特許 7441245 組換え腫瘍溶解性ウイルスとその調製方法、使用および医薬品

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-02-20

(45)【発行日】2024-02-29

(54)【発明の名称】組換え腫瘍溶解性ウイルスとその調製方法、使用および医薬品

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/38 20060101AFI20240221BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/39 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/43 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/41 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/45 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240221BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/56 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/53 20060101ALI20240221BHJP

   A61K 35/768 20150101ALI20240221BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20240221BHJP

   A61K 35/763 20150101ALI20240221BHJP

   A61K 35/765 20150101ALI20240221BHJP

   A61K 35/766 20150101ALI20240221BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240221BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240221BHJP

【ＦＩ】

C12N15/38

C12N7/01 ZNA

C12N15/39

C12N15/43

C12N15/41

C12N15/45

C12N15/113 100Z

C12N15/55

C12N15/113 130Z

C12N15/12

C12N15/56

C12N15/53

A61K35/768

A61K35/761

A61K35/763

A61K35/765

A61K35/766

A61P35/00

A61K31/7105

【請求項の数】 26

(21)【出願番号】P 2021571547

(86)(22)【出願日】2020-05-28

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-04

(86)【国際出願番号】 CN2020093006

(87)【国際公開番号】W WO2020239040

(87)【国際公開日】2020-12-03

【審査請求日】2022-01-18

(31)【優先権主張番号】201910462073.5

(32)【優先日】2019-05-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

【微生物の受託番号】CCTCC  CCTCC V201919

(73)【特許権者】

【識別番号】521523947

【氏名又は名称】伍沢堂

(74)【代理人】

【識別番号】240000327

【弁護士】

【氏名又は名称】弁護士法人クレオ国際法律特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】伍沢堂

【審査官】市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１９／０２３４８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／０１５６０１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１０－５３９９５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１５／０２５９４０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００４／０２４１８５４（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ７／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ゲノム配列に、
（１）第１のプロモーターと第１の干渉ＲＮＡ発現配列とを含む第１の発現カセットと、
（２）標的配列と、
（３）第２の発現カセットと
の外因性要素が含まれ、
前記第１の干渉ＲＮＡ発現配列は、前記標的配列に結合する第１の干渉ＲＮＡの発現に用いられ、前記第１の干渉ＲＮＡ発現配列は、第１の細胞で前記第１の干渉ＲＮＡを発現するように前記第１のプロモーターによって駆動され、
前記標的配列は、組換え腫瘍溶解性ウイルスの複製に必須なものである必須遺伝子の５’末端非コード領域または３’末端非コード領域に位置し、
前記第２の発現カセットは、第２のプロモーターと阻害成分発現配列とを含み、前記阻害成分発現配列が、腫瘍特異的に阻害成分を発現させることに用いられ、前記阻害成分が酵素の生合成の抑制および／または生物学的活性の抑制に用いられ、前記酵素が干渉ＲＮＡの生合成に必要な酵素であり、前記阻害成分発現配列が、前記第１の細胞で前記阻害成分を発現させずに第２の細胞で前記阻害成分を発現させるように前記第２のプロモーターによって駆動され、
前記第２の細胞は哺乳動物の腫瘍細胞であり、前記第１の細胞は哺乳動物の非腫瘍細胞であり、
前記標的配列は、第１の干渉ＲＮＡの標的配列であり、
前記阻害成分には、前記酵素の遺伝子の発現を干渉して前記酵素の生合成を阻害する第３の干渉ＲＮＡが含まれ、
前記第３の干渉ＲＮＡの塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されている
ことを特徴とする組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項2】

前記第１の発現カセットは、第２の干渉ＲＮＡを発現するための第２の干渉ＲＮＡ発現配列をさらに有し、前記第２の干渉ＲＮＡは、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの複製に非必須の非必須遺伝子のオープンリーディングフレームに作用して前記非必須遺伝子の発現を阻害し、前記第２の干渉ＲＮＡ発現配列は、前記第１のプロモーターの駆動により発現される
ことを特徴とする請求項１に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項3】

前記第１の干渉ＲＮＡと前記第２の干渉ＲＮＡは、それぞれ独立した低分子干渉ＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡである
ことを特徴とする請求項２に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項4】

前記哺乳動物はヒトであり、
前記腫瘍細胞は、肺がん細胞、肝臓がん細胞、乳がん細胞、胃がん細胞、前立腺がん細胞、脳腫瘍細胞、ヒト結腸がん細胞、子宮頸がん細胞、腎臓がん細胞、卵巣がん細胞、頭頸部がん細胞、黒色腫細胞、膵臓がん細胞または食道がん細胞である
ことを特徴とする請求項２に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項5】

前記標的配列は、非哺乳動物の遺伝子の短い配列から選択され、
前記標的配列が、前記非哺乳動物の遺伝子におけるオープンリーディングフレームの長さが１９－２３個のヌクレオチドのヌクレオチド配列から選択され、
前記非哺乳動物が、酵母、クラゲ、大腸菌、昆虫、魚または植物であり、
前記非哺乳動物の遺伝子は、クラゲ由来の緑色蛍光タンパク質遺伝子、大腸菌由来のβ－ガラクトシダーゼ遺伝子、およびホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子から選択されるいずれか１種である
ことを特徴とする請求項２に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項6】

前記標的配列の塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されており、前記第１の干渉ＲＮＡの塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されている
ことを特徴とする請求項５に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項7】

前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの１つまたは複数の必須遺伝子の５’末端非コード領域または３’末端非コード領域に前記標的配列が挿入されており、
前記標的配列の挿入された任意の位置でのコピー数は１つ以上である
ことを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項8】

前記組換え腫瘍溶解性ウイルスは単純ヘルペスウイルスであり、前記必須遺伝子はＩＣＰ２７であり、非必須遺伝子はＩＣＰ３４．５である
ことを特徴とする請求項１に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項9】

前記第２の干渉ＲＮＡの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されている
ことを特徴とする請求項２に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項10】

前記第１のプロモーターは構成的プロモーターであり、
複数の必須遺伝子の５’末端非コード領域または３’末端非コード領域に前記標的配列が挿入される場合、前記第１の発現カセットが、前記第１の干渉ＲＮＡのみを発現し、前記第１のプロモーターがヒトＨｕ６またはＨ１プロモーターであり、
１つの必須遺伝子の５’末端非コード領域または３’末端非コード領域に前記標的配列が挿入される場合、前記第１の発現カセットが、前記第１の干渉ＲＮＡと前記第２の干渉ＲＮＡを発現し、前記第１のプロモーターが、ＣＭＶ、ＳＶ４０およびＣＢＡプロモーターから選択されるいずれか１種である
ことを特徴とする請求項２に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項11】

前記第２のプロモーターはヒト癌特異的プロモーターであり、
前記ヒト癌特異的プロモーターが、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター（ｈＴＥＲＴ）、ヒト上皮成長因子受容体－２プロモーター（ＨＥＲ－２）、Ｅ２Ｆ１プロモーター、オステオカルシンプロモーター、癌胎児性抗原プロモーター、サバイビンプロモーターおよびセルロプラスミンプロモーターから選択されるいずれか１種である
ことを特徴とする請求項１に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項12】

前記酵素が、Ｄｒｏｓｈａである
ことを特徴とする請求項１に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項13】

前記阻害成分には、Ｄｒｏｓｈａの生物学的活性を抑制するためのヌクレオチドトリプレットリピート配列またはＤｉｃｅｒ活性を抑制するための非コードＲＮＡがさらに含まれ、
前記ヌクレオチドトリプレットリピート配列が、（ＣＧＧ）ｎの一般式を有し、ただし、ｎが２０以上の自然数であり、
ｎの値の範囲が６０～１５０であり、
前記Ｄｉｃｅｒ活性を抑制するための非コードＲＮＡが５型アデノウイルスＶＡ１ ＲＮＡであり、
前記５型アデノウイルスＶＡ１ ＲＮＡの塩基配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されている
ことを特徴とする請求項１に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項14】

前記第２の発現カセットには、前記阻害成分の発現を増強するためのエンハンサー配列がさらに含まれ、
前記エンハンサー配列が、ＣＭＶまたはＳＶ４０エンハンサー配列である
ことを特徴とする請求項１１～１３のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項15】

前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの受託番号は、ＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ２０１９１９である
ことを特徴とする請求項１４に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項16】

ゲノム配列には、干渉ＲＮＡの標的配列と発現カセットとの外因性要素が含まれ、
前記発現カセットに、プロモーターと干渉ＲＮＡ発現配列とが含まれ、前記干渉ＲＮＡ発現配列が、前記標的配列に結合する前記干渉ＲＮＡの発現に用いられ、
前記干渉ＲＮＡの標的配列は、組換え腫瘍溶解性ウイルスの複製に必須なものである必須遺伝子の５’末端非コード領域または３’末端非コード領域に位置し、
前記干渉ＲＮＡ発現配列は、第２の細胞で前記干渉ＲＮＡを発現させずに第１の細胞で前記干渉ＲＮＡを発現させるように第１の細胞特異的プロモーターによって駆動され、
前記第２の細胞は哺乳動物の腫瘍細胞であり、前記第１の細胞は哺乳動物の非腫瘍細胞である
ことを特徴とする組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【請求項17】

請求項１～１５のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスを調製するための組成物であって、
前記標的配列、前記第１の発現カセット、および前記第２の発現カセットのうちの１種または複数種の要素を有する配列からなる核酸と、親ウイルスおよび相補的な宿主細胞の少なくとも一方とを含み、
前記親ウイルスのゲノム配列は、野生型ウイルスのゲノム配列に対して、前記必須遺伝子が欠失するものであり、
前記相補的な宿主細胞には、前記必須遺伝子を発現するＤＮＡ断片が含まれる
ことを特徴とする組成物。

【請求項18】

請求項１～１５のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスを調製するための方法であって、
前記標的配列、前記第１の発現カセット、および前記第２の発現カセットのうちの１種または複数種の要素を有する配列からなる核酸を野生型腫瘍溶解性ウイルスのゲノムに取り込むことを含む
ことを特徴とする方法。

【請求項19】

前記核酸の存在下で、親ウイルスおよび相補的な宿主細胞とを共培養し、培養物から前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを収集することを含み、
前記親ウイルスのゲノム配列は、野生型腫瘍溶解性ウイルスのゲノム配列に対して、前記必須遺伝子が欠失するものであり、
前記相補的な宿主細胞には、前記必須遺伝子を発現するＤＮＡ断片が含まれる
ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

ＩＣＰ２７を発現するＶｅｒｏ細胞株を調製するステップと、親ウイルスを調製するステップと、遺伝子操作されたＩＣＰ２７および調節成分発現プラスミドを構築するステップと、組換え溶解性ヘルペスウイルスを構築するステップとを含む
ことを特徴とする請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

細胞を選択的に死滅させる医薬品の調製における、請求項１～１６のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスの使用。

【請求項22】

前記細胞は腫瘍細胞である
ことを特徴とする請求項２１に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスの使用。

【請求項23】

請求項１～１６のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス、および薬学に許容されるアジュバントを含有する
ことを特徴とする細胞を死滅させるための医薬品。

【請求項24】

前記細胞は腫瘍細胞である
ことを特徴とする請求項２３に記載の医薬品。

【請求項25】

組換え腫瘍溶解性ウイルスの力価の測定のステップと、組換え腫瘍溶解性ウイルスの増幅のステップと、組換え腫瘍溶解性ウイルスの精製のステップと、ｍＲＮＡ発現分析のステップと、タンパク質発現分析のステップと、ｍｉＲＮＡ発現分析のステップとを含む
請求項１～１５のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスを検出する方法。

【請求項26】

前記細胞が腫瘍細胞である、
細胞を選択的死滅させる使用に用いられる請求項１～１６のいずれか１項に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願への相互参照）
本願は、２０１９年５月３０日に中国特許庁に提出された出願番号２０１９１０４６２０７３．５の「組換え腫瘍溶解性ウイルスとその調製方法、使用および医薬品」という名称の中国特許出願の優先権を主張し、その内容のすべてはここに参照として取り込まれる。

【0002】

本開示は、バイオテクノロジーの分野に関し、具体的には、組換え腫瘍溶解性ウイルスとその調製方法、使用および医薬品に関する。

【背景技術】

【0003】

がんは、すでに人々の健康を脅かす主なキラーになっている。「２０１５世界のがん統計」のデータによると、２０１５年に、世界中で約１，４１０万例の新しいがんの症例があり、８２０万人が死亡した。２０１５年、中国では４２９万人の新規がん症例が発生し、２８１万人が死亡した。現在、がんの治療は主に伝統的な外科的切除、放射線療法および化学療法に依存している。外科的切除の場合、患者の痛みをある程度和らげることができるが、体の奥深くにある癌には適さず、広がった腫瘍には無力である。放射線療法と化学療法は長年臨床的に使用されてきたが、非選択性、大きな副作用、および高線量／高薬量による死の潜在的なリスクのために、それらの応用は制限されている。近年、特に過去５年間で、がん治療における抗体とＣＡＲ Ｔの可能性と応用がますます注目されている。抗体療法は癌の進行を遅らせることができるが、治癒効果があまり良くなく、補助療法としてより適していると広く考えられている。ＣＡＲ Ｔ治療は、正確に標的を狙い、がんを根治する可能性があるが、その治療が主に血液がんに適し、かつ一つの治療計画が一人の特定の患者にのみ適すため、一般のがん患者にとって治療費が非常に高く、より大きな問題として、ＣＡＲ Ｔ治療が標的から外れると患者が死にいたる。がん治療を安全かつ効率的に行い、がん患者の苦痛を軽減するためには、新しい案による新薬の開発が急務である。多くの可能な選択肢のうち、腫瘍溶解性ウイルスは薬剤耐性がなく、安全で効果的であるため、がんを治療するために遺伝子工学に操作された腫瘍溶解性ウイルスは特に魅力的である。

【0004】

１００年前の臨床観察では、ウイルスの感染で腫瘍の成長を遅らせ、または腫瘍を消失させたことが観察された。その後、Ｂ型肝炎患者の血漿またはＢ型肝炎患者の血漿抽出物を用いてホジキン病を治療したことがある。しかし、がん細胞だけでウイルスを成長して増殖させることは不可能であったため、ウイルスががん治療の実行可能な選択肢であるとは考えていなかった。１９９０年代、分子生物学技術の進歩により、ウイルスを遺伝子操作してがん細胞に対して特異的な向性を持たせる道を開いた。初期の研究は、主に欠陥スプリットウイルス（ウイルスが感染した後、ウイルスが細胞内で増殖して細胞を死滅させ、死んだ細胞から放出されて隣接の細胞に感染する。これらのウイルスの例として、例えば、アデノウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヘルペスウイルスが挙げられる）、および欠損非溶解性ウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルスおよびレンチウイルスなど）を増殖させて免疫分子（ＧＭＣＳＦ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７）または免疫応答刺激因子（ＴＮＦα、ＩＦＮα）を発現させて、免疫応答を高めることによってがんを治療していた。ウイルスによる免疫療法は、従来の免疫療法と同様に、一般に臨床効果がよくないため、主に補助療法として使用される方法と考えられている。がん治療におけるウイルスの役割を強化するために、近年の研究では、主に遺伝子操作されたスプリットウイルスを利用し、がん細胞中で選択的に増殖（腫瘍溶解性ウイルス）させ、腫瘍内注射により元の腫瘍細胞中で増殖してがん細胞（溶解性）を死滅させ、溶解したがん細胞の断片が癌特異的な免疫応答を引き起こし、広がったがん細胞を死滅させることによって、がん治療の目的を達成していた。腫瘍溶解性ウイルスが安全で、かつ１つの腫瘍溶解性ウイルスが多種類のがんを治療する可能性があるため、がん治療における腫瘍溶解性ウイルスの応用の将来性は期待されている。米国、欧州連合、およびオーストラリアでは、２０１５年から２０１６年にかけて、メラノーマの治療にＡｍｇｅｎ社のＩ型ヘルペスウイルによる腫瘍溶解性ウイルスＴｖｅｃの臨床使用を前後して承認し、腫瘍溶解性ウイルスによるがん治療の新時代の幕が開いた。その後、腫瘍溶解性ウイルスの開発が本格化され、２０１７年だけでも、世界中、腫瘍溶解性ウイルスを使用して様々ながんを治療した臨床試験が８０件あった。多種の腫瘍溶解性ウイルスは、単一の動物モデルで優れた性能を発揮し、臨床において安全だが、一般的な反応率と治癒率に満足なものにはまだ程遠い。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、新しい組換え腫瘍溶解性ウイルス、該ウイルスを調製するための核酸配列と方法、がん治療における該組換え腫瘍溶解性ウイルスの関連する使用、および該組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬品などを提供する。該組換え腫瘍溶解性ウイルスの増殖または複製は、ゲノム配列に挿入された外因性要素によってコントロールされている。これらの外因性要素のコントロールによって、該組換え腫瘍溶解性ウイルスは異なるタイプの細胞で選択的に増殖または複製することができ、非標的細胞（例えば、正常細胞）に損傷を与えず、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を選択的に死滅させることができる。

【0006】

現在、従来の腫瘍溶解性ウイルスは、主に１つまたは複数のウイルス非必須遺伝子を排除するか、１つまたは複数の必須遺伝子を癌特異的プロモーターの駆動下で発現させることによって、がん細胞における腫瘍溶解性ウイルスの選択的増殖の目的を達成するものである。ウイルスの増殖については、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの場合、非必須遺伝子を必要としないが、ｉｎ ｖｉｖｏでの場合、非必須遺伝子がウイルスの増殖を促進するために宿主の抗ウイルスメカニズムに拮抗するなど複数の機能を実行している。１つまたは複数の必須遺伝子を癌特異的プロモーターの駆動下で発現させる案を利用して構築された腫瘍溶解性ウイルスは、完全なウイルス遺伝子を持っているが、ウイルス遺伝子の時間に伴う発現の高度な調和性が変わった。したがって、非必須遺伝子の削除または癌特異的プロモーターの駆動下での必須遺伝子の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏでのウイルスの増殖に影響を及ぼす。要するに、現在の腫瘍溶解性ウイルスの不十分な臨床成績は既存の設計案による結果である。腫瘍溶解性ウイルスの有効性と広域性を高めるために、ウイルスのゲノムの完全性を維持するとともにウイルス遺伝子の時間に伴う発現の高度な調和性に影響を与えることないようにすることが腫瘍溶解性ウイルスの設計に重要である。以上のようなことを考慮して、本開示は、新しい案を採用し、新しい腫瘍溶解性ウイルスを作製した。

【0007】

第１の局面において、本開示は、組換え腫瘍溶解性ウイルスを提供し、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスのゲノム配列に、
（１）第１のプロモーターと第１の干渉ＲＮＡ発現配列とを含む第１の発現カセットと、
（２）標的配列と、
（３）第２の発現カセットと、
の外因性要素が含まれ、
前記第１の干渉ＲＮＡ発現配列は、前記標的配列に結合した第１の干渉ＲＮＡの発現に用いられ、前記第１の干渉ＲＮＡ発現配列は、第１の細胞で前記第１の干渉ＲＮＡを発現するように前記第１のプロモーターによって駆動され、
前記標的配列は、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの複製に必須な必須遺伝子の５’末端非コード領域または３’末端非コード領域に位置し、
前記第２の発現カセットは、第２のプロモーターと阻害成分発現配列とを含み、前記阻害成分発現配列が阻害成分の発現に用いられ、前記阻害成分が酵素の生合成の抑制および／または生物学的活性の抑制に用いられ、前記酵素が干渉ＲＮＡの生合成に必要な酵素であり、前記阻害成分発現配列が、前記第１の細胞で前記阻害成分を発現させずに第２の細胞で前記阻害成分を発現させるように前記第２のプロモーターによって駆動され、
前記第１の細胞と前記第２の細胞とは異なるタイプのものである。

【0008】

本開示による組換え腫瘍溶解性ウイルスは、そのゲノムに外因性の第１の干渉ＲＮＡ標的配列、第１の発現カセットおよび第２の発現カセットなどの外因性要素（図１を参照）を挿入して、そして第１のプロモーターを利用して第１の細胞（非標的細胞、例えば、正常細胞）で第１の干渉ＲＮＡの発現を駆動し、第２のプロモーターを利用して第１の細胞で阻害成分を発現させず、第２の細胞（標的細胞、例えば、腫瘍細胞）で阻害成分の発現を駆動するコントロール案により、該組換え腫瘍溶解性ウイルスが第１の細胞に感染したとき、発現する第１の干渉ＲＮＡがウイルス必須遺伝子の５’末端または３’末端非コード領域に位置する干渉ＲＮＡの標的配列に結合して必須遺伝子の翻訳を阻害し、さらにウイルスの増殖または複製を抑制し、第１の細胞に対して死滅効果がなく、または死滅効果が非常に低く、そして、組換え腫瘍溶解性ウイルスが第２の細胞に感染したとき、第２のプロモーターの駆動下で発現された阻害成分が干渉ＲＮＡの合成に関与する酵素の生合成および／または生物学的活性を抑制するため、第１の干渉ＲＮＡによる干渉が機能できなくなる。このようにして、必須遺伝子が正常に転写、翻訳され、該組換え腫瘍溶解性ウイルスが第２の細胞で増殖または複製され、第２の細胞に死滅効果をもつ。

【0009】

従来の組換え腫瘍溶解性ウイルスと異なり、本開示による組換え腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスゲノムの完全性を保つことができるとともに、ウイルス遺伝子の秩序のよい発現を乱すことなく、また、選択的に野生型ウイルスと同様のまたは野生型ウイルスに近い能力で第２の細胞で増殖または複製して第２の細胞に死滅効果をもつとともに、第１の細胞に死滅効果をもたないようにすることができ、第１の細胞に対して安全である。したがって、該組換え腫瘍溶解性ウイルスは、幅広く使用でき、例えば、本開示に係る組換え腫瘍溶解性ウイルスを利用すれば、高い死滅効率で、第２の細胞、例えば、腫瘍細胞を死滅させるとともに、第１の細胞、例えば、正常細胞に死滅効果をもたらさないようにすることができ、安全性と高い効率の目的を達することができる。

【0010】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記第１の発現カセットは、第２の干渉ＲＮＡを発現するための第２の干渉ＲＮＡ発現配列をさらに有し、前記第２の干渉ＲＮＡは、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの複製に非必須の非必須遺伝子のオープンリーディングフレームに作用して前記非必須遺伝子の発現を阻害し、前記第２の干渉ＲＮＡ発現配列は、前記第１のプロモーターの駆動により発現される。

【0011】

第２の干渉ＲＮＡを使用することにより、ウイルスが第１の細胞に感染したとき、第２の干渉ＲＮＡもウイルスの非必須遺伝子のオープンリーディングフレームに結合し、非必須遺伝子の翻訳を阻害してその発現を干渉することができ、第１の干渉ＲＮＡの役割と似ており、第１の細胞でウイルスの増殖または複製をできる限り抑制し、第１の細胞の安全性を向上させる。

【0012】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記第１の干渉ＲＮＡと前記第２の干渉ＲＮＡは、それぞれ独立した低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。

【0013】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記第２の細胞は哺乳動物の腫瘍細胞であり、前記第１の細胞は哺乳動物の非腫瘍細胞である。

【0014】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記哺乳動物はヒトである。

【0015】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記腫瘍細胞は、肺がん細胞、肝臓がん細胞、乳がん細胞、胃がん細胞、前立腺がん細胞、脳腫瘍細胞、ヒト結腸がん細胞、子宮頸がん細胞、腎臓がん細胞、卵巣がん細胞、頭頸部がん細胞、黒色腫細胞、膵臓がん細胞または食道がん細胞である。

【0016】

なお、本開示による組換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞を選択的に死滅させることに限定されず、他の非腫瘍タイプの狙った細胞の死滅にも使用できる。すなわち、任意の狙った細胞も上記の第２の細胞または標的細胞とすることができ、狙わない細胞を第１の細胞または非標的細胞とする。例えば、神経細胞、赤血球、白血球、血小板、食細胞、上皮細胞、心筋細胞、卵細胞、精子などのいずれか１種の細胞を第２の細胞として死滅させることができ、すなわち、哺乳動物由来の任意の細胞も第２の細胞とすることができ、第２の細胞として選択されていない細胞のうちの任意の１種、複数種、またはすべてを第１の細胞とし、該組換え腫瘍溶解性ウイルスがこれらの第１の細胞に死滅効果をもたない。

【0017】

また、本開示の組換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスに限定されず、他のタイプのウイルスも本開示に適用することができ、本開示による技術案をもとに、標的細胞を選択的に死滅させる効果を達成できれば、他のタイプのウイルス（如何なるタイプでもよい）で本開示の腫瘍溶解性ウイルスを置き換えてもよく、これも本開示の保護範囲に属する。

【0018】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記標的配列は、非哺乳動物の遺伝子の短い配列から選択される。

【0019】

好ましくは、本開示のいくつかの実施形態において、前記標的配列が、前記非哺乳動物の遺伝子におけるオープンリーディングフレームの長さが１９－２３個のヌクレオチドのヌクレオチド配列から選択される。

【0020】

好ましくは、本開示のいくつかの実施形態において、前記非哺乳動物が、酵母、クラゲ、大腸菌、昆虫、魚または植物である。

【0021】

好ましくは、本開示のいくつかの実施形態において、前記非哺乳動物の遺伝子は、クラゲ由来の緑色蛍光タンパク質遺伝子、大腸菌由来のβ－ガラクトシダーゼ遺伝子、およびホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子から選択されるいずれか１種である。

【0022】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記標的配列の塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されており、前記第１の干渉ＲＮＡの塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されている。

【0023】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの１つまたは複数の必須遺伝子の５’末端非コード領域または３’末端非コード領域に前記標的配列が挿入されている。

【0024】

好ましくは、前記標的配列の挿入された任意の位置でのコピー数は１つ以上である。

【0025】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ、ＨＳＶ）、アデノウイルス、ウシポックスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、麻疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、ウシポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＶＳＶ）およびインフルエンザウイルスから選択されるいずれか１種である。

【0026】

好ましくは、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが単純ヘルペスウイルスである場合、必須遺伝子が、エンベロープ糖タンパク質Ｌ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、キャプシドタンパク質、スパイラルエンザイムプロ酵素サブユニット、ＤＮＡ複製開始結合ヘリカーゼ、ミリスチン酸誘導体タンパク質、デオキシリボヌクレアーゼ、外被セリン／トレオニンプロテインキナーゼ、ＤＮＡパッケージング末端酵素サブユニット１、コートタンパク質ＵＬ１６、ＤＮＡパッケージングタンパク質ＵＬ１７、キャプシドの３本鎖サブユニット２、主要なキャプシドタンパク質、エンベロープタンパク質ＵＬ２０、核タンパク質ＵＬ２４、ＤＮＡパッケージングタンパク質ＵＬ２５、キャプシド成熟プロテアーゼ、キャプシドタンパク質、エンベロープ糖タンパク質Ｂ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ触媒サブユニット、核外輸送層タンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質ＵＬ３２、ＤＮＡパッケージングタンパク質ＵＬ３３、核外輸送膜タンパク質、大キャプシドタンパク質、キャプシドの３本鎖サブユニット１、リボヌクレオチド還元酵素サブユニット１、リボヌクレオチド還元酵素サブユニット２、エンベロープ宿主閉鎖タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ加工性サブユニット、膜タンパク質ＵＬ４５、コートタンパク質ＶＰ１３／１４、トランス活性化タンパク質ＶＰ１６、コートタンパク質ＶＰ２２、エンベロープ糖タンパク質Ｎ、コートタンパク質ＵＬ５１、ヘリカーゼ－プライマーゼプライマーゼサブユニット、エンベロープ糖タンパク質Ｋ、ＩＣＰ２７、核タンパク質ＵＬ５５、核タンパク質ＵＬ５６、転写調節因子ＩＣＰ４、調節タンパク質ＩＣＰ２２、エンベロープ糖タンパク質Ｄおよび膜タンパク質ＵＳ８Ａから選択され、非必須遺伝子が、ＩＣＰ３４．５、ＩＣＰ０、核タンパク質ＵＬ３、核タンパク質ＵＬ４、スパイラルエンザイムプロ酵素スパイラルエンザイムサブユニット、表皮タンパク質ＵＬ７、エンベロープ糖タンパク質Ｍ、コートタンパク質ＵＬ１４、コートタンパク質ＵＬ２１、エンベロープ糖タンパク質Ｈ、チミジンキナーゼ、ＤＮＡパッキングターミナーゼサブユニット２、小キャプシドタンパク質、コートタンパク質ＵＬ３７、エンベロープタンパク質ＵＬ４３、エンベロープ糖タンパク質Ｃ、コートタンパク質ＶＰ１１／１２、デオキシウリジントリホスファターゼ、ウイルスタンパク質ＵＳ２、セリン／トレオニンプロテインキナーゼＵ３、膜Ｇ糖タンパク質、エンベロープ糖タンパク質Ｊ、エンベロープ糖タンパク質Ｉ、エンベロープ糖タンパク質Ｅ、膜タンパク質ＵＳ９、ウイルスタンパク質ＵＳ１０、表皮タンパク質Ｕｓ１１およびＩＣＰ４７から選択される１種または複数種である。

【0027】

好ましくは、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスがアデノウイルスである場合、必須遺伝子が、初期タンパク質１Ａ、初期タンパク質１Ｂ １９Ｋ、初期タンパク質１Ｂ ５５Ｋ、カプセル化されたタンパク質Ｉｖａ２、ＤＮＡポリメラーゼ、末端タンパク質前駆体ｐＴＰ、カプセル化されたタンパク質５２Ｋ、キャプシドタンパク質前駆体ｐＩＩＩａ、ペントンマトリックス、コアタンパク質ｐＶＩＩ、コアタンパク質前駆体ｐＸ、コアタンパク質前駆体ｐＶＩ、ヘキソン、プロテアーゼ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ヘキサマーアセンブリタンパク質１００Ｋ、タンパク質３３Ｋ、カプセル化されたタンパク質２２Ｋ、キャプシドタンパク質前駆体、タンパク質Ｕ、フィブリン、調節タンパク質Ｅ４オープンリーディングフレーム６／７、調節タンパク質Ｅ４ ３４Ｋ、調節タンパク質Ｅ４オープンリーディングフレーム４、調節タンパク質Ｅ４オープンリーディングフレーム３、調節タンパク質Ｅ４オープンリーディングフレーム２および調節タンパク質Ｅ４オープンリーディングフレーム１から選択される１種または複数種であり、非必須遺伝子が、キャプシドタンパク質ＩＸ、タンパク質１３．６Ｋ、コアタンパク質Ｖ、調節タンパク質Ｅ３ １２．５Ｋ、膜糖タンパク質Ｅ３ ＣＲ１－α、膜糖タンパク質Ｅ３ ｇｐ１９Ｋ、膜糖タンパク質Ｅ３ ＣＲ１－β、膜糖タンパク質Ｅ３ ＣＲ１－δ、膜糖タンパク質Ｅ３ ＲＩＤ－δおよび膜糖タンパク質Ｅ３ １４．７Ｋから選択される１種または複数種である。

【0028】

好ましくは、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスがウシポックスウイルスである場合、必須遺伝子が、ヌクレオチド還元酵素小サブユニット、セリン／トレオニンキナーゼ、ＤＮＡ結合ウイルスコアタンパク質、ポリメラーゼ大サブユニット、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット、ＤＮＡポリメラーゼ、スルフヒドリルオキシダーゼ、仮想的ＤＮＡ結合ウイルス核タンパク質、ＤＮＡ結合リンタンパク質、ウイルスコアシステインプロテアーゼ、ＲＮＡヘリカーゼＮＰＨ－ＩＩ、仮想的メタロプロテアーゼ、転写伸長因子、グルタチオン様タンパク質、ＲＮＡポリメラーゼ、仮想的ウイルス核タンパク質、後期転写因子ＶＬＴＦ－１、ＤＮＡ結合ウイルス核タンパク質、ウイルスキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ小サブユニット、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットｒｐｏ２２、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットｒｐｏ１４７、セリン／トレオニンプロテインホスファターゼ、ＩＭＶヘパリン結合性表面タンパク質、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、後期転写因子ＶＬＴＦ－４、ＤＮＡトポイソメラーゼＩ型、ｍＲＮＡキャッピング酵素大サブユニット、ウイルスコアタンパク質１０７、ウイルスコアタンパク質１０８、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ、トリホスファターゼ、初期遺伝子転写因子ＶＥＴＦの７０ｋＤａ小サブユニット、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットｒｐｏ１８、ヌクレオシド三リン酸加水分解酵素－Ｉ、ｍＲＮＡキャッピング酵素小サブユニット、リファンピシンターゲット、後期転写因子ＶＬＴＦ－２、後期転写因子ＶＬＴＦ－３、ジスルフィド結合形成経路、コアタンパク質４ｂ前駆体ｐ４ｂ、コアタンパク質３９ｋＤａ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットｒｐｏ１９、初期遺伝子転写因子ＶＥＴＦの８２ｋＤａ大サブユニット、転写因子ＶＩＴＦ－３の３２ｋＤａ小サブユニット、ＩＭＶ膜タンパク質１２８、コアタンパク質４ａ前駆体Ｐ４ａ、ＩＭＶ膜タンパク質１３１、ホスホネート化ＩＭＶ膜タンパク質、ＩＭＶ膜タンパク質Ａ１７Ｌ、ＤＮＡヘリカーゼ、ウイルスＤＮＡポリメラーゼプロセシング因子、ＩＭＶ膜タンパク質Ａ２１Ｌ、パルミトイル化タンパク質、中間遺伝子転写因子ＶＩＴＦ－３の４５ｋＤａ大サブユニット、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットｒｐｏ１３２、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼｒｐｏ３５、ＩＭＶタンパク質Ａ３０Ｌ、仮想的ＡＴＰアーゼ、セリン／トレオニンキナーゼ、ＥＥＶ成熟タンパク質、パルミトイル化ＥＥＶ膜糖タンパク質、ＩＭＶ表面タンパク質Ａ２７Ｌ、ＥＥＶ膜リン酸糖タンパク質、ＩＥＶとＥＥＶ膜糖タンパク質、ＥＥＶ膜糖タンパク質、ジスルフィド結合形成経路タンパク質、仮想的ウイルス核タンパク質、ＩＭＶ膜タンパク質Ｉ２Ｌ、ポックスウイルスミリストイルタンパク質、ＩＭＶ膜タンパク質Ｌ１Ｒ、後期１６ｋＤａ仮想的膜タンパク質、仮想的ウイルス膜タンパク質Ｈ２Ｒ、ＩＭＶ膜タンパク質Ａ２１Ｌ、ケモカイン結合タンパク質、表皮成長因子様タンパク質およびＩＬ－１８結合タンパク質から選択される１種または複数種であり、非必須遺伝子が、分泌性補体結合タンパク質、ｋｅｌｃｈ様タンパク質、病原性因子、仮想的α－アミノタンパク質感受性タンパク質、セリンプロテアーゼ阻害剤タンパク質、ホスフォリパーゼＤタンパク質、特徴なしタンパク質Ｋ７Ｒ、ＣＤ４７仮想的膜タンパク質、セマフォリンタンパク質、Ｃ型レクチンＩＩ型膜タンパク質、分泌性糖タンパク質、デオキシウリジントリホスファターゼ、ｋｅｌｃｈ様タンパク質Ｆ３Ｌ、仮想的ミリストイル化タンパク質、リボヌクレオチド還元酵素大サブユニット、ウシポックスウイルスＡ型封入体タンパク質、アンキリンタンパク質、６ｋｄａ細胞内ウイルスタンパク質、腫瘍壊死因子α受容体様タンパク質２１５、腫瘍壊死因子α受容体様タンパク質２１７、アンキリンタンパク質Ｂ４Ｒ、アンキリンタンパク質２１３、アンキリンタンパク質２１１、ジンクフィンガータンパク質２０７、ジンクフィンガータンパク質２０８、アンキリンタンパク質０１４、アンキリンタンパク質０１５、アンキリンタンパク質０１６、アンキリンタンパク質０１７、アンキリンタンパク質０１９、アンキリンタンパク質０３０、仮想的モノグリセリドリパーゼ０３６、仮想的モノグリセリドリパーゼ０３７、仮想的モノグリセリドリパーゼ０３８、アンキリンタンパク質１９９、アンキリンタンパク質２０３／仮想的タンパク質、Ａ型封入体タンパク質、グアニル酸キナーゼおよびアンキリンタンパク質１８８から選択される１種または複数種である。

【0029】

好ましくは、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルスである場合、必須遺伝子が、タンパク質Ｖｐｇ、コアタンパク質２Ａ、タンパク質２Ｂ、ＲＮＡヘリカーゼ２Ｃ、タンパク質３Ａ、プロテアーゼ３Ｃ、逆転写酵素３Ｄ、コートタンパク質Ｖｐ４およびタンパク質Ｖｐ１から選択される１種または複数種であり、非必須遺伝子が、キャプシドタンパク質Ｖｐ２およびＶｐ３から選択される１種または複数種である。

【0030】

好ましくは、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが麻疹ウイルスである場合、必須遺伝子が、核タンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、マトリックスタンパク質Ｍ、膜貫通糖タンパク質Ｆ、膜貫通糖タンパク質ＨおよびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＬから選択される１種または複数種であり、非必須遺伝子が、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼアネックスタンパク質ＣおよびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼアネックスタンパク質Ｖから選択される１種または複数種である。

【0031】

前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが耳下腺炎ウイルスである場合、必須遺伝子が、核タンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、融合タンパク質Ｆ、ＲＮＡポリメラーゼＬから選択される１種または複数種であり、非必須遺伝子が、リンタンパク質Ｖ、膜タンパク質Ｍおよび血球凝集素ノイラミニダーゼタンパク質ＨＮから選択される１種または複数種である。

【0032】

好ましくは、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが水疱性口内炎ウイルスである場合、必須遺伝子が、糖タンパク質Ｇ、核タンパク質Ｎ、リンタンパク質ＰおよびＲＮＡポリメラーゼＬから選択される１種または複数種であり、非必須遺伝子が、マトリックスタンパク質Ｍである。

【0033】

好ましくは、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスがポリオウイルスである場合、必須遺伝子が、キャプシドタンパク質ＶＰ１、キャプシドタンパク質ＶＰ２、キャプシドタンパク質ＶＰ３、システインプロテアーゼ２Ａ、タンパク質２Ｂ、タンパク質２Ｃ、タンパク質３Ａ、タンパク質３Ｂ、プロテアーゼ３Ｃ、タンパク質３ＤおよびＲＮＡガイドＲＮＡポリメラーゼから選択される１種または複数種であり、非必須遺伝子が、キャプシドタンパク質ＶＰ４である。

【0034】

好ましくは、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスがインフルエンザウイルスである場合、必須遺伝子が、血球凝集素、ノイラミニダーゼ、核タンパク質、膜タンパク質Ｍ１、膜タンパク質Ｍ２、ポリメラーゼＰＡ、ポリメラーゼＰＢ１－Ｆ２およびポリメラーゼＰＢ２から選択される１種または複数種であり、非必須遺伝子が、非構造タンパク質ＮＳ１および非構造タンパク質ＮＳ２から選択される１種または複数種である。

【0035】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスは単純ヘルペスウイルス１型であり、前記必須遺伝子はＩＣＰ２７であり、非必須遺伝子はＩＣＰ３４．５である。

【0036】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記第２の干渉ＲＮＡの配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されている。

【0037】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記第１のプロモーターは構成的プロモーターである。

【0038】

好ましくは、複数の必須遺伝子の５’末端非コード領域または３’末端非コード領域に前記標的配列が挿入される場合、前記第１の発現カセットが、前記第１の干渉ＲＮＡのみを発現し、前記第１のプロモーターがヒトＨｕ６またはＨ１プロモーターである。

【0039】

好ましくは、１つの必須遺伝子の５’末端非コード領域または３’末端非コード領域に前記標的配列が挿入される場合、前記第１の発現カセットが、前記第１の干渉ＲＮＡと前記第２の干渉ＲＮＡを発現し、前記第１のプロモーターが、ＣＭＶ、ＳＶ４０およびＣＢＡプロモーターから選択されるいずれか１種である。

【0040】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記第２のプロモーターはヒト癌特異的プロモーターである。

【0041】

好ましくは、ヒト癌特異的プロモーターが、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター（ｈＴＥＲＴ）、ヒト上皮成長因子受容体－２（ＨＥＲ－２）プロモーター、Ｅ２Ｆ１プロモーター、オステオカルシンプロモーター（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）プロモーター、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）プロモーターおよびセルロプラスミン（ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎ）プロモーターから選択されるいずれか１種である。

【0042】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記酵素は、Ｄｒｏｓｈａ、ＤｉｃｅｒおよびＡｇｏｎａｕｔｓから選択されるいずれか１種である。

【0043】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記阻害成分には、前記酵素の遺伝子の発現を干渉して前記酵素の生合成を阻害する第３の干渉ＲＮＡが含まれる。

【0044】

好ましくは、前記酵素が、Ｄｒｏｓｈａである。

【0045】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記第３の干渉ＲＮＡの塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されている。

【0046】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記阻害成分には、Ｄｒｏｓｈａの活性を抑制するためのヌクレオチドトリプレットリピート配列またはＤｉｃｅｒ活性を抑制するための非コードＲＮＡがさらに含まれる。

【0047】

好ましくは、前記ヌクレオチドトリプレットリピート配列が、（ＣＧＧ）ｎの一般式を有し、ただし、ｎが２０以上の自然数である。

【0048】

好ましくは、ｎの値の範囲が６０～１５０である。

【0049】

好ましくは、ｎの値の範囲が１００である。

【0050】

好ましくは、前記Ｄｉｃｅｒ活性を抑制するための非コードＲＮＡがアデノウイルス５型ＶＡ１ＲＮＡである。

【0051】

好ましくは、前記アデノウイルス５型ＶＡ１ＲＮＡの塩基配列が下記に示され（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）：
ＡＧＣＧＧＧＣＡＣＵＣＵＵＣＣＧＵＧＧＵＣＵＧＧＵＧＧＡＵＡＡＡＵＵＣＧＣＡＡＧＧＧＵＡＵＣＡＵＧＧＣＧＧＡＣＧＡＣＣＧＧＧＧＵＵＣＧＡＧＣＣＣＣＧＵＡＵＣＣＧＧＣＣＧＵＣＣＧＣＣＧＵＧＡＵＣＣＡＵＧＣＧＧＵＵＡＣＣＧＣＣＣＧＣＧＵＧＵＣＧＡＡＣＣＣＡＧＧＵＧＵＧＣＧＡＣＧＵＣＡＧＡＣＡＡＣＧＧＧＧＧＡＧＵＧＣＵＣＣＵＵＵ。

【0052】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記第２の発現カセットには、前記阻害成分の発現を増強するためのエンハンサー配列がさらに含まれる。

【0053】

好ましくは、前記エンハンサー配列が、ＣＭＶまたはＳＶ４０エンハンサー配列から選択される。

【0054】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、上記の組換え腫瘍溶解性ウイルスの受託番号は、ＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ２０１９１９である。該ウイルスは、２０１９年４月２４日付で武漢市武昌珞珈山武漢大学にある中国典型培養物寄託センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託がなされた。

【0055】

第２の局面において、本開示は、もう１種の組換え腫瘍溶解性ウイルスをさらに提供する。該組換え腫瘍溶解性ウイルスのゲノム配列には、干渉ＲＮＡ標的配列と発現カセットとの外因性要素が含まれ、
前記発現カセットに、プロモーターと干渉ＲＮＡ発現配列とが含まれ、干渉ＲＮＡ発現配列が、前記標的配列に結合する前記干渉ＲＮＡの発現に用いられ、
前記ＲＮＡ標的配列は、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスの複製に必須な必須遺伝子の５’末端非コード領域または３’末端の非コード領域に位置し、
前記干渉ＲＮＡ発現配列は、第２の細胞で前記ＲＮＡを発現させずに第１の細胞で前記ＲＮＡを発現させるように前記第１の細胞特異的プロモーターによって駆動され、
前記第１の細胞と前記第２の細胞とは異なるタイプのものである。

【0056】

第１の局面の組換え腫瘍溶解性ウイルスが細胞を死滅させる原理に基づいて、本開示はもう１種の組換え腫瘍溶解性ウイルスをさらに提供する。第１の局面の組換え腫瘍溶解性ウイルスと比較して、該組換え腫瘍溶解性ウイルスは、第２の発現カセットを有さず、その干渉ＲＮＡ発現配列は、第１の細胞特異的プロモーターの駆動により発現され、該第１の細胞特異的プロモーターの駆動により、干渉ＲＮＡが第２の細胞で発現されず、第１の細胞で発現される。該第１の細胞特異的プロモーターのコントロールによれば、該組換え腫瘍溶解性ウイルスが第１の細胞に感染したとき、干渉ＲＮＡが発現されて干渉ＲＮＡ標的配列に結合して、必須遺伝子の翻訳を阻止または阻害し、ウイルスの増殖または複製が阻止または抑制され、第１の細胞に死滅効果をもたず、第１の細胞に対して安全である。該組換え腫瘍溶解性ウイルスが第２の細胞に感染したとき、第１の細胞特異的プロモーターが発現を駆動せず、干渉ＲＮＡの発現が抑制され、必須遺伝子が正常に転写、翻訳して、増殖または複製することができ、第２の細胞に死滅効果をもつ。

【0057】

第２の局面の組換え腫瘍溶解性ウイルスは、第１の局面の組換え腫瘍溶解性ウイルスと同様に、選択的に増殖または複製する効果、即ち選択的に細胞を死滅させる効果をもち、つまり、第１の細胞、例えば、正常細胞に対して死滅効果をもたず、第２の細胞、例えば、腫瘍細胞に対して所望の死滅効果をもつ。

【0058】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記第１の細胞は哺乳動物の非腫瘍細胞であり、前記第２の細胞は腫瘍細胞である。

【0059】

第３の局面において、本開示は、上記の組換え腫瘍溶解性ウイルスを調製するための核酸配列を提供し、前記核酸配列は、
前記標的配列、前記第１の発現カセット、および前記第２の発現カセットのうちの１種または複数種の要素を有する。

【0060】

第４の局面において、本開示は、上記の核酸配列と、親ウイルスおよび／または相補的な宿主細胞の少なくとも一方とを含む、上記の組換え腫瘍溶解性ウイルスを調製するための組成物を提供する。

【0061】

ここで、前記親ウイルスのゲノム配列は、野生型ウイルスのゲノム配列に対して、前記必須遺伝子が欠失するものであり、
前記相補的な宿主細胞には、前記必須遺伝子を発現するＤＮＡ断片が含まれる。

【0062】

第５の局面において、本開示は、上記の核酸配列を野生型腫瘍溶解性ウイルスのゲノムに取り込むことが含まれる、上記の組換え腫瘍溶解性ウイルスを調製する方法を提供する。

【0063】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、上記の調製方法は、前記核酸配列と、親ウイルスおよび相補的な宿主細胞とを共培養し、培養物から前記組換え腫瘍溶解性ウイルスを収集することを含み、
前記親ウイルスのゲノム配列は、野生型腫瘍溶解性ウイルスのゲノム配列に対して、前記必須遺伝子が欠失するものであり、
前記相補的な宿主細胞には、前記必須遺伝子を発現するＤＮＡ断片が含まれる。

【0064】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記方法は、ＩＣＰ２７を発現するＶｅｒｏ細胞株を調製するステップと、親ウイルスを調製するステップと、遺伝子操作されたＩＣＰ２７および調節成分発現プラスミドを構築するステップと、組換え溶解性ヘルペスウイルスを構築するステップと、を含む。

【0065】

第６の局面において、本開示は、細胞を選択的に死滅させる医薬品の調製における、上記の組換え腫瘍溶解性ウイルスの使用を提供する。

【0066】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記細胞は腫瘍細胞である。

【0067】

第７の局面において、本開示は、上記の組換え腫瘍溶解性ウイルスを標的細胞と接触させることを含む細胞を死滅させる方法を提供する。

【0068】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記標的細胞は腫瘍細胞である。

【0069】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記方法は非疾患治療を目的とする。

【0070】

第８の局面において、本開示は、上記の組換え腫瘍溶解性ウイルス、および薬学的に許容されるアジュバントを含む、細胞を死滅させるための医薬品を提供する。

【0071】

さらに、本開示のいくつかの実施形態において、前記細胞は腫瘍細胞である。

【0072】

第９の局面において、本開示は、組換え腫瘍溶解性ウイルスの力価の測定のステップと、組換え腫瘍溶解性ウイルスの増幅のステップと、組換え腫瘍溶解性ウイルスの精製のステップと、ｍＲＮＡ発現分析のステップと、タンパク質発現分析のステップと、ｍｉＲＮＡ発現分析のステップとを含む、上記の組換え腫瘍溶解性ウイルスを検出する方法を提供する。

【0073】

本開示は、被験者の疾患を治療する方法をさらに提供し、該方法が、本開示に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスまたはそれを含む組成物を前記被験者に投与することを含み、前記疾患は前記第２の細胞に関連する疾患である。

【0074】

１つまたは複数の実施形態において、前記疾患はがんであり、前記第２の細胞は腫瘍細胞である。

【0075】

本開示は、細胞を選択的に死滅させるための、本開示に記載の組換え腫瘍溶解性ウイルスの使用を提供する。

【0076】

１つまたは複数の実施形態において、前記細胞が腫瘍細胞である。

【0077】

本開示の実施例の技術案をより明瞭に説明するために、以下は、実施例に必要な図面を簡単に説明する。図面は、本開示のいくつかの実施例を示すものにすぎず、範囲を限定するものではないことが理解されたい。当業者にとって、発明能力を利用しなくても、これらの図面をもとに他の関係図面を得ることもできる。

【図面の簡単な説明】

【0078】

【図1】本開示による組換え腫瘍溶解性ウイルスのゲノム配列に挿入された外因性要素の構造、およびコントロール関係の模式図である。図１では、（ａ）：ゲノム配列上の外因性要素の構成模式図であり、標的配列の数は１つ以上であり、（ｂ）：標的配列が必須遺伝子の３’末端非コード領域（３’ＵＴＲ）に挿入されたときの構成模式図であり、（ｃ）：第１の発現カセットが、第２の干渉ＲＮＡ発現配列を有しない場合（ｃ１）、第２の干渉ＲＮＡ発現配列を有する場合（ｃ２）の構成模式図であり、第１の干渉ＲＮＡ発現配列が第１の干渉ＲＮＡを発現し、第１の干渉ＲＮＡが標的配列に結合し、必須遺伝子の発現を阻害し、第２の干渉ＲＮＡ発現配列が第２の干渉ＲＮＡを発現し、第２の干渉ＲＮＡが非必須遺伝子に結合し、非必須遺伝子の発現を阻害し、（ｄ）：第２の発現カセットの構成模式図であり、阻害成分発現配列が、阻害成分を発現して干渉ＲＮＡの合成に関与する酵素の生合成および／または生物学的活性を阻害する。

【図2】ＨＳＶ－１ＩＣＰ２７相補的細胞の発現に必要なプラスミドを構築するための親プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ＥＧＦＰの構成模式図である。ＣＭＶの駆動下でＥＧＦＰ発現配列を発現し、およびネオマイシンのＤＮＡ配列を構成的に発現した。

【図3】本開示の実施例における組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲのゲノム配列に挿入された外因性要素の構成模式図である。

【図4】正常細胞では、ＥＧＦＰとＩＣＰ３４．５ ｍｉＲＮＡが組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲから発現され、標的遺伝子ＩＣＰ２７とＩＣＰ３４．５タンパク質の生合成が阻害される。Ｖｅｒｏ細胞に０．２５ＭＯＩ（ウイルスの数／細胞）ＨＳＶ－１野生型ウイルスＫＯＳまたは腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲを感染させ、１日後、一部の細胞を収集し、低分子ＲＮＡを単離し、ノーザンブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）でｍｉＲＮＡ（Ａ）を検出した。感染の２日後、残りの細胞を収集し、タンパク質を単離し、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）でＨＳＶ－１必須遺伝子ＩＣＰ２７と非必須遺伝子ＩＣＰ３４．５によってコードされるタンパク質（Ｂ）を検出した。

【図5】がん細胞は機能性低分子干渉ＲＮＡの生合成経路を有し、組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲを感染したがん細胞でＤｒｏｓｈａがわずかに発現し、低分子干渉ＲＮＡの生合成経路は顕著に阻害されまたは完全に遮断され、標的遺伝子ＩＣＰ２７とＩＣＰ３４．５は、野生型ウイルスＫＯＳから正常に発現されるように、ｏＨＳＶ－ＢＪＲから正常に発現される。がん細胞が機能性低分子干渉ＲＮＡの生合成経路を有するか否かを検出した。子宮頸がんＨｅｌａ細胞、子宮頸部扁平上皮がんｓｉＨａ細胞、乳がんＳＫ－ＢＲ３細胞と乳がんＭＥ－１８０細胞に対して、それぞれＩＣＰ２７発現プラスミドまたはＩＣＰ２７＋ターゲット配列とｍｉＲＮＡ共発現プラスミドを利用して形質導入した。２日後、細胞を収集し、タンパク質を単離し、ウエスタンブロットでＨＳＶ－１必須遺伝子ＩＣＰ２７タンパク質（Ａ）を検出した。がん細胞で腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲからの阻害性トリプレットとＤｒｏｓａｈ ｓｉＲＮＡの発現はＤｒｏｓｈａの発現に影響を与えるか否か、低分子干渉ＲＮＡの生合成経路を遮断または閉鎖するか否か、およびＩＣＰ２７とＩＣＰ３４．５が腫瘍溶解性ウイルスから正常に発現できるか否かについて検出した。がん細胞Ｈｅｌａ、ｓｉＨＡ、ＳＫ－ＢＲ３とＭＥ－１８０は、それぞれＫＯＳまたは腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲ（０．５ＭＯＩ）に感染し、１日後、細胞を収集し、低分子ＲＮＡとタンパク質を抽出した。ノーザンブロットでトリプレットとＤｒｏｓｈａ ｓｉＲＮＡを検出し（Ｂ）、およびＥＧＦＰとＩＣＰ３４．５ ｍｉＲＮＡを検出し（Ｄ）、ウエスタンブロットでＤｒｏｓｈａを検出し（Ｃ）、ＩＣＰ２７とＩＣＰ３４．５タンパク質を検出した（Ｅ）。

【図6】がん細胞における腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲと野生型ウイルスＫＯＳの生殖動態は基本的に一致する。０．１ＭＯＩのＫＯＳまたはｏＨＳＶ－ＢＪＲで様々ながん細胞に感染させ、異なる日の後に、細胞と培地を回収し、３回の凍結融解サイクルで細胞内に保持されたウイルスを培地に放出された。相補的細胞はウイルスに感染し、プラーク法でウイルス力価（プラーク形成単位／ミリリットル、ＰＦＵ／ｍｌ）を測定した。Ａ：子宮頸がんＨｅｌａ細胞、Ｂ：子宮頸部扁平上皮がんｓｉＨａ細胞、Ｃ：乳がんＳＫ－ＢＲ３細胞、Ｄ：乳がんＭＥ－１８０細胞。

【図7】組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲは、動物において肺がん、胃がん、肝臓がんおよび直腸がんの増殖を顕著に抑制した。ヒト化肺がん、胃がん、肝臓がんマウスの癌モデルは、それぞれｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された、ヒト非小細胞肺がんＡ５４９細胞、胃がんＮＣＩ－Ｎ８７細胞、肝臓がんＳＫ－ＨＥＰ－１細胞を皮下接種したＢＡＬｂ／ｃ（肺がんおよび胃がん）マウスまたはＮＰＧマウス（肝臓がん）を使用した。腫瘍が一定の大きさに増殖したあと、腫瘍を取り出して小さく切り、対応するマウスに移植して、４０－１２０ｍｍ^３まで成長させた後、ウイルスを腫瘍に注入した。直腸がんモデルは、直接直腸がん細胞株ＨＣＴ－８をＢＡＬｂ／ｃマウスに皮下接種することによって構築され、腫瘍が４０－１２０ｍｍ^３まで成長した後、腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍内注射を開始した。腫瘍溶解性ウイルス腫瘍において、３日ごとに１回注射して計３回注射し、毎回２×１０^７感染ユニット（４０μｌのＰＢＳに懸濁）、複数の場所に注射した。ネガティブコントロールとしてＰＢＳ（腫瘍溶解性ウイルスを含まず）を注入した。腫瘍溶解性ウイルス注射後、腫瘍サイズを週に２回、合計２５～３２日間測定した（ネガティブコントロール動物を安楽死させることに必要な時間によって決める）。腫瘍の大きさに応じて腫瘍の成長曲線を作成した（Ａ：肺がん、Ｂ：肝臓がん、Ｃ：胃がん、Ｄ：直腸がん）。試験終了時の試験群の腫瘍の大きさとネガティブコントロールを比較、分析して、相対阻害率を計算した（Ｅ）。

【発明を実施するための形態】

【0079】

本開示の実施例の目的、技術案、および利点をより明瞭にするために、本開示の実施例における技術案を以下に明瞭かつ完全に説明する。実施例に具体的な条件が示されていない場合は、従来の条件またはメーカーが推奨する条件に従って実施するものとする。使用される試薬または機器は、製造元が明示されていない場合、すべて市販で購入できる一般的な製品である。

【0080】

本明細書で使用される場合、「塩基配列」および「ヌクレオチド配列」という用語は交換して使用することができ、一般に、ＤＮＡまたはＲＮＡの塩基の配列を指す。

【0081】

「プライマー」という用語は、ポリヌクレオチドテンプレートと二重鎖を形成した後、核酸合成の開始点として機能し、その３’末端からテンプレートに沿って伸長し、それによって拡張された二重鎖を形成することができる、天然または合成オリゴヌクレオチドを指す。伸長プロセスで追加されるヌクレオチド配列は、テンプレートポリヌクレオチドの配列によって決定され、プライマーはＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは通常、プライマー伸長産物の合成での使用と互換性のある長さを持ち、その特定の長さは、温度、プライマー由来、実験方法などの多くの要因の影響を受ける。

【0082】

「プロモーター」という用語は、一般に、ＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識され、ＲＮＡポリメラーゼを活性化することができる構造遺伝子の５’末端の上流に位置するＤＮＡ配列を指す。

【0083】

「エンハンサー」という用語は、それに連鎖する遺伝子の転写の頻度を増加させるＤＮＡ配列を指す。エンハンサーはプロモーターによって転写を増強させる。効果的なエンハンサーは、遺伝子の５’末端または遺伝子の３’末端に位置してもよく、一部が遺伝子のイントロンに位置してもよい。エンハンサーの効果は顕著であり、一般に遺伝子転写の頻度を１０～２００倍増やすことができ、数千倍になることもある。

【0084】

本明細書で使用される場合、「干渉ＲＮＡ」という用語は、標的配列と相互作用し、標的配列の発現を阻害することができるＲＮＡまたはＲＮＡ様分子を指す。干渉ＲＮＡ分子の例として、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、一本鎖ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー基質２７－ｍｅｒ二重鎖を含むが、これらに限定されない。

【0085】

用語の「被験者」、「個体」および「患者」は、本明細書で交換して使用することができ、脊椎動物を指し、好ましくは、哺乳動物を指し、最も好ましくは、ヒトを指す。哺乳動物は、げっ歯類、類人猿、ヒト、家畜、スポーツ動物、ペットなどを含むが、これらに限定されない。

【0086】

本開示の特徴および性能は、実施例を用いてさらに詳細に説明する。

【0087】

実施例１
組換え腫瘍溶解性ウイルスの調製
ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）ＫＯＳを実験の材料にして改造を行って、本実施例による組換え腫瘍溶解性ウイルスを構築した。該組換え腫瘍溶解性ウイルスのゲノム配列は、以下の構造的特徴がある。

【0088】

（１）その必須遺伝子ＩＣＰ２７と非必須ＩＣＰ３４．５遺伝子をｍｉＲＮＡの標的遺伝子として扱い、ＨＳＶゲノムの必須遺伝子ＩＣＰ２７遺伝子の３’末端非コード領域（３’ＵＴＲ）に緑色蛍光タンパク質ｍｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ ｍｉＲＮＡ、即ち第１の干渉ＲＮＡ）の標的配列（該標的配列は、ＥＧＦＰ遺伝子配列に従って設計され、その配列は、ＥＧＦＰ遺伝子のＯＲＦ対応セグメントの配列と一致しており、以下、ＥＧＦＰ ｍｉＲＮＡ標的配列と名付ける）、第１の発現カセット、および第２の発現カセットを挿入した。

【0089】

（２）第１の発現カセットには、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶプロモーターの駆動下でＥＧＦＰ ｍｉＲＮＡを発現するＥＧＦＰ ｍｉＲＮＡ発現配列（即ち第１の干渉ＲＮＡ発現配列）、ＨＳＶ非必須遺伝子ＩＣＰ３４．５に特異的なｍｉＲＮＡ（即ち第２の干渉ＲＮＡ、以下ＩＣＰ３４．５ ｍｉＲＮＡと名付ける）を発現するＩＣＰ３４．５ ｍｉＲＮＡ発現配列（即ち第２の干渉ＲＮＡ発現配列）、およびＩＣＰ３４．５ ｍｉＲＮＡ発現配列の後に位置するＰｏｌｙ（Ａ）配列が含まれる。

【0090】

（３）第２の発現カセットには、がん細胞特異的プロモーターｈＴＥＲＴおよび互いに接続されたＣＭＶエンハンサーによって形成された複合プロモーター、および阻害成分発現配列が含まれる。該阻害成分発現配列は、複合プロモーターの駆動により、阻害成分を発現することができる。該阻害成分には、Ｄｒｏｓｈａ酵素の合成を阻害またはブロックするＤｒｏｓｈａ ｓｉＲＮＡ（即ち第３の干渉ＲＮＡ）、およびＤｒｏｓｈａ酵素の活性を阻害するＣＧＧトリプレット（即ちヌクレオチドトリプレットリピート配列）が含まれる。該ＣＧＧトリプレットは、（ＣＧＧ）１００との一般式を有する。阻害成分発現配列には、Ｄｒｏｓｈａ ｓｉＲＮＡ発現配列、ＣＧＧトリプレット発現配列、および阻害成分発現配列の下流に位置するＰｏｌｙ（Ａ）配列が含まれる。

【0091】

該組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲの調製方法は、以下の通りである。ＥＧＦＰ遺伝子でＩＣＰ２７を置き換えたＫＯＳを親ウイルスとして、組換え腫瘍溶解性ウイルスを調製した。アフリカングリーンモンキー腎臓細胞（Ｖｅｒｏ細胞）を宿主として、ＩＣＰ２７を発現する相補的細胞を確立し、組換え腫瘍溶解性ウイルスの調製、増殖、および増幅を行った。組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲは、親ウイルスとプラスミドＤＮＡの相同組換えによって相補細胞に構築された。

【0092】

具体的なステップは、以下の通りである。

【0093】

（１）ＩＣＰ２７を発現するＶｅｒｏ細胞株の調製
野生型ヘルペスウイルスＤＮＡをテンプレートとして用いて、ＩＣＰ２７遺伝子のコード領域をＰＣＲで増幅し、増幅した断片を、ネオマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ＥＧＦＰ（図２を参照）のＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａサイトの間に挿入してＥＧＦＰを置き換えた。処理されたプラスミドはｐｃＤＮＡ３．１－ＩＣＰ２７と名付けられ、ＩＣＰ２７遺伝子はＣＭＶプロモーターの駆動下で発現された。

【0094】

Ｖｅｒｏ細胞を異なる濃度のＧ４１８で処理し、３日ごとにＧ４１８を含む培地を交換し、６日後の細胞死を観察した。細胞死に必要な最小限のＧ４１８濃度を決定し、これを、細胞株を樹立する際のＧ４１８濃度として使用した。３．５×１０^５個のＶｅｒｏ細胞を６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに播種し、抗生物質を含まない培地で一晩インキュベートし、リポソーム（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）でｐｃＤＮＡ３．１－ＩＣＰ２７発現プラスミドを形質導入した（投与量：４μｇ／ウェル）。２４時間後、１：５、１：１０および１：２０の比率で希釈し、プレートに移し、Ｇ４１８を含む培地で培養し、３日ごとに培地を交換した。培地を６～７回交換した後、クローンを収集し、２４ウェルプレートから段階的に増幅した。その後、タンパク質を単離し、ウエスタンブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）でＩＣＰ２７の発現を検出した。ＩＣＰ２７を高度に発現するクローン由来の細胞を相補的細胞（即ち、必須遺伝子が欠失或いは非発現の複製欠損ウイルスに欠失タンパク質機能を提供することにより複製をサポートするトランスジェニック細胞であり、ＶＥＲＯ－Ｃ_{１ＣＰ２７}と名付け、Ｃ_{１ＣＰ２７}と略称する）として選択した。該相補的細胞は、２０１９年４月２４日付で武漢市武昌珞珈山武漢大学にある中国典型培養物寄託センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託がなされ、ＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｃ２０１９７４の受託番号が付与された。

【0095】

（２）親ウイルスの調製
親ウイルスＨＳＶ－ＥＧＦＰは、ＥＧＦＰ遺伝子でＩＣＰ２７遺伝子を置き換えた移行型ヘルペスウイルス１型であり、腫瘍溶解性ウイルスのスクリーニングを容易にするように、プラスミドと野生型ヘルペスウイルスＫＯＳの相同組換えによって得られる。

【0096】

人工合成には、ＩＣＰ２７遺伝子の５’末端配列、ＣＭＶプロモーター、ＥＧＦＰコーディングフレーム、ウシ成長ホルモンＰｏｌｙ（Ａ）（ＢＧＨ Ｐｏｌｙ（Ａ））、およびＩＣＰ２７遺伝子の３’末端配列のＤＮＡ断片Ａが含まれる。ＤＮＡ断片Ａの塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されている。ここで、
１～６番目：無関係な配列、末端の長さを長くすると酵素的切断が容易になり、
７～１２番目：Ｘｈｏ１サイト、Ｃ／ＴＣＧＡＧ、
１３～５７５番目：ＩＣＰ２７ ５’末端配列、
５７６～１１６３番目：ＣＭＶプロモーター配列、
１１６４～１１７４番目：スペーサー配列、
１１７５～１１８０番目：Ｋｏｚａｋ配列、タンパク質の発現を増強させ、
１１８１～１９００番目：ＥＧＦＰコーディングフレーム、
１９０１～２１４４番目：ＢＧＨ Ｐｏｌｙ（Ａ）、
２１４５～２６６７番目：ＩＣＰ２７ ３’末端配列、
２６６８～２７７３番目：ＨｉｎｄＩＩＩサイト、Ａ／ＡＧＣＴＴ、
２７７４～２７７９番目：無関係な配列、末端の長さを長くすると酵素的切断が容易になる。

【0097】

ＤＮＡ断片Ａを酵素的切断し、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ＥＧＦＰ（図２を参照）のＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏ１サイトにライゲーションし、改造されたプラスミドをＥＧＦＰ発現プラスミドと名付けた。

【0098】

３．５×１０^５／ウェルの相補的細胞Ｃ_{ＩＣＰ２７}を６ウェル細胞培養プレートに播種し、抗生物質を含まない培地で一晩培養し、細胞にそれぞれ０．１、０．５、１、３ＭＯＩ（ウイルス／細胞）野生型ウイルスＫＯＳを感染させ、１時間後、上記のステップで得られたＥＧＦＰ発現プラスミド（４μｇ ＤＮＡ／ウェル）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００によって細胞に形質導入した。

【0099】

４時間後、完全培地で形質導入溶液を置き換えた。すべての細胞が感染した後、細胞と培地を収集し、３回凍結融解し、遠心処理によって上清液を収集した。

【0100】

上清液を希釈し、相補的細胞Ｃ_{ＩＣＰ２７}に感染させ、プラーク単離法によってウイルスを単離した。感染の４～５日後、蛍光顕微鏡下で緑色のウイルスプラークを選択した。その後、得られたウイルスプラークを、純粋なウイルスプラークを得るまで２または３回スクリーニングした。それを増殖して拡大して、親ウイルスＨＳＶ－ＥＧＦＰを取得した。親ウイルスを野生型ヘルペスウイルスと比較し、親ウイルスのＩＣＰ２７遺伝子がＥＧＦＰ遺伝子に置き換えられた。

【0101】

（３）遺伝子操作されたＩＣＰ２７および調節成分発現プラスミドの構築
ＴＡクローンプラスミドは、マルチクローニングサイトがＸｈｏＩサイト（プラスミドＴＡ－ＸｈｏＩ）のみを含むように遺伝子操作された。

【0102】

人工合成には、ＩＣＰ２７ ５’末端配列（天然のＩＣＰ２７プロモーターを含む）、ＩＣＰ２７オープンリーディングフレーム、２コピーのＥＧＦＰ ｍｉＲＮＡ標的配列（単一コピーのＥＧＦＰ ｍｉＲＮＡ標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されており、塩基配列が表１に示される）、ＳＶ４０ Ｐｏｌｙ（Ａ）配列とＩＣＰ２７ ３’末端配列のＤＮＡ断片Ｂ（５’と３’の各末端にそれぞれ１つのＸｈｏＩサイトを含み、ＳＶ４０ Ｐｏｌｙ（Ａ）とＩＣＰ２７ ３’末端配列の間に１つのＨｉｎｄＩＩＩサイトがある）が含まれる。ＤＮＡ断片Ｂの塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されている。ここで、
１～６番目：無関係な配列、末端の長さを長くすると酵素的切断が容易になり、
７～１２番目：Ｘｈｏ１サイト、Ｃ／ＴＣＧＡＧ、
１３～６８３番目：ＩＣＰ２７ ５’末端配列（ＩＣＰ２７プロモーターを含む）、
６８４～２２２２番目：ＩＣＰ２７リーディングフレーム、
２２２３～２２２７番目：スペーサー配列、
２２２８～２２４９、２２５３～２２７４番目：ＥＧＦＰ ｍｉＲＮＡ標的配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、
２２５０～２２５２番目：スペーサー配列、
２２７５～２８００番目：ＳＶ４０ Ｐｏｌｙ（Ａ）、
２８０１～２８０６番目：ＨｉｎｄＩＩＩサイト、Ａ／ＡＧＣＴＴ、
２８０７～３３２６番目：ＩＣＰ２７ ３’末端配列、
３３２７～３３３２番目：Ｘｈｏ１サイト、
３３３３～３３３８：無関係な配列、末端の長さを長くすると酵素的切断が容易になる。

【0103】

ＤＮＡ断片ＢをＸｈｏＩで酵素的切断し、プラスミドＴＡ－ＸｈｏＩのＸｈｏＩサイトに挿入し、プラスミドＴＡ－ＸｈｏＩ－ｍＩＣＰ２７を生成した。

【0104】

人工合成には、ＣＭＶプロモーター、ＥＧＦＰ ｍｉＲＮＡ発現配列、ＩＣＰ３４．５ ｍｉＲＮＡ発現配列、ＢＧＨ Ｐｏｌｙ（Ａ）、ｈＴＥＲＴ－ＣＭＶ複合プロモーター、Ｄｒｏｓｈａ ｓｉＲＮＡ発現配列、およびＣＧＧトリプレット発現配列とＳＶ４０ Ｐｏｌｙ（Ａ）配列のＤＮＡ断片Ｃ（逆相補的）が含まれ、５’と３’の各末端にそれぞれ１つのＨｉｎｄＩＩＩサイトがある。

【0105】

ＤＮＡ断片Ｃ的塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されている。ここで、
１～８番目：無関係な配列、末端の長さを長くすると酵素的切断が容易になり、
９～１４番目：ＨｉｎｄＩＩＩサイトＡ／ＡＧＣＴＴ、
１５～６２９番目：ＣＭＶプロモーター、
６３０～７０６番目：ＥＧＦＰ ｍｉＲＮＡ発現配列（発現されたＥＧＦＰ ｍｉＲＮＡの塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示され、塩基配列が表１に示される）。
７０７～７６２番目：無関係な配列、スペーサー配列として機能し、
７６３～８３０番目：ＩＣＰ３４．５ ｍｉＲＮＡ発現配列（発現されたＩＣＰ３４．５ ｍｉＲＮＡの塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示され、塩基配列が表１に示される）、
８３１～９８９番目：無関係な配列、スペーサー配列として機能し、
９９０～１２１３番目：ＢＧＨ Ｐｏｌｙ（Ａ）、１５～１２１３番目配列は、第１の発現カセットを構成し、
１２１４～１６６０番目：逆相補的ＳＶ４０ Ｐｏｌｙ（Ａ）、
１６６１～１６６７番目：無関係な配列、スペーサー配列として機能し、
１６６８～１９６７番目：逆相補的ＣＧＧトリプレットリピート配列（即ちＣＧＧトリプレット発現配列、発現されたＣＧＧトリプレットの一般式は、（ＣＧＧ）１００）であり、
１９６８～１９７６番目：無関係な配列、スペーサー配列として機能し、
１９７７～２０２６番目：逆相補的Ｄｒｏｓｈａ ｓｉＲＮＡ発現配列（発現されたＤｒｏｓｈａ ｓｉＲＮＡの塩基配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示され、塩基配列が表１に示される）、
２０２７～２０４４番目：無関係な配列、スペーサー配列として機能し、
２０４５～２１５２番目：逆相補的ＣＭＶエンハンサー、
２１５３～２６０８番目：逆相補的ｈＴＥＲＴプロモーター、１２１４～２６０８番目は第２の発現カセットを構成し、
２６０９～２６１４番目：ＨｉｎｄＩＩＩサイト、Ａ／ＡＧＣＴＴ、
２６１５～２６２２番目：無関係な配列、末端の長さを長くすると酵素的切断が容易になる。
ＤＮＡ断片ＣをＨｉｎＩＩＩで酵素的切断し、ＨｉｎｄＩＩＩサイトに上記プラスミドＴＡ－ＸｈｏＩ－ｍＩＣＰ２７を挿入し、組換え腫瘍溶解性ウイルスを調製するための組換えプラスミドＴＡ－ＸｈｏＩ－ｍＩＣＰ２７－ＲＥＧ－ＲＮＡを生成した。

【0106】

【表1】

【0107】

（４）組換え溶解性ヘルペスウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲの構築
組換え溶解性ヘルペスウイルスは、相補的細胞Ｃ_{ＩＣＰ２７}においてプラスミドＴＡ－ＸｈｏＩ－ｍＩＣＰ２７－ＲＥＧ－ＲＮＡと親ウイルスＨＳＶ－ＥＧＦＰの相同組換えによって得られた。操作方法は、以下の通りである。

【0108】

３．５×１０^５個の相補的細胞Ｃ_{ＩＣＰ２７}を６ウェル細胞培養プレートに播種し、抗生物質を含まない培地で一晩培養した。異なるＭＯＩ（０．１、０．５、１、３）の親ウイルスＨＳＶ－ＥＧＦＰで細胞に感染させ、１時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００によって組換えプラスミドＴＡ－ＸｈｏＩ－ｍＩＣＰ２７－ＲＥＧ－ＲＮＡ（４μｇ ＤＮＡ／ウェル）を細胞に形質導入した。４時間後、完全培地で形質導入溶液を置き換えた。すべての細胞が感染した後、細胞と培地を収集し、３回凍結融解し、遠心処理によって上清液を収集した。上清液を希釈し、相補的細胞Ｃ_{ＩＣＰ２７}に感染させ、プラーク単離法によってウイルスを単離した。４～５日後、蛍光顕微鏡下で黒色のウイルスプラークを選択した。その後、得られたウイルスプラークを、純粋なウイルスプラークを得るまで２または３サイクルスクリーニングした。ウイルスを増殖、増幅させ、感染細胞のＤＮＡを単離し、特異的プライマーを使用して、ＰＣＲ増幅によってフラグメントを調べ、配列決定を行い、組換え腫瘍溶解性ウイルスを取得し、ｏＨＳＶ－ＢＪＲと命付けた。

【0109】

上記組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲは、２０１９年４月２４日付で武漢市武昌珞珈山武漢大学にある中国典型培養物寄託センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託がなされ、ＣＣＴＣＣ ＮＯ．Ｖ２０１９１９の受託番号が付与されている。

【0110】

得られた組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲのゲノム配列に以下の要素（各要素の挿入の位置関係は図３を参照）が挿入されており、
必須遺伝子ＩＣＰ２７の３’末端非コード領域に挿入されたＥＧＦＰ ｍｉＲＮＡ標的配列とＳＶ４０ Ｐｏｌｙ（Ａ）配列、
ＳＶ４０ Ｐｏｌｙ（Ａ）配列の下流にあり、ＣＭＶプロモーター、ＥＧＦＰ ｍｉＲＮＡ発現配列、ＩＣＰ３４．５ ｍｉＲＮＡ発現配列、ＢＧＨ Ｐｏｌｙ（Ａ）が含まれる第１の発現カセット。

【0111】

および、第１の発現カセットの下流にあり、ｈＴＥＲＴ－ＣＭＶ複合プロモーター、Ｄｒｏｓｈａ ｓｉＲＮＡ発現配列、ＣＧＧトリプレット発現配列およびＳＶ４０ Ｐｏｌｙ（Ａ）配列が含まれる第２の発現カセット（逆相補的配列）。

【0112】

実施例２
腫瘍溶解性ウイルスの力価分析、増殖増幅および精製、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現分析、がん細胞の培養

【0113】

（１）組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲの力価の測定
３．５×１０^５個の相補的細胞Ｃ_{ＩＣＰ２７}を６ウェル細胞培養プレートに播種し、培養液で一晩培養した。実施例１で得られた組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲのウイルス液を１０倍に段階希釈し、０．１ｍｌ異なる希釈倍数のウイルスで細胞に感染させた。１時間後、培養液を吸引し、１．２５％メチルセルロースを含む培地３ｍｌを細胞の各ウェルに加えた。細胞をＣＯ_２インキュベーターで５日間培養し、５０％メタノールと５０％エタノールで調製した０．１％アメジストブルーで染色し、ウイルスプラークをカウントした。ウイルス力価（ＰＦＵ／ｍｌ）を算出した。

【0114】

（２）組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲの増幅
５．５×１０^６個の相補的細胞Ｃ_{ＩＣＰ２７}を１５０ｍｌ培養フラスコに播種し、一晩培養した。０．０３ＭＯＩ（ウイルス数／細胞）の実施例１で得られた組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲで細胞に感染させ、すべての細胞が感染するまで細胞をＣＯ_２インキュベーターで培養した。細胞を収集し、組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲの初始抽出液を取得した。

【0115】

（３）組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲの精製
組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲの初始抽出液を－８０℃／３７℃で３回凍結融解し、４℃の温度下で、３５００ｒｐｍで遠心分離し、上清液を収集した。０．６μＭタンジェンシャルフロー（中空糸）でろ過し、０．１μＭタンジェンシャルフローで限外ろ過濃縮し、濃縮溶液をヘパラン（ｈｅｐａｒａｎ）アフィニティークロマトグラフィーおよび０．１μＭタンジェンシャルフロー濃度で精製し、精製された組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲを取得した。

【0116】

（４）ｍＲＮＡ発現分析
細胞を収集し、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡ精製試薬でＲＮＡを単離した。Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ逆転写試薬でｃＤＮＡを合成した。その後、ＩＣＰ２７またはＩＣＰ３４．５特異的プライマーを半定量的ＰＣＲ（２０サイクルのＰＣＲ）と組み合わせて使用し、ＩＣＰ２７またはＩＣＰ３４．５ｍＲＮＡの発現を分析した。ローディングコントロールとしてβ－アクチンを使用した。

【0117】

（５）タンパク質発現分析
細胞を収集し、１×ＰＢＳで洗浄し、遠心分離して、ＲＩＰＡバッファーでタンパク質を抽出した。標準サンプルとしてＢＳＡを使用し、タンパク質の含有量をＢＣＡ法で測定した。タンパク質を４％～２０％のグラジエントＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離しＰＶＤＦメンブレンに電気転写した。５％粉乳を含むＰＢＳＴ（ＰＢＳに０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む）で固定し、メンブレンを室温下で２．５％粉乳と一次抗体を含むＰＢＳＴ溶液で２時間インキュベートした。メンブレンをＰＢＳＴで３回洗浄し、メンブレンを室温下で、二次抗体ＰＢＳＴ溶液で１時間インキュベートした。メンブレンをＰＢＳＴで３回洗浄し、その後、Ｐｉｅｃｅ社の化学蛍光基質で染色し、Ｂｉｏｒａｄ社の化学蛍光試薬イメージャーを使用してタンパク質バンドを検出した。ローディングコントロールとしてβ－アクチンを使用した。

【0118】

（６）ｍｉＲＮＡ発現分析
Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｐｕｒｅ ｍｉＲＮＡ分離キットを使用してｍｉＲＮＡを単離し、Ｒｏｃｈｅ社のＤＩＧ ＲＮＡラベリングキットを使用してＲＮＡプローブを標識し、ノーザンブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）でｍｉＲＮＡを分析した。

【0119】

（７）がん細胞の培養
子宮がん細胞Ｈｅｌａ、子宮頸部扁平上皮がん細胞ｓｉＨＡ、乳がん細胞ＳＫ－ＢＲ３及乳がん細胞ＭＥ－１８０は、すべて米国のＡＴＣＣから購入されたものである。Ｈｅｌａ、ｓｉＨＡおよびＭＥ－１８０は１０％ウシ血液１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地で培養し、ＳＫ－ＢＲ３は１０％ウシ血液１×ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＭｃＣｏｙ培地で培養した。３日ごとにフラスコを交換して増幅培養を行った。

【0120】

実施例３
導入されたｍｉＲＮＡは正常細胞で発現し、標的ウイルス遺伝子の発現に大きく影響する。

【0121】

導入されたｍｉＲＮＡが正常細胞で組換えウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲから予想通りに発現され、標的ウイルス遺伝子の生合成を阻害するか否かを調べるために、３ＭＯＩ組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲと野生型ウイルスＫＯＳでＶｅｒｏ細胞に感染させ、一日後に細胞を収集し、低分子ＲＮＡを単離し、タンパク質を抽出した。ノーザンブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）でＥＧＦＰおよびＩＣＰ３４．５ ｍｉＲＮＡを検出し、ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）でＨＳＶ－１ＩＣＰ２７およびＩＣＰ３４．５タンパク質を検出した。

【0122】

野生型ウイルスＫＯＳに感染した細胞の場合、ＥＧＦＰ関連の一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）および成熟ｍｉＲＮＡの産生はない。野生型ウイルスＫＯＳに感染した細胞の場合、ＩＣＰ３４．５特異的ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡおよび成熟ｍｉＲＮＡはすべて検出可能なレベルに達するが、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡおよび成熟ｍｉＲＮＡの量はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ（宿主細胞にコードされたＩＣＰ３４．５特異的ｍｉＲＮＡを使用してＨＳＶ－１の増殖を抑制する案を開示した文献が既にあった）より顕著に多かった。ｏＨＳＶ－ＢＪＲ感染細胞において、ＥＧＦＰとＩＣＰ３４．５関連のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡおよび成熟ｍｉＲＮＡはすべて検出可能なレベルに達し、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡおよび成熟ｍｉＲＮＡの量はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡより顕著に多く、且つＩＣＰ３４．５ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡおよび成熟ｍｉＲＮＡ量はＫＯＳに感染した細胞におけるＩＣＰ３４．５ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡおよび成熟ｍｉＲＮＡ量よりも顕著に多かった（図４Ａ）。そして、野生型ウイルスＫＯＳに感染した細胞においてＩＣＰ２７とＩＣＰ３４．５タンパク質が容易に検出可能なレベルまで発現したが、ｏＨＳＶ－ＢＪＲに感染した細胞においてＩＣＰ２７とＩＣＰ３４．５の発現レベルは検出限界を下回った（図４Ｂ）。その結果、導入されたｍｉＲＮＡ、すなわちＥＧＦＰｍｉＲＮＡおよびＩＣＰ３４．５ｍｉＲＮＡが、正常細胞で組換えウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲから健康に発現され、標的ウイルス遺伝子の発現を阻害したことがわかった。

【0123】

実施例４
がん細胞は機能性低分子干渉ＲＮＡの生合成経路を有する。Ｄｒｏｓｈａは、組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲに感染したがん細胞でわずかに発現し、低分子干渉ＲＮＡの生合成経路は顕著に阻害されまたは完全に遮断される。したがって、がん細胞では、組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲは、野生型ウイルスＫＯＳと同様、正常に標的遺伝子ＩＣＰ２７とＩＣＰ３４．５を発現した。

【0124】

がん細胞が機能性低分子干渉ＲＮＡの生合成経路を有するか否かを調べるために、がん細胞Ｈｅｌａ、ｓｉＨＡ、ＳＫ－ＢＲ３およびＭＥ－１８０に対しては、それぞれＩＣＰ２７発現プラスミドまたはＩＣＰ２７＋ターゲット配列とｍｉＲＮＡ共発現プラスミドを利用して形質導入し、２日後、細胞を収集し、タンパク質を単離し、ウエスタンブロットでＨＳＶ－１必須遺伝子ＩＣＰ２７タンパク質を検出した。

【0125】

がん細胞において、阻害性トライアドおよびＤｒｏｓｈａｓｉＲＮＡの組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲからの発現がＤｒｏｓｈａの発現に影響を与えるか否か、低分子干渉ＲＮＡの生合成経路を遮断または閉鎖するか否か、およびＩＣＰ２７およびＩＣＰ３４．５が腫瘍溶解性ウイルスから正常に発現できるか否かを調べるには、がん細胞Ｈｅｌａ、ｓｉＨＡ、ＳＫ－ＢＲ３およびＭＥ－１８０に対しては、それぞれＫＯＳまたは腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲ（０．５ＭＯＩ）で感染させ、１日後、細胞を収集し、低分子ＲＮＡとタンパク質を抽出した。

【0126】

ノーザンブロットを使用してトリプレットおよびＤｒｏｓｈａｓｉＲＮＡ、ならびにＥＧＦＰとＩＣＰ３４．５ ｍｉＲＮＡを検出し、ウエスタンブロットでＤｒｏｓｈａ、ＩＣＰ２７およびＩＣＰ３４．５タンパク質を検出した。

【0127】

４種のがん細胞において、ＥＧＦＰｍｉＲＮＡの発現は、標的配列を有するＩＣＰ２７の発現を阻害した（図５Ａ）。ＣＧＧトリプレットリピートとｐｒｉ－ＤｒｏｓｈａｓｉＲＮＡハイブリッドＲＮＡは容易に検出可能なレベルまで発現した（図５Ｂ）が、ｐｒｅ－Ｄｒｏｓｈａ ｓｉＲＮＡと成熟Ｄｒｏｓｈａ ｓｉＲＮＡは検出可能なレベルを下回った（結果は掲示せず）。４種のがん細胞のうち、野生型ウイルスＫＯＳに感染した細胞はＤｒｏｓｈａタンパク質を検出可能なレベルに達したが、ｏＨＳＶ－ＢＪＲに感染した４種のがん細胞において、Ｄｒｏｓｈａタンパク質の量はいずれも非常に少なかった（図５Ｃ）。ｐｒｉ－ＥＧＦＰとＩＣＰ３４．５ ｍｉＲＮＡは容易に検出可能な範囲に達したが、ｐｒｅ－ＥＧＦＰおよび成熟ＥＧＦＰとＩＣＰ３４．５ ｍｉＲＮＡの量は非常に少なくまたは検出されなかった（図５Ｄ）。ｏＨＳＶ－ＢＪＲに感染した細胞において、成熟ＥＧＦＰとＩＣＰ３４．５ ｍｉＲＮＡの非常に低いレベルに対応して、ｏＨＳＶ－ＢＪＲに感染した４種のがん細胞において、ＩＣＰ２７とＩＣＰ３４．５タンパク質の発現レベルは、基本的にＫＯＳに感染した細胞と一致した（図５Ｅ）。その結果、組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲに感染したがん細胞において、干渉ＲＮＡ合成経路が阻害または遮断され、ｏＨＳＶ－ＢＪＲの標的ウイルス遺伝子は野生型ウイルスＫＯＳのウイルス遺伝子と同様に正常に発現することができることがわかった。

【0128】

実施例５
組換えウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲはがん細胞において野生型ウイルスＫＯＳの増殖能を維持する。
組換えウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲの、がん細胞を死滅させる能力を分析するために、異なるがん細胞において、組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲの増殖能を分析した。０．１ＭＯＩのＫＯＳまたはｏＨＳＶ－ＢＪＲを使用して、それぞれ子宮頸がんＨｅｌａ細胞、子宮頸部扁平上皮がんｓｉＨａ細胞、乳がんＳＫ－ＢＲ３細胞および乳がんＭＥ－１８０細胞に感染させた。異なる日の後に、細胞と培地を回収し、３回の凍結融解サイクルで細胞内に保持されたウイルスを培地に放出した。ウイルスで相補的細胞に感染させ、プラーク法でウイルス力価（プラーク形成単位／ミリリットル、ＰＦＵ／ｍｌ）を測定した。組換えウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲは、Ｈｅｌａ（図６Ａ）、ｓｉＨａ（図６Ｂ）、ＳＫ－ＢＲ３（図６Ｃ）およびＭＥ－１８０（図６Ｄ）での増殖速度が異なるが、各細胞での生殖動態が基本的にＫＯＳと一致した。

【0129】

実施例６
組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲは、野生型ウイルスＫＯＳと同様にがん細胞を死滅させる。

【0130】

組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲががん細胞を死滅させる能力を分析するために、０．２５または０．５ＭＯＩの野生型ＫＯＳまたはｏＨＳＶ－ＢＪＲを使用して、子宮頸がんＨｅｌａ細胞、子宮頸部扁平上皮がんｓｉＨａ細胞、乳がんＳＫ－ＢＲ３細胞および乳がんＭＥ－１８０細胞にそれぞれ感染させ、異なる日の後に、細胞死率を分析した。結果を表２－表５に示した。表２～表５は、２つのウイルスに感染した異なるがん細胞の死亡率を反映した。組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲがＨｅｌａ（表２）、ｓｉＨａ（表３）、ＳＫ－ＢＲ３（表４）とＭＥ－１８０（表５）に対する死滅能力は多少異なるが、各種のがん細胞に対する死滅効率は基本的にＫＯＳのそれと一致した。

【0131】

【表2】

【0132】

ｏＨＳＶ－ＢＪＲの、がん細胞Ｈｅｌａ細胞に感染させ、死滅させる効率は、野生型ウイルスと基本に同じである（表中のデータは細胞死亡率であり、単位は％である）。

【0133】

【表3】

【0134】

ｏＨＳＶ－ＢＪＲ感染による、がん細胞ｓｉＨＡ細胞を死滅させる効率は、基本に野生型ウイルスと同じである（表中のデータは細胞死亡率であり、単位は％である）。

【0135】

【表4】

【0136】

ｏＨＳＶ－ＢＪＲは、野生型ウイルスに対して、がん細胞ＳＫ－ＢＲ３細胞を死滅させる能力に基本的に相違がなかった（表中のデータは細胞死亡率であり、単位は％である）。

【0137】

【表5】

【0138】

ｏＨＳＶ－ＢＪＲは、野生型ウイルスと同様に効率的にがん細胞ＭＥ－１８０を死滅させる（表中のデータは細胞死亡率であり、単位は％である）。

【0139】

実施例７
組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲは、基本的に正常細胞の活性に影響を与えない。

【0140】

組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲの安全性を調べるために、組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲ（２ＭＯＩ）および野生型ウイルスＫＯＳ（０．５ＭＯＩ）でＶｅｒｏ細胞または初代ヒト角膜上皮細胞に感染させた。ｏＨＳＶ－ＢＪＲに感染した細胞と未処理の細胞の活性を３日後に測定し、野生ウイルスＫＯＳに感染した細胞の活性を２日後に測定した。各群の細胞生存率の検出結果は表６に示される。

【0141】

ＫＯＳ感染の２日後、Ｖｅｒｏ細胞と初代ヒト角膜上皮細胞はすべて死亡した（表６）。ｏＨＳＶ－ＢＪＲ感染の３日後、Ｖｅｒｏ細胞と初代ヒト角膜上皮細胞はほとんど死亡しなかった（表６）。生存率は９５％達し、これは未処理群の細胞生存率と基本的に同じである。これは、実施例１で得られた組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲが、正常細胞および非がん細胞に対して比較的信頼できる安全性を有することを示している。

【0142】

【表6】

野生型ウイルスは正常細胞を死滅させることに対し、ｏＨＳＶ－ＢＪＲは、正常細胞の活性に対する影響が小さい（表中のデータは細胞生存率であり、単位は％である）。

【0143】

実施例８
実施例１の組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲは、動物において肺がん、胃がん、肝臓がん及直腸がんの成長を顕著に抑制した。

【0144】

がん治療における腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲの有効性と効果範囲の広さを調べるために、ヒト肺がん、胃がん、肝臓がんのマウスの癌モデルを構築した。それぞれｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたヒト非小細胞肺がんＡ５４９細胞、胃がんＮＣＩ－Ｎ８７細胞、肝臓がんＳＫ－ＨＥＰ－１細胞をＢＡＬｂ／ｃ（肺がんおよび胃がん）またはＮＰＧマウス（肝臓がん）に皮下接種し、腫瘍が８００－１０００ｍｍ^３まで成長したとき、腫瘍を取り出して３０ｍｍ^３のものに細かく切り、相応のマウスに移植して４０～１２０ｍｍ^３まで成長させた後、実施例１で得られた組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲを腫瘍内に注射した。

【0145】

ＢＡＬｂ／ｃマウスに直腸がん細胞株ＨＣＴ－８を直接皮下接種して直腸がんモデルを構築した。腫瘍が４０～１２０ｍｍ^３まで成長したとき、実施例１で得られた組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲを腫瘍内に注射した。

【0146】

組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲを、３日に１回、合計３回、毎回２×１０^７感染ユニット（４０μｌのＰＢＳに懸濁）腫瘍内に注射し、複数の箇所に注射した。モデルごとに８匹の動物に注射し、ネガティブコントロールとして４０μｌのＰＢＳを注射した。組換え腫瘍溶解性ウイルスが注射され後、腫瘍サイズを週に２回、合計２５～３２日間測定した（ネガティブコントロール動物の安楽死の要する時間によって決まる）。腫瘍の大きさに基づいて腫瘍の成長曲線を作成し、結果を図７に示した（図７において、Ａ：肺がん、Ｂ：肝臓がん、Ｃ：胃がん、Ｄ：直腸がん）。試験終了時の試験群の腫瘍の大きさとネガティブコントロールを比較、分析して、相対阻害率を計算した（Ｅ）、結果を図７Ｅに示した。

【0147】

図７の結果は、組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲの注射後の経時的な腫瘍サイズが、陰性対照群の腫瘍サイズより顕著に小さかったことが示され、組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲが腫瘍の成長速度を抑制できることがわかった。そして、該組換え腫瘍溶解性ウイルスｏＨＳＶ－ＢＪＲは、肺がん、肝臓がん、胃がん、直腸がんなどの腫瘍に対して増殖を抑制する効果があり、抗がん効果範囲が広い。

【0148】

上記のように、様々な従来の腫瘍溶解性ウイルスの欠陥は、主に腫瘍溶解性ウイルス構築の従来の設計案に関わっていることを発明者が発見した。従来の設計案は、ウイルスの増殖能力（腫瘍溶解性能力）の犠牲と引き換えに、腫瘍溶解性ウイルスのがん細胞における増殖の選択性を得ていたため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、特にｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍溶解性ウイルスの増殖を損なうことになる。

【0149】

従来の腫瘍溶解性ウイルスの設計は、主に３種の案が採用されている。

【0150】

１）正常細胞の抗ウイルスメカニズムに拮抗する１つまたは複数の非必須遺伝子を削除する。がん細胞は、正常細胞と異なり、抗ウイルスメカニズムが比較的損傷したものまたは比較的弱いものであるため、腫瘍溶解性ウイルスががん細胞内で選択的に増殖して成長する。ウイルスによってコードされる、非必須遺伝子を含むいずれの遺伝子も直接または間接的にウイルスの複製に影響を与え、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験により、該案により産生された腫瘍溶解性ウイルスのｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖速度が、野生型のものより数倍または１オーダ以上で低く、ｉｎ ｖｉｔｒｏの増殖の場合、１～３オーダで低いことが証明されている。

【0151】

２）がん細胞特異的プロモーターを使用して１つまたは２つのウイルス必須遺伝子を駆動する。この案によって開発された腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスゲノムの完全性が保たれたが、ウイルスが細胞に感染させた後、ウイルス遺伝子がバッチで経時的に調和性の高く発現され（初期の遺伝子が発現した後、中期後期の遺伝子の発現を開始する前にオフにする必要がある）、ウイルス遺伝子発現時の高度な調和性が破壊され。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験により、この案によって産生された腫瘍溶解性ウイルスの増殖能力が第１種の案によって産生された腫瘍溶解性ウイルスよりも劣ることが証明されている。

【0152】

３）ウイルス必須遺伝子の３’末端非コード領域に組織特異的ｍｉＲＮＡターゲット配列を挿入する。特異的ｍｉＲＮＡは正常組織で発現し、相応のｍｉＲＮＡは該組織のがん細胞では発現しなくまたは低レベルで発現する。したがって、腫瘍溶解性ウイルスはがん細胞でのみ増殖し、がん細胞を死滅させることができる。しかし、特定の種類のがんの患者集団に対して、各患者の発がんメカニズムがそれぞれ異なり、異なる患者のがん細胞の抗ウイルス能力または組織特異的ｍｉＲＮＡの発現レベルは大きく異なるため、上記の３種の案からの腫瘍溶解性ウイルスは、特定の種類の癌に対する反応率と治癒率が比較的低く、または効果がない可能性もある。がん治療における腫瘍溶解性ウイルスの有効性を高め、様々ながん治療に適する効果範囲の広い腫瘍溶解性ウイルスを開発するために、本開示は、従来の案と全く異なる案でがんを治療する腫瘍溶解性ウイルスを設計、開発する案を採用している。ウイルス遺伝子の完全性を保ちながら、内因性プロモーターの駆動下でウイルス遺伝子を発現し、非哺乳類動物ｍｉＲＮＡターゲティング配列を１つまたは２つのウイルス必須遺伝子の３’非コード領域に挿入する。強力な構成的プロモーターによる駆動下で非哺乳類ｍｉＲＮＡ（２つのウイルス必須遺伝子を同時に攻撃する）を発現し、または非哺乳類ｍｉＲＮＡ（１つのウイルス必須遺伝子を攻撃する）とウイルス非必須遺伝子ＯＲＦを標的とするｍｉＲＮＡを同時に発現するＤＮＡ配列をウイルスゲノムに挿入することにより、ウイルスが正常細胞で増殖できず、二重保険で安全性を保証する。同時に、ハイブリッドプロモーターとなる、効果範囲の広いがん細胞特異的プロモーター（多くのがん細胞でも発現活性を有する）＋強力なプロモーターのエンハンサー（プロモーター活性を増強し、がん細胞特異的プロモーター活性のがん細胞での生成物の高発現を確保する）によって駆動されて、干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）生合成酵素を標的に阻害するｓｉＲＮＡと、干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）生合成酵素の活性を抑制するヌクレオチドトリプレットリピートとを発現するＤＮＡ配列をウイルスゲノムに挿入することにより、がん細胞において、干渉ＲＮＡの生合成経路が迅速かつ継続的に阻害され、または完全に遮断され、ｍｉＲＮＡによるウイルス遺伝子に対する攻撃を解除し、ウイルスが、野生型ウイルスと同様または野生型ウイルスに類似してがん細胞内で急速に増殖しがん細胞を死滅させることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験により、本願による案で構築されたヘルペスウイルス１型ベースの腫瘍溶解性ウイルスが、正常細胞に対して安全であるとともに、野生型ウイルスのように効率的に増殖できて様々ながん細胞を死滅させることができることがわかった。動物試験により、該腫瘍溶解性ウイルスが肺がん、肝臓がん、胃がんおよび直腸がんの成長を顕著に抑制できることがわかった。

【0153】

上記の説明は、本開示の好ましい実施例にすぎず、本開示を限定することを意図するものではない。当業者にとって、本開示は、様々な修正および変更を有することができる。本開示の精神および原則の範囲内で行われた修正、均等置換、改善などは、本開示の保護範囲に含まれるものとする。

【産業上の利用可能性】

【0154】

本開示による組換え腫瘍溶解性ウイルスは、非標的細胞（例えば正常細胞）を損なわずに、選択的な増殖または複製を通じて標的細胞（例えば腫瘍細胞）を選択的に死滅させることができる。特に、本開示の組換え腫瘍溶解性ウイルスは、がん治療に使用できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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