特許 7444471 グリカン依存性免疫療法分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-02-27

(45)【発行日】2024-03-06

(54)【発明の名称】グリカン依存性免疫療法分子

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20240228BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240228BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240228BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240228BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240228BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240228BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20240228BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240228BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20240228BHJP

   A61K 47/66 20170101ALI20240228BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240228BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240228BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20240228BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240228BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240228BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240228BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240228BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240228BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240228BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240228BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20240228BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61P35/00 ZNA

A61P43/00 121

A61K38/17

A61K35/12

A61K35/17

A61K39/00 H

A61K47/68

A61K47/64

A61K47/66

A61K39/395 N

C07K16/28

C07K16/18

C07K19/00

C07K16/46

C12N15/13

C12N15/12

C12N15/62 Z

C12N5/10

A61K38/16

C12N15/63 Z

【請求項の数】 28

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2021168790

(22)【出願日】2021-10-14

(62)【分割の表示】P 2018508625の分割

【原出願日】2016-04-29

(65)【公開番号】P2022023132

(43)【公開日】2022-02-07

【審査請求日】2021-11-12

(31)【優先権主張番号】62/155,761

(32)【優先日】2015-05-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500210903

【氏名又は名称】ザ、リージェンツ、オブ、ザ、ユニバーシティ、オブ、カリフォルニア

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】デメトリウ，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】シュウ，レイモンド・ウェンホウ

【審査官】松浦 安紀子

(56)【参考文献】

【文献】特表２００６－５１４６９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００８／０５３４８６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１８－５１４５９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５２８００３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３８／１６

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ａ６１Ｋ ３８／１７

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３５／１２

Ａ６１Ｋ ３５／１７

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ａ６１Ｋ ４７／６８

Ａ６１Ｋ ４７／６４

Ａ６１Ｋ ４７／６６

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ｃ０７Ｋ １６／２８

Ｃ０７Ｋ １６／１８

Ｃ０７Ｋ １９／００

Ｃ０７Ｋ １６／４６

Ｃ１２Ｎ １５／１３

Ｃ１２Ｎ １５／１２

Ｃ１２Ｎ １５／６２

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｎ １５／６３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

レクチンに由来する腫瘍関連糖鎖抗原（ＴＡＣＡ）結合ドメインを含むペプチドを含む免疫療法分子をコードする単離された核酸分子であって、
免疫療法分子が、
（ｉ）レクチンに由来する腫瘍関連糖鎖抗原（ＴＡＣＡ）結合ドメイン及び免疫エフェクター細胞に特異的に結合するドメインを含む、融合タンパク質；又は
（ｉｉ）レクチンに由来するＴＡＣＡ結合ドメインを含む抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
であり、
ＴＡＣＡ結合ドメインは、腫瘍細胞のＴＡＣＡに特異的に結合し；そして
レクチンは、ガレクチン、シグレック、セレクチン；Ｃ型レクチン；ＣＤ３０１、Ｌ－ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓロイコアグルチニン）；Ｅ－ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓエリスロアグルチニン）；トマトレクチン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍレクチン；ＬＥＡ）；ピーナッツレクチン（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａアグルチニン；ＰＮＡ）；ジャガイモレクチン（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍレクチン）、ヨウシュヤマゴボウマイトジェン（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ Ａｍｅｒｉｃａｎレクチン）、コムギ胚芽アグルチニン（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ Ｖｕｌｇａｒｉｓレクチン）；Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓレクチン（Ｊａｃａｌｉｎレクチン）；Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａアグルチニン（ＶＶＡ）；Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａアグルチニン（ＨＰＡ）；Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａアグルチニン（ＷＦＡ）；Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａアグルチニン（ＳＮＡ）、ＢＣ２ＬＣＭ（グラム陰性菌Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ由来レクチン）、Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓロイコアグルチニン（ＭＡＬ）、Ｐｓａｔｈｙｒｅｌｌａ ｖｅｌｕｔｉｎａ（ＰＶＬ）、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉレクチン（ＳＲＬ）、Ｅｕｃｈｅｕｍａ ｓｅｒｒａアグルチニン（ＥＳＡ）、ＣＬＥＣ１７Ａ（Ｐｒｏｌｅｃｔｉｎ）、Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａレクチン、Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａレクチン（ＳＳＡ）、Ｇｌｅｃｈｏｍａ ｈｅｄｅｒａｃｅａレクチン（Ｇｌｅｈｅｄａ）、Ｍｏｒｕｓ ｎｉｇｒａアグルチニン（Ｍｏｒｎｉｇａ Ｇ）、Ｓａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａレクチン、Ｓａｌｖｉａ ｂｏｇｏｔｅｎｓｉｓレクチン、Ｓａｌｖｉａ ｈｏｒｍｉｎｕｍレクチン、Ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｏｍｕｍレクチン、Ｍｏｌｕｃｃｅｌｌａ ｌａｅｖｉｓレクチン、Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ（ＧｓＬＡ４）、Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ（酸性ＷＢＡＩ）、Ａｂｒｕｓ ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓレクチン、Ｍｏｌｕｃｅｌｌａ ｌａｅｖｉｓレクチン（ＭＬＬ）、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｃａｕｄａｔｕｓレクチン、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｌｅｕｃｏｃａｒｐｕｓレクチン、Ｌａｅｌｉａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓレクチン、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａレクチン、Ｍａｃｌｕｒａ ｐｏｍｉｆｅｒａレクチン、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｌａｋｏｏｃｈａレクチン、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓアグルチニン、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓレクチン、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘレクチン、及びＡｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓレクチンからなる群から選択される、
単離された核酸分子。

【請求項2】

前記ガレクチンが、ガレクチン－１、ガレクチン－２、ガレクチン－３、ガレクチン－４、ガレクチン－５、ガレクチン－６、ガレクチン－７、ガレクチン－８、ガレクチン－９、ガレクチン－１０、ガレクチン－１１、ガレクチン－１２、ガレクチン－１３、ガレクチン－１４、及びガレクチン－１５からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項3】

前記シグレックが、シグレック－１（ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｏｎ）、シグレック－２（ＣＤ２２）、シグレック－３（ＣＤ３３）、シグレック－４（ミエリン関連糖タンパク質）、シグレック－５、シグレック－６、シグレック－７、シグレック－８、シグレック－９、シグレック－１０、シグレック－１１、シグレック－１２、シグレック－１３、シグレック－１４、シグレック－１５、シグレック－１６、シグレック－１７、シグレックＥ、シグレックＦ、シグレックＧ、及びシグレックＨからなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項4】

前記ＴＡＣＡ結合ドメインが、β１，６分岐、Ｔ抗原、シアリル－Ｔエピトープ、Ｔｎエピトープ、シアリル－Ｔｎエピトープ、α２，６シアリル化、シアリル化、シアリル－ルイス^ｘ／ａ、ジシアリル－ルイス^ｘ／ａ、シアリル６－スルホルイス^ｘ、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ３、及びフコシルＧＭ１からなる群から選択されるＴＡＣＡに結合する、請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項5】

前記ＴＡＣＡ結合ドメインが、腫瘍細胞のβ１，６ＧｌｃＮＡｃ分岐型Ｎ－グリカンに結合する、請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項6】

（ｉ）腫瘍細胞のＴＡＣＡが、腫瘍細胞のβ１，６ＧｌｃＮＡｃ分岐型Ｎ－グリカン修飾タンパク質であり、ＴＡＣＡ結合ドメインは、Ｌ－ＰＨＡに由来する；
（ｉｉ）腫瘍細胞のＴＡＣＡが、腫瘍細胞のＴｎエピトープ修飾タンパク質であり、ＴＡＣＡ結合ドメインが、Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａアグルチニン（ＶＶＡ）又はＣＤ３０１に由来する；
（ｉｉｉ）腫瘍細胞のＴＡＣＡが、腫瘍細胞のシアリル－Ｔｎエピトープ修飾タンパク質であり、ＴＡＣＡ結合ドメインが、ＣＤ３０１、シグレック１－１７の細胞外ドメイン、又はガレクチン１－１５の細胞外ドメインに由来する；
（ｉｖ）腫瘍細胞のＴＡＣＡが、腫瘍細胞のＧＤ２修飾タンパク質であり、ＴＡＣＡ結合ドメインが、ＣＤ３０１に由来する；
（ｖ）腫瘍細胞のＴＡＣＡが、腫瘍細胞のβ１，６分岐、シアリル化、ＧＭ３、又はジシアリル－ルイス^ｘ／ａ修飾タンパク質であり、ＴＡＣＡ結合ドメインが、シグレック１－１７の細胞外ドメインに由来する；
（ｖｉ）腫瘍細胞のＴＡＣＡが、腫瘍細胞のＮグリカン修飾タンパク質に対するβ１，６分岐であり、ＴＡＣＡ結合ドメインが、トマトレクチン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍレクチン；ＬＥＡ）、シグレック１－１７の細胞外ドメイン、又はガレクチン１－１５の細胞外ドメインに由来する；
（ｖｉｉ）腫瘍細胞のＴＡＣＡが、腫瘍細胞のＴ抗原修飾タンパク質又は脂質であり、ＴＡＣＡ結合ドメインが、ガレクチン１－１５の細胞外ドメインに由来する；
（ｖｉｉｉ）腫瘍細胞のＴＡＣＡが、腫瘍細胞のＧｌｏｂｏ Ｈ修飾タンパク質であり、ＴＡＣＡ結合ドメインが、シグレック１－１７の細胞外ドメイン又はガレクチン１－１５の細胞外ドメインに由来する、
請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項7】

ＴＡＣＡ結合ドメインが、配列番号１、２、３、４、５、６又は７に少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項8】

ＴＡＣＡ結合ドメインが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項9】

融合タンパク質が、Ｆｃドメインに連結されたＴＡＣＡ結合ドメインを含む、Ｆｃ融合タンパク質である、請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項10】

免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞及び好中球からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項11】

免疫エフェクター細胞に特異的に結合するドメインが、Ｔ細胞結合ドメインを含み、Ｔ細胞結合ドメインが、Ｔ細胞に特異的に結合する、請求項１０に記載の単離された核酸分子。

【請求項12】

Ｔ細胞結合ドメインが、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２、ＣＤ２８又はＣＤ２５に結合する、請求項１１に記載の単離された核酸分子。

【請求項13】

Ｔ細胞結合ドメインが、配列番号９及び配列番号９に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の単離された核酸分子。

【請求項14】

融合タンパク質が、配列番号１１，配列番号１１に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１２、配列番号１２に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１３、配列番号１３に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１４、配列番号１４に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１５、配列番号１５に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１６、配列番号１６に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、配列番号１７、配列番号１７に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項15】

免疫エフェクター細胞に特異的に結合するドメインが、ＮＫ細胞結合ドメインを含み、ＮＫ細胞結合ドメインが、ＮＫ細胞に特異的に結合する、請求項１０に記載の単離された核酸分子。

【請求項16】

ＮＫ細胞結合ドメインが、ＣＤ１６又はＮＫＧ２Ｄに結合する、請求項１５に記載の単離された核酸分子。

【請求項17】

膜貫通ドメインが、
（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ、ＴＣＲ－ベータ、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ３－イプシロン、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４からなる群から選択される分子の膜貫通領域；
（ｂ）主に疎水性アミノ酸残基を含む、合成膜貫通ドメイン；又は
（ｃ）フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンのトリプレットを含む、合成膜貫通ドメイン
を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項18】

膜貫通ドメインが、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項19】

キメラ抗原受容体が、さらにヒンジドメインを含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項20】

ヒンジドメインが、ＣＤ８αヒンジドメインである、請求項１９に記載の単離された核酸分子。

【請求項21】

キメラ抗原受容体が、さらに共刺激ドメインを含み、共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、及びそれらの組合せからなる群から選択される分子の共刺激ドメインである、請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項22】

共刺激ドメインが、４－１ＢＢ共刺激ドメインである、請求項２１に記載の単離された核酸分子。

【請求項23】

細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択される分子の細胞内シグナリングドメインを含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項24】

細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内シグナリングドメインである、請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項25】

細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ細胞内シグナリングドメイン、及び
（ｉ）４－１ＢＢ共刺激ドメイン；
（ｉｉ）ＣＤ２８共刺激ドメイン；又は
（ｉｉｉ）４－１ＢＢ及びＣＤ２８共刺激ドメイン
を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項26】

単離された核酸分子が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡである、請求項１に記載の単離された核酸分子。

【請求項27】

請求項１～２６のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。

【請求項28】

請求項１～２６のいずれか一項に記載の単離された核酸分子によりコードされる、免疫療法分子。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年５月１日出願の米国仮特許出願第６２／１５５，７６１号に対する優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

モノクローナル抗体は、従来的アプローチである化学療法及び放射線療法と並び、癌治療の有望な薬剤として開発されてきた。腫瘍細胞上で過剰発現するタンパク質を標的とするモノクローナル抗体を、化学療法薬または放射性同位元素とコンジュゲートすることで、抗体の結合パートナー、主として悪性細胞の死滅を誘導することができる。さらに、裸のモノクローナル抗体は、患者自身の免疫系を利用し、免疫機構の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって、抗体の結合パートナーの殺傷を媒介することができる。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、及び好中球などの免疫エフェクター細胞は、治療抗体のＦｃ鎖を認識するＦｃ受容体を有し、それによって標的細胞破壊をもたらす。抗体は、これらの免疫系のＦｃ受容体発現エフェクター細胞を動員するが、これらの細胞はエフェクター集団の少数を占めるにすぎない。そのため、その臨床有効性は限定されている。

【0003】

最も強力で豊富なエフェクターはＴ細胞である。しかしながら、Ｔ細胞はＦｃ受容体を有しない。Ｔ細胞のエフェクター機能を活用するため、Ｔ細胞と癌細胞の両方に結合する能力を有するような二重特異性抗体のクラスが設計されている。Ｔ細胞を動員して癌細胞を殺傷するために二重特異性抗体を使用するという考え方は、１９８５年に示された（Ｓｔａｅｒｚ ｅｔ ａｌ．１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：６２８－６３１）。以来、さまざまな形式／構造の二重特異性抗体が作製されている。最新かつ最も成功を収めている二重特異性抗体は、二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴＥ）抗体である。２０１４年にＦＤＡは、フィラデルフィア染色体陰性前駆Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ細胞ＡＬＬ、ＡＬＬの希少形態）の治療に対し、Ｔ細胞上のＣＤ３とＢ細胞上のＣＤ１９とを結合するＢｉＴＥ抗体、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ）を承認した。ＢｉＴＥ抗体は、ペプチドの短い配列によって連結された２つの結合アームから構成される二重特異性一本鎖ポリペプチドである。各アーム、すなわち一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、モノクローナル抗体の可変重鎖及び軽鎖に由来する。例えば、Ｂｌｉｎｃｙｔｏは、抗ヒトＣＤ３の結合ドメインを抗ヒトＣＤ１９と結合することによって得られる。

【0004】

癌抗原を標的化するためにモノクローナルまたはＢｉＴＥを利用するにはいくつかの問題がある。まず、癌を標的とするモノクローナル抗体を作製するには、最初に特異的抗原を癌細胞上で同定しなければならない。実際、２０１２年までに米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が承認した、特定の型の癌を治療するモノクローナル抗体は１２に留まった（Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，１２：２７８－２８７）。加えて、異なる癌型にわたる共通のタンパク質抗原はないため、単一のキメラＢｉＴＥタンパク質によって標的化できる癌の数は大幅に制限される。したがって、個別の癌に応じた、固有のＢｉＴＥタンパク質を多数生成する必要があり、開発コストが大幅に増加することになる。最後に、腫瘍特異的抗原は、低レベルではあるが正常組織にも頻繁に発現する。したがって、正常組織も殺傷の対象となる可能性がある。これらはすべて、Ｂｌｉｎｃｙｔｏにも見られ得る問題である。なぜなら、Ｂｌｉｎｃｙｔｏは、１）米国で年間約１，０００例しかない、単一の、希少な治療できない癌を標的とし、また、２）正常なＢ細胞で発現するＣＤ１９を標的としており、癌細胞の殺傷に加えて正常なＢ細胞の枯渇をもたらすためである。より良い方法は、正常組織での発現が限定されるか、または発現しない複数の一般的な癌に存在する抗原を標的とすることである。

【0005】

このように、癌を治療するための改善された組成物及び方法が当技術分野において必要とされている。本発明は、このような未対応の要求を満たすものである。

【発明の概要】

【0006】

一態様では、本発明は、レクチンに由来する腫瘍関連糖鎖抗原（ＴＡＣＡ）結合ドメインを含むペプチドを含み、当該ＴＡＣＡ結合ドメインが腫瘍細胞のＴＡＣＡに特異的に結合する、癌を治療するための組成物を提供する。一実施形態では、レクチンは、哺乳動物レクチン、ヒトレクチン、植物レクチン、細菌レクチン、ウイルスレクチン、真菌レクチン、及び原生動物レクチンからなる群より選択される。

【0007】

一実施形態では、レクチンは、ガレクチン、シグレック、セレクチン、Ｃ型レクチン；ＣＤ３０１、Ｌ－ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓロイコアグルチニン）；Ｅ－ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓエリスロアグルチニン）；トマトレクチン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍレクチン；ＬＥＡ）；ピーナッツレクチン（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａアグルチニン；ＰＮＡ）；ジャガイモレクチン（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍレクチン）、ヨウシュヤマゴボウマイトジェン（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ Ａｍｅｒｉｃａｎレクチン）、コムギ胚芽アグルチニン（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ Ｖｕｌｇａｒｉｓレクチン）；Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓレクチン（Ｊａｃａｌｉｎレクチン）；Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａアグルチニン（ＶＶＡ）；Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａアグルチニン（ＨＰＡ）；Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａアグルチニン（ＷＦＡ）；Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａアグルチニン（ＳＮＡ）、ＢＣ２ＬＣＭ（グラム陰性菌Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ由来レクチン）、Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓロイコアグルチニン（ＭＡＬ）、Ｐｓａｔｈｙｒｅｌｌａ ｖｅｌｕｔｉｎａ（ＰＶＬ）、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉレクチン（ＳＲＬ）、Ｅｕｃｈｅｕｍａ ｓｅｒｒａアグルチニン（ＥＳＡ）、ＣＬＥＣ１７Ａ（Ｐｒｏｌｅｃｔｉｎ）、Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａレクチン、Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａレクチン（ＳＳＡ）、Ｇｌｅｃｈｏｍａ ｈｅｄｅｒａｃｅａレクチン（Ｇｌｅｈｅｄａ）、Ｍｏｒｕｓ ｎｉｇｒａアグルチニン（Ｍｏｒｎｉｇａ Ｇ）、Ｓａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａレクチン、Ｓａｌｖｉａ ｂｏｇｏｔｅｎｓｉｓレクチン、Ｓａｌｖｉａ ｈｏｒｍｉｎｕｍレクチン、Ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｏｍｕｍレクチン、Ｍｏｌｕｃｃｅｌｌａ ｌａｅｖｉｓレクチン、Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ（ＧｓＬＡ４）、Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ（酸性ＷＢＡＩ）、Ａｂｒｕｓ ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓレクチン、Ｍｏｌｕｃｅｌｌａ ｌａｅｖｉｓレクチン（ＭＬＬ）、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｃａｕｄａｔｕｓレクチン、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｌｅｕｃｏｃａｒｐｕｓレクチン、Ｌａｅｌｉａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓレクチン、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａレクチン、Ｍａｃｌｕｒａ ｐｏｍｉｆｅｒａレクチン、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｌａｋｏｏｃｈａレクチン、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓアグルチニン、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓレクチン、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘレクチン、及びＡｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓレクチンからなる群から選択される。

【0008】

一実施形態では、ガレクチンは、ガレクチン－１、ガレクチン－２、ガレクチン－３、ガレクチン－４、ガレクチン－５、ガレクチン－６、ガレクチン－７、ガレクチン－８、ガレクチン－９、ガレクチン－１０、ガレクチン－１１、ガレクチン－１２、ガレクチン－１３、ガレクチン－１４、及びガレクチン－１５からなる群から選択される。

【0009】

一実施形態では、シグレックは、シグレック－１（ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｏｎ）、シグレック－２（ＣＤ２２）、シグレック－３（ＣＤ３３）、シグレック－４（ミエリン関連糖タンパク質）、シグレック－５、シグレック－６、シグレック－７、シグレック－８、シグレック－９、シグレック－１０、シグレック－１１、シグレック－１２、シグレック－１３、シグレック－１４、シグレック－１５、シグレック－１６、シグレック－１７、シグレックＥ、シグレックＦ、シグレックＧ、及びシグレックＨからなる群から選択される。

【0010】

一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、β１，６分岐、Ｔ抗原、シアリル－Ｔエピトープ、Ｔｎエピトープ、シアリル－Ｔｎエピトープ、α２，６シアリル化、シアリル化、シアリル－ルイス^ｘ／ａ、ジシアリル－ルイス^ｘ／ａ、シアリル６－スルホルイス^ｘ、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ３、及びフコシルＧＭ１からなる群から選択されるＴＡＣＡに結合する。一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、腫瘍細胞のβ１，６ＧｌｃＮＡｃ分岐型Ｎ－グリカンに結合する。一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、配列番号１、配列番号１に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号２、配列番号２に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号３、配列番号３に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号４、配列番号４に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号５、配列番号５に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号６、配列番号６に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号７、及び配列番号７に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0011】

一実施形態では、ペプチドは、Ｆｃドメインに連結されたＴＡＣＡ結合ドメインを含むＦｃ融合ペプチドである。

【0012】

一実施形態では、ペプチドは、免疫エフェクター細胞に特異的に結合するドメインをさらに含む。一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、及び好中球からなる群から選択される。

【0013】

一実施形態では、免疫エフェクター細胞に特異的に結合するドメインはＴ細胞結合ドメインを含み、このＴ細胞結合ドメインはＴ細胞に特異的に結合する。一実施形態では、Ｔ細胞結合ドメインは、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２、ＣＤ２８、及びＣＤ２５からなる群のうち少なくとも１つに結合する。一実施形態では、Ｔ細胞結合ドメインは、配列番号９、及び配列番号９に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ペプチドは、配列番号１１、配列番号１１に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１２、配列番号１２に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１３、配列番号１３に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１４、配列番号１４に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１５、配列番号１５に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１６、配列番号１６に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１７、及び配列番号１７に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0014】

一実施形態では、免疫エフェクター細胞に特異的に結合するドメインはＮＫ細胞結合ドメインを含み、このＮＫ細胞結合ドメインはＮＫ細胞に特異的に結合する。一実施形態では、ＮＫ細胞結合ドメインは、ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄからなる群のうち少なくとも１つに結合する。

【0015】

一実施形態では、ペプチドは、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。

【0016】

一態様では、本発明は、レクチンに由来する腫瘍関連糖鎖抗原（ＴＡＣＡ）結合ドメインを含むペプチドをコードする単離された核酸分子を含み、当該ＴＡＣＡ結合ドメインが腫瘍細胞のＴＡＣＡに特異的に結合する、癌を治療するための組成物を提供する。一実施形態では、レクチンは、哺乳動物レクチン、ヒトレクチン、植物レクチン、細菌レクチン、ウイルスレクチン、真菌レクチン、及び原生動物レクチンからなる群から選択される。

【0017】

一実施形態では、レクチンは、ガレクチン、シグレック、セレクチン；Ｃ型レクチン；ＣＤ３０１、Ｌ－ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓロイコアグルチニン）；Ｅ－ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓエリスロアグルチニン）；トマトレクチン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍレクチン；ＬＥＡ）；ピーナッツレクチン（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａアグルチニン；ＰＮＡ）；ジャガイモレクチン（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍレクチン）、ヨウシュヤマゴボウマイトジェン（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ Ａｍｅｒｉｃａｎレクチン）、コムギ胚芽アグルチニン（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ Ｖｕｌｇａｒｉｓレクチン）；Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓレクチン（Ｊａｃａｌｉｎレクチン）；Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａアグルチニン（ＶＶＡ）；Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａアグルチニン（ＨＰＡ）；Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａアグルチニン（ＷＦＡ）；Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａアグルチニン（ＳＮＡ）、ＢＣ２ＬＣＭ（グラム陰性菌Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ由来レクチン）、Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓロイコアグルチニン（ＭＡＬ）、Ｐｓａｔｈｙｒｅｌｌａ ｖｅｌｕｔｉｎａ（ＰＶＬ）、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉレクチン（ＳＲＬ）、Ｅｕｃｈｅｕｍａ ｓｅｒｒａアグルチニン（ＥＳＡ）、ＣＬＥＣ１７Ａ（Ｐｒｏｌｅｃｔｉｎ）、Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａレクチン、Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａレクチン（ＳＳＡ）、Ｇｌｅｃｈｏｍａ ｈｅｄｅｒａｃｅａレクチン（Ｇｌｅｈｅｄａ）、Ｍｏｒｕｓ ｎｉｇｒａアグルチニン（Ｍｏｒｎｉｇａ Ｇ）、Ｓａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａレクチン、Ｓａｌｖｉａ ｂｏｇｏｔｅｎｓｉｓレクチン、Ｓａｌｖｉａ ｈｏｒｍｉｎｕｍレクチン、Ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｏｍｕｍレクチン、Ｍｏｌｕｃｃｅｌｌａ ｌａｅｖｉｓレクチン、Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ（ＧｓＬＡ４）、Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ（酸性ＷＢＡＩ）、Ａｂｒｕｓ ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓレクチン、Ｍｏｌｕｃｅｌｌａ ｌａｅｖｉｓレクチン（ＭＬＬ）、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｃａｕｄａｔｕｓレクチン、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｌｅｕｃｏｃａｒｐｕｓレクチン、Ｌａｅｌｉａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓレクチン、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａレクチン、Ｍａｃｌｕｒａ ｐｏｍｉｆｅｒａレクチン、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｌａｋｏｏｃｈａレクチン、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓアグルチニン、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓレクチン、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘレクチン、及びＡｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓレクチンからなる群から選択される。

【0018】

一実施形態では、ガレクチンは、ガレクチン－１、ガレクチン－２、ガレクチン－３、ガレクチン－４、ガレクチン－５、ガレクチン－６、ガレクチン－７、ガレクチン－８、ガレクチン－９、ガレクチン－１０、ガレクチン－１１、ガレクチン－１２、ガレクチン－１３、ガレクチン－１４、及びガレクチン－１５からなる群から選択される。

【0019】

一実施形態では、シグレックは、シグレック－１（ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｏｎ）、シグレック－２（ＣＤ２２）、シグレック－３（ＣＤ３３）、シグレック－４（ミエリン関連糖タンパク質）、シグレック－５、シグレック－６、シグレック－７、シグレック－８、シグレック－９、シグレック－１０、シグレック－１１、シグレック－１２、シグレック－１３、シグレック－１４、シグレック－１５、シグレック－１６、シグレック－１７、シグレックＥ、シグレックＦ、シグレックＧ、及びシグレックＨからなる群から選択される。

【0020】

一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、β１，６分岐、Ｔ抗原、シアリル－Ｔエピトープ、Ｔｎエピトープ、シアリル－Ｔｎエピトープ、α２，６シアリル化、シアリル化、シアリル－ルイス^ｘ／ａ、ジシアリル－ルイス^ｘ／ａ、シアリル６－スルホルイス^ｘ、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ３、及びフコシルＧＭ１からなる群から選択されるＴＡＣＡに結合する。一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、腫瘍細胞のβ１，６ＧｌｃＮＡｃ分岐型Ｎ－グリカンに結合する。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１、配列番号１に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号２、配列番号２に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号３、配列番号３に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号４、配列番号４に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号５、配列番号５に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号６、配列番号６に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号７、及び配列番号７に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴＡＣＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0021】

一実施形態では、核酸分子によってコードされるペプチドは、Ｆｃドメインに連結されたＴＡＣＡ結合ドメインを含むＦｃ融合ペプチドである。

【0022】

一実施形態では、核酸分子によってコードされるペプチドは、免疫エフェクター細胞に特異的に結合するドメインをさらに含む。一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、及び好中球からなる群から選択される。

【0023】

一実施形態では、免疫エフェクター細胞に特異的に結合するドメインはＴ細胞結合ドメインを含み、このＴ細胞結合ドメインはＴ細胞に特異的に結合する。一実施形態では、Ｔ細胞結合ドメインは、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２、ＣＤ２８、及びＣＤ２５からなる群のうち少なくとも１つに結合する。一実施形態では、核酸分子は、配列番号９、及び配列番号９に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴ細胞結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１１、配列番号１１に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１２、配列番号１２に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１３、配列番号１３に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１４、配列番号１４に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１５、配列番号１５に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１６、配列番号１６に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１７、及び配列番号１７に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0024】

一実施形態では、免疫エフェクター細胞に特異的に結合するドメインはＮＫ細胞結合ドメインを含み、このＮＫ細胞結合ドメインはＮＫ細胞に特異的に結合する。一実施形態では、ＮＫ細胞結合ドメインは、ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄからなる群のうち少なくとも１つに結合する。

【0025】

一実施形態では、核酸分子は、抗原認識ドメイン及び細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、当該抗原認識ドメインはＴＡＣＡ結合ドメインを含む。一実施形態では、核酸分子によってコードされるＣＡＲの抗原認識ドメインは、配列番号１、配列番号１に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号２、配列番号２に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号３、配列番号３に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号４、配列番号４に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号５、配列番号５に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号６、配列番号６に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号７、及び配列番号７に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴＡＣＡ結合ドメインを含む。一実施形態では、核酸分子によってコードされるＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインを含む。

【0026】

一実施形態では、単離された核酸分子は、発現ベクターを含む。一実施形態では、単離された核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡを含む。

【0027】

一態様では、本発明は、レクチンに由来する腫瘍関連糖鎖抗原（ＴＡＣＡ）結合ドメインを含むペプチドと結合する薬剤を含み、当該ＴＡＣＡ結合ドメインが腫瘍細胞のＴＡＣＡに特異的に結合する、癌を治療するための組成物を提供する。一実施形態では、薬剤はレクチン結合ドメインを含む。

【0028】

一態様では、本発明は、レクチンに由来する腫瘍関連糖鎖抗原（ＴＡＣＡ）結合ドメインを含むペプチドと結合するペプチドをコードする単離された核酸分子を含み、当該ＴＡＣＡ結合ドメインが腫瘍細胞のＴＡＣＡに特異的に結合する組成物を提供する。一実施形態では、核酸分子によってコードされるペプチドは、レクチン結合ドメインを含む。一実施形態では、単離された核酸分子は、抗原結合ドメイン及び細胞内ドメインを含むＣＡＲをコードし、当該抗原結合ドメインはレクチン結合ドメインを含む。

【0029】

一態様では、本発明は、レクチンに由来する腫瘍関連糖鎖抗原（ＴＡＣＡ）結合ドメインを含むペプチドを発現するように改変され、当該ＴＡＣＡ結合ドメインが腫瘍細胞のＴＡＣＡに特異的に結合する細胞を提供する。一態様では、細胞は、抗原認識ドメイン及び細胞内ドメインを含むＣＡＲを発現するように改変され、当該抗原認識ドメインはＴＡＣＡ結合ドメインを含む。一態様では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、及び制御性Ｔ細胞からなる群から選択される。

【0030】

一態様では、本発明は、治療を必要とする対象における癌の治療方法であって、レクチンに由来する腫瘍関連糖鎖抗原（ＴＡＣＡ）結合ドメインを含むペプチドを含み、当該ＴＡＣＡ結合ドメインが腫瘍細胞のＴＡＣＡに特異的に結合する組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、レクチンは、哺乳動物レクチン、ヒトレクチン、植物レクチン、細菌レクチン、ウイルスレクチン、真菌レクチン、及び原生動物レクチンからなる群から選択される。

【0031】

一実施形態では、レクチンは、ガレクチン、シグレック、セレクチン；Ｃ型レクチン；ＣＤ３０１、Ｌ－ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓロイコアグルチニン）；Ｅ－ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓエリスロアグルチニン）；トマトレクチン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍレクチン；ＬＥＡ）；ピーナッツレクチン（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａアグルチニン；ＰＮＡ）；ジャガイモレクチン（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍレクチン）、ヨウシュヤマゴボウマイトジェン（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ Ａｍｅｒｉｃａｎレクチン）、コムギ胚芽アグルチニン（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ Ｖｕｌｇａｒｉｓレクチン）；Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓレクチン（Ｊａｃａｌｉｎレクチン）；Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａアグルチニン（ＶＶＡ）；Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａアグルチニン（ＨＰＡ）；Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａアグルチニン（ＷＦＡ）；Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａアグルチニン（ＳＮＡ）、ＢＣ２ＬＣＭ（グラム陰性菌Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ由来レクチン）、Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓロイコアグルチニン（ＭＡＬ）、Ｐｓａｔｈｙｒｅｌｌａ ｖｅｌｕｔｉｎａ（ＰＶＬ）、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉレクチン（ＳＲＬ）、Ｅｕｃｈｅｕｍａ ｓｅｒｒａアグルチニン（ＥＳＡ）、ＣＬＥＣ１７Ａ（Ｐｒｏｌｅｃｔｉｎ）、Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａレクチン、Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａレクチン（ＳＳＡ）、Ｇｌｅｃｈｏｍａ ｈｅｄｅｒａｃｅａレクチン（Ｇｌｅｈｅｄａ）、Ｍｏｒｕｓ ｎｉｇｒａアグルチニン（Ｍｏｒｎｉｇａ Ｇ）、Ｓａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａレクチン、Ｓａｌｖｉａ ｂｏｇｏｔｅｎｓｉｓレクチン、Ｓａｌｖｉａ ｈｏｒｍｉｎｕｍレクチン、Ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｏｍｕｍレクチン、Ｍｏｌｕｃｃｅｌｌａ ｌａｅｖｉｓレクチン、Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ（ＧｓＬＡ４）、Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ（酸性ＷＢＡＩ）、Ａｂｒｕｓ ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓレクチン、Ｍｏｌｕｃｅｌｌａ ｌａｅｖｉｓレクチン（ＭＬＬ）、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｃａｕｄａｔｕｓレクチン、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｌｅｕｃｏｃａｒｐｕｓレクチン、Ｌａｅｌｉａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓレクチン、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａレクチン、Ｍａｃｌｕｒａ ｐｏｍｉｆｅｒａレクチン、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｌａｋｏｏｃｈａレクチン、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓアグルチニン、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓレクチン、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘレクチン、及びＡｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓレクチンからなる群から選択される。

【0032】

一実施形態では、ガレクチンは、ガレクチン－１、ガレクチン－２、ガレクチン－３、ガレクチン－４、ガレクチン－５、ガレクチン－６、ガレクチン－７、ガレクチン－８、ガレクチン－９、ガレクチン－１０、ガレクチン－１１、ガレクチン－１２、ガレクチン－１３、ガレクチン－１４、及びガレクチン－１５からなる群から選択される。

【0033】

一実施形態では、シグレックは、シグレック－１（ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｏｎ）、シグレック－２（ＣＤ２２）、シグレック－３（ＣＤ３３）、シグレック－４（ミエリン関連糖タンパク質）、シグレック－５、シグレック－６、シグレック－７、シグレック－８、シグレック－９、シグレック－１０、シグレック－１１、シグレック－１２、シグレック－１３、シグレック－１４、シグレック－１５、シグレック－１６、シグレック－１７、シグレックＥ、シグレックＦ、シグレックＧ、及びシグレックＨからなる群から選択される。

【0034】

一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、β１，６分岐、Ｔ抗原、シアリル－Ｔエピトープ、Ｔｎエピトープ、シアリル－Ｔｎエピトープ、α２，６シアリル化、シアリル化、シアリル－ルイス^ｘ／ａ、ジシアリル－ルイス^ｘ／ａ、シアリル６－スルホルイス^ｘ、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ３、及びフコシルＧＭ１からなる群から選択されるＴＡＣＡに結合する。一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、腫瘍細胞のβ１，６ＧｌｃＮＡｃ分岐型Ｎ－グリカンに結合する。一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、配列番号１、配列番号１に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号２、配列番号２に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号３、配列番号３に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号４、配列番号４に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号５、配列番号５に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号６、配列番号６に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号７、及び配列番号７に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0035】

一実施形態では、ペプチドは、Ｆｃドメインに連結されたＴＡＣＡ結合ドメインを含むＦｃ融合ペプチドである。

【0036】

一実施形態では、ペプチドは、免疫エフェクター細胞に特異的に結合するドメインをさらに含む。一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、及び好中球からなる群から選択される。

【0037】

一実施形態では、免疫エフェクター細胞に特異的に結合するドメインはＴ細胞結合ドメインを含み、このＴ細胞結合ドメインはＴ細胞に特異的に結合する。一実施形態では、Ｔ細胞結合ドメインは、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２、ＣＤ２８、及びＣＤ２５からなる群のうち少なくとも１つに結合する。一実施形態では、Ｔ細胞結合ドメインは、配列番号９、及び配列番号９に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ペプチドは、配列番号１１、配列番号１１に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１２、配列番号１２に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１３、配列番号１３に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１４、配列番号１４に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１５、配列番号１５に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１６、配列番号１６に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１７、及び配列番号１７に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0038】

一実施形態では、免疫エフェクター細胞に特異的に結合するドメインはＮＫ細胞結合ドメインを含み、このＮＫ細胞結合ドメインはＮＫ細胞に特異的に結合する。一実施形態では、ＮＫ細胞結合ドメインは、ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄからなる群のうち少なくとも１つに結合する。

【0039】

一実施形態では、ペプチドは、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。

【0040】

一実施形態では、対象はＴＡＣＡを発現する固形腫瘍を有している。

【0041】

一態様では、本発明は、治療を必要とする対象における癌の治療方法であって、レクチンに由来する腫瘍関連糖鎖抗原（ＴＡＣＡ）結合ドメインを含むペプチドをコードする単離された核酸分子を含み、当該ＴＡＣＡ結合ドメインが腫瘍細胞のＴＡＣＡに特異的に結合する組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、レクチンは、哺乳動物レクチン、ヒトレクチン、植物レクチン、細菌レクチン、ウイルスレクチン、真菌レクチン、及び原生動物レクチンからなる群から選択される。

【0042】

一実施形態では、レクチンは、ガレクチン、シグレック、セレクチン；Ｃ型レクチン；ＣＤ３０１、Ｌ－ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓロイコアグルチニン）；Ｅ－ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓエリスロアグルチニン）；トマトレクチン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍレクチン；ＬＥＡ）；ピーナッツレクチン（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａアグルチニン；ＰＮＡ）；ジャガイモレクチン（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍレクチン）、ヨウシュヤマゴボウマイトジェン（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ Ａｍｅｒｉｃａｎレクチン）、コムギ胚芽アグルチニン（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ Ｖｕｌｇａｒｉｓレクチン）；Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓレクチン（Ｊａｃａｌｉｎレクチン）；Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａアグルチニン（ＶＶＡ）；Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａアグルチニン（ＨＰＡ）；Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａアグルチニン（ＷＦＡ）；Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａアグルチニン（ＳＮＡ）、ＢＣ２ＬＣＭ（グラム陰性菌Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ由来レクチン）、Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓロイコアグルチニン（ＭＡＬ）、Ｐｓａｔｈｙｒｅｌｌａ ｖｅｌｕｔｉｎａ（ＰＶＬ）、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉレクチン（ＳＲＬ）、Ｅｕｃｈｅｕｍａ ｓｅｒｒａアグルチニン（ＥＳＡ）、ＣＬＥＣ１７Ａ（Ｐｒｏｌｅｃｔｉｎ）、Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａレクチン、Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａレクチン（ＳＳＡ）、Ｇｌｅｃｈｏｍａ ｈｅｄｅｒａｃｅａレクチン（Ｇｌｅｈｅｄａ）、Ｍｏｒｕｓ ｎｉｇｒａアグルチニン（Ｍｏｒｎｉｇａ Ｇ）、Ｓａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａレクチン、Ｓａｌｖｉａ ｂｏｇｏｔｅｎｓｉｓレクチン、Ｓａｌｖｉａ ｈｏｒｍｉｎｕｍレクチン、Ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｏｍｕｍレクチン、Ｍｏｌｕｃｃｅｌｌａ ｌａｅｖｉｓレクチン、Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ（ＧｓＬＡ４）、Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ（酸性ＷＢＡＩ）、Ａｂｒｕｓ ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓレクチン、Ｍｏｌｕｃｅｌｌａ ｌａｅｖｉｓレクチン（ＭＬＬ）、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｃａｕｄａｔｕｓレクチン、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｌｅｕｃｏｃａｒｐｕｓレクチン、Ｌａｅｌｉａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓレクチン、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａレクチン、Ｍａｃｌｕｒａ ｐｏｍｉｆｅｒａレクチン、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｌａｋｏｏｃｈａレクチン、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓアグルチニン、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓレクチン、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘレクチン、及びＡｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓレクチンからなる群から選択される。

【0043】

一実施形態では、ガレクチンは、ガレクチン－１、ガレクチン－２、ガレクチン－３、ガレクチン－４、ガレクチン－５、ガレクチン－６、ガレクチン－７、ガレクチン－８、ガレクチン－９、ガレクチン－１０、ガレクチン－１１、ガレクチン－１２、ガレクチン－１３、ガレクチン－１４、及びガレクチン－１５からなる群から選択される。

【0044】

一実施形態では、シグレックは、シグレック－１（ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｏｎ）、シグレック－２（ＣＤ２２）、シグレック－３（ＣＤ３３）、シグレック－４（ミエリン関連糖タンパク質）、シグレック－５、シグレック－６、シグレック－７、シグレック－８、シグレック－９、シグレック－１０、シグレック－１１、シグレック－１２、シグレック－１３、シグレック－１４、シグレック－１５、シグレック－１６、シグレック－１７、シグレックＥ、シグレックＦ、シグレックＧ、及びシグレックＨからなる群から選択される。

【0045】

一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、β１，６分岐、Ｔ抗原、シアリル－Ｔエピトープ、Ｔｎエピトープ、シアリル－Ｔｎエピトープ、α２，６シアリル化、シアリル化、シアリル－ルイス^ｘ／ａ、ジシアリル－ルイス^ｘ／ａ、シアリル６－スルホルイス^ｘ、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ３、及びフコシルＧＭ１からなる群から選択されるＴＡＣＡに結合する。一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、腫瘍細胞のβ１，６ＧｌｃＮＡｃ分岐型Ｎ－グリカンに結合する。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１、配列番号１に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号２、配列番号２に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号３、配列番号３に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号４、配列番号４に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号５、配列番号５に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号６、配列番号６に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号７、及び配列番号７に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴＡＣＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0046】

一実施形態では、核酸分子によってコードされるペプチドは、Ｆｃドメインに連結されたＴＡＣＡ結合ドメインを含むＦｃ融合ペプチドである。

【0047】

一実施形態では、核酸分子によってコードされるペプチドは、免疫エフェクター細胞に特異的に結合するドメインをさらに含む。一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、及び好中球からなる群から選択される。

【0048】

一実施形態では、免疫エフェクター細胞に特異的に結合するドメインはＴ細胞結合ドメインを含み、このＴ細胞結合ドメインはＴ細胞に特異的に結合する。一実施形態では、Ｔ細胞結合ドメインは、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２、ＣＤ２８、及びＣＤ２５からなる群のうち少なくとも１つに結合する。一実施形態では、核酸分子は、配列番号９、及び配列番号９に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴ細胞結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１１、配列番号１１に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１２、配列番号１２に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１３、配列番号１３に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１４、配列番号１４に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１５、配列番号１５に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１６、配列番号１６に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号１７、及び配列番号１７に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0049】

一実施形態では、免疫エフェクター細胞に特異的に結合するドメインはＮＫ細胞結合ドメインを含み、このＮＫ細胞結合ドメインはＮＫ細胞に特異的に結合する。一実施形態では、ＮＫ細胞結合ドメインは、ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄからなる群のうち少なくとも１つに結合する。

【0050】

一実施形態では、核酸分子は、抗原認識ドメイン及び細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、当該抗原認識ドメインはＴＡＣＡ結合ドメインを含む。一実施形態では、核酸分子によってコードされるＣＡＲの抗原認識ドメインは、配列番号１、配列番号１に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号２、配列番号２に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号３、配列番号３に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号４、配列番号４に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号５、配列番号５に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号６、配列番号６に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列、配列番号７、及び配列番号７に対して約９０％超の相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴＡＣＡ結合ドメインを含む。一実施形態では、核酸分子によってコードされるＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインを含む。

【0051】

一実施形態では、単離された核酸分子は、発現ベクターを含む。一実施形態では、単離された核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡを含む。

【0052】

一実施形態では、対象はＴＡＣＡを発現する固形腫瘍を有している。

【0053】

一態様では、本発明は、治療を必要とする対象における癌の治療方法であって、レクチンに由来する腫瘍関連糖鎖抗原（ＴＡＣＡ）結合ドメインを含むペプチドを発現するように改変され、当該ＴＡＣＡ結合ドメインが腫瘍細胞のＴＡＣＡに特異的に結合する細胞を対象に投与することを含む方法を提供する。

【0054】

一実施形態では、細胞は、抗原認識ドメイン及び細胞内ドメインを含むＣＡＲを発現するように改変され、当該抗原認識ドメインはＴＡＣＡ結合ドメインを含む。一実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、及び制御性Ｔ細胞からなる群から選択される。一実施形態では、細胞は自己由来である。

【0055】

一態様では、本発明は、治療を必要とする対象における癌の治療方法であって、ａ）レクチンに由来する腫瘍関連糖鎖抗原（ＴＡＣＡ）結合ドメインを含むペプチドと結合する薬剤を含む第１の組成物を対象に投与することと、ｂ）ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチドを含む第２の組成物を対象に投与することと、を含む方法を提供する。

【0056】

一態様では、本発明は、治療を必要とする対象における癌の治療方法であって、ａ）レクチンに由来する腫瘍関連糖鎖抗原（ＴＡＣＡ）結合ドメインを含むペプチドと結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現するように改変された細胞を対象に投与することと、ｂ）ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチドを含む組成物を対象に投与することと、を含む方法を提供する。一実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、レクチン結合ドメインを含み、当該レクチン結合ドメインはＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチドと結合する。

【0057】

本発明の好ましい実施形態に関する以下の詳細な説明は、添付図面と併せて読むと、より良く理解されるであろう。本発明を例示するために、現時点で好適である実施形態を図面に示している。ただし、本発明は、図面に示された実施形態の正確な配置及び手段に限定されないと理解すべきである。

【図面の簡単な説明】

【0058】

【図1】Ｎ－グリコシル化分岐経路を示す説明図である。オリゴサッカリルトランスフェラーゼは、予め組み立てられたグリカン、Ｇｌｃ_３Ｍａｎ_９ｇｌｃＮＡｃ_２をＥＲ中の糖タンパク質のＮｘＳ／Ｔモチーフに転移させる。糖タンパク質がゴルジ体を通過すると、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素（Ｍｇａｔ１、Ｍｇａｔ２、Ｍｇａｔ４、及びＭｇａｔ５）が順次作用し、ガレクチンの親和性増加を呈する分岐型Ｎ－グリカンを生成する。ガラクトシルトランスフェラーゼ３が、ＧｌｃＮＡｃにガラクトースを付加して分岐が伸長されると、ガレクチンが結合することができるＮ－アセチルラクトサミンが生成される。Ｌ－ＰＨＡ結合部位を示す。ＧＩ、グルコシダーゼＩ；ＧＩＩ、グルコシダーゼＩＩ；ＭＩ、マンノシダーゼＩ；ＭＩＩ、マンノシダーゼＩＩ；ＧａｌＴ３、ガラクトシルトランスフェラーゼ３。

【図2】Ｌ－ＰＨＡｘＣＤ３キメラタンパク質の原理を示す説明図である。キメラタンパク質は、抗ＣＤ３モノクローナル抗体の可変重鎖及び軽鎖と、植物レクチンＬ－ＰＨＡを含む一本鎖ポリペプチドである。これは、β１，６ＧｌｃＮＡｃ分岐型Ｎ－グリカンによって、Ｔ細胞及び癌細胞と結合することができる。この相互作用がＴ細胞を活性化し、癌細胞の細胞傷害性の殺傷を誘導することができる。

【図3】ＧｌｙＴＲ Ｌ－ＰＨＡｘＣＤ３が、ＣＤ３及び４分岐型Ｎ－グリカンの両方に結合することを示す実験例の結果を示す。１０μＭキフネンシン（Ｋｉｆ）による３日間の前処理をした場合としていない場合に、ジャーカット（左）及びＫ５６２（右）細胞に結合する細胞表面のＬ－ＰＨＡｘＣＤ３を示すフローサイトメトリー分析。ジャーカット細胞（左）では、Ｌ－ＰＨＡｘＣＤ３はＣＤ３及び４分岐型Ｎ－グリカンの両方に結合することができ、細胞がＫｉｆで前処理されている場合、結合は減少し、このとき分岐は排除されるが、細胞表面のＣＤ３は結合したままであった。ＣＤ３陰性の慢性骨髄性白血病癌細胞Ｋ５６２（右）では、結合は検出されたが、Ｋｉｆ処理したＫ５６２細胞では検出されなかった。

【図4】ＧｌｙＴＲ Ｌ－ＰＨＡｘＣＤ３が、癌細胞の殺傷を媒介することを示す実験例の結果を示す図４Ａ～図４Ｊを含む。ＣＦＳＥ標識Ｋ５６２（図４Ａ～図４Ｃ）、キフネンシン処理Ｋ５６２（図４Ｂ）、Ｒａｊｉ（図４Ｄ）、ＲＰＭＩ ８２２６（図４Ｅ）、ＲＳ４；１１（図４Ｆ）、ＭＣＦ７（図４Ｇ）、ＨＴ－２９（図４Ｈ）、Ｈｅｐ Ｇ２（図４Ｉ）、またはＨｅＬａ（図４Ｊ）を９６ウェルプレートに播種した。ヒト休止期ＰＢＭＣ、及びＧｌｙＴＲ Ｌ－ＰＨＡｘＣＤ３の段階希釈液をプレートに添加し、３７℃、５％ＣＯ_２培養器にて４時間インキュベートした。細胞傷害性は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（図４Ａ～図４Ｃ、図４Ｊ）染色または７ＡＡＤ（図４Ｄ～図４Ｉ）染色により検出し、フローサイトメトリーにより分析した。特異的細胞傷害性％＝ＣＦＳＥ^＋ＰＩ^＋％_{ＧｌｙＴＲ}－ＣＦＳＥ^＋ＰＩ^＋％_未処理（図４Ａ～図４Ｃ、図４Ｊ）または＝ＣＦＳＥ^＋７－ＡＡＤ^＋％_{ＧｌｙＴＲ}－ＣＦＳＥ^＋７－ＡＡＤ^＋％_未処理（図４Ｄ～図４Ｉ）であり、ＰＢＭＣに対する細胞傷害性分析についてＣＦＳＥ^－ＰＩ^＋の細胞を評価した（ｇａｔｅｄ）（図４Ｃ）。

【図5】腫瘍細胞に発現したＴＡＣＡに結合するＴＡＣＡ結合ドメインを含むレクチン由来ペプチドを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようにＴ細胞が改変された、本発明の例示的実施形態の概略図である。

【図6】レクチン結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようにＴ細胞が改変された、本発明の例示的実施形態の概略図である。レクチン結合ドメインは、腫瘍細胞に発現したＴＡＣＡに結合するＴＡＣＡ結合ドメインを含むレクチン由来ペプチドに結合することができる。

【発明を実施するための形態】

【0059】

本発明は、癌を治療する組成物及び方法に関する。一態様では、本発明は、腫瘍関連糖鎖抗原（ＴＡＣＡ）に特異的に結合する第１のドメインを含むペプチドを含んでいる組成物を提供する。ある特定の実施形態では、このペプチドは、免疫エフェクター細胞に特異的に結合する第２のドメインを含む。ある特定の実施形態では、第２のドメインはＴ細胞に結合する。例えば、ある特定の実施形態では、このタンパク質は、腫瘍細胞上に存在するＴＡＣＡ、及びＴ細胞上に存在する生体分子（例えば、表面タンパク質）に結合し、それによってＴ細胞を腫瘍細胞へと動員する。場合によって、ＴＡＣＡ結合ドメイン及びＴ細胞結合ドメインを含むペプチドは、本明細書でグリカン依存性Ｔ細胞動員因子（ＧｌｙＴＲ）と称する。一実施形態では、組成物は、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載される融合ペプチドをコードする核酸分子を含む。一実施形態では、組成物は、本明細書に記載される融合ペプチドを発現するように遺伝子改変された細胞を含む。

【0060】

本発明は、治療を必要とする対象での癌の治療方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、本明細書に記載される有効量の組成物を対象に投与することを含む。例えば、一実施形態では、方法は、ＴＡＣＡに結合する第１のドメインと、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞に結合する第２のドメインとを含む融合ペプチドを対象に投与することを含む。一実施形態では、方法は、本明細書に記載される融合ペプチドをコードする核酸分子を含む組成物を対象に投与することを含む。一実施形態では、方法は、本明細書に記載される融合ペプチドを発現するように改変された細胞を含む組成物を対象に投与することを含む。

【0061】

定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様または同等であるいかなる方法及び材料をも本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料について記載する。

【0062】

本明細書で使用される場合、以下の用語の各々は、本セクションでのものと関連する意味を有する。

【0063】

冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書で、その冠詞の文法上の目的語の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指して使用される。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ（１つの要素）」は１つの要素または複数の要素を意味する。

【0064】

量、時間的継続などの測定可能な値を指す際に本明細書で使用される場合、「約」は、指定された値からの±２０％、±１０％、±５％、±１％、または±０．１％のばらつきを包含するものとするが、これはそのようなばらつきが、開示される方法を実施する上で妥当なためである。

【0065】

本明細書で使用される場合、「活性化」とは、検出可能な細胞増殖を誘導するように十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す。活性化はまた、サイトカイン産生の誘導、及び検出可能なエフェクター機能を伴う可能性もある。用語「活性化Ｔ細胞」は特に、細胞分裂を行っているＴ細胞を指す。

【0066】

本発明で使用される場合、用語「抗体」は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然供給源または組換え供給源に由来する無傷の免疫グロブリンであっても、無傷の免疫グロブリンの免疫応答部分であってもよい。抗体は通常、免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ）_２、ならびに一本鎖抗体及びヒト化抗体を含む、種々の形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）。

【0067】

用語「抗体断片」は、無傷抗体の一部分を指し、無傷抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ抗体、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0068】

本明細書で使用される場合、「抗体重鎖」とは、天然に存在するコンフォメーションにある、すべての抗体分子中に存在する２種類のポリペプチド鎖のうち、大きい方を指す。

【0069】

本明細書で使用される場合、「抗体軽鎖」とは、天然に存在するコンフォメーションにある、すべての抗体分子中に存在する２種類のポリペプチド鎖のうち、小さい方を指す。κ軽鎖及びλ軽鎖とは、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。

【0070】

本明細書で使用される場合、用語「合成抗体」は、組換えＤＮＡ技術を用いて作製される抗体、例えば、本明細書に記載のバクテリオファージによって発現される抗体などを意味する。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって作製される抗体であって、そのＤＮＡ分子が抗体タンパク質またはその抗体を指定するアミノ酸配列を発現し、そのＤＮＡまたはアミノ酸配列が、当技術分野において利用可能であり、周知であるＤＮＡまたはアミノ酸配列の合成技術を用いて得られる抗体を意味すると解釈されるべきである。

【0071】

本明細書で使用される場合、用語「抗腫瘍効果」とは、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、期待余命の延長、または癌病態に付随するさまざまな生理学的症状の改善によって現われ得る生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、及び抗体が、腫瘍のそもそもの発生を予防する能力によっても現われ得る。

【0072】

本明細書で使用される場合、用語「自己由来」は、後にその個体へ再導入される、同一の個体に由来する任意の物質を指すことを意味する。

【0073】

「同種異系」とは、同じ種の異なる動物に由来する移植片を指す。

【0074】

「異種」とは、異なる種の動物に由来する移植片を指す。

【0075】

本明細書で使用される場合、用語「癌」は、異常細胞の急速かつ制御不能な増殖を特徴とする疾患であると定義する。癌細胞は、局所的に分布することもあれば、血流及びリンパ系を介して身体の他の部分へと拡散することもある。さまざまな癌の例としては、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵臓癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、悪性脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0076】

「疾患」とは、動物が恒常性を維持することができず、その疾患が改善しなければその動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態のことである。対照的に、動物における「障害」とは、その動物は恒常性を維持することはできるが、その動物の健康状態が、障害のない場合よりも良好ではない健康状態のことである。障害は処置しないままでも、必ずしもその動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすとは限らない。

【0077】

本明細書で使用される場合、「有効量」は、治療的または予防的な有益性をもたらす量を意味する。

【0078】

「コードする」とは、所定のヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）または所定のアミノ酸配列のいずれか、及びそれに起因する生物学的特性を有する、他のポリマー及び巨大分子の生物過程における合成のための鋳型として機能する、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどの、ポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列生来の特性を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳によって、細胞または他の生体系にタンパク質が産生される場合、そのタンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一であって通常は配列表に記載されるヌクレオチド配列を有するコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として用いられる非コード鎖の両方を、タンパク質、またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードすると称することができる。

【0079】

本明細書で使用される場合、「内在性」とは、生物体、細胞、組織、もしくは系に由来するか、またはその内部で産生される任意の物質を指す。

【0080】

本明細書で使用される場合、「外来性」とは、生物体、細胞、組織、もしくは系から導入されるか、またはその外部で産生される任意の物質を指す。

【0081】

本明細書で使用される場合、用語「発現」は、プロモーターによって誘導される特定のヌクレオチド配列の転写及び／または翻訳であると定義する。

【0082】

「発現ベクター」とは、発現させようとするヌクレオチド配列と機能的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系において供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド（例えば、裸のもの、またはリポソーム中に含まれるもの）、及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）といった、当技術分野で既知のものすべてが含まれる。

【0083】

「相同な」とは、２つのポリペプチド間、または２つの核酸分子間の配列類似性または配列同一性を指す。比較する２つの配列の両方で、ある位置を同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットが占めている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおいて、ある位置をアデニンが占めている場合には、それらの分子はその位置で相同である。２つの配列間の相同率は、２つの配列に共通する、一致する位置または相同な位置の数を、比較する位置の数で除算し１００を掛けた関数である。例えば、２つの配列中の１０個の位置のうち６個が一致するかまたは相同である場合、２つの配列は６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣ及びＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を有する。一般に、最大の相同性が得られるように２つの配列をアラインメントして比較を行う。

【0084】

本明細書で使用される場合、用語「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」は、抗体として機能するタンパク質のクラスであると定義する。Ｂ細胞によって発現される抗体は、ＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）または抗原受容体と称される場合もある。このタンパク質のクラスに含まれる５つのメンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥである。ＩｇＡは、唾液、涙液、母乳、消化管分泌物、ならびに気道及び泌尿生殖路の粘液分泌物などの身体分泌物中に存在する主要な抗体である。ＩｇＧは、最も一般的な血中抗体である。ＩｇＭは、ほとんどの対象で一次免疫応答において産生される主な免疫グロブリンである。これは凝集反応、補体結合、及びその他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌及びウイルスに対する防御において重要である。ＩｇＤは抗体機能が判明していない免疫グロブリンであるが、抗原受容体として作用している可能性がある。ＩｇＥは、アレルゲンに晒されたときにマスト細胞及び好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすことによって即時型過敏症を媒介する免疫グロブリンである。

【0085】

本明細書で使用される場合、「指示書」には、本発明の組成物及び方法の有用性を伝えるために使用することができる、刊行物、記録、図、または他の任意の表現媒体を含む。本発明のキットの指示書は、例えば、本発明の核酸、ペプチド、及び／または組成物を含む容器に貼付してもよく、または核酸、ペプチド、及び／または組成物を含む容器と同梱してもよい。あるいは、指示書及び化合物がレシピエントによって協同的に使用されることを意図して、指示書を容器と別に出荷してもよい。

【0086】

「単離された」とは、天然の状態から変更されたか、または取り出されたことを意味する。例えば、生きた動物に天然で存在する核酸またはペプチドは「単離され」ていないが、その天然状態で共存する物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態のまま存在することも、または例えば宿主細胞などの非天然の環境で存在することもできる。

【0087】

本発明に関連して、一般的に存在する核酸塩基に関しては以下の略語を使用する。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。

【0088】

別段の指定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチド配列を含む。また、タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句には、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が一部の型においてイントロン（複数可）を含み得る場合に限り、イントロンを含み得る。

【0089】

本明細書で使用される場合、用語「レクチン」とは、糖鎖構造に結合するタンパク質またはペプチドを指す。レクチンが、糖部分への結合に特異性が高いタンパク質またはペプチドであることを当業者は理解されよう。

【0090】

本明細書で使用される場合、用語「腫瘍関連糖鎖抗原」または「ＴＡＣＡ」とは、癌に見られる糖鎖構造を指す。糖鎖構造が、１つ以上の結合した糖または単糖からなることを当業者は理解されよう。糖鎖構造は、単独で存在するか、及び／または糖タンパク質及び糖脂質として知られているタンパク質もしくは脂質と結合する場合があることを当業者は理解されよう。この糖鎖構造はレクチンに結合することを当業者は理解されよう。

【0091】

本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」とは、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーの属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞を感染させ得る点で、レトロウイルスの中でも独特であり、相当な量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡ中に送達することができるため、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及びＦＩＶはすべて、レンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏで有意なレベルの遺伝子移入を達成する手段を提供する。

【0092】

本明細書で使用される場合、用語「調節する」とは、治療もしくは化合物の不在下でのその対象における反応のレベルと比較して、及び／または治療を受けていない以外は同一である対象における反応のレベルと比較して、対象での反応のレベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は、本来のシグナルまたは反応を擾乱させる、及び／またはそれらに影響を及ぼすことにより、対象、好ましくはヒトにおいて有益な治療反応を媒介することを包含する。

【0093】

別段の指定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及びＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が、イントロンを含んでいてもよい。

【0094】

用語「機能的に連結した」とは、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結であって、後者の発現を結果的にもたらす機能的連結を指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に配置されている場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と機能的に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列と機能的に連結している。一般に、機能的に連結したＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域の接続が必要な場合には、同一のリーディングフレーム内にある。

【0095】

用語「過剰発現された」腫瘍抗原、または腫瘍抗原の「過剰発現」は、患者の特定の組織または臓器の内部にある固形腫瘍のような疾患領域からの細胞における腫瘍抗原の発現が、その組織または臓器からの正常細胞における発現のレベルと比較して異常なレベルを示すことを意味する。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍または血液悪性腫瘍を有する患者は、当技術分野において既知である標準的アッセイによって判定することができる。

【0096】

免疫原性組成物の「非経口」投与には、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または胸骨内の注射法または輸注法を含む。

【0097】

「患者」、「対象」、「個体」などの用語は、本明細書で同義に使用され、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｓｉｔｕの別を問わず、本明細書に記載の方法を適用できる、任意の動物またはその細胞を指す。ある非限定的な実施形態では、患者、対象、または個体はヒトである。

【0098】

本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの連鎖であると定義する。加えて、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で使用される場合、核酸とポリヌクレオチドとは同義である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、これがモノマー「ヌクレオチド」に加水分解され得るという一般知識を有する。モノマー「ヌクレオチド」はヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドには、限定されないが、組換え手段、すなわち通常のクローニング技術及びＰＣＲ（商標）などを用いて組換えライブラリーまたは細胞ゲノムから核酸配列をクローニングすることを含む当技術分野で利用可能な任意の手段によって、及び合成手段によって得られる、すべての核酸配列を含むが、これらに限定されない。

【0099】

本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は同義に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いに結合した２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、この用語は、例えば、当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも称される短鎖、ならびに多くの種類がある当技術分野で一般にタンパク質と称される長鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、主として、例えば、生物学的活性断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変種、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質を含む。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはこれらの組み合わせを含む。

【0100】

本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるために必要である、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列であると定義する。

【0101】

本明細書で使用される場合、用語「プロモーター／調節配列」は、プロモーター／調節配列と機能的に連結した遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。ある場合には、この配列はコアプロモーター配列であってよく、また別の場合には、この配列が、遺伝子産物の発現に必要とされるエンハンサー配列及び他の調節エレメントを含んでもよい。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的な方法で遺伝子産物を発現させるものであってもよい。

【0102】

「構成的」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、細胞のほとんどまたはすべての生理的条件下で、その遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。

【0103】

「誘導性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、そのプロモーターに対応する誘導物質が細胞内に存在する場合のみ、実質的にその遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。

【0104】

「組織特異的」プロモーターとは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと機能的に連結された場合に、細胞がそのプロモーターに対応する組織型の細胞である場合のみ、実質的にその遺伝子産物を細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。

【0105】

抗体に関して本明細書で使用される場合、用語「特異的に結合する」とは、サンプル中の特異的な抗原は認識するが、他の分子は実質的に認識もせず、それと結合もしない抗体を意味する。例えば、ある種由来の抗原と特異的に結合する抗体は、１つ以上の種由来のその抗原とも結合することができる。ただし、そのような種間反応性それ自体によって、特異性としての抗体の種別が変更されることはない。別の例では、抗原と特異的に結合する抗体が、その抗原の異なる対立遺伝子形態と結合することもある。ただし、そのような交差反応性それ自体によって、特異性としての抗体の種別が変更されることはない。場合によっては、抗体、タンパク質、またはペプチドの第２の化学種との相互作用と関連して使用される場合、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、相互作用が化学種での特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する。例えば、抗体は、タンパク質全体ではなく、特異的タンパク質構造を認識して、それと結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、エピトープＡを含む分子（または遊離した非標識Ａ）の存在は、標識「Ａ」及びその抗体を含む反応において、その抗体と結合した標識Ａの量を減少させることになる。

【0106】

本明細書で使用される場合、「実質的に精製された」細胞とは、他の細胞型を本質的に含まない細胞である。また、実質的に精製された細胞とは、その天然に存在する状態には通常付随する他の細胞型から、分離された細胞も指す。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団とは、均一な細胞集団を指す。別の場合には、この用語は、単に、天然の状態において本来付随する細胞から分離された細胞を指す。いくつかの実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される。いくつかの実施形態では、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでは培養されない。

【0107】

本明細書で使用される場合、用語「治療的」は、治療及び／または予防を意味する。治療効果は、疾患状態の抑制、寛解、または根絶によって得られる。

【0108】

用語「治療有効量」は、研究者、獣医、医師、またはその他の臨床専門家が調べようとする、組織、系、または対象の生物学的または医学的反応を誘発するであろう対象化合物の量を指す。用語「治療有効量」には、投与された場合に、治療される障害または疾患の徴候または症状のうち１つ以上の発生を予防するか、またはある程度改善するのに十分な化合物の量を含む。治療有効量は、化合物、疾患及びその重症度、ならびに治療される対象の年齢、体重などに応じて異なるものである。

【0109】

ある疾患を「治療する」とは、この用語が本明細書で使用される場合、対象が患っている疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重症度を軽減することを意味する。

【0110】

本明細書で使用される場合、用語「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」は、外来性核酸が宿主細胞内に移入または導入される過程を指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞とは、外来性核酸をトランスフェクトされた、外来性核酸で形質転換された、または外来性核酸を形質導入された細胞である。この細胞には初代対象細胞及びその子孫を含む。

【0111】

本明細書で使用される場合、語句「転写制御下」または「機能的に連結した」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始及びポリヌクレオチドの発現を制御するために、ポリヌクレオチドに対して正しい位置及び向きにあることを意味する。

【0112】

「ベクター」とは、単離された核酸を含み、かつその単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用できる物質組成である。限定されないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含む数多くのベクターが、当技術分野において既知である。したがって、用語「ベクター」は、自律複製性のプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えばポリリジン化合物、リポソームなどのような、細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミド性及び非ウイルス性の化合物も含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0113】

範囲：本開示の全体を通じて、本発明のさまざまな態様を、範囲形式で提示することができる。範囲形式による記載は、単に便宜上かつ簡潔さのためであって、本発明の範囲に対する不変の限定と解釈されるべきではないと理解すべきである。したがって、ある範囲の記載は、その範囲内におけるすべての可能な部分範囲のほか、個々の数値も明確に開示されていると見されるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲のほか、その範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６も、明確に開示されていると見されるべきである。これは範囲の幅とは関係なく適用される。

【0114】

説明
本発明は、癌ならびに他の疾患を治療するための組成物及び方法を提供する。癌は、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、原発腫瘍、または転移腫瘍であり得る。本発明の組成物には、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチド、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチドをコードする核酸分子、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチドを発現するように改変された細胞、及びペプチド、核酸、細胞、またはそれらの組み合わせを含む基材を含む。

【0115】

ペプチド
一実施形態では、本発明は、ＴＡＣＡ結合ドメインを含む融合ペプチドを含む組成物を提供する。ＴＡＣＡ結合ドメインには、ＴＡＣＡに特異的に結合することができる、いずれのペプチド、タンパク質、レクチン、レクチン断片、抗体、抗体断片、小分子、核酸などをも含み得る。例示的なＴＡＣＡ及びその結合パートナーを表１に列挙する。

【0116】

例示的なＴＡＣＡとしては、β１，６分岐、Ｔ抗原、シアリル－Ｔエピトープ、Ｔｎエピトープ、シアリル－Ｔｎエピトープ、α２，６シアリル化、シアリル化、シアリル－ルイス^ｘ／ａ、ジシアリル－ルイス^ｘ／ａ、シアリル６－スルホルイス^ｘ、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ３、及びフコシルＧＭ１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0117】

一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、Ｎ－グリカンに結合する。ある特定の実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、三分岐型オリゴ糖及び四分岐型オリゴ糖に結合する。一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、β１，６ＧｌｃＮＡｃ分岐型Ｎ－グリカンに結合する。一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、Ｔｎエピトープに結合する。

【表1】

【0118】

ある特定の実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、レクチンタンパク質に由来するペプチド配列である。ある特定の実施形態では、レクチンは、哺乳動物レクチン、ヒトレクチン、植物レクチン、細菌レクチン、ウイルスレクチン、真菌レクチン、及び原生動物レクチンからなる群から選択される。

【0119】

例えば、ある特定の実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、ガレクチン－１、ガレクチン－２、ガレクチン－３、ガレクチン－４、ガレクチン－５、ガレクチン－６、ガレクチン－７、ガレクチン－８、ガレクチン－９、ガレクチン－１０、ガレクチン－１１、ガレクチン－１２、ガレクチン－１３、ガレクチン－１４、及びガレクチン－１５などのガレクチン；シグレック－１（ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｏｎ）、シグレック－２（ＣＤ２２）、シグレック－３（ＣＤ３３）、シグレック－４（ミエリン関連糖タンパク質）、シグレック－５、シグレック－６、シグレック－７、シグレック－８、シグレック－９、シグレック－１０、シグレック－１１、シグレック－１２、シグレック－１３、シグレック－１４、シグレック－１５、シグレック－１６、シグレック－１７、シグレックＥ、シグレックＦ、シグレックＧ、及びシグレックＨなどのシグレック；セレクチン；Ｃ型レクチン；ＣＤ３０１、Ｌ－ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓロイコアグルチニン）；Ｅ－ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓエリスロアグルチニン）；トマトレクチン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍレクチン；ＬＥＡ）；ピーナッツレクチン（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａアグルチニン；ＰＮＡ）；ジャガイモレクチン（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍレクチン）、ヨウシュヤマゴボウマイトジェン（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ Ａｍｅｒｉｃａｎレクチン）、コムギ胚芽アグルチニン（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ Ｖｕｌｇａｒｉｓレクチン）；Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓレクチン（Ｊａｃａｌｉｎレクチン）；Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａアグルチニン（ＶＶＡ）；Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａアグルチニン（ＨＰＡ）；Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａアグルチニン（ＷＦＡ）；Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａアグルチニン（ＳＮＡ）、ＢＣ２ＬＣＭ（グラム陰性菌Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ由来レクチン）、Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓロイコアグルチニン（ＭＡＬ）、Ｐｓａｔｈｙｒｅｌｌａ ｖｅｌｕｔｉｎａ（ＰＶＬ）、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉレクチン（ＳＲＬ）、Ｅｕｃｈｅｕｍａ ｓｅｒｒａアグルチニン（ＥＳＡ）、ＣＬＥＣ１７Ａ（Ｐｒｏｌｅｃｔｉｎ）、Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａレクチン、Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａレクチン（ＳＳＡ）、Ｇｌｅｃｈｏｍａ ｈｅｄｅｒａｃｅａレクチン（Ｇｌｅｈｅｄａ）、Ｍｏｒｕｓ ｎｉｇｒａアグルチニン（Ｍｏｒｎｉｇａ Ｇ）、Ｓａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａレクチン、Ｓａｌｖｉａ ｂｏｇｏｔｅｎｓｉｓレクチン、Ｓａｌｖｉａ ｈｏｒｍｉｎｕｍレクチン、Ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｏｍｕｍレクチン、Ｍｏｌｕｃｃｅｌｌａ ｌａｅｖｉｓレクチン、Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ（ＧｓＬＡ４）、Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ（酸性ＷＢＡＩ）、Ａｂｒｕｓ ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓレクチン、Ｍｏｌｕｃｅｌｌａ ｌａｅｖｉｓレクチン（ＭＬＬ）、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｃａｕｄａｔｕｓレクチン、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｌｅｕｃｏｃａｒｐｕｓレクチン、Ｌａｅｌｉａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓレクチン、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａレクチン、Ｍａｃｌｕｒａ ｐｏｍｉｆｅｒａレクチン、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｌａｋｏｏｃｈａレクチン、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓアグルチニン、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓレクチン、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘレクチン、及びＡｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓレクチンに由来する。

【0120】

ある特定の実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、レクチンの断片に由来する。例えば、一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、ＴＡＣＡに結合する能力を保持するレクチンの断片を含む。

【0121】

ある特定の実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、レクチンの突然変異体、またはその断片を含む。例えば、ある特定の実施形態では、突然変異体は、特異性の増強、結合親和性の増加、またはオリゴマー化の減少を示す。

【0122】

一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインはＬ－ＰＨＡに由来する。例えば、一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、以下に示す配列番号１のアミノ酸配列を含む：

【表2】

（配列番号１）。

【0123】

一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、Ｌ－ＰＨＡが、分子を単量体化するために残基１～５で短縮されている変異型Ｌ－ＰＨＡを含む。例えば、一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、以下に示す配列番号２のアミノ酸配列を含む：

【表3】

（配列番号２）。

【0124】

一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、結合親和性を増加させるためにＬ－ＰＨＡが変異されている変異型Ｌ－ＰＨＡを含む。例えば、一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、以下に示す配列番号３のアミノ酸配列を含む：

【表4】

（配列番号３）。

【0125】

一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、分子を単量体化し、結合親和性を増加させるためにＬ－ＰＨＡが変異されている変異型Ｌ－ＰＨＡを含む。例えば、一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、以下に示す配列番号４のアミノ酸配列を含む：

【表5】

（配列番号４）。

【0126】

一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、Ｔｎエピトープに結合し、ＶＶＡ（Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａイソレクチンＢ）に由来する。例えば、一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、以下に示す配列番号５のアミノ酸配列を含む：

【表6】

（配列番号５）。

【0127】

一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、Ｔｎエピトープに結合し、ＶＶＡが、分子を単量体化するために残基１～５で短縮されている変異型ＶＶＡ（Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａイソレクチンＢ）を含む。例えば、一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、以下に示す配列番号６のアミノ酸配列を含む：

【表7】

（配列番号６）。

【0128】

一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、Ｔｎエピトープに結合し、ＣＤ３０１（ＣＬＥＣ１０Ａ）に由来する。例えば、一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインは、以下に示す配列番号７のアミノ酸配列を含む：

【表8】

（配列番号７）。

【0129】

ある特定の実施形態では、このペプチドはリーダー配列を含む。リーダー配列は、ペプチドの翻訳を増強する、ペプチドを特定の細胞内または細胞外の位置に標的化する、またはペプチドの分泌を誘導するように機能し得る。一実施形態では、ペプチドは、以下に示す配列番号８のアミノ酸配列のリーダー配列を含む：

【表9】

（配列番号８）。

【0130】

ある特定の実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるＴＡＣＡ結合ドメインに結合するペプチドを含む。例えば、ある特定の実施形態では、組成物は、レクチン由来ＴＡＣＡ結合ペプチドに結合するペプチドを含む。例えば、一実施形態では、組成物はレクチン結合ドメインを含み、当該レクチン結合ドメインはＴＡＣＡに結合するレクチンまたはレクチン由来のペプチドに結合する。例えば、ＴＡＣＡ結合ドメインに結合するペプチドは、ＴＡＣＡ結合ドメインに特異的に結合する抗体または抗体断片である。別の実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインに結合するペプチドは、関連するＴＡＣＡ自体に由来し得る。

【0131】

ある特定の実施形態では、組成物は、本明細書に記載される１つ以上のＴＡＣＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を含む。例えば、一実施形態では、融合タンパク質は、１つ以上のＴＡＣＡ結合ドメイン及び１つ以上の標的ドメインを含み、当該標的ドメインは融合タンパク質を特定の細胞または組織領域に誘導することができる。一実施形態では、融合タンパク質は、抗体のＦｃドメインに連結された１つ以上のＴＡＣＡ結合ドメインを含むＦｃ融合タンパク質を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、１つ以上のＴＡＣＡ結合ドメインを含む二重特異性抗体を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、１つ以上のＴＡＣＡ結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。

【0132】

ある特定の実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるＴＡＣＡ結合ドメインに結合する１つ以上のペプチドを含む融合タンパク質を含む。例えば、一実施形態では、組成物は、１つ以上のレクチン結合ドメインを含む融合タンパク質を含み、当該レクチン結合ドメインはＴＡＣＡに結合するレクチンまたはレクチン由来ペプチドに結合する。例えば、一実施形態では、融合タンパク質は、１つ以上のレクチン結合ドメイン及び１つ以上の標的ドメインを含み、当該標的ドメインは融合タンパク質を特定の細胞または組織領域に誘導することができる。一実施形態では、融合タンパク質は、抗体のＦｃドメインに連結された１つ以上のレクチン結合ドメインを含むＦｃ融合タンパク質を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、１つ以上のレクチン結合ドメインを含む二重特異性抗体を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、１つ以上のレクチン結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。

【0133】

一態様では、組成物は、２つの異なる結合特異性を有し、それによって２つの異なる抗原に結合するペプチドを含む。一実施形態では、ペプチドは、第１の抗原に結合する第１の抗原認識ドメインと、第２の抗原に結合する第２の抗原認識ドメインとを含む。一実施形態では、第１の抗原認識ドメインはＴＡＣＡ結合ドメインである。ＴＡＣＡの例は、本明細書の他の箇所に記載されており、本発明のペプチドはそのすべてを標的とすることができる。

【0134】

ある特定の実施形態では、第２の抗原認識ドメインは、免疫エフェクター細胞に結合する。例示的な免疫エフェクター細胞としては、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、及び好中球が挙げられるが、これらに限定されない。

【0135】

一実施形態では、第２の抗原認識はＮＫ細胞抗原に結合し、本明細書ではこれをＮＫ細胞結合ドメインと称する。

【0136】

一実施形態では、第２の抗原認識ドメインはＴ細胞抗原に結合し、本明細書ではこれをＴ細胞結合ドメインと称する。

【0137】

ある特定の実施形態では、ペプチドは、ＴＡＣＡ結合ドメイン及び免疫エフェクター細胞結合ドメインを有する二重特異性ペプチドを含む。一実施形態では、ペプチドは、ＴＡＣＡ結合ドメイン及びＮＫ細胞結合ドメインを有する二重特異性ペプチドを含む。一実施形態では、ペプチドは、ＴＡＣＡ結合ドメイン及びＴ細胞結合ドメインを有する二重特異性ペプチドを含む。一実施形態では、二重特異性ペプチドは、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはそれらの断片を含む。ある特定の実施形態では、二重特異性ペプチドは、レクチン、レクチン断片、またはそれらの変異体を含む。

【0138】

ある特定の実施形態では、ペプチドは、免疫エフェクター細胞結合ドメインを含む。例えば、一実施形態では、免疫エフェクター細胞結合ドメインは、免疫エフェクター細胞上に存在する生体分子に結合するペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片を含む。

【0139】

ある特定の実施形態では、ペプチドは、ＮＫ細胞結合ドメインを含む。例えば、一実施形態では、ＮＫ細胞結合ドメインは、ＮＫ細胞上に存在する生体分子に結合するペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片を含む。ＮＫ細胞結合ドメインが結合できるＮＫ細胞の例示的な分子としては、ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄが挙げられるが、これらに限定されない。

【0140】

ある特定の実施形態では、ペプチドは、Ｔ細胞結合ドメインを含む。例えば、一実施形態では、Ｔ細胞結合ドメインは、Ｔ細胞上に存在する生体分子に結合するペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片を含む。Ｔ細胞結合ドメインが結合できるＴ細胞の例示的な分子としては、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体、ＣＤ２、ＣＤ２８、及びＣＤ２５が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、Ｔ細胞結合ドメインは、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合するペプチド、タンパク質、抗体、または抗体断片を含む。

【0141】

一実施形態では、Ｔ細胞結合ドメインは、ＣＤ３に特異的に結合する抗体断片を含む。例えば、一実施形態では、Ｔ細胞結合ドメインは、以下に示す配列番号９のアミノ酸配列を含む：

【表10】

（配列番号９）。

【0142】

一実施形態では、ペプチドは、ＴＡＣＡ結合ドメイン及びＴ細胞結合ドメインを含む。場合によって、ＴＡＣＡ結合ドメイン及びＴ細胞結合ドメインを含むペプチドは、グリカン依存性Ｔ細胞動員因子（ＧｌｙＴＲ）と称される。

【0143】

ある特定の実施形態では、ペプチドは、ＴＡＣＡ結合ドメインと免疫エフェクター細胞結合ドメインとの間にリンカードメインを含む。リンカードメインは、任意の適切なサイズまたは配列であり得る。例えば、一実施形態では、リンカードメインは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号１０）を含む。

【0144】

一実施形態では、ペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７（実施例２に示す）のアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドは、Ｃ末端Ｈｉｓタグがそこに含まれていない、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７のアミノ酸配列を含む。他の例示的なペプチドとしては、表２に列挙されたものが挙げられる。ただし、本発明は、いずれかの特定のＴＡＣＡ結合ドメイン、免疫エフェクター細胞結合ドメイン、ＮＫ細胞結合ドメイン、またはＴ細胞結合ドメインに限定されない。むしろ、ＴＡＣＡ結合ドメイン、免疫エフェクター細胞結合ドメイン、ＮＫ細胞結合ドメイン、Ｔ細胞結合ドメイン、またはそれらの組み合わせのいずれをも利用することができる。

【表11】

【0145】

一実施形態では、組成物のペプチドは、本明細書の他の箇所に記載されるＴＡＣＡ結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、共刺激ドメイン、またはゼータ鎖のうち１つ以上をさらに含む。膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含むＣＡＲは、米国特許出願公開番号ＵＳ２０１３／０２８７７４８、ＵＳ２０１４／０３７００１７、ＵＳ２０１４／００９９３０９、及びＵＳ２０１４／０２７１６３５に詳細に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。共刺激ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含む。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。

【0146】

本発明のＣＡＲに使用される細胞内シグナル伝達ドメインの好ましい例としては、抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始するために協調して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と共受容体の細胞質配列、ならびにその配列の任意の誘導体または変種、及び同じ機能的能力を有する任意の合成配列が挙げられる。

【0147】

ＴＣＲ単独で生成されたシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次的または共刺激的なシグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つのクラスの異なる細胞質シグナル伝達配列、すなわちＴＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）と、抗原に依存せずに作用して、二次的または共刺激的なシグナルをもたらすもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると言える。

【0148】

一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激的方法または阻害的方法のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激的方法で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシン系の活性化モチーフ、すなわちＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。

【0149】

本発明で特に使用される、一次細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。本発明のＣＡＲ中の細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含むことが特に好ましい。

【0150】

好ましい実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを単独で、または本発明のＣＡＲに関連して有用である任意の他の望ましい細胞質ドメイン（複数可）と組み合わせて含むように設計することができる。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分及び共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３などと特異的に結合するリガンドが挙げられる。

【0151】

本発明のペプチドは、化学的方法を用いて作製することができる。例えば、ペプチドを、固相技術（Ｒｏｂｅｒｇｅ Ｊ Ｙ ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２－２０４）によって合成し、樹脂から切り出して、分取高速液体クロマトグラフィーによって精製することができる。自動合成は、例えば、ＡＢＩ ４３１ Ａペプチドシンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、製造業者が提供する指示書に従って行うことができる。

【0152】

本発明はまた、本明細書で開示されるペプチドと実質的に相同性を有する、いかなる形態のペプチドをも含むと解釈すべきである。好ましくは、「実質的に相同」であるペプチドは、本明細書で開示されるペプチドのアミノ酸配列に対して、約５０％相同、より好ましくは約７０％相同、さらにより好ましくは約８０％相同、より好ましくは約９０％相同、さらにより好ましくは約９５％相同、さらにより好ましくは約９９％相同である。

【0153】

ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号１～１７のいずれかのアミノ酸配列に対して、約５０％相同、約７０％相同、約８０％相同、約９０％相同、約９５％相同、または約９９％相同であるペプチドを含む。

【0154】

あるいはペプチドは、組換え手段によって、または長いポリペプチドからの切断によって作製することができる。ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定によって確認することができる。

【0155】

本発明によるペプチドの変種は、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換されたものであり、そのような置換アミノ酸残基が、遺伝暗号によってコードされたものであってもなくてもよいもの、（ｉｉ）１つ以上の修飾されたアミノ酸残基、例えば置換基の結合によって修飾された残基が存在するもの、（ｉｉｉ）ペプチドが、本発明のペプチドの選択的スプライスバリアントであるもの、（ｉｖ）ペプチドの断片、及び／または（ｖ）ペプチドが別のペプチド、例えばリーダー配列もしくは分泌配列、または精製に用いられる配列（例えば、Ｈｉｓタグ）もしくは検出に用いられる配列（例えば、Ｓｖ５エピトープタグ）と融合されているものであり得る。断片には、元の配列のタンパク質分解切断（多部位タンパク質分解を含む）によって生成されたペプチドを含む。変種は、翻訳後修飾または化学修飾されていてもよい。このような変種は、本明細書の教示により当業者の範囲内にあると見なされる。

【0156】

当技術分野で既知であるように、２つのペプチド間の「類似性」は、あるポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存アミノ酸置換基を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。変種は、元の配列とは異なるペプチド配列、好ましくは元の配列と異なる残基が目的のセグメントあたり４０％未満である、より好ましくは元の配列と異なる残基が目的のセグメントあたり２５％未満である、より好ましくは元の配列と異なる残基が目的のセグメントあたり１０％未満である、最も好ましくは元のタンパク質配列と異なる残基が目的のセグメントあたりごく少数であると同時に、元の配列と十分に相同であり、元の配列の機能性及び／またはＴＡＣＡへの結合能が保持されているペプチド配列を含むと定義される。本発明は、元のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、９０％、または９５％類似する、または同一であるアミノ酸配列を含む。２つのペプチド間の同一度は、コンピュータアルゴリズム及び当業者に周知の方法を用いて決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して決定される［ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）］。

【0157】

本発明のペプチドは、翻訳後修飾することができる。例えば、本発明の範囲内にある翻訳後修飾としては、シグナルペプチド切断、グリコシル化、アセチル化、イソプレニル化、タンパク質分解、ミリストイル化、タンパク質フォールディング、及びタンパク質分解プロセシングなどが挙げられる。いくつかの修飾またはプロセシング事象には、付加的な生体機構の導入を必要とする。例えば、標準翻訳反応にイヌのミクロソーム膜またはアフリカツメガエル卵抽出物（米国特許第６，１０３，４８９号）を付加することによって、シグナルペプチド切断及びコアグリコシル化などのプロセシング事象を調べる。

【0158】

本発明のペプチドは、翻訳後修飾によって、または翻訳中に非天然アミノ酸を導入することによって形成された非天然アミノ酸を含み得る。タンパク質翻訳中に非天然アミノ酸を導入するためのさまざまなアプローチが利用可能である。

【0159】

本発明のペプチドまたはタンパク質をタンパク質などの他の分子とコンジュゲートし、融合タンパク質を調製してもよい。これは、例えば、Ｎ末端またはＣ末端融合タンパク質の合成によって達成することができるが、得られる融合タンパク質がペプチドの機能を保持している場合に限る。

【0160】

本発明のペプチドまたはタンパク質は、Ｒｅｅｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．（Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １１（４）：１３６５，１９９２）に記載の方法などの従来の方法を用いてリン酸化することができる。

【0161】

本発明のペプチドの環式誘導体も本発明の一部である。環化により、ペプチドが他の分子との会合に適した、より好ましいコンフォメーションをとることが可能になる場合がある。環化は、当技術分野で既知の技術を用いて行うことができる。例えば、遊離スルフヒドリル基を有する２つの適切に離間された成分間にジスルフィド結合が形成されてもよく、ある成分のアミノ基と他の成分のカルボキシル基との間にアミド結合が形成されてもよい。環化はまた、Ｕｌｙｓｓｅ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５，１１７，８４６６－８４６７による記載のようにアゾベンゼン含有アミノ酸を使用して行うこともできる。結合を形成する成分は、アミノ酸の側鎖、非アミノ酸成分、またはその２つの組み合わせであり得る。本発明の一実施形態では、環式ペプチドは、正しい位置にβターンを含み得る。正しい位置にアミノ酸Ｐｒｏ－Ｇｌｙを付加することにより、βターンを本発明のペプチドに導入することができる。

【0162】

上記のようなペプチド結合架橋を含む環式ペプチドよりも、柔軟性のある環式ペプチドを製造する方が望ましい場合がある。柔軟性のあるペプチドは、ペプチドの右側及び左側にシステインを導入し、２つのシステイン間にジスルフィド架橋を形成することによって調製することができる。２つのシステインは、βシート及びターンを変形させないように配置される。このペプチドは、ジスルフィド結合の長さと、βシート部分の水素結合数の減少の結果、柔軟性が高くなる。環式ペプチドの相対的な柔軟性は、分子動力学シミュレーションによって決定することができる。

【0163】

本発明はまた、キメラタンパク質を目的の細胞成分または細胞型もしくは細胞組織へと誘導できる、標的タンパク質及び／または標的ドメインに融合された、またはそれらに組み込まれたペプチドにも関する。キメラタンパク質はまた、追加のアミノ酸配列またはドメインを含み得る。キメラタンパク質は、さまざまな成分が異なる供給源に由来し、そのような成分が自然界では一緒に存在しない（すなわち、異種である）という意味で組換えである。

【0164】

一実施形態では、標的ドメインは、膜貫通ドメイン、膜結合ドメイン、または例えばベシクルもしくは核と会合するようにタンパク質を誘導する配列であり得る。一実施形態では、標的ドメインは、ペプチドを特定の細胞型または細胞組織に対して標的化することができる。例えば、標的ドメインは、細胞表面リガンド、または標的組織（例えば、骨、再生骨、変性骨、軟骨）の細胞表面抗原に対する抗体であり得る。標的ドメインは、本発明のペプチドを細胞成分に対して標的化することができる。

【0165】

本発明のペプチドは、従来の技術によって合成することができる。例えば、ペプチドまたはキメラタンパク質は、固相ペプチド合成を用いた化学合成によって合成することができる。これらの方法は、固相合成法または液相合成法のいずれかを用いる（例えば、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ，ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２^ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉｌｌ．（１９８４）及びＧ．Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔｏｒｓ Ｅ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ Ｖｏｌ．２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０，ｐｐ．３－２５４ ｆｏｒ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；ならびにＭ Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ １９８４，及びＥ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｅｄｓ．，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｕｐｒｓ，Ｖｏｌ １，ｆｏｒ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓを参照）。例として、本発明のペプチドは、Ｎ－フルオレニルメトキシ－カルボニル－Ｏ－ベンジル－Ｌ－ホスホスレオニン誘導体としてのホスホスレオニンの直接取り込みによる９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相化学を用いて合成することができる。

【0166】

他の分子とコンジュゲートされた本発明のペプチドまたはキメラタンパク質を含む、Ｎ末端またはＣ末端融合タンパク質は、ペプチドまたはキメラタンパク質のＮ末端またはＣ末端と、目的の生物学的機能を有する選択タンパク質または選択マーカーの配列を組換え技術により融合することによって調製することができる。得られた融合タンパク質は、本明細書に記載の選択タンパク質またはマーカータンパク質に融合された本発明のペプチドを含む。融合タンパク質の調製に使用できるタンパク質の例としては、免疫グロブリン、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、及び短縮型ｍｙｃが挙げられる。

【0167】

本発明のペプチドは、生物学的発現系を用いて開発することができる。これらの系の使用により、ランダムペプチド配列の大きなライブラリーの作製、及びこのライブラリーでの特定のタンパク質に結合するペプチド配列のスクリーニングが可能になる。ライブラリーは、ランダムペプチド配列をコードする合成ＤＮＡを適切な発現ベクターにクローニングすることにより作製することができる（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ １９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１； Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ，１９９０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４；Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ １９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８を参照）。ライブラリーはまた、重複ペプチドの同時合成によって構築することもできる（米国特許第４，７０８，８７１号を参照）。

【0168】

本発明のペプチド及びキメラタンパク質は、塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸などの無機酸、またはギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、サリチル酸、ベンゼンスルホン酸、及びトルエンスルホン酸などの有機酸と反応させることにより、医薬塩へと変換することができる。

【0169】

核酸
一実施形態では、本発明は、本明細書の他の箇所に記載するＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチドをコードする単離された核酸を含む組成物を提供する。

【0170】

一実施形態では、単離された核酸配列は、ＴＡＣＡ結合ドメインをコードする。ある特定の実施形態では、単離された核酸は、例えば、ガレクチン－１、ガレクチン－２、ガレクチン－３、ガレクチン－４、ガレクチン－５、ガレクチン－６、ガレクチン－７、ガレクチン－８、ガレクチン－９、ガレクチン－１０、ガレクチン－１１、ガレクチン－１２、ガレクチン－１３、ガレクチン－１４、及びガレクチン－１５などのガレクチン；シグレック－１（ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｏｎ）、シグレック－２（ＣＤ２２）、シグレック－３（ＣＤ３３）、シグレック－４（ミエリン関連糖タンパク質）、シグレック－５、シグレック－６、シグレック－７、シグレック－８、シグレック－９、シグレック－１０、シグレック－１１、シグレック－１２、シグレック－１３、シグレック－１４、シグレック－１５、シグレック－１６、シグレック－１７、シグレックＥ、シグレックＦ、シグレックＧ、及びシグレックＨなどのシグレック；セレクチン；Ｃ型レクチン；ＣＤ３０１、Ｌ－ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓロイコアグルチニン）；Ｅ－ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓエリスロアグルチニン）；トマトレクチン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍレクチン；ＬＥＡ）；ピーナッツレクチン（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａアグルチニン；ＰＮＡ）；ジャガイモレクチン（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍレクチン）、ヨウシュヤマゴボウマイトジェン（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ Ａｍｅｒｉｃａｎレクチン）、コムギ胚芽アグルチニン（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ Ｖｕｌｇａｒｉｓレクチン）；Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓレクチン（Ｊａｃａｌｉｎレクチン）；Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａアグルチニン（ＶＶＡ）；Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａアグルチニン（ＨＰＡ）；Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａアグルチニン（ＷＦＡ）；Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａアグルチニン（ＳＮＡ）、ＢＣ２ＬＣＭ（グラム陰性菌Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ由来レクチン）、Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓロイコアグルチニン（ＭＡＬ）、Ｐｓａｔｈｙｒｅｌｌａ ｖｅｌｕｔｉｎａ（ＰＶＬ）、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉレクチン（ＳＲＬ）、Ｅｕｃｈｅｕｍａ ｓｅｒｒａアグルチニン（ＥＳＡ）、ＣＬＥＣ１７Ａ（Ｐｒｏｌｅｃｔｉｎ）、Ａｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａレクチン、Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｓｉｅｂｏｌｄｉａｎａレクチン（ＳＳＡ）、Ｇｌｅｃｈｏｍａ ｈｅｄｅｒａｃｅａレクチン（Ｇｌｅｈｅｄａ）、Ｍｏｒｕｓ ｎｉｇｒａアグルチニン（Ｍｏｒｎｉｇａ Ｇ）、Ｓａｌｖｉａ ｓｃｌａｒｅａレクチン、Ｓａｌｖｉａ ｂｏｇｏｔｅｎｓｉｓレクチン、Ｓａｌｖｉａ ｈｏｒｍｉｎｕｍレクチン、Ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｏｍｕｍレクチン、Ｍｏｌｕｃｃｅｌｌａ ｌａｅｖｉｓレクチン、Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ（ＧｓＬＡ４）、Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ（酸性ＷＢＡＩ）、Ａｂｒｕｓ ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓレクチン、Ｍｏｌｕｃｅｌｌａ ｌａｅｖｉｓレクチン（ＭＬＬ）、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｃａｕｄａｔｕｓレクチン、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｌｅｕｃｏｃａｒｐｕｓレクチン、Ｌａｅｌｉａ ａｕｔｕｍｎａｌｉｓレクチン、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａレクチン、Ｍａｃｌｕｒａ ｐｏｍｉｆｅｒａレクチン、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ ｌａｋｏｏｃｈａレクチン、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓアグルチニン、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓレクチン、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘレクチン、及びＡｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓレクチンを含む、レクチンに由来するペプチドをコードする配列を含む。

【0171】

例えば、種々の実施形態において、単離された核酸配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７から選択されるアミノ酸配列を含むＴＡＣＡ結合ドメインをコードする。

【0172】

ある特定の実施形態では、単離された核酸配列は、リーダー配列をコードする。例えば、ある特定の実施形態では、単離された核酸配列は、配列番号８のアミノ酸配列を含むリーダー配列をコードする。

【0173】

ある特定の実施形態では、単離された核酸配列は、Ｔ細胞結合ドメインをコードする。例えば、ある特定の実施形態では、単離された核酸配列は、配列番号９のアミノ酸配列を含むＴ細胞結合ドメインをコードする。

【0174】

ある特定の実施形態では、単離された核酸配列は、ＴＡＣＡ結合ドメイン及びＴ細胞結合ドメインを含むペプチドをコードする。例えば、ある特定の実施形態では、単離された核酸配列は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。ある特定の実施形態では、単離された核酸は、Ｃ末端Ｈｉｓタグがそこに含まれていない、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。

【0175】

一実施形態では、単離された核酸配列は、配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。

【0176】

ある特定の実施形態では、単離された核酸配列は、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むＣＡＲをコードする。ある特定の実施形態では、単離された核酸配列は、ＴＡＣＡ結合ドメインと１つ以上の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含むＣＡＲをコードする。

【0177】

さらに、本発明は、本明細書で開示されるペプチドと実質的に相同性を有するペプチドをコードする単離された核酸を包含する。ある特定の実施形態では、単離された核酸配列は、配列番号１～１７から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有するペプチドをコードする。

【0178】

さらに、本発明は、本明細書で開示されるヌクレオチド配列と実質的に相同性を有するペプチドをコードする単離された核酸を包含する。ある特定の実施形態では、単離された核酸配列は、配列番号１８と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有する。

【0179】

本発明のペプチドをコードする単離された核酸配列は、当技術分野で既知の多くの組換え法のいずれかを用いて、例えば、標準的な技術を使用して、遺伝子を発現する細胞のライブラリーをスクリーニングすることによって、遺伝子を含むことが既知であるベクターから遺伝子を誘導することによって、または遺伝子を含む細胞及び組織から直接単離することによって得ることができる。あるいは、目的の遺伝子を、クローニングではなく合成的に作製することができる。

【0180】

単離された核酸は、例えばＤＮＡ及びＲＮＡに限定されない、いずれの型の核酸をも含み得る。例えば、一実施形態では、組成物は、例えば、本発明のペプチドをコードする単離されたｃＤＮＡ分子を含む単離されたＤＮＡ分子、またはその機能的断片を含む。一実施形態では、組成物は、本発明のペプチドをコードする単離されたＲＮＡ分子、またはその機能的断片を含む。

【0181】

本発明の核酸分子を修飾して、細胞培養の際に血清中または増殖培地中の安定性を向上させることができる。修飾を加えることで、本発明の核酸分子の安定性、機能性、及び／または特異性を高め、かつ免疫活性化特性を最小限に抑えることができる。例えば、安定性を高めるために、３’残基を分解に対して安定化することができ、例えば、３’残基がプリンヌクレオチド、特にアデノシンまたはグアノシンヌクレオチドからなるように選択することができる。あるいは、修飾された類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、２’－デオキシチミジンによるウリジンの置換が許容され、分子の機能に影響を及ぼさない。

【0182】

本発明の一実施形態では、核酸分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド類似体を含み得る。例えば、修飾ヌクレオチド類似体を組み込むことによって末端を安定化させることができる。

【0183】

ヌクレオチド類似体の非限定的な例としては、糖修飾リボヌクレオチド及び／または主鎖修飾リボヌクレオチド（すなわち、リン酸－糖主鎖に対する修飾を含む）が挙げられる。例えば、窒素または硫黄ヘテロ原子の少なくとも１つを含むように、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合を修飾することができる。好ましい主鎖修飾リボヌクレオチドでは、隣接するリボヌクレオチドに結合するホスホエステル基が、例えばホスホチオエート基である修飾基で置換される。好ましい糖修飾リボヌクレオチドにおいて、２’ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、またはＯＮから選択される基で置換され、ここで、ＲはＣ_１～Ｃ_６アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩである。

【0184】

修飾の他の例は、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち天然に存在する核酸塩基の代わりに少なくとも１つの天然に存在しない核酸塩基を含むリボヌクレオチドである。塩基は、アデノシンデアミナーゼの活性をブロックするように修飾することができる。例示的な修飾核酸塩基としては、５位修飾ウリジン及び／またはシチジン、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ブロモウリジン；８位修飾アデノシン及び／またはグアノシン、例えば、８－ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシン；Ｏ－及びＮ－アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６－メチルアデノシンが挙げられ、好適であるが、これらに限定されない。なお、上記の変形型を組み合わせてもよい。

【0185】

場合によって、核酸分子は、以下の化学修飾、すなわち１つ以上のヌクレオチドの２’－Ｈ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、または２’－ＯＨ修飾のうち少なくとも１つを含む。ある特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、増強されたヌクレアーゼ耐性を有することができる。ヌクレアーゼ耐性を増加させるため、核酸分子は、例えば、２’－修飾リボース単位及び／またはホスホロチオエート結合を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）を、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または置換することができる。ヌクレアーゼ耐性を増加させるため、本発明の核酸分子は、２’－Ｏ－メチル、２’－フッ素、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－アミノ、及び／またはホスホロチオエート結合を含み得る。ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、例えば２’－４’－エチレン架橋核酸の付加、及び２－アミノ－Ａ修飾、２－チオ（例えば、２－チオ－Ｕ）修飾、Ｇ－クランプ修飾などのある種の核酸塩基修飾はまた、標的に対する結合親和性を増加させることができる。

【0186】

一実施形態では、核酸分子は、２’－修飾ヌクレオチド、例えば、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）を含む。一実施形態では、核酸分子は少なくとも１つの２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、いくつかの実施形態では、核酸分子のすべてのヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル修飾を含む。

【0187】

ある特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、好ましくは、以下の特性の１つ以上を有する：

【0188】

本明細書で述べる核酸剤は、特に修飾されないＲＮＡ及びＤＮＡ、ならびに例えば有効性を改善するために修飾されたＲＮＡ及びＤＮＡ、ならびにヌクレオシド代替物のポリマーを含む。非修飾ＲＮＡとは、核酸の成分、すなわち糖、塩基、及びリン酸部分が自然界に存在するもの、好ましくは人体に天然に存在するものと同じまたは本質的に同じである分子を指す。当技術分野では、希有または例外的だが天然に存在するＲＮＡを修飾ＲＮＡと称している。例えば、Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌを参照のこと（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９４，２２：２１８３－２１９６）。修飾ＲＮＡとしばしば称される、このような希有または例外的なＲＮＡは通常、転写後修飾の結果であり、本明細書で使用される非修飾ＲＮＡという用語の範囲内である。本明細書で使用される修飾ＲＮＡとは、１つ以上の核酸の成分、すなわち糖、塩基、及びリン酸部分が自然界に存在するものと異なる、好ましくは人体に天然に存在するものと異なる分子を指す。それらは「修飾ＲＮＡ」と称されるが、修飾のために、厳密に言えばＲＮＡではない分子も当然ながら含まれることになる。ヌクレオチド代替物とは、ハイブリダイゼーションがリボリン酸骨格で見られるものと実質的に類似するように、塩基を正しい空間関係で提示することが可能である非リボリン酸構築物、例えばリボリン酸骨格の非荷電模倣体で、リボリン酸骨格が置換されている分子である。

【0189】

本発明の核酸の修飾は、リン酸基、糖基、骨格、Ｎ末端、Ｃ末端、または核酸塩基のうちの１つ以上に存在していてもよい。

【0190】

本発明はまた、本発明の単離された核酸が挿入されたベクターを含む。当技術分野には、本発明に有用である適切なベクターが豊富に存在する。

【0191】

簡単に要約すると、本発明のペプチドをコードする天然または合成の核酸の発現は、通常、ペプチドまたはその一部をコードする核酸をプロモーターに機能的に連結し、その構築物を発現ベクターに組み込むことによって行う。使用されるベクターは、複製、及び場合により真核細胞中の組み込みに適している。典型的なベクターには、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、ならびに目的の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターが含まれている。

【0192】

本発明のベクターはまた、標準的な遺伝子送達プロトコールを用いて、核酸免疫法及び遺伝子療法に使用することができる。遺伝子送達の方法は、当技術分野において既知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号を参照のこと。別の実施形態では、本発明は遺伝子療法ベクターを提供する。

【0193】

本発明の単離された核酸は、多数の種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むが、これらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特に対象となるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターを含む。

【0194】

さらに、ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は、当技術分野において周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ならびに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、適切なベクターには、少なくとも１つの生物体において機能する複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択マーカーが含まれている（例えば、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；及び米国特許第６，３２６，１９３号）。

【0195】

哺乳動物細胞への遺伝子移入に、ウイルスを用いた系が数多く開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系に便利なプラットフォームである。当技術分野で既知の技術を用いて、選抜遺伝子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次いで、組換えウイルスを単離し、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで対象の細胞に送達することができる。多数のレトロウイルス系が、当技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターを使用する。多数のアデノウイルスベクターが、当技術分野において既知である。一実施形態では、レンチウイルスベクターを使用する。

【0196】

例えば、レンチウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターは、導入遺伝子の長期間の安定した組み込み及び娘細胞へのその分配を可能にするので、長期間の遺伝子移入を実現するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルス由来のベクターを上回る別の利点を有する。これらはまた、免疫原性が低いという別の利点を有する。一実施形態では、組成物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターを含む。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、さまざまな疾患の治療に適した強力な遺伝子送達ツールとなっている。ＡＡＶベクターは、病原性の欠如、最小限の免疫原性、及び有糸分裂後細胞を安定かつ効率的に形質導入する能力を含め、遺伝子療法にとって最適なベクターにするいくつかの特徴を有する。ＡＡＶベクター内に含まれる特定の遺伝子の発現は、ＡＡＶ血清型、プロモーター、及び送達方法の適切な組み合わせを選択することにより、１つ以上の種類の細胞を特異的に標的とすることができる。

【0197】

ある特定の実施形態では、ベクターはまた、プラスミドベクターでトランスフェクトされた細胞または本発明により産生されたウイルスに感染した細胞でのその転写、翻訳、及び／または発現を可能にするように導入遺伝子に機能的に連結された従来の制御エレメントを含む。本明細書で使用される場合、「機能的に連結された」配列は、目的遺伝子と隣接する発現制御配列と、目的遺伝子を制御するためにトランスでまたは一定の距離で作用する発現制御配列の両方を含む。発現制御配列には、適切な転写開始配列、転写終結配列、転写プロモーター配列、及び転写エンハンサー配列；スプライシングシグナル及びポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに必要に応じて、コード産物の分泌を増強する配列を含む。ネイティブプロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び／または組織特異的プロモーターを含む、多数の発現制御配列が当技術分野で既知であり、利用可能である。

【0198】

さらに別のプロモーターエレメント、例えばエンハンサーは転写開始の頻度を調節する。通常これらは、開始部位の上流３０～１１０ｂｐの領域に位置するが、先頃、いくつかのプロモーターは開始部位の下流にも機能的エレメントを含むことが示されている。プロモーター要素間の間隔は柔軟であることが多く、そのためエレメントが互いに反転または移動してプロモーター機能が維持される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔は、５０ｂｐの距離まで長くすることができ、それ以降は活性が低下し始める。プロモーターによっては、転写を活性化するために、個々のエレメントを協働的に機能させることも、または独立して機能させることもできると思われる。

【0199】

適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに機能的に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルな発現を誘導できる強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターのもう一つの例が、伸長増殖因子－１α（ＥＦ－１α）である。ただし、他の構成的プロモーター配列も使用することができ、これには、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バールウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターなどに限定されないヒト遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図される。誘導性プロモーターを使用すると、それが機能的に連結されているポリヌクレオチド配列の発現を、そのような発現が望ましい場合はオンにし、発現が望ましくない場合はオフにすることが可能な分子スイッチが得られる。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

【0200】

ベクターに存在するエンハンサー配列もまた、ベクター中に含まれる遺伝子の発現を調節する。通常エンハンサーはタンパク質因子と結合して遺伝子の転写を増強する。エンハンサーは、それが調節する遺伝子の上流または下流に位置し得る。エンハンサーはまた、特定の細胞型または組織型での転写を増強するために組織特異的であり得る。一実施形態では、本発明のベクターは、ベクター内に存在する遺伝子の転写を増強する１つ以上のエンハンサーを含む。

【0201】

細胞に導入される発現ベクターは、ペプチドの発現を評価するために、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させようとする細胞集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にする選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれかまたは両方を含むことができる。他の態様では、選択マーカーを個別のＤＮＡ片上に担持して、同時トランスフェクト手順に使用することができる。選択マーカーとレポーター遺伝子はいずれも、宿主細胞での発現が可能である適切な調節配列と隣接させることができる。有用な選択マーカーとしては、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。

【0202】

レポーター遺伝子は、潜在的なトランスフェクト細胞を同定するため、及び調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物もしくは組織に存在しないか、またはそれらによって発現されない遺伝子であり、いくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって発現が顕在化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後、適切な時点で評価される。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を含み得る（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）。適切な発現系は周知であり、既知の技術を用いて調製するか、または商業的に入手することができる。一般に、最小５’フランキング領域がレポーター遺伝子の最も高い発現レベルを示す構築物は、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結して、薬剤のプロモーター駆動性転写を調節する能力に関する評価に使用することができる。

【0203】

遺伝子を細胞に導入し発現させる方法は、当技術分野で既知である。発現ベクターに関連して、ベクターを、当技術分野の任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。

【0204】

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクター及び／または外来性核酸を含む細胞の産生方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。

【0205】

目的ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞への遺伝子挿入に最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号を参照のこと。

【0206】

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベース系などのコロイド分散系が挙げられる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの送達ビヒクルとして使用される例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。

【0207】

非ウイルス送達系を利用する場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。核酸の宿主細胞への導入（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏ）に脂質製剤の使用が企図されている。別の態様では、核酸は脂質と会合していてもよい。脂質と会合した核酸は、リポソームの水性内部にカプセル化されるか、リポソームの脂質二重層内に散在されるか、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に会合した連結分子を介してリポソームに結合されるか、リポソームに捕捉されるか、リポソームと複合体化されるか、脂質を含有する溶液中に分散されるか、脂質と混合されるか、脂質と複合体化するか、脂質中に懸濁液として含有されるか、ミセルに含有されるもしくはそれと複合体化するか、またはそれ以外の方法で脂質と会合され得る。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクター会合組成物は、溶液中にて何らかの特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二層構造で、ミセルとして、または「崩壊」構造で存在し得る。それらはまた、単に溶液中に散在していてもよく、場合によりサイズまたは形状が均一ではない凝集体を形成してもよい。脂質は、天然または合成の脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質には、細胞質に天然に存在する脂肪滴、ならびに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、及びアルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体を含む化合物のクラスを含む。

【0208】

使用に適した脂質は、市販品の供給元から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手することができ、ジエチルリン酸（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から入手することができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質原液は、約－２０℃で保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するので、単独の溶媒としてはクロロホルムを使用する。「リポソーム」は、封入脂質二重層または凝集体の生成によって形成される多様な単層及び多層脂質ビヒクルを包含する一般用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内部水性媒体を有する小胞構造を有することを特徴とし得る。多重層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。これは、リン脂質を過剰の水溶液中で懸濁させると自然に形成される。脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己再構成を起こし、脂質二重層間に水及び溶解された溶質を取り込む（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：５０５－１０）。しかしながら、通常の小胞構造とは異なる構造を溶液中で有する組成物も包含される。例えば、脂質は、ミセル構造をとることも、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在することもできる。また、リポフェクタミン－核酸複合体も企図される。

【0209】

外来性核酸の宿主細胞への導入に使用する方法を問わず、宿主細胞中の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、さまざまなアッセイを実施することができる。このようなアッセイには、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ、及びＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）または本発明の範囲内にある薬剤を同定するための本明細書に記載されるアッセイによって、特定のペプチドの存在または不在を検出するなどの「生化学的」アッセイを含む。

【0210】

一実施形態では、本発明のペプチドをコードする単離された核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）されたＲＮＡを含む。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成鋳型を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって産生される。適切なプライマー及びＲＮＡポリメラーゼを使用して、任意の供給源由来の目的ＤＮＡをＰＣＲによって直接、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍＲＮＡ合成の鋳型に変換することができる。ＤＮＡ供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列、または任意の他の適切なＤＮＡ供給源であり得る。

【0211】

一実施形態では、ＰＣＲに使用されるＤＮＡはオープンリーディングフレームを含む。このＤＮＡは、生物のゲノム由来の天然に存在するＤＮＡ配列由来であってもよい。一実施形態では、ＤＮＡは、遺伝子の一部分の目的とする全長遺伝子である。遺伝子は、５’及び／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）のいくつかまたはすべてを含み得る。遺伝子は、エキソン及びイントロンを含み得る。一実施形態では、ＰＣＲに使用されるＤＮＡはヒト遺伝子である。別の実施形態では、ＰＣＲに使用されるＤＮＡは、５’及び３’ＵＴＲを含むヒト遺伝子である。あるいは、ＤＮＡは、天然に存在する生物では通常発現しない人工ＤＮＡ配列であってもよい。例示的な人工ＤＮＡ配列は、一緒に連結されて融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成する遺伝子部分を含むものである。一緒に連結されるＤＮＡの部分は、単一の生物体または複数の生物体由来であり得る。

【0212】

ＰＣＲのためのＤＮＡ供給源として使用することができる遺伝子には、生物体に治療的もしくは予防的な効果をもたらすか、または生物体における疾患もしくは障害を診断するために使用することができる、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む。好ましい遺伝子は、短期治療には有用であるが、そうでない場合には投与量もしくは発現遺伝子に関して安全性の懸念がある遺伝子である。例えば、癌、自己免疫障害、寄生体感染症、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、または他の感染症の治療の場合、発現させようとする導入遺伝子（複数可）は、免疫系の細胞にとってリガンドもしくは受容体として機能するか、または生物体の免疫系を刺激もしくは阻害するように機能できるポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、長期間にわたり免疫系の継続的な刺激があることは望ましくなく、かつ治療奏功後も持続する変化を生じさせることも必要としないが、これはその後に新たな問題を誘発する恐れがあるためである。自己免疫障害の治療の場合、再燃時には免疫系を阻害または抑制することが望ましい場合があるが、患者が感染に過度にかかりやすくなる恐れがあるため、長期的には望ましくない。

【0213】

ＰＣＲは、トランスフェクションに使用される、ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型を作製するために使用される。ＰＣＲを実施する方法は、当技術分野において周知である。ＰＣＲに使用されるプライマーは、ＰＣＲのための鋳型として使用されるＤＮＡの領域に対して実質的に相補的である領域を有するように設計される。本明細書で使用される場合、「実質的に相補的」とは、プライマー配列中の塩基の大半もしくはすべてが相補的であるか、または１つ以上の塩基が非相補的もしくはミスマッチである、ヌクレオチドの配列を指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに使用されるアニーリング条件下で、意図したＤＮＡ標的とアニールまたはハイブリダイズすることができる。プライマーは、ＤＮＡ鋳型の任意の部分に対して実質的に相補的であるように設計することができる。例えば、プライマーを、５’及び３’ＵＴＲを含む、細胞で通常転写される遺伝子の一部分（オープンリーディングフレーム）を増幅するように設計することができる。また、プライマーを、目的とする特定のドメインをコードする遺伝子の一部分を増幅するように設計することもできる。一実施形態では、プライマーは、５’及び３’ＵＴＲの全体または部分を含む、ヒトｃＤＮＡのコード領域を増幅するように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当技術分野において周知である合成法によって作製される。「順方向プライマー」とは、増幅させようとするＤＮＡ配列の上流にある、ＤＮＡ鋳型上のヌクレオチドに対して実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「上流」は、本明細書で使用される場合、コード鎖に対して、増幅させようとするＤＮＡ配列の５’側を指す。「逆方向プライマー」とは、増幅させようとするＤＮＡ配列の下流にある、二本鎖ＤＮＡ鋳型に対して実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「下流」は、本明細書で使用される場合、コード鎖に対して、増幅させようとするＤＮＡ配列の３’側を指す。

【0214】

ＰＣＲに有用なＤＮＡポリメラーゼのいずれをも、本明細書で開示される方法に使用することができる。試薬及びポリメラーゼは、いくつかの供給元から市販されている。

【0215】

安定性及び／または翻訳効率を高める能力を有する化学構造体を使用することもできる。ＲＮＡは５’及び３’ＵＴＲを有することが好ましい。一実施形態では、５’ＵＴＲは０～３０００ヌクレオチドの長さである。コード領域に付加される５’及び３’ＵＴＲ配列の長さは、さまざまな方法によって変化させることができ、この方法には、そのＵＴＲの別の領域とアニーリングするＰＣＲ用プライマーの設計を含むが、これに限定されない。この方法を用いて、当業者は、転写ＲＮＡのトランスフェクト後に最適な翻訳効率を達成するために必要とされる、５’及び３’ＵＴＲの長さを改変することができる。

【0216】

５’及び３’ＵＴＲは、目的遺伝子の天然に存在する内在性５’及び３’ＵＴＲであり得る。あるいは、ＵＴＲ配列を順方向及び逆方向プライマーに組み込むことによって、または鋳型の他の何らかの改変によって、目的遺伝子に内在しないＵＴＲ配列を付加することもできる。目的遺伝子に内在しないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性及び／または翻訳効率の変更に有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列中のＡＵリッチエレメントはｍＲＮＡの安定性を低下させ得ることが知られている。したがって、当技術分野において周知であるＵＴＲの特性に基づいて、転写ＲＮＡの安定性を高めるように３’ＵＴＲを選択または設計することができる。

【0217】

一実施形態では、５’ＵＴＲは内在性遺伝子のＫｏｚａｋ配列を含み得る。あるいは、目的遺伝子に内在しない５’ＵＴＲを上記のようにＰＣＲによって付加すると、５’ＵＴＲ配列の付加によりコンセンサスＫｏｚａｋ配列が再設計され得る。Ｋｏｚａｋ配列は、いくつかのＲＮＡ転写物の翻訳効率を高めることができるが、すべてのＲＮＡについて効率的な翻訳を可能にするために必要であるとは限らないと思われる。多くのｍＲＮＡにＫｏｚａｋ配列が必要であることは、当技術分野において既知である。他の実施形態では、５’ＵＴＲを、ＲＮＡゲノムが細胞内で安定であるＲＮＡウイルスから誘導することができる。他の実施形態では、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨げるために、さまざまなヌクレオチド類似体を３’または５’ＵＴＲに使用することができる。

【0218】

遺伝子クローニングを必要とせずにＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を可能にするには、転写プロモーターが、転写させようとする配列の上流でＤＮＡ鋳型に付加される必要がある。ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターとして機能する配列を順方向プライマーの５’末端に付加すると、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが、転写させようとするオープンリーディングフレームの上流でＰＣＲ産物に組み込まれるようになる。好ましい一実施形態では、プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載したようにＴ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターとしては、Ｔ３及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は当技術分野において既知である。

【0219】

ある好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは５’末端のキャップ及び３’ポリ（Ａ）尾部の両方を有し、これらがリボソーム結合、翻訳の開始、及び細胞でのｍＲＮＡ安定性を決定付ける。環状ＤＮＡ鋳型、例えばプラスミドＤＮＡ上では、ＲＮＡポリメラーゼが、真核細胞での発現に適さない長いコンカテマー産物を産生する。３’ＵＴＲの末端で線状化されたプラスミドＤＮＡの転写では、転写後であっても、真核生物トランスフェクションに有効ではない、正常サイズのｍＲＮＡが生じる。

【0220】

線状ＤＮＡ鋳型上で、ファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の最終塩基を越えて転写物の３’末端を伸長させることができる（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ ａｎｄ Ｍｉｅｒｅｎｄｏｒｆ，Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：６２２３－３６（１９８５）；Ｎａｃｈｅｖａ ａｎｄ Ｂｅｒｚａｌ－Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：１４８５－６５（２００３）。

【0221】

ＤＮＡ鋳型にポリＡ／Ｔ連鎖を組み込む従来の方法は分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡに組み込まれたポリＡ／Ｔ配列はプラスミドの不安定化を引き起こす恐れがあり、このことが、細菌細胞から得たプラスミドＤＮＡ鋳型に欠失及び他の異常がしばしば高頻度で混入する理由となっている。そのため、クローニング手順が面倒で時間がかかるだけでなく、信頼性も損なわれる場合が多い。このような理由から、ポリＡ／Ｔ ３’連鎖を有するＤＮＡ鋳型の構築をクローニングなしで可能にする方法が強く望まれている。

【0222】

転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、ＰＣＲ中に、ポリＴ尾部、例えば１００Ｔ尾部など（サイズは５０～５０００Ｔであり得る）を含む逆方向プライマーを使用することによって、またはＰＣＲ後に、ＤＮＡ連結もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えを含むが、これらに限定されない他の任意の方法によって産生することができる。ポリ（Ａ）尾部はまた、ＲＮＡに安定性をもたらし、その分解も低下させる。一般に、ポリ（Ａ）尾部の長さは、転写ＲＮＡの安定性と正の相関関係にある。一実施形態では、ポリ（Ａ）尾部は１００～５０００個のアデノシンである。

【0223】

ＲＮＡのポリ（Ａ）尾部は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写後に、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、例えばＥ．ｃｏｌｉポリＡポリメラーゼ（Ｅ－ＰＡＰ）などの使用により、さらに伸長させることができる。一実施形態では、ポリ（Ａ）尾部の長さを１００ヌクレオチドから３００～４００ヌクレオチドへと増やすことにより、ＲＮＡの翻訳効率が約２倍に増加する。さらに、異なる化学基を３’末端に結合して、ｍＲＮＡの安定性を高めることができる。このような結合は、修飾／人工ヌクレオチド、アプタマー、及び他の化合物を含み得る。例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて、ＡＴＰ類似体をポリ（Ａ）尾部に組み込むことができる。ＡＴＰ類似体は、ＲＮＡの安定性をさらに高めることができる。

【0224】

５’キャップ付加（５’ ｃａｐｓ ｏｎ）もまた、ＲＮＡ分子に安定性を与える。ある好ましい実施形態では、本明細書で開示される方法により産生されるＲＮＡは５’キャップを含む。５’キャップは、当技術分野において既知であって本明細書に記載される技術を用いて付与される（Ｃｏｕｇｏｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２９：４３６－４４４（２００１）；Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，７：１４６８－９５（２００１）；Ｅｌａｎｇｏ， ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３０：９５８－９６６（２００５））。

【0225】

本明細書で開示される方法により産生されるＲＮＡはまた、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列も含み得る。ＩＲＥＳ配列は、ｍＲＮＡに対するキャップ非依存的なリボソーム結合を開始させて、翻訳開始を容易にする、任意のウイルス配列、染色体配列、または人工的に設計された配列であってよい。細胞透過性及び生存可能性を促進する因子、例えば糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤、及び界面活性剤などを含み得る、細胞エレクトロポレーションに適した任意の溶質を含めることができる。

【0226】

ＲＮＡは、いくつかのさまざまな方法のいずれか、例えば、エレクトロポレーション（Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ－ＩＩ（Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、（ＥＣＭ ８３０（ＢＴＸ）（Ｈａｒｖａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）、またはＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ、Ｄｅｎｖｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ、Ｈａｍｂｕｒｇ Ｇｅｒｍａｎｙ）、リポフェクションを用いるカチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション、ポリマーカプセル封入、ペプチド媒介性トランスフェクション、または「遺伝子銃」などのバイオリスティック粒子送達システムを含むが、これらに限定されない市販の方法を用いて、標的細胞に導入することができる（例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１２（８）：８６１－７０（２００１）を参照）。

【0227】

別の態様では、ＲＮＡ構築物はエレクトロポレーションによって細胞内に送達することができる。例えば、ＵＳ２００４／００１４６４５、ＵＳ２００５／００５２６３０Ａ１、ＵＳ２００５／００７０８４１Ａ１、ＵＳ２００４／００５９２８５Ａ１、ＵＳ２００４／００９２９０７Ａ１に教示されているような、哺乳動物細胞への核酸構築物のエレクトロポレーションの製剤及び方法を参照のこと。既知のいずれの細胞型のエレクトロポレーションにも必要とされる、電界強度を含むさまざまなパラメーターは、関連研究文献ならびに当技術分野における多数の特許及び出願において公知である。例えば、米国特許第６，６７８，５５６号、米国特許第７，１７１，２６４号、及び米国特許第７，１７３，１１６号を参照のこと。エレクトロポレーションの治療適用のための装置は市販されており、これには例えば、ＭｅｄＰｕｌｓｅｒ（商標）ＤＮＡ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｏｖｉｏ／Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）があり、米国特許第６，５６７，６９４号；米国特許第６，５１６，２２３号、米国特許第５，９９３，４３４号、米国特許第６，１８１，９６４号、米国特許第６，２４１，７０１号、及び米国特許第６，２３３，４８２号などの特許に記載されている。エレクトロポレーションはまた、例えばＵＳ２００７０１２８７０８Ａ１に記載されるような、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞のトランスフェクションに使用することもできる。エレクトロポレーションはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで核酸を細胞に送達するために使用することもできる。このように、当業者に既知の多くの利用可能なデバイス及びエレクトロポレーションシステムのいずれかを利用した、発現構築物を含む核酸の細胞へのエレクトロポレーション媒介性投与は、目的ＲＮＡを標的細胞に送達する画期的な新しい手段である。

【0228】

キメラ抗原受容体
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＣＡＲをコードする核酸分子を含み、当該ＣＡＲがＴＡＣＡ結合ドメインを含む組成物を提供する。一実施形態では、ＣＡＲは細胞外及び細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、別の用語では抗原結合ドメインとも称される標的特異的結合エレメントを含む。細胞内ドメイン、または別の用語で細胞質ドメインは、共刺激シグナル伝達領域及びゼータ鎖部分を含む。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指す。共刺激分子とは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。

【0229】

ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間、またはＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に、スペーサードメインを組み込んでもよい。本明細書で使用される場合、用語「スペーサードメイン」とは、一般に、ポリペプチド鎖中の膜貫通ドメインを、細胞外ドメインまたは細胞質ドメインのいずれかと連結させる働きをする任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、最大で３００アミノ酸、好ましくは１０～１００アミノ酸、最も好ましくは２５～５０アミノ酸で構成され得る。

【0230】

抗原結合部分
一実施形態では、本発明のＣＡＲは、別の用語で抗原結合部分とも称される標的特異的結合要素を含む。

【0231】

一実施形態では、本発明のＣＡＲの抗原結合部分は、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上のＴＡＣＡ結合ドメインを含む。例えば、一実施形態では、抗原結合部分は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、またはその相同ペプチドのいずれかの１つ以上のＴＡＣＡ結合ドメインを含む。

【0232】

一実施形態では、組成物は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含み、当該核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、またはその相同ペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0233】

一実施形態では、ＣＡＲの抗原結合部分は、本明細書に記載されるＴＡＣＡ結合ドメインに結合するペプチドを含む。例えば、一実施形態では、ＣＡＲの抗原結合部分は、レクチン結合ドメインを含み、当該レクチン結合ドメインはＴＡＣＡに結合するレクチンまたはレクチン由来のペプチドに結合する。

【0234】

膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインと融合した膜貫通ドメインを含むように設計することができる。一実施形態では、ＣＡＲ内のドメインの１つに天然に結合する膜貫通ドメインを用いる。場合によっては、膜貫通ドメインを選択、またはアミノ酸置換により修飾することにより、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに対するそのようなドメインの結合を回避することで、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えことができる。

【0235】

膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれに由来してもよい。供給源が天然である場合、ドメインは何らかの膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明に特に使用される膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来し得る（すなわち、少なくともそれらの膜貫通領域（複数可）を含む）。あるいは、膜貫通ドメインは合成されていてもよく、その場合には、主としてロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含む。好ましくは、合成膜貫通ドメインの各末端には、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットが見られるはずである。場合により、好ましくは長さが２～１０アミノ酸である短いオリゴペプチドまたはポリペプチドのリンカーによって、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間に架橋が形成されていてもよい。グリシン－セリンのダブレットは特に適したリンカーとなる。

【0236】

好ましくは、本発明のＣＡＲ内の膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインである。場合によっては、本発明のＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８αヒンジドメインを含む。

【0237】

細胞質ドメイン
本発明のＣＡＲの細胞質ドメイン、または別の用語で細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが挿入された免疫細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも１つの活性化を担う。用語「エフェクター機能」は、細胞の特別な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達して、細胞に特別な機能を実行させるタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を利用できるが、多くの場合、その鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分を使用する場合には、そのような短縮部分を、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに使用してもよい。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むものとする。

【0238】

本発明のＣＡＲに使用される細胞内シグナル伝達ドメインの好ましい例としては、抗原受容体結合後にシグナル伝達を開始するために協調して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と共受容体の細胞質配列、ならびにその配列の任意の誘導体または変種、及び同じ機能的能力を有する任意の合成配列が挙げられる。

【0239】

ＴＣＲ単独で生成されたシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次的または共刺激的なシグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つのクラスの異なる細胞質シグナル伝達配列、すなわちＴＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）と、抗原に依存せずに作用して、二次的または共刺激的なシグナルをもたらすもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると言える。

【0240】

一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激的方法または阻害的方法のいずれかで、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激的方法で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシン系の活性化モチーフ、すなわちＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。

【0241】

本発明で特に使用される、一次細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。本発明のＣＡＲ中の細胞質シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質シグナル伝達配列を含むことが特に好ましい。

【0242】

好ましい実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを単独で、または本発明のＣＡＲに関連して有用である任意の他の望ましい細胞質ドメイン（複数可）と組み合わせて含むように設計することができる。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分及び共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部分を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３などと特異的に結合するリガンドが挙げられる。したがって、本発明では、共刺激シグナル伝達エレメントとして主に４－１ＢＢが例示されているが、他の共刺激エレメントも本発明の範囲内である。

【0243】

本発明のＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムな順序または指定された順序で互いに連結することができる。場合により、好ましくは長さが２～１０アミノ酸である短いオリゴペプチドまたはポリペプチドのリンカーが、架橋を形成していてもよい。グリシン－セリンのダブレットは特に適したリンカーとなる。

【0244】

一実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。別の実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。さらに別の実施形態では、細胞質ドメインは、ＣＤ３－ゼータのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８と４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。

【0245】

ベクター
本発明は、ＣＡＲをコードする配列を含み、当該配列が細胞内ドメインをコードする核酸配列に機能的に連結された抗原結合部分をコードする核酸配列を含む核酸分子を包含する。例えば、一実施形態では、ＣＡＲをコードする分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、またはその相同ペプチドのいずれかの１つ以上のＴＡＣＡ結合ドメインを含む抗原結合部分をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、またはその相同ペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を含む。一実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子は、ＴＡＣＡ結合ドメインに結合するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、一実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸分子は、レクチン結合ドメインに結合するヌクレオチド配列を含み、当該レクチン結合ドメインはＴＡＣＡに結合するレクチンまたはレクチン由来のペプチドに結合する。

【0246】

核酸分子は、本明細書の他の箇所に記載されているような、任意のＤＮＡもしくはＲＮＡ構築物、ベクター、またはプラスミドであり得る。

【0247】

遺伝子改変細胞
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、本発明のペプチドを発現するように改変された細胞を含む。例えば、ある特定の実施形態では、細胞は、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチドを発現するように改変される。ある特定の実施形態では、細胞は、ＴＡＣＡ結合ドメイン及びＴ細胞結合ドメインを含むペプチドを発現するように改変される。ある特定の実施形態では、細胞は、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むＣＡＲを発現するように改変される。

【0248】

ある特定の実施形態では、細胞は、本発明のペプチドをコードする単離された核酸と細胞を接触させることによって遺伝子改変される。

【0249】

いくつかの実施形態では、核酸配列は、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを使用して細胞内に送達される。例えば、本発明のペプチドを発現するレトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターは、形質導入細胞を担体として用いるか、またはカプセル封入されたベクター、結合されたベクター、もしくは裸のベクターの無細胞性の局所的または全身性の送達を用いて、さまざまな種類の真核細胞、さらには組織及び生物全体へと送達することができる。この方法は、安定的な発現が必要とされるか、または十分に求められる、いずれの目的にも使用することができる。

【0250】

他の実施形態では、核酸配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡを使用して細胞内に送達される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡは、形質導入細胞を担体として用いるか、あるいはカプセル封入されたｍＲＮＡ、結合されたｍＲＮＡ、または裸のｍＲＮＡの無細胞性の局所的または全身性の送達を用いて、さまざまな種類の真核細胞、さらには組織及び生物全体へと送達することができる。この方法は、一過性発現が必要とされるか、または十分に求められる、いずれの目的にも使用することができる。

【0251】

ある特定の実施形態では、細胞は、望ましいペプチドを発現できる任意の適切な細胞型であり得る。ある特定の実施形態では、改変細胞は、細胞をレシピエントに導入する方法に使用される。ある特定の実施形態では、細胞は、レシピエントに関して自己由来、同種異系、同系、または異種である。

【0252】

一実施形態では、細胞はＴ細胞である。開示される組成物及び方法は、遺伝子改変Ｔ細胞が標的癌細胞を死滅させる能力の評価を含め、癌、幹細胞、急性及び慢性感染症、ならびに自己免疫疾患の分野における基礎研究及び療法でのＴ細胞活性の調節に適用することができる。

【0253】

本発明のＴ細胞の増殖及び遺伝子改変の前に、Ｔ細胞の供給源を対象から採取する。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む、多くの供給源から得ることができる。本発明のある特定の実施形態では、当技術分野で利用可能な任意の数のＴ細胞株を使用することができる。本発明のある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの、当業者に既知の任意の数の技術を用いて、対象から採取された血液単位から得ることができる。好ましい一実施形態では、個体の血流からの細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は通常、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含むリンパ球を含有する。一実施形態では、アフェレーシスによって採取された細胞を洗浄して血漿画分を除去し、その後の処理工程のために細胞を適切な緩衝液または培地に入れてもよい。本発明の一実施形態では、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。代替的実施形態では、洗浄溶液はカルシウムを含まず、またマグネシウムを含んでいなくても、二価カチオンのすべてではないもののその多くを含んでいなくてもよい。ここでも、驚くべきことに、初期の活性化工程にカルシウムが存在しないことにより、活性化を増大させることができる。当業者であれば容易に理解できるように、洗浄工程は、当業者に既知の方法、例えば半自動の「流水式」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１ ｃｅｌｌ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ，Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を製造業者の指示に従って使用することにより行うことができる。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ^２＋フリーＰＢＳ、Ｍｇ^２＋フリーＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅＡ、またはその他の緩衝液を含むまたは含まない生理食塩水などに再懸濁してもよい。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁させてもよい。

【0254】

別の実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）の勾配による遠心分離、または対向流遠心溶出法により単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球から単離する。陽性または陰性選択技術によって、特定のＴ細胞の亜集団、例えばＣＤ３^＋、ＣＤ２８^＋、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋、ＣＤ４５ＲＡ^＋、及びＣＤ４５ＲＯ^＋Ｔ細胞をさらに単離することができる。例えば、一実施形態では、目的のＴ細胞の陽性選択に十分な期間、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち３ｘ２８）をコンジュゲートしたビーズ、例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔとインキュベートすることによって、Ｔ細胞を単離する。一実施形態では、期間は約３０分である。さらなる実施形態では、期間は、３０分～３６時間の範囲またはそれ以上の範囲であり、その間のすべての整数値である。さらなる実施形態では、期間は少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。さらに別の好ましい実施形態では、期間は１０～２４時間である。好ましい一実施形態では、インキュベーション期間は２４時間である。白血病患者からのＴ細胞の単離の場合、用いるインキュベーション時間を長くすることにより（例えば２４時間）、細胞収率を増加させることができる。腫瘍組織または免疫不全個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する場合など、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ない場合は、状況を問わず、長いインキュベーション時間を用いてＴ細胞を単離してもよい。さらに、用いるインキュベーション時間を長くすることにより、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の捕捉効率を増加させることができる。したがって、時間を単に短縮または延長することにより、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させることができ、及び／またはＴ細胞に対するビーズの比率を（本明細書でさらに記載されるように）増減させることにより、培養開始時またはプロセス中の他の時点で、Ｔ細胞の亜集団を可否に応じて優先的に選択することができる。あるいは、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３及び／または抗ＣＤ２８抗体の比率を増減させることによって、培養開始時または他の望ましい時点で、Ｔ細胞の亜集団を可否に応じて優先的に選択することができる。当業者であれば、本発明に関連して、複数回の選択も使用できることを認識されよう。ある特定の実施形態では、活性化及び増殖過程で、選択手順を実行し、「非選択」細胞を使用することが望ましい場合がある。「非選択」細胞はまた、さらに何回か選択を施してもよい。

【0255】

陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせを用いて行うことができる。１つの方法は、陰性選択された細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体カクテルを使用する、負磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞の分取及び／または選別である。例えば、陰性選択によってＣＤ４^＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは通常、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。ある特定の実施形態では、通常ＣＤ４^＋、ＣＤ２５^＋、ＣＤ６２Ｌ^ｈｉ、ＧＩＴＲ^＋、及びＦｏｘＰ３^＋を発現する制御性Ｔ細胞を濃縮するかまたは陽性選択することが望ましい場合がある。あるいは、ある特定の実施形態では、抗Ｃ２５がコンジュゲートされたビーズまたは他の類似の選択方法によって、制御性Ｔ細胞を枯渇させる。

【0256】

陽性または陰性選択によって目的の細胞集団を単離する場合に、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変更することができる。ある特定の実施形態では、細胞とビーズの接触を最大にするために、ビーズと細胞の混合量を大幅に減少させる（すなわち、細胞濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。例えば、一実施形態では、２０億細胞／ｍｌの濃度を使用する。一実施形態では、１０億細胞／ｍｌの濃度を使用する。さらなる実施形態では、１億細胞／ｍｌ超を使用する。さらなる実施形態では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万細胞／ｍｌの細胞濃度を使用する。さらに別の実施形態では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億細胞／ｍｌの細胞濃度を使用する。さらなる実施形態では、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用することができる。高濃度を使用すると、細胞収率、細胞活性化、及び細胞増殖の増加を生じさせることができる。さらに、高細胞濃度の使用により、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの、目的とする標的抗原の発現が弱い場合がある細胞、または腫瘍細胞が多く存在するサンプル（すなわち、白血病の血液、腫瘍組織など）からの細胞をより効率的に捕捉することが可能になる。そのような細胞集団は治療的価値を有する可能性があり、また取得が望ましいと予想される。例えば、高濃度の細胞の使用により、通常はＣＤ２８発現が弱いＣＤ８^＋Ｔ細胞の効率的な選択が可能になる。

【0257】

関連する実施形態では、低濃度の細胞を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物を大幅に希釈することによって、粒子と細胞との間の相互作用が最小限に抑えられる。これにより、目的の抗原が大量に発現する細胞を粒子に結合させて選択する。例えば、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞は、ＣＤ２８の発現レベルが高く、希薄濃度でＣＤ８^＋ Ｔ細胞よりも効率的に捕捉される。一実施形態では、使用される細胞の濃度は５ｘ１０^６／ｍｌである。他の実施形態では、使用される濃度は、約１ｘ１０^５／ｍｌ～１ｘ１０^６／ｍｌ、及びその間のあらゆる整数値であり得る。

【0258】

他の実施形態では、細胞は、さまざまな長さの時間にわたって、さまざまな速度で２～１０℃または室温にてローテーター上でインキュベートすることができる。

【0259】

刺激するＴ細胞はまた、洗浄工程後に凍結することもできる。理論に束縛されるものではないが、凍結及びその後の解凍工程により、顆粒球及びある程度の単球が細胞集団から除去されることで、より均一な生成物が得られる。血漿と血小板を除去する洗浄工程の後、細胞を凍結溶液中に懸濁させてもよい。多くの凍結溶液及びパラメーターが当技術分野で既知であり、この状況において有用であるが、１つの方法は、２０％ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンならびに７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、または３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、ならびに７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、または例えばＨｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する他の好適な細胞凍結媒体を使用し、次いで細胞を１℃／分の速度で－８０℃に凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの蒸気相中で保存することを含む。他の制御凍結方法を使用しても、－２０℃または液体窒素中で無制御に急速凍結する方法を使用してもよい。

【0260】

ある特定の実施形態では、凍結保存した細胞を本明細書に記載されるように解凍して洗浄し、室温で１時間静置した後、本発明の方法を使用して活性化する。

【0261】

また、本発明に関連して、本明細書に記載される細胞の増殖が必要となり得る前の時点で、対象から血液サンプルまたはアフェレーシス産物を採取することも企図される。例えば、増殖させる細胞の供給源は、必要に応じていつでも採取することができ、本明細書に記載されるようなＴ細胞療法が有益である多数の疾患または病態のＴ細胞療法で後ほど使用するために単離して凍結することができる。一実施形態では、血液サンプルまたはアフェレーシスは、概ね健康な対象から採取される。ある特定の実施形態では、血液サンプルまたはアフェレーシスは、疾患を発症する危険性があるが、まだ疾患を発症していない概ね健康な対象から採取され、その目的とする細胞は単離され、後ほど使用するために凍結される。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞を増殖させ、凍結し、後で使用してもよい。ある特定の実施形態では、サンプルは、本明細書に記載される特定の疾患と診断された直後であるが、何らかの治療をする前に患者から採取される。さらなる実施形態では、関連する任意の数の治療法の前に、対象由来の血液サンプルまたはアフェレーシスから細胞を単離する。このような治療法には、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤などの薬剤、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、及びＦＫ５０６などの免疫抑制剤、またはＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、マイコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８などの他の免疫除去（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ）剤、ならびに照射による治療を含むが、これらに限定されない。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンのいずれかを阻害するか（シクロスポリン及びＦＫ５０６）、または増殖因子誘導性シグナル伝達にとって重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６６：８０７－８１５，１９９１；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎ．７３：３１６－３２１，１９９１；Ｂｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．５：７６３－７７３，１９９３）。さらなる実施形態では、細胞は、患者用に単離され、後ほど、骨髄もしくは幹細胞移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体のいずれかを使用するＴ細胞除去療法と併用して（例えば、その前に、同時に、または後に）使用するために凍結される。別の実施形態では、ＣＤ２０と反応する薬剤（例えばリツキサン）などのＢ細胞除去療法後の治療の前に、細胞を単離して凍結し、後ほど使用することができる。

【0262】

本発明のさらなる実施形態では、Ｔ細胞は、治療後に直接患者から採取される。この点に関して、ある種の癌治療、特に免疫系に損傷を与える薬物による治療後で、通常であれば患者が治療から回復中である治療直後の期間には、得られるＴ細胞の質が、ｅｘ ｖｉｖｏでの増殖に最適であるか、または増強され得ることが観察されている。同様に、本明細書に記載される方法を用いたｅｘ ｖｉｖｏ操作後、これらの細胞は、移植及びｉｎ ｖｉｖｏ増殖の増強に好ましい状態であり得る。したがって、本発明に関連して、この回復期中に、Ｔ細胞、樹状細胞、または造血系統の他の細胞を含む血液細胞を採取することが企図される。さらに、ある特定の実施形態では、動員（例えば、ＧＭ－ＣＳＦによる動員）及び条件付きレジメンを用いて、特に療法後のある規定された時間枠の間、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生及び／または増殖にとって有利に働く条件を対象に作り出すことができる。例示的な細胞型としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及び免疫系の他の細胞が挙げられる。

【0263】

本発明のペプチドを発現するためのＴ細胞の遺伝子改変の前後を問わず、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；６，５３４，０５５号；６，９０５，６８０号；６，６９２，９６４号；５，８５８，３５８号；６，８８７，４６６号；６，９０５，６８１号；７，１４４，５７５号；７，０６７，３１８号；７，１７２，８６９号；７，２３２，５６６号；７，１７５，８４３号；５，８８３，２２３号；６，９０５，８７４号；６，７９７，５１４号；６，８６７，０４１号；及び米国特許出願公開番号２００６０１２１００５に記載される方法を使用して、Ｔ細胞を活性化して増殖させることができる。

【0264】

一般に、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤と、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドとがそこに結合された表面と接触することによって増大される。特に、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載されるように、例えば、表面上に固定化された抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、または抗ＣＤ２抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアを伴うプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触などによって刺激され得る。Ｔ細胞の表面上の補助分子の共刺激には、補助分子と結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、Ｔ細胞の集団を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４^＋ Ｔ細胞またはＣＤ８^＋ Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するには、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、当技術分野で一般的に知られている他の方法と同様に使用することができる（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５－３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．２２７（１－２）：５３－６３，１９９９）。

【0265】

ある特定の実施形態では、Ｔ細胞の一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、さまざまなプロトコールによって与えることができる。例えば、各シグナルを与える薬剤が、溶液中に存在していても、表面に結合してもよい。表面に結合する場合、薬剤は、同じ表面に結合しても（すなわち「シス」フォーメーション）、別の表面に結合してもよい（すなわち「トランス」フォーメーション）。あるいは、一方の薬剤が表面に結合し、他方の薬剤が溶液中に存在していてもよい。一実施形態では、共刺激シグナルを与える薬剤が細胞表面に結合し、一次活性化シグナルを与える薬剤が溶液中に存在するか、または表面に結合する。ある特定の実施形態では、両方の薬剤が溶液中に存在し得る。別の実施形態では、薬剤は可溶化形態であってもよく、さらにＦｃ受容体を発現する細胞、または薬剤と結合する抗体もしくは他の結合剤などの表面と架橋されてもよい。この点に関して、本発明でのＴ細胞の活性化及び増殖に使用することが企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）については、例えば、米国特許出願公開番号２００４０１０１５１９号及び２００６００３４８１０号を参照のこと。

【0266】

一実施形態では、２つの薬剤は、同じビーズ上、すなわち「シス」、または別々のビーズ、すなわち「トランス」のいずれかでビーズに固定化される。例として、一次活性化シグナルを与える薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片であり、共刺激シグナルを与える薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片であり、さらに両方の薬剤が等分子量で同じビーズに共固定化される。一実施形態では、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞増殖及びＴ細胞増殖には、ビーズに結合する各抗体が１：１の比で使用される。本発明のある特定の態様では、ビーズに結合する抗ＣＤ３：抗ＣＤ２８抗体の比は、１：１の比を用いたときに観察される増殖と比較してＴ細胞増殖の増加が観察されるような比を使用する。特定の一実施形態では、１：１の比を用いたときに観察される増殖と比較して、約１倍～約３倍の増加が観察される。一実施形態では、ビーズに結合するＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比は、１００：１～１：１００の範囲内、及びその間のすべての整数値である。本発明の一態様では、抗ＣＤ３抗体よりも多くの抗ＣＤ２８抗体が粒子に結合する、すなわち、ＣＤ３：ＣＤ２８の比が１未満である。本発明のある特定の実施形態では、ビーズに結合する抗ＣＤ３抗体に対する抗ＣＤ２８抗体の比は２：１より大きい。特定の一実施形態では、ビーズと結合する抗体に１：１００のＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。別の実施形態では、ビーズと結合する抗体に１：７５のＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。さらなる実施形態では、ビーズと結合する抗体に１：５０のＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。別の実施形態では、ビーズと結合する抗体に１：３０のＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。好ましい一実施形態では、ビーズと結合する抗体に１：１０のＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。別の実施形態では、ビーズに結合する抗体に１：３のＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。さらに別の実施形態では、ビーズに結合する抗体に３：１のＣＤ３：ＣＤ２８比を使用する。

【0267】

Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激するには、粒子と細胞との比に、１：５００～５００：１及びその間の任意の整数値を使用することができる。当業者であれば容易に理解できるように、粒子と細胞との比は、標的細胞に対する粒子サイズに依存し得る。例えば、サイズの小さなビーズには数個の細胞しか結合できず、大きなビーズは多くの細胞と結合できると考えられる。ある特定の実施形態では、粒子と細胞との比は１：１００～１００：１の範囲、及びその間の整数値であり、さらなる実施形態では、比は１：９～９：１、及びその間の任意の整数値を含み、これを同じくＴ細胞を刺激するために用いることもできる。Ｔ細胞刺激を生じさせる、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８結合粒子とＴ細胞との比は、上記のように変化し得るが、ある特定の好ましい値としては、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、及び１５：１が挙げられ、１つの好ましい比は少なくともＴ細胞あたりの粒子が１：１である。一実施形態では、１：１以下の粒子と細胞との比が使用される。特定の一実施形態では、粒子：細胞の好ましい比は１：５である。さらなる実施形態では、粒子と細胞との比は、刺激日に応じて変更することができる。例えば、一実施形態では、粒子と細胞との比は、最初の日に１：１～１０：１であり、以降の最大１０日間は、最終の比が１：１～１：１０（追加日の細胞数に基づく）となるように、毎日または隔日で粒子を細胞に追加する。特定の一実施形態では、粒子と細胞との比は、刺激初日に１：１であり、刺激３日目及び５日目には１：５に調節する。別の実施形態では、最終比が１日目に１：１、刺激３日目及び５日目に１：５になるように粒子を毎日または隔日で追加する。別の実施形態では、粒子と細胞との比は、刺激初日に２：１であり、刺激３日目及び５日目には１：１０に調節する。別の実施形態では、最終比が１日目に１：１、刺激３日目及び５日目に１：１０になるように粒子を毎日または隔日で追加する。それ以外のさまざまな比が本発明での使用に適し得ることを当業者は理解されよう。具体的には、粒子サイズ、ならびに細胞のサイズ及び型に応じて比が異なる。

【0268】

本発明のさらなる実施形態では、Ｔ細胞などの細胞を薬剤被覆ビーズと組み合わせ、その後ビーズと細胞を分離し、次いで細胞を培養する。代替的実施形態では、培養前に、薬剤被覆ビーズと細胞とを分離せず、一緒に培養する。さらなる実施形態では、ビーズ及び細胞を最初に磁力などの力の付加によって濃縮することで、細胞表面マーカーのライゲーションを増加させ、それによって細胞刺激を誘導する。

【0269】

例として、細胞表面タンパク質は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８が結合した常磁性ビーズ（３ｘ２８ビーズ）をＴ細胞と接触させることによって連結させることができる。一実施形態では、細胞（例えば、１０^４～１０^９ Ｔ細胞）及びビーズ（例えば、１：１比のＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ常磁性ビーズ）を緩衝液、好ましくはＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムなどの二価のカチオンを含まない）中で混合する。この場合も、当業者は、任意の細胞濃度を使用できることを容易に理解することができる。例えば、標的細胞がサンプル中で極めて希少であり、サンプルの０．０１％しか含まれていない場合もあれば、サンプル全体（すなわち１００％）が目的の標的細胞を含んでいる場合もある。したがって、いずれの細胞数も本発明が意図する範囲内である。ある特定の実施形態では、細胞と粒子の接触を最大にするために、粒子と細胞の混合量を大幅に減少させる（すなわち、細胞濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。例えば、一実施形態では、約２０億細胞／ｍｌの濃度を使用する。別の実施形態では、１億細胞／ｍｌ超を使用する。さらなる実施形態では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万細胞／ｍｌの細胞濃度を使用する。さらに別の実施形態では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億細胞／ｍｌの細胞濃度を使用する。さらなる実施形態では、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍｌの濃度を使用することができる。高濃度を使用すると、細胞収率、細胞活性化、及び細胞増殖の増加を生じさせることができる。さらに、高細胞濃度の使用により、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの、目的とする標的抗原の発現が弱い場合がある細胞をより効率的に捕捉することが可能になる。そのような細胞集団は治療的価値を有する可能性があり、ある特定の実施形態では取得が望ましいと予想される。例えば、高濃度の細胞の使用により、通常はＣＤ２８発現が弱いＣＤ８^＋Ｔ細胞の効率的な選択が可能になる。

【0270】

本発明の一実施形態では、混合物は、数時間（約３時間）～約１４日、またはその間の任意の１時間単位の整数値にわたり培養することができる。別の実施形態では、混合物を２１日間培養してもよい。本発明の一実施形態では、ビーズ及びＴ細胞を約８日間一緒に培養する。別の実施形態では、ビーズ及びＴ細胞を約２～３日間一緒に培養する。また、Ｔ細胞の培養時間が６０日以上となり得るように、数回の刺激が望ましい場合がある。Ｔ細胞培養に適した条件は、血清（例えば、ウシ胎児またはヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、及びＴＮＦ－αまたは当業者に既知である細胞増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖及び生存に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地、またはＲＰＭＩ培地１６４０、またはＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））を含む。細胞増殖のための他の添加剤としては、界面活性剤、プラスマネート、ならびにＮ－アセチル－システイン及び２－メルカプトエタノールなどの還元剤が挙げられるが、これらに限定されない。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加されており、無血清であるか、または適切な量の血清（または血漿）もしくは一連の所定のホルモン、及び／またはＴ細胞の成長及び増殖に十分な量のサイトカイン（複数可）が補充されている、ＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５、及びＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含み得る。抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンは、実験培養液にのみ含まれ、対象への注入を目的とする細胞の培養液には含まれない。標的細胞は、増殖の補助に必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ_２）下に維持する。

【0271】

負荷された刺激時間がさまざまであるＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。例えば、通常の血液またはアフェレーシス末梢血単核細胞産物は、細胞傷害性またはサプレッサーＴ細胞集団（Ｔ_Ｃ、ＣＤ８^＋）よりも多くヘルパーＴ細胞集団（Ｔ_Ｈ、ＣＤ４^＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖は、約８～９日目以前には、主としてＴ_Ｈ細胞からなるＴ細胞の集団を産生するが、約８～９日目以後、Ｔ細胞の集団は、Ｔ_Ｃ細胞の集団を次第に多く含むようになる。したがって、治療の目的に応じて、主としてＴ_Ｈ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することが有利な場合がある。同様に、Ｔ_Ｃ細胞の抗原特異的サブセットが単離されている場合、このサブセットをそれ以上に増殖させることが有益な場合がある。

【0272】

さらに、ＣＤ４及びＣＤ８マーカーに加えて、他の表現型マーカーも、細胞の増殖過程で有意に、ただし大部分において再現性を伴って変動する。したがって、そのような再現性により、特定の目的に応じて活性化Ｔ細胞産物を調整することが可能になる。

【0273】

足場
本発明は、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチド、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチドをコードする核酸分子、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチドを発現するように改変された細胞、またはそれらの組み合わせを含む足場または基材組成物を提供する。例えば、一実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチド、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチドをコードする核酸分子、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチドを発現するように改変された細胞、またはそれらの組み合わせが足場内部に存在する。別の実施形態では、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチド、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチドをコードする核酸分子、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチドを発現するように改変された細胞、またはそれらの組み合わせが足場の表面に使用される。本発明の足場は、当技術分野で既知であるいかなる種類のものであってもよい。このような足場の非限定的な例としては、ヒドロゲル、エレクトロスピニング足場、発泡体、メッシュ、シート、パッチ、及びスポンジが挙げられる。

【0274】

医薬組成物
本発明はまた、本明細書に記載される１つ以上の組成物を含む医薬組成物を提供する。製剤を、従来の賦形剤、すなわち、創傷または治療部位への投与に適した薬学的に許容される有機または無機担体物質と混合して用いてもよい。医薬組成物は滅菌されていてもよく、また望ましい場合は、補助剤、例えば滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に作用する塩、緩衝剤、着色剤、及び／または芳香族物質などと混合されていてもよい。製剤はまた、望ましい場合に他の活性剤、例えば、他の鎮痛剤と組み合わせてもよい。

【0275】

本発明の組成物の投与は、例えば、非経口によって、静脈内、腫瘍内、皮下、筋肉内、もしくは腹腔内注射によって、または注入によって、または他の許容される全身性の方法いずれによっても行うことができる。

【0276】

本明細書で使用される場合、「追加成分」には、賦形剤；界面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；造粒剤及び崩壊剤；結合剤；潤滑剤；着色剤；防腐剤；ゼラチンなどの生理学的に分解可能な組成物；水性ビヒクル及び溶媒；油性ビヒクル及び溶媒；懸濁剤；分散剤または湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；緩衝剤；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定化剤；ならびに薬学的に許容されるポリマー材料または疎水性材料のうち１つ以上を含むが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物に含んでもよい他の「追加成分」は、当技術分野において既知であり、例えば、Ｇｅｎａｒｏ，ｅｄ．（１９８５，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。

【0277】

本発明の組成物は、組成物の総重量の約０．００５％～２．０％の防腐剤を含んでもよい。防腐剤は、環境中の汚染物質に晒された場合に腐敗を防ぐために使用される。本発明による有用な防腐剤の例としては、ベンジルアルコール、ソルビン酸、パラベン、イミド尿素、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい防腐剤は、約０．５％～２．０％のベンジルアルコールと０．０５％～０．５％のソルビン酸の組み合わせである。

【0278】

一実施形態では、組成物は、組成物の１つ以上の成分の分解を阻害する抗酸化剤及びキレート剤を含む。いくつかの化合物にとって好ましい抗酸化剤は、好ましくは組成物の総重量の約０．０１重量％～０．３重量％の範囲内のＢＨＴ、ＢＨＡ、アルファ－トコフェロール、及びアスコルビン酸、より好ましくは組成物の総重量の０．０３重量％～０．１重量％の範囲内のＢＨＴである。好ましくは、キレート剤は、組成物の総重量の０．０１重量％～０．５重量％の量で存在する。特に好ましいキレート剤は、組成物の総重量の約０．０１重量％～０．２０重量％の重量範囲内、より好ましくは組成物の総重量の０．０２重量％～０．１０重量％の範囲内のエデト酸塩（例えば、エデト酸二ナトリウム）及びクエン酸である。キレート剤は、製剤の貯蔵寿命に有害であり得る組成物中の金属イオンをキレート化するのに有用である。ＢＨＴ及びエデト酸二ナトリウムは、いくつかの化合物それぞれに対して特に好ましい抗酸化剤及びキレート剤であるが、当業者に既知であれば、他の適切かつ同等の抗酸化剤及びキレート剤を代わりに使用してもよい。

【0279】

従来の方法を使用して液体懸濁液を調製し、水性または油性ビヒクル中の本発明のペプチドまたは他の組成物の懸濁液を得ることができる。水性ビヒクルとしては、例えば、水及び等張生理食塩水が挙げられる。油性ビヒクルとしては、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、植物油、例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、またはヤシ油、分留植物油、及び流動パラフィンなどの鉱物油が挙げられる。液体懸濁液はさらに、１つ以上の追加成分を含んでもよく、これには、懸濁化剤、分散剤または湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、防腐剤、緩衝剤、塩、香味剤、着色剤、及び甘味剤を含むが、これらに限定されない。油性懸濁液はさらに増粘剤を含んでもよい。既知の懸濁化剤としては、ソルビトールシロップ、水素化食用脂、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アラビアゴム、及びカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。既知の分散剤または湿潤剤としては、レシチンなどの天然型リン脂質、アルキレンオキシドの、脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール、脂肪酸とヘキシトールから誘導される部分エステル、または脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合生成物（例えば、それぞれ、ポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）が挙げられるが、これらに限定されない。既知の乳化剤としては、レシチン及びアカシアが挙げられるが、これらに限定されない。既知の防腐剤としては、メチルヒドロキシベンゾエート、エチルヒドロキシベンゾエート、またはＮ－プロピル－パラ－ヒドロキシベンゾエート、アスコルビン酸、及びソルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。

【0280】

治療適用
本発明は、それを必要とする対象での癌の治療または予防方法を提供する。この方法は、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、原発腫瘍、または転移腫瘍を含む、いずれの癌の治療に使用してもよい。

【0281】

一実施形態では、方法は、対象を本発明の組成物と接触させることを含む。例えば、ある特定の実施形態では、方法は、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチド、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチドをコードする核酸分子、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチドを発現するように改変された細胞、またはそれらの組み合わせを含む組成物と、対象を接触させることを含む。一実施形態では、方法は、ＴＡＣＡ結合ドメイン及びＴ細胞結合ドメインを含むペプチド、ＴＡＣＡ結合ドメイン及びＴ細胞結合ドメインを含むペプチドをコードする核酸分子、ＴＡＣＡ結合ドメイン及びＴ細胞結合ドメインを含むペプチドを発現するように改変された細胞、またはそれらの組み合わせを含む組成物と、対象を接触させることを含む。

【0282】

本発明は、腫瘍細胞に存在するＴＡＣＡへの結合を介して、腫瘍細胞に特異的に結合するＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチドの使用を提供する。ある特定の実施形態では、ペプチドは、Ｔ細胞へのＴ細胞結合ドメインの結合を介して、ＴＡＣＡを発現する腫瘍細胞にＴ細胞を動員するために使用される。したがって、本発明はまた、本明細書に記載される組成物を哺乳動物に投与するステップを含む、哺乳動物の標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介性免疫応答を刺激する方法を提供する。

【0283】

ある特定の実施形態では、方法は、ＴＡＣＡ結合ドメインに結合するペプチド、ＴＡＣＡ結合ドメインに結合するペプチドをコードする核酸分子、またはＴＡＣＡ結合ドメインに結合するペプチドを発現するように改変された細胞を含む組成物と、対象を接触させることを含む。例えば、一実施形態では、方法は、レクチン結合ドメインを含むペプチド、レクチン結合ドメインを含むペプチドをコードする核酸分子、またはレクチン結合ドメインを含むペプチドを発現するように改変された細胞を含み、当該レクチン結合ドメインがＴＡＣＡに結合するレクチンまたはレクチン由来のペプチドに結合する組成物と、対象を接触させることを含む。

【0284】

一実施形態では、方法は、（１）ＴＡＣＡ結合ドメインに結合するペプチド、ＴＡＣＡ結合ドメインに結合するペプチドをコードする核酸分子、またはＴＡＣＡ結合ドメインに結合するペプチドを発現するように改変された細胞を含む組成物を投与することと、（２）ＴＡＣＡ結合ドメイン、またはＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチドをコードする核酸分子を含む組成物を投与することと、を含む。例えば、一実施形態では、方法は、ＴＡＣＡに結合するレクチンまたはレクチン由来のペプチドを含む組成物を投与することと、レクチンまたはレクチン由来のペプチドに結合する二重特異性抗体を投与することと、を含む。一実施形態では、方法は、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変された細胞であって、当該ＣＡＲが、レクチン結合ドメインを含む抗原結合部分を含む細胞を投与することと、ＴＡＣＡに結合するレクチンまたはレクチン由来のペプチドを含む組成物を、ＴＡＣＡに結合するレクチンまたはレクチン由来のペプチドにＣＡＲが結合するように投与することと、を含む。場合によっては、ＴＡＣＡ結合レクチン及びレクチン結合組成物（例えば、抗レクチンＣＡＲを発現するように遺伝子操作されたＴ細胞）を投与することが有利であり得る。第一に、この方法は、レクチンの半減期が遺伝子操作Ｔ細胞よりもはるかに短いため、Ｔ細胞応答の時間を制限することができる。遺伝子操作Ｔ細胞は、数年間残存する可能性があるが、レクチンが存在しなければ、Ｔ細胞は非活性であり、その結果、応答の持続性を制限することにより、固形癌を容易に標的化することが可能になる。

【0285】

一実施形態では、本発明は、本発明のペプチドを発現するようにＴ細胞を遺伝子改変し、その細胞をそれを必要とするレシピエントに注入するタイプの細胞療法を含む。ある特定の実施形態では、注入された細胞は、レシピエントの腫瘍細胞を殺傷することができる。抗体療法とは異なり、この改変細胞はｉｎ ｖｉｖｏで複製可能であるため、長期的に残存し、持続的な腫瘍制御をもたらすことができる。

【0286】

一実施形態では、本発明の改変Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで安定してＴ細胞を増殖させることができ、長時間にわたって持続することができる。別の実施形態では、本発明の改変Ｔ細胞は、特異的記憶Ｔ細胞へと進化し、再活性化されることで、何らかの付加的な腫瘍形成または増殖を阻害することができる。例えば、本発明の改変Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで安定してＴ細胞を増殖させ、血液及び骨髄中で長時間にわたり高レベルで残存し、特異的記憶Ｔ細胞を形成することができる。

【0287】

治療することができる癌には、血管新生性でないか、または実質的にまだ血管新生化されていない腫瘍、ならびに血管新生化腫瘍を含む。癌には、非固形腫瘍（血液悪性腫瘍など、例えば、白血病及びリンパ腫）を含む場合もあれば、固形腫瘍を含む場合もある。本発明のＣＡＲを用いて治療される癌の種類としては、癌腫、芽細胞腫、及び肉腫、ならびにある種の白血病またはリンパ性悪性腫瘍、良性及び悪性腫瘍、ならびに例えば、肉腫、癌腫、及び黒色腫などの悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。成人腫瘍／癌及び小児腫瘍／癌も含まれる。

【0288】

血液癌とは、血液または骨髄の癌である。血液性（または造血性）癌としては、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ならびに骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、及び赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、及び慢性リンパ性白血病）を含む白血病、赤血病、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性及び高悪性度形態）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病、及び骨髄形成異常が挙げられる。

【0289】

固形腫瘍とは、通常は嚢胞または液体領域を含んでいない異常な組織塊である。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。固形腫瘍の各型は、腫瘍を形成する細胞の種類に応じて命名される（例えば、肉腫、癌腫、及びリンパ腫など）。肉腫及び癌腫などの固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、及び他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、リンパ系悪性腫瘍、膵臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫の皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、黒色腫、及びＣＮＳ腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠及び混合性神経膠腫）、膠芽腫（多形性膠芽腫として知られる）星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、及び脳転移）が挙げられる。

【0290】

本発明の組成物は、単独で、または希釈剤及び／またはＩＬ－２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分と組み合わせて医薬組成物として投与してもよい。簡潔には、本発明の医薬組成物は、１つ以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、本明細書に記載される組成物を含んでもよい。そのような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；ならびに防腐剤を含んでもよい。

【0291】

本発明の医薬組成物は、治療（または予防）する疾患に適切な方法で投与することができる。投与の量及び頻度は、患者の病態、ならびに患者の疾患の種類及び重症度のような因子に応じて決定することになるが、適切な投与量を臨床試験によって決定してもよい。

【0292】

「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」が示されている場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染症または転移の程度、及び患者（対象）の病態に関する個体差を考慮して、医師が決定することができる。

【0293】

本組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸液、注入、または移植によるものを含む、任意の利便な方法で行ってよい。本明細書に記載される組成物は、患者に、皮下投与、皮内投与、腫瘍内投与、リンパ節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｌｙ）投与、髄内投与、筋肉内投与、静脈内（ｉ．ｖ．）注射投与、または腹腔内投与することができる。一実施形態では、本発明の組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。別の実施形態では、本発明の組成物は、ｉ．ｖ．注射によって投与される。ある特定の実施形態では、組成物は、腫瘍またはリンパ節に直接注射されるものである。

【0294】

ある特定の実施形態では、組成物は、任意の数の関連する治療法と併用して（例えば、治療前、治療と同時、または治療後）、患者に投与され、そのような治療法には、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、及びＦＫ５０６、抗体、ＣＡＭ ＰＡＴＨなどの他の免疫除去剤、抗ＣＤ３抗体または他の抗体療法、シトキサン、フルダリビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎｅ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、マイコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、及び照射による治療を含むが、これらに限定されない。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンのいずれかを阻害するか（シクロスポリン及びＦＫ５０６）、または増殖因子誘導性シグナル伝達にとって重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６６：８０７－８１５，１９９１；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎ．７３：３１６－３２１，１９９１；Ｂｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．５：７６３－７７３，１９９３）。さらなる実施形態では、本発明の組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体を使用するＴ細胞除去療法と併用して（例えば、治療前に、治療と同時に、または治療後に）患者に投与される。別の実施形態では、本発明の組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤（例えばリツキサン）などのＢ細胞除去療法後に投与される。例えば、一実施形態では、対象は高用量の化学療法に続く、末梢血幹細胞移植による標準治療を受けることができる。ある特定の実施形態では、移植後に、対象は、本発明の増殖した免疫細胞の注入を受ける。追加の実施形態では、増殖した細胞は、術前または術後に投与される。

【0295】

ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、腫瘍または病変組織の外科的切除または減量術中に投与される。例えば、病変組織または腫瘍の外科的処置を受けている対象において、腫瘍をさらに治療するために、組成物をその部位に投与することができる。

【0296】

一実施形態では、方法は、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチド、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチドをコードする核酸分子、ＴＡＣＡ結合ドメインを含むペプチドを発現するように改変された細胞、またはそれらの組み合わせを含む足場を対象に投与することを含む。

【0297】

本発明の組成物及び医薬組成物の投与に企図される対象には、ヒト及び他の霊長類、商業的意義のある哺乳動物、例えばヒト以外の霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、及びイヌを含む哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。

【0298】

上記治療の患者に投与すべき投与量は、治療する病態及び治療のレシピエントの正確な性質に応じて異なる。ヒト投与の投与量の秤量は、当技術分野で許容される慣行に従って行うことができる。Ｔ細胞の投薬及び計画のための方法が論じられている（Ｅｒｔｌ ｅｔ ａｌ，２０１１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７１：３１７５－８１；Ｊｕｎｇｈａｎｓ，２０１０，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８：５５）。

【実施例】

【0299】

本発明を、以下の実験的実施例を参照してさらに詳細に説明する。これら実施例は、例示のみを目的として提供するものであり、別段の指定のない限り、限定的であることを意図しない。したがって、本発明は、いかなる場合も以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に示す教示の結果として明らかにされる一部及びすべての変更を包含すると解釈されるべきである。

【0300】

さらなる説明がなくても、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な実施例を用いて、本発明を作成して利用し、請求される方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に示すものであり、いかなる場合においても本開示のそれ以外の部分を限定するものと見なされるべきではない。

【0301】

実施例１：グリカン依存性Ｔ細胞動員因子（ＧｌｙＴＲ）
細胞の悪性形質転換は、ほぼ例外なく細胞表面でのグリコシル化の異常な変化を伴う（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｖａｒｋｉ，１９９７，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ，１４：５６９－５７６）。実際に、細胞表面グリコシル化の変化が、あらゆる種類の実験的なヒト癌で観察されており（Ｈａｋｏｍｏｒｉ，２００２，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９９：１０２３１－１０２３３）、これらの変化した糖構造は腫瘍関連糖鎖抗原（ＴＡＣＡ）と呼ばれている（表１）。この腫瘍特異的な特性により、細胞表面のＴＡＣＡは、多くの一般的な癌を標的とするモノクローナル抗体を産生するための優れた標的抗原となっている。しかしながら、数十年にわたる取り組みに反して、糖鎖抗原に対する抗体の作製が困難なため、ＴＡＣＡに対する高親和性を有する特異性抗体は未だ提供されていない。

【0302】

この問題に対処する方法の一つが、糖鎖を結合するタンパク質であるレクチンを利用することである。技術発展により、多数の異なる糖鎖部位に対して高度に特異的である何百ものさまざまな異なる糖鎖結合タンパク質が産生されている。さらに、植物及び動物のいずれに由来するレクチンも、数十年にわたり広く使用されており、その結合特性は十分に解明されている。

【0303】

本明細書では、Ｔ細胞及び／または他の癌殺傷細胞に結合する抗体ドメインに結合させた、レクチン由来の糖鎖結合ドメインからなるキメラタンパク質のクラスについて記載する。このキメラタンパク質のクラスを、本明細書ではグリカン依存性Ｔ細胞動員因子（ＧｌｙＴＲ）と称する。ＧｌｙＴＲキメラタンパク質は、癌特異的糖鎖抗原を標的とし、Ｔ細胞を媒介して死滅に至らせるよう設計されている。新規ＧｌｙＴＲ分子の例を表２に列挙する。

【0304】

ＧｌｙＴＲ分子の有用性を実証するために、上皮癌及び造血細胞癌を含む、さまざまな癌細胞型で高頻度に過剰発現する糖鎖構造である、Ｔ細胞上のＣＤ３及びβ１，６ ＧｌｃＮＡｃ分岐型Ａｓｎ（Ｎ）結合グリカンを標的とするＧｌｙＴＲを設計及び作製した。

【0305】

β１，６ＧｌｃＮＡｃ分岐型Ｎ－グリカンは、複合体型Ｎ－グリカンのサブセットを成す三分岐及び四分岐型オリゴ糖である（図１）。細胞のβ１，６ＧｌｃＮＡｃ分岐レベルの測定に、高特異的植物レクチンＬ－ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、ロイコアグルチニン）が使用されている。β１，６ＧｌｃＮＡｃ分岐型Ｎ－グリカンへのＬ－ＰＨＡの高特異的結合特性、及び二重特異性抗体の技術を利用するために、レクチンＬ－ＰＨＡ及び抗ＣＤ３のｓｃＦｖ両方で構成される一本鎖ポリペプチド（Ｌ－ＰＨＡｘＣＤ３、図２）を生成することにより、新規な二重特異性キメラタンパク質を作製した。

【0306】

フローサイトメトリー分析により、ゴルジ体の分岐阻害剤キフネンシンで細胞を前処理したとき、慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２への結合の完全な逆転が実証され、ＧｌｙＴＲ Ｌ－ＰＨＡｘＣＤ３が、β１，６ＧｌｃＮＡｃ分岐型Ｎ－グリカンに特異的に結合することを確認した（図３）。また、ＣＤ３を発現するジャーカットＴ細胞をキフネンシンで処理し、β１，６ＧｌｃＮＡｃ分岐型Ｎ－グリカンへの結合を排除して分析することにより、ＣＤ３への結合を確認した（図３）。

【0307】

抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイにおいて、休止期のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として使用し、Ｋ５６２、Ｂ細胞リンパ腫（Ｒａｊｉ）、多発性骨髄腫（ＲＰＭＩ ８２２６）、急性リンパ芽球性白血病（ＲＳ４；１１）、乳腺癌（ＭＣＦ７）、大腸腺癌（ＨＴ－２９）、肝臓肝細胞癌（Ｈｅｐ Ｇ２）、及び子宮頸癌（ＨｅＬａ）細胞に対して、ＧｌｙＴＲ Ｌ－ＰＨＡｘＣＤ３がＴ細胞による殺傷を誘導する能力を試験した（図４Ａ～図４Ｊ）。結果は、ＧｌｙＴＲ Ｌ－ＰＨＡｘＣＤ３は用量依存的に癌細胞のＴ細胞による殺傷を誘導することを示している。重要な点として、β１，６ＧｌｃＮＡｃ分岐を低減するゴルジ体阻害剤キフネンシンで前処理された癌細胞の殺傷が、極度に抑制されたが（図４Ｂ）、これは、ＧｌｙＴＲ Ｌ－ＰＨＡｘＣＤ３により誘導される殺傷が糖鎖抗原の存在に依存することを示している。さらに、オフターゲット（非癌性）ＰＢＭＣの殺傷は極めて低く、癌に対する特異性が実証された（図４Ｃ）。

【0308】

要約すると、ＧｌｙＴＲキメラタンパク質は、新たなクラスの癌免疫療法用治療薬を開発する機会を与えるものであり、既存の技術に優る大きな利点を有する。ＧｌｙＴＲの考え方、及びさまざまなＴＡＣＡに対して特異的であるさまざまなレクチンの利用可能性から見て、Ｌ－ＰＨＡを他のレクチンと置き換えることにより、多数のＧｌｙＴＲを作製することができる。あるいは、他の免疫エフェクター細胞を動員することができる、レクチン及びｓｃＦｖで構成されるキメラタンパク質を作製することができる。

【0309】

レクチンドメインの機能は変異によって改善することができる。例えば、糖鎖結合ドメインのＥ－ＰＨＡをＬ－ＰＨＡに交換すると、結合が約２０～３０倍増加し、ＧｌｙＴＲ Ｌ－ＰＨＡｘＣＤ３をさらに改善できる（Ｋａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７７：１６９２８－１６９３５）。ＧｌｙＴＲ Ｌ－ＰＨＡｘＣＤ３は二量体になると思われ、これが問題を示す場合には、ＧｌｙＴＲ Ｌ－ＰＨＡｘＣＤ３タンパク質において、二量体形成を媒介するＬ－ＰＨＡドメインの最初の５個のＮ末端アミノ酸を欠失させ、二量体化を防止することができる。最後に、二重特異性キメラタンパク質の生成に加えて、レクチンを癌のキメラ抗原受容体療法に利用することもできる（Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｍｅｄ，６５：３３３－３４７）。

【0310】

実施例２：アミノ酸配列及びヌクレオチド配列
ＧｌｙＴＲ Ｌ－ＰＨＡｘＣＤ３
リーダー配列－Ｌ－ＰＨＡ－リンカー－抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－Ｈｉｓタグ
タンパク質配列：５２５ａａ

【表12】

（配列番号１１）

【0311】

分子を単量化する変異型ＧｌｙＴＲ Ｌ－ＰＨＡｘＣＤ３
リーダー配列－Ｌ－ＰＨＡ_{（Δ１－５）}－リンカー－抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－Ｈｉｓタグ
タンパク質配列：５２０ａａ

【表13】

（配列番号１２）

【0312】

結合親和性を増加させる変異型ＧｌｙＴＲ Ｌ－ＰＨＡｘＣＤ３
リーダー配列－変異型Ｌ－ＰＨＡ－リンカー－抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－Ｈｉｓタグ
タンパク質配列

【表14】

（配列番号１３）

【0313】

分子を単量化し、結合親和性を増加させる変異型ＧｌｙＴＲ Ｌ－ＰＨＡｘＣＤ３
リーダー配列－変異型Ｌ－ＰＨＡ－リンカー－抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－Ｈｉｓタグ
タンパク質配列

【表15】

（配列番号１４）

【0314】

Ｖｉｃｉａ ｖｉｌｌｏｓａイソレクチンＢｘＣＤ３ ｓｃＦｖ（ＶＶＡｂｘＣＤ３）
ＶＶＡ－リンカー－ＣＤ３ ｓｃＦＶ－Ｈｉｓタグ
タンパク質配列

【表16】

（配列番号１５）

【0315】

ＶＶＡｂｘＣＤ３（ＶＶＡｂ_Δ１－５ｘＣＤ３ ｓｃＦＶ）
ＶＶＡｂ_Δ１－５－リンカー－ＣＤ３ ｓｃＦＶ－Ｈｉｓタグ
タンパク質配列

【表17】

（配列番号１６）

【0316】

ＣＤ３０１ｘＣＤ３ ｓｃＦｖの細胞外ドメイン（ＣＤ３０１_ＥＣｘＣＤ３）
ＣＤ３０１_ＥＣ－リンカー－ＣＤ３ ｓｃＦＶ－Ｈｉｓタグ
タンパク質配列

【表18】

（配列番号１７）

【0317】

ＧｌｙＴＲ Ｌ－ＰＨＡｘＣＤ３
遺伝子配列：１６０４ｂｐ（２９３及びＣＨＯ両方によるコドン最適化）
ＥｃｏＲＩ－Ｋｏｚａｋ配列－リーダー配列－Ｌ－ＰＨＡ－リンカー－抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－Ｈｉｓタグ－ＸｂａＩ
ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ配列に下線が引かれている。Ｋｏｚａｋ配列は太字である。

【表19】

（配列番号１８）

【0318】

本明細書で引用された特許、特許出願、及び刊行物すべての開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。具体的な実施形態を参照しながら本発明を開示してきたが、本発明の真の趣旨及び範囲を逸脱することなく、本発明の他の実施形態及び変形例も当業者によって考案され得ることは明らかである。添付された特許請求の範囲は、そのようなすべての実施形態及び等価な変形例を含むことを意図している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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