特許 7438958 新規な抗体分子、その調製方法及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-02-16

(45)【発行日】2024-02-27

(54)【発明の名称】新規な抗体分子、その調製方法及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240219BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240219BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240219BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240219BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240219BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240219BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240219BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240219BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240219BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240219BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240219BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240219BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240219BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C07K16/28

C07K16/46

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12P21/08

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61K45/00

A61P29/00

A61P31/00

A61P35/00

A61P37/02

【請求項の数】 24

(21)【出願番号】P 2020545187

(86)(22)【出願日】2019-03-26

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-07-15

(86)【国際出願番号】 CN2019079671

(87)【国際公開番号】W WO2019184909

(87)【国際公開日】2019-10-03

【審査請求日】2022-02-15

(31)【優先権主張番号】201810259102.3

(32)【優先日】2018-03-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】201910196438.4

(32)【優先日】2019-03-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】518049935

【氏名又は名称】イノベント バイオロジックス （スウツォウ） カンパニー，リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100091487

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 行孝

(74)【代理人】

【識別番号】100105153

【弁理士】

【氏名又は名称】朝倉 悟

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】リウ、ジュンジャン

(72)【発明者】

【氏名】ミャオ、シャオニウ

(72)【発明者】

【氏名】クアン、チフイ

【審査官】福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／０１４８５５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１６－５１４０９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／２００８３５（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体分子であって、（ｉ）単一ドメイン抗原結合部位ＶＨＨと、（ｉｉ）抗原結合Ｆａｂ断片と、（ｉｉｉ）前記単一ドメイン抗原結合部位ＶＨＨのＣ末端に位置する免疫グロブリンＦｃドメインとを含み、前記単一ドメイン抗原結合部位ＶＨＨは前記抗原結合Ｆａｂ断片の免疫グロブリンＣＨ１ドメインのＣ末端に位置し、前記単一ドメイン抗原結合部位ＶＨＨ及び前記抗原結合Ｆａｂ断片はそれぞれ抗原ＰＤ－Ｌ１及びＯＸ４０と結合し、かつ、前記単一ドメイン抗原結合部位ＶＨＨと前記抗原結合Ｆａｂ断片との間に接続ペプチドを有するかもしくは有さず、
前記単一ドメイン抗原結合部位ＶＨＨがＰＤ－Ｌ１分子と特異的に結合し、配列番号３で表されるＣＤＲ１と、配列番号４で表されるＣＤＲ２と、配列番号５で表されるＣＤＲ３とを含み、かつ、
前記抗原結合Ｆａｂ断片がＯＸ４０と特異的に結合し、配列番号１１及び７で表される対となる重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列における全ての６つの重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲを含む、抗体分子。

【請求項2】

前記単一ドメイン抗原結合部位ＶＨＨが、ラクダ科の種に天然に存在する重鎖抗体の重鎖可変ドメイン、及びヒト化ラクダ科抗体の重鎖可変ドメインから選択される、請求項１に記載の抗体分子。

【請求項3】

前記免疫グロブリンがＩｇＧ１免疫グロブリン、ＩｇＧ２免疫グロブリン又はＩｇＧ４免疫グロブリンである、請求項１に記載の抗体分子。

【請求項4】

前記Ｆｃドメインが免疫グロブリンの定常部分にヒンジ領域を含み、かつ、前記抗体分子の重鎖が前記ヒンジ領域においてジスルフィド結合を介して互いに安定的に会合する、請求項１に記載の抗体分子。

【請求項5】

前記抗体分子の重鎖のＦｃドメインは、それぞれＫａｂａｔのＥＵ番号方式に基づくＹ３４９Ｃ及びＳ３５４Ｃ、又はＳ３５４Ｃ及びＹ３４９Ｃをさらに含み、それによって前記抗体分子の重鎖がＦｃ領域において鎖間ジスルフィド結合をさらに形成する、請求項４に記載の抗体分子。

【請求項6】

前記Ｆｃドメインが抗体のエフェクター機能に影響を与える突然変異をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体分子。

【請求項7】

前記Ｆｃドメインが抗体のエフェクター機能に影響を与えるＬＡＬＡ突然変異をさらに含む、請求項６に記載の抗体分子。

【請求項8】

前記抗体分子の重鎖のＦｃドメインが、それぞれ突起又は空洞を含み、かつ、一方の重鎖のＦｃドメインにおける前記突起又は空洞はそれぞれ他方の重鎖のＦｃドメインにおける空洞又は突起に位置することができ、それによって前記抗体分子の重鎖が互いにノブ－イン－ホールの安定的な会合を形成する、請求項１に記載の抗体分子。

【請求項9】

前記免疫グロブリンＣＨ１ドメイン及び軽鎖定常ドメインＣＬがそれぞれ突起又は空洞を含み、かつ、ＣＨ１ドメインにおける前記突起又は空洞がそれぞれ軽鎖定常ドメインＣＬにおける空洞又は突起に位置することができ、それによって前記抗体分子の重鎖と軽鎖とが互いにノブ－イン－ホールの安定的な会合を形成する、請求項１に記載の抗体分子。

【請求項10】

前記単一ドメイン抗原結合部位ＶＨＨと前記抗原結合Ｆａｂ断片との間に接続ペプチドを有して、かつ、前記接続ペプチドがアミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含み、ｎが１～７の正の整数である、請求項１に記載の抗体分子。

【請求項11】

前記接続ペプチドがアミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含み、ｎが２である、請求項１０に記載の抗体分子。

【請求項12】

前記単一ドメイン抗原結合部位ＶＨＨが配列番号１又は配列番号２で表される抗ＰＤ－Ｌ１ ＶＨＨアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上同一である配列を含み、かつ、前記抗原結合Ｆａｂ断片が配列番号１１及び７で表される対となる重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列、又は対となる前記重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の抗体分子。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項14】

請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項15】

請求項１３に記載のポリヌクレオチド又は請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項16】

前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。

【請求項17】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体分子の製造方法であって、（ｉ）前記抗体分子の発現に適する条件で請求項１５に記載の宿主細胞を培養する工程と、（ｉｉ）前記宿主細胞又は前記宿主細胞の培地から前記抗体分子を回収する工程とを含む、製造方法。

【請求項18】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体分子と薬学的に許容可能なベクターとを含む、医薬組成物。

【請求項19】

少なくとも１種の他の有効成分をさらに含む、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項20】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体分子と、前記抗体分子と複合する１つ以上の異種分子とを含む免疫複合体であって前記１つ以上の異種分子が細胞傷害剤である、免疫複合体。

【請求項21】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体分子、請求項１８又は１９に記載の医薬組成物、及び請求項２０に記載の免疫複合体の、適用対象における疾患を治療及び／又は予防するための医薬品を調製し、又は疾患の診断試薬を調製するための使用。

【請求項22】

前記適用対象が哺乳類である、請求項２１に記載の使用。

【請求項23】

前記適用対象がヒトである、請求項２２に記載の使用。

【請求項24】

前記疾患は自己免疫疾患、急性または慢性炎症性疾患、感染性疾患、及び腫瘍から選択される、請求項２１に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、全体的には、免疫学及び抗体工学の分野に関する。具体的には、本発明は人工的に設計された複数種の新規な抗体分子、前記抗体分子をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ポリヌクレオチドもしくはベクターを含む宿主細胞、前記抗体分子を含む免疫複合体及び医薬組成物、並びに疾患の免疫治療、予防及び／又は診断における前記抗体分子の使用を開示する。

【背景技術】

【0002】

抗体分子は、対応する抗原と標的特異的に結合することができ、さまざまな疾患（例えば、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患など）の重要な治療剤、予防剤及び／又は診断剤になってきている。しかしながら、臨床利用において、１つの標的だけに対する単一特異性抗体には限界がある。患者が単一特異性抗体による治療を受けた後、薬剤耐性が生じたり、非応答者になったりすることがある。がんや他のさまざまな疾患についての研究により、複数種のシグナル伝達経路が疾患の発生と発展に関与する場合が多く、単一の標的による免疫療法が多くの疾患に対しては一般に治療作用を果たすのに不十分であることが分かった。

【0003】

多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は異なる抗原と特異的に結合できるため、一方の抗原が特定の免疫細胞に位置し、他方の抗原が疾患細胞に位置する場合は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は特定の免疫細胞を疾患細胞にリダイレクトすることによって、疾患細胞に対する免疫細胞の殺滅作用を強化できる。また、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）も、２種以上の異なる媒体に同時に作用するシグナル伝達経路として設計されてもよい。これらの利点により、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）の幅広い応用に将来性が期待できる。

【0004】

抗体工学により想像力に満ちた数多くの多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）の形態が開発されており、疾患への利用に関するそれらの適用性も研究されている（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｕ．＆Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ．Ｅ．，Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍａｂｓ，２０１７，９（２）：１８２－２１２）。現在、市販品として承認された２種の二重特異性抗体製品は、それぞれＭｉｃｒｏｍｅｔ社及びＡｍｇｅｎ社によって開発されたＢｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ、及びＴｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ社によって開発されたＣａｔｕｍａｘｏｍａｂである。Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂは米国で初めて市販品として承認されたＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）及び前駆Ｂ急性リンパ芽球性白血病リンパ腫（ＡＬＬ）を治療するための分子量が約５５ＫＤａの単鎖二重特異性抗体であり、それぞれＣＤ１９分子及びＣＤ３分子をターゲットとする２種の単鎖Ｆｖ分子が可動性リンカーを介して融合してなり、ほぼ全てのＢ細胞リンパ腫において発現されるＣＤ１９及びＴ細胞において発現されるＣＤ３を用いて、Ｔ細胞と標的細胞（腫瘍細胞）を緊密に結合させ、Ｔ細胞がパーフォリン及びテロメラーゼをシナプス間隙に放出して、腫瘍細胞に一連の化学反応を引き起こすことによって、腫瘍細胞を殺滅する（Ｎａｇｏｒｓｅｎ Ｄ．＆Ｂａｅｕｅｒｌｅ Ｐ．Ａ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ Ｔ ｃｅｌｌ－ｅｎｇａｇｉｎｇ ＢｉＴＥ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２０１１，３１７：１２５５－１２６０）。Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂは、それぞれ親マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ及びラットＩｇＧ２ｂアイソタイプに由来する２つの半抗体からなるキメラであり、それぞれの半抗体は１本の軽鎖と１本の重鎖とを有し、抗ＣＤ３ラットＩｇＧ２ｂ半抗体はＴ細胞を認識し、抗腫瘍細胞表面抗原ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）のマウスＩｇＧ２ａ半抗体は腫瘍細胞を認識するために用いられる（ＣｈｅｌｉｕｓＤ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ，ＭＡｂｓ，２０１０，２：３０９－３１９）。Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ（Ｒｅｍｏｖａｂ（登録商標））は２００９年４月に欧州でＥｐＣＡＭ陽性の上皮性転移性腫瘍が引き起こす悪性腹水の治療用許可を取っていた。

【0005】

多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は、その構成部分及び構築方式によって多くの種類に分けることができる。例えば、多重特異性抗体構造の左右対称性によって、対称構造及び非対称構造に分けられ、多重特異性抗体におけるＩｇＧのＦｃ領域の有無によって、Ｆｃ領域を持つ抗体の形態及びＦｃ領域を持たない抗体の形態に分けられ、多重特異性抗体における抗原結合部位の数量によって、二価、三価、四価又はそれ以上の多価抗体などに分けることができる。

【0006】

従来技術による多重特異性抗体の形態はその調製においても利用においてもそれぞれ利点と欠点があり、例えば、Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を組換えることによって大規模に培養して製造できるが、凝集物が形成されやすく、インビボ半減期が非常に短く、実際に使用する時は連続輸液装置を別途設ける必要があり、Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂは製造プロセスが複雑であり、しかもマウスヘテロ抗体が人体で免疫原性関連の問題を引き起こしやすい。

【0007】

したがって、本分野では選択可能で特性的に改善されている多重特異性抗体の形態が求められる。本発明は、新規な多重特異性抗体の形態を提供する。前記抗体形態は分子量が小さくかつ安定性が高い単一ドメイン抗原結合部位を構築モジュールとして使用し、Ｆａｂ断片のＮ末端又はＣ末端に接続させており、このように得た接続物をＦｃ領域に接続させると、インビトロで培養細胞において効果的に発現されやすく、複雑な製造プロセスを必要としない。また、本発明の抗体形態においてＦｃ領域の存在により、培養細胞において本発明の抗体が発現された後、ワンステップアフィニティークロマトグラフィーを用いると精製された抗体を得ることができ、しかも本発明の抗体はインビボで血清半減期が比較的長く、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）のようなエフェクター機能を引き起こすことができる。本発明の多重特異性抗体の形態は、該多重特異性抗体における各抗原結合部位の対応する異なるエピトープとの結合親和力を保持でき、かつ異なるエピトープと結合する場合は互いに立体障害による干渉が生じいため、ドラッガブルである。さらに、本発明の多重特異性抗体の形態は、物理的・生物学的に安定しており、このため該抗体にはより良好な生産性と将来性が期待できる。

【発明の概要】

【0008】

本出願は、抗体工学的方法によって構築された新規な抗体分子を開示する。前記抗体分子は、高親和力と高特異性で１種又は複数種の抗原と結合し、好ましくは、２種以上の抗原と結合することができる。さらに本発明は、前記抗体をコードする核酸分子、前記抗体分子を産生するための発現ベクター、宿主細胞及び方法を提供する。さらに本発明は、本発明の抗体分子を含む免疫複合体及び医薬組成物を提供する。本出願で開示されている抗体分子は、単独で、又は他の医薬品もしくは他の治療方式と組み合わせて、自己免疫疾患、急性または慢性炎症性疾患、感染性疾患（例えば、慢性感染症又は敗血症）、腫瘍などの疾患を治療、予防及び／又は診断することができる。

【0009】

このため、１つの様態において、本発明は、以下に示される１つ又は複数の特性を有する抗体分子を提供する：
（ａ）高親和力、例えば少なくとも約１０^７Ｍ^－１、好ましくは約１０^８Ｍ^－１、より好ましくは約１０^９Ｍ^－１又はそれよりも高い親和力定数で１種又は複数種の抗原と特異的に結合する；
（ｂ）インビトロで培養細胞において発現されやすく、かつ抗体分子の各鎖同士が正確にカップリング又はペアリングすることができる；
（ｃ）良好な物理的安定性を有し、特に、良好な長期的熱安定性を有し、かつ長期間にわたって生物学的活性を保持できる；かつｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／ＣＤ８０、
（ｄ）１種又は複数種の抗原と特異的に結合すると、各抗原が関与するシグナル伝達経路を調節（例えば、抑制又は作動）することによって生物学的機能を発揮する；
（ｅ）１種又は複数種の抗原と特異的に結合すると、Ｆｃ領域によってエフェクター機能を発揮する。

【0010】

１つの実施形態において、本発明の抗体分子は（ｉ）単一ドメイン抗原結合部位と、（ｉｉ）抗原結合Ｆａｂ断片とを含み、前記単一ドメイン抗原結合部位は前記抗原結合Ｆａｂ断片の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＮ末端もしくは前記抗原結合Ｆａｂ断片の軽鎖定常領域（ＣＬ）のＣ末端に位置し、又は、前記単一ドメイン抗原結合部位は前記抗原結合Ｆａｂ断片の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＮ末端もしくは免疫グロブリンＣＨ１ドメインのＣ末端に位置し、前記単一ドメイン抗原結合部位及び前記抗原結合Ｆａｂ断片は同じ又は異なる抗原と結合し、かつ、前記単一ドメイン抗原結合部位と前記抗原結合Ｆａｂ断片との間に、接続ペプチドを有するかもしくは有さない、本発明の抗体分子は前記単一ドメイン抗原結合部位及び前記抗原結合Ｆａｂ断片のＣ末端に位置する（ｉｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメインをさらに含む。

【0011】

１つの実施形態において、本発明の抗体分子は少なくとも４つの抗原結合部位を含み、それぞれは少なくとも２つの単一ドメイン抗原結合部位及び少なくとも２つのＦａｂ断片における抗原結合部位であり、少なくとも４種、３種、２種の異なる抗原と結合し、又は１種の同じ抗原と結合する。結合対象となる各種の抗原に対して、本発明の抗体分子における抗原結合部位が結合するのは、抗原分子における同じ又は異なるエピトープである。１つの実施形態において、本発明の抗体分子は４つの抗原結合部位を含み、そのうち、２つの単一ドメイン抗原結合部位は第１抗原における同じ又は異なるエピトープと結合し、２つのＦａｂ断片は第２抗原における同じ又は異なるエピトープと結合し、前記第１抗原は前記第２抗原と異なる。

【0012】

１つの実施形態において、本発明の抗体分子における単一ドメイン抗原結合部位と抗原結合Ｆａｂ断片との間には、接続ペプチドとして、単独で又は組み合わせて使用されたグリシン及び／又はセリン残基を有する。例えば、前記接続ペプチドはアミノ酸配列（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎを含み、ここでｎは１以上の正の整数であり、例えば、ｎは１～７の正の整数であり、ｎは２、３、４、５、６である。

【0013】

１つの実施形態において、本発明の抗体分子における単一ドメイン抗原結合部位が重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、天然の軽鎖欠如抗体の重鎖可変ドメイン（例えば、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）種で天然に存在する重鎖抗体の重鎖可変ドメイン）、魚類免疫グロブリンにおけるＶＨ様単一ドメイン（新規抗原受容体又はＮＡＲ、例えば、サメの血清で天然に存在するＩｇＮＡＲと呼ばれる）、及びこれらから誘導される組換え単一ドメイン抗原結合部位（例えば、ラクダ化ヒトＶＨドメイン、ヒト化ラクダ科抗体の重鎖可変ドメイン）から選択される。１つの好ましい実施形態において、本発明の抗体分子における前記単一ドメイン抗原結合部位は、ラクダ科で天然に存在する重鎖抗体の重鎖可変ドメイン、ラクダ化ヒトＶＨドメイン、及びヒト化ラクダ科抗体の重鎖可変ドメインから選択される。本出願において天然の軽鎖欠如重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメインは、四本鎖免疫グロブリンにおける通常のＶＨ領域と区別するために、ＶＨＨとも呼ばれる。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科の種（例えばラクダ、アルパカ、ヒトコブラクダ、リャマ、グアナコ）で産生する抗体から誘導されてもよい。ラクダ科以外の種も天然の軽鎖欠如重鎖抗体を産生でき、このようなＶＨＨも本発明の範囲内である。

【0014】

１つの実施形態において、本発明は、４本のポリペプチド鎖を含む抗体分子であって、第１ポリペプチド鎖及び第３ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖は免疫グロブリン軽鎖と、前記免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＮ末端に位置する単一ドメイン抗原結合部位、例えばＶＨＨとを含み、第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖は免疫グロブリン重鎖を含む抗体分子を提供する。好ましくは、前記免疫グロブリンがＩｇＧ１免疫グロブリン、ＩｇＧ２免疫グロブリン又はＩｇＧ４免疫グロブリンであり、より好ましくは、前記免疫グロブリンはヒトＩｇＧ１免疫グロブリンである。

【0015】

１つの実施形態において、本発明は、４本のポリペプチド鎖を含む抗体分子であって、第１ポリペプチド鎖及び第３ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖は免疫グロブリン軽鎖と、前記免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）のＣ末端に位置する単一ドメイン抗原結合部位、例えばＶＨＨとを含み、第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖は免疫グロブリン重鎖を含む抗体分子を提供する。好ましくは、前記免疫グロブリンがＩｇＧ１免疫グロブリン、ＩｇＧ２免疫グロブリン又はＩｇＧ４免疫グロブリンであり、より好ましくは、前記免疫グロブリンはヒトＩｇＧ１免疫グロブリンである。

【0016】

１つの実施形態において、本発明は、４本のポリペプチド鎖を含む抗体分子であって、第１ポリペプチド鎖及び第３ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖は免疫グロブリン軽鎖を含み、第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖は免疫グロブリン重鎖と、前記免疫グロブリン重鎖のＮ末端に位置する単一ドメイン抗原結合部位、例えばＶＨＨとを含む抗体分子を提供する。好ましくは、前記免疫グロブリンがＩｇＧ１免疫グロブリン、ＩｇＧ２免疫グロブリン又はＩｇＧ４免疫グロブリンであり、より好ましくは、前記免疫グロブリンはヒトＩｇＧ１免疫グロブリンである。

【0017】

１つの実施形態において、本発明は、４本のポリペプチド鎖を含む抗体分子であって、第１ポリペプチド鎖及び第３ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖は免疫グロブリン軽鎖を含み、第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで免疫グロブリン重鎖可変領域と、免疫グロブリンＣＨ１ドメインと、単一ドメイン抗原結合部位（例えばＶＨＨ）と、免疫グロブリンＣＨ２、ＣＨ３ドメインと、必要に応じてＣＨ４ドメインとを含む抗体分子を提供する。好ましくは、前記免疫グロブリンがＩｇＧ１免疫グロブリン、ＩｇＧ２免疫グロブリン又はＩｇＧ４免疫グロブリンであり、より好ましくは、前記免疫グロブリンはヒトＩｇＧ１免疫グロブリンである。

【0018】

１つの実施形態において、本発明は、４本のポリペプチド鎖を含む抗体分子であって、第１ポリペプチド鎖及び第３ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで単一ドメイン抗原結合部位（例えばＶＨＨ）と、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含み、第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、免疫グロブリンＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインと、必要に応じてＣＨ４ドメインとを含む抗体分子を提供する。好ましくは、前記免疫グロブリンがＩｇＧ１免疫グロブリン、ＩｇＧ２免疫グロブリン又はＩｇＧ４免疫グロブリンであり、より好ましくは、前記免疫グロブリンはヒトＩｇＧ１免疫グロブリンである。

【0019】

１つの実施形態において、本発明は、４本のポリペプチド鎖を含む抗体分子であって、第１ポリペプチド鎖及び第３ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）と、単一ドメイン抗原結合部位（例えばＶＨＨ）とを含み、第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、免疫グロブリンＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインと、必要に応じてＣＨ４ドメインとを含む抗体分子を提供する。好ましくは、前記免疫グロブリンがＩｇＧ１免疫グロブリン、ＩｇＧ２免疫グロブリン又はＩｇＧ４免疫グロブリンであり、より好ましくは、前記免疫グロブリンはヒトＩｇＧ１免疫グロブリンである。

【0020】

１つの実施形態において、本発明は、４本のポリペプチド鎖を含む抗体分子であって、第１ポリペプチド鎖及び第３ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含み、第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで単一ドメイン抗原結合部位（例えばＶＨＨ）と、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、免疫グロブリンＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインと、必要に応じてＣＨ４ドメインとを含む抗体分子を提供する。好ましくは、前記免疫グロブリンがＩｇＧ１免疫グロブリン、ＩｇＧ２免疫グロブリン又はＩｇＧ４免疫グロブリンであり、より好ましくは、前記免疫グロブリンはヒトＩｇＧ１免疫グロブリンである。

【0021】

１つの実施形態において、本発明は、４本のポリペプチド鎖を含む抗体分子であって、第１ポリペプチド鎖及び第３ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）とを含み、第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、免疫グロブリンＣＨ１ドメインと、単一ドメイン抗原結合部位（例えばＶＨＨ）と、免疫グロブリンＣＨ２、ＣＨ３ドメインと、必要に応じてＣＨ４ドメインとを含む抗体分子を提供する。好ましくは、前記免疫グロブリンがＩｇＧ１免疫グロブリン、ＩｇＧ２免疫グロブリン又はＩｇＧ４免疫グロブリンであり、より好ましくは、前記免疫グロブリンはヒトＩｇＧ１免疫グロブリンである。

【0022】

１つの実施形態において、本発明は、４本のポリペプチド鎖を含む抗体分子であって、第１ポリペプチド鎖及び第３ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで単一ドメイン抗原結合部位（例えばＶＨＨ）と、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、免疫グロブリンＣＨ１ドメインとを含み、第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）と、免疫グロブリンＣＨ２、ＣＨ３ドメインと、必要に応じてＣＨ４ドメインとを含む抗体分子を提供する。好ましくは、前記免疫グロブリンがＩｇＧ１免疫グロブリン、ＩｇＧ２免疫グロブリン又はＩｇＧ４免疫グロブリンであり、より好ましくは、前記免疫グロブリンはヒトＩｇＧ１免疫グロブリンである。

【0023】

１つの実施形態において、本発明は、４本のポリペプチド鎖を含む抗体分子であって、第１ポリペプチド鎖及び第３ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、免疫グロブリンＣＨ１ドメインと、単一ドメイン抗原結合部位（例えばＶＨＨ）とを含み、第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）と、免疫グロブリンＣＨ２、ＣＨ３ドメインと、必要に応じてＣＨ４ドメインとを含む抗体分子を提供する。好ましくは、前記免疫グロブリンがＩｇＧ１免疫グロブリン、ＩｇＧ２免疫グロブリン又はＩｇＧ４免疫グロブリンであり、より好ましくは、前記免疫グロブリンはヒトＩｇＧ１免疫グロブリンである。

【0024】

１つの実施形態において、本発明は、４本ポリペプチド鎖を含む抗体分子であって、第１ポリペプチド鎖及び第３ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、免疫グロブリンＣＨ１ドメインとを含み、第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで単一ドメイン抗原結合部位（例えばＶＨＨ）と、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）と、免疫グロブリンＣＨ２、ＣＨ３ドメインと、必要に応じてＣＨ４ドメインとを含む抗体分子を提供する。好ましくは、前記免疫グロブリンがＩｇＧ１免疫グロブリン、ＩｇＧ２免疫グロブリン又はＩｇＧ４免疫グロブリンであり、より好ましくは、前記免疫グロブリンはヒトＩｇＧ１免疫グロブリンである。

【0025】

１つの実施形態において、本発明は、４本のポリペプチド鎖を含む抗体分子であって、第１ポリペプチド鎖及び第３ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、免疫グロブリンＣＨ１ドメインとを含み、第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖の各ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）と、単一ドメイン抗原結合部位（例えばＶＨＨ）と、免疫グロブリンＣＨ２、ＣＨ３ドメインと、必要に応じてＣＨ４ドメインとを含む抗体分子を提供する。好ましくは、前記免疫グロブリンがＩｇＧ１免疫グロブリン、ＩｇＧ２免疫グロブリン又はＩｇＧ４免疫グロブリンであり、より好ましくは、前記免疫グロブリンはヒトＩｇＧ１免疫グロブリンである。

【0026】

本発明に係る４本のポリペプチド鎖を含む抗体分子において、発明者は抗体の分子構造を安定化させるとともに各鎖同士間の正確なカップリング又はペアリングを容易にするためにアミノ酸残基を設計している。例えば、抗体分子の第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖のＦｃドメインには、「ＣＰＰＣ」アミノ酸残基を有するヒンジ領域が含まれ、それによって前記第２ポリペプチド鎖と第４ポリペプチド鎖は互いに前記ヒンジ領域のアミノ酸残基の間に形成されたジスルフィド結合によって安定的に会合する。１つの実施形態において、本発明の抗体分子の第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖はそれぞれのＦｃドメインにそれぞれＹ３４９Ｃ及びＳ３５４Ｃが含まれ、又はそれぞれＳ３５４Ｃ及びＹ３４９Ｃが含まれ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＥＵインデックスに基づいて番号を付け、以下「ＥＵ番号方式」という）、それによって、第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖はＦｃ領域でさらに鎖間のジスルフィド結合を形成することによって、第２ポリペプチド鎖と第４ポリペプチド鎖の正確なペアリングを安定化させる。

【0027】

１つの実施形態において、本発明の抗体分子の第２ポリペプチド鎖及び／又は第４ポリペプチド鎖は、Ｆｃドメインに抗体エフェクター機能に影響を与えるアミノ酸突然変異が含まれる。１つの特定の実施形態において、前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。１つの実施形態において、前記アミノ酸突然変異は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインに存在し、例えば、前記抗体分子は、第２ポリペプチド鎖及び／又は第４ポリペプチド鎖の第２３４位及び第２３５位（ＥＵ番号方式）のアミノ酸置換を含む。１つの特定の実施形態において、前記アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａである（以下、「ＬＡＬＡ突然変異」という）。

【0028】

１つの実施形態において、本発明の抗体分子の第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖のそれぞれのＦｃドメインにはそれぞれ突起（「ノブ（ｋｎｏ）」）又は空洞（「ホール（ｈｏｌｅ）」）が含まれ、かつ第２ポリペプチド鎖のＦｃドメインにおける前記突起又は空洞は、それぞれ第４ポリペプチド鎖のＦｃドメインにおける前記空洞又は突起に置いてもよく、それによって前記第２ポリペプチド鎖と第４ポリペプチド鎖は互いに「ノブ－イン－ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」のように安定的に会合し得る。１つの実施形態において、前記第２ポリペプチド鎖と第４ポリペプチド鎖の一方の鎖にはアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗが含まれ、かつ、前記第２ポリペプチド鎖と第４ポリペプチド鎖の他方の鎖にはアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号方式）が含まれる。それによって一方の鎖の突起を他方の鎖の空洞に置くことによって、第２ポリペプチド鎖と第４ポリペプチド鎖の正確なペアリングを促進することができる。

【0029】

１つの実施形態において、本発明の抗体分子の第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖の免疫グロブリンＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインにはそれぞれ突起又は空洞が含まれ、かつ、ＣＨ１ドメインにおける前記突起又は空洞はそれぞれＣＬドメインにおける前記空洞又は突起に置くことによって、前記第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖も互いに「ノブ－イン－ホール」のように安定的に会合し得る。同様に、本発明の抗体分子の第３ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖の免疫グロブリンＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインにもそれぞれ突起又は空洞が含まれ、かつ、ＣＨ１ドメインにおける前記突起又は空洞はそれぞれＣＬドメインにおける前記空洞又は突起に置くことによって、前記第３ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖も互いに「ノブ－イン－ホール」のように安定的に会合し得る。

【0030】

１つの実施形態において、本発明の抗体分子における２つの単一ドメイン抗原結合部位は第１抗原における同じエピトープと結合し、２つのＦａｂ断片は第２抗原における同じエピトープと結合し、それによって、前記抗体分子は第１抗原及び第２抗原に対する二重特異性抗体である。

【0031】

本発明の抗体分子が特異的に結合する抗原のタイプについては特に制限がなく、抗原は、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、シグナル伝達タンパク質、炎症性メディエーター、リガンド、細胞表面受容体又はその断片であってもよい。１つの実施形態において、本発明の抗体分子が特異的に結合する抗原は、腫瘍関連抗原、免疫チェックポイント分子、血管新生因子、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー及び免疫系における共刺激分子、並びにこれら分子のリガンド及び／又は受容体、例えば、ＯＸ４０、ＣＤ４７、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＶＥＧＦ及びＧＩＴＲから選択される。

【0032】

本発明において、下記の複数種の二重特異性抗体が例示される。

【0033】

ｉ）１つの実施形態において、本発明の抗体分子は、抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体であり、前記抗体は、少なくとも約１０^７Ｍ^－１、好ましくは約１０^８Ｍ^－１、より好ましくは約１０^９Ｍ^－１又はそれよりも高い親和力定数で、腫瘍細胞表面で発現された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバーＯＸ４０と結合することによって、Ｔ細胞を活性化させ、例えば、エフェクターＴ細胞の免疫刺激／エフェクト機能を強化させかつ／又はこれらの細胞を増殖させかつ／又は制御性Ｔ細胞の免疫抑制機能をダウンレギュレートし、さらに少なくとも約１０^７Ｍ^－１、好ましくは約１０^８Ｍ^－１、より好ましくは約１０^９Ｍ^－１又はそれよりも高い親和力定数で腫瘍細胞表面のＰＤ－Ｌ１と結合することによって、Ｔ細胞におけるＰＤ－１と腫瘍細胞表面のＰＤ－Ｌ１の結合を抑制して、Ｔ細胞の活性化を誘導して抗腫瘍作用を発揮させることができる。

【0034】

１つの実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体は左右に実質的に対称な４本のポリペプチド鎖からなり、左半分の２本のポリペプチド鎖及び右半分の２本のポリペプチド鎖は、いずれも（ｉ）単一ドメイン抗原結合部位と、（ｉｉ）抗原結合Ｆａｂ断片とを含み、前記単一ドメイン抗原結合部位は前記抗原結合Ｆａｂ断片の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＮ末端もしくは前記抗原結合Ｆａｂ断片の軽鎖定常領域（ＣＬ）のＣ末端に位置し、又は前記単一ドメイン抗原結合部位は前記抗原結合Ｆａｂ断片の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＮ末端もしくは免疫グロブリンＣＨ１ドメインのＣ末端に位置し、前記単一ドメイン抗原結合部位及び前記抗原結合Ｆａｂ断片はＯＸ４０又はＰＤ－Ｌ１と結合し、かつ、前記単一ドメイン抗原結合部位と抗原結合Ｆａｂ断片との間に、接続ペプチドを有するかもしくは有さない、左半分の２本のポリペプチド鎖及び右半分の２本のポリペプチド鎖は、前記単一ドメイン抗原結合部位及び前記抗原結合Ｆａｂ断片のＣ末端に位置する（ｉｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメインをさらに含む。

【0035】

１つの実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体における単一ドメイン抗原結合部位はＰＤ－Ｌ１と特異的に結合するＶＨＨであり、Ｆａｂ断片はＯＸ４０と特異的に結合する抗ＯＸ４０抗体Ｆａｂ断片である。

【0036】

１つの好ましい実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体におけるＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する前記ＶＨＨは配列番号３で表されるＣＤＲ１と、配列番号４で表されるＣＤＲ２と、配列番号５で表されるＣＤＲ３とを含み、又は前記３つのＣＤＲの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、５、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列であり、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体におけるＯＸ４０と特異的に結合する前記抗ＯＸ４０抗体Ｆａｂ断片は抗ＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２０１１２から誘導される配列番号１１及び７で表される対となる重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列における全ての６つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ、又は前記６つＣＤＲの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、５、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。

【0037】

別の実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体におけるＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する前記ＶＨＨは配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同じ）である配列を含み、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体におけるＯＸ４０と特異的に結合する前記抗ＯＸ４０抗体Ｆａｂ断片は、抗ＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２０１１２から誘導される配列番号１１及び７で表される対となる重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列、又は対となる前記重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。

【0038】

別の好ましい実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体は左右に実質的に対称な４本のポリペプチド鎖からなり、前記抗体分子の左半分の２本のポリペプチド鎖はそれぞれ配列番号６で表される第１ポリペプチド鎖と、配列番号１０で表される第２ポリペプチド鎖とを含み、それぞれ配列番号１４で表される第１ポリペプチド鎖と、配列番号１０で表される第２ポリペプチド鎖とを含み、それぞれ配列番号１５で表される第１ポリペプチド鎖と、配列番号１６で表される第２ポリペプチド鎖とを含み、それぞれ配列番号１５で表される第１ポリペプチド鎖と、配列番号１７で表される第２ポリペプチド鎖とを含み、又は前記配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同じ）である配列を含み、これに対応して、前記抗体分子の右半分の２本のポリペプチド鎖はそれぞれ配列番号６で表される第３ポリペプチド鎖と、配列番号１０で表される第４ポリペプチド鎖とを含み、それぞれ配列番号１４で表される第３ポリペプチド鎖と、配列番号１０で表される第４ポリペプチド鎖とを含み、それぞれ配列番号１５で表される第３ポリペプチド鎖と、配列番号１６で表される第４ポリペプチド鎖とを含み、それぞれ配列番号１５で表される第３ポリペプチド鎖と、配列番号１７で表される第４ポリペプチド鎖とを含み、又は前記配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同じ）である配列を含む。

【0039】

ｉｉ）１つの実施形態において、本発明の抗体分子は抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体であり、前記抗体は少なくとも約１０^７Ｍ^－１、好ましくは約１０^８Ｍ^－１、より好ましくは約１０^９Ｍ^－１又はそれよりも高い親和力定数で血管内皮増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）と結合することによって、ＶＥＧＦとその受容体ＶＥＧＦＲの結合を遮断して、ＶＥＧＦＲが活性化できないようにし、それによって抗血管新生作用を発揮し、例えば、抗腫瘍血管新生作用を発揮し、腫瘍の成長を抑制する。かつ、少なくとも約１０^７Ｍ^－１、好ましくは約１０^８Ｍ^－１、より好ましくは約１０^９Ｍ^－１又はそれよりも高い親和力定数でＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるグルココルチコイドによって誘導された腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）と結合し、それによって制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の抑制作用を逆転するとともにエフェクターＴ細胞の共刺激と活性化により抗腫瘍作用を発揮する。

【0040】

１つの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体は左右に実質的に対称な４本のポリペプチド鎖からなり、左半分の２本のポリペプチド鎖及び右半分の２本のポリペプチド鎖は、いずれも（ｉ）単一ドメイン抗原結合部位と、（ｉｉ）抗原結合Ｆａｂ断片とを含み、前記単一ドメイン抗原結合部位は前記抗原結合Ｆａｂ断片の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＮ末端もしくは前記抗原結合Ｆａｂ断片の軽鎖定常領域（ＣＬ）のＣ末端に位置し、又は前記単一ドメイン抗原結合部位は前記抗原結合Ｆａｂ断片の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＮ末端もしくは免疫グロブリンＣＨ１ドメインのＣ末端に位置し、前記単一ドメイン抗原結合部位及び前記抗原結合Ｆａｂ断片はＶＥＧＦ又はＧＩＴＲと結合し、前記単一ドメイン抗原結合部位と前記抗原結合Ｆａｂ断片との間に、接続ペプチドを有するかもしくは有さない、左半分の２本のポリペプチド鎖及び右半分の２本のポリペプチド鎖は、前記単一ドメイン抗原結合部位及び前記抗原結合Ｆａｂ断片のＣ末端に位置する（ｉｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメインをさらに含む。

【0041】

１つの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体における単一ドメイン抗原結合部位はＧＩＴＲと特異的に結合するＶＨＨであり、Ｆａｂ断片はＶＥＧＦと特異的に結合する抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ断片である。

【0042】

１つの好ましい実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体におけるＧＩＴＲと特異的に結合する前記ＶＨＨはＧＦＡＦＧＳＳ（配列番号２５）で表されるＣＤＲ１と、ＳＧＧＧＦＧＤ（配列番号２６）で表されるＣＤＲ２と、ＡＴＤＷＲＫＰ（配列番号２７）で表されるＣＤＲ３とを含み、又は前記３つのＣＤＲの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、５、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列であり、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体におけるＶＥＧＦと特異的に結合する前記抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ断片は抗ＶＥＧＦ抗体Ａｖａｓｔｉｎから誘導される配列番号２２／２０で表される対となる重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列における全ての６つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ、又は前記６つＣＤＲの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、５、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。

【0043】

別の実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体におけるＧＩＴＲと特異的に結合する前記ＶＨＨは配列番号２４で表される抗ＧＩＴＲ ＶＨＨから誘導されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同じ）である配列を含み、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体におけるＶＥＧＦと特異的に結合する前記抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ断片は、抗ＶＥＧＦ抗体Ａｖａｓｔｉｎから誘導される配列番号２２／２０で表される対となる重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列、又は対となる前記重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。

【0044】

別の好ましい実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体は左右に実質的に対称な４本のポリペプチド鎖からなり、前記抗体分子の左半分の２本のポリペプチド鎖はそれぞれ配列番号１８で表される第１ポリペプチド鎖と、配列番号２１で表される第２ポリペプチド鎖とを含み、それぞれ配列番号１８で表される第１ポリペプチド鎖と、配列番号２８で表される第２ポリペプチド鎖とを含み、又は前記配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同じ）である配列を含み、これに対応して、前記抗体分子の右半分の２本のポリペプチド鎖はそれぞれ配列番号１８で表される第３ポリペプチド鎖と、配列番号２１で表される第４ポリペプチド鎖とを含み、それぞれ配列番号１８で表される第３ポリペプチド鎖と、配列番号２８で表される第４ポリペプチド鎖とを含み、又は前記配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同じ）である配列を含む。

【0045】

第２の態様において、本発明は、本発明の抗体分子におけるいずれか１本又は複数本のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0046】

第３の態様において、本発明は、本発明の抗体分子におけるいずれか１本又は複数本のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。

【0047】

第４の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。例えば、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、好ましくはＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞であり、前記宿主細胞は、原核細胞、好ましくは大腸菌細胞である。

【0048】

第５の態様において、本発明は、本発明の抗体分子の産生方法を提供する。前記方法は、（ｉ）前記抗体分子の発現に適する条件において本発明の宿主細胞を培養する工程と、（ｉｉ）前記宿主細胞又は前記培地から前記抗体分子を回収する工程とを含む。

【0049】

第６の態様において、本発明は、本発明の抗体分子を含む免疫複合体及び医薬組成物を提供する。本出願で開示されている抗体分子は、単独で、又は他の医薬品もしくは他の治療方式と組み合わせて、自己免疫疾患、急性または慢性炎症性疾患、感染性疾患（例えば、慢性感染症又は敗血症）、腫瘍などの疾患を治療、予防及び／又は診断することができる。

【0050】

第７の態様において、本発明は、本発明の抗体分子、免疫複合体及び医薬組成物の使用を提供し、対象における疾患を治療及び／又は予防するための医薬品又は疾患の診断ツールとして用いられる。好ましくは、前記対象は、哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。１つの実施形態において、前記疾患は、自己免疫疾患、急性または慢性炎症性疾患、感染性疾患（例えば、慢性感染症又は敗血症）、腫瘍である。

【0051】

特に断らない限り、本出願で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の当業者が理解している通常の意味を有する。本出願に言及される全ての刊行物、特許出願、特許又は他の参照文献は引用によりその全体が組み込まれる。また、本出願に記載の材料、方法及び例は、説明用のものであり、制限することが意図されない。本発明の他の特徴、目的及び利点は、本明細書と図面、添付された特許請求の範囲から明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0052】

以下の図面を参照して閲覧すれば、次に詳細に説明される本発明の好ましい実施形態をよりよく理解できる。本発明を説明するために、図面に好ましい実施形態が示されている。しかしながら、本発明は図面に示される実施形態の特定の配置又は手段に制限されていないことは理解できる。

【図1】図１Ａ－図１Ｄは、本発明の二重特異性抗体の４種の構造を例示する。

【図2】図２Ａ－図２Ｄは、それぞれサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＳＥＣ）を利用して検出された、本発明によって調製された４種の構造の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１０－１１２ＨＣ、Ｂｉ－１１３－１１２ＨＣ、Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣ及びＢｉ－１２２－１１２ＬＣの純度を示す。

【図3】図３は、ＦＡＣＳにより検出された、抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣ、及び対照である抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ抗体とＰＤ－Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ細胞の結合を示す。図中、横軸は抗体濃度を示し、縦軸は平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。

【図4】図４は、ＦＡＣＳにより検出された、抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣ、及び陽性対照である抗ＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２０１１２とＯＸ４０を過剰発現させたＣＨＯ－Ｓ細胞の結合を示す。図中、横軸は抗体濃度を示し、縦軸は平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。

【図5】図５は、ＯＸ４０を過剰発現させたＣＨＯ細胞及びＰＤ－Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ細胞に対する抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の同時結合作用を示す。

【図6】図６は、ヒトＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１に対する本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の結合作用を示し、本発明の二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣによるヒトＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合の遮断を証明している。さらに対照である抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ及びＩｇＧ１の作用を検出している。

【図7】図７は、ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用によるＮＦＡＴシグナル伝達経路の遮断効果に対する本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣの効果的な解消を示し、蛍光信号を得ている。さらに対照である抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ及びＩｇＧ１の作用を検出している。

【図8】図８は、ＰＤ－Ｌ１依存性ＯＸ４０介在性シグナル伝達経路に対する本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣの作用を示す。さらに抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ、ＡＤＩ－２０１１２、抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ＋ＡＤＩ－２０１１２及びＩｇＧ１の作用を検出している。

【図9】図９は、示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）により測定された本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣのＴ_ｍ値の結果を示す。

【図10】図１０は、ヒトＴ細胞に対する本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣの活性化作用を示す。さらに抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ、ＡＤＩ－２０１１２及びＩｇＧ１の作用を検出している。

【図11】図１１Ａ－図１１Ｂは、本発明の二重特異性抗体の２種の構造を例示する。

【図12】図１２Ａ－図１２ＢはそれぞれＳＥＣを利用して検出された、本発明によって調製されたＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体Ｂｉ－２－５０及びＢｉ－２－５１の純度を示す。

【図13】図１３は、ＦＡＣＳにより検出された、抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体Ｂｉ－２－５０及びＢｉ－２－５１とＧＩＴＲを過剰発現させたＣＨＯ細胞の結合を示す。図中、横軸は抗体濃度を示し、縦軸は平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0053】

Ｉ．定義
用語「約」は数値と共に使用されるとき、下限として記載数値より５％小さく上限として記載数値より５％大きい範囲内の数値を含むことを意味する。

【0054】

本明細書に用いられるように、用語「包含する」又は「含む」とは、前記要素、整数又はステップを含むが、任意の他の要素、整数又はステップを排除しないことを意味する。

【0055】

用語「抗体」は、本出願において最も広い意味で使用されており、抗原結合部位を含むタンパク質を意味し、さまざまな構造の天然抗体及び人工抗体を含み、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、単鎖抗体、完全な抗体及び抗体断片を含むが、これらに限定されない。

【0056】

用語「全抗体」、「全長抗体」、「完全抗体」及び「完全な抗体」は、本出願において入れ替えて使用され、ジスルフィド結合を介して互いに接続された少なくとも２本の重鎖（Ｈ）と２本の軽鎖（Ｌ）とを含む天然に存在する糖タンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）と重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインからなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）と軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、さらに分けられると、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と、その間に挿入されているより保存的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ））がある。ＶＨ及びＶＬのそれぞれは、３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなり、アミノ末端からカルボキシル末端までは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される。定常領域は、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、さまざまなエフェクター機能を示している。

【0057】

用語「抗原結合断片」は、完全な抗体又は完全抗体のアミノ酸残基の数よりも少ない完全な抗体又は完全抗体の一部又は１つの断片であり、抗原に結合し又は完全な抗体（即ち、抗原結合断片が由来する完全な抗体）と競争的に抗原と結合できる。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術、又は酵素もしくは化学的手段により完全な抗体を切断することによって調製することができる。抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含むが、これらに限定されない。前記Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬとＣＨ１ドメインとからなる一価の断片であり、例えば、Ｆａｂ断片はパパインで完全抗体を消化することによって得られる。また、ペプシンを用いてヒンジ領域のジスルフィド結合の下方で完全抗体を消化して産生されたＦ（ａｂ’）_２は、Ｆａｂ’の二量体であり、二価の抗体断片である。Ｆ（ａｂ’）_２は、中性条件でヒンジ領域におけるジスルフィド結合を破壊することによって還元でき、これによってＦ（ａｂ’）_２二量体はＦａｂ’単量体に変換される。Ｆａｂ’単量体は、基本的にはヒンジ領域を有するＦａｂ断片である（他の抗体断片に関する詳細な説明は、基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編集，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）が参照される）。前記Ｆｖ断片は、抗体のシングルアームＶＬ及びＶＨドメインからなる。また、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨは独立した遺伝子によってコードされるものの、組換え法により、この２つのドメインを１本のタンパク質鎖として産生できる合成接続ペプチドによってこれらを接続することができ、前記１本のタンパク質鎖においてＶＬ領域とＶＨ領域がペアリングして単鎖Ｆｖを形成する。前記抗体断片は化学的方法、ＤＮＡ組換え法又はタンパク質酵素消化法により得られる。

【0058】

用語「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「単一可変ドメイン（ＳＶＤ）抗体」は一般に、単一の可変ドメイン（例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）又は軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ラクダ科の重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン、魚類ＩｇＮＡＲから誘導されるＶＨ様単一ドメイン（ｖ－ＮＡＲ））が抗原結合を付与できるような抗体を指す。即ち、該単一の可変ドメインは、標的抗原を認識するために別の可変ドメインと相互作用する必要がない。単一ドメイン抗体の例は、ラクダ科（アメリカラクダ及びラクダ）及び軟骨魚類（例えばコモリザメ）に由来する単一ドメイン抗体（ＷＯ２００５／０３５５７２）を含む。

【0059】

用語「ラクダ化ヒトＶＨドメイン」は、ラクダ科ＶＨＨに由来する主要エレメントをヒトＶＨドメインに導入することによってヒトＶＨドメインが標的抗原を認識するためにＶＬドメインとペアリングする必要がなく、ラクダ化ヒトＶＨドメインは単独でも抗原に結合特異性を付与できることを指す。

【0060】

本出願で使用される用語「結合部位」又は「抗原結合部位」は、抗体分子における抗原と実際に結合する領域を指し、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からなるＶＨ／ＶＬ対、ラクダ科の重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン、サメ科動物のＩｇＮＡＲに由来するＶＨ様単一ドメイン（ｖ－ＮＡＲ）、ラクダ化ヒトＶＨドメイン、ヒト化ラクダ科抗体の重鎖可変ドメインを含む。本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体分子は、少なくとも４つの抗原結合部位を含み、例えば、２つの単一ドメイン抗原結合部位（例えば、ＶＨＨ）と、２つのＦａｂ断片においてＶＨ／ＶＬ対によって形成された抗原結合部位とを含む。

【0061】

用語「単一ドメイン抗原結合部位」は、単一の可変ドメイン（例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ラクダ科の重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン、サメ科動物のＩｇＮＡＲに由来するｖ－ＮＡＲ、ラクダ化ヒトＶＨドメイン、ヒト化ラクダ科抗体の重鎖可変ドメイン、及びこれらの組換えによる単一ドメイン）をもって抗原と実際に結合する抗体分子の領域を示す。本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体分子は、それぞれ同じ又は異なる抗原と結合する２つの単一ドメイン抗原結合部位を含む。本発明の別の実施形態において、本発明の抗体分子は、それぞれ同じ又は異なる抗原エピトープと結合する２つの単一ドメイン抗原結合部位を含む。

【0062】

本出願で使用される用語「単一特異性」抗体とは、１つ又は複数の結合部位を有する抗体を指し、前記部位のそれぞれは、同じ抗原の同じエピトープと結合する。

【0063】

本出願で使用される用語「多重特異性」抗体とは、少なくとも２つの抗原結合部位を有する抗体を指し、前記少なくとも２つの抗原結合部位の各抗原結合部位は、同じ抗原の異なるエピトープ又は異なる抗原の異なるエピトープと結合する。本出願に係る抗体は一般に多重特異性抗体であり、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原エピトープに対して結合特異性を有する抗体である。１つの実施形態において、本出願は、第１抗原及び第２抗原に対する結合特異性を有する二重特異性抗体を提供する。

【0064】

用語「免疫グロブリン分子」とは、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧ類免疫グロブリンは、ジスルフィド結合を介して結合された２本の軽鎖と２本の重鎖とからなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各本の免疫グロブリン重鎖は、重鎖可変ドメインとも呼ばれる１つの重鎖可変領域（ＶＨ）を有し、それに続くのは３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）である。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各本の免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメインとも呼ばれる１つの軽鎖可変領域（ＶＬ）を有し、それに続くのは１つの軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）である。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と称される５つのクラスのいずれかに分類できる。そのうち、一部のクラスはさらに例えば、γ_１（ＩｇＧ１）、γ_２（ＩｇＧ２）、γ_３（ＩｇＧ_３）、γ_４（ＩｇＧ_４）、α_１（ＩｇＡ_１）とα_２（ＩｇＡ_２）などのサブクラスに分けられる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列によって、κ及びλと呼ばれる２つのタイプのいずれかに分類できる。免疫グロブリンは基本的に、免疫グロブリンヒンジ領域を介して接続された２つのＦａｂ分子と１つのＦｃドメインとからなる。

【0065】

用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、本出願において、少なくとも一部の定常領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するように使用される。該用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。天然の免疫グロブリン「Ｆｃドメイン」は、２つ又は３つの定常ドメイン、即ちＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインを含み、必要に応じてＣＨ４ドメインを含んでもよい。例えば、天然抗体において、免疫グロブリンＦｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ類抗体の２本の重鎖に由来する第２及び第３定常ドメイン（ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン）を含み、又はＩｇＭ及びＩｇＥ類抗体の２本の重鎖に由来する第２、第３及び第４定常ドメイン（ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン）を含む。本出願において、特に断らない限り、Ｆｃ領域又は重鎖定常領域におけるアミノ酸残基の番号は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載のＥＵ番号システム（ＥＵインデックスともいう）に基づいて番号が付けられる。

【0066】

用語「エフェクター機能」は、免疫グロブリンアイソタイプによって変化する免疫グロブリンＦｃ領域に直結する生物学的活性を指す。免疫グロブリンのエフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合作用、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、免疫複合体介在性抗原提示細胞による抗原の取り込み、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）のダウンレギュレート及びＢ細胞活性化を含む。

【0067】

用語「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域又はその一部を変化、置換又は交換することによって、抗原結合部位が異なる又は変化したタイプ、エフェクター機能及び／又は生物種の定常領域又はキメラ抗体に新しい性能を付与する完全に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、医薬品）などに接続され、又は（ｂ）可変領域又はその一部を、異なる又は変化した抗原特異性を有する可変領域によって変化、置換又は交換させた抗体分子を指す。例えば、マウス抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリンに由来する定常領域に変更することによって修飾できる。ヒト定常領域に変更したため、該キメラ抗体は、抗原認識についてのその特異性を保持するとともに、元のマウス抗体と比べて、ヒトにおいて低下した抗原性を有する。

【0068】

「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体（例えばマウスモノクローナル抗体）の抗原特異性反応性を保留するとともに、治療薬としてヒトに投与する場合に免疫原性が低い抗体である。ヒト化抗体は、例えば、非ヒト抗原結合部位を保留するとともに、抗体の残りの部分をこれらに対応するヒト由来の部分（即ち、定常領域及び可変領域における結合に関与しない部分はヒト抗体の対応する部分である）に変更することによって実現できる。例えばＰａｄｌａｎ，Ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．，１９９４，３１：１６９－２１７が参照される。ヒト抗体工学技術の他の例は、ＵＳ５，７６６，８８６に開示されているＸｏｍａ技術を含むが、これに限定されない。

【0069】

用語「・・・価」抗体とは、抗体分子に存在する抗原結合部位の数を指す。「二価」、「三価」及び「四価」抗体とは、抗体分子にそれぞれ２つの抗原結合部位、３つの結合部位及び４つの結合部位が存在することを意味する。１つの実施形態において、本出願で報道された二重特異性抗体は「四価」のものである。

【0070】

用語「左右に実質的に対称な４本のポリペプチド鎖からなる」抗体とは、抗体分子が４本のポリペプチド鎖からなり、抗体分子の左側の２本のポリペプチド鎖と右側の２本のポリペプチド鎖とを含み、かつ、抗体分子の左側の２本のポリペプチド鎖の配列と右側の２本のポリペプチド鎖の配列は１００％の同一性を有し、又は少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する。

【0071】

用語「可動性リンカー」又は「接続ペプチド」は、アミノ酸からなる接続ペプチドを指し、例えば単独で又は組み合わせて使用されるグリシン及び／又はセリン残基であり、抗体の各可変ドメインを接続するために用いられる。１つの実施形態において、可動性リンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）ｎを含むＧｌｙ／Ｓｅｒ接続ペプチドであり、ここで、ｎは１以上の正の整数であり、例えば、ｎは１～７の正の整数である。１つの実施形態において、前記可動性リンカーは（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_２（配列番号９）である。ＷＯ２０１２／１３８４７５に記載の接続ペプチドも本発明の範囲に含まれており、前記文献は引用により本出願に組み込まれる。

【0072】

本出願で使用される用語「結合」又は「特異性結合」とは、結合作用が抗原に対して選択的であり、かつ好ましくない又は非特異的な相互作用と区別できることを意味する。特定の抗原に対する抗原結合部位の結合能力は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）又は本分野で公知の通常の結合測定法により測定できる。

【0073】

「親和力」又は「結合親和力」は、結合対のメンバー同士間の相互作用を反映する固有結合の親和力を指す。その作用対象Ｙに対する分子Ｘの親和力は一般に解離定数（Ｋ_Ｄ）で示し、解離定数は解離速度定数と会合速度定数（それぞれｋ_ｄｉｓ、ｋ_ｏｎ）の比である。親和力は、本分野で公知の通常の方法により測定できる。親和力を測定するための具体的な方法の１つは、本出願に記載のＦｏｒｔｅＢｉｏ動力学的結合測定法である。

【0074】

用語「抗原」は、免疫応答を引き起こす分子を指す。このような免疫応答は、抗体の産生又は特異性免疫細胞の活性化に関係しており、又は両方に関係する可能性がある。当業者が理解できるように、ほぼ全てのタンパク質又はペプチドを含む大分子は、いずれも抗原として利用できる。また、抗原は組換えＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから誘導されるものであってもよい。本出願のいくつかの実施形態において、第１抗原、第２抗原、第３抗原は３種の異なる抗原である。

【0075】

用語「腫瘍関連抗原」又は「がん抗原」は入れ替えて使用され、正常な細胞よりも、好ましくはがん細胞の表面において完全なもの又は断片（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）として発現された分子（一般にタンパク質、炭水化物又は脂質）を意味し、前記分子は、薬剤に用いられると優先的にがん細胞を標的とする。いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原は、正常な細胞よりも腫瘍細胞で過剰発現された、例えば、正常な細胞よりも１倍に過剰発現された、２倍に過剰発現された、３倍に過剰発現された又はそれ以上の倍数に過剰発現された細胞表面分子である。いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞において合成された問題がある細胞表面分子であり、例えば、正常な細胞において発現された分子に対して欠失、添加又は突然変異を含む分子である。いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面においてのみ完全に発現され又は断片として発現され、しかも正常な細胞の表面には合成又は発現されない。従来技術には、例えば、上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、インターロイキン１１受容体α（ＩＬ－１１Ｒａ）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＣＤ７２、ＣＤ４７など、さまざまな腫瘍関連抗原が開示されている。

【0076】

用語「免疫チェックポイント」とは、末梢組織における免疫反応の持続性及び強度を調節することによって組織の損傷を避け、自体の抗原に対する耐性の維持に関与する免疫系に存在する抑制性シグナル分子を指す（Ｐａｒｄｏｌｌ ＤＭ．，Ｔｈｅ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，１２（４）：２５２－２６４）。研究して判明したのは、腫瘍細胞がインビボの免疫系から回避して制御不能に増殖できる原因の１つは、免疫チェックポイントの抑制性シグナル伝達経路を利用して、Ｔリンパ球の活性を抑制することによって、Ｔリンパ球が腫瘍に対する殺傷効果を効果的に発揮できないことである（Ｙａｏ Ｓ，Ｚｈｕ Ｙ＆Ｃｈｅｎ Ｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ，２０１３，１２（２）：１３０－１４６）。免疫チェックポイント分子は、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）、ＬＡＧ－３及びＴＩＭ－３を含むが、これらに限定されない。

【0077】

用語「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合してＴ細胞の共刺激反応（例えば、増殖が挙げられるが、これに限定されない）を介在するＴ細胞上の対応する結合作用対象である。共刺激分子は、抗原受容体又はそのリガンド以外の、有効免疫応答に寄与する細胞表面分子である。共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ（即ちＣＤ１３７）、ＣＤ２７及びＣＤ２８を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、「共刺激分子」は、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ（即ちＣＤ１３７）、ＣＤ２７及び／又はＣＤ２８である。

【0078】

用語「サイトカイン」は、細胞集団から放出されて、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用するタンパク質の通称である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ－α又はＴＮＦ－β、及びＬＩＦ、ｋｉｔリガンド（ＫＬ）とγ－インターフェロンを含む他のポリペプチド性サイトカインが挙げられる。本出願で使用される用語「サイトカイン」は、天然由来の又は組換え細胞培養物に由来するタンパク質及び天然配列サイトカインの生物学的活性を有する同等物を含み、この同等物は、人工合成により産生された小分子実体、及びその薬学的に許容される誘導体と塩を含む。

【0079】

「免疫複合体」は、１つ又は複数の異種分子（細胞傷害剤を含むが、これに限定されない）と複合する抗体である。

【0080】

本出願で使用される用語「細胞傷害剤」は、細胞機能を抑制又は阻止でき、かつ／又は細胞の死亡又は破壊を引き起こす物質である。細胞傷害剤は、放射性同位体（例えば、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２及びＬｕの放射性同位体）、化学療法薬もしくは医薬品（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンブラスチン類アルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ゾルビシンもしくは他のインターカレーター）、成長阻害剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素、抗生物質、細菌由来、真菌由来、植物由来もしくは動物由来の低分子毒素もしくは酵素活性毒素（その断片及び／又は変異体を含む）などの毒素、及び以下に記載されているさまざまな抗腫瘍剤もしくは抗がん剤を含むが、これらに限定されない。

【0081】

アミノ酸配列の「同一性百分率（％）」とは、候補配列と本明細書に示される具体的なアミノ酸配列を比較し、かつ必要に応じて最大の配列同一性百分率を実現するためにギャップを導入し、いずれの保存的置換も配列同一性の一部と考慮されない場合、本明細書に示される具体的なアミノ酸配列のアミノ酸残基と一致するアミノ酸残基の候補配列における百分率を指す。

【0082】

ポリペプチド配列の場合、「保存的修飾」は、ポリペプチド配列に対する置換、欠失又は添加を含み、それによって特定のアミノ酸は化学的に類似するアミノ酸に置換される。機能的に類似するアミノ酸の保存的置換表は、本分野で公知の内容として提供される。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間ホモログ及び対立遺伝子に対しては、付加的なものであり、それらが排除されない。以下は、互いに保存的置換となる８組のアミノ酸である。１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）参照）。いくつかの実施形態において、用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特徴に明らかな影響がない又は結合特徴を変えないアミノ酸修飾である。

【0083】

用語「Ｎ末端」は、Ｎ末端の最後のアミノ酸を指し、用語「Ｃ末端」は、Ｃ末端の最後のアミノ酸を指す。

【0084】

用語「宿主細胞」は、既に外因性ポリヌクレオチドが導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、「形質転換体」と「形質転換された細胞」は、初代より形質転換された細胞及びこれらより誘導された子孫を含む。宿主細胞は、本発明の抗体分子を産生するために用いられる任意のタイプの細胞系であってもよく、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞と、原核細胞、例えば、大腸菌細胞とを含む。宿主細胞は、培養された細胞を含み、遺伝子組換え動物、遺伝子組換え植物又は培養された植物組織もしくは動物組織の内部の細胞を含む。

【0085】

用語「発現ベクター」は、組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指し、発現されるヌクレオチド配列に有効に接続された発現制御配列を含む。発現ベクターは、発現するのに十分なシス作用エレメントを含み、発現用の別のエレメントは、宿主細胞により提供されるか、又はインビトロ発現系にあるものであってもよい。発現ベクターは、本分野で公知の全てのものを含み、これらは、組換えポリヌクレオチドが組み込まれたコスミド、プラスミド（例えば、ヌードなるもの又はリポソームに含まれるもの）、ウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス）を含む。

【0086】

用語「個体」又は「対象」は、哺乳動物を指すように入れ替えて使用される。哺乳動物は、家畜化された動物（例えば、乳牛、ヒツジ、ネコ、イヌとウマ）、霊長類（例えば、ヒトとサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウスとラット）を含むが、これらに限定されない。特に、対象はヒトを指す。

【0087】

用語「治療」とは、治療を受けている対象における疾患の自然的過程を変えるための臨床的介入を指す。求められる治療効果は、疾患の発生又は再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の改善又は寛解、及び予後の緩和又は改善を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子は、疾患の発展又は疾患の進行を遅延させるために用いられる。

【0088】

用語「抗腫瘍作用」は、さまざまな手段により表示できる生物学的効果であり、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の低減又は生存する腫瘍細胞の減少を含むが、これらに限定されない。用語「腫瘍」及び「がん」は、本出願において、固形腫瘍と液性腫瘍を含むように入れ替えて使用される。

【0089】

用語「がん」及び「がん性」は、一般に、細胞の成長が調節できないことを特徴とする哺乳動物の生理障害を指し又はこれを説明する。がんの例は、がん、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病又はリンパ系悪性腫瘍を含むが、これらに限定されない。上記のがんのより具体的な例は、扁平上皮がん（例えば、上皮系扁平上皮がん）、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、肺扁平上皮がんを含む）、腹膜がん、肝細胞がん、胃がん（胃腸がん、消化管間質がんを含む）、膵臓がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、尿道がん、肝臓がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんもしくは子宮がん、唾液腺がん、腎臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝がん、肛門がん、陰茎がん、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫、結節型黒色腫、多発性骨髄腫とＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、及びファコマトーシス（ｐｈａｋｏｍａｔｏｓｅｓ）、水腫（脳腫瘍関連など）、メーグス（Ｍｅｉｇｓ）症候群に関連する異常な血管増殖、脳腫瘍と脳がん、及び頭頸部がん、関連する転移を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体による治療に適するがんは、肺がん（例えば非小細胞肺がん）、肝がん、胃がん又は結腸がんを含み、これらのがんの転移をも含む。

【0090】

用語「腫瘍」は、悪性か良性かに関らず、全ての腫瘍性（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）の細胞の成長及び増殖、全ての前がん（ｐｒｅ－ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）及びがん性の細胞と組織を含む。用語「がん」、「がん性」及び「腫瘍」は、本出願で言及される場合に互いに排他的ではない。

【0091】

用語「感染性疾患」は病原体が引き起こす疾患を指し、例えばウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染又は真菌感染を含む。

【0092】

ＩＩ．本発明の抗体分子
本発明は、さまざまな疾患の免疫治療、予防及び／又は診断に用いられる新規な抗体分子を提供する。本発明の抗体分子は、少なくとも４つの抗原結合部位を含み、単一特異性抗体又は多重特異性（例えば二重特異性）抗体として機能でき、好ましくは、多重特異性（例えば二重特異性）抗体として機能できる。

【0093】

複数本のポリペプチド鎖を有する単一特異性又は多重特異性（例えば二重特異性）抗体を産生する場合、一般には望ましくない鎖間のミスマッチ、抗体親和力の低下、安定性低下などの問題が生じる。本出願によって構築される抗体分子は、これらのよく生じる問題を避けることができる。

【0094】

本出願によって構築される抗体分子は（ｉ）単一ドメイン抗原結合部位と、（ｉｉ）抗原結合Ｆａｂ断片とを含み、前記単一ドメイン抗原結合部位は前記抗原結合Ｆａｂ断片の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＮ末端もしくは前記抗原結合Ｆａｂ断片の軽鎖定常領域（ＣＬ）のＣ末端に位置し、又は、前記単一ドメイン抗原結合部位は前記抗原結合Ｆａｂ断片の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＮ末端もしくは免疫グロブリンＣＨ１ドメインのＣ末端に位置し、前記単一ドメイン抗原結合部位及び前記抗原結合Ｆａｂ断片は同じ又は異なる抗原と結合し、かつ、前記単一ドメイン抗原結合部位と前記抗原結合Ｆａｂ断片との間に、接続ペプチドを有するかもしくは有さない、本出願によって構築される抗体分子は前記単一ドメイン抗原結合部位及び前記抗原結合Ｆａｂ断片のＣ末端に位置する（ｉｉｉ）免疫グロブリンＦｃドメインをさらに含む。

【0095】

１つの実施形態において、本発明の抗体分子は、２つの単一ドメイン抗原結合部位と、２つのＦａｂ断片と、Ｆｃ領域とを含む４本のポリペプチド鎖を有する。

【0096】

別の実施形態において、本発明の抗体分子の単一ドメイン抗原結合部位とＦａｂ断片との間には、接続ペプチドがない。

【0097】

別の実施形態において、本発明の抗体分子の単一ドメイン抗原結合部位とＦａｂ断片との間には、接続ペプチドがある。前記接続ペプチドのタイプについては特に制限されない。実施形態において、前記接続ペプチドは、長さが１～１００個、特に１～５０個、好ましくは１～２０個のアミノ酸のアミノ酸配列を有するペプチドである。いくつかの実施形態において、前記接続ペプチドは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、ここでＧ＝グリシン、Ｓ＝セリンであり、かつ、ｘ＝１～４の整数で、ｎ＝１～７の整数で、ｍ＝０～３の整数である。１つの特定の実施形態において、前記接続ペプチドは、（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号９）である。

【0098】

本発明の抗体分子における単一ドメイン抗原結合部位は、高親和力で標的抗原のエピトープと特異的に結合できる単一の可変ドメイン、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ラクダ科の重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン、サメ科動物のＩｇＮＡＲに由来するｖ－ＮＡＲ、ラクダ化ヒトＶＨドメイン、ヒト化ラクダ科抗体の重鎖可変ドメイン、これらによる組換え単一ドメインである。１つの実施形態において、本発明の抗体分子における単一ドメイン抗原結合部位は、ラクダ科の重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン、ラクダ化ヒトＶＨドメイン及び／又はヒト化ラクダ科抗体の重鎖可変ドメインである。

【0099】

従来技術において、ラクダ科の種（例えばラクダ、アルパカ、ヒトコブラクダ、リャマ、グアナコ）から得られた抗体タンパク質の大きさ、構造及びヒト対象に対する抗原性のキャラクタリゼーションがすでに完成されている。自然界でラクダ科哺乳動物ファミリーに由来する一部のＩｇＧ抗体は、軽鎖が欠如しており、そのため構造的には他の動物に由来する２本の重鎖と２本の軽鎖とを有する一般的な四鎖抗体の構造とは異なる。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４（１９９４年３月３日に開示されたＷＯ９４／０４６７８）が参照される。

【0100】

標的抗原に対する高親和力を有するラクダ科の重鎖抗体の重鎖可変ドメイン（該領域はＶＨＨとも呼ばれる）は遺伝子工学的方法により得られる。１９９８年６月２日に登録された米国特許第５，７５９，８０８号が参照される。他の非ヒト抗体断片と同様に、ラクダ科ＶＨＨのアミノ酸配列は、組換えにより変化させることによってヒト配列により類似する配列とすることができ、これは即ち「ヒト化」であり、それによってヒトに対するラクダ科ＶＨＨの抗原性が低減する。また、ラクダ科ＶＨＨから誘導される主要エレメントをヒトＶＨドメインに移すことによって、ラクダ化ヒトＶＨドメインを得ることもできる。本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体分子における単一ドメイン抗原結合部位は配列番号１及び／又は配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するＰＤ－Ｌ１に対するヒト化ＶＨＨである。本発明の別の実施形態において、本発明の抗体分子における単一ドメイン抗原結合部位は配列番号２４で表されるアミノ酸配列を有するＧＩＴＲに対するＶＨＨである。

【0101】

ＶＨＨは、ヒトＩｇＧ分子に対して分子量がその十分の一であり、しかも物理的直径はわずか数ナノメートルである。ＶＨＨ自体は優れた熱安定性を有し、極端なｐＨ及びタンパク質の酵素分解消化に対して安定的でかつ抗原性が低いため、本発明の抗体の１つの実施形態において、構築モジュールとしてＶＨＨを含むことによって本発明の抗体分子の安定性にも、ヒト対象における低抗原性にも寄与する。

【0102】

本発明の抗体分子におけるＦａｂ断片は比較的高い親和力で標的抗原エピトープと特異的に結合できる。１つの実施形態において、前記Ｆａｂ断片は免疫グロブリンのＦａｂ断片であり、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と免疫グロブリン軽鎖定常領域（ＣＬ）とからなるペプチドを含み、かつ、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と免疫グロブリン重鎖定常領域１（ＣＨ１）とからなるペプチドを含み、前記ＣＬ領域とＣＨ１領域は必要に応じて、ジスルフィド結合を介して共有接続されることによってＦａｂ断片をヘテロ二量体化させる。１つの実施形態において、前記Ｆａｂ断片は免疫グロブリンＦａｂ断片の軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）が交換したＦａｂ断片であり、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）とからなるペプチドを含み、かつ、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とからなるペプチドを含み、前記ＣＬ領域とＣＨ１領域は必要に応じて、ジスルフィド結合を介して共有接続されることによってＦａｂ断片をヘテロ二量体化させる。別の実施形態において、前記Ｆａｂ断片は免疫グロブリンＦａｂ断片の軽鎖定常領域（ＣＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）が交換したＦａｂ断片であり、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とからなるペプチドを含み、かつ、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）とからなるペプチドを含み、前記ＣＬ領域とＣＨ１領域は必要に応じて、ジスルフィド結合を介して共有接続されることによってＦａｂ断片をヘテロ二量体化させる。

【0103】

当業者が熟知しているように、Ｆａｂ断片のＣＬ領域とＣＨ１領域との間にジスルフィド結合を設けることが好ましいが、機能的には必ずしもそうするとは限らない（Ｏｒｃｕｔｔ ＫＤｅｔ ａｌ．，Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ＩｇＧ－ｓｃＦｖ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏｐｏｌｏｇｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２０１０，２３（４）：２２１－２２８）。そのため、いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子におけるＦａｂ断片はジスルフィド結合を含まない。これに関しては、Ｆａｂ断片の２本の鎖は、ジスルフィド結合がなくても安定的に相互作用できるように、次の方式で改変してもよい。例えば、いくつかの実施形態において、Ｆａｂ断片の２本の鎖を改変させてシステイン残基を除去してもよく、それでいながらＦａｂ断片の２本の鎖はなおも安定的に相互作用し、しかもＦａｂのように機能を発揮できる。１つの実施形態において、Ｆａｂ断片の２本の鎖に対して、該２本の鎖同士における安定的な相互作用を促進できるために、突然変異を行う。例えば、「ノブ－イン－ホール」という遺伝的改変メソッド（例えば、Ｊｏｈｎ Ｂ．Ｂ．Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，‘Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ’ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９６．９（７）：ｐ．６１７－２１；Ｓｈａｎｅ Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｂｌｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ ｆｏｒｍ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｏｆ ａ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ ｕｓｉｎｇ ａ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９７．２７０：ｐ．２６－３５が参照される）を用いて、Ｆａｂ断片の２本の鎖同士におけるヘテロ二量体化を促進してもよい。該メソッドを用いる場合は、相互作用するドメイン同士間のインターフェースで大きなアミノ酸側鎖で小さなアミノ酸側鎖を置換することによって「ノブ」構造を産生する。これに対応して、相互作用する分子同士間のインターフェースで小さな側鎖で大きな側鎖を置換することによって「ホール」構造を実現する。したがって、本出願で使用されるＦａｂ断片は、例えば、ＣＨ１及び／又はＣＬの定常ドメインにおけるアミノ酸変化、ジスルフィド結合の除去などのように、特定の目的に応じて変異を設計しているものであってもよい。

【0104】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子におけるＦａｂ断片はモノクローナル抗体に由来し、しかもＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びこれらのサブタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意のタイプの抗体に由来するものであってもよい。軽鎖ドメインはκ鎖又はλ鎖に由来してもよい。また、本出願で使用されるＦａｂ断片は組換えにより調製されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子のＦａｂ断片におけるＣＨ１ドメイン、ＣＬドメインは、いずれもヒト免疫グロブリンの対応する部分に由来し、又はそれらと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同じ）である配列を有する。

【0105】

本発明の抗体分子における免疫グロブリンＦｃドメインは、本発明の抗体のインビボ半減期を延長させエフェクター機能を付与することができる。例えば、国際公開第ＷＯ９８／２３２８９号、国際公開第ＷＯ９７／３４６３１号、米国特許第６，２７７，３７５号が参照される。

【0106】

１つの特定の実施形態において、本発明の抗体分子の第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖のＦｃドメインはそれぞれ「ＣＰＰＣ」アミノ酸残基を有するヒンジ領域を含み、かつ／又はそれぞれＹ３４９ＣとＳ３５４Ｃと（Ｋａｂａｔの「ＥＵ番号方式」に基づく）を含み、それによって、本発明の抗体分子の第２ポリペプチド鎖と第４ポリペプチド鎖はＦｃ領域で鎖間ジスルフィド結合を形成し、これは本発明の抗体分子の第２ポリペプチド鎖と第４ポリペプチド鎖の正確なペアリングに寄与する。

【0107】

１つの実施形態において、本発明の抗体分子の免疫グロブリンＦｃドメインにおいても「ノブ－イン－ホール」技術が用いられ、該技術は本発明の抗体分子の異なる鎖同士の間にインターフェースを改変させることによって、本発明の抗体分子の各本の鎖の正確な会合を促進できる。一般に、該技術は突起が空洞に配置できるように、一方の鎖のインターフェースに「突起」を、それとペアリングする他方の鎖のインターフェースに対応する「空洞」を導入することに関する。第１の好ましいインターフェースは、一方の鎖の重鎖定常ドメインのＣＨ３ドメインとそれとペアリングする他方の鎖の重鎖定常ドメインのＣＨ３ドメインとを含む。一方の鎖に由来する重鎖定常ドメインのＣＨ３ドメインのインターフェースの小さなアミノ酸側鎖を比較的大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）に置き換えることで突起を構築できる。大きなアミノ酸側鎖を比較的小さな側鎖（例えばアラニン又はトレオニン）に置き換えることによって、ペアリングされる他方の鎖の重鎖定常ドメインのＣＨ３ドメインのインターフェースで、大きさが突起と同じ又は類似する補償用空洞が構築される。第２の好ましいインターフェースは、上記のＦａｂ断片のように軽鎖のＣＬドメインと重鎖のＣＨ１ドメインとを含み、突起－空洞の相互作用を構築することによってＦａｂ断片の２本の鎖同士間に正確なヘテロ二量体化が行われるように促進する。

【0108】

１つの実施形態において、本発明の抗体分子のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体に対する結合親和力の修飾を含む。１つの実施形態において、前記Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体であり、特にヒトＦｃγ受容体である。１つの実施形態において、前記Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。１つの実施形態において、前記修飾は、本発明の抗体分子のエフェクター機能を低減させる。１つの特定の実施形態において、前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。１つの実施形態において、前記修飾は、前記免疫グロブリン分子のＦｃ領域内に位置し、特にそのＣＨ２領域内に位置する。１つの実施形態において、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の第３２９位（ＥＵ番号方式）のアミノ酸置換を含む。１つの特定の実施形態において、前記アミノ酸置換はＰ３２９Ｇである。１つの実施形態において、本発明の抗体分子は、免疫グロブリン重鎖の第２３４位及び第２３５位（ＥＵ番号方式）のアミノ酸置換を含む。１つの特定の実施形態において、前記アミノ酸置換は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ突然変異）である（Ａｒｍｏｕｒ ＫＬ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｌａｃｋｉｎｇ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９．２９（８）：２６１３－２４）。１つの実施形態において、本発明の抗体分子は、免疫グロブリンの重鎖の第２３４位、第２３５位及び第３２９位（ＥＵ番号方式）のアミノ酸置換を含む。１つの特定の実施形態において、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖におけるアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号方式）を含む。

【0109】

本発明の抗体分子における少なくとも１つの単一ドメイン抗原結合部位（例えば、２つの単一ドメイン抗原結合部位）及び少なくとも１つのＦａｂ断片は少なくとも１種の抗原と特異的に結合できる。好ましくは、本発明の抗体分子は２種又はそれ以上の抗原と結合し、したがって、本発明の抗体分子は多重特異性抗体分子であり、例えば、二重特異性抗体分子である。前記抗原は、サイトカイン、成長因子、ホルモン、シグナル伝達タンパク質、炎症性メディエーター、リガンド、細胞表面受容体又はその断片を含むが、これらに限定されない。

【0110】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子は複数種（例えば、２種）の免疫チェックポイント分子のシグナル伝達経路を抑制する。例えば、本発明の抗体分子はＰＤ－Ｌ１に対する第１結合特異性及びＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ２に対する第２結合特異性を有する二重特異性抗体分子であり、前記免疫チェックポイント分子のシグナル伝達経路を抑制することによって作用を発揮する。

【0111】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子は免疫チェックポイント分子のシグナル伝達経路を抑制し共刺激分子のシグナル伝達経路を作動させる。例えば、本発明の抗体分子はＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ２に対する第１結合特異性及びＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＣＤ２７又はＣＤ２８に対する第２結合特異性を有する二重特異性抗体分子であり、前記免疫チェックポイント分子のシグナル伝達経路を抑制し前記共刺激分子のシグナル伝達経路を作動させることによって作用を発揮する。

【0112】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子は免疫チェックポイント分子のシグナル伝達経路を抑制し異常な血管新生を抑制する。例えば、本発明の抗体分子はＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ２に対する第１結合特異性及びＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体に対する第２結合特異性を有する二重特異性抗体分子であり、前記免疫チェックポイント分子のシグナル伝達経路を抑制しＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体のシグナル伝達経路を抑制することによって作用を発揮する。

【0113】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子は複数種（例えば、２種）の共刺激分子のシグナル伝達経路を作動させる。例えば、本発明の抗体分子はＯＸ４０に対する第１結合特異性及びＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＣＤ２７又はＣＤ２８に対する第２結合特異性を有する二重特異性抗体分子であり、前記共刺激分子のシグナル伝達経路を作動させることによって作用を発揮する。

【0114】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子は共刺激分子のシグナル伝達経路を作動させ異常な血管新生を抑制する。例えば、本発明の抗体分子はＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＣＤ２７又はＣＤ２８に対する第１結合特異性及びＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体に対する第２結合特異性を有する二重特異性抗体分子であり、前記共刺激分子のシグナル伝達経路を作動させＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体のシグナル伝達経路を抑制することによって作用を発揮する。

【0115】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子は異常な血管新生を抑制し、免疫チェックポイント分子のシグナル伝達経路を抑制し共刺激分子のシグナル伝達経路を作動させる。例えば、本発明の抗体分子はＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体に対する第１結合特異性、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ２に対する第２結合特異性及びＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＣＤ２７又はＣＤ２８に対する第３結合特異性を有する三重特異性抗体分子であり、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体のシグナル伝達経路を抑制し、前記免疫チェックポイント分子のシグナル伝達経路を抑制し前記共刺激分子のシグナル伝達経路を作動させることによって作用を発揮する。

【0116】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子は明細書の図１Ａ－図１Ｄに例示されるいずれかの構造を有する。

【0117】

図１Ａの模式図に示されるように、本発明の例示的な抗体分子は４鎖抗体分子であり、２つＦａｂ断片と、それぞれ各Ｆａｂ断片の軽鎖定常領域（ＣＬ）のＣ末端に位置する単一ドメイン抗原結合部位と、本発明の抗体分子のＣ末端となる免疫グロブリンＦｃドメインとを含み、Ｆａｂ断片の軽鎖定常領域（ＣＬ）のＣ末端と単一ドメイン抗原結合部位との間には、接続ペプチドがあり又は接続ペプチドがない。

【0118】

図１Ｂの模式図に示されるように、本発明の例示的な抗体分子は４鎖抗体分子であり、２つのＦａｂ断片と、それぞれ各Ｆａｂ断片の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＮ末端に位置する単一ドメイン抗原結合部位と、本発明の抗体分子のＣ末端となる免疫グロブリンＦｃドメインとを含み、Ｆａｂ断片の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＮ末端と単一ドメイン抗原結合部位との間には、接続ペプチドがあり又は接続ペプチドがない。

【0119】

図１Ｃの模式図に示されるように、本発明の例示的な抗体分子は４鎖抗体分子であり、、２つのＦａｂ断片と、それぞれ各Ｆａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端に位置する単一ドメイン抗原結合部位と、本発明の抗体分子のＣ末端となる免疫グロブリンＦｃドメインとを含み、Ｆａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端と単一ドメイン抗原結合部位との間には、接続ペプチドがあり又は接続ペプチドがない。

【0120】

図１Ｄの模式図に示されるように、本発明の例示的な抗体分子は４鎖抗体分子であり、２つのＦａｂ断片と、それぞれ各Ｆａｂ断片の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＮ末端に位置する単一ドメイン抗原結合部位と、本発明の抗体分子のＣ末端となる免疫グロブリンＦｃドメインとを含み、Ｆａｂ断片の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＮ末端と単一ドメイン抗原結合部位との間には、接続ペプチドがあり又は接続ペプチドがない。

【0121】

次に、いくつかの本発明の抗体分子及び本発明の抗体分子の、その特異的に結合する抗原が関与するシグナル伝達経路に対する調節作用を例示する。

【0122】

ｉ）１つの実施形態において、本発明の抗体分子は抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。

【0123】

ＯＸ４０（ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４及びＡＣＴ３５とも呼ばれる）は細胞表面糖タンパク質及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーであり、Ｔリンパ球において発現され、活性化されたＴ細胞の増殖と生存に共刺激信号を提供する。ＯＸ４０は最初にラットＣＤ４ Ｔ細胞上のＴ細胞活性化マーカー（Ｐａｔｅｒｓｏｎ ＤＪ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒａｔ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｏｆ ５０，０００ Ｍｒ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｏｎｌｙ ｏｎ ＣＤ４ ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｔ ｂｌａｓｔｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８７；２４：１２８１－１２９０）として知られ、その後ＴＣＲ試験でアップレギュレーションされることが判明している（Ｍａｌｌｅｔｔ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＭＲＣ ＯＸ４０ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＣＤ４ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ－ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９０；９：１０６３－１０６８）。既にＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞及び好中球においてＯＸ４０が同定されている（Ｐａｔｅｒｓｏｎ Ｄ． Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒａｔ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｏｆ ５０，０００ Ｍ（ｒ） ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｏｎｌｙ ｏｎ ＣＤ４ ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｔ ｂｌａｓｔｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９８７，２４（１２）：１２８１－１２９０）。ＯＸ４０シグナル伝達はＴ細胞に対する共刺激信号を促進し、細胞増殖、生存、エフェクター機能及び移行の強化につながる（Ｇｒａｍａｇｌｉａ Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｏｘ－４０ ｌｉｇａｎｄ：ａ ｐｏｔｅｎｔ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｆｏｒ ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｉｍａｒｙ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１６１：６５１０－６５１７；Ｇｒａｍａｇｌｉａ Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＯＸ４０ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＣＤ４ ｍｅｍｏｒｙ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｌｏｎａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１６５：３０４３－３０５０）。

【0124】

従来技術においてＯＸ４０アゴニストとして抗ＯＸ４０抗体が開示されている。例えば、ＷＯ２０１２／０２７３２８において抗ＯＸ４０抗体ｍＡｂ １０６－２２２及びヒト化１０６－２２２（Ｈｕ１０６）の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列、抗ＯＸ４０抗体ｍＡｂ １１９－１２２及びヒト化１１９－１２２（Ｈｕ１１９）の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列が開示されている。米国特許第７，９５９，９２５号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／１２１８１０号及び中国特許出願第２０１７１０１８５３９９．９号にもＯＸ４０アゴニストとなる抗ＯＸ４０抗体が開示されている。前記抗ＯＸ４０抗体はＯＸ４０を活性化させることによって、効果Ｔリンパ球の増殖を誘導し、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を促進することができる。

【0125】

ＰＤ－Ｌ１（表面抗原分類２７４（ＣＤ２７４）又はＢ７ホモログ１（Ｂ７－Ｈ１）とも呼ばれる）は、４０ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質である。ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ＿ｐｒｏｔｅｉｎＰＤ－Ｌ１は、活性化したＴ細胞に存在するその受容体ＰＤ－１と結合して、Ｔ細胞の活性化をダウンレギュレートする（Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１－８；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４－４３）。ヒト肺がん、卵巣がん、結腸がん、多数の骨髄腫など、多くのがんでＰＤ－Ｌ１発現が認められ、しかもＰＤ－Ｌ１発現はがんの予後不良に関係する場合が多い（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．（２００２） ＰＮＡＳ ９９：１２２９３－７；Ｏｈｉｇａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ１１：２９４７－５３；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎ．１９：８１３－２４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６：３３８１－５）。ＰＤ１とＰＤ－Ｌ１の局所的相互作用を抑制することによって一部の腫瘍患者において免疫抑制を逆転することが提案されている。

【0126】

エフ・ホフマン・ラ・ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社によって研究・開発された抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、独メルク社（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）及び米ファイザー社（Ｐｆｉｚｅｒ）が共同で開発した抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ａｖｅｌｕｍａｂ、アストラゼネカ社によって研究・開発されたＤｕｒｖａｌｕｍａｂは一部の腫瘍患者に治療効果を表している。他の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（重鎖及び軽鎖の可変領域は、ＷＯ２０１０／０７７６３４に記載の配列番号２０及び２１で表されている）及びＷＯ２００７／００５８７４に開示されている抗ＰＤ－Ｌ１抗体などを含む。

【0127】

本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、少なくともＯＸ４０とＰＤ－Ｌ１を同時に標的とする抗体であり、そのＦａｂ断片及び単一ドメイン抗原結合部位はそれぞれＯＸ４０又はＰＤ－Ｌ１分子と結合することによって、抑制性ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路を遮断しＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞におけるＯＸ４０／ＯＸ４０リガンドシグナル伝達経路を活性化させて、疾患に対する免疫応答を促進することができる。

【0128】

１つの実施形態において、本発明の抗体分子はＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する単一ドメイン抗原結合部位と、ＯＸ４０と特異的に結合するＦａｂ断片とを含む。１つの実施形態において、本発明の抗体分子はＯＸ４０と特異的に結合する単一ドメイン抗原結合部位と、ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合するＦａｂ断片とを含む。

【0129】

前記ＰＤ－Ｌ１又はＯＸ４０と特異的に結合するＦａｂ断片に関しては、従来技術で報告されていた任意の抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、前述した抗ＰＤ－Ｌ１抗体）及び将来に研究・開発される抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＶＨ／ＶＬ対から誘導される６つのＣＤＲ、又は前記６つのＣＤＲの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、５、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含み、又は従来技術で報告された任意の抗ＯＸ４０抗体（例えば、上述した抗ＯＸ４０抗体）及び将来に研究・開発される抗ＯＸ４０抗体のＶＨ／ＶＬ対から誘導される６つのＣＤＲ又は前記６つのＣＤＲの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、５、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。１つの実施形態において、抗ＯＸ４０抗体はＡＤＩ－２０１１２であり、配列番号１０で表される重鎖アミノ酸配列と、配列番号１５で表される軽鎖アミノ酸配列とを有する。

【0130】

ＰＤ－Ｌ１又はＯＸ４０と特異的に結合する前記単一ドメイン抗原結合部位に関しては、ＰＤ－Ｌ１又はＯＸ４０と特異的に結合する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、ラクダ科の血清に由来し天然に軽鎖を含まず２本の重鎖だけからなるラクダ抗体の重鎖可変ドメインと、サメ科動物のＩｇＮＡＲに由来するＶＨ様単一ドメインと、ラクダ化ヒトＶＨドメインと、ヒト化ラクダ科抗体の重鎖可変ドメインとを含む。

【0131】

１つの実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体はＯＸ４０と特異的に結合する２つのＦａｂ断片と、ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する２つの単一ドメイン抗原結合部位（例えばＶＨＨ）とを含み、それぞれ図１Ａ－図１Ｄで例示されるいずれかの構造を有する。ＯＸ４０と特異的に結合する前記２つのＦａｂ断片は、ＯＸ４０分子上の同じエピトープ又は異なるエピトープと特異的に結合し、ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する前記２つの単一ドメイン抗原結合部位はＰＤ－Ｌ１分子上の同じエピトープ又は異なるエピトープと特異的に結合する。

【0132】

１つの実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体におけるＯＸ４０と特異的に結合する前記Ｆａｂ断片は、抗ＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２０１１２から誘導される配列番号１１及び７の対となる重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列に含まれている全ての６つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と軽鎖ＣＤＲ、又は前記６つのＣＤＲの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、５、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。

【0133】

１つの実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体におけるＯＸ４０と特異的に結合する前記Ｆａｂ断片は、抗ＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２０１１２から誘導される配列番号１１及び７の対となる重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列、又は対となる前記重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。

【0134】

１つの実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体におけるＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する単一ドメイン抗原結合部位は、配列番号３で表されるＣＤＲ１と、配列番号４で表されるＣＤＲ２と、配列番号５で表されるＣＤＲ３と、又は前記３つのＣＤＲの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、５、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。

【0135】

別の実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体におけるＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する前記単一ドメイン抗原結合部位は、配列番号１及び／又は配列番号２で表されるアミノ酸配列、又はこれらの配列と実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同じ）である配列を含む。

【0136】

本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体における重鎖定常領域のＣＨ１ドメイン及びＦｃ領域（ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインと、必要に応じてＣＨ４ドメインとを含む）のタイプについては特に制限がなく、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４免疫グロブリンの重鎖定常領域の対応するドメインから、又はそれと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同じ）である配列から誘導される。より好ましくは、前記重鎖定常領域のＣＨ１ドメイン及びＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンの重鎖定常領域のＣＨ１ドメイン及びＦｃ領域から、又はそれと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同じ）である配列から誘導される。

【0137】

１つの実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体は、ＩｇＧ４（例えば、ヒトＩｇＧ４）の重鎖定常領域のＣＨ１ドメインとＦｃ領域とを含む。１つの実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体は、ＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）の重鎖定常領域のＣＨ１ドメインとＦｃ領域とを含む。別の実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体はＩｇＧ４（例えば、ヒトＩｇＧ４）重鎖定常領域のＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）重鎖定常領域のＦｃ領域とを含み、又はＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）重鎖定常領域のＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ４（例えば、ヒトＩｇＧ４）重鎖定常領域のＦｃ領域とを含む。

【0138】

１つの実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖のＦｃドメインは、それぞれ「ＣＰＰＣ」アミノ酸残基を有するヒンジ領域を含み、かつ／又はそれぞれＹ３４９Ｃ及びＳ３５４Ｃを含み（ＫａｂａｔのＥＵ番号方式に基づく）、それによって、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖は、Ｆｃ領域で鎖間ジスルフィド結合を形成して、第２ポリペプチド鎖と第４ポリペプチド鎖の正確なペアリングを安定化させる。

【0139】

１つの実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の第２ポリペプチド鎖及び／又は第４ポリペプチド鎖は、Ｆｃドメインにおいて抗体エフェクター機能に影響を与えるアミノ酸突然変異が含まれる。１つの特定の実施形態において、前記アミノ酸置換は、ＬＡＬＡ突然変異である。

【0140】

別の実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体は、κ軽鎖定常領域及び／又はλ軽鎖定常領域、例えば、ヒトκ軽鎖定常領域及び／又はヒトλ軽鎖定常領域を含む。１つの実施形態において、軽鎖定常領域は、配列番号８で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同じ）である配列に含まれる。

【0141】

１つの実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖は、それぞれのＦｃドメインに「ノブ－イン－ホール」である安定的な会合が含まれる。１つの実施形態において、前記第２ポリペプチド鎖と第４ポリペプチド鎖の一方の鎖にはアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗが含まれ、かつ、前記第２ポリペプチド鎖と第４ポリペプチド鎖の他方の鎖にはアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号方式）が含まれる。それによって一方の鎖の突起を他方の鎖の空洞に置くことによって、第２ポリペプチド鎖と第４ポリペプチド鎖の正確なペアリングを促進することができる。

【0142】

１つの実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにはそれぞれ突起又は空洞が含まれ、かつ、ＣＨ１ドメインにおける前記突起又は空洞はそれぞれＣＬドメインにおける前記空洞又は突起に置くことができるため、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖も互いに「ノブ－イン－ホール」である安定的な会合を形成する。

【0143】

１つの特定の実施形態において、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体は左右に実質的に対称な４本のポリペプチド鎖からなり、前記抗体分子の左半分の２本のポリペプチド鎖はそれぞれ配列番号６で表される第１ポリペプチド鎖と、配列番号１０で表される第２ポリペプチド鎖とを含み、それぞれ配列番号１４で表される第１ポリペプチド鎖と、配列番号１０で表される第２ポリペプチド鎖とを含み、それぞれ配列番号１５で表される第１ポリペプチド鎖と、配列番号１６で表される第２ポリペプチド鎖とを含み、それぞれ配列番号１５で表される第１ポリペプチド鎖と、配列番号１７で表される第２ポリペプチド鎖とを含み、又は前記配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同じ）である配列を含み、これに対応して、前記抗体分子の右半分の２本のポリペプチド鎖はそれぞれ配列番号６で表される第３ポリペプチド鎖と、配列番号１０で表される第４ポリペプチド鎖とを含み、それぞれ配列番号１４で表される第３ポリペプチド鎖と、配列番号１０で表される第４ポリペプチド鎖とを含み、それぞれ配列番号１５で表される第３ポリペプチド鎖と、配列番号１６で表される第４ポリペプチド鎖とを含み、それぞれ配列番号１５で表される第３ポリペプチド鎖と、配列番号１７で表される第４ポリペプチド鎖とを含み、又は前記配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同じ）である配列を含む。

【0144】

本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体は、ＰＤ－Ｌ１及びＯＸ４０タンパク質と同時に結合でき、かつ親抗体の親和力定数を維持しているため、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路を遮断するとともにＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞におけるＯＸ４０／ＯＸ４０リガンドのシグナル伝達経路を活性化させることができる。本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体は、前記シグナル伝達経路に関連する疾患の治療、予防又は診断に用いることができる。

【0145】

ｉｉ）１つの実施形態において、本発明の抗体分子は抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。

【0146】

血管内皮増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）は最初に血管透過性亢進因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ、ＶＰＦ）と呼ばれ（Ｓｅｎｇｅｒ，ＤＲ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｅ ａ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８３，２１９（４５８７）：９８３－９８５）、血管を刺激して形成させた細胞によって産生されたシグナルタンパク質である。ＶＥＧＦは成長因子のサブファミリーであり、血管新生に関与する１種の重要なシグナル伝達タンパク質である。正常な組織に血管内皮増殖因子及び血管内皮増殖抑制因子が同時に存在し、かつ相対的なバランスを保ち、このようなバランスにより人体の血管が正常に新生又は分化することができる。しかしながら、疾患の場合、例えば、腫瘍が成長する過程で、ＶＥＧＦファミリー分子の数量が激増し、血管新生抑制因子との間の調節はバランスが崩れ、それによって、血管内皮細胞の分裂・増殖と移行が大いに促進され、血管透過性が増し、腫瘍細胞アポトーシスが抑制されるため、腫瘍の成長と転移に好適な微小環境を提供している（Ｌａｐｅｙｒｅ－Ｐｒｏｓｔ Ａｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆＶＥＧＦｉｎ Ｃａｎｃｅｒ，Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１７；３３０：２９５－３４２）。ＶＥＧＦファミリーは密接に関連する６種類のポリペプチドを含み、いずれも高度に保存的なホモ二量体糖タンパク質であり、ＶＥＧＦ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－Ｄ、－Ｅ、胎盤増殖因子（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＰＬＧＦ））という６つのサブタイプがあり、分子量は３５から４４ｋＤａである。ＶＥＧＦ－Ａ（そのスプライソソーム、例えばＶＥＧＦ_１６５を含む）の発現は一部の固形腫瘍における微小血管密度と関連性があり、しかも組織におけるＶＥＧＦ－Ａの濃度は乳がん、肺がん、前立腺がん、結腸がん等の固形腫瘍の予後に関係している。ＶＥＧＦファミリーメンバーのぞれぞれはその生物学的活性が細胞表面ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）ファミリーの１種又は複数種によって介在され、前記ＶＥＧＦＲファミリーはＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ－１とも呼ばれる）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ、Ｆｌｋ－１とも呼ばれる）、ＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ－４とも呼ばれる）等を含み、そのうちＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２は血管新生と密接に関連し、ＶＥＧＦ－Ｃ／Ｄ／ＶＥＧＦＲ３はリンパ管の新生と密接に関連している。

【0147】

臨床研究により、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体を用いるとＶＥＧＦとその受容体の結合を遮断できることが判明している。ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）社によって研究・開発されたベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、商品名Ａｖａｓｔｉｎ）は組換えヒト－マウス抗ＶＥＧＦキメラ抗体であり、ＶＥＧＦ－ＡとＶＥＧＦＲの結合を遮断することによって、ＶＥＧＦＲを活性化できないようにし、それによって抗血管新生の作用を発揮する。現在、ベバシズマブは転移性の結腸・直腸がんの一次治療に用いられ、将来には転移性の肺がん、乳がん、膵臓がん、腎臓がん等の疾患の治療にも用いるであろう。またベバシズマブは今までに開発されている抗体類薬物のうち比較的効果的な１つでもある。

【0148】

グルココルチコイドによって誘導される腫瘍壊死因子受容体（英表記はｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒで、略号はＧＩＴＲであり、ＴＮＦＲＳＦ１８、活性化誘導型ＴＮＦＲファミリーメンバー（ＡＩＴＲ）、ＣＤ３５７及びＧＩＴＲ－Ｄとも呼ばれる）は、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ、ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーの１８番目のメンバーである。デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）で処理されたネズミ由来Ｔ細胞系から最初に同定されていた（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ／ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９７；９４（１２）：６２１６－２１）。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの他のメンバーはＣＤ４０、ＣＤ２７、４－１ＢＢ及びＯＸ４０を含む。初代ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞でＧＩＴＲの発現量は少ないが、それが制御性Ｔ細胞において構成的発現されている（Ｔｏｎｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｕｓｅ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ ｉｓ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００３；１００（２５）：１５０５９－６４）。しかしながら、エフェクターＴ細胞においてＧＩＴＲの発現を誘導する場合は、エフェクターＴ細胞の活性化、増殖及びサイトカイン産生を促進している。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に関しては、Ｓｈｉｍｉｚｕが混合培養阻害分析を行って、ＧＩＴＲ活性化によりＴｒｅｇの機能が阻害されることを報告している（Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ２５（＋）ＣＤ４（＋）ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＧＩＴＲ ｂｒｅａｋｓ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｌｆ－ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００２；３：１３５－４２）。さまざまな腫瘍モデルにおいて、抗ＧＩＴＲ抗体ＤＴＡ－１が介在するＧＩＴＲ刺激は抗腫瘍免疫を促進している（Ｃｏｈｅｎ ＡＤ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｏｎｉｓｔ ａｎｔｉ－ＧＩＴＲ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍｅｌａｎｏｍａ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂｙ ａｌｔｅｒｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｔｒａ－ｔｕｍｏｒ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１０；５（５）：ｅ１０４３６；Ｃｏｅ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｎｔｉ－ＧＩＴＲ ｍＡｂ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２０１０；５９（９）：１３６７－７７）。

【0149】

ＧＩＴＲがＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）と結合すると活性化され、前記リガンドは主にＡＰＣで発現され、ＧＩＴＲは活性化されると腫瘍及びウイルス感染に対する耐性を高め、自己免疫反応／炎症性反応に関与し、白血球の血管外遊出を調節することができる（Ｃｏｈｅｎ ＡＤ ｅｔ ａｌ．，同上；ＣｕｚｚｏｃｒｅａＳ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＧＩＴＲ－ＧＩＴＲＬ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００７，２１（１）：１１７－１２９）。

【0150】

次の文献には抗ＧＩＴＲ抗体について説明している。米国特許第７，０２５，９６２号、欧州特許第１９４７１８３Ｂ１号、米国特許第７，８１２，１３５号、米国特許第８，３８８，９６７、米国特許第８，５９１，８８６号、欧州特許第ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０２８６８３号、米国特許第８，７０９，４２４号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０３９９５４号、国際公開第ＷＯ２０１３／０３９９５４号、米国特許公開第ＵＳ２０１４／００７２５６６号、国際公開第ＷＯ２０１５／０２６６８４号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／００７１９０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／１３３８２２号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０５５８０８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／４０１９６号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００１／０３７２０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／２０７５８号、米国特許第６，６８９，６０７号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０８３２８９号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１１５４５１号、米国特許第７，６１８，６３２号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０５１７２６号、国際公開第ＷＯ２００４０６０３１９号及び国際公開第ＷＯ２０１４０１２４７９号。

【0151】

本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、少なくとも同時にＶＥＧＦ及びＧＩＴＲを標的とし、そのＦａｂ断片及び単一ドメイン抗原結合部位はＶＥＧＦ又はＧＩＴＲ分子とそれぞれ結合することによって、ＶＥＧＦファミリーシグナル伝達経路を遮断するとともにエフェクターＴ細胞を活性化させＴｒｅｇの機能を阻害することができる。

【0152】

１つの実施形態において、本発明の抗体分子はＧＩＴＲと特異的に結合する単一ドメイン抗原結合部位と、ＶＥＧＦと特異的に結合するＦａｂ断片とを含む。１つの実施形態において、本発明の抗体分子はＶＥＧＦと特異的に結合する単一ドメイン抗原結合部位と、ＧＩＴＲと特異的に結合するＦａｂ断片とを含む。

【0153】

ＧＩＴＲ又はＶＥＧＦと特異的に結合する前記Ｆａｂ断片に関しては、従来技術において報告されていた任意の抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、前述した抗ＧＩＴＲ抗体）及び将来に研究・開発される抗ＧＩＴＲ抗体のＶＨ／ＶＬ対から誘導される６つのＣＤＲ、又は前記６つのＣＤＲの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、５、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含み、又は従来技術において報告されていた任意の抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、上述した抗ＶＥＧＦ抗体）及び将来に研究・開発される抗ＶＥＧＦ抗体のＶＨ／ＶＬ対から誘導される６つのＣＤＲ又は前記６つのＣＤＲの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、５、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。１つの実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体はＡｖａｓｔｉｎであり、配列番号１９で表される重鎖アミノ酸配列と、配列番号１８で表される軽鎖アミノ酸配列とを有する。

【0154】

ＧＩＴＲ又はＶＥＧＦと特異的に結合する前記単一ドメイン抗原結合部位に関しては、ＧＩＴＲ又はＶＥＧＦと特異的に結合する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、ラクダ科の血清に由来し天然に軽鎖を含まず２本の重鎖だけからなるラクダ抗体の重鎖可変ドメインと、サメ科動物のＩｇＮＡＲに由来するＶＨ様単一ドメインと、ラクダ化ヒトＶＨドメインと、ヒト化ラクダ科抗体の重鎖可変ドメインとを含む。

【0155】

１つの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体はＶＥＧＦと特異的に結合する２つのＦａｂ断片と、ＧＩＴＲと特異的に結合する２つの単一ドメイン抗原結合部位（例えば、ＶＨＨ）とを含み、それぞれ図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｄ、図１１Ａ及び図１１Ｂで例示されるいずれかの構造を有する。ＶＥＧＦと特異的に結合する前記２つのＦａｂ断片はＶＥＧＦ分子上の同じエピトープ又は異なるエピトープと特異的に結合し、ＧＩＴＲと特異的に結合する前記２つの単一ドメイン抗原結合部位はＧＩＴＲ分子上の同じエピトープ又は異なるエピトープと特異的に結合する。

【0156】

１つの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体におけるＶＥＧＦと特異的に結合する前記Ｆａｂ断片は、抗ＶＥＧＦ抗体Ａｖａｓｔｉｎから誘導される配列番号２２／２０の対となる重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列に含まれている全ての６つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と軽鎖ＣＤＲ、又は前記６つのＣＤＲの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、５、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。

【0157】

１つの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体におけるＶＥＧＦと特異的に結合する前記Ｆａｂ断片は、抗ＶＥＧＦ抗体Ａｖａｓｔｉｎから誘導される配列番号２２／２０の対となる重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列、又は対となる前記重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含む。

【0158】

１つの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体におけるＧＩＴＲと特異的に結合する前記単一ドメイン抗原結合部位は、ＧＦＡＦＧＳＳ（配列番号２５）で表されるＣＤＲ１と、ＳＧＧＧＦＧＤ（配列番号２６）で表されるＣＤＲ２と、ＡＴＤＷＲＫＰ（配列番号２７）で表されるＣＤＲ３と、又は前記３つのＣＤＲの１つ又は複数のＣＤＲに対して１、２、３、４、５、６個又はそれ以上のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸置換又は欠失）配列を含む。

【0159】

別の実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体におけるＧＩＴＲと特異的に結合する前記単一ドメイン抗原結合部位は、配列番号２４で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同じ）である配列を含む。

【0160】

本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体における重鎖定常領域のＣＨ１ドメイン及びＦｃ領域（ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、必要に応じてＣＨ４ドメインを含む）のタイプについては特に制限がなく、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４免疫グロブリンの重鎖定常領域の対応するドメインから、又はそれと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同じ）である配列から誘導される。より好ましくは、前記重鎖定常領域のＣＨ１ドメイン及びＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンの重鎖定常領域のＣＨ１ドメイン及びＦｃ領域から、又はそれと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同じ）である配列から誘導される。

【0161】

１つの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体は、ＩｇＧ４（例えば、ヒトＩｇＧ４）の重鎖定常領域のＣＨ１ドメインとＦｃ領域とを含む。１つの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体は、ＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）の重鎖定常領域のＣＨ１ドメインとＦｃ領域とを含む。別の実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体は、ＩｇＧ４（例えば、ヒトＩｇＧ４）の重鎖定常領域のＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）の重鎖定常領域のＦｃ領域とを含み、又はＩｇＧ１（例えば、ヒトＩｇＧ１）の重鎖定常領域のＣＨ１ドメインと、ＩｇＧ４（例えば、ヒトＩｇＧ４）の重鎖定常領域のＦｃ領域とを含む。

【0162】

１つの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体の第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖のＦｃドメインは、それぞれ「ＣＰＰＣ」アミノ酸残基を有するヒンジ領域を含み、かつ／又はそれぞれＹ３４９Ｃ及びＳ３５４Ｃを含み（ＫａｂａｔのＥＵ番号方式に基づく）、それによって、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体の第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖は、Ｆｃ領域で鎖間ジスルフィド結合を形成して、第２ポリペプチド鎖と第４ポリペプチド鎖の正確なペアリングを安定化させる。

【0163】

１つの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体の第２ポリペプチド鎖及び／又は第４ポリペプチド鎖は、Ｆｃドメインにおいて抗体エフェクター機能に影響を与えるアミノ酸突然変異が含まれる。１つの特定の実施形態において、前記アミノ酸置換は、ＬＡＬＡ突然変異である。

【0164】

別の実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体は、κ軽鎖定常領域及び／又はλ軽鎖定常領域、例えば、ヒトκ軽鎖定常領域及び／又はヒトλ軽鎖定常領域を含む。１つの実施形態において、軽鎖定常領域は、配列番号８で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同じ）である配列に含まれる。

【0165】

１つの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体の第２ポリペプチド鎖及び第４ポリペプチド鎖は、それぞれのＦｃドメインに「ノブ－イン－ホール」である安定的な会合が含まれる。１つの実施形態において、前記第２ポリペプチド鎖と第４ポリペプチド鎖の一方の鎖にはアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗが含まれ、かつ、前記第２ポリペプチド鎖と第４ポリペプチド鎖の他方の鎖にはアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号方式）が含まれる。それによって一方の鎖の突起を他方の鎖の空洞に置くことによって、第２ポリペプチド鎖と第４ポリペプチド鎖の正確なペアリングを促進することができる。

【0166】

１つの実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体の免疫グロブリンＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにそれぞれ突起又は空洞が含まれ、かつ、ＣＨ１ドメインにおける前記突起又は空洞はそれぞれＣＬドメインにおける前記空洞又は突起に置くことができるため、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体の第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖も互いに「ノブ－イン－ホール」である安定的な会合を形成する。

【0167】

特定の実施形態において、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体は左右に実質的に対称な４本のポリペプチド鎖からなり、前記抗体分子の左半分の２本のポリペプチド鎖はそれぞれ配列番号１８で表される第１ポリペプチド鎖と、配列番号２１で表される第２ポリペプチド鎖とを含み、それぞれ配列番号１８で表される第１ポリペプチド鎖と、配列番号２８で表される第２ポリペプチド鎖とを含み、又は前記配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同じ）である配列を含み、これに対応して、前記抗体分子の右半分の２本のポリペプチド鎖はそれぞれ配列番号１８で表される第３ポリペプチド鎖と、配列番号２１で表される第４ポリペプチド鎖とを含み、それぞれ配列番号１８で表される第３ポリペプチド鎖と、配列番号２８で表される第４ポリペプチド鎖とを含み、又は前記配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上に同じ）である配列を含む。

【0168】

本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体は、ＧＩＴＲ及びＶＥＧＦタンパク質と同時に結合でき、かつ親抗体の親和力定数を維持しているため、ＶＥＧＦファミリーのシグナル伝達経路を遮断するとともにＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞におけるＧＩＴＲ／ＧＩＴＲリガンドのシグナル伝達経路を活性化させることができる。本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体は、前記シグナル伝達経路に関連する疾患の治療、予防又は診断に用いることができる。

【0169】

ＩＩＩ．本発明の抗体分子の変異体
いくつかの実施形態において、本出願で例示される二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体が提案される。これは、例えば、二重特異性抗体の結合親和力及び／又は他の生物学的特性を改善するためである。二重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列への適切な修飾の導入又はペプチド合成により二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体を調製できる。このような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列からの残基の欠失及び／又は前記アミノ酸配列への残基の挿入及び／又は前記アミノ酸配列の残基の置換を含む。欠失、挿入と置換の任意の組み合わせを生じることによって最終構築体を得ることができ、ただし、前記最終構築体は所望の特徴、例えば抗原結合作用を有することが前提である。

【0170】

表１には、「保存的置換」列に保存的置換が示される。表１には、「例示的置換」列にアミノ酸側鎖の種類を示しこれを参照して下記のとおりにより明らかな変化を説明している。アミノ酸置換を目標抗体に導入し、かつ、産物に対して、所望の活性、例えば、保留／改善された抗原結合作用又は低下した免疫原性を選別することができる。

【0171】

【表1】

アミノ酸は、一般的な側鎖特性によって分けることができる。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ；Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ；Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖方向に影響がある残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0172】

また非保存的置換により、特定の種類に分類されているものを別の種類に変更することができる。

【0173】

ＩＶ．免疫複合体
本発明の抗体分子は、異種タンパク質又はポリペプチドへの組換え融合又は化学的複合（共有結合性複合及び非共有結合性複合を含む）により融合タンパク質を産生できる。タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを抗体に融合又は複合させる方法は、本分野で知られている内容である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、第５，６２２，９２９号及び欧州特許第ＥＰ３６７，１６６号が参照される。

【0174】

また、本発明の抗体分子は、標識された配列（例えば、ペプチド）に融合することによって精製しやすくなる。好ましい実施形態において、標識されたアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド、例えばｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）などにおいて提供された標識であり、そのほとんどは市販品として得ることができる。Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１－８２４に記載のとおり、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質を精製しやすくできる。他の精製用ペプチド標識は、ヘマグルチニン（「ＨＡ」）標識を含むが、これに限定されない。それはインフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープ（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３７：７６７）及び「ｆｌａｇ」標識に対応する。

【0175】

他の実施形態において、本発明の抗体分子は診断剤又は検出可能な試薬と複合する。このような抗体は、臨床検査方法の一部（例えば、特定の療法の効果を確認するため）として、疾患又は病症の発生、成立、進行及び／又はその重症度を監視又は予測することができる。このような診断及び検査は、抗体と検出可能な物質をカップリングさせることによって実現でき、前記検出可能な物質は、さまざまな酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、各種の陽電子放出断層撮影法で使用される陽電子放出性金属及び非放射性の常磁性金属イオンを含み、前記酵素としては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼを含むが、これらに限定されない。前記補欠分子族としては、例えば、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンを含むが、これらに限定されない。前記蛍光物質としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリスリンを含むが、これらに限定されない。前記発光物質としては、ルミノールを含むが、これに限定されない。前記生物発光物質としては、ルシフェラーゼ、フルオレセイン、イクオリンを含むが、これらに限定されない。前記放射性物質としては、ヨウ素（^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ及び^１２１Ｉ）、炭素（^１４Ｃ）、硫黄（^３５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム（^１１５Ｉｎ、^１１３Ｉｎ、^１１２Ｉｎ及び^１１１Ｉｎ）、テクネチウム（^９９Ｔｃ）、タリウム（^２０１Ｔｉ）、ガリウム（^６８Ｇａ、^６７Ｇａ）、パラジウム（^１０３Ｐｄ）、モリブデン（^９９Ｍｏ）、キセノン（^１３３Ｘｅ）、弗素（^１８Ｆ）、^１５３Ｓｍ、^１７７Ｌｕ、^１５９Ｇｄ、^１４９Ｐｍ、^１４０Ｌａ、^１７５Ｙｂ、^１６６Ｈｏ、^９０Ｙ、４７Ｓｃ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１４２Ｐｒ、^１０５Ｒｈ、^９７Ｒｕ、^６８Ｇｅ、^５７Ｃｏ、^６５Ｚｎ、^８５Ｓｒ、^３２Ｐ、^１５３Ｇｄ、^１６９Ｙｂ、^５１Ｃｒ、^５４Ｍｎ、^７５Ｓｅ、^１１３Ｓｎ及び^１１７Ｔｉｎを含むが、これらに限定されない。

【0176】

本発明はさらに、治療用部分と複合する抗体分子の使用を含む。抗体分子は、治療用部分、例えば、細胞毒素（例えば、細胞成長阻害剤又は細胞殺滅剤）、治療剤、又はαエミッターなどの放射性金属イオンと複合できる。用語「細胞毒素」又は「細胞傷害剤」は、細胞に害を与える任意の物質を含む。

【0177】

また、本発明の抗体分子は所定の生物学的反応を調節する治療用部分又は薬物部分と複合できる。治療用部分又は薬物部分は、古典的な化学療法薬に制限されると解釈できない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質、ペプチド又はポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素などの毒素、腫瘍壊死因子、α－インターフェロン、β－インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、抗血管新生剤などのタンパク質、又はリンホカインなどの生物学的応答調節物質を含んでもよい。

【0178】

また、本発明の抗体分子は、治療用部分、例えば、^２１３Ｂｉなどのα－エミッターをはじいめとする放射性金属イオンと複合でき、又は放射金属イオン（^１３１Ｉｎ、^１３１ＬＵ、^１３１Ｙ、^１３１Ｈｏ、^１３１Ｓｍを含むが、これらに限定されない）をポリペプチドと複合させる大環状キレート剤として用いることができる。いくつかの実施形態において、前記大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に付着する１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸（ＤＯＴＡ）である。このようなリンカー分子は、本分野で公知の内容であり、Ｄｅｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４（１０）：２４８３－９０にも記載されている。前記文献はそれぞれ引用によりその全体が組み込まれる。

【0179】

治療用部分と抗体を複合させる技術は公知の内容であり、例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（編集），ｐ２４３－２５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．１９８５）より一部抜粋）が参照される。

【0180】

抗体は、固相支持物に接続されてもよく、前記支持物は特に免疫測定法又は標的抗原の精製に用いられる。このような固相支持物は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンを含むが、これらに限定されない。

【0181】

Ｖ．本発明の抗体分子の製造及び精製
本発明の抗体分子は、例えば、固相ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組換えにより製造できる。組換え製造において、宿主細胞でクローニング及び／又は発現するために、前記抗体分子のいずれか１本のポリペプチド鎖及び／又は複数本のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを単離し、１つ又は複数のベクターに挿入する。通常の方法を用いて、前記ポリヌクレオチドを簡易に単離してシーケンシングすることができる。１つの実施形態において、本発明の１種又は複数種のポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。

【0182】

当業者が公知する方法を用いて発現ベクターを構築することができる。発現ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージ又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むが、これらに限定されない。

【0183】

本発明の１種又は複数種のポリヌクレオチドを含む発現用の発現ベクターを調製できたら、発現ベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクション又は導入できる。この目的を達成させるためには、例えば、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、レトロウイルス形質導入、ウイルストランスフェクション、パーティクルガン、リポソームに基づくトランスフェクション又は他の一般的な技術など、さまざまな技術を利用できる。

【0184】

１つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含む１種又は複数種の宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本出願で使用される用語「宿主細胞」は、工学的手法により本発明の抗体分子を産生できる任意の種類の細胞系を指す。複製及び本発明の抗体分子の発現をサポートするのに適する宿主細胞は、本分野で公知する事項である。必要に応じて、このような細胞は特定の発現ベクターを用いてトランスフェクション又は形質導入することができ、しかもベクターを含む多くの細胞を培養して大型の発酵槽に接種して、臨床用として十分な量の本発明の抗体分子を得ることができる。適切な宿主細胞は、大腸菌などの原核微生物、糸状真菌もしくは酵母などの真核微生物、又は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などのさまざまな真核細胞を含む。懸濁培養に適する哺乳動物細胞系を用いることができる。使用可能な哺乳動物宿主細胞系の例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）；ヒト胎児腎臓株（ＨＥＫ ２９３又は２９３Ｆ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、犬腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、骨髄腫細胞株、例えばＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などが挙げられる。タンパク質の産生に適する哺乳動物宿主細胞系に関する概要は、例えば、Ｙａｚａｋｉ＆Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編集，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐ２５５－２６８（２００３）が参照される。１つの好ましい実施形態において、前記宿主細胞はＣＨＯ、ＨＥＫ２９３又はＮＳＯ細胞である。

【0185】

本分野において、これらの宿主細胞系で外来遺伝子を発現させる標準技術は公知する内容である。１つの実施形態において、本発明の抗体分子の産生方法を提供し、前記方法は、前記抗体の発現に適する条件で、前記抗体分子をコードするポリヌクレオチドを含む本出願に係る宿主細胞を培養することと、宿主細胞（又は宿主細胞培地）から前記抗体を回収することとを含む。

【0186】

本出願に記載のとおり調製された抗体分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど、既知の従来技術により精製できる。特定のタンパク質を精製するための実際の条件は、正味電荷、疎水性、親水性などの因素にも依存し、これは当業者にとって公知する内容である。

【0187】

本発明の抗体分子の純度は、さまざまな公知する分析方法のいずれかにより決定でき、前記公知する分析方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィーなどを含む。本出願に係る抗体分子の物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性は、本分野の公知するさまざまな測定法により、同定、選別し又はその特性評価を行うことができる。

【0188】

ＶＩ．医薬組成物及びキット
別の態様において、本発明は、組成物、例えば、医薬組成物を提供し、前記組成物は、薬学的に許容可能なベクターと配合される本出願に記載の抗体分子を含む。本出願で使用される「薬学的に許容可能なベクター」は、生理学的に適合性がある溶剤、分散媒体、等張剤、吸収遅延剤などのいずれか又はその全てを含む。本発明の医薬組成物は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、直腸投与、脊髄投与又は表皮投与（例えば、注射又は輸注）に適する。

【0189】

本出願はさらに、本出願に記載の抗体分子と１種以上の治療剤とを組み合わせた組成物を開示し、前記治療剤は、以下のカテゴリ（ｉ）～（ｉｉｉ）の１つ、２つ又は全てから選択される。（ｉ）抗原提示（例えば、腫瘍抗原提示）を強化させる医薬品、（ｉｉ）エフェクター細胞反応（例えば、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞活性化及び／又は動員）を強化させる医薬品、又は（ｉｉｉ）免疫抑制を低減させる医薬品。

【0190】

本発明の組成物は、さまざまな形態で存在することができる。これらの形態は、液体、半固体及び固体の剤型、例えば、液体溶液剤（例えば、注射用溶液剤、輸注用溶液剤）、分散体剤もしくは懸濁剤、リポソーム剤及び坐剤を含む。好ましい形態は、所望の投与モードと治療用途によって決定する。一般的に好ましくは、組成物が注射用溶液剤、輸注用溶液剤の形態である。好ましい投与モードは、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内）注射である。１つの好ましい実施形態において、抗体分子は静脈内輸注又は注射により投与される。別の好ましい実施形態において、抗体分子は筋肉内、腹腔内又は皮下注射により投与される。

【0191】

本出願で使用される用語「非経口投与」及び「非経口方式投与」は、経腸投与及び局所投与以外の投与モードを指し、一般には注射して投与されるが、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、腹腔内、経気管、皮下注射、輸注を含むが、これらに限定されない。

【0192】

治療用組成物は一般に、滅菌されたものであり、しかもその製造・保管条件において安定している。組成物は溶液、マイクロエマルション、分散体、リポソーム又は凍結乾燥物の形態として調製することができる。活性化合物（即ち抗体分子）を所定の量で適切な溶剤に加え、次に濾過・消毒することによって、滅菌された注射用溶液剤を調製することができる。一般には、前記活性化合物を滅菌溶媒に混入することによって分散体を調製し、前記滅菌溶媒は基礎となる分散媒体と他の成分を含む。レシチンなどのコーティング剤を用いることができる。分散体である場合は、界面活性剤を用いて溶液剤に適切な流動性を維持できる。吸収を遅延させる物質、例えばモノステアレート、ゼラチンを組成物に含有させることによって注射用組成物の吸収を引き伸ばすことができる。

【0193】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子は経口投与され、例えば、不活性希釈剤又は食用可能ベクターとともに経口投与される。本発明の抗体分子は、ハードゼラチンカプセル又はソフトゼラチンカプセルに封入されるか、錠剤に圧縮されてもよいし、又はそのまま対象の食事に混入されてもよい。経口投与して治療に使用される場合は、前記化合物は、賦形剤とともに混入され、摂取される錠剤、頬錠、トローチ剤（ｔｒｏｃｈｅ）、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハ剤（ｗａｆｅｒ）などの形態で使用されてもよい。本発明の抗体分子を非経口経路で投与するためには、前記抗体分子をその不活性化を防ぐ材料でコーティングするか、又は当該材料とともに投与する場合がある。さらに治療用組成物は、本分野で公知する医療機器を用いて投与できる。

【0194】

本発明の医薬組成物は、「治療的有効量」又は「予防的有効量」の本発明に記載の抗体分子を含んでもよい。「治療的有効量」とは、所定の期間に亘って所定の用量で所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。治療的有効量は、病状、個体の年齢、性別、体重などの多くの要因によって異なる。治療的有効量は、毒性又は害が治療による有益な効果に及ばないような任意の量である。治療を受けていない対象と比べ、「治療的有効量」は、測定可能なパラメータ（例えば、腫瘍成長率）を好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、一層好ましくは少なくとも約８０％抑制する。前記測定可能なパラメータ（例えば、腫瘍体積）に対する本発明の抗体分子の抑制能力は、ヒト腫瘍における効果を示すための動物モデルシステムにおいて評価できる。

【0195】

「予防的有効量」は、所定の期間に亘って所定の用量で所望の予防結果を達成するために有効な量を指す。一般には、予防的用量は疾患の早期より前に又は比較的初期の段階で対象に使用されるため、予防的有効量は治療的有効量を下回る。

【0196】

本出願に記載の抗体分子を含むキットも本発明の範囲内である。キットは、１つ又は複数の他の要素を含んでもよく、例えば、取扱説明書、マーカー又はカップリング用試薬などの他の試薬、薬学的に許容可能なベクター、対象への投与のための装置もしくは他の材料を含む。

【0197】

ＶＩＩ．抗体分子の使用
本出願で開示されている抗体分子は、インビトロ・インビボ診断用途、及び治療的・予防的用途を有する。例えば、これらの分子は、インビトロ又はエキソビボ培養細胞、又は対象、例えば、ヒト対象に投与されて、がん、自己免疫疾患、急性または慢性炎症性疾患、感染性疾患（例えば、慢性感染症又は敗血症）などのさまざまな抗原関連疾患を治療、予防及び／又は診断することができる

【0198】

１つの態様において、本発明は、血清、精液、尿又は組織生検サンプル（例えば、過剰増殖性又はがん性の病巣に由来する）などの生体サンプル中の関連抗原の存在をインビトロ又はインビボで検出する診断方法を提供する。該診断方法は、（ｉ）相互作用が生じることが認められる条件において、サンプル（必要に応じて、対照サンプル）を本出願に記載の抗体分子と接触させ、又は対象に前記抗体を投与することと、（ｉｉ）前記抗体とサンプル（必要に応じて、対照サンプル）による複合物の形成を検出することとを含む。複合物が形成される場合、関連抗原が存在することを示し、本出願に記載の治療及び／又は予防の適合性又はその必要性も示唆される。

【0199】

いくつかの実施形態において、治療前、例えば、治療を開始する前、又は治療間隔がある場合は、治療を再開する前に関連抗原を検出する。利用可能な検出方法は、免疫組織化学、免疫細胞化学、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＰＣＲ技術（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）又はインビボイメージング技術を含む。一般には、インビトロ又はインビボ検出方法に使用される抗体分子は、結合された又は未結合のコンジュゲートを検出しやすくするために、検出可能な物質で直接的又は間接的に標識される。適切な検出可能な物質は、さまざまな生物活性酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、常磁性（例えば、核磁気共鳴活性）物質、及び放射性物質を含む。

【0200】

いくつかの実施形態において、関連抗原のレベル及び／又は分布をインビボで決定し、例えば、検出可能な物質で標識された本発明の抗体分子を、非侵襲的方式（例えば、適切なイメージング技術（例えば、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）による走査）により検出する。１つの実施形態において、例えば、ＰＥＴ試薬（例えば、^１８Ｆ－フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ））を用いて検出可能な方式で標識された本発明の抗体分子を検出することによって、関連抗原のレベル及び／又は分布をインビボで測定する。

【0201】

１つの実施形態において、本発明は、本出願に記載の抗体分子と、取扱説明書とを含む診断キットを提供する。

【0202】

別の態様において、本発明は、本発明に記載の抗体分子を用いて、免疫応答の調節が必要な対象の疾患をインビボで治療又は予防し、それによってがん性腫瘍、自己免疫疾患、急性または慢性炎症性疾患、感染性疾患（例えば、慢性感染症又は敗血症）などの関連する疾患の発生又は再発を抑制又は減少する。本発明の抗体分子は単独で使用できる。必要に応じて、抗体分子は、他のがん治療剤／予防剤と組み合わせて投与されてもよい。本発明の抗体分子が１種又は複数種の他の医薬品と組み合わせて投与される場合は、任意の順番でこの組み合わせで投与してもよいし又は同時に投与してもよい。

【0203】

したがって、１つの実施形態において、本発明は、対象における免疫応答を調節する方法を提供し、前記方法は、本出願に記載の抗体分子を治療的有効量で対象に投与することを含む。別の実施形態において、本発明は、対象における疾患の発生又は再発を防止する方法を提供し、前記方法は本出願に記載の抗体分子を予防的有効量で対象に投与することを含む。

【0204】

いくつかの実施形態において、抗体分子を用いて治療及び／又は予防するがんは、固形腫瘍、血液がん（例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫、例えば、多発性骨髄腫）及び転移性病巣を含むが、これらに限定されない。１つの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。固形腫瘍の例は、悪性腫瘍、例えば、複数の臓器系の肉腫もしくはがん、例えば肺、乳房、卵巣、リンパ系、消化管（例えば、結腸）、肛門、性器及び尿生殖路（例えば、腎臓、膀胱上皮、膀胱細胞、前立腺）、咽頭、ＣＮＳ（例えば、脳、神経細胞又はグリア細胞）、頭頸部、皮膚（例えば、黒色腫）、鼻咽頭（例えば、分化型又は未分化型の転移性又は局所再発性鼻咽頭がん）又は膵臓を侵襲するがん、及び腺がん、例えば、結腸がん、直腸がん、腎細胞がん、肝がん、非小細胞肺がん、小腸がん及び食道がんなどの悪性腫瘍を含む。がんは、早期、中期又は末期にあるがん又は転移性がんであってもよい。

【0205】

いくつかの実施形態において、前記がんは、黒色腫、乳がん、結腸がん、食道がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、腎臓がん（例えば、腎細胞がん）、肝がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、頭頸部腫瘍、胃がん、血液悪性疾患（例えば、リンパ腫）から選択される。

【0206】

いくつかの実施形態において、抗体分子を用いて治療及び／又は予防する感染性疾患は、効果的なワクチンがない病原体、又は一般的なワクチンでは十分な効果が得られないような病原体を含む。これらの病原体は、ＨＩＶ、（Ａ型、Ｂ型及びＣ型）肝炎、インフルエンザ、疱疹、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、マラリア、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含むが、これらに限定されない。本発明で例示される抗体分子によるＰＤ－Ｌ１遮断作用は、感染が発展するに伴い、変異抗原が生じる病原体（例えばＨＩＶ）が引き起す感染には特に利用できる。これらの変異抗原は、抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体が投与されると、外来抗原とみなされ、それによって、本発明で例示される抗体分子は、負のシグナルにより抑制されない強烈なＴ細胞反応をＰＤ－Ｌ１を介して活性化させることができる。

【0207】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子を用いて炎症性・自己免疫性疾患及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を治療及び／又は予防し、免疫系をダウンレギュレートする。本発明の抗体分子を投与することで治療及び／又は予防できる自己免疫性疾患の例は、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、限局性回腸炎、エリテマトーデス、潰瘍性結腸炎、ぶどう膜炎などを含むが、これらに限定されない。本発明の抗体分子を投与することで治療及び／又は予防できる炎症性疾患の例は、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、アレルギー性疾患、敗血症性ショック、肺線維症、関節炎、ウイルスもしくは細菌の慢性感染による慢性炎症を含むが、これらに限定されない。

【0208】

次に、本発明に対する一層の理解のために、実施例を用いて説明する。これらの実施例は本発明の保護範囲を制限するものとは解釈されず、何らかの形でそのような示唆をするためのものでもない

【実施例】

【0209】

実施例１． 抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の構築、発現、精製及び性質同定
実施例１．１． 抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の構築
本実施例において、４種の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体が構築され、それぞれ（１）構造模式図が図１Ａに示される二重特異性抗体Ｂｉ－１１０－１１２ＨＣと、（２）構造模式図が図１Ｂに示される二重特異性抗体Ｂｉ－１１３－１１２ＨＣと、（３）構造模式図が図１Ｃに示される二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣと、（４）構造模式図が図１Ｄに示される二重特異性抗体Ｂｉ－１２２－１１２ＬＣと命名される。次に上記４種の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体についてそれぞれ説明する。

【0210】

（１）図１Ａの構造模式図に示されるように、二重特異性抗体Ｂｉ－１１０－１１２ＨＣは左右に対称な４本のポリペプチド鎖からなり、左半分の２本のポリペプチド鎖（即ち、ペプチド鎖＃１及びペプチド鎖＃２）はＮ末端からＣ末端までそれぞれ配列番号６及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する。具体的には、配列番号６で表されるペプチド鎖＃１はＮ末端からＣ末端まで抗ＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２０１１２から誘導される配列番号７で表されるＶＬアミノ酸配列と、前記ＶＬアミノ酸配列のＣ末端に位置する配列番号８で表されるヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）アミノ酸配列と、前記ヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）アミノ酸配列のＣ末端に位置する配列番号９で表される接続ペプチドアミノ酸配列と、前記接続ペプチドアミノ酸配列のＣ末端に位置する配列番号２で表される抗ＰＤ－Ｌ１ ＶＨＨアミノ酸配列とを含む。配列番号１０で表されるペプチド鎖＃２は、抗ＯＸ４０モノクローナル抗体ＡＤＩ－２０１１２誘導される配列番号１１で表されるＶＨアミノ酸配列と、前記ＶＨアミノ酸配列のＣ末端に位置するヒトＩｇＧ１から誘導される配列番号１２で表されるＣＨ１アミノ酸配列と、前記ＣＨ１アミノ酸配列のＣ末端に位置するヒトＩｇＧ１から誘導される配列番号１３で表されるＦｃ領域アミノ酸配列とを含む。

【0211】

（２）図１Ｂの構造模式図に示されるように、二重特異性抗体Ｂｉ－１１３－１１２ＨＣは左右に対称な４本のポリペプチド鎖からなり、左半分の２本のポリペプチド鎖（即ち、ペプチド鎖＃１及びペプチド鎖＃２）はＮ末端からＣ末端までそれぞれ配列番号１４及び配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する。具体的には、配列番号１４で表されるペプチド鎖＃１はＮ末端からＣ末端まで配列番号２で表される抗ＰＤ－Ｌ１ ＶＨＨアミノ酸配列と、配列番号９で表される接続ペプチドアミノ酸配列と、配列番号７で表される抗ＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２０１１２から誘導されるＶＬアミノ酸配列と、配列番号８で表されるヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）アミノ酸配列とを含む。ペプチド鎖＃２は配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する。

【0212】

（３）図１Ｃの構造模式図に示されるように、二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣは左右に対称な４本のポリペプチド鎖からなり、左半分の２本のポリペプチド鎖（即ち、ペプチド鎖＃１及びペプチド鎖＃２）はＮ末端からＣ末端までそれぞれ配列番号１５及び配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有する。具体的には、配列番号１５で表されるペプチド鎖＃１はＮ末端からＣ末端まで配列番号７で表される抗ＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２０１１２から誘導されるＶＬアミノ酸配列と、配列番号８で表されるヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）アミノ酸配列とを含む。配列番号１６で表されるペプチド鎖＃２はＮ末端からＣ末端まで配列番号１１で表される抗ＯＸ４０モノクローナル抗体ＡＤＩ－２０１１２から誘導されるＶＨアミノ酸配列と、ヒトＩｇＧ１から誘導されるＣＨ１アミノ酸配列と、配列番号２で表される抗ＰＤ－Ｌ１ ＶＨＨアミノ酸配列と、配列番号１３で表されるヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域から誘導されるアミノ酸配列とを含む。

【0213】

（４）図１Ｄの構造模式図に示されるように、二重特異性抗体Ｂｉ－１２２－１１２ＬＣは左右に対称な４本のポリペプチド鎖からなり、左半分の２本のポリペプチド鎖（即ち、ペプチド鎖＃１及びペプチド鎖＃２）はＮ末端からＣ末端までそれぞれ配列番号１５及び配列番号１７で表されるアミノ酸配列を有し、前記ペプチド鎖＃２はＮ末端からＣ末端まで配列番号２で表される抗ＰＤ－Ｌ１ ＶＨＨアミノ酸配列と、配列番号９で表される接続ペプチドアミノ酸配列と、配列番号１１で表される抗ＯＸ４０モノクローナル抗体ＡＤＩ－２０１１２から誘導されるＶＨアミノ酸配列と、配列番号１２で表されるヒトＩｇＧ１から誘導されるＣＨ１アミノ酸配列と、配列番号１３で表されるヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域から誘導されるアミノ酸配列とを含む。

【0214】

実施例１．２． 抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の発現、精製及び分析
本実施例において、実施例１．１で構築された抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体のペプチド鎖＃１、ペプチド鎖＃２をコードするヌクレオチド配列をそれぞれポリクローナルサイトによって真核発現ベクターｐＴＴ５の市販品に組み入れ、真核細胞において発現させて精製することによって、抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１０－１１２ＨＣ、Ｂｉ－１１３－１１２ＨＣ、Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣ及びＢｉ－１２２－１１２ＬＣを得た。操作は具体的に以下のとおりである。

【0215】

二重特異性抗体Ｂｉ－１１０－１１２ＨＣ、Ｂｉ－１１３－１１２ＨＣ、Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣ及びＢｉ－１２２－１１２ＬＣの上記各ペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列の合成は蘇州金唯智生物科技有限公司（Ｇｅｎｅｗｉｚ）によって実施された。適切な制限酵素とリガーゼを用いて、合成されたペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列をそれぞれベクターｐＴＴ５に接続させることによって、それぞれペプチド鎖をコードする前記ヌクレオチド配列を含む組換えベクターを得た。

【0216】

前記組換えベクターは、シーケンシングしてその正確性が確認され、後続の発現に用いる。
ＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）をＥｘｐｉ２９３細胞培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）において継代培養した。トランスフェクションの１日前に細胞培養物を遠心分離して細胞ペレットを得、細胞を新鮮なＥｘｐｉ２９３細胞培養培地に懸濁し、細胞密度を１×１０^６細胞／ｍｌに調整した引き続きＨＥＫ２９３細胞を培養し、トランスフェクション当日に培養物中の細胞密度は約２×１０^６個の細胞／ｍｌである。ＨＥＫ２９３細胞懸濁液の最終体積の１／１０に相当するＦ１７培地（Ｇｉｂｃｏ社から購入、製品カタログ番号はＡ１３８３５－０１）をトランスフェクション緩衝液として用いる。１ｍＬのトランスフェクション緩衝液当たり、上記のとおりに調製された、それぞれペプチド鎖＃１又はペプチド鎖＃２をコードするヌクレオチド配列を含むモル比１：１の組換えプラスミド２００μｇを加え、均一に混合し、次にポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（ＰＥＩ））（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号：２３９６６）３０μｇを加えて、均一に混合し、室温で１０分間インキュベートした後、ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物をＨＥＫ２９３細胞懸濁液に徐々にデカントした。軽く混合させて均一になると、８％ＣＯ_２、３６．５℃において一晩培養した。

【0217】

一晩培養した後、培養フラスコに、トランスフェクション後の培養物の体積の１／５０で濃度が２００ｇ／ＬのＦＥＥＤ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｈ６７８４－１００Ｇ）と、トランスフェクション後の培養物の体積の１／５０で濃度が２００ｇ／Ｌのグルコース溶液を追加し、軽く混合させて均一になると、８％ＣＯ_２、３６．５℃において引き続き培養した。２０時間後に、最終濃度が２ｍＭ／ＬになるようＶＰＡ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１１４０－０５０）を加えた。７日目まで又は細胞活性≦６０％となるまで連続的に培養すると、培養物を収集して、７５００回転／分で３０分間遠心分離し、細胞の上清を取り分けて、ＳＡＲＴＯＰＯＲＥ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カタログ番号：５４４１３０７Ｈ４）で濾過した後、ＡＫＴＡｐｕｒｅシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。

【0218】

アフィニティークロマトグラフィーによる精製の操作ステップは具体的に以下のとおりである。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号：１７－５４３８－０３）アフィニティークロマトグラフィーカラムを使用し、ＡＫＴＡｐｕｒｅシステムに配置した。０．１Ｍ ＮａＯＨを用いてＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティークロマトグラフィーカラムが装備されたＡＫＴＡｐｕｒｅシステムから、一晩でエンドトキシンを除去した後、カラムの体積の５倍の結合緩衝液（Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ｐＨ７．２）でシステムを洗浄してカラムを平衡化した。上記のように濾過後の細胞上清はカラムに通した。カラムの体積の５～１０倍の結合緩衝液で再度平衡化し、ＡＫＴＡｐｕｒｅシステムに装備された紫外線検出装置を用いてＵＶ基線が直線となるまで監視した。次に、溶出緩衝液（クエン酸＋クエン酸ナトリウム１００ｍＭ、ｐＨ３．５）を用いて抗体を溶出し、紫外線吸収値に基づいてサンプルを収集した。収集液は１ｍｌ当たりに中和緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ２Ｍ）８０μｌを加えて中和させておいた。

【0219】

サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＳＥＣ）を利用して、収集された各レベルのサブチューブ中のサンプルの純度を検出した。ＳＥＣ結果はそれぞれ図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ及び図２Ｄに示されるように、二重特異性抗体Ｂｉ－１１０－１１２ＨＣ純度は７１．４０％、Ｂｉ－１１３－１１２ＨＣ純度は８４．５４％、Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣ純度は９９．４３％、Ｂｉ－１２２－１１２ＬＣ純度は９４．７９％である。

【0220】

精製後の二重特異性抗体溶液に対して、１５ｍｌ限外濾過遠心分離管において４５００回転／分で３０分間遠心分離した。ＰＢＳでタンパク質を希釈して、次に４５００回転／分で３０分間遠心し、該操作を２回繰り返すことによって、緩衝液を交換した。緩衝液が交換された抗体を合わせて、抗体濃度を測定した。

【0221】

後続の実験では、単一メインピーク純度が９９．４３％の二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣを選択してさらに研究した。

【0222】

実施例１．３． 抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の解離定数の測定
Ｏｃｔｅｔシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）を用いて動力学的結合測定法により本発明の上記の例示的な抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣがＯＸ４０及びＰＤ－Ｌ１と結合する時の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を測定した。関連の文献で報告された方法（Ｅｓｔｅｐ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ．ＭＡｂｓ，２０１３、５（２）：ｐ２７０－２７８）に基づいてＦｏｒｔｅＢｉｏ親和力測定を行った。簡単に言えば、実験開始の３０分間前に、ＡＨＣセンサ（Ｐａｌｌ、カタログ番号：１５０６０９１）をＳＤ緩衝液（ＰＢＳ １×、ＢＳＡ ０．１％、ポリソルベート２０ ０．０５％）に浸漬して室温で平衡化した。黒色ポリスチレン製のハーフボリューム９６ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のウェルにそれぞれ空白対照（背景除去用）としてＳＤ緩衝液１００μｌと、１００ｎＭの精製された二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣと、対照として抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ抗体（ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９５８８４）と、抗ＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２０１１２ （中国特許出願第２０１７１０１８５４００．８号）と、抗原としてＳＤ緩衝液によって希釈されたヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓ（１００ｎＭ）とヒトＯＸ４０－ｈｉｓ（１００ｎＭ）（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の溶液１００μｌとを加えた。抗ヒトＩｇＧ ＦｃバイオセンサＡＨＣを、それぞれ前記抗体溶液を含むウェルに室温で６００秒間浸漬した後、ローディングした。次に基線となるまでＳＤ緩衝液においてセンサを洗浄し、１００μｌの抗原溶液を含むウェルに浸漬して、抗体と抗原の結合を監視した。次にセンサをＳＤ緩衝液１００μｌを含むウェルに移して、抗体の解離を監視した。回転数は４００回転／分であり、温度は３０℃である。Ｏｃｔｅｔ分析ソフトウェア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて、背景修正後の結合曲線と解離曲線を当てはめして、結合（ｋ_ｏｎ）及び解離（ｋ_ｄｉｓ）の速度定数を生成し、後に平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）の算出するにこれらを用いる。表１、表２には、抗原ＯＸ４０又はＰＤ－Ｌ１に対する二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣのｋ_ｏｎ、ｋ_ｄｉｓ及びＫ_Ｄデータが示されている。

【0223】

【表2】

【0224】

【表3】

【0225】

上記のデータから分かるように、本発明の二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣは溶液中のＰＤ－Ｌ１及びＯＸ４０タンパク質と同時に結合でき、しかも親抗体ＡＤＩ－２０１１２及びヒト化Ｎｂ－Ｆｃの各抗原に対する親和力定数を維持している。

【0226】

実施例１．４． 本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体とＯＸ４０又はＰＤ－Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ細胞の結合分析
ＦＡＣＳにより本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣとＯＸ４０又はＰＤ－Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ細胞の結合を測定した。

【0227】

簡単に言えば、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ａ２９１３３）を用いて、マーカーが提供する取扱説明書に従って下記のとおりに操作した。ポリクローナルサイト（ＭＣＳ）にクローニングされたヒトＰＤ－ＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を持つｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をチャイニーズハムスター卵巣がん細胞（ＣＨＯ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションすることによって、ヒトＰＤ－Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞）を産生した。ＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞を計数し、細胞培地を用いて１×１０^６個の細胞／ｍｌとなるよう希釈し、１００μｌ／ウェルでＵ底９６ウェルプレートに加えた。遠心分離機において４００ｇで５分間遠心分離して、細胞培地を除去した。階段希釈された本発明の二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣ １００μｌと、対照としてヒト化Ｎｂ－ＦｃとをそれぞれＵ底プレートに加えて細胞を再懸濁させ、氷上に３０分間静置した。４００ｇで５分間遠心分離して、上清を除去し、ＰＢＳで細胞を洗浄して、未結合の抗体を取り除いた。４００ｇで５分間遠心分離して、ＰＢＳを除去した。各ウェルに、１：２００に希釈されたＰＥと複合した抗ヒトＦｃ抗体（ＳＯＵＴＨＥＲＮ ＢＩＯＴＥＣＨ）１００μｌを加え、遮光条件で、氷上に３０分間インキュベートした。４００ｇで５分間遠心分離して、上清を除去した。ＰＢＳで細胞を洗浄して、未結合のＰＥと複合した抗ヒトＦｃ抗体を取り除いた。ＰＢＳ １００μｌで細胞を再懸濁させ、ＦＡＣＳにより抗体と細胞の結合を検出した。結果は図３に示される。

【0228】

図３から分かるように、本発明の二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣは細胞表面で発現されたＰＤ－Ｌ１と結合でき、結合のＥＣ５０は２．６５４ｎＭであり、細胞表面で発現されたＰＤ－Ｌ１に対する抗ＰＤ－Ｌ１親抗体の結合能力（ＥＣ５０は１．９４０ｎＭ）に相当する。

【0229】

同様に、ポリクローナルサイト（ＭＣＳ）にクローニングされたヒトＯＸ４０ ｃＤＮＡ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を持つｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をチャイニーズハムスター卵巣がん細胞（ＣＨＯ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションすることによって、ヒトＯＸ４０を過剰発現させたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ＯＸ４０細胞）を産生した。

【0230】

ＣＨＯ－ＯＸ４０に対してＦＡＣＳ検出を実施する際、異なる細胞を使用すること、対照抗体としてＡＤＩ－２０１１２抗体を使用すること以外、他に実験操作はいずれもＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞に対する上記のＦＡＣＳ検出と同じである。

【0231】

結果は図４に示される。図４から分かるように、本発明の二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣは細胞表面で発現されたＯＸ４０と結合でき、結合のＥＣ５０は３．１９５ｎＭであり、細胞表面で発現されたＯＸ４０に対する抗ＯＸ４０親抗体の結合能力（ＥＣ５０は２．１９３ｎＭ）に相当する。

【0232】

実施例１．５． 本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体と、ＯＸ４０を過剰発現させたＣＨＯ細胞及びＰＤ－Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ細胞の同時結合の分析
本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣが異なる細胞に由来する標的抗原と同時に結合できるかどうかを検証するために、本実施例ではフローサイトメトリーを用いて、前記二重特異性抗体によって誘導される異なる細胞のカップリングについて検出した。実験手順は具体的に以下のとおりである。

【0233】

１）実施例１．４に記載のとおりＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞及びＣＨＯ－ＯＸ４０細胞を得て、培養した。遠心分離機においてＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞を含む培養物及びＣＨＯ－ＯＸ４０細胞を含む培養物をそれぞれ４００ｇで５分間遠心分離して、細胞培地を除去した。ＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳで細胞を再懸濁させた。細胞を計数して、細胞密度を２×１０^６個の細胞／ｍｌに調整した。ＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞及びＣＨＯ－ＯＸ４０細胞にそれぞれ１：５０００でＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ）及びＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染料を加え、３７℃で３０分間静置した。遠心分離機において４００ｇで５分間遠心分離して、上清を除去し、ＰＢＳで細胞を洗浄した。

【0234】

２）勾配希釈されたサンプル（抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣと、抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ抗体（ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９５８８４）と、抗ＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２０１１２（中国特許出願第２０１７１０１８５４００．８号））をそれぞれ９６ウェルＵ底プレートに加えた。前記１）の染色後のＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞を加え、混合させた（最終細胞密度は１．５×１０^６個／ｍｌ）。９６ウェルＵ底プレートを４℃で３０分間静置してプレートを取り出し、４００ｇで５分間遠心分離し、次にＰＢＳで４回洗浄し、ＰＢＳで細胞を再懸濁させた。

【0235】

３）９６ウェルＵ底プレート中の前記２）の細胞懸濁液に前記１）の染色後のＣＨＯ－ＯＸ４０細胞を加えて、ＣＨＯ－ＯＸ４０細胞の最終細胞密度は１×１０^６個／ｍｌになると、室温で１時間静置してＦＡＣＳ検出を行った。チャンネル２及チャンネル４の二重陽性細胞の比率は抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣが引き起こす細胞カップリングの状況を反映している。

【0236】

ＦＡＣＳ検出結果は図５に示し、抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣがＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞とＣＨＯ－ＯＸ４０細胞のカップリングを誘導できることから、本発明の二重特異性抗体は異なる細胞表面に由来する標的抗原と同時に結合できることを示している。本実施例で使用されるＩｇＧ１陰性対照の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列は配列番号２９で表され、ＩｇＧ１陰性対照の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列は配列番号３０で表される。

【0237】

実施例１．６． 本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体によるＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ細胞の結合遮断の分析
本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体がＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ細胞の結合を遮断できるかどうかを検証するために、本実施例ではフローサイトメトリーを用いて、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体によるＰＤ－１タンパク質とＰＤ－Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ細胞の結合遮断を検出した。実験手順の詳細は以下のとおりである。

【0238】

１）実施例１．４に記載のとおりＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞を得て、培養した。遠心分離機において、２．４×１０^７個のＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞を含む培養物を４００ｇで５分間遠心分離して、細胞培地を除去した。ＰＢＳで洗浄して、５ｍｌのＰＢＳで細胞を再懸濁させた。

【0239】

２）細胞プレーティング：１）で処理されたＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞を１ウェル当たり５０μｌで９６ウェルＵ底凝集プレートに加えた。

【0240】

３）勾配濃度サンプル溶液の調製：５ｍｌのＰＢＳにビオチン化ヒトＰＤ－１タンパク質（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＤ１－Ｈ８２Ｆ２）２００μｌを加え（ヒトＰＤ－１タンパク質の濃度は０．２ｍｇ／ｍｌ）、均一に混合した。ビオチン化ヒトＰＤ－１とＰＢＳの混合液を用いて、被検サンプルを次のように希釈した。１０００ｎＭを開始濃度とし、それに続く１１の濃度は３倍希釈して、合計で１２の濃度とした。

【0241】

４）調製された勾配濃度サンプルは１ウェル当たり５０μｌで、２）の細胞プレーティングを終えた９６ウェルＵ底凝集プレートに加え、均一に混合し、４℃で、３０分間インキュベートして、４００ｇで、５分間遠心分離して、上清を除去し、１ウェル当たり１５０μｌのＰＢＳを加え、４００ｇで、５分間遠心分離して、上清を除去し、これを３回繰り返した。

【0242】

５）１ウェル当たり１：２００希釈されたＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｒ－ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＳＡＰＥ）（ＴＨＥＲＭＯ、Ｓ２１３８８）１００μｌを加え、４℃で、３０分間静置した。

【0243】

６）各ウェル当たり１５０μｌのＰＢＳを加え、４００ｇで、５分間遠心分離して、上清を除去し、これを２回繰り返し、１００μｌのＰＢＳで再懸濁させ、フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＡＣＣＵＲＩＣ６）で検出した。

【0244】

本実施例で使用されるＩｇＧ１陰性対照は、上記の実施例１．５で使用されるＩｇＧ１陰性対照と同じである。実験結果は図６に示し、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣはＰＤ－１と、ＰＤ－Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ細胞の結合を効果的に遮断でき、しかも遮断活性は抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ抗体に相当する（抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体のＩＣ５０は３．５２２ｎＭであり、抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ抗体のＩＣ５０は４．９０６ｎＭである）。

【0245】

実施例１．７． ルシフェラーゼレポーター遺伝子による抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の抗ＰＤ－Ｌ１活性の検出
抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体がＮＦＡＴシグナル伝達経路に対するＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の抑制作用を解消できるかどうかを検証するために、本実施例ではルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いて細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＳ１８７１０９）を検出し、ルシフェラーゼの発現検出によってＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用に対する二重特異性抗体の抑制能力を示す。実験手順の詳細は以下のとおりである。

【0246】

抗体を研究する際はその作用メカニズム（ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ、ＭＯＡ）の解明とその生物学的活性が基礎となることから、本実施例ではＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ Ｍｏｄｅｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、本発明の二重特異性抗体の抗ＰＤ－Ｌ１生物学的活性を研究した。

【0247】

Ｐｒｏｍｅｇａ社によるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙは、ＭＯＡに基づく生物学的測定法であり、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断できる抗体の効力及び安定性を測定するために用いられる。該測定法は、２種の遺伝子組み換え細胞株を用いる。

【0248】

・ＰＤ－１エフェクター細胞：ヒトＰＤ－１を安定的に発現させ、活性化Ｔ細胞核内因子（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ、ＮＦＡＴ）によってルシフェラーゼを誘導発現させるＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞。

【0249】

・ＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞：ヒトＰＤ－Ｌ１を安定的に発現させるＣＨＯ－Ｋ１細胞、及び対応するＴＣＲを非抗原依存的に活性化させる細胞表面タンパク質。

【0250】

ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合は、ＮＦＡＴ下流シグナルの伝達を遮断することによって、ルシフェラーゼの発現を抑制でき、ＰＤ－１抗体又はＰＤ－Ｌ１抗体が加えられると、このような遮断効果が逆転され、ルシフェラーゼが発現されるため、蛍光シグナルが検出される。該検出方法は、感度、特異性、正確性がいずれも良好であり、しかも安定性が高い。

【0251】

メーカーの製品取扱説明書に従って検出した。

【0252】

１）活性検出の前日にＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞をプレーティングする：培養上清を捨て、ＰＢＳで洗浄し、パンクレリパーゼ（Ｇｉｂｃｏ、２５２０００７２）を加え、３７℃で、３～５分間インキュベートし、４倍の体積となる１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３００８４．０３）含有のＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、２２４００－０７１）培地で消化を停止させ、細胞を収集し、少量に細胞混合液を取り分けて細胞濃度を測定し、所定体積の細胞液を得て、４００ｇで、１０分間遠心分離して、上清を捨て、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３００８４．０３）含有のＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、２２４００－０７１）培地を測定緩衝液（ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ）として用い細胞を再懸濁させることによって、細胞密度を４×１０^５個の細胞／ｍｌとした。細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルで白色９６ウェル細胞培養プレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ、１３６１０１）に加え、白色９６ウェル細胞培養プレートの縁部のウェルには２００μｌ／ウェルでＰＢＳを加えた。３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベータで細胞を一晩培養した。

【0253】

２）滅菌９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ、４４２４０４）に対して、１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ１６４０培地を用いて被検サンプルを次のように希釈した。２００ｎＭを開始濃度とし、２番目の濃度～１２番目の濃度は３倍希釈して、合計で１２の濃度とした。

【0254】

３）ＰＤ－１エフェクター細胞を取得して、計数し、４００ｇで５分間遠心分離し、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで細胞を再懸濁させることによって、細胞濃度を１．２５×１０^６個の細胞／ｍｌとした。

【0255】

４）インキュベータから白色細胞培養プレートを取り出して、各ウェルから９５μｌ捨て、２）で希釈された抗体４０μｌ、３）で処理した細胞を加え、各ウェルはＪｕｒｋａｔ／ＰＤ－１細胞４０μｌとした。

【0256】

５）二酸化炭素インキュベータにおいて、３７℃、５％ＣＯ_２の培養条件で６時間培養した。

【0257】

６）白色細胞培養プレートを取り出して、室温で５～１０分間静置した。

【0258】

７）Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７９４０）を融解し、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）基質を加え（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７９４０）、均一に混合した。得られたＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬を、上記のとおりに６時間培養した検出プレートのウェルに８０μｌ／ウェルで加えた。室温で５～１０分間静置した。

【0259】

８）Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｉ３マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｍａｘ ｉ３）を用いて、化学発光の全波長を収集し、各ウェルの収集時間は１０００ミリ秒とした。

【0260】

本実施例で使用されるＩｇＧ１陰性対照は、上記の実施例１．５で使用されるＩｇＧ１陰性対照と同じである。実験結果は図７に示し、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣはＮＦＡＴシグナル伝達経路に対するＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断効果を効果的に解消でき、しかも活性は抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ抗体に相当する（抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体のＥＣ５０は０．４５８５ｎＭであり、抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ抗体のＥＣ５０は０．３２８３ｎＭである）。

【0261】

実施例１．８． ルシフェラーゼレポーター遺伝子による本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体が介在するＰＤ－Ｌ１依存性のＯＸ４０介在性シグナル伝達経路の活性化の検出
目的は、実施例１．４で得たＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞が存在する条件で、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体がＯＸ４０介在性シグナル伝達経路を活性化させる生理活性を検出することである。本実施例では、信達生物製薬（蘇州）有限公司が製造するＪｕｒｋａｔ－ＯＸ４０－ＮＦｋＢ－Ｌｕｃ－Ｒｅｐ安定化細胞株を使用して、ＯＸ４０が介在する転写活性化を測定することによって本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体に抗ＯＸ４０抗体のアゴニストとしての活性があるかどうかを評価する。抗ヒトＣＤ３（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号：５５５３２９）、抗ヒトＣＤ２８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号：５５５７２５）に、溶液に溶解された本発明の抗体を加えて、ヒトＯＸ４０構築体（Ｓｉｎｏから購入）及びＮＦｋＢ－ルシフェラーゼ構築体（ＮＦｋＢプロモーター－ｌｕｃ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を導入したヒトＯＸ４０を過剰発現させたＪｕｒｋａｔ細胞（米ＡＴＣＣ提供）を持続的に１６時間活性化させ、次に発色のためにＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬を加えた。実験手順は具体的に以下のとおりである。

【0262】

溶液調製：分析緩衝液：ＲＰＩＭ－１６４０（９０％）（Ｇｉｂｃｏ、２２４００－０７１）、ＦＢＳ（１０％）（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３００８４．０３）、抗ヒトＣＤ３（２μｇ／ｍｌ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号：５５５３２９）、抗ヒトＣＤ２８（２μｇ／ｍｌ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号：５５５７２５）。使用直前に調製する。

【0263】

実験ステップ：
１）少量に細胞懸濁液を取り分け、細胞計数盤で細胞密度を測定し、４００ｇで１０分間遠心分離して、上清を捨て、分析緩衝液で徐々に細胞を再懸濁させ、Ｊｕｒｋａｔ－ＯＸ４０－ＮＦｋＢ－Ｌｕｃ－Ｒｅｐ細胞密度は４×１０^５個／ｍｌ、ＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞密度は４×１０^５個／ｍｌである。

【0264】

２）細胞懸濁液をロードスロットに移し、白色９６ウェル細胞培養プレートを用意した（ＮＵＮＣ、カタログ番号：１３６１０１）。各ウェルに１）で処理したＪｕｒｋａｔ－ＯＸ４０－ＮＦｋＢ－Ｌｕｃ－Ｒｅｐ細胞５０μＬ及びＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞懸濁液５０μＬ、被検サンプルを加え、サンプルの開始濃度は１００ｎＭであり、２番目の濃度から１３番目の濃度は３倍希釈して、合計で１３の濃度とし、これを３セット設置して実験を繰り返す。

【0265】

３）二酸化炭素インキュベータにおいて、３７℃、５％ＣＯ_２の培養条件で１６時間培養した。

【0266】

４）Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｇ７９４０）を融解し、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｇ７９４０）を加え、均一に混合し。得られたＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬を、上記のとおりに16時間培養した検出プレートのウェルに８０μｌ／ウェルで加えた。室温で５～１０分間静置し、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｉ３マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｍａｘ ｉ３）を用いて、化学発光の全波長を収集し、各ウェルの収集時間は１０００ミリ秒とした。

【0267】

本実施例で使用されるＩｇＧ１陰性対照は、上記の実施例１．５で使用されるＩｇＧ１陰性対照と同じである。実験結果は図８に示し、ＰＤ－Ｌ１が発現される細胞系では、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣはＮＦｋＢシグナル伝達経路に対する明らかな活性化作用を有し、抗ＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２０１１２には比較的弱いＮＦｋＢシグナル伝達経路活性化効果が検出されており、抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ抗体にＮＦｋＢシグナル伝達経路活性化効果はない。本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体はＰＤ－Ｌ１を発現する細胞が存在する環境で、ＯＸ４０下流のＮＦｋＢシグナル伝達経路をより効果的に活性化できることが示されている。

【0268】

実施例１．９． 本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の熱安定性検出
示差走査蛍光測定法（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ、ＤＳＦ）は、タンパク質マップにおける蛍光の変化過程に基づいてタンパク質の構造安定性に関する情報を提供し、タンパク質の立体配置の変化を検出し、タンパク質の融解温度（Ｔ_ｍ）を取得するために利用できる。本実施例において、ＤＳＦ法を用いて本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体のＴ_ｍ値を測定した。

【0269】

本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣ抗体をＰＢＳ溶液でそれぞれ１ｍｇ／ｍｌに希釈した。

【0270】

４μｌのＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：Ｓ６６５０）に１９６μｌのＰＢＳを加えて、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎを５０倍希釈した。

【0271】

９６ウェルＰＣＲプレート（Ｎｕｎｃ）に濃度が１ｍｇ／ｍｌの上記二重特異性抗体５０μｌ、５０倍希釈した上記のＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ１０μｌを加え、次に水４０μｌを加えた。７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＢ／７５００）に入れて検出した。システム温度は１分間に０．５℃上昇するように設定し、蛍光曲線の絶対値にピークが出現する時に対応する温度は該タンパク質のＴ_ｍである。

【0272】

実験結果は次の表３及び図９に示される。本発明の二重特異性抗体はＴ_ｍ＞６０℃であり、したがって、良好な熱安定性を有している。

【0273】

【表4】

【0274】

実施例１．１０ 本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の熱安定性検出
二重特異性抗体の安定性の一層の確認のために、本実施例では、調製された一連の抗体が４０℃で０日、１日、３日、７日、１０日、２０日、３０日静置後の純度変化を検出することによって、抗体の長期的熱安定性を評価した。ＳＥＣ検出の結果、調製された一連のＢｉ－１１９－１１２ＬＣ抗体の初期純度は９２．９１％である。実験方法は以下のとおりである。抗体サンプルを５ｍｇ／ｍｌに濃縮させ（ＰＢＳに溶解）、ＥＰ管に分注し、２００μｌ／管で、遮光条件で４０℃で静置した。０日目、１日目、３日目、７日目、１０日目、２０日目、３０日目に各１管に対しＳＥＣ－ＨＰＬＣで単一メインピーク純度を測定した。

【0275】

実験結果は表４に示される。本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣを４０℃で３０日間静置した後、その単一メインピーク比率の低減幅はわずか３．６９％であった。結果により、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体は良好な熱安定性を有することが示される。

【0276】

【表5】

【0277】

実施例１．１１． ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞に対する本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の活性化作用の検出
本実施例では、ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞に対する抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の活性化作用をインビトロで検出し、実験手順は具体的に以下のとおりである。

【0278】

ヒトＰＢＭＣ細胞（ＡＬＬＣＥＬＬＳ、ＰＢ００５Ｆ）を融解し、３時間静置して容器に接着した細胞は単核細胞であり、ＡＩＭ Ｖ（登録商標） Ｍｅｄｉｕｍ ＣＴＳ（ＧＩＢＣＯ、Ａ３０２１００２）培地１０ｍｌを入れ、ＩＬ４（２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ、２０４－ＩＬ）と、ＧＭ－ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ、２１５－ＧＭ）とを加えて単核細胞が樹状細胞に分化する（即ち、ＤＣ細胞）ように誘導し、５日間培養すると、成熟ＤＣへの誘導のために、サイトカインＴＮＦα（１０００Ｕ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号：２１０－ＴＡ）と、ＲｈＩＬ－１β（５ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号：２０１－ＬＢ）と、ＲｈＩＬ－６（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号：２０６－ＩＬ）と、１μＭのＰＧＥ（Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号：２２９６）とを加え、二酸化炭素インキュベータにおいて３７℃、５％ＣＯ_２の培養条件で引き続き２日間培養するものを、リンパ球混合培養反応（ＭＬＲ）用の成熟するＤＣ細胞（ｍｏＤＣ）として用いた。

【0279】

ヒトＰＢＭＣ細胞（ＡＬＬＣＥＬＬＳ、カタログ番号：ＰＢ００５Ｆ）を融解し、ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号：１９０５２）の取扱説明書に従って、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の単離を行った。簡単に言えば、ＰＢＭＣを静置して２時間培養した後に懸濁細胞液を吸い取って、２０ｍｌ遠心分離管に入れ、３００ｇで１０分間遠心分離し、細胞沈殿物に分離液５００μｌと、キットに入っていた精製抗体１００μｌとを加えて、４℃で２０分間インキュベートし、分離液で洗浄し、次にビーズ緩衝液５００μｌを加えて１５分間インキュベートし、磁場によってビーズを除去し、ＡＩＭ Ｖ（登録商標） Ｍｅｄｉｕｍ ＣＴＳ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号：Ａ３０２１００２）培地で洗浄し、ＡＩＭ Ｖ（登録商標） Ｍｅｄｉｕｍ ＣＴＳ培地８ｍｌで培養して、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を得た。ＣＤ４^＋Ｔ細胞：抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ＝１：１でＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、カタログ番号：１１１３１Ｄ）を加え、二酸化炭素インキュベータにおいて３７℃、５％ＣＯ_２の培養条件で３日間培養し、ＣＤ４^＋Ｔ細胞にビーズ刺激を行った。

【0280】

上記のように単離されたＤＣ細胞とビーズ刺激されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を混合して、ブドウ球菌エンテロトキシンＥスーパー抗原（Ｔｏｘｉｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号：ＥＴ４０４）を加え、最終濃度は１ｎｇ／ｍｌであり、各ウェルは２００μｌの体積で、ＤＣ細胞は１２０００個、ＣＤ４^＋Ｔ細胞は１２００００個であり、勾配希釈された抗体を加え、３日間混合培養し、Ｃｉｓｂｉｏ ＩＬ２検出キット（ＣＩＳＢＩＯ、カタログ番号：６２ＨＩＬ０２ＰＥＧ）を用いて各サンプルのＩＬ２発現量を検出し、各種抗体のＩＬ２発現量はＴ細胞に対する該抗体の活性化能力を反映している。

【0281】

結果は図１０に示し、本発明の抗ＯＸ４０／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体Ｂｉ－１１９－１１２ＬＣは、インビトロでヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞を効果的に活性化でき、その活性化効果は抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ抗体、抗ＯＸ４０抗体ＡＤＩ－２０１１２を上回っている。

【0282】

実施例２． 抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体の構築、発現、精製及び性質同定
実施例２．１． 抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体の構築
本実施例において、２種の構造の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体が構築され、それぞれ（１）構造模式図が図１１Ａに示される二重特異性抗体Ｂｉ－２－５０と、（２）構造模式図が図１１Ｂに示される二重特異性抗体Ｂｉ－２－５１と命名される。次に上記２種の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体についてそれぞれ説明する。

【0283】

（１）図１１Ａの構造模式図に示されるように、二重特異性抗体Ｂｉ－２－５０は左右に対称な４本のポリペプチド鎖からなり、左半分の２本のポリペプチド鎖（即ち、ペプチド鎖＃１及びペプチド鎖＃２）はＮ末端からＣ末端までそれぞれ配列番号１８及び配列番号２１で表されるアミノ酸配列を有する。具体的には、配列番号１８で表されるペプチド鎖＃１は抗ＶＥＧＦ抗体Ａｖａｓｔｉｎから誘導される配列番号２０で表されるＶＬアミノ酸配列と、前記ＶＬアミノ酸配列のＣ末端に位置する配列番号８で表されるヒトκ軽鎖定常領域（ＣＬ）アミノ酸配列とを含み、配列番号２１で表されるペプチド鎖＃２は抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａｖａｓｔｉｎから誘導される配列番号２２で表されるＶＨアミノ酸配列と、前記ＶＨアミノ酸配列のＣ末端に位置するヒトＩｇＧ１から誘導される配列番号２３で表されるＣＨ１アミノ酸配列、ＣＨ１アミノ酸配列のＣ末端に位置する配列番号９で表される接続ペプチドアミノ酸配列と、配列番号２４で表される抗ＧＩＴＲ ＶＨＨアミノ酸配列と、配列番号１３で表されるヒトＩｇＧ１のＦｃ領域から誘導されるアミノ酸配列とを含む。

【0284】

（２）図１１Ｂの構造模式図に示されるように、二重特異性抗体Ｂｉ－２－５１は左右に対称な４本のポリペプチド鎖からなり、左半分の２本のポリペプチド鎖（即ち、ペプチド鎖＃１及びペプチド鎖＃２）はＮ末端からＣ末端までそれぞれ配列番号１８及び配列番号２８で表されるアミノ酸配列を有する。配列番号２８で表されるペプチド鎖＃２はＮ末端からＣ末端まで配列番号２２で表される抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａｖａｓｔｉｎから誘導されるＶＨアミノ酸配列と、配列番号２３で表されるヒトＩｇＧ１から誘導されるＣＨ１アミノ酸配列と、配列番号２４で表される抗ＧＩＴＲ ＶＨＨアミノ酸配列と、配列番号１３で表されるヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域から誘導されるアミノ酸配列とを含む。

【0285】

実施例２．２． 抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体の発現、精製及び分析
本実施例において、実施例２．１で構築された抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体Ｂｉ－２－５０及びＢｉ－２－５１のペプチド鎖＃１、ペプチド鎖＃２をコードするヌクレオチド配列をそれぞれポリクローナルサイトによって真核発現ベクターｐＴＴ５の市販品に組み入れ、真核細胞において発現させて精製することによって、抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体Ｂｉ－２－５０及びＢｉ－２－５１を得た。

【0286】

プラスミドのトランスフェクション、抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体Ｂｉ－２－５０及びＢｉ－２－５１の発現・精製操作は上記実施例１．２と同じである。二重特異性抗体Ｂｉ－２－５０及びＢｉ－２－５１のＳＥＣ結果はそれぞれ図１２Ａ及び図１２Ｂに示される。

【0287】

精製後に、抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体はいずれも比較的高い純度を有し、二重特異性抗体Ｂｉ－２－５０及びＢｉ－２－５１の単一メインピーク純度はそれぞれ９９．５７％及び９９．４８％であった。

【0288】

実施例２．３． 抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体の解離定数の測定
Ｏｃｔｅｔシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）を用いて動力学的結合測定法により本発明の上記の例示的な抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体Ｂｉ－２－２－５０－５１がＶＥＧＦ及びＧＩＴＲと結合する時の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を測定した。使用される抗体と抗原が異なる以外、他の具体的な実験手順は上記実施例１．３と同じである。検出結果は次の図５及び表６に示される。

【0289】

ＧＩＴＲに対する単一特異性親抗体として、名称が「ｈｃＩｇＧ－１０」で、配列番号３１で表されるアミノ酸配列を有する抗体を使用し、それはＮ末端からＣ末端まで配列番号２４で表される抗ＧＩＴＲ ＶＨＨアミノ酸配列と、「ＤＫＴＨＴ」ペプチド断片と、配列番号１３で表されるヒトＩｇＧ１のＦｃ領域から誘導されるアミノ酸配列とを含む。

【0290】

【表6】

【0291】

【表7】

【0292】

表５及び表６のデータから分かるように、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体Ｂｉ－２－５０及びＢｉ－２－５１は、いずれも溶液中のＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ、２９３－ＶＥ－５００）及びＧＩＴＲ （ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＧＩＲ－Ｈ５２２８－１ＭＧ）タンパク質と同時に結合でき、しかも親抗体Ａｖａｓｔｉｎ又はｈｃＩｇＧ－１０の親和力定数を維持している。

【0293】

実施例２．４． 本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体とＶＥＧＦ又はＧＩＴＲを過剰発現させたＣＨＯ細胞の結合分析
ＦＡＣＳにより本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体Ｂｉ－２－５０及びＢｉ－２－５１と、ＶＥＧＦ又はＧＩＴＲを過剰発現させたＣＨＯ細胞の結合を測定した。使用される抗体と抗原が異なる以外、他の具体的な実験手順は上記実施例１．４と同じである。本実施例で使用されるＩｇＧ１陰性対照は、上記の実施例１．５で使用されるＩｇＧ１陰性対照と同じである。結果は図１３に示される。

【0294】

図１３から分かるように、本発明の抗ＶＥＧＦ／ＧＩＴＲ二重特異性抗体Ｂｉ－２－５０及びＢｉ－２－５１はいずれも細胞表面で発現されたＧＩＴＲと結合でき、結合ＥＣ５０はそれぞれ２．９９０ｎＭ、３．１６８ｎＭである。親抗体ｈｃＩｇＧ－１０と細胞表面ＧＩＴＲの結合に関するＥＣ５０は０．６０６１ｎＭである。

【0295】

本発明の目的を説明するために、一部の典型的な実施形態を詳細に示しているが、発明の趣旨を逸脱することなくこれらに対してさまざまな変化及び修正を行うことができる。これは当業者にとって自明な事項である。これによって、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲のみによって限定される。

【図1】

【図2A-B】

【図2C-D】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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