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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-21
(45)【発行日】2024-03-01
(54)【発明の名称】架橋ヒアルロン酸を利用した薬物送達組成物およびその製造方法
(51)【国際特許分類】
A61K 47/36 20060101AFI20240222BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20240222BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240222BHJP
A61K 31/445 20060101ALI20240222BHJP
A61K 31/245 20060101ALI20240222BHJP
A61K 31/167 20060101ALI20240222BHJP
A61K 31/381 20060101ALI20240222BHJP
A61P 23/02 20060101ALI20240222BHJP
【ＦＩ】
A61K47/36
A61K9/06
A61K45/00
A61K31/445
A61K31/245
A61K31/167
A61K31/381
A61P23/02
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2022551561
(86)(22)【出願日】2020-10-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-12
(86)【国際出願番号】 KR2020014829
(87)【国際公開番号】W WO2021172694
(87)【国際公開日】2021-09-02
【審査請求日】2022-08-24
(31)【優先権主張番号】10-2020-0023763
(32)【優先日】2020-02-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】522337381
【氏名又は名称】株式会社 ジェーピー ケアズ
【氏名又は名称原語表記】ＪＰ ＣＡＲＥＳ
【住所又は居所原語表記】＃７０８， ５２， Ｓａｇｉｍａｋｇｏｌ－ｒｏ， Ｊｕｎｇｗｏｎ－ｇｕ， Ｓｅｏｎｇｎａｍ－ｓｉ， Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ， Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】イ ユンギ
(72)【発明者】
【氏名】チェ ミンヨン
(72)【発明者】
【氏名】ハン ソンイ
(72)【発明者】
【氏名】イ ミョン ヒ
【審査官】高橋 樹理
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５１００４１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５２４０１６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０２０－５１２０６１（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
異なる膨潤度を有する２種の架橋ヒアルロン酸ゲルを含む薬物送達組成物であって、前記異なる膨潤度を有するヒアルロン酸ゲルは、膨潤度差が１００％～５００％範囲であり、低膨潤度の第１架橋ヒアルロン酸ゲルと高膨潤度の第２架橋ヒアルロン酸ゲルを含み、
前記架橋ヒアルロン酸ゲルは、０．１～５モル％の架橋度を有し、
前記第１架橋ヒアルロン酸ゲルと前記第２架橋ヒアルロン酸ゲルは、３：１～１：３の混合重量比で含まれ、
前記第１架橋ヒアルロン酸ゲルは、膨潤度が５０～１７５％であり、前記第２架橋ヒアルロン酸ゲルは、膨潤度が１５０～６７５％であり、
前記薬物送達組成物は、固形分含有量が２重量％の薬物送達組成物試料を０．０２Ｈｚで測定した複合粘度が５００，０００～１，５００，０００ｃｐであり、弾性係数が１５０～２５０ｐａ（１Ｈｚ）である、薬物送達組成物。
【請求項2】
薬物は、局所麻酔剤であり、前記薬物送達組成物は、前記薬物の累積放出量が、２４時間に５５～７５重量％、４８時間に７０～９０重量％および７２時間に９０重量％以上の放出パターンを有するものであり、前記４８時間の薬物の累積放出量は前記２４時間の薬物の累積放出量より５重量％以上高い放出パターンを有するものである、請求項１に記載の薬物送達組成物。
【請求項3】
前記薬物送達組成物は、膨潤度が１００～２５０％である、請求項１に記載の薬物送達組成物。
【請求項4】
異なる膨潤度を有する２種の架橋ヒアルロン酸ゲルを含む請求項１～３のいずれか一項に記載の薬物送達組成物と、薬物とを含み、前記薬物は、局所麻酔剤である、薬学的組成物。
【請求項5】
前記薬物は、ロピバカイン、ブピバカイン、クロロプロカイン、リドカイン、メピバカイン、プロカイン、テトラカイン、レボブピバカイン、およびアチカインからなる群より選択された１種以上の局所麻酔剤である、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項6】
前記架橋ヒアルロン酸と薬物の合計固形分含有量１００重量％を基準として、架橋ヒアルロン酸の固形分含有量は４０～９０重量％であり、薬物の含有量は１０～６０重量％である、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項7】
アルカリ水溶液下で分子量１，０００ＫＤａ～２，０００ＫＤａ範囲のヒアルロン酸またはその塩と、架橋剤とを混合して、少なくとも２の異なる容量で架橋反応を行って、架橋反応物を製造する段階、および得られた前記架橋反応物を精製および粉砕して、異なる膨潤度を有する少なくとも２種の架橋ヒアルロン酸ゲルを得る段階
を含み、
前記精製および粉砕を異なる容量の架橋反応で得られた各架橋反応物に対して別々に行って異なる膨潤度を有する少なくとも２種の架橋ヒアルロン酸ゲルを得て、前記異なる膨潤度を有する少なくとも２種の架橋ヒアルロン酸ゲルを混合する段階を含む、異なる膨潤度を有する少なくとも２種の架橋ヒアルロン酸ゲルを含む薬物送達組成物の製造方法であって、
前記架橋ヒアルロン酸ゲルは、０．１～５モル％の架橋度を有し、
前記異なる膨潤度を有するヒアルロン酸ゲルは、膨潤度差が１００％～５００％の範囲であり、低膨潤度を有する第１架橋ヒアルロン酸ゲルと高膨潤度を有する第２架橋ヒアルロン酸ゲルを含むものであり、
前記第１架橋ヒアルロン酸ゲルと前記第２架橋ヒアルロン酸ゲルは、３：１～１：３の混合重量比で含まれ、
前記第１架橋ヒアルロン酸ゲルは、膨潤度が５０～１７５％であり、前記第２架橋ヒアルロン酸ゲルは、膨潤度が１５０～６７５％であり、
前記薬物送達組成物は、固形分含有量２重量％の薬物送達組成物試料を０．０２Ｈｚで測定した複合粘度が５００，０００～１，５００，０００ｃｐであるものであり、弾性係数が１５０～２５０ｐａ（１Ｈｚ）であり、
異なる膨潤度を有する少なくとも２種の架橋ヒアルロン酸ゲルを含む薬物送達組成物の製造方法。
【請求項8】
前記薬物送達組成物は、膨潤度が１００～２５０％である、請求項７に記載の製造方法。
【請求項9】
前記薬物送達組成物は、薬物の累積放出量が、２４時間に５５～７５重量％、４８時間に７０～９０重量％および７２時間に９０重量％以上の放出パターンを有するものであり、前記４８時間の薬物の累積放出量は前記２４時間の薬物の累積放出量より５重量％以上高い放出パターンを有するようにし、前記薬物は、局所麻酔剤である、請求項７に記載の製造方法。
【請求項10】
前記第１架橋ヒアルロン酸ゲルは、架橋反応容量が１００～８００ｍＬであり、前記第２架橋ヒアルロン酸ゲルは、３～５０ｍＬの容量で架橋反応を行ったものである、請求項７に記載の製造方法。
【請求項11】
前記第１架橋ヒアルロン酸ゲルは、前記架橋反応物を篩で１次粉砕、精製および篩で２次粉砕する工程で製造されるものである、請求項７に記載の製造方法。
【請求項12】
前記第２架橋ヒアルロン酸ゲルは、前記架橋反応物を精製および篩で粉砕する工程で製造されるものである、請求項７に記載の製造方法。
【請求項13】
前記架橋反応物を製造する段階は、分子量が１，０００ＫＤａ～２，０００ＫＤａの範囲のヒアルロン酸と架橋剤０．３～１．３モル％との架橋反応を行うものである、請求項７に記載の製造方法。
【請求項14】
前記架橋剤は、ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４－ｂｕｔａｎｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ：ＢＤＤＥ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ：ＥＧＤＧＥ）、ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（１，６－ｈｅｘａｎｅｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、プロピレングリコールジグリシジルエーテル（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリテトラメチレングリコールジグリシジルエーテル（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル（ｎｅｏｐｅｎｔｙｌ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ジグリセロールポリグリシジルエーテル（ｄｉｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、グリセロールポリグリシジルエーテル（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、トリメチルプロパンポリグリシジルエーテル（ｔｒｉ－ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ビスエポキシプロポキシエチレン（１，２－（ｂｉｓ（２，３－ｅｐｏｘｙｐｒｏｐｏｘｙ）ｅｔｈｙｌｅｎｅ）、ペンタエリトリトールポリグリシジルエーテル（ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）およびソルビトールポリグリシジルエーテル（ｓｏｒｂｉｔｏｌ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）からなる群より選択される１種以上である、請求項７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、架橋ヒアルロン酸を利用した薬物送達組成物およびその製造方法に関し、前記薬物送達組成物と薬物とを含む。
【背景技術】
【0002】
ヒアルロン酸は、自己質量に対して最大１，０００倍の水分吸着力を有しているが、架橋されていないヒアルロン酸単独では生体内で数日内に分解され、薬物送達効果が微々である点などから薬物送達体の役割を大きく期待することは難しかった。
【0003】
このようなヒアルロン酸自体の短い半減期を補完するために既存のヒアルロン酸に相対的に高い比率の架橋剤（ＢＤＤＥ）を使用して架橋ヒアルロン酸ゲルを形成したが、これは体内使用時に副作用の発生確率が高い。体内副作用の発生確率を減少させるために、架橋剤比率を下げるとヒアルロン酸の持続性と物性を維持し難くなるが、架橋剤比率を低めても持続性および物性を維持するのに主要な事項はヒアルロン酸の精製にある。
【0004】
従来はヒアルロン酸を精製する前に１次粉砕を通じて精製時間を短縮させたが、精製時に架橋ヒアルロン酸ゲルが膨潤されて物性を低下させる短所があった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の一例は、目的とする放出特性挙動を有し、異なる膨潤度を有する２種の架橋ヒアルロン酸を含む薬物送達組成物およびその製造方法を提供することにその目的がある。
【0006】
本発明の追加一例は、異なる膨潤度を有する２種の架橋ヒアルロン酸を含む薬物送達組成物と薬物を含む薬学的組成物を提供することにその目的がある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、２以上の架橋ヒアルロン酸を利用した薬物送達組成物およびその製造方法と、前記薬物送達組成物と薬物を含んで目的とする放出特性挙動を有する薬学的組成物に関する。
【0008】
本発明は、ヒアルロン酸の粉砕を最小化させながら物性を増加させる架橋および精製技術を適用した架橋ヒアルロン酸を薬物送達体で開発して、生体内の分解期間および薬物の放出速度を調節し、１回の投与でも十分な薬効を引き出して施術便宜性の確保および患者により効果的かつ安全な痛症管理を引き出すことができる。また架橋ヒアルロン酸ゲルとは膨潤度（Ｓｗｅｌｌｉｎｇ Ｒａｔｉｏ）が異なるゲルを混合してヒアルロン酸ゲルの分解速度を段階的に調節して薬物の放出速度を一定に維持することができる技術を実現することができる。
【発明の効果】
【0009】
本発明は、ヒアルロン酸の粉砕を最小化させながら、物性を増加させる架橋および精製技術を適用した架橋ヒアルロン酸を薬物送達体で開発して、生体内の分解期間および薬物の放出速度を調節し、１回投与でも十分な薬効を引き出して施術便宜性の確保および患者により効果的かつ安全な痛症管理を引き出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】本発明の一例により製造された架橋ヒアルロン酸に対する膨潤度を確認した結果である。
【図2】実施例１で製造された架橋ヒアルロン酸に対する弾性係数（Ｇ’）を確認した結果である。
【図3】実施例１で製造された架橋ヒアルロン酸に対する複合粘度（ｃｐ）を確認した結果である。
【図4】実施例２で製造された架橋ヒアルロン酸に対する膨潤度を確認した結果である。
【図5】実施例２で製造された架橋ヒアルロン酸に対する弾性係数（Ｇ’）を確認した結果である。
【図6】実施例２で製造された架橋ヒアルロン酸に対する複合粘度（ｃｐ）を確認した結果である。
【図7】実施例１で製造された架橋ヒアルロン酸に対するブピバカインの薬物放出挙動を示すグラフである。
【図8】実施例２で製造された架橋ヒアルロン酸に対するロピバカインの薬物放出挙動を示すグラフである。
【図9】実施例２で製造された架橋ヒアルロン酸（Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０）とロピバカインを含む薬物製剤を実験動物に投与後、機械的異痛程度（閾値）を測定した結果を示すグラフである。
【図10】実施例２で製造された架橋ヒアルロン酸（Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０）とロピバカインを含む薬物製剤を実験動物に投与後、投与部位周辺の筋肉および座骨神経を観察した結果である。
【図11】実施例２で製造された架橋ヒアルロン酸（Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０）とロピバカインを含む薬物製剤を投与した後に、経過時間による試験群Ｇｅ、ＧｆおよびＧｇの血中ロピバカインの濃度を測定した結果を示すグラフであり、ＳＣは０．９％塩化ナトリウム、ＶｏはＶｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０、Ｒｏはロピバカインを意味する。
【図12】実施例２で製造された架橋ヒアルロン酸（Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０）とロピバカインを含む薬物製剤を投与した後に、薬物投与後の試験群Ｇｅ、ＧｆおよびＧｇのＡＵＣ（血中濃度－時間曲線下の面積）平均を測定した結果を示すグラフであり、ＡＵＣ０－４８ｈｒは４８時間の面積平均を意味する。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明の一例は、異なる膨潤度を有する２種の架橋ヒアルロン酸を含む薬物送達組成物であって、前記異なる膨潤度を有するヒアルロン酸は、膨潤度差が１００％～５００％範囲を有し、低膨潤度を有する第１架橋ヒアルロン酸と高膨潤度を有する第２架橋ヒアルロン酸を含むものである。
【0012】
前記薬物送達組成物は、（１）固形分含有量２重量％の薬物送達組成物の試料を０．０２Ｈｚで測定した複合粘度が５００，０００～１，５００，０００ｃｐ、（２）弾性係数が１５０～２５０ｐａ（１Ｈｚ）および（３）膨潤度１００～２５０％からなる群より選択された１以上の物性を有するものであり得る。
【0013】
前記異なる膨潤度を有する２種の架橋ヒアルロン酸は、膨潤度差が１００％～５００％の範囲であり、低膨潤度の第１架橋ヒアルロン酸と高膨潤度の第２架橋ヒアルロン酸を含むことができ、具体的に前記第１架橋ヒアルロン酸は、膨潤度５０～１７５％を有し、第２架橋ヒアルロン酸は、膨潤度１５０～６７５％を有するものであり得る。本発明で架橋ヒアルロン酸の膨潤度は、下記数式１で表すことができ、より詳しくは、架橋反応物の精製および粉砕で得られた架橋ヒアルロン酸２ｇを２５ｍＬのリン酸緩衝溶液に添加し、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄液を除去した後、膨潤されたヒアルロン酸ゲル重量を測定し、下記数式１で得られる。下記数式１で初期測定された架橋ヒアルロン酸のゲルの重量は、リン酸緩衝溶液を投入する前の重量であり、例えば架橋反応物の精製および粉砕を経た産物として、固形分含有量が０．５～５．０重量％または１．０～５．０重量％であり、水の含有量が９５．０～９９．０重量％または９５．０～９９．５重量％であるものであり得る。
［数式１］
膨潤度（％）＝（膨潤された架橋ヒアルロン酸ゲルの重量／初期測定された架橋ヒアルロン酸のゲルの重量）×１００
［数式１］
膨潤度（％）＝（膨潤された架橋ヒアルロン酸ゲルの重量／初期測定された架橋ヒアルロン酸のゲルの重量）×１００
【0014】
本発明による薬物送達組成物の弾性係数（Ｇ’）は、レオメーター（ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ）を使用して０．０２Ｈｚ～１Ｈｚの振動数範囲で測定することができ、複合粘度はレオメーター（ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ）を使用して０．０２Ｈｚ～１Ｈｚの振動数範囲で測定することができる。
【0015】
前記低膨潤度の第１架橋ヒアルロン酸と高膨潤度の第２架橋ヒアルロン酸は、分子量が１，０００ＫＤａ～２，０００ＫＤａの範囲のヒアルロン酸と架橋剤０．３～１．３モル％を利用した架橋反応、精製および粉砕工程を含む方法で製造され得る。具体的に、異なる膨潤度を有する２種の架橋ヒアルロン酸は、架橋反応を行う段階で、異なる反応容量で架橋反応を行って精製および粉砕工程を経て製造され得る。
【0016】
例えば、第１架橋ヒアルロン酸は、架橋反応の容量が１００～８００ｍＬ、好ましくは１５０～８００ｍＬ、１５０～７００ｍＬ、１５０～６００ｍＬ、１５０～５５０ｍＬ、２００～８００ｍＬ、２００～７００ｍＬ、２００～６００ｍＬ、２００～５５０ｍＬ、２５０～８００ｍＬ、２５０～７００ｍＬ、２５０～６００ｍＬ、または２５０～５５０ｍＬであり得る。前記第１架橋ヒアルロン酸は、低膨潤度を有し、例えば前記膨潤度が５０～１７５％のものであり得る。前記第２架橋ヒアルロン酸は、架橋反応の容量が３～５０ｍＬ、好ましくは５～３０ｍＬであり得、前記第２架橋ヒアルロン酸は、高膨潤度を有し、例えば前記膨潤度が１５０～６７５％のものであり得る。好ましくは、低膨潤度を有する第１架橋ヒアルロン酸と高膨潤度を有する第２架橋ヒアルロン酸との膨潤度差は１００％～５００％であり得る。
【0017】
本発明による薬物送達組成物は、異なる膨潤度を有する２種の架橋ヒアルロン酸を含み、前記異なる膨潤度を有するヒアルロン酸は、膨潤度差が１００％～５００％範囲であり、低膨潤度の第１架橋ヒアルロン酸と高膨潤度の第２架橋ヒアルロン酸を含むものである。具体的な一例において、前記薬物送達組成物に含まれる低膨潤度の第１架橋ヒアルロン酸と高膨潤度の第２架橋ヒアルロン酸との混合重量比（第１架橋ヒアルロン酸：第２架橋ヒアルロン酸）は、５：１～１：５、４：１～４：１、３：１～１：３、２：１～１：２、１：１～５、１：１～４、１：１～３、１：１～２、または１：１であり得る。
【0018】
本発明による薬物送達組成物は、薬物を含んで特定の薬物放出挙動を示す薬学的組成物の製造に使用することができる。したがって、本発明のまた他の一例は、本発明による異なる膨潤度を有する２種の架橋ヒアルロン酸を含む薬物送達組成物と薬物を含む薬学的組成物を提供する。
【0019】
本発明による薬物送達組成物と薬物、例えば局所痲酔剤を含む薬学的組成物の累積薬物放出量が２４時間に５５～７５重量％、４８時間に７０～９０重量％および７２時間に９０重量％以上であり、ただし、前記４８時間の薬物累積放出量は２４時間の薬物累積放出量との差が５重量％以上である薬物放出パターンを有する。例えば、好ましくは、２４時間の間累積薬物放出量は、５７～７５重量％、５９～７５重量％、または６０～７５重量％であり得、前記４８時間の累積薬物放出量は、７５～９０重量％、７７～９０重量％、８０～９０重量％、８０重量％以上～９０重量％未満、７５～８７重量％、７７～８７重量％、または８０～８７重量％であり得、ただし、前記４８時間の薬物累積放出量は２４時間の薬物累積放出量と差が５重量％以上である薬物放出パターンを有する。
【0020】
本発明による異なる膨潤度を有する２種以上の架橋ヒアルロン酸を含む薬物送達組成物と薬物を含む薬学的組成物において、架橋ヒアルロン酸と薬物の合計固形分含有量１００重量％を基準として、架橋ヒアルロン酸の固形分含有量は４０～９０重量％であり、前記薬物の含有量は、１０～６０重量％であり得る。具体的に、薬学的組成物において架橋ヒアルロン酸と薬物の合計固形分含有量１００重量％を基準として、架橋ヒアルロン酸の固形分含有量は４５～９０重量％、５０～９０重量％、５５～９０重量％、６０～９０重量％、６５～９０重量％、７０～９０重量％、４５～８７重量％、５０～８７重量％、５５～８７重量％、６０～８７重量％、６５～８７重量％、７０～８７重量％、４５～８５重量％、５０～８５重量％、５５～８５重量％、６０～８５重量％、６５～８５重量％、または７０～８５重量％であり得、薬物の固形分含有量は１０～５５重量％、１０～５０重量％、１０～４５重量％、１０～４０重量％、１０～３５重量％、１０～３０重量％、１３５５重量％、１３～５０重量％、１３～４５重量％、１３～４０重量％、１３～３５重量％、１３～３０重量％、１５～５５重量％、１５～５０重量％、１５～４５重量％、１５～４０重量％、１５～３５重量％、または１５～３０重量％であり得る。
【0021】
前記薬物は目的とする放出挙動を達成すれば特に制限なしに使用することができ、例えばロピバカイン、ブピバカイン、クロロプロカイン、リドカイン、メピバカイン、プロカイン、テトラカイン、レボブピバカイン、およびアチカインからなる群より選択された１種以上の局所麻酔剤であり得る。前記薬学的組成物が局所痲酔剤を含む場合、局所痲酔剤の含有量は、添加剤（塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、注射用水、塩酸）を含む１ｍＬを基準として、０．０１～３重量％、０．０５～３重量％、０．０７５～３重量％、０．１～３重量％、０．０１～１重量％、０．０５～１重量％、０．０７５～１重量％、０．１～１重量％、０．０１～０．５重量％、０．０５～０．５重量％、０．０７５～０．５重量％、または０．１～０．５重量％であり得る。
【0022】
本発明において、ヒアルロン酸は、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンとＤ－グルクロン酸からなる繰り返し単位が線形で連結されている生体高分子物質であり、本発明でヒアルロン酸は、ヒアルロン酸自体、その塩またはこれらの組み合わせを全て含む意味で使用される。前記ヒアルロン酸の塩は、例えばヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛、ヒアルロン酸コバルトなどの無機塩と、ヒアルロン酸テトラブチルアンモニウムなどの有機塩が全て含まれるものであるが、これに限定されるのではない。本発明では、ヒアルロン酸自体、またはその塩を単独で、またはヒアルロン酸自体、またはその塩を２種以上組み合わせて使用することができる。本発明において、前記ヒアルロン酸の分子量は、分子量１，０００ＫＤａ～２，０００ＫＤａ範囲であり得る。
【0023】
架橋ヒアルロン酸重合体または架橋ヒアルルロン酸誘導体は、前記のようなヒアルロン酸自体またはその塩を架橋剤を使用して架橋させて製造することができる。架橋のためには、アルカリ水溶液下で架橋剤を使用する方法を使用することができる。前記アルカリ水溶液としては、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、好ましくはＮａＯＨ水溶液を使用することができ、これに制限されるのではない。この時、ＮａＯＨ水溶液の場合、０．２５Ｎ～５Ｎの濃度で使用することができる。
【0024】
また前記架橋されたヒアルロン酸誘導体は、固形分含有量２重量％の薬物送達組成物の試料を０．０２Ｈｚで測定した複合粘度が５００，０００～１，５００，０００ｃｐであるものであり得る。
【0025】
前記架橋剤は、二つまたはそれ以上のエポキシ作用基を含む化合物であって、多様であり、好ましい例としてブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４－ｂｕｔａｎｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ：ＢＤＤＥ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ：ＥＧＤＧＥ）、ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（１，６－ｈｅｘａｎｅｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、プロピレングリコールジグリシジルエーテル（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリテトラメチレングリコールジグリシジルエーテル（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル（ｎｅｏｐｅｎｔｙｌ ｇｌｙｃｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ジグリセロールポリグリシジルエーテル（ｄｉｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、グリセロールポリグリシジルエーテル（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、トリメチルプロパンポリグリシジルエーテル（ｔｒｉ－ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐａｎｅ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ビスエポキシプロポキシエチレン（１，２－（ｂｉｓ（２，３－ｅｐｏｘｙｐｒｏｐｏｘｙ）ｅｔｈｙｌｅｎｅ）、ペンタエリトリトールポリグリシジルエーテル（ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）およびソルビトールポリグリシジルエーテル（ｓｏｒｂｉｔｏｌ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ）などが挙げられ、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテルが特に好ましい。
【0026】
本発明による架橋ヒアルロン酸と架橋剤を利用した架橋方法において、架橋剤０．３～１．３モル％、好ましくは０．３５～１．０モル％を使用することができる。
【0027】
本発明で用語「架橋度（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）」は、ヒアルロン酸基質組成物の架橋結合された部分内のヒアルロン酸単量体単位に対する架橋結合剤の％重量比と定義される。これはヒアルロン酸単量体の重量比に対する架橋結合剤の重量比で測定される。本発明では特に、このようなヒアルロン酸の架橋度（ＭＯＤ、Ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ｍｏｌ％）が前記のような架橋剤による架橋を通じて０．１モル％～５モル％、０．２～５モル％、０．２５～５モル％、０．３～５モル％、０．３５～５モル％、０．４～５モル％、０．１モル％～３モル％、０．２～３モル％、０．２５～３モル％、０．３～３モル％、０．３５～３モル％、０．４～３モル％、０．１モル％～２モル％、０．２～２モル％、０．２５～２モル％、０．３～２モル％、０．３５～２モル％、０．４～２モル％、０．１モル％～１モル％、０．２～１モル％、０．２５～１モル％、０．３～１モル％、０．３５～１モル％、０．４～１モル％、具体的に０．１モル％～５モル％、０．２～４モル％、０．３～３モル％、０．４～２モル％または０．４～１モル％であり得る。
【0028】
本発明の一例による異なる膨潤度を有する少なくとも２種の架橋ヒアルロン酸を含む薬物送達組成物の製造方法は、
（ａ）アルカリ水溶液下で分子量１，０００ＫＤａ～２，０００ＫＤａ範囲のヒアルロン酸またはその塩と、架橋剤０．３～１．３モル％とを混合して、少なくとも２以上の異なる容量で架橋反応を行って架橋反応物を製造する段階、および
（ｂ）前記得られた架橋反応物を精製および粉砕して、異なる膨潤度を有する少なくとも２種以上の架橋ヒアルロン酸を得る段階
を含むことができる。
（ａ）アルカリ水溶液下で分子量１，０００ＫＤａ～２，０００ＫＤａ範囲のヒアルロン酸またはその塩と、架橋剤０．３～１．３モル％とを混合して、少なくとも２以上の異なる容量で架橋反応を行って架橋反応物を製造する段階、および
（ｂ）前記得られた架橋反応物を精製および粉砕して、異なる膨潤度を有する少なくとも２種以上の架橋ヒアルロン酸を得る段階
を含むことができる。
【0029】
本発明による方法で製造された前記架橋ヒアルロン酸誘導体は、固形分含有量が０．５～５．０重量％または１．０～５．０重量％であり、水の含有量が９５．０～９９．０重量％または９５．０～９９．５重量％であるものであり得る。
【0030】
前記（ａ）架構反応物を製造する段階は、具体的に０．２５～２．５Ｎの塩基性水溶液、例えばＮａＯＨ水溶液に対して１～３０重量％の濃度でヒアルロン酸またはその塩を入れ、前記ヒアルロン酸に対して０．３～１．３モル％、好ましくは０．３５～１．０モル％の架橋剤を添加してヒアルロン酸またはその塩と均質な状態で混合して、少なくとも２以上の異なる容量で架橋反応を行って架橋反応物を製造することができる。具体的な一様態として、前記段階でヒアルロン酸と架橋剤の架橋反応は、１０～６０℃、より好ましくは２０～５０℃、最も好ましくは２５～４０℃で行うことができる。
【0031】
前記製造方法の段階（ａ）の架橋反応は、異なる容量で架橋反応を行う。例えば第１架橋ヒアルロン酸は、架橋反応の容量が１００～８００ｍＬ、好ましくは１５０～８００ｍＬ、１５０～７００ｍＬ、１５０～６００ｍＬ、１５０～５５０ｍＬ、２００～８００ｍＬ、２００～７００ｍＬ、２００～６００ｍＬ、２００～５５０ｍＬ、２５０～８００ｍＬ、２５０～７００ｍＬ、２５０～６００ｍＬ、または２５０～５５０ｍＬであり得る。前記第１架橋ヒアルロン酸は、低膨潤度を有し、例えば前記膨潤度５０～１７５％を有するものであり得る。前記第２架橋ヒアルロン酸は、架橋反応の容量が３～５０ｍＬ、好ましくは５～３０ｍＬであり得、前記第２架橋ヒアルロン酸は、高膨潤度を有し、例えば前記膨潤度１５０～６７５％を有するものであり得る。好ましくは低膨潤度を有する第１架橋ヒアルロン酸と高膨潤度を有する第２架橋ヒアルロン酸との膨潤度差は、１００％～５００％であり得る。
【0032】
前記（ｂ）異なる膨潤度を有する少なくとも２種以上の架橋ヒアルロン酸を得る段階は、前記段階（ａ）で得られた架橋反応物を精製および／または粉砕する段階を行って異なる膨潤度を有する少なくとも２以上の架橋ヒアルロン酸を得る。前記精製および粉砕を異なる容量の架橋反応で得られた各架橋反応物に対して別途に行い、異なる膨潤度を有する少なくとも２種以上の架橋ヒアルロン酸を得ることができる。
【0033】
前記段階（ｂ）で低膨潤度を有する第１架橋ヒアルロン酸は、架橋反応の容量が１００～８００ｍＬであり得、前記得られた比較的大きい反応容量の架橋反応物を孔径５００～２，０００μｍ、例えば孔径１０００μｍの篩を利用して予備粉砕して予備粉砕物を得る。前記予備粉砕物を精製して未反応架橋剤を除去し、ｐＨを６．５～７．５水準で安定化することができる。架橋剤などを除去するために洗浄水を利用して架橋ヒアルロン酸を洗浄することができ、洗浄水は食塩水またはリン酸緩衝溶液などを使用することができるが、特に制限されない。
【0034】
前記精製された粉砕物を孔径が２０μｍ～５００μｍ、５０μｍ～５００μｍ、１００μｍ～５００μｍ、１５０μｍ～５００μｍ、２００μｍ～５００μｍ、２０μｍ～４５０μｍ、５０μｍ～４５０μｍ、１００μｍ～４５０μｍ、１５０μｍ～４５０μｍ、または２００μｍ～４５０μｍ、例えば孔径３５０μｍの篩を通過させて行うことができる。
【0035】
前記段階（ｂ）で高膨潤度を有する第２架橋ヒアルロン酸は、３～５０ｍＬの容量で架橋反応を行った架橋反応物を得て、粉砕工程なしに精製工程を行って未反応架橋剤を除去してｐＨを６．５～７．５水準で安定化した。前記段階（ｂ）で架橋剤などを除去するために洗浄水を利用して架橋ヒアルロン酸を洗浄することができ、洗浄水は食塩水またはリン酸緩衝溶液などを使用することができるが、特に制限されない。高膨潤度を有する第２架橋ヒアルロン酸が架橋反応物は、精製を完了した後に、粉砕工程を行い、前記粉砕は孔径が２０μｍ～５００μｍ、５０μｍ～５００μｍ、１００μｍ～５００μｍ、１５０μｍ～５００μｍ、２００μｍ～５００μｍ、２０μｍ～４５０μｍ、５０μｍ～４５０μｍ、１００μｍ～４５０μｍ、１５０μｍ～４５０μｍ、または２００μｍ～４５０μｍ、例えば孔径３５０μｍの篩を通過させて行うことができる。
【0036】
前記予備粉砕、精製および粉砕工程を行った後に得られる第１架橋ヒアルロン酸の固形分含有量は、２．０重量％以下、または１．５重量％以下、例えば０．５～２．０重量％、０．５～１．５重量％、１．０～１．５重量％、または１．１～１．４重量％であり、残りは水の含有量であり得る。前記精製および粉砕工程を行った後に得られる第２架橋ヒアルロン酸の固形分含有量は、１．５重量％以上、２．０重量％以上、または２．５重量％以上、例えば１．５～５．０重量％、２．０～５．０重量％、２．５～５．０重量％、または３．０～５．０重量％であり得、総１００重量％中で前記固形分含有量を除いた残りは水の含有量であり得る。
【0037】
前記異なる膨潤度を有するヒアルロン酸は、膨潤度差が１００％～５００％範囲を有し、低膨潤度を有する第１架橋ヒアルロン酸と高膨潤度を有する第２架橋ヒアルロン酸を含むものであり得、または前記第１架橋ヒアルロン酸は、膨潤度５０～１７５％を有し、第２架橋ヒアルロン酸は、膨潤度１５０～６７５％を有するものであり得る。
【0038】
前記製造方法の前記段階（ｂ）は、精製および粉砕を異なる容量の架橋反応で得られた架橋反応物に対して別途に行い、異なる膨潤度を有する少なくとも２種以上の架橋ヒアルロン酸を得て、追加的に前記異なる膨潤度を有する少なくとも２種以上の架橋ヒアルロン酸を混合する段階を含むものであり得る。前記第１架橋ヒアルロン酸は、前記架橋反応物を篩で１次粉砕、精製および篩で２次粉砕する工程で製造され得る。また、前記第２架橋ヒアルロン酸は、前記架橋反応物を精製しおよび篩で粉砕する工程で製造されるものであり得る。
【0039】
前記方法で製造された薬物送達組成物は、製品の固形分含有量で調整し、容器充填、滅菌および包装工程を追加的に含めて製造され得る。
【実施例】
【0040】
下記の実施例を挙げて本発明をより詳しく説明するが、本発明の範囲が下記の実施例に限定される意図ではない。
【0041】
実施例１：架橋ヒアルロン酸の製造および物性評価
１－１：架橋ヒアルロン酸の製造
１，５００，０００Ｄａの分子量を有する非架構ヒアルロン酸（繰り返し単位の分子量４０１．３）１００重量部を０．２５Ｎ ＮａＯＨ溶液４００重量部に溶解して２０重量％のヒアルロン酸溶液を製造した。前記ヒアルロン酸溶液に架橋剤である１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ、ＢＤＤＥ）を０．７モル％の比率で添加して、それぞれ４個の異なる容量で反応を行い、具体的にＪＰＤ００１は４００ｍＬ、ＪＰＤ００２は５ｍＬ、ＪＰＤ００３は１５ｍＬ、およびＪＰＤ００４は２５ｍＬの容量体積で分注して室温で２４時間架橋反応を行い、異なる容量を有する架橋反応物を得た。
１－１：架橋ヒアルロン酸の製造
１，５００，０００Ｄａの分子量を有する非架構ヒアルロン酸（繰り返し単位の分子量４０１．３）１００重量部を０．２５Ｎ ＮａＯＨ溶液４００重量部に溶解して２０重量％のヒアルロン酸溶液を製造した。前記ヒアルロン酸溶液に架橋剤である１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ、ＢＤＤＥ）を０．７モル％の比率で添加して、それぞれ４個の異なる容量で反応を行い、具体的にＪＰＤ００１は４００ｍＬ、ＪＰＤ００２は５ｍＬ、ＪＰＤ００３は１５ｍＬ、およびＪＰＤ００４は２５ｍＬの容量体積で分注して室温で２４時間架橋反応を行い、異なる容量を有する架橋反応物を得た。
【0042】
前記架橋反応の完了後、ＪＰＤ００１は孔径１，０００μｍの篩で通過させて粉砕することによって、各粉砕物の直径が約１，０００μｍになるように１次粉砕物を得た。以降、前記ＪＰＤ００１の１次粉砕物をリン酸緩衝溶液で数回洗浄して未反応ＢＤＤＥを除去し、ｐＨを６．５～７．５水準で安定化し、精製にかかった時間は２４時間であった。
【0043】
また、前記架橋反応が完了したＪＰＤ００２、ＪＰＤ００３およびＪＰＤ００４反応物は、粉砕過程なしにそのままリン酸緩衝溶液で数回洗浄して未反応ＢＤＤＥを除去し、ｐＨを６．５～７．５水準で安定化した。前記精製工程にかかった時間はＪＰＤ００２およびＪＰＤ００３反応物は約３６時間であり、ＪＰＤ００４反応物は約７２時間であった。
【0044】
前記得られた４種類の反応物（ＪＰＤ００１、ＪＰＤ００２、ＪＰＤ００３、ＪＰＤ００４）に対して孔径（ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）３００μｍの篩を通過させて粉砕し、固形分の含有量を大韓薬典の乾燥減量試験方法で測定した。前記粉砕後に得られた反応物の固形分含有量は、ＪＰＤ００１は１．４ｗｔ／ｗｔ％、ＪＰＤ００２は２．２ｗｔ／ｗｔ％、ＪＰＤ００３は２．５ｗｔ／ｗｔ％、ＪＰＤ００４は３．９ｗｔ／ｗｔ％であった。
【0045】
固形分含有量２．０重量％の試料製品を製造するために、ＪＰＤ００１反応物は前記架橋反応の原料として使用した非架構ヒアルロン酸を添加して２．０重量％に合わせ、ＪＰＤ００２、ＪＰＤ００３、ＪＰＤ００４反応物は、固形分含有量が２．０重量％を超えるため、ＰＢＳを添加して２．０重量％に希釈して固形分含有量が２．０重量％になるようにした。前記得られた４種類の試料は１２１℃で２０分間滅菌して架橋ヒアルロン酸ゲルを製造した。
【0046】
前記精製および粉砕されたＪＰＤ００２～ＪＰＤ００４反応物を含む試料は、架橋反応物の精製工程で水分吸収が少ないため、薬物が含まれている水溶液と混合する場合、架橋ヒアルロン酸が膨潤されながら薬物を架橋ヒアルロン酸の内部にさらに多く混入することができる。反面、架橋反応の容量が４００ｍＬであるＪＰＤ００１は、通常の製品に含まれている固形分含有量２％よりさらに低い固形分含有量を有してより多くの水分を吸収した状態であり、そのため、薬物と混合する場合、混入可能な薬物量が多少低い。
【0047】
１－２：架橋ヒアルロン酸の物性評価
前記製造された架橋ヒアルロン酸ゲルＪＰＤ００１、ＪＰＤ００２、ＪＰＤ００３、ＪＰＤ００４、および（ＪＰＤ００１とＪＰＤ００４の重量比１：１で含む混合物）に対し、膨潤度比率、弾性係数および複合粘度を測定してその結果を表１と図１～図３に示した。
前記製造された架橋ヒアルロン酸ゲルＪＰＤ００１、ＪＰＤ００２、ＪＰＤ００３、ＪＰＤ００４、および（ＪＰＤ００１とＪＰＤ００４の重量比１：１で含む混合物）に対し、膨潤度比率、弾性係数および複合粘度を測定してその結果を表１と図１～図３に示した。
【0048】
（１）膨潤度
各サンプル２ｇを正確に称量して５０ｍＬのコニカルチューブに投入し、２５ｍＬのリン酸緩衝溶液を投入した後、１５分間１００ｒｐｍで振とう（ｓｈａｋｉｎｇ）し、５分間２，０００ｒｐｍで遠心分離し、そしてコニカルチューブの上澄液を除去した後、膨潤されたヒアルロン酸ゲルの重量を測定し、下記数式１のように膨潤度を得た。下記数式１において、初期測定された架橋ヒアルロン酸のゲルの重量とは、リン酸緩衝溶液を投入する前の重量であり、実質的に実施例１で得られた固形分含有量が２．０重量％を含む試料の重量である。
［数式１］
膨潤度（％）＝（膨潤された架橋ヒアルロン酸ゲルの重量／初期測定された架橋ヒアルロン酸のゲルの重量）×１００
各サンプル２ｇを正確に称量して５０ｍＬのコニカルチューブに投入し、２５ｍＬのリン酸緩衝溶液を投入した後、１５分間１００ｒｐｍで振とう（ｓｈａｋｉｎｇ）し、５分間２，０００ｒｐｍで遠心分離し、そしてコニカルチューブの上澄液を除去した後、膨潤されたヒアルロン酸ゲルの重量を測定し、下記数式１のように膨潤度を得た。下記数式１において、初期測定された架橋ヒアルロン酸のゲルの重量とは、リン酸緩衝溶液を投入する前の重量であり、実質的に実施例１で得られた固形分含有量が２．０重量％を含む試料の重量である。
［数式１］
膨潤度（％）＝（膨潤された架橋ヒアルロン酸ゲルの重量／初期測定された架橋ヒアルロン酸のゲルの重量）×１００
【0049】
（２）弾性係数
レオロジー特性を比較するためにレオメーター（ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ）を使用して０．０２Ｈｚ～１Ｈｚの振動数範囲で弾性係数（Ｇ’）を測定した。
レオロジー特性を比較するためにレオメーター（ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ）を使用して０．０２Ｈｚ～１Ｈｚの振動数範囲で弾性係数（Ｇ’）を測定した。
【0050】
（３）複合粘度
レオロジー特性を比較するためにレオメーター（ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ）を使用して０．０２Ｈｚ～１Ｈｚの振動数範囲で複合粘度（ｃｏｍｐｌｅｘ ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）を測定した。
レオロジー特性を比較するためにレオメーター（ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ）を使用して０．０２Ｈｚ～１Ｈｚの振動数範囲で複合粘度（ｃｏｍｐｌｅｘ ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）を測定した。
【0051】
［回転型レオメーター（Ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ）の分析条件］
（ａ）試験装備：回転型レオメーター（ＫＩＮＥＸＵＳ ｐｒｏ＋）
（ｂ）周波数：０．０１～１Ｈｚ
（ｃ）温度：２５
（ｄ）ひずみ：４％
（ｅ）測定形状：４０ｍｍのプレート
（ｆ）測定ギャップ：０．１４５ｍｍ
（ａ）試験装備：回転型レオメーター（ＫＩＮＥＸＵＳ ｐｒｏ＋）
（ｂ）周波数：０．０１～１Ｈｚ
（ｃ）温度：２５
（ｄ）ひずみ：４％
（ｅ）測定形状：４０ｍｍのプレート
（ｆ）測定ギャップ：０．１４５ｍｍ
【0052】
【表1】
【0053】
膨潤度が低いほど、局所麻酔剤溶液と混合して体内適用時、薬物放出が急速に行われ、反対に膨潤度が高いほど、薬物放出速度が遅く作用する。具体的に、図７のように膨潤度が最も低いＪＰＤ００１の場合、薬物が最も速く放出され、膨潤度が最も高いＪＰＤ００４の場合には薬物放出速度が最も遅く示された。架橋ヒアルロン酸の弾性係数が低いほど、体内適用時、組織内拡散程度が高く、つまり、広い部位に局所麻酔剤の痛み減少効果を提供することができる。複合粘度は、低いほど体内適用時、注射針を使用した時に注入力が低くて使用を容易にする。薬物放出速度に関連して膨潤度が最も重要な要因で作用し、弾性係数および複合粘度の場合には実際臨床適用時に局所麻酔剤の作用を補助する要因で作用する。前記表１に示した架橋ヒアルロン酸の膨潤度は、１００～６００範囲で示され、痛みが最も激しい３日間、ＪＰＤ００１とＪＰＤ００４を混合した条件で薬物が安定的に放出されることを確認できた。
【0054】
実施例２：架橋ヒアルロン酸の製造および物性評価
２－１：架橋ヒアルロン酸の製造
１，５００ｋＤａの分子量を有する非架構ヒアルロン酸（繰り返し単位の分子量４０１．３）１００重量部を０．２５Ｎ ＮａＯＨ溶液４００重量部に溶解して２０重量％のヒアルロン酸溶液を製造した。前記ヒアルロン酸溶液に架橋剤である１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ、ＢＤＤＥ）を０．４モル％の比率で添加して、それぞれ３個の異なる容量で反応を行い、具体的にＪＤ００５は４００ｍＬ、ＪＤ００６は５ｍＬ、およびＪＤ００７は２５ｍＬの容量体積で分注して室温で２４時間架橋反応を行い、異なる容量を有する架橋反応物を得た。
２－１：架橋ヒアルロン酸の製造
１，５００ｋＤａの分子量を有する非架構ヒアルロン酸（繰り返し単位の分子量４０１．３）１００重量部を０．２５Ｎ ＮａＯＨ溶液４００重量部に溶解して２０重量％のヒアルロン酸溶液を製造した。前記ヒアルロン酸溶液に架橋剤である１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ、ＢＤＤＥ）を０．４モル％の比率で添加して、それぞれ３個の異なる容量で反応を行い、具体的にＪＤ００５は４００ｍＬ、ＪＤ００６は５ｍＬ、およびＪＤ００７は２５ｍＬの容量体積で分注して室温で２４時間架橋反応を行い、異なる容量を有する架橋反応物を得た。
【0055】
１，５００ＫＤａの分子量を有する非架構ヒアルロン酸を０．２５Ｎ ＮａＯＨ溶液に溶解して２０重量％のヒアルロン酸溶液を製造した。前記ヒアルロン酸溶液に架橋剤である１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル（１，４－ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ ｄｉｇｌｙｃｉｄｙｌ ｅｔｈｅｒ、ＢＤＤＥ）を０．４モル％の比率で添加して、それぞれ４個の異なる容量で反応を行い、具体的にＪＤ００５は４００ｍＬ、ＪＤ００６は５ｍＬ、およびＪＤ００７は２５ｍＬの容量体積で分注して室温で２４時間架橋反応を行い、異なる容量を有する架橋反応物を得た。
【0056】
前記架橋反応の完了後、ＪＤ００５は孔径１，０００μｍの篩を通過させて粉砕することによって、各粉砕物の直径が約１，０００μｍになるように１次粉砕物を得た。以降、前記ＪＤ００５の１次粉砕物をリン酸緩衝溶液で数回洗浄して未反応ＢＤＤＥを除去し、ｐＨを６．５～７．５水準で安定化し、精製にかかった時間は２４時間であった。
【0057】
また、前記架橋反応が完了したＪＤ００６およびＪＤ００７反応物は、粉砕過程なしにそのままリン酸緩衝溶液で数回洗浄して未反応ＢＤＤＥを除去し、ｐＨを６．５～７．５水準で安定化した。前記精製工程にかかった時間は、ＪＤ００６反応物は約３６時間であり、ＪＤ００７反応物は約７２時間であった。
【0058】
前記得られた３種類の反応物（ＪＤ００５、ＪＤ００６、ＪＤ００７）に対して３００μｍの篩を通過させて粉砕し、固形分の含有量を大韓薬典の乾燥減量試験方法で測定した。前記粉砕後に得られた反応物の固形分含有量は、ＪＤ００５は１．１ｗｔ／ｗｔ％、ＪＤ００６は１．８ｗｔ／ｗｔ％、ＪＤ００７は２．５ｗｔ／ｗｔ％であった。
【0059】
固形分含有量２．０重量％の試料製品を製造するために、ＪＤ００５およびＪＤ００６反応物は、前記架橋反応の原料で使用した非架構ヒアルロン酸を添加して固形分含有量２．０重量％に合わせ、ＪＤ００７反応物は、固形分含有量が２．０重量％を超えるため、ＰＢＳを添加して２．０重量％に希釈して固形分含有量が２．０重量％になるようにした。前記得られた３種類の試料は、１２１℃で２０分間滅菌して架橋ヒアルロン酸ゲルを製造した。
【0060】
２－２：架橋ヒアルロン酸の物性評価
前記製造された架橋ヒアルロン酸ＪＤ００５、ＪＤ００６、ＪＤ００７、および（ＪＤ００５とＪＤ００７の重量比１：１で含む混合物）に対して、膨潤度比率、弾性係数および複合粘度を実施例１と同様な方法で測定してその結果を表２と図４～図６に示した。
前記製造された架橋ヒアルロン酸ＪＤ００５、ＪＤ００６、ＪＤ００７、および（ＪＤ００５とＪＤ００７の重量比１：１で含む混合物）に対して、膨潤度比率、弾性係数および複合粘度を実施例１と同様な方法で測定してその結果を表２と図４～図６に示した。
【0061】
【表2】
【0062】
前記表２と図４～図６に示したように、異なる膨潤度を有するＪＤ００５＋ＪＤ００７を１：１で混合した試料と類似の膨潤度を有する試料－ＪＤ００６の物性を比較した場合、混合試料は２倍程度が増加した弾性係数（Ｇ’）を示す。低い弾性値を有する試料は組織に投入時に組織内拡散性が高く、組織内で散る可能性が高い。したがって、好ましい膨潤度範囲は１００～２００％であると確認した。
【0063】
複合粘度分析データの場合にも異なる膨潤度を有する（ＪＤ００５＋ＪＤ００７）試料を１：１で混合した試料と類似の膨潤度を有する試料－ＪＤ００６の物性を比較した場合、混合試料は複合粘度が２倍程度高い結果を示した。したがって、好ましい弾性係数（Ｇ’）範囲は１Ｈｚで測定した値が０～２５０ｐａ（１Ｈｚ）であり、複合粘度は０．０２Ｈｚで測定した値が５００，０００～１，５００，０００ｃｐ（０．０２Ｈｚ）であると確認した。
【0064】
実施例３：架橋ヒアルロン酸を利用した薬物（ブピバカイン）の放出挙動評価
実施例１で製造した架橋ヒアルロン酸固形分が２重量％含有量で含まれている架橋ヒアルロン酸ゲルであるＪＰＤ００１、ＪＰＤ００４および（ＪＰＤ００１とＪＰＤ００４の１：１重量比の混合物）、つまり、実施例１の試料１－１、１－４および１－５をそれぞれ６ｇと、０．７５重量％ブピバカイン（ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ）溶液３ｇを混合して薬物製剤を製造した。対照群として１，５００ｋＤａの分子量を有する非架構ヒアルロン酸（繰り返し単位の分子量４０１．３）２重量％を混合した製剤とブピバカイン薬物のみを含む製剤をそれぞれ製造した。
実施例１で製造した架橋ヒアルロン酸固形分が２重量％含有量で含まれている架橋ヒアルロン酸ゲルであるＪＰＤ００１、ＪＰＤ００４および（ＪＰＤ００１とＪＰＤ００４の１：１重量比の混合物）、つまり、実施例１の試料１－１、１－４および１－５をそれぞれ６ｇと、０．７５重量％ブピバカイン（ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ）溶液３ｇを混合して薬物製剤を製造した。対照群として１，５００ｋＤａの分子量を有する非架構ヒアルロン酸（繰り返し単位の分子量４０１．３）２重量％を混合した製剤とブピバカイン薬物のみを含む製剤をそれぞれ製造した。
【0065】
前記製造された薬物製剤に対してそれぞれ透析バッグ（ＭＷＣＯ：１２ Ｋ－１４ Ｋ Ｄａ）に入れた。その後、透析バッグをチューブに１５ｍｌリン酸緩衝溶液で浸漬させた。浸漬された透析バッグが入っている５０ｍＬのコニカルチューブを３７℃で維持される振とう水槽に入れて１００ｒｐｍで 水平に振とうさせた。その後、予定された時間間隔で、１．５ｍＬの異型培地（ＰＢＳ）分取量を回収し、全体異型媒体を１５ｍＬの新たなＰＢＳに交換してシンク条件を維持した。放出されたブピバカインの定量化は、ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ）とアセトニトリル／ｐＨ８．０バッファー（６０：４０、ｖ／ｖ）を１０分以上使用した逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって決定された。薬物放出挙動を評価してその結果を図７に示した。
【0066】
図７の経時的薬物放出挙動に示したように、ブピバカインの時間帯別累積放出量においてブピバカイン単独使用時、８時間以内に９９％放出された。架橋ヒアルロン酸２％溶液の場合、８時間経過後６５．８％、２４時間経過後９９％のブピバカインを放出された。膨潤度が比較的低いＪＰＤ００１（試料１－１）の場合、２４時間に７０％の放出が行われ、４８時間に９６．７％のブピバカイン放出された。膨潤度が高いＪＰＤ００４（試料１－４）の場合、初期に比較的低い放出速度を示し、７２時間に８５．３％が放出された。また、ＪＰＤ００１とＪＰＤ００４の１：１重量比に混合した薬物送達体（試料１－５）は、放出初期にＪＰＤ００１のような放出速度を示してから徐々に放出するプロファイルを示し、具体的に、薬物の累積放出量が２４時間に６０％、４８時間に７５％および７２時間に９０％以上の放出パターンを示した。
【0067】
したがって、体内に適用時、局所麻酔剤が徐々に放出されて手術後最も痛みが激しい３日間痛みを減少させることができることを確認した。
【0068】
実施例４：薬物（ロピバカイン）の放出挙動評価
実施例２で製造した架橋ヒアルロン酸固形分が２重量％含有量で含まれている架橋ヒアルロン酸ゲルであるＪＤ００６、ＪＤ００７および（ＪＤ００５とＪＤ００７の１：１重量比の混合物）、つまり、実施例２による試料２－２、試料２－３および試料２－４をそれぞれ６ｇに対して、０．７５重量％ロピバカイン（ｒｏｐｉｖａｃａｉｎｅ）溶液３ｇを混合して薬物製剤を製造した。対照群として１，５００ｋＤａの分子量を有する非架構ヒアルロン酸（繰り返し単位の分子量４０１．３）２重量％を混合した製剤とブピバカイン薬物のみを含む製剤をそれぞれ製造した。
実施例２で製造した架橋ヒアルロン酸固形分が２重量％含有量で含まれている架橋ヒアルロン酸ゲルであるＪＤ００６、ＪＤ００７および（ＪＤ００５とＪＤ００７の１：１重量比の混合物）、つまり、実施例２による試料２－２、試料２－３および試料２－４をそれぞれ６ｇに対して、０．７５重量％ロピバカイン（ｒｏｐｉｖａｃａｉｎｅ）溶液３ｇを混合して薬物製剤を製造した。対照群として１，５００ｋＤａの分子量を有する非架構ヒアルロン酸（繰り返し単位の分子量４０１．３）２重量％を混合した製剤とブピバカイン薬物のみを含む製剤をそれぞれ製造した。
【0069】
前記製造された薬物製剤に対して実施例３のような方法で薬物放出挙動を評価してその結果を図８に示した。
【0070】
図８の経時的薬物放出挙動に示したように、ＨＡのフィラーの場合、２４時間以内に９９％放出され、ＪＤ００６（試料２－３）とＪＤ００５＋ＪＤ００７混合物（試料２－４）の場合、膨潤度が類似しているが、混合物の場合が７２時間まで放出されるプロファイルを示す。具体的に、ＪＤ００６（試料２－３）の薬物累積放出量が２４時間に９０％、４８時間に９５％以上の放出パターンを示した。また、ＪＤ００５＋ＪＤ００７混合物（試料２－４）を使用した場合、薬物の累積放出量が２４時間に６０．７％、４８時間に７９．６％および７２時間に９０．８％の放出パターンを示した。したがって、体内に適用時、局所麻酔剤が徐々に放出されて手術後最も痛みが激しい３日間痛みを減少させることができることを確認した。
【0071】
実施例５．外科用品（Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０）注入液およびロピバカインの混合投与による痛み緩和効果および安全性評価
５．１：試験動物の準備
１）試験系
下記条件の、特定病原体の存在しない（ＳＰＦ）Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット［Ｃｒｌ：ＣＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）］（生産処：株式会社オリエントバイオ（大韓民国京畿道城南市中院区ガルマチ路３２２）を準備した。
（１）入手時の動物数：雄２８匹
（２）入手時の週齢：約７週齢
（３）入手時の体重範囲：１９９．２９～２２２．３５ｇ
（４）投与開始時の週齢：約８週齢
（５）投与開始時の体重範囲：２６５．６３～２９４．００ｇ
（６）使用動物数：２４匹
（７）群分離
投与前日に体重を測定し、Ｅｘｃｅｌ ｐｒｏｇｒａｍを利用して順位化した体重で群分離を実施した。平均体重の±２０％範囲内に属する動物のみを試験に使用した。
５．１：試験動物の準備
１）試験系
下記条件の、特定病原体の存在しない（ＳＰＦ）Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット［Ｃｒｌ：ＣＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）］（生産処：株式会社オリエントバイオ（大韓民国京畿道城南市中院区ガルマチ路３２２）を準備した。
（１）入手時の動物数：雄２８匹
（２）入手時の週齢：約７週齢
（３）入手時の体重範囲：１９９．２９～２２２．３５ｇ
（４）投与開始時の週齢：約８週齢
（５）投与開始時の体重範囲：２６５．６３～２９４．００ｇ
（６）使用動物数：２４匹
（７）群分離
投与前日に体重を測定し、Ｅｘｃｅｌ ｐｒｏｇｒａｍを利用して順位化した体重で群分離を実施した。平均体重の±２０％範囲内に属する動物のみを試験に使用した。
【0072】
２）飼育環境
（１）温度および湿度範囲：温度２２±３℃、相対湿度５０±２０％ＲＨ
（２）換気回数：１０～１５回／ｈｒ
（３）明暗ｃｙｃｌｅ：蛍光灯照明１２ｈｒ（０８：００点灯～２０：００消灯）
（４）照度：１５０～３００ｌｘ
（５）騒音：６０ｄＢ以下
（６）アンモニア濃度：５ｐｐｍ以下
（７）飼育箱および飼育密度
検疫、純化、投与および観察期間中にステンレス製の網飼育箱（２５０Ｗ×精製および篩Ｌ×１８０Ｈｍｍ）に３匹以下収容し、投与および観察期間中には１匹以下収容した。飼育箱の交換は群分離時に実施した。
（８）飼料および水
飼料（Ｔｅｋｌａｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ Ｇｌｏｂａｌ １８％ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ、Ｅｎｖｉｇｏ、ＵＳＡ）は、コアテック（大韓民国京畿道平沢市振威面振威路１８１－２１）から供給を受けて給餌器に入れて自由摂取させた。水は飲用上水道水を浄水させた後、ポリカーボネート製ウォーターボトルに入れて自由摂取させた。
（１）温度および湿度範囲：温度２２±３℃、相対湿度５０±２０％ＲＨ
（２）換気回数：１０～１５回／ｈｒ
（３）明暗ｃｙｃｌｅ：蛍光灯照明１２ｈｒ（０８：００点灯～２０：００消灯）
（４）照度：１５０～３００ｌｘ
（５）騒音：６０ｄＢ以下
（６）アンモニア濃度：５ｐｐｍ以下
（７）飼育箱および飼育密度
検疫、純化、投与および観察期間中にステンレス製の網飼育箱（２５０Ｗ×精製および篩Ｌ×１８０Ｈｍｍ）に３匹以下収容し、投与および観察期間中には１匹以下収容した。飼育箱の交換は群分離時に実施した。
（８）飼料および水
飼料（Ｔｅｋｌａｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ Ｇｌｏｂａｌ １８％ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ、Ｅｎｖｉｇｏ、ＵＳＡ）は、コアテック（大韓民国京畿道平沢市振威面振威路１８１－２１）から供給を受けて給餌器に入れて自由摂取させた。水は飲用上水道水を浄水させた後、ポリカーボネート製ウォーターボトルに入れて自由摂取させた。
【0073】
５．２：試験群の準備
前記準備した試験動物の全身麻酔状態で左側足底部をきれいに消毒した後、足踵端部０．５ｃｍ離れた部分から始まって縦方向に１ｃｍの長さの皮膚と筋膜を切開した。切開した部分の足裏筋肉（足底筋）をフォーセップで持ち上げて１ｃｍの長さを分離した。縦方向の両側端部は足裏筋肉が離れないように慎重に持ち上げて分離し、左側太股の側面大腿二頭筋の座骨神経部分に、実施例２で製造した架橋ヒアルロン酸固形分が２重量％含有量で含まれている架橋ヒアルロン酸ゲルであるＪＤ００５とＪＤ００７の１：１重量比の混合物である試料２－４（Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０）とロピバカイン（ｒｏｐｉｖａｃａｉｎｅ）を含む製剤を１回投与して皮膚を縫合して下記表３のように試験群を構成した。Ｇａ～Ｇｄの投与液量（μｌ）は全て同一に６００μｌを神経組織付近に投与し、実験群に含まれている動物は６匹であった。
前記準備した試験動物の全身麻酔状態で左側足底部をきれいに消毒した後、足踵端部０．５ｃｍ離れた部分から始まって縦方向に１ｃｍの長さの皮膚と筋膜を切開した。切開した部分の足裏筋肉（足底筋）をフォーセップで持ち上げて１ｃｍの長さを分離した。縦方向の両側端部は足裏筋肉が離れないように慎重に持ち上げて分離し、左側太股の側面大腿二頭筋の座骨神経部分に、実施例２で製造した架橋ヒアルロン酸固形分が２重量％含有量で含まれている架橋ヒアルロン酸ゲルであるＪＤ００５とＪＤ００７の１：１重量比の混合物である試料２－４（Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０）とロピバカイン（ｒｏｐｉｖａｃａｉｎｅ）を含む製剤を１回投与して皮膚を縫合して下記表３のように試験群を構成した。Ｇａ～Ｇｄの投与液量（μｌ）は全て同一に６００μｌを神経組織付近に投与し、実験群に含まれている動物は６匹であった。
【0074】
【表3】
【0075】
Ｇｃに投与される薬物製剤は、２重量％濃度の架橋ヒアルロン酸ゲル３ｇ、０．７５重量％濃度のロピバカイン溶液３ｇを使用し、これをそれぞれの有効成分固形分含有量で換算すれば架橋ヒアルロン酸６０ｍｇおよびロピバカイン２３ｍｇを含み、架橋ヒアルロン酸と薬物の合計固形分含有量１００重量％を基準としてｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０の固形分含有量は７２．２重量％であり、ロピバカイン固形分含有量は２７．３重量％である。
【0076】
Ｇｄに投与される薬物製剤は、２重量％濃度の架橋ヒアルロン酸ゲル４ｇ、０．７５重量％濃度のロピバカイン溶液２ｇを使用し、これをそれぞれの有効成分固形分含有量で換算すれば架橋ヒアルロン酸８０ｍｇおよびロピバカイン１５ｍｇを含み、架橋ヒアルロン酸と薬物の合計固形分含有量１００重量％を基準としてｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０の固形分含有量は８４．２重量％であり、ロピバカイン固形分含有量は１５．８重量％である。
【0077】
５．３：試験方法
前記試験群の作製後、機械的異痛の程度を測定するための方法で白ネズミを網目の大きさが２×２ｍｍである鉄網ケージに入れて１５分以上適応させた後、ネズミの動きなどが静かになれば８個の連続した太さのフォン・フライ・フィラメント（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔ）（１、２、４、６、８、１５、２６、６０ｇ、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ、ＵＳＡ）を使用して連続的な反応をｕｐ－ｄｏｗｎ ｍｅｔｈｏｄで評価した。Ｆｉｌａｍｅｎｔを左側患部足裏に垂直に接触させ、５－６秒間維持させてネズミが迅速な回避反応を見せたりまたはｈａｉｒｓを離しながら直ちに動いたり足裏をなめれば陽性反応を示したものと見なした。中央部のフォン・フライ・フィラメント（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔ）から刺激して陽性反応を示せば弱いｆｉｌａｍｅｎｔで刺激し、陽性反応がなければ強いｆｉｌａｍｅｎｔで刺激しながら進行した。前記方法で試験物質の投与前、投与後１、２、４、８、２４、４８、７２、１２０、１６８時間目に測定した。痛み行動検査の結果解釈は、回避反応を見せたり足がプラスチック板についた状態で網の上に持ち上げられることを陽性と判定した。刺激は３～５分間隔で２回与え、このうち陽性反応を見せた閾値を利用して時間による反応変化曲線を得た。
前記試験群の作製後、機械的異痛の程度を測定するための方法で白ネズミを網目の大きさが２×２ｍｍである鉄網ケージに入れて１５分以上適応させた後、ネズミの動きなどが静かになれば８個の連続した太さのフォン・フライ・フィラメント（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔ）（１、２、４、６、８、１５、２６、６０ｇ、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ、ＵＳＡ）を使用して連続的な反応をｕｐ－ｄｏｗｎ ｍｅｔｈｏｄで評価した。Ｆｉｌａｍｅｎｔを左側患部足裏に垂直に接触させ、５－６秒間維持させてネズミが迅速な回避反応を見せたりまたはｈａｉｒｓを離しながら直ちに動いたり足裏をなめれば陽性反応を示したものと見なした。中央部のフォン・フライ・フィラメント（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔ）から刺激して陽性反応を示せば弱いｆｉｌａｍｅｎｔで刺激し、陽性反応がなければ強いｆｉｌａｍｅｎｔで刺激しながら進行した。前記方法で試験物質の投与前、投与後１、２、４、８、２４、４８、７２、１２０、１６８時間目に測定した。痛み行動検査の結果解釈は、回避反応を見せたり足がプラスチック板についた状態で網の上に持ち上げられることを陽性と判定した。刺激は３～５分間隔で２回与え、このうち陽性反応を見せた閾値を利用して時間による反応変化曲線を得た。
【0078】
また、安定性評価のために試験物質外科用品（Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０）に使用される注入液とロピバカインの混合物を前記試験群の座骨神経周囲に投与時に現れる薬物投与部位の局所毒性を調査するために、試験物質投与１４日後に投与部位周辺の筋肉および座骨神経を切取してトリミング、脱水およびパラフィン包埋などの一般的な組織処理過程を経て組織切片を作製して薄切し、ＨＥ染色（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ Ｅｏｓｉｎｓｔａｉｎ）染色を実施した後、検鏡した。
【0079】
５．４：薬動力学的分析結果
薬物投与後の時間別反応による薬力学的分析結果を下記表４および図９に示した。Ｇａ～Ｇｄグループ試験群の各動物の試験物質投与前、投与後１、２、４、８、２４、４８、７２、１２０、１６８時間目の痛み閾値を測定し、各試験群ごとの閾値の平均を計算した。下記表４で薬物投与時間別測定された閾値（ｇ）を示す。
薬物投与後の時間別反応による薬力学的分析結果を下記表４および図９に示した。Ｇａ～Ｇｄグループ試験群の各動物の試験物質投与前、投与後１、２、４、８、２４、４８、７２、１２０、１６８時間目の痛み閾値を測定し、各試験群ごとの閾値の平均を計算した。下記表４で薬物投与時間別測定された閾値（ｇ）を示す。
【0080】
【表4】
【0081】
Ｇａグループは、手術後１時間から測定された平均閾値（ｇ）が９．８ｇに減少し始めて４８時間後から閾値平均１０．８ｇに次第に痛みが安定的に回復して１６８時間に完全に回復した。
【0082】
Ｇｂグループは、手術後４時間から閾値平均３７．３ｇに減少し始めて４８時間後から閾値平均１７．５ｇに次第に痛みが安定的に回復して１２０時間に完全に回復した。
【0083】
Ｇｃグループは、手術後４時間から閾値平均４８．７ｇに減少し始めて４８時間後から閾値平均２０．５ｇに次第に痛みが安定的に回復して１２０時間に完全に回復した。
【0084】
Ｇｄグループは、手術後８時間から閾値平均５７．２ｇに減少し始めて４８時間後から閾値平均２４．２ｇに次第に痛みが安定的に回復して１２０時間に完全に回復した。
【0085】
前記試験群の分析結果で生理食塩水混合投与群（ＧａおよびＧｂ）とＶｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０混合投与群（ＧｃおよびＧｄ）の薬力学的変化を比較した結果、Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０混合投与群で閾値が高く測定されて痛み緩和効果がより大きいことが確認された。このような結果は、Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０と混合投与で薬物放出が遅延して発生する効果と判断される。
【0086】
また、ＧｃおよびＧｄを比較する場合、ロピバカイン濃度がより低く、Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０の濃度がより高いＧｄで閾値が高く測定されて痛み緩和効果がより大きいことが確認された。このような結果は、Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０の濃度増加によるロピバカインの薬物放出が遅延されて発生した効果と判断される。したがって、Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０の濃度が増加するほど薬物放出が調節されて痛み緩和効果が増加すると判断される。
【0087】
５．５：組織病理学的観察結果
投与部位周辺の筋肉および座骨神経をＨＥ染色を実施した後、検鏡した結果を図１０に示した。
投与部位周辺の筋肉および座骨神経をＨＥ染色を実施した後、検鏡した結果を図１０に示した。
【0088】
図１０ａでＧａ、Ｇｂ、ＧｃおよびＧｄ群の代表写真に示したように、Ｇｃ－１４およびＧｃ－１５の神経周辺に異物（ｆｏｒｅｉｇｎ ｂｏｄｙ）が境界をなして局所的に観察され、Ｇｄ－２１では異物と共に炎症細胞の浸潤が観察された。これに関連して、観察された炎症細胞の浸潤は投与した一部の試験物質の残存によるものと推定され、試験物質による毒性とは関連がないものである。前記観察状況を除くと、全ての試験群の試験物質投与部位周辺の筋肉および座骨神経では異常所見が観察されなかった。このような結果を基に外科用品（Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０）に使用される注入液とロピバカインの混合物を座骨神経周囲に投与した結果、試験物質による局所毒性がないと判断され、Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０濃度増加によりロピバカインの薬物放出が調節されて痛み緩和効果が増加すると判断される。
【0089】
実施例６．外科用品（Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０）注入液およびロピバカインの混合投与による薬物動態評価
６．１：試験動物の準備
特定病原体の存在しない（ＳＰＦ）Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット［Ｃｒｌ：ＣＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）］（生産処：株式会社オリエントバイオ（大韓民国京畿道城南市中院区ガルマチ路３２２）を下記条件により準備した。
（１）入手時の動物数：雄１８匹
（２）入手時の週齢：約８週齢
（３）入手時の体重範囲：２５６．９１～２７２．２４ｇ
（４）投与開始時の週齢：約９週齢
（５）投与開始時の体重範囲：２５９．３３～２７２．２４ｇ
（６）使用動物数：１５匹
（７）群分離
６．１：試験動物の準備
特定病原体の存在しない（ＳＰＦ）Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット［Ｃｒｌ：ＣＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）］（生産処：株式会社オリエントバイオ（大韓民国京畿道城南市中院区ガルマチ路３２２）を下記条件により準備した。
（１）入手時の動物数：雄１８匹
（２）入手時の週齢：約８週齢
（３）入手時の体重範囲：２５６．９１～２７２．２４ｇ
（４）投与開始時の週齢：約９週齢
（５）投与開始時の体重範囲：２５９．３３～２７２．２４ｇ
（６）使用動物数：１５匹
（７）群分離
【0090】
投与前日に体重を測定し、Ｅｘｃｅｌ ｐｒｏｇｒａｍを利用して順位化した体重で群分離を実施した。平均体重の±２０％範囲内に属する動物のみを試験に使用した。
【0091】
前記試験群の検疫、純化、投与および観察期間中にステンレス製の網飼育箱（２５０Ｗ×精製および篩Ｌ×１８０Ｈｍｍ）に３匹以下収容し、投与および観察期間中には２匹以下収容し、それ以外の条件は実質的に実施例５の試験群飼育環境と同一に飼育した。
【0092】
６．２：試験群の準備
前記準備した試験動物をイソフルラン（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を利用して吸入麻酔を実施し、大腿部位の皮膚を切開した後、座骨神経周囲に実施例２で製造した架橋ヒアルロン酸であるＪＤ００５とＪＤ００７の１：１重量比の混合物である試料２－４（Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０）とロピバカイン（ｒｏｐｉｖａｃａｉｎｅ）を含む製剤を注射器で１回投与して皮膚を縫合して下記表５のように試験群を構成し、投与液量（μｌ）はＧｅ～Ｇｇが全て同一に６００μｌに設定し、実験群に含まれている動物は５匹であった。
前記準備した試験動物をイソフルラン（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を利用して吸入麻酔を実施し、大腿部位の皮膚を切開した後、座骨神経周囲に実施例２で製造した架橋ヒアルロン酸であるＪＤ００５とＪＤ００７の１：１重量比の混合物である試料２－４（Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０）とロピバカイン（ｒｏｐｉｖａｃａｉｎｅ）を含む製剤を注射器で１回投与して皮膚を縫合して下記表５のように試験群を構成し、投与液量（μｌ）はＧｅ～Ｇｇが全て同一に６００μｌに設定し、実験群に含まれている動物は５匹であった。
【0093】
【表5】
【0094】
６．３：試験動物の採血
頸静脈（Ｊｕｇｕｌａｒ ｖｅｉｎ）から、使い捨て注射器を利用して、約０．５μｌの前記試験群の血液を試験物質投与前、投与後０．５、１、２、４、６、８、１２、２４および４８時間目に採血した。採血した血液はヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）処理したチューブ（５ＩＵ／ｍｌ）に移し、１２，０００ｒｐｍ（４℃）で５分間遠心分離した後、上層（血しょう）を分離した。分離した血しょうは、分析前まで－７０℃に設定されている超低温冷凍庫（大韓科学、Ｋｏｒｅａ；ＭＡＩ－０４０－０３）に保管後、分析に利用した。
頸静脈（Ｊｕｇｕｌａｒ ｖｅｉｎ）から、使い捨て注射器を利用して、約０．５μｌの前記試験群の血液を試験物質投与前、投与後０．５、１、２、４、６、８、１２、２４および４８時間目に採血した。採血した血液はヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）処理したチューブ（５ＩＵ／ｍｌ）に移し、１２，０００ｒｐｍ（４℃）で５分間遠心分離した後、上層（血しょう）を分離した。分離した血しょうは、分析前まで－７０℃に設定されている超低温冷凍庫（大韓科学、Ｋｏｒｅａ；ＭＡＩ－０４０－０３）に保管後、分析に利用した。
【0095】
６．４：試験方法
６．４．１試験機器および試薬
本発明で使用した実験機器は下記表６、試薬は下記表７のとおりである。
６．４．１試験機器および試薬
本発明で使用した実験機器は下記表６、試薬は下記表７のとおりである。
【0096】
【表6】
【0097】
【表7】
【0098】
１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）をＬＣ機器で、６４６０ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｌｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）をＭＳ／ＭＳ機器でＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を進行した。ロピバカイン塩酸塩水化物（Ｒｏｐｉｖａｃａｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）（Ｌｏｔ Ｎｏ．：０００００７７９１５、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を標準物質で、リドカイン塩酸塩水化物（Ｌｉｄｏｃａｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）（Ｌｏｔ Ｎｏ．：ＷＳ－０５４、ＪｏｏｎｇｈｕｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ、Ｋｏｒｅａ）を内部標準物質で使用した。
【0099】
６．４．２標準溶液および試料の調製
０．０５００ｇのロピバカイン塩酸塩水化物標準物質（純度９８．７％）を称量して５０ｍｌ ｂｏｔｔｌｅに入れ、５０％メタノールを満たした後、溶解して９８７．０００ｍｇ／ｌを調製した後、９８７．０００ｍｇ／ｌ濃度のロピバカイン塩酸塩水化物標準物質１．０１３ｍｌを１０ｍｌメスフラスコ（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｆｌａｓｋ）に入れて５０％メタノールを１０ｍｌ標線まで添加して１００．０００ｍｇ／ｌ濃度のストック溶液を調製し、下記表８の濃度および体積を有する調製されたストック溶液を５０％メタノールで系列希釈して下記表８の濃度を有する使用溶液を製造して使用した。
０．０５００ｇのロピバカイン塩酸塩水化物標準物質（純度９８．７％）を称量して５０ｍｌ ｂｏｔｔｌｅに入れ、５０％メタノールを満たした後、溶解して９８７．０００ｍｇ／ｌを調製した後、９８７．０００ｍｇ／ｌ濃度のロピバカイン塩酸塩水化物標準物質１．０１３ｍｌを１０ｍｌメスフラスコ（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｆｌａｓｋ）に入れて５０％メタノールを１０ｍｌ標線まで添加して１００．０００ｍｇ／ｌ濃度のストック溶液を調製し、下記表８の濃度および体積を有する調製されたストック溶液を５０％メタノールで系列希釈して下記表８の濃度を有する使用溶液を製造して使用した。
【0100】
【表8】
【0101】
０．０５ｇのリドカイン塩酸塩水化物（純度１００．０％）を称量して５０ｍｌ ｂｏｔｔｌｅに入れ、５０％メタノールを満たした後、溶解して１，０００．０００ｍｇ／ｌを調製した後、１，０００．０００ｍｇ／ｌ濃度のリドカイン塩酸塩水化物標準物質１ｍｌを１００ｍｌメスフラスコ（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｆｌａｓｋ）に入れて５０％メタノールを１００ｍｌ標線まで添加して、１０．０００ｍｇ／ｌ濃度のストック溶液を調製し、調製されたストック溶液 ６０μｌとアセトニトリル（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）９，９４０μｌを混合して６００ｎｇ／ｍｌの使用溶液を調製した。
【0102】
ストック溶液の標準溶液のストック溶液を使用し、下記表９の濃度および体積を有する調製された標準溶液のストック溶液を５０％メタノールで系列希釈して下記表９の濃度を有する使用溶液を製造して使用した。
【0103】
【表9】
【0104】
前記７０℃以下に保管した血しょうを室温に放置して溶かした後、約３０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）でよく混合した。下記表１０の濃度および体積を有する使用溶液を血しょうで系列希釈して標準溶液の使用溶液を下記表１０の濃度を有する検量線試料の標準血しょうを調剤して準備した。
【0105】
【表10】
【0106】
６．４．３試料の前処理
検量線試料および生体試料２００μｌに６００．０００ｎｇ／ｍｌ濃度の内部標準溶液４０μｌ、１Ｍ水酸化ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）４０μｌ、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（ｔｅｒｔ－Ｂｕｔｙｌ ｍｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ）１，２００μｌを添加した後、３０秒間ボルテックス混合（ｖｏｒｔｅｘ ｍｉｘｉｎｇ）した後、３，４００ｒｐｍで５分間遠心分離して上層液９００μｌを取った。この上層液９００μｌに０．１％ギ酸９０μｌを添加した後、３０秒間ボルテックス混合（ｖｏｒｔｅｘ ｍｉｘｉｎｇ）した後、３，４００ｒｐｍで５分間遠心分離して下層液８０μｌを取った。
検量線試料および生体試料２００μｌに６００．０００ｎｇ／ｍｌ濃度の内部標準溶液４０μｌ、１Ｍ水酸化ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）４０μｌ、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（ｔｅｒｔ－Ｂｕｔｙｌ ｍｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ）１，２００μｌを添加した後、３０秒間ボルテックス混合（ｖｏｒｔｅｘ ｍｉｘｉｎｇ）した後、３，４００ｒｐｍで５分間遠心分離して上層液９００μｌを取った。この上層液９００μｌに０．１％ギ酸９０μｌを添加した後、３０秒間ボルテックス混合（ｖｏｒｔｅｘ ｍｉｘｉｎｇ）した後、３，４００ｒｐｍで５分間遠心分離して下層液８０μｌを取った。
【0107】
６．４．４分析条件および定量方法および結果解釈
以下、本発明に使用した具体的なＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件は下記表１１のとおりである。
以下、本発明に使用した具体的なＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件は下記表１１のとおりである。
【0108】
【表11】
【0109】
定量値は得られたクロマトグラムから内部標準物質のピーク面積に対する標準物質のピーク面積比（ｐｅａｋ ａｒｅａ ｒａｔｉｏ）（標準物質のピーク面積／内部標準物質のピーク面積）を求めた。当該機器のＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ Ｂ．０７．１（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）を利用して予め作成した検量線から血しょう中の試験物質の濃度を求めた。
【0110】
毒性動態結果解釈は、血中濃度曲線に基づいた非モデル解釈法によりＰｈｏｅｎｉｘ（商標名）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎを利用してＴｍａｘ（最高血中濃度到達時間）、Ｃｍａｘ（最高血中濃度）、ＡＵＣ０－４８ｈｒ（０～４８時間の血中濃度－時間曲線下の面積）およびＭＲＴ（薬物の平均滞留時間）の動態学的なパラメータを算出して解釈した。
【0111】
６．５：血中ロピバカイン濃度変化の分析結果
全ての試験群でロピバカインの薬物濃度は、薬物投与後１～２時間に薬物の濃度が急激に増加し、以降６時間まで急激に減少する傾向を示し、１２時間に薬物が全部消失し、前記結果を図１１、表１２に示した。Ｇｅ～Ｇｇグループ試験群の各動物の試験物質投与前、投与後０．５、１、２、４、６、８、１２、２４および４８時間目に採血した血しょうのロピバカイン濃度を測定し、各試験群ことに義濃度の平均を計算した。下記表１２で時間別測定されたＲａｔの血しょう内にロピバカイン濃度（ｎｇ／ｋｇ）の平均を示した。
全ての試験群でロピバカインの薬物濃度は、薬物投与後１～２時間に薬物の濃度が急激に増加し、以降６時間まで急激に減少する傾向を示し、１２時間に薬物が全部消失し、前記結果を図１１、表１２に示した。Ｇｅ～Ｇｇグループ試験群の各動物の試験物質投与前、投与後０．５、１、２、４、６、８、１２、２４および４８時間目に採血した血しょうのロピバカイン濃度を測定し、各試験群ことに義濃度の平均を計算した。下記表１２で時間別測定されたＲａｔの血しょう内にロピバカイン濃度（ｎｇ／ｋｇ）の平均を示した。
【0112】
【表12】
【0113】
６．６：ロピバカイン薬物動態学的パラメータの分析結果
薬物投与後、血中時間別濃度に基づいて血しょう中のロピバカインの薬物動態学的パラメータを分析し、分析結果は下記図１２および表１３に示した。Ｇｅ～Ｇｇグループ試験群の各動物のパラメータ値を測定し、各試験群ごとの各パラメータ値の平均を計算した。下記表１３で分析されたパラメータの平均を示した。
薬物投与後、血中時間別濃度に基づいて血しょう中のロピバカインの薬物動態学的パラメータを分析し、分析結果は下記図１２および表１３に示した。Ｇｅ～Ｇｇグループ試験群の各動物のパラメータ値を測定し、各試験群ごとの各パラメータ値の平均を計算した。下記表１３で分析されたパラメータの平均を示した。
【0114】
【表13】
【0115】
Ｇｅグループは、ＡＵＣ０－４８ｈｒ平均が１２５４．９７ｎｇ・ｈ／ｍｌ、Ｃｍａｘ平均が４３９．９０ｎｇ／ｍｌ、Ｔｍａｘ平均が１．２ｈｒ、ＭＲＴ平均が１．８６ｈｒと示された。
【0116】
Ｇｆグループは、ＡＵＣ０－４８ｈｒ平均が１３０８．３９ｎｇ・ｈ／ｍｌ、Ｃｍａｘ平均が４０９．２３ｎｇ／ｍｌ、Ｔｍａｘ平均が２ｈｒ、ＭＲＴ平均が２．１７ｈｒと示された。
【0117】
Ｇｇグループは、ＡＵＣ０－４８ｈｒ平均が９４７．８６ｎｇ・ｈ／ｍｌ、Ｃｍａｘ平均が３２０．４１ｎｇ／ｍｌ、Ｔｍａｘ平均が１．２ｈｒ、ＭＲＴ平均が２．１５ｈｒと示された。
【0118】
生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）混合投与群とＶｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０混合投与群との薬物動態学的変化を比較するためにＧｅおよびＧｆを比較した結果、ＡＵＣ０－４８ｈｒ平均は同一であり、Ｔｍａｘ、ＭＲＴがＶｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０混合投与群で増加し、Ｃｍａｘは生理食塩水混合投与群が増加すると判断される。このような結果は、生体利用率は同一であるが、Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０混合の場合、薬物放出遅延による結果と判断される。
【0119】
Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０の希釈比率によるロピバカイン濃度変化による薬物動態学的比較するためにＧｆおよびＧｇを比較した結果、濃度変化によるＡＵＣ０－４８ｈｒ、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘの減少が観察され、ＭＲＴは変化がなかった。このような結果は生体利用率は同一であるが、Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０混合の場合、薬物放出遅延による結果である。
【0120】
混合投与群のロピバカイン濃度の薬物動態学的変化を比較するためにＧｅおよびＧｆとＧｇを比較した結果、ＡＵＣ０－４８ｈｒ、Ｔｍａｘ、Ｃｍａｘの減少が観察され、ＭＲＴは変化がなかった。このような結果は、ロピバカインの濃度減少によるＡＵＣ０－４８ｈｒ、Ｔｍａｘ、Ｃｍａｘの減少と判断され、Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０の濃度増加による影響で薬物放出が遅延されて平均滞留時間には影響がないと判断される。したがって、Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０の濃度が増加するほど薬物放出が遅延されると判断される。
【0121】
以上の結果に基づいて外科用品（Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０）に使用される注入液は、ロピバカインの薬物放出を遅延すると判断され、Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０濃度増加により薬物放出が遅延すると判断される。また、対照群（Ｇｅ）と比較して試験群であるＧｆおよびＧｇ群で血液内低いＣｍａｘ値は、Ｖｏｆｅｒｏｎ－Ｌ６０の濃度増加による影響で薬物放出が遅延し、ロピバカインを単独で使用する場合より安全であると判断される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
