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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-16
(45)【発行日】2024-02-27
(54)【発明の名称】キメラ抗原受容体の最適化
(51)【国際特許分類】
C07K 14/715 20060101AFI20240219BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240219BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240219BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240219BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240219BHJP
【ＦＩ】
C07K14/715 ZNA
C07K19/00
C07K16/00
C12N5/10
C12N15/12
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2022549226
(86)(22)【出願日】2021-02-09
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-03
(86)【国際出願番号】 CN2021076231
(87)【国際公開番号】W WO2021160120
(87)【国際公開日】2021-08-19
【審査請求日】2022-08-12
(31)【優先権主張番号】202010090537.7
(32)【優先日】2020-02-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】522322815
【氏名又は名称】イミュノファーム テクノロジー カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100136249
【弁理士】
【氏名又は名称】星野 貴光
(72)【発明者】
【氏名】ルー シンアン
(72)【発明者】
【氏名】ヘ ティン
(72)【発明者】
【氏名】キ フェイフェイ
(72)【発明者】
【氏名】ディン ヤンピン
(72)【発明者】
【氏名】ション フイン
(72)【発明者】
【氏名】リアン メンメン
【審査官】鳥居 敬司
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５１２２１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／０６０１７４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１８－５１８９３９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５０１６４７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／１７６５２５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１９／００２３７６４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０２０／００２３０１０（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １４／００－１４／８２５
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号：４、６または８に示されるアミノ酸配列からなる、改変4-1BB共刺激ドメイン。
【請求項2】
請求項１に記載の改変4-1BB共刺激ドメインを含む、キメラ抗原受容体。
【請求項3】
請求項２に記載のキメラ抗原受容体を含む、動物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、キメラ抗原受容体（Chimeric Antigen Receptor，CAR）の最適化、特に細胞内共刺激ドメインの改変に関する。
【背景技術】
【0002】
CAR-T技術は、抗体の特異性とT細胞の殺傷効果を組み合わせて、養子免疫の効果的な方法を形成する（Benmebarek et al., Int. J. Mol. Sci. 20: 1283, 2019）。最初のCARは通常、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ領域、膜貫通領域、および細胞内シグナル伝達ドメインで構成される（Gross et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10024-10028, 1989；Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 720-724, 1993）。第2世代のCARは通常、膜貫通領域と細胞内シグナル伝達ドメインの間に位置する細胞内共刺激ドメインを追加する（Imai et al., Leukemia 18: 676-684, 2004；Zhao et al., Cancer Cell 28: 415-428, 2015）。第3世代のCARは、二つの共刺激ドメインを追加する（Zhong et al., Mol. Ther. 18: 413-420, 2010）。CAR-T技術は血液腫瘍の治療に大きな成功を獲得しているが、反応しない、または反応後に再発する患者もおり、治療効果の持続性と毒性の副作用にはまだ欠陥がある。さらに、CAR-Tは、固形腫瘍の治療において、治療効果の制限やオフターゲット効果など、さらに多くの障害に直面している。CAR-Tの治療効果と安全性に関する二つの重要な問題は、1）CAR-Tの体内での増幅と持続性が不十分であること；及び2）CAR-Tは、サイトカインストーム、神経毒性、オフターゲット効果などの毒性の副作用を引き起こす可能性があることである。
【0003】
上記現象の原因は、現在のCAR分子で使用されている各部品が基本的に野生型であり、その結果、抗原認識ドメインが標的分子に結合するときに免疫シナプスの形成に最適な結合状態に達しない可能性があり、または、免疫シナプス形成後の細胞内へのシグナル伝達が強すぎるか弱すぎるため、CAR-T細胞の体内での生存、増幅、腫瘍細胞殺傷性能の持続、および免疫系全体の機能調節に影響を与え、最終的には臨床治療効果と安全性の違いに反映されるためである。
【0004】
本発明は、ＣＡＲ分子、特に細胞内共刺激ドメインを最適化することにより、ＣＡＲ-T細胞の体内での増幅効率および持続時間を改善し、腫瘍殺傷効率を高め、そして毒性の副作用を低減し、最終的に臨床効果の改善、病気の再発と副作用の減少の目的を達成する。
【発明の概要】
【0005】
本発明の一態様は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメインを改変する方法に関する。一実施形態では、この方法は、共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフ内の一つまたは複数のアミノ酸残基を置換することを含む。任意選択的に、この方法は、更に共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフのN端および/またはC端の一つまたは複数のアミノ酸残基を置換することを含んでもよい。別の実施形態では、この方法は、共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフを追加または削除することを含む。任意選択的に、この方法は、更に共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフのN端および/またはC端の一つまたは複数のアミノ酸残基を追加または削除することを含んでもよい。別の実施形態では、この方法は、共刺激ドメインに、下流のシグナル伝達分子中の多量体化（例えば、三量体化）に関与する一つまたは複数の配列を追加することを含む。本発明はまた、前記方法によって得られた改変共刺激ドメインに関する。
【0006】
本発明の一態様は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の改変共刺激ドメインに関する。一実施形態では、改変された共刺激ドメインは、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフ内の一つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含む。任意選択的に、改変された共刺激ドメインは、更に下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフのN端および/またはC端の一つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含んでもよい。別の実施形態では、改変された共刺激ドメインは、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフを追加または削除する。任意選択的に、改変された共刺激ドメインは、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフのN端および/またはC端の一つまたは複数のアミノ酸残基を追加または削除してもよい。別の実施形態では、改変された共刺激ドメインは、下流のシグナル伝達分子中の多量体化（例えば、三量体化）に関与する一つまたは複数の配列を追加する。
【0007】
本発明の一態様は、キメラ抗原受容体を最適化する方法に関する。この方法は、一つのステップとして、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメインを改変する上記の方法を含む。本発明のキメラ抗原受容体を最適化する方法（具体的には、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメインを改変する方法）は、単独で、またはキメラ抗原受容体を最適化する他の方法（例えば、シグナル伝達ドメインを改変する方法）と組み合わせて使用することができる。本発明はまた、前記方法によって得られる最適化されたキメラ抗原受容体に関する。
【0008】
本発明の一態様は、最適化されたキメラ抗原受容体に関する。このキメラ抗原受容体は、一つの部品として、上記の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の改変共刺激ドメインを含む。本発明の最適化されたキメラ抗原受容体は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の改変共刺激ドメインだけでなく、改変シグナル伝達ドメインなどの他の改変された部品も含み得る。
【0009】
本発明の一態様は、本発明の改変共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体に関する。本発明の一態様は、本発明のキメラ抗原受容体を含む動物細胞に関する。一実施形態では、動物は哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、およびウマ）である。一実施形態では、動物は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、およびウサギ）または非ヒト霊長類（例えば、サル、類人猿、およびチンパンジー）である。一実施形態では、動物はヒトである。一実施形態では、前記細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞などのリンパ球である。
【0010】
例えば、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは4-1BBである。例えば、前記下流のシグナル伝達分子はＴＲＡＦ２である。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
特に断らない限り、本発明の実施は、当該技術分野範囲内の分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用する。これらの技術は、文献で完全に説明されている。
【0013】
特に断らない限り、本明細書で使用される技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。
【0014】
１．共刺激ドメイン
【0015】
キメラ抗原受容体で使用される細胞内共刺激ドメインは通常、4-1BBに代表される腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー(TNFRSF)とCD28に代表されるCD28ファミリーの二つのファミリーに由来する。腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーには、4-1BB、ATAR、CD27、CD30、CD40、Ox40、LMP1、およびLTβRなどの共刺激分子が含まる。これらと下流のシグナル伝達分子(例えば、TRAFファミリーメンバー)との結合部位は、配列保守性があり、主なコンセンサスモチーフ(P/S/A/T)X(Q/E)EおよびマイナーコンセンサスモチーフPXQXXDを含み、Xは任意のアミノ酸である。例えば、ヒト配列では、4-1BB(NP_001552.2)にはTTQEとPEEE、ATRRにはAVEE、CD27にはPIQE、CD30にはPEQEとSVEE、CD40にはPVQE、LMP1にはPQQATD、LTβRにはPHQE、OX40にはPIQE、TANKにはPIQCTD、TNF-R2にはSKEEが含まれる。さまざまな共刺激分子は、すべてTRAFファミリーのTRAF2に結合するが、TRAFファミリーの他のメンバー(例えば、TRAF1、TRAF3、TRAF5、TRAF6)との結合は異なる。Hong et al., Molecular Cell 4: 321-330, 1999を参照。
【0016】
本発明において、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーの共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と結合するモチーフを改変することにより、ＣＡＲ-T細胞の体内での増幅効率を向上させ、ＣＡＲ-T細胞の体内での持続時間を延長し、ＣＡＲ-T細胞の腫瘍細胞に対する殺傷効率を高め、そしてサイトカイン放出症候群と神経毒性を軽減し、最終的に臨床効果を改善し、毒性の副作用を軽減する目的を達成する。
【0017】
一方、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメインに、さらに共刺激ドメインを多量体化（例えば、三量体化）させる配列を追加し、下流へのシグナル伝達の強度を調整する。Wu et al., Structural Studies of Human TRAF2, Cold Spring Harb Symp Quant Biol 64: 541-550, 1999を参照。
【0018】
本発明において、4-1BB共刺激ドメインは、例えば、NP_000725.2に記載のアミノ酸配列を含んでもよい。ここで、共刺激ドメインは、第２１４～２５５位のアミノ酸残基（配列番号：2）に対応する。あるいは、4-1BB共刺激ドメインは、対立遺伝子産物、アイソフォーム、ホモログ、パラログなどの他の天然に存在する同一アミノ酸配列であってもよい。このような場合、4-1BB由来の共刺激ドメインは、他の天然に存在する同一アミノ酸配列中の、NP_000725.2に記載のアミノ酸配列の第２１４～２５５位のアミノ酸残基に対応する部分である。
【0019】
２．共刺激ドメインの改変方法
【0020】
本発明の一態様は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメインを改変する方法に関する。この方法は、共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフ内の一つまたは複数のアミノ酸残基を置換することを含む。任意選択的に、この方法は、更に共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフのN端および/またはC端の一つまたは複数のアミノ酸残基を置換することを含んでもよい。
【0021】
本発明の一態様は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメインを改変する方法に関する。この方法は、共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフを追加または削除することを含む。任意選択的に、この方法は、更に共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用するモチーフのN端および/またはC端の一つまたは複数のアミノ酸残基を追加または削除することを含んでもよい。
【0022】
本発明の一態様は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメインを改変する方法に関する。この方法は、共刺激ドメインに、下流のシグナル伝達分子中の多量体化（例えば、三量体化）に関与する一つまたは複数の配列を追加することを含む。
【0023】
一実施形態では、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは、CD30、CD40、CD27、OX40、4-1BB、ATAR、LTβR、およびLMP1からなる群より選択される。一実施形態では、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは4-1BBである。一実施形態では、前記下流のシグナル伝達分子は、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5、およびTRAF6からなる群より選択される。一実施形態では、前記下流のシグナル伝達分子はＴＲＡＦ２である。一実施形態では、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは4-1BBであり、且つ前記下流のシグナル伝達分子はＴＲＡＦ２である。
【0024】
一実施形態では、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用するモチーフは、(P/S/A/T)X(Q/E)EおよびPXQXXDからなる群より選択され、ここで、Xは任意の天然アミノ酸である。一実施形態では、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用するモチーフは、(P/S/A/T)X(Q/E)Eであり、ここで、Xは任意の天然アミノ酸である。一実施形態では、前記置換により、天然に存在しないモチーフが得られる。一実施形態では、「天然に存在しないモチーフ」は、すべての腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーにおいて天然に存在しないモチーフを指す。一実施形態では、「天然に存在しないモチーフ」は、改変された腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーにおいて天然に存在しないモチーフを指す。一実施形態では、「天然に存在しないモチーフ」は、改変された腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーの改変位置に天然に存在しないモチーフを指す。
【0025】
一実施形態では、前記方法は、共刺激ドメイン中の、下流の分子シグナルと相互作用する二つの異なるモチーフ内の一つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、且つ二つの異なるモチーフの位置を交換させることを含む。一実施形態では、前記方法は、更に共刺激ドメイン中の二つの異なるモチーフのN端および／またはＣ端の一つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、且つ二つの異なるモチーフのN端および／またはＣ端の一つまたは複数のアミノ酸残基とモチーフと共にその位置を交換させることを含む。
【0026】
一実施形態では、4-1BB共刺激ドメイン（例えば、配列番号：２、NP_000725.2に記載のアミノ酸配列の第２１４～２５５位に対応する）中のＴＴＱＥモチーフ（NP_000725.2に記載のアミノ酸配列の第２３４～２３７位に対応する）は、ＰＴＥＥまたはＰＥＥＥモチーフで置換される。一実施形態では、4-1BB共刺激ドメイン（例えば、配列番号：２、NP_000725.2に記載のアミノ酸配列の第２１４～２５５位に対応する）中のＰＥＥＥモチーフ（NP_000725.2に記載のアミノ酸配列の第２４６～２４９位に対応する）は、ＰＥＱＥ、ＴＥＱＥまたはTTQEモチーフで置換される。一実施形態では、4-1BB共刺激ドメイン中のＰＥＥＥモチーフは、ＰＥＱＥモチーフで置換される。一実施形態では、4-1BB共刺激ドメイン中のＴＴＱＥモチーフはＰＴＥＥモチーフで置換され、且つＰＥＥＥモチーフはＴＥＱＥモチーフで置換される。一実施形態では、4-1BB共刺激ドメイン中のＴＴＱＥモチーフはＰＥＥＥモチーフで置換され、且つＰＥＥＥモチーフはＴＴＱＥモチーフで置換され、すなわち、ＴＴＱＥモチーフとＰＥＥＥモチーフの位置が交換される。一実施形態では、4-1BB共刺激ドメイン中のＱＴＴＱＥ配列はＦＰＥＥＥ配列で置換され、ＦＰＥＥＥ配列はＱＴＴＱＥ配列で置換される。すなわち、ＴＴＱＥモチーフとＮ端のＱ残基の両方の位置を、PEEEモチーフとN端のF残基の両方の位置と交換する。
【0027】
一実施形態において、4-1BB共刺激ドメイン（例えば、配列番号：２）に、ＴＴＱＥおよび／またはＰＥＥＥモチーフを追加する。一実施形態において、4-1BB共刺激ドメインのN端またはＣ端、特にＣ端に、ＴＴＱＥおよび／またはＰＥＥＥモチーフを追加する。一実施形態において、4-1BB共刺激ドメインに、ＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳおよび／またはＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥ配列を追加する。一実施形態において、4-1BB共刺激ドメインのN端またはＣ端、特にＣ端に、ＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳおよび／またはＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥ配列を追加する。
【0028】
一実施形態において、4-1BB共刺激ドメイン（例えば、配列番号：２）に、ＴＲＡＦ２由来のＤＬＡＭＡＤＬＥＱＫＶ三量体化配列を追加する。一実施形態において、4-1BB共刺激ドメインのN端またはＣ端、特にＣ端に、ＤＬＡＭＡＤＬＥＱＫＶ三量体化配列を追加する。
【0029】
本発明はまた、前記方法によって得られた改変共刺激ドメインにも関する。
【0030】
３．改変共刺激ドメイン
【0031】
本発明の一態様は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の改変共刺激ドメインに関する。当該共刺激ドメインの天然配列と比較して、改変された共刺激ドメインは、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフ内の一つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含む。任意選択的に、改変された共刺激ドメインは、更に下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフのN端および/またはC端の一つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含んでもよい。
【0032】
本発明の一態様は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の改変共刺激ドメインに関する。当該共刺激ドメインの天然配列と比較して、改変された共刺激ドメインは、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフを追加または削除する。任意選択的に、改変された共刺激ドメインは、更に下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフのN端および/またはC端の一つまたは複数のアミノ酸残基を追加または削除してもよい。
【0033】
本発明の一態様は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の改変共刺激ドメインに関する。当該共刺激ドメインの天然配列と比較して、改変された共刺激ドメインは、下流のシグナル伝達分子中の多量体化（例えば、三量体化）に関与する一つまたは複数の配列を追加する。
【0034】
一実施形態では、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは、CD30、CD40、CD27、OX40、4-1BB、ATAR、LTβR、およびLMP1からなる群より選択される。一実施形態では、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは4-1BBである。一実施形態では、前記下流のシグナル伝達分子は、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5、およびTRAF6からなる群より選択される。一実施形態では、前記下流のシグナル伝達分子はＴＲＡＦ２である。一実施形態では、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは4-1BBであり、且つ前記下流のシグナル伝達分子はＴＲＡＦ２である。
【0035】
一実施形態では、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用するモチーフは、(P/S/A/T)X(Q/E)EおよびPXQXXDからなる群より選択され、ここで、Xは任意の天然アミノ酸である。一実施形態では、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用するモチーフは、(P/S/A/T)X(Q/E)Eであり、ここで、Xは任意の天然アミノ酸である。一実施形態では、前記置換により、天然に存在しないモチーフが得られる。一実施形態では、「天然に存在しないモチーフ」は、すべての腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーにおいて天然に存在しないモチーフを指す。一実施形態では、「天然に存在しないモチーフ」は、改変された腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーにおいて天然に存在しないモチーフを指す。一実施形態では、「天然に存在しないモチーフ」は、改変された腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーの改変位置に天然に存在しないモチーフを指す。
【0036】
一実施形態では、改変された共刺激ドメイン中の二つの異なるモチーフの位置は交換される。一実施形態では、改変された共刺激ドメイン中の二つの異なるモチーフの位置は交換され、且つ、二つの異なるモチーフのN端および/またはC端の一つまたは複数のアミノ酸残基とモチーフと共にその位置は交換される。
【0037】
一実施形態では、天然配列の4-1BB共刺激ドメイン（例えば、配列番号：２、NP_000725.2の第２１４～２５５位に対応する）と比較して、改変された4-1BB共刺激ドメインは、ＴＴＱＥモチーフ（NP_000725.2の第２３４～２３７位に対応する）から置換されたＰＴＥＥまたはＰＥＥＥモチーフを含む。一実施形態では、天然配列の4-1BB共刺激ドメイン（例えば、配列番号：２、NP_000725.2の第２１４～２５５位に対応する）と比較して、改変された4-1BB共刺激ドメインは、ＰＥＥＥモチーフ（NP_000725.2の第２４６～２４９位に対応する）から置換されたＰＥＱＥ、ＴＥＱＥまたはTTQEモチーフを含む。一実施形態では、改変された4-1BB共刺激ドメインは、ＰＥＥＥモチーフから置換されたＰＥＱＥモチーフを含む。一実施形態では、改変された4-1BB共刺激ドメインは、ＴＴＱＥモチーフから置換されたＰＴＥＥモチーフ、およびＰＥＥＥモチーフから置換されたＴＥＱＥモチーフを含む。一実施形態では、改変された4-1BB共刺激ドメインは、ＴＴＱＥモチーフから置換されたＰＥＥＥモチーフ、およびＰＥＥＥモチーフから置換されたＴＴＱＥモチーフを含む。一実施形態では、改変された4-1BB共刺激ドメインは、ＱＴＴＱＥ配列から置換されたＦＰＥＥＥ配列、およびＦＰＥＥＥ配列から置換されたＱＴＴＱＥ配列を含む。一実施形態では、改変された4-1BB共刺激ドメインは、配列番号：４、６または８に示されるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【0038】
一実施形態において、天然配列の4-1BB共刺激ドメイン（例えば、配列番号：２）と比較して、改変された4-1BB共刺激ドメインは、追加のＴＴＱＥおよび／またはＰＥＥＥモチーフを含む。一実施形態において、追加のＴＴＱＥおよび／またはＰＥＥＥモチーフは、4-1BB共刺激ドメインのN端またはＣ端、特にＣ端に追加される。一実施形態において、改変された4-1BB共刺激ドメインは、追加のＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳおよび／またはＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥ配列を含む。一実施形態において、追加のＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳおよび／またはＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥ配列は、4-1BB共刺激ドメインのN端またはＣ端、特にＣ端に追加される。一実施形態では、改変された4-1BB共刺激ドメインは、配列番号：１０または１２に示されるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【0039】
一実施形態において、天然配列の4-1BB共刺激ドメイン（例えば、配列番号：２）と比較して、改変された4-1BB共刺激ドメインは、ＴＲＡＦ２由来のＤＬＡＭＡＤＬＥＱＫＶ三量体化配列を含む。一実施形態において、ＤＬＡＭＡＤＬＥＱＫＶ三量体化配列は、4-1BB共刺激ドメインのN端またはＣ端、特にＣ端に追加される。一実施形態では、改変された4-1BB共刺激ドメインは、配列番号：１４に示されるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【0040】
４．キメラ抗原受容体を最適化する方法
【0041】
本発明の一態様は、キメラ抗原受容体を最適化する方法に関する。この方法は、一つのステップとして、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー（特に4-1BB）由来の共刺激ドメインを改変する上記の方法を含む。
【0042】
本発明のキメラ抗原受容体を最適化する方法（具体的には、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー（特に4-1BB）由来の共刺激ドメインを改変する方法）は、単独で、またはキメラ抗原受容体を最適化する他の方法（例えば、シグナル伝達ドメインを改変する方法）と組み合わせて使用することができる。
【0043】
本発明はまた、前記方法によって得られた最適化されたキメラ抗原受容体に関する。
【0044】
５．最適化されたキメラ抗原受容体
【0045】
本発明の一態様は、最適化されたキメラ抗原受容体に関する。このキメラ抗原受容体は、一つの部品として、上記の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー（特に4-1BB）由来の共刺激ドメインを含む。
【0046】
本発明の最適化されたキメラ抗原受容体は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー（特に4-1BB）由来の改変共刺激ドメインのだけでなく、改変シグナル伝達ドメインなどの他の改変された部品も含み得る。
【0047】
一実施形態では、本発明は、BCMAを標的する最適化されたキメラ抗原受容体を提供する。このキメラ抗原受容体は、
（1）BCMAを標的する抗原結合ドメイン、特に配列番号：１６の第２３～２６８位のアミノ酸、
（2）ヒンジ領域、特に配列番号：１６の第２６９～３１３位のアミノ酸、
（3）膜貫通領域、特に配列番号：１６の第３１４～３３７位のアミノ酸、
（4）共刺激ドメイン、特に配列番号：４、６、８、１０、１２と１４からなる群より選択されるアミノ酸配列；および
（5）シグナル伝達ドメイン、特に配列番号：１６の第３８０～４９１位のアミノ酸
を含む。
（1）BCMAを標的する抗原結合ドメイン、特に配列番号：１６の第２３～２６８位のアミノ酸、
（2）ヒンジ領域、特に配列番号：１６の第２６９～３１３位のアミノ酸、
（3）膜貫通領域、特に配列番号：１６の第３１４～３３７位のアミノ酸、
（4）共刺激ドメイン、特に配列番号：４、６、８、１０、１２と１４からなる群より選択されるアミノ酸配列；および
（5）シグナル伝達ドメイン、特に配列番号：１６の第３８０～４９１位のアミノ酸
を含む。
【0048】
特に明記しない限り、本明細書に記載の技術案は任意に組み合わせることができる。
【0049】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【0050】
実施例
実施例１ 共刺激シグナルドメインの改変と最適化
この実施例では、Bluebird特許(US20180085444A1)の単鎖抗体に基づいて構築された、B細胞成熟抗原(BCMA)を標的するCAR(BCMA CAR)分子の4-1BB共刺激ドメインの改変と最適化を、例とした。改変原則:4-1BB共刺激ドメインの性質と機能を変更することなく、CAR-T細胞の自己活性化の可能性を減らし、細胞内への4-1BBシグナル伝達の効率を高め、CAR-T細胞を促進してより多くのメモリーT細胞(CAR-Tcm)、ナイーブT細胞(CAR-Tnaive)、幹細胞様メモリーT細胞(CAR-Tscm)サブグループ(まとめてTcnsと呼ばれる)を生成させ、CAR-T細胞の体内生存時間を延長し、CAR-T細胞の抗腫瘍能力を高めた。
実施例１ 共刺激シグナルドメインの改変と最適化
この実施例では、Bluebird特許(US20180085444A1)の単鎖抗体に基づいて構築された、B細胞成熟抗原(BCMA)を標的するCAR(BCMA CAR)分子の4-1BB共刺激ドメインの改変と最適化を、例とした。改変原則:4-1BB共刺激ドメインの性質と機能を変更することなく、CAR-T細胞の自己活性化の可能性を減らし、細胞内への4-1BBシグナル伝達の効率を高め、CAR-T細胞を促進してより多くのメモリーT細胞(CAR-Tcm)、ナイーブT細胞(CAR-Tnaive)、幹細胞様メモリーT細胞(CAR-Tscm)サブグループ(まとめてTcnsと呼ばれる)を生成させ、CAR-T細胞の体内生存時間を延長し、CAR-T細胞の抗腫瘍能力を高めた。
【0051】
元のBCMA CAR分子のヌクレオチド配列は配列番号：１５、アミノ酸配列は配列番号：１６に示される。
【0052】
未改変の4-1BB共刺激シグナルドメインについて、BCMA CARの4-1BB共刺激シグナルドメインのヌクレオチド配列は配列番号：１、アミノ酸配列は配列番号：２に示される。
【0053】
改変された4-1BB共刺激シグナルドメインについて、BCMA CAR-B５共刺激シグナルドメインのヌクレオチド配列は配列番号：３、アミノ酸配列は配列番号：４に示される；BCMA CAR-B６共刺激シグナルドメインのヌクレオチド配列は配列番号：５、アミノ酸配列は配列番号：６に示される；BCMA CAR-B７共刺激シグナルドメインのヌクレオチド配列は配列番号：７、アミノ酸配列は配列番号：８に示される；BCMA CAR-B８共刺激シグナルドメインのヌクレオチド配列は配列番号：９、アミノ酸配列は配列番号：１０に示される；BCMA CAR-B９共刺激シグナルドメインのヌクレオチド配列は配列番号：１１、アミノ酸配列は配列番号：１２に示される；BCMA CAR-B１１共刺激シグナルドメインのヌクレオチド配列は配列番号：１３、アミノ酸配列は配列番号：１４に示される。
【0054】
上記各態様のヌクレオチド配列は、遺伝子合成方法によって合成され、次いで他の配列と架橋されて、最終的にCARをコードする分子を形成する。CARをコードする分子を、レンチウイルスベクターpLenti6.3/V5(Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)に挿入した(図２)。
【0055】
T細胞は健康なボランティア（Miaotong（Shanghai）Biotechnology Co., Ltd.、China）の末梢血単核細胞から分離された。単離・精製されたT細胞をX-VIVO１５培地（Lonza，Switzerland)に1.0×106細胞/mlで接種・培養し、1：１のT細胞数とCD3/CD28 Dynabeads（Thermo Fisher）の比率でDynabeadsを培養システムに添加し、さらにIL-2（Shandong Jintai Bioengineering Co., Ltd.、China）（500 IU/ml）を添加し、48時間培養後、未改変または改変の4-1BBを含むCARをレンチウイルスによってT細胞に形質導入した。ウイルス感染の24時間後、細胞を遠心分離して培地を交換し、IL-2（500 IU/ml）を含む新鮮なX-VIVO１５を加えて培養を続けた。細胞培養の4日後、培養システム内のすべての細胞を収集し、培養システム内のDynabeadsを磁気スタンドで取り出し、T細胞を遠心分離して計数し、各グループの細胞のCAR含有量をフローサイトメトリー（NovoCyte 2060R，ACEA Biosciences，San Diego，CA 92121，USA）で検出した後、5:1のCAR-T細胞とNCI H929細胞(National Experimental Cell Resource Sharing Platform、中国)の比率で、NCI H929を追加して共培養した。CAR-T細胞を16日目まで培養し、対応細胞サンプルをフローサイトメトリーで検出し、CAR発現率、CAR-T細胞中のCD4+細胞、CD8+細胞、CCR7+CD62L+細胞の割合、およびCAR-T細胞の免疫枯渇分子PD1、LAG3の発現を分析し、腫瘍細胞殺傷実験を行った。以上は、基本的に先行記録を参照して実行された（Sallusto et al., Nature 401(6754): 708, 1999）。
【0056】
結果を図３～７に示す。図３は、4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインが改変されたBCMA CAR-T-B11が、CAR-T細胞の増殖を約３分の２加速させできることを示す。その結果、体内での腫瘍の殺傷速度を高め、体外で臨床に使用される細胞の調製に必要な時間を短縮し、患者の待ち時間を短縮し、病気を治すチャンスを増加させ、患者の治療費を抑えることができる。図4は、4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインが改変されたBCMA CAR-T-B6およびBCMA CAR-T-B7が、CAR-T細胞中のCD8+CAR-T細胞の割合を約１倍増加させ、対応CAR-T細胞の腫瘍細胞に対する殺傷能力を高めできることを示す。図５は、4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインが改変されたBCMA CAR-T-B5、BCMA CAR-T-B7、BCMA CAR-T-B8、BCMA CAR-T-B9、およびBCMA CAR-T-B11が、CAR-T細胞中のCAR-Tcnsの割合を約30%増加させ、対応CAR-T細胞の体内での生存期間を延長し、疾患再発のリスクを軽減し得ることを示す。図６は、4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインの改変が、対応CAR-T細胞の枯渇状態に有意な影響を与えなかったであり、対応CAR-T細胞の殺傷効率と体内での生存期間を改善しながら、細胞の枯渇状態に影響を与えないことを示す。図７は、4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインが改変された対応BCMA CAR-T-B6および BCMA CAR-T-B7が殺傷効果を約10%増加させることができることを示す。これは、患者が完全緩和を達成し、疾患の再発を減らすのに非常に重要である。
【0057】
結論として、4-1BB共刺激シグナル伝達ドメインが改変されたCAR-Tは、その体外細胞増殖、サブグループの分布、細胞枯渇、および腫瘍細胞殺傷に顕著な改善を実現した。
【0058】
この明細書は、当業者が本発明を実施できるようにするのに十分である。実施例は、例示のみを目的として提供されており、本発明の範囲を限定することを意図していない。実際、本明細書に記載されている内容に加えて、本発明の様々な改変は、当業者にとって明らかであり、添付の特許請求の範囲内にある。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の改変共刺激ドメインであって、
天然配列と比較して、前記改変共刺激ドメインは、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフ内の一つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含み、
任意選択的に、前記改変共刺激ドメインは、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフのN末端および/またはC末端の一つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含み、
任意選択的に、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは、CD30、CD40、CD27、OX40、4-1BB、ATAR、LTβR、およびLMP1からなる群より選択され、および/または前記下流のシグナル伝達分子は、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5、およびTRAF6からなる群より選択され、特に、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは4-1BBであり、且つ前記下流のシグナル伝達分子はＴＲＡＦ２であり、
任意選択的に、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用するモチーフは、(P/S/A/T)X(Q/E)EおよびPXQXXDからなる群より選択され、ここで、Xは任意の天然アミノ酸であり、前記置換により、前記改変腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーの改変位置に天然に存在しないモチーフが生成され、
任意選択的に、前記改変共刺激ドメインでは、2つの異なるモチーフが位置を交換している、
ことを特徴とする、改変共刺激ドメイン。
〔２〕前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは4-1BBであり、改変された4-1BB共刺激ドメインは、TTQEモチーフから置換されたPTEEまたはPEEEモチーフ、および/またはPEEEモチーフから置換されたPEQE、TEQE、またはTTQEモチーフを含む、前記〔１〕に記載の改変共刺激ドメイン。
〔３〕改変された4-1BB共刺激ドメインは、ＱＴＴＱＥモチーフから置換されたＦＰＥＥＥモチーフおよび／またはＦＰＥＥＥモチーフから置換されたＱＴＴＱＥモチーフを含む、前記〔２〕に記載の改変共刺激ドメイン。
〔４〕改変された4-1BB共刺激ドメインは、配列番号：４、６または８に示されるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、前記〔２〕に記載の改変共刺激ドメイン。
〔５〕腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の改変共刺激ドメインであって、
天然配列と比較して、前記改変共刺激ドメインは、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフを追加または削除し、
任意選択的に、前記改変共刺激ドメインは、下流のシグナル伝達分子と相互作用する前記モチーフのN末端および/またはC末端の一つまたは複数のアミノ酸残基を追加または削除し、
任意選択的に、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは、CD30、CD40、CD27、OX40、4-1BB、ATAR、LTβR、およびLMP1からなる群より選択され、および/または前記下流のシグナル伝達分子は、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5、およびTRAF6からなる群より選択され、特に、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは4-1BBであり、且つ前記下流のシグナル伝達分子はＴＲＡＦ２であり、
任意選択的に、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用するモチーフは、(P/S/A/T)X(Q/E)EおよびPXQXXDからなる群より選択され、ここで、Xは任意の天然アミノ酸である、
ことを特徴とする、改変共刺激ドメイン。
〔６〕前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは4-1BBであり、改変された4-1BB共刺激ドメインは、追加のTTQEおよび/またはPEEEモチーフを含む、前記〔５〕に記載の改変共刺激ドメイン。
〔７〕改変された4-1BB共刺激ドメインは、追加のVQTTQEEDGCSおよび/またはRFPEEEEGGCE配列を含む、前記〔６〕に記載の改変共刺激ドメイン。
〔８〕改変された4-1BB共刺激ドメインは、配列番号：１０又は１２に示されるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、前記〔６〕に記載の改変共刺激ドメイン。
〔９〕腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の改変共刺激ドメインであって、
天然配列と比較して、前記改変共刺激ドメインには、下流のシグナル伝達分子由来の多量体化に関連する一つまたは複数の配列が追加されており、
任意選択的に、前記多量体化は三量体化であり、
任意選択的に、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは、CD30、CD40、CD27、OX40、4-1BB、ATAR、LTβR、およびLMP1からなる群より選択され、および/または前記下流のシグナル伝達分子は、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5、およびTRAF6からなる群より選択され、特に、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは4-1BBあり、且つ前記下流のシグナル伝達分子はＴＲＡＦ２である、
ことを特徴とする、改変共刺激ドメイン。
〔１０〕前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは4-1BBであり、改変された4-1BB共刺激ドメインは、TRAF2由来のDLAMADLEQKV三量体化配列を含む、前記〔９〕に記載の改変共刺激ドメイン。
〔１１〕改変された4-1BB共刺激ドメインは、配列番号：１４に示されるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、前記〔１０〕に記載の改変共刺激ドメイン。
〔１２〕腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメインを改変する方法であって、
共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフ内の一つまたは複数のアミノ酸残基を置換する工程、および/または
共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフを追加または削除する工程、および/または
共刺激ドメインに、下流のシグナル伝達分子由来の多量体化に関与する一つまたは複数の配列を追加する工程を含む、
ことを特徴とする、方法。
〔１３〕前記〔１〕から〔１１〕のいずれか一項に記載の改変共刺激ドメインまたは前記〔１２〕に記載の方法によって得られた改変共刺激ドメインを含む、キメラ抗原受容体。
〔１４〕前記〔１３〕に記載のキメラ抗原受容体を含む、動物細胞。
〔１５〕腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体を最適化する方法であって、
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフ内の一つまたは複数のアミノ酸残基を置換する工程、および/または
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフを追加または削除する工程、および/または
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメインに、下流のシグナル伝達分子由来の多量体化に関与する一つまたは複数の配列を追加する工程を含む、
ことを特徴とする、方法。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の改変共刺激ドメインであって、
天然配列と比較して、前記改変共刺激ドメインは、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフ内の一つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含み、
任意選択的に、前記改変共刺激ドメインは、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフのN末端および/またはC末端の一つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含み、
任意選択的に、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは、CD30、CD40、CD27、OX40、4-1BB、ATAR、LTβR、およびLMP1からなる群より選択され、および/または前記下流のシグナル伝達分子は、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5、およびTRAF6からなる群より選択され、特に、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは4-1BBであり、且つ前記下流のシグナル伝達分子はＴＲＡＦ２であり、
任意選択的に、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用するモチーフは、(P/S/A/T)X(Q/E)EおよびPXQXXDからなる群より選択され、ここで、Xは任意の天然アミノ酸であり、前記置換により、前記改変腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーの改変位置に天然に存在しないモチーフが生成され、
任意選択的に、前記改変共刺激ドメインでは、2つの異なるモチーフが位置を交換している、
ことを特徴とする、改変共刺激ドメイン。
〔２〕前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは4-1BBであり、改変された4-1BB共刺激ドメインは、TTQEモチーフから置換されたPTEEまたはPEEEモチーフ、および/またはPEEEモチーフから置換されたPEQE、TEQE、またはTTQEモチーフを含む、前記〔１〕に記載の改変共刺激ドメイン。
〔３〕改変された4-1BB共刺激ドメインは、ＱＴＴＱＥモチーフから置換されたＦＰＥＥＥモチーフおよび／またはＦＰＥＥＥモチーフから置換されたＱＴＴＱＥモチーフを含む、前記〔２〕に記載の改変共刺激ドメイン。
〔４〕改変された4-1BB共刺激ドメインは、配列番号：４、６または８に示されるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、前記〔２〕に記載の改変共刺激ドメイン。
〔５〕腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の改変共刺激ドメインであって、
天然配列と比較して、前記改変共刺激ドメインは、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフを追加または削除し、
任意選択的に、前記改変共刺激ドメインは、下流のシグナル伝達分子と相互作用する前記モチーフのN末端および/またはC末端の一つまたは複数のアミノ酸残基を追加または削除し、
任意選択的に、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは、CD30、CD40、CD27、OX40、4-1BB、ATAR、LTβR、およびLMP1からなる群より選択され、および/または前記下流のシグナル伝達分子は、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5、およびTRAF6からなる群より選択され、特に、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは4-1BBであり、且つ前記下流のシグナル伝達分子はＴＲＡＦ２であり、
任意選択的に、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用するモチーフは、(P/S/A/T)X(Q/E)EおよびPXQXXDからなる群より選択され、ここで、Xは任意の天然アミノ酸である、
ことを特徴とする、改変共刺激ドメイン。
〔６〕前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは4-1BBであり、改変された4-1BB共刺激ドメインは、追加のTTQEおよび/またはPEEEモチーフを含む、前記〔５〕に記載の改変共刺激ドメイン。
〔７〕改変された4-1BB共刺激ドメインは、追加のVQTTQEEDGCSおよび/またはRFPEEEEGGCE配列を含む、前記〔６〕に記載の改変共刺激ドメイン。
〔８〕改変された4-1BB共刺激ドメインは、配列番号：１０又は１２に示されるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、前記〔６〕に記載の改変共刺激ドメイン。
〔９〕腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の改変共刺激ドメインであって、
天然配列と比較して、前記改変共刺激ドメインには、下流のシグナル伝達分子由来の多量体化に関連する一つまたは複数の配列が追加されており、
任意選択的に、前記多量体化は三量体化であり、
任意選択的に、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは、CD30、CD40、CD27、OX40、4-1BB、ATAR、LTβR、およびLMP1からなる群より選択され、および/または前記下流のシグナル伝達分子は、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF5、およびTRAF6からなる群より選択され、特に、前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは4-1BBあり、且つ前記下流のシグナル伝達分子はＴＲＡＦ２である、
ことを特徴とする、改変共刺激ドメイン。
〔１０〕前記腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーは4-1BBであり、改変された4-1BB共刺激ドメインは、TRAF2由来のDLAMADLEQKV三量体化配列を含む、前記〔９〕に記載の改変共刺激ドメイン。
〔１１〕改変された4-1BB共刺激ドメインは、配列番号：１４に示されるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、前記〔１０〕に記載の改変共刺激ドメイン。
〔１２〕腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメインを改変する方法であって、
共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフ内の一つまたは複数のアミノ酸残基を置換する工程、および/または
共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフを追加または削除する工程、および/または
共刺激ドメインに、下流のシグナル伝達分子由来の多量体化に関与する一つまたは複数の配列を追加する工程を含む、
ことを特徴とする、方法。
〔１３〕前記〔１〕から〔１１〕のいずれか一項に記載の改変共刺激ドメインまたは前記〔１２〕に記載の方法によって得られた改変共刺激ドメインを含む、キメラ抗原受容体。
〔１４〕前記〔１３〕に記載のキメラ抗原受容体を含む、動物細胞。
〔１５〕腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体を最適化する方法であって、
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフ内の一つまたは複数のアミノ酸残基を置換する工程、および/または
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメイン中の、下流のシグナル伝達分子と相互作用する一つまたは複数のモチーフを追加または削除する工程、および/または
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー由来の共刺激ドメインに、下流のシグナル伝達分子由来の多量体化に関与する一つまたは複数の配列を追加する工程を含む、
ことを特徴とする、方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】