特許 7442874 アルツハイマー病における標的としてのＴＰＫの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-02-26

(45)【発行日】2024-03-05

(54)【発明の名称】アルツハイマー病における標的としてのＴＰＫの使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20240227BHJP

   A61K 38/45 20060101ALI20240227BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240227BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20240227BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240227BHJP

   A01K 67/0276 20240101ALI20240227BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240227BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20240227BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240227BHJP

   C12N 9/12 20060101ALN20240227BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61K38/45

A61P25/28

G01N33/15 Z

C12Q1/02

A01K67/0276 ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/10 200Z

A61K45/00

C12N9/12

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2022506763

(86)(22)【出願日】2020-07-29

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-04

(86)【国際出願番号】 CN2020105353

(87)【国際公開番号】W WO2021023069

(87)【国際公開日】2021-02-11

【審査請求日】2022-03-25

(31)【優先権主張番号】201910711540.3

(32)【優先日】2019-08-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202010038537.2

(32)【優先日】2020-01-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】522044799

【氏名又は名称】シャンハイ、レイジング、ファーマシューティカル、カンパニー、リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＲＡＩＳＩＮＧ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100091487

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 行孝

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】チョン、チュンチウ

(72)【発明者】

【氏名】サン、シャオミン

【審査官】渡邉 潤也

(56)【参考文献】

【文献】Neurological Research，2018年，40(8)，pp.658-665

【文献】Alzheimer's Research & Therapy，2018年，10，26，pp.1-13

【文献】PLoS ONE，2017年，12(1)，e0167273, pp.1-13

【文献】Biol Res.，2018年，51，35, pp.1-9

【文献】Oncotarget，2017年，8(7)，pp.12081-12092

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ

Ａ０１Ｋ

Ｃ１２Ｎ

Ｃ１２Ｑ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

チアミンピロホスホキナーゼ（ＴＰＫ）またはＴＰＫ発現ベクターを含む、アルツハイマー病の予防又は治療のための医薬。

【請求項2】

脳内のＴＰＫタンパク質のキナーゼ活性及び／又は発現レベルを促進するための、請求項１記載の医薬。

【請求項3】

アルツハイマー病を予防又は治療するための医薬をインビトロまたはエクスビボでスクリーニングする方法であって、
被検化合物についてチアミンピロホスホキナーゼ（ＴＰＫ）のキナーゼ活性及び／又は発現レベルを測定する工程、および
前記被検化合物から、チアミンピロホスホキナーゼ（ＴＰＫ）のキナーゼ活性及び／又は発現レベルを促進する試薬を選択する工程
を含む、方法。

【請求項4】

前記試薬が、チアミンピロホスホキナーゼ（ＴＰＫ）タンパク質を調節する試薬及び／又はチアミンピロホスホキナーゼ（ＴＰＫ）遺伝子を調節する試薬である、請求項３記載の方法。

【請求項5】

標的動物においてＴＰＫ遺伝子のノックアウトにより動物モデルを構築することを特徴とする、アルツハイマー病の動物モデル構築方法。

【請求項6】

標的動物が齧歯類であることを特徴とする請求項５記載の動物モデルの構築方法。

【請求項7】

前記齧歯類がマウスであることを特徴とする請求項６に記載の動物モデルの構築方法。

【請求項8】

ＴＰＫ遺伝子のエクソン４をノックアウトすることを特徴とする請求項５記載の動物モデルの構築方法。

【請求項9】

遺伝子ノックアウトのためのターゲティングベクターＴＰＫ－ｌｏｘｐを構築し、該ターゲティングベクターを標的動物に導入してＴＰＫ－ｌｏｘＰ＋／＋標的動物を得る工程を含むことを特徴とする請求項５に記載の動物モデル構築方法。

【請求項10】

前記標的化ベクターの配列が配列番号１に記載されていることを特徴とする、請求項９に記載の動物モデル構築方法。

【請求項11】

ＴＰＫ－ｌｏｘＰ＋／＋標的動物とＣａｍＫ２α－Ｃｒｅ／ＥＲＴ２＋／－標的動物とを交配し、ＴＰＫ遺伝子の条件付きノックアウトがされた、ＣａｍＫ２α－Ｃｒｅ／ＥＲＴ２＋／－；ＴＰＫ－ｌｏｘＰ＋／＋標的動物を得る工程をさらに含むことを特徴とする請求項９記載の動物モデル構築方法。

【請求項12】

アルツハイマー病の研究における、請求項５～１１のいずれか一項記載の動物モデルの構築方法により得られる動物モデルの使用。

【請求項13】

細菌人工染色体をベクターとして用い、ＴＰＫ遺伝子のエクソンに相同な配列の両端にネオマイシン耐性遺伝子配列と共に直接ｌｏｘＰ配列を挿入することを特徴とする、アルツハイマー病の動物モデルのターゲティングベクターの構築方法。

【請求項14】

前記エクソンがエクソン４であることを特徴とする、請求項１３に記載の標的ベクターの構築方法。

【請求項15】

ターゲティングベクターの配列が配列番号１に記載されていることを特徴とする、請求項１４に記載のターゲティングベクター構築方法。

【請求項16】

請求項１３～１５のいずれかに記載の構築方法によって構築された標的化ベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１９年８月２日に中国特許庁に出願された中国特許出願第２０１９１０７１１５４０．３号（「動物モデルを構築するための方法及び対応するモデルの使用」を主題とする）、及び２０２０年１月１４日に中国特許庁に出願された中国特許出願第２０２０１００３８５３７．２号（「アルツハイマー病における標的としてのＴＰＫの使用」を主題とする）の優先権を主張するものであり、これらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明の分野
本発明は、医学の分野、特にアルツハイマー病における標的としてのＴＰＫの使用に関する。

【背景技術】

【0003】

背景
アルツハイマー病（ＡＤ）は最も一般的な認知症であり、主に認知と記憶の慢性的かつ進行性の退行と人格の変化を特徴とします。２０１５年までに世界中で５０００万人以上のＡＤ患者がおり、その発生率は６５歳以上の人々の年齢とともに増加しました。世界的な高齢化の継続的な進展に伴い、ＡＤは社会や家族に大きな経済的・精神的負担をもたらしている。

【0004】

ＡＤはニューロンの喪失、グリア細胞の活性化、アミロイドβタンパク質（Ａβ）の細胞外沈着による特徴的な老人病斑、細胞内Ｔａｕタンパク質の高リン酸化による神経原線維変化等様々な病態生理学的変化を伴う疾患である。さらに、シナプスの喪失、脳グルコース代謝異常、酸化ストレス等もＡＤ脳では恒常的な病的変化であり、患者における脳グルコース代謝の低下は認知障害と密接に関連している。

【0005】

病因が明らかにされていないことから、ＡＤの治療法は依然として確立されていない。従来の「Ａβカスケード仮説」は、常に、ＡＤの病因を説明する最も有力な理論である。これに基づいて種々のトランスジェニック動物モデルが開発され、医薬品開発のための実験が行われてきたが、現在のところ、第ＩＩ／ＩＩＩ相臨床試験で全て終了したか、あるいは失敗に終わっている。また、Ｔａｕタンパク質の異常な蓄積を抑制するような他の新規な医薬品についても、目的とする結果が得られていない。ＡＤのメカニズムや医薬品に関する研究の進展には多くの制約要因があり、その第一は医薬品の標的の選択である。ＡＤは様々な病態変化を伴う疾患であり、単一の標的に対する医薬品は、病気の進行を完全に阻止することができず、新たな治療標的の開発が必要である。さらに、既存のＡＤ研究用動物モデルは主に遺伝的背景に基づいて確立されたものであり、より正確に言えば、それらはＡＤの動物モデルというよりもＡβカスケード仮説のモデルであり、ＡＤ脳における複数の病態変化を完全にシミュレートすることはできず、また、既存の動物モデルで有効であることが立証された医薬品は臨床試験で期待された結果を達成することができない。それは、現在、ＡＤの好適な動物モデルを見つけるための喫緊の課題である。

【発明の概要】

【0006】

発明の要旨
この観点から、発明の特定の実施形態は、アルツハイマー病を治療又は予防する際の新規な標的としてのＴＰＫの使用を提供し、その特定の技術的解決策は以下のとおりである：

【0007】

アルツハイマー病の治療又は予防における標的としてのＴＰＫ遺伝子又はタンパク質の使用。

【0008】

ＴＰＫ遺伝子又はタンパク質を標的として、脳におけるＴＰＫタンパク質のキナーゼ活性及び／又は発現レベルが促進されてもよい。

【0009】

アルツハイマー病を予防又は治療するための医薬における標的としてのＴＰＫ遺伝子又はタンパク質の使用、又はその医薬のスクリーニング又は調製におけるＴＰＫ遺伝子又はタンパク質の使用。

【0010】

薬物は、ＴＰＫ遺伝子又はタンパク質を標的として、脳におけるＴＰＫタンパク質のキナーゼ活性及び／又は発現レベルを促進するものであってもよい。

【0011】

アルツハイマー病を予防又は治療するための医薬の調製における、脳におけるＴＰＫタンパク質のキナーゼ活性及び／又は発現レベルを促進する試薬の使用。

【0012】

脳におけるＴＰＫタンパク質のキナーゼ活性及び／又は発現レベルを促進する試薬は、ＴＰＫタンパク質を調節する試薬及び／又はＴＰＫ遺伝子を調節する試薬であってもよい。

【0013】

アルツハイマー病を予防又は治療するための医薬であって、ＴＰＫ遺伝子又はタンパク質を標的として、脳内のＴＰＫタンパク質のキナーゼ活性及び／又は発現レベルを促進する医薬。

【0014】

アルツハイマー病の動物モデルを構築する際の標的としてのＴＰＫ遺伝子又はタンパク質の使用。

【0015】

ＴＰＫ遺伝子を標的動物においてノックアウトして動物モデルを構築する動物モデルの構築方法。

【0016】

標的動物は齧歯類であってもよい。

【0017】

齧歯類はマウスであってもよい。

【0018】

ＴＰＫ遺伝子のエクソン４をノックアウトしてもよい。

【0019】

本方法は、遺伝子ノックアウトのための標的ベクターＴＰＫ－ｌｏｘＰを構築するステップと、標的ベクターを標的動物に導入してＴＰＫ－ｌｏｘＰ＋／＋標的動物を得るステップとを含んでいてもよい。

【0020】

ターゲティングベクターの配列は配列番号１に記載されるものであってもよい。

【0021】

本方法はさらに、ＴＰＫ－ｌｏｘＰ＋／＋標的動物をＣａｍＫ２α－Ｃｒｅ／ＥＲＴ２＋／－標的動物と交配し、ＴＰＫ遺伝子の条件付きノックアウトを有するＣａｍＫ２α－Ｃｒｅ／ＥＲＴ２＋／－；ＴＰＫ－ｌｏｘＰ＋／＋標的動物を得る工程を含んでいてもよい。

【0022】

非疾患治療目的の神経変性疾患の研究における動物モデルの構築のための上記方法により得られた動物モデルの使用。

【0023】

神経変性疾患はアルツハイマー病であってもよい。

【0024】

動物モデルのためのターゲティングベクターを構築する方法であって、細菌人工染色体をベクターとして用い、ＴＰＫ遺伝子のエクソンと相同な配列の両端に、ネオマイシン耐性遺伝子配列と共に直接ｌｏｘＰ配列を挿入する、方法。

【0025】

エクソンはエクソン４であってもよい。

【0026】

ターゲティングベクターの配列は配列番号１に記載されるものであってもよい。

【0027】

動物モデルのためのターゲティングベクターを構築するための、上記方法により構築されたターゲティングベクター。

【0028】

本発明は、ＡＤの新規な治療標的を提供し、本発明の特定の実施形態は、脳におけるＴＰＫタンパク質のキナーゼ活性及び／又は発現レベルを促進することによって、ＴＰＫタンパク質レベルに対する阻害によって引き起こされるＡＤ症状（例えば、認知退行、ニューロンの喪失、グリア細胞の活性化、シナプス機能障害、Ａβの蓄積の増加、タウタンパク質の異常なリン酸化の増加等を引き起こすチアミン代謝異常、グルコース代謝異常）を治療又は予防することができる。ＡＤ研究のための既存の動物モデルの制限及び現在のチアミン欠乏動物モデルの欠点に関して、本発明の特定の実施形態の動物モデルの構築方法は、ＴＰＫ遺伝子ノックアウトによって、脳のグルコース代謝の低下が誘導され、認知退行を引き起こす、ニューロンの喪失、グリア細胞の活性化、シナプス機能障害、Ａβの増加、タウタンパク質の異常なリン酸化の増加等を引き起こす、新規な脳のチアミン欠乏動物モデルを構築する。動物モデルは、ＡＤ様の慢性の複数の病態生理学的変化をシミュレートすることができ、ＡＤの発生及び発達におけるＴＤＰ欠乏及びグルコース代謝異常の役割並びに異なるＡＤの病態生理学的変化間の相関を研究するために使用することができ、ＡＤ研究を広げ、ＡＤの病因を研究し、疾患の診断のための新規な分子マーカー及び医薬品の治療標的等を探索するために非常に重要な科学的意義及び応用価値を有する。

【0029】

図面の簡単な説明
本発明の実施例又は先行技術の技術的解決手段をより明確に説明するために、実施例で使用される図面を以下に簡単に示す。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】図１は、実施例１のＴＤモデルのマウスにおける脳、血液、肝臓及び腎臓におけるＴＤＰ、ＴＭＰ及びＴＭレベルの比較を示す。

【図2】図２は、実施例１のＰＴＤモデルのマウスにおける脳、血液、肝臓及び腎臓におけるＴＤＰ、ＴＭＰ及びＴＭレベルの比較を示す。

【図3】図３は、実施例１における正常マウスの脳及び血液、肝臓及び腎臓におけるＴＰＫ酵素の活性の比較を示す。

【図4】図４は、Ａｍｐがアンピシリン耐性遺伝子配列であり、ＮｏｔＩが制限エンドヌクレアーゼ標的部位であり、３’アーム及び５’アームがエクソン４に隣接する相同配列であり、Ｎｅｏ Ｃａｓｓｅｔｔｅがネオマイシン耐性遺伝子コード配列であり、ｌｏｘＰ配列がノックアウトされる断片を位置決定し標的化するためのものであり、ＦｒｔがＦｌｐがＮｅｏ配列を切断するための認識部位である、実施例２において使用される標的ベクターのプラスミドマップを示す。

【図5】図５は、実施例２におけるＣａｍＫ２α－Ｃｒｅ／ＥＲＴ２＋／－；ＴＰＫ－ｌｏｘＰ＋／＋マウスの調製のための簡単なフローチャートを示し、ここで、１は、得られた標的ベクターの胚性幹細胞への電気的形質転換であり；２は、正しい陽性クローンの選択であり；３は、Ｎｅｏ配列を除去してＣａｍＫ２α－Ｃｒｅ／ＥＲＴ２＋／－；Ｔｐｋ－ｌｏｘＰ＋／＋マウスを得るためのＦｌｐマウスとの交配である。

【図6】図６はＴＰＫ及びＴＤＰ発現に対するＴＰＫ遺伝子ノックアウトの影響を示し、ここで、ａはＷＴマウスがＴＰＫ^{ｆｌ／ｆｌ}マウス、すなわちＴＰＫ－ｌｏｘＰ＋／＋マウスであり、ＣａｍｋＩＩ－ＫＯマウスがＣａｍＫ２α－Ｃｒｅ／ＥＲＴ２＋／－であり；Ｔｐｋ－ｌｏｘＰ＋／＋マウスがＴＰＫノックアウトマウスであり；ｂはＴＰＫ－ｆｌｏｘマウスの遺伝子ノックアウト構造を示し；ｃ－ｄはＣａｍｋＩＩ－ＫＯマウス及びＷＴマウスにおけるＴＰＫ酵素活性の発現量の比較を示し；ｅ－ｆはＣａｍｋＩＩ－ＫＯマウス及びＷＴマウスにおけるＴＤＰ、ＴＭＰ及びＴＭの発現量の比較、ｇ－ｉはＣａｍＫ２α－Ｃｒｅ／ＥＲＴ２＋／－マウスをルシフェラーゼレポーターマウスＡｉ９と交配して得られたＣａｍＫ２α－Ｃｒｅ／ＥＲＴ２＋／－を示し；ＣｒｅはＡｉ９マウスでは主に皮質と海馬で発現しているが、小脳と脳幹では発現していない。

【図7】図７は、実施例２において、ＴｏｍａｘｉｆｅｎがＴＰＫ遺伝子ノックアウトを誘導してからそれぞれ１、２、２．５ヶ月後に実施したＦＤＧ－ＰＥＴ検査、耐糖能異常並びに体重変化及び空腹時血糖変化を示し、ここで、ａ－ｆは、ＴｏｍａｘｉｆｅｎがＴＰＫ遺伝子ノックアウトを誘導してから１、２、２．５ヶ月後の脳領域におけるグルコース代謝の変化のＦＤＧ－ＰＥＴ評価であり；ｇ－ｊは、ＴｏｍａｘｉｆｅｎがＴＰＫ遺伝子ノックアウトを誘導してから１、２、２．５ヶ月後の耐糖能異常であり；ｋ－ｌは、ＴｏｍａｘｉｆｅｎがＴＰＫ遺伝子ノックアウトを誘導してから１、２、２．５ヶ月後の体重変化及び空腹時血糖変化である。

【図8】図８は、実施例２におけるＴＰＫ遺伝子ノックアウト後の解糖及びトリカルボン酸回路障害の結果を示す。

【図9】図９は実施例２におけるＴＰＫ遺伝子ノックアウト前後の病理検査の結果を示し、ここで、ａ－ｃはＴＰＫ遺伝子ノックアウトマウスの皮質表面積及び重量の変化を示し；ｄはＴＰＫ遺伝子ノックアウトマウスのニューロンの変化を示し；ｅはＴＰＫ遺伝子ノックアウトマウスのＴｕｎｅｌ陽性細胞の変化の結果を示し；ｆはＴＰＫ遺伝子ノックアウトマウスの認知障害結果のＹ迷路評価を示す。

【図10】図１０は、実施例２におけるＴＰＫ遺伝子ノックアウト前後に引き起こされるＡβ及びタウの病的変化の結果を示し、ここで、ａ－ｃはＴＰＫ遺伝子ノックアウト前後の可溶性及び不溶性のＡβ４０及びＡβ４２レベル並びにＡβ４０／Ａβ４２比のＥＬＩＳＡ検出を示し；ｄ－ｅはＷＢ及びＲＴ－ＰＣＲ検出によるＴＰＫ遺伝子ノックアウト前後の海馬及び皮質におけるＡＰＰ及びＢａｃｅｌのタンパク質発現レベル及びｍＲＮＡレベルの変化を示し；ｆは免疫蛍光染色検出によるＴＰＫ遺伝子ノックアウト前後の皮質及び海馬におけるリン酸化Ｔａｕレベルの変化を示す。

【図11】図１１は、実施例２におけるＴＰＫ遺伝子ノックアウト前後に引き起こされた血管の神経炎症応答及び機能障害の結果を示し、ここで、ａ－ｄは、ＩＨＣ検出によるＴＰＫ遺伝子ノックアウト前後のマウス皮質及び海馬におけるミクログリア細胞及びアストロサイトの活性化及び増殖を示し；ｅ－ｆは、ＲＴ－ＰＣＲ検出によるＴＰＫ遺伝子ノックアウト前後のマウス海馬及び皮質におけるＩｂａｌ及びＧＦＡＰ ｍＲＮＡレベルを示し；ｇ－ｊは、免疫蛍光染色検出によるＴＰＫ遺伝子ノックアウト前後のマウス皮質及び海馬における血管形態及び血管ＩｇＧ漏出を示す。

【図12】図１２は、実施例３におけるＴＰＫ過剰発現プラスミドを示す。

【図13】図１３は、実施例３における２４時間後及び４８時間後のＨＥＫ２９３－ＡＰＰ細胞株におけるＴＰＫ過剰発現プラスミド及びその対照群のＷＢ検出結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0031】

具体的な実施形態
ＡＤ患者は、脳内に複数のカスケード型病態生理学的変化を有しており、脳グルコース代謝異常は、その一貫した病理学的特徴であり、認知機能の退行と密接に関連し、臨床症状より何年も前から現れる。グルコースは、脳内細胞の主要なエネルギー基質であり、グルコース代謝の中間産物も神経伝達物質の合成の基質を提供する。脳内グルコース代謝は主に２つのプロセスを含み、それは、それぞれ、膜透過輸送とグルコースの細胞内代謝である。ＡＤ患者の細胞内グルコース利用障害は、主にグルコース代謝の主要な酵素であるトランスケトラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、α－ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性低下によるものである。チアミン二リン酸（ＴＤＰ）は、チアミンの主要な活性化型であるが、これら３つの主要な酵素の共通の補酵素であり、グルコース代謝に重要な役割を果たしている。上記の３つの主要な酵素の活性低下及びＴＤＰの顕著な欠落は、ＡＤ患者に特異的かつ普遍的であり、血管性認知症、前頭側頭型認知症、パーキンソン病の患者には存在しない。チアミンピロホスホキナーゼ（ＴＰＫ）は、ＴＤＰ合成の主要な酵素であるのみならず、脳内におけるＴＤＰの恒常性を維持するための重要な因子である。本発明者は、さらなる研究を通じて、ＴＤＰレベルの欠乏による脳グルコース代謝の低下がＡＤの発症に関連すること、ＡＤがＴＰＫタンパク質の発現に関連することを見出した。さらに、ＴＰＫ遺伝子ノックアウトによる脳内ＴＰＫタンパク質量の抑制は、明らかにチアミン代謝障害、グルコース代謝異常をもたらし、さらに重要なことは、ＡＤ様の神経変性疾患、脳萎縮、Ａβやタウの病理学的変化、神経炎症、神経血管障害を誘導することができる。したがって、ＴＰＫ遺伝子又はタンパク質は、ＡＤにおいて非常に重要な役割を果たし、それゆえ、ＡＤを治療及び予防するための新しい標的となる。ＴＰＫ遺伝子又はタンパク質を標的として脳内のＴＰＫタンパク質のキナーゼ活性及び／又は発現量を促進させることにより、ＴＰＫタンパク質阻害によるＡＤを予防することができる。標的動物におけるＴＰＫ遺伝子ノックアウトによる動物モデルの構築方法により得られた動物モデルは、神経変性疾患の研究、特にアルツハイマー病の研究に用いることができ、これには、疾患治療研究及び非疾患治療研究を含む。動物モデルにおける非疾患治療研究には、具体的には、例えば、１）神経変性疾患のメカニズムを調査及び／又は研究すること、２）神経変性疾患を治療することができる産物を調製及び／又はスクリーニングすること、３）神経変性疾患を診断及び／又は示唆することができる分子マーカーを探索及び検証すること、等が含まれる。

【0032】

本発明の特定の実施形態において、脳におけるＴＰＫタンパク質の発現レベルの促進は、限定されるものではないが、ＴＰＫタンパク質の発現を阻害から予防すること、ＴＰＫタンパク質の発現レベルを増加させること、ＴＰＫタンパク質の活性を増加させること、又はＴＰＫタンパク質の安定性を増加させることを含む。

【0033】

本発明の特定の実施形態において、脳におけるＴＰＫタンパク質の発現レベルを促進する試薬は、ＴＰＫタンパク質を調節する試薬であってもよく、またＴＰＫ遺伝子を調節する試薬であってもよい。この試薬は、限定されるものではないが、脳におけるＴＰＫタンパク質の発現レベルを促進するための促進剤、アゴニスト、アクチベーターを含む。試薬は、化合物、化学的小分子、生体分子等であってもよく、具体的には、例えば、ＴＰＫタンパク質を調節する試薬（例えば、ＴＰＫ結合タンパク質）、ＴＰＫ、又はＴＰＫを改変するための酵素等の化学的アゴニスト、ＴＰＫ遺伝子を調節する試薬（例えば、ＴＰＫ遺伝子の複製又は転写を活性化する物質、ＴＰＫ遺伝子の発現を増加させる物質、ＴＰＫ遺伝子のプロモーターを促進する上方調節剤、ＴＰＫ遺伝子の特異的過剰発現のためのタンパク質）であってもよい。

【0034】

本発明の特定の実施形態において、医薬は、脳におけるＴＰＫタンパク質の発現レベルを促進する安全かつ有効な用量の試薬及び薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。医薬製剤は、通常、投与に適合し、製剤の剤形は、注射剤、経口製剤（錠剤、カプセル剤、経口液剤）、経皮製剤又は徐放性製剤であり得る。

【0035】

本発明の特定の実施形態において、標的動物は、霊長類又は齧歯類等を含む非ヒト動物であり、さらにマウスである。本方法では、ＴＰＫ遺伝子のエクソン４をノックアウトし、マウスでは、ＴＰＫ遺伝子は合計９個のエクソンを有し、ＡＴＧはエクソン２に位置し、終止コドンはエクソン９に位置し、エクソン４がノックアウトの標的として選択される一方で、ノックアウトされたエクソン配列は３の整数倍ではなく、下流の読み枠にフレームシフト変異を生じさせることができる；他方で、選択されたエクソンが翻訳開始部位に近いほど、遺伝子の機能は保持されにくい。

【0036】

本発明の特定の実施形態は、改変Ｃｒｅ－ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を用いて、ＴＰＫ遺伝子の条件付きノックアウトのための動物モデルを確立することができるものであり、ＴＰＫ－ｌｏｘＰ遺伝子ノックアウトのための標的ベクターを構築し、該標的ベクターを標的動物に導入してＴＰＫ－ｌｏｘＰ＋／＋標的動物を得て、該ＴＰＫ－ｌｏｘＰ＋／＋標的動物とＣａｍＫ２α－Ｃｒｅ／ＥＲＴ２＋／－標的動物と交配してＴＰＫ遺伝子の条件付きノックアウトを有するＣａｍＫ２α－Ｃｒｅ／ＥＲＴ２＋／－；ＴＰＫ－ｌｏｘＰ＋／＋標的動物をするステップを含む。特に、ベクターとして細菌人工染色体を用いることができ、適当なエクソンの相同配列に並列して直接ｌｏｘＰ配列及びネオマイシン耐性遺伝子の配列を挿入し；標的ベクターを胚性幹（ＥＳ）細胞にエレクトロトランスフォーメーションにより形質転換し；正しい部位に位置する正しい配列で形質転換されたＥＳ細胞を抗生物質耐性のスクリーニング、ＰＣＲ及びサザンブロットにより同定し；陽性クローンを標的動物の胚盤胞にマイクロインジェクトし、成功裏にインジェクトされた胚盤胞を標的動物の子宮内に移植して、ＥＳ細胞を組み込まれたキメラ標的動物を作製し；得られたキメラ標的動物をＦｌｐツール標的動物と交配し、ネオマイシン耐性遺伝子の配列を誘導により切断し、精製してノックアウト能を有するＴＰＫ－ｌｏｘＰ＋／＋標的動物を得ることができ；変異型エストロゲン受容体エレメント（ＬＢＤ－ＥＲ）とを組み合わせたＣａｍＫ２αを有するＣｒｅツール標的動物を上記ＴＰＫ－ｌｏｘＰ＋／＋標的動物と交配するために選択し；同定した上で安定に遺伝したＣａｍＫ２α－Ｃｒｅ／ＥＲＴ２＋／－；ＴＰＫ－ｌｏｘＰ＋／＋標的動物が得られる。

【0037】

本発明の特定の実施形態では、細菌人工染色体をベクターとして用い、ＴＰＫ遺伝子のエクソンに相同な配列の両端に、ネオマイシン耐性遺伝子配列とともに直接ｌｏｘＰ配列を挿入した、動物モデルのターゲティングベクターの構築方法を提供する。

【0038】

本発明の動物モデルのための標的ベクターを構築するための方法の特定の実施形態において、エクソンはエクソン４であり、以下の標的配列が構築される：「５’－相同アーム－ｌｏｘＰ－エクソン４－ｆｒｔ－ネオ－ｆｒｔ－ｌｏｘＰ－相同アーム－３’」。

【0039】

本発明の動物モデルのための標的ベクターを構築するための方法の特定の実施形態において、標的ベクターの配列は配列番号１に記載される。

【0040】

本発明の特定の実施形態では、上記動物モデルの標的化ベクターの構築方法によって得られる動物モデルの標的化ベクターも提供される。

【実施例】

【0041】

本発明は、以下の実施例に基づいてさらに説明される。

【0042】

例１
単純チアミン食欠乏（ＴＤ）モデル、及びピリチアミン注入（ＰＴＤ）と組み合わせた、チアミン食欠乏モデルを用いて、それぞれ、実験を行った。ＴＤ及びＰＴＤモデルの動的変化を追跡した。ＴＤ １１日、１８日、２６日及びＰＴＤ ７日、１１日を含む６群（ｎ＝４）を比較のために設定した。同日に出生し、体重が類似している３か月齢のＣ５７マウスを選択した。グループ分けに応じて異なるモデリング開始時点を選択し、最終的には同日にモデリングを完了し、サンプリングも同様とした。ＴＤモデル：正常飲料水及びチアミン欠乏飼料でそれぞれ１１日間、１８日間及び２６日間モデリング；ＰＴＤモデル：正常飲料水、チアミン欠乏飼料、及び５００μｇ／（ｋｇ・ｄ）の用量で０．１ｍｇ／ｍＬのＰＴ（ピリチアミン）の毎日の腹腔内注射でそれぞれ７日間及び１１日間モデリング；対照群：正常飲料水、正常飼料及び正常生理食塩水の腹腔内注射。モデリングが完了したら、マウスをイソフルランの吸入で麻酔し、眼を摘出し、ヘパリン抗凝固剤を含む試験管に採血し、それを急速に転倒させて混合した。１５０μＬ全血に等量の７．５％ＰＣＡを添加し、ボルテックスで混合した。マウスを氷上で頸椎脱臼により急速に屠殺し、脳、腎臓、肝組織等を採取して重量を測定した。組織の重量を記録した。組織をＫＨ２ＰＯ４と、組織：（ｍｇ）ＫＨ２ＰＯ４（μＬ）＝１００：９００の比で混合し、７０Ｈｚで９０秒間、組織グラインダーで粉砕し、３０分間完全に粉砕した後に氷浴に供し、使用するまで－８０℃で保存した。ＴＤ及びＰＴＤモデルにおいて、マウスの脳、血液、肝臓、及び腎臓におけるＴＤＰ、ＴＭＰ及びＴＭ活性の比較を図１及び図２に示し、正常マウスの脳、血液、肝臓、及び腎臓におけるＴＰＫ活性の比較を図３に示した。

【0043】

以上の実験から、ＴＤモデルでは、血液、肝臓、腎臓と比較して、脳においてＴＤＰレベルの低下が有意に遅いという特徴が示され、脳におけるＴＤＰの喪失に対する保護が示唆された（図１参照）。ＰＴＤモデルでは、ＴＰＫの特異的阻害剤であるＰＴが、体内のＴＤＰのホメオスタシス、特に脳におけるＴＤＰレベルを損傷する可能性がある（図２参照）。正常マウスの異なる組織でのチアミンピロホスホキナーゼ（ＴＰＫ）活性のさらなる検出により、ＴＰＫ活性が脳で最も高いことが見出され（図３）、脳組織に特異的なＴＰＫの高い活性が脳におけるＴＤＰホメオスタシス維持の鍵であったと推測される。

【0044】

例２
１．ターゲティングベクターの構築
ベクターには細菌人工染色体（ＢＡＣ）を用い、エクソン４に隣接するイントロンを相同アームとして構築した標的配列「５’－相同アーム－ｌｏｘＰ－エクソン４－ｆｒｔ－Ｎｅｏ－ｆｒｔ－ｌｏｘＰ－相同アーム－３’」を挿入し、遺伝子ノックアウトのための標的ベクターを構築する（図４参照）。

【0045】

２．ＣａｍＫ２α－Ｃｒｅ／ＥＲＴ２＋／－；ＴＰＫ－ｌｏｘＰ＋／＋マウスの構築（図５参照）
ＴＰＫ－ｆｌｏｘＰ＋／－胚幹細胞の入手及びスクリーニング
（１）マウス胚性幹細胞（ＥＳ）の作製
栄養膜細胞としての一次マウスはい線維芽細胞を、ＥＳ細胞を解凍する前日に０．１％ゼラチンで処理した皿に接種し、１０００Ｕ／ｍＬの濃度でＬＩＦを添加した細胞培養ブロス中で培養した。

【0046】

（２）ＥＳ細胞の形質転換
［１］ＥＳ細胞をパンクレアチンで消化した後、ＰＢＳ（約２×１０＾７／ｍＬ）に再懸濁し、氷上に置いた；
［２］線形化標的ベクター（４５μｇ）を１ｍＬ細胞と混合し、エレクトロポレーションタンクに装填し、６００Ｖ、２５μＦ、１０ｍｓのパラメーターでエレクトロトランスフォーメーションを実施した；
［３］エレクトロトランスフォーメーション後の細胞を、完全に密集したトロホブラストを有するディッシュに接種し、３７℃のインキュベーターに入れ、Ｇ４１８（２８０μｇ／ｍＬ）を含有する細胞スクリーニングブロスを添加して、２４時間後に置換した。

【0047】

（３）ＥＳ陽性クローンのピックアップ及び増幅
培養数日後にクローンの選択を開始し、単一の未分化ＥＳクローンを低倍率顕微鏡下で選択し、以下の培養のために９６ウェルプレートに配置した；各クローンを２つに分け、１つを凍結保存し、もう１つを増幅及び継代培養のために２４ウェルプレートに移した。

【0048】

（４）標的ＥＳ細胞のＰＣＲ法及びサザンブロット法による同定
Ｇ４１８耐性の陽性クローンを選択して増幅し、ゲノムＤＮＡを抽出して酵素消化し、アガロースゲル電気泳動のバンドを解析した。その後、Ｔｐｋ ｅｘｏｎ４の５’及び３’末端を標的とするプローブを用いてサザンブロットを行い、対照ＥＳ細胞と標的ＥＳ細胞とを区別するバンドにしたがって同定を行った。ここで、
ＰＣＲ同定のためのプライマーは以下のとおりであった：

【0049】

【表1】

【0050】

サザンブロット用の５’及び３’プローブを調製するためのプライマーは以下のものであった：

【0051】

【表2】

【0052】

胚盤胞マイクロインジェクションによるＴＰＫ－ｆｌｏｘＰキメラマウスの構築
（１）マウス胚盤胞の調製
４週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを選抜し、正午に１０ＩＵのゴナドトロピンを腹腔内に注射した。４８時間後に１０ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピンを注射し、雌マウスを雄マウスとともにケージに入れた。次の日の朝に、雌マウスの膣栓の有無を検査し（０．５日と記録）、３日後に膣栓を有する雌マウスを殺処分し、子宮を摘出し、胚盤胞をＢＭＯＣ－３培養液で洗浄した後、６０ｍｍのディッシュに滴下した培養液に胚盤胞を移し、鉱物油覆った。胞胚腔に拡大させた後、マイクロインジェクションを行った。

【0053】

（２）胚盤胞へのマイクロインジェクション
マイクロインジェクション用の保持ピペット及び注入ピペットを準備した。インジェクションの３時間前に、インジェクション用のＥＳ細胞に、置換用の新鮮な培養液を添加した。パンクレアチン消化の際に単一細胞懸濁液を調製した。明るい表面を有する小型及び円形のＥＳ細胞をインジェクションのために選択し、各胚に約１２個から１５個のＥＳ細胞を注射し、注射された胚盤胞は一般に１時間培養後に正常な形態を回復し、形態が損傷していない胚盤胞を移植のために選択した。

【0054】

（３）胚盤胞移植
偽妊娠マウスの作製：白の昆明種の雌マウスを精管結紮した雄マウスと交配し、翌日（０．５日と記録）に膣栓検査を行った。２日後には偽妊娠マウスを胚移植に用いることができる。偽妊娠マウスをイソフルランで麻酔し、１０個の注入された胚盤胞を一側子宮に移植するために背部手術を行った。手術が成功した場合、１７日後に新生児マウスが誕生する可能性があり、数日後の毛の色から、標的ＥＳ細胞を組み込んだＴＰＫ－ｆｌｏｘＰキメラマウスが得られたか否かを視覚的に判定することが可能であり、全体の毛に対する褐色の毛の割合からキメラの度合いを推定した。

【0055】

ＴＰＫ－ｌｏｘＰ＋／＋キメラマウスの取得
得られたＴＰＫ－ｆｌｏｘＰキメラマウスをＦｌｐツールマウスと交配したところ、Ｆｌｐツール酵素はＦｒｔ部位でＮｅｏ配列の開裂を誘導でき、純化により、ノックアウト可能なＴｐｋ－ｌｏｘＰ＋／＋ホモ接合マウスが得られた。

【0056】

ＣａｍＫ２α－Ｃｒｅ／ＥＲＴ２＋／－；Ｔｐｋ－ｌｏｘＰ＋／＋マウスの入手
（１）上記の操作により得られ、確認されたＴｐｋ－ｌｏｘＰ＋／＋マウスは、Ｔｐｋノックアウトを達成することができる；
（２）Ｔｐｋ－ｌｏｘＰ＋／＋マウスとＣａｍＫ２α－Ｃｒｅ／ＥＲＴ２＋／－マウスを交配して、ＣａｍＫ２α－Ｃｒｅ／ＥＲＴ２＋／－；Ｔｐｋ－ｌｏｘＰ＋／＋マウスを得て、これを遺伝的に同定し、交配した。

【0057】

同定用プライマー：

【表3】

【0058】

条件付きＴＰＫ遺伝子の条件付きノックアウトを有するマウスの表現型
ＣａｍｋＩＩ－Ｃｒｅ／ＥＲＴ２＋／－マウスとの交配により皮質と海馬に特異的なＴＰＫ遺伝子ノックアウトを行い、３ヶ月齢のマウスにＴｏｍａｘｉｆｅｎを腹腔内投与してＴＰＫ遺伝子ノックアウトを誘導した。ＴＰＫ遺伝子ノックアウトマウスの表現型解析を行、その結果を図６から図１１に示す。

【0059】

図６を参照すると、ＴｏｍａｘｉｆｅｎがＴＰＫ遺伝子ノックアウトを誘導してから２．５ヶ月後に、脳内のＴＰＫタンパク質レベル及びＴＤＰレベルを、チアミンレベルに影響を与えることなく有意に低下させることができる。図７を参照すると、ＴｏｍａｘｉｆｅｎがＴＰＫ遺伝子ノックアウトを誘導してからそれぞれ１、２、２．５ヶ月後にＦＤＧ－ＰＥＴを実施したところ、血中グルコースアッセイ及びグルコース耐性試験により、ＴＰＫノックアウトマウスが有意な脳グルコース代謝障害、末梢グルコース恒常性障害及び耐糖能障害を示すことが見出された。図８を参照すると、メタボノミクス研究により、ＴＰＫ遺伝子ノックアウトが解糖及びトリカルボン酸回路障害を引き起こすことが示された。図９を参照すると、病理学的検出により、ＴＰＫ遺伝子ノックアウトが脳萎縮、シナプス及びニューロンの大幅な喪失、Ｔｕｎｅｌ陽性細胞の増加、染色体凝縮及び核凝縮を有意に引き起こすことが示された。図１０を参照すると、ＡＤに必須であるＡβ及びタウの病理学的研究により、ＴＰＫ遺伝子ノックアウトがＡβ４０及びＡβ４２の産生を有意に増加させることが示され、この増加は主にＡＰＰ発現及びＢａｃｅ１タンパク質レベルの増加及びＴａｕタンパク質リン酸化の増加によって達成されることが示された。図１１を参照すると、ＡＤの発生及び発症には炎症反応が重要な役割を果たしており、ＴＰＫ遺伝子ノックアウトマウスではアストロサイト及びミクログリア細胞の有意な活性化及び脳皮質及び海馬における炎症因子の発現増加が認められた；一方、ＴＰＫ遺伝子ノックアウトは神経血管障害及び血管透過性の増加をもたらした。結論として、脳ＴＤＰホメオスタシス調節の鍵酵素であるＴＰＫ遺伝子のノックアウトは、チアミン代謝障害、グルコース代謝障害を有意にもたらす可能性があり、さらに重要なことに、ＡＤ様神経変性疾患、脳萎縮、Ａβ及びタウの病理的変化、神経炎症及び神経血管障害を、驚くべきことに誘導する可能性がある。

【0060】

例３
本実施例における抗体の情報は以下のとおりであった。

【0061】

【表4】

【0062】

本実施例における試薬の情報は以下のとおりである。

【0063】

【表5】

【0064】

１．ＴＰＫ過剰発現プラスミドの構築
ヒト由来のＨＥＫ２９３細胞から逆転写により作製したｃＤＮＡからヒトＴＰＫ配列をＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ増幅産物を制限エンドヌクレアーゼ（５’：ＢａｍＨＩ－ＨＦ（緩衝液４）、３’：ＣｌａＩ（緩衝液４＋ＢＳＡ））で消化した後、７３２ｂｐの標的遺伝子配列断片ＴＰＫ１（ＮＭ＿０２２４４５）（配列番号１４）を得た。コード配列のＣ末端に８個のＭｙｃタグの反復配列を挿入してＴＰＫ１－Ｍｙｃを生成し、標的断片をｐＣＳ２ベクターにクローニングし、次いでＴＰＫ過剰発現プラスミドを構築した（図１２参照）。

【0065】

ＰＣＲ増幅用のプライマー：
フォワードプライマー：ＡＴ－ＧＧＡＴＣＣ（ＢａｍＨＩ）－ＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＡＴＧＣＣＴＴＴＡＣＣＣＣＧ（配列番号１５）；
リバースプライマー：ＡＴ－ＡＴＣＧＡＴ（ＣｌａＩ）－ＧＧＣＴＴＴＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣＡ（配列番号１６）。

【0066】

２．ＨＥＫ２９３－ＡＰＰ細胞及び培養
１）ＨＥＫ２９３－ＡＰＰ細胞を１０ｃｍのディッシュ中で培養し、ディッシュ中の培地を少なくとも９０％の付着細胞の集密度になるまで除去した。付着細胞を１ｍＬの３７℃で予備加熱した１×ＰＢＳ緩衝液で穏やかに洗浄し、続いてＰＢＳを除去し、次いで、０．２５％の質量体積％濃度を有する１ｍＬの３７℃で予備加熱したトリプシン－ＥＤＴＡをディッシュに添加し、次にこれを穏やかにシェイクして、消化液を付着細胞と完全に接触させた。ＨＥＫ２９３－ＡＰＰ細胞を室温に置いたが、消化には約２分から４分しか必要としなかった。
２）１０％ＦＢＳ（体積％濃度）を含む３７℃で予備加熱した４ｍＬのＤＭＥＭ培地を添加して消化を終了させた後、穏やかに上下にピペッティングした。ＨＥＫ２９３－ＡＰＰ細胞懸濁液を収集し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
３）上清を廃棄し、ＨＥＫ２９３－ＡＰＰ細胞をそれぞれ１ｍｌのチップで穏やかに上下させて分散させた。
４）実験条件に従って、３）のＨＥＫ２９３－ＡＰＰ細胞を１２ウェルプレートに１５０，０００個／ウェルで接種し、２日間培養後、７５％から８５％の集密度に接着成長させた後、以下のリポソームトランスフェクション実験を行った。

【0067】

３．リポソームトランスフェクション実験
１）－２０°Ｃからプラスミドを取り出し、常温で溶解し、１３，０００ｒｐｍ、室温で３分間遠心分離した。
２）プラスミド溶液の調製：Ｘ８０６（ＴＰＫ過剰発現プラスミド（１．２１８μｇ／μｌ））とＣｔｒｌプラスミド（空の対照プラスミド（１．２１μｇ／μｌ））をそれぞれｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地に１：５０の質量体積比でプレミックスした。
３）リポソーム溶液の調製：リポフェクタミン２０００をｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地に１：５０質量体積比で混合した。
４）等容量のプラスミド溶液とリポソーム溶液を混合し、室温で２０分間放置して、プラスミドとリポソームの複合体を形成した。混合物は６時間安定であった。
５）１２ウェルの細胞培養プレートに、１ウェル当たり合計１５０μｌの混合物を添加した。蓄積を避けるために、混合物を上下にピペッティングするか、プレートを前後に振とうした。
６）プラスミド－リポソーム混合物を添加したＨＥＫ２９３－ＡＰＰ細胞を二酸化炭素インキュベーター中に２４時間及び４８時間置いた後、細胞からのタンパク質試料の収集、処理及び試験を行った。

【0068】

４．ＨＥＫ２９３－ＡＰＰ細胞のタンパク質試料の採取及び処理
リポソームでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３－ＡＰＰ細胞を２４時間及び４８時間培養した後、３７℃に予熱した１×ＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳを廃棄し、１００μｌのＲＩＰＡ溶解溶液（プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦを含む）を１２ウェル細胞培養プレートの各ウェルに添加した。ＲＩＰＡ溶解溶液を細胞と完全に接触させた後、５分間氷上に置いた。細胞を細胞スクレーパー又はチップでこすり落とした後、チューブに採取し、４℃、１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。沈殿物を廃棄し、タンパク質上清を回収し、そのタンパク質濃度をＢＣＡキットで測定した後、次いで、ウェスタンブロットにより標的タンパク質の発現を検出した。

【0069】

５．ウェスタンブロット検出
ＨＥＫ２９３－ＡＰＰ細胞株における２４時間（ＴＰＫ ＯＶＥＲ－１）及び４８時間（ＴＰＫ ＯＶＥＲ－１）のＴＰＫプラスミドの過剰発現がＷＢ法により検出された。検出の具体的方法は以下のとおりである。

【0070】

１）ゲルの調製：トップゲル（質量体積濃度５％）、ボトムゲル（質量体積濃度１０％）。
２）電気泳動：１×泳動緩衝液、９０Ｖで２０分間から３０分間泳動後、次いで、１２０Ｖで６０分間から９０分間泳動。
３）膜への転移：ＰＶＤＦ膜を活性化のためにメタノール中に置き、続いて４００ｍＡの定電流で１００分間ポリアクリルアミドゲルから固体支持体、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を移動させた。
４）抗体反応：ＰＶＤＦを５％ＢＳＡ（ＴＢＳＴ中の質量体積百分率濃度）で２時間ブロッキングし、一次抗体を加え、４℃で一晩置いた。１×ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄した後、ＰＶＤＦ膜を５％ＢＳＡ（ＴＢＳＴ中）で希釈した二次抗体とともに室温で２時間インキュベートし、続いて１×ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄した。
５）ＥＣＬ現像液：ＣＬｉＮＸ発光装置（ＣＬｉＮＸ、Ｃｈｅｍｉ ｓｃｏｐｅｓｅｒｉｅｓ ６０００）を用いて現像を行った。

【0071】

統計的分析によりＴ－検定を採用した。ＷＢ試験の結果、ＨＥＫ２９３－ＡＰＰ細胞におけるＡＰＰタンパク質の発現を有意に減少し、全ての比較において有意差が認められた（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）（図１３参照）。

【0072】

ＴＰＫの過剰発現は、ＨＥＫ２９３－ＡＰＰ細胞におけるＡＰＰタンパク質の発現量を低下させる可能性があり、ＡＰＰタンパク質のレベルは、２４時間群及び４８時間群の両方において、ブランク対照群と比較して有意差をもって減少し、ＴＰＫ過剰発現プラスミドがＨＥＫ２９３－ＡＰＰ細胞におけるＡＰＰタンパク質の発現レベルを阻害し得ることが示された。よって、ＴＰＫ過剰発現は、ＨＥＫ２９３－ＡＰＰ細胞におけるＡＰＰタンパク質の発現レベルを減少させることができる。

【0073】

上記は、単に本発明の好ましい実施形態である。当業者は、本発明の原理を超えることなく、本発明をさらに改変及び改良することができることに留意されたく、改変及び改良された発明もまた、本発明の範囲内にあるとみなされるものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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