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特許7439498アフィニティ担体、クロマトグラフィーカラム、及び抗体又はその断片の単離方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-19
(45)【発行日】2024-02-28
(54)【発明の名称】アフィニティ担体、クロマトグラフィーカラム、及び抗体又はその断片の単離方法
(51)【国際特許分類】
C07K 1/22 20060101AFI20240220BHJP
C07K 14/31 20060101ALI20240220BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240220BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240220BHJP
【ＦＩ】
C07K1/22 ZNA
C07K14/31
C07K19/00
C12M1/00 Z
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2019230471
(22)【出願日】2019-12-20
(65)【公開番号】P2021098660
(43)【公開日】2021-07-01
【審査請求日】2022-06-14
(73)【特許権者】
【識別番号】000004178
【氏名又は名称】ＪＳＲ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】金原 雅晃
(72)【発明者】
【氏名】小林 邦彦
(72)【発明者】
【氏名】西田 貴也
【審査官】田ノ上 拓自
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１７－０３７０６９（ＪＰ，Ａ）
【文献】TOSOH Research & Technology Review, 2014年，Vol.58，p.31-34
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｍ １／００－３／１０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
多孔質粒子と、当該多孔質粒子に結合されたイムノグロブリン結合タンパク質とを備えるアフィニティ担体であって、湿潤状態での空孔率が７０～９５％（ｖ／ｖ）であり、
湿潤状態での平均細孔径が２２～３５ｎｍであり、
湿潤状態での見掛密度が１００～２００ｇ／Ｌであり、
前記イムノグロブリン結合タンパク質が、ポリペプチド鎖を含み、
前記ポリペプチド鎖が、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、及び配列番号３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列であり、
前記イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる前記ポリペプチド鎖の数が３～１０個である、アフィニティ担体。
【請求項2】
前記多孔質粒子が合成高分子系多孔質粒子であり、当該合成高分子系多孔質粒子が、多官能ビニルモノマー由来の構造単位及びモノビニルモノマー由来の構造単位を有するポリマーを含み、前記多官能ビニルモノマーが、芳香族系多官能ビニルモノマーである、請求項１に記載の担体。
【請求項3】
前記多孔質粒子が多糖類系多孔質粒子である、請求項１に記載の担体。
【請求項4】
前記空孔率が８０～９０％（ｖ／ｖ）である、請求項１～３のいずれか１項に記載の担体。
【請求項5】
平均粒子径が３０～１００μｍである、請求項１～４のいずれか１項に記載の担体。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載の担体を含む、クロマトグラフィーカラム。
【請求項7】
請求項１～５のいずれか１項に記載の担体又は請求項７に記載のクロマトグラフィーカラムを用いる、抗体又はその断片の単離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アフィニティ担体、クロマトグラフィーカラム、及び抗体又はその断片の単離方法に関する。
【背景技術】
【0002】
アフィニティクロマトグラフィーは、イオンクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー等の他のクロマトグラフィーに比べて、高収率且つ高速で経済的な単離が可能なため、抗体等の単離に広く用いられている。
【0003】
アフィニティクロマトグラフィーを用いて抗体やその断片を単離する場合、アフィニティクロマトグラフィーに使用されるアフィニティ担体には、抗体やその断片に対する動的結合容量を備えることが求められる。例えば、メジアン粒径を特定範囲に調整するなどすることで、抗体に対する動的結合容量を大きくした担体が知られているが（特許文献１）、動的結合容量の更なる改善が要求されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特表２００８－５２３１４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の課題は、抗体又はその断片に対する動的結合容量が大きいアフィニティ担体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
そこで、本発明者らは鋭意検討した結果、特定のポリペプチド鎖を２～１０個含むイムノグロブリン結合タンパク質が多孔質粒子に結合され、且つ湿潤状態での空孔率が７０～９５％（ｖ／ｖ）であるアフィニティ担体が、抗体又はその断片に対する動的結合容量が大きいものであることを見出し、本発明を完成した。
【0007】
すなわち、本発明は、以下の＜１＞～＜７＞を提供するものである。
＜１＞ 多孔質粒子と、当該多孔質粒子に結合されたイムノグロブリン結合タンパク質とを備えるアフィニティ担体であって、湿潤状態での空孔率が７０～９５％（ｖ／ｖ）であり、前記イムノグロブリン結合タンパク質が、ポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖が、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列、及びそれらの変異体配列から選ばれるアミノ酸配列であり、前記イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる前記ポリペプチド鎖の数が２～１０個である、アフィニティ担体（以下、本発明のアフィニティ担体とも称する）。
＜１＞ 多孔質粒子と、当該多孔質粒子に結合されたイムノグロブリン結合タンパク質とを備えるアフィニティ担体であって、湿潤状態での空孔率が７０～９５％（ｖ／ｖ）であり、前記イムノグロブリン結合タンパク質が、ポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖が、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列、及びそれらの変異体配列から選ばれるアミノ酸配列であり、前記イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる前記ポリペプチド鎖の数が２～１０個である、アフィニティ担体（以下、本発明のアフィニティ担体とも称する）。
【0008】
＜２＞ 前記ポリペプチド鎖の数が３～１０個である、＜１＞に記載の担体。
＜３＞ 湿潤状態での平均細孔径が２２～３５ｎｍである、＜１＞又は＜２＞に記載の担体。
＜４＞ 前記空孔率が８０～９０％（ｖ／ｖ）である、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の担体。
＜５＞ 平均粒子径が３０～１００μｍである、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の担体。
＜３＞ 湿潤状態での平均細孔径が２２～３５ｎｍである、＜１＞又は＜２＞に記載の担体。
＜４＞ 前記空孔率が８０～９０％（ｖ／ｖ）である、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の担体。
＜５＞ 平均粒子径が３０～１００μｍである、＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の担体。
【0009】
＜６＞ ＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の担体を含む、クロマトグラフィーカラム（以下、本発明のクロマトグラフィーカラムとも称する）。
＜７＞ ＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の担体又は＜６＞に記載のクロマトグラフィーカラムを用いる、抗体又はその断片の単離方法（以下、本発明の抗体又はその断片の単離方法とも称する）。
＜７＞ ＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の担体又は＜６＞に記載のクロマトグラフィーカラムを用いる、抗体又はその断片の単離方法（以下、本発明の抗体又はその断片の単離方法とも称する）。
【発明の効果】
【0010】
本発明のアフィニティ担体は、抗体又はその断片に対する動的結合容量が大きい。したがって、本発明によれば、抗体又はその断片に対する動的結合容量が大きいクロマトグラフィーカラムを提供できる。
【発明を実施するための形態】
【0011】
＜アフィニティ担体＞
本発明のアフィニティ担体は、多孔質粒子と、当該多孔質粒子に結合されたイムノグロブリン結合タンパク質とを備えるアフィニティ担体であって、湿潤状態での空孔率が７０～９５％（ｖ／ｖ）であり、前記イムノグロブリン結合タンパク質が、ポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖が、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列、及びそれらの変異体配列から選ばれるアミノ酸配列であり、前記イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる前記ポリペプチド鎖の数が２～１０個であることを特徴とするものである。
なお、本明細書において、数値範囲を表すａ～ｂ等の記載は、ａ以上、ｂ以下と同義であり、ａ及びｂを数値範囲内に含む。また、本明細書において、「アフィニティ担体」とは、担体が備えるイムノグロブリン結合タンパク質に、単離の標的物質である抗体（イムノグロブリン）又はその断片が、特異的な分子間の親和力（アフィニティ）に基づいて結合することを利用した担体をいう。
本発明のアフィニティ担体は、多孔質粒子と、当該多孔質粒子に結合されたイムノグロブリン結合タンパク質とを備えるアフィニティ担体であって、湿潤状態での空孔率が７０～９５％（ｖ／ｖ）であり、前記イムノグロブリン結合タンパク質が、ポリペプチド鎖を含み、前記ポリペプチド鎖が、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列、及びそれらの変異体配列から選ばれるアミノ酸配列であり、前記イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる前記ポリペプチド鎖の数が２～１０個であることを特徴とするものである。
なお、本明細書において、数値範囲を表すａ～ｂ等の記載は、ａ以上、ｂ以下と同義であり、ａ及びｂを数値範囲内に含む。また、本明細書において、「アフィニティ担体」とは、担体が備えるイムノグロブリン結合タンパク質に、単離の標的物質である抗体（イムノグロブリン）又はその断片が、特異的な分子間の親和力（アフィニティ）に基づいて結合することを利用した担体をいう。
【0012】
（空孔率）
本発明のアフィニティ担体の湿潤状態での空孔率は、７０～９５％（ｖ／ｖ）である。湿潤状態での空孔率をこのような範囲とすることによって、抗体及びその断片に対する動的結合容量が大きくなる。
湿潤状態での空孔率は、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは７５％（ｖ／ｖ）以上、より好ましくは７８％（ｖ／ｖ）以上、更に好ましくは８０％（ｖ／ｖ）以上、特に好ましくは８４％（ｖ／ｖ）以上であり、また、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは９３％（ｖ／ｖ）以下、より好ましくは９２％（ｖ／ｖ）以下、特に好ましくは９０％（ｖ／ｖ）以下である。具体的な範囲としては、７５～９３％（ｖ／ｖ）が好ましく、７８～９２％（ｖ／ｖ）がより好ましく、８０～９０％（ｖ／ｖ）が更に好ましく、８４～９０％（ｖ／ｖ）が特に好ましい。
本明細書において、湿潤状態での空孔率は、湿潤状態で測定したときの多孔質粒子の非空孔部と多孔質粒子の空孔部とイムノグロブリン結合タンパク質との合計体積に対する多孔質粒子の空孔部の体積の割合を意味し、例えば、カラム容器に充填したときのアフィニティ担体の容積、担体の容積を求めたカラムに５００ｍＭ 塩化ナトリウム水溶液５０μＬを打ち込んだときの塩化ナトリウムの溶出体積、及び担体の容積を求めたカラムにデキストランを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液５０μＬを打ち込んだときのデキストランの溶出体積から求めることができる。具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い測定すればよい。
本発明のアフィニティ担体の湿潤状態での空孔率は、７０～９５％（ｖ／ｖ）である。湿潤状態での空孔率をこのような範囲とすることによって、抗体及びその断片に対する動的結合容量が大きくなる。
湿潤状態での空孔率は、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは７５％（ｖ／ｖ）以上、より好ましくは７８％（ｖ／ｖ）以上、更に好ましくは８０％（ｖ／ｖ）以上、特に好ましくは８４％（ｖ／ｖ）以上であり、また、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは９３％（ｖ／ｖ）以下、より好ましくは９２％（ｖ／ｖ）以下、特に好ましくは９０％（ｖ／ｖ）以下である。具体的な範囲としては、７５～９３％（ｖ／ｖ）が好ましく、７８～９２％（ｖ／ｖ）がより好ましく、８０～９０％（ｖ／ｖ）が更に好ましく、８４～９０％（ｖ／ｖ）が特に好ましい。
本明細書において、湿潤状態での空孔率は、湿潤状態で測定したときの多孔質粒子の非空孔部と多孔質粒子の空孔部とイムノグロブリン結合タンパク質との合計体積に対する多孔質粒子の空孔部の体積の割合を意味し、例えば、カラム容器に充填したときのアフィニティ担体の容積、担体の容積を求めたカラムに５００ｍＭ 塩化ナトリウム水溶液５０μＬを打ち込んだときの塩化ナトリウムの溶出体積、及び担体の容積を求めたカラムにデキストランを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液５０μＬを打ち込んだときのデキストランの溶出体積から求めることができる。具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い測定すればよい。
【0013】
（平均細孔径）
本発明のアフィニティ担体の湿潤状態での平均細孔径は、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは１５ｎｍ以上、より好ましくは１８ｎｍ以上、更に好ましくは２２ｎｍ以上、特に好ましくは２３ｎｍ以上であり、また、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは４５ｎｍ以下、より好ましくは４０ｎｍ以下、更に好ましくは３５ｎｍ以下、更に好ましくは２７ｎｍ以下であり、特に好ましくは２６ｎｍ以下である。具体的な範囲としては、１５～４５ｎｍが好ましく、１８～４０ｎｍがより好ましく、２２～３５ｎｍが更に好ましく、２２～２７ｎｍが更に好ましく、２３～２６ｎｍが特に好ましい。
本明細書において、アフィニティ担体の湿潤状態での平均細孔径は、“Ｈａｇｅｌ，ｅｔ．ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，Ｖｏｌ．７４３（１９９６）３２－４２”に記載の方法を用いて湿潤状態で測定したときの平均細孔径を意味し、例えば、カラム容器に充填したときのアフィニティ担体の容積、担体の容積を求めたカラムに５００ｍＭ 塩化ナトリウム水溶液５０μＬを打ち込んだときの塩化ナトリウムの溶出体積、担体の容積を求めたカラムにデキストランを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液５０μＬを打ち込んだときのデキストランの溶出体積、及びプルランのスタンダードサンプルを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液５０μＬを打ち込んだときのプルランの溶出体積から求めることができる。具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い測定すればよい。
本発明のアフィニティ担体の湿潤状態での平均細孔径は、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは１５ｎｍ以上、より好ましくは１８ｎｍ以上、更に好ましくは２２ｎｍ以上、特に好ましくは２３ｎｍ以上であり、また、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは４５ｎｍ以下、より好ましくは４０ｎｍ以下、更に好ましくは３５ｎｍ以下、更に好ましくは２７ｎｍ以下であり、特に好ましくは２６ｎｍ以下である。具体的な範囲としては、１５～４５ｎｍが好ましく、１８～４０ｎｍがより好ましく、２２～３５ｎｍが更に好ましく、２２～２７ｎｍが更に好ましく、２３～２６ｎｍが特に好ましい。
本明細書において、アフィニティ担体の湿潤状態での平均細孔径は、“Ｈａｇｅｌ，ｅｔ．ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，Ｖｏｌ．７４３（１９９６）３２－４２”に記載の方法を用いて湿潤状態で測定したときの平均細孔径を意味し、例えば、カラム容器に充填したときのアフィニティ担体の容積、担体の容積を求めたカラムに５００ｍＭ 塩化ナトリウム水溶液５０μＬを打ち込んだときの塩化ナトリウムの溶出体積、担体の容積を求めたカラムにデキストランを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液５０μＬを打ち込んだときのデキストランの溶出体積、及びプルランのスタンダードサンプルを含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液５０μＬを打ち込んだときのプルランの溶出体積から求めることができる。具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い測定すればよい。
【0014】
（体積平均粒子径）
本発明のアフィニティ担体の平均粒子径は、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは３０μｍ以上、より好ましくは３５μｍ以上、特に好ましくは４０μｍ以上であり、また、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは９０μｍ以下、特に好ましくは８０μｍ以下である。具体的な範囲としては、３０～１００μｍが好ましく、３５～９０μｍがより好ましく、４０～８０μｍが特に好ましい。
本明細書において、アフィニティ担体の平均粒子径は、ＪＩＳ Ｚ ８８２５（２０１３）に従いレーザ回折散乱法で測定される体積平均粒子径をいう。具体的には、後述する実施例に記載の方法のようにして、ＪＩＳ Ｚ ８８２５（２０１３）に従って、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置（例えば、ベックマン・コールター社製 ＬＳ１３３２０等）により体積基準の粒径分布を測定することで求めることができる。
また、体積平均粒子径の変動係数は、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下である。変動係数は、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置で測定される値をいう。
本発明のアフィニティ担体の平均粒子径は、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは３０μｍ以上、より好ましくは３５μｍ以上、特に好ましくは４０μｍ以上であり、また、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは９０μｍ以下、特に好ましくは８０μｍ以下である。具体的な範囲としては、３０～１００μｍが好ましく、３５～９０μｍがより好ましく、４０～８０μｍが特に好ましい。
本明細書において、アフィニティ担体の平均粒子径は、ＪＩＳ Ｚ ８８２５（２０１３）に従いレーザ回折散乱法で測定される体積平均粒子径をいう。具体的には、後述する実施例に記載の方法のようにして、ＪＩＳ Ｚ ８８２５（２０１３）に従って、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置（例えば、ベックマン・コールター社製 ＬＳ１３３２０等）により体積基準の粒径分布を測定することで求めることができる。
また、体積平均粒子径の変動係数は、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下である。変動係数は、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置で測定される値をいう。
【0015】
（見掛密度）
本発明のアフィニティ担体の湿潤状態での見掛密度は、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは８０ｇ／Ｌ以上、より好ましくは９０ｇ／Ｌ以上、特に好ましくは１００ｇ／Ｌ以上であり、また、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは４００ｇ／Ｌ以下、より好ましくは３００ｇ／Ｌ以下、更に好ましくは２５０ｇ／Ｌ以下、特に好ましくは２００ｇ／Ｌ以下である。具体的な範囲としては、８０～４００ｇ／Ｌが好ましく、９０～３００ｇ／Ｌがより好ましく、１００～２５０ｇ／Ｌが更に好ましく、１００～２００ｇ／Ｌが特に好ましい。
本明細書において、アフィニティ担体の湿潤状態での見掛密度は、例えば、粒子状のアフィニティ担体を水に分散させたスラリーを加えたメスシリンダー内でアフィニティ担体を沈降させ、アフィニティ担体の重量をアフィニティ担体の沈降体積で割ることにより求めることができる。具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い測定すればよい。
本発明のアフィニティ担体の湿潤状態での見掛密度は、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは８０ｇ／Ｌ以上、より好ましくは９０ｇ／Ｌ以上、特に好ましくは１００ｇ／Ｌ以上であり、また、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは４００ｇ／Ｌ以下、より好ましくは３００ｇ／Ｌ以下、更に好ましくは２５０ｇ／Ｌ以下、特に好ましくは２００ｇ／Ｌ以下である。具体的な範囲としては、８０～４００ｇ／Ｌが好ましく、９０～３００ｇ／Ｌがより好ましく、１００～２５０ｇ／Ｌが更に好ましく、１００～２００ｇ／Ｌが特に好ましい。
本明細書において、アフィニティ担体の湿潤状態での見掛密度は、例えば、粒子状のアフィニティ担体を水に分散させたスラリーを加えたメスシリンダー内でアフィニティ担体を沈降させ、アフィニティ担体の重量をアフィニティ担体の沈降体積で割ることにより求めることができる。具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い測定すればよい。
【0016】
（多孔質粒子）
本発明のアフィニティ担体は、多孔質粒子を備える。
多孔質粒子としては、合成高分子系多孔質粒子、天然高分子系多孔質粒子等の有機系多孔質粒子；無機系多孔質粒子；これらを組み合わせた有機－有機複合系多孔質粒子や有機－無機複合系多孔質粒子等が挙げられる。天然高分子系多孔質粒子としては、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン等の多糖類系多孔質粒子（好ましくは架橋多糖類系多孔質粒子）が挙げられる。多糖類の中では、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、アガロースが特に好ましい。無機系多孔質粒子としては、ガラス、シリカゲル、金属、金属酸化物等で構成されるものが挙げられる。
これら多孔質粒子の中では、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、有機系多孔質粒子が好ましく、高分子系多孔質粒子がより好ましく、合成高分子系多孔質粒子が特に好ましい。また、多孔質粒子は、好ましくは水不溶性多孔質粒子である。
本発明のアフィニティ担体は、多孔質粒子を備える。
多孔質粒子としては、合成高分子系多孔質粒子、天然高分子系多孔質粒子等の有機系多孔質粒子；無機系多孔質粒子；これらを組み合わせた有機－有機複合系多孔質粒子や有機－無機複合系多孔質粒子等が挙げられる。天然高分子系多孔質粒子としては、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン等の多糖類系多孔質粒子（好ましくは架橋多糖類系多孔質粒子）が挙げられる。多糖類の中では、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、アガロースが特に好ましい。無機系多孔質粒子としては、ガラス、シリカゲル、金属、金属酸化物等で構成されるものが挙げられる。
これら多孔質粒子の中では、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、有機系多孔質粒子が好ましく、高分子系多孔質粒子がより好ましく、合成高分子系多孔質粒子が特に好ましい。また、多孔質粒子は、好ましくは水不溶性多孔質粒子である。
【0017】
なお、多孔質粒子は、ＷＯ２０１９／０３９５４５、特開２０１１－２５２９２９号公報、ＷＯ２０１７／１５５１０５、特開昭６２－２５１０２号公報等に記載の架橋構造の導入や表面変性を行ったものであってもよい。
架橋構造を与える架橋剤としては、例えば、オキサリルジヒドラジド、マロン酸ジヒドラジド、コハク酸ジヒドラジド、２，３－ジヒドロキシコハク酸ジヒドラジド、グルタル酸ジヒドラジド、アジピン酸ジヒドラジド、ピメリン酸ジヒドラジド、オクタン二酸ジヒドラジド、ノナン二酸ジヒドラジド、セバシン酸ジヒドラジド、ドデカン二酸ジヒドラジド、フタル酸ジヒドラジド、イソフタル酸ジヒドラジド、テレフタル酸ジヒドラジド、キノリン酸ジヒドラジド等のジカルボン酸ジヒドラジド類；シクロヘキサントリカルボン酸トリヒドラジド等のトリカルボン酸トリヒドラジド類；Ｎ１，Ｎ１－（エタン－１，２－ジイル）ビス（コハク酸モノアミド）等の（アルキレンビスイミノ）ビス（オキソアルカン酸）類；エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリン等のハロヒドリン類；レゾルシノールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、１，６－ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ヒドロゲナートビスフェノールＡジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンジグリシジルエーテル、ジグリシジルテレフタレート、ジグリシジルオルトフタレート、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル等のビスオキシラン類；３官能以上のポリオキシラン類等が挙げられる。
また、表面変性としては、例えば、多孔質粒子の表面に、水酸基を有するポリマーによりグラフト層を設ける手法が挙げられる。
架橋構造を与える架橋剤としては、例えば、オキサリルジヒドラジド、マロン酸ジヒドラジド、コハク酸ジヒドラジド、２，３－ジヒドロキシコハク酸ジヒドラジド、グルタル酸ジヒドラジド、アジピン酸ジヒドラジド、ピメリン酸ジヒドラジド、オクタン二酸ジヒドラジド、ノナン二酸ジヒドラジド、セバシン酸ジヒドラジド、ドデカン二酸ジヒドラジド、フタル酸ジヒドラジド、イソフタル酸ジヒドラジド、テレフタル酸ジヒドラジド、キノリン酸ジヒドラジド等のジカルボン酸ジヒドラジド類；シクロヘキサントリカルボン酸トリヒドラジド等のトリカルボン酸トリヒドラジド類；Ｎ１，Ｎ１－（エタン－１，２－ジイル）ビス（コハク酸モノアミド）等の（アルキレンビスイミノ）ビス（オキソアルカン酸）類；エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリン等のハロヒドリン類；レゾルシノールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、１，６－ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ヒドロゲナートビスフェノールＡジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンジグリシジルエーテル、ジグリシジルテレフタレート、ジグリシジルオルトフタレート、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル等のビスオキシラン類；３官能以上のポリオキシラン類等が挙げられる。
また、表面変性としては、例えば、多孔質粒子の表面に、水酸基を有するポリマーによりグラフト層を設ける手法が挙げられる。
【0018】
また、合成高分子系多孔質粒子に含まれるポリマーとしては、例えば、（メタ）アクリレート系モノマー由来の構造単位、（メタ）アクリル酸由来の構造単位、（メタ）アクリルアミド系モノマー由来の構造単位、（メタ）アクリロニトリル系モノマー由来の構造単位、芳香族ビニル系モノマー由来の構造単位、ビニルアルコール系モノマー由来の構造単位、オレフィン系モノマー（例えばエチレン等）由来の構造単位、ビニルエーテル系モノマー由来の構造単位、ビニルケトン系モノマー由来の構造単位、Ｎ－ビニルアミド系モノマー由来の構造単位、ビニルアルキレンオキシド系モノマー由来の構造単位、三重結合を有するアルキレンオキシド系モノマー（例えば２，３－エポキシプロピルプロパルギルエーテル等）由来の構造単位、アリル系モノマー由来の構造単位、不飽和ジカルボン酸無水物系モノマー由来の構造単位、及び不飽和ポリアルキレングリコールエーテル系モノマー由来の構造単位から選ばれる１種又は２種以上を有するポリマーが挙げられる。
上記ポリマーとしては、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、（メタ）アクリレート系モノマー由来の構造単位、（メタ）アクリル酸由来の構造単位、（メタ）アクリルアミド系モノマー由来の構造単位及び芳香族ビニル系モノマー由来の構造単位から選ばれる１種又は２種以上を有するポリマーが好ましく、（メタ）アクリレート系モノマー由来の構造単位及び芳香族ビニル系モノマー由来の構造単位から選ばれる１種又は２種以上を有するポリマーがより好ましく、（メタ）アクリレート系モノマー由来の構造単位及び芳香族ビニル系モノマー由来の構造単位を少なくとも有するポリマーが特に好ましい。
上記ポリマーとしては、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、（メタ）アクリレート系モノマー由来の構造単位、（メタ）アクリル酸由来の構造単位、（メタ）アクリルアミド系モノマー由来の構造単位及び芳香族ビニル系モノマー由来の構造単位から選ばれる１種又は２種以上を有するポリマーが好ましく、（メタ）アクリレート系モノマー由来の構造単位及び芳香族ビニル系モノマー由来の構造単位から選ばれる１種又は２種以上を有するポリマーがより好ましく、（メタ）アクリレート系モノマー由来の構造単位及び芳香族ビニル系モノマー由来の構造単位を少なくとも有するポリマーが特に好ましい。
【0019】
また、合成高分子系多孔質粒子に含まれるポリマーとしては、多官能ビニルモノマー由来の構造単位及びモノビニルモノマー由来の構造単位から選ばれる構造単位を有するポリマーが好ましく、多官能ビニルモノマー由来の構造単位及びモノビニルモノマー由来の構造単位を有するポリマーがより好ましい。
【0020】
（多官能ビニルモノマー）
多官能ビニルモノマーは、１分子内に重合性ビニル基を２個以上有するビニルモノマーである。
多官能ビニルモノマーとしては、（メタ）アクリレート系多官能ビニルモノマー、（メタ）アクリルアミド系多官能ビニルモノマー、芳香族系多官能ビニルモノマーの他、フタル酸ジアリル、イソフタル酸ジアリル、テレフタル酸ジアリル、マレイン酸ジアリル、フマル酸ジアリル、イタコン酸ジアリル、トリメリット酸ジアリル、トリメリット酸トリアリル、シアヌル酸トリアリル、イソシアヌル酸ジアリル、イソシアヌル酸トリアリル等のポリアリル系モノマーや、ジアミノプロパノール、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、グルコサミン等のアミノアルコールと（メタ）アクリル酸との脱水縮合反応物、ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフィン等が挙げられる。
これらの中では、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、（メタ）アクリレート系多官能ビニルモノマー、（メタ）アクリルアミド系多官能ビニルモノマー及び芳香族系多官能ビニルモノマーから選ばれる１種又は２種以上のモノマーが好ましく、（メタ）アクリレート系多官能ビニルモノマー及び芳香族系多官能ビニルモノマーから選ばれる１種又は２種以上のモノマーがより好ましく、芳香族系多官能ビニルモノマーが特に好ましい。
また、多官能ビニルモノマーに含まれる重合性ビニル基の個数としては、１分子内に、２～５個が好ましく、２又は３個がより好ましい。
多官能ビニルモノマーは、１分子内に重合性ビニル基を２個以上有するビニルモノマーである。
多官能ビニルモノマーとしては、（メタ）アクリレート系多官能ビニルモノマー、（メタ）アクリルアミド系多官能ビニルモノマー、芳香族系多官能ビニルモノマーの他、フタル酸ジアリル、イソフタル酸ジアリル、テレフタル酸ジアリル、マレイン酸ジアリル、フマル酸ジアリル、イタコン酸ジアリル、トリメリット酸ジアリル、トリメリット酸トリアリル、シアヌル酸トリアリル、イソシアヌル酸ジアリル、イソシアヌル酸トリアリル等のポリアリル系モノマーや、ジアミノプロパノール、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、グルコサミン等のアミノアルコールと（メタ）アクリル酸との脱水縮合反応物、ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフィン等が挙げられる。
これらの中では、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、（メタ）アクリレート系多官能ビニルモノマー、（メタ）アクリルアミド系多官能ビニルモノマー及び芳香族系多官能ビニルモノマーから選ばれる１種又は２種以上のモノマーが好ましく、（メタ）アクリレート系多官能ビニルモノマー及び芳香族系多官能ビニルモノマーから選ばれる１種又は２種以上のモノマーがより好ましく、芳香族系多官能ビニルモノマーが特に好ましい。
また、多官能ビニルモノマーに含まれる重合性ビニル基の個数としては、１分子内に、２～５個が好ましく、２又は３個がより好ましい。
【0021】
（メタ）アクリレート系多官能ビニルモノマーとしては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４－ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６－ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、ブタントリオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、イノシトールジ（メタ）アクリレート、グルコースジ（メタ）アクリレート、マンニトールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリレート系モノマー；トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、イノシトールトリ（メタ）アクリレート、グルコーストリ（メタ）アクリレート、マンニトールトリ（メタ）アクリレート等のトリ（メタ）アクリレート系モノマー；ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、イノシトールテトラ（メタ）アクリレート、グルコーステトラ（メタ）アクリレート、マンニトールテトラ（メタ）アクリレート等のテトラ（メタ）アクリレート系モノマー；ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、マンニトールペンタ（メタ）アクリレート等のペンタ（メタ）アクリレート系モノマー等が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【0022】
芳香族系多官能ビニルモノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルエチルベンゼン、ジビニルナフタレン等の芳香族系ジビニルモノマー；トリビニルベンゼン等の芳香族系トリビニルモノマー等が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【0023】
多官能ビニルモノマー由来の構造単位の含有量は、ポリマー中の全構造単位に対して、１～９０質量％が好ましく、２．５～８０質量％がより好ましく、５～７０質量％が更に好ましく、１０～６０質量％が特に好ましい。
なお、ポリマー中の各構造単位の含有量は、ＮＭＲ等により測定すればよい。
なお、ポリマー中の各構造単位の含有量は、ＮＭＲ等により測定すればよい。
【0024】
（モノビニルモノマー）
モノビニルモノマーは、１分子内に重合性ビニル基を１個有するビニルモノマーである。
モノビニルモノマーは、イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基を分子内に有するモノビニルモノマーと、イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基を分子内に有さないモノビニルモノマーとに大別でき、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよいが、スペーサーを介さずに多孔質粒子をイムノグロブリン結合タンパク質と結合させるためには、イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基を分子内に有するモノビニルモノマーが好ましい。
イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基としては、例えば、環状エーテル基、カルボキシ基、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、Ｎ－スクシンイミジル基、ホルミル基、イソシアネート基、アミノ基、ヒドラジド基等が挙げられる。これらの中では、環状エーテル基が好ましく、環を構成する原子数が３～７個の環状エーテル基がより好ましい。環状エーテル基は、置換基としてアルキル基を有していてもよい。環状エーテル基の具体例としては、以下の式（１）～（６）で表される環状エーテル基が挙げられるが、式（１）、（５）又は（６）で表される環状エーテル基が好ましく、式（１）で表される環状エーテル基がより好ましい。
モノビニルモノマーは、１分子内に重合性ビニル基を１個有するビニルモノマーである。
モノビニルモノマーは、イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基を分子内に有するモノビニルモノマーと、イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基を分子内に有さないモノビニルモノマーとに大別でき、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよいが、スペーサーを介さずに多孔質粒子をイムノグロブリン結合タンパク質と結合させるためには、イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基を分子内に有するモノビニルモノマーが好ましい。
イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基としては、例えば、環状エーテル基、カルボキシ基、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、Ｎ－スクシンイミジル基、ホルミル基、イソシアネート基、アミノ基、ヒドラジド基等が挙げられる。これらの中では、環状エーテル基が好ましく、環を構成する原子数が３～７個の環状エーテル基がより好ましい。環状エーテル基は、置換基としてアルキル基を有していてもよい。環状エーテル基の具体例としては、以下の式（１）～（６）で表される環状エーテル基が挙げられるが、式（１）、（５）又は（６）で表される環状エーテル基が好ましく、式（１）で表される環状エーテル基がより好ましい。
【0025】
【化1】
【0026】
〔式中、Ｒ1～Ｒ4は、それぞれ独立して、水素原子又はアルキル基を示し、＊は、結合手を示す。〕
【0027】
Ｒ1～Ｒ4で示されるアルキル基の炭素数は、好ましくは１～４であり、より好ましくは１又は２である。アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基等が挙げられる。また、Ｒ1～Ｒ4としては、水素原子が好ましい。
【0028】
イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基を分子内に有するモノビニルモノマーとしては、例えば、エポキシ基を分子内に有するモノビニルモノマー；（メタ）アクリル酸等のカルボキシ基を分子内に有するモノビニルモノマー；イソシアナトエチル（メタ）アクリレート等のイソシアネート基を分子内に有するモノビニルモノマー；マレイン酸無水物、メチルマレイン酸無水物、グルタコン酸無水物等の不飽和ジカルボン酸無水物系モノマーの他、テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【0029】
エポキシ基を分子内に有するモノビニルモノマーとしては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、３－オキシラニルプロピル（メタ）アクリレート、４－オキシラニルブチル（メタ）アクリレート、５－オキシラニルペンチル（メタ）アクリレート、６－オキシラニルヘキシル（メタ）アクリレート、７－オキシラニルヘプチル（メタ）アクリレート、８－オキシラニルオクチル（メタ）アクリレート、（３－メチルオキシラニル）メチル（メタ）アクリレート、４－ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテル、３，４－エポキシシクロヘキシルメチル（メタ）アクリレート、３，４－エポキシシクロヘキシルエチル（メタ）アクリレート、３，４－エポキシシクロヘキシルプロピル（メタ）アクリレート、α－（メタ）アクリル－ω－グリシジルポリエチレングリコール、グリセリンモノ（メタ）アクリレートグリシジルエーテル等のエポキシ基含有（メタ）アクリレート系モノビニルモノマー；ビニルベンジルグリシジルエーテル、イソプロペニルベンジルグリシジルエーテル、ビニルフェネチルグリシジルエーテル、ビニルフェニルブチルグリシジルエーテル、ビニルベンジルオキシエチルグリシジルエーテル、ビニルフェニルグリシジルエーテル、イソプロペニルフェニルグリシジルエーテル、１，２－エポキシ－３－（４－ビニルベンジル）プロパン等のエポキシ基含有芳香族系モノビニルモノマー；アリルグリシジルエーテル等のエポキシ基含有アリルエーテル系モノビニルモノマー；３，４－エポキシ－１－ブテン、３，４－エポキシ－３－メチル－１－ブテン等のビニルアルキレンオキシド系モノビニルモノマー等が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【0030】
イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基を分子内に有さないモノビニルモノマーとしては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ－ブチル（メタ）アクリレート、４－ｔｅｒｔ－ブチル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、２－エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ－オクチル（メタ）アクリレート、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンモノ（メタ）アクリレート、ブタントリオールモノ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、イノシトールモノ（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリレート系モノビニルモノマー；（メタ）アクリルアミド、ジメチル（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリロイルモルホリン、ダイアセトン（メタ）アクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド系モノビニルモノマー；スチレン、α－メチルスチレン、ハロゲン化スチレン、４－メチルスチレン、２，４－ジメチルスチレン、２，４，６－トリメチルスチレン、エチルビニルベンゼン、４－イソプロピルスチレン、４－ｎ－ブチルスチレン、４－イソブチルスチレン、４－ｔｅｒｔ－ブチルスチレン、１－ビニルナフタレン、２－ビニルナフタレン等の芳香族系モノビニルモノマー；エチルビニルケトン、プロピルビニルケトン、イソプロピルビニルケトン等のビニルケトン系モノビニルモノマー；アクリロニトリル、メタクリロニトリル等の（メタ）アクリロニトリル系モノビニルモノマー；Ｎ－ビニルアセトアミド、Ｎ－ビニルプロピオンアミド等のＮ－ビニルアミド系モノビニルモノマー等が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【0031】
モノビニルモノマー由来の構造単位の含有量は、ポリマー中の全構造単位に対して、１０～９９質量％が好ましく、２０～９７．５質量％がより好ましく、３０～９５質量％が更に好ましく、４０～９０質量％が特に好ましい。
【0032】
また、ポリマー中に含まれる多官能ビニルモノマー由来の構造単位（Ｐ）とモノビニルモノマー由来の構造単位（Ｍ）との含有割合〔（Ｐ）：（Ｍ）〕としては、質量比で、１：９９～９０：１０が好ましく、２．５：９７．５～８０：２０がより好ましく、５：９５～７０：３０が更に好ましく、１０：９０～６０：４０が特に好ましい。
【0033】
（イムノグロブリン結合タンパク質）
本発明のアフィニティ担体が備えるイムノグロブリン結合タンパク質は、ポリペプチド鎖を含むものであり、また、当該ポリペプチド鎖は、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列、及びそれらの変異体配列から選ばれるアミノ酸配列である。このポリペプチド鎖は、イムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖であり、イムノグロブリン結合ドメインとして機能する。以下、このポリペプチド鎖を「特定イムノグロブリン結合ドメイン」とも称する。また、上記イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる特定イムノグロブリン結合ドメインの数は２～１０個である。
なお、本明細書において、「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる、抗体（イムノグロブリン）又はその断片に対する結合活性を単独で有するポリペプチドの機能単位をいう。また、特定イムノグロブリン結合ドメインのうち、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖は、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメイン（Ｃドメイン）であり、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖は、プロテインＬのイムノグロブリン結合ドメイン（Ｃ４ドメイン）であり、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖は、プロテインＧのイムノグロブリン結合ドメイン（β１ドメイン）である。
本発明のアフィニティ担体が備えるイムノグロブリン結合タンパク質は、ポリペプチド鎖を含むものであり、また、当該ポリペプチド鎖は、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列、及びそれらの変異体配列から選ばれるアミノ酸配列である。このポリペプチド鎖は、イムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖であり、イムノグロブリン結合ドメインとして機能する。以下、このポリペプチド鎖を「特定イムノグロブリン結合ドメイン」とも称する。また、上記イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる特定イムノグロブリン結合ドメインの数は２～１０個である。
なお、本明細書において、「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる、抗体（イムノグロブリン）又はその断片に対する結合活性を単独で有するポリペプチドの機能単位をいう。また、特定イムノグロブリン結合ドメインのうち、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖は、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメイン（Ｃドメイン）であり、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖は、プロテインＬのイムノグロブリン結合ドメイン（Ｃ４ドメイン）であり、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖は、プロテインＧのイムノグロブリン結合ドメイン（β１ドメイン）である。
【0034】
ここで、本明細書において、アミノ酸配列やヌクレオチド配列の「同一性」は、カーリンとアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０：５８７３－５８７７）を用いて決定することができる。このＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、ＴＢＬＡＳＴＮ及びＴＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５：４０３－４１０）。これらのプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いることができる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（[www.ncbi.nlm.nih.gov]参照）。
【0035】
また、本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列に関する「少なくとも８５％の同一性」とは、８５％以上の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、より好ましくは９５％以上の同一性、さらに好ましくは９７％以上の同一性、さらに好ましくは９８％以上の同一性、特に好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【0036】
また、本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列）とを、各アミノ酸配列又はヌクレオチド配列中に存在する保存アミノ酸残基又はヌクレオチドに最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute: EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/index.html]）のウェブサイト上で利用することができる。
【0037】
また、本明細書において、アミノ酸残基は次の略号でも記載される：アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、及び任意のアミノ酸残基（Ｘａａ又はＸ）。また、本明細書において、ペプチドのアミノ酸配列は、常法に従って、アミノ末端（以下Ｎ末端という）が左側、カルボキシル末端（以下Ｃ末端という）が右側に位置するように記載される。
【0038】
また、本明細書において、アミノ酸配列の特定の位置に対する「前」及び「後」の位置とは、それぞれ、該特定の位置のＮ末端側及びＣ末端側に隣接する位置をいう。例えば、特定の位置の「前」及び「後」の位置へアミノ酸残基を挿入する場合、該特定の位置のＮ末端側及びＣ末端側に隣接する位置に、挿入後のアミノ酸残基が配置される。
【0039】
本明細書において、「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、抗体又はその断片に対する結合活性を有するタンパク質をいう。
また、本明細書において、「抗体」は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びこれらのサブクラス等の任意のクラスのイムノグロブリン、それらの変異体を包含する概念である。また、本明細書において「抗体」は、ヒト化抗体等のキメラ抗体、抗体複合体、及び抗原認識部位を含む他のイムノグロブリン修飾体などであってもよい。
また、本明細書において、「抗体の断片」は、抗原認識部位を含む抗体の断片であっても、抗原認識部位を含まない抗体の断片であってもよい。抗原認識部位を含まない抗体の断片としては、例えば、イムノグロブリンのＦｃ領域のみからなるタンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、及びそれらの変異体や修飾体などが挙げられる。
また、本明細書において、「抗体」は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びこれらのサブクラス等の任意のクラスのイムノグロブリン、それらの変異体を包含する概念である。また、本明細書において「抗体」は、ヒト化抗体等のキメラ抗体、抗体複合体、及び抗原認識部位を含む他のイムノグロブリン修飾体などであってもよい。
また、本明細書において、「抗体の断片」は、抗原認識部位を含む抗体の断片であっても、抗原認識部位を含まない抗体の断片であってもよい。抗原認識部位を含まない抗体の断片としては、例えば、イムノグロブリンのＦｃ領域のみからなるタンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、及びそれらの変異体や修飾体などが挙げられる。
【0040】
ここで、特定イムノグロブリン結合ドメインにおける上記「変異体配列」について詳細に説明する。変異体配列の親ドメインとしては、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁成分であるプロテインＡ（以下、ＳｐＡとも称する）のイムノグロブリン結合ドメインであるＡドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメイン、及びＢドメインの改変型ドメインであるＺドメイン；Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ ３１２株又は３３１６株が産生するプロテインＬのイムノグロブリン結合ドメインであるＢ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ４ドメイン、Ｂ５ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ３ドメイン、及びＣ４ドメイン；Ｇグループの連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の細胞壁成分であるプロテインＧのイムノグロブリン結合ドメインであるβ１ドメイン、β２ドメイン、及びβ３ドメインが挙げられる。これらの中でも、ポリペプチド鎖が上記変異体配列からなる場合における親ドメインとしては、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、ＳｐＡのＣドメイン、プロテインＬのＣ４ドメイン、プロテインＧのβ１ドメインが好ましく、ＳｐＡのＣドメインがより好ましい。
【0041】
ＳｐＡのＣドメイン、プロテインＬのＣ４ドメイン、及びプロテインＧのβ１ドメインは、上記変異体配列からなるポリペプチド鎖の親ドメインとして使用され得る。
ＳｐＡのＣドメインは、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖である。該Ｃドメインの変異体としては、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。プロテインＬのＣ４ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖である。該Ｃ４ドメインの変異体としては、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。プロテインＧのβ１ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖である。該β１ドメインの変異体としては、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。
したがって、上記変異体配列からなるポリペプチド鎖の親ドメインの例としては、配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖が挙げられる。この中でも、親ドメインとしては、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖が好ましい。
ＳｐＡのＣドメインは、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖である。該Ｃドメインの変異体としては、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。プロテインＬのＣ４ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖である。該Ｃ４ドメインの変異体としては、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。プロテインＧのβ１ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖である。該β１ドメインの変異体としては、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が挙げられる。
したがって、上記変異体配列からなるポリペプチド鎖の親ドメインの例としては、配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖が挙げられる。この中でも、親ドメインとしては、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖が好ましい。
【0042】
上記変異体配列からなるポリペプチド鎖としては、ＳｐＡのＣドメインに対して、配列番号１のアミノ酸配列の１位に相当する位置及び２９位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換若しくは欠失、又は当該位置の前若しくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入をして得られるポリペプチド鎖が挙げられ、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有し、且つ配列番号１のアミノ酸配列の１位に相当する位置及び２９位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも１つの位置におけるアミノ酸残基の、他のアミノ酸残基への置換若しくは欠失、又は当該位置の前若しくは後の位置への他のアミノ酸残基の挿入を変異として有するアミノ酸配列からなり、イムノグロブリン結合活性を有するポリペプチド鎖が好ましい。
１位に相当する位置において、置換前のアミノ酸残基はＡｌａであり、これと置換される他のアミノ酸残基は、Ａｌａ以外のアミノ酸残基であればよく、好ましくはＶａｌである。また、２９位に相当する位置において、置換前のアミノ酸残基はＧｌｙであり、これと置換される他のアミノ酸残基は、Ｇｌｙ以外のアミノ酸残基であればよいが、好ましくはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＭｅｔであり、より好ましくはＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり、特に好ましくはＡｌａである。
ＳｐＡのＣドメインに対する上記変異は、配列番号１のアミノ酸配列の１位又は２９位に相当する位置におけるアミノ酸残基の単独変異であっても、上記１位及び２９位に相当する位置における２つのアミノ酸残基が変異した多重変異であってもよい。例えば、ＳｐＡのＣドメインに対する上記変異は、配列番号１のアミノ酸配列の１位又は２９位に相当する位置におけるアミノ酸残基の単独置換であっても、上記１位及び２９位に相当する位置における２つのアミノ酸残基を置換した多重置換であってもよい。
１位に相当する位置において、置換前のアミノ酸残基はＡｌａであり、これと置換される他のアミノ酸残基は、Ａｌａ以外のアミノ酸残基であればよく、好ましくはＶａｌである。また、２９位に相当する位置において、置換前のアミノ酸残基はＧｌｙであり、これと置換される他のアミノ酸残基は、Ｇｌｙ以外のアミノ酸残基であればよいが、好ましくはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＭｅｔであり、より好ましくはＡｌａ、Ｇｌｕ又はＡｒｇであり、特に好ましくはＡｌａである。
ＳｐＡのＣドメインに対する上記変異は、配列番号１のアミノ酸配列の１位又は２９位に相当する位置におけるアミノ酸残基の単独変異であっても、上記１位及び２９位に相当する位置における２つのアミノ酸残基が変異した多重変異であってもよい。例えば、ＳｐＡのＣドメインに対する上記変異は、配列番号１のアミノ酸配列の１位又は２９位に相当する位置におけるアミノ酸残基の単独置換であっても、上記１位及び２９位に相当する位置における２つのアミノ酸残基を置換した多重置換であってもよい。
【0043】
上記のような変異体配列からなるポリペプチド鎖の中でも、形質転換体におけるタンパク質発現量を増加させるために（ＰＮＡＳ，１９８９，８６：８２４７－８２５１，Ｆｉｇ．２）、また、複数のドメインを連結したイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの作製を容易にするために（ＷＯ２０１０／１１０２８８）、配列番号１のアミノ酸配列の１位に相当する位置におけるＡｌａをＶａｌとする置換を含むものが好ましい。また、上記変異体配列からなるポリペプチド鎖としては、イムノグロブリン結合タンパク質の化学的安定性及びアルカリ耐性を改善させるために（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，２００７，８４８（１）：４０－４７）、配列番号１のアミノ酸配列の２９位に相当する位置におけるＧｌｙをＡｌａとする置換をさらに含むものが特に好ましい。
【0044】
また、上記変異体配列からなるポリペプチド鎖は、イムノグロブリン結合活性を有する限りにおいて、タンパク質構造の安定性を高めるために（ＷＯ２０１３／１０９３０２、ＷＯ２０１７／１９４５９６等）、配列番号１～３のいずれかのアミノ酸配列のＮ末端から少なくとも２残基（例えば、２残基、４残基、６残基又は７残基）に相当するアミノ酸残基を欠失した変異イムノグロブリン結合ドメインであってもよい。このような変異体としては、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から２～７残基を欠失した変異イムノグロブリン結合ドメインが挙げられる。
【0045】
上記変異体配列からなるポリペプチド鎖において、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列の１位に相当する位置にＶａｌを含むか、及び／又は配列番号１のアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＡｌａを含んでいてもよい。
変異体配列からなるポリペプチド鎖の中では、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖が特に好ましい。
変異体配列からなるポリペプチド鎖の中では、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖が特に好ましい。
【0046】
上記変異体配列からなるポリペプチド鎖は、ＳｐＡのＣドメイン、プロテインＬのＣ４ドメイン、プロテインＧのβ１ドメインのアミノ酸配列に対して、アミノ酸残基の挿入、削除、置換又は欠失や、アミノ酸残基の化学的修飾等の改変を施すことによって作製することができる。アミノ酸残基の挿入、削除、置換又は欠失の手段としては、そのドメインをコードするポリヌクレオチドに対する部位特異的突然変異等の公知の手段が挙げられる。
【0047】
本発明のアフィニティ担体が備えるイムノグロブリン結合タンパク質に含まれる特定イムノグロブリン結合ドメインの数は２～１０個である。
イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる特定イムノグロブリン結合ドメインの数は、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、特に好ましくは５個以上であり、また、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは８個以下、より好ましくは７個以下である。具体的な範囲としては、３～１０個が好ましく、４～１０個がより好ましく、４～８個が更に好ましく、４～７個が更に好ましく、５～７個が更に好ましく、６個が特に好ましい。なお、イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる２～１０個の特定イムノグロブリン結合ドメインは、同種のものでも異種のものでもよいが、好ましくは同種である。
イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる特定イムノグロブリン結合ドメインの数は、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、特に好ましくは５個以上であり、また、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、好ましくは８個以下、より好ましくは７個以下である。具体的な範囲としては、３～１０個が好ましく、４～１０個がより好ましく、４～８個が更に好ましく、４～７個が更に好ましく、５～７個が更に好ましく、６個が特に好ましい。なお、イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる２～１０個の特定イムノグロブリン結合ドメインは、同種のものでも異種のものでもよいが、好ましくは同種である。
【0048】
また、本発明のアフィニティ担体が備えるイムノグロブリン結合タンパク質は、特定イムノグロブリン結合ドメイン以外のイムノグロブリン結合ドメインを含んでいてもよい。このようなドメインとしては、例えば、Ｃドメイン以外の天然型ＳｐＡのイムノグロブリン結合ドメイン（例えば、ＳｐＡのＡドメイン、Ｂドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメイン）、ＳｐＡのＢドメインの改変型ドメインであるＺドメイン、Ｃ４ドメイン以外の天然型プロテインＬのイムノグロブリン結合ドメイン（Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｂ４ドメイン、Ｂ５ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、Ｃ３ドメイン）、β１ドメイン以外の天然型プロテインＧのイムノグロブリン結合ドメイン（β２ドメイン、β３ドメイン）、これらの変異体等が挙げられる。
【0049】
イムノグロブリン結合タンパク質としては、抗体及びその断片に対する動的結合容量を大きくするために、特定イムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列が直鎖状に２～１０個（好ましくは３～１０個、より好ましくは４～１０個、更に好ましくは４～８個、更に好ましくは４～７個、更に好ましくは５～７個、特に好ましくは６個）連結されたポリペプチドが好ましく、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列、及びそれらの変異体配列から選ばれるアミノ酸配列のうちいずれか１種のアミノ酸配列が直鎖状に２～１０個（好ましくは３～１０個、より好ましくは４～１０個、更に好ましくは４～８個、更に好ましくは４～７個、更に好ましくは５～７個、特に好ましくは６個）連結されたポリペプチドがより好ましい。
なお、本明細書において、アミノ酸配列が「直鎖状に連結された」とは、２～１０個のアミノ酸配列がリンカーを介して又はリンカーを介さずに直列に連結されていることを意味する。例えば、リンカーを介する場合、「直鎖状に連結された」とは、１つのアミノ酸配列のＣ末端と別のアミノ酸配列のＮ末端とがリンカーを介して直列に連結された構造を意味し、一方、リンカーを介さない場合、「直鎖状に連結された」とは、１つのアミノ酸配列のＣ末端と別のアミノ酸配列のＮ末端とがペプチド結合によって直列に連結された構造を意味する。
なお、本明細書において、アミノ酸配列が「直鎖状に連結された」とは、２～１０個のアミノ酸配列がリンカーを介して又はリンカーを介さずに直列に連結されていることを意味する。例えば、リンカーを介する場合、「直鎖状に連結された」とは、１つのアミノ酸配列のＣ末端と別のアミノ酸配列のＮ末端とがリンカーを介して直列に連結された構造を意味し、一方、リンカーを介さない場合、「直鎖状に連結された」とは、１つのアミノ酸配列のＣ末端と別のアミノ酸配列のＮ末端とがペプチド結合によって直列に連結された構造を意味する。
【0050】
なお、本発明のアフィニティ担体が備えるイムノグロブリン結合タンパク質は、特定イムノグロブリン結合ドメインのＮ末端、Ｃ末端及びドメイン間のうちいずれか１箇所以上に、任意のアミノ酸残基又はペプチドが付加又は挿入されていてもよい。当該付加又は挿入されるアミノ酸残基又はペプチドとしては、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、（Ｐｒｏ）ｍ、（Ａｌａ－Ｐｒｏ）ｎ、（Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｙｓ）ｐが挙げられる。なお、ｍは、２～３００の整数、好ましくは１２～２４の整数であり、ｎは、４以上の整数、好ましくは４～１０の整数であり、ｐは、２以上の整数、好ましくは２～６の整数である。
【0051】
本発明のアフィニティ担体が備えるイムノグロブリン結合タンパク質は、例えば、アミノ酸配列に基づく化学合成法や、リコンビナント法などで製造できる。例えば、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ． ＡｕｓｂｅｌらによるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙや、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）等に記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用して製造することができる。
すなわち、本発明のアフィニティ担体が備えるイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを大腸菌等の宿主に形質転換し、得られた組換え体を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、目的のタンパク質を大量且つ経済的に取得することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができる。例えば、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されているプラスミドや、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１）等に記載されているプラスミドが挙げられる。また、形質転換のための宿主としては、大腸菌等のバクテリア、真菌類、昆虫細胞、哺乳類細胞等の組換えタンパク質を発現させるために用いられる公知の宿主を用いることができる。宿主中に核酸を導入することにより宿主を形質転換させるためには、各宿主に応じて当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）等に記載されている公知の方法を利用することができる。なお、得られた形質転換体（好ましくは細菌等の細胞）を培養して発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られている。また、イムノグロブリン結合タンパク質は、無細胞タンパク質合成系を用いて発現させてもよい。
すなわち、本発明のアフィニティ担体が備えるイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを大腸菌等の宿主に形質転換し、得られた組換え体を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、目的のタンパク質を大量且つ経済的に取得することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができる。例えば、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されているプラスミドや、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１）等に記載されているプラスミドが挙げられる。また、形質転換のための宿主としては、大腸菌等のバクテリア、真菌類、昆虫細胞、哺乳類細胞等の組換えタンパク質を発現させるために用いられる公知の宿主を用いることができる。宿主中に核酸を導入することにより宿主を形質転換させるためには、各宿主に応じて当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）等に記載されている公知の方法を利用することができる。なお、得られた形質転換体（好ましくは細菌等の細胞）を培養して発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られている。また、イムノグロブリン結合タンパク質は、無細胞タンパク質合成系を用いて発現させてもよい。
【0052】
本発明のアフィニティ担体は、上記のようなイムノグロブリン結合タンパク質が多孔質粒子に結合されたものであるが、当該結合は、直接的な化学結合でもスペーサー分子を介した間接的な結合でもよい。直接的な化学結合としては、例えば、多孔質粒子に含まれる「イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基」の残基（開環エポキシ基等）とイムノグロブリン結合タンパク質との共有結合が挙げられる。なお、イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基としては、イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基を分子内に有するモノビニルモノマーが有するものとして挙げた反応性官能基と同様のものが挙げられる。
【0053】
また、イムノグロブリン結合タンパク質の多孔質粒子に対する結合量は、空孔率を所望の範囲にしやすくするために、多孔質粒子の乾燥重量１ｇに対して、好ましくは３０～１５０ｍｇ、より好ましくは４０～１２０ｍｇである。
なお、イムノグロブリン結合タンパク質の結合量は、Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ（ＢＣＡ）を用いたアッセイ（ＢＣＡアッセイ）等で測定できる。
なお、イムノグロブリン結合タンパク質の結合量は、Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ（ＢＣＡ）を用いたアッセイ（ＢＣＡアッセイ）等で測定できる。
【0054】
＜アフィニティ担体の製造方法＞
本発明のアフィニティ担体は、アフィニティ担体の湿潤状態での空孔率が７０～９５％（ｖ／ｖ）となるように、（工程１）原料となる多孔質粒子の調製と（工程２）当該多孔質粒子への上記イムノグロブリン結合タンパク質の結合を行うことにより、製造することができる。
本発明のアフィニティ担体は、アフィニティ担体の湿潤状態での空孔率が７０～９５％（ｖ／ｖ）となるように、（工程１）原料となる多孔質粒子の調製と（工程２）当該多孔質粒子への上記イムノグロブリン結合タンパク質の結合を行うことにより、製造することができる。
【0055】
（工程１）
原料となる多孔質粒子は公知の方法を参考にして適宜調製すればよいが、天然高分子系多孔質粒子を多孔質粒子として備えるアフィニティ担体を製造する場合、原料となる天然高分子系多孔質粒子は、例えば、Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７９（２），３９３－３９８（１９６４）、ＷＯ９７／３８０１８、特開２０１２－８７２０２号公報、特開２０１２－１２６７９６号公報等に記載されている逆相懸濁ゲル化法やイオン液体に溶解させて懸濁させる方法等の常法により調製すればよい。このとき、原料天然高分子の使用量やゲル化温度やゲル化時間を調節することによって、空孔率が所望の範囲になりやすくなる。なお、懸濁に用いる有機溶媒としては、多孔化剤として後述する有機溶媒が挙げられる。また、空孔率を所望の範囲にしやすくするために、工程２に先立って、上記で得られた天然高分子系の原料多孔質粒子に分級処理を行うのが好ましい。
また、架橋化及び／又はエポキシ基導入をする場合は、エピハロヒドリン、ビスエポキシド、１，２，３－トリハロ置換された低級炭化水素類等と反応させてもよい。なお、この反応は、分級処理前に行っても分級処理後に行ってもよい。
原料となる多孔質粒子は公知の方法を参考にして適宜調製すればよいが、天然高分子系多孔質粒子を多孔質粒子として備えるアフィニティ担体を製造する場合、原料となる天然高分子系多孔質粒子は、例えば、Ｈｊｅｒｔｅｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７９（２），３９３－３９８（１９６４）、ＷＯ９７／３８０１８、特開２０１２－８７２０２号公報、特開２０１２－１２６７９６号公報等に記載されている逆相懸濁ゲル化法やイオン液体に溶解させて懸濁させる方法等の常法により調製すればよい。このとき、原料天然高分子の使用量やゲル化温度やゲル化時間を調節することによって、空孔率が所望の範囲になりやすくなる。なお、懸濁に用いる有機溶媒としては、多孔化剤として後述する有機溶媒が挙げられる。また、空孔率を所望の範囲にしやすくするために、工程２に先立って、上記で得られた天然高分子系の原料多孔質粒子に分級処理を行うのが好ましい。
また、架橋化及び／又はエポキシ基導入をする場合は、エピハロヒドリン、ビスエポキシド、１，２，３－トリハロ置換された低級炭化水素類等と反応させてもよい。なお、この反応は、分級処理前に行っても分級処理後に行ってもよい。
【0056】
一方、合成高分子系多孔質粒子を多孔質粒子として備えるアフィニティ担体を製造する場合、原料となる合成高分子系多孔質粒子は、例えば、ＷＯ２０１５／８０１７４、ＷＯ２０１５／１１９２５５等に記載の公知の方法を参考にして適宜調製すればよい。具体的には、モノマーを、重合開始剤及び多孔化剤を用いて懸濁重合させる方法が挙げられる。懸濁重合に用いるモノマーとしては、合成高分子系多孔質粒子を与えるモノマーとして上記で述べたものが挙げられる。
【0057】
重合開始剤としてはラジカル重合開始剤が好ましい。ラジカル重合開始剤としては、アゾ系開始剤、過酸化物系開始剤、レドックス系開始剤等が挙げられる。より具体的には、アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソ酪酸メチル、アゾビス－２，４－ジメチルバレロニトリル、過酸化ベンゾイル、過酸化ジ－ｔｅｒｔ－ブチル、過酸化ベンゾイル－ジメチルアニリン等が挙げられる。
【0058】
多孔化剤は、油滴内でモノマーと共に存在し、非重合成分として孔を形成する作用を有する。多孔化剤は、モノマーの種類やその使用量等に応じて適宜選択すればよいが、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタン、ノナン、デカン、ウンデカン等の脂肪族炭化水素類；シクロペンタン、シクロヘキサン等の脂環式炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、ナフタレン、エチルベンゼン等の芳香族炭化水素類；四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、テトラクロロエタン、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類；ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、４－メチル－２－ペンタノール、２－エチル－１－ヘキサノール等の脂肪族アルコール類；シクロヘキサノール等の脂環式アルコール類；２－フェニルエチルアルコール、ベンジルアルコール等の芳香族アルコール類；ジエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン、アセトフェノン、２－オクタノン、シクロヘキサノン等のケトン類；ジブチルエーテル、ジイソブチルエーテル、アニソール、エトキシベンゼン等のエーテル類；酢酸イソペンチル、酢酸ブチル、酢酸－３－メトキシブチル、マロン酸ジエチル等のエステル類の他、非架橋性ビニルモノマーのホモポリマー等の線状重合物が挙げられる。なお、このうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
多孔化剤の使用量は、モノマーの種類やその使用量、多孔化剤の種類等に応じて適宜調整すればよいが、空孔率を所望の範囲にしやすくするために、モノマー総量１００質量部に対して、好ましくは１００～６００質量部、より好ましくは１５０～５５０質量部、特に好ましくは２５０～５００質量部である。
多孔化剤の使用量は、モノマーの種類やその使用量、多孔化剤の種類等に応じて適宜調整すればよいが、空孔率を所望の範囲にしやすくするために、モノマー総量１００質量部に対して、好ましくは１００～６００質量部、より好ましくは１５０～５５０質量部、特に好ましくは２５０～５００質量部である。
【0059】
なお、上記懸濁重合は、上記各成分に加えて必要に応じて、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン等の水溶性高分子；分散安定剤；各種界面活性剤；重合禁止剤；重合調整剤等を用いて行ってもよい。なお、このうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【0060】
懸濁重合の重合温度は、重合開始剤の種類等に応じて適宜決定すればよいが、通常２～１００℃程度であり、アゾビスイソブチロニトリルを重合開始剤として用いる場合は、６５～９５℃が好ましい。また、重合時間は、通常５分間～４８時間である。なお、得られた多孔質粒子には、ＷＯ２０１９／０３９５４５、特開２０１１－２５２９２９号公報、ＷＯ２０１７／１５５１０５、特開昭６２－２５１０２号公報等に記載の上記の架橋構造の導入や表面変性を行ってもよい。
また、天然高分子系多孔質粒子の場合と同様、空孔率を所望の範囲にしやすくするために、工程２に先立って、上記で得られた合成高分子系の原料多孔質粒子に分級処理を行うのが好ましい。
また、天然高分子系多孔質粒子の場合と同様、空孔率を所望の範囲にしやすくするために、工程２に先立って、上記で得られた合成高分子系の原料多孔質粒子に分級処理を行うのが好ましい。
【0061】
（工程２）
工程１で得た多孔質粒子に上記イムノグロブリン結合タンパク質を結合させる方法は、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００７，８，６，１７７５－１７８９等に記載の一般的な方法でよい。例えば、工程１で得た多孔質粒子が、イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基を有する場合は、当該反応性官能基にイムノグロブリン結合タンパク質を結合させる方法が挙げられる。工程１で得た多孔質粒子が環状エーテル基を有する場合は、当該環状エーテル基に、イムノグロブリン結合タンパク質のアミノ基、ヒドロキシ基又はチオール基を反応させればよい。また、工程１で得た多孔質粒子がカルボキシ基を有する場合は、当該カルボキシ基をＮ－ヒドロキシコハク酸イミド等で活性化させ、イムノグロブリン結合タンパク質のアミノ基と反応させる方法や、水溶性カルボジイミド等の脱水縮合剤存在下でイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ基と反応させる方法が挙げられる。
また、特開２０１７－８３３６３号公報、ＷＯ２０１５／１１９２８８等に記載の公知の手法を参考にして、ポリアルキレングリコール鎖や糖類等のスペーサー分子を介して、工程１で得た多孔質粒子に上記イムノグロブリン結合タンパク質を結合させてもよい。
工程１で得た多孔質粒子に上記イムノグロブリン結合タンパク質を結合させる方法は、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００７，８，６，１７７５－１７８９等に記載の一般的な方法でよい。例えば、工程１で得た多孔質粒子が、イムノグロブリン結合タンパク質と反応性を有する反応性官能基を有する場合は、当該反応性官能基にイムノグロブリン結合タンパク質を結合させる方法が挙げられる。工程１で得た多孔質粒子が環状エーテル基を有する場合は、当該環状エーテル基に、イムノグロブリン結合タンパク質のアミノ基、ヒドロキシ基又はチオール基を反応させればよい。また、工程１で得た多孔質粒子がカルボキシ基を有する場合は、当該カルボキシ基をＮ－ヒドロキシコハク酸イミド等で活性化させ、イムノグロブリン結合タンパク質のアミノ基と反応させる方法や、水溶性カルボジイミド等の脱水縮合剤存在下でイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ基と反応させる方法が挙げられる。
また、特開２０１７－８３３６３号公報、ＷＯ２０１５／１１９２８８等に記載の公知の手法を参考にして、ポリアルキレングリコール鎖や糖類等のスペーサー分子を介して、工程１で得た多孔質粒子に上記イムノグロブリン結合タンパク質を結合させてもよい。
【0062】
また、工程１で得た多孔質粒子が環状エーテル基を有する場合、これに由来する環状エーテル基が、工程２を行った後も残存することがあるが、この残存した環状エーテル基は公知の手法で開環させてもよい。例えば、酸又はアルカリ；メルカプトエタノール、チオグリセロール等のメルカプト基を有するアルコール；グリセロール等の多価アルコール；モノエタノールアミン等を用いて開環させることができる。
【0063】
＜クロマトグラフィーカラム＞
本発明のクロマトグラフィーカラムは、本発明のアフィニティ担体を含むものである。
本発明のクロマトグラフィーカラムは、本発明のアフィニティ担体を含む以外は、通常のクロマトグラフィーカラムと同様である。具体的には、カラム容器と当該カラム容器に充填された本発明のアフィニティ担体とを備えるクロマトグラフィーカラムが挙げられる。
本発明のクロマトグラフィーカラムは、本発明のアフィニティ担体を含むものである。
本発明のクロマトグラフィーカラムは、本発明のアフィニティ担体を含む以外は、通常のクロマトグラフィーカラムと同様である。具体的には、カラム容器と当該カラム容器に充填された本発明のアフィニティ担体とを備えるクロマトグラフィーカラムが挙げられる。
【0064】
＜抗体又はその断片の単離方法＞
本発明の抗体又はその断片の単離方法は、本発明のアフィニティ担体又は本発明のクロマトグラフィーカラムを用いるものである。
本発明の抗体又はその断片の単離方法は、本発明のアフィニティ担体又は本発明のクロマトグラフィーカラムを用いること以外は、抗体又はその断片の一般的な単離方法と同様にして行えばよい。具体的には、本発明のアフィニティ担体と、抗体又はその断片を含む試料とを接触させる工程を含む方法が挙げられる。また、この工程によって抗体又はその断片をアフィニティ担体に捕捉させて抗体又はその断片から夾雑物（例えば、抗体又はその断片以外のタンパク質等）を分離した後、アフィニティ担体に捕捉された抗体又はその断片を溶出させる溶出工程を行うことが好ましい。この溶出液を回収することで、試料から抗体又はその断片を単離することができる。溶出工程には、イムノグロブリン結合タンパク質と抗体又はその断片とを解離させる解離液が通常使用される。解離液のｐＨ（２５℃）は、好ましくは２～７の範囲、より好ましくは３～５の範囲である。
また、単離は、本発明のクロマトグラフィーカラムを用いて行ってもよい。このような方法としては、本発明のクロマトグラフィーカラムに、抗体又はその断片を含む試料を通液する工程を含む方法が挙げられ、この工程によって抗体又はその断片をアフィニティ担体に捕捉させて抗体又はその断片から夾雑物を分離した後、上記と同様に溶出工程を行うことが好ましい。
本発明の抗体又はその断片の単離方法は、本発明のアフィニティ担体又は本発明のクロマトグラフィーカラムを用いるものである。
本発明の抗体又はその断片の単離方法は、本発明のアフィニティ担体又は本発明のクロマトグラフィーカラムを用いること以外は、抗体又はその断片の一般的な単離方法と同様にして行えばよい。具体的には、本発明のアフィニティ担体と、抗体又はその断片を含む試料とを接触させる工程を含む方法が挙げられる。また、この工程によって抗体又はその断片をアフィニティ担体に捕捉させて抗体又はその断片から夾雑物（例えば、抗体又はその断片以外のタンパク質等）を分離した後、アフィニティ担体に捕捉された抗体又はその断片を溶出させる溶出工程を行うことが好ましい。この溶出液を回収することで、試料から抗体又はその断片を単離することができる。溶出工程には、イムノグロブリン結合タンパク質と抗体又はその断片とを解離させる解離液が通常使用される。解離液のｐＨ（２５℃）は、好ましくは２～７の範囲、より好ましくは３～５の範囲である。
また、単離は、本発明のクロマトグラフィーカラムを用いて行ってもよい。このような方法としては、本発明のクロマトグラフィーカラムに、抗体又はその断片を含む試料を通液する工程を含む方法が挙げられ、この工程によって抗体又はその断片をアフィニティ担体に捕捉させて抗体又はその断片から夾雑物を分離した後、上記と同様に溶出工程を行うことが好ましい。
【0065】
なお、抗体又はその断片を含む試料は特に限定されないが、例えば、全血、血清、血漿、各種血球、血餅、血小板等の血液組成成分、尿、精液、母乳、汗、間質液、間質性リンパ液、骨髄液、組織液、唾液、胃液、関節液、胸水、胆汁、腹水、羊水等の体液、菌体液、細胞培養の培地、細胞培養上清、組織細胞の破砕液等の各種液体試料が挙げられる。
【実施例】
【0066】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。但し、実施例３、５、１１、１３、１４及び１７は参考例である。
【0067】
（実施例１）
（１）４４８ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製 ＰＶＡ－２１７）２．６９ｇを添加し、加熱撹拌することでポリビニルアルコールを溶解させ、水溶液Ｓを調製した。
一方、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）２．９７ｇ及びグリシジルメタクリレート（三菱ガス化学社製）１１．９ｇからなる単量体組成物を、２－オクタノン２３．４ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。
次いで、前記水溶液Ｓを、セパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に前記単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’－アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）１．３８ｇを添加し、内温を８６℃にした。
（１）４４８ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製 ＰＶＡ－２１７）２．６９ｇを添加し、加熱撹拌することでポリビニルアルコールを溶解させ、水溶液Ｓを調製した。
一方、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）２．９７ｇ及びグリシジルメタクリレート（三菱ガス化学社製）１１．９ｇからなる単量体組成物を、２－オクタノン２３．４ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。
次いで、前記水溶液Ｓを、セパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に前記単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’－アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）１．３８ｇを添加し、内温を８６℃にした。
【0068】
（２）その後、８６℃に温度を維持したまま、１時間撹拌を行った。次いで、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。
（３）次に、洗浄後の粒子を、篩目開き３２μｍ及び篩目開き７５μｍの試験篩にて湿式分級した。この分級後の多孔質粒子を多孔質粒子（Ｐ１）ともいう。
（３）次に、洗浄後の粒子を、篩目開き３２μｍ及び篩目開き７５μｍの試験篩にて湿式分級した。この分級後の多孔質粒子を多孔質粒子（Ｐ１）ともいう。
【0069】
（４）次に、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを取得した。なお、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号１）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体（配列番号４）がペプチド結合によって直列に連結したホモテトラマーからなるイムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：４個）である。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔの発現と精製は以下のようにして行った。すなわち、ＰｒＡｔをコードするプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社製）を形質転換し、得られた形質転換体を富栄養培地中３７℃で対数増殖期まで培養した。その後、培地にイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（和光純薬工業社製）を終濃度１ｍＭで添加して、さらに３７℃で４時間培養することにより、目的タンパク質を発現させた。続いて培養液を遠心分離して上清を除き、得られた菌体に、卵白由来リゾチーム（和光純薬工業社製）及びポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬工業社製）を含むｐＨ９．５の３０ｍＭトリス緩衝液を添加して菌体を破砕した。得られた細胞破砕液から、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ－セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）及び陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ－セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によって、組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質を精製した。精製したイムノグロブリン結合タンパク質を、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度を確認したところ、９５％以上であった。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔの発現と精製は以下のようにして行った。すなわち、ＰｒＡｔをコードするプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社製）を形質転換し、得られた形質転換体を富栄養培地中３７℃で対数増殖期まで培養した。その後、培地にイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（和光純薬工業社製）を終濃度１ｍＭで添加して、さらに３７℃で４時間培養することにより、目的タンパク質を発現させた。続いて培養液を遠心分離して上清を除き、得られた菌体に、卵白由来リゾチーム（和光純薬工業社製）及びポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬工業社製）を含むｐＨ９．５の３０ｍＭトリス緩衝液を添加して菌体を破砕した。得られた細胞破砕液から、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ－セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）及び陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ－セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によって、組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質を精製した。精製したイムノグロブリン結合タンパク質を、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度を確認したところ、９５％以上であった。
【0070】
（５）次いで、１．１Ｍ硫酸ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．８）４５０μＬに、上記（４）で得たイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを１．１６ｍｇ溶解させ、これを上記（３）で得た多孔質粒子（Ｐ１）８ｍｇに加え、混合液を２５℃で５時間振とうすることで、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを多孔質粒子（Ｐ１）に結合させた。粒子に残存するエポキシ基をチオグリセロールで開環させた後、０．５Ｍ ＮａＯＨ及び０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ３．２）を用いて洗浄することで、アフィニティ担体を得た。
【0071】
（実施例２～７、１９、比較例４、５）
各モノマー及び有機溶媒（多孔化剤）の仕込量を、表１、３、５に記載の量とした以外は、実施例１と同様にして、アフィニティ担体を得た。
各モノマー及び有機溶媒（多孔化剤）の仕込量を、表１、３、５に記載の量とした以外は、実施例１と同様にして、アフィニティ担体を得た。
【0072】
（調製例１ イムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：２個）の調製）
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｉを取得した。なお、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｉは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号１）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体（配列番号４）がペプチド結合によって直列に連結したホモダイマーからなるイムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：２個）である。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｉの発現と精製は、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔの発現と精製と同様にして行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｉを取得した。なお、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｉは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号１）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体（配列番号４）がペプチド結合によって直列に連結したホモダイマーからなるイムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：２個）である。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｉの発現と精製は、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔの発現と精製と同様にして行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。
【0073】
（調製例２ イムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：６個）の調製）
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｈを取得した。なお、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｈは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号１）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体（配列番号４）がペプチド結合によって直列に連結したホモヘキサマーからなるイムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：６個）である。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｈの発現と精製は、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔの発現と精製と同様にして行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｈを取得した。なお、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｈは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号１）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体（配列番号４）がペプチド結合によって直列に連結したホモヘキサマーからなるイムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：６個）である。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｈの発現と精製は、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔの発現と精製と同様にして行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。
【0074】
（調製例３ イムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：１０個）の調製）
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｅを取得した。なお、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｅは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号１）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体（配列番号４）がペプチド結合によって直列に連結したホモデカマー（１０量体）からなるイムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：１０個）である。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｅの発現と精製は、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔの発現と精製と同様にして行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｅを取得した。なお、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｅは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号１）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体（配列番号４）がペプチド結合によって直列に連結したホモデカマー（１０量体）からなるイムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：１０個）である。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｅの発現と精製は、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔの発現と精製と同様にして行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。
【0075】
（調製例４ イムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：１個）の調製）
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｍを取得した。なお、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｍは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号１）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体（配列番号４）を１個含むイムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：１個）である。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｍの発現と精製は、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔの発現と精製と同様にして行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｍを取得した。なお、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｍは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号１）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体（配列番号４）を１個含むイムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：１個）である。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｍの発現と精製は、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔの発現と精製と同様にして行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。
【0076】
（調製例５ イムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：１２個）の調製）
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｄを取得した。なお、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｄは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号１）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体（配列番号４）がペプチド結合によって直列に連結したホモドデカマー（１２量体）からなるイムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：１２個）である。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｄの発現と精製は、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔの発現と精製と同様にして行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｄを取得した。なお、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｄは、プロテインＡのＣドメイン（配列番号１）のＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体（配列番号４）がペプチド結合によって直列に連結したホモドデカマー（１２量体）からなるイムノグロブリン結合タンパク質（ドメイン数：１２個）である。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｄの発現と精製は、イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔの発現と精製と同様にして行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。
【0077】
（実施例８～１８、２０、比較例１～３、６～８）
各モノマー及び有機溶媒（多孔化剤）の仕込量を、表２、３及び５に記載の量とし、且つイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを、Ａ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体ドメイン数が表２、３及び５に記載の数であるイムノグロブリン結合タンパク質（イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｉ、ＰｒＡｈ、ＰｒＡｄｅ、ＰｒＡｍ又はＰｒＡｄｄ）に変更した以外は、実施例１と同様にして、アフィニティ担体を得た。
各モノマー及び有機溶媒（多孔化剤）の仕込量を、表２、３及び５に記載の量とし、且つイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを、Ａ１Ｖ／Ｇ２９Ａ変異体ドメイン数が表２、３及び５に記載の数であるイムノグロブリン結合タンパク質（イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｄｉ、ＰｒＡｈ、ＰｒＡｄｅ、ＰｒＡｍ又はＰｒＡｄｄ）に変更した以外は、実施例１と同様にして、アフィニティ担体を得た。
【0078】
（実施例２１）
アガロース（株式会社日本ジーン社製Ａｇａｒｏｓｅ Ｈ）２４ｇ及び精製水４００ｇをバッフル付きセパラブルフラスコに投入し、温水バスにセットし９５℃で２時間加熱することによりアガロース水溶液を調製した。
アガロース水溶液を６０℃まで冷却した後、イソオクタン（和光純薬社製）４４０ｇ及び界面活性剤（三洋化成社製Ｓ－８０）２４ｇを投入し撹拌することによってアガロース水溶液の懸濁液を調製した。その後、この懸濁液を２時間かけて２５℃まで冷却し、その後４時間保持した。
次に、水－エタノール溶液にて粒子を洗浄後、水で回収した。この洗浄後の粒子を、篩目開き３２μｍ及び篩目開き１００μｍの試験篩にて湿式分級し、３２～１００μｍの間の粒子を水で回収し分級後粒子を得た。
次いで、分級後粒子の５０％（ｖ／ｖ）スラリー１００ｍＬに硫酸ナトリウム５０ｇを加え、さらに５０％（ｗ／ｖ）水酸化ナトリウム溶液（和光純薬社製）及びエピクロロヒドリン（和光純薬社製）をそれぞれ１０ｍＬ投入し、４５℃で８時間反応させることにより、アガロースにエポキシ基を導入した。
その後、実施例１の（３）で得た多孔質粒子（Ｐ１）を、上記で得たエポキシ基導入アガロース粒子に変更する以外は、実施例１の（５）と同様の操作を行うことでイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを結合させ、アフィニティ担体を得た。
アガロース（株式会社日本ジーン社製Ａｇａｒｏｓｅ Ｈ）２４ｇ及び精製水４００ｇをバッフル付きセパラブルフラスコに投入し、温水バスにセットし９５℃で２時間加熱することによりアガロース水溶液を調製した。
アガロース水溶液を６０℃まで冷却した後、イソオクタン（和光純薬社製）４４０ｇ及び界面活性剤（三洋化成社製Ｓ－８０）２４ｇを投入し撹拌することによってアガロース水溶液の懸濁液を調製した。その後、この懸濁液を２時間かけて２５℃まで冷却し、その後４時間保持した。
次に、水－エタノール溶液にて粒子を洗浄後、水で回収した。この洗浄後の粒子を、篩目開き３２μｍ及び篩目開き１００μｍの試験篩にて湿式分級し、３２～１００μｍの間の粒子を水で回収し分級後粒子を得た。
次いで、分級後粒子の５０％（ｖ／ｖ）スラリー１００ｍＬに硫酸ナトリウム５０ｇを加え、さらに５０％（ｗ／ｖ）水酸化ナトリウム溶液（和光純薬社製）及びエピクロロヒドリン（和光純薬社製）をそれぞれ１０ｍＬ投入し、４５℃で８時間反応させることにより、アガロースにエポキシ基を導入した。
その後、実施例１の（３）で得た多孔質粒子（Ｐ１）を、上記で得たエポキシ基導入アガロース粒子に変更する以外は、実施例１の（５）と同様の操作を行うことでイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを結合させ、アフィニティ担体を得た。
【0079】
（実施例２２）
１－エチル－３－メチルイミダゾリウムアセテート（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）６０ｇ及びセルロース粉末（フナコシ株式会社製）３．５ｇを、バッフル付きセパラブルフラスコに投入し、温水バスにセットし９５℃に加熱し、２時間撹拌を行うことで、セルロース溶液を得た。
別のセパラブルフラスコ内で、トルエン（和光純薬工業社製）２００ｍＬにエチルセルロース４５（平均分子量１５００００）（和光純薬工業社製）１６ｇを加え、温水バスにセットし８０℃で２時間撹拌を行い溶解させた。この溶液を「エチルセルロース４５含有溶液Ｘ」とも称する。
さらに別のセパラブルフラスコ内で、トルエン１５０ｍＬにエチルセルロース４５を１２ｇ加え、温水バスにセットし８０℃で２時間撹拌を行い溶解させた後、０．２Ｍ硫酸ナトリウム水溶液６２．５ｍＬを加え、３０分間撹拌を行うことでＷ／Ｏ型エマルジョンを得た。
次に、エチルセルロース４５含有溶液Ｘを、上記セルロース溶液に加えて、４００ｒｐｍ、９０℃で１０分間撹拌し、セルロース溶液の液滴分散液（ＩＬ／Ｏ型エマルジョン（ここで、ＩＬはイオン液体））を調製した後、上記で得られたＷ／Ｏ型エマルジョンを加えて、４００ｒｐｍで撹拌しながら２５℃に冷却し、３時間保持した。その後、エタノール１５００ｍＬ中に注ぎ、撹拌後静置しデカンテーションにより上澄み液を除去した。
その後、水とエタノールで濾過洗浄を行い、セルロース粒子を得た。この洗浄後の粒子を、篩目開き３２μｍ及び篩目開き１００μｍの試験篩にて湿式分級し、３２～１００μｍの間の粒子を水で回収し分級後粒子を得た。
分級後のセルロース粒子に、実施例２１と同様の手法でエポキシ基導入を行うことで、エポキシ基導入セルロース粒子を得た。
その後、実施例１の（３）で得た多孔質粒子（Ｐ１）を、上記で得たエポキシ基導入セルロース粒子に変更する以外は、実施例１の（５）と同様の操作を行うことでイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを結合させ、アフィニティ担体を得た。
１－エチル－３－メチルイミダゾリウムアセテート（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）６０ｇ及びセルロース粉末（フナコシ株式会社製）３．５ｇを、バッフル付きセパラブルフラスコに投入し、温水バスにセットし９５℃に加熱し、２時間撹拌を行うことで、セルロース溶液を得た。
別のセパラブルフラスコ内で、トルエン（和光純薬工業社製）２００ｍＬにエチルセルロース４５（平均分子量１５００００）（和光純薬工業社製）１６ｇを加え、温水バスにセットし８０℃で２時間撹拌を行い溶解させた。この溶液を「エチルセルロース４５含有溶液Ｘ」とも称する。
さらに別のセパラブルフラスコ内で、トルエン１５０ｍＬにエチルセルロース４５を１２ｇ加え、温水バスにセットし８０℃で２時間撹拌を行い溶解させた後、０．２Ｍ硫酸ナトリウム水溶液６２．５ｍＬを加え、３０分間撹拌を行うことでＷ／Ｏ型エマルジョンを得た。
次に、エチルセルロース４５含有溶液Ｘを、上記セルロース溶液に加えて、４００ｒｐｍ、９０℃で１０分間撹拌し、セルロース溶液の液滴分散液（ＩＬ／Ｏ型エマルジョン（ここで、ＩＬはイオン液体））を調製した後、上記で得られたＷ／Ｏ型エマルジョンを加えて、４００ｒｐｍで撹拌しながら２５℃に冷却し、３時間保持した。その後、エタノール１５００ｍＬ中に注ぎ、撹拌後静置しデカンテーションにより上澄み液を除去した。
その後、水とエタノールで濾過洗浄を行い、セルロース粒子を得た。この洗浄後の粒子を、篩目開き３２μｍ及び篩目開き１００μｍの試験篩にて湿式分級し、３２～１００μｍの間の粒子を水で回収し分級後粒子を得た。
分級後のセルロース粒子に、実施例２１と同様の手法でエポキシ基導入を行うことで、エポキシ基導入セルロース粒子を得た。
その後、実施例１の（３）で得た多孔質粒子（Ｐ１）を、上記で得たエポキシ基導入セルロース粒子に変更する以外は、実施例１の（５）と同様の操作を行うことでイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを結合させ、アフィニティ担体を得た。
【0080】
（実施例２３）
３６０ｇの純水にポリビニルアルコール２．１５ｇを添加し、加熱撹拌することでポリビニルアルコールを溶解させ、水溶液Ｓ２を調製した。
一方、グリシジルメタクリレート（三菱ガス化学社製）４．５６ｇ及びエチレンジメタクリレート（東京化成社製）６．８４ｇからなる単量体組成物を、２－オクタノン（東洋合成社製）１２．３ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。
次いで、上記水溶液Ｓ２を、セパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、攪拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’－アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．６５ｇを添加し、８６℃に温度を維持しながら２時間撹拌を行った。
その後、純水とエタノールで多孔質粒子を洗浄した。この洗浄後の粒子を、篩目開き３２μｍ及び篩目開き１００μｍの試験篩にて湿式分級し、３２～１００μｍの間の粒子を水で回収し分級後粒子を得た。
その後、実施例１の（３）で得た多孔質粒子（Ｐ１）を、上記で得た分級後粒子に変更する以外は、実施例１の（５）と同様の操作を行うことでイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを結合させ、アフィニティ担体を得た。
３６０ｇの純水にポリビニルアルコール２．１５ｇを添加し、加熱撹拌することでポリビニルアルコールを溶解させ、水溶液Ｓ２を調製した。
一方、グリシジルメタクリレート（三菱ガス化学社製）４．５６ｇ及びエチレンジメタクリレート（東京化成社製）６．８４ｇからなる単量体組成物を、２－オクタノン（東洋合成社製）１２．３ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。
次いで、上記水溶液Ｓ２を、セパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、攪拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’－アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．６５ｇを添加し、８６℃に温度を維持しながら２時間撹拌を行った。
その後、純水とエタノールで多孔質粒子を洗浄した。この洗浄後の粒子を、篩目開き３２μｍ及び篩目開き１００μｍの試験篩にて湿式分級し、３２～１００μｍの間の粒子を水で回収し分級後粒子を得た。
その後、実施例１の（３）で得た多孔質粒子（Ｐ１）を、上記で得た分級後粒子に変更する以外は、実施例１の（５）と同様の操作を行うことでイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを結合させ、アフィニティ担体を得た。
【0081】
（実施例２４～２６）
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを、調製例２で取得したイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｈに変更した以外は、実施例２１～２３と同様にして、アフィニティ担体を得た。
イムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｔを、調製例２で取得したイムノグロブリン結合タンパク質ＰｒＡｈに変更した以外は、実施例２１～２３と同様にして、アフィニティ担体を得た。
【0082】
試験例１ （空孔率及び平均細孔径の測定）
２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を用いて、各実施例及び比較例で得られたアフィニティ担体４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）をカラム容器に充填した。５００ｍＭ 塩化ナトリウム水溶液、プルランのスタンダードサンプル（昭和電工社製Ｐ－８２）を含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液、及びデキストラン（分子量：５，０００，０００～４０，０００，０００（和光純薬社製））を含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液それぞれをカラムに５０μＬずつ打ち込み、溶出体積を記録した。カラム容積からデキストランの溶出体積（粒子空隙容積）を引いた値を「粒子容積」とし、塩化ナトリウムの溶出体積からデキストランの溶出体積を引いた値を「細孔容積」とした。得られた細孔容積を粒子容積で割った値を「湿潤状態での空孔率」として算出した。湿潤状態での空孔率を表１～５に示す。
さらに湿潤状態での平均細孔径を、“Ｈａｇｅｌ，ｅｔ．ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，Ｖｏｌ．７４３（１９９６）３２－４２”に記載の方法で算出した。すなわち、プルランの分子サイズと分配係数Ｋｄのプロットを作成し、近似直線を引き、Ｋｄ＝ε（１－分子サイズ／平均ポアサイズ）＾（１／２）が成り立つことから、切片と傾きから平均細孔径を算出した。湿潤状態での平均細孔径を表１～５に示す。なお、分配係数Ｋｄは、Ｋｄ＝（プルランの溶出体積－デキストランの溶出体積）／（塩化ナトリウムの溶出体積－デキストランの溶出体積）で表される値である。
２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を用いて、各実施例及び比較例で得られたアフィニティ担体４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）をカラム容器に充填した。５００ｍＭ 塩化ナトリウム水溶液、プルランのスタンダードサンプル（昭和電工社製Ｐ－８２）を含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液、及びデキストラン（分子量：５，０００，０００～４０，０００，０００（和光純薬社製））を含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液それぞれをカラムに５０μＬずつ打ち込み、溶出体積を記録した。カラム容積からデキストランの溶出体積（粒子空隙容積）を引いた値を「粒子容積」とし、塩化ナトリウムの溶出体積からデキストランの溶出体積を引いた値を「細孔容積」とした。得られた細孔容積を粒子容積で割った値を「湿潤状態での空孔率」として算出した。湿潤状態での空孔率を表１～５に示す。
さらに湿潤状態での平均細孔径を、“Ｈａｇｅｌ，ｅｔ．ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，Ｖｏｌ．７４３（１９９６）３２－４２”に記載の方法で算出した。すなわち、プルランの分子サイズと分配係数Ｋｄのプロットを作成し、近似直線を引き、Ｋｄ＝ε（１－分子サイズ／平均ポアサイズ）＾（１／２）が成り立つことから、切片と傾きから平均細孔径を算出した。湿潤状態での平均細孔径を表１～５に示す。なお、分配係数Ｋｄは、Ｋｄ＝（プルランの溶出体積－デキストランの溶出体積）／（塩化ナトリウムの溶出体積－デキストランの溶出体積）で表される値である。
【0083】
試験例２ （平均粒子径の測定）
各実施例及び比較例で得られたアフィニティ担体の体積平均粒子径を、ＪＩＳ Ｚ ８８２５（２０１３）に従って、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン・コールター社製 ＬＳ１３３２０）により測定した。なお、溶媒（水）の屈折率は１．３３３に、粒子（アフィニティ担体）の屈折率は１．５０に、それぞれ設定した。
結果を表１～５に示す。なお、表中の数値は、小数点以下を四捨五入した値である。
各実施例及び比較例で得られたアフィニティ担体の体積平均粒子径を、ＪＩＳ Ｚ ８８２５（２０１３）に従って、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン・コールター社製 ＬＳ１３３２０）により測定した。なお、溶媒（水）の屈折率は１．３３３に、粒子（アフィニティ担体）の屈折率は１．５０に、それぞれ設定した。
結果を表１～５に示す。なお、表中の数値は、小数点以下を四捨五入した値である。
【0084】
試験例３ （見掛密度の測定）
実施例１で得られたアフィニティ担体を水に分散させ、スラリーを得た。このスラリーをメスシリンダーに測りとった後、２４時間以上静置することにより、メスシリンダー内で担体を完全に沈降させた。沈降した粒子層の容積をメスシリンダー内で読み取り、アフィニティ担体の湿潤状態での見掛密度を下記式により算出した。
（メスシリンダー内に投入したスラリー重量×スラリー中の固形分濃度［質量％］（Ｔｏｔａｌ ｓｏｌｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ））／沈降した粒子層の容積 × １００
なお、スラリーの固形分濃度は、アルミカップにスラリーを秤量した後、アルミカップを２００℃で１０分間加熱することで水を除去し、残った固形分の重量から算出した。
また、実施例２～７のアフィニティ担体の湿潤状態での見掛密度についても、上記と同様にして測定した。
その結果、実施例１の担体の湿潤状態での見掛密度は１８２ｇ／Ｌ、実施例２の担体の湿潤状態での見掛密度は１５２ｇ／Ｌ、実施例３の担体の湿潤状態での見掛密度は１４５ｇ／Ｌ、実施例４の担体の湿潤状態での見掛密度は１８０ｇ／Ｌ、実施例５の担体の湿潤状態での見掛密度は１５５ｇ／Ｌ、実施例６の担体の湿潤状態での見掛密度は１３５ｇ／Ｌ、実施例７の担体の湿潤状態での見掛密度は１３０ｇ／Ｌであった。
実施例１で得られたアフィニティ担体を水に分散させ、スラリーを得た。このスラリーをメスシリンダーに測りとった後、２４時間以上静置することにより、メスシリンダー内で担体を完全に沈降させた。沈降した粒子層の容積をメスシリンダー内で読み取り、アフィニティ担体の湿潤状態での見掛密度を下記式により算出した。
（メスシリンダー内に投入したスラリー重量×スラリー中の固形分濃度［質量％］（Ｔｏｔａｌ ｓｏｌｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ））／沈降した粒子層の容積 × １００
なお、スラリーの固形分濃度は、アルミカップにスラリーを秤量した後、アルミカップを２００℃で１０分間加熱することで水を除去し、残った固形分の重量から算出した。
また、実施例２～７のアフィニティ担体の湿潤状態での見掛密度についても、上記と同様にして測定した。
その結果、実施例１の担体の湿潤状態での見掛密度は１８２ｇ／Ｌ、実施例２の担体の湿潤状態での見掛密度は１５２ｇ／Ｌ、実施例３の担体の湿潤状態での見掛密度は１４５ｇ／Ｌ、実施例４の担体の湿潤状態での見掛密度は１８０ｇ／Ｌ、実施例５の担体の湿潤状態での見掛密度は１５５ｇ／Ｌ、実施例６の担体の湿潤状態での見掛密度は１３５ｇ／Ｌ、実施例７の担体の湿潤状態での見掛密度は１３０ｇ／Ｌであった。
【0085】
試験例４ （ＤＢＣの測定）
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるタンパク質（ヒトＩｇＧ抗体、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ Ｂｉｏ社製 ＨＧＧ－１０００）に対する実施例及び比較例の各アフィニティ担体のＤＢＣを測定した。カラム容器は容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）のものを、タンパク質は２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）にタンパク質を５ｍｇ／ｍＬ溶解したものをそれぞれ使用し、溶出先端１０％ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からＤＢＣを求め、以下の基準で評価した。結果を表１～５に示す。
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるタンパク質（ヒトＩｇＧ抗体、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ Ｂｉｏ社製 ＨＧＧ－１０００）に対する実施例及び比較例の各アフィニティ担体のＤＢＣを測定した。カラム容器は容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）のものを、タンパク質は２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）にタンパク質を５ｍｇ／ｍＬ溶解したものをそれぞれ使用し、溶出先端１０％ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からＤＢＣを求め、以下の基準で評価した。結果を表１～５に示す。
【0086】
（ＤＢＣの評価基準）
ＡＡＡ：６５ｍｇ／ｍＬ以上
ＡＡ ：６０ｍｇ／ｍＬ以上６５ｍｇ／ｍＬ未満
Ａ ：５３ｍｇ／ｍＬ以上６０ｍｇ／ｍＬ未満
Ｂ ：５０ｍｇ／ｍＬ以上５３ｍｇ／ｍＬ未満
Ｃ ：５０ｍｇ／ｍＬ未満
ＡＡＡ：６５ｍｇ／ｍＬ以上
ＡＡ ：６０ｍｇ／ｍＬ以上６５ｍｇ／ｍＬ未満
Ａ ：５３ｍｇ／ｍＬ以上６０ｍｇ／ｍＬ未満
Ｂ ：５０ｍｇ／ｍＬ以上５３ｍｇ／ｍＬ未満
Ｃ ：５０ｍｇ／ｍＬ未満
【0087】
【表1】
【0088】
【表2】
【0089】
【表3】
【0090】
【表4】
【0091】
【表5】
【0092】
表中の記号は、それぞれ以下を示す。
ＧＭＡ：グリシジルメタクリレート
ＤＶＢ：ジビニルベンゼン
ＭＨＫ：２－オクタノン
ＡｃＰｈ：アセトフェノン
ＧＭＡ＋ＥＤＭＡ：グリシジルメタクリレートとエチレンジメタクリレートとの重合体
ＧＭＡ：グリシジルメタクリレート
ＤＶＢ：ジビニルベンゼン
ＭＨＫ：２－オクタノン
ＡｃＰｈ：アセトフェノン
ＧＭＡ＋ＥＤＭＡ：グリシジルメタクリレートとエチレンジメタクリレートとの重合体
【配列表】