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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-27
(45)【発行日】2024-03-06
(54)【発明の名称】ヒト尿からのマイクロベシクルの分離方法及び分析方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/543 20060101AFI20240228BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240228BHJP
G01N 33/493 20060101ALI20240228BHJP
C12Q 1/24 20060101ALN20240228BHJP
【ＦＩ】
G01N33/543 597
G01N33/53 D
G01N33/493 A
C12Q1/24
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2019107271
(22)【出願日】2019-06-07
(65)【公開番号】P2019215342
(43)【公開日】2019-12-19
【審査請求日】2022-06-02
(31)【優先権主張番号】P 2018109403
(32)【優先日】2018-06-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０１９年４月３０日、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／６２３５５３ｖ１
(73)【特許権者】
【識別番号】591122956
【氏名又は名称】株式会社ＬＳＩメディエンス
(73)【特許権者】
【識別番号】504145342
【氏名又は名称】国立大学法人九州大学
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(74)【代理人】
【氏名又は名称】森田 憲一
(72)【発明者】
【氏名】康 東天
(72)【発明者】
【氏名】内海 健
(72)【発明者】
【氏名】伊神 恒
【審査官】倉持 俊輔
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０００３２９９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１２－５３３３０８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００３－５３３６９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５３８２５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】PISITKUN Trairak et al.，“Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine”，Proceedings of the National Academy of Sciences，2004年08月23日，Vol. 101, No. 36，p.13368-13373，DOI: 10.1073/pnas.0403453101
【文献】FERNANDEZ-LLAMA Patricia et al.，“Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation”，Kidney International，2010年04月，Vol. 77, No. 8，p.736-742，DOI: 10.1038/ki.2009.550
【文献】KANCHI RAVI Rupesh et al.，“A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes”，Journal of Visualized Experiments，2015年01月16日，No. 95，DOI: 10.3791/51158
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４９３，３３／５３，
Ｃ１２Ｑ １／２４，
Ｃ１２Ｎ ５／０７
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
尿検体中のマイクロベシクルを分離する方法であって、（工程１）採取された尿検体を、低速遠心分離し、細胞画分やデブリスを除去する工程、
（工程２）前記工程１で得られた上清を高速遠心して、マイクロベシクル画分を沈殿させる工程、
（工程３）前記工程２で得られた沈殿画分に還元剤を加える工程、
（工程４）前記工程３で得られた試料を高速遠心して、マイクロベシクル画分を濃縮するとともに還元剤を除去する工程、
（工程５）前記工程４で得られた尿検体処理物に、（１）標識した、マイクロベシクルに特異的に結合することができる物質と（２）標識したＩｇＧとを、この順に、若しくは逆の順に、又は同時に添加する工程、及び
（工程６）前記工程５で得られた反応物をフローサイトメーターの測定に供する工程
を含み、前記工程６において、
（工程Ａ）取得したデータを解析し、（１）凝集したマイクロベシクルと、（２）標識したＩｇＧに反応する粒子群とを、この順に、若しくは逆の順に、又は同時に観測像から除外する工程、及び
（工程Ｂ）由来する細胞のマイクロベシクル集団への分別、キャラクタライズを行う工程
を含む、前記方法。
【請求項2】
還元剤が、１，４－ジチオトレイトールとトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩とのうちのいずれかから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
フローサイトメーターの測定における観測域が１μｍ以下、又は２００ｎｍ以上１μｍ以下のいずれかである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
フローサイトメーターの観測域に所望の直径の粒子群を収束させるためにフローサイトメーターのパラメータを設定する工程を実施する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
粒径が０．２２～１．３５μｍである、ポリスチレンビーズを使用して観測域における粒子径を推定する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
分離されるマイクロベシクルの直径が１μｍ以下である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
分離されたマイクロベシクルが、表４－１から表４－２８に記載のいずれかの蛋白質を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
（工程１）採取された尿検体を、低速遠心分離し、細胞画分やデブリスを除去する工程、
（工程２）前記工程１で得られた上清を高速遠心して、マイクロベシクル画分を沈殿させる工程、
（工程３）前記工程２で得られた沈殿画分に還元剤を加える工程、
（工程４）前記工程３で得られた試料を高速遠心して、マイクロベシクル画分を濃縮するとともに還元剤を除去する工程、
（工程５）前記工程４で得られた尿検体処理物に、（１）標識した、マイクロベシクルに特異的に結合することができる物質と（２）標識したＩｇＧとを、この順に、若しくは逆の順に、又は同時に添加する工程、及び
（工程６）前記工程５で得られた反応物をフローサイトメーターの測定に供する工程
を含み、前記工程６において、
（工程Ａ）取得したデータを解析し、（１）凝集したマイクロベシクルと、（２）標識したＩｇＧに反応する粒子群とを、この順に、若しくは逆の順に、又は同時に観測像から除外する工程、及び
（工程Ｂ）由来する細胞のマイクロベシクル集団への分別、キャラクタライズを行う工程
を含み、更に、
（工程７）前記工程６でキャラクタライズを行った画分をセルソーターで分離する工程
を含む、尿検体中のマイクロベシクルを分離する方法によって分離されたマイクロベシクルを使用して、尿に由来するマイクロベシクルに特異的に含まれる物質を探索する方法。
【請求項9】
（工程１）採取された尿検体を、低速遠心分離し、細胞画分やデブリスを除去する工程、
（工程２）前記工程１で得られた上清を高速遠心して、マイクロベシクル画分を沈殿させる工程、
（工程３）前記工程２で得られた沈殿画分に還元剤を加える工程、
（工程４）前記工程３で得られた試料を高速遠心して、マイクロベシクル画分を濃縮するとともに還元剤を除去する工程、
（工程５）前記工程４で得られた尿検体処理物に、（１）標識した、マイクロベシクルに特異的に結合することができる物質と（２）標識したＩｇＧとを、この順に、若しくは逆の順に、又は同時に添加する工程、及び
（工程６）前記工程５で得られた反応物をフローサイトメーターの測定に供する工程
を含み、前記工程６において、
（工程Ａ）取得したデータを解析し、（１）凝集したマイクロベシクルと、（２）標識したＩｇＧに反応する粒子群とを、この順に、若しくは逆の順に、又は同時に観測像から除外する工程、及び
（工程Ｂ）由来する細胞のマイクロベシクル集団への分別、キャラクタライズを行う工程
を含み、更に、
（工程７）前記工程６でキャラクタライズを行った画分をセルソーターで分離する工程
を含む、尿検体中のマイクロベシクルを分離する方法によって分離されたマイクロベシクルを使用して、対象における疾患、薬剤投与効果または他の医学的状態の検出を助ける方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒト尿中に存在するマイクロベシクルを効率的に分離及び分析する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞から離出分離する微小膜画分として、エクソソーム（直径０．０３～０．１μｍ）、マイクロベシクル（直径０．１～１μｍ）等が知られており、これらはそれぞれ異なるメカニズムで分泌され、正常条件下および病的条件下のいずれにおいても数多くの異なる細胞タイプから分泌されることが報告されている（非特許文献１）。
【0003】
これらの微小膜画分はヒト体液中（血液、尿、髄液、他）に含まれるが、これらの微小膜画分が含有する内容物は、細胞や組織間相互作用におけるシグナル伝達機能において重要な役割を担うと考えられている。そして一方で、これらの微小膜画分は、非侵襲的な診断材料であるリキッドバイオプシとして罹患状態や疾病の有無を判別に用いられ得ることが期待されている（特許文献１、特許文献２、非特許文献２、非特許文献３）。
【0004】
リキッドバイオプシとして使用される生体材料には、遊離核酸、微小膜画分、血中循環腫瘍細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ：ＣＴＣ）等が挙げられる。微小膜画分は、（Ｉ）エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）：直径３０～１００ｎｍの膜性小胞、（II）エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）（マイクロベシクル（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）、シェディング・マイクロベシクル（ＳＭＶｓ：ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）ともいう）：原形質膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）から直接放出される、直径１００～１，０００ｎｍの大きい膜性小胞、（III）アポトーシス性水疱（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｂｌｅｂｓ）：死んで行く細胞から放出される直径５０～５，０００ｎｍの小胞、を含む。
【0005】
近年、これら微小膜画分の臨床的価値が注目されている。エクソソームにおいては臨床応用が進められており、小胞内のポリヌクレオチドを利用した乳がん診断方法が開発されている（特許文献３）。しかしながら、従来のエクソソームを使用した診断方法は、１個１個のキャラクタライズが困難でどういった組織や細胞に由来しているのかが簡便には判別しづらいという問題点がある。
【0006】
マイクロベシクルは腫瘍の浸潤に極めて重要な役割を担っていることが知られており（非特許文献４）、尿中に存在するマイクロベシクルは糖尿病性腎症などへの疾患への関与が報告されている（非特許文献５）ことからも、その臨床的有用性が期待されている。マイクロベシクルは、ＣＴＣなどと比べてヒト体液中に多量に含まれること、腫瘍の浸潤に極めて重要な役割を担っていること（非特許文献４）や、血液中に存在するマイクロベシクルは生理的な血液凝固の因子であると同時に敗血症などへの疾患への関与が報告されている（非特許文献１）ことから、臨床検査材料としての有効利用が期待されているものの、未だ実現には至っていない。
【0007】
エクソソームとマイクロベシクルはその生成プロセスが異なり、別々の微小膜画分として定義されているものの、これまでの観測法では大きさやそれらを特徴づける膜に存在する表面抗原が非常に近接、類似しており、これらを厳密に区別して分離し観測することができなかった。例えば、特許文献１や特許文献２ではエクソソーム及びマイクロベシクルを両方含む形での分離方法及び分析方法について記述されており、両者の区別は不明瞭である。
【0008】
また、一般的に、体液中に存在する微小膜画分は、全身の臓器、組織、またはそれらを構成する各細胞に由来するため、診断や検査応用に価値を見出すには、特定の疾患にマッチングした特定の臓器、組織や細胞にフォーカスした微小膜画分の観測が必要とされている。従って、観測する微小膜画分がどういった臓器、組織や細胞に由来するかを簡便にカテゴライズする分析法が確立できれば、微小膜画分の臨床的有用性は更に高まると考えられる。
【0009】
特に尿中においてもエクソソーム他、微小膜画分の存在は確認されており、これを抽出する方法や検出法についての知見がある。尿中にはＴａｍｍ－Ｈｏｒｓｆａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｕｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）（以下ＴＨＰと略）が多量に含有され、これらは高分子ポリマーを形成することが知られている。これらの高分子ポリマーと微小膜画分を分別するために還元処理にて高分子ポリマーをあらかじめ分解したのちにエクソソームを抽出する手法などが考慮されている（非特許文献６）。
【0010】
このように、マイクロベシクルを臨床検査材料等として有効利用するためには、エクソソームと区別して分離することに加えて、由来する臓器、組織や細胞を区別できる分離法及び分析法が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【文献】特許第5838963号公報
【文献】特開2015-91251号公報
【文献】特開2014-117282号公報
【非特許文献】
【0012】
【文献】Andrea Piccin , William G, Owen P (2007) Circulating microparticles: pathophysiology and clinical implications. Blood Reviews 21, 157-171
【文献】Boukouris S, Mathivanan S (2015) Exosomes in bodily fluids are a highly stable resource of disease biomarkers. Proteomics Clin Appl 9(3-4): 358-367
【文献】IH Chen, L Xue, CC Hsu, (2017) Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. PNAS vol. 114, no. 12, 3175-3180
【文献】James W. Clancy, Alanna Sedgwick, Carine Rosse, (2015) Regulated delivery of molecular cargo to invasive tumour-derived microvesicles. Nature Communications 6, Article number: 6919
【文献】Ai-li Sun, Jing-ti Deng, Guang-ju Guan, Shi-hong Chen, Yuantao Liu, Jing Cheng, Zhen-wei Li, Xiang-hua Zhuang, (2012) Dipeptidyl peptidase-IV is a potential molecular biomarker in diabetic kidney disease. Diabetes & Vascular Disease Research 9(4), 301-308
【文献】Patricia Ferna´ndez-Llama, Sookkasem Khositseth, Patricia A. Gonzales, Robert A. Star,Trairak Pisitkun and Mark A. Knepper (2010) Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney International 77, 736-742
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
上述したように、マイクロベシクルはリキッドバイオプシとして有効な臨床検査材料になりえると考えられるが、エクソソームとマイクロベシクルを明確に区別して分離することは非常に困難である上に、尿中に存在するマイクロベシクルは様々な細胞や組織に由来するマイクロベシクルが混在しており、尿中マイクロベシクル全体を抽出してリキッドバイオプシとして使用（例えば核酸などを抽出）しても、疾患部位の特定や診断目的にマッチした結果は獲得しがたいと考えられる。
【0014】
そこで、特に尿中のマイクロベシクル（直径０．１～１μｍ）に注目し、これらを簡便にキャラクタライズし１個１個のマイクロベシクルがどういった細胞に由来するかを観測でき、また、これまで不明瞭であったエクソソームとマイクロベシクルとを区別して分離し、また観測するマイクロベシクルが由来する細胞や組織、臓器を明確にする方法を構築することを、本発明の課題とする。
【0015】
そのためには、尿に含まれるマイクロベシクルを効率よく濃縮することが必要である。このことに加えて、本発明者は、尿中に存在するＴＨＰポリマーが分子サイズとしてマイクロベシクルと近接するだけでなく、ＴＨＰポリマーはＩｇＧとも相互作用し、尿由来のマイクロベシクルに免疫化学的なキャラクタライズ方法を実施する際に問題となることから、ＴＨＰポリマーを除去する必要があることを見出した。尿中のマイクロベシクルを効率よく濃縮したうえでＴＨＰポリマーを除去することで、マイクロベシクルをサイズ分画し、更にその膜表面に存在するタンパク質にてキャラクタライズ分析することで１個１個のマイクロベシクルが由来する細胞や組織、臓器を推定できる測定系の構築が可能となる。
なお、本明細書において、分離とは、分画、検出などと同義で用いるものとする。
なお、本明細書において、分離とは、分画、検出などと同義で用いるものとする。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明者らは、前記の問題点を解決すべく鋭意検討した結果、尿からマイクロベシクルを遠心操作により濃縮し、還元処理にてＴＨＰポリマーを分解除去する工程、フローサイトメーターを使用し、直径約０．１～１μｍの画分に集約させて観測する工程、さらに観測像から残存するＴＨＰポリマーを除去する工程、そしてマイクロベシクルが由来する細胞に特異的な表面抗原にてマイクロベシクルをキャラクタライズする工程により、１個１個のマイクロベシクルがどういった臓器、組織やそれを構成する細胞から放出されて尿中に存在していたのかを精度よく観測できることを見出した。本発明はこの知見に基づいて、尿中のマイクロベシクルを個々にキャラクタライズしうる測定法を完成させたものである。
【0017】
すなわち、本発明は、以下を提供する：
［１］尿検体中のマイクロベシクルを分離する方法であって、以下の工程を含む方法；
（工程１）採取された尿検体を、低速遠心分離し、細胞画分やデブリスを除去する工程、
（工程２）前記工程１で得られた上清を高速遠心して、マイクロベシクル画分を沈殿させる工程、
（工程３）前記工程２で得られた沈殿画分に還元剤を加える工程、
（工程４）前記工程３で得られた試料を高速遠心して、マイクロベシクル画分を濃縮するとともに還元剤を除去する工程、
（工程５）前記工程４で得られた尿検体処理物に、（１）染色試薬と（２）標識したＩｇＧとを、この順に、若しくは逆の順に、又は同時に添加する工程、
（工程６）前記工程５で得られた反応物をフローサイトメーターの測定に供する工程、
［２］フローサイトメーターの測定において、以下の工程を含む、［１］の方法；
（工程Ａ）取得したデータを解析し、（１）凝集したマイクロベシクルと、（２）標識したＩｇＧに反応する粒子群とを、この順に、若しくは逆の順に、又は同時に観測像から除外する工程、
（工程Ｂ）由来する細胞のマイクロベシクル集団への分別、キャラクタライズを行う工程、
［３］還元剤が、１，４－ジチオトレイトール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩のいずれかから選択される、［１］又は［２］の方法、
［４］フローサイトメーターの測定における観測域が１μｍ以下、又は２００ｎｍ以上１μｍ以下のいずれかである、［１］～［３］のいずれかの方法、
［５］フローサイトメーターの観測域に所望の直径の粒子群を収束させるためにフローサイトメーターのパラメータを設定する工程を実施する、［１］～［４］のいずれかの方法、
［６］粒径が０．２２～１．３５μｍである、ポリスチレンビーズを使用して観測域における粒子径を推定する、［１］～［５］のいずれかの方法、
［７］分離されるマイクロベシクルの直径が１μｍ以下である、［１］～［６］のいずれかの方法、
［８］分離されたマイクロベシクルが、表４に記載の蛋白質を含む、［１］～［７］のいずれかの方法、
［９］［１］～［８］のいずれかの方法によって得られた画分を使用して、尿に由来するマイクロベシクルに特異的に含まれる物質を探索する方法、
［１０］［１］～［９］のいずれかの方法によって得られた画分を使用して、対象における疾患、薬剤投与効果または他の医学的状態の検出を助ける方法
に関する。
［１］尿検体中のマイクロベシクルを分離する方法であって、以下の工程を含む方法；
（工程１）採取された尿検体を、低速遠心分離し、細胞画分やデブリスを除去する工程、
（工程２）前記工程１で得られた上清を高速遠心して、マイクロベシクル画分を沈殿させる工程、
（工程３）前記工程２で得られた沈殿画分に還元剤を加える工程、
（工程４）前記工程３で得られた試料を高速遠心して、マイクロベシクル画分を濃縮するとともに還元剤を除去する工程、
（工程５）前記工程４で得られた尿検体処理物に、（１）染色試薬と（２）標識したＩｇＧとを、この順に、若しくは逆の順に、又は同時に添加する工程、
（工程６）前記工程５で得られた反応物をフローサイトメーターの測定に供する工程、
［２］フローサイトメーターの測定において、以下の工程を含む、［１］の方法；
（工程Ａ）取得したデータを解析し、（１）凝集したマイクロベシクルと、（２）標識したＩｇＧに反応する粒子群とを、この順に、若しくは逆の順に、又は同時に観測像から除外する工程、
（工程Ｂ）由来する細胞のマイクロベシクル集団への分別、キャラクタライズを行う工程、
［３］還元剤が、１，４－ジチオトレイトール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩のいずれかから選択される、［１］又は［２］の方法、
［４］フローサイトメーターの測定における観測域が１μｍ以下、又は２００ｎｍ以上１μｍ以下のいずれかである、［１］～［３］のいずれかの方法、
［５］フローサイトメーターの観測域に所望の直径の粒子群を収束させるためにフローサイトメーターのパラメータを設定する工程を実施する、［１］～［４］のいずれかの方法、
［６］粒径が０．２２～１．３５μｍである、ポリスチレンビーズを使用して観測域における粒子径を推定する、［１］～［５］のいずれかの方法、
［７］分離されるマイクロベシクルの直径が１μｍ以下である、［１］～［６］のいずれかの方法、
［８］分離されたマイクロベシクルが、表４に記載の蛋白質を含む、［１］～［７］のいずれかの方法、
［９］［１］～［８］のいずれかの方法によって得られた画分を使用して、尿に由来するマイクロベシクルに特異的に含まれる物質を探索する方法、
［１０］［１］～［９］のいずれかの方法によって得られた画分を使用して、対象における疾患、薬剤投与効果または他の医学的状態の検出を助ける方法
に関する。
【発明の効果】
【0018】
本発明により、尿中に存在するマイクロベシクルを簡便に且つ特異的に分離、観測することができ、さらに膜に存在する表面抗原を用いて個々のマイクロベシクルをキャラクタライズ（どういった細胞や組織、臓器に由来するのか）することができる。その結果、特定の疾患にマッチングした特定の臓器、組織や細胞にフォーカスした診断や検査応用が可能な検査としての価値の向上が期待される。また、本発明により得られた画分を使用して分析することで、対象における疾患、薬剤投与効果または他の医学的状態を推定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】尿を前処理により濃縮したマイクロベシクル画分のフローサイトメーターでの観測像である。
【図2】前処理により濃縮したマイクロベシクル画分の透過型電子顕微鏡によるネガティブ染色像である。
【図3】前処理により濃縮したマイクロベシクル画分のナノ粒子解析システムによる粒度分布ヒストグラムである。
【図4】ショットガンプロテオミクス解析により検出した蛋白質からｍｅｔａｓｃａｐｅを使用した蛋白質のエンリッチメント解析結果である。
【図5】ショットガンプロテオミクス解析により検出した蛋白質からｍｅｔａｓｃａｐｅを使用した蛋白質のエンリッチメント解析結果をクラスター毎にネットワーク解析した結果である。
【図6】前処理により濃縮したマイクロベシクル画分のフローサイトメーターによる測定データを側方散乱光におけるパルス幅とパルスエリアで展開した観測像である。
【図10】由来する細胞集団へのマイクロベシクルのキャラクタライゼーション後に側方散乱光とＡｎｎｅｘｉｎ５の展開図へ重ね合わせた図である。
【図11】由来する細胞集団へのマイクロベシクルのキャラクタライゼーション後に側方散乱光とＡｎｎｅｘｉｎ５の展開図へ重ね合わせた図（左側）と、由来する各細胞集団における、Ａｎｎｅｘｉｎ５陽性集団とＡｎｎｅｘｉｎ５陰性集団のフローサイトメーターでの観察像（右側）である。
【図12】フローサイトメーターによる健常人１０名からの各細胞由来マイクロベシクルのＡｎｎｅｘｉｎ５陽性集団とＡｎｎｅｘｉｎ５陰性集団との割合を比較した結果を示すグラフである。
【図13】実施例１においてマイクロベシクル画分を濃縮して得られたペレットに由来する三種類の画分に対して、合成基質 H-Gly-Pro-7-amido-4-methylcoumarin hydrobromideを用いたＣＤ２６（Dipeptidyl peptidase 4）のペプチド切断活性を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0020】
以下において、本発明の実施形態について詳細に説明するが、利用方法の態様についてはこれに限定されるものではない。
【0021】
本発明は、ヒト尿中のマイクロベシクルの分離方法及び分析方法である。大別すると、ヒト尿において夾雑物を除去しマイクロベシクルを濃縮する工程と、尿マイクロベシクルに特化した観測条件を設定したフローサイトメーターによる工程とを含む。本明細書において、前処理は濃縮や回収の意味を含むものとし、濃縮と回収はほぼ同義の語として用いられることがある。
【0022】
本明細書において尿とは、採取された尿をそのまま使用してもよいし、水、酸性溶液、アルカリ性溶液、緩衝液等に溶解または懸濁し、必要に応じてさらに処理を加えたものを使用してもよい。本発明で利用可能な酸性溶液、アルカリ性溶液、緩衝液は、当業者であれば適宜選択して使用することが可能である。
【0023】
以下、尿中のマイクロベシクルを、フローサイトメーターを用いて分離、分析する条件の一例について説明をするが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0024】
本発明で利用可能な、夾雑物を除去しマイクロベシクルを濃縮する前処理法は、遠心分離法を特徴とするが、例えば、以下の工程に従って実施することができる。
【0025】
採尿された尿検体を、低速遠心分離にて細胞画分やデブリスなどを分離し、上清を回収する（工程１）。このとき、低速遠心分離条件などは、公知の方法に従って実施することができ、室温で２，０００×ｇで２０分間遠心分離して得られた上清を使用することができる。
工程１により得られた上清をさらに低速遠心して、上清を回収する工程を実施してもよい。この遠心工程により、血小板由来の小胞やアポトーシス性水疱などを沈殿させることができるため、好ましい。工程１同様に、室温で２，０００×ｇで２０分間遠心分離して得られた上清を回収して使用することができる。
工程１により得られた上清をさらに低速遠心して、上清を回収する工程を実施してもよい。この遠心工程により、血小板由来の小胞やアポトーシス性水疱などを沈殿させることができるため、好ましい。工程１同様に、室温で２，０００×ｇで２０分間遠心分離して得られた上清を回収して使用することができる。
【0026】
工程１により得られた上清を高速遠心して,マイクロベシクル画分を沈殿させる（工程２）。当該工程の条件としては、例えば、室温で２０，０００×ｇで３０分遠心分離して得られた沈殿を使用することができる。
【0027】
工程２により得られた沈殿画分に還元剤（例えば、１，４－ジチオトレイトール（１,４－Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ：ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Ｔｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＴＣＥＰ）を含む緩衝液を加え、静置する（工程３）。この工程を実施することで、ＴＨＰポリマーにおけるジスルフィド結合を還元開裂させて、ＴＨＰポリマーを分解することができる。
【0028】
工程３で還元剤を添加した試料を高速遠心して、マイクロベシクル画分を濃縮するとともに還元剤を除去する（工程４）。この高速遠心により、マイクロベシクル画分を濃縮することができ、夾雑物を除去することができる。当該工程の条件としては、室温で２０，０００×ｇで３０分遠心分離して得られた沈殿を使用することができる。必要に応じて、この工程４を繰り返してもよい。複数回高速で遠心分離をおこなうことにより、夾雑物を取り除いてマイクロベシクル画分の純度を高めることができ、好ましい。
【0029】
添加する還元剤は、ジスルフィド結合を切断する目的で添加するため、ジスルフィド結合を切断可能なものであればよい。例えば、ジチオスレイトール、２－メルカプトエタノール、２－メルカプトエチラミン塩酸、ＴＣＥＰ、システイン塩酸、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）、ヨードアセトアミド、グルタチオン、ヒドラジンなどのような、タンパク質のＳＨ基の保護や、ジスルフィド結合の切断、還元剤試薬として一般的に用いられるものの中から、当業者であれば適宜選択して使用することができる。これらの還元剤のうち、マイクロベシクルの測定に影響を与えないことが好ましく、かつ、脂質二重層を不安定化させる作用を持たないものであることが更に好ましい。これらの還元剤は単独でも、あるいは、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【0030】
本発明の一態様として利用可能な前処理方法は上記各工程を実施する以外にも、いくつか考えられる。例えば、水溶液およびタンパク質を含む溶液のろ過滅菌等に使用する各種孔径を有するメンブレンフィルターを組み合わせて、目的とするマイクロベシクル画分を抽出することができる。この場合孔径は直径０．１～１０μｍのものを使用した精密ろ過（Ｍｉｃｒｏ－Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）法に相当する方法が好適である。
【0031】
また、その他の前処理法として、密度勾配溶質とともに試料を遠心分画する平衡密度勾配遠心法、微小膜画分の表面抗原に特異的な抗体を利用し、微小膜画分を様ざまな担体に結合させて回収する免疫学的捕捉法、サイズ排除クロマトグラフィー（ゲルろ過法）により可溶性蛋白質よりも早く溶出してくる画分を回収する方法、微小膜画分の膜構成成分に対して金属イオン存在下で結合する担体を使用したリン脂質アフィニティー法、また高分子ポリマーと微小膜画分を混合し、目的の微小膜画分を沈殿させるポリマー沈殿法などがある。当業者であれば、適宜これらの方法を選択して実施することが可能であるが、これらの方法においても、試料に還元剤を添加する工程を実施することで、上記工程１～工程５に代替する方法として実施することができる。
【0032】
以下、これらの方法によって濃縮し夾雑物を除去した試料を、尿検体処理物と称することがある。
【0033】
次にマイクロベシクルに特化したフローサイトメーターでの観測条件の一例について説明をするが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0034】
本発明において使用できるフローサイトメーターは、特定の機器に限定されるものではなく、クオーツキュベット方式、ジェットインエアー方式などいずれのフローセルを採用したフローサイトメーターであっても使用することができる。
【0035】
本発明で利用可能なフローサイトメーターを用いた観測法は、例えば、以下の工程に従って実施することができる。
【0036】
（１）マイクロベシクルの染色
本工程では、還元剤を添加し、濃縮された尿検体処理物と、染色試薬とを混和させて、マイクロベシクルを染色する（工程５）。より具体的には、尿検体処理物に、染色試薬、例えば、蛍光標識した、表面抗原に特異的な抗体を混和させて、マイクロベシクルを染色する。染色方法は、当業者であれば定法を採用し、場合によっては条件を適宜検討して実施することができる。マイクロベシクル中の複数の抗原ターゲッティングを行うために、マルチカラー分別として、多種類の標識抗体で染色して検出してもよい。例えば、マイクロベシクルの膜構成成分であるホスファチジルセリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ：ＰＳ）に対して、金属イオン存在下で結合するタンパク質であるＡｎｎｅｘｉｎ５などを使用することができる。
本工程では、還元剤を添加し、濃縮された尿検体処理物と、染色試薬とを混和させて、マイクロベシクルを染色する（工程５）。より具体的には、尿検体処理物に、染色試薬、例えば、蛍光標識した、表面抗原に特異的な抗体を混和させて、マイクロベシクルを染色する。染色方法は、当業者であれば定法を採用し、場合によっては条件を適宜検討して実施することができる。マイクロベシクル中の複数の抗原ターゲッティングを行うために、マルチカラー分別として、多種類の標識抗体で染色して検出してもよい。例えば、マイクロベシクルの膜構成成分であるホスファチジルセリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ：ＰＳ）に対して、金属イオン存在下で結合するタンパク質であるＡｎｎｅｘｉｎ５などを使用することができる。
【0037】
その他、マイクロベシクルに特異的に結合することができる物質としては、例えば、小胞マイクロベシクル表面に存在するタンパク質、脂質または糖に結合することができる物質であればよい。表面に存在する物質としては、例えばタンパク質の場合、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ５９、ＣＤ４４、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ１４４、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ４１、ＣＤ６１、ＥＰ－ＣＡＭ、ＣＤ３２４、ＣＤ１４、ＣＤ８１、ＣＤ３１、ＣＤ２７４、ＣＤ６３、Ａｌｉｘ、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ２７９、ＣＤ１５、ＴＳＧ１０１、ＣＤ２０、ＣＤ２４９、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ２６、ＣＤ２７３、ＣＤ９、ＭＵＣ－１、ＣＤ１３、ＣＤ１４６、ＣＤ６２Ｅまたはこれらの組み合わせを使用することができる。
【0038】
上記以外のマイクロベシクルに特異的に結合することができる物質は、例えば、タンパク質に対して結合親和性を有する物質、酵素の基質、補酵素、調節因子、受容体と特異的に結合する物質、レクチン、糖、糖蛋白質、抗原、抗体若しくはその抗原結合断片、ホルモン、神経伝達物質、リン脂質結合タンパク質、プレクストリン相同（ＰＨ：ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ、ＰＨ）ドメインを含むタンパク質、コレステロール結合タンパク質、またはこれらの組み合わせであってもよい。抗原結合断片は、抗原結合部位を含むものであり、例えば、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖを使用してもよい。
【0039】
例えば、多種類の膜型ペプチダーゼを有するマイクロベシクルとしてＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６全てが陽性になる画分を、上皮系の細胞に由来するマイクロベシクルとしてＡｎｎｅｘｉｎ５、ＣＤ２２７（ＭＵＣ－１）陽性のように組み合わせて使用することで、より高精度な分離ができるため、好ましい。
【0040】
（２）ＩｇＧの添加
本工程では、還元処理で除去しきれなかったＴＨＰポリマーを観測像において検出するためにＩｇＧを蛍光標識したものを混和させてＴＨＰポリマーと反応させる（工程５）。
先の工程で尿検体処理物と染色試薬とを混和させて得られた混和物に、あるいは、染色試薬と混和させる前の尿検体処理物に、ＩｇＧを蛍光標識したものを混和させて反応させる（工程５）。前記ＩｇＧの由来は特に限定されるものではなく、例えば、マウスＩｇＧ、ヒトＩｇＧ、ラットＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、ヤギＩｇＧ、ウシＩｇＧなどを用いることができる。マイクロベシクルの染色工程同様、当業者であれば定法に従って実施することができる。例えば、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識マウスＩｇＧ、Ｍｉｘ－ｎ－Ｓｔａｉｎ ＡＰＣ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｂｉｏｔｉｕｍ社）を使用して、定常プロトコールにて、室温で３０分静置することで実施することができる。
本工程では、還元処理で除去しきれなかったＴＨＰポリマーを観測像において検出するためにＩｇＧを蛍光標識したものを混和させてＴＨＰポリマーと反応させる（工程５）。
先の工程で尿検体処理物と染色試薬とを混和させて得られた混和物に、あるいは、染色試薬と混和させる前の尿検体処理物に、ＩｇＧを蛍光標識したものを混和させて反応させる（工程５）。前記ＩｇＧの由来は特に限定されるものではなく、例えば、マウスＩｇＧ、ヒトＩｇＧ、ラットＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、ヤギＩｇＧ、ウシＩｇＧなどを用いることができる。マイクロベシクルの染色工程同様、当業者であれば定法に従って実施することができる。例えば、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識マウスＩｇＧ、Ｍｉｘ－ｎ－Ｓｔａｉｎ ＡＰＣ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｂｉｏｔｉｕｍ社）を使用して、定常プロトコールにて、室温で３０分静置することで実施することができる。
【0041】
血液中には補体などイムノグロブリンを補足するタンパク質が存在し、イムノコンプレックスを形成することがある。このイムノコンプレックスは、マイクロベシクルと分子サイズが近接する場合がある。そのため、イムノコンプレックスはＩｇＧとも相互作用するので血液由来のマイクロベシクルに免疫化学的なキャラクタライズ方法を実施する際には問題となりうる。従って、観測像においてＩｇＧを捕捉する画分を検出し、それらを観測像から除去するためにＩｇＧを蛍光標識したものを混和させてＩｇＧ捕捉画分と反応させる工程を実施することで、目的とするマイクロベシクル以外を除去することができ、夾雑物を含まないより正確な測定を行うことができるため、好ましい。
なお、上記の、表面抗原特異的な抗体によってマイクロベシクルを染色する工程とＩｇＧを添加する工程とは、いずれを先に実施してもよく、両工程を同時に実施してもよく、当業者が実施する環境に合わせて、適宜選択することが可能である。
なお、上記の、表面抗原特異的な抗体によってマイクロベシクルを染色する工程とＩｇＧを添加する工程とは、いずれを先に実施してもよく、両工程を同時に実施してもよく、当業者が実施する環境に合わせて、適宜選択することが可能である。
【0042】
（３）フローサイトメーターの設定
前方散乱光と側方散乱光の光電子増倍管の電圧（Ｖｏｌｔａｇｅ）と閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を調節して観測域に特定の直径を持つ粒子群を収束させる。これらのパラメータ等条件設定に際しては、未染色サンプルおよび染色サンプルの測定を実施し、各標的を検出する上でのその検出感度を満たす電圧設定や及びシース流速度を決定することが好ましい。
前方散乱光と側方散乱光の光電子増倍管の電圧（Ｖｏｌｔａｇｅ）と閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を調節して観測域に特定の直径を持つ粒子群を収束させる。これらのパラメータ等条件設定に際しては、未染色サンプルおよび染色サンプルの測定を実施し、各標的を検出する上でのその検出感度を満たす電圧設定や及びシース流速度を決定することが好ましい。
【0043】
フローサイトメーターのパラメータ設定としては、当業者であれば、最適な条件を探索して適宜設定することが可能であるが、例えば、流量（Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）は１２μＬ／ｍｉｎ、前方散乱光の電圧は３８１、側方散乱光の電圧は３４０に設定し、それぞれの検出感度として、蛍光強度閾値を２００に設定して実施することができる。各蛍光物質に対する励起光（Ｅｘ．）及び蛍光検出フィルター（Ｅｍ．）の波長及び電圧は、使用する各々の蛍光物質に応じて適宜選択して設定することができる。
【0044】
上記で設定したフローサイトメーターのパラメータを使用して、観測域における粒子径の推定を行う。サイズが均一なポリスチレンビーズ（例えば、ＳＰＨＥＲＯＴＭ Ｎａｎｏ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｓｉｚｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｋｉｔ、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）などを使用して定法に従って測定を実施することができる。観測域の粒子径を推定するためには、例えば、ポリスチレンビーズのサイズの粒径が０．２２μｍ、０．４５μｍ、０．８８μｍ、１．３５μｍであることが好ましい。
【0045】
観測域として設定する直径としては、マイクロベシクルを含む大きさであれば特に限定されるものではないが、例えば、約１μｍ以下が好ましく、１００ｎｍ～１μｍがより好ましく、２００ｎｍ～１μｍが更に好ましい。特にこれら微小粒子を観測する際に、側方散乱光が前方散乱光より分解能が高く粒子のサイズ検証などにも使用することができるため、好ましい。
【0046】
なお、本工程は、前記染色工程及びＩｇＧ添加工程と、下記測定・分離工程との間に実施する態様に限定されず、例えば、パラメータを設定した後、染色工程、ＩｇＧ添加工程、測定・分離工程を実施することもできるし、あるいは、一度設定できれば、測定毎にパラメータを設定することなく、一連の工程を繰り返し実施することができる。
【0047】
（４）フローサイトメトリーによる測定・分離
フローサイトメーターでデータを取得する。マルチカラー測定を実施した場合は各蛍光から割り当てた検出器以外の検出器へ漏れこんだ蛍光の漏れこみ補正を実施し、その条件下にて測定結果を得る（工程６）。
フローサイトメーターでデータを取得する。マルチカラー測定を実施した場合は各蛍光から割り当てた検出器以外の検出器へ漏れこんだ蛍光の漏れこみ補正を実施し、その条件下にて測定結果を得る（工程６）。
【0048】
（５）凝集したマイクロベシクル、ＩｇＧ捕捉画分との複合体の除外（工程６－Ａ）
マイクロベシクルが凝集する場合があるが、凝集したマイクロベシクルを観測像から除外するために、１）側方散乱光のパルス幅（Ｗｉｄｔｈ）の値が集団から外れて非常に高いもの、２）前方散乱光と側方散乱光のプロットから両者が集団から外れて高い値となっているものをマーキングしてゲートアウトすることができる。特に、前処理法を加えてマイクロベシクルが凝集した場合などに有効である。
マイクロベシクルが凝集する場合があるが、凝集したマイクロベシクルを観測像から除外するために、１）側方散乱光のパルス幅（Ｗｉｄｔｈ）の値が集団から外れて非常に高いもの、２）前方散乱光と側方散乱光のプロットから両者が集団から外れて高い値となっているものをマーキングしてゲートアウトすることができる。特に、前処理法を加えてマイクロベシクルが凝集した場合などに有効である。
【0049】
また、ＩｇＧ捕捉画分との免疫複合体を除去するために、ＩｇＧを蛍光標識したものに反応する陽性集団をマーキングしてゲートアウトすることができる。この工程により、還元処理で除去しきれなかったＴＨＰポリマーを観測像から除外するために、ＩｇＧを蛍光標識したものに反応する陽性集団をマーキングしてゲートアウトすることができるため、好ましい。
【0050】
なお、上記の、凝集したマイクロベシクルを除外する工程とＩｇＧにより捕捉された免疫複合体を除去する工程とは、いずれを先に実施してもよく、両工程を同時に実施してもよく、当業者が実施する環境に合わせて、適宜選択することが可能である。
【0051】
（６）得られたマイクロベシクル集団のキャラクタライズ（工程６－Ｂ）
マルチカラーで検出したマイクロベシクルをゲーティング操作により、それぞれが由来する細胞のマイクロベシクル集団への分別、キャラクタライズを行うことができる。この工程により、分離された尿中のマイクロベシクルであることを確認することができる。
マルチカラーで検出したマイクロベシクルをゲーティング操作により、それぞれが由来する細胞のマイクロベシクル集団への分別、キャラクタライズを行うことができる。この工程により、分離された尿中のマイクロベシクルであることを確認することができる。
【0052】
本発明により尿中マイクロベシクルの分別、キャラクタライズを行うことができるが、これらのキャラクタライズした画分を、セルソーターを使用して更に分離することもできる。これらの分離した画分からその特異的なコンテンツ（核酸、代謝物、蛋白質、脂質）を分析し臨床応用することも可能である。分離された画分について、更に、各マイクロベシクル集団の頻度解析や標的分子の発現量解析に使用してもよい。
【0053】
マイクロベシクルを分離し観測しうる測定技術としては上記工程に加えて、例えば、ナノトラッキング粒子径測定装置ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（ナノサイト、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社）は、ＮＴＡ（Ｎａｎｏ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ）技術とＦＦＦ（Ｆｉｅｌｄ Ｆｌｏｗ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）技術を組み合わせて使用することもできる。ＮＴＡ技術は、液中のナノ粒子のブラウン運動の様子をＰＣ画面上で、リアルタイムに観察することができ、また、ＦＦＦ技術は、薄いフロー・チャンネルの中で分離が行われるが、このチャンネルの特殊な幾何学的形状によって、このフローは放射状の断面をもつ層流をなしえ、この層流と直交することで、分離力が生じさせることにより、マイクロベシクルのような微小粒子をサイズで分離することができるため、より高精度な分離や分析が期待される。このような分離／観測法と個々のマイクロベシクルを特徴付ける表面抗原を組み合わせることでマイクロベシクルをキャラクタライズし、臓器特異性や疾患特異性を高め、臨床応用に利用できる。
【0054】
異なる本発明実施の一態様として、対象における疾患進行のモニタリングのための方法、個体における疾患再発のモニタリングのための方法として使用することもできる。これらの方法は、尿検体中からマイクロベシクルを分離する工程に加えて、マイクロベシクル中に含まれる物質を分析するプロファイル工程を含む。ある特定の医学的状態の対象個体において、プロファイルを分析することによって、例えば特定の疾患の存在を推定することに用いることができる。例えば、マイクロベシクルを分離するための試料採取の期間を、目的とする対象疾患の検出などに応じて適宜設定することで、より詳細なプロファイルを得て状態を観察し、診断を補助することが可能となる。また、これは、薬剤投与後の疾患状態をモニタリングする方法としても使用することができる。
【0055】
本発明により、マイクロベシクルを臨床検査材料としての有効利用できるようになるため、尿中に存在するマイクロベシクルを簡便に且つ特異的に抽出、観測することができ、さらに膜に存在する表面抗原を用いて個々のマイクロベシクルのキャラクタライズ（どういった細胞や組織、臓器に由来するのか）することができる。その結果、特定の疾患にマッチングした特定の臓器、組織や細胞にフォーカスした診断や検査応用が可能な検査としての価値の向上が期待される。また、本発明により得られた画分を使用して分析することで、対象における疾患、薬剤投与効果または他の医学的状態を推定することが可能となる。
【実施例】
【0056】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【0057】
《実施例１：ヒト尿中からのマイクロベシクルの濃縮》
健常人から、～１０ｍＬの尿を採取した。尿試料を、２０℃で２，０００×ｇで１０分間遠心分離して尿を得て、その後に約２０℃で約２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、尿内脂質及び細胞残余物、血液由来成分などを除去し、上澄み液を下記実験に使用した。なお、本採尿からの実験は、九州大学医系地区部局臨床研究倫理審査委員会の承認（許可番号２９－３４０）の下、実施された。
健常人から、～１０ｍＬの尿を採取した。尿試料を、２０℃で２，０００×ｇで１０分間遠心分離して尿を得て、その後に約２０℃で約２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、尿内脂質及び細胞残余物、血液由来成分などを除去し、上澄み液を下記実験に使用した。なお、本採尿からの実験は、九州大学医系地区部局臨床研究倫理審査委員会の承認（許可番号２９－３４０）の下、実施された。
【0058】
得られた尿１２００μＬを２０℃で１８，９００×ｇで３０分間遠心分離した。遠心分離された結果物から上澄み液を除去し、ペレットにおいてマイクロベシクル画分を濃縮した。このペレットに対して、終濃度１０ｍｇ／ｍＬのＤＴＴを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１８０μＬを添加した。ボルテックスにて撹拌後、３７℃で１０分間静置した。静置後、２０℃で１８，９００×ｇで３０分遠心分離した。遠心分離された結果物からペレットにおいてマイクロベシクル画分を濃縮した。
【0059】
《実施例２：フローサイトメーターを用いた尿マイクロベシクルの観測》
Ａ．尿から濃縮したマイクロベシクルの免疫蛍光染色
前記実施例１にてマイクロベシクル画分を濃縮したペレットに対してＰＢＳ６０μＬを添加し、ボルテックスにてマイクロベシクル画分を溶液中に分散させた。この溶液に対し、ＦＩＴＣ－Ａｎｎｅｘｉｎ５（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣ／Ｃｙ７ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ２６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ／Ｃｙ７ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ２２７ ＭＵＣ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ標識ｍｏｕｓｅＩｇＧ（購入したＮｏｒｍａｌ ＭｏｕｓｅＩｇＧ（Ｗａｋｏ社）を、Ｍｉｘ－ｎ－Ｓｔａｉｎ ＡＰＣ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｂｉｏｔｉｕｍ社）に添付の定常プロトコールにて標識したもの）を、各々１μＬ添加し、室温で３０分静置した。
Ａ．尿から濃縮したマイクロベシクルの免疫蛍光染色
前記実施例１にてマイクロベシクル画分を濃縮したペレットに対してＰＢＳ６０μＬを添加し、ボルテックスにてマイクロベシクル画分を溶液中に分散させた。この溶液に対し、ＦＩＴＣ－Ａｎｎｅｘｉｎ５（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣ／Ｃｙ７ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ２６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ／Ｃｙ７ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ２２７ ＭＵＣ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ標識ｍｏｕｓｅＩｇＧ（購入したＮｏｒｍａｌ ＭｏｕｓｅＩｇＧ（Ｗａｋｏ社）を、Ｍｉｘ－ｎ－Ｓｔａｉｎ ＡＰＣ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（Ｂｉｏｔｉｕｍ社）に添付の定常プロトコールにて標識したもの）を、各々１μＬ添加し、室温で３０分静置した。
【0060】
Ｂ．フローサイトメーターでの尿中マイクロベシクルの観測
測定は、フローサイトメーターとしてＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて行った。測定手順とパラメータ設定は次のとおりである。サンプルは前記実施例２Ａで各種蛍光染色した画分を７５０μＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、０．１４ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２に懸濁したものを使用した。流量（Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）は１２μＬ／ｍｉｎ、前方散乱光の電圧（Ｖｏｌｔａｇｅ）は３８１、側方散乱光の電圧は３４０に設定し、それぞれの閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）として２００に設定した。各蛍光物質に対する励起光（Ｅｘ．）及び蛍光検出フィルター（Ｅｍ．）の波長及び電圧は、ＦＩＴＣ：Ｅｘ．４８８ｎｍ、Ｅｍ．５２７／３２ｎｍ、電圧４４２、ＰＥ：Ｅｘ．４８８ｎｍ、Ｅｍ．５８６／４２ｎｍ、電圧４１１、ＰｅｒＣＰ：Ｅｘ．４８８ｎｍ、Ｅｍ．７００／５４ｎｍ、電圧５５６、ＰＥ／Ｃｙ７：Ｅｘ．４８８ｎｍ、Ｅｍ．７８３／５６ｎｍ、電圧５６４．３、ＡＰＣ：Ｅｘ．６４０ｎｍ、Ｅｍ．６６０／１０ｎｍ、電圧５３８．２、ＡＰＣ／Ｃｙ７：Ｅｘ．６４０ｎｍ、Ｅｍ．７８３／５６ｎｍ、電圧５８４．８、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１：Ｅｘ．４０５ｎｍ、Ｅｍ．４４８／４５ｎｍ、電圧５３８．２とした。
測定は、フローサイトメーターとしてＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて行った。測定手順とパラメータ設定は次のとおりである。サンプルは前記実施例２Ａで各種蛍光染色した画分を７５０μＬの１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、０．１４ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２に懸濁したものを使用した。流量（Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ）は１２μＬ／ｍｉｎ、前方散乱光の電圧（Ｖｏｌｔａｇｅ）は３８１、側方散乱光の電圧は３４０に設定し、それぞれの閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）として２００に設定した。各蛍光物質に対する励起光（Ｅｘ．）及び蛍光検出フィルター（Ｅｍ．）の波長及び電圧は、ＦＩＴＣ：Ｅｘ．４８８ｎｍ、Ｅｍ．５２７／３２ｎｍ、電圧４４２、ＰＥ：Ｅｘ．４８８ｎｍ、Ｅｍ．５８６／４２ｎｍ、電圧４１１、ＰｅｒＣＰ：Ｅｘ．４８８ｎｍ、Ｅｍ．７００／５４ｎｍ、電圧５５６、ＰＥ／Ｃｙ７：Ｅｘ．４８８ｎｍ、Ｅｍ．７８３／５６ｎｍ、電圧５６４．３、ＡＰＣ：Ｅｘ．６４０ｎｍ、Ｅｍ．６６０／１０ｎｍ、電圧５３８．２、ＡＰＣ／Ｃｙ７：Ｅｘ．６４０ｎｍ、Ｅｍ．７８３／５６ｎｍ、電圧５８４．８、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ４２１：Ｅｘ．４０５ｎｍ、Ｅｍ．４４８／４５ｎｍ、電圧５３８．２とした。
【0061】
Ｃ．設定した観測域におけるポリスチレンビーズによるサイズ検証測定
前記にて設定したフローサイトメーターのパラメータにおいて、観測域における粒子径を推定するためにサイズが均一なポリスチレンビーズ（ＳＰＨＥＲＯＴＭ Ｎａｎｏ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｓｉｚｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｋｉｔ、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）の測定を行った。ポリスチレンビーズのサイズはその粒子径が０．２２μｍ、０．４５μｍ、０．８８μｍ、１．３５μｍのものを使用した。
前記にて設定したフローサイトメーターのパラメータにおいて、観測域における粒子径を推定するためにサイズが均一なポリスチレンビーズ（ＳＰＨＥＲＯＴＭ Ｎａｎｏ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｓｉｚｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｋｉｔ、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）の測定を行った。ポリスチレンビーズのサイズはその粒子径が０．２２μｍ、０．４５μｍ、０．８８μｍ、１．３５μｍのものを使用した。
【0062】
Ｄ．フローサイトメーターでのマイクロベシクル測定結果の解釈
測定データを横軸：側方散乱光（ＳＳＣ）の強度、縦軸：ＦＩＴＣ（Ａｎｎｅｘｉｎ５）強度にて展開した観測像を図１に示す。この図において蛍光強度の大きい領域をＡｎｎｅｘｉｎ５陽性集団とし、また蛍光強度の小さい領域をＡｎｎｅｘｉｎ５陰性集団とした。また側方散乱光の強度と０．２２～１．３５μｍのポリスチレンビーズのサイズが観測域にて比例関係にあり、特に０．２２μｍと０．４５μｍの直径を有するポリスチレンビーズ間にマイクロベシクル画分の中央値が集積するように観測された。
測定データを横軸：側方散乱光（ＳＳＣ）の強度、縦軸：ＦＩＴＣ（Ａｎｎｅｘｉｎ５）強度にて展開した観測像を図１に示す。この図において蛍光強度の大きい領域をＡｎｎｅｘｉｎ５陽性集団とし、また蛍光強度の小さい領域をＡｎｎｅｘｉｎ５陰性集団とした。また側方散乱光の強度と０．２２～１．３５μｍのポリスチレンビーズのサイズが観測域にて比例関係にあり、特に０．２２μｍと０．４５μｍの直径を有するポリスチレンビーズ間にマイクロベシクル画分の中央値が集積するように観測された。
【0063】
《実施例３：尿から濃縮したマイクロベシクル画分の電子顕微鏡観測》
Ａ．尿中マイクロベシクルの固定化
実施例１においてマイクロベシクル画分を濃縮したペレットに対してＰＢＳ１００μＬを添加し、これに対し固定液（４％パラフォルムアルデヒド、４％グルタルアルデヒド含有の０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））１００μＬを添加し、撹拌後、４℃にて１時間静置した。
Ａ．尿中マイクロベシクルの固定化
実施例１においてマイクロベシクル画分を濃縮したペレットに対してＰＢＳ１００μＬを添加し、これに対し固定液（４％パラフォルムアルデヒド、４％グルタルアルデヒド含有の０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））１００μＬを添加し、撹拌後、４℃にて１時間静置した。
【0064】
Ｂ．ネガティブ染色法
上記固定化したサンプルをグリッドがコートされたフォルムバールフィルム（ｆｏｒｍｖａｒ ｆｉｌｍ）に吸着させて、２％のリン・タングステン酸（ｐＨ７．０）で３０秒間染色した。
上記固定化したサンプルをグリッドがコートされたフォルムバールフィルム（ｆｏｒｍｖａｒ ｆｉｌｍ）に吸着させて、２％のリン・タングステン酸（ｐＨ７．０）で３０秒間染色した。
【0065】
Ｃ．透過型電子顕微鏡での観測
上記のグリッドを透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ－１４００；ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．）にて観測した。加速電圧（ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｖｏｌｔａｇｅ）は１００ｋＶに設定した。デジタルイメージ（３２９６×２４７２ｐｉｘｅｌｓ）はＣＣＤカメラ（ＥＭ－１４８３０ＲＵＢＹ２；ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．）にて取得した。観察画像を図２に示す。マイクロベシクルの大きさを有し、膜構造及びその内側に内部構造として含有されるもの（オルガネラ他）を含む微小膜画分が検出された。
上記のグリッドを透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ－１４００；ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．）にて観測した。加速電圧（ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｖｏｌｔａｇｅ）は１００ｋＶに設定した。デジタルイメージ（３２９６×２４７２ｐｉｘｅｌｓ）はＣＣＤカメラ（ＥＭ－１４８３０ＲＵＢＹ２；ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．）にて取得した。観察画像を図２に示す。マイクロベシクルの大きさを有し、膜構造及びその内側に内部構造として含有されるもの（オルガネラ他）を含む微小膜画分が検出された。
【0066】
《実施例４：ナノ粒子解析システムによる抽出画分の粒子計測》
実施例１においてマイクロベシクル画分を濃縮したペレットに対してＰＢＳ１００μＬを添加し、さらにＰＢＳにて３倍希釈したものをＮａｎｏｓｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社）にて測定した。装置の観測条件を表１に示す。ナノ粒子解析システムによる粒度分布ヒストグラムを図３に示す。本濃縮操作にて直径が１μｍ以上の画分は殆ど含まれず、直径が６００μｍ以下の画分に濃縮され、その粒子径として２００～３００ｎｍ程度に均一な集団をメインに含有し、それ以下の粒子径（～１００ｎｍ）を含む画分であることが確認された。
実施例１においてマイクロベシクル画分を濃縮したペレットに対してＰＢＳ１００μＬを添加し、さらにＰＢＳにて３倍希釈したものをＮａｎｏｓｉｇｈｔ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社）にて測定した。装置の観測条件を表１に示す。ナノ粒子解析システムによる粒度分布ヒストグラムを図３に示す。本濃縮操作にて直径が１μｍ以上の画分は殆ど含まれず、直径が６００μｍ以下の画分に濃縮され、その粒子径として２００～３００ｎｍ程度に均一な集団をメインに含有し、それ以下の粒子径（～１００ｎｍ）を含む画分であることが確認された。
【0067】
【表1】
【0068】
《実施例５：ショットガンプロテオミクス解析による濃縮マイクロベシクル画分において検出された蛋白質》
Ａ．尿の前処理により得られた濃縮マイクロベシクル画分から蛋白質画分の抽出
実施例１においてマイクロベシクル画分を濃縮した画分から、特に膜蛋白質を効率よく抽出するためにＰＴＳ（Ｐｈａｓｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ（相間移動可溶化剤））を用いた蛋白質可溶化法を実施した。この原理を用いた試薬キットとしてＭＰＥＸ ＰＴＳ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ＭＳ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）を使用した。実施例１においてマイクロベシクル画分を濃縮したペレットに対して２５０μＬの当該キット試薬Ｂを添加し、超音波ホモジナイザー（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ：ソニック・バイオ社）にて稼働１分３０秒、インターバル３０秒からなるサイクルを１０回、１０℃の条件でソニケーション（パワー：ＭＡＸ）した。破砕後、遠心式フィルター（Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ ３Ｋ、メルク）にて１４，０００ｇ×１５ｍｉｎを２回繰り返し、濃縮した。この画分をＢＣＡアッセイ（ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用）にて蛋白質定量した。
Ａ．尿の前処理により得られた濃縮マイクロベシクル画分から蛋白質画分の抽出
実施例１においてマイクロベシクル画分を濃縮した画分から、特に膜蛋白質を効率よく抽出するためにＰＴＳ（Ｐｈａｓｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ（相間移動可溶化剤））を用いた蛋白質可溶化法を実施した。この原理を用いた試薬キットとしてＭＰＥＸ ＰＴＳ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ＭＳ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）を使用した。実施例１においてマイクロベシクル画分を濃縮したペレットに対して２５０μＬの当該キット試薬Ｂを添加し、超音波ホモジナイザー（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ：ソニック・バイオ社）にて稼働１分３０秒、インターバル３０秒からなるサイクルを１０回、１０℃の条件でソニケーション（パワー：ＭＡＸ）した。破砕後、遠心式フィルター（Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ ３Ｋ、メルク）にて１４，０００ｇ×１５ｍｉｎを２回繰り返し、濃縮した。この画分をＢＣＡアッセイ（ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用）にて蛋白質定量した。
【0069】
Ｂ．蛋白質画分の酵素消化
ＢＣＡアッセイにて定量し、３０μｇ／２０μＬの濃度になるように前記試薬Ｂに溶解したものを膜蛋白質消化のための試料とした。１μＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加え（ジスルフィド結合の還元開裂のため）、室温で３０分間インキュベートした。これに１μＬの５５０ｍｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミドを加え（Ｃｙｓのカルバミドメチル化のため）、遮光して室温で３０分間インキュベートした。当該キットの試薬Ａを７７μＬ加え、１．５μＬのトリプシン（ＴＰＣＫ－Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．：Ｐｒｏｄ＃２０２３３））を加えた。室温で一晩インキュベートして蛋白消化を実施した。１５０μＬの試薬Ｃと１．５μＬの試薬Ｄを加えた。添加後１分間ボルテックスをして、２５℃、１５，６００×ｇで２分間遠心し二相分離した。不要な可溶化剤は上相にくるので、これをピペットで吸引し除去した。残った試薬Ｃを除去するために、遠心濃縮を行った後に、５０μＬの５％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えてボルテックスした。
ＢＣＡアッセイにて定量し、３０μｇ／２０μＬの濃度になるように前記試薬Ｂに溶解したものを膜蛋白質消化のための試料とした。１μＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加え（ジスルフィド結合の還元開裂のため）、室温で３０分間インキュベートした。これに１μＬの５５０ｍｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミドを加え（Ｃｙｓのカルバミドメチル化のため）、遮光して室温で３０分間インキュベートした。当該キットの試薬Ａを７７μＬ加え、１．５μＬのトリプシン（ＴＰＣＫ－Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．：Ｐｒｏｄ＃２０２３３））を加えた。室温で一晩インキュベートして蛋白消化を実施した。１５０μＬの試薬Ｃと１．５μＬの試薬Ｄを加えた。添加後１分間ボルテックスをして、２５℃、１５，６００×ｇで２分間遠心し二相分離した。不要な可溶化剤は上相にくるので、これをピペットで吸引し除去した。残った試薬Ｃを除去するために、遠心濃縮を行った後に、５０μＬの５％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えてボルテックスした。
【0070】
Ｃ．ペプチドの脱塩・濃縮
前記にて酵素消化したものを脱塩・濃縮するためにＧＬ－Ｔｉｐ ＳＤＢ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ）を使用した。当該チップをまず、８０％アセトニトリル、０．１％ ＴＦＡ水溶液を２０μＬ添加し、室温、３，０００×ｇで２分間遠心することでコンディショニングした。これに５％アセトニトリル、０．１％ ＴＦＡ水溶液を２０μＬ添加し、室温、３，０００×ｇで２分間遠心することでカラムを平衡化した。これに対して、前記実施例５Ｂの操作で得られた試料を全量添加し、室温、３，０００×ｇで５分間遠心することでペプチドをカラムに吸着させた。さらに５％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ水溶液を２０μＬ添加し、室温、３，０００×ｇで２分間遠心することでカラムを洗浄後、８０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ水溶液を５０μＬ添加し、室温、３，０００×ｇで２分間遠心することで、ペプチドを溶出させた。
前記にて酵素消化したものを脱塩・濃縮するためにＧＬ－Ｔｉｐ ＳＤＢ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ）を使用した。当該チップをまず、８０％アセトニトリル、０．１％ ＴＦＡ水溶液を２０μＬ添加し、室温、３，０００×ｇで２分間遠心することでコンディショニングした。これに５％アセトニトリル、０．１％ ＴＦＡ水溶液を２０μＬ添加し、室温、３，０００×ｇで２分間遠心することでカラムを平衡化した。これに対して、前記実施例５Ｂの操作で得られた試料を全量添加し、室温、３，０００×ｇで５分間遠心することでペプチドをカラムに吸着させた。さらに５％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ水溶液を２０μＬ添加し、室温、３，０００×ｇで２分間遠心することでカラムを洗浄後、８０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ水溶液を５０μＬ添加し、室温、３，０００×ｇで２分間遠心することで、ペプチドを溶出させた。
【0071】
Ｄ．質量分析測定
上記サンプルを、ｎａｎｏ－ＬＣシステム（ＥＡＳＹ－ｎＬＣ１０００：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を連結したフーリエ変換型Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）で、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析を行った。上記にて調製した質量分析測定用サンプルから２μＬを測定に供した。なお、トラップカラムとしてＡｃｃｌａｉｍＲＴＰｅｐＭａｐ１００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．：Ｃ１８、充填剤径３μｍ、内径７５μｍ、カラム長２ｃｍ）、分析カラムとして、ＡｃｃｌａｉｍＲＴＰｅｐＭａｐＲＳＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．：Ｃ１８、充填剤径２μｍ、内径５０μｍ、カラム長１５ｃｍ）を用いた。移動相Ａは０．１％蟻酸水溶液、移動相Ｂは０．１％蟻酸／アセトニトリル、流量は２００ｎＬ／分、グラジエントは、０－４０％移動相Ｂ／２００分間、４０－１００％移動相Ｂ／１０分間、１００％移動相Ｂ／１０分間で測定した。
上記サンプルを、ｎａｎｏ－ＬＣシステム（ＥＡＳＹ－ｎＬＣ１０００：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を連結したフーリエ変換型Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）で、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析を行った。上記にて調製した質量分析測定用サンプルから２μＬを測定に供した。なお、トラップカラムとしてＡｃｃｌａｉｍＲＴＰｅｐＭａｐ１００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．：Ｃ１８、充填剤径３μｍ、内径７５μｍ、カラム長２ｃｍ）、分析カラムとして、ＡｃｃｌａｉｍＲＴＰｅｐＭａｐＲＳＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．：Ｃ１８、充填剤径２μｍ、内径５０μｍ、カラム長１５ｃｍ）を用いた。移動相Ａは０．１％蟻酸水溶液、移動相Ｂは０．１％蟻酸／アセトニトリル、流量は２００ｎＬ／分、グラジエントは、０－４０％移動相Ｂ／２００分間、４０－１００％移動相Ｂ／１０分間、１００％移動相Ｂ／１０分間で測定した。
【0072】
ＭＳ測定のスキャン条件はＦｕｌｌ ＭＳ／ｄｄ－ＭＳ２モードを使用しＦｕｌｌ ＭＳをスキャンした後に、強度が高いシグナルのＭＳ／ＭＳスペクトルを取得した。設定条件を表２に示す。
【0073】
【表2】
【0074】
Ｅ．データ解析
得られたデータはＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １．４ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）にて、ヒトタンパク質データベースＨｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ＿Ｕｎｉｐｒｏｔ＿２０１２１０．ｆａｓｔに対してＳｅｑｕｅｓｔＨＴアルゴリズムにより検索を行った。ＳｅｑｕｅｓｔＨＴでの検索条件を表３に示す。
得られたデータはＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １．４ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）にて、ヒトタンパク質データベースＨｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ＿Ｕｎｉｐｒｏｔ＿２０１２１０．ｆａｓｔに対してＳｅｑｕｅｓｔＨＴアルゴリズムにより検索を行った。ＳｅｑｕｅｓｔＨＴでの検索条件を表３に示す。
【0075】
【表3】
【0076】
検索結果からＳｃｏｒｅ１．０以上のものをピックアップした。抽出したマイクロベシクル画分のショットガンプロテオミクス解析により検出できた蛋白質の一覧を表４に、その中で上位にスコアリングされたタンパク質の内、フローサイトメーターでのキャラクタライズに使用した表面抗原を表５に、それぞれ、示す。また、ショットガンプロテオミクス解析により検出した蛋白質からｍｅｔａｓｃａｐｅ（Tripathi et al., Cell Host & Microbe (2015), 18: 723-735）を使用した蛋白質のエンリッチメント解析結果を図４に、そのエンリッチメント解析結果をクラスター毎にネットワーク解析した結果を図５に、それぞれ、示す。表４に示す蛋白質は細胞膜や細胞内にカテゴライズされるものが多いが、物質輸送や栄養素リサイクル、代謝、生合成といった機能を有すものが含まれ（図４）、これら検出された蛋白質はマイクロベシクルをキャラクタライズする表面マーカーとして、またその内容物をバイオマーカー利用として、臨床検査や診断に使用できる可能性がある。
【0077】
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【表4-4】
【表4-5】
【表4-6】
【表4-7】
【表4-8】
【表4-9】
【表4-10】
【表4-11】
【表4-12】
【表4-13】
【表4-14】
【表4-15】
【表4-16】
【表4-17】
【表4-18】
【表4-19】
【表4-20】
【表4-21】
【表4-22】
【表4-23】
【表4-24】
【表4-25】
【表4-26】
【表4-27】
【表4-28】
【0078】
【表5】
【0079】
《実施例６：フローサイトメーターを用いた尿マイクロベシクルのキャラクタライゼーション》
Ａ．パルス処理による凝集マイクロベシクルのゲートアウト（観測像からの除外）
実施例１においてマイクロベシクル画分を濃縮した画分を各表面抗原で染色し、実施例２のフローサイトメーターの観測条件にて測定した。このとき、観測像の中にはマイクロベシクルが凝集して複数個合体したような像が観測された（各種染色した表面抗原が全て陽性集団となるような集団）。これを観測像から除去するために、側方散乱光におけるパルス幅（縦軸）とパルスエリア（横軸）で展開した観察像（図６）を用意して、大きく外れた集団を観測像から除外した。
Ａ．パルス処理による凝集マイクロベシクルのゲートアウト（観測像からの除外）
実施例１においてマイクロベシクル画分を濃縮した画分を各表面抗原で染色し、実施例２のフローサイトメーターの観測条件にて測定した。このとき、観測像の中にはマイクロベシクルが凝集して複数個合体したような像が観測された（各種染色した表面抗原が全て陽性集団となるような集団）。これを観測像から除去するために、側方散乱光におけるパルス幅（縦軸）とパルスエリア（横軸）で展開した観察像（図６）を用意して、大きく外れた集団を観測像から除外した。
【0080】
Ｂ. ＴＨＰポリマーのゲートアウト（観測像からの除外）
上記実施例６Ａの操作後に、側方散乱光とＡＰＣマウスＩｇＧの展開図からＡＰＣ陽性集団すなわち残存ＴＨＰポリマーがキャプチャーしうるマウスＩｇＧ集団を抽出し、ＡＰＣ陽性となる集団を抽出し観測像から除外した（図７）。
上記実施例６Ａの操作後に、側方散乱光とＡＰＣマウスＩｇＧの展開図からＡＰＣ陽性集団すなわち残存ＴＨＰポリマーがキャプチャーしうるマウスＩｇＧ集団を抽出し、ＡＰＣ陽性となる集団を抽出し観測像から除外した（図７）。
【0081】
Ｃ．ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６陽性となるマイクロベシクルのキャラクタライゼーション
上記実施例Ａ、実施例Ｂの操作後に、ＣＤ１０及びＣＤ１３の展開図からこれらが２種類ともに陽性となる集団を抽出し、さらにＣＤ２６陽性となる集団を選別した。この集団をＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６陽性マイクロベシクルとし、観測された全体における本集団の割合は６６％であった。これら３種のＣＤマーカーは全て膜に存在するペプチダーゼであり、蛋白質を分解する機能を当該マイクロベシクルが有している可能性がある（図８）。
上記実施例Ａ、実施例Ｂの操作後に、ＣＤ１０及びＣＤ１３の展開図からこれらが２種類ともに陽性となる集団を抽出し、さらにＣＤ２６陽性となる集団を選別した。この集団をＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６陽性マイクロベシクルとし、観測された全体における本集団の割合は６６％であった。これら３種のＣＤマーカーは全て膜に存在するペプチダーゼであり、蛋白質を分解する機能を当該マイクロベシクルが有している可能性がある（図８）。
【0082】
Ｄ．ＭＵＣ１陽性マイクロベシクルのキャラクタライゼーション
上記実施例Ａ、実施例Ｂの操作後に、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）及び側方散乱光の展開図からＭＵＣ１陽性集団を抽出し、更にこの集団からＡｎｎｅｘｉｎ５陽性となる集団を選別した。この集団をＭＵＣ１陽性マイクロベシクルとし、観測された全体における本集団の割合は２．４％であった（図９）。
上記実施例Ａ、実施例Ｂの操作後に、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）及び側方散乱光の展開図からＭＵＣ１陽性集団を抽出し、更にこの集団からＡｎｎｅｘｉｎ５陽性となる集団を選別した。この集団をＭＵＣ１陽性マイクロベシクルとし、観測された全体における本集団の割合は２．４％であった（図９）。
【0083】
Ｅ．尿マイクロベシクルの２分類
上記において、それぞれが由来する細胞集団へのマイクロベシクルのキャラクタライゼーション後に側方散乱光とＡｎｎｅｘｉｎ５の展開図へ重ね合わせた図の一例を図１０に示す。
上記において、それぞれが由来する細胞集団へのマイクロベシクルのキャラクタライゼーション後に側方散乱光とＡｎｎｅｘｉｎ５の展開図へ重ね合わせた図の一例を図１０に示す。
【0084】
Ｆ．各細胞由来マイクロベシクルのＡｎｎｅｘｉｎ５陽性と陰性によるキャラクタライゼーション
前記実施例６Ｂの操作後に、側方散乱光とＡｎｎｅｘｉｎ５の展開図からＡｎｎｅｘｉｎ５陽性と陰性集団を抽出し、この集団から前記Ｃ、Ｄで示したＣＤ抗原を用いた由来細胞からのマイクロベシクルキャラクタライゼーションも行った（図１１）。由来するベシクルごとにＡｎｎｅｘｉｎ５陽性と陰性の割合を比較したところＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６陽性となるマイクロベシクルはＡｎｎｅｘｉｎ５陰性集団が多かった（図１２）。なお、比較検定はウィルコクソンの符号順位検定を用いた（* p< 0.05, ** p < 0.01）。
従来より利用されているマイクロベシクルのマーカー（例えばＡｎｎｅｘｉｎ５）について、上記結果より、Ａｎｎｅｘｉｎ５陰性のマイクロベシクルが多数存在し、その割合も由来する細胞ごとに大きな違いがあることが明らかとなった。すなわち、各細胞に由来するマイクロベシクル中の物質の挙動が従来とは異なる可能性が見いだされた。このことは、従来より利用されている方法を利用したキャラクタライゼーションのみではマイクロベシクルの正確な性質を見落とす可能性がある。本発明を利用することで、疾患部位の特定や診断目的にマッチした結果を得るための臨床検査材料を入手することができる可能性があることが示唆された。
前記実施例６Ｂの操作後に、側方散乱光とＡｎｎｅｘｉｎ５の展開図からＡｎｎｅｘｉｎ５陽性と陰性集団を抽出し、この集団から前記Ｃ、Ｄで示したＣＤ抗原を用いた由来細胞からのマイクロベシクルキャラクタライゼーションも行った（図１１）。由来するベシクルごとにＡｎｎｅｘｉｎ５陽性と陰性の割合を比較したところＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６陽性となるマイクロベシクルはＡｎｎｅｘｉｎ５陰性集団が多かった（図１２）。なお、比較検定はウィルコクソンの符号順位検定を用いた（* p< 0.05, ** p < 0.01）。
従来より利用されているマイクロベシクルのマーカー（例えばＡｎｎｅｘｉｎ５）について、上記結果より、Ａｎｎｅｘｉｎ５陰性のマイクロベシクルが多数存在し、その割合も由来する細胞ごとに大きな違いがあることが明らかとなった。すなわち、各細胞に由来するマイクロベシクル中の物質の挙動が従来とは異なる可能性が見いだされた。このことは、従来より利用されている方法を利用したキャラクタライゼーションのみではマイクロベシクルの正確な性質を見落とす可能性がある。本発明を利用することで、疾患部位の特定や診断目的にマッチした結果を得るための臨床検査材料を入手することができる可能性があることが示唆された。
【0085】
《実施例７：尿マイクロベシクルのＣＤ２６（Dipeptidyl peptidase 4）のペプチド切断活性の測定》
実施例１においてマイクロベシクル画分を濃縮した画分に対して元々のサンプル量と同様の緩衝液を加えたもの（マイクロベシクル画分）、マイクロベシクル画分を除いた上清（上清画分）、元々の尿画分（ただし２０００ｇｘ１０分を２回実施して細胞残余物は除いたもの）の３画分を準備し、それぞれの画分を用いて、ＣＤ２６（Dipeptidyl peptidase 4）のペプチド切断活性を測定した。活性測定には合成基質 H-Gly-Pro-7-amido-4-methylcoumarin hydrobromideを使用した。溶液中のペプチダーゼ活性によりH-Gly-Pro-7-amido-4-methylcoumarin hydrobromideが切断を受けて、7-Amino-4-methylcoumarinが産生されるとその蛍光発色する。３画分を測定し、元々の尿画分を１００％とした場合、マイクロベシクル画分は３０％程度の酵素活性が含有されることを見出した（図１３）。
上記結果から、本発明を用いて分離・濃縮されたマイクロベシクル画分中に含まれるプロテアーゼ等の酵素類は元検体中の性状をそのまま維持・反映しているものであることが確認された。従って、実施例６－Fに加えて実施例７の結果からも、本発明を利用することで、疾患部位の特定や診断目的にマッチした結果を得るための臨床検査材料を入手することができる可能性があることが示唆された。
実施例１においてマイクロベシクル画分を濃縮した画分に対して元々のサンプル量と同様の緩衝液を加えたもの（マイクロベシクル画分）、マイクロベシクル画分を除いた上清（上清画分）、元々の尿画分（ただし２０００ｇｘ１０分を２回実施して細胞残余物は除いたもの）の３画分を準備し、それぞれの画分を用いて、ＣＤ２６（Dipeptidyl peptidase 4）のペプチド切断活性を測定した。活性測定には合成基質 H-Gly-Pro-7-amido-4-methylcoumarin hydrobromideを使用した。溶液中のペプチダーゼ活性によりH-Gly-Pro-7-amido-4-methylcoumarin hydrobromideが切断を受けて、7-Amino-4-methylcoumarinが産生されるとその蛍光発色する。３画分を測定し、元々の尿画分を１００％とした場合、マイクロベシクル画分は３０％程度の酵素活性が含有されることを見出した（図１３）。
上記結果から、本発明を用いて分離・濃縮されたマイクロベシクル画分中に含まれるプロテアーゼ等の酵素類は元検体中の性状をそのまま維持・反映しているものであることが確認された。従って、実施例６－Fに加えて実施例７の結果からも、本発明を利用することで、疾患部位の特定や診断目的にマッチした結果を得るための臨床検査材料を入手することができる可能性があることが示唆された。
【0086】
以上の結果より、尿中のマイクロベシクルを濃縮し、ＴＨＰポリマーを分解、除去しうる方法により、マイクロベシクル画分にフォーカスした観測法が確立できて、個々のマイクロベシクルが表面に有している蛋白質を用いてキャラクタライゼーションできることが示された。本発明を用いることで、尿中に存在する個々のマイクロベシクルの由来する細胞や臓器を判別し、その増減や含有率などを測定することが可能になった。
【産業上の利用可能性】
【0087】
本発明におけるマイクロベシクルを濃縮する前処理法は特に複雑な操作を伴うことなく、ＴＨＰポリマーを上手く除去して、効率よくマイクロベシクル抽出することが可能である。当該、前処理法を実施することで、マイクロベシクルに含有されるバイオマーカーとなるべく候補物質（実施例では蛋白質の一覧を例示）を濃縮することができ、尿を直接測定するよりも高感度な測定を実施できる可能性がある。
【0088】
また、本発明によれば、簡便にマイクロベシクルの表面抗原によって個々の尿中マイクロベシクルのキャラクタライゼーションを行うことができ、どういった細胞や臓器に由来したマイクロベシクルが存在するのかを測定／定量／解析することができる。マイクロベシクルなどの微小膜画分には細胞や臓器間コミュニケーションに必要な伝達物質が含まれリキッドバイオプシとしての臨床応用が期待されているが、表面抗原そのものにも標的臓器や細胞との接着や相互作用としての臨床的、生理的な意味合いが含有されると思われる。特に尿中のマイクロベシクルは蛋白質分解作用のあるペプチダーゼをその表面に有しており、その機能活性が臨床的な意味合いを持つ可能性が高いと考えられる。
【0089】
これらのことは本発明によるマイクロベシクルの観測が特定の疾患や患者の状態を判定する検査法への応用や健康状態→未病（疾病予備軍）状態への個人の遷移などを日々管理しうる予防、予知マーカーとしての臨床応用なども考えられる。より微小な粒子をダイナミックレンジの広い性能にて、表面抗原と合わせて測定できる系があればエクソソーム、マイクロベシクルなどを含めて微小膜画分としての臨床応用価値を高めることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
