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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-15
(45)【発行日】2024-02-26
(54)【発明の名称】フォトルミネッセンス無機ナノ粒子を使用した毛細管現象試験
(51)【国際特許分類】
G01N 21/64 20060101AFI20240216BHJP
【ＦＩ】
G01N21/64 B
【請求項の数】
25
(21)【出願番号】P 2021502484
(86)(22)【出願日】2019-07-17
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-11-11
(86)【国際出願番号】 EP2019069263
(87)【国際公開番号】W WO2020016308
(87)【国際公開日】2020-01-23
【審査請求日】2022-06-10
(31)【優先権主張番号】1856651
(32)【優先日】2018-07-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(73)【特許権者】
【識別番号】513262665
【氏名又は名称】エコール ポリテクニック
【氏名又は名称原語表記】ＥＣＯＬＥ ＰＯＬＹＴＥＣＨＮＩＱＵＥ
(73)【特許権者】
【識別番号】506316557
【氏名又は名称】サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】プレイラ、パスカル
(72)【発明者】
【氏名】リッチリィ、マクシミリアン
(72)【発明者】
【氏名】ブジーグ、セドリック
(72)【発明者】
【氏名】アレクサンドロウ、アンティゴーニ
(72)【発明者】
【氏名】ギャコワン、ティエリー
【審査官】吉田 将志
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１２－０３２２６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００７／０８３６２６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１３－２５００９７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００５－５０２５７３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０１７２３３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１０－１９７２４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１３－０５７０３７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１５／０２２９１４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１３－５３６４３１（ＪＰ，Ａ）
【文献】STOUWDSAM et al.，Colloidal Nanoparticles of Ln3+-Doped LaVO4: Energy Transfer to Visible- and Near-Infrared-Emitting Lanthanide Ions，Langmuir，American Chemical Society，2005年，Vol.21，PP.7003-7008
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ２１／６２ － Ｇ０１Ｎ ２１／７４
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の式（ＩＩ）のフォトルミネッセンス無機ナノ粒子をプローブとして使用する、毛細管現象試験によって、液体サンプル中の目的の生物学的または化学的物質を検出および／または定量化するためのインビトロ方法であって、Ａ１－ｘＬｎｘＶＯ４（１－ｙ）（ＰＯ４）ｙ（ＩＩ）
式中、
Ａは、イットリウム（Ｙ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、ランタン（Ｌａ）、ルテチウム（Ｌｕ）、およびそれらの混合物から選択され、
Ｌｎは、ユウロピウム（Ｅｕ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、サマリウム（Ｓｍ）、ネオジム（Ｎｄ）、エルビウム（Ｅｒ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ツリウム（Ｔｍ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ホルミウム（Ｈｏ）、およびそれらの混合物から選択され、
０．２≦ｘ≦０．６、および
０≦ｙ＜１、
前記方法が、一光子吸収後、ナノ粒子の発光寿命が１００ｍｓ未満のルミネッセンスを、３２０ｎｍ以下の波長でマトリックスを励起することによって検出することを使用する、方法。
【請求項2】
ルミネッセンスの検出が、３００ｎｍ以下で構成される波長でマトリックスを励起することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
液体サンプルが生物学的サンプルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
サンプル中の分子、タンパク質、核酸、毒素、ウイルス、細菌または寄生虫を検出および／または定量化するための、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記フォトルミネッセンスナノ粒子が、５ｎｍ以上で厳密に１μｍ未満の平均サイズを有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
Ｌｎが、Ｅｕ、Ｄｙ、Ｓｍ、Ｙｂ、Ｅｒ、Ｎｄおよびそれらの混合物から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
Ａが、Ｙ、Ｇｄ、Ｌａおよびそれらの混合物から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ナノ粒子が、その表面にテトラアルキルアンモニウムカチオンを有し、前記ナノ粒子が、ｐＨ≧５の水性媒体中でζが－２８ｍＶ以下と指定されたゼータ電位を有し、厳密にイオン伝導度が１００μＳ・ｃｍ－１未満である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記ナノ粒子が、式Ａ１－ｘＬｎｘＶＯ４（ＩＩＩ）のものであり、式中、Ａ、Ｌｎ、およびｘが、請求項１、６、および７のいずれか一項に定義されている通りである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記フォトルミネッセンス無機ナノ粒子が、分析される物質に特異的に結合する少なくとも１つの試薬に結合されている毛細管現象試験デバイスを使用する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記フォトルミネッセンス無機ナノ粒子が、毛細管現象試験デバイス内での移動を促進することを目的とする１つまたは複数の薬剤で表面上で官能化されている、毛細管現象試験デバイスを使用する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記液体サンプル、および場合により希釈剤を沈着させるためのゾーン（１）、前記沈着ゾーンの下流に配置され、「標識ゾーン」と呼ばれ、分析される物質に特異的に結合する少なくとも１つの試薬に結合された前記フォトルミネッセンス無機ナノ粒子が担持された、ゾーン（２）、
前記標識ゾーン（２）の下流に配置され、「検出ゾーン」とも呼ばれ、前記分析される物質に特異的な少なくとも１つの捕捉試薬が固定化される、反応ゾーン（３）、
前記検出ゾーンの下流に位置し、前記分析される物質に特異的に結合する前記試薬に特異的な少なくとも１つの第２の捕捉試薬が固定化される、対照ゾーン（４）、および
場合により、前記反応ゾーンおよび前記対照ゾーンの下流に配置される、吸収パッド（５）、
を含む毛細管現象試験デバイスを使用する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記方法が、少なくとも以下のステップ、（ｉ）前記毛細管現象試験デバイスの前記沈着ゾーン（１）のレベルで、分析される液体サンプル、および場合により希釈剤を適用すること、
（ｉｉ）前記フォトルミネッセンスナノ粒子によって生成された前記ルミネッセンスが前記反応ゾーン（３）で検出されるまで、および／または前記ルミネッセンスが移動対照ゾーン（４）で検出されるまで、前記デバイスをインキュベートすること、および
（ｉｉｉ）結果を読んで解釈すること、
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記毛細管現象試験の結果の読み取りが、アッセイの終了時に、毛細管現象試験デバイスのレベルで固定化されたプローブによって生成された前記ルミネッセンスを検出することによって行われる、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記ナノ粒子が、式Ｙ１－ｘＥｕｘＶＯ４（ＩＶ）のものであり、前記ルミネッセンスの検出が、２３０ｎｍ～３２０ｎｍの波長でＹＶＯ４マトリックスを励起することによって行われる、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記毛細管現象試験の結果の読み取りが、毛細管現象試験デバイスの直接の肉眼観察により行われる、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記毛細管現象試験の結果の読み取りが、発光フィルタおよび光子検出器を含む検出装置を使用して行われる、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
結果の解釈が、請求項１２に定義された毛細管現象試験デバイスの検出ゾーン、対照ゾーンおよびバックグラウンドシグナルに対応するシグナルを決定し、前記バックグラウンドシグナルのルミネッセンスの値を差し引き、前記検出ゾーンからのシグナル対前記対照ゾーンからのシグナルの比を決定することを含む、請求項１から１５および１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
液体サンプル中の目的の生物学的または化学的物質を検出および／または定量化するのに有用な毛細管現象試験デバイスであって、前記デバイスは、プローブとして、以下の式（ＩＩ）のフォトルミネッセンス無機ナノ粒子を含み、Ａ１－ｘＬｎｘＶＯ４（１－ｙ）（ＰＯ４）ｙ（ＩＩ）
式中、
Ａは、イットリウム（Ｙ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、ランタン（Ｌａ）、ルテチウム（Ｌｕ）、およびそれらの混合物から選択され、
Ｌｎは、ユウロピウム（Ｅｕ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、サマリウム（Ｓｍ）、ネオジム（Ｎｄ）、エルビウム（Ｅｒ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ツリウム（Ｔｍ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ホルミウム（Ｈｏ）、およびそれらの混合物から選択され、
０．２≦ｘ≦０．６、および
０≦ｙ＜１、
前記ナノ粒子は、一光子吸収後、発光寿命が１００ｍｓ未満のルミネッセンスを、３２０ｎｍ以下の波長でマトリックスを励起することによってルミネッセンスを発光することができる、デバイス。
【請求項20】
前記ナノ粒子が、請求項５から１１のいずれか一項に定義されている通りである、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項21】
前記デバイスが、請求項１２に定義された通りである、請求項１９または２０に記載のデバイス。
【請求項22】
体外診断キットであって、少なくとも、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の毛細管現象試験デバイス、および
アッセイ終了時に、前記デバイスのレベルで固定化されたプローブにより生成された前記ルミネッセンスを検出するためのデバイス
を含む、体外診断キット。
【請求項23】
体外診断の目的のための、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法の使用、または請求項１９から２１のいずれか一項に記載の毛細管現象試験デバイスの使用。
【請求項24】
農産物または食品または環境中の目的の物質を検出および／または定量化するための、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法の使用、または請求項１９から２１のいずれか一項に記載の毛細管現象試験デバイスの使用。
【請求項25】
違法な化学物質を検出および／または定量化するための、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法の使用、または請求項１９から２１のいずれか一項に記載の毛細管現象試験デバイスの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物分析および体外診断の分野に関する。本発明は、より具体的には、光学的および物理化学的特性が制御されたフォトルミネッセンス無機ナノ粒子をプローブとして使用した毛細管現象試験により、液体サンプル中の目的の生物学的または化学的物質、例えばタンパク質、抗体、毒素および他の化合物を検出および／または定量するためのインビトロ方法に関する。
【背景技術】
【0002】
一般に「ストリップ試験」という名前で知られている、例えばラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）などの毛細管現象試験は、臨床、製薬、食品または化学分析の目的で一般的に使用される。それらは、抗体、抗原、タンパク質、バイオマーカー、化学分子、核酸などの多くの種類の分析物の存在を検出するために使用することができる（［１］）。ラテラルフローアッセイで使用される認識分子が抗体である場合、より一般的には、「イムノクロマトグラフアッセイ」（ラテラルフローイムノアッセイ、ＬＦＩＡ）と呼ばれる。
【0003】
毛細管現象試験は、その使いやすさ、速度（１５分以下の時間での検出）、および低コストで特に高く評価されている。
【0004】
一般に、毛細管現象試験用のデバイスは、多孔質固体支持体（例えば、ニトロセルロース膜）の形態の毛細管現象のための手段を使用し、固体支持体の一端に沈着した試験サンプル、および販売されているデバイスに組み込まれた試薬は、毛細管現象によって移動する。
【0005】
典型的には、毛細管現象試験用のデバイスの多孔質固体支持体は、液体形態、凍結乾燥または脱水され、分析される物質（または「分析物」）と特異的に結合し、プローブ（または検出種）と結合した試薬を保持する標識ゾーン（英語の用語では「コンジュゲートパッド」）、および分析物を特異的に捕捉する試薬が固定化された検出ゾーン（英語の用語では「検出パッド」）を含む。
【0006】
分析物と特異的に結合する試薬は、凍結乾燥された形で固定化されるが、濡れると固体支持体中で移動性になる。したがって、固体支持体が液体サンプルと接触すると、液体サンプルは、プローブに結合した分析物と特異的に結合する試薬を同伴する当該支持体における毛細管現象により移動する。サンプル、および分析物と特異的に結合した試薬は、固体支持体における毛細管現象により、分析物に特異的に、固定化された捕捉試薬を保持する検出ゾーンまで移動する。
【0007】
「サンドイッチ」タイプの最も一般的な毛細管現象試験では、プローブに結合した結合試薬は、サンプルに含まれる分析物に結合し、分析物が出会うと、分析物は、捕捉試薬により固体支持体上に固定化される。したがって、サンプル中の分析物の有無は、分析物を介して検出ゾーンのレベルで固定化されたプローブを検出することによって測定される。
【0008】
これらのデバイスはまた、毛細管流の方向に対して検出ゾーンの下流に位置する、いわゆる対照（コントロール）ゾーンを含み、ここで、標識された標的試薬に特異的な第２の捕捉試薬が固定化される。検出ゾーンまで移動した後、分析物と反応しなかった過剰のプローブに結合した結合試薬は、対照ゾーンまで移動し、第２の捕捉試薬に結合する。したがって、ユーザは、デバイス内のサンプルと試薬の移動を検証できるようにするポジティブコントロールを持っているため、試験の適切な動作を検証することができる。
【0009】
したがって、サンプル中の分析物の決定は、検出ゾーンのレベルで、および場合により、対照ゾーンのレベルでプローブの有無を検出することによって達成される。
【0010】
毛細管現象試験で最も一般的に使用されるプローブは、金ナノ粒子である（［１］、［２］）。ナノ粒子は、表面プラズモン周波数に対応する特徴的な波長の光を吸収する。ナノ粒子の表面プラズモン周波数は、ナノ粒子のサイズと凝集状態に依存する。金ナノ粒子が検出ゾーンおよび／または対照ゾーンのレベルで固定化されると、互いに近接しているナノ粒子の表面プラズモンの周波数に関連する吸収は、したがって、肉眼で視認可能な特徴的な色、典型的には青／紫を当該ゾーンに付与することを可能にする。有利なことに、これらの試験は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの従来の免疫検出技術に必要な時間、典型的にはＥＬＩＳＡアッセイのためには数時間と比較して、サンプルの分析結果を迅速に、典型的には数分で得ることを可能にする。さらに、準備や分析のために高価でかさばる機器を必要としない。
【0011】
しかし、これらの試験には、検出感度が低く、定量限界が低いという大きな欠点がある。したがって、試験は通常、定性的または半定量的な情報のみを提供する。特に、これらのストリップ試験の検出感度は、例えばＥＬＩＳＡタイプの従来の免疫検出アッセイによって得られる検出感度よりもはるかに低い。したがって、金ナノ粒子に基づくストリップ試験では、一般的には数ｎｇ／ｍＬのオーダーの濃度を検出できるが、ＥＬＩＳＡアッセイでは、一般的には２～３桁感度が高い数ｐｇ／ｍＬの検出が可能である。例えば、Ｃｏｒｔｅｚ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社は、トロポニンＩ（心筋梗塞のバイオマーカー）を検出するための感度が１ｎｇ／ｍｌのストリップ試験を提供しているが（［３］）、Ａｂｃａｍ社は感度が７ｐｇ／ｍＬのＥＬＩＳＡアッセイ（ａｂ２０００１６）を提供している。
【0012】
ストリップ試験の感度を向上させるために、言い換えれば、これらのアッセイの検出限界を下げるために、毛細管現象試験における金ナノ粒子に替わるプローブとして、様々な材料、特に修飾金ナノ粒子、磁性粒子、半導体ナノ結晶または「量子ドット」、アップコンバージョン蛍光体、有機フルオロフォアなどが提案されている（［１］、［４］）。
【0013】
したがって、金ナノ粒子に基づくいくつかのナノ材料は、例えば、金ナノ粒子でコーティングされたＦｅ２Ｏ３のナノメートル粒子から形成されたコアを含む磁性ミクロスフェア（［５］）、金ナノ粒子を保有するシリカナノチューブ（［６］）、または多分岐金ナノフラワー（ＧＮＦ）（［７］）などの、毛細管現象試験用のデバイスのプローブとして探索されてきた。また、金ナノ粒子上に銀の層を沈着させることを提案しているＤｅｒ－Ｊｉａｎｇら（［８］）を引用することができる。しかし、これらのアプローチでは、これらのプローブを合成するためのルートが必要であり、非常に複雑になることが多い。さらに、銀は金よりも酸化しやすいため、銀と金を組み合わせたプローブは、水性媒体での毛細管現象試験に適用するには安定性が低くなる。
【0014】
有機フルオロフォアや量子ドットなどのフォトルミネッセンスプローブ（以下、より簡単に「ルミネッセンスプローブ」とも呼ぶ）を使用することで、金ナノ粒子に基づくアッセイと比較して、毛細管現象試験の感度を高めることができる。実際、発光（ルミネッセンス）の検出は一般的に、吸収の検出よりも感度が高く（金ナノ粒子の場合のように）、後者は透過光のより高いバックグラウンドに対して行われる（例えば、有機フルオロフォアに関しては［９］、［１０］および［１１］、ＱＤに関しては［１１］～［１７］、［５０］）。
【0015】
残念ながら、これらのフォトルミネッセンスプローブにはいくつかの欠点があるため、ストリップ試験のプローブとしての可能性を十分に活用することができない。これらの欠点の中で、例えば、有機フルオロフォアの場合、照明により不可逆的な構造変化が生じた後、蛍光の消失に反映されるフォトブリーチング現象、あるいは半導体ナノ結晶、または「量子ドット」の場合、発光が瞬く現象があり、プローブは周期的に発光を停止し、その結果、一定の再現性のあるシグナルを生成するのに適していない。他の欠点は、例えば、ルミネッセンスプローブの発光スペクトルの幅に起因する。実際、発光スペクトルが広すぎると、存在する可能性のあるバックグラウンドシグナルをフィルタリングすることが困難になり、これがシグナルの品質、特にシグナル対ノイズ比に影響を与える。生物学的アッセイにおけるプローブの効率に寄与する光学的要因に加えて、プローブの実用的特性および使いやすさも考慮に入れる必要がある。したがって、特定の粒子は、半導体ナノ結晶の場合のように、凍結後にルミネッセンス特性を失うため、バイオコンジュゲート半導体ナノ結晶の保存の欠点を表している。プローブの分子化合物への結合の容易さにより、所望の分子を標的にすることもまた、適切なプローブを選択する際に考慮すべき側面である。したがって、半導体ナノ結晶を含む特定の数の粒子が有機溶媒中で合成される。生物学的用途への使用は、これらの粒子を水中に分散させるための表面処理の追加ステップを必要とすることになるが、このプロセスは、実施するのが複雑であり、時間の経過とともに不安定になる可能性がある（［１８］）。実際、半導体ナノ結晶に使用される表面官能化には、ナノ結晶の表面との共有結合は伴わない。したがって、官能化分子は分離し、プローブとして機能するナノ結晶の分析物（抗体または他のもの）と特異的に結合する試薬の解離を引き起こす可能性がある。したがって、これらのナノ結晶を分析物の特定の結合試薬に結合させるには、官能化のタイプに応じて、数週間から数ヶ月かかる場合がある。しかし、毛細管現象試験を商業的に使用するには、プローブ結合試薬コンジュゲートをテストストリップに沈着させてから２年程度の安定性を必要とする。
【0016】
これらのルミネッセンスプローブのもう一つの欠点は、ルミネッセンスを検出するために必要な励起が寄生光の発光を引き起こす可能性があり、その結果、バックグラウンドシグナルが増加し、その結果、シグナル対ノイズ比が低下することである。寄生発光からこのシグナルを除去する、または少なくとも低減するための様々なアプローチが提案されており、例えば、ルミネッセンスの遅延検出と組み合わせたランタニドイオンのキレートまたは錯体を含むルミネッセンスナノ粒子の使用、アップコンバージョンナノ粒子、または他の永続的なルミネッセンスを有するナノ粒子などが提案されている。
【0017】
したがって、ランタニドのキレートまたは錯体を担持したルミネッセンス粒子は、毛細管現象試験におけるルミネッセンスプローブとしてすでに提案されている。
【0018】
例えば、Ｚｈａｎｇら（［１９］）は、ランタニド（Ｅｕ）キレートを担持したシリカナノ粒子を、移動ストリップ試験における細菌トウモロコシ萎ちょう細菌病菌（Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）（Ｐｓｓ）を検出するためのプローブとして使用することを提案している。これらのプローブは、金粒子を使用する従来のアッセイで得られる検出限界の１００分の１の検出限界を達成することを可能にすると述べられている。さらに、Ｘｉａら（［２０］）は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を検出するためのラテラルフローアッセイで、ユウロピウムキレートを担持したシリカ粒子を使用している。
【0019】
本発明者らはまた、血清サンプル中のα－フェトプロテイン（ＡＦＰ）を検出するために、または前立腺特異抗原（ＰＳＡ）およびビオチン化ウシ血清アルブミン（ビオチン－ＢＳＡ）を検出するために、ラテラルフローアッセイでユウロピウムキレートを担持したポリスチレン微粒子を使用することを提案している、Ｌｉａｎｇら（［２１］）およびＪｕｎｔｕｎｅｎら（［２２］）の著作を引用することができる。文献国際公開第２０１３／０１３２１４号および国際公開第２０１４／１４６２１５号はまた、テルビウムおよび／またはユウロピウムのキレートを担持したポリスチレンナノスフェアをラテラルフローアッセイストリップのプローブとして使用することを提案している。
【0020】
また、文献国際公開第２０１４／１４６２１５号で、ランタニドイオンのキレートまたは錯体を含むこれらのナノ粒子の長寿命発光（１００μｓのオーダー）を利用して、寿命が一般的に１～１０ｎｓのオーダーである寄生発光を回避することを可能にする遅延検出を実施することが提案されている。
【0021】
しかし、ルミネッセンスプローブとして使用されるランタニドのキレートまたは錯体を担持したルミネッセンス粒子は、典型的には、キレートまたは錯体あたり単一のランタノイドイオンのみを含む。各キレートまたは錯体は、ナノ粒子またはマイクロ粒子内で無視できないスペースを占有し、これにより、与えられた粒子サイズに対応する発光イオンの数が制限される。例えば、４５ｎｍのナノ粒子には、１０００個程度のキレートおよび発光イオンのみを含む［４７］。さらに、ランタニドイオンの錯体またはキレートを含むこのタイプの粒子の合成は、錯体またはキレートを合成し、次いで、キレートを含む粒子を合成するという少なくとも２つのステップを含む。したがって、このタイプの粒子の合成は複雑であり、したがって比較的高価である。最後に、このタイプの粒子の安定性も疑問視されている（［２３］）。
【0022】
近年、希土類に基づく別のタイプのルミネッセンスナノ粒子が、バイオイメージング、特に毛細管現象試験の用途でルミネッセンスプローブとして提案されており、これらは、赤外または近赤外源による励起下で可視光を放出するアップコンバージョン蛍光体のナノ粒子である（例えば、［２４］～［２９］）。これらのアップコンバージョンナノ粒子を使用する状況では、検出されたシグナルに対応するルミネッセンス発光が観察される前に、２つの光子がナノ粒子によって吸収される。例として、本発明者らは、ＵＰＴタイプ（「アップコンバート蛍光体技術」」）のプローブを使用したラテラルフローアッセイストリップを提案し、酵素結合免疫吸着検定法よりも高い検出感度に到達することを可能にする、Ｎｉｅｄｂａｌａら（［３０］）の著作に言及することができる。この種のアップコンバージョンルミネッセンスプローブは、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１７０６７４号で提案されているラテラルフローアッセイ用のデバイスで使用されている。
【0023】
これらのアップコンバージョン蛍光体は、特に、前述のルミネッセンスプローブと比較して、フォトブリーチング現象に対して抵抗性を示し、バックグラウンドノイズを引き起こす寄生蛍光が少ないという利点がある。実際、励起は、検出波長よりも低い波長で行われるため、サンプルに含まれる補助物質または多孔質固体支持体による発光は事実上存在しない。
【0024】
残念ながら、これらのアップコンバージョン蛍光体には、量子収率が低いという大きな欠点があり、その効率は、励起源の低い光出力密度に対してかなり低下し、ルミネッセンスは励起の出力密度の二乗に比例する。さらに、試験バンド、および場合により対照バンドを含むかなり広いゾーンを励起する必要があり、これにより、所与の出力に対する励起の出力密度が低下する。したがって、この種のルミネッセンスプローブを用いた試験の読み取りには、励起用のレーザーダイオードと、レンズ、フィルタ、光電子増倍管、プリアンプなどの他の要素を組み合わせた複雑な機器が必要となる。
【0025】
最後に、永続的なルミネッセンスを放出する無機ナノ粒子も、励起によって誘発される寄生ルミネッセンスを回避するために提案されてきた。これらの無機ナノ粒子は、ドーパントとしてランタニドイオンを含む結晶性マトリックスから形成される。永続的なルミネッセンスを伴うナノ粒子の特定の特徴は、ドーパントが結晶の電子構造にトラップ状態を導入し、励起された電荷がそこにトラップされることである。したがって、これらのナノ粒子によるルミネッセンス発光は、これらのトラップ状態から電荷が放出された後にのみ発生する可能性があり、この放出は熱活性化によって発生する（［３１］）。電子構造内のこれらのトラップ状態のエネルギーに応じて、つまりトラップの深さに応じて、熱活性化、したがって発光の寿命は、数時間または数日に達する可能性がある。したがって、ナノ粒子を励起し、励起が停止した後、適切なリーダに毛細管現象試験デバイスを挿入し、励起がない場合、したがって寄生発光がない場合にルミネッセンスを検出することによってアッセイを読み取ることができる。例えば、Ｐａｔｅｒｓｏｎら（［３２］）により、金ナノ粒子で得られたものと比較して大幅に改善された検出感度が得られた（検出限界は金ナノ粒子で得られたものの約１０分の１）。また、これにより、読み取りに発光フィルタを使用する必要がなくなる。
【0026】
しかし、このシステムには、発光からのシグナルの取得時間が長いという欠点がある。実際、これらのナノ粒子による発光は、状況に応じて数分間、特に数時間、さらには数日間行われるため、発光した光子の数のうち無視できないほどの割合を収集するためには、この寿命に相当する時間を待つ必要がある。したがって、単位時間、例えば１秒あたりでは、発光する光子の数は少なくなり、その結果、高レベルの感度に到達するために、ルミネッセンスの取得時間を長くする必要がある。このような取得時間は、迅速な診断を提供するという毛細管現象試験の目的に反している。この問題に対処するために、励起出力を上げることができるが、しかし、複雑な機器が必要であり、コンパクトで安価なアッセイシステムの要件を満たさない。
【0027】
最後に、ユウロピウムとビスマスを共ドープしたＹＶＯ４ナノ粒子が、毛細管現象試験の別の変形で使用された（［３３］）。ビスマスの存在により、バナジン酸イオンＶＯ４
３－内の電荷移動遷移Ｏ２－－Ｖ５＋により、２８０ｎｍでの吸収ピークを有するＹＶＯ４マトリックスの吸収が、電荷移動遷移Ｂｉ３＋－Ｖ５＋の出現により、可視にシフトすることが可能になり、したがって、３５０ｎｍ付近のより一般的な励起源を使用できるようになる。次いで、励起はＥｕ３＋イオンに伝達される。しかし、このアプローチには、これらのナノ粒子を複雑に合成するという欠点がある。特に、結晶構造が異なるＹＶＯ４とＢｉＶＯ４の均質な固溶体を生成することは困難である（［３４］）。これには、より複雑な装置（オートクレーブ）を必要とする高温での水熱合成（［３３］）、または熟成プロセス（［３４］）のいずれかに頼る必要がある。
【0028】
したがって、毛細管現象試験のためにこれまでに提案されたプローブはどれも完全に満足できるものではない。特に、金ナノ粒子に基づく毛細管現象システムよりもはるかに感度の高い検出を提供する、非常に発光性が高く、合成の複雑さが少なく、合成が安価であるプローブと、肉眼で読み取るためのシステムまたはコンパクトで安価なリーダと組み合わせることが可能な、毛細管現象試験デバイスでの使用と互換性のあるプローブが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【0029】
本発明は、正確には、毛細管現象試験で使用することができ、この必要性を満たす新規なルミネッセンスプローブを提案することを目的としている。
【0030】
より具体的には、毛細管現象試験による分析方法のプローブとして、制御された光学的および物理化学的特性を備えた、希土類イオンをドープしたルミネッセンスナノ粒子の使用を提案している。
【0031】
したがって、本発明は、以下の式（Ｉ）のフォトルミネッセンス無機ナノ粒子をプローブとして使用して、毛細管現象試験によって、液体サンプル中の目的の生物学的または化学的物質を検出および／または定量化するためのインビトロ方法を記載し、
（Ａ１－ｘＬｎｘ）ａ（ＭｐＯｑ）（Ｉ）
式中、
Ｍは、酸素（Ｏ）と結合して結晶性化合物を形成できる１つまたは複数の元素を表し、
Ｌｎは、１つまたは複数のルミネッセンスランタニドイオンに対応し、
Ａは、その電子レベルがルミネッセンスプロセスに関与しない結晶性マトリックスの一部を形成する１つまたは複数のイオンに対応し、
０＜ｘ＜１、および
ｐ、ｑ、およびａの値は、（Ａ１－ｘＬｎｘ）ａ（ＭｐＯｑ）の電気的中性が守られる値であり、
当該方法は、一光子吸収後、ナノ粒子の発光寿命が１００ミリ秒より短いルミネッセンスを検出することを使用している。
（Ａ１－ｘＬｎｘ）ａ（ＭｐＯｑ）（Ｉ）
式中、
Ｍは、酸素（Ｏ）と結合して結晶性化合物を形成できる１つまたは複数の元素を表し、
Ｌｎは、１つまたは複数のルミネッセンスランタニドイオンに対応し、
Ａは、その電子レベルがルミネッセンスプロセスに関与しない結晶性マトリックスの一部を形成する１つまたは複数のイオンに対応し、
０＜ｘ＜１、および
ｐ、ｑ、およびａの値は、（Ａ１－ｘＬｎｘ）ａ（ＭｐＯｑ）の電気的中性が守られる値であり、
当該方法は、一光子吸収後、ナノ粒子の発光寿命が１００ミリ秒より短いルミネッセンスを検出することを使用している。
【0032】
より具体的には、その第１の態様によれば、本発明は、以下の式（ＩＩ）のフォトルミネッセンス無機ナノ粒子をプローブとして使用して、毛細管現象試験によって、液体サンプル中の目的の生物学的または化学的物質を検出および／または定量化するためのインビトロ方法に関し、
Ａ１－ｘＬｎｘＶＯ４（１－ｙ）（ＰＯ４）ｙ（ＩＩ）
式中、
Ａは、イットリウム（Ｙ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、ランタン（Ｌａ）、ルテチウム（Ｌｕ）、およびそれらの混合物から選択され、
Ｌｎは、ユウロピウム（Ｅｕ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、サマリウム（Ｓｍ）、ネオジム（Ｎｄ）、エルビウム（Ｅｒ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ツリウム（Ｔｍ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ホルミウム（Ｈｏ）、およびそれらの混合物から選択され、
０＜ｘ＜１、特に０．２≦ｘ≦０．６、より具体的にはｘの値は０．４であり、および
０≦ｙ＜１、特にｙの値は０であり、
当該方法は、一光子吸収後、ナノ粒子の発光寿命が１００ｍｓ未満のルミネッセンスを、３２０ｎｍ以下の波長でマトリックスを励起することによって検出することを使用している。
Ａ１－ｘＬｎｘＶＯ４（１－ｙ）（ＰＯ４）ｙ（ＩＩ）
式中、
Ａは、イットリウム（Ｙ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、ランタン（Ｌａ）、ルテチウム（Ｌｕ）、およびそれらの混合物から選択され、
Ｌｎは、ユウロピウム（Ｅｕ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、サマリウム（Ｓｍ）、ネオジム（Ｎｄ）、エルビウム（Ｅｒ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ツリウム（Ｔｍ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ホルミウム（Ｈｏ）、およびそれらの混合物から選択され、
０＜ｘ＜１、特に０．２≦ｘ≦０．６、より具体的にはｘの値は０．４であり、および
０≦ｙ＜１、特にｙの値は０であり、
当該方法は、一光子吸収後、ナノ粒子の発光寿命が１００ｍｓ未満のルミネッセンスを、３２０ｎｍ以下の波長でマトリックスを励起することによって検出することを使用している。
【0033】
特に、ルミネッセンスの検出は、マトリックスＡＶＯ４（１－ｙ）（ＰＯ４）ｙ、例えばＹＶＯ４を、３００ｎｍ以下、特に２５０～３００ｎｍの波長で励起することによって有利に行われる。
【0034】
したがって、本発明の方法によれば、検出されたシグナルは、単一光子の吸収後のフォトルミネッセンスナノ粒子によるルミネッセンス発光、言い換えれば、励起波長よりも長い波長での発光に対応する。単一光子の吸収後のルミネッセンス発光は、上記の「アップコンバージョン」粒子の場合のように、二光子吸収のための粒子によるルミネッセンス発光を検出する場合とは異なる。
【0035】
これらのナノ粒子は、以下に説明するように、分析される物質を認識することができる認識分子（抗体、核酸、ペプチド、アプタマーなど）で官能化されている。
【0036】
本発明の意味において、サンプル中の物質の「分析」は、当該物質の有無の検出または定性的特徴付けの側面、ならびに当該物質の決定または定量的特徴付けの側面をカバーする。
【0037】
液体サンプルは、特に生物学的サンプル、特に任意の生物学的流体または体液であってもよい。例えば、液体サンプルは、血液、血清、血漿、唾液、喀痰、鼻汁塗抹標本、尿、希釈された糞便、腟塗抹標本または脳脊髄液から選択される、ヒトから採取されたサンプルであってもよい。
【0038】
また、液体サンプルは、例えば、環境サンプルまたは農産物および食品からのサンプルなどの、生物学的分子、化学分子あるいは病原性ウイルスまたは細菌を含む溶液であってもよい。
【0039】
本発明の方法は、特に、サンプル中、特に生物学的サンプル中の分子、タンパク質、核酸、毒素、ウイルス、細菌または寄生虫を検出および／または定量化するために使用することができる。
【0040】
方法は、例えば、バイオマーカー、抗体、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭなど）、抗原の存在を検出するために使用することができ、また、抗原は、生物学的サンプル中のウイルス、細菌または寄生虫を構成する生体分子であってもよい。
【0041】
また、抗原は、例えば、科学警察の捜査についての目的の分子、例えば、薬物などの違法な化学物質、または防衛上の目的の物質（バイオテロ剤）であってもよい。
【0042】
また、抗原は、食品の安全性（サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの病原菌、またはノロウイルスなどのウイルスまたはアレルゲン）、または環境、例えば汚染物質（農薬）についての目的の物質であってもよい。
【0043】
本発明による毛細管現象試験によって分析することを目的とする、目的の生物学的または化学的物質は、以下、より簡単に「分析される物質」または「分析物」という表現で表す。
【0044】
本発明によるルミネッセンス無機ナノ粒子を、例えばテストストリップなどの毛細管現象試験デバイスにおけるプローブとして使用することは、いくつかの点で特に有利であることが証明されている。
【0045】
第一に、本発明により使用される、以下により詳細に記載される式（Ａ１－ｘＬｎｘ）ａ（ＭｐＯｑ）（Ｉ）の希土類イオンをドープしたナノ粒子、例えば、タイプＹＶＯ４：ＥｕまたはＧｄＶＯ４：Ｅｕ、ＹＡＧ：Ｃｅのナノ粒子、特に式Ａ１－ｘＬｎｘＶＯ４（１－ｙ）（ＰＯ４）ｙ（ＩＩ）のナノ粒子は、特に、その優れた光安定性に関して特に有利な特性を有しており、この特性により、長時間の一定のシグナルの取得が可能となり、発光が瞬く現象をなくすことが可能となる。
【0046】
さらに、これらのナノ粒子は、凍結後にルミネッセンスを失うことはない。
【0047】
希土類をドープしたバナジン酸イットリウムに基づくナノ粒子は、例えば、Ｒｉｗｏｔｚｋｉら（［４５］）およびＨｕｉｇｎａｒｄら（［４６］）によって詳細に記述されている。文献欧州特許第１ ２８２ ８２４号に関しては、生物学的物質または他の有機物質を検出するためのプローブとして、表面修飾無機ルミネッセンスナノ粒子の使用について記載されている。
【0048】
しかし、本発明者らが知る限り、希土類イオンをドープし、永続的なルミネッセンスを有する粒子とは異なり、単一光子を吸収した後に発光する、上記で定義されたフォトルミネッセンス無機ナノ粒子を、毛細管現象試験におけるルミネッセンスプローブとして利用することが提案されたことはない。
【0049】
ランタニドイオンに基づくこれらのナノ粒子が、化学的または生物学的物質の検出および定量化、特に毛細管現象試験において使用できること、さらに、それらが試験の感度の点で性能の向上につながることは、まったく予見できなかった。
【0050】
実際、瞬きがないことを除けば、希土類に基づくナノ粒子のルミネッセンス特性は、量子ドットのルミネッセンス特性より劣っていると考えられている。希土類イオンをドープしたこれらのナノ粒子、特に金属酸化物マトリックスからなるナノ粒子において、ルミネッセンスの励起は、マトリックスの直接励起によって、またはまれに、ルミネッセンス希土類イオンの可視光での直接励起によって行うことができる。希土類イオンを直接吸収するための吸光係数は一般に非常に低いが、結晶性マトリックスを励起するための吸光係数ははるかに高くなる（［３５］）。
【0051】
しかし、結晶性マトリックスの吸収帯は一般的に紫外域に位置しており、これが大きな欠点となっており、生体分子ならびに毛細管現象デバイスの様々なコンポーネント（例えば、毛細管拡散膜）も紫外域で強く吸収される。例えば、バナジン酸イオンＶＯ４
３－に基づくマトリックスの場合、２８０ｎｍにおける吸収ピークは、タンパク質の吸収、特にトリプトファンアミノ酸の吸収と一致する。その結果、希土類イオンをドープした結晶性マトリックスに基づくナノ粒子のルミネッセンスの励起は、特に紫外域で、大きな副次的な発光シグナルを生成する傾向がある。このような寄生発光は、分子の複雑な混合物から低強度のシグナルを正確に識別することを目的とする毛細管流ストリップ試験などの体外診断試験の目的とは相容れない。
【0052】
すべての予想に反して、本発明者らは、紫外域での励起、特に３５０ｎｍ以下、有利には３２０ｎｍ以下、より有利には２５０ｎｍ～および３２０ｎｍ、特に２５０ｎｍ～３００ｎｍの励起の条件であっても、本発明による希土類に基づくこれらのフォトルミネッセンスナノ粒子を、毛細管現象試験タイプの体外診断技術におけるプローブとして使用することが可能であることを発見した。
【0053】
理論に縛られることを望まずに、本発明者らは、寄生発光からの強いシグナルが存在するにもかかわらず、使用されたナノ粒子に特有の以下の３つの光学特性により、紫外域で励起されたナノ粒子のルミネッセンスの検出が、毛細管現象試験で可能であることを発見した。ｉ）非常に大きなサイズのナノ粒子に頼る必要がない、本発明のナノ粒子に含まれる多数のルミネッセンスランタニドイオン、ｉｉ）一般的に非常に広いスペクトルを有する寄生発光を効果的に除去することを可能にする希土類イオンの狭い発光スペクトル、およびｉｉｉ）大きなストークスシフト（吸収ピークと発光ピークの間のシフト）、典型的にはＥｕをドープしたＹＶＯ４またはＧｄＶＯ４ナノ粒子についての約３５０ｎｍのストークスシフト（バナジン酸マトリックスの２８０ｎｍでの吸収ピークとＥｕの６１７ｎｍでの発光ピーク）であり、これは、一般的に小さなストークスシフトを有する移動サポートまたは分析される物質を含むサンプルに起因する励起波長と寄生発光の効果的な除去を可能にする。特に、このストークスシフトが大きいということは、検出には、干渉フィルタよりも安価な、単純なハイパスフィルタを使用することが可能であることを意味している。
【0054】
したがって、寄生発光の効果的な除去、および所望の検出感度を達成するのに十分なシグナル対ノイズ比を有するシグナルの取得を得ることが可能である。
【0055】
さらに、すべての予想に反して、３８０ｎｍでの励起よりも非常に低い、３２０ｎｍ以下、特にバナジン酸マトリックスの吸収ピークが位置する２８０ｎｍ付近（図１１（Ａ）参照）または３００ｎｍでの励起は、ラテラルフローアッセイに通常使用されるニトロセルロース膜に関連した寄生発光を誘導することが判明した（図１１（Ｂ）参照）。ランタニドイオンをキレート化または錯体化する分子が、典型的には３２０ｎｍ（［４７］）～４００ｎｍ（［４８］）を吸収することを知っていると、２５０ｎｍ～３００ｎｍ、特に２６０ｎｍ～３００ｎｍを吸収するマトリックスを使用することは、さらなる利点を提供する。
【0056】
特に、２８０ｎｍを中心とするＹＶＯ４またはＧｄＶＯ４の結晶または３００ｎｍを中心とするＬａＶＯ４の結晶におけるバナジン酸イオンＶＯ４
３－内のＯ２－－Ｖ５＋電荷移動吸収に加えて（［４０］）、Ｅｕを含むナノ粒子の場合、Ｏ２－－Ｅｕ３＋電荷移動に関連する別の吸収が可能であり、２６０ｎｍを中心とする吸収につながる。後者は、例えば、Ｌａ２Ｈｆ２Ｏ７：Ｅｕ、Ａ２Ｈｆ２Ｏ７（Ａ＝Ｙ、Ｇｄ、Ｌｕ）およびＬａ２Ｚｒ２Ｏ７：Ｅｕナノ粒子で観察される（［４１］）。
【0057】
さらに、以下に示す例に示すように、本発明の方法は、検出感度に関して、少なくとも１桁、またはそれ以上に改善された毛細管現象試験の性能に到達することを可能にする。
【0058】
特に、定性分析（サンプル中の分析物の有無）だけでなく、半定量分析および定量分析も可能にする。
【0059】
したがって、本発明はさらに、毛細管現象試験デバイスにおけるプローブとして、上記で定義されたナノ粒子を使用して、当該毛細管現象試験デバイスの検出感度を高めることに関する。
【0060】
フォトルミネッセンスナノ粒子は、プローブとして、図２に模式的に示されるようないわゆる「サンドイッチ」アッセイであっても、図３に示されるようないわゆる「競合」アッセイであっても、任意の既知のタイプの毛細管現象試験、例えばラテラルフローアッセイにおいて使用することができる。フォトルミネッセンスナノ粒子は、特に、毛細管現象試験デバイスの支持体の特性を変更する必要なしに、ルミネッセンスプローブとして、これまでは金ナノ粒子を用いて提案された毛細管現象試験デバイスで使用するのに適している。
【0061】
特に、以下に示す例に示されるように、本発明によるフォトルミネッセンスナノ粒子は、例えば、金ナノ粒子の平均サイズと同様の約３０～５０ｎｍの平均サイズを有し得、その結果、このサイズの粒子の移動に適した毛細管現象手段、典型的にはニトロセルロース膜に適合している。
【0062】
あるいは、本発明によるフォトルミネッセンスナノ粒子は、より大きくてもよく、したがって、ルミネッセンスシグナルを最適化することが可能になる。実際、ランタニドイオンの数はナノ粒子の体積とともに増加するため、放出されるルミネッセンスシグナルは、球形粒子の半径の３乗に応じて増加する。この場合、ラテラルフローアッセイの移動サポートには、選択したナノ粒子のサイズに適合した細孔を含んでもよい。可変孔径を有する膜は、例えば、市販されている（例えば、ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社によって、参照ＨＦ０７５、ＨＦ０９０、ＨＦ１２０、ＨＦ１３５、ＨＦ１８０の下で販売されている可変孔径を有する膜）。
【0063】
より大きなナノ粒子は、例えば、例示されるように粒子の遠心分離によってサイズを分類し、サイズ分布において、最大サイズの粒子のみを保持することによって得られてもよく、またはバルク材料を粉砕することによって得られてもよい。当業者によって知られている他の任意の技術も使用することができる。
【0064】
さらに、例示したように、本発明のナノ粒子は、金粒子の粒子サイズと同様の粒子サイズを維持しながら、ルミネッセンスを生じさせる多数の、特に、ランタニドのキレートまたは錯体に基づく粒子の場合よりも著しく多くのイオンを有し、したがって、高強度の発光シグナルを生成することが可能となり、その結果、改善された感度を達成することが可能となる。
【0065】
有利なことに、本発明による検出方法は、定性的測定を、金ナノ粒子をプローブとして使用するまったく同一のアッセイの検出限界の１０分の１まで、特に１００分の１まで、さらには１０００分の１まで可能にする。
【0066】
最後に、毛細管現象試験におけるプローブとしての本発明によるナノ粒子の使用は、ランタニドのキレートを担持した粒子で得られた結果と比較して、感度に関して、改善された性能さえもたらす。
【0067】
その別の態様によれば、本発明は、液体サンプル中の目的の生物学的または化学的物質を検出および／または定量化するのに有用な毛細管現象試験デバイスに関し、当該デバイスは、上記で定義されたフォトルミネッセンス無機ナノ粒子をプローブとして含む。
【0068】
したがって、より正確には、本発明は、液体サンプル中の目的の生物学的または化学的物質を検出および／または定量化するのに有用な毛細管現象試験デバイスに関し、当該デバイスは、式Ａ１－ｘＬｎｘＶＯ４（１－ｙ）（ＰＯ４）ｙ（ＩＩ）のフォトルミネッセンス無機ナノ粒子をプローブとして含み、式中、Ａ、Ｌｎ、ｘ、およびｙは、上記の通りであり、当該ナノ粒子は、３２０ｎｍ以下、特に３００ｎｍ以下、より具体的には２５０ｎｍ～３００ｎｍの波長でマトリックスを励起することにより、一光子吸収後、１００ｍｓ以下の発光寿命でルミネッセンスを放出することができる。
【0069】
したがって、本発明による毛細管現象試験デバイスは、式（ＩＩ）のフォトルミネッセンス無機ナノ粒子を含み、そのルミネッセンスは、３２０ｎｍ以下、特に３００ｎｍ以下、より具体的には２５０ｎｍ～３００ｎｍの波長でマトリックスを励起することにより、一光子吸収後、１００ｍｓ以下の発光寿命で検出される。
【0070】
より正確には、ラテラルフローアッセイのための既知のデバイスで従来使用されているプローブ、例えば金ナノ粒子のように、本発明によるフォトルミネッセンスナノ粒子は、特に、「標識ゾーン」（英語の用語では、より一般的に「コンジュゲートパッド」と呼ばれる）と呼ばれるアッセイデバイスのゾーンのレベルで、抗体などの分析される物質を特異的に結合する少なくとも１つの試薬に結合された形態で存在する。
【0071】
本発明は、図１に模式的に示されるように、移動ストリップタイプ（英語の呼称「ラテラルフローストリップ」によって知られる）の従来の毛細管現象試験デバイスを参照して、以下により具体的に説明される。当然、本発明の方法は、本発明のフォトルミネッセンスナノ粒子をプローブとして使用するのに適しているという条件で、毛細管現象試験デバイスの他の任意の変形を使用することができる。
【0072】
したがって、典型的には、本発明による毛細管現象試験デバイスは、基準方向に毛細管現象を行うための手段、特にニトロセルロース膜などの多孔質固体支持体を含んでもよく、そのようなニトロセルロース膜は、
液体サンプルを沈着させるためのゾーン、
サンプルを沈着させるためのゾーンの下流に配置され、標識ゾーンまたはカップリングゾーンと呼ばれ、本発明によるフォトルミネッセンス無機ナノ粒子（プローブ）が担持され、分析される物質に特異的な少なくとも１つの「結合試薬」（認識分子）、例えば抗体に結合される、ゾーン、
標識ゾーンの下流に配置され、「検出ゾーン」とも呼ばれ、分析される物質に特異的な抗体などの少なくとも１つの「捕捉試薬」（認識分子）が固定化される、反応ゾーン、
検出ゾーンの下流に位置する、試薬の移動の対照ゾーン、および
場合により、対照ゾーンの下流に配置される吸収パッドを含む。
液体サンプルを沈着させるためのゾーン、
サンプルを沈着させるためのゾーンの下流に配置され、標識ゾーンまたはカップリングゾーンと呼ばれ、本発明によるフォトルミネッセンス無機ナノ粒子（プローブ）が担持され、分析される物質に特異的な少なくとも１つの「結合試薬」（認識分子）、例えば抗体に結合される、ゾーン、
標識ゾーンの下流に配置され、「検出ゾーン」とも呼ばれ、分析される物質に特異的な抗体などの少なくとも１つの「捕捉試薬」（認識分子）が固定化される、反応ゾーン、
検出ゾーンの下流に位置する、試薬の移動の対照ゾーン、および
場合により、対照ゾーンの下流に配置される吸収パッドを含む。
【0073】
毛細管現象試験用のデバイスの例は、以下でより詳細に説明される。
【0074】
液体サンプルは、本発明による毛細管現象試験デバイスを使用して直接分析することができる。本発明の方法による液体サンプルの分析は、典型的には、
（ｉ）毛細管現象試験デバイスの沈着ゾーンのレベルに、分析される液体サンプル、および場合により希釈剤を適用すること、
（ｉｉ）フォトルミネッセンスナノ粒子によって生成されたルミネッセンスが反応ゾーンで検出されるまで、および／またはルミネッセンスが移動対照ゾーンで検出されるまで、デバイスをインキュベートすること、
（ｉｉｉ）結果を読んで解釈することを含む。
（ｉ）毛細管現象試験デバイスの沈着ゾーンのレベルに、分析される液体サンプル、および場合により希釈剤を適用すること、
（ｉｉ）フォトルミネッセンスナノ粒子によって生成されたルミネッセンスが反応ゾーンで検出されるまで、および／またはルミネッセンスが移動対照ゾーンで検出されるまで、デバイスをインキュベートすること、
（ｉｉｉ）結果を読んで解釈することを含む。
【0075】
その別の態様によれば、本発明は、液体サンプル、特に生物学的サンプル中の目的の生物学的または化学的物質を検出および／または定量化するための本発明による毛細管現象試験デバイスの使用に関する。
【0076】
毛細管現象試験デバイスは、試験結果を提供するリーダに結合することができる。
【0077】
以下に詳述するように、結果の読み取りは、毛細管現象試験デバイスの検出ゾーンのレベルで、および該当する場合は対照ゾーンのレベルで、固定化されたナノ粒子によって生成されたルミネッセンスを検出することを含む。
【0078】
より具体的には、
固定化されたフォトルミネッセンスナノ粒子の励起、および
ルミネッセンス発光の検出
によって実行される。
固定化されたフォトルミネッセンスナノ粒子の励起、および
ルミネッセンス発光の検出
によって実行される。
【0079】
特に有利なことに、適切なフィルタのみを使用して毛細管現象試験デバイスを肉眼で読み取ることが可能である。
【0080】
あるいは、ルミネッセンスは、単純な検出装置を使用して、例えば、発光フィルタおよびカメラなどの検出器を使用して読み取ることができる。
【0081】
発光フィルタは干渉フィルタであってもよいが、単純なハイパスフィルタであってもよい。実際、これらの粒子の発光に関連する大きなストークスシフトのために、一般的に小さなストークスシフトを有する寄生発光は、これらのナノ粒子からの発光よりも短い波長に位置するであろう。
【0082】
最後に、本発明による毛細管現象試験デバイスは、多重検出、言い換えれば、同じ毛細管現象試験による、まったく同一のサンプル中のいくつかの物質の同時検出に適している。
【0083】
その別の態様によれば、本発明はさらに、体外診断の目的で、上記で定義された検出方法、または上記で定義された毛細管現象試験デバイスの使用に関する。有利なことに、本発明による毛細管現象試験により、生物学的サンプル中の特定の物質の低含有量を検出することが可能であることは、例えば、疾患の早期の検出、あるいは疾患の進行のまたは治療処置の効果の診断のために本発明の方法を使用することを可能にする。
【0084】
本発明による毛細管現象試験によって診断することができる疾患は限定されず、１つまたは複数の特異的結合パートナー（リガンド、抗体、抗原、相補的核酸、アプタマーなど）が存在する生物学的に関心のあるタイプの分子（タンパク質、核酸、抗体など）である、疾患の特異的マーカーの存在によって明らかにされるすべての疾患を含む。
【0085】
例として、感染症（細菌性、寄生虫性、またはエイズなどのウイルス性）、炎症性および自己免疫性疾患、心臓病、神経性疾患、または腫瘍性疾患（例えば、乳癌または前立腺癌などの固形癌）について言及する場合がある。
【0086】
感度の最大の向上（１００または１０００倍）により、ＥＬＩＳＡアッセイまたはＥＬＩＳＡの変形の１つに近い性能を達成することが可能になる。したがって、本発明の方法は、ＥＬＩＳＡタイプの高感度検出が必要であるが利用できない場合に特に適している。
【0087】
したがって、本発明の方法により、ポイントオブケア（ＰＯＣ）での迅速な診断が可能になる。
【0088】
したがって、本発明の方法は、感染症または他の一般的な疾患の診断のための、例えば発展途上国、地方および／または遠隔地における感染症または他の一般的な疾患の診断に有用である可能性がある。
【0089】
また、本発明の方法は、特に患者の生存が危険にさらされている可能性がある場合（心不全、静脈血栓症、炎症性症候群、全身性細菌感染症（敗血症）、急性膵炎）において、緊急診断を可能にするために、救急医療（ＳＡＭＵ、ＳＭＵＲ救急医療サービス）の状況で特に有用であることが証明される可能性がある。このような状況では、病院に到着する前にＥＬＩＳＡアッセイと同等の感度で迅速なアッセイを実行し、患者の診断と管理にかかる時間を節約し、患者の生存の可能性を高めるために本発明の方法を使用することができる。
【0090】
さらに、本発明による粒子をプローブとして使用する毛細管現象試験による診断は、投与される医薬品の用量を調整するための定期的な診断試験を必要とする患者（例えば、免疫調節剤または免疫抑制剤の場合）に特に有用であり得る。実際、採血や他のより侵襲的な検査による診断ではなく、ストリップ試験を実行することにより、患者の快適さを改善し、診断のコストを削減し、検出／定量化をより短い間隔で実行することが可能になり、したがって、投与される医薬品の用量をより良好に調整することができるという利点がある。
【0091】
当然、本発明の方法は、上記の用途に限定されない。したがって、核酸（例えば、種子中のＧＭＯ）を検出するために、または環境中、例えば水中で、あるいはヒトまたは動物の消費を目的とする食品中の汚染物質または病原体を検出するために使用することができる。
【0092】
したがって、本発明の方法の適用は、免疫学から分子遺伝学、またはＤＮＡおよびＲＮＡの検出にまで及ぶ可能性がある。これは、ナノ粒子に結合した部分的に相補的なフラグメントで、生物学的サンプルのＲＮＡの１つまたは複数のストランドを標識し、次いで、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘタイプのＤＮＡチップと類似したアプローチに従って、ストリップの基質上にグラフトされた別の領域の相補的なフラグメント上でハイブリダイゼーションすることによって検出するために使用することができる。本発明の１つの利点は、これらのアプローチに通常必要とされる増幅ステップがないことである。
【0093】
本発明の方法はまた、違法な化学物質、例えば、薬物、あるいは警察または防衛のための他の目的の物質を検出するために使用することができる。
【0094】
また、農産物または食品中、あるいは環境中の、目的の物質、特に病原体を検出および／または定量化するために使用することができる。
【0095】
本発明による方法および毛細管現象試験デバイスの他の特徴、変形、および利点は、例示の目的で、本発明を限定するものではなく、以下に示す説明、例および図を読むことでより明確になる。
【0096】
以下、「…と…の間」、「…から…までの範囲」および「…から…までの変化」という表現は等価であり、特に明記しない限り、範囲の限界が含まれることを意味することを意図している。
【0097】
特に明記しない限り、「ａ／ｏｎｅを含む」という表現は、「少なくとも１つを含む」と理解されるべきである。
【0098】
フォトルミネッセンス無機ナノ粒子
上記のように、本発明の方法は、毛細管現象試験デバイスのプローブとして、特定の光学的および物理化学的特性を有するフォトルミネッセンス無機ナノ粒子を使用する。
上記のように、本発明の方法は、毛細管現象試験デバイスのプローブとして、特定の光学的および物理化学的特性を有するフォトルミネッセンス無機ナノ粒子を使用する。
【0099】
本発明のフォトルミネッセンスナノ粒子は、希土類イオンをドープした結晶性マトリックスから形成される。「結晶性マトリックス」は、特定の原子が「置換イオン」と呼ばれる他の原子に置き換えられた、代表的な結晶性固体である。置換イオンは、結晶性マトリックスの化学的または物理的特性を変更することを可能にし、特にナノ粒子に高品質の光学発光を与えることを可能にする。
【0100】
本発明のナノ粒子中の希土類イオンは、希土類イオンの錯体またはキレートの形態ではなく、後者は、例えば、Ｙｕａｎらの研究（［３６］）に記載されているように、適切な有機配位子と組み合わせた希土類イオンから形成される。
【0101】
本発明のナノ粒子は、同じ性質または異なる性質の希土類イオンとドープすることができる。
【0102】
より具体的には、それらは、ユウロピウム（Ｅｕ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、サマリウム（Ｓｍ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジム（Ｎｄ）、エルビウム（Ｅｒ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、セリウム（Ｃｅ）、ホルミウム（Ｈｏ）、テルビウム（Ｔｂ）、ツリウム（Ｔｍ）およびそれらの混合物から選択されるランタニドイオンであってもよい。
【0103】
特に、ランタニドイオンは、Ｅｕ、Ｄｙ、Ｓｍ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｅｒ、Ｙｂ、Ｈｏ、Ｔｍおよびそれらの混合物から、特にＥｕ、Ｄｙ、Ｓｍ、Ｙｂ、Ｅｒ、Ｎｄおよびそれらの混合物から、特にＥｕ、Ｄｙ、Ｓｍおよびそれらの混合物から、特にＥｕから選択されてもよい。
【0104】
本発明による毛細管現象試験においてプローブとして使用されるルミネッセンス無機ナノ粒子は、より具体的には、以下の式（Ｉ）のものであり、
（Ａ１－ｘＬｎｘ）ａ（ＭｐＯｑ）（Ｉ）
式中、
Ｍは、酸素（Ｏ）と結合して結晶性化合物を形成できる１つまたは複数の元素を表し、
Ｌｎは、１つまたは複数のルミネッセンスランタニドイオンに対応し、
Ａは、その電子レベルがルミネッセンスプロセスに関与しない結晶性マトリックスの一部を形成する１つまたは複数のイオンに対応し、
０＜ｘ＜１、特に０．１≦ｘ≦０．９、特に０．２≦ｘ≦０．６、特に０．２≦ｘ≦０．４、より具体的にはｘの値は０．４であり、および
ｐ、ｑ、およびａの値は、（Ａ１－ｘＬｎｘ）ａ（ＭｐＯｑ）の電気的中性が守られる値であり、
当該方法は、一光子吸収後、ナノ粒子の発光寿命が１００ミリ秒より短いルミネッセンスを検出、言い換えれば、励起波長よりも長い波長でのルミネッセンスを検出することを使用している。
（Ａ１－ｘＬｎｘ）ａ（ＭｐＯｑ）（Ｉ）
式中、
Ｍは、酸素（Ｏ）と結合して結晶性化合物を形成できる１つまたは複数の元素を表し、
Ｌｎは、１つまたは複数のルミネッセンスランタニドイオンに対応し、
Ａは、その電子レベルがルミネッセンスプロセスに関与しない結晶性マトリックスの一部を形成する１つまたは複数のイオンに対応し、
０＜ｘ＜１、特に０．１≦ｘ≦０．９、特に０．２≦ｘ≦０．６、特に０．２≦ｘ≦０．４、より具体的にはｘの値は０．４であり、および
ｐ、ｑ、およびａの値は、（Ａ１－ｘＬｎｘ）ａ（ＭｐＯｑ）の電気的中性が守られる値であり、
当該方法は、一光子吸収後、ナノ粒子の発光寿命が１００ミリ秒より短いルミネッセンスを検出、言い換えれば、励起波長よりも長い波長でのルミネッセンスを検出することを使用している。
【0105】
Ａは、より具体的には、イットリウム（Ｙ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、ランタン（Ｌａ）、ルテチウム（Ｌｕ）およびそれらの混合物から選択されてもよく、特にＡは、Ｙ、ＧｄまたはＬａ、特にＹまたはＧｄを表し、好ましくはＡはＹを表す。
【0106】
特に、前述の式（Ｉ）のＭは、Ｖ、Ｐ、Ｗ、Ｍｏ、Ａｓ、Ａｌ、Ｈｆ、Ｚｒ、Ｇｅ、Ｔｉ、ＳｎおよびＭｎから選択される１つまたは複数の元素を表すことができる。本発明により使用されるナノ粒子の結晶性マトリックスは、１つまたは複数のタイプのアニオンＭｐＯｑを組み込むことができる。
【0107】
好ましくは、Ｍは、Ｖ、Ｐ、Ａｌ、Ｈｆ、Ｚｒ、Ｇｅ、Ｔｉ、ＳｎおよびＭｎから選択される１つまたは複数の元素を表す。
【0108】
特に、Ｍは、Ｖ１－ｙＰｙを表し、ｙは０～１の範囲である。より具体的には、Ｍは、Ｖを表すことができる。
【0109】
特定の実施形態によれば、前述の式（Ｉ）のｐは、ゼロとは異なる。
【0110】
一例として、本発明のナノ粒子は、ＭがＶおよび／またはＰを表し、ｐの値が１である式（Ｉ）のナノ粒子であってもよいため、当該ナノ粒子のマトリックスＡａ（ＭｐＯｑ）は、ＶＯ４
３－および／またはＰＯ４
３－アニオンを含む。
【0111】
別の特定の実施形態によれば、本発明のナノ粒子は、ＭがＨｆまたはＺｒ、Ｇｅ、Ｔｉ、Ｓｎ、Ｍｎを表し、ｐの値が２であり、ｑの値が７である式（Ｉ）のナノ粒子であってもよいため、当該粒子のマトリックスは、ＡａＨｆ２Ｏ７、ＡａＺｒ２Ｏ７、ＡａＧｅ２Ｏ７、ＡａＴｉ２Ｏ７、ＡａＳｎ２Ｏ７またはＡａＭｎ２Ｏ７である。特に、Ａは、Ｌａ、Ｙ、Ｇｄ、またはＬｕを表すことができ、その場合はａ＝２である。
【0112】
別の実施形態の例では、ＭがＡｌを表し、ＡがＹまたはＬｕを表し、ｐの値が５であり、ｑの値が１２であるため、当該ナノ粒子のマトリックスＡａ（ＭｐＯｑ）は、ガーネットＹ３Ａｌ５Ｏ１２（ＹＡＧ）またはＬｕ３Ａｌ５Ｏ１２（ＬｕＡＧ）である。
【0113】
別の実施形態の例では、ｐの値がゼロであり、ＡがＹまたはＧｄを表すため、当該ナノ粒子のマトリックスＡａ（ＭｐＯｑ）は、タイプＹ２Ｏ３またはＧｄ２Ｏ３のものである。
【0114】
したがって、変形実施形態によれば、毛細管現象試験で使用されるルミネッセンス無機ナノ粒子は、式Ｇｄ２Ｏ３：Ｌｎのものであり、式中、Ｌｎは、１つまたは複数のルミネッセンスランタニドイオンを表し、特に上記で定義されるように、Ｌｎイオンを有するナノ粒子のドーピングのレベルは、１０％～９０％、特に２０％～６０％、特に２０％～４０％、より具体的には４０％である。
【0115】
この変形実施形態の文脈において、ルミネッセンスは、２５０ｎｍ未満の波長でのマトリックスの励起によって検出することができる［５１］。
【0116】
本発明によるナノ粒子の結晶性マトリックスのイオン、特に金属酸化物マトリックスのイオンの希土類イオンでの置換の程度は、より具体的には１０％～９０％、特に２０％～６０％、特に２０％～４０％、より具体的には４０％であってもよい。
【0117】
このような高レベルのドーピングを選択することは、直感に反していた。実際、一般に、希土類イオンをドープしたルミネッセンスナノ粒子の通常のドープレベルは、より高濃度で発生する「消光」効果を回避するために、１０％以下の値に維持されている（［４２］～［４４］）。
【0118】
有利なことに、本発明によるナノ粒子の不完全な結晶化度は、以下により詳細に説明されるように、「消光」効果を回避することを可能にする。
【0119】
本発明によるフォトルミネッセンスナノ粒子の別の特徴によれば、それらは、検出されたシグナルに対応する単一の光子の吸収後にルミネッセンスを放出することができる。
【0120】
さらに、本発明のナノ粒子によるルミネッセンス発光は、いわゆる永続的なルミネッセンスを有するナノ粒子（［３２］）とは対照的に、「トラップ」状態を伴わない。
【0121】
したがって、本発明のナノ粒子は、１００ミリ秒より短い、言い換えれば、厳密に１００ミリ秒未満のルミネッセンス発光寿命を有する（［３５］、［３９］、［４９］）。
【0122】
発光寿命は、発光するナノ粒子、より具体的には発光する希土類イオンの励起状態の寿命として理解されるべきであり、実際には、励起の停止後のルミネッセンス発光光子の持続時間、または励起停止後のルミネッセンスの指数関数的減衰の特徴的な時間によって決定される。
【0123】
発光するナノ粒子の発光寿命は、ナノ粒子の光分解またはフォトブリーチング前のルミネッセンス発光時間とは異なる。
【0124】
本発明により使用されるナノ粒子は、より具体的には、１００ミリ秒未満、または１０ミリ秒未満、あるいは１ミリ秒未満の発光寿命を有する。
【0125】
有利なことに、本発明により使用されるナノ粒子は、５μｓ以上、特に１０μｓ以上、特に２０μｓ以上、または５０μｓ以上の発光寿命を有する。
【0126】
本発明の粒子の発光寿命（Ｙ１－ｘＥｕｘＶＯ４粒子の場合、ナノ秒のオーダーの通常のフルオロフォアの寿命と比較して、数百μｓ）を利用して、複雑でなく安価な材料を使用した、十分な時間分解能（１０μｓのオーダー、または１００μｓのオーダー）で時間分解検出、特に発光の遅延検出を行うことが可能である。例えば、励起に使用できるＬＥＤ（発光ダイオード）の電流を変調し、ストリップの画像を１枚だけでなく一連の画像を記録し、短い寿命（１０ｎｓ以下のオーダー）の残留寄生発光を除去するように、シグナルを時間の関数として分析することが可能である。
【0127】
変形実施形態によれば、本発明により使用されるフォトルミネッセンスナノ粒子は、以下の式（ＩＩ）のものであってもよく、
Ａ１－ｘＬｎｘＶＯ４（１－ｙ）（ＰＯ４）ｙ（ＩＩ）
式中、
Ａは、イットリウム（Ｙ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、ランタン（Ｌａ）、ルテチウム（Ｌｕ）、およびそれらの混合物から選択され、特にＡは、Ｙを表し、
Ｌｎは、ユウロピウム（Ｅｕ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、サマリウム（Ｓｍ）、ネオジム（Ｎｄ）、エルビウム（Ｅｒ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ツリウム（Ｔｍ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ホルミウム（Ｈｏ）、およびそれらの混合物から選択され、好ましくはＬｎは、Ｅｕを表し、
０＜ｘ＜１、特に０．２≦ｘ≦０．６、より具体的にはｘの値は０．４であり、および
０≦ｙ＜１、特にｙの値は０であり、
当該方法は、一光子吸収後、ナノ粒子からの１００ミリ秒より短い寿命を有するルミネッセンスの検出を使用している。
Ａ１－ｘＬｎｘＶＯ４（１－ｙ）（ＰＯ４）ｙ（ＩＩ）
式中、
Ａは、イットリウム（Ｙ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、ランタン（Ｌａ）、ルテチウム（Ｌｕ）、およびそれらの混合物から選択され、特にＡは、Ｙを表し、
Ｌｎは、ユウロピウム（Ｅｕ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、サマリウム（Ｓｍ）、ネオジム（Ｎｄ）、エルビウム（Ｅｒ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、ツリウム（Ｔｍ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ホルミウム（Ｈｏ）、およびそれらの混合物から選択され、好ましくはＬｎは、Ｅｕを表し、
０＜ｘ＜１、特に０．２≦ｘ≦０．６、より具体的にはｘの値は０．４であり、および
０≦ｙ＜１、特にｙの値は０であり、
当該方法は、一光子吸収後、ナノ粒子からの１００ミリ秒より短い寿命を有するルミネッセンスの検出を使用している。
【0128】
特定の実施形態によれば、本発明により使用されるナノ粒子は、ｙの値が０である前述の式（ＩＩ）に対応する。言い換えれば、ナノ粒子は、式Ａ１－ｘＬｎｘＶＯ４（ＩＩＩ）のものであってもよく、式中、Ａ、Ｌｎおよびｘは、上記で定義された通りである。
【0129】
前述の式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）において、Ａは、より具体的には、イットリウム（Ｙ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、ランタン（Ｌａ）およびそれらの混合物から選択されてもよい。特に、Ａは、ＹまたはＧｄを表す。特定の実施形態によれば、前述の式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）において、Ａは、イットリウム（Ｙ）を表す。
【0130】
前述の式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）において、Ｌｎは、より具体的には、ユウロピウム（Ｅｕ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、サマリウム（Ｓｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）、エルビウム（Ｅｒ）、ネオジム（Ｎｄ）およびそれらの混合物から選択されてもよい。特に、Ｌｎは、Ｅｕ、Ｄｙ、Ｓｍおよびそれらの混合物から選択される。別の特定の実施形態によれば、前述の式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）において、Ｌｎは、Ｅｕを表す。
【0131】
したがって、変形実施形態によれば、本発明によるルミネッセンスプローブとして使用されるナノ粒子は、式Ｙ１－ｘＥｕｘＶＯ４（ＩＶ）のものであり、式中、０＜ｘ＜１、特に０．２≦ｘ≦０．６、より具体的にはｘの値は０．４である。
【0132】
変形実施形態によれば、対応する電子遷移が許可される場合、希土類イオンの直接吸収を利用することが可能である。これらの場合、直接吸収は、一般的には酸化物マトリックスの吸収よりも弱いままであっても、対応する電子遷移が禁止されている場合よりも強くなる。この場合が適用される希土類イオンの２つの例は、Ｅｕ２＋およびＣｅ３＋イオンである。これらのイオンは、例えば、以下の無機ナノ粒子の構成要素、Ｃｅ３＋の場合はＬａＰＯ４またはＹＡＧ、Ｅｕ２＋の場合はＳｒ２Ｏ４として存在することができる。
【0133】
本発明により使用されるフォトルミネッセンスナノ粒子は、５ｎｍ以上で厳密に１μｍ未満、特に１０ｎｍ～５００ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ～２００ｎｍ、特に２０ｎｍ～１００ｎｍの平均サイズを有することができる。
【0134】
したがって、本発明により使用されるフォトルミネッセンスナノ粒子は、多数の希土類イオンを含むのに十分な体積を有し、したがって、低濃度の分析物の検出を可能にするのに十分な発光シグナルを放出する。
【0135】
好ましくは、本発明のナノ粒子は、少なくとも１０３個の希土類イオン、特に１０００～６００００００個の希土類イオン、特に５０００～５０００００個、より具体的には２００００～１００００００個の希土類イオンを含む。
【0136】
例として、直径３０ｎｍのＹ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４球状ナノ粒子には、７００００個のＥｕ３＋イオンが含まれている（参考文献Ｃａｓａｎｏｖａら［３７］によるイオン数の計算）。
【0137】
平均サイズは、透過型電子顕微鏡で測定することができる。透過型電子顕微鏡からの画像は、ナノ粒子の形状（球形、楕円体）を決定し、ナノ粒子の平均寸法を推定することを可能にする。全体が球形の粒子の場合、平均サイズは、粒子の平均直径を意味する。楕円形の粒子の場合、平均サイズは、楕円体と同じ体積の球の平均サイズを意味する。一般に、２Ｄ投影である透過画像に表示されない楕円体の３番目の軸は、最小サイズの軸と長さが等しいと想定される。
【0138】
特定の実施形態によれば、本発明のナノ粒子は、全体的に細長い（扁長な）楕円形である。
【0139】
それらは、より具体的には、ａで示される２０ｎｍ～６０ｎｍの長さの主軸、およびｂで示される１０ｎｍ～３０ｎｍの長さの短軸を有する。特に、本発明のナノ粒子は、長軸の長さの平均値ａが４０ｎｍであり、短軸の長さの平均値ｂが２０ｎｍであってもよい。
【0140】
有利なことに、本発明により使用されるナノ粒子は、多分散度が低い。動的光散乱の測定から推定できる多分散度指数は、厳密に０．２未満であることが好ましい。これが粒子の合成または官能化の終了時に当てはまらない場合、遠心分離または当業者に知られている他の任意の技術によりサイズを選別することによって、より低い多分散度を得ることができる。
【0141】
特定の実施形態によれば、希土類イオン、例えばユウロピウム（Ｅｕ）によるドーピングのレベルの積に、ナノ粒子による発光の量子効率を掛けたものが最大化される。
【0142】
Ｌｎイオンによるドーピングｘのレベルと量子効率の積は、Ｌｎイオンによる強力なドーピングを使用して、量子効率を低下させることなく、特に吸光の濃度につながるドーピングイオン間の移動プロセスを制限することによって、例えば０．２～０．６、特に０．４で最大化できる。特に、高い量子効率を維持するために、ナノ粒子は不完全な結晶化度を有している。実際、優れた結晶化度は、特に、高レベルのドーピングの場合のようにドーピングイオンが互いに接近している場合に、ドーピングイオン間の移動プロセスを促進し、その結果、表面および溶媒の存在に連動した非放射プロセスによるイオンの脱励起プロセスを促進する。特に、室温で、または少なくとも６００℃を超えない温度で合成する方法は、これらのナノ粒子に必要な不完全な結晶化度にとって好ましい。
【0143】
ナノ粒子の結晶化度は、少なくとも１つの特定の結晶学的方向のＸ線回折パターンによって測定されるコヒーレンス長が、透過型電子顕微鏡画像で決定したその方向の粒子サイズの８０％未満である場合、「不完全」であると考えられる。多結晶化度、欠陥、多孔性など、様々なタイプの不完全な結晶化度が考慮される場合がある。
【0144】
有利なことに、本発明により使用されるナノ粒子は、それぞれ、発光が停止する前に、１０８個を超える光子、特に１０９個を超える、または１０１０個を超える光子を放出することができる。非常に多くの場合、特にＥｕをドープしたＹＶＯ４またはＧｄＶＯ４粒子の場合、連続照明下では発光の停止（吸光）は観察されない。言い換えれば、有利なことに、本発明によるナノ粒子は、不可逆的な光分解またはフォトブリーチングの現象を示さない。
【0145】
有利なことに、本発明により使用されるナノ粒子は、溶液中で良好なコロイド安定性を示す。
【0146】
溶液中のナノ粒子の安定性は、毛細管現象試験デバイスのプローブとしてのこれらの粒子の使用に基づく検出結果の再現性に関する要件を満たすために特に決定的である。
【0147】
特に、ナノ粒子の良好なコロイド安定性は、毛細管現象試験の多孔質支持体における液体サンプルの移動中に、該当する場合、分析される物質に結合したルミネッセンスナノ粒子の移動を、検出ゾーンまで、場合によりデバイスの対照ゾーンまで、確実に行うことを可能にする。
【0148】
「ゼータ電位」は、懸濁液の安定性を表す要素の１つである。例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ社のＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳタイプの機器を使用して直接測定することができる。光学デバイスを使用して、この機器は、粒子に印加された電界の関数として粒子の変位速度を測定する。
【0149】
特に、本発明のナノ粒子は、有利には、合成の終了時に、ｐＨ≧５の水性媒体中で、－２８ｍＶ以下である、ζで示されるゼータ電位を有する。特に、ナノ粒子は、ｐＨ≧６．５、特にｐＨ≧７、特にｐＨ≧８の水性媒体中で、－３０ｍＶ以下のゼータ電位を有する。
【0150】
ζで示される「ゼータ電位」は、溶液の大部分と粒子のせん断面との間に存在する電位差として定義することができる。ゼータ電位は、懸濁液の安定性を表している。せん断面（または流体力学的半径）は、粒子が溶液中で移動する際に、溶媒が粒子とともに移動する、粒子の周りの仮想球に対応する。ゼータ電位は、当業者に知られている方法によって、例えば、電界におけるその可溶化層を有する粒子の変位によって決定することができる。
【0151】
このナノ粒子の負のゼータ電位が、ｐＨ≧５で－２８ｍＶ以下であることにより、互いに関連した水溶液中のナノ粒子の静電反発現象を増加させ、凝集現象を抑制することができる。実際、高い絶対値のゼータ電位、特に２８ｍＶを超える高い絶対値のゼータ電位は、一般に、低いイオン強度を有する媒体中で凝集効果を抑制できることが、当業者に経験的に知られている。
【0152】
ゼータ電位の測定は、粒子の水性懸濁液の精製後に行われ、したがって、イオン伝導度が厳密に１００μＳ．ｃｍ－１未満の水性懸濁液に対して行われることを理解されたい。懸濁液のイオン伝導度は、当該懸濁液中に存在するイオンのレベルを推定することを可能にし、任意の既知の伝導率計を用いて、室温（２５℃）で測定することができる。
【0153】
特定の実施形態によれば、本発明により使用されるルミネッセンスナノ粒子は、１つまたは複数の表面分子を有することができ、高いゼータ電位のために、それらを懸濁状態に保つことを促進する。
【0154】
特定の実施形態によれば、本発明により使用されるナノ粒子は、表面上にテトラアルキルアンモニウムカチオンを有してもよい。この種のナノ粒子、およびそれらの合成方法は、例えば、仏国特許第１７５４４１６号の下で提出された出願に記載されている。
【0155】
一例として、本発明により使用されるフォトルミネッセンスナノ粒子は、式Ｙ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４のものであってもよく、その表面上に、テトラメチルアンモニウムカチオンが場合により固定化される。
【0156】
本発明により使用されるナノ粒子、特に前述の式（ＩＩ）のナノ粒子は、主に結晶性および多結晶性であり、特に、Ｘ線回折によって推定される微結晶の平均サイズが３ｎｍ～４０ｎｍである。
【0157】
ナノ粒子の調製
本発明により使用される希土類イオンをドープした結晶性マトリックスを有するフォトルミネッセンスナノ粒子は、当業者に知られている任意の従来の方法によって調製することができる。
本発明により使用される希土類イオンをドープした結晶性マトリックスを有するフォトルミネッセンスナノ粒子は、当業者に知られている任意の従来の方法によって調製することができる。
【0158】
特に、それらは、コロイド合成経路によって調製することができる。水性コロイド合成の方法は、当業者によく知られている（Ｂｏｕｚｉｇｕｅｓら、ＡＣＳ Ｎａｎｏ ５、８４８８－８５０５（２０１１）［４９］）。水性媒体中でのこれらの合成には、溶媒移動の後続のステップを必要としないという利点がある。
【0159】
一例として、式Ａ１－ｘＬｎｘＶＯ４（１－ｙ）（ＰＯ４）ｙ（ＩＩ）のナノ粒子は、水性媒体中で、当該元素ＡおよびＬｎの前駆体から出発し、オルトバナジン酸イオン（ＶＯ４
３－）および場合によりリン酸イオン（ＰＯ４
３－）の前駆体から出発して、共沈反応によって形成することができる。
【0160】
元素ＡおよびＬｎの前駆体は、従来、当該元素の塩、例えば、硝酸塩、塩化物、過塩素酸塩または酢酸塩、特に硝酸塩の形態であってもよい。元素ＡおよびＬｎの前駆体、ならびにそれらの量は、当然、ナノ粒子の所望の性質を考慮して適切な方法で選択される。
【0161】
例えば、式Ｙ１－ｘＥｕｘＶＯ４（ＩＶ）のナノ粒子の合成は、イットリウムおよびユウロピウムの前駆体化合物として、硝酸イットリウム（Ｙ（ＮＯ３）３）および硝酸ユウロピウム（Ｅｕ（ＮＯ３）３）を使用することができる。
【0162】
本発明により使用されるフォトルミネッセンスナノ粒子のための、この種のコロイド経路による合成の方法は、例えば、仏国特許第１７５４４１６号の下で出願された出願に記載されている。有利なことに、仏国特許第１７５４４１６号に記載されているように、共沈反応は、有効量のテトラアルキルアンモニウムカチオンの存在下で行うことができる。
【0163】
本発明によるルミネッセンスナノ粒子の合成、特に数十ナノメートルを超えるより大きなサイズの合成は、当業者に知られている他の任意のアプローチによって、例えば、粉砕によって達成することができる。
【0164】
ルミネッセンスナノ粒子の表面官能化
ナノ粒子の結合試薬への結合
ラテラルフローアッセイデバイスで従来使用されているプローブと同様に、本発明により使用されるルミネッセンスナノ粒子は、分析される物質に特異的な少なくとも１つの結合試薬に結合される。
ナノ粒子の結合試薬への結合
ラテラルフローアッセイデバイスで従来使用されているプローブと同様に、本発明により使用されるルミネッセンスナノ粒子は、分析される物質に特異的な少なくとも１つの結合試薬に結合される。
【0165】
ルミネッセンスプローブに結合された結合試薬の機能、およびその結果としての性質は、以下に詳述するように、いわゆる「サンドイッチ」アッセイであるか「競合」アッセイであるかに応じて、使用される毛細管現象試験、特にラテラルフローアッセイの性質に応じて異なる。
【0166】
したがって、「結合試薬」とは、「サンドイッチ」タイプのアッセイの文脈で、同定が必要な目的の生物学的または化学的物質に、あるいは「競合」アッセイの文脈で同定が必要な目的の生物学的または化学的物質と競合する検出ゾーンの捕捉試薬に特異的に結合することができる任意の化学的、生化学的または生物学的化合物を意味する。以下に詳述するように、結合試薬はまた、ラテラルフローアッセイのためにデバイスの対照ゾーンに固定化された第２の捕捉試薬に特異的に結合することができる。
【0167】
「結合（ｂｉｎｄ）」または「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、任意の強い結合、例えば共有結合、または好ましくは、例えば抗原／抗体タイプの弱い結合の集合を意味する。
【0168】
当然、本発明によるプローブとして使用されるルミネッセンスナノ粒子に結合された結合試薬の性質は、サンプル中で分析される物質を考慮して選択される。
【0169】
有利なことに、本発明により使用されるフォトルミネッセンスナノ粒子は、多種多様な生物学的標的に完全に適しており、特定の結果は、ナノ粒子の表面にグラフトされた１または複数の結合試薬の性質に依存する。
【0170】
結合試薬は、より具体的には、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、抗体フラグメント、ナノボディ、抗原、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ホルモン、リガンド、サイトカイン、ペプチド模倣物、タンパク質、炭水化物、化学修飾タンパク質、化学修飾核酸、既知の細胞表面タンパク質を標的とする化学修飾炭水化物、アプタマー、タンパク質とＤＮＡ／ＲＮＡの集合体、またはＨａｌｏＴａｇタイプの標識に使用されるクロロアルカンから選択されてもよい。ＳＮＡＰ－ＴａｇまたはＣＬＩＰ－Ｔａｇタイプのアプローチも使用することができる。
【0171】
特定の実施形態によれば、結合試薬は、抗体または抗体フラグメント、ペプチド、化学修飾核酸またはアプタマーであり、特に抗体である。
【0172】
適切な抗体フラグメントは、単純な可変ドメインＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２などの免疫グロブリンの少なくとも１つの可変ドメインおよび他のタンパク質分解フラグメントまたは「ナノボディ」（ラクダ科の抗体から得られるＶＨＨフラグメントまたは軟骨魚類の抗体から得られるＶＮＡＲなどの単一ドメインを有する抗体）を含む。
【0173】
本発明による「抗体」という用語は、キメラ抗体、ヒトまたはヒト化抗体、組換えおよび修飾抗体、コンジュゲート抗体、およびそれらのフラグメントを含む。
【0174】
結合試薬はまた、細胞表面受容体に結合することが知られている分子に由来してもよい。例えば、標的化フラグメントは、低密度リポタンパク質、トランスフェリン、ＥＧＦ、インスリン、ＰＤＧＦ、線維素溶解酵素、抗ＨＥＲ２、抗ＨＥＲ３、抗ＨＥＲ４、アネキシン、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポエチンまたはコロニー刺激因子に由来してもよい。
【0175】
粒子の結合試薬への結合
１つまたは複数の結合試薬に結合された粒子を適切に調製するために、結合／グラフトの適切な方法を使用することは、当業者次第である。ルミネッセンスナノ粒子の表面官能化に使用される結合試薬の量は、粒子の量を考慮して調整される。
１つまたは複数の結合試薬に結合された粒子を適切に調製するために、結合／グラフトの適切な方法を使用することは、当業者次第である。ルミネッセンスナノ粒子の表面官能化に使用される結合試薬の量は、粒子の量を考慮して調整される。
【0176】
典型的には、各ナノ粒子がいくつかの結合試薬、好ましくは少なくとも５個の結合試薬、より好ましくは少なくとも１０個の結合試薬に結合されることが望ましい。
【0177】
結合試薬は、ナノ粒子に直接、またはスペーサー（「リンカー」とも呼ばれる）を介してグラフトすることができる。
【0178】
粒子を生体分子に結合する（グラフト化とも呼ばれる）方法は、当業者にはよく知られている。一般に、共有結合、表面錯体形成、静電相互作用、カプセル化、または吸着による結合である。
【0179】
共有結合による結合の場合を含む特定の場合において、粒子は、結合試薬によって運ばれる別の化学基と反応して共有結合を形成することができる化学基で事前に官能化されてもよい。
【0180】
ナノ粒子の表面に存在する可能性のある化学基の例として、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、およびエポキシ基に言及することができる。
【0181】
アミノ基は、アミノトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）などのアミノオルガノシランなどの分子によって供給することができる。ＡＰＴＥＳの利点は、共有結合によってナノ粒子の周りにカプセルを形成することである。したがって、ＡＰＴＥＳによって供給されるアミンは長期間にわたって非常に安定している。アミノ基は、無水コハク酸との反応によってカルボキシル基に変換することができる。
【0182】
カルボキシル基は、クエン酸またはポリアクリル酸（ＰＡＡ）などの分子によって供給され得る。
【0183】
カルボキシル基は、当技術分野で知られている任意の技術によって、結合試薬がタンパク質または抗体である場合、特に１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と反応させ、次いで、ポリペプチドの表面上のアミン官能基と反応させ、共有結合性のアミド結合を形成することによって活性化される。
【0184】
ＡＰＴＥＳによるナノ粒子の官能化は、ナノ粒子をシリカの層でコーティングした後に有利に行うことができる。
【0185】
他の場合には、粒子は、結合試薬へのその後の結合を可能にすることができる分子に事前に結合されていてもよい。
【0186】
例えば、粒子は、ストレプトアビジンに結合することができ、これはビオチン化された標的剤への結合を可能にする。
【0187】
一例として、仏国特許第１７５４４１６号は、ストレプトアビジンに結合されたナノ粒子をビオチン化抗体に結合することによる、ナノ粒子のビオチン化抗体への結合を示している。また、結合は、上記のようにＡＰＴＥＳで官能化されたナノ粒子上の抗体を結合することによって直接実行することもできる（アミノ基のカルボキシル基への変換、カルボキシル基の活性化、および抗体表面のアミノ基との直接反応）。
【0188】
ナノ粒子の表面での結合試薬の結合はまた、当業者によって知られている他の任意の方法によって達成することができる。
【0189】
また、結合は、ナノ粒子をシリカの層でコーティングし、続いて、アミン官能基が２つのＮＨＳ官能基を含む二官能性スペーサー剤と反応するのに役立つＡＰＴＥＳでコーティングする反応によってもたらされ得る。次に、二官能性スペーサー剤に結合したナノ粒子は、タンパク質（抗体、ストレプトアビジンなど）の表面のアミン官能基と反応することができる。このタイプの結合方法は、特にＣａｓａｎｏｖａら（［３８］）およびＧｉａｕｍｅら（［３９］）の研究に記載される。
【0190】
移動剤
また、本発明のルミネッセンスナノ粒子は、その表面の電荷および性質、形状およびサイズに応じて、毛細管現象試験デバイス内、例えばニトロセルロース膜内でのルミネッセンスナノ粒子の移動を容易にする、以下「移動剤」と呼ばれる薬剤でコーティングすることができる。
また、本発明のルミネッセンスナノ粒子は、その表面の電荷および性質、形状およびサイズに応じて、毛細管現象試験デバイス内、例えばニトロセルロース膜内でのルミネッセンスナノ粒子の移動を容易にする、以下「移動剤」と呼ばれる薬剤でコーティングすることができる。
【0191】
当業者は、１つまたは複数の移動剤でナノ粒子を適切に官能化することができる。特に、この移動剤は、上記のようにナノ粒子の結合試薬への結合、特に、結合試薬が、毛細管現象試験において、分析物に特異的に結合するか、または分析物と競合する捕捉試薬に結合する能力を妨害してはならないことを理解されたい。
【0192】
移動剤は、特に、ステルス剤または不動態化剤から選択されてもよい。
【0193】
そのような薬剤は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）の鎖、特にシラン化された鎖、ＰＥＯ－ポリ（プロピレンオキシド）－ＰＥＯ、ポリ（Ｌ－リジン）鎖でグラフト化されたポリ（エチレンオキシド）の鎖（「ポリ（Ｌ－リジン）－グラフト化－ポリ（エチレングリコール）」（ＰＬＬ－ｇ－ＰＥＧ））、ポリ（Ｌ－リジン）でグラフト化デキストランの鎖、ポリ（ｐ－キシリレン）（パリレン）、ポロキサマー（中央部分がプロピレンオキシドブロックであり、末端がポリエチレンオキシドブロックであるトリブロックコポリマー、例えば、ＢＡＳＦ社によってＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の名前で販売されているもの）ポロキサミン、ポリソルバートおよび多糖類（例えば、キトサン、デキストラン、ヒアルロン酸およびヘパリン）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）－メタクリラート（ＨＰＭＡ）コポリマーおよびポリアミノ酸、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤および両性イオン性界面活性剤であってもよい。
【0194】
好ましくは、移動剤は、シラン化ＰＥＧ鎖、ポロキサマーおよびポリ乳酸（ＰＬＡ）から選択される。これらの薬剤は、当業者に知られている任意のアプローチによってナノ粒子の表面に沈着させることができる。例えば、薬剤は、ナノ粒子上に吸着され得るか、またはナノ粒子上に共有結合的に固定され得る。
【0195】
ナノ粒子と１つまたは複数の移動剤との結合は、例えば、結合試薬のアミノ基の反応によって結合試薬のナノ粒子への結合が起こる際に、アミノ基を有する移動剤を選択することによって、結合試薬の結合と同時に行うことができる。この場合、移動剤の量は、結合試薬の量に対して調整されるべきであり、その結果、ナノ粒子は、その表面上に十分な数の移動剤および結合試薬の両方を含む。
【0196】
毛細管現象試験デバイス
上記のように、上記で定義されたフォトルミネッセンスナノ粒子は、本発明によれば、毛細管現象試験、例えば「ラテラルフロー」アッセイにおけるプローブとして使用される。
上記のように、上記で定義されたフォトルミネッセンスナノ粒子は、本発明によれば、毛細管現象試験、例えば「ラテラルフロー」アッセイにおけるプローブとして使用される。
【0197】
「ラテラルフロー」という用語は、すべての溶解または分散した化合物が毛細管現象によって、好ましくは同等の速度および規則的な流量で、拡散手段を介して横方向に輸送される液体の流れを指す。
【0198】
本発明の方法は、例えば、金ナノ粒子タイプのプローブで知られている任意の従来の毛細管現象試験デバイスを用いて行うことができる。毛細管現象試験デバイスは、特に任意の構成を想定してもよく、したがって、線形、放射状、Ｔ字型、Ｌ字型、十字型などの構成を有してもよい。
【0199】
以下、より具体的には、移動ストリップタイプのラテラルフローアッセイ用のデバイスに関連する添付の図１から３および５を参照する。
【0200】
さらに、本発明により使用されるデバイスは、以下に詳述するように、「サンドイッチ」タイプのアッセイ、あるいは、「競合」アッセイに適合させることができる。
【0201】
典型的には、毛細管現象試験デバイス、特に図１に示される本発明によるラテラルフローアッセイ用のデバイスは、基準方向（Ｘ）に毛細管現象を行うための手段、特に多孔質固体支持体（１０）を含み、
－液体サンプル、および場合により希釈剤を沈着させるためのゾーン（１）、
－沈着ゾーンの下流に配置され、「標識ゾーン」と呼ばれ、分析される物質に特異的に結合する少なくとも１つの試薬に結合された本発明によるフォトルミネッセンス無機ナノ粒子（プローブ）が担持されたゾーン（２）、
－標識ゾーン（２）の下流に配置され、「検出ゾーン」とも呼ばれ、分析される物質に特異的な少なくとも１つの捕捉試薬が固定化される、反応ゾーン（３）、
－検出ゾーン（３）の下流に位置し、分析物に特異的に結合する試薬に特異的な少なくとも１つの第２の捕捉試薬が固定化される、対照ゾーン（４）を含む。
－液体サンプル、および場合により希釈剤を沈着させるためのゾーン（１）、
－沈着ゾーンの下流に配置され、「標識ゾーン」と呼ばれ、分析される物質に特異的に結合する少なくとも１つの試薬に結合された本発明によるフォトルミネッセンス無機ナノ粒子（プローブ）が担持されたゾーン（２）、
－標識ゾーン（２）の下流に配置され、「検出ゾーン」とも呼ばれ、分析される物質に特異的な少なくとも１つの捕捉試薬が固定化される、反応ゾーン（３）、
－検出ゾーン（３）の下流に位置し、分析物に特異的に結合する試薬に特異的な少なくとも１つの第２の捕捉試薬が固定化される、対照ゾーン（４）を含む。
【0202】
「サンドイッチ」アッセイでは、検出ゾーンから分析物を特異的に捕捉する試薬およびプローブに結合された結合試薬は、それぞれ分析物に特異的に結合するように選択され、例えば、分析物の２つの異なるエピトープ部位で結合するように選択される。
【0203】
「競合」アッセイでは、プローブに結合された結合試薬は、分析物と同一または類似しており、検出ゾーンの捕捉試薬に結合して、分析物と競合する。
【0204】
移動対照ゾーン（４）は、サンプルの少なくとも一部がアッセイデバイスの多孔質固体支持体を適切に通過したことをユーザに示す。
【0205】
ラテラルフローアッセイ用のデバイスは、一般的に、反応ゾーンおよび対照ゾーンの下流に配置された吸収パッド（５）をさらに含み、その一端は多孔質支持体と流体接触している。吸収パッドは、毛細管現象による移動を維持し、余分な液体サンプルを受け取る。
【0206】
「上流」および「下流」という用語は、アッセイにおける毛細管流の方向（Ｘ）を指し、この移動は、沈着ゾーン（１）（上流の機能端）から検出ゾーン（３）まで行われ、存在する場合、吸収パッド（５）のレベル（下流の機能端）で終了する。
【0207】
ラテラルフローアッセイ用のデバイスの多孔質固体支持体の異なるゾーンのそれぞれは、隣接する１つまたは複数のゾーンと流体連絡している。
【0208】
２つの要素間の「流体接触」は、毛細管現象試験用のデバイスで通常行われているように、第１の要素から第２の要素への液体の移動を可能にするために２つの要素が物理的に接触していることを示すことを目的としている。好ましくは、この接触は、図１に模式的に示されるように、１つの要素を他の要素とオーバーラップさせることによって提供される。
【0209】
「毛細管現象のための手段」は、より具体的には、単純な毛細管現象によって液体の移動を可能にする多孔質固体支持体（１０）を意味する。この支持体の多孔性は、液体または湿潤状態でのサンプルおよび／または試薬の毛細管流（または横方向の移動）を可能にする。多孔質支持体は、既知のラテラルフローアッセイデバイスですでに使用されている支持体から選択することができる。例として、多孔質支持体は、ニトロセルロース、ポリエステル、ガラス繊維、セルロース繊維、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、セルロースエステル、ＰＶＤＦなどからなってもよい。
【0210】
毛細管現象の手段は、１つまたは複数の別個の部分からなり得、支持体の異なる部分は、異なる材料からなり得る。毛細管現象の手段が異なる部品または異なる材料からなる場合、これらの要素は、毛細管現象の手段における毛細管流の連続性を可能にするように配置される。
【0211】
典型的には、毛細管現象の手段は、毛細管現象の方向（Ｘ）に伸長された多孔質固体支持体からなる。
【0212】
有利なことに、それは、バンドまたはストリップの形態の多孔質支持体（１０）である。特に、それは、いくつかの重ねられた、または重なり合った膜からなる免疫クロマトグラフィーストリップであってもよい。
【0213】
特定の実施形態によれば、多孔質支持体はニトロセルロース膜である。ニトロセルロース膜の例として、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）ＨＦ２４０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）ＨＦ１８０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）ＨＦ１３５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）ＨＦ１２０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）ＨＦ０９０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）ＨＦ０７５、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（商標）ＣＮ１４０、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（商標）ＣＮ１５０、ＦＦ１２０ ＨＰ膜（ＧＥ）、ＦＦ８０ＨＰ膜（ＧＥ）、ＡＥ膜、（ＧＥ）、イムノポア膜（ＧＥ）に言及することができる。
【0214】
ラテラルフローアッセイ用のデバイスの多孔質固体支持体のサイズは、様々であってもよい。例えば、それは、長さが３０ｍｍ～２００ｍｍ、好ましくは６０ｍｍ～１００ｍｍであり、幅が２ｍｍ～１０ｍｍ、好ましくは４ｍｍ～５ｍｍのバンドであってもよい。
【0215】
本発明によるラテラルフローアッセイ用のデバイスは、例えば、剛性支持体（６）に固定されたクロマトグラフィーストリップからなってもよい。
【0216】
剛性支持体（６）は、板、プラスチックコーティング板、またはより好ましくはプラスチックなどの様々な材料からなってもよい。好ましくは、剛性支持体はポリスチレンで作られている。
【0217】
有利なことに、特定の材料は、毛細管現象のための手段の各ゾーンに対応する。
【0218】
サンプルの沈着ゾーン（１）（英語の用語では「サンプルパッド」という名前でも知られている）は、吸収性の多孔質材料から有利に形成することができる。実際、毛細管現象のための手段の沈着ゾーンは、液体サンプルを受け取ることを意図しており、例えば、尿の流れまたは血液サンプルと接触させることを意図している。この材料は、当業者に知られ、従来のラテラルフローアッセイですでに使用されている適切な吸収剤から選択される。
【0219】
上記の無機フォトルミネッセンスナノ粒子（７）は、図２および図３に示すように、毛細管現象の手段の標識ゾーン（２）（英語の用語では「コンジュゲートパッド」という名前でも知られている）のレベルで使用される。
【0220】
上記のように、これらのナノ粒子（７）は、分析される物質に特異的に結合する少なくとも１つの試薬に結合される。
【0221】
「サンドイッチ」アッセイの文脈では、結合試薬は、ラテラルフローアッセイ中に、分析物に特異的に結合することができる。結合試薬は、例えば、分析物の特異的抗体であってもよい。
【0222】
従来の「競合」アッセイの文脈では、結合試薬は、分析物と競合して、検出ゾーン（３）の捕捉試薬に特異的に結合することができる。したがって、結合試薬は、例えば、分析物自体または適切な類似体であってもよい。「適切な類似体」とは、分析物を特異的に捕捉する試薬に特異的に結合する類似体を意味する。
【0223】
ルミネッセンスプローブに結合された結合試薬はまた、対照ゾーンに固定化された第２の捕捉試薬（９）に特異的に結合することができる。
【0224】
好ましくは、上記のように、ルミネッセンスナノ粒子は、それらの表面上に、ステルス剤または不動態化剤、例えばポリエチレングリコールなどの、ラテラルフローアッセイのためのデバイス内でのそれらの移動を容易にすることを意図した少なくとも１つの薬剤をさらに有する。したがって、これらの薬剤は、該当する場合、結合試薬を介して分析物に結合したナノ粒子の、多孔質支持体、例えばニトロセルロース膜内での、検出ゾーン（３）までの移動を促進する。
【0225】
分析物に特異的に結合する少なくとも１つの試薬に結合した無機フォトルミネッセンスナノ粒子は、毛細管現象のための手段で乾燥状態で固定化されるが、湿ったときに毛細管現象によって自由に移動する。
【0226】
したがって、アッセイ中に、毛細管現象によって毛細管現象の手段を介して移動するサンプルは、分析される物質に特異的に結合する試薬に結合されたナノ粒子を同伴する。
【0227】
分析される物質に特異的な第１の捕捉試薬は、本発明によるラテラルフローアッセイ用のデバイスの毛細管現象の手段の検出ゾーン（３）（英語の用語では検出パッド」という名前でも知られている）のレベルで固定化される。それは、分析物に特異的に結合するその能力のために適切な方法で選択される。
【0228】
「サンドイッチ」アッセイ（図２）の文脈では、検出ゾーンの捕捉試薬は、フォトルミネッセンスナノ粒子に結合するための上記の結合試薬と同様の性質のものであってもよい。それは、例えば、分析される物質に対して強い親和性を有する抗体（８）であってもよい。
【0229】
「競合的」アッセイの文脈では、捕捉試薬はまた、ルミネッセンスプローブに結合された結合試薬に結合することができる（例えば、分析物と同一または類似）。
【0230】
分析物（１１）および捕捉試薬（８）は、典型的には、リガンド／受容体、抗原／抗体、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／タンパク質の対を形成する。
【0231】
したがって、分析物が抗原またはハプテンである場合、捕捉試薬は、例えば、分析物の特異的抗体であり、または分析物が抗体である場合、捕捉試薬は、抗体によって認識される抗原または分析物を特異的に認識する抗体である。分析物が核酸である場合、捕捉試薬は、例えば、相補的ＤＮＡプローブである。
【0232】
捕捉試薬は、湿った際に移動しないように、検出ゾーンのレベルで沈着および固定化される。この固定化は、当業者によって知られている技術によって、例えば、ニトロセルロースまたは電荷修飾ナイロンの膜の場合の静電相互作用によって、またはポリ（フッ化ビニリデン）またはポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）の膜の場合の疎水性相互作用によって行うことができる。
【0233】
特定の実施形態によれば、検出ゾーン（３）は、毛細管現象のための手段上で、空間的に分離され、例えば、バンド（１つまたは複数のテストライン「Ｔ」）の形態で、１つまたは複数の捕捉試薬で官能化された、１つまたは複数の領域を含んでもよい。複数の「テストライン」の使用は、複数の検出のためのアッセイの使用、言い換えると、まったく同一のサンプル内の複数の物質を同時に検出するためのアッセイの使用の文脈で特に興味深いものである。
【0234】
毛細管現象試験デバイスは、典型的には、アッセイの有効性を確認するために使用される、検出ゾーン（３）の下流に位置する対照ゾーン（４）を含み、このゾーン内に、プローブに結合された結合試薬に特異的な少なくとも１つの第２の捕捉剤（９）が固定化されている。
【0235】
この第２の捕捉剤は、プローブに結合した結合試薬に特異的に結合するその能力のために適切に選択される。それは、例えば、「サンドイッチ」タイプのアッセイの文脈において、分析物に特異的に結合する試薬として使用される二次抗体または抗体の特定の抗原であってもよい。
【0236】
検出ゾーン（３）の第１の捕捉試薬と同様に、この第２の捕捉試薬は、湿った際に動かないように、対照ゾーン（４）のレベルで固定化される。
【0237】
毛細管現象のための手段は、場合により、プレートまたはカセットなどの、一般にプラスチック製の固体支持体（６）に固定することができる。
【0238】
本発明による毛細管現象試験デバイスは、特に、テストストリップが配置されるケース（１２）を含んでもよく、当該ケースは、図８に模式的に示されるように、提供される特定の開口部のレベルを除いて、閉じられることが好ましい。特に、開口部（１４）は、サンプルの沈着のためにゾーンの上に提供される。読み取りウィンドウ（１３）を構成する別の開口部は、例えば、検出ゾーン（３）および任意の対照ゾーン（４）のレベルで提供することができる。あるいは、検出ゾーンおよび対照ゾーンをそれぞれ観察するために、２つのウィンドウを提供することができる。
【0239】
あるいは、これらのゾーンを見えるようにするために、ケースは透明であるか、または１つまたは複数の透明な部品を備えていてもよい。
【0240】
当然、従来の毛細管現象試験デバイスで知られているデバイスの様々な構成を使用することができる。例えば、テストストリップを含むケースは、上面のレベルで、少なくとも１つの中空レリーフを含んでもよく、その基部は、ストリップの表面上にあり、液体サンプルを沈着するためのウェルまたはスペースを形成する。
【0241】
本発明の方法による毛細管現象試験の手順は、より具体的には、
（ｉ）毛細管現象試験デバイスの沈着ゾーン（１）のレベルで、分析される液体サンプル、および場合により希釈剤を適用すること、
（ｉｉ）フォトルミネッセンスナノ粒子によって生成されたルミネッセンスが反応ゾーン（３）で検出されるまで、および／またはルミネッセンスが移動対照ゾーン（４）で検出されるまで、デバイスをインキュベートすること、
（ｉｉｉ）結果を読んで解釈することを含む。
（ｉ）毛細管現象試験デバイスの沈着ゾーン（１）のレベルで、分析される液体サンプル、および場合により希釈剤を適用すること、
（ｉｉ）フォトルミネッセンスナノ粒子によって生成されたルミネッセンスが反応ゾーン（３）で検出されるまで、および／またはルミネッセンスが移動対照ゾーン（４）で検出されるまで、デバイスをインキュベートすること、
（ｉｉｉ）結果を読んで解釈することを含む。
【0242】
分析される液体サンプルは、デバイスの毛細管現象のための手段の沈着ゾーン（１）に直接沈着されてもよい。
【0243】
「液体サンプル」とは、分析される物質が溶液または懸濁液になっているサンプルを意味する。この液体サンプルは、特に任意の生物学的流体または体液であってもよい。液体サンプルはまた、生物学的流体または体液から得られてもよい。また、固体サンプルからの液体抽出物であってもよい。
【0244】
典型的には、液体サンプルは、尿、全血、血漿、血清、希釈された糞便である。
【0245】
特定の実施形態によれば、特に、液体サンプルが血漿、血清、全血、鼻汁塗抹標本または腟塗抹標本または喀痰である場合、分析されるサンプルとともに希釈剤が使用される。希釈剤は、デバイスの沈着ゾーンのレベルで沈着される。
【0246】
サンプルを沈着する前に、希釈剤は、分析されるサンプルと混合することができる。あるいは、希釈剤は、サンプルの前または後に沈着することができる。この希釈剤は、多孔質支持体内を移動し、サンプル、および結合試薬に結合したプローブを同伴する。典型的には、この希釈剤は、緩衝生理食塩溶液を含む。希釈剤はまた、界面活性剤または反応に必要な他の任意の成分を含むことができる。
【0247】
次に、毛細管現象試験デバイスは、沈着ゾーンから対照ゾーンへの毛細管現象による液体サンプルの移動に十分な時間インキュベートされる。
【0248】
より具体的には、図２に模式的に示されている「サンドイッチ」タイプのラテラルフローアッセイは、以下のように進行する。
【0249】
多孔質支持体が分析物（１１）を含む液体サンプルと接触すると、後者は、プローブ（７）に結合した分析物を特異的に結合する試薬が配置される標識ゾーンまで、この支持体の毛細管現象によって移動する。したがって、分析物（１１）は、結合試薬によってルミネッセンスプローブ（７）に結合する。
【0250】
分析される物質が存在する場合、後者は、毛細管現象試験デバイスの検出ゾーン（３）のレベルに固定された第１の捕捉試薬（８）によって、検出ゾーンのレベルに固定化される。したがって、これにより、検出ゾーン（３）のレベルでルミネッセンスプローブが固定化される。
【0251】
したがって、サンプル中の分析される物質の有無は、検出ゾーン（３）のレベルでルミネッセンスプローブを検出することによって測定される。より具体的には、検出ゾーンのレベルで検出されるルミネッセンスは、サンプル中の分析物の濃度とともに、特に濃度に比例して増加する。
【0252】
過剰なプローブ、言い換えれば、分析物と反応していない結合試薬に結合したナノ粒子は、対照ゾーンに移動する。この対照ゾーンでは、結合試薬が第２の捕捉剤（９）に結合し、対照ゾーン（４）のレベルで過剰なプローブを固定化することにつながる。したがって、ユーザは、デバイス内のサンプルと試薬の移動を検証できるようにするポジティブコントロールを自由に使用できるため、試験の適切な動作を検証することができる。
【0253】
本発明の方法の別の変形によれば、使用されるアッセイは、「競合アッセイ」タイプのものである。競合アッセイの文脈では、図３－ａに模式的に示されているように、サンプル中に分析物が存在しない場合、ルミネッセンスプローブは、その結合試薬が検出ゾーンの捕捉試薬に結合することにより、検出ゾーンのレベルで固定化される。しかし、分析物が存在する場合、後者は、ルミネッセンスプローブの結合試薬と競合して、検出ゾーンの捕捉試薬に固定される。
【0254】
したがって、競合アッセイの文脈では、検出ゾーンのレベルで検出されるルミネッセンスは、サンプル中の分析物の濃度とともに、特に濃度に反比例して減少する。
【0255】
「競合」タイプのアッセイのさらに別の変形によれば、図３－ｂに示すように、分析物は、検出ゾーンの捕捉部位のレベルですでに固定化されているが、標識ゾーンのルミネッセンスナノ粒子に結合した結合試薬は、「サンドイッチ」アッセイの場合のように、分析物に特異的に結合することができる。
【0256】
サンプルに分析物が含まれている場合、後者は、サンドイッチアッセイの場合のように、結合試薬を介してルミネッセンスナノ粒子に固定されるため、検出ゾーンのレベルで結合することはできない。しかし、分析物と反応しなかった結合試薬に結合されたプローブは、検出ゾーンの捕捉試薬のレベルで固定化された分析物を介して検出ゾーンに結合することができる。この場合も、検出ゾーンのレベルで検出されるルミネッセンスシグナルは、サンプル中の分析物の濃度とともに減少し、特に反比例して減少する。
【0257】
したがって、毛細管現象試験の前述の変形の１つまたは他のものによれば、結果は、アッセイの終了時に、毛細管現象試験デバイスのレベルで、特に、検出ゾーン（３）のレベルで、および場合により対照ゾーン（４）のレベルでサンプルの移動の終了時に固定化されたナノ粒子によって生成されたルミネッセンスを検出することによって読み取られる。
【0258】
当然、本発明は、添付の図に模式的に示されているような、毛細管現象試験デバイスの実施形態に何ら限定されるものではない。
【0259】
本発明による方法を実施するための毛細管現象試験デバイスの他の変形は、それらが本発明のフォトルミネッセンスナノ粒子を検出プローブとして使用するのに適しているという条件で、想定され得る。例えば、それらは、「ディップスティックラテラルフロー」タイプまたは「垂直ラテラルフロー」タイプなどの毛細管現象試験用のデバイスであってもよい。
【0260】
変形実施形態によれば、単一のアッセイでサンプルのいくつかの物質を検出することが可能である（いわゆる「多重化」検出）。
【0261】
例えば、「サンドイッチ」アッセイの文脈では、反応ゾーン（３）のレベルで、別々の領域（例えば、いくつかのテストライン「Ｔ」）のレベルで、分析される物質の各々に特異的ないくつかの捕捉試薬を固定化することが可能である。この場合、検出プローブとして機能するナノ粒子は、分析される物質の各々に特異的な２つ以上のタイプの捕捉試薬に結合されてもよい。様々な分析物の存在下で、プローブは、各分析物に特異的な捕捉試薬を含む別々の領域の各々に固定されるようになる。反応ゾーンの各々でのルミネッセンスシグナルの存在および値は、対応する分析物の存在および濃度に対応する。この場合は空間多重化である。
【0262】
あるいは、標識ゾーン（２）のレベルで、異なる発光波長で発光する異なるランタニドイオンをドープした様々なプローブを使用することも可能であり、プローブの各々は、分析される物質の各々に特異的な結合試薬に結合され、単一の反応ゾーン（３）のレベルで、分析される物質の各々に特異的ないくつかの捕捉試薬に結合されている。この場合、いくつかの発光色を使用した多重化である。この場合、紫外域における結晶性マトリックスの励起は、同じ励起波長で、異なる波長で発光する異なるランタニドイオンを励起することが可能になるため、特に有利である。
【0263】
空間多重化およびいくつかの発光色による多重化の２つのアプローチを組み合わせて、例えば、各々が４つの分析される物質のうちの２つおよび２つの反応ゾーンに特異的な２種類の試薬に結合され、各々が４つの分析される物質のうちの２つの特異的な結合試薬を含む、２つの異なる発光色を有する２つのプローブで４つの分析物を検出することができる。したがって、第１の反応ゾーンの２つの異なる色のシグナルは、第１の２つの分析物の存在および濃度を示し、第２の反応ゾーンの２つの異なる色のシグナルは、他の２つの分析物の存在および濃度を示す。
【0264】
ルミネッセンスの検出
従来の毛細管現象試験と同様に、本発明の方法により実施される試験（検出および／または定量化）の評価は、検出ゾーン、および場合により対照ゾーンを観察することによって行われる。
従来の毛細管現象試験と同様に、本発明の方法により実施される試験（検出および／または定量化）の評価は、検出ゾーン、および場合により対照ゾーンを観察することによって行われる。
【0265】
より正確には、アッセイの結果は、検出ゾーンおよび／または対照ゾーンのレベルで、好ましくは検出ゾーンおよび対照ゾーンのレベルで固定化されたプローブによって生成されたルミネッセンスを検出することによって読み取られる。
【0266】
検出デバイス
本発明による毛細管現象試験デバイスの検出ゾーンおよび対照ゾーンの観察は、より具体的には、（ｉ）フォトルミネッセンスナノ粒子の励起のステップおよび（ｉｉ）ルミネッセンス発光の検出のステップを使用する。
本発明による毛細管現象試験デバイスの検出ゾーンおよび対照ゾーンの観察は、より具体的には、（ｉ）フォトルミネッセンスナノ粒子の励起のステップおよび（ｉｉ）ルミネッセンス発光の検出のステップを使用する。
【0267】
その別の態様によれば、本発明は、体外診断キットに関し、少なくとも、
上記で定義された本発明による毛細管現象試験デバイス、および
デバイスの検出ゾーン、および場合により対照ゾーンのレベルで固定化されたプローブにより生成されたルミネッセンスを検出するためのデバイスを含む。
上記で定義された本発明による毛細管現象試験デバイス、および
デバイスの検出ゾーン、および場合により対照ゾーンのレベルで固定化されたプローブにより生成されたルミネッセンスを検出するためのデバイスを含む。
【0268】
したがって、励起源を含む照明デバイスを含む単純な検出セットアップにより、ルミネッセンスプローブの存在を観察することが可能である。
【0269】
励起は、ナノ粒子の吸光度特性に適合していなければならない。励起は、紫外線、可視光、または近赤外線で生じる可能性がある。
【0270】
励起は、ランプ、発光ダイオードまたはレーザーなどの非コヒーレント励起源を使用して行うことができる。
【0271】
励起源は、希土類イオンおよび／または希土類イオンが組み込まれているナノ粒子のマトリックスを直接励起することができる。好ましくは、希土類イオンは、検出ゾーンのレベル、および場合により対照ゾーンのレベルで固定化されたフォトルミネッセンスナノ粒子のマトリックス（例えば、ＡＶＯ４、または他の金属酸化物マトリックス）の励起、およびその後の当該ナノ粒子から希土類イオンへのエネルギーの移動により励起される。ほとんどの場合、マトリックスの励起は、紫外域で行われる。
【0272】
特に、上記の式Ａ１－ｘＬｎｘＶＯ４（１－ｙ）（ＰＯ４）ｙ（ＩＩ）のナノ粒子の文脈では、特にｙの値が０である場合、ルミネッセンスは、厳密に３５０ｎｍ未満、特に３２０ｎｍ以下、より具体的には３００ｎｍ以下の波長でのマトリックスの励起によって検出することができる。
【0273】
ＡＶＯ４マトリックス、特に式Ｙ１－ｘＥｕｘＶＯ４（ＩＶ）のナノ粒子のＹＶＯ４マトリックスの場合、励起は、２３０ｎｍ～３２０ｎｍ、特に２５０ｎｍ～３１０ｎｍの間、より具体的には２６５ｎｍ～２９５ｎｍの波長で行うことができる。ナノ粒子のマトリックスの励起は、マトリックスの吸収係数（または溶液中のナノ粒子の吸光係数）がルミネッセンスイオンの直接励起に対応するものよりはるかに大きいため、特に有利である。さらに、すべての予想に反して、紫外域での励起によって生成される寄生バックグラウンドシグナルは、以下に示す例で示されるように、分析物が低濃度で存在する場合であっても、ナノ粒子の発光に起因するシグナルの検出を妨げる性質のものではない。
【0274】
Ｅｕを含む酸化物マトリックスの場合、励起は、２１０ｎｍ～３１０ｎｍ、特に２３０ｎｍ～２９０ｎｍ、より具体的には２４５ｎｍ～２７５ｎｍの波長で行うことができる。
【0275】
この場合、励起は、紫外線ランプ、紫外線発光ダイオード（ＬＥＤ）、またはＵＶレーザーを使用して行うことができる。プローブを検出するために必要な励起のパワーおよび強度は、紫外線ランプまたは紫外線ＬＥＤを使用して簡単に取得することができる。好ましくは、励起は、ＬＥＤを使用して行われ、後者は、エネルギー損失がほとんどなく、したがって、除去される熱がほとんどない。
【0276】
さらに、有利なことに、励起は、ストリップの表面上で、特に検出ゾーンおよび対照ゾーンのレベルで均一に実行される。この均一性は、紫外線ランプだけでなく、検出ゾーンと対照ゾーンの周囲に配置された低電力のいくつかのＬＥＤでも達成することができる。一例として、図７に示すように、４つのＬＥＤからなる４つのグループを使用することができる。図７のスキームは、ストリップの検出ゾーンおよび対照ゾーンの周囲に複数のＬＥＤを配置するための可能なスキームの１つを示している。
【0277】
励起出力密度は、０．５～２０ｍＷ／ｃｍ２、特に１～１０ｍＷ／ｃｍ２であってもよい。
【0278】
本発明による毛細管現象試験の商業的適用の文脈では、励起中に生成された熱を効果的に除去することができると仮定して、所定の励起出力で得られる検出感度と、問題の励起出力を得るために必要な励起源のコストとの比を考慮して、性能指数を定義することができる。有利なことに、本発明による診断キットは、この性能指数を最適化することを可能にする。
【0279】
特に有利な実施形態によれば、結果の読み取りは、特に分析物の定性的特徴付けの文脈では、毛細管現象試験デバイスの直接の肉眼観察、特に検出ゾーン、場合により対照ゾーンの直接の肉眼観察を、発光フィルタを使用して行うことができる。
【0280】
発光フィルタを使用すると、ルミネッセンスイオンの特徴的な発光バンドを選択して、非特異的なシグナルを除外することが可能である。一例として、Ｙ１－ｘＥｕｘＶＯ４ナノ粒子を使用する場合、発光される光度は、ＹＶＯ４マトリックス中のＥｕ３＋のルミネッセンス波長、すなわち６１７ｎｍで検出することができる。発光フィルタは、干渉フィルタまたはハイパスフィルタであってもよい。
【0281】
あるいは、単純な検出装置を使用して結果を読み取ることもできる。後者は、発光フィルタおよび検出器を含んでもよい。
【0282】
検出器は、光子検出器である。
【0283】
それは、単一の検出器、特に光電子増倍管、フォトダイオード、またはアバランシェフォトダイオードタイプの単一の検出器であってもよく、またはＣＣＤカメラまたはＥＭ－ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラなどの２Ｄ表面の検出画素からなる感光性デバイスのアレイのタイプの検出器であってもよい。
【0284】
好ましくは、２Ｄと呼ばれる、カメラなどの検出デバイスである。したがって、ラテラルフローアッセイに使用されるストリップの２Ｄ画像を取得することが可能になる。
【0285】
例えば、検出器は、スマートフォンのＣＣＤまたはＣＭＯＳセンサであってもよい。
【0286】
有利には、本発明による毛細管現象試験は、発光のシグナルの取得時間が短い。特に、ルミネッセンスは、数秒、特に１秒未満、特に１００ミリ秒未満で測定することができる。好ましくは、発光シグナルの取得時間は、スマートフォンのカメラによる画像の取得時間と適合していなければならない。
【0287】
ラテラルフローアッセイの結果の分析
次に、ルミネッセンス結果を解釈することができる。
次に、ルミネッセンス結果を解釈することができる。
【0288】
ラテラルフローアッセイの結果の分析は、例えば、肉眼による単純な視覚的観察によって、または例えばＣＣＤカメラで得られたストリップの２Ｄ画像、例えばスマートフォンで記録された写真を目視で読み取ることによって、検出ゾーンおよび／または対照ゾーンのレベルでのプローブの存在の単純な決定（定性的測定）からなってもよい。
【0289】
これにより、分析対象のサンプルにアッセイの目的物質が存在するかどうかを判断することが可能である。
【0290】
例えば、「サンドイッチ」タイプのラテラルフローアッセイの文脈では、結果の定性的解釈は、以下のようになってもよい：
・２つのバンドが存在する場合、試験は陽性である；
・単一の対照バンドが存在する場合、試験は陰性である；
・単一の試験バンドが存在する場合、試験は無効である；
・バンドが存在しない場合、試験は無効である。
・２つのバンドが存在する場合、試験は陽性である；
・単一の対照バンドが存在する場合、試験は陰性である；
・単一の試験バンドが存在する場合、試験は無効である；
・バンドが存在しない場合、試験は無効である。
【0291】
有利なことに、本発明による検出方法は、金ナノ粒子をプローブとして使用するまったく同一の毛細管現象試験の検出限界の、１０分の１まで、特に１００倍分の１まで、さらには１０００分の１までの定性的測定を可能にする。
【0292】
毛細管現象試験の結果の分析はまた、分析される物質の定量的特徴付け、言い換えれば、ルミネッセンス結果を解釈することにより、サンプル内の当該物質の濃度の決定を含んでもよい。
【0293】
次に、本発明により使用される検出システムは、ルミネッセンス発光を分析するための任意の手段、例えば、ルミネッセンスシグナルを記録および利用することを可能にする変換器をさらに含んでもよい。
【0294】
ルミネッセンス測定は、事前に確立された標準またはキャリブレーションを参照することで解釈することができる。
【0295】
上で見たように、サンドイッチタイプのアッセイの文脈では、検出ゾーンのルミネッセンスシグナルは増加し、特に分析物の濃度に比例するが、競合アッセイの文脈では反比例する可能性がある。
【0296】
キャリブレーションを参照することによる定量化は、例えば、分析される物質の異なる濃度を含む、キャリブレーションバンドと呼ばれるいくつかの対照バンドを使用して行われてもよい。
【0297】
ルミネッセンス測定の解釈は、特に、検出ゾーンからのルミネッセンスシグナルと対照ゾーンからのルミネッセンスシグナルとの比率を利用することができる。
【0298】
ルミネッセンスを解釈するためのこれらの手段は、例えば、スマートフォンアプリケーション内で組み合わされて、得られた画像を分析し、得られた結果の定量的値を与えることが可能である。
【0299】
あるいは、本発明により使用される検出システムは、２Ｄ検出器、画像を記録するためのシステム、および画像分析ソフトウェアを使用することができる。
【0300】
あるいは、２Ｄ検出器をリーダに統合し、記録された画像をスマートフォンまたはその他のシステムに転送して、画像の分析を可能にすることもできる。
【0301】
特に分析物の定量的特徴付けのための（例えば、分析ソフトウェアによる）結果の分析は、例えば、検出ゾーン、対照ゾーン、およびバックグラウンドシグナルに対応するシグナルの決定を含んでもよい。バックグラウンドシグナルのルミネッセンスの値は、他の２つのゾーンの値から差し引かれる。次に、検出ゾーンからのシグナルと対照ゾーンからのシグナルの比率を計算する。
【0302】
より正確には、特に分析物の定量的特徴付けのための（例えば、分析ソフトウェアによる、または有利なことに、検出デバイス（スマートフォンまたは他のもの）にロードされたアプリケーションによる）結果の分析は、例えば、（ｉ）検出ゾーンでのルミネッセンスレベルＬＤの決定、対照ゾーンでのルミネッセンスレベルＬＣの決定、およびユーザが同定したマーカーのないゾーンでのルミネッセンスレベルＬＢ（バックグラウンドシグナル）の測定、（ｉｉ）式ＳＤ／Ｃ＝（ＬＤ／Ｃ－ＬＢ）での生のシグナルＳＤおよびＳＣの計算、（ｉｉｉ）検出ゾーンおよび対照ゾーンの最適な位置測定を可能にするＳＤ／Ｃの最大化のためのアルゴリズムの使用、（ｉｖ）レシオメトリックシグナルＲ＝ＳＤ／ＳＣまたはＲ＝ＳＤ／（ＳＤ＋ＳＣ）の計算および（ｖ）分析物の絶対濃度を決定するためのキャリブレーションテーブルとＲの値との比較を含んでもよい。検出ゾーンの自動配置（ステップｉｉｉ）により、ユーザによってもたらされたバイアスを回避し、再現性のある定量的測定値を取得することが可能である。あるいは、検出バンドおよび対照バンドの位置は、ユーザの介入なしに完全に自動的に選択することができる。後者の場合、ストリップ上の検出バンドおよび対照バンドの位置とリーダ内のストリップの位置が常に同じであることが重要である。
【0303】
「サンドイッチ」タイプのアッセイの文脈では、結果の分析は、好ましくは、比率Ｒ＝ＳＤ／ＳＤ＋ＳＣの計算を含む。実際、「サンドイッチ」タイプのアッセイの文脈では、分析物の濃度が高いほど、シグナルＳＤが大きくなり、シグナルＳＣが小さくなる（対照ゾーンに移行するために使用できるプローブが少なくなる）。
【0304】
励起、ルミネッセンスの検出、および結果の分析のためのすべての要素は、毛細管現象試験デバイスのリーダ、例えばストリップリーダと呼ばれるケース内で組み合わせることができる。
【0305】
例えば、試験結果を読み取る目的で１つまたは複数のストリップを挿入するために、ストリップリーダに開口部を作ることができる。
【0306】
記録された画像をデータ分析装置に転送できるように、ＵＳＢ接続または同等のものを含む開口部を設けることもできる。
【0307】
本発明による方法は、有利なことに、サンプル中の目的の物質を、厳密に５ｎｇ／ｍＬ未満、特に０．５ｎｇ／ｍＬ未満、またはさらには０．０５ｎｇ／ｍＬ未満の含有量で検出することを可能にする。この性能は当然、分析物、および使用する特定の結合試薬の効率に依存する。
【0308】
有利なことに、本発明による検出方法は、金ナノ粒子をプローブとして使用するまったく同一の毛細管現象試験の定量限界の１０分の１まで、特に１００分の１まで、さらには１０００分の１までの定量的測定を可能にする。
【0309】
以下に提示される例および図は、例示の目的でのみ与えられており、本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0310】
【図1】ラテラルフローアッセイ用のストリップの断面図での模式図。
【図2】沈着ゾーン（１）のレベル（上図）およびアッセイの終了時（下図）での分析物（１１）を含む分析される液体サンプルを適用する前の「サンドイッチ」タイプのアッセイの模式図。
【図3】沈着ゾーン（１）のレベル（上図）およびアッセイの終了時（下図）での分析物（１１）を含む分析される液体サンプルを適用する前の２つの変形例による「競合」アッセイの手順の模式図。
【図5】例１．１．ａによる約３００個のナノ粒子のセットのＴＥＭ画像から決定されたナノ粒子サイズのヒストグラム。
【図6】５、０．５、０．０５ｎｇ／ｍＬのｈ－ＦＡＢＰ抗原を含む溶液を紫外線ランプを照射して移動した後の、例３のアッセイによるストリップの写真。左側に検出バンド、右側に対照バンドがある。吸収パッドは画像の右端にある。写真に示されているルミネッセンスシグナルは、ＩｍａｇｅＪによって分析した。結果を図７に示す。
【図7】例３によりテストストリップで試験した５、０．５、０．０５、および０ｎｇ／ｍＬのｈ－ＦＡＢＰを含む液体サンプルについて、ＩｍａｇｅＪによって測定した比率Ｒ＝ＳＤ／ＳＤ＋ＳＣの結果。点は、Ｒの平均値を表し、エラーバーは、それぞれ３本と２本のストリップに関連する標準偏差を表す。
【図8】ラテラルフローアッセイ用のストリップを含むケースの上面図の模式図。
【図9】ナノ粒子の励起に４つの紫外線ＬＥＤの４つのグループ（「ＬＥＤ＃１」から「ＬＥＤ＃４」）を使用したストリップリーダのスキーム。ストリップは、挿入レール（２０）のレベルでリーダに挿入することができる。読み取りは、カバーの開口部から行われ、その中には、ナノ粒子の発光（例では６１７ｎｍを中心とする）を選択し、励起波長（例では２８０ｎｍを中心とする）を拒否することを可能にするフィルタが配置されている。フィルタは、干渉フィルタまたはハイパスフィルタであってもよい。カメラ、例えば携帯電話のＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラは、画像を記録するためにこの開口部の前に配置される。
【図10】Ａｎｄｒｏｉｄ（Ｓａｍｓｕｎｇ）で動作する専用アプリケーションを使用したストリップの結果の分析の図。左：検出ゾーン、バックグラウンドシグナルのゾーンおよび対照ゾーンについて、上から下に向かって累積的なルミネッセンスのレベルが計算される長方形のストリップの白黒画像。右：Ａｎｄｒｏｉｄ分析アプリケーションが実行されている携帯電話のスクリーンショット。累積的なルミネッセンスのレベルの計算が行われる長方形のストリップの白黒画像、ならびに「捕捉」、「測定」、「調整」および「保存」の機能を見ることができる。
【図11-a】例により合成されたＹ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４ナノ粒子の溶液の吸光度スペクトル。
【図11-b】例のラテラルフローアッセイに使用されるようにバッキングカードに接着されたニトロセルロース膜を石英キュベットに挿入し、２８０、３００、および３８０ｎｍで励起したときの発光スペクトル（励起スリットの幅５ｎｍ）。発光は、スペクトル全体にわたって３８０ｎｍで、より具体的にはＹ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４ナノ粒子に基づくプローブからのシグナルが検出される波長である６１７ｎｍで励起した後、はるかに強くなる。
【図12】発光波長を６１７ｎｍに固定したＹ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４ナノ粒子の励起スペクトル（図の左側）および励起波長を２７８ｎｍに固定した発光スペクトル（図の右側）。
【図15】発光波長をＥｕ３＋イオンを含むナノ粒子については６１７ｎｍに固定し、Ｄｙ３＋イオンを含むナノ粒子については５７３ｎｍに固定したＹ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４、Ｌｕ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４、ＬｕＶＯ４：Ｄｙ１０％、Ｌａ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４およびＧｄＶＯ４：Ｄｙ２０％ナノ粒子の励起スペクトル。
【図16】２７８ｎｍの励起波長でのＬｕ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４ナノ粒子の発光スペクトル（ＬｕＶＯ４マトリックスの励起）。発光には、６１７ｎｍにメインピークがあり、５９３ｎｍおよび７００ｎｍに他の２つのピークがある。
【図17】２７８ｎｍの励起波長でのＬｕＶＯ４：Ｄｙ１０％ナノ粒子の発光スペクトル（ＬｕＶＯ４マトリックスの励起）。発光には、４８３ｎｍおよび５７３ｎｍに２つのメインピークがある。
【図18】２７８ｎｍの励起波長でのＬａ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４ナノ粒子の発光スペクトル（ＬａＶＯ４マトリックスの励起）。発光には、６１７ｎｍにメインピークがあり、５９３ｎｍおよび７００ｎｍに他の２つのピークがある。
【図19】２７８ｎｍの励起波長でのＧｄＶＯ４：Ｄｙ２０％ナノ粒子の発光スペクトル（ＧｄＶＯ４マトリックスの励起）。発光には、４８３ｎｍおよび５７３ｎｍに２つのメインピークがある。
【図20】ｙ＝０、ｙ＝０．０５、ｙ＝０．２、ｙ＝０．５およびｙ＝１の場合のＹ（ＶＯ４）１－ｙ（ＰＯ４）ｙ：Ｅｕ２０％ナノ粒子の吸光度スペクトル。希釈前の初期濃度は、約５０ｍＭのバナジン酸イオンの濃度である。
【図21】励起波長を２７８ｎｍに固定したｙ＝０、ｙ＝０．０５、ｙ＝０．２、ｙ＝０．５およびｙ＝１の場合のＹ（ＶＯ４）１－ｙ（ＰＯ４）ｙ：Ｅｕ２０％ナノ粒子の発光スペクトル。希釈前の初期濃度は、約５０ｍＭのバナジン酸イオンの濃度である。
【図22】抗原の非存在下での、対照ラインに固定化されたＢＳＡ－ビオチンを含む「ディップスティック」ストリップ上のＬｕ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４－ＳＡおよびＬｕ０．９Ｄｙ０．１ＶＯ４－ＳＡナノ粒子の移動。ストリップは、３１２ｎｍの紫外線ランプを照射して観察される。干渉フィルタ（それぞれＥｕ３＋およびＤｙ３＋イオンの発光に対してＳｅｍｒｏｃｋ ＦＦ０１－６２０／１４－２５およびＦＦ０３－５７５／２５）を介して検出された発光、Ｉｐｈｏｎｅ６スマートフォンで撮影した画像。対照ラインには２つの明確なバンドが見られる。画像の右側に、吸収パッドまで移動したナノ粒子の発光が見られる。
【0311】
例
１．フォトルミネッセンスプローブの調製
１．１．フォトルミネッセンス無機ナノ粒子の合成
１．１．ａ Ｙ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４ナノ粒子の合成
メタバナジン酸アンモニウムＮＨ４ＶＯ３をメタバナジン酸イオンＶＯ３ －の供給源として使用し、オルトバナジン酸ＶＯ４ ３－は、塩基、この場合は水酸化テトラメチルアンモニウム、Ｎ（ＣＨ３）４ＯＨとの反応後にその場で得られる。Ｙ３＋およびＥｕ３＋イオンの供給源として、硝酸イットリウムおよび硝酸ユウロピウムを使用した。
１．フォトルミネッセンスプローブの調製
１．１．フォトルミネッセンス無機ナノ粒子の合成
１．１．ａ Ｙ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４ナノ粒子の合成
メタバナジン酸アンモニウムＮＨ４ＶＯ３をメタバナジン酸イオンＶＯ３ －の供給源として使用し、オルトバナジン酸ＶＯ４ ３－は、塩基、この場合は水酸化テトラメチルアンモニウム、Ｎ（ＣＨ３）４ＯＨとの反応後にその場で得られる。Ｙ３＋およびＥｕ３＋イオンの供給源として、硝酸イットリウムおよび硝酸ユウロピウムを使用した。
【0312】
０．１ＭのＮＨ４ＶＯ３および０．２ＭのＮ（ＣＨ３）４ＯＨの１０ｍＬ水溶液（溶液１）を新たに調製する。
【0313】
０．１Ｍのイオン（Ｙ３＋＋Ｅｕ３＋）でのＹ（ＮＯ３）３およびＥｕ（ＮＯ３）３の別の１０ｍＬ溶液（溶液２）を、シリンジポンプで溶液１に１ｍＬ／分の流量で滴下する。
【0314】
Ｙ（ＮＯ３）３対Ｅｕ（ＮＯ３）３のモル濃度比は、ナノ粒子中のＹ３＋およびＥｕ３＋イオンの所望の比の関数として選択され、典型的には、モル比Ｙ３＋：Ｅｕ３＋は、０．６：０．４である。
【0315】
Ｙ（ＮＯ３）３／Ｅｕ（ＮＯ３）３溶液を添加すると、溶液は拡散性になり、沈殿物を形成することなく白色／乳白色に見える。合成は、すべてのＹ（ＮＯ３）３／Ｅｕ（ＮＯ３）３溶液が添加されるまで続く。
【0316】
２０ｍＬの最終溶液は、過剰な対イオンを除去するために精製する必要がある。この目的のために、１１０００ｇ（Ｓｉｇｍａ ３Ｋ１０、Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で８０分間遠心分離（通常は３回）、各遠心分離後の超音波処理（Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、最大出力１３０Ｗ、５０％で４０秒間動作）による再分散を、導電率が１００μＳ．ｃｍ－１を厳密に下回るまで使用する。化学導電率計を使用して導電率を測定する。
【0317】
テトラメチルアンモニウムカチオンが表面に固定化されているＹ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４ナノ粒子の合成は、以下のように記載できる。
【化1】
【0318】
結果
ボトル内で１６時間放置した後のナノ粒子の溶液の目視観察は、均一に拡散する溶液を示している。
ボトル内で１６時間放置した後のナノ粒子の溶液の目視観察は、均一に拡散する溶液を示している。
【0319】
最終溶液は、合成の最終ｐＨ（約ｐＨ５）で数ヶ月後でも、水中で非常に安定している。イオン強度は高い（＞０．１Ｍ）が、溶液は合成媒体を含めて（過剰な対イオンを除去する前に）安定したままである。
【0320】
対イオンを除去した後、ＤＬＳ－ゼータ電位装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ９０、Ｍａｌｖｅｒｎ社）で決定したナノ粒子のゼータ電位は、ｐＨ７で－３８．４ｍＶである。
【0321】
ＴＥＭによるナノ粒子の観察（図４）は、ナノ粒子が細長い楕円形であることを示している。ナノ粒子の寸法は、約３００個のナノ粒子のセットのＴＥＭ画像から決定される（図５）。本発明のナノ粒子は、ａで示される長軸の長さが２０～６０ｎｍであり、平均値が約４０ｎｍであり、ｂで示される短軸の長さが１０～３０ｎｍであり、平均値が約２０ｎｍである。
【0322】
Ｙ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４ナノ粒子の励起スペクトルおよび発光スペクトルを図１２に示す。励起スペクトルには２７８ｎｍにピークがあり、発光スペクトルには６１７ｎｍにメインピークがあり、５９３ｎｍおよび７００ｎｍに２つのピークがある。
【0323】
ＹＶＯ４マトリックスのＥｕ３＋イオンは、他のルミネッセンスランタニドイオンに置き換えることができる。この場合、Ｖ－Ｏ電荷移動遷移に関連するＶＯ４
３－バナジン酸イオンの吸収ピーク周辺の励起スペクトルおよび吸収スペクトルは変化しない。発光スペクトルは、各ランタニドイオンの発光スペクトルの典型である。
【0324】
１．１．ｂ Ｙ０．９５Ｄｙ０．０５ＶＯ４（ＹＶＯ４：Ｄｙ５％）ナノ粒子の合成
合成は、０．１Ｍのイオン（Ｙ３＋＋Ｄｙ３＋）でＹ（ＮＯ３）３およびＤｙ（ＮＯ３）３からなる溶液２を除いて、例１．１．ａ．の合成と同じである。溶液２を、シリンジポンプで溶液１に１ｍＬ／分の流量で滴下する。
合成は、０．１Ｍのイオン（Ｙ３＋＋Ｄｙ３＋）でＹ（ＮＯ３）３およびＤｙ（ＮＯ３）３からなる溶液２を除いて、例１．１．ａ．の合成と同じである。溶液２を、シリンジポンプで溶液１に１ｍＬ／分の流量で滴下する。
【0325】
Ｙ（ＮＯ３）３対Ｄｙ（ＮＯ３）３のモル濃度比は、ナノ粒子中のＹ３＋およびＤｙ３＋イオンの所望の比の関数として選択され、この場合、モル比Ｙ３＋：Ｄｙ３＋は、０．９５：０．０５である。
【0326】
これらのナノ粒子の励起スペクトルおよび発光スペクトルを図１３に示す。Ｄｙ３＋イオンの発光には、４８３ｎｍおよび５７３ｎｍに２つのメインピークがある。
【0327】
１．１．ｃ Ｙ０．９７Ｓｍ０．０３ＶＯ４（ＹＶＯ４：Ｓｍ３％）ナノ粒子の合成
合成は、０．１Ｍのイオン（Ｙ３＋＋Ｓｍ３＋）でＹ（ＮＯ３）３およびＳｍ（ＮＯ３）３からなる溶液２を除いて、例１．１．ａ．の合成と同じである。溶液２を、シリンジポンプで溶液１に１ｍＬ／分の流量で滴下する。
合成は、０．１Ｍのイオン（Ｙ３＋＋Ｓｍ３＋）でＹ（ＮＯ３）３およびＳｍ（ＮＯ３）３からなる溶液２を除いて、例１．１．ａ．の合成と同じである。溶液２を、シリンジポンプで溶液１に１ｍＬ／分の流量で滴下する。
【0328】
Ｙ（ＮＯ３）３対Ｓｍ（ＮＯ３）３のモル濃度比は、ナノ粒子中のＹ３＋およびＳｍ３＋イオンの所望の比の関数として選択され、この場合、モル比Ｙ３＋：Ｓｍ３＋は、０．９７：０．０３である。
【0329】
これらのナノ粒子の励起スペクトルおよび発光スペクトルを図１４に示す。
【0330】
さらに、ＹＶＯ４マトリックスのＹ３＋イオンは、Ｇｄ３＋、Ｌｕ３＋およびＬａ３＋などの他のイオンに置き換えることができる（次の例を参照）。これらすべてのマトリックスＧｄＶＯ４、ＬｕＶＯ４およびＬａＶＯ４の場合、Ｖ５＋－Ｏ２
－電荷移動遷移に関連するＶＯ４
３－バナジン酸イオンの吸収ピーク周辺の励起スペクトルおよび吸収スペクトルは、ＹＶＯ４マトリックスと比較して変化しない。さらに、これらのマトリックスＧｄＶＯ４、ＬｕＶＯ４およびＬａＶＯ４では、Ｅｕ３＋イオンは、他のルミネッセンスランタニドイオンに置き換えることができる。発光スペクトルは、各ランタニドイオンの発光スペクトルの典型である。マトリックスおよびルミネッセンスランタニドイオンの様々な代表的な組み合わせを以下に示す。
【0331】
１．１．ｄ Ｌｕ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４ナノ粒子の合成
合成は、０．１Ｍのイオン（Ｌｕ３＋＋Ｅｕ３＋）でＬｕ（ＮＯ３）３およびＥｕ（ＮＯ３）３からなる溶液２を除いて、例１．１．ａ．の合成と同じである。溶液２を、シリンジポンプで溶液１に１ｍＬ／分の流量で滴下する。
合成は、０．１Ｍのイオン（Ｌｕ３＋＋Ｅｕ３＋）でＬｕ（ＮＯ３）３およびＥｕ（ＮＯ３）３からなる溶液２を除いて、例１．１．ａ．の合成と同じである。溶液２を、シリンジポンプで溶液１に１ｍＬ／分の流量で滴下する。
【0332】
Ｌｕ（ＮＯ３）３対Ｅｕ（ＮＯ３）３のモル濃度比は、ナノ粒子中のＬｕ３＋およびＥｕ３＋イオンの所望の比の関数として選択され、この場合、モル比Ｌｕ３＋：Ｅｕ３＋は、０．６：０．４である。
【0333】
Ｌｕ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４ナノ粒子の励起スペクトルを図１５に示し、発光スペクトルを図１６に示す。ＬｕＶＯ４マトリックスのＥｕ３＋イオンの発光スペクトルは、ＹＶＯ４マトリックスの発光スペクトルと比較して実質的変化せず（図１２）、６１７ｎｍにメインピークがあり、５９３ｎｍおよび７００ｎｍに２つのピークがある。
【0334】
１．１．ｅ ＬｕＶＯ４：Ｄｙ１０％ナノ粒子の合成
合成は、０．１Ｍのイオン（Ｌｕ３＋＋Ｄｙ３＋）でＬｕ（ＮＯ３）３およびＤｙ（ＮＯ３）３からなる溶液２を除いて、例１．１．ａ．の合成と同じである。溶液２を、シリンジポンプで溶液１に１ｍＬ／分の流量で滴下する。
合成は、０．１Ｍのイオン（Ｌｕ３＋＋Ｄｙ３＋）でＬｕ（ＮＯ３）３およびＤｙ（ＮＯ３）３からなる溶液２を除いて、例１．１．ａ．の合成と同じである。溶液２を、シリンジポンプで溶液１に１ｍＬ／分の流量で滴下する。
【0335】
Ｌｕ（ＮＯ３）３対Ｄｙ（ＮＯ３）３のモル濃度比は、ナノ粒子中のＬｕ３＋およびＤｙ３＋イオンの所望の比の関数として選択され、この場合、モル比Ｌｕ３＋：Ｄｙ３＋は、０．９：０．１である。
【0336】
ＬｕＶＯ４：Ｄｙ１０％ナノ粒子の励起スペクトルを図１６に示し、発光スペクトルを図１７に示す。ＬｕＶＯ４マトリックスのＤｙ３＋イオンの発光スペクトルは、ＹＶＯ４マトリックスの発光スペクトルと比較して実質的変化せず（図１３）、４８３ｎｍおよび５７３ｎｍに２つのピークがある。
【0337】
１．１．ｆ Ｌａ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４ナノ粒子の合成
合成は、０．１Ｍのイオン（Ｌａ３＋＋Ｅｕ３＋）でＬａ（ＮＯ３）３およびＥｕ（ＮＯ３）３からなる溶液２を除いて、例１．１．ａ．の合成と同じである。溶液２を、シリンジポンプで溶液１に１ｍＬ／分の流量で滴下する。
合成は、０．１Ｍのイオン（Ｌａ３＋＋Ｅｕ３＋）でＬａ（ＮＯ３）３およびＥｕ（ＮＯ３）３からなる溶液２を除いて、例１．１．ａ．の合成と同じである。溶液２を、シリンジポンプで溶液１に１ｍＬ／分の流量で滴下する。
【0338】
Ｌａ（ＮＯ３）３対Ｅｕ（ＮＯ３）３のモル濃度比は、ナノ粒子中のＬａ３＋およびＥｕ３＋イオンの所望の比の関数として選択され、この場合、モル比Ｌａ３＋：Ｅｕ３＋は、０．６：０．４である。
【0339】
Ｌａ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４ナノ粒子の励起スペクトルを図１５に示し、発光スペクトルを図１８に示す。ＬａＶＯ４マトリックスのＥｕ３＋イオンの発光スペクトルは、ＹＶＯ４マトリックスの発光スペクトルと比較して実質的変化せず（図１２）、６１７ｎｍにメインピークがあり、５９３ｎｍおよび７００ｎｍに２つのピークがある。
【0340】
１．１．ｇ ＧｄＶＯ４：Ｄｙ２０％ナノ粒子の合成
これらのナノ粒子の合成は、オルトバナジン酸前駆体から出発して、以下のように行われる。０．１ＭのＮａＶＯ４の１０ｍＬ水溶液（溶液１）を新たに調製し、１ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを１２．６～１３に調整する。
これらのナノ粒子の合成は、オルトバナジン酸前駆体から出発して、以下のように行われる。０．１ＭのＮａＶＯ４の１０ｍＬ水溶液（溶液１）を新たに調製し、１ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを１２．６～１３に調整する。
【0341】
０．１Ｍのイオン（Ｇｄ３＋＋Ｄｙ３＋）でのＧｄ（ＮＯ３）３およびＤｙ（ＮＯ３）３の別の１０ｍＬ溶液（溶液２）を、撹拌しながらシリンジポンプで溶液１に１ｍＬ／分の流量で滴下する。
【0342】
Ｇｄ（ＮＯ３）３対Ｄｙ（ＮＯ３）３のモル濃度比は、ナノ粒子中のＧｄ３＋およびＤｙ３＋イオンの所望の比の関数として選択され、この場合、モル比Ｇｄ３＋：Ｄｙ３＋は、０．８：０．２である。
【0343】
Ｇｄ（ＮＯ３）３／Ｄｙ（ＮＯ３）３溶液を添加すると、乳白色の沈殿物が形成される。合成は、すべてのＹ（ＮＯ３）３／Ｅｕ（ＮＯ３）３溶液が添加されるまで続く。ｐＨが８～９で安定するまで、溶液を３０分間撹拌する。
【0344】
過剰な対イオンを除去するには、例１．１．ａのように２０ｍＬの最終溶液を精製する必要がある。この目的のために、１１０００ｇ（Ｓｉｇｍａ ３Ｋ１０、Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で１５分間遠心分離（通常は３回）、各遠心分離後の超音波処理（Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、最大出力１３０Ｗ、５０％で４０秒間動作）による再分散を、導電率が１００μＳ．ｃｍ－１を厳密に下回るまで使用する。
【0345】
ＧｄＶＯ４：Ｄｙ２０％ナノ粒子の励起スペクトルを図１５に示し、発光スペクトルを図１９に示す。ＧｄＶＯ４マトリックスのＤｙ３＋イオンの発光スペクトルは、ＹＶＯ４マトリックスの発光スペクトルと比較して実質的変化せず（図１３）、４８３ｎｍおよび５７３ｎｍに２つのピークがある。
【0346】
１．１．ｈ Ｙ（ＶＯ４）１－ｙ（ＰＯ４）ｙ：Ｅｕ２０％ナノ粒子の合成
異なるＶＯ４ ３－：ＰＯ４ ３－比でマトリックス中にＶＯ４ ３－およびＰＯ４ ３－イオンの混合物を含むナノ粒子も合成した。
異なるＶＯ４ ３－：ＰＯ４ ３－比でマトリックス中にＶＯ４ ３－およびＰＯ４ ３－イオンの混合物を含むナノ粒子も合成した。
【0347】
合成は、０．１Ｍのイオン（ＶＯ３
－＋ＰＯ４
３－）および０．２（１－ｙ）ＭのＮ（ＣＨ３）４ＯＨの合計濃度で０．１ｙＭのＮａ３ＰＯ４、０．１（１－ｙ）ＭのＮＨ４ＶＯ３からなる溶液１を除いて、例１．１．ａ．の合成と同じである。上記濃度の１０ｍＬ水溶液（溶液１）を新たに調製する。ｙ＝０、ｙ＝０．０５、ｙ＝０．２、ｙ＝０．５、ｙ＝１のＮＰを調製した。
【0348】
ＰＯ４
３－イオンは２７８ｎｍで吸収を示さない。したがって、ＰＯ４
３－イオンを１００％含むナノ粒子には、２７８ｎｍに吸収ピークがない（図２０を参照）。これらのナノ粒子の発光スペクトルは、図２１に示すが、ｙが１と異なるすべての値で同一である（ｙ＝１では発光は観測されない）。それらには、６１７ｎｍにメインピークがあり、５９３ｎｍおよび７００ｎｍに２つの追加ピークがある。これらの発光スペクトルは、実質的に同一である。
【0349】
１．２．ナノ粒子のタンパク質への共有結合（抗ｈ－ＦＡＢＰ抗体）
ポイント１．１．ａ．に記載したように得られたＹ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４ナノ粒子は、以下のプロトコルにより抗体に結合される。
ポイント１．１．ａ．に記載したように得られたＹ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４ナノ粒子は、以下のプロトコルにより抗体に結合される。
【0350】
１．２．１ナノ粒子のシリカ層を用いたコーティング
ナノ粒子の合成の終了時に、ナノ粒子の溶液を１７０００ｇで３分間遠心分離して、ナノ粒子の凝集体を沈殿させ、上清を回収する。サイズによる選択を行う。この目的のために、１９００ｇで３分間の遠心分離を数回行う。各遠心分離に続いて、超音波処理器でナノ粒子を再分散させ、次いで、ナノ粒子のサイズをＤＬＳ－ゼータ電位装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ９０、Ｍａｌｖｅｒｎ社）を使用して決定する。
ナノ粒子の合成の終了時に、ナノ粒子の溶液を１７０００ｇで３分間遠心分離して、ナノ粒子の凝集体を沈殿させ、上清を回収する。サイズによる選択を行う。この目的のために、１９００ｇで３分間の遠心分離を数回行う。各遠心分離に続いて、超音波処理器でナノ粒子を再分散させ、次いで、ナノ粒子のサイズをＤＬＳ－ゼータ電位装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ９０、Ｍａｌｖｅｒｎ社）を使用して決定する。
【0351】
バナジン酸イオンの濃度が２０ｍＭである２５ｍＬのＹ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４粒子を調製する。粒子の表面をコーティングするために、２．５ｍＬの純粋なケイ酸ナトリウムの別の溶液（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社１．０５６２１．２５００）をピペットで滴下する。この溶液を少なくとも５時間、撹拌しながら作用させる。
【0352】
次に、溶液を精製し、過剰なケイ酸およびナトリウム対イオンを除去する。溶液を１１０００ｇ（Ｓｉｇｍａ ３Ｋ１０、Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で６０分間遠心分離し、超音波処理（Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、４００Ｗの電力で５０％で動作）によって再分散させる。このステップは、溶液の導電率が１００μＳ／ｃｍ未満になるまで繰り返す。
【0353】
１．２．２．ナノ粒子の表面へのアミンのグラフト化
３つ口タイプの５００ｍＬフラスコに２２５ｍＬの無水エタノールを入れ、最終濃度１．１２５ｍＭに相当する２６５μＬのＡＰＴＥＳ（３－アミノプロピルトリエトキシシラン）（分子量２２１．３７ｇ／ｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加する。この量は、導入されたバナジン酸の５当量に相当する。次いで、コンデンサをフラスコに取り付ける。全体をフラスコヒーターに配置し、フードの下に置く。混合物を９０℃の還流下で加熱する。３つ口フラスコの入口の１つに、ｐＨ９で７５ｍＬの水中ナノ粒子のコロイド溶液（バナジン酸イオンの濃度［Ｖ］＝３ｍＭ）を、蠕動ポンプを使用して１ｍＬ／分の流量で滴下する。全体を撹拌しながら２４時間加熱する。
３つ口タイプの５００ｍＬフラスコに２２５ｍＬの無水エタノールを入れ、最終濃度１．１２５ｍＭに相当する２６５μＬのＡＰＴＥＳ（３－アミノプロピルトリエトキシシラン）（分子量２２１．３７ｇ／ｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加する。この量は、導入されたバナジン酸の５当量に相当する。次いで、コンデンサをフラスコに取り付ける。全体をフラスコヒーターに配置し、フードの下に置く。混合物を９０℃の還流下で加熱する。３つ口フラスコの入口の１つに、ｐＨ９で７５ｍＬの水中ナノ粒子のコロイド溶液（バナジン酸イオンの濃度［Ｖ］＝３ｍＭ）を、蠕動ポンプを使用して１ｍＬ／分の流量で滴下する。全体を撹拌しながら２４時間加熱する。
【0354】
４８時間後、ロータリーエバポレータ（ｒｏｔａｖａｐｏｒ Ｒ－１００、ＢＵＣＨＩ社）を使用してナノ粒子を部分的に濃縮する。溶液を適切なフラスコで回転させ、５０℃の浴で加熱する。
【0355】
回収された溶液を、エタノール：水（３：１）溶媒中での数回の遠心分離によって精製する。精製後、上記のプロトコルに従って、サイズによる選別を行う。
【0356】
１．２．３．アミノ化ナノ粒子の表面へのカルボキシルのグラフト化
グラフト化を開始する前に、溶媒の移動を行う。
グラフト化を開始する前に、溶媒の移動を行う。
【0357】
移動プロトコルは以下の通りである。
【0358】
アミノ化ＮＰをＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏ緩衝液からＤＭＦまたはＤＭＳＯに移し、数回の遠心分離（１３０００ｇ、９０分）を行う。各遠心分離間の超音波処理（７５％で２０秒）により、ペレットを再分散させる。ＮＰの濃度を測定および決定する。
【0359】
５ｍＬのＤＭＦでＮＰＳを回収し、１０％の無水コハク酸をガラスビーカーに添加する（つまり、５ｍＬ中０．５ｇ）。撹拌しながら、不活性雰囲気下で少なくとも一晩反応させる。
【0360】
カルボキシル化ＮＰを少なくとも２回、遠心分離（１３０００ｇで６０分間、Ｌｅｇｅｎｄ Ｍｉｃｒｏ １７ｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で洗浄し、ＤＭＦと過剰の無水コハク酸を除去する。
【0361】
超音波処理（Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）により、カルボキシル化粒子を水またはｐＨ６のＭＥＳ緩衝液に再懸濁させる。
【0362】
１．２．４．ナノ粒子の抗ｈ－ＦＡＢＰ抗体への結合
ＣＯＯＨで表面グラフト化されたナノ粒子の結合は、以下のプロトコルにより行う。
１．ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５～６）中のＥＤＣ／Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ（それぞれ濃度５００ｍｇ／ｍＬおよび５００ｍｇ／ｍＬ）の混合溶液を新たに調製する。
２．事前に調製した３ｍＬの溶液に、９０ｎＭのＮＰ（この場合は参考文献Ｃａｓａｎｏｖａら［３７］により、バナジン酸イオンの濃度から算出したナノ粒子の濃度）を添加し、室温で２５分間、撹拌しながら反応させる。
３．ＮＰを少なくとも２回、ＭｉｌｌｉＱ水で遠心分離（１３０００ｇで６０分間、Ｌｅｇｅｎｄ Ｍｉｃｒｏ １７Ｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）ですばやく洗浄し、過剰な試薬を除去する。
４．ｐＨ７．３のリン酸ナトリウム緩衝液で超音波処理した後、最後のペレットを回収する。必要な量のタンパク質（抗ｈ－ＦＡＢＰ抗体、参照４Ｆ２９、１０ Ｅ１、Ｈｙｔｅｓｔ社）を、必要な比率（タンパク質：Ｎｐ）の関数として、典型的には２０：１の比率のために２μＭ、および５ｍｇ／ｍＬのｍＰＥＧ－シラン（ＭＷ：１０ ｋＤ、Ｌａｙｓａｎ Ｂｉｏ ２５６－５８６－９００４）を添加する。
５．この溶液を撹拌しながら室温で２～４時間反応させる。
６．ブロッキング剤（１％のグリシン）を添加して、遊離ＣＯＯＨと反応させ、ＮＰの表面の残留反応部位をブロックする。３０分間反応させる。
７．タンパク質に結合したＮＰを数回、ｐＨ７．２のＰＢＳで遠心分離フィルタ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ０．５ｍＬ、Ｒｅｆ ＵＦＣ５０１０９６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用して遠心分離することにより、洗浄する。保存媒体であるリン酸緩衝液＋Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）＋０．１％グリシン＋１０％グリセロールにＮＰを移す。ＢＣＡアッセイには１００μＬを使用する。残りの溶液をアリコートに分け、－８０℃で凍結する。
ＣＯＯＨで表面グラフト化されたナノ粒子の結合は、以下のプロトコルにより行う。
１．ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５～６）中のＥＤＣ／Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ（それぞれ濃度５００ｍｇ／ｍＬおよび５００ｍｇ／ｍＬ）の混合溶液を新たに調製する。
２．事前に調製した３ｍＬの溶液に、９０ｎＭのＮＰ（この場合は参考文献Ｃａｓａｎｏｖａら［３７］により、バナジン酸イオンの濃度から算出したナノ粒子の濃度）を添加し、室温で２５分間、撹拌しながら反応させる。
３．ＮＰを少なくとも２回、ＭｉｌｌｉＱ水で遠心分離（１３０００ｇで６０分間、Ｌｅｇｅｎｄ Ｍｉｃｒｏ １７Ｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）ですばやく洗浄し、過剰な試薬を除去する。
４．ｐＨ７．３のリン酸ナトリウム緩衝液で超音波処理した後、最後のペレットを回収する。必要な量のタンパク質（抗ｈ－ＦＡＢＰ抗体、参照４Ｆ２９、１０ Ｅ１、Ｈｙｔｅｓｔ社）を、必要な比率（タンパク質：Ｎｐ）の関数として、典型的には２０：１の比率のために２μＭ、および５ｍｇ／ｍＬのｍＰＥＧ－シラン（ＭＷ：１０ ｋＤ、Ｌａｙｓａｎ Ｂｉｏ ２５６－５８６－９００４）を添加する。
５．この溶液を撹拌しながら室温で２～４時間反応させる。
６．ブロッキング剤（１％のグリシン）を添加して、遊離ＣＯＯＨと反応させ、ＮＰの表面の残留反応部位をブロックする。３０分間反応させる。
７．タンパク質に結合したＮＰを数回、ｐＨ７．２のＰＢＳで遠心分離フィルタ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ０．５ｍＬ、Ｒｅｆ ＵＦＣ５０１０９６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用して遠心分離することにより、洗浄する。保存媒体であるリン酸緩衝液＋Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）＋０．１％グリシン＋１０％グリセロールにＮＰを移す。ＢＣＡアッセイには１００μＬを使用する。残りの溶液をアリコートに分け、－８０℃で凍結する。
【0363】
さらに、例１．１．ｂから１．１．ｈにより合成したすべてのナノ粒子は、Ｙ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４ナノ粒子の場合と同じ方法で、抗体に結合することができる。
【0364】
１．３．ナノ粒子のタンパク質への受動的結合（抗ｈ－ＦＡＢＰ抗体）
例１．２の共有結合の代わりに、ナノ粒子の抗体への受動的結合も以下のように行うことができる。
・１ｍＬのナノ粒子（５ｍＭのバナジン酸イオンの濃度）の溶液を１５０００ｇで１５分間遠心分離する。
・ペレットを８００μＬのＭｉｌｌｉＱ水に取り、超音波処理（Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、最大出力１３０Ｗ、５０％で４０秒間動作）によって再分散させる。
・リン酸カリウム緩衝液２ｍＭ ｐＨ７．４に２５０μｇ／ｍＬの抗体溶液１００μＬを添加する。
・回転させながら１時間インキュベートする。
・１００μＬのリン酸カリウム緩衝液２０ｍＭ ｐＨ７．４／１％ＢＳＡを添加する。
・１５０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を除去する。
・ペレットを１ｍＬのリン酸カリウム緩衝液２ｍＭ ｐＨ７．４／０．１％ＢＳＡに取る。超音波処理（Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、最大出力１３０Ｗ、５０％で４０秒間動作）によって再分散させる。
・１５０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を除去する。
・ペレットを２５０μＬのリン酸カリウム緩衝液２ｍＭ ｐＨ７．４／０．１％ＢＳＡに取る。超音波処理（Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、最大出力１３０Ｗ、５０％で４０秒間動作）によって再分散させる。
例１．２の共有結合の代わりに、ナノ粒子の抗体への受動的結合も以下のように行うことができる。
・１ｍＬのナノ粒子（５ｍＭのバナジン酸イオンの濃度）の溶液を１５０００ｇで１５分間遠心分離する。
・ペレットを８００μＬのＭｉｌｌｉＱ水に取り、超音波処理（Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、最大出力１３０Ｗ、５０％で４０秒間動作）によって再分散させる。
・リン酸カリウム緩衝液２ｍＭ ｐＨ７．４に２５０μｇ／ｍＬの抗体溶液１００μＬを添加する。
・回転させながら１時間インキュベートする。
・１００μＬのリン酸カリウム緩衝液２０ｍＭ ｐＨ７．４／１％ＢＳＡを添加する。
・１５０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を除去する。
・ペレットを１ｍＬのリン酸カリウム緩衝液２ｍＭ ｐＨ７．４／０．１％ＢＳＡに取る。超音波処理（Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、最大出力１３０Ｗ、５０％で４０秒間動作）によって再分散させる。
・１５０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を除去する。
・ペレットを２５０μＬのリン酸カリウム緩衝液２ｍＭ ｐＨ７．４／０．１％ＢＳＡに取る。超音波処理（Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、最大出力１３０Ｗ、５０％で４０秒間動作）によって再分散させる。
【0365】
２．「サンドイッチ」タイプのストリップでの試験の調製
タンパク質の存在を定性的または定量的に決定するための迅速なテストを開発するには、様々なパラメーターを最適化し、反応時間と試験の感度の間の妥協点を見つける必要がある。
タンパク質の存在を定性的または定量的に決定するための迅速なテストを開発するには、様々なパラメーターを最適化し、反応時間と試験の感度の間の妥協点を見つける必要がある。
【0366】
図１に示すように、アッセイストリップの製造は、以下の４つの重要な部分を組み合わせて行われる。
・本質的に不活性なガラス繊維を標識ゾーン（２）（英語の用語では「コンジュゲートパッド」）（ＧＦＤＸ １０３０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）として使用する。
・沈着ゾーン（英語の用語では「サンプルパッド」）（１）（Ｒｅｆ ＣＦＳＰ１７３０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）として表面修飾ポリエステルを使用する。それらには、タンパク質との弱い非特異的相互作用、優れた牽引力、および優れた取り扱い特性を有するという利点がある。
・ニトロセルロース膜（ＮＣ）（ＨＦ１８０ＭＣ１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を毛細管現象の手段（１０）として使用する。ニトロセルロース膜は、液体の移動およびタンパク質の固定化に最適な特性を備えている。ＮＣ膜は、無孔接着プラスチック（「バッキングカード」）のサポート（６）に接着されている。
・セルロース（ＣＦＳＰ１７３０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を、吸収能力が高いため、吸収パッド（５）として使用する。
・本質的に不活性なガラス繊維を標識ゾーン（２）（英語の用語では「コンジュゲートパッド」）（ＧＦＤＸ １０３０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）として使用する。
・沈着ゾーン（英語の用語では「サンプルパッド」）（１）（Ｒｅｆ ＣＦＳＰ１７３０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）として表面修飾ポリエステルを使用する。それらには、タンパク質との弱い非特異的相互作用、優れた牽引力、および優れた取り扱い特性を有するという利点がある。
・ニトロセルロース膜（ＮＣ）（ＨＦ１８０ＭＣ１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を毛細管現象の手段（１０）として使用する。ニトロセルロース膜は、液体の移動およびタンパク質の固定化に最適な特性を備えている。ＮＣ膜は、無孔接着プラスチック（「バッキングカード」）のサポート（６）に接着されている。
・セルロース（ＣＦＳＰ１７３０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を、吸収能力が高いため、吸収パッド（５）として使用する。
【0367】
心臓のバイオマーカーであるｈ－ＦＡＢＰ（ヒト脂肪酸結合タンパク質）を検出するには、
様々なコンポーネントを組み立てる前に、ＮＣ膜に抗体を沈着させる必要がある。
様々なコンポーネントを組み立てる前に、ＮＣ膜に抗体を沈着させる必要がある。
【0368】
１．ｈ－ＦＡＢＰ（参照４Ｆ２９、９Ｆ３、Ｈｙｔｅｓｔ社）に対するマウスモノクローナル抗体の溶液を１ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈する。この溶液を試験バンド（３）に使用する。マウス抗体に対するヤギポリクローナルＩｇＧ抗体（Ｒｅｆ ａｂ６７０８、Ａｂｃａｍ社）の別の溶液を、１ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈する。後者は対照バンド（４）に使用する。
【0369】
２．抗体溶液を、「ディスペンサー」（Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ Ｂｉｏ社Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｌａｔｅｒａｌ Ｆｌｏｗ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ（ＡＬＦＲＤ））を使用して、ＮＣ膜に沈着させる。シリンジポンプを使用して、ＮＣ膜（長さ約３０ｃｍ、そこからいくつかのストリップを作成する）に沿って、全面に、各バンドについて０．７μＬ／２ｍｍの容量を沈着させる。３７℃で１時間乾燥させる。
【0370】
３．抗体を沈着させた後、ＮＣ膜を０．０４％で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋Ｔｗｅｅｎ２０で希釈した１％ＢＳＡで３７℃で３０分間インキュベートし、抗体が占有していない固定部位を不動態化する。
【0371】
４．ディスペンサーを使用して、ＮＰに結合したＡｂを標識ゾーン（「コンジュゲートパッド」）に沈着させる。３μＬ／４ｍｍの容量をグラスファイバー膜に沿って全面に塗布する。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した１％ＢＳＡでブロッキングする前に、室温で１時間乾燥させる。室温で乾燥させる。
【0372】
ストリップの組み立て
１．Ａｂがすでに固定化されているＮＣの接着部分に、様々な構造（吸収パッドおよび沈着ゾーンとして機能するセルロース、Ａｂ＋ＮＰが沈着される標識ゾーン）を組み立てる。コンポーネントは、ＮＣのプラスチックサポートに、標識ゾーン（「コンジュゲートパッド」）、沈着ゾーン（「サンプルパッド」）、最後に吸収パッドの順序で固定させる。毛細管現象による流体の移動を改善するために、図に示すように（図１）、互いに重なり合うように様々なコンポーネントを取り付ける。
１．Ａｂがすでに固定化されているＮＣの接着部分に、様々な構造（吸収パッドおよび沈着ゾーンとして機能するセルロース、Ａｂ＋ＮＰが沈着される標識ゾーン）を組み立てる。コンポーネントは、ＮＣのプラスチックサポートに、標識ゾーン（「コンジュゲートパッド」）、沈着ゾーン（「サンプルパッド」）、最後に吸収パッドの順序で固定させる。毛細管現象による流体の移動を改善するために、図に示すように（図１）、互いに重なり合うように様々なコンポーネントを取り付ける。
【0373】
２．組み立てた膜をペーパーカッターで４ｍｍ幅に切断する。
【0374】
３．次に、湿度が３０％未満の雰囲気で、吸湿剤（乾燥剤）の存在下でアルミニウムバッグにストリップを保管する。
【0375】
３．ストリップ試験手順
ストリップは、例１．２で調製した抗体に結合されたＹ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４ナノ粒子を使用して調製する。
ストリップは、例１．２で調製した抗体に結合されたＹ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４ナノ粒子を使用して調製する。
【0376】
ｈ－ＦＡＢＰ（参照８Ｆ６５、Ｈｙｔｅｓｔ社）のいくつかの濃度は、５ｎｇ／ｍＬから０．０５ｎｇ／ｍＬまで測定した。組換えｈ－ＦＡＢＰは、緩衝液または血清で目的の濃度に希釈する。
【0377】
１．上記のポイント２で説明したように調製したストリップ、および分析するサンプルを室温に戻してから、試験を行う。
【0378】
２．４００μＬのサンプルをボトルに垂直に沈着させる。
【0379】
３．ストリップをボトルに浸し、沈着ゾーン（「サンプルパッド」）を下に向ける。下部のストリップをタップして移動を開始する。ストリップをチューブ内で垂直位置に、１０分間保持する。
【0380】
４．紫外線ランプ（Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ、ＶＬ－８．ＭＣ ３１２ｎｍで８Ｗおよび２５４ｎｍで８Ｗ）（デジタル写真の撮影とＩｍａｇｅＪによる分析、図６および７を参照）を使用するか、図８および９に示すリーダを使用してストリップの結果を読み取る。図１０は、Ａｎｄｒｏｉｄで動作する携帯電話の専用アプリケーションを使用したストリップの結果の分析を示している。リーダは、２７８ｎｍでの４つのＬＥＤの４つのグループおよび検出用の干渉フィルタ（６２０／１５、Ｓｅｍｒｏｃｋ社）を使用する。ＲＧ６０５フィルタ（Ｓｃｈｏｔｔ社）などのハイパスフィルタも検出に使用することができる。
【0381】
ナノ粒子の吸収スペクトルを図１１（Ａ）に示す。吸収ピークは２８０ｎｍにあり、半値全幅は約５０ｎｍである。紫外線ランプの発光スペクトルは３１０ｎｍを中心とし、半値全幅は４０ｎｍである。紫外線ＬＥＤの発光スペクトルは２７８ｎｍを中心とし、半値全幅は１０ｎｍである。
【0382】
結果の定性的解釈
結果の定性的解釈は次の通りである：
・２つのバンドが存在する場合、試験は陽性である；
・単一の対照バンドが存在する場合、試験は陰性である；
・単一の試験バンドが存在する場合、試験は無効である；
・バンドが存在しない場合、試験は無効である。
結果の定性的解釈は次の通りである：
・２つのバンドが存在する場合、試験は陽性である；
・単一の対照バンドが存在する場合、試験は陰性である；
・単一の試験バンドが存在する場合、試験は無効である；
・バンドが存在しない場合、試験は無効である。
【0383】
結果の定量的解釈
図１０は、専用アプリケーションを使用して携帯電話で撮影したデジタル写真から開始する定量分析の例を示している。携帯電話の画面の「捕捉」を押すと、白黒画像の記録が開始される。次に、「測定」を押すと、アプリケーションにより、携帯電話の画面上で検出ゾーン、次いで対照ゾーンを押すよう指示される。これにより、アプリケーションは、検出ゾーンを含む長方形内の累積ルミネッセンスレベルＬＤ、および対照ゾーンを含む同じ大きさの長方形内の累積ルミネッセンスレベルＬＣを計算する。「調整」を押すと、検出ゾーンおよび対照ゾーンに対応する２つの長方形の位置が最適化され、測定シグナルが最大化される。検出ゾーンと対照ゾーンとの間のスペースの中央に位置する同じサイズの長方形内の累積発光レベルは、バックグラウンドシグナルＬＢを決定し、シグナルＳＤ／Ｃ＝ＬＤ／Ｃ－ＬＢを計算するのに役立つ。アプリケーションは、比率Ｒ＝ＳＤ／ＳＣまたはＲ＝ＳＤ／（ＳＤ＋ＳＣ）を計算して表示する。Ｒの値は、ｎｇ／ｍＬ単位の濃度値を提供するためのキャリブレーションテーブルと比較することができる。結果は「保存」機能で保存して、後で次の結果と比較することができる。
図１０は、専用アプリケーションを使用して携帯電話で撮影したデジタル写真から開始する定量分析の例を示している。携帯電話の画面の「捕捉」を押すと、白黒画像の記録が開始される。次に、「測定」を押すと、アプリケーションにより、携帯電話の画面上で検出ゾーン、次いで対照ゾーンを押すよう指示される。これにより、アプリケーションは、検出ゾーンを含む長方形内の累積ルミネッセンスレベルＬＤ、および対照ゾーンを含む同じ大きさの長方形内の累積ルミネッセンスレベルＬＣを計算する。「調整」を押すと、検出ゾーンおよび対照ゾーンに対応する２つの長方形の位置が最適化され、測定シグナルが最大化される。検出ゾーンと対照ゾーンとの間のスペースの中央に位置する同じサイズの長方形内の累積発光レベルは、バックグラウンドシグナルＬＢを決定し、シグナルＳＤ／Ｃ＝ＬＤ／Ｃ－ＬＢを計算するのに役立つ。アプリケーションは、比率Ｒ＝ＳＤ／ＳＣまたはＲ＝ＳＤ／（ＳＤ＋ＳＣ）を計算して表示する。Ｒの値は、ｎｇ／ｍＬ単位の濃度値を提供するためのキャリブレーションテーブルと比較することができる。結果は「保存」機能で保存して、後で次の結果と比較することができる。
【0384】
ｈ－ＦＡＢＰ抗原を含む各サンプルのストリップ試験用に３つのストリップを調製した。抗原を含まないサンプルの場合、２つのストリップのみを調製した。
【0385】
図７のグラフは、５、０．５、０．０５、および０ｎｇ／ｍＬのｈ－ＦＡＢＰを含む様々な液体サンプルについて、ＩｍａｇｅＪによって測定した比率Ｒ＝ＳＤ／（ＳＤ＋ＳＣ）で得られた結果を示している。図７の点は、Ｒの平均値を表し、エラーバーは、試験した様々なストリップに関連する標準偏差を表す（ｈ－ＦＡＢＰを含むサンプルの場合は３つのストリップ、含まないサンプルの場合は２つのストリップ）。
【0386】
したがって、本発明による方法は、有利には、サンプル中のｈ－ＦＡＢＰを、５ｎｇ／ｍＬ以下、特に０．５ｎｇ／ｍＬ以下、またはさらには０．０５ｎｇ／ｍＬのような低い値までの含有量で検出することを可能にする。言い換えれば、ｈ－ＦＡＢＰは、３３０ｐＭ以下、特に３３ｐＭ以下、または３．３ｐＭのような低い値までの含有量で検出することができる。
【0387】
４．「サンドイッチ」タイプの「ディップスティック」ストリップ上でのＬｕ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４－ＳＡおよびＬｕ０．９Ｄｙ０．１ＶＯ４－ＳＡナノ粒子の移動
それぞれ例１．１．ｄおよび１．１．ｅにより合成したＬｕ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４およびＬｕ０．９Ｄｙ０．１ＶＯ４ナノ粒子を、例１．３によりストレプトアビジン（ＳＡ）に結合させた（受動的結合）。「ディップスティック」ストリップは、ストレプトアビジンに結合したＮＰを認識するために、ＢＳＡ－ビオチンをニトロセルロース膜に固定化することにより、例２により調製した。テストストリップは、抗原の非存在下で、例３によるＬｕ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４－ＳＡおよびＬｕ０．９Ｄｙ０．１ＶＯ４－ＳＡナノ粒子を用いて作成した。ストリップは、紫外線ランプ励起（３１２ｎｍ）下で視覚化した。対照ラインのレベルで２つの明確で強いバンドが形成された（図２２）。
それぞれ例１．１．ｄおよび１．１．ｅにより合成したＬｕ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４およびＬｕ０．９Ｄｙ０．１ＶＯ４ナノ粒子を、例１．３によりストレプトアビジン（ＳＡ）に結合させた（受動的結合）。「ディップスティック」ストリップは、ストレプトアビジンに結合したＮＰを認識するために、ＢＳＡ－ビオチンをニトロセルロース膜に固定化することにより、例２により調製した。テストストリップは、抗原の非存在下で、例３によるＬｕ０．６Ｅｕ０．４ＶＯ４－ＳＡおよびＬｕ０．９Ｄｙ０．１ＶＯ４－ＳＡナノ粒子を用いて作成した。ストリップは、紫外線ランプ励起（３１２ｎｍ）下で視覚化した。対照ラインのレベルで２つの明確で強いバンドが形成された（図２２）。
【図1】
【図2】
【図3-a】
【図3-b】
【図4a】
【図4b】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-a】
【図11-b】
【図12】
【図13-a】
【図13-b】
【図14-a】
【図14-b】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
