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特許7442221生物学的年齢の計算方法、老化状態の評価方法、ＣｐＧサイトの評価方法、プログラム、およびコンピュータ可読記憶媒体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-22
(45)【発行日】2024-03-04
(54)【発明の名称】生物学的年齢の計算方法、老化状態の評価方法、ＣｐＧサイトの評価方法、プログラム、およびコンピュータ可読記憶媒体
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20240226BHJP
G16H 50/00 20180101ALI20240226BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240226BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68
G16H50/00
C12N15/09 Z
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2022182688
(22)【出願日】2022-11-15
【審査請求日】2024-01-05
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】507148456
【氏名又は名称】学校法人 岩手医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000176
【氏名又は名称】弁理士法人一色国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】小巻 翔平
(72)【発明者】
【氏名】清水 厚志
(72)【発明者】
【氏名】八谷 剛史
【審査官】田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】特表２０２２－５０８５９７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１４／１４６７９３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０２２／１３６０３７（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／６８
Ｇ１６Ｈ ５０／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
個人の生物学的年齢の計算方法であって、個人から得られた細胞集団のゲノムにおいて、下記表に記載の１～２３５番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのうち、
（１）２１５個以上２３５個以下のＣｐＧサイトを選択するか、または
（２）２３５個のＣｐＧサイトに、ランダムに選択された１～３個のＣｐＧサイトを追加することによって、
ＣｐＧサイトのプールを作る工程と、
前記プールのＣｐＧサイトのメチル化を調べ、前記プールのＣｐＧサイトの各々におけるメチル化率を算出する工程と、
下記数式を用いて、前記個人の生物学的年齢を計算する工程と、
【数1】
を含む、計算方法。
［表］
【請求項2】
ｔ＝８０～８４である、請求項１に記載の計算方法。
【請求項3】
ｔ＝８１．９４６６０９である、請求項１に記載の計算方法。
【請求項4】
Ｃｎは、前記表に記載のｎ番の染色体の位置に対する係数の８０％～１２０％にある値を示す、請求項１に記載の計算方法。
【請求項5】
Ｃｎは、前記表に記載のｎ番の染色体の位置に対する係数である、請求項１に記載の計算方法。
【請求項6】
前記表に記載の２３５個のＣｐＧサイトが選択されて、ＣｐＧサイトのプールが作られる、請求項１～５のいずれか１項に記載の計算方法。
【請求項7】
前記個人がアジア人である、請求項１～５のいずれか１項に記載の計算方法。
【請求項8】
前記細胞集団が血液細胞である、請求項１～５のいずれか１項に記載の計算方法。
【請求項9】
個人の老化状態の評価方法であって、請求項１～５のいずれか１項に記載の計算方法によって、前記個人の生物学的年齢を計算する工程と、
前記個人の前記生物学的年齢と、前記個人の暦年齢と、を比較する工程と、
を含む、評価方法。
【請求項10】
個人の生物学的年齢を計算するためのＣｐＧサイトの評価方法であって、ある個人から得られた細胞集団のゲノムにおいて、下記表に記載の１～２３５番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのうち、
（１）２００個以上２１４個以下のＣｐＧサイトを選択するか、または
（２）２３５個のＣｐＧサイトに、４～６個のＣｐＧサイトを追加することによって、
ＣｐＧサイトのプールを作る工程と、
前記プールのＣｐＧサイトのメチル化を調べ、前記プールのＣｐＧサイトの各々におけるメチル化率を算出する工程と、
下記数式を用いて、前記個人の生物学的年齢を計算する工程と、
【数2】
を含む、評価方法。
［表］
【請求項11】
前記個人がアジア人である、請求項１０に記載の評価方法。
【請求項12】
前記細胞集団が血液細胞である、請求項１０または１１に記載の評価方法。
【請求項13】
請求項１～５のいずれか１項に記載の計算方法、または請求項１０または１１に記載の評価方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
【請求項14】
請求項１３に記載のプログラムを格納するコンピュータ可読記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生物学的年齢の計算方法、老化状態の評価方法、ＣｐＧサイトの評価方法、プログラム、およびコンピュータ可読記憶媒体に関する。
【背景技術】
【0002】
人は加齢やそれに伴う老化に伴って、様々な疾患を発症したり、認知機能や身体機能の低下を示したりする。人類の平均寿命が伸びている現代社会においては、老化に伴う疾患の発症や機能の低下を呈する期間を遅延させること、すなわち健康寿命を伸ばすことの重要性が増している。そのためには個人の老化状態を評価することが不可欠であるが、老化は個人によって進行速度が異なるため、暦年齢ではなく生物学的年齢を評価できる指標が必要である。
【0003】
たとえば、従来、生物学的年齢を評価する対象としてＤＮＡメチル化を用いるEpigenetic clockという概念が存在する。ＤＮＡメチル化状態は環境要因などによって後天的に変化し、一部のＣｐＧは老化に伴って一定のＤＮＡメチル化率の変化を示す。そこで幅広い暦年齢や老化状態の人に由来するＤＮＡのメチル化情報から年齢や老化状態と関連するＣｐＧを特定し、個人の生物学的年齢をＤＮＡメチル化情報から計算された数値として推定することを可能にするモデルが開発されている。このモデルにおいて、ＤＮＡメチル化情報から計算された数値は、エピゲノム年齢と呼ばれる。このモデルを用いて計算された、ある個人のエピゲノム年齢と、その個人の暦年齢を比較することで、その個人の老化の進行度を評価することも可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、新規な生物学的年齢の計算方法、新規な老化状態の評価方法、新規なＣｐＧサイトの評価方法、新規なプログラム、および新規なコンピュータ可読記憶媒体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明の一実施態様は、個人の生物学的年齢の計算方法であって、個人から得られた細胞集団のゲノムにおいて、下記表１に記載の１～２３５番の染色体の位置（ＧＲＣｈ３７に基づく）のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのうち、（１）２１５個以上２３５個以下のＣｐＧサイトを選択するか、または（２）２３５個のＣｐＧサイトに、ランダムに選択された１～３個のＣｐＧサイトを追加することによって、ＣｐＧサイトのプールを作る工程と、前記プールのＣｐＧサイトのメチル化を調べ、前記プールのＣｐＧサイトの各々におけるメチル化率を算出する工程と、下記数式を用いて、前記個人の生物学的年齢を計算する工程と、
【0006】
［数１］
（ただし、ｔ＝７９～８５であり、ＤＮＡｍｎは、下記表１に記載のｎ番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのメチル化率を示し、Ｃｎは、下記表１に記載のｎ番の染色体の位置に対する係数の５０％～１５０％にある値を示す。）を含む、計算方法である。ｔ＝８０～８４であってもよく、ｔ＝８１．９４６６０９であってもよい。Ｃｎは、下記表１に記載のｎ番の染色体の位置に対する係数の８０％～１２０％にある値であってもよく、下記表１に記載のｎ番の染色体の位置に対する係数の値であってもよい。表１に記載の２３５個のＣｐＧサイトが選択されて、ＣｐＧサイトのプールが作られてもよい。前記個人がアジア人であってもよい。前記細胞集団が血液細胞であってもよい。
【0007】
本発明の他の実施態様は、個人の老化状態の評価方法であって、上記いずれかの計算方法によって、前記個人の生物学的年齢を計算する工程と、前記個人の前記生物学的年齢と、前記個人の暦年齢と、を比較する工程と、を含む、評価方法である。
【0008】
本発明のさらなる実施態様は、個人の生物学的年齢を計算するためのＣｐＧサイトの評価方法であって、ある個人から得られた細胞集団のゲノムにおいて、下記表１に記載の１～２３５番の染色体の位置（ＧＲＣｈ３７に基づく）のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのうち、（１）２００個以上２１４個以下のＣｐＧサイトを選択するか、または（２）２３５個のＣｐＧサイトに、４～６個のＣｐＧサイトを追加することによって、ＣｐＧサイトのプールを作る工程と、前記プールのＣｐＧサイトのメチル化を調べ、前記プールのＣｐＧサイトの各々におけるメチル化率を算出する工程と、下記数式を用いて、前記個人の生物学的年齢を計算する工程と、
【0009】
［数２］
（ただし、ｔ＝７９～８５であり、ＤＮＡｍｎは、下記表１に記載のｎ番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのメチル化率を示し、Ｃｎは、下記表１に記載のｎ番の染色体の位置に対する係数の５０％～１５０％にある値を示す。）を含む、評価方法である。前記個人がアジア人であってもよい。前記細胞集団が血液細胞であってもよい。
【0010】
本発明のさらなる実施態様は、上記いずれかの計算方法または評価方法をコンピュータに実行させるためのプログラムおよび当該プログラムを格納するコンピュータ可読記憶媒体である。
【発明の効果】
【0011】
本発明によって新規な生物学的年齢の計算方法、新規な老化状態の評価方法、新規なＣｐＧサイトの評価方法、新規なプログラム、および新規なコンピュータ可読記憶媒体を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1A】本発明の実施例において、表１に記載の１～５０番目の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトにおける、被検者の暦年齢（Chronological Age）（ｘ軸）とメチル化率（％）（ｙ軸）との関係を示したグラフである。
【図1B】本発明の実施例において、表１に記載の５１～１００番目の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトにおける、被検者の暦年齢（Chronological Age）（ｘ軸）とメチル化率（％）（ｙ軸）との関係を示したグラフである。
【図1C】本発明の実施例において、表１に記載の１０１～１５０番目の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトにおける、被検者の暦年齢（Chronological Age）（ｘ軸）とメチル化率（％）（ｙ軸）との関係を示したグラフである。
【図1D】本発明の実施例において、表１に記載の１５１～２００番目の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトにおける、被検者の暦年齢（Chronological Age）（ｘ軸）とメチル化率（％）（ｙ軸）との関係を示したグラフである。
【図1E】本発明の実施例において、表１に記載の２０１～２３５番目の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトにおける、被検者の暦年齢（Chronological Age）（ｘ軸）とメチル化率（％）（ｙ軸）との関係を示したグラフである。
【図2】（ａ）本発明の実施例において、エピゲノム年齢の計算式を用いて得られたエピゲノム年齢（Epigenetic Age）と暦年齢（Chronological Age）との相関を示したグラフである。（ｂ）本発明の実施例において、血液細胞種特異的なＤＮＡメチル化率を示すＣｐＧサイトを用いて得られたエピゲノム年齢（Epigenetic Age）に対する老化評価度の計算式の値（Epigenetic Age Acceleration）を、暦年齢に対してプロットしたグラフである。
【図3A】表１に記載の１～２３５番のＣｐＧサイトにおいて、ランダムにＣｐＧサイトを除外し、残ったＣｐＧサイトでエピゲノム年齢を算出した実施例において、除外したＣｐＧサイトの個数（ｘ軸）に対して、エピゲノム年齢と暦年齢との差の絶対値（ｙ軸）をプロットしたグラフである。なお、エピゲノム年齢と暦年齢との差の絶対値は、中央値（点）と四分位範囲（線分）で示した。
【図3B】表１に記載の１～２３５番のＣｐＧサイトにおいて、ランダムにＣｐＧサイトを除外し、残ったＣｐＧサイトでエピゲノム年齢を算出した実施例において、除外したＣｐＧサイトの個数（ｘ軸）に対して、エピゲノム年齢と暦年齢の相関係数（ｙ軸）をプロットしたグラフである。なお、エピゲノム年齢と暦年齢の相関係数は、中央値（点）と四分位範囲（線分）で示した。
【図4A】表１に記載の１～２３５番のＣｐＧサイトにおいて、ランダムに選択された表１に記載のないＣｐＧサイトを追加し、得られたＣｐＧサイトでエピゲノム年齢を算出した実施例において、追加した個数（ｘ軸）に対して、エピゲノム年齢と暦年齢との差の絶対値の平均（ｙ軸）をプロットしたグラフである。なお、エピゲノム年齢と暦年齢との差の絶対値は、中央値（点）と四分位範囲（線分）で示した。
【図4B】表１に記載の１～２３５番のＣｐＧサイトにおいて、ランダムに選択された表１に記載のないＣｐＧサイトを追加し、得られたＣｐＧサイトでエピゲノム年齢を算出した実施例において、追加したＣｐＧサイトの個数（ｘ軸）に対して、エピゲノム年齢と暦年齢の相関係数（ｙ軸）をプロットしたグラフである。なお、エピゲノム年齢と暦年齢の相関係数は、中央値（点）と四分位範囲（線分）で示した。
【図5】実施例１で得られたエピゲノム年齢の計算式において、表１に記載の係数に対して１－ｘ～１＋ｘ（ｘは０、０．５０、または１．００）の間の乱数をかけて得られた係数を用いてエピゲノム年齢を算出し、エピゲノム年齢（Epigenetic Age）と暦年齢（Chronological Age）の相関を示したグラフである。
【図6】実施例１で得られたエピゲノム年齢の計算式において、表１に記載の係数に対して１－ｘ～１＋ｘ（ｘは０．００以上１．００以下で、０．０１刻みの１０１通りの数）の間の乱数をかけて得られた係数を用いてエピゲノム年齢を算出し、ｘ（ｘ軸）に対して、エピゲノム年齢と暦年齢との差の絶対値（ｙ軸）をプロットしたグラフである。なお、エピゲノム年齢と暦年齢との差の絶対値は、中央値（点）と四分位範囲（線分）で示した。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明の目的、特徴、利点、およびそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態および具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示または説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。なお、本明細書で、表についての「Ｎ番」とは、表の上から数えてＮ番目を表すこととする。
【0014】
＝＝生物学的年齢の計算方法＝＝
本明細書に開示の、個人の生物学的年齢の計算方法は、個人から細胞集団を得る工程と、細胞集団からゲノムを抽出する工程と、細胞集団のゲノムにおいて、表１に記載の１～２３５番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのうち、
本明細書に開示の、個人の生物学的年齢の計算方法は、個人から細胞集団を得る工程と、細胞集団からゲノムを抽出する工程と、細胞集団のゲノムにおいて、表１に記載の１～２３５番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのうち、
【0015】
（１）第１の個数のＣｐＧサイトを選択するか、または
（２）２３５個のＣｐＧサイトに、ランダムに選択された第２の個数のＣｐＧサイトを追加することによって、
（２）２３５個のＣｐＧサイトに、ランダムに選択された第２の個数のＣｐＧサイトを追加することによって、
【0016】
ＣｐＧサイトのプールを作る工程と、作られたプールのＣｐＧサイトのメチル化を調べ、プールのＣｐＧサイトの各々におけるメチル化率を算出する工程と、下記数式を用いて、個人の生物学的年齢を計算する工程と、を含む。
【0017】
［数３］
（式中、ｔは第１の係数であり、ＤＮＡｍｎは、表１に記載のｎ番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのメチル化率を示し、Ｃｎは、表１に記載のｎ番の染色体の位置に対する第２の係数を示す。）
【表1】
【0018】
なお、本明細書において、「生物学的年齢」とは、その年齢が暦年齢である人々の平均的老化度を有するエピゲノム年齢を意味する。また、本明細書において、染色体上の位置は、ＧＲＣｈ３７上の位置によって特定される。
【0019】
個人の人種、国籍、および所属する集団は特に限定されないが、アジア人であることが好ましく、東アジア人であることがより好ましく、日本人であることがさらに好ましい。ここで、アジア人、東アジア人、および日本人とは、ゲノム情報またはミトコンドリアＤＮＡ情報に基づいた人種解析によって、それぞれ、アジア人、東アジア人、および日本人の大多数からなるクラスターの中に入る個体をいうものとする。解析方法は特に限定されず、例えばマイクロサテライトＤＮＡ多型を用いた方法など、学術的に認定されているものであればよい。
【0020】
細胞集団の細胞種（cell type）は特に限定されず、単数の細胞種から成っていても、複数の細胞種から成っていてもよい。取得しやすいという理由から血液細胞が好ましい。
【0021】
第１の係数ｔは、７７～８７であることが好ましく、７９～８５であることがより好ましく、８０～８４であることがさらに好ましく、８１．９４６６０９であることがさらに好ましい。
【0022】
第２の係数Ｃｎは、表１に記載の値に対して、５０～１５０％の範囲にある値であることが好ましく、８０～１２０％の範囲にある値であることがより好ましく、９５～１０５％の範囲にある値であることがさらに好ましく、１００％（すなわち、表１に記載の値）であることがさらに好ましい。
【0023】
表１に記載の１～２３５番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのうち、ＣｐＧサイトを選択する第１の個数は、１８５個以上２３５個以下であることが好ましく、２１５個以上２３５個以下であることがより好ましく、２２５個以上２３５個以下であることがさらに好ましく、２３０個以上２３５個以下であることがさらに好ましく、２３５個全てであることがさらに好ましい。
【0024】
また、表１に記載の１～２３５番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのうち、２３５個のＣｐＧサイトに追加する、ランダムに選択されたＣｐＧサイトの個数は、１～９個であることが好ましく、１～６個であることがさらに好ましく、１～３個であることがさらに好ましい。
【0025】
ＣｐＧサイトのメチル化を解析する方法は特に限定されず、公知の方法を使えばよい。例えば、バイサルファイト法では、ＤＮＡをバイサルファイトで処理すると、非メチル化シトシンはウラシルに変換され、メチル化シトシンはシトシンのままで変換されないため、処理後、塩基配列を決定し、処理前のＤＮＡ配列と処理後のＤＮＡ配列を比較し、処理前にはシトシンで処理後にウラシルになった塩基を非メチル化シトシンと特定し、処理前にはシトシンで処理後もシトシンである塩基をメチル化シトシンであると特定できる。
【0026】
各ＣｐＧサイトにおけるメチル化率は、ＣｐＧサイトにおけるメチル化を調べたゲノムが由来する細胞集団において、ＣｐＧサイト全体の数に対する、メチル化されているＣｐＧサイトの割合として計算することができる。例えば、上述したバイサルファイト法では、各ＣｐＧサイトにおいて、配列決定時のシトシンとウラシルのシグナルの強さを比較することで、メチル化率を算出することができる。具体的には、シトシンのシグナルの強さとウラシルのシグナルの強さの合計に対するシトシンのシグナルの強さの割合がメチル化率である。
【0027】
実施例で示すように、この方法を用いることによって、ある個人の生物学的年齢を計算することができる。
【0028】
また、ここに記載した計算方法をコンピュータに実行させるためのプログラム、およびそのプログラムを格納するコンピュータ可読記憶媒体も、本発明の実施形態である。
【0029】
＝＝個人の老化状態の評価方法＝＝
本明細書に開示されている個人の老化状態の評価方法は、上述した生物学的年齢の計算方法によって、個人の生物学的年齢を計算する工程と、個人の生物学的年齢と、個人の暦年齢と、を比較する工程と、を含む。ここで、ある個人の「老化状態」とは、老化の特定の一側面をいうのではなく、年齢によって規定され、その年齢の人の標準的な身体状態をいう。具体的な評価方法として、個人の生物学的年齢を個人の暦年齢と比較し、生物学的年齢のほうが暦年齢より大きければ、その人は標準より老化が進んでおり、生物学的年齢が暦年齢と等しければ、その人は標準的に老化しており、生物学的年齢のほうが暦年齢より小さければ、その人は標準より老化が進んでいない、と評価できる。ここで、「標準」とは、その年齢の人の平均的な老化状態を意味する。
本明細書に開示されている個人の老化状態の評価方法は、上述した生物学的年齢の計算方法によって、個人の生物学的年齢を計算する工程と、個人の生物学的年齢と、個人の暦年齢と、を比較する工程と、を含む。ここで、ある個人の「老化状態」とは、老化の特定の一側面をいうのではなく、年齢によって規定され、その年齢の人の標準的な身体状態をいう。具体的な評価方法として、個人の生物学的年齢を個人の暦年齢と比較し、生物学的年齢のほうが暦年齢より大きければ、その人は標準より老化が進んでおり、生物学的年齢が暦年齢と等しければ、その人は標準的に老化しており、生物学的年齢のほうが暦年齢より小さければ、その人は標準より老化が進んでいない、と評価できる。ここで、「標準」とは、その年齢の人の平均的な老化状態を意味する。
【0030】
例えば、老化評価度として、（生物学的年齢－暦年齢）と定義し、値が大きくなるほど老化度が大きいと評価し、値が小さくなるほど老化度が小さい、と判断することもできる。
【0031】
また、下記式によって老化評価度を求め、値が大きくなるほど老化度が大きいと評価し、値が小さくなるほど老化度が小さい、と判断してもよい。
【0032】
［数４］
老化評価度＝ｐ１＋暦年齢×ｐ２－エピゲノム年齢
式中、第１の定数ｐ１は、７．５～７．８であることが好ましく、７．６７７１３９であることがより好ましい。第２の定数ｐ２は、０．８～０．９であることが好ましく、０．８５０７５５７であることがより好ましい。
老化評価度＝ｐ１＋暦年齢×ｐ２－エピゲノム年齢
式中、第１の定数ｐ１は、７．５～７．８であることが好ましく、７．６７７１３９であることがより好ましい。第２の定数ｐ２は、０．８～０．９であることが好ましく、０．８５０７５５７であることがより好ましい。
【0033】
さらに、細胞集団が血液細胞の場合、細胞種の組成を決め、血液細胞種ごとにＤＮＡメチル化率をそれぞれ算出し、下記式によって老化評価度を求め、値が大きくなるほど老化度が大きいと評価し、値が小さくなるほど老化度が小さい、と判断してもよい。細胞種の組成の分析は、血液を各細胞で分離して行ってもよく、血液細胞種特異的なＤＮＡメチル化率を用いて行ってもよい。
【0034】
［数５］
老化評価度＝ｑ１＋暦年齢×ｑ２＋ＣＤ８×ｑ３＋ＣＤ４×ｑ４＋ＮＫ×ｑ５＋Ｂ×ｑ６＋Ｍ×ｑ７＋Ｎ×ｑ８－エピゲノム年齢
式中、ＣＤ８、ＣＤ４、ＮＫ、Ｂ、Ｍ、およびＮは、それぞれＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、単球、および好中球でのＤＮＡメチル化率である。また、第１の定数ｑ１は、６４～６５であることが好ましく、６４．３０２８８であることがより好ましい。第２の定数ｑ２は、０．８～０．９であることが好ましく、０．８６７４８８１であることがより好ましい。第３の定数ｑ３は、－４０～－５０であることが好ましく、－４４．３６６４９であることがより好ましい。第４の定数ｑ４は、－７０～－８０であることが好ましく、－７６．０８９７３であることがより好ましい。第５の定数ｑ５は、－４５～－５５であることが好ましく、－５０．９８６１であることがより好ましい。第６の定数ｑ６は、－４７．５～－５７．５であることが好ましく、－５２．４９７８であることがより好ましい。第７の定数ｑ７は、－７７．５～－８７．５であることが好ましく、－８２．１３９４４であることがより好ましい。第８の定数ｑ８は、－５０～－６０であることが好ましく、－５５．２８４８５であることがより好ましい。
老化評価度＝ｑ１＋暦年齢×ｑ２＋ＣＤ８×ｑ３＋ＣＤ４×ｑ４＋ＮＫ×ｑ５＋Ｂ×ｑ６＋Ｍ×ｑ７＋Ｎ×ｑ８－エピゲノム年齢
式中、ＣＤ８、ＣＤ４、ＮＫ、Ｂ、Ｍ、およびＮは、それぞれＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、単球、および好中球でのＤＮＡメチル化率である。また、第１の定数ｑ１は、６４～６５であることが好ましく、６４．３０２８８であることがより好ましい。第２の定数ｑ２は、０．８～０．９であることが好ましく、０．８６７４８８１であることがより好ましい。第３の定数ｑ３は、－４０～－５０であることが好ましく、－４４．３６６４９であることがより好ましい。第４の定数ｑ４は、－７０～－８０であることが好ましく、－７６．０８９７３であることがより好ましい。第５の定数ｑ５は、－４５～－５５であることが好ましく、－５０．９８６１であることがより好ましい。第６の定数ｑ６は、－４７．５～－５７．５であることが好ましく、－５２．４９７８であることがより好ましい。第７の定数ｑ７は、－７７．５～－８７．５であることが好ましく、－８２．１３９４４であることがより好ましい。第８の定数ｑ８は、－５０～－６０であることが好ましく、－５５．２８４８５であることがより好ましい。
【0035】
さらに、このような老化評価度を導入することによって、時間の経過とともに、老化の進行が平均より速く進んでいるのか、平均より遅く進んでいるのかについても判断することができるようになる。具体的には、ある時点での老化評価度が、所定時間後に低下した場合、老化の進行が平均より遅く進んでいると判断でき、所定時間後に増加した場合、老化の進行が平均より速く進んでいると判断できる。
【0036】
＝＝生物学的年齢を計算するためのＣｐＧサイトの評価方法＝＝
本明細書に開示の、生物学的年齢を計算するためのＣｐＧサイトの評価方法は、複数の個人から細胞集団を得る工程と、細胞集団からゲノムを抽出する工程と、細胞集団のゲノムにおいて、上記表１に記載の１～２３５番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのうち、
本明細書に開示の、生物学的年齢を計算するためのＣｐＧサイトの評価方法は、複数の個人から細胞集団を得る工程と、細胞集団からゲノムを抽出する工程と、細胞集団のゲノムにおいて、上記表１に記載の１～２３５番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのうち、
【0037】
（１）第１の個数のＣｐＧサイトを選択するか、または
（２）２３５個のＣｐＧサイトに、ランダムに選択された第２の個数のＣｐＧサイトを追加することによって、
（２）２３５個のＣｐＧサイトに、ランダムに選択された第２の個数のＣｐＧサイトを追加することによって、
【0038】
ＣｐＧサイトのプールを作る工程と、作られたプールのＣｐＧサイトのメチル化を調べ、プールのＣｐＧサイトの各々におけるメチル化率を算出する工程と、下記数式２を用いて、個人の生物学的年齢を計算する工程と、を含む。
【0039】
［数６］
（式中、ｔは第１の係数であり、ＤＮＡｍｎは、表１に記載のｎ番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのメチル化率を示し、Ｃｎは、表１に記載のｎ番の染色体の位置に対する第２の係数を示す。）
【0040】
個人の人種、国籍、および所属する集団は特に限定されないが、アジア人であることが好ましく、日本人であることがより好ましい。
【0041】
細胞集団の細胞種（cell type）は特に限定されず、単数の細胞種から成っていても、複数の細胞種から成っていてもよい。取得しやすいという理由から血液細胞が好ましい。
【0042】
第１の係数ｔは、７７～８７であることが好ましく、７９～８５であることがより好ましく、８０～８４であることがさらに好ましく、８１．９４６６０９であることがさらに好ましい。
【0043】
第２の係数Ｃｎは、表１に記載の値に対して、５０～１５０％の範囲にある値であることが好ましく、８０～１２０％の範囲にある値であることがより好ましく、９５～１０５％の範囲にある値であることがさらに好ましく、１００％（すなわち、表１に記載の値）であることがさらに好ましい。
【0044】
表１に記載の１～２３５番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのうち、ＣｐＧサイトを選択する第１の個数は、１８０個以上２１４個以下であることが好ましく、２００個以上２１４個以下であることがより好ましい。
【0045】
また、表１に記載の１～２３５番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのうち、２３５個のＣｐＧサイトに追加する、ランダムに選択されたＣｐＧサイトの個数は、４～１２個であることが好ましく、４～９個であることがさらに好ましく、４～６個であることがさらに好ましい。
【0046】
この方法を用いることによって、表１に記載のＣｐＧサイトに対し、特定のＣｐＧサイトを加えたり、減らしたりしても、生物学的年齢を適切に計算することができるかどうか、調べることができる。しかも、ランダムなサイトで実施するより高頻度で、好適な条件を見つけることができる。
【実施例】
【0047】
［実施例１］
２０代から７０代の健常な日本人男女８５名の血液からＤＮＡを抽出した。バイサルファイト変換した後、表１に記載の１～２３５番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトにおいて、シトシンのメチル化率を測定した。各位置における、各人の暦年齢とメチル化率との関係を図１に示す。
２０代から７０代の健常な日本人男女８５名の血液からＤＮＡを抽出した。バイサルファイト変換した後、表１に記載の１～２３５番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトにおいて、シトシンのメチル化率を測定した。各位置における、各人の暦年齢とメチル化率との関係を図１に示す。
【0048】
得られた結果を下記数式３に代入し、各人のエピゲノム年齢を算出した。
【0049】
［数７］
（式中、ｔ’は８１．９４６６０９、ＤＮＡｍｎは、表１に記載のｎ番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのメチル化率を示し、Ｃ’ｎは、表１に記載のｎ番の染色体の位置に対する係数を示す。）
【0050】
図２ａに、エピゲノム年齢と暦年齢との相関を示す。得られた結果から、男女別および全体の相関係数を計算したところ、全体の相関係数が０．９６４、男性のデータによる相関係数が０．９６１、女性のデータによる相関係数が、０．９７０となり、非常に高い相関性が観察され、上記のエピゲノム年齢を生物学的年齢とみなせることがわかる。
【0051】
次に、このようにして得られた各人のエピゲノム年齢を目的変数とし、暦年齢を説明変数とした単回帰分析を行った。こうして得られた回帰式を下記式に示す。
【0052】
［数８］
回帰式：７．６７７１３９＋暦年齢×０．８５０７５５７－エピゲノム年齢
この回帰式を、エピゲノム年齢加速（Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ａｇｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ；ＥＡＡ）を計算するための基準式とすることにより、各人の老化度を判定できる。
回帰式：７．６７７１３９＋暦年齢×０．８５０７５５７－エピゲノム年齢
この回帰式を、エピゲノム年齢加速（Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ａｇｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ；ＥＡＡ）を計算するための基準式とすることにより、各人の老化度を判定できる。
【0053】
さらに、ＤＮＡメチル化情報から血液細胞種の組成を推定するツールとして、Minfi package(Bioconductor)内のestimateCellCountsの機能を用いて、血液細胞種特異的なＤＮＡメチル化率を示すＣｐＧサイトから、血液細胞種の組成を推定した。そして、暦年齢と細胞種組成推定値を説明変数、エピゲノム年齢を目的変数とした重回帰分析を行った。こうして得られた回帰式を下記式に示す。
【0054】
［数９］
回帰式：６４．３０２８８＋暦年齢×０．８６７４８８１＋ＣＤ８×（－４４．３６６４９）＋ＣＤ４×（－７６．０８９７３）＋ＮＫ×（－５０．９８６１）＋Ｂ×（－５２．４９７８）＋Ｍ×（－８２．１３９４４）＋Ｎ×（－５５．２８４８５）－エピゲノム年齢
式中、ＣＤ８、ＣＤ４、ＮＫ、Ｂ、Ｍ、およびＮは、それぞれＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、単球、および好中球でのＤＮＡメチル化率である。
回帰式：６４．３０２８８＋暦年齢×０．８６７４８８１＋ＣＤ８×（－４４．３６６４９）＋ＣＤ４×（－７６．０８９７３）＋ＮＫ×（－５０．９８６１）＋Ｂ×（－５２．４９７８）＋Ｍ×（－８２．１３９４４）＋Ｎ×（－５５．２８４８５）－エピゲノム年齢
式中、ＣＤ８、ＣＤ４、ＮＫ、Ｂ、Ｍ、およびＮは、それぞれＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、単球、および好中球でのＤＮＡメチル化率である。
【0055】
この回帰式の値をｙ軸に、暦年齢をｘ軸にしたグラフを図２ｂに示す。その結果、暦年齢にかかわらず、ＥＡＡはほぼ０となるため、この回帰式を、エピゲノム年齢加速を計算するための基準式とすることにより、各人の老化度を判定できる。
【0056】
［実施例２］
本実施例では、表１に記載の１～２３５番のＣｐＧサイトからランダムにＣｐＧサイトを除外し、残ったＣｐＧサイトを下記数式４に適用してエピゲノム年齢を算出し、暦年齢と比較した。具体的には、ランダムに１～１００個のＣｐＧサイトを１００回選択し、それぞれを除去したＣｐＧサイトの組み合わせを用いて、合計１００００回、下記数式４を用いてエピゲノム年齢を算出した。同時に、２３５個全てを用いて、１００回エピゲノム年齢を算出した。
本実施例では、表１に記載の１～２３５番のＣｐＧサイトからランダムにＣｐＧサイトを除外し、残ったＣｐＧサイトを下記数式４に適用してエピゲノム年齢を算出し、暦年齢と比較した。具体的には、ランダムに１～１００個のＣｐＧサイトを１００回選択し、それぞれを除去したＣｐＧサイトの組み合わせを用いて、合計１００００回、下記数式４を用いてエピゲノム年齢を算出した。同時に、２３５個全てを用いて、１００回エピゲノム年齢を算出した。
【0057】
［数１０］
（式中、ｔ’は８１．９４６６０９、ＤＮＡｍｋは、表１に記載のｋ番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのメチル化率を示し、Ｃ’ｋは、表１に記載のｋ番の染色体の位置に対する係数を示す。ｋは、１～２３５番のＣｐＧサイトからランダムに１～１００個のＣｐＧサイトが除外され、残ったＣｐＧサイトの番号を表す数値である。）
【0058】
各エピゲノム年齢について、暦年齢との差の絶対値を求め、ｘ軸に除外した個数、ｙ軸にその差の絶対値の中央値（点）と四分位範囲（線分）とをグラフにプロットし、図３Ａに示す。エピゲノム年齢と暦年齢との差が約５歳になるのは２０個のＣｐＧサイトを除外した時だった。なお、除外したＣｐＧサイトの数それぞれに対し、エピゲノム年齢と暦年齢の相関について、Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数を算出し、ｘ軸に除外した個数、ｙ軸にＰｅａｒｓｏｎの相関係数の中央値（点）と四分位範囲（線分）とをグラフにプロットし、図３Ｂに示す。結果として、相関係数が約０．９６になるのは、５０個のＣｐＧサイトを除外した時だった。
【0059】
従って、２３５個のＣｐＧサイトから少なくとも１８５個、好ましくは少なくとも２１５個をランダムに選択し、数式４に適用しても、暦年齢と極めて高い相関を有する生物学的年齢を求めることができる。
【0060】
［実施例３］
本実施例では、表１に記載の１～２３５番のＣｐＧサイトにおいて、表１に記載のない染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトを新たにランダムに追加し、得られたＣｐＧサイトを下記数式５に適用してエピゲノム年齢を算出し、暦年齢と比較した。具体的には、１～１００個の表１以外のＣｐＧサイトをランダムに１００回選択し、それぞれを追加したＣｐＧサイトの組み合わせを用いて、合計１００００回、下記数式５を用いてエピゲノム年齢を算出した。なお、新たに追加した染色体の位置に対する係数は、表１に記載されている係数の最小値～最大値（すなわち－０．１００～０．０６７）の範囲にある乱数をランダムに適用した。同時に、２３５個全てを用いて、１００回エピゲノム年齢を算出した。
本実施例では、表１に記載の１～２３５番のＣｐＧサイトにおいて、表１に記載のない染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトを新たにランダムに追加し、得られたＣｐＧサイトを下記数式５に適用してエピゲノム年齢を算出し、暦年齢と比較した。具体的には、１～１００個の表１以外のＣｐＧサイトをランダムに１００回選択し、それぞれを追加したＣｐＧサイトの組み合わせを用いて、合計１００００回、下記数式５を用いてエピゲノム年齢を算出した。なお、新たに追加した染色体の位置に対する係数は、表１に記載されている係数の最小値～最大値（すなわち－０．１００～０．０６７）の範囲にある乱数をランダムに適用した。同時に、２３５個全てを用いて、１００回エピゲノム年齢を算出した。
【0061】
［数１１］
（式中、ｔ’は８１．９４６６０９、ＤＮＡｍｋは、表１に記載の染色体の位置および新たに追加した染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのメチル化率を示し、Ｃ’ｋは、表１に記載のｋ番の染色体の位置に対する係数及び新たに追加した染色体の位置に対する係数を示す。ｋは、２３５に新たに追加したＣｐＧサイトの数を加えた数値である。）
【0062】
【0063】
【0064】
従って、２３５個のＣｐＧサイトに対して９個好ましくは３個のＣｐＧサイトをランダムに選択して追加し、数式５に適用しても、暦年齢と極めて高い相関を有する生物学的年齢を求めることができる。
【0065】
［実施例４］
本実施例では、表１に記載の係数に対して所定の範囲内の乱数をかけて得られた係数を下記数式６に適用してエピゲノム年齢を算出し、各エピゲノム年齢について、暦年齢との差の絶対値、およびエピゲノム年齢と暦年齢の相関を実施例２と同様に解析した。
本実施例では、表１に記載の係数に対して所定の範囲内の乱数をかけて得られた係数を下記数式６に適用してエピゲノム年齢を算出し、各エピゲノム年齢について、暦年齢との差の絶対値、およびエピゲノム年齢と暦年齢の相関を実施例２と同様に解析した。
【0066】
具体的には、表１に記載の係数に対し、１－ｘ～１＋ｘ（ｘは０．００以上１．００以下で、０．０１刻みの１０１通りの数）の間の乱数を表１に記載の係数にかけることで得られた係数を用い、下記数式６を用いてエピゲノム年齢を算出した。
【0067】
［数１２］
（式中、ｔ’は８１．９４６６０９、ＤＮＡｍｎは、表１に記載のｎ番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのメチル化率を示し、Ｃ’ｎは、表１に記載の係数に対し、１－ｘ～１＋ｘ（ｘは０．００以上１．００以下で、０．０１刻みの１０１通りの数）の間の乱数を表１に記載の係数にかけることで得られた係数を示す。）暦年齢（ｘ軸）に対して、得られたエピゲノム年齢（ｙ軸）をプロットしたグラフを図５に示す。
【0068】
図５では、代表的な場合として、（Ａ）ｘ＝０、（Ｂ）ｘ＝０．５、（Ｃ）ｘ＝１．０の場合を示すが、ｘ＝０．５まで係数を変化させても暦年齢とエピゲノム年齢との差はわずかであったが、ｘ＝１．０では、暦年齢とエピゲノム年齢との間にかなりのずれが見られた。
【0069】
そこで、各ｘ（ｘ軸）に対し、暦年齢とエピゲノム年齢との差の絶対値（ｙ軸）をプロットしたグラフを図６に示す。差の絶対値は、中央値（点）±四分位範囲（線分）で示す。
【0070】
図６で示されるように、ｘが約０．２で暦年齢とエピゲノム年齢との差が約４歳に、ｘが約０．５でその差が約５歳になった。
【0071】
このように、表１に記載の係数に、ある程度の幅をもたせてエピゲノム年齢を計算しても、暦年齢を推定する十分な精度を有する。
【要約】
【課題】本発明は、生物学的年齢の新規な計算方法を提供することを目的とする。
【解決手段】
本発明にかかる生物学的年齢の計算方法は、個人の生物学的年齢の計算方法であって、個人から得られた細胞集団のゲノムにおいて、表１に記載の１～２３５番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのうち、
（１）２１５個以上２３５個以下のＣｐＧサイトを選択するか、または
（２）２３５個のＣｐＧサイトに、ランダムに選択された１～３個のＣｐＧサイトを追加することによって、
ＣｐＧサイトのプールを作る工程と、前記プールのＣｐＧサイトのメチル化を調べ、前記プールのＣｐＧサイトの各々におけるメチル化率を算出する工程と、下記数式を用いて、前記個人の生物学的年齢を計算する工程と、
【数１】
（ただし、ｔ＝７９～８５であり、ＤＮＡｍｎは、表１に記載のｎ番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのメチル化率を示し、Ｃｎは、表１に記載のｎ番の染色体の位置に対する係数の５０％～１５０％にある値を示す。）を含む、計算方法である。
【選択図】なし
【解決手段】
本発明にかかる生物学的年齢の計算方法は、個人の生物学的年齢の計算方法であって、個人から得られた細胞集団のゲノムにおいて、表１に記載の１～２３５番の染色体の位置のＤＮＡにあるＣｐＧサイトのうち、
（１）２１５個以上２３５個以下のＣｐＧサイトを選択するか、または
（２）２３５個のＣｐＧサイトに、ランダムに選択された１～３個のＣｐＧサイトを追加することによって、
ＣｐＧサイトのプールを作る工程と、前記プールのＣｐＧサイトのメチル化を調べ、前記プールのＣｐＧサイトの各々におけるメチル化率を算出する工程と、下記数式を用いて、前記個人の生物学的年齢を計算する工程と、
【数１】
【選択図】なし
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
