特許 7438224 ＬＣ－ＭＳに基づくＨｂＡ１ｃ測定の高速試料ワークフロー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-02-15

(45)【発行日】2024-02-26

(54)【発明の名称】ＬＣ－ＭＳに基づくＨｂＡ１ｃ測定の高速試料ワークフロー

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20210101AFI20240216BHJP

   G01N 33/72 20060101ALI20240216BHJP

   C07K 1/12 20060101ALI20240216BHJP

   C07K 1/14 20060101ALI20240216BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20240216BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240216BHJP

   C07K 14/805 20060101ALN20240216BHJP

【ＦＩ】

G01N27/62 V ZNA

G01N27/62 X

G01N33/72 A

C07K1/12

C07K1/14

C07K7/08

C12N15/12

C07K14/805

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2021541222

(86)(22)【出願日】2020-01-16

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-03-08

(86)【国際出願番号】 EP2020051039

(87)【国際公開番号】W WO2020148394

(87)【国際公開日】2020-07-23

【審査請求日】2023-01-10

(31)【優先権主張番号】19152309.1

(32)【優先日】2019-01-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100157923

【弁理士】

【氏名又は名称】鶴喰 寿孝

(72)【発明者】

【氏名】コボルト，ウーベ

(72)【発明者】

【氏名】ライネンバッハ，アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】ミトラ，インドラニル

【審査官】嶋田 行志

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２００８／００９４４５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／１０３１８０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００９／０６７４２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／１１２４２９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Approved IFCC Reference Method for the Measurement of HbA1c in Human Blood，Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，Walter de Gruyter GmbH & Co. KG，2005年06月01日，Vol. 40, No. 1，Pages 78-89，doi: 10.1515/CCLM.2002.016

【文献】Modified HPLC-Electrospray Ionization/Mass Spectrometry Method for HbA1c Based on IFCC Reference Measurement Procedure，Clinical Chemistry，American Association for Clinical Chemistry，2008年06月01日，Volume 54, Issue 6，Pages 1018-1022，doi: 10.1373/clinchem.2007.100875

【文献】最適なペプチド分析のために ペプチドマッピングの基礎［オンライン］，Pub.No. 5991-2348JAJP，アジレント・テクノロジー株式会社，2013年11月20日，pp. 1-24，<URL:https://www.chem-agilent.com/appnote/applinote.php?pubno=5991-2348JAJP>

【文献】Approved IFCC Reference Method for the Measurement of HbA1c in Human Blood，Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，Walter de Gruyter GmbH & Co. KG，2005年06月01日，Vol. 40, No. 1，pp. 79-89，doi: 10.1515/CCLM.2002.016

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２７／６０－Ｇ０１Ｎ ２７／７０

Ｇ０１Ｎ ２７／９２

Ｇ０１Ｎ ３３／００－Ｇ０１Ｎ ３３／９８

Ｇ０１Ｎ ３０／００－Ｇ０１Ｎ ３０／９６

Ｃ０７Ｋ １／１２

Ｃ０７Ｋ １／１４

Ｃ０７Ｋ ７／０８

Ｃ０７Ｋ １４／８０５

Ｃ１２Ｎ １５／１２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＪＳＴＣｈｉｎａ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ

Ｎａｔｕｒｅ

Ｓｃｉｅｎｃｅ

Ｏｘｆｏｒｄ Ｊｏｕｒｎａｌｓ

ＡＣＳ ＰＵＢＬＩＣＡＴＩＯＮＳ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中の糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ１ｃ）を決定するための方法であって、
（ａ）ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）分子を含む試料を用意する工程、
（ｂ）工程（ａ）からの試料に部分的タンパク質分解消化工程を施す工程であって、ヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片が生成される、工程、該部分的タンパク質分解消化工程において、試料中に存在するＨｂＡβ鎖分子の１％～２０％が、試料中に元々存在するＨｂＡβ鎖分子の総量に基づいて消化される、
および
（ｄ）ヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片を含む試料に質量分析（ＭＳ）による分析を施す工程であって、試料中のＨｂＡ１ｃの量または濃度が決定される、工程
を含む方法。

【請求項2】

（ｃ）工程（ｂ）において生成されたヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片を富化する工程、ここで、該工程（ｃ）は、ステップ（ｂ）の後であってかつステップ（ｄ）の前に行う、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

工程（ａ）における試料が、溶血した全血試料である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化を、タンパク質分解酵素を用いて行い、これにより、４～２０アミノ酸の範囲の長さを有する、ヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片を生成する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化が、エンドペプチダーゼを用いて行われる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

工程（ｂ）において、部分的タンパク質分解消化が、６０分未満行われる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化が、エンドペプチダーゼＧｌｕ－Ｃを用いて行われ、消化が、ギ酸を反応溶液に添加することによって停止される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

富化工程（ｃ）において、ヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片が、固相からの選択的溶出によって富化される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

工程（ｄ）が、ヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片のＭＳ／ＭＳ分析を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

非糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ０）に対するまたは全ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）に対する糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ１ｃ）の比が決定される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

（ｉ）ＨｂＡβ鎖分子の部分的タンパク質分解消化用の酵素、および前記酵素の消化用バッファー、
（ｉｉ）（ｉ）の酵素でのタンパク質分解消化を停止することが可能な停止用媒体
を含むキット。

【請求項12】

（ｉｉｉ）タンパク質分解性に消化されたＨｂＡ１ｃ分子を富化するための富化手段、および
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の富化手段からの試料成分を溶出する際に使用するための水混和性有機溶媒を含む溶出媒体
の少なくとも１つをさらに含む、請求項１１に記載のキット。

【請求項13】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法における、請求項１１または１２に記載のキットの使用。

【請求項14】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法を行うように適合されている試料における糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡｃ１）を決定するための診断システム。

【請求項15】

試料中の糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡｃ１）を決定するための診断システムであって、
（ｉ）ＨｂＡ１ｃ分子のＮ末端断片を含む試料の調製のための少なくとも１つのステーションであって、調製が、ヘモグロビンＡ（Ｈｂ１）分子の部分的タンパク質分解消化を含む、少なくとも１つのステーション
を含む診断システム。

【請求項16】

（ｉｉ）試料からヘモグロビンＡβ分子のＮ末端断片を選択的に富化するように適合されている少なくとも１つの富化ステーション、および
（ｉｉｉ）質量分析（ＭＳ）によりヘモグロビンＡ分子のＮ末端断片を分析し、試料中のＨｂＡｃ１の量または濃度を決定するように適合されている少なくとも１つのステーション
の少なくとも１つをさらに含む、請求項１５に記載の診断システム。

【請求項17】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法における、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の診断システムの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、質量分析（ＭＳ）による糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ１ｃ）分子のペプチド断片を決定するための方法、試薬キットおよび本方法を実施するように適合されている臨床診断システムを指す。

【背景技術】

【0002】

循環血中グルコースレベルの制御の障害は、糖尿病の指標である。血糖は、非酵素的な統計的プロセスで、ポリペプチドのリジン残基に結合し、これにより糖化ポリペプチドをもたらす恐れがある。ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）の場合、グルコースとβ鎖のＮ末端との間に反応が起こる。生じた糖化ヘモグロビンＡβ鎖は、ＨｂＡ１ｃと表される。

【0003】

ＨｂＡ１ｃは、ヒト血液中の主要な糖化ヘモグロビン種である。包括的な糖尿病の管理および合併症の治験（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｔｒｉａｌ：ＤＣＣＴ）は、網膜症、腎障害および神経症などの合併症が、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を有する患者において高血糖の程度に直接、関係するという証拠を提示し、血液中のＨｂＡ１ｃの測定が、糖尿病患者の血糖状態を長期間にわたりモニタリングする優れた手段となることを示した（Ｎａｔｈａｎら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３２９巻（１９９３年）９７７～９８６頁；Ｓａｎｔｉａｇｏ，Ｊ．Ｖ．、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４２巻（１９９３年）１５４９～１５５４頁；Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｊ．およびＳａｃｋｓ，Ｄ．Ｂ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０巻（１９９４年）６８３～６８７頁；およびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ Ｄ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ４０巻（１９９４年）１６３７～１６４０頁）。ＤＣＣＴの検討により、それぞれ、ＨｂＡ１ｃおよびＨｂＡ０（すなわち非糖化ヘモグロビン）の信頼性の高いかつ再現性の高い測定の必要性がまた明確に実証された。

【0004】

糖化ヘモグロビンを決定する様々な方法、すなわちクロマトグラフィーおよび／または質量分析（ＭＳ）、化学的方法ならびに免疫学的方法を含めた、物理化学的方法が多数、存在する。国際臨床化学連合（ＩＦＣＣ）により承認を受けているヒト血液中のＨｂＡ１ｃの測定に関する基準法は、１８～２０時間の期間、酵素のエンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃによる、ヘモグロビンのペプチドへの酵素による切断、その後のＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーイオン化質量分析によって、またはＵＶ検出を備えるＨＰＬＣおよびキャピラリー電気泳動を使用する二次元手法での、β鎖の糖化Ｎ末端ヘキサペプチドおよび非糖化Ｎ末端ヘキサペプチドの分離および定量を含む（Ｊｅｐｐｓｓｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．４０巻（２００２年）、７８～８９頁）。

【0005】

この基準法の改変が、Ｋａｉｓｅｒら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５４巻（２００８年）、１０１８～１０２２頁；Ｌｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．７７６巻（２００２年）、１４９～１６０頁）；Ｊｅｏｎｇ（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｌｅｔｔ．５巻（２０１４年）、５２～５６頁；およびＺｈａｎｇら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ Ｍｅｄ．５４巻（２０１６年）、５６９～５７６頁）により記載されており、すべてが、少なくとも１８時間の期間のタンパク質分解消化に言及している。

【0006】

したがって、ヘモグロビンＡの酵素消化を含む公知の方法は、通常、十分な量の切断生成物を得て、こうして安定な測定シグナルを得るために、一晩のインキュベートを必要とする。さらに、試料にＭＳ検出を施す前に、従来のクロマトグラフィーを用いるマトリックス成分を含む複合体ペプチド混合物の分離が必要である。したがって、これらの方法は、患者の試料をハイスループット測定するには、時間を要し、使用には制限がある。

【0007】

したがって、ＭＳによるＨｂＡ１ｃを決定するための迅速かつ信頼性の高い方法を提供することが必要とされている。

【発明の概要】

【0008】

本発明の第１の態様は、試料中の糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ１ｃ）を決定するための方法であって、
（ａ）ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）分子を含む試料を用意する工程、
（ｂ）工程（ａ）からの試料に部分的タンパク質分解消化工程を施す工程であって、ヘモグロビンＡβ分子のＮ末端断片が生成される、工程、
（ｃ）工程（ｂ）において生成されたヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片を場合により富化する工程、および
（ｄ）ヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片を含む試料に質量分析（ＭＳ）による分析を施す工程であって、試料中のＨｂＡ１ｃの量または濃度が決定される、工程
を含む方法を指す。

【0009】

本発明の第２の態様は、
（ｉ）ＨｂＡβ鎖分子の部分的タンパク質分解消化用の酵素、および場合により前記酵素の消化用バッファー、
（ｉｉ）（ｉ）の酵素でのタンパク質分解消化を停止することが可能な停止用媒体、および
（ｉｉｉ）場合により、タンパク質分解性に消化されたＨｂＡ１ｃ分子を富化するための富化手段、および
（ｉｖ）場合により、（ｉｉｉ）の富化手段からの試料成分を溶出する際に使用するための水混和性有機溶媒を含む溶出媒体
を含むキットを指す。

【0010】

本キットは、上記の方法に使用するのに特に好適である。

【0011】

本発明の第３の態様では、上記の方法を行うように適合されている診断システムが提供される。診断システムは、特に、上記のキットと一緒に使用するためのものである。

【0012】

本発明により、ＭＳによって、試料中のタンパク質分解性に消化された糖化ＨｂＡ１ｃ分子、および場合によりタンパク質分解性に消化された非糖化ＨｂＡ０分子の迅速かつ信頼性の高い決定が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】Ｇｌｕ－Ｃを用いて全血試料を消化することによって得られたＨｂＡ１ｃおよびＨｂＡ０ペプチドからのＭＳ／ＭＳピークを示す図である。

【図2】Ｇｌｕ－Ｃによるさらに精製していない（上部）、および磁気ビーズ表面での富化による試料精製を伴う、全血試料の消化と、その後の、様々な濃度のＡＣＮ、すなわち、それぞれ、５％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ、１０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ、１５％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ、２０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮおよび３０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮを用いた洗浄および溶出からの結果を示す図である。特に５％または１０％ ＡＣＮの量でのＡＣＮによる溶出により、ＬＣ－ＭＳ前の、ＨｂＡ１ｃおよびＨｂＡ０の特異的溶出、およびこうして富化が可能となる。

【発明を実施するための形態】

【0014】

定義
「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、ならびに「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、明記した整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群を含むことを意味するが、他のいかなる整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群を除外することを意味するものではないことが理解されよう。

【0015】

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が特に明白に示さない限り、個々の複数の用語も含む。

【0016】

百分率、濃度、量および他の数値データは、「範囲」形式で本明細書において表現または提示することができる。このような範囲の形式は、便宜上および簡潔にするために単に使用されているに過ぎないこと、したがって、その範囲を限定するものとして明示的に列挙されている数値を含むだけではなく、各数値および部分範囲があたかも明示的に列挙されているかのごとくその範囲に包含される個々の数値のすべてまたは部分範囲を含むことを柔軟に解釈するべきであると理解される。例示として、「４％～２０％」の数値範囲は、４％～２０％という明示的に列挙されている値を含むだけではなく、表示されている範囲内の個々の値および部分範囲を含むと解釈されるべきである。したがって、４、５、６、７、８、９、１０、・・・１８、１９、２０％などの個々の値、および４～１０％、５～１５％、１０～２０％などの部分範囲がこの数値範囲に含まれる。この同じ原理が、最低値または最高値を列挙する範囲に当てはまる。さらに、このような解釈は、その範囲の幅または記載されている特性に関わらず、当てはまるはずである。

【0017】

用語「約」は、数値に関連して使用される場合、表示数値よりも５％小さい下限値、および表示数値より５％大きな上限値を有する範囲内の数値を包含することを意味する。

【0018】

用語「質量分析」（「Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ」または「ＭＳ」）は、その質量によって化合物を特定するために使用する分析技術に関する。ＭＳは、その質量対電荷比または「ｍ／ｚ」に基づいて、イオンをフィルターにかけ、検出し、測定する方法のことである。ＭＳ技術は、一般に、（１）化合物をイオン化し、電荷を帯びた化合物を形成すること、および（２）電荷を帯びた化合物の分子量を検出して、質量対電荷比を計算することを含む。化合物は、任意の好適な手段によってイオン化されて、検出され得る。「質量分析計」は、一般に、イオン化装置およびイオン検出器を含む。一般に、１つまたは複数の目的の分子がイオン化されて、続いて、このイオンは、質量分析機器に導入されて、この機器において、磁場および電場の組合せにより、イオンは、質量（「ｍ」）および電荷（「ｚ」）に依存して空間の経路をたどる。用語「イオン化」または「イオン化する」とは、１つまたは複数の電子単位に等しい正味の電荷を有する被分析物のイオンを発生させるプロセスを指す。陰イオンは、１つまたは複数の電子単位の正味の負電荷を有するものである一方、陽イオンは、１つまたは複数の電子単位の正味の正電荷を有するものである。ＭＳ方法は、陰イオンが発生してこれが検出される「陰イオンモード」、または陽イオンが発生してこれが検出される「陽イオンモード」のどちらか一方で行うことができる。

【0019】

「タンデム質量分析」または「ＭＳ／ＭＳ」は、質量分析の選択および検出からなる複数の工程を含み、被分析物のフラグメント化がこれらの工程の間に起こる。タンデム型質量分析計では、イオンはイオン源で形成され、質量分析の第１の段階で、質量対電荷比によって分離される（ＭＳ１）。特定の質量対電荷比のイオン（前駆体イオンまたは親イオン）が選択されて、フラグメントイオン（または娘イオン）は、衝突誘導解離、イオン－分子反応、および／または光解離により生成する。生じたイオンは、次に、質量分析の第２の段階で分離されて、検出される（ＭＳ２）。

【0020】

ＭＳにおける大部分の試料のワークフローは、試料調製および／または富化工程をさらに含み、例えば、目的の被分析物は、例えばガスまたは液体クロマトグラフィーを使用して、マトリックスから、例えば被分析物とは異なる試料構成成分から分離される。通常、質量分析測定の場合、以下の３つの工程が行われる：
（１）目的の被分析物を含む試料が、通常は陽イオンとの付加物を形成することによって、多くの場合、陽イオンへのプロトン化によってイオン化される。イオン化源は、以下に限定されないが、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）および大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）を含む。
（２．）イオンは分類されて、その質量および電荷に従い分離される。高電場非対称波形イオン移動度分光分析（ＦＡＩＭＳ）をイオンフィルターとして使用することができる。
（３．）次に、分離したイオンは、例えば、多重反応モード（ＭＲＭ）で検出され、結果がチャートに表示される。

【0021】

用語「エレクトロスプレーイオン化」または「ＥＳＩ」とは、溶液を長さの短いキャピラリー管に沿って通過させて、キャピラリー管の端部に高い正電位または負電位を印加する、方法を指す。管の端部に到達した溶液は、溶媒蒸気中で非常に小さな溶液の液滴のジェットまたはスプレーへと気化（噴霧化）される。液滴のこの霧は、エバポレーションチャンバーを通り、このチャンバーは、わずかに加熱されて、縮合を予防して溶媒をエバポレートする。液滴が小さくなるほど、同じ電荷間の自然な反発によってイオンと中性分子が放出されるまで、電気的な表面電荷密度が向上する。

【0022】

用語「大気圧化学イオン化」または「ＡＰＣＩ」は、ＥＳＩに類似した質量分析方法を指す。しかし、ＡＰＣＩは、大気圧においてプラズマ内で発生するイオン－分子反応によってイオンを生成する。プラズマは、スプレーキャピラリーと対電極との間の電気放電により維持される。イオンは、通常、一連の差動ポンプ式スキマーステージ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｍｐｅｄ ｓｋｉｍｍｅｒ ｓｔａｇｅｓ）の使用により質量分析装置に抽出される。向流の乾燥および予熱Ｎ_２ガスを用いて、溶媒の除去を改善することができる。ＡＰＣＩにおける気相イオン化は、極性がより低い実体を分析するためにＥＳＩよりも有効となり得る。

【0023】

「多重反応モード」または「ＭＲＭ」は、前駆体イオンおよび１つまたは複数のフラグメントイオンが選択的に検出される、ＭＳ機器用の検出モードである。

【0024】

質量分析計は、わずかに異なる質量のイオンを分離して検出するので、所与の元素からなる異なる同位体を容易に区別する。したがって、質量分析は、以下に限定されないが、低分子量の被分析物、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含めた、被分析物の正確な質量決定および特徴づけにとって重要な方法である。その用途は、タンパク質およびその翻訳後修飾の同定、タンパク質複合体、そのサブユニットおよび機能的相互作用の解明、ならびにプロテオミクスにおけるタンパク質の全測定を含む。質量分析によるペプチドまたはタンパク質のデノボ配列決定は、通常、アミノ酸配列のこれまでの知識なしに行うことができる。

【0025】

質量分析決定は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、特にＨＰＬＣ、および／またはイオン移動度に基づく分離技法などのクロマトグラフィー法を含めた追加の分析法と組み合わされてもよい。

【0026】

本開示の文脈において、用語「被分析物」、「被分析物分子」または「目的の被分析物」は、互換的に使用されて、質量分析により分析される化学種を指す。質量分析により分析されるのに好適な化学種、すなわち被分析物は、生存生物において存在する任意の種類の分子とすることができ、以下に限定されないが、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡなど）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質（例えば、細胞表面受容体、サイトゾルタンパク質など）、代謝産物またはホルモン（例えば、テストステロン、エストロゲン、エストラジオールなど）、脂肪酸、脂質、炭水化物、ステロイド、ケトステロイド、セコステロイド（例えば、ビタミンＤ）、別の分子のある種の修飾に特徴的な分子（例えば、タンパク質上の糖部分またはホスホリル残基、ゲノムＤＮＡ上のメチル残基）、または生物体により内部移行された物質（例えば、治療薬、乱用薬物、毒素など）、またはそのような物質の代謝産物とすることができる。このような被分析物は、バイオマーカーとして役立つことがある。本発明の文脈において、用語「バイオマーカー」とは、前記システムの生物学的状態の指標として使用される、生物学的システム内の物質を指す。

【0027】

被分析物は、目的の試料中、例えば、生体試料または臨床試料中に存在することがある。用語「試料」または「目的の試料」は、本明細書において互換的に使用され、組織、器官もしくは個体の部分または片を指し、通常、組織、器官または個体の全体を表すことが意図されているこのような組織、器官または個体よりも小さい。分析に際して、試料は、組織状態、あるいは器官もしくは個体の健康状態または疾患状態に関する情報を提供する。試料の例は、以下に限定されないが、血液、血清、血漿、滑液、髄液、尿、唾液およびリンパ液などの液体試料、または乾燥血液スポットおよび組織抽出物などの固体試料を含む。試料のさらなる例は、細胞培養物または組織培養物である。

【0028】

本開示の文脈において、試料は、「個体」または「対象」に由来し得る。通常、対象は、哺乳動物である。哺乳動物には、以下に限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギおよびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれる。

【0029】

質量分析による分析前に、試料は、試料および／または被分析物に特有の方法で前処理されてもよい。本開示の文脈において、用語「前処理」とは、質量分析による所望の被分析物の後の分析を可能にするために必要な任意の手段を指す。前処理手段は、通常、以下に限定されないが、固体試料の溶出（例えば、乾燥血液スポットの溶出）、全血試料への溶血試薬（ＨＲ）の添加および尿試料への酵素試薬の添加を含む。同様に、内標準（ＩＳＴＤ）の添加は、試料の前処理と見なされる。

【0030】

用語「溶血試薬」（ＨＲ）は、試料中に存在する細胞を溶解する試薬を指す。本発明の文脈において、溶血試薬は、特に、以下に限定されないが、全血試料中に存在する赤血球を含めた、血液試料中に存在する細胞を溶解する試薬を指す。周知の溶血試薬は、水（Ｈ_２Ｏ）、例えば脱イオン水またまたは蒸留水である。溶血試薬のさらなる例は、以下に限定されないが、高いオスモル濃度の液体（例えば、８Ｍ尿素）、イオン性液体および異なる洗剤を含む。

【0031】

通常、内標準（ＩＳＴＤ）は、質量スペクトル検出のワークフローに施すと、目的の被分析物と類似の特性を示す、既知量の物質である（すなわち、任意の前処理、富化および実際の検出工程を含む）。ＩＳＴＤは、目的の被分析物と類似の特性を示すが、目的の被分析物とはやはり明確に区別可能である。例証すると、ガスクロマトグラフィーまたは液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー分離の間に、ＩＳＴＤは、試料に由来する目的の被分析物とほぼ同じ保持時間を有する。したがって、被分析物とＩＳＴＤのどちらも、同時に質量分析計に入る。しかし、ＩＳＴＤは、試料に由来する目的の被分析物とは異なる分子量を示す。これにより、ＩＳＴＤ由来のイオンと被分析物由来のイオンを、それらの異なる質量／電荷（ｍ／ｚ）比により質量スペクトルの区別が可能となる。どちらもフラグメント化を受け、娘イオンをもたらす。これらの娘イオンは、互いに、およびそれぞれの親イオンとは、それらのｍ／ｚ比により区別することができる。したがって、ＩＳＴＤおよび被分析物に由来するシグナルの個々の決定および定量を行うことができる。ＩＳＴＤは、既知量で添加されるので、試料に由来する被分析物のシグナル強度は、被分析物の具体的な定量的量に起因し得る。したがって、ＩＳＴＤの添加により、検出される被分析物の量の相対比較が可能となり、被分析物が質量分析計に到達すると、試料中に存在する目的の被分析物の明確な同定および定量が可能となる。通常、必ずではないが、ＩＳＴＤは、目的の被分析物の同位体標識されている変形体（例えば、少なくとも１個の^２Ｈ、^１３Ｃおよび／または^１５Ｎなどの標識を含む）。

【0032】

前処理に加えて、試料はまた、１つまたは複数の富化工程が施されてもよく、試料に、１つまたは複数の「富化方法」または「富化ワークフロー」が施される。周知の富化方法は、以下に限定されないが、化学沈殿、固体相の使用およびクロマトグラフィー法を含む。

【0033】

化学沈殿とは、試料に化学成分を添加し、これにより、試料のある特定の構成成分が関与することを指す。例証すると、周知の沈殿方法は、試料へのアセトニトリルの添加である。

【0034】

固体相は、以下に限定されないが、固体相抽出（ＳＰＥ）カートリッジ、およびビーズを含む。用語「ビーズ」は、非磁性、磁性または常磁性球状粒子を指す。ビーズは、目的の被分析物に特異的であるように異なってコーティングされていてもよい。コーティングは、所期の使用、すなわち所期の捕捉分子に応じて様々となり得る。コーティングがどの被分析物に好適かは当業者に周知である。ビーズは、様々な異なる物質で作製されていてもよい。ビーズは、様々なサイズを有することができ、細孔を有するまたはこれを有さない表面を備える。

【0035】

用語「クロマトグラフィー」とは、液体または気体により運ばれる化学混合物が、それらが固定液体相もしくは固体相の周りまたは上を流れると、化学実体の示差的分布の結果として、成分に分離されるプロセスを指す。

【0036】

用語「液体クロマトグラフィー」または「ＬＣ」とは、流体が、微粉砕物質のカラムまたはキャピラリー流通路を一様に浸透する際に、流体溶液の１つまたは複数の成分が選択的に遅延するプロセスを指す。遅延は、この流体が固定相に対して移動するので、１種または複数の固定相とバルク流体（すなわち、移動相）との間の混合物の成分の分布に起因する。固定相が移動相よりも極性となる方法（例えば、移動相としてのトルエン、固定相としてのシリカ）は、順相液体クロマトグラフィー（ＮＰＬＣ）と呼ばれ、固定相が移動相ほど極性ではない方法（例えば、移動相として水－メタノール混合物および固定相としてＣ１８（オクタデシルシリル））においては、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）と呼ばれる。

【0037】

「高速液体クロマトグラフィー」または「ＨＰＬＣ」とは、分離度が、通常の密に充填したカラムである固定相を加圧下で移動相を強制することにより向上する、液体クロマトグラフィーの方法を指す。通常、カラムには、不規則な形状の粒子または球形状の粒子、多孔質モノリシック層または多孔質膜からなる固定相が充填されている。ＨＰＬＣは、移動相および固定相の極性に基づいた２種の異なる部分クラス、すなわちＮＰ－ＨＰＬＣおよびＲＰ－ＨＰＬＣに歴史的に分類されている。

【0038】

マイクロＬＣとは、狭いカラム内径、通常１ｍｍ未満、例えば約０．５ｍｍを有するカラムを使用するＨＰＬＣ法を指す。「超高速液体クロマトグラフィー」または「ＵＨＰＬＣ」とは、例えば、１２０ＭＰａ（１７，４０５ｌｂｆ／ｉｎ^２）または約１２００気圧の高圧を使用するＨＰＬＣ法を指す。

【0039】

迅速ＬＣとは、＜２ｃｍ、例えば１ｃｍの長さの短い、上記の内径を有するカラムを使用するＬＣ法を指し、上記の流速を適用し、上記の圧力を用いる（マイクロＬＣ、ＵＨＰＬＣ）。短い迅速ＬＣプロトコールは、単一分析用カラムを使用する、捕捉／洗浄／溶出工程を含み、＜１分間という非常に短い時間でＬＣを実現する。

【0040】

さらなる周知のＬＣ方法は、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、サイズ排除ＬＣ、イオン交換ＬＣおよび親和性ＬＣを含む。

【0041】

ＬＣ分離は、単一チャネルＬＣ、または平行して配列されている複数のＬＣチャネルを含む多重チャネルＬＣとすることができる。ＬＣでは、被分析物は、一般に当業者に公知の通り、その極性またはｌｏｇＰ値、サイズまたは親和性に従い分離され得る。

【0042】

本開示の文脈において、用語「第１の富化プロセス」、「第１の富化工程」または「第１の富化ワークフロー」とは、試料の前処理に続いて行われ、最初の試料に比べて富化された被分析物を含む試料をもたらす、富化プロセスを指す。

【0043】

本開示の文脈において、用語「第２の富化プロセス」、「第２の富化工程」または「第２の富化ワークフロー」とは、試料の前処理および第１の富化プロセスに続いて行われ、最初の試料および第１の富化プロセス後の試料に比べて富化された被分析物を含む試料をたらす、富化プロセスを指す。

【0044】

用語「クロマトグラフィー」とは、液体または気体により運ばれる化学混合物が、それらが固定液体相もしくは固体相の周りまたは上を流れると、化学実体の示差的分布の結果として、成分に分離されるプロセスを指す。

【0045】

「キット」は、少なくとも１つの試薬、例えば障害を治療するための医薬、または本発明の被分析物を特異的に検出するためのプローブを含む任意の製造物品（例えば、パッケージまたは容器）のことである。本キットは、本発明の方法を行うための単位として、好ましくは販売促進される、配布されるまたは販売される。通常、キットは、バイアル、チューブなどの１つまたは複数の容器手段を厳重に封されて受け取るようコンパートメント化されている担体手段をさらに備えることができる。特に、容器手段は、第１の態様の方法に使用する個別の要素の１つを備えてもよい。キットは、以下に限定されないが、バッファー、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジ、および使用説明書を備える添付文書を含めた、さらなる物質を含む１つまたは複数の他の容器をさらに備えてもよい。ラベルは、その組成物が、特定の用途に使用されることを表示するよう容器に提示されてもよく、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのどちらかで使用するための指示も表示し得る。本キットはまた、光学的保存媒体（例えば、コンパクトディスク）などのデータ保管用媒体もしくはデバイスに、またはコンピュータもしくはデータ処理デバイスに直接、設けられたコンピュータプログラムコードを含んでもよい。さらに、本キットは、較正目的で、本明細書の他の箇所に記載されているバイオマーカーの標準量を含むことができる。

【0046】

「添付文書」は、適応症、利用、成績、および／またはこのような診断製品の使用に関する注意書きに関する情報を含む、診断製品の市販パッケージに慣用的に含まれている指示書を指すために使用される。

【0047】

実施形態
本発明の第１の態様は、試料中の糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ１ｃ）を決定するための方法であって、
（ａ）ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）分子を含む試料を用意する工程、
（ｂ）工程（ａ）からの試料に部分的タンパク質分解消化工程を施す工程であって、ヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片が生成される、工程、
（ｃ）工程（ｂ）において生成されたヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片を場合により富化する工程、および
（ｄ）ヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片を含む試料に質量分析（ＭＳ）による分析を施す工程であって、試料中のＨｂＡ１ｃの量または濃度が決定される、工程
を含む、方法
を指す。

【0048】

こうして、試料中の、ＨｂＡ１ｃの量または濃度、特にＨｂＡ１ｃの相対量、すなわち非糖化ＨｂＡ０分子に対するまたはＨｂＡ分子全体に対する糖化ＨｂＡ１ｃ分子の比を決定することができる。本方法は、非常に正確であり、所与の試料中のＨｂＡ１ｃの量、ＨｂＡ１ｃ／ＨｂＡの比またはＨｂＡ１ｃ／ＨｂＡ０の比を繰り返し決定すると、２．５％以下、特に２．０％以下、より詳細には１．５％以下の変動係数（ＣＶ）をもたらす。

【0049】

工程（ａ）によれば、ヘモグロビン分子を含む試料が用意される。試料は、好ましくは、溶血した全血試料、特に、例えば、糖化ヘモグロビンＡの量に関してその血液を検査する対象に由来する溶血したヒト全血試料である。溶血は、特に、水（Ｈ_２Ｏ）、例えば脱イオン水または蒸留水を用いて、特に、約１：２～約１：２０、特に、約１：５～約１：１０、特に約１：９（ｖ／ｖ）となる試料：水の比で希釈することにより行われる。試料は、約３０分未満、約１０分未満、約５分未満の時間の間に溶血され得、または約２分未満でも溶血され得る。特定の実施形態では、試料は、約１０～約６０秒の時間の間に溶血される。

【0050】

特定の実施形態では、溶血は、試料および水を混合することによって、特に試料と水をボルテックスすることによって行われる。特に、試料および水は、約１～約６０秒間、特に約５～約３０秒間、特に、約１０秒間、混合され、特にボルテックスされる。

【0051】

溶血の間、試料は、２０℃～３０℃、特に２２～２５℃の温度、特に室温で維持され得る。

【0052】

特定の実施形態では、試料の溶血は、室温で１０秒間、ボルテックスすることによって、１：９の比で試料と水を混合することにより行われる。

【0053】

本発明の方法の工程（ｂ）は、試料中のＨｂＡ分子の部分的タンパク質分解消化を含む。驚くべきことに、試料中に存在するヘモグロビンＡ分子に部分的タンパク質分解消化を施すと、消化生成物の量が、試料中のＨｂＡ１ｃを正確に決定することが可能となるほど十分となることを見出した。したがって、ＨｂＡ１ｃを決定するための迅速かつ信頼性の高い方法が提供される。部分的タンパク質分解消化は、無傷のＨｂＡ分子およびタンパク質分解性に消化されたＨｂＡ分子を含む混合物、特に無傷のＨｂＡ１ｃβ鎖分子、無傷のＨｂＡ０β鎖分子、タンパク質分解性に消化されたＨｂＡ１ｃβ鎖分子およびタンパク質分解性に消化されたＨｂＡ０β鎖分子からなる混合物をもたらす。好ましい実施形態では、工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化は、試料中に存在するＨｂＡβ鎖分子の約１％～約２０％、特に約５％～１０％が、試料中に元々存在するＨｂＡβ鎖分子の総量に基づいて消化される、消化を含む。

【0054】

本発明の方法の工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化は、ＨｂＡβ鎖分子のタンパク質分解消化による切断が起こる条件下で、タンパク質分解酵素を用いて行われる。好ましくは、その切断特異性に基づいて、４～２０アミノ酸の範囲、特に５～１５アミノ酸の範囲の長さを有する、ヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片を生成するタンパク質分解酵素が選択される。より好ましくは、タンパク質分解酵素は、アミノ酸の位置６、８または１４の後の配列番号１に示されているヒトＨｂＡβ鎖分子のＮ末端を切断する。

【0055】

特定の実施形態では、工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化は、エンドペプチダーゼ、特に、Ｇｌｕ－Ｃ、トリプシン、ペプシンおよびサーモリシンからなる群から選択されるエンドペプチダーゼを用いて行われる。Ｇｌｕ－Ｃによるタンパク質分解消化は、６アミノ酸のＮ末端断片をもたらし、トリプシンによるタンパク質分解消化は、８アミノ酸のＮ末端断片をもたらし、ペプシンによるタンパク質分解消化は、１４アミノ酸のＮ末端断片をもたらす。特定の実施形態では、タンパク質分解消化は、エンドペプチダーゼＧｌｕ－Ｃを用いて行われる。

【0056】

特定の実施形態では、本発明である工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化は、約１０分～約１２０分の期間、例えば約６０分間以下、約４５分間以下、または約３０分間以下の期間、行われる。特定の実施形態では、部分的タンパク質分解消化は、約１５分間～約４５分間、行われる。

【0057】

特定の実施形態では、工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化は、約２０℃～約４０℃、特に、約２５℃～約３７℃、特に、約３０℃～約３７℃の温度範囲で行われる。特定の実施形態では、部分的タンパク質分解消化は、３７℃で行われる。

【0058】

実施形態では、工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化に使用するバッファーは、Ｎａ^＋および／またはＫ^＋イオンを含まないバッファー、特に、例えば約２０ｍＭ～約５０ｍＭの酢酸アンモニウムまたは約３０ｍＭの酢酸アンモニウムを含む酢酸アンモニウムバッファーまたはクエン酸アンモニウムバッファーなどのアンモニウムイオンを含むバッファーである。

【0059】

実施形態では、消化用バッファーのｐＨは、特定のタンパク質分解酵素に依存する。実施形態では、Ｇｌｕ－Ｃがタンパク質分解酵素として使用される場合、消化用バッファーは、酸性ｐＨ、例えば約４～約５のｐＨ、特に約４．２～約４．５のｐＨまたは約４．３のｐＨを有する。

【0060】

実施形態では、工程（ｂ）におけるプロテアーゼは、所望の程度の部分的消化を得るため、好適な任意の濃度で存在する。実施形態では、タンパク質分解酵素、例えばエンドペプチダーゼＧｌｕ－Ｃは、約０．１～約１ｍｇ／ｍＬ、特に０．３ｍｇ／ｍｌ～０．８ｍｇ／ｍｌ、特に約０．６ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。特定の実施形態では、Ｇｌｕ－Ｃがタンパク質分解酵素として使用される場合、工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化に使用される濃度は、約０．６ｍｇ／ｍＬである。

【0061】

特定の実施形態では、工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化は、エンドペプチダーゼＧｌｕ－Ｃを使用して、約３７℃の温度で約４５分間行われる。

【0062】

特定の実施形態では、工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化は、エンドペプチダーゼＧｌｕ－Ｃを使用して、約０．６ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３７℃の温度で約４５分間行われる。

【0063】

特定の実施形態では、工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化は、エンドペプチダーゼＧｌｕ－Ｃを使用して、３０ｍＭの酢酸アンモニウムバッファー中で約０．６ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３７℃の温度で約４５分間行われる。

【0064】

特定の実施形態では、工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化は、エンドペプチダーゼＧｌｕ－Ｃを使用して、約４．３のｐＨにおいて３０ｍＭの酢酸アンモニウムバッファー中で０．６ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３７℃の温度で約４５分間行われる。

【0065】

本発明の特定の実施形態では、工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化は、所望の程度のタンパク質分解消化による切断を実現した後に停止される。例えば、この消化は、タンパク質分解消化を停止することが可能な、またはこれを停止する停止用媒体を添加することにより停止され得る。特定の実施形態では、停止剤は、希釈媒体、例えば、酸性溶液、特にギ酸（ＦＡ）を含む酸性溶液である。実施形態では、前記酸性溶液は、水中のＦＡを含む。ＦＡが工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化を停止するための酸性溶液に使用される実施形態では、ＦＡは、０．０５％～０．２％（ｖ／ｖ）の濃度のＦＡ、特に、約０．１％（ｖ／ｖ）の濃度のＦＡで存在することができる。実施形態では、酸、特に、ＦＡは、ｐＨを約１～約４に調整する。特に、ｐＨを約２．７に調整する。

【0066】

特定の実施形態では、工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化は、エンドペプチダーゼＧｌｕ－Ｃを使用して、約４．３のｐＨにおいて約３０ｍＭの酢酸アンモニウムバッファー中で約０．６ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３７℃の温度で約４５分間行われ、ｐＨを約２．７に調整するために、水中に約０．１％（ｖ／ｖ）ＦＡを含む希釈バッファーを使用した後に停止される。

【0067】

特定の実施形態では、工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化後に得られた試料に被分析物の富化ワークフロー、すなわち、試料中にヘモグロビンＡβ鎖のタンパク質分解性に生成されたＮ末端断片を富化することを含む、富化工程（ｃ）がさらに施されてもよい。タンパク質分解性に生成されたＮ末端断片を「富化する」という用語は、ＭＳによる分析に試料を施す前に、Ｎ末端断片分子対他の試料構成成分の相対量を向上させるものとして理解される。特に、富化工程は、Ｎ末端ヘモグロビンＡβ鎖断片の富化を含む一方、測定を妨害する可能性のある他の試料構成成分は、枯渇または除去される。特定の実施形態では、Ｎ末端ヘモグロビンＡβ鎖断片は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍、富化される。

【0068】

富化工程（ｃ）は、１つまたは複数の富化方法、特に第１および／または第２の富化工程を含むことができる。富化方法は、当分野で周知であり、以下に限定されないが、化学沈殿を含めた化学的富化方法、および以下に限定されないが、固体相抽出方法、ビーズワークフローおよびクロマトグラフィー法（例えばガスクロマトグラフィーまたは液体クロマトグラフィー）を含めた固体相を使用する富化方法を含む。したがって、特定の実施形態では、富化工程（ｃ）は、化学沈殿、固体相抽出方法を使用する方法、ビーズワークフローおよびクロマトグラフィー法からなる群から選択される１つまたは複数の富化方法を含む。

【0069】

実施形態では、富化工程（ｃ）は、１種または２種の富化方法を含み、すなわち、富化工程（ｃ）（ｉ）および／または富化工程（ｃ）（ｉｉ）を含む。本方法が富化工程（ｃ）（ｉ）および富化工程（ｃ）（ｉｉ）を含む実施形態では、富化工程（ｃ）（ｉ）は富化工程（ｃ）（ｉｉ）の前に行われる。

【0070】

実施形態では、第１の富化工程（ｃ）（ｉ）は、前処理した試料への被分析物に選択的な群を有する固体相の添加を含む、結合／遊離分離工程を含む。固体相は、固体粒子または非特異的固体相、例えば、容器またはウェル内でコーティングされた表面からなることができる。特定の実施形態では、固体相は、磁性粒子または常磁性粒子、特に、磁性コアまたは常磁性コアを有する粒子からなる。実施形態では、前記磁性コアまたは常磁性コアは、金属酸化物および／または金属炭化物を含む。とりわけ特定の実施形態では、コアはＦｅ_３Ｏ_４を含む。

【0071】

固体相の表面、特に、磁性ビーズまたは常磁性ビーズは、特に、Ｃ_３～Ｃ_１８アルキル基、より詳細にはＣ_４アルキル基などの疎水性有機基を含む、疎水性表面とすることができる。さらに、固体相の疎水性表面、特に磁性ビーズまたは超常磁性ビーズの表面は、細孔を備える。細孔サイズは、１ｎｍ～２００ｎｍ、特に約１００ｎｍ未満、特に約１０ｎｍ未満の範囲にあることができる。好適な疎水性表面は、例えば、「Ｔｈｅ ＨＰＬＣ Ｅｘｐｅｒｔ：Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」ＤＯＩ：１０．１００２／９７８３５２７６７７６１０に見出すことができる。

【0072】

実施形態では、富化工程（ｃ）は、磁性ビーズまたは常磁性ビーズを使用する第１の富化工程（ｃ）（ｉ）を含む。実施形態では、第１の富化工程（ｃ）（ｉ）は、試料中に存在するヘモグロビンＡβ鎖分子のタンパク質分解性に生成されたＮ末端断片の選択的結合のための基を有する磁性ビーズまたは常磁性ビーズの添加を含む。実施形態では、磁気ビーズの添加は、撹拌または混合を含む。ビーズ表面でヘモグロビンＡβ鎖分子のタンパク質分解性に生成されたＮ末端断片を捕捉するための事前に規定されたインキュベーション期間が続く。実施形態では、ワークフローは、磁気ビーズと共にインキュベートした後に洗浄工程（Ｗ１）を含む。被分析物に応じて、１つまたは複数の追加の洗浄工程（Ｗ２）が行われる。１つの洗浄工程（Ｗ１、Ｗ２）は、磁石または電磁石を備える磁気ビーズ取り扱いユニットによる磁気ビーズ分離、液体の吸引、洗浄用バッファーの添加、磁気ビーズの再懸濁、別の磁気ビーズの分離工程および液体の別の吸引を含む、一連の工程を含む。さらに、洗浄工程は、溶媒のタイプ（水／有機／塩／ｐＨ）に関して、分量および数、または洗浄サイクルの組合せとは異なり得る。個々のパラメーターの選択方法は、当業者に周知である。最後の洗浄工程（Ｗ１、Ｗ２）の後に、溶出試薬の添加、次いで、磁気ビーズの再懸濁、および磁気ビーズから目的の被分析物を放出するための事前に規定されたインキュベーション期間が続く。結合していない磁気ビーズは、次に、分離されて、Ｎ末端ヘモグロビンＡβ鎖断片を含有する上清が捕捉される。

【0073】

実施形態では、Ｎ末端ヘモグロビンＡβ鎖断片を含む試料の固体相への接触は、酸性ｐＨ、例えば約１～約４のｐＨ、特に約２．７のｐＨで好ましくは行われる。この目的のために、試料、例えば溶血した全血試料は、部分的タンパク質分解消化後、所望のｐＨを得るため、酸性媒体、例えば約０．０１％～約０．２％（ｖ／ｖ）、例えば約０．１％（ｖ／ｖ）の濃度で上記の通りのギ酸を用いて希釈され得る。

【0074】

固体相からのヘモグロビンＡβ鎖分子の結合したタンパク質分解性に生成されたＮ末端断片の選択的溶出は、ロードした固体相に溶出媒体を接触させることによって行うことができ、溶出媒体は、水混和性有機溶媒、特に、約５～約２０％（ｖ／ｖ）、例えば、約１０％（ｖ／ｖ）の量のアセトニトリルまたはメタノールを含む水溶液とすることができる。溶出媒体は、好ましくは酸性媒体、特に、ギ酸を含む。溶出媒体の水性部分は、固体相結合媒体、例えば、約１～約４のｐＨ、例えば約２．７のｐＨを有する酸性媒体について記載されているものと実質的に同じとすることができる。

【0075】

代替としてまたはさらに、富化工程（ｃ）は、第２の富化工程（ｃ）（ｉｉ）を含んでもよい。第２の富化工程（ｃ）（ｉｉ）では、Ｎ末端ヘモグロビンＡβ鎖断片は、試料中でさらに富化される。特定の実施形態では、富化工程（ｃ）（ｉｉ）は、クロマトグラフィー工程を含み、この場合、試料の個々の構成成分が互いに分離される。実施形態では、第２の富化工程（ｃ）（ｉｉ）は、上で詳述されている工程（ｂ）の部分的タンパク質分解消化に続いて行われてもよく、または上で詳述されている第１の富化工程（ｃ）（ｉ）に続いて行われてもよい。

【0076】

第２の富化工程（ｃ）（ｉｉ）では、クロマトグラフィー分離を使用して、試料中の目的の被分析物をさらに富化する。実施形態では、クロマトグラフィー分離は、ガスクロマトグラフィーまたは液体クロマトグラフィーである。どちらの方法も当業者に周知である。実施形態では、液体クロマトグラフィーは、ＨＰＬＣ、迅速ＬＣ，マイクロＬＣ、フローインジェクションならびにトラップおよび溶出からなる群から選択される。特定の実施形態では、クロマトグラフィー分離は、単一クロマトカラム（ｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｃｏｌｕｍｎ）の使用、または２本以上のクロマトカラムの使用を含む。特定の実施形態では、２本以上のクロマトカラムが使用される場合、これらのカラムは、互いに下流に位置しており、すなわち、第２のカラムは、第１のカラムの下流に位置しており、任意選択の第３のカラムは、第２のカラムの下流に位置するなどである。２本以上のカラムが使用される実施形態では、これらのカラムは、同一であってもよく、または所望の機能に応じて、互いに異なっていてもよい。正しいカラムの選択および設定は、当業者に周知である。

【0077】

実施形態では、タンパク質分解消化工程（ｂ）または第１の富化工程（ｃ）（ｉ）の後に得られた試料は、ＬＣステーションに移送されるか、または希釈液体の添加による希釈工程後にＬＣステーションに移送される。異なる溶出手順／試薬もまた、例えば溶媒の種類（水／有機／塩／ｐＨ）および体積を変更することによって使用されてもよい。様々なパラメーターが、当業者に周知であり、容易に選択される。

【0078】

特定の実施形態では、富化工程（ｃ）は、第１の富化工程（ｃ）（ｉ）および第２の富化工程（ｃ）（ｉｉ）を含み、特に、この場合、第２の富化工程（ｃ）（ｉｉ）は、第１の富化工程（ｃ）（ｉ）の後に行われる。特定の実施形態では、第１の富化工程（ｃ）（ｉ）は、上で詳述されているビーズワークフローを含み、第２の富化工程（ｃ）（ｉｉ）は、特に、ＨＰＬＣ、迅速ＬＣ，マイクロＬＣ、フローインジェクションならびに／またはトラップおよび溶出からなる群から選択される液体クロマトグラフィーを含む。

【0079】

本発明によれば、本発明の方法の工程（ｄ）は、ヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片の分析を含み、この断片は、ペプシン、トリプシンまたはＧｌｕ－Ｃなどのプロテアーゼによる部分的消化により生成され、ＭＳ分析前に消化されていない無傷のヘモグロビンＡβ鎖分子から分離されている。

【0080】

工程（ｄ）による分析は、ＭＳにより行われる。好ましくは、ＭＳ分析手順は、タンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）分析、特にトリプル四重極型（Ｑ）ＭＳ／ＭＳ分析を含む。

【0081】

実施形態では、質量分析による分析の工程（ｄ）は、（ｉ）ヘモグロビンＡβ鎖分子のタンパク質分解性に生成されたＮ末端断片のイオンに質量分析による分析の第１段階を施し、これにより、ヘモグロビンＡβ鎖分子のタンパク質分解性に生成されたＮ末端断片の親イオンを、その質量／電荷（ｍ／ｚ）比に準拠して特徴づける工程
（ｉｉ）親イオンをフラグメント化する工程であって、ヘモグロビンＡβ鎖分子のタンパク質分解性に生成されたＮ末端断片の娘イオンが、ヘモグロビンＡβ鎖分子のタンパク質分解性に生成されたＮ末端断片の親イオンとはそのｍ／ｚ比が異なる、工程
（ｉｉｉ）娘イオンに質量分析による分析の第２段階を施し、これにより娘イオンがそのｍ／ｚ比に準拠して特徴づけられる、工程
を含む。

【0082】

本発明の方法は、試料中のＨｂＡ１ｃの定量的決定を含む。特に、非糖化ＨｂＡ０分子に対する、またはＨｂＡ分子の全量に対する糖化ＨｂＡ１ｃ分子の相対量が決定される。とりわけ好ましい実施形態では、この相対量は、２．５％以下、特に２．０％以下、より詳細には１．５％以下の変動係数（ＣＶ）で決定される。

【0083】

とりわけ好ましい実施形態では、本発明の方法は、以下のワークフロー：
（ａ）全血試料を、例えばＨ_２Ｏで希釈することにより溶血させる工程、
（ｂ）工程（ａ）からの試料に、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃを用いる部分的タンパク質分解消化を施す工程であって、ヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片が生成され、希釈酸、例えばギ酸を添加することによって消化を停止させる工程、
（ｃ）ヘモグロビンＡβ鎖分子のタンパク質分解性に生成されたＮ末端断片が固体相に結合して、ロードした固体相からの結合断片を選択的に溶出する条件下で、試料を、特に疎水的修飾されている表面を有する磁性粒子または常磁性粒子からなる固体相に接触させることによる、工程（ｂ）において生成されたヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片を富化する工程、および、
（ｄ）ヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片を含む工程（ｃ）からの試料にＭＳ、特にタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、特に、トリプル四重極タンデムＭＳによる分析を施す工程であって、試料中のＨｂＡ１ｃの量または濃度が決定される工程
を含む。

【0084】

第１の態様のさらなる実施形態では、試料中の糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ１ｃ）を決定するための方法は、試料に内標準（ＩＳＴＤ）を添加する追加の工程を含む。実施形態では、内標準は、部分的タンパク質分解消化工程（ｂ）の前または後に、試料に添加される。内標準が部分的タンパク質分解消化工程（ｂ）の前に添加される場合、内標準は、好ましくは同位体標識されている無傷のヘモグロビン分子である。内標準が部分的タンパク質分解消化工程（ｂ）の後に添加される場合、内標準は、好ましくは同位体標識されているＨｂＡ１ｃペプチドである。実施形態では、同位体標識されているＩＳＴＤは、少なくとも１個の^２Ｈ、^１３Ｃ，および／または^１５Ｎ標識を含む。

【0085】

本発明の第２の態様は、
（ｉ）ＨｂＡβ鎖分子の部分的タンパク質分解消化用の酵素、および場合により前記酵素の消化用バッファー、
（ｉｉ）（ｉ）の酵素によりタンパク質分解消化を停止することが可能なまたは停止する停止用媒体、および
（ｉｉｉ）場合により、タンパク質分解性に消化されたＨｂＡ１ｃ分子を富化するための富化手段、および
（ｉｖ）場合により、（ｉｉｉ）の富化手段からの試料成分を溶出する際に使用するための水混和性有機溶媒を含む溶出媒体
を含む、上記の方法を行うのに特に好適なキットを指す。

【0086】

本発明の第２の態様の特定の実施形態に関して、第１の態様の文脈において上で詳述されているすべての実施形態を参照する。

【0087】

本発明の第２の態様の実施形態では、キット中に含まれている酵素は、Ｇｌｕ－Ｃ、トリプシンおよびペプシンからなる群から選択される。特定の実施形態では、含まれている酵素はＧｌｕ－Ｃである。

【0088】

第２の態様の実施形態では、酵素、特にＧｌｕ－Ｃは、Ｎａ^＋および／またはＫ^＋イオンを含まないバッファー中、特に酢酸アンモニウムバッファーまたはクエン酸アンモニウムバッファーなどのアンモニウムイオンを含むバッファー中に含まれる。特定の実施形態では、Ｇｌｕ－Ｃは、約２０ｍＭ～約５０ｍＭの酢酸アンモニウムまたは約３０ｍＭの酢酸アンモニウムを含むバッファーに含まれる。

【0089】

実施形態では、消化用バッファーのｐＨは、特異的タンパク質分解酵素に依存する。実施形態では、Ｇｌｕ－Ｃがキットに含まれる場合、消化用バッファーは、酸性ｐＨ、特に、約４～約５のｐＨ、特に約４．２～約４．５のｐＨ、特に約４．３のｐＨを有する。

【0090】

実施形態では、酵素、特にＧｌｕ－Ｃは、所望の程度の部分的タンパク質分解消化を得るため、好適な任意の濃度で存在する。実施形態では、キット中に含まれるタンパク質分解酵素、特にＧｌｕ－Ｃは、約１～約５ｍｇ／ｍＬ、特に２ｍｇ／ｍｌ～３ｍｇ／ｍｌ、特に約２ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。特定の実施形態では、Ｇｌｕ－Ｃがタンパク質分解酵素として使用される場合、キットに含まれる濃度は約２ｍｇ／ｍＬである。

【0091】

実施形態では、キットは、タンパク質分解消化を停止することが可能な、またはこれを停止する停止用媒体、例えば希釈媒体をさらに含む。実施形態では、希釈媒体は、ギ酸（ＦＡ）を含む酸性溶液である。実施形態では、前記酸性溶液は、水中のＦＡを含む。実施形態では、希釈媒体は、水中の０．０５％～０．２％（ｖ／ｖ）の濃度、特に約０．１％（ｖ／ｖ）ＦＡの濃度で含む。実施形態では、酸は、分析される試料のｐＨを約１～約４のｐＨに調整する量で存在し、特にｐＨは、約２．７に調整される。

【0092】

実施形態では、本キットは、少なくとも１つの富化工程、特に結合／遊離分離工程および／またはクロマトグラフィー工程を行うように適合されている富化手段を備える。実施形態では、富化手段は、固体粒子、例えば磁性粒子または常磁性粒子、または非粒子固体相からなっていてもよい固体相を含む。

【0093】

特定の実施形態では、固体相は、ヘモグロビンＡβ鎖分子のタンパク質分解性に生成されたＮ末端断片の選択的結合のための基、例えば、疎水性有機基を有する。さらなる特定の実施形態では、富化手段は、クロマトグラフィーカラム、特にクロマトグラフィー工程を行うためのクロマトグラフィーカラムを含むことができる。

【0094】

実施形態では、キットに場合により含まれる溶出媒体は、水混和性有機溶媒、特にアセトニトリル（ＡＣＮ）を含む水溶液を含む。水混和性有機溶媒、特にＡＣＮは、約５～約２０％、例えば約１０％（ｖ／ｖ）の量で存在する。

【0095】

本キットは、個々の成分の容器を含む単一パッケージとして、または各々が個々の成分の容器を含む、一組のいくつかのパッケージとして提供されてもよい。

【0096】

実施形態では、本キットは、添付文書をさらに含む。実施形態では、添付文書は、適応症、利用、成績および／またはキットに関する注意書きに関する情報を含む。

【0097】

本発明の第３の態様は、特に、上記の方法を行うことによって、試料中の糖化ＨｂＡ１ｃを決定するように適合されている診断システムである。

【0098】

特定の実施形態では、診断システムは、
（ｉ）ＨｂＡ１ｃ分子のＮ末端断片を含む試料の調製のための少なくとも１つのステーションであって、調製が、ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）分子の部分的タンパク質分解消化を含む、少なくとも１つのステーション、
（ｉｉ）場合により、試料からヘモグロビンＡβ分子のＮ末端断片を選択的に富化するように適合されている少なくとも１つの富化ステーション、および
（ｉｉｉ）質量分析（ＭＳ）によりヘモグロビンＡ分子のＮ末端断片を分析し、試料中のＨｂＡｃ１の量または濃度を決定するように適合されている少なくとも１つのステーション
を含む。

【0099】

本発明の第３の態様の特定の実施形態に関して、第１および第２の態様の文脈において上で詳述されているすべての実施形態を参照する。

【0100】

特定の実施形態では、診断システムは、試料のハイスループットを可能にするよう、特に最大で１００個の試料／時間以上のスループットを可能にするように適合されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２０１７／１０３１８０に記載されているシステムを使用することができる。

【0101】

特定の実施形態では、診断システムは、ランダムアクセス試料調製用の少なくとも１つのステーション、およびＭＳ分析前のヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片の富化のための少なくとも１つのステーションを備える。

【0102】

実施形態では、このような診断システムは、ヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片を含む試料の自動化調製用の試料調製ステーションを備える。特定の実施形態では、前記ステーションは、１つまたは複数の試料を溶血するための区域、および１つまたは複数の試料におけるＨｂＡ分子の部分的タンパク質分解消化を実現するための区域を備える。

【0103】

実施形態では、前記診断システムは、富化ステーションをさらに含む。前記富化ステーションは、部分的タンパク質分解消化を行った後の１つまたは複数の試料を富化手段、特に固体相、特に磁性粒子または常磁性粒子に接触させるための区域を備える。さらにまたは代替的に、富化ステーションは、クロマトグラフィー区域、特にＬＣ区域を備える。実施形態では、ＬＣ区域は、１つまたは複数のＬＣチャネルを備える。実施形態では、ＬＣ区域が１つより多いＬＣチャネルを含む場合、チャネルは平行して並べてられてもよい。

【0104】

実施形態では、本診断システムは、先に調製した試料をその後の区域またはステーションにインプットするための、様々な区域とステーションとの間に少なくとも１つのインターフェースを備える。

【0105】

実施形態では、本診断システムは、各々が、試料調製および富化工程の事前に規定されたシークエンスを備え、完了に対する事前に規定された時間を必要とする、事前に規定された試料調製および富化ワークフローに試料を割り当てるようプログラム化されていてもよい、コントローラーをさらに備える。

【0106】

特定の実施形態では、コントローラーは、異なる富化ステーションチャネルからのＨｂＡβ鎖分子のＮ末端断片が、予測溶出時間に基づいた重複しない溶出液アウトプットシークエンスにおける溶出を可能にする、調製済み試料をインプットするための富化ステーションチャネルインプットシークエンスを計画する。

【0107】

実施形態では、コントローラーは、富化ステーションチャネルインプットシークエンスに適合する試料調製ステーションからの調製済み試料のアウトプットシークエンスを生成する試料調製開始シークエンスを設定して開始し、その結果、試料の調製が完了すると、割り当てられた富化ステーションチャネルも利用可能となり、調製済み試料が、別の試料の調製が完了する前、または次の調製済み試料が試料調製／富化インターフェースに到着する前に、割り当てられた富化ステーションチャネルにインプットされ得る。

【0108】

実施形態では、コントローラーは、ワークフローの適切な時機となるよう参照期間を設定する。これにより、以下の処理工程の連係が可能となる：（１）試料調製開始シークエンスにおける連続試料の間に、可能な１つまたは複数の参照期間を伴う参照期間あたり、最大でも１つの試料の調製を開始する；および／または（２）調製済み試料アウトプットシークエンスの連続調製済み試料の間に、可能な１つまたは複数の参照期間を伴う参照期間あたり最大でも１つの試料の調製を完了する；および／または（３）連続富化ステーションチャネルインプットの間に、可能な１つまたは複数の参照期間を伴う富化ステーションチャネルの１つに参照期間あたり１つの調製済み試料をインプットする；および／または（４）連続富化ステーション溶出液の間に、可能な１つまたは複数の参照期間を伴う参照期間あたり１つの富化ステーション溶出液をアウトプットする。

【0109】

特に、本発明は以下の項目に関する：
１．試料中の糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ１ｃ）を決定するための方法であって、
（ａ）ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）分子を含む試料を用意する工程、
（ｂ）工程（ａ）からの試料に部分的タンパク質分解消化工程を施す工程であって、ヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片が生成される、工程、
（ｃ）工程（ｂ）において生成されたヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片を場合により富化する工程、および
（ｄ）ヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片を含む試料に質量分析（ＭＳ）による分析を施す工程であって、試料中のＨｂＡ１ｃの量または濃度が決定される、工程
を含む方法。

【0110】

２．工程（ａ）における試料が、溶血した全血試料、特に溶血したヒト全血試料である、項目１の方法。

【0111】

３．工程（ａ）における試料が、例えば、試料：水の比が約１：５、約１：１０または約１：９（ｖ／ｖ）の比などの約１．２～約１：２０で、水（Ｈ_２Ｏ）を使用して溶血される、項目１または２の方法。

【0112】

４．試料を、３０分間未満、約１０分間未満、または約５分間未満の期間、特に約１０～約６０秒の時間、溶血する、項目１から３のいずれか１つの方法。

【0113】

５．部分的タンパク質分解消化工程（ｂ）において、試料中に存在するＨｂＡβ鎖分子の約１％～約２０％、特に約５％～１０％が、試料中に元々存在するＨｂＡβ鎖分子の総量に基づいて消化される、項目１から４のいずれかの方法。

【0114】

６．工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化を、タンパク質分解酵素を用いて行い、これにより、４～２０アミノ酸の範囲、特に５～１５アミノ酸の範囲の長さを有する、ヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片を生成し、より詳細にはタンパク質分解酵素が、配列番号１によるアミノ酸位置６、８または１４の後のヘモグロビンＡβ鎖分子を切断する、項目１から５のいずれか１つの方法。

【0115】

７．工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化が、エンドペプチダーゼ、特に、Ｇｌｕ－Ｃ、トリプシン、ペプシンおよびサーモリシンからなる群から選択されるエンドペプチダーゼを用いて行われる、項目１から６のいずれか１つの方法。

【0116】

８．工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化が、約６０分未満、特に約４５分未満、または３０分未満の期間行われる、項目１から７のいずれか１つの方法。

【0117】

９．工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化が、約２０℃～約４０℃、または約２５℃～約３７℃の温度範囲で行われる、項目１から８のいずれか１つの方法。

【0118】

１０．工程（ｂ）における消化用バッファーが、例えば約２０～約５０ｍＭの酢酸アンモニウム、特に約３０ｍＭの酢酸アンモニウムを含む、酢酸アンモニウムバッファーまたはクエン酸アンモニウムバッファーなどのアンモニウムイオンを含むバッファーである、項目１から９のいずれか１つの方法。

【0119】

１１．消化用バッファーが、約４～約５のｐＨ、特に約４．３のｐＨを有する、項目１から１０のいずれか１つの方法。

【0120】

１２．工程（ｂ）におけるタンパク質分解酵素が、約０．１～約１ｍｇ／ｍＬ、特に、約０．６ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、項目１から１１のいずれか１つの方法。

【0121】

１３．工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化が、特に、ギ酸（ＦＡ）、特に水中の約０．１％（ｖ／ｖ）ＦＡなどの酸性媒体を添加することにより停止される、項目１～１２のいずれか１つの方法。

【0122】

１４．工程（ｂ）における部分的タンパク質分解消化が、エンドペプチダーゼＧｌｕ－Ｃを用いて、特に約０．６ｍｇ／ｍＬの濃度において、約１５分～約４５分の期間、約３７℃の温度で、アンモニウムイオンを含むバッファー中で行われ、消化が、水中のギ酸、特に水中の０．１％（ｖ／ｖ）ＦＡを添加することによって停止される、項目１から１３のいずれか１つの方法。

【0123】

１５．富化工程（ｃ）が、ヘモグロビンＡβ鎖のタンパク質分解性に生成したＮ末端断片が固体相に結合し、固体相から結合断片を選択的に溶出する条件下、試料をヘモグロビンＡβ鎖のタンパク質分解性に生成したＮ末端断片を選択的結合するための表面を有する固体相に接触させる工程を含む、結合／遊離分離工程（ｃ）（ｉ）を含む、項目１から１４のいずれか１つの方法。

【0124】

１６．固体相が疎水性表面を備える、項目１５の方法。

【0125】

１７．工程（ｃ）（ｉ）において、試料を、酸性ｐＨ、特に約１～約３のｐＨ、例えば約２のｐＨにおいて固体相に接触させる、項目１５または１６の方法。

【0126】

１８．固体相が、粒子、例えば磁性粒子または常磁性粒子、例えば金属酸化物および／または金属炭化物、特にＦｅ_３Ｏ_４を含む磁性コアまたは常磁性コアを有する粒子からなる、項目１５から１７のいずれか１つの方法。

【0127】

１９．固体相の疎水性表面が、Ｃ_３～Ｃ_１８アルキル基、特にＣ_４アルキル基を含む、項目１５～１８のいずれか１つの方法。

【0128】

２０．固体相の疎水性表面が、約１００ｎｍ未満、特に約１０ｎｍ未満の細孔サイズを有する細孔を備える、項目１５～１９のいずれか１つの方法。

【0129】

２１．ヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片が、固体相からの選択的溶出によって、特に約５～２０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルの存在下で、より詳細には約１０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルの存在下で富化される、項目１５～２０のいずれか１つの方法。

【0130】

２２．工程（ｃ）が、クロマトグラフィー工程（ｉｉ）、特に試料のＨＰＬＣ、マイクロＬＣまたは迅速ＬＣなどの液体クロマトグラフィーを含む、項目１～２１のいずれか１つの方法。

【0131】

２３．富化工程が、結合／遊離分離工程（ｃ）（ｉ）およびクロマトグラフィー工程（ｃ）（ｉｉ）を含む、項目１５～２２のいずれか１つの方法。

【0132】

２４．工程（ｄ）が、ＭＳ／ＭＳ分析、特にヘモグロビンＡβ鎖分子のＮ末端断片のＭＳ／ＭＳ分析を含む、項目１～２３のいずれか１つの方法。

【0133】

２５．工程（ｄ）が、トリプル四重極型－ＭＳ／ＭＳ分析を含む、項目１～２４のいずれか１つの方法。

【0134】

２６．非糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ０）に対するまたは全ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）に対する糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ１ｃ）の比が決定される、項目１～２５のいずれか１つの方法。

【0135】

２７．比が、２．５％以下、特に、２．０％以下、より詳細には１．５％以下の変動係数で決定される、項目２６の方法。

【0136】

２８．（ｉ）ＨｂＡβ鎖分子の部分的タンパク質分解消化用の酵素、および場合により前記酵素の消化用バッファー、
（ｉｉ）（ｉ）の酵素によりタンパク質分解消化を停止することが可能な停止用媒体、および
（ｉｉｉ）場合により、タンパク質分解性に消化されたＨｂＡ１ｃ分子を富化するための富化手段、および
（ｉｖ）場合により、（ｉｉｉ）の富化手段からの試料成分を溶出する際に使用するための水混和性有機溶媒を含む溶出媒体
を含むキット。

【0137】

２９．項目１から２７のいずれか１つの方法における、項目２８のキットの使用。

【0138】

３０．項目１～２７のいずれか１つの方法を行うように適合されている試料における、糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡｃ１）を決定するための診断システム。

【0139】

３１．試料中の糖化ヘモグロビンＡ（ＨｂＡｃ１）を決定するための診断システムであって、
（ｉ）ＨｂＡ１ｃ分子のＮ末端断片を含む試料の調製のための少なくとも１つのステーションであって、調製が、ヘモグロビンＡ（Ｈｂ１）分子の部分的タンパク質分解消化を含む、少なくとも１つのステーション、
（ｉｉ）場合により、試料からヘモグロビンＡβ分子のＮ末端断片を選択的に富化するように適合されている少なくとも１つの富化ステーション、および
（ｉｉｉ）質量分析（ＭＳ）によりヘモグロビンＡ分子のＮ末端断片を分析し、試料中のＨｂＡｃ１の量または濃度を決定するように適合されている少なくとも１つのステーション
を含むシステム。

【0140】

３２．項目１から２７のいずれか１つの方法における、項目３０または３１の診断システムの使用。

【0141】

以下において、本発明を、実施例によって一層詳細に説明する。

【実施例】

【0142】

実施例１
全血中のＨｂＡ１ペプチド断片の決定
１００μＬの全血試料を９００μＬのＨ_２Ｏにより希釈し、濁りのない溶液が得られるまで、１０秒間、ボルテックスすることによって混合した。次に、５μＬの溶血した全血試料を２０μＬのＨ２Ｏによりさらに希釈した。部分消化、例えば、試料中に存在するＨｂＡ分子の１～２０％の消化を実現するため、５μＬの希釈した溶血した血液試料、１５μＬのエンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ（２ｍｇ／ｍＬ）および３０μＬの消化用バッファー（５０ｍＭの酢酸アンモニウム、ｐＨ４．３）をＬｏＢｉｎｄバイアル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に添加し、３７℃で４５分間、インキュベートした。酵素反応は、０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸９５０μＬを添加することにより停止させた。

【0143】

次に、いくつかの回分の１００μＬの疎水性磁気ビーズ（５０ｍｇ／ｍＬ）を用意した。２００μＬの消化後の全血試料および０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸を含む７００μＬのＨ_２Ｏを磁気ビーズの各回分に添加した。この混合物を３７℃および１２００ｒｐｍで５分間、振とうした。

【0144】

次に、このビーズを９００μＬの０．１％（ｖ／ｖ）水性ギ酸を使用して２回、洗浄した。続いて、９００μＬの溶出媒体（様々な量のアセトニトリル（ＡＣＮ）、すなわち５％（ｖ／ｖ）、１０％（ｖ／ｖ）、１５％（ｖ／ｖ）、２０％（ｖ／ｖ）および３０％（ｖ／ｖ）を含有する０．１％ギ酸を含む水）をロードしたビーズの各回分に添加した。この混合物を３７℃および１２００ｒｐｍで１分間、振とうし、上清を採取した。

【0145】

各回分から、試験用に５００μＬの溶出媒体を採取した。１μＬを逆相カラム（Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８ Ｓｅｎｔｒｙガードカートリッジ３００Ａ、３．５μｍ、２．１×１０ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ）に注入した。次に、９００μＬ／分で０．１％のギ酸を含む１０％水性ＡＣＮを使用するイソクラティック溶出を行った。合計の稼働時間は１２秒とした。

【0146】

ＭＳ／ＭＳに関するパラメーターは、以下の通りとした：
イオン源タイプ：ＥＳＩ
スプレー電圧：
－ 静的
－ 陽イオン（Ｖ）：３５００．００
－ 陰イオン（Ｖ）：２５００．００
－ シースガス（Ａｒｂ）：５０
－ Ａｕｘガス（Ａｒｂ）：２５
－ スイープガス（Ａｒｂ）：３
－ イオン移送管温度（℃）：３５０
－ 気化器温度（℃）：４００

【0147】

表１において、ＨｂＡ０およびＨｂＡ１ｃに関する測定パラメーターが示されている。

【表1】

【0148】

図１は、Ｇｌｕ－Ｃを用いて全血試料を消化することによって得られたＨｂＡ１ｃおよびＨｂＡ０ペプチドからのＭＳ／ＭＳピークを示している。

【0149】

表２において、溶出媒体中の様々な量のアセトニトリル（ＡＣＮ）を用いて得られたＨｂＡ０およびＨｂＡ１ｃの量、ならびにＨｂＡ１ｃ／ＨｂＡ０比に関して、反復（ｎ＝３）の変動係数（ＣＶ）の測定結果が示されている：

【表2】

【0150】

図２は、Ｇｌｕ－Ｃによるさらに精製していない（上部）、および磁気ビーズ表面での富化による試料精製を伴う、全血試料の消化と、その後の、様々な濃度のＡＣＮ、すなわち、それぞれ、５％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ、１０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ、１５％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ、２０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮおよび３０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮを用いて洗浄および溶出した、結果を示している。特に５％または１０％ ＡＣＮの量でのＡＣＮによる溶出により、ＬＣ－ＭＳ前の、ＨｂＡ１ｃおよびＨｂＡ０の特異的溶出、およびこうして富化が可能となる。

【図1】

【図2】

【配列表】

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