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特許7442251細胞外小胞の分泌を抑制する細胞外小胞分泌抑制剤、およびその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-22
(45)【発行日】2024-03-04
(54)【発明の名称】細胞外小胞の分泌を抑制する細胞外小胞分泌抑制剤、およびその用途
(51)【国際特許分類】
A61K 31/713 20060101AFI20240226BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240226BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240226BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240226BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240226BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240226BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20240226BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240226BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240226BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20240226BHJP
C12N 9/22 20060101ALN20240226BHJP
C07K 16/40 20060101ALN20240226BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20240226BHJP
C12N 5/079 20100101ALN20240226BHJP
C12Q 1/02 20060101ALN20240226BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALN20240226BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20240226BHJP
【ＦＩ】
A61K31/713
A61K31/7088
A61K31/7105
A61P35/00
A61P43/00 111
A61K45/00
G01N33/48 Z
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N9/22
C07K16/40
C12N5/071
C12N5/079
C12Q1/02
C12Q1/6851 Z
C12Q1/686 Z
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2022514098
(86)(22)【出願日】2021-04-07
(86)【国際出願番号】 JP2021014693
(87)【国際公開番号】W WO2021206105
(87)【国際公開日】2021-10-14
【審査請求日】2022-08-12
(31)【優先権主張番号】P 2020069392
(32)【優先日】2020-04-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2021022825
(32)【優先日】2021-02-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】513086728
【氏名又は名称】テオリアサイエンス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100129137
【弁理士】
【氏名又は名称】中山 ゆみ
(72)【発明者】
【氏名】落谷 孝広
(72)【発明者】
【氏名】占部 文彦
(72)【発明者】
【氏名】小坂 展慶
(72)【発明者】
【氏名】山元 智史
【審査官】濱田 光浩
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／１０６１２６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１８－５２１０３８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０４３３７０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／００４５９１５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１９／００７１４００（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｋ ３１／７０８８
Ａ６１Ｋ ３１／７１３
Ａ６１Ｋ ３１／７１０５
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ｃ１２Ｎ １５／１１３
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
セリン合成経路の阻害剤を含み、
前記阻害剤が、前記セリン合成経路の酵素タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質であり、
前記コードする遺伝子が、ＰＳＡＴ１遺伝子、ＰＨＧＤＨ遺伝子、およびＰＳＰＨ遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つであり、
前記発現抑制物質が、ＲＮＡ干渉物質、アンチセンス、アンチジーン、リボザイム、およびこれらのいずれかを発現する発現ベクターからなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制する細胞外小胞分泌抑制剤。
【請求項2】
前記細胞が、がん細胞である、請求項１に記載の細胞外小胞分泌抑制剤。
【請求項3】
前記がん細胞が、大腸がん細胞、肺がん細胞、メラノーマ細胞、乳がん細胞、膵臓がん細胞、および多発性骨髄腫細胞からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項２に記載の細胞外小胞分泌抑制剤。
【請求項4】
前記細胞が、ウイルス感染細胞である、請求項１に記載の細胞外小胞分泌抑制剤。
【請求項5】
前記ＲＮＡ干渉物質が、ｍｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡである、請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞外小胞分泌抑制剤。
【請求項6】
in vitroにおいて、細胞におけるセリン合成経路を構成する酵素タンパク質の発現を抑制することを特徴とする細胞からの細胞外小胞分泌の抑制方法。
【請求項7】
in vitroにおいて、請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞外小胞分泌抑制剤を細胞に投与する、請求項６に記載の抑制方法。
【請求項8】
前記細胞が、がん細胞である、請求項６または７に記載の抑制方法。
【請求項9】
前記がん細胞が、大腸がん細胞、肺がん細胞、メラノーマ細胞、乳がん細胞、膵臓がん細胞、および多発性骨髄腫細胞からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項８に記載の抑制方法。
【請求項10】
前記細胞が、ウイルス感染細胞である、請求項６または７に記載の抑制方法。
【請求項11】
非ヒト動物において、細胞におけるセリン合成経路を構成する酵素タンパク質の発現を抑制することを特徴とする細胞からの細胞外小胞分泌の抑制方法。
【請求項12】
非ヒト動物に、請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞外小胞分泌抑制剤を投与する、請求項１１に記載の抑制方法。
【請求項13】
セリン合成経路の酵素タンパク質をコードする遺伝子から前記酵素タンパク質を発現する発現系に被検物質を共存させ、前記酵素タンパク質を発現させる工程、
前記発現系における前記酵素タンパク質の発現を検出する工程、および、
前記酵素タンパク質の発現量が、前記被検物質を共存させていないコントロールの発現よりも相対的に低い前記被検物質を、細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制する候補物質として選択する工程を含む
ことを特徴とする細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制する細胞外小胞分泌抑制剤の候補物質のスクリーニング方法。
【請求項14】
セリン合成経路の酵素タンパク質に被検物質を接触させる工程、
前記酵素タンパク質の触媒活性を検出する工程、および、
前記酵素タンパク質の触媒活性が、前記被検物質を共存させていないコントロールの系よりも相対的に低い前記被検物質を、細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制する候補物質として選択する工程を含む
ことを特徴とする細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制する細胞外小胞分泌抑制剤の候補物質のスクリーニング方法。
【請求項15】
セリン合成経路の酵素タンパク質に被検物質を接触させる工程、
前記酵素タンパク質と前記被検物質との結合を検出する工程、および、
前記酵素タンパク質に結合した前記被検物質を、細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制する候補物質として選択する工程を含む
ことを特徴とする細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制する細胞外小胞分泌抑制剤の候補物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制する細胞外小胞分泌抑制剤、およびその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、細胞から分泌されるエクソソーム等の細胞外小胞が着目されている。前記細胞外小胞は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等の核酸、タンパク質を内包している。そして、これらの内包物が、前記細胞外小胞を介して、前記細胞外小胞を分泌した細胞から受取側の細胞に伝達されることから、細胞間のコミュニケーションツールとして機能すると考えられている。具体例として、例えば、がんの転移に関しても、原発がんから分泌される細胞外小胞の関与が報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
しかしながら、細胞からの細胞外小胞の分泌が、どのように制御されているのか、その分泌のメカニズムについては解明されていない。前記細胞外小胞の分泌のメカニズムが解明されれば、例えば、そのメカニズムに基づいて前記細胞外小胞の分泌を抑制することにより、前記細胞外小胞の分泌が与える生体への影響を容易に解析することも可能になる。また、前記細胞外小胞の分泌が原因となっている疾患等であれば、前記メカニズムに基づいて前記細胞外小胞の分泌を抑制することにより、その疾患の治療も可能となる。
【0004】
そこで、本発明は、細胞からの細胞外小胞の分泌に関して、新たな分泌抑制剤および分泌抑制方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0005】
前記目的を達成するために、本発明は、セリン合成経路の阻害剤を含むことを特徴とする細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制する細胞外小胞分泌抑制剤である。
【0006】
本発明の分泌抑制方法は、細胞からの細胞外小胞の分泌の抑制方法であり、本発明の細胞外小胞分泌抑制剤を、投与対象に投与する工程を含むことを特徴とする。
【0007】
本発明のスクリーニング方法は、細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制する細胞外小胞分泌抑制剤の候補物質のスクリーニング方法であり、被検物質から、セリン合成経路を阻害する阻害物質を、細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制する候補物質として選択することを特徴とする。
【発明の効果】
【0008】
本発明者らは、鋭意研究の結果、細胞からの細胞外小胞の分泌にセリン合成経路が関与しており、セリン合成経路を阻害することで、細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制できることを見出した。前述のように、細胞からの細胞外小胞の分泌のメカニズムについては解明されておらず、本発明者らがはじめて見出したことである。本発明によれば、セリン合成経路の阻害によって、細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制できる。このため、本発明により分泌抑制を行うことで、例えば、細胞外小胞の分泌または分泌の抑制が生体に与える影響を解析することも可能である。したがって、本発明は、例えば、医療分野において非常に有用な技術といえる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】図１において、（Ａ）は、ｍｉＲ－８９１ｂをトランスフェクションした形質転換体（ｍｉＲ－８９１ｂ）とネガティブコントロールの形質転換体（ＮＣ）とについて、ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法によるＥＶ量の相対値を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＮＴＡ法によるＥＶ量の相対値を示すグラフである。
【図2】図２において、（Ａ）は、ｓｉＰＳＡＴ１をトランスフェクションした形質転換体（ｓｉＰＳＡＴ１）とネガティブコントロールの形質転換体（ＮＣ）とについて、ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法によるＥＶ量の相対値を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＮＴＡ法によるＥＶ量の相対値を示すグラフである。
【図3】図３において、（Ａ）は、前記形質転換体（ｍｉＲ－８９１ｂ）と前記形質転換体（ＮＣ）について、ＰＳＡＴ１遺伝子の発現量の相対値を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＰＳＡＴ１タンパク質の相対値を示すグラフであり、（Ｃ）は、ＰＳＡＴ１遺伝子の３’ＵＴＲとｍｉＲ－８９１ｂとの関係を示す図であり、（Ｄ）は、ＰＳＡＴ１遺伝子とｍｉＲ－８９１ｂとをトランスフェクションした形質転換体におけるＰＳＡＴ１の発現量を示すグラフである。
【図4】図４は、各種がん細胞にｓｉＰＳＡＴ１をトランスフェクションした形質転換体（ｓｉＰＳＡＴ１）とネガティブコントロールの形質転換体（ＮＣ）とについて、ＮＴＡ法による分泌ＥＶ量の相対値を示すグラフである。
【図5】図５は、がん細胞にｓｉＰＳＡＴ１をトランスフェクションした形質転換体（ｓｉＰＳＡＴ１）とネガティブコントロールの形質転換体（ＮＣ）とについて、細胞内におけるＣＤ６３陽性ＥＶの相対量を示すグラフである。
【図6】図６において、がん細胞にｓｉＰＳＡＴ１をトランスフェクションした形質転換体（ｓｉＰＳＡＴ１）とネガティブコントロールの形質転換体（ＮＣ）とについて、セリン欠乏培地またはセリン含有培地で培養した結果であり、（Ａ）は、ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法による分泌ＥＶ量の相対値を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＮＴＡ法による分泌ＥＶ量の相対値を示すグラフである。
【図9】図９は、各種がん細胞にｓｉＰＳＡＴ１をトランスフェクションした形質転換体（ｓｉＰＳＡＴ１）とネガティブコントロールの形質転換体（ＮＣ）とについて、ＮＴＡ法による分泌ＥＶ量の相対値を示すグラフである。
【図10】図１０は、乳がん転移株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１＿Ｌｕｃ＿Ｄ３Ｈ２ＬＮの結果であり、（Ａ）は、ＮＴＡ法による分泌ＥＶ量の相対値を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＰＳＡＴ１タンパク質の発現を示すウェスタンブロットの写真である。
【図12】図１２は、ＰＳＡＴ１またはＰＨＧＤＨをサイレンシングした肺がん細胞の結果であり、（Ａ）は、細胞生存率の結果であり、（Ｂ）は、ＮＴＡ法による分泌ＥＶ量の相対値を示すグラフであり、（Ｃ）は、ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法による分泌ＥＶ量の相対値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）分泌抑制剤は、以下、ＥＶ分泌抑制剤という。
【0011】
本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、前記阻害剤が、セリン合成経路における酵素タンパク質の発現を抑制する発現抑制物質またはセリン合成経路における酵素タンパク質の触媒機能を抑制する触媒機能抑制物質である。
【0012】
本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、前記セリン合成経路が、ＰＳＡＴ１を含む合成経路である。
【0013】
本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、前記セリン合成経路の阻害剤が、ＰＳＡＴ１タンパク質の発現抑制物質または触媒機能抑制物質である。
【0014】
本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、前記セリン合成経路の阻害剤が、ＰＨＧＤＨタンパク質の発現抑制物質または触媒機能抑制物質である。
【0015】
本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、前記セリン合成経路の阻害剤が、ＰＳＰＨタンパク質の発現抑制物質または触媒機能抑制物質である。
【0016】
本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、前記細胞が、がん細胞である。
【0017】
本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、前記がん細胞が、大腸がん細胞、肺がん細胞、メラノーマ細胞、乳がん細胞、膵臓がん細胞、および多発性骨髄腫細胞からなる群から選択された少なくとも一つである。
【0018】
本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、前記細胞が、ウイルス感染細胞である。
【0019】
本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、前記阻害剤が、低分子化合物、タンパク質、またはペプチドである。
【0020】
本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、前記酵素タンパク質に対する発現抑制物質が、前記酵素タンパク質をコードする遺伝子からの転写を抑制する物質、転写された転写産物を分解する物質、および前記転写物からのタンパク質の翻訳を抑制する物質からなる群から選択された少なくとも一つである。
【0021】
本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、前記発現抑制物質が、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、およびリボザイムからなる群から選択された少なくとも一つの核酸物質である。
【0022】
本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、前記発現抑制物質が、前記核酸物質を発現する発現ベクターである。
【0023】
本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、前記タンパク質の機能抑制物質が、前記酵素タンパク質に対する活性阻害物質または活性中和物質である。
【0024】
本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、前記活性中和物が、前記タンパク質に対する抗体または抗原結合断片である。
【0025】
本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、前記機能抑制物質が、前記活性中和物を発現する発現ベクターである。
【0026】
本発明のＥＶ分泌の抑制方法は、例えば、前記細胞が、がん細胞である。
【0027】
本発明のＥＶ分泌の抑制方法は、例えば、前記がん細胞が、大腸がん細胞、肺がん細胞、メラノーマ細胞、乳がん細胞、膵臓がん細胞、および多発性骨髄腫細胞からなる群から選択された少なくとも一つである。
【0028】
本発明のＥＶ分泌の抑制方法は、例えば、前記細胞が、ウイルス感染細胞である。
【0029】
本発明のＥＶ分泌の抑制方法は、例えば、前記投与対象が、ヒトまたは非ヒト動物である。
【0030】
本発明のＥＶ分泌の抑制方法は、例えば、前記投与が、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。
【0031】
本発明のＥＶ分泌抑制剤の候補物質のスクリーニング方法は、例えば、前記細胞が、がん細胞である。
【0032】
本発明のＥＶ分泌抑制剤の候補物質のスクリーニング方法は、例えば、前記がん細胞が、大腸がん細胞、肺がん細胞、メラノーマ細胞、乳がん細胞、膵臓がん細胞、および多発性骨髄腫細胞からなる群から選択された少なくとも一つである。
【0033】
本発明のＥＶ分泌抑制剤の候補物質のスクリーニング方法は、例えば、前記細胞が、ウイルス感染細胞である。
【0034】
＜細胞外小胞分泌抑制剤＞
本発明の細胞外小胞（ＥＶ）分泌抑制剤（以下、ＥＶ分泌抑制剤という）は、細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制する剤である。本発明のＥＶ分泌抑制剤は、前述のように、セリン合成経路の阻害剤を含むことを特徴とする。本発明のＥＶ分泌抑制剤は、前記阻害剤を含むことが特徴であって、その他の構成および条件は、特に制限されない。また、本発明のＥＶ分泌抑制剤は、後述する本発明のＥＶ分泌の抑制方法等の記載を援用できる。
本発明の細胞外小胞（ＥＶ）分泌抑制剤（以下、ＥＶ分泌抑制剤という）は、細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制する剤である。本発明のＥＶ分泌抑制剤は、前述のように、セリン合成経路の阻害剤を含むことを特徴とする。本発明のＥＶ分泌抑制剤は、前記阻害剤を含むことが特徴であって、その他の構成および条件は、特に制限されない。また、本発明のＥＶ分泌抑制剤は、後述する本発明のＥＶ分泌の抑制方法等の記載を援用できる。
【0035】
本発明において、前記阻害剤は、セリン合成経路における酵素タンパク質に対する発現抑制物質でもよいし、セリン合成経路における酵素タンパク質に対する触媒機能抑制物質でもよい。本発明は、前述のように、セリン合成経路の発現挙動がＥＶ分泌を制御しており、セリンの合成を阻害することで、細胞からのＥＶ分泌を抑制できることを見出したことが特徴である。このため、セリン合成を阻害する物質の種類および阻害の方法に関しては、何ら制限されない。
【0036】
前記阻害剤は、セリン合成経路を阻害できればよく、その阻害の形式は特に制限されない。すなわち、セリン合成経路における酵素タンパク質の発現を抑制することで阻害してもよいし、セリン合成経路における酵素タンパク質の触媒機能を抑制することで阻害してもよい。前者の場合、前記阻害剤は、例えば、セリン合成経路における酵素タンパク質に対する発現抑制物質であり、後者の場合、前記阻害剤は、例えば、セリン合成経路における酵素タンパク質の触媒機能抑制物質である。本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、有効成分の前記阻害剤として、前記発現抑制物質を含んでもよいし、前記触媒機能抑制物質を含んでもよいし、前者と後者の両方を含んでもよい。
【0037】
前記阻害剤の種類は、特に制限されず、例えば、核酸物質等の低分子化合物、抗体等のタンパク質、抗原結合断片等のペプチド等があげられる。
【0038】
前記発現抑制物質は、例えば、前記酵素タンパク質をコードする遺伝子（以下、ターゲット遺伝子ともいう）からの前記酵素タンパク質（以下、ターゲットタンパク質ともいう）の発現において、転写および翻訳のいずれの工程を抑制するものでもよく、特に制限されない。転写の抑制としては、例えば、ＤＮＡからｍＲＮＡ前駆体への転写の阻害、ｍＲＮＡ前駆体から成熟ｍＲＮＡを形成するＲＮＡプロセシングの阻害、ｍＲＮＡ前駆体または成熟ｍＲＮＡの分解等があげられる。前記翻訳の抑制としては、例えば、成熟ｍＲＮＡからの翻訳の阻害、翻訳産物の修飾の阻害等があげられる。
【0039】
前記発現抑制物質は、例えば、核酸物質（以下、核酸型抑制物質もいう）であり、そのままで発現を抑制する形態（第１形態）でもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏの環境下において発現を抑制する状態となる、前駆体の形態（第２形態）でもよい。
【0040】
前記第１形態の発現抑制物質は、例えば、アンチジーン、アンチセンス（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）物質、リボザイム等があげられる。ＲＮＡｉ物質は、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等があげられる。アンチジーンは、例えば、ｍＲＮＡの転写を阻害し、アンチセンスおよびｍｉＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡからの翻訳を阻害し、ｓｉＲＮＡおよびリボザイムは、例えば、ｍＲＮＡを分解する。これらの発現抑制物質は、例えば、前記ターゲット遺伝子の全領域および部分領域のいずれをターゲット領域としてもよい。具体例として、アンチセンスおよびｍｉＲＮＡは、例えば、ターゲットの遺伝子から転写されたｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域に結合するようにデザインでき、ｓｉＲＮＡおよびリボザイムは、例えば、ターゲットの遺伝子から転写されたｍＲＮＡの一部の領域に完全に相補的に結合するようにデザインできる。
【0041】
前記第１形態の発現抑制物質は、例えば、後述するようなスクリーニング方法により得ることもでき、また、前記ターゲット遺伝子の配列から設計することもできる。
【0042】
前記第１形態の発現抑制物質は、例えば、一本鎖でも二本鎖でもよい。前記発現抑制物質の構成単位は、特に制限されず、例えば、糖と、プリンまたはピリミジン等の塩基と、リン酸とを含み、デオキシリボヌクレオチド骨格またはリボヌクレオチド骨格があげられ、この他に、例えば、ピロリジンまたピペリジン等の塩基を含む非ヌクレオチド骨格等でもよい。これらの骨格は、修飾型でも非修飾型でもよい。また、前記構成単位は、例えば、天然型でも、人工の非天然型でもよい。前記発現抑制物質は、例えば、同じ構成単位から形成されてもよいし、二種類以上の構成単位から形成されてもよい。
【0043】
前記第２形態の発現抑制物質は、前述のように、前記前駆体であり、具体例としては、前記第１形態の発現抑制物質を発現する前駆体があげられる。前記前駆体は、対象に投与することで、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏの環境下、前記第１形態の発現抑制物質を発現させ、機能させることができる。
【0044】
前記前駆体は、例えば、前記第１形態の発現抑制物質とリンカーとを含む形態があげられる。具体例として、前記前駆体は、ｓｉＲＮＡの両鎖を前記リンカーで連結した形態があげられる。このような前駆体によれば、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏの環境下、前記前駆体が切断されることにより、前記前駆体から前記リンカーが除去され、二本鎖のｓｉＲＮＡを生成（発現）できる。前記前駆体の具体例として、例えば、切断によりｓｉＲＮＡを生成するｓｈＲＮＡ等が例示できる。
【0045】
また、前記前駆体は、例えば、前記第１形態の発現抑制物質のコード配列を挿入した発現ベクターでもよい。前記発現ベクターによれば、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏの環境下、前記第１形態の発現抑制物質を発現することができる。前記発現ベクターには、例えば、前述のｓｈＲＮＡ等の前駆体のコード配列を挿入してもよい。前記発現ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター等があげられ、前記ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスベクター、センダイウイルスベクター等があげられる。
【0046】
前記触媒機能抑制物質は、例えば、前記酵素タンパク質の活性を阻害する活性阻害物質、前記酵素タンパク質の活性を中和する活性中和物質があげられる。
【0047】
前記活性阻害物質は、特に制限されず、低分子化合物等があげられる。
【0048】
前記活性中和物質は、例えば、前記酵素タンパク質に対する抗体または抗原結合断片（抗原結合ペプチド）（以下、あわせて抗体型抑制物質ともいう）等があげられる。前記抗体型抑制物質は、例えば、前記酵素タンパク質への結合によって、前記酵素タンパク質の機能を抑制できることから、中和抗体または中和抗原結合断片ともいう。前記抗体型抑制物質は、例えば、後述するようなスクリーニング方法により得ることもできる。
【0049】
前記抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよく、また、そのアイソタイプは、特に制限されず、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ等があげられる。前記抗体は、ヒトに投与する場合、例えば、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体等が好ましい。
【0050】
前記抗原結合断片は、例えば、前記ターゲットタンパク質の標的部位を認識して結合できればよく、前記抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有している断片があげられる。具体例として、前記抗原結合断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）等の断片等があげられる。
【0051】
前記触媒機能抑制物質は、例えば、そのままで前記酵素タンパク質の触媒機能を抑制する第１形態でもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏの環境下において発現を抑制する状態となる、前駆体の第２形態でもよい。前記第１形態の触媒機能抑制物質は、例えば、前述のような抗体型抑制物質である。また、前記第２形態の前駆体は、例えば、前記酵素タンパク質の触媒機能を抑制するタンパク質またはペプチドのコード配列を挿入した発現ベクターがあげられる。前記発現ベクターの種類は、特に制限されず、前述と同様に、プラスミドベクター、ウイルスベクター等があげられる。
【0052】
また、前記触媒機能抑制物質は、例えば、前記酵素タンパク質が触媒活性を有し、触媒としての機能を失ってはいないが、機能しうる状態を抑制する物質でもよい。すなわち、具体例として、前記酵素タンパク質が機能するために必要な基質を減少させる、または基質を変化させる等の抑制物質でもよい。前記基質の減少は、例えば、基質の生成の抑制でもよいし、基質の分解でもよい。
【0053】
セリン合成経路は、例えば、下記式に示す合成経路（Ｉ）があげられる。本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、ＰＳＡＴ１を含むセリン合成経路（Ｉ）の阻害剤を含むことが好ましい。本発明者らは、前述のように、セリン合成経路の発現挙動がＥＶ分泌を制御していることを見出した。具体的には、例えば、がん細胞等のような非正常細胞は、セリン合成経路の遺伝子およびそれがコードするタンパク質の発現が過剰になることで、正常細胞と比較して、ＥＶ分泌量が増加するとの知見を得た。そして、このセリン合成経路におけるタンパク質、具体的には、例えば、下記セリン合成経路（Ｉ）におけるタンパク質について、それをコードする遺伝子の発現を抑制（阻害）したり、機能を抑制（阻害）することによって、非正常細胞についてＥＶ分泌の増加を抑制できることを確認し、本発明を確立した。本発明におけるＥＶ分泌の抑制は、例えば、ＥＶ分泌の増加の抑制ということもでき、具体的には、例えば、ＥＶ分泌が正常のレベルよりも増加することを抑制することともいえる。
【化1】
【0054】
ＰＨＧＤＨは、Ｄ－３－Ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅである。ヒトＰＨＧＤＨタンパク質およびそれをコードするＰＨＧＤＨ遺伝子は、データベース（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ （ＧＴＲ））においてＧｅｎｅ ＩＤ：２６２２７で登録されている。ＰＨＧＤＨに対する発現抑制物質は、例えば、ＰＨＧＤＨ遺伝子の配列から設定することができる。また、前記ＰＨＧＤＨに対する触媒機能抑制物質は、例えば、ＮＣＴ－５０３、ＣＢＲ－５８８４等の阻害剤、ＰＨＧＤＨ抗体等の中和抗体を使用できる。
【0055】
ＰＳＡＴ１は、Ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １である。ヒトＰＳＡＴ１タンパク質およびそれをコードするＰＳＡＴ１遺伝子は、データベース（ＧＴＲ）においてＧｅｎｅ ＩＤ： ２９９６８で登録されている。ＰＳＡＴ１に対する発現抑制物質は、例えば、ＰＳＡＴ１遺伝子の配列から設定することができ、具体例として、ｍｉＲ－８９１ｂ等が使用できる。また、前記ＰＳＡＴ１に対する触媒機能抑制物質は、例えば、ＰＳＡＴ１抗体等の中和抗体を使用できる。
【0056】
ＰＳＰＨは、Ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅである。ヒトＰＳＰＨタンパク質およびそれをコードするＰＳＰＨ遺伝子は、データベース（ＧＴＲ）においてＧｅｎｅ ＩＤ：５７２３で登録されている。ＰＳＰＨに対する発現抑制物質は、例えば、ＰＳＰＨ遺伝子の配列から設定することができる。また、前記ＰＳＰＨに対する触媒機能抑制物質は、例えば、ＰＳＰＨ抗体等の中和抗体を使用できる。
【0057】
本発明において、セリン合成経路の阻害剤は、例えば、ＰＳＡＴ１タンパク質の発現抑制物質および触媒機能抑制物質、ＰＨＧＤＨタンパク質の発現抑制物質および触媒機能抑制物質、ならびにＰＳＰＨタンパク質の発現抑制物質および触媒機能抑制物質のいずれでもよく、いずれか一種類を含んでもよく、二種類以上を含んでもよい。
【0058】
本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、前記有効成分のみを含んでもよいし、さらにその他の添加成分を含んでもよい。前記添加成分は、特に制限されず、例えば、以下のような成分、好ましくは、薬理学的に許容される成分があげられる。前記添加成分は、例えば、前記ＥＶ分泌抑制剤の投与方法、投与対象、および剤型等に応じて、適宜設定できる。
【0059】
前記添加成分は、例えば、賦形剤があげられる。前記賦形剤は、例えば、水性溶媒、アルコール溶媒、ポリアルコール溶媒、油性溶媒、これらの混合溶媒（例えば、乳化溶媒）等の液体媒質、乳糖、デンプン等があげられる。前記水性溶媒は、例えば、水、生理食塩水、塩化ナトリウム等の等張液等があげられ、油性溶媒は、例えば、大豆油等があげられる。前記添加成分は、これらの他に、例えば、デンプン糊等の結合剤；デンプン、炭酸塩等の崩壊剤；タルク、ワックス等の滑沢剤等があげられる。また、前記添加成分は、例えば、前記有効成分を目的部位にデリバリーするためのＤＤＳ剤を含んでもよい。
【0060】
本発明において、ＥＶの分泌抑制の対象となる細胞は、特に制限されず、細胞外小胞の分泌を抑制することによって、分泌による影響または分泌抑制による影響を確認したい細胞が対象となる。前記細胞は、例えば、正常細胞でもよいし、目的の項目について非正常である細胞でもよい。前記目的の項目について非正常とは、特に制限されず、例えば、前記項目ががんの場合、非正常の細胞は、がん細胞でもよいし、前記項目がウイルス感染の場合、非正常の細胞は、ウイルス感染細胞でもよい。本発明によれば、例えば、がんの発生、転移、治療等のメカニズムを解析できることから、前記細胞としては、がん細胞が好ましい。特に、前述のように、細胞外小胞は細胞間の情報伝達の役割を果たすことから、他の器官（臓器）に転移する原発がんのがん細胞が好ましい。前記がん細胞は、特に制限されず、例えば、大腸がん細胞、肺がん細胞、メラノーマ細胞、乳がん細胞、膵臓がん細胞、または多発性骨髄腫細胞等があげられる。また、本発明によれば、例えば、ウイルスの感染のメカニズムを解析できることから、前記細胞としては、ウイルス感染細胞が好ましい。前記ウイルスの種類は、特に制限されず、インフルエンザウイルス、コロナウイルス等があげられる。
【0061】
本発明において、細胞外小胞は、例えば、エンドサイトーシスパスウェイにより分泌されるエクソソーム、マイクロベシクル（微小小胞体）、アポトーシス小体等であり、中でも、例えば、エクソソームである。エクソソームは、一般的に、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９、フロチリン等のマーカ分子により検出できる。
【0062】
本発明のＥＶ分泌抑制剤の使用方法は、特に制限されず、例えば、細胞外小胞の分泌を抑制させたい対象に添加すればよく、添加方法は、特に制限されず、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏでもよい。本発明のＥＶ分泌抑制剤の添加対象は、例えば、細胞もしくは組織、または生体等である。前記細胞および組織の種類、ならびに生体の部位（器官）は、特に制限されず、例えば、大腸、肺、皮膚、乳房、乳菅、乳腺、膵臓、および骨髄等があげられる。前記細胞および組織は、例えば、生体から単離したものでもよいし、セルラインまたはその培養物でもよい。前記添加対象の細胞および組織は、例えば、ヒト由来でもよいし、非ヒト動物由来でもよい。また、前記添加対象の生体は、例えば、ヒトでもよいし、非ヒト動物でもよい。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ラクダ等の哺乳類動物があげられる。前記添加対象が非ヒト動物由来または非ヒト動物の場合、前記ＥＶ分泌抑制物質は、例えば、その特定の非ヒト動物由来のターゲットタンパク質（前記酵素タンパク質）またはターゲット遺伝子に相対的に特異的に対応する抑制物質であることが好ましく、また、前記添加対象がヒト由来またはヒトの場合、前記抑制物質は、例えば、ヒト由来の前記ターゲットタンパク質またはターゲット遺伝子に相対的に特異的に対応する抑制物質であることが好ましい。
【0063】
＜ＥＶ分泌抑制方法＞
本発明のＥＶ分泌抑制方法は、細胞からのＥＶの分泌を抑制する方法であり、前記本発明のＥＶ分泌抑制剤を、投与対象に投与する工程を含むことを特徴とする。本発明は、前記本発明のＥＶ分泌抑制剤を使用することがポイントであって、その他の工程および条件は、特に制限されない。前記本発明のＥＶ分泌抑制方法に関しては、前記本発明のＥＶ分泌抑制剤における記載を援用できる。
本発明のＥＶ分泌抑制方法は、細胞からのＥＶの分泌を抑制する方法であり、前記本発明のＥＶ分泌抑制剤を、投与対象に投与する工程を含むことを特徴とする。本発明は、前記本発明のＥＶ分泌抑制剤を使用することがポイントであって、その他の工程および条件は、特に制限されない。前記本発明のＥＶ分泌抑制方法に関しては、前記本発明のＥＶ分泌抑制剤における記載を援用できる。
【0064】
前記投与対象が細胞の場合は、例えば、培地の存在下、前記ＥＶ分泌抑制剤を添加し、インキュベートすることによって、前記細胞からのＥＶ分泌を抑制することができる。前記インキュベートの条件は、特に制限されず、例えば、細胞の種類に応じて、前記培地、温度、時間、湿度等を設定できる。
【0065】
前記投与対象が組織の場合は、例えば、培地の存在下、前記ＥＶ分泌抑制剤を添加し、インキュベートすることによって、前記組織を構成する細胞からのＥＶ分泌を抑制することができる。前記インキュベートの条件は、特に制限されず、例えば、組織の種類、大きさ等に応じて、前記培地、温度、時間、湿度等を設定できる。
【0066】
前記投与対象が生体の場合、前記ＥＶ分泌抑制剤の投与方法は、特に制限されず、非経口投与、経口投与、静脈投与等があげられる。投与条件は、特に制限されず、例えば、生体の種類、投与対象の器官の種類等に応じて、適宜決定できる。
【0067】
前記非経口投与の場合、投与部位は、例えば、対象器官、すなわち、ＥＶ分泌を抑制させたい細胞を有する器官（対象部位ともいう）でもよいし、前記対象部位まで前記ＥＶ分泌抑制剤の有効成分である前記阻害剤をデリバリーできる部位でもよい。具体例として、例えば、対象細胞が大腸細胞の場合、投与部位は、対象部位の大腸でもよいし、大腸にまで前記阻害剤をデリバリーできる部位でもよい。また、例えば、対象細胞が肺細胞の場合、投与部位は、対象部位の肺でもよいし、肺まで前記阻害剤をデリバリーできる部位でもよく、他の器官についても同様である。前記非経口投与の方法は、例えば、患部注射、静脈注射、皮下注射、皮内注射、点滴注射、経皮投与等があげられる。前記ＥＶ分泌抑制剤の形態は、特に制限されず、前述のように、投与方法等に応じて適宜設定でき、前述の記載を援用できる。
【0068】
非経口投与の場合、剤型は、特に制限されず、投与方法により適宜決定でき、例えば、液状、クリーム状、ジェル状等であり、媒質と前記阻害剤とを混合することで調製できる。前記媒質のうち、水性溶媒は、例えば、生理食塩水、等張液等であり、油性溶媒は、例えば、大豆油等であり、乳化溶媒は、例えば、これらの混合液である。前記非経口投与剤は、例えば、さらに、アルコール、ポリアルコール、界面活性剤等を含んでもよい。また、前記非経口投与剤は、前記阻害剤を、対象部位以外の部位から前記対象部位に効果的にデリバリーするためのＤＤＳ剤を含んでもよい。また、前記対象部位の組織の中でも、例えば、がん細胞に前記阻害剤を効果的にデリバリーする場合、前記非経口投与剤は、例えば、前記がん細胞を特異的に認識するＤＤＳ剤を含んでもよい。
【0069】
前記経口投与の場合、経口投与剤の剤型は、特に制限されず、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、シロップ剤等があげられる。前記経口投与剤は、例えば、希釈剤、賦形剤、担体等を含んでもよい。また、前記経口投与剤は、例えば、前記阻害剤を前記対象部位に効果的にデリバリーするためのＤＤＳ剤を含んでもよい。また、前記対象部位の組織の中でも、例えば、がん細胞に前記阻害剤を効果的にデリバリーする場合、前記経口投与剤は、例えば、前記がん細胞を特異的に認識するＤＤＳ剤を含んでもよい。
【0070】
前記生体への投与において、本発明のＥＶ分泌抑制剤の投与条件は、例えば、年齢、体重、投与対象の器官の種類、性別等に応じて適宜決定できる。
【0071】
本発明者らによって、がんの転移のメカニズムとして、原発がんのがん細胞から細胞外小胞が分泌され、前記細胞外小胞を介した細胞間の情報伝達により、がんの転移が生じることが報告されている。本発明のＥＶ分泌抑制剤によれば、前述のように、がんに罹患した患者の対象部位（がん器官）への投与により、前記対象部位におけるがん細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制することで、がんの進行を抑制したり、他の器官へのがんの転移を抑制できる。このため、本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、がんの治療剤としても使用できる。本明細書において、治療は、例えば、いわゆる、がんの進行の緩和、がんの治癒等のための行為の他、がんへの罹患、再発を防止するための予防の行為の意味も含む。本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、いずれか１つを目的として使用されてもよいし、２つ以上を目的として使用されてもよい。
【0072】
この場合、前記生体への投与において、本発明のＥＶ分泌抑制剤の投与条件は、例えば、前述の例示した項目に加えて、さらに、がんの種類（例えば、大腸がん、肺がん、メラノーマ、乳がん、膵臓がん、および多発性骨髄腫等）、がんの進行度等に応じて適宜決定できる。また、前記生体は、例えば、治療の点から、前記がん罹患に罹患した対象でもよいし、予防の点から、前記がんに罹患していない対象、または罹患の有無が不明な対象でもよい。
【0073】
本発明のＥＶ分泌抑制の用途としては、このような例示には限定されない。近年、例えば、体内における細胞間の伝達にエクソソーム等のＥＶが関与することが報告されている。具体例としては、例えば、感染したウイルス（例えば、インフルエンザウイルス、コロナウイルス等）の体内における伝達等があげられる。このため、本発明のＥＶ分泌抑制剤によれば、ＥＶの分泌抑制によって、例えば、ウイルスの伝達を抑制し、結果的に体内におけるウイルス感染の拡大を阻害することもできる。
【0074】
本発明のＥＶ分泌抑制剤により分泌が抑制されるＥＶは、前述のように、例えば、ある細胞内の情報物質を他の細胞に移送することにより、細胞間の情報伝達を行うという役割を果たすことが知られている。このため、本発明のＥＶ分泌抑制剤は、例えば、細胞間の情報伝達抑制剤ということもでき、また、本発明のＥＶ分泌抑制方法は、例えば、細胞間の情報伝達抑制方法ともいえる。
【0075】
＜スクリーニング方法＞
本発明のスクリーニング方法は、細胞からのＥＶの分泌を抑制するＥＶ分泌抑制剤の候補物質のスクリーニング方法であり、被検物質から、セリン合成経路を阻害する阻害物質を、細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制する候補物質として選択することを特徴とする。前記細胞の種類は、特に制限されず、前述のとおりであり、例えば、がん細胞が例示できる。前記がん細胞は、前述のように、例えば、大腸がん細胞、肺がん細胞、メラノーマ細胞、乳がん細胞、膵臓がん細胞、および多発性骨髄腫細胞等があげられる。
本発明のスクリーニング方法は、細胞からのＥＶの分泌を抑制するＥＶ分泌抑制剤の候補物質のスクリーニング方法であり、被検物質から、セリン合成経路を阻害する阻害物質を、細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制する候補物質として選択することを特徴とする。前記細胞の種類は、特に制限されず、前述のとおりであり、例えば、がん細胞が例示できる。前記がん細胞は、前述のように、例えば、大腸がん細胞、肺がん細胞、メラノーマ細胞、乳がん細胞、膵臓がん細胞、および多発性骨髄腫細胞等があげられる。
【0076】
前記発現抑制物質の候補物質をスクリーニングする場合、本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記酵素タンパク質をコードする遺伝子（前記ターゲット遺伝子）から前記酵素タンパク質（前記ターゲットタンパク質）を発現する発現系に前記被検物質を共存させ、前記ターゲットタンパク質を発現させる工程、前記発現系における前記ターゲットタンパク質の発現を検出する工程、および前記ターゲットタンパク質の発現量が、前記被検物質を共存させていないコントロールの発現系よりも相対的に低い前記被検物質を、前記候補物質として選択する工程を含む。
【0077】
前記触媒機能抑制物質の候補物質をスクリーニングする場合、本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記酵素タンパク質（前記ターゲットタンパク質）に前記被検物質を接触させる工程、前記酵素タンパク質の触媒活性を検出する工程、および前記酵素タンパク質の触媒活性が、前記被検物質を共存させていないコントロールの系よりも相対的に低い前記被検物質を、前記候補物質として選択する工程を含む。
【0078】
前記触媒機能抑制物質の候補物質として、前記活性中和物質をスクリーニングする場合、本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記酵素タンパク質（前記ターゲットタンパク質）に前記被検物質を接触させる工程、前記ターゲットタンパク質と前記被検物質との結合を検出する工程、および前記ターゲットタンパク質に結合した前記被検物質を、前記候補物質として選択する工程を含む。
【0079】
＜用途＞
本発明は、細胞からの細胞外小胞の分泌抑制に使用するための前記阻害剤である。前記抑制物質は、前記本発明のＥＶ分泌抑制剤および前記本発明のＥＶ分泌抑制方法の記載を援用できる。
本発明は、細胞からの細胞外小胞の分泌抑制に使用するための前記阻害剤である。前記抑制物質は、前記本発明のＥＶ分泌抑制剤および前記本発明のＥＶ分泌抑制方法の記載を援用できる。
【実施例】
【0080】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。
【0081】
（細胞）
大腸がん細胞として、ヒト結腸腺がん細胞株ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２４７）、肺がん細胞として、ヒト肺胞基底上皮腺がん細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）を使用した。メラノーマ細胞として、ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６１９）、乳がん細胞として、ヒト乳癌細胞株ＭＭ２３１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－２６）、膵臓がん細胞として、ヒト膵臓腺がん細胞株Ｐａｎｃ－１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４６９）、多発性骨髄腫細胞として、ヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１５５）を使用した。
大腸がん細胞として、ヒト結腸腺がん細胞株ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２４７）、肺がん細胞として、ヒト肺胞基底上皮腺がん細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）を使用した。メラノーマ細胞として、ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６１９）、乳がん細胞として、ヒト乳癌細胞株ＭＭ２３１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－２６）、膵臓がん細胞として、ヒト膵臓腺がん細胞株Ｐａｎｃ－１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４６９）、多発性骨髄腫細胞として、ヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１５５）を使用した。
【0082】
（核酸分子）
核酸分子ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－８９１ｂ（ｍｉＲ－８９１ｂ ｍｉｍｉｃともいう。配列番号１：ＧＣＡＡＣＵＵＡＣＣＵＧＡＧＵＣＡＵＵＧＡ）（製品番号 ４４６４０６６ 、Ａｍｂｉｏｎ社）を使用し、ネガティブコントロール用の核酸分子ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲＮＡ Ｍｉｍｉｃ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ＃１（４４６４０５８）（Ａｍｂｉｏｎ）を使用した。核酸分子ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＰＳＡＴ１（製品番号 ｓｉＧＥＮＯＭＥ ＳＭＡＲＴ ｐｏｏｌ ｓｉＲＮＡ Ｍ－０１０３９８、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を使用し、ネガティブコントロール用の核酸分子ｓｉＲＮＡとして、ＡＬＬ ＳＴＡＲネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（ＳＩ０３６５０３１８）（いずれもＱｉａｇｅｎ）を使用した。
核酸分子ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－８９１ｂ（ｍｉＲ－８９１ｂ ｍｉｍｉｃともいう。配列番号１：ＧＣＡＡＣＵＵＡＣＣＵＧＡＧＵＣＡＵＵＧＡ）（製品番号 ４４６４０６６ 、Ａｍｂｉｏｎ社）を使用し、ネガティブコントロール用の核酸分子ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲＮＡ Ｍｉｍｉｃ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ＃１（４４６４０５８）（Ａｍｂｉｏｎ）を使用した。核酸分子ｓｉＲＮＡとして、ｓｉＰＳＡＴ１（製品番号 ｓｉＧＥＮＯＭＥ ＳＭＡＲＴ ｐｏｏｌ ｓｉＲＮＡ Ｍ－０１０３９８、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を使用し、ネガティブコントロール用の核酸分子ｓｉＲＮＡとして、ＡＬＬ ＳＴＡＲネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（ＳＩ０３６５０３１８）（いずれもＱｉａｇｅｎ）を使用した。
【0083】
（細胞培養）
ＭＭ２３１用の培地は、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質－抗真菌溶液（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＲＰＭＩ完全培地を使用した。ＨＣＴ１１６用の培地は、Ｍａｃｃｏｙ５Ａに１０％熱不活化ＦＢＳおよび抗生剤－抗真菌薬を添加したＭａｃｃｏｙ５Ａ完全培地を使用し、その他の細胞用の培地は、ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）に１０％熱不活化ＦＢＳおよび抗生剤－抗真菌薬を添加したＤＭＥＭ完全培地を使用した。培養条件は、３７℃、５％二酸化炭素、９５％相対湿度（ＲＨ）とした。約１００，０００個の細胞を前記完全培地１８ｍＬに播種し、３～４日間インキュベートし、継代数２０未満の細胞を使用した。
ＭＭ２３１用の培地は、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質－抗真菌溶液（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＲＰＭＩ完全培地を使用した。ＨＣＴ１１６用の培地は、Ｍａｃｃｏｙ５Ａに１０％熱不活化ＦＢＳおよび抗生剤－抗真菌薬を添加したＭａｃｃｏｙ５Ａ完全培地を使用し、その他の細胞用の培地は、ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）に１０％熱不活化ＦＢＳおよび抗生剤－抗真菌薬を添加したＤＭＥＭ完全培地を使用した。培養条件は、３７℃、５％二酸化炭素、９５％相対湿度（ＲＨ）とした。約１００，０００個の細胞を前記完全培地１８ｍＬに播種し、３～４日間インキュベートし、継代数２０未満の細胞を使用した。
【0084】
（分泌ＥＶの回収）
培養したがん細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、培地を、前記抗生物質－抗真菌薬と２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）とを含むａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩまたはａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭに置き換えた。置換後の調整培養液を２，０００×ｇで１０分間遠心分離して細胞を除去し、得られた上清を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過した。得られたろ液を１１０，０００×ｇで７０分間遠心分離し、ＥＶが濃縮されたペレットを得た。前記ペレットを１１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、さらに１１０，０００×ｇで７０分間超遠心分離し、再回収した。
培養したがん細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、培地を、前記抗生物質－抗真菌薬と２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）とを含むａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩまたはａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭに置き換えた。置換後の調整培養液を２，０００×ｇで１０分間遠心分離して細胞を除去し、得られた上清を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ過した。得られたろ液を１１０，０００×ｇで７０分間遠心分離し、ＥＶが濃縮されたペレットを得た。前記ペレットを１１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、さらに１１０，０００×ｇで７０分間超遠心分離し、再回収した。
【0085】
（Ｅｘｏ Ｓｃｒｅｅｎ法）
ＥＶの検出には、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎストレプトアビジン被覆ドナービーズ（６７６０００２）、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ非結合アクセプタービーズ（６０６２０１１）、およびＡｌｐｈａＬＩＳＡユニバーサルバッファ（ＡＬ００１Ｆ）から構成されるＡｌｐｈａＬＩＳＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、９６ウェルハーフエリアホワイトプレート（６００５５６０、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、および検出装置ＥｎＳｐｉｒｅ Ａｌｐｈａ ２３００ Ｍｕｔｉｌａｂｅｌプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用した。具体的には、前記プレートの各ウェルに、ＥＶ ５μＬまたはＣＭ（細胞の培養上清）１０μＬと、前記バッファで調製した５ｎｍｏｌ／Ｌビオチン化抗体 １０μＬと、５０μｇ／ｍＬ ＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ結合抗体 １０μＬとを添加した。ＣＤ９／ＣＤ９二重陽性ＥＶの検出には、ビオチン化抗ヒトＣＤ９抗体とＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ結合抗ヒトＣＤ９抗体とを使用し、ＣＤ９／ＣＤ６３二重陽性ＥＶの検出には、ビオチン化抗ヒトＣＤ９抗体とＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ結合抗ヒトＣＤ６３抗体とを使用した。また、ＣＤ６３／ＣＤ６３二重陽性ＥＶの検出には、ビオチン化抗ヒトＣＤ６３抗体とＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ結合抗ヒトＣＤ６３抗体とを使用した。そして、前記プレートを３７℃で１時間インキュベートした後、８０μｇ／ｍＬ ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎストレプトアビジン被覆ドナービーズ ２５μＬを添加し、さらに３７℃で３０分間、暗所でインキュベートした。つぎに、前記検出装置を励起波長６８０ｎｍおよび発光検出波長６１５ ｎｍに設定し、前記プレートのウェルにおける発光を測定した。抗体は、いずれも市販品として、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ９（クローン１２Ａ１２）およびＣＤ６３抗体（クローン８Ａ１２）（いずれもＣｏｓｍｏ Ｂｉｏ）を使用した。
ＥＶの検出には、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎストレプトアビジン被覆ドナービーズ（６７６０００２）、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ非結合アクセプタービーズ（６０６２０１１）、およびＡｌｐｈａＬＩＳＡユニバーサルバッファ（ＡＬ００１Ｆ）から構成されるＡｌｐｈａＬＩＳＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、９６ウェルハーフエリアホワイトプレート（６００５５６０、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、および検出装置ＥｎＳｐｉｒｅ Ａｌｐｈａ ２３００ Ｍｕｔｉｌａｂｅｌプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用した。具体的には、前記プレートの各ウェルに、ＥＶ ５μＬまたはＣＭ（細胞の培養上清）１０μＬと、前記バッファで調製した５ｎｍｏｌ／Ｌビオチン化抗体 １０μＬと、５０μｇ／ｍＬ ＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ結合抗体 １０μＬとを添加した。ＣＤ９／ＣＤ９二重陽性ＥＶの検出には、ビオチン化抗ヒトＣＤ９抗体とＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ結合抗ヒトＣＤ９抗体とを使用し、ＣＤ９／ＣＤ６３二重陽性ＥＶの検出には、ビオチン化抗ヒトＣＤ９抗体とＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ結合抗ヒトＣＤ６３抗体とを使用した。また、ＣＤ６３／ＣＤ６３二重陽性ＥＶの検出には、ビオチン化抗ヒトＣＤ６３抗体とＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ結合抗ヒトＣＤ６３抗体とを使用した。そして、前記プレートを３７℃で１時間インキュベートした後、８０μｇ／ｍＬ ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎストレプトアビジン被覆ドナービーズ ２５μＬを添加し、さらに３７℃で３０分間、暗所でインキュベートした。つぎに、前記検出装置を励起波長６８０ｎｍおよび発光検出波長６１５ ｎｍに設定し、前記プレートのウェルにおける発光を測定した。抗体は、いずれも市販品として、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ９（クローン１２Ａ１２）およびＣＤ６３抗体（クローン８Ａ１２）（いずれもＣｏｓｍｏ Ｂｉｏ）を使用した。
【0086】
（ナノ粒子トラッキング追跡分析ＮＴＡによるＥＶの分析）
回収した分泌ＥＶをＰＢＳに懸濁し、さらにＰＢＳで希釈系を調製し、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ粒子トラッキング分析（ＬＭ１０、ソフトウェアＶｅｒ． ２．０３）で分析した。前記粒子トラッキングは、カメラレベル１４で各サンプルから少なくとも５つの６０秒ビデオを得た。分析設定は、最適化し、サンプル間で一定に維持させた。ＥＶ濃度は、培養液の粒子／細胞として算出し、正味のＥＶ分泌率が得られた。前記ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法によるＥＶの測定結果は、ＮＴＡ分析によるＥＶの測定結果と相関関係を示したことから、ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法により分泌ＥＶ量を測定できることが確認できた。
回収した分泌ＥＶをＰＢＳに懸濁し、さらにＰＢＳで希釈系を調製し、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ粒子トラッキング分析（ＬＭ１０、ソフトウェアＶｅｒ． ２．０３）で分析した。前記粒子トラッキングは、カメラレベル１４で各サンプルから少なくとも５つの６０秒ビデオを得た。分析設定は、最適化し、サンプル間で一定に維持させた。ＥＶ濃度は、培養液の粒子／細胞として算出し、正味のＥＶ分泌率が得られた。前記ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法によるＥＶの測定結果は、ＮＴＡ分析によるＥＶの測定結果と相関関係を示したことから、ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法により分泌ＥＶ量を測定できることが確認できた。
【0087】
（一過性トランスフェクションアッセイ）
６ウェルプレートに、１．０×１０５細胞／ウェルの条件でがん細胞の懸濁液２ｍＬを播種し、２４時間インキュベートした後、目的の核酸分子１０ｎｍｏｌ／Ｌを添加し、トランスフェクション試薬（商品名ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ １）により前記核酸分子のトランスフェクションを行った。前記核酸分子は、前記ｍｉＲＮＡ、前記ｓｉＲＮＡを使用した。前記２４時間のインキュベート後、培地を、前記抗生物質－抗真菌薬と２ｍｍｏｌ／Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）とを含む前記ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０培地またはａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地に置き換えた。置換の４８時間後、トータルＲＮＡを抽出し、目的の遺伝子の発現をｑＰＣＲで測定した。
６ウェルプレートに、１．０×１０５細胞／ウェルの条件でがん細胞の懸濁液２ｍＬを播種し、２４時間インキュベートした後、目的の核酸分子１０ｎｍｏｌ／Ｌを添加し、トランスフェクション試薬（商品名ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ １）により前記核酸分子のトランスフェクションを行った。前記核酸分子は、前記ｍｉＲＮＡ、前記ｓｉＲＮＡを使用した。前記２４時間のインキュベート後、培地を、前記抗生物質－抗真菌薬と２ｍｍｏｌ／Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）とを含む前記ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ １６４０培地またはａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地に置き換えた。置換の４８時間後、トータルＲＮＡを抽出し、目的の遺伝子の発現をｑＰＣＲで測定した。
【0088】
（ＲＮＡ抽出およびｑＰＣＲ分析）
トータルＲＮＡは、市販の試薬（商品名ＱＩＡｚｏｌ、商品名ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて培養細胞から抽出した。逆転写反応は、市販キット（商品名Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびランダムヘキサマープライマーを用いて行った。リアルタイムＰＣＲ分析は、市販キット（商品名ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ、商品名ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。ｍＲＮＡの発現は、β－アクチンで正規化した。ＰＳＡＴ１用のプローブは、ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
トータルＲＮＡは、市販の試薬（商品名ＱＩＡｚｏｌ、商品名ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて培養細胞から抽出した。逆転写反応は、市販キット（商品名Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびランダムヘキサマープライマーを用いて行った。リアルタイムＰＣＲ分析は、市販キット（商品名ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ、商品名ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。ｍＲＮＡの発現は、β－アクチンで正規化した。ＰＳＡＴ１用のプローブは、ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
【0089】
実施例におけるデータは、特に記載しない限り、平均値±標準誤差で示した。統計的有意性はスチューデントｔ検定で決定した。ドットプロットにおいて、バーは、中央値と四分位範囲を示し、統計的有意性は、スチューデントｔ検定によって決定した。Ｐ ＜０．０５を、統計的に有意とした。
＊ Ｐ ＜０．０５、＊＊ Ｐ ＜０．０１。
＊ Ｐ ＜０．０５、＊＊ Ｐ ＜０．０１。
【0090】
［実施例Ａ］
［実施例Ａ１］
大腸がんおよび肺がんにおけるＥＶ分泌の調節に関与するターゲット遺伝子を同定した。
［実施例Ａ１］
大腸がんおよび肺がんにおけるＥＶ分泌の調節に関与するターゲット遺伝子を同定した。
【0091】
（１）がん細胞から分泌されるＥＶの検出
大腸がん細胞ＨＣＴ１１６および肺がん細胞Ａ５４９に、それぞれｍｉＲ－８９１ｂをトランスフェクションして、その形質転換体（ｍｉＲ－８９１ｂ）の培養上清（ＣＭ）および前記形質転換体（ｍｉＲ－８９１ｂ）から分泌されたＥＶを含むＥＶ画分を回収し、前記ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法により分泌ＥＶ量を強度シグナルとして測定した。また、各形質転換体について、ＮＴＡ分析により、分泌ＥＶ量を確認した。ネガティブコントロールとして、ｍｉＲ－８９１ｂ ｍｉＲＮＡ Ｍｉｍｉｃ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ＃１をトランスフェクションしたＡ５４９の形質転換体（ＮＣ）についても、同様に分泌ＥＶ量を測定した。そして、形質転換体（ＮＣ）の分泌ＥＶ量を１として、形質転換体（ｍｉＲ－８９１ｂ）の分泌ＥＶの相対値（ｎ＝３）を求めた。
大腸がん細胞ＨＣＴ１１６および肺がん細胞Ａ５４９に、それぞれｍｉＲ－８９１ｂをトランスフェクションして、その形質転換体（ｍｉＲ－８９１ｂ）の培養上清（ＣＭ）および前記形質転換体（ｍｉＲ－８９１ｂ）から分泌されたＥＶを含むＥＶ画分を回収し、前記ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法により分泌ＥＶ量を強度シグナルとして測定した。また、各形質転換体について、ＮＴＡ分析により、分泌ＥＶ量を確認した。ネガティブコントロールとして、ｍｉＲ－８９１ｂ ｍｉＲＮＡ Ｍｉｍｉｃ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ＃１をトランスフェクションしたＡ５４９の形質転換体（ＮＣ）についても、同様に分泌ＥＶ量を測定した。そして、形質転換体（ＮＣ）の分泌ＥＶ量を１として、形質転換体（ｍｉＲ－８９１ｂ）の分泌ＥＶの相対値（ｎ＝３）を求めた。
【0092】
これらの結果を図１に示す。図１において、（Ａ）は、ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法による分泌ＥＶ量の相対値を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＮＴＡ法による分泌ＥＶ量の相対値を示すグラフである。図１（Ａ）に示すように、ｍｉＲ－８９１ｂをトランスフェクトした大腸がん細胞ＨＣＴ１１６および肺がん細胞Ａ５４９の形質転換体（ｍｉＲ－８９１ｂ）は、前記ＣＭおよびＥＶ画分のいずれにおいても、形質転換体（ＮＣ）より、分泌ＥＶ量が有意に抑制された。また、図１（Ｂ）に示すように、ＮＴＡ法によっても同様の結果が得られた。これらの結果から、大腸がん細胞および肺がん細胞において、ｍｉＲ－８９１ｂが、ＥＶ分泌を抑制することがわかった。
【0093】
（２）ｍｉＲ－８９１ｂのターゲット遺伝子
前記（１）において、ｍｉＲ－８９１ｂのトランスフェクションによってＥＶ分泌が抑制されたことから、発明者らは、さらなる鋭意研究によって、ｍｉＲ－８９１ｂにより発現が抑制されるターゲット遺伝子としてＰＳＡＴ１遺伝子を見出した。そこで、ＰＳＡＴ１遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＳＡＴ１）を大腸がん細胞ＨＣＴ１１６および肺がん細胞Ａ５４９にトランスフェクションして、ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法およびＮＴＡ法により分泌ＥＶ量を確認した。また、ネガティブコントロールとして、ＡＬＬ ＳＴＡＲネガティブコントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションして、同様の確認を行った。これらの結果を図２に示す。図２において、（Ａ）は、ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法による分泌ＥＶ量の相対値を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＮＴＡ法による分泌ＥＶ量の相対値を示すグラフである。
前記（１）において、ｍｉＲ－８９１ｂのトランスフェクションによってＥＶ分泌が抑制されたことから、発明者らは、さらなる鋭意研究によって、ｍｉＲ－８９１ｂにより発現が抑制されるターゲット遺伝子としてＰＳＡＴ１遺伝子を見出した。そこで、ＰＳＡＴ１遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＳＡＴ１）を大腸がん細胞ＨＣＴ１１６および肺がん細胞Ａ５４９にトランスフェクションして、ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法およびＮＴＡ法により分泌ＥＶ量を確認した。また、ネガティブコントロールとして、ＡＬＬ ＳＴＡＲネガティブコントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションして、同様の確認を行った。これらの結果を図２に示す。図２において、（Ａ）は、ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法による分泌ＥＶ量の相対値を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＮＴＡ法による分泌ＥＶ量の相対値を示すグラフである。
【0094】
図２（Ａ）に示すように、ｓｉＰＳＡＴ１をトランスフェクトした大腸がん細胞ＨＣＴ１１６および肺がん細胞Ａ５４９の形質転換体（ｓｉＰＳＡＴ１）は、前記ＣＭおよびＥＶ画分のいずれにおいても、形質転換体（ＮＣ）より、分泌ＥＶ量が有意に抑制された。また、図２（Ｂ）に示すように、ＮＴＡ法によっても同様の結果が得られた。このように、ｓｉＰＳＡＴ１によるＰＳＡＴ１遺伝子のダウンレギュレーションによって、ＥＶ分泌が抑制されたことから、前記（１）の結果とあわせて、ｍｉＲ－８９１ｂのターゲット遺伝子がＰＳＡＴ１遺伝子であることがわかった。
【0095】
（３）ターゲット遺伝子の確認
前記（２）におけるＰＳＡＴ１遺伝子について、ｍｉＲ－８９１ｂの直接のターゲット遺伝子であることの確認を行った。
前記（２）におけるＰＳＡＴ１遺伝子について、ｍｉＲ－８９１ｂの直接のターゲット遺伝子であることの確認を行った。
【0096】
まず、前記形質転換体（ｍｉＲ－８９１ｂ）およびそれに対するコントロールの前記形質転換体（ＮＣ）について、ＰＳＡＴ１遺伝子の発現を検出した。そして、前記形質転換体（ＮＣ）の発現量を１として、前記形質転換体（ｍｉＲ－８９１ｂ）の発現量の相対値を求めた。これらの結果を図３（Ａ）に示す。図３（Ａ）は、ＰＳＡＴ１遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。また、前記形質転換体（ｍｉＲ－８９１ｂ）およびそれに対するコントロールの前記形質転換体（ＮＣ）について、ＰＳＡＴ１タンパク質の発現をウエスタンブロッティングにより検出した。また、コントロールとして、β－アクチンも検出した。これらの結果を図３（Ｂ）に示す。図３（Ｂ）は、ＰＳＡＴ１タンパク質の発現を示すウェスタンブロットの写真である。
【0097】
つぎに、図３（Ｃ）に示すように、ｍｉＲ－８９１ｂは、ヒトＰＳＡＴ１ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ（配列番号２：ＵＧＧＡＣＵＵＡＡＵＡＡＵＧＣＡＡＧＵＵＧＣは、３’ＵＴＲの部分領域）における連続する７塩基領域にパーフェクトマッチする配列を有する。そこで、３’ＵＴＲの前記７塩基領域が野生型配列（配列番号３：ＡＡＧＴＴＧＣ）である野生型ＰＳＡＴ１遺伝子と、３’ＵＴＲ’の前記７塩基領域が変異型配列（配列番号４：ＴＴＣＡＡＣＧ）である変異型ＰＳＡＴ１遺伝子とを用いて、ｍｉＲ－８９１ｂによる影響を確認した。具体的には、以下のような実験を行った。野生型ＰＳＡＴ１遺伝子または変異型ＰＳＡＴ１遺伝子を、プラスミドベクターｐｓｉＣＨＥＣＫ２にサブクローニングし、この組換えベクターを、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に、ｍｉＲ－８９１ｂまたはネガティブコントロール用ｍｉＲＮＡと共に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後に、Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍの操作手順に従い、形質転換体のルシフェラーゼ活性をプレートリーダーで定量した。
【0098】
【0099】
図３（Ｄ）に示すように、ｍｉＲ－８９１ｂのトランスフェクションにより、ＰＳＡＴ１遺伝子の発現およびＰＳＡＴ１タンパク質の発現が抑制された。さらにｍｉＲ－８９１ｂの認識領域の配列が野生型である野生型ＰＳＡＴ１の場合、ｍｉＲ－８９１ｂのトランスフェクションによって、ＰＳＡＴ１の発現量は有意に低下したが、ｍｉＲ－８９１ｂの認識領域の配列を変異型とすることによって、ＰＳＡＴ１の発現量が低下しなかった。これらのことから、ｍｉＲ－８９１ｂがＰＳＡＴ１の３’ＵＴＲを認識してＰＳＡＴ１を切断していることがわかった。つまり、ＰＳＡＴ１遺伝子が、ｍｉＲ－８９１ｂの直接的なターゲットであることが裏付けられた。
【0100】
［実施例Ａ２］
ＰＳＡＴ１遺伝子の発現抑制による、各種がん細胞からのＥＶ分泌の抑制を確認した。
ＰＳＡＴ１遺伝子の発現抑制による、各種がん細胞からのＥＶ分泌の抑制を確認した。
【0101】
メラノーマ細胞Ａ３７５、乳がん細胞ＭＭ２３１、膵臓がん細胞Ｐａｎｃ－１、多発性骨髄腫細胞ＲＰＭＩ８２２６を使用した以外は、実施例Ａ１（２）と同様に、ｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＳＡＴ１）をトランスフェクションし、ナノ粒子トラッキング追跡分析（ＮＴＡ）法によりＥＶ分泌量を測定した。これらの結果を図４に示す。図４は、ＮＴＡ法による分泌ＥＶ量の相対値を示すグラフである。
【0102】
図４に示すように、いずれのがん細胞も、ｓｉＰＳＡＴ１をトランスフェクトした形質転換体（ｓｉＰＳＡＴ１）は、ネガティブコントロールの形質転換体（ＮＣ）より、分泌ＥＶ量が有意に抑制された。これらの結果から、大腸がん細胞および肺がん細胞だけでなく、様々ながん細胞のＥＶ分泌も、ＰＳＡＴ１の発現抑制によって抑制できることがわかった。このことから、ＰＳＡＴ１の発現を抑制することによって、様々ながん細胞からのＥＶ分泌を抑制し、これらのがんの治療、他の器官へのがん転移の予防が可能であるといえる。
【0103】
［実施例Ａ３］
前記実施例Ａ１（２）と同様に、大腸がん細胞ＨＣＴ１１６および肺がん細胞Ａ５４９にｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＳＡＴ１）をトランスフェクションし、ＰＳＡＴ１サイレンシング後のＥＶバイオジェネシスを確認した。サイレンシング後の各形質転換体について、免疫蛍光によりＣＤ６３およびＰＳＡＴ１を確認したところ、ＰＳＡＴ１サイレンシング後の細胞質において、ＥＶのマーカであるＣＤ６３の蓄積が確認された。また、ｍｉＲ－８９１ｂをトランスフェクションした場合も、同様に、ＣＤ６３の蓄積が確認できた。この結果から、ＰＳＡＴ１の発現を抑制することによって、ＥＶの産生自体は維持されるが、産生されたＥＶは細胞質内に蓄積され、細胞から外部へのＥＶ分泌が抑制されることを確認できた。
前記実施例Ａ１（２）と同様に、大腸がん細胞ＨＣＴ１１６および肺がん細胞Ａ５４９にｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＳＡＴ１）をトランスフェクションし、ＰＳＡＴ１サイレンシング後のＥＶバイオジェネシスを確認した。サイレンシング後の各形質転換体について、免疫蛍光によりＣＤ６３およびＰＳＡＴ１を確認したところ、ＰＳＡＴ１サイレンシング後の細胞質において、ＥＶのマーカであるＣＤ６３の蓄積が確認された。また、ｍｉＲ－８９１ｂをトランスフェクションした場合も、同様に、ＣＤ６３の蓄積が確認できた。この結果から、ＰＳＡＴ１の発現を抑制することによって、ＥＶの産生自体は維持されるが、産生されたＥＶは細胞質内に蓄積され、細胞から外部へのＥＶ分泌が抑制されることを確認できた。
【0104】
さらに、ＰＳＡＴ１サイレンシング後の前記形質転換体について、ＥＶのマーカであるＣＤ６３と、初期エンドソームマーカーであるＥＥＡ１または後期エンドソームマーカーであるＲａｂ７との共免疫染色を行った。その結果、ＰＳＡＴ１サイレンシング後の形質転換体とネガティブコントロールの形質転換体のいずれにおいても、ＥＥＡ１とＣＤ６３との重複は確認されなかった。一方、ネガティブコントロールの形質転換体では、ＣＤ６３とＲａｂ７との大部分がオーバーラップしたが、ＰＳＡＴ１サイレンシング後の形質転換体では、ＣＤ６３とＲａｂ７とのオーバーラップは少なかった。そこで、ＣＤ６３シングルポジティブの面積を強度に基づいて測定した。この結果を図５に示す。図５に示すように、ＨＣＴ１１６およびＡ５４９のいずれについても、ＰＳＡＴ１サイレンシングを行うことによって、ＣＤ６３シングルポジティブの面積が顕著に増加し、細胞内にＥＶが蓄積していることが確認された。これらの結果から、ＰＳＡＴ１が、後期エンドソーム合成の過程でＥＶ分泌に機能している可能性が示唆された。
【0105】
［実施例Ｂ］
前記実施例Ａにおいて、ＥＶ分泌にＰＳＡＴ１が関与しており、ＰＳＡＴ１の発現抑制により、ＥＶ分泌を抑制できることが確認された。ＰＳＡＴ１は、セリン合成経路の酵素タンパク質であるため、ＥＶ分泌にセリン合成経路が関与しており、セリン合成経路の阻害、すなわちセリン合成の阻害によってＥＶ分泌を抑制できることが推測された。そこで、実施例Ｂにおいて、ＰＳＡＴ１にかかわらず、セリン合成経路についていずれかの工程を阻害することで、ＥＶ分泌を抑制できることを確認した。
前記実施例Ａにおいて、ＥＶ分泌にＰＳＡＴ１が関与しており、ＰＳＡＴ１の発現抑制により、ＥＶ分泌を抑制できることが確認された。ＰＳＡＴ１は、セリン合成経路の酵素タンパク質であるため、ＥＶ分泌にセリン合成経路が関与しており、セリン合成経路の阻害、すなわちセリン合成の阻害によってＥＶ分泌を抑制できることが推測された。そこで、実施例Ｂにおいて、ＰＳＡＴ１にかかわらず、セリン合成経路についていずれかの工程を阻害することで、ＥＶ分泌を抑制できることを確認した。
【0106】
［実施例Ｂ１］
通常のＤＭＥＭ培地にはセリンが含まれているため、セリン欠乏培地を使用し、セリン添加によるＥＶ分泌への影響を確認した。
通常のＤＭＥＭ培地にはセリンが含まれているため、セリン欠乏培地を使用し、セリン添加によるＥＶ分泌への影響を確認した。
【0107】
１×インスリン、トランスフェリン、セレン溶液（１００×ＩＴＳ －Ｇ）、１×ＭＥＭビタミン溶液、およびセリン（４ｍｍｏｌ／Ｌ）を含む無血清のセリン含有ＭＥＭ培地と、セリンを含まない以外は同じ組成である無血清のセリン欠乏ＭＥＭ培地とを使用した。大腸がん細胞ＨＣＴ１１６および肺がん細胞Ａ５４９を、９６ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェルとなるように播種し、６ウェルプレートに１．５×１０５細胞／ウェルとなるように播種し（Ｄａｙ０）、培地（１０％ ＦＢＳと１×ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃとを含むＤＭＥＭ）で、２４時間インキュベートした。インキュベート後（Ｄａｙ１）に、各細胞をｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＳＡＴ１）または前記ＡＬＬ ＳＴＡＲネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（ＮＣ）でトランスフェクションし、さらに２４時間インキュベートした。インキュベート後（Ｄａｙ２）、ウェル中の培地を前記セリン欠乏ＭＥＭ培地または前記セリン含有ＭＥＭ培地に交換し、さらに４８時間インキュベーションした後（Ｄａｙ４）後、前記９６ウェルプレートをＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法に使用し、前記６ウェルプレートから培養後の培地を回収した。前記回収した培地から分泌ＥＶを回収し、ＮＴＡを行った。
【0108】
その結果、ＰＳＡＴ１サイレンシング後の形質転換体は、前記セリン欠乏ＭＥＭ培地を使用した場合、前記セリン含有ＭＥＭ培地を使用した場合と比較して、その生育は遅くなった。
【0109】
さらに、ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法およびＮＴＡによる測定結果を、図６に示す。前記ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法による分泌ＥＶ量は、ｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＳＡＴ１）でトランスフェクションした形質転換体の結果を１として、相対値を求め、ＮＴＡによる分泌ＥＶ量は、ｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＳＡＴ１）でトランスフェクションした形質転換体の分泌ＥＶ量を１として、相対値を求めた。図６において、（Ａ）は、ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法による分泌ＥＶ量の相対値を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＮＴＡ法による分泌ＥＶ量の相対値を示すグラフである。
【0110】
図６に示すように、ＰＳＡＴ１サイレンシングされていないネガティブコントロール（ＮＣ）は、前記セリン欠乏ＭＥＭ培地と前記セリン含有ＭＥＭ培地とにおいて、ほぼ同様の結果であった。一方、ｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＳＡＴ１）でトランスフェクションした形質転換体は、前記セリン欠乏ＭＥＭ培地で培養した結果、ネガティブコントロールの形質転換体（ＮＣ）よりもＥＶ分泌量が減少した。そして、ｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＳＡＴ１）でトランスフェクションした形質転換体は、ＥＶ分泌量が、前記セリン含有ＭＥＭ培地の使用（つまり、セリンの添加）によって、前記セリン欠乏ＭＥＭ培地を用いた結果よりも有意に増加し、ネガティブコントロール（ＮＣ）と同程度の結果になった。これらの結果から、セリン合成がＥＶ分泌に関与しており、セリン合成の阻害によりＥＶ分泌を抑制できることがわかった。
【0111】
［実施例Ｂ２］
セリン合成経路における阻害剤を使用して、ＥＶ分泌への影響を確認した。
セリン合成経路における阻害剤を使用して、ＥＶ分泌への影響を確認した。
【0112】
前記阻害剤として、セリン合成経路における酵素タンパク質（ＰＨＧＤＨ）の阻害剤ＮＣＴ－５０３を使用した。
【化2】
【0113】
具体的には、以下のようにして試験を行った。大腸がん細胞ＨＣＴ１１６および肺がん細胞Ａ５４９を、それぞれ、６ウェルプレートに１．５×１０５細胞／ウェルとなるように播種し（Ｄａｙ０）、培地（ＤＭＥＭ ｗｉｔｈ １０％ ＦＢＳ， １ｘ ａｎｔｉ－ａｎｔｉ培地）で、２４時間インキュベートした。インキュベート後（Ｄａｙ１）、前記培地を除去してから、前記ウェルにセリン欠乏培地と阻害剤溶液とを添加した。前記阻害剤溶液は、ＮＣＴ－５０３をＤＭＳＯに溶解して調製し、前記ウェルあたりの阻害剤の濃度は、２．５μｍｏｌ／Ｌとした。そして、さらに４８時間のインキュベート後（Ｄａｙ３）、前記ウェル中の培地を回収し、前記ウェル中の細胞のカウントを行った。なお、ネガティブコントロール（ＮＣ）は、前記阻害溶液に代えてＤＭＳＯを添加した以外は、同様に行った。
【0114】
細胞内の蓄積ＥＶについては、以下のようにして分析を行った。すなわち、回収した細胞を免疫染色し、ＣＤ６３シングルポジティブの面積を、蛍光強度に基づいて測定し、核の数で割った値を、細胞内に蓄積されたＥＶ量として求めた。これらの結果を図７に示す。一方、分泌ＥＶについては、前記回収した培地からＥＶを回収し、ＮＴＡを行った。ＮＴＡによる分泌ＥＶ量は、ネガティブコントロールの分泌ＥＶ量を１として、相対値として求めた。この結果を図８に示す。
【0115】
まず、免疫蛍光観察の結果、がん細胞を阻害剤と共存させることによって、前記実施例Ａ３におけるＰＳＡＴ１サイレンシングの形質転換体の結果と同様に、ＣＤ６３陽性ＥＶの細胞内蓄積が確認された。この結果は、図７においても同様であった。すなわち、図７においても、阻害剤を共存させた細胞は、ＮＣと比較して、ＥＶ量が増加したことから、ＥＶが細胞内に蓄積され、分泌が阻害されていることが確認できた。また、これに対応して、図８に示すように、阻害剤を共存させた細胞の培地は、ＮＣと比較して、ＥＶ量が減少したことから、細胞からのＥＶ分泌が阻害されていることが確認できた。これらの結果からも、セリン合成の阻害によって、ＥＶ分泌が抑制できることがわかった。
【0116】
［実施例Ｃ］
様々ながん細胞を用いて、セリン合成によるＥＶ分泌の制御を確認した。なお、本実施例において、セリン合成経路の阻害としてＰＳＡＴ１サイレンシングを利用したが、前述のように、ＰＳＡＴ１のサイレンシングには限定されず、セリン合成の阻害であれば、同様にＥＶ分泌を抑制できることは確認済みである。
様々ながん細胞を用いて、セリン合成によるＥＶ分泌の制御を確認した。なお、本実施例において、セリン合成経路の阻害としてＰＳＡＴ１サイレンシングを利用したが、前述のように、ＰＳＡＴ１のサイレンシングには限定されず、セリン合成の阻害であれば、同様にＥＶ分泌を抑制できることは確認済みである。
【0117】
細胞として、大腸がん細胞株（ＨＣＴ１５、ＣＯＬＯ２０１、ＣＯＬＯ２０５、ＨＴ－２９）と正常大腸線維芽細胞（ＣＣＤ－１８ｃｏ）、肺がん細胞株（Ａ４２７、Ｈ１６５０、Ｈ２２２８）と正常肺上皮細胞を使用した。これらの細胞からトータルＲＮＡを調製し、ＰＳＡＴ１の発現レベルを確認したところ、大腸細胞および肺細胞ともに、正常細胞と比較して、がん細胞におけるＰＳＡＴ１の発現レベルは有意に高かった。また、大腸がんおよび肺がんの他に、卵巣がん、乳がん、メラノーマ、頭頚部がん、多発性骨髄腫、膵臓がんの細胞についても、同様に、正常細胞よりもがん細胞におけるＰＳＡＴ１の発現レベルが有意に高いことを確認した。また、肺がん患者におけるＰＳＡＴ１の発現レベルは、生存率と高い相関関係を示し、具体的には、発現レベルが高い程、生存率は低かった。
【0118】
そこで、本実施形態においては、前記実施例Ａ２と同様にして、前記各種がん細胞に、ｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＳＡＴ１）をトランスフェクションし、ＰＳＡＴ１サイレンシングした形質転換体について、ＮＴＡによりＥＶ分泌量の測定を行った。これらの結果を図９に示す。図９は、ＮＴＡ法による分泌ＥＶ量の相対値を示すグラフである。
【0119】
図９に示すように、いずれのがん細胞も、ｓｉＰＳＡＴ１をトランスフェクトした形質転換体（ｓｉＰＳＡＴ１）は、ネガティブコントロールの形質転換体（ＮＣ）より、分泌ＥＶ量が有意に抑制された。これらの結果から、様々ながん細胞のＥＶ分泌も、ＰＳＡＴ１の発現抑制によって抑制できることがわかった。このことから、ＰＳＡＴ１の発現を抑制することによって、セリン合成が阻害され、様々ながん細胞からのＥＶ分泌を抑制できることが確認できた。このため、ＰＳＡＴ１の発現抑制等によりセリン合成を阻害することで、これらの様々ながんの治療、他の器官へのがん転移の予防が可能であるといえる。
【0120】
［実施例Ｄ］
セリン合成経路における酵素タンパク質（ＰＨＧＤＨ）の阻害剤ＮＣＴ－５０３を使用して、in vivoにおける腫瘍体積の減少、ＥＶ分泌の抑制等を確認した。
セリン合成経路における酵素タンパク質（ＰＨＧＤＨ）の阻害剤ＮＣＴ－５０３を使用して、in vivoにおける腫瘍体積の減少、ＥＶ分泌の抑制等を確認した。
【0121】
乳がん転移株としてＭＤＡ－ＭＢ－２３１＿Ｌｕｃ＿Ｄ３Ｈ２ＬＮ細胞株（以下、Ｄ３Ｈ２ＬＮという）を使用した。この細胞株は、親株乳がん細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１の改変株であり、前記親株に対して有意にエクソソーム分泌量が多く、ＰＳＡＴ１の発現量が多いことを確認済みである。すなわち、前記親株と前記Ｄ３Ｈ２ＬＮについて、前記実施例Ａ１と同様にして、ＮＴＡ分析によりＥＶ分泌量を測定し、また、ウエスタンブロッティングによりＰＳＡＴ１の発現を測定した。この結果を図１０に示す。図１０において、（Ａ）は、ＮＴＡ法による分泌ＥＶ量の相対値を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＰＳＡＴ１タンパク質の発現を示すウェスタンブロットの写真である。図１０に示すように、Ｄ３Ｈ２ＬＮは、前記親株に対して、エクソソーム分泌量が有意に多く、ＰＳＡＴ１の発現量が有意に多いことを確認済みである。
【0122】
マウスとして、免疫不全マウスＣ．Ｂ－１７ ｓｃｉｄ ｍｏｕｓｅ（雌、６週齢）を使用した。前記Ｄ３Ｈ２ＬＮをＰＢＳで懸濁し、１×１０６細胞／１００μＬの細胞懸濁液を調製した。そして、０日（Ｄａｙ０）に、マウスの乳腺皮下に前記細胞懸濁液１００μＬを注射して移植した。そして、７日目（Ｄａｙ７）に、前記Ｄ３Ｈ２ＬＮの生着し、毎日、阻害剤投与群（ｎ＝６）を、体重１ｋｇあたり４０ｍｇの条件で、ＮＣＴ－５０３液（溶媒 ＰＢＳ）を腹腔内注射により投与した。非投与群（ｎ＝６、Vehicle）は、前記ＮＣＴ－５０３に代えて、毎日、同量のＰＢＳを投与した。前記投与群および前記非投与群ともに、１週間ごとにＩＶＩＳ―Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（住商ファーマインターナショナル株式会社）を用いて原発巣（乳腺）の腫瘍の体積を測定した。具体的には、前記腫瘍の長径と短径を用いた計算式（短径×短径×長径×０．５）により算出した。また、毒性の判定として、毎日、マウスの体重を測定した。３５日目（Ｄａｙ３５）に、マウスを屠殺し、原発巣である乳腺と、転移巣である肺を切除し、原発巣の重さを測定した。
【0123】
これらの結果を、図１１に示す。図１１において、（Ａ）は、Ｄａｙ２１およびＤａｙ３５におけるマウスの原発巣（乳腺）の腫瘍体積のグラフ（算出値）であり、（Ｂ）は、Ｄａｙ３５のマウスの原発巣（乳腺）の腫瘍重量のグラフ（実測値）である。
【0124】
図１１（Ａ）に示すように、前記阻害剤を投与した投与群は、前記非投与群と比較して、経時的に有意に原発巣の腫瘍の体積が減少した。また、図１１（Ｂ）に示すように、前記阻害剤を投与した投与群は、前記非投与群と比較して、原発巣の腫瘍の重量も有意に減少した。また、転移巣である肺をＨＥ染色で確認したところ、前記投与群の肺は、前記非投与群の肺と比較して転移巣が少ない傾向にあった。
【0125】
［実施例Ｅ］
セリン合成経路の酵素タンパク質であるＰＨＧＤＨについて、上述の実施例でＥＶ分泌抑制が確認されているＰＳＡＴ１をポジティブコントロールとして、それぞれの遺伝子（ＰＨＧＤＨ遺伝子およびＰＳＡＴ１遺伝子）の発現抑制による、がん細胞からのＥＶ分泌の抑制を確認した。特に示さない限りは、前記実施例Ｂ１の方法と同様に行った。
セリン合成経路の酵素タンパク質であるＰＨＧＤＨについて、上述の実施例でＥＶ分泌抑制が確認されているＰＳＡＴ１をポジティブコントロールとして、それぞれの遺伝子（ＰＨＧＤＨ遺伝子およびＰＳＡＴ１遺伝子）の発現抑制による、がん細胞からのＥＶ分泌の抑制を確認した。特に示さない限りは、前記実施例Ｂ１の方法と同様に行った。
【0126】
ＰＨＧＤＨ遺伝子は、ｓｉＲＮＡとしてｓｉＰＨＧＤＨ（製品番号Ｍ－９５１８－０１－００１０、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を使用した。ＰＳＡＴ１遺伝子は、前記実施例Ａと同様に、前記ｓｉＰＳＡＴ１を使用した。
【0127】
肺がん細胞Ａ５４９および大腸がん細胞ＨＣＴ１１６およびを、それぞれ、９６ウェルプレートに５×１０３細胞／ウェルとなるように播種し、また、６ウェルプレートに１．５×１０５細胞／ウェルとなるように播種し（Ｄａｙ０）、２４時間インキュベートした。培地は、ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）に１０％熱不活化ＦＢＳおよび抗生剤－抗真菌薬を添加したＤＭＥＭ完全培地を使用した。そして、Ｄａｙ１に、各細胞をｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＳＡＴ１またはｓｉＰＨＧＤＨ）または前記ＡＬＬ ＳＴＡＲネガティブコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクションし、さらに２４時間インキュベートした。インキュベート後（Ｄａｙ２）、ウェル中の培地をａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに４８時間インキュベーションした後（Ｄａｙ４）、前記９６ウェルプレートをＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法に使用し、前記６ウェルプレートから培養後の培地を回収した。前記回収した培地から分泌ＥＶを回収し、ＮＴＡを行った。また、前記６ウェルプレートで培養したＤａｙ４の細胞数をカウントし、前記ネガティブコントロールの細胞数を相対値１として生存率を算出した。
【0128】
図１２に肺がん細胞Ａ５４９の結果、図１３に大腸がん細胞ＨＣＴ１１６の結果を示す。図１２および図１３において、（Ａ）は、細胞生存率の結果であり、（Ｂ）は、ＮＴＡ法による分泌ＥＶ量の相対値を示すグラフである。
【0129】
いずれのがん細胞も、図１２（Ａ）および図１３（Ａ）に示すように、サイレンシングされていないコントロールと比較して、サイレンシングした形質転換体は、生存率がほとんど変化しなかった。また、図１２（Ｂ）（Ｃ）に示すように、コントロールと比較して、サイレンシングした形質転換体は、ＥＶ分泌が減少した。
【0130】
［実施例Ｆ］
前記実施例Ｂ２において、セリン合成経路のＰＨＧＤＨを阻害する阻害剤ＮＣＴ－５０３を用いて、がん細胞におけるＥＶ分泌を抑制できることが確認された。ここで、ＮＣＴ－５０３の添加によって、細胞が細胞死したことによりＥＶ分泌が抑制されたのではなく、がん細胞等の非正常細胞に特有のＥＶ分泌がセリン合成経路の阻害によって抑制されたことの補足データを示す。
前記実施例Ｂ２において、セリン合成経路のＰＨＧＤＨを阻害する阻害剤ＮＣＴ－５０３を用いて、がん細胞におけるＥＶ分泌を抑制できることが確認された。ここで、ＮＣＴ－５０３の添加によって、細胞が細胞死したことによりＥＶ分泌が抑制されたのではなく、がん細胞等の非正常細胞に特有のＥＶ分泌がセリン合成経路の阻害によって抑制されたことの補足データを示す。
【0131】
本例においては、がん細胞に特有のＥＶ分泌が抑制されたことの間接的なデータとして、正常細胞におけるＮＣＴ－５０３の影響を確認した。前記実施例Ｂ２では、ウェルの培地に対して２．５μｍｏｌ／ＬとなるようにＮＣＴ－５０３を添加した。そこで、肺（ＨＢＥＣ）および大腸（ＨＣｏＥｐｉＣ）のそれぞれの正常上皮細胞について、ＮＣＴ－５０３未添加（ＤＭＳＯ添加）の培地、または、所定の濃度（０．１５６２５～２．５μｍｏｌ／Ｌ）となるようにＮＣＴ－５０３を添加したＮＣＴ－５０３添加培地を用いて培養を行い、細胞生存率と、ＥｘｏＳｃｒｅｅｎによるＥＶ分泌量とを確認した。
【0132】
具体的には、正常以下のようにして試験を行った。前記正常上皮細胞を、９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルとなるように播種し（Ｄａｙ０）、培地で、２４時間インキュベートした（Ｄａｙ１）。前記大腸細胞に対する培地は、ＣｏＥｐｉＣＭ １ｘ ａｎｔｉ－ａｎｔｉ培地を使用し、前記肺細胞に対する培地は、ＢＥＢＭ １ｘ ａｎｔｉ－ａｎｔｉ培地を使用した。前記インキュベート後、細胞の接着を確認し、さらに、ＮＣＴ－５０３が２．５μｍｏｌ／Ｌとなるように、前記実施例Ｂ２と同様にして前記阻害剤溶液（ＮＣＴ－５０３／ＤＭＳＯ）を添加し、さらにさらに４８時間のインキュベートを行った（Ｄａｙ３）。そして、前記ウェル中の培地を回収し、前記ウェル中の細胞のカウントを行った。また、コントロールとして、前記阻害剤溶液に代えてＤＭＳＯを添加した以外は、同様として、前記ウェル中の細胞のカウントを行った。そして、コントロールの前記ＮＣＴ未添加（０Ｍ）培地（すなわちＤＭＳＯ添加培地）における細胞数を相対値１として、細胞生存率を算出した。また、ＥｘｏＳｃｒｅｅｎによりＥＶ分泌量を測定した。
【0133】
これらの結果を図１４に示す。図１４は、細胞１個あたりのＥＶ分泌量を示すグラフであり、（Ａ）は、大腸の正常上皮細胞の結果であり、（Ｂ）は、肺の正常上皮細胞の結果である。その結果、前記ＮＣＴ－５０３添加培地のＥＶ分泌量は、ＮＣＴ未添加（０Ｍ）であるＤＭＳＯ添加培地のＥＶ分泌量に対して、大腸および肺の正常上皮細胞はいずれも、ほとんど差は見られなかった。具体例として、例えば、２．５μｍｏｌ／ＬのＮＣＴ－５０３を添加した場合、前記ＮＣＴ－５０３添加培地のＥＶ分泌量は、ＮＣＴ未添加（０Ｍ）のＤＭＳＯ添加培地のＥＶ分泌量に対して、大腸の正常上皮細胞では、相対値０．９８、肺の正常上皮細胞では、相対値１．１７であり、ほとんど差は見られなかった。つまり、ＮＣＴ－５０３の添加は、正常上皮細胞におけるＥＶ分泌には影響を与えなった。これらの結果に対して、前記実施例Ｂ２では、がん細胞に対して、２．５μｍｏｌ／Ｌ ＮＣＴ－５０３を添加することによって、ＮＣＴ－５０３の溶媒であるＤＭＳＯのみを添加したコントロールと比較して、ＥＶ分泌は有意に抑制できた。これらの結果から、がん細胞におけるＮＣＴ－５０３の添加によるＥＶ抑制は、細胞死によるものではなく、細胞のがん化によりセリン合成系の発現がアップレギュレートされ、それに対して前記合成系のＰＨＧＤＨが阻害剤ＮＣＴ－５０３により阻害され、結果的に、ＥＶ分泌が抑制されたということが確認された。
【0134】
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
【0135】
この出願は、２０２０年４月７日に出願された日本出願特願２０２０－０６９３９２および２０２１年２月１６日に出願された日本出願特願２０２１－０２２８２５を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【0136】
本発明によれば、セリン合成経路の阻害によって、細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制できる。このため、本発明により分泌抑制を行うことで、細胞外小胞の分泌または分泌の抑制が生体に与える影響を解析することが可能になる。したがって、本発明は、例えば、医療分野において非常に有用な技術といえる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】