞内分解から保護される（Ｕｒａｔａ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９２ ２０：３３２５－３２）。したがって、Ｌ－ＤＮＡは非常に広く適用可能である。
【0069】
本開示に記載の「ステム」は、同じオリゴヌクレオチド内（そのため部分的に自己相補的である）または異なるオリゴヌクレオチド間（部分的にまたは完全に相補的である）のいずれかで塩基対合することによって形成されたＤＮＡ二本鎖であると理解されるべきである。分子内塩基対合は、同じオリゴヌクレオチド内の塩基対合を示し、異なるオリゴヌクレオチド間の塩基対合は、分子間塩基対合と称される。
【0070】
本開示の意味において「ループ」は、ステム構造内またはその末端のいずれかの不対合一本鎖領域であると理解されるべきである。「ヘアピン」は、同じオリゴヌクレオチドの２つの自己相補的領域がハイブリダイズし、１つの末端に不対合ループを有するステムが形成される場合に生じるステムとループの特徴的な組合せである。
【0071】
上記ヌクレオチドを共有結合的または非共有結合的に付着した「固相」は、以下に限定されないが、カラム、マトリックス、ビーズ、修飾または官能化ガラスを含むガラス、シリカ、またはシリコンおよび変性シリコンを含むシリカ系物質、合成樹脂（ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、およびスチレンと他の物質の共重合体、アクリル、ポリブチレン、ポリウレタンなどを含む）、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、多糖類、炭素、さらに無機ガラスおよび無機合成樹脂を指す。したがって、マイクロリットルプレートも本開示に記載の固相の範囲内である。
【0072】
本開示に記載の免疫調節は免疫刺激および免疫抑制を指す。免疫刺激は、免疫系のエフェクター細胞が、増殖、遊走、分化のため刺激されること、または他の何らかの形態で活性化することを優先的に意味する。例えば、通常、ヘルパー胸腺細胞からの共刺激シグナルを必要とするＢ細胞増殖は、共刺激シグナルなしで免疫刺激オリゴヌクレオチドによって誘導され得る。
【0073】
一方、免疫抑制は、免疫系の活性化または効力を低下させることと理解されるべきである。一般的に、免疫抑制は、例えば移植された臓器の拒絶反応を予防するため、骨髄移植後の移植片対宿主病を治療するため、または、例えば関節リウマチもしくはクローン病のような自己免疫疾患を治療するため、意図的に誘導される。
【0074】
この文脈において、免疫調節は、発現途中か成熟途中の免疫反応に影響を及ぼすこともしくは該反応を修飾すること、または確立した免疫反応の特徴を調節することのいずれかによる、免疫反応の性質または特徴への影響も指してよい。したがって、影響を及ぼすことは、チェックポイント阻害剤についての文脈では、その阻害作用を抑制すること、共刺激分子についての文脈では、それを活性化することを意味する。
【0075】
「がん」という用語は、乳癌、黒色腫、皮膚新生物、胃腸腫瘍（結腸癌、胃癌、膵臓癌、結腸がん、および小腸がんを含む）、卵巣癌、子宮頚癌、肺がん、前立腺がん、腎臓細胞癌、および／または肝転移を含む群から選択される、治療中または予防中のがん性疾患または腫瘍を含む。
【0076】
本開示に記載の自己免疫疾患は、関節リウマチ、クローン病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、グレーブス病、重症筋無力症、セリアック病、およびアジソン病を含む。
【0077】
本開示の意味においてかつその一般的な定義によると、アゴニストは、受容体またはリガンドのような別の分子に結合し、これによって該分子を活性化する化学物質または分子を示す。活性化させるアゴニストに対し、アンタゴニストは、アンタゴニストが結合する分子とそれぞれのアゴニストとの相互作用を遮断する化学物質または分子として理解されるべきである。文脈によっては、本発明の理解において、アンタゴニストは、例えば、アンタゴニストが別のアンタゴニストと受容体との相互作用を遮断するため、反応を活性化することになる場合もある。
【0078】
本明細書で用いる場合、「薬学的に適用可能なまたは許容し得る塩」という用語は、本発明の化合物に認められる特定の置換基に応じて、比較的無毒性の（すなわち、薬学的に許容される）酸または塩基で調製される上記組合せの化合物の塩を含む。例えば、本発明の化合物が酸性官能基を有する場合、塩基付加塩は、このような化合物の中性形態と十分な量の望ましい塩基を、溶媒なしまたは適当な不活性溶媒中のいずれかで接触させることによって得られることがある。薬学的に許容される塩基付加塩の非限定的な例として、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、有機アミノ塩、もしくはマグネシウム塩、または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が塩基性官能基を有する場合、酸付加塩は、このような化合物の中性形態と十分な量の望ましい酸を、溶媒なしまたは適当な不活性溶媒中のいずれかで接触させることによって得られることがある。薬学的に許容される酸付加塩の非限定的な例として、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、リン酸、部分的に中和されたリン酸、硫酸、部分的に中和された硫酸、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などといった無機酸由来のもの、同様に酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などといった比較的無毒性の有機酸由来の塩が挙げられる。さらに、アルギニンなどのようなアミノ酸の塩およびグルクロン酸またはガラクツロン酸などといった有機酸の塩も挙げられる。本発明のある特定の化合物は、塩基性および酸性官能基の両方を有しており、このため該化合物は、塩基付加塩または酸付加塩のいずれにも転換可能である。該塩を塩基または酸と接触させ、従来の方法で親化合物を単離することによって、本発明の化合物の中性形態を再生してもよい。該化合物の親形態は、極性溶媒に対する溶解度のような特定の物理的性質において、様々な塩の形態とは異なるが、本発明の目的において、該塩は該化合物の親形態と同等である。本発明の化合物は、キラルもしくは不斉炭素原子（光学的中心）および／または二重結合を有してよい。ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体、および各光学異性体は、本発明に包含される。本発明の化合物は、非溶媒和形態、同様に、水和形態を含む溶媒和形態で存在してよい。一般に、該溶媒和形態は、非溶媒和形態と同等であり、さらに本発明に包含される。さらに、本発明の化合物は、種々の結晶性形態または非晶質形態で存在してもよい。
【0079】
部分的に一本鎖でダンベル型をしている、デオキシリボヌクレオシド残基の共有結合で閉鎖している鎖から成り、１つまたは複数の塩基配列Ｎ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４の配列（ここで、Ｎ１Ｎ２はＧＴ、ＧＧ、ＧＡ、ＡＴ、またはＡＡの群からの要素であり、Ｎ３Ｎ４はＣＴまたはＴＴの群からの要素であり、さらにＣはデオキシシトシン、Ｇはデオキシグアノシン、Ａはデオキシアデノシン、およびＴはデオキシチミジンである）を有するデオキシリボ核酸分子は、ヒトまたは高等動物における免疫刺激のための免疫系のＴ細胞調節因子に結合できる化学物質または分子との組合せに使用される。
【0080】
本開示に関連するデオキシリボ核酸分子の長さが、最大２００ヌクレオチドであってよい。具体的には、長さが４８～１１６ヌクレオチドの間の配列を意図する。
【0081】
上記ダンベル型の非コード配列のデオキシリボ核酸分子は、一本鎖領域である塩基配列Ｎ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４を有してよい。
【0082】
上記免疫刺激は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行われてもよい。
【0083】
本開示は、少なくとも１つのＣｐＧモチーフおよび少なくとも１個のＬ－立体配座のヌクレオチドを有する直鎖状の開鎖したＤＮＡ配列も提供する。部分的／完全なＬ－立体配座であるため、該ＤＮＡ配列には、エキソヌクレアーゼに利用される５’－または３’－末端がない。該構造が、二本鎖の１つの末端に一本鎖ループを有する場合、該末端も分解から保護される。これによって、毒性であることが認められているホスホロチオエート主鎖を使用する必要なく、該ＯＤＮは、細胞の分解から完全に保護される。さらに、該ＯＤＮは、最小数のヌクレオチドのみから成り、該ＯＤＮを小さくすることで細胞への導入が容易になっている。
【0084】
少なくとも１つの配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４を有する非コード配列のデオキシリボ核酸は、一本鎖または部分的もしくは完全に二本鎖であってよい。これは、同じ分子内（分子内）または異なる分子間（分子間）での塩基対合または任意のその組合せを含む。該構成が、少なくとも１箇所の不対合の一本鎖領域を有することも可能である。追加の実施形態として、ヘアピン構造が含まれる。部分的または完全なＬ－立体配座であるため、Ｌ－立体配座のヌクレオチドが分解されないことから、該構成の半減期は、より長いことが保証される。
【0085】
一本鎖または部分的もしくは完全に二本鎖である少なくとも２つの分子が、互いに連結して、多量体構築物を形成することも、本開示の範囲内である。このため、該多量体構築物は、１つの分子内に隙間なく格納された、少なくともライゲーションパートナーと同数のＣｐＧモチーフが組み込まれており、したがって、Ｔ細胞調節因子との組合せの一環として、顕著な免疫応答も引き起こすことが期待される。得られた一本鎖または部分的もしくは完全に二本鎖の多量体構築物は、細胞の分解に対する保護のため、該分子内にＬ－立体配座のヌクレオチドを有し、共有結合で閉鎖された多量体構築物、または５’－および／または３’－末端にＬ－立体配座のヌクレオチドを有し、開鎖した多量体構築物のいずれかであってよい。
【0086】
さらに本開示は、カルボキシル、アミン、アミド、アルデミン、ケタール、アセタール、エステル、エーテル、ジスルフィド、チオール、およびアルデヒド基を含む群から選択される官能基を用いた、少なくとも１つの配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４を有する非コード配列のデオキシリボ核酸中の少なくとも１つのヌクレオチドの化学修飾を含む。これによって、例えば、吸着、共有結合、またはイオン結合による、該ＤＮＡ構築物と、ペプチド、タンパク質、炭水化物、抗体、合成分子、ポリマー、微小発射体、金属粒子、または固相を含む群から選択される化合物との結合が可能となる。
【0087】
上記修飾は、それぞれの目的に合わせて特異的に選択し得る。したがって、上記構築物は、例えば、組み込まれたＣｐＧモチーフに応答する特異的な細胞に他の分子を往復輸送するために使用し得る。さらに、このような修飾によって、該構築物を該細胞に導入するために使用できる微小発射体に該構築物が結合する可能性がある。該構築物は、マイクロタイタープレートなどの固相に結合することも可能である。
【0088】
下記の実験は、非コード配列のデオキシリボ核酸とＴ細胞調節因子の組合せの影響を検討するために行われた。該実験は、上記配列モチーフＮ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４を有するダンベル型の非コード配列のデオキシリボ核酸、Ｎ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４を有する直鎖状で開鎖した非コード配列のデオキシリボ核酸を用いて行われており、ここで、それらの構築物は、分解されることを防止するためにＬ－立体配座のヌクレオチドを有している。さらに、Ｔ細胞調節因子と、Ｎ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４および配列番号４の配列を２つ有する非コード配列のデオキシリボ核酸の組合せによる作用を検討した。
【0089】
ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＯＸ４０、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ３、およびＣＤ１３７（４－１ＢＢ）に結合するＴ細胞調節因子抗体を、ヒト腫瘍を注入したマウスモデルに使用した。増殖期後の治療における効果は、対照群と比較した腫瘍の増殖に対する作用は、以下でより詳細に記載される。
【0090】
上記実験は、本開示の組合せの構成成分を同時に、交互に、または連続して適用する投与計画を比較している。上記化合物の質的適用性（ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に加え、Ｎ１Ｎ２ＣＧＮ３Ｎ４配列モチーフを有する非コードＤＮＡ配列の非存在下で、上記チェックポイント阻害剤を適用する際に同程度またはより良い結果を得るために、Ｔ細胞調節因子の用量を減量することが必要かどうかを検討した。
【0091】
ＴＬＲ９アゴニストとＴ細胞調節因子に結合する分子との組合せの可能性に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ分析は、刺激後にＴ細胞の応答を評価するためのヒトＰＢＭＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養系の使用を含む。免疫学的Ｔ細胞調節因子（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１など）に対する抗体およびＴＬＲ９アゴニスト（すなわち、配列番号５、配列番号７、配列番号１０、配列番号６）の存在下で、ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザ、および破傷風毒素由来の免疫原性ペプチドの混合物によって、ＰＢＭＣを刺激できることがある。
【0092】
細胞培養上清中のサイトカイン（ＩＬ－２およびＩＦＮ－γ）の定量化を確定した。該ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養系は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける免疫細胞の複雑な相互作用を再現することはできないが、これらのＴＬＲ９アゴニストの組合せの利点に関する根拠を提供する。
【0093】
図面の詳細な説明
配列番号５と抗ＰＤ－１の組合せは、マウスＡ２０腫瘍モデルにおいて、抗ＰＤ－１または配列番号５のいずれかによる単独療法と比較して、驚くほど極めて増強した抗腫瘍効果を示した。
配列番号５と抗ＰＤ－１の組合せは、マウスＡ２０腫瘍モデルにおいて、抗ＰＤ－１または配列番号５のいずれかによる単独療法と比較して、驚くほど極めて増強した抗腫瘍効果を示した。
【0094】
腫瘍増殖は、配列番号５とＰＤ－１の組合せによって驚くほどほぼ完全に阻害された（図１Ａ、Ｂ）。各群９～１２匹のマウスにＡ２０マウス腫瘍細胞を皮下接種し、さらに配列番号５（１４、１６、１９、２１、２３、２６、２８、３０、３３、および３５日目に２５０μｇ／適用、腫瘍内）、抗ＰＤ－１（８、１１、１６、および１９日目に１００μｇ／適用、腹腔内）、または両方を注入した。溶媒の注入（腫瘍内）を対照とした。図１Ａは、平均腫瘍増殖－差し込み、１８～３２日目の平均腫瘍増殖阻害を示す（２９日目：配列番号５では４６．０％、抗ＰＤ－１では５４．２％、組合せでは９９．９％）。図１Ｂは、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存率プロットを示す。
【0095】
ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、抗原性ペプチドおよび配列番号５と抗ＰＤ－１の組合せと共に培養した際、図１Ａ、Ｂに示された配列番号５と抗ＰＤ－１の相乗的組合せ効果が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで確認された。ペプチドは、リコール抗原（ＣＭＶ、ＥＢＶ、Ｆｌｕ＝ＣＥＦ）のＨＬＡクラスＩ－拘束性Ｔ細胞エピトープから選択され、配列番号５との組合せは、配列番号５または抗ＰＤ－１のみの注入と比較して、該ＰＢＭＣによるＩＮＦ－γ分泌を明らかに増加させた（図２）。該ペプチドの最終濃度は、ペプチド毎に１μｇ／ｍＬであり、配列番号５は濃度３μＭ、さらに抗ＰＤ－１は１０μｇ／ｍＬで使用された（ｎ＝４）。ＩＦＮ－γ分泌を、免疫応答のマーカーとして分析し、ＣＥＦ－ペプチドのみによるＰＢＭＣ刺激後のＩＦＮ－γ値に対して正規化した。マウスＩｇＧ（１０μｇ／ｍＬ）を、抗ＰＤ－１の対照として使用した。
【0096】
さらに、マウスＣＴ２６腫瘍モデルにおける、抗ＰＤ－Ｌ１と配列番号５の組合せ療法の驚くべき有益な効果も、配列番号５または抗ＰＤ－Ｌ１のいずれかによる単独療法を明らかに上回った。腫瘍増殖は減少し（図３Ａ）、生存率は上昇した（図３Ｂ）。各群１０匹のマウスにＣＴ２６マウス腫瘍細胞を皮下接種し、さらに配列番号５（３、５、７、１０、１２、１４、１７、１９、２１、２４、および２６日目に２５０μｇ／適用、皮下）、抗ＰＤ－Ｌ１（３、５、７、９、１１、１３、１５、１７日目に適用毎に１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）、または両方を注入した。溶媒の注入（皮下）を対照とした。図３Ａは、平均腫瘍増殖－差し込み、１７～２７日目の平均腫瘍増殖阻害を示す（２０日目：レフィトリモド（ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ）では２３．０％、抗ＰＤ－Ｌ１では阻害が認められず、組合せでは３９．９％）。図１Ｂは、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存率プロットを示す。
【0097】
ループ配列ＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＣＴＴを有する配列番号６を適用する組合せ効果も検討した。
【0098】
配列番号６を抗ＰＤ－１と共にマウスＣＴ２６腫瘍モデルに投与した。該組合せは、配列番号６または抗ＰＤ－１といった単剤を用いた単独療法と比較して、抗腫瘍効果を驚くほど極めて増強した（図４Ａ、Ｂ）。再び、各群１０匹のマウスにＣＴ２６マウス腫瘍細胞を皮下接種し、さらに配列番号６（１５、１７、１９、２２、２４、２６、２９、３１日目に２５０μｇ／適用、腫瘍内）、抗ＰＤ－１（３、６、１０、および１３日目に１００μｇ／適用、腹腔内）、または両方を注入した。溶媒の注入（腫瘍内）を対照とした。図４Ａは、平均腫瘍増殖－差し込み、１５～２９日目の平均腫瘍増殖阻害を示す（２３日目：配列番号６では４８．２％、抗ＰＤ－１では阻害が認められず、組合せでは７５．４）。図１Ｂは、平均Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存率プロットを示す。
【0099】
図４に示された結果は、抗原性ペプチドによるヒトＰＢＭＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激データに一致し、驚くべきことに、上記化合物の単独使用を上回る上記組合せの有益性も示している（図５）。リコール抗原（ＣＭＶ、ＥＢＶ、Ｆｌｕ＝ＣＥＦ）のＨＬＡクラスＩ－拘束性Ｔ細胞エピトープから選択され、各最終濃度が１μｇ／ｍＬのペプチド、濃度が３μＭの配列番号６、および１０μｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１が使用された（ｎ＝４）。ＩＦＮ－γ分泌を、免疫応答のマーカーとして使用し、ＣＥＦ－ペプチドのみによるＰＢＭＣ刺激後のＩＦＮ－γ値に対して正規化した。マウスＩｇＧ（１０μｇ／ｍＬ）を、抗ＰＤ－１の対照として使用した。
【0100】
Ｌ－立体配座のヌクレオチドを有するオリゴを、追加試験に使用した。これらのオリゴは、表示された位置にＬ－ヌクレオチドを有する。ＤＮＡ分子は、コア配列［ｙＴＣＡＴＴｘＣＧＴＧＡＣＧＴＧＡＣＧＴＴＣｚｖ］（ｙ＝１～３個のＬ－デオキシリボースで保護されたまたは非保護の２～８個のＧ；ｘ＝３～４個のＡ；ｚ＝１～３個のＬ－デオキシリボースで保護された２～６個のＴ；ｖ＝Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）と共に使用された。
【0101】
これらのＬ－ヌクレオチドを有する分子は、チェックポイント阻害剤と組み合わせた場合、免疫調節性および抗腫瘍特性の増強を示した。例えば、マウスＣＴ２６腫瘍モデルにおける、配列番号７（ＧＧＧＧＴＣＡＴＴ ＡＡＡＡＣＧＴＧＡＣＧＴＧＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴ、Ｌ－デオキシリボースを含む塩基に下線）と抗ＣＴＬＡ－４の組合せは、配列番号７または抗ＣＴＬＡ－４による単独療法と比較して、驚くほど効率的な腫瘍増殖の減少が得られた（図６）。各群１０匹のマウスにＣＴ２６マウス腫瘍細胞を皮下接種し、さらに配列番号７（３、５、８、１０、１２、１５、１７、１９、２２、１４、および２６日目に２００μｇ／適用、皮下）、抗ＣＴＬＡ－４（８日目に１００μｇ／適用、１１および１４日目に５０μｇ／適用、腹腔内）、または両方を注入した。溶媒の注入（皮下）を対照とした。図６Ａは、平均腫瘍増殖－差し込み、１５～３０日目の平均腫瘍増殖阻害を示す（２２日目：配列番号７では１９．８％、抗ＰＤ－１では５９．１％、組合せでは６５．３％）。図６Ｂは、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存率プロットを示す。
【0102】
マウスＣＴ２６腫瘍モデルにおける、配列番号７と抗ＰＤ－Ｌ１の組合せも、配列番号７または抗ＰＤ－Ｌ１の単独化合物の場合と比較して、抗腫瘍効果の中程度の増強を示した。各群１０匹のマウスにＣＴ２６マウス腫瘍細胞を皮下接種し、さらに配列番号７（３、５、７、１０、１２、１４、１７、１９、２１、２４、および２６日目に、皮下）、抗ＰＤ－Ｌ１（３、５、７、９、１１、１３、１５、１７日目に適用毎に１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）、または両方を注入した。溶媒の注入（皮下）を対照とした。図７Ａは、平均腫瘍増殖－差し込み、１３～２７日目の平均腫瘍増殖阻害を示す（２０日目：配列番号７では１６．３％、抗ＰＤ－Ｌ１では阻害が認められず、組合せでは３３．３％）。図７Ｂは、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存率プロットを示す。
【0103】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、抗ＰＤ－１と配列番号７の組合せの有益性を検討した。配列番号８（ＧＧＧＧＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＡＡＡＣＧＴＧＡＣＧＴＧＡＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴ、Ｌ－デオキシリボースを含む塩基に下線）、および配列番号９（ＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＡＡＣＧＴＧＡＣＧＴＧＡ ＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴ、Ｌ－デオキシリボースを含む塩基に下線）を、抗原性ペプチドで刺激されたＰＢＭＣからのＩＦＮ－γ分泌に関して観察した（図８）。ペプチドは、リコール抗原（ＣＭＶ、ＥＢＶ、Ｆｌｕ＝ＣＥＦ；ペプチド毎の最終濃度１μｇ／ｍＬ）のＨＬＡクラスＩ－拘束性Ｔ細胞エピトープから選択され、配列番号７（Ａ、ｎ＝１２）、配列番号８（Ｂ、ｎ＝２）、配列番号９（Ｃ、ｎ＝４）、各ＤＮＡ分子の最終濃度は３μＭ、および抗ＰＤ－１（１０μｇ／ｍＬ）。免疫応答のマーカーとしてのＩＦＮ－γ分泌の分析；ＣＥＦ－ペプチドのみによる刺激後のＩＦＮ－γ値に対して正規化した。マウスＩｇＧ（１０μｇ／ｍＬ）を、抗ＰＤ－１の対照として使用した。
【0104】
別の一連の実験では、コア配列［ｙＴＣＡＴＴｘＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＴＴＣｚｖ］（ｙ＝１～３個のＬ－デオキシリボースで保護されたまたは非保護の２～８個のＧ；ｘ＝３～４個のＡ；ｚ＝１～３個のＬ－デオキシリボースで保護された２～６個のＴ；ｖ＝Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）を有するＤＮＡ分子が使用された。
【0105】
免疫調節に関する組合せ効果および抗腫瘍効果が、この群においても確立された。
この群の例として、配列番号１０（ＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧ ＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴ、Ｌ－デオキシリボースを含む塩基に下線）を、抗ＰＤ－１との組合せを検討するために使用した。
この群の例として、配列番号１０（ＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧ ＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴ、Ｌ－デオキシリボースを含む塩基に下線）を、抗ＰＤ－１との組合せを検討するために使用した。
【0106】
上記組合せによって、マウスＣＴ２６腫瘍モデルにおける腫瘍増殖の著しい減少が得られた（図９）。各群１０匹のマウスにＣＴ２６マウス腫瘍細胞を皮下接種し、さらに配列番号１０（３、５、８、１０、１２、１５、１７、１９、２２、１４、および２６日目に２００μｇ／適用、皮下）、抗ＰＤ－１（３、６、１０、および１４日目に２００μｇ／適用、腹腔内）、または両方を注入した。溶媒の注入（皮下）を対照とした。図９Ａは、平均腫瘍増殖－差し込み、１４～３２日目の平均腫瘍増殖阻害を示す（２５日目：配列番号１０では１７．８％、抗ＰＤ－１では５１．９％、組合せでは７４．６％）。図９Ｂは、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存率プロットを示す。
【0107】
さらに、マウスＣＴ２６腫瘍モデルにおける、配列番号１０と抗ＣＴＬＡ－４の組合せは、配列番号１０または抗ＣＴＬＡ－４の単剤による治療と比較して、腫瘍増殖を減少する（図１０）。各群１０匹のマウスにＣＴ２６マウス腫瘍細胞を皮下接種し、さらに配列番号１０（３、５、８、１０、１２、１５、１７、１９、２２、１４、および２６日目に２００μｇ／適用、皮下）、抗ＣＴＬＡ－４（８日目に１００μｇ／適用、１１および１４日目に５０μｇ／適用、腹腔内）、または両方を注入した。溶媒の注入（皮下）を対照とした。図１０Ａは、平均腫瘍増殖－充填、１５～３０日目の平均腫瘍増殖阻害を示す（２２日目：配列番号１０では４９．７％、抗ＰＤ－１では５９．１％、組合せでは７０．３％）。図１０Ｂは、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存率プロットを示す。
【0108】
さらに、配列番号１０と抗ＰＤ－１の組合せは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＰＢＭＣ刺激試験で評価し、配列番号１０または抗ＰＤ－１のみと比較して、ＩＦＮ－γ分泌に関する効果の増強を示した（図１１）。ペプチドは、リコール抗原（ＣＭＶ、ＥＢＶ、Ｆｌｕ＝ＣＥＦ；ペプチド毎の最終濃度１μｇ／ｍＬ））のＨＬＡクラスＩ－拘束性Ｔ細胞エピトープから選択され、配列番号１０（３μＭ）、および抗ＰＤ－１（１０μｇ／ｍＬ）（ｎ＝５）。ＩＦＮ－γ分泌の分析を、免疫応答のマーカーとし、ＣＥＦ－ペプチドのみによる刺激後のＩＦＮ－γ値に対して正規化した。マウスＩｇＧ（１０μｇ／ｍＬ）を、抗ＰＤ－１の対照として使用した。
【0109】
追加の実験において、コア配列［ｙＴＣＡＴＴｘＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧｚｖ］（ｙ＝１～３個のＬ－デオキシリボースで保護されたまたは非保護の２～８個のＧ；ｘ＝３～４個のＡ；ｚ＝１～３個のＬ－デオキシリボースで保護された２～６個のＴ；ｖ＝Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）を有するＤＮＡ分子が実験に使用された。
【0110】
この群の例として、配列番号１１（ＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＡＡＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＴ、Ｌ－デオキシリボースを含む塩基に下線）を使用した。ＰＢＭＣ試験において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで配列番号１１と抗ＰＤ－１を組み合わせた場合、ＩＦＮ－γ分泌は、驚くほど著しく増加し、配列番号１１または抗ＰＤ－１のみと比較して向上することが示された（図１２）。ペプチドは、リコール抗原（ＣＭＶ、ＥＢＶ、Ｆｌｕ＝ＣＥＦ；ペプチド毎の最終濃度１μｇ／ｍＬ）のＨＬＡクラスＩ－拘束性Ｔ細胞エピトープから選択され、配列番号１１（３μＭ）、および抗ＰＤ－１（１０μｇ／ｍＬ）（ｎ＝４）。免疫応答のマーカーとしてのＩＦＮ－γ分泌の分析；ＣＥＦ－ペプチドのみによる刺激後のＩＦＮ－γ値に対して正規化した。マウスＩｇＧ（１０μｇ／ｍＬ）を、抗ＰＤ－１の対照として使用した。
【0111】
最後に、コア配列［ｙＡＣＧＡＴＣＧＴＣｗＴ］（ｙ＝１～３個のＬ－デオキシリボースで保護されたまたは非保護の２～８個のＧ；ｗ＝１～３個のＬ－デオキシリボースで保護された４～１２個のＧ）を有するＤＮＡ分子が、組合せに適用の効果を試験するために使用された。
【0112】
この群の例は、配列番号１２（ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＴ、Ｌ－デオキシリボースを含む塩基に下線）である。ヒトＰＢＭＣを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの刺激試験において、抗ＰＤ－１との組合せは、その単独化合物と比較して、著しく増強した免疫応答を引き起こすと評価された（図１３）。ペプチドは、リコール抗原（ＣＭＶ、ＥＢＶ、Ｆｌｕ＝ＣＥＦ；ペプチド毎の最終濃度１μｇ／ｍＬ）のＨＬＡクラスＩ－拘束性Ｔ細胞エピトープから選択され、配列番号１２（３μＭ）、および抗ＰＤ－１（１０μｇ／ｍＬ）（ｎ＝４）。免疫応答のマーカーとしてのＩＦＮ－γ分泌の分析；ＣＥＦ－ペプチドのみによる刺激後のＩＦＮ－γ値に対して正規化した。マウスＩｇＧ（１０μｇ／ｍＬ）を、抗ＰＤ－１の対照として使用した。
【0113】
上記の実験設定を考慮に入れ、マウスの体重が約２０ｇ、適用されるＤＮＡの量が約１２．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内であるとすると、示された驚くべき結果を得るためには、最大１５ｍｇ／ｋｇが必要であることは適当と考えられる。
【0114】
抗ＰＤ－１抗体は、１０ｍｇ／ｋｇ体重で適用され、このため、示された驚くべき結果を得るためには、最大１５ｍｇ／ｋｇ体重での適用も必要と考えられる。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】