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特許7445609ＥＰＡＣ阻害剤としてのチエノ［２，３－Ｂ］ピリジン誘導体及びその医薬用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-28
(45)【発行日】2024-03-07
(54)【発明の名称】ＥＰＡＣ阻害剤としてのチエノ［２，３－Ｂ］ピリジン誘導体及びその医薬用途
(51)【国際特許分類】
A61K 31/4365 20060101AFI20240229BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240229BHJP
A61P 9/06 20060101ALI20240229BHJP
A61P 9/04 20060101ALI20240229BHJP
【ＦＩ】
A61K31/4365
A61P9/00
A61P9/06
A61P9/04
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2020568471
(86)(22)【出願日】2019-06-06
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-10-11
(86)【国際出願番号】 EP2019064886
(87)【国際公開番号】W WO2019234197
(87)【国際公開日】2019-12-12
【審査請求日】2022-05-06
(31)【優先権主張番号】18305685.2
(32)【優先日】2018-06-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】591100596
【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル
(73)【特許権者】
【識別番号】510139564
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・トゥールーズ・トロワ－ポール・サバティエ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＴＯＵＬＯＵＳＥ ＩＩＩ－ＰＡＵＬ ＳＡＢＡＴＩＥＲ
(73)【特許権者】
【識別番号】520179305
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ パリ－サクレー
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ－ＳＡＣＬＡＹ
(73)【特許権者】
【識別番号】520476569
【氏名又は名称】サピエンツァ・ウニヴェルシタ・ディ・ローマ
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＰＩＥＮＺＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡ ＤＩ ＲＯＭＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】ブロンドー，ジャン－ポール
(72)【発明者】
【氏名】コルチア，アントニオ
(72)【発明者】
【氏名】ローデット，マリオン
(72)【発明者】
【氏名】ルズーアオ，フランク
【審査官】伊藤 幸司
(56)【参考文献】
【文献】特表２００９－５４４６２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１０／１５１７９９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００５－５３０８１６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５０１８８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５３７３２８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１４／０５３３１５（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｅｐａｃタンパク質が関与する疾患の治療及び／又は予防に使用するための医薬組成物であって、少なくとも１種の薬学的に許容し得る賦形剤を伴って、下記式（Ｉ）：【化1】
［式中、
Ｒ１は、
－ Ｈ、
－ （Ｃ２～Ｃ２０）アルキル、及び
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール
からなる群より選択され、
ここで、該アルキル及びアリール基は、場合により置換されており、
Ｒ２は、
－ （Ｃ１～Ｃ２０）アルキル、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択されるか、
又はＲ２及びＲ４は、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル基を形成しており、
Ｒ３は、
－ Ｈ、及び
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール
からなる群より選択され、
ここで、該アリール基は、場合により置換されており、
Ｒ４は、Ｈであるか、
又はＲ２及びＲ４は、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル基を形成している］
を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩、水和物若しくは水和塩又はその多形結晶構造体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマーを含み、
ここで、該疾患が、心肥大、心不整脈、弁膜症、拡張機能障害、慢性心不全、虚血性心不全、心筋虚血、再潅流傷害、心筋炎、肥大型及び拡張型心筋症からなる群より選択される心疾患である、医薬組成物。
【請求項2】
式（Ｉ）において、Ｒ３が、－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール
からなる群より選択され、
ここで、該アリール基が、場合により置換されている、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項3】
式（Ｉ）において、Ｒ１が、－ Ｈ、及び
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール
からなる群より選択され、
ここで、該アリール基が、１つ以上のハロゲン原子により場合により置換されている、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項4】
式（Ｉ）において、Ｒ２が、－ （Ｃ１～Ｃ２０）アルキル、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択されるか、
又はＲ２及びＲ４が、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル基を形成している、請求項１～３のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項5】
式（Ｉ）において、Ｒ３が、１つ以上のハロゲン原子により場合により置換されている（Ｃ６～Ｃ１０）アリールである、請求項１～４のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項6】
式（Ｉ）において、Ｒ４が、Ｈであるか、又はＲ２及びＲ４が、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ５～Ｃ６）シクロアルキル基を形成している、請求項１～５のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項7】
式（Ｉ）において、Ｒ１が、フェニル基であり及び／又はＲ２が、チエニル基であり、該フェニル基及びチエニル基が、場合により置換されている、請求項１～６のいずれか一項記載の医薬組成物。
【請求項8】
式（Ｉ）において、Ｒ１が、
－ （Ｃ２～Ｃ２０）アルキル、及び
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール
からなる群より選択され、
ここで、該アルキル及びアリール基が、場合により置換されており、
Ｒ２が、
－ （Ｃ１～Ｃ２０）アルキル、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択されるか、
又はＲ２及びＲ４が、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル基を形成している、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項9】
式（Ｉ）で示される化合物が、下記式（ＩＩ）：【化2】
［式中、
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚが、Ｈ、－ＯＨ及びハロゲン原子からなる群より選択され、
Ｒ４が、Ｈであり、
Ｒ３が、請求項１で定義されたとおりである］
により特徴付けられる、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項10】
式（Ｉ）で示される化合物が、下記式：【化3】
のうちの１つを有する、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項11】
式（Ｉ）で示される化合物が、下記式：【化4】
を有する、請求項１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｅｐａｃ阻害剤として有用なチエノ［２，３－ｂ］ピリジン誘導体及びその医薬用途に関する。
【背景技術】
【0002】
二次情報伝達物質であるサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）は、細胞増殖、透過性及び炎症を含む多様な生理学的プロセスをレギュレーションする。ｃＡＭＰの主な細胞内機能は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）と、より最近特定されたＥｘｃｈａｎｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｉｒｅｃｔｌｙ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｃＡＭＰ（以下、Ｅｐａｃと呼ばれる）とにより伝達される。
【0003】
Ｅｐａｃタンパク質には、Ｅｐａｃ１及びＥｐａｃ２という２つのアイソフォームが存在する。両タンパク質は、低分子量Ｇプロテイン、Ｒａｐ１及びＲａｐ２のグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）として作用し、ＰＫＡ非依存的に機能する。Ｅｐａｃの２つのアイソフォームは、Ｅｐａｃ１が単一の環状ヌクレオチド結合（ＣＮＢ）ドメインを有し、一方、Ｅｐａｃ２がＣＮＢ－Ａ及びＣＮＢ－Ｂと呼ばれる２つのＣＮＢドメイン（これらは、ＤＥＰドメイン（Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ，Ｅｇｌ－１０ ａｎｄ Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎドメイン）の両側に位置している）を有する点で異なる。
【0004】
Ｅｐａｃは、炎症、ガン、血管疾患、腎疾患、認知障害、疼痛、感染症、肥満及び心疾患等の疾患に関連する種々の生理学的プロセスをレギュレーションする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
したがって、新規なＥｐａｃ阻害剤を提供することが必要とされている。特に、より強力かつ／又はより選択的なＥｐａｃ阻害剤が必要とされている。また、Ｅｐａｃが関与する疾患、例えば、炎症、ガン、血管疾患、腎疾患、認知障害、疼痛、感染症、肥満及び心疾患の予防及び／又は治療に使用することができるＥｐａｃ阻害剤を提供することも必要とされている。
【0006】
本発明の目的は、新規なＥｐａｃ阻害剤を提供することである。
【0007】
本発明の別の目的は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて既知のＥｐａｃ阻害剤、例えば、化合物ＣＥ３Ｆ４又は８－ＣＰＴ－Ｎ６－フェニル－ｃＡＭＰ（８－ＣＰＴ－Ｎ６又は８－（４－クロロフェニルチオ）－Ｎ６－フェニルアデノシン－３’，５’－環状モノホスファート）より、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて強力な、新規なＥｐａｃ阻害剤を提供することである。
【0008】
本発明の別の目的は、Ｅｐａｃ下流エフェクターの活性化、特に、Ｅｐａｃ１誘引Ｒａｐ１活性化を妨げる、新規なＥｐａｃ阻害剤を提供することである。
【0009】
本発明の別の目的は、Ｅｐａｃ１触媒活性を選択的に阻害する、新規なＥｐａｃ阻害剤を提供することである。
【0010】
本発明の目的は、炎症、ガン、血管疾患、腎疾患、認知障害、疼痛、感染症、肥満及び心疾患の予防及び／又は治療に有用であることができる、新規なＥｐａｃ阻害剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
このため、本発明は、Ｅｐａｃタンパク質が関与する疾患の治療及び／又は予防に使用するための、下記式（Ｉ）：
［式中、
Ｒ１は、
－ Ｈ、
－ （Ｃ２～Ｃ２０）アルキル、
－ （Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル、
－ ３～１０員のヘテロシクロアルキル、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択され、
ここで、前記アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、場合により置換されており、
Ｒ２は、
－ Ｈ、
－ （Ｃ１～Ｃ２０）アルキル、
－ （Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル、
－ ３～１０員のヘテロシクロアルキル、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択されるか、
又はＲ２及びＲ４は、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル基を形成しており、
ここで、前記アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、場合により置換されており、
Ｒ３は、
－ Ｈ、
－ （Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル、
－ ３～１０員のヘテロシクロアルキル、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択され、
ここで、前記シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、場合により置換されており、
Ｒ４は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＲｘＲｙ及び－Ｃ（Ｏ）ＯＲｚからなる群より選択され、
Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは、それぞれ独立して、Ｈ又は（Ｃ１～Ｃ１０）アルキルであるか、
又はＲ２及びＲ４は、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル基を形成している］
を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩、水和物若しくは水和塩又はその多形結晶構造体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマーに関する。
【化1】
［式中、
Ｒ１は、
－ Ｈ、
－ （Ｃ２～Ｃ２０）アルキル、
－ （Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル、
－ ３～１０員のヘテロシクロアルキル、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択され、
ここで、前記アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、場合により置換されており、
Ｒ２は、
－ Ｈ、
－ （Ｃ１～Ｃ２０）アルキル、
－ （Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル、
－ ３～１０員のヘテロシクロアルキル、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択されるか、
又はＲ２及びＲ４は、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル基を形成しており、
ここで、前記アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、場合により置換されており、
Ｒ３は、
－ Ｈ、
－ （Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル、
－ ３～１０員のヘテロシクロアルキル、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択され、
ここで、前記シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、場合により置換されており、
Ｒ４は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＲｘＲｙ及び－Ｃ（Ｏ）ＯＲｚからなる群より選択され、
Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは、それぞれ独立して、Ｈ又は（Ｃ１～Ｃ１０）アルキルであるか、
又はＲ２及びＲ４は、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル基を形成している］
を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩、水和物若しくは水和塩又はその多形結晶構造体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマーに関する。
【0012】
本発明者らは、驚くべきことに、チエノ［２，３－ｂ］ピリジン誘導体がＥｐａｃタンパク質を阻害することを発見した。この阻害により、Ｅｐａｃ誘引Ｒａｐ１活性化の阻害がもたらされる。また、本発明者らは、驚くべきことに、チエノ［２，３－ｂ］ピリジン誘導体がｃＡＭＰ及びＥｐａｃアゴニストの非競合的阻害剤であることも発見した。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】図１：ＢＲＥＴアッセイ。ｃＡＭＰ（１００μM）を加える前に、ＡＭ－００１、（Ｒ）－ＣＥ３Ｆ４（２０μM）又は媒体を細胞抽出物に加え、ＢＲＥＴ比（３つのウェルの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ）を測定し、阻害剤を使用しない対照値に対するＢＲＥＴ比の％ 変化としてプロットした。
【図2】図２及び図３：ＢＲＥＴ比を漸増濃度のＡＭ－００１又はｃＡＭＰの存在下において、トリプリケートで測定した。データをｃＡＭＰ（図２）又はＡＭ－００１（図２）濃度の関数としてプロットした。各条件下で得られた曲線を、Graphpad Prismを使用して分析し、最大ＢＲＥＴ比応答（阻害剤を使用しない対照値に対するＢＲＥＴ比の％ 変化として表現される）を得た。報告された値は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ（トリプリケート；いくつかのエラーバーを記号によりマスクする）である。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対媒体。図２において、曲線ａは、ＡＭ－００１の不存在に対応し、曲線ｂは、濃度２μM ＡＭ－００１に対応し、曲線ｃは、濃度５μM ＡＭ－００１に対応し、曲線ｄは、濃度１０μM ＡＭ－００１に対応し、曲線ｅは、濃度２０μM ＡＭ－００１に対応し、曲線ｆは、濃度３０μM ＡＭ－００１に対応し、曲線ｇは、濃度６０μM ＡＭ－００１の濃度に対応する。
【図3】図３において、曲線ａは、濃度１，０００μM ｃＡＭＰに対応し、曲線ｂは、濃度３００μM ｃＡＭＰに対応し、曲線ｃは、濃度１００μM ｃＡＭＰに対応し、曲線ｄは、濃度３０μM ｃＡＭＰに対応し、曲線ｅは、濃度１０μM ｃＡＭＰに対応し、曲線ｆは、濃度３μM ｃＡＭＰに対応し、曲線ｇは、濃度１μM ｃＡＭＰに対応する。
【図4】図４～図８．Ｅｐａｃ１（図４）及びＥｐａｃ２（図６）の活性を、Ｓｐ－８－ＣＰＴの不存在下（■）又は３０μM Ｓｐ－８－ＣＰＴの存在下において、単独（●）又は２０μM （Ｒ）－ＣＥ３Ｆ４（△）若しくは２０μM ＡＭ－００１（◇）のいずれかで測定した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）の変化を時間の関数として試験し、単一指数関数に適合させた。
【図6】Ｅｐａｃ１（図４）及びＥｐａｃ２（図６）の活性を、Ｓｐ－８－ＣＰＴの不存在下（■）又は３０μM Ｓｐ－８－ＣＰＴの存在下において、単独（●）又は２０μM （Ｒ）－ＣＥ３Ｆ４（△）若しくは２０μM ＡＭ－００１（◇）のいずれかで測定した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）の変化を時間の関数として試験し、単一指数関数に適合させた。
【図8】結果を阻害剤の非存在下で測定された対照値（１００％に設定）に対するＥｐａｃ触媒ＧＤＰ交換の初速度として表現した（図８）。Ｅｐａｃ１（●）及びＥｐａｃ２Ｂ（□）により誘引されたヌクレオチド交換の初速度を、飽和濃度のＳｐ－８－ＣＰＴ（５０μM）及び漸増濃度のＡＭ－００１の存在下において、トリプリケートで測定した。結果を時間経過試験からのＡＭ－００１の非存在下で測定されたＧＤＰ交換の％ 初速度として表現し、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ（いくつかのエラーバーを記号によりマスクする）として示す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照値又は指示値。
【図9】図９～図１３．Ｅｐａｃ１（図９～図１１）、Ｅｐａｃ２Ａ（図１２）又はＥｐａｃ２Ｂ（図１３）によりトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞において、Ｒａｐ１－ＧＴＰの量（各群ｎ＝５、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ）を測定した。細胞をＡＭ－００１（図９、図１２及び図１３）、ＡＭ－００２（図１０）又はＡＭ－００３（図１１）（２０μM、３０分）とプレインキュベーションするか又はせず、ついで、８－ＣＰＴ－ＡＭ（Ｅｐａｃ１活性化については１０μM及びＥｐａｃ２Ａ活性化については２０μM）又はＳ－２２０（Ｅｐａｃ２Ｂ活性化については５０μM）で１０分間処理するか又はしなかった。ＥＳＩ－０５をＥｐａｃ２Ａ阻害の陽性対照として使用した。代表的なイムノブロットを示す。＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対指示値、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ対比検定。
【図10】Ｅｐａｃ１（図９～図１１）、Ｅｐａｃ２Ａ（図１２）又はＥｐａｃ２Ｂ（図１３）によりトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞において、Ｒａｐ１－ＧＴＰの量（各群ｎ＝５、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ）を測定した。細胞をＡＭ－００１（図９、図１２及び図１３）、ＡＭ－００２（図１０）又はＡＭ－００３（図１１）（２０μM、３０分）とプレインキュベーションするか又はせず、ついで、８－ＣＰＴ－ＡＭ（Ｅｐａｃ１活性化については１０μM及びＥｐａｃ２Ａ活性化については２０μM）又はＳ－２２０（Ｅｐａｃ２Ｂ活性化については５０μM）で１０分間処理するか又はしなかった。ＥＳＩ－０５をＥｐａｃ２Ａ阻害の陽性対照として使用した。代表的なイムノブロットを示す。＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対指示値、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ対比検定。
【図11】Ｅｐａｃ１（図９～図１１）、Ｅｐａｃ２Ａ（図１２）又はＥｐａｃ２Ｂ（図１３）によりトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞において、Ｒａｐ１－ＧＴＰの量（各群ｎ＝５、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ）を測定した。細胞をＡＭ－００１（図９、図１２及び図１３）、ＡＭ－００２（図１０）又はＡＭ－００３（図１１）（２０μM、３０分）とプレインキュベーションするか又はせず、ついで、８－ＣＰＴ－ＡＭ（Ｅｐａｃ１活性化については１０μM及びＥｐａｃ２Ａ活性化については２０μM）又はＳ－２２０（Ｅｐａｃ２Ｂ活性化については５０μM）で１０分間処理するか又はしなかった。ＥＳＩ－０５をＥｐａｃ２Ａ阻害の陽性対照として使用した。代表的なイムノブロットを示す。＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対指示値、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ対比検定。
【図12】Ｅｐａｃ１（図９～図１１）、Ｅｐａｃ２Ａ（図１２）又はＥｐａｃ２Ｂ（図１３）によりトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞において、Ｒａｐ１－ＧＴＰの量（各群ｎ＝５、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ）を測定した。細胞をＡＭ－００１（図９、図１２及び図１３）、ＡＭ－００２（図１０）又はＡＭ－００３（図１１）（２０μM、３０分）とプレインキュベーションするか又はせず、ついで、８－ＣＰＴ－ＡＭ（Ｅｐａｃ１活性化については１０μM及びＥｐａｃ２Ａ活性化については２０μM）又はＳ－２２０（Ｅｐａｃ２Ｂ活性化については５０μM）で１０分間処理するか又はしなかった。ＥＳＩ－０５をＥｐａｃ２Ａ阻害の陽性対照として使用した。代表的なイムノブロットを示す。＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対指示値、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ対比検定。
【図13】Ｅｐａｃ１（図９～図１１）、Ｅｐａｃ２Ａ（図１２）又はＥｐａｃ２Ｂ（図１３）によりトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞において、Ｒａｐ１－ＧＴＰの量（各群ｎ＝５、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ）を測定した。細胞をＡＭ－００１（図９、図１２及び図１３）、ＡＭ－００２（図１０）又はＡＭ－００３（図１１）（２０μM、３０分）とプレインキュベーションするか又はせず、ついで、８－ＣＰＴ－ＡＭ（Ｅｐａｃ１活性化については１０μM及びＥｐａｃ２Ａ活性化については２０μM）又はＳ－２２０（Ｅｐａｃ２Ｂ活性化については５０μM）で１０分間処理するか又はしなかった。ＥＳＩ－０５をＥｐａｃ２Ａ阻害の陽性対照として使用した。代表的なイムノブロットを示す。＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対指示値、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ対比検定。
【図14】図１４：単離された成人心筋細胞をＡＭ－００１（２０μM、３０分）で前処理するか又はせず、８－ＣＰＴ－ＡＭ（１０μM、３０分）で刺激するか又はせず、正常酸素圧（ＮＸ）又は低酸素－再酸素化（ＨＸ＋Ｒ）処理に供した。細胞生存率をＮＸ又はＨＸ＋Ｒ条件下（ｎ＝６）での乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出により決定した。
【図15】図１５～図１６：リスク領域（ＡＡＲ）の定量を％ 左心室サイズとして表現し、梗塞サイズを％ ＡＡＲのパーセンテージとして表現した。ＡＭ－００１（図１５）又はＲ－ＣＥ３Ｆ４（図１６）により前処理するか又はしなかったマウスのエバンスブルー及びＴＴＣで染色した代表的な断面を示す。統計学的有意差を二元配置ＡＮＯＶＡ、続けて、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定又はｔ－検定にて決定した。＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１対指示値。
【図16】リスク領域（ＡＡＲ）の定量を％ 左心室サイズとして表現し、梗塞サイズを％ ＡＡＲのパーセンテージとして表現した。ＡＭ－００１（図１５）又はＲ－ＣＥ３Ｆ４（図１６）により前処理するか又はしなかったマウスのエバンスブルー及びＴＴＣで染色した代表的な断面を示す。統計学的有意差を二元配置ＡＮＯＶＡ、続けて、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定又はｔ－検定にて決定した。＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１対指示値。
【発明を実施するための形態】
【0014】
一実施態様では、式（Ｉ）で示される化合物は、選択的Ｅｐａｃ阻害剤である。選択的Ｅｐａｃ阻害剤は、Ｅｐａｃタンパク質に対して阻害効果を示し、他のタンパク質に対して中等度の阻害効果を示すか又は全く阻害効果を示さない化合物であることができる。一実施態様では、式（Ｉ）で示される化合物は、非競合阻害剤である。一実施態様では、式（Ｉ）で示される化合物は、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡとも呼ばれる）を阻害しない。別の実施態様では、式（Ｉ）で示される化合物によるＥｐａｃの阻害は、前記化合物の濃度に依存する。
【0015】
一実施態様では、式（Ｉ）で示される化合物は、Ｅｐａｃ１阻害剤である。別の実施態様では、式（Ｉ）で示される化合物は、Ｅｐａｃ１選択的阻害剤である。一実施態様では、Ｅｐａｃ１選択的阻害剤は、Ｅｐａｃ１アイソフォームに対して阻害効果を示す化合物である。とりわけ、一般的には、Ｅｐａｃ１選択的阻害剤は、Ｅｐａｃ１に対する阻害効果を示し、Ｅｐａｃ２アイソフォームに対する中等度の阻害効果を示すか又は全く阻害効果を示さない。「選択的Ｅｐａｃ１阻害剤」とは、Ｅｐａｃ１阻害剤が、他のアイソフォームであるＥｐａｃ２よりも優先して、特定のＥｐａｃ１アイソフォームに影響を及ぼす能力と理解することができる。Ｅｐａｃ１選択的阻害剤は、２つのＥｐａｃアイソフォームを識別する能力を有するため、本質的には、Ｅｐａｃ１アイソフォームに影響を及ぼすことができる。
【0016】
「ＣＥ３Ｆ４」は、下記式：
を有する化合物を指す。
【化2】
を有する化合物を指す。
【0017】
「（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル」又は「（Ｃ２～Ｃ２０）アルキル」という用語は、直鎖又は分岐鎖であることができ、鎖中にそれぞれ１～２０個の炭素原子又は２～２０個の炭素原子を有する、飽和又は不飽和脂肪族炭化水素基を意味する。好ましいアルキル基は、鎖中に１～５個の炭素原子を有し、好ましいアルキル基は、特に、メチル又はエチル基である。「分岐鎖」は、１つ又は低級アルキル基、例えば、メチル、エチル若しくはプロピルが直鎖アルキル鎖に付着していることを意味する。アルキル基は置換されている場合がある。
【0018】
「（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル」とは、３～１０個の炭素原子を有し、ここで、置換可能な任意の炭素原子が置換基により置換されている場合がある、環状飽和炭化水素基を意味する。特に、シクロアルキル基は、シクロプロピル又はシクロヘキシル基である。
【0019】
「３～１０員のヘテロシクロアルキル」は、３～１０個の炭素原子を有し、ここで、１つ以上の炭素原子が１つ以上のヘテロ原子、例えば、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子；例えば、１つ若しくは２つの窒素原子、１つ若しくは２つの酸素原子、１つ若しくは２つの硫黄原子又は異なるヘテロ原子の組み合わせ、例えば、１つの窒素原子及び１つの酸素原子により置き換えられている、環状飽和炭化水素基を意味する。置換が可能な任意の環原子は、置換基により置換されている場合がある。好ましい３～１０員のヘテロシクロアルキルは、フラン、チオフェン、窒素環、例えば、ピロール若しくはピラゾール又はフルオロフェニル環である。
【0020】
「（Ｃ６～Ｃ１０）アリール」という用語は、芳香族単環式、二環式又は三環式炭化水素環系であって、置換可能な環原子は、置換基により置換されている場合がある、炭化水素系を指す。アリール部分の例は、フェニルを含むが、これに限定されない。
【0021】
「５～１０員のヘテロアリール」という用語は、芳香族単環式、二環式又は三環式炭化水素環系であって、置換可能な任意の環原子が置換基により置換されている場合があり、ここで、１つ以上の炭素原子が１つ以上のヘテロ原子、例えば、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子；例えば、１つ若しくは２つの窒素原子、１つ若しくは２つの酸素原子、１つ若しくは２つの硫黄原子又は異なるヘテロ原子の組み合わせ、例えば、１つの窒素原子及び１つの酸素原子により置き換えられている。好ましいヘテロアリール基は、チエニル、ピリジル、ピリミジル及びオキサジル基、より好ましくは、チエニル基である。
【0022】
「ハロゲン」という用語は、周期表の１７族の原子を指し、特に、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素原子、より好ましくは、フッ素、塩素及び臭素原子、例えば、フッ素を含む。
【0023】
「場合により置換されている」は、本発明の化合物のアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基が－ＯＨ、ハロゲン原子、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、－（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、－（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシ及び－ＮＲ７Ｒ８基（ここで、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル又はＨから選択される）からなる群より選択される１つ以上の置換基により、場合により置換されていることを意味することができる。
【0024】
好ましくは、前記アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、１つ以上のハロゲン原子、より好ましくは、フッ素原子により場合により置換されている。
【0025】
「チエノ［２，３－ｂ］ピリジン誘導体」という用語は、下記化学構造：
から誘導される化合物を指す。
【化3】
から誘導される化合物を指す。
【0026】
本明細書に記載された化合物は、不斉中心を有する場合がある。不斉置換原子を含有する本発明の化合物は、光学活性体又はラセミ体で単離することができる。ラセミ体の分割又は光学活性出発物質からの合成等により、光学活性体を調製する方法は、当技術分野において周知である。立体化学又は異性体が特に示されない限り、化合物の全てのキラル、ジアステレオマーラセミ体及び全ての幾何異性体が意図される。
【0027】
「薬学的に許容し得る塩」という用語は、本発明の化合物の生物学的有効性及び特性を保持し、生物学的に又は他の点で望ましくなくはない塩を指す。薬学的に許容し得る酸付加塩は、無機酸及び有機酸から調製することができる。一方、薬学的に許容し得る塩基付加塩は、無機塩基及び有機塩基から調製することができる。薬学的に許容し得る塩のレビューについては、Berge, et al.（(1977) J. Pharm. Sd, vol. 66, 1）を参照のこと。例えば、該塩は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等から得られる塩並びに有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、フマル酸、メタンスルホン酸及びトルエンスルホン酸等から調製される塩を含む。
【0028】
「Ｅｐａｃタンパク質が関与する疾患」は、Ｅｐａｃタンパク質が発現している若しくは過剰発現しているかつ／又は突然変異している疾患を意味する。
【0029】
本発明の文脈において、本明細書で使用する場合、「処置する」又は「処置」という用語は、このような用語が適用される障害若しくは状態又はこのような障害若しくは状態の１つ以上の症状の進行を逆転させ、これらを軽減し、阻害することを意味する。
【0030】
本発明の文脈において、本明細書で使用する場合、「予防する」又は「予防」という用語は、このような用語が適用される障害若しくは状態又はこのような障害若しくは状態の１つ以上の症状の発症又は進行を回避することを意味する。
【0031】
また、本発明は、心肥大、心不整脈、弁膜症、拡張機能障害、慢性心不全、虚血性心不全、心筋虚血、再潅流傷害、心筋炎、肥大型及び拡張型心筋症からなる群より選択される心疾患の治療及び／又は予防に使用するための、下記式（Ｉ）：
［式中、
Ｒ１は、
－ （Ｃ２～Ｃ２０）アルキル、
－ （Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル、
－ ３～１０員のヘテロシクロアルキル、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択され、
ここで、前記アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、場合により置換されており、
Ｒ２は、
－ Ｈ、
－ （Ｃ１～Ｃ２０）アルキル、
－ （Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択されるか、
又はＲ２及びＲ４は、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル基を形成しており、
ここで、前記アルキル、シクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、場合により置換されており、
Ｒ３は、
－ Ｈ、
－ （Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル、
－ ３～１０員のヘテロシクロアルキル、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択され、
ここで、前記シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、場合により置換されており、
Ｒ４は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＲｘＲｙ及び－Ｃ（Ｏ）ＯＲｚからなる群より選択され、
Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは、それぞれ独立して、Ｈ又は（Ｃ１～Ｃ１０）アルキルであるか、
又はＲ２及びＲ４は、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル基を形成している］
を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩、水和物若しくは水和塩又はその多形結晶構造体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマーに関する。
【化4】
［式中、
Ｒ１は、
－ （Ｃ２～Ｃ２０）アルキル、
－ （Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル、
－ ３～１０員のヘテロシクロアルキル、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択され、
ここで、前記アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、場合により置換されており、
Ｒ２は、
－ Ｈ、
－ （Ｃ１～Ｃ２０）アルキル、
－ （Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択されるか、
又はＲ２及びＲ４は、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル基を形成しており、
ここで、前記アルキル、シクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、場合により置換されており、
Ｒ３は、
－ Ｈ、
－ （Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル、
－ ３～１０員のヘテロシクロアルキル、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択され、
ここで、前記シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、場合により置換されており、
Ｒ４は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＲｘＲｙ及び－Ｃ（Ｏ）ＯＲｚからなる群より選択され、
Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは、それぞれ独立して、Ｈ又は（Ｃ１～Ｃ１０）アルキルであるか、
又はＲ２及びＲ４は、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル基を形成している］
を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩、水和物若しくは水和塩又はその多形結晶構造体、ラセミ体、ジアステレオマー若しくはエナンチオマーに関する。
【0032】
実施態様によれば、Ｒ３は、
－ （Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル、
－ ３～１０員のヘテロシクロアルキル、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択され、
ここで、前記シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、場合により置換されている。
－ （Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル、
－ ３～１０員のヘテロシクロアルキル、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択され、
ここで、前記シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、場合により置換されている。
【0033】
一般式（Ｉ）で示される化合物
一実施態様では、Ｒ３は、
－ （Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル、
－ ３～１０員のヘテロシクロアルキル、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択され、
ここで、前記シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、場合により置換されている。
一実施態様では、Ｒ３は、
－ （Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル、
－ ３～１０員のヘテロシクロアルキル、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択され、
ここで、前記シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、場合により置換されている。
【0034】
特定の実施態様では、Ｒ３は、好ましくは、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル及びハロゲン原子からなる群より選択される１つ以上の置換基により場合により置換されている（Ｃ６～Ｃ１０）アリールである。一実施態様では、Ｒ３は、Ｈ又は（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル及びハロゲン原子からなる群より選択される１つ以上の置換基により場合により置換されている（Ｃ６～Ｃ１０）アリールである。特定の実施態様では、Ｒ３は、Ｈ又は１つ以上のハロゲン原子により場合により置換されているフェニルである。特定の実施態様では、Ｒ３は、好ましくは、１つ以上のハロゲン原子により場合により置換されているフェニルである。
【0035】
別の実施態様では、Ｒ１は、
－ Ｈ、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択され、
ここで、前記アリール及びヘテロアリール基は、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、ハロゲン原子及び－ＮＲ７Ｒ８基（式中、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル又はＨから選択される）からなる群より選択される１つ以上の置換基により場合により置換されている。
－ Ｈ、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択され、
ここで、前記アリール及びヘテロアリール基は、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、ハロゲン原子及び－ＮＲ７Ｒ８基（式中、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル又はＨから選択される）からなる群より選択される１つ以上の置換基により場合により置換されている。
【0036】
好ましくは、Ｒ１は、Ｈ又は１つ以上の置換基、例えば、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、ハロゲン原子及び－ＮＲ７Ｒ８基（式中、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル又はＨから選択される）からなる群より選択される置換基により場合により置換されている（Ｃ６～Ｃ１０）アリールである。特定の実施態様では、Ｒ１は、Ｈ又は１つ以上のハロゲン原子、例えば、好ましくは、パラ位において１つのフッ素原子により場合により置換されているフェニルである。
【0037】
別の実施態様では、Ｒ１は、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択され、
ここで、前記アリール及びヘテロアリール基は、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、ハロゲン原子及び－ＮＲ７Ｒ８基（式中、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル又はＨから選択される）からなる群より選択される１つ以上の置換基により場合により置換されている。
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択され、
ここで、前記アリール及びヘテロアリール基は、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、ハロゲン原子及び－ＮＲ７Ｒ８基（式中、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル又はＨから選択される）からなる群より選択される１つ以上の置換基により場合により置換されている。
【0038】
好ましくは、Ｒ１は、１つ以上の置換基、例えば、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、ハロゲン原子及び－ＮＲ７Ｒ８基（式中、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル又はＨから選択される）からなる群より選択される置換基により場合により置換されている（Ｃ６～Ｃ１０）アリールである。特定の実施態様では、Ｒ１は、１つ以上のハロゲン原子、例えば、好ましくは、パラ位において１つのフッ素原子により場合により置換されているフェニルである。
【0039】
一実施態様では、Ｒ２は、
－ Ｈ、
－ （Ｃ１～Ｃ２０）アルキル、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択されるか、
又はＲ２及びＲ４は、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル基を形成しており、
ここで、前記アルキル、シクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル及びハロゲン原子からなる群より選択される１つ以上の置換基により場合により置換されている。
－ Ｈ、
－ （Ｃ１～Ｃ２０）アルキル、
－ （Ｃ６～Ｃ１０）アリール、及び
－ ５～１０員のヘテロアリール
からなる群より選択されるか、
又はＲ２及びＲ４は、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル基を形成しており、
ここで、前記アルキル、シクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル及びハロゲン原子からなる群より選択される１つ以上の置換基により場合により置換されている。
【0040】
特定の実施態様では、Ｒ２は、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル及び５～６員のヘテロアリール基からなる群より選択されるか又はＲ２及びＲ４は、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル基を形成しており、ここで、前記アルキル、シクロアルキル及びヘテロアリール基は、好ましくは、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル及びハロゲン原子からなる群より選択される１つ以上の置換基により場合により置換されている。
【0041】
特定の実施態様では、Ｒ２は、５～６員のヘテロアリール基からなる群より選択され、ここで、前記ヘテロアリール基は、好ましくは、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル及びハロゲン原子からなる群より選択される１つ以上の置換基により場合により置換されている。特定の実施態様では、Ｒ２は、チエニル基である。
【0042】
特定の実施態様では、Ｒ２は、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル及びチエニル環からなる群より選択されるか又はＲ２及びＲ４は、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ５～Ｃ６）シクロアルキル基、例えば、シクロヘキシル基を形成している。
【0043】
一実施態様では、Ｒ４は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び－Ｃ（Ｏ）ＯＨからなる群より選択されるか又はＲ２及びＲ４は、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル基を形成している。一実施態様では、Ｒ４は、Ｈであるか又はＲ２及びＲ４は、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ５～Ｃ６）シクロアルキル基を形成している。好ましくは、Ｒ４は、Ｈである。
【0044】
特定の実施態様では、Ｒ１は、フェニル基であり及び／又はＲ２は、チエニル基であり、前記フェニル基及びチエニル基は、場合により置換されている。一実施態様では、Ｒ１及びＲ２のうちの少なくとも一方は、（Ｃ６～Ｃ１０）アリール基又は５～１０員のヘテロアリール基である。
【0045】
好ましくは、上記式（Ｉ）において、Ｒ１は、（Ｃ２～Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル、３～１０員のヘテロシクロアルキル、（Ｃ６～Ｃ１０）アリール及び５～１０員のヘテロアリールからなる群より選択され、ここで、前記アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール及びヘテロアリール基は、場合により置換されており、Ｒ２は、Ｈ、（Ｃ１～Ｃ２０）アルキル、（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル、（Ｃ６～Ｃ１０）アリール及び５～１０員のヘテロアリールからなる群より選択されるか又はＲ２及びＲ４は、それらを担持している炭素原子と共に、（Ｃ３～Ｃ１０）シクロアルキル基を形成しており、ここで、前記アルキル、シクロアルキル、ヘアリール及びヘテロアリール基は、場合により置換されている。
【0046】
特定の一実施態様では、本発明の化合物は、下記式（ＩＩ）：
［式中、
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは、
Ｈ、－ＯＨ、ハロゲン原子、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシ及び－ＮＲ５Ｒ６
からなる群より選択され、
ここで、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル又はＨから選択され、
Ｒ４は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び－Ｃ（Ｏ）ＯＨからなる群より選択され、
Ｒ３は、上記定義されたとおりである］
により特徴付けられる。
【化5】
［式中、
Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは、
Ｈ、－ＯＨ、ハロゲン原子、－Ｃ（Ｏ）ＯＨ、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシ及び－ＮＲ５Ｒ６
からなる群より選択され、
ここで、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、（Ｃ１～Ｃ１０）アルキル又はＨから選択され、
Ｒ４は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び－Ｃ（Ｏ）ＯＨからなる群より選択され、
Ｒ３は、上記定義されたとおりである］
により特徴付けられる。
【0047】
特定の実施態様では、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは、Ｈ、ハロゲン原子又は（Ｃ１～Ｃ１０）アルキルの中から選択される。一実施態様では、Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは、Ｈでありかつ／又はＲａ、Ｒｂ、Ｒｄ及びＲｅは、Ｈである。好ましくは、Ｒｃは、Ｈ又はハロゲン原子、例えば、フッ素原子である。
【0048】
一実施態様では、式（Ｉ）で示される化合物は、下記式：
のうちの１つを有する。
【化6】
のうちの１つを有する。
【0049】
好ましくは、式（Ｉ）で示される化合物は、下記式：
を有する。
【化7】
を有する。
【0050】
また、本発明は、式（Ｉ）で示される化合物自体に関する。
【0051】
医薬組成物及び使用
また、本発明は、少なくとも１種の薬学的に許容し得る賦形剤と関連して、上記定義されたその使用のための、式（Ｉ）を有する化合物を含む、医薬組成物に関する。
また、本発明は、少なくとも１種の薬学的に許容し得る賦形剤と関連して、上記定義されたその使用のための、式（Ｉ）を有する化合物を含む、医薬組成物に関する。
【0052】
また、本発明は、上記定義されたその使用のための、式（Ｉ）を有する化合物を含む、薬剤に関する。
【0053】
式（Ｉ）を有する化合物を単独で投与することは可能であるが、それらを医薬組成物として提示することが好ましい。本発明に従って有用で、獣医学的使用及びヒトに対する使用の両方のための医薬組成物は、１種以上の薬学的に許容し得る担体及びおそらく他の治療成分と共に、上記定義された式（Ｉ）を有する少なくとも１つの化合物を含む。
【0054】
特定の好ましい実施態様では、併用療法に必要な活性成分は、同時投与のために単一の医薬組成物中で組み合わせることができる。
【0055】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容し得る」及びその文法的変形例は、それらが組成物、担体、希釈剤及び試薬を言及する場合、互換的に使用され、該材料が望ましくない生理学的作用、例えば、吐き気、めまい、胃の不調等を生じさせることなく、ほ乳類に又はほ乳類上に投与可能であることを表わす。
【0056】
溶解され又は分散された活性成分を含有する薬理学的組成物の調製は、当技術分野において十分に理解されており、製剤に基づいて限定される必要はない。典型的には、このような組成物は、注射剤として、液剤又は懸濁剤のいずれかとして調製されるが、使用前に、液体中で液剤又は懸濁剤にするのに適した固体形態にも調製することができる。該調製物は、乳化させることもできる。特に、医薬組成物は、固体剤形、例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉末剤、糖衣錠又は顆粒剤に製剤化することができる。
【0057】
媒体の選択及び媒体中の活性物質の含量は、一般的には、活性化合物の溶解性及び化学的特性、特定の投与様式並びに薬務において遵守されるべき規定に従って決定される。例えば、賦形剤、例えば、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム並びに崩壊剤、例えば、デンプン、アルギン酸並びに潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクと組み合わせた特定のシリカート複合体を、錠剤を調製するのに使用することができる。カプセル剤を調製するために、ラクトース及び高分子量ポリエチレングリコールを使用するのが有利である。水性懸濁剤が使用される場合、それらは、乳化剤又は懸濁を促進する作用剤を含有することができる。また、希釈剤、例えば、スクロース、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール及びクロロホルム又はそれらの混合物も使用することができる。
【0058】
該医薬組成物は、経口、直腸、鼻、頬、眼、舌下、経皮、直腸、局所、膣、非経口（皮下、動脈内、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内及び硬膜外を含む）、槽内及び腹腔内を含む局所投与又は全身投与により、ヒト及び動物に適した製剤で投与することができる。好ましい経路は、例えば、レシピエントの状態により変化する場合があることが理解されるであろう。
【0059】
該製剤は、薬学分野で周知の方法のいずれかにより、単位剤形に調製することができる。このような方法は、活性成分を１種以上の副次的成分を構成する担体と会合させる工程を含む。一般的には、該製剤は、活性成分を液体担体若しくは微細分割固体担体又はそれらの両方と均一かつ緊密に会合させること、ついで、必要に応じて、製品を成形することにより調製される。
【0060】
本発明は、炎症、ガン（メラノーマ、乳房、卵巣、子宮頸部、結腸、肺、膵臓及び胃のガン並びに線維肉腫）、血管疾患、腎臓疾患、認知障害、慢性疼痛、細菌及びウイルス感染症、肥満、肺（ＣＯＰＤ、気道線維症）並びに心疾患の治療及び／又は予防に使用するための、上記定義された式（Ｉ）を有する化合物に関する。
【0061】
また、本発明は、炎症、ガン、血管疾患、腎臓疾患、認知障害、疼痛、感染症、肥満及び心疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための、上記定義された式（Ｉ）を有する化合物の使用に関する。
【0062】
一実施態様では、心疾患は、心肥大、心不整脈、弁膜症、拡張機能障害、慢性心不全、虚血性心不全、心筋虚血、再潅流傷害、心筋炎、肥大型、拡張型及び糖尿病性心筋症からなる群より選択される。特定の実施態様では、前記心疾患は、肥大、心筋虚血及び再潅流傷害からなる群より選択される。特定の実施態様では、前記心疾患は、肥大、心筋虚血及び再潅流傷害からなる群より選択される。
【0063】
「炎症」は、人体が攻撃に対して自らを防御し、種々の症状、例えば、疼痛、腫脹、熱感又は皮膚の発赤においてそれ自体が生じる場合がある現象を意味する。
【0064】
「ガン」という用語は、固形腫瘍及び／若しくは播種性血液ガン並びに／又はそれらの転移を意味する。「転移」又は「転移性疾患」という用語は、別の箇所に移動した原発腫瘍由来の細胞により形成される二次腫瘍を指す。「血液ガン」という用語は、血液、骨髄及びリンパ節に影響を及ぼす種類のガン、例えば、骨髄腫、リンパ腫又は白血病を指す。特に、「ガン」という用語は、乳房、卵巣、子宮頸部、結腸、肺、膵臓、胃及び膵臓のガン、メラノーマ並びに線維肉腫を指す。
【0065】
「血管疾患」は、アテローム形成、アテローム性動脈硬化症及び血管形成術後再狭窄を意味することができる。
【0066】
「腎臓疾患」は、腎尿細管間質の病態、例えば、糖尿病性腎症を意味する場合があるが、多発性嚢胞腎疾患も意味する。
【0067】
認知障害は、主に、学習、記憶、知覚及び問題解決に影響を及ぼすメンタルヘルス障害のカテゴリーであり、健忘、認知症及びせん妄を含む。認知障害の中でも、アルツハイマー病に言及される場合がある。
【0068】
「疼痛」という用語は、疾患、傷害又は生物学的プロセス、例えば、炎症性疼痛による身体的苦痛又は苦痛を意味する。疼痛は、急性又は慢性、好ましくは慢性炎症性疼痛であることができる。
【0069】
「感染症」という用語は、ウイルス、細菌、寄生虫又は真菌の感染症を意味する。
【0070】
肥満は、過剰な体脂肪を特徴とする病態である。「肥満」という用語は、30kg/m2を超えるボディ・マス・インデックス（ＢＭＩ）（すなわち、人間の体重（kg）を人間の身長（メートル）の二乗で割ることにより得られる計測値）を有する患者を意味することができる。
【0071】
心疾患は、より具体的には、心肥大、心不整脈、弁膜症、拡張機能障害、慢性心不全、虚血性心不全、心筋虚血、再潅流傷害、心筋炎、肥大型及び拡張型心筋症を指す。Ｒａｐ１に加えて、Ｅｐａｃ１は、初代心筋細胞を含む異なる細胞種において、低分子量ＧＴＰａｓｅ Ｈ－Ｒａｓを活性化することが示されている（Keiper et al., 2004；Metrich et al., 2008；Metrich et al., 2010a, 2010b；Schmidt et al., 2001）ことに留意する必要がある。
【0072】
本明細書で使用する場合、「心不整脈」という用語は、一般的には、心拍数又は心リズムの異常として現れる心臓の電気的活動の障害と定義される。不整脈は、最も一般的には、心血管疾患、特に、虚血性心疾患に関連している。この用語は、洞性不整脈、期外収縮、心ブロック、心房細動、心房粗動、心室頻拍、心室細動、交互脈及び発作性頻拍を含む。
【0073】
また、本発明は、Ｅｐａｃタンパク質が関与する疾患の予防及び／又は治療の方法であって、それを必要とする患者に、薬学的に許容し得る量の上記定義された式（Ｉ）で示される化合物を投与することを含む、方法に関する。
【0074】
好ましくは、本発明は、炎症、ガン、血管疾患、腎臓疾患、認知障害、疼痛、感染症、肥満及び心疾患の予防及び／又は治療の方法であって、それを必要とする患者に、薬学的に許容し得る量の上記定義された式（Ｉ）で示される化合物を投与することを含む、方法に関する。
【0075】
とりわけ、本発明は、心肥大、心不整脈、弁膜症、拡張機能障害、慢性心不全、虚血性心不全、心筋虚血、再潅流傷害、心筋炎、肥大型及び拡張型心筋症の予防及び／又は治療の方法であって、それを必要とする患者に、薬学的に許容し得る量の上記定義された式（Ｉ）で示される化合物を投与することを含む、方法に関する。
【実施例】
【0076】
Ａ－材料及び方法
試薬及び抗体
ＡＭ－００１及び構造類似体（ＡＭ－００２；ＡＭ－００３；ＡＭ－００４；ＡＭ－００５；ＡＭ－００６；ＡＭ－００７；ＡＭ－００８；ＡＭ－００９；ＡＭ－０１０）をAmbinterから、下記照会番号：Ａｍｂ１７８１５９７（ＡＭ－００１）、Ａｍｂ２１９３１７２（ＡＭ－００２）、Ａｍｂ２６５４８７４（ＡＭ－００３）、Ａｍｂ２６７５７１８（ＡＭ－００４）、Ａｍｂ１８５８９５４（ＡＭ－００５）、Ａｍｂ６９５８４０（ＡＭ－００６）、Ａｍｂ５８４２１６３（ＡＭ－００７）、Ａｍｂ３４４３９２０（ＡＭ－００８）、Ａｍｂ２８２３８１０（ＡＭ－００９）及びＡｍｂ６３２６９４８（ＡＭ－０１０）で購入した。
試薬及び抗体
ＡＭ－００１及び構造類似体（ＡＭ－００２；ＡＭ－００３；ＡＭ－００４；ＡＭ－００５；ＡＭ－００６；ＡＭ－００７；ＡＭ－００８；ＡＭ－００９；ＡＭ－０１０）をAmbinterから、下記照会番号：Ａｍｂ１７８１５９７（ＡＭ－００１）、Ａｍｂ２１９３１７２（ＡＭ－００２）、Ａｍｂ２６５４８７４（ＡＭ－００３）、Ａｍｂ２６７５７１８（ＡＭ－００４）、Ａｍｂ１８５８９５４（ＡＭ－００５）、Ａｍｂ６９５８４０（ＡＭ－００６）、Ａｍｂ５８４２１６３（ＡＭ－００７）、Ａｍｂ３４４３９２０（ＡＭ－００８）、Ａｍｂ２８２３８１０（ＡＭ－００９）及びＡｍｂ６３２６９４８（ＡＭ－０１０）で購入した。
【0077】
ＡＭ－００１、ＡＭ－００４、ＡＭ－００５、ＡＭ－００６、ＡＭ－００７、ＡＭ－００８及びＡＭ－００９は上記されたとおりであり、本発明の式（Ｉ）で示される化合物である。一方、ＡＭ－００２、ＡＭ－００３及びＡＭ－０１０は、本発明の化合物ではない。
【化8】
【0078】
Ｅｐａｃ１阻害剤であるＣＥ３Ｆ４を以前に発表された方法（Courilleau D, Bisserier M, Jullian JC, Lucas A, Bouyssou P, Fischmeister R, Blondeau JP, Lezoualc'h F (2012) Identification of a tetrahydroquinoline analog as a pharmacological inhibitor of the cAMP-binding protein Epac. J Biol Chem 287:44192-44202）に従って合成した。
【0079】
ｃＡＭＰ、８－ＣＰＴ－Ｎ６－フェニル－ｃＡＭＰ（８－ＣＰＴ－Ｎ６）、８－（４－クロロフェニルチオ）－２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’，５’－環状モノホスファート、アセトキシメチルエステル（８－ＣＰＴ－ＡＭ）及びＳｐ－８－ＣＰＴ（Ｓｐ－８－ｐＣＰＴ－２’－Ｏ－Ｍｅ－ｃＡＭＰＳ（Ｓｐ－８－ＣＰＴ：８－（４－クロロフェニルチオ）－２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’，５’－環状モノホスホロチオアート、Ｓｐ－異性体）をBioLog（Bremen, Germany）から購入した。
【0080】
グアノシン ５’－二リン酸、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、２’－（又は３’）－Ｏ－（Ｎ－（２－アミノエチル）ウレタン）、ビス（トリエチルアンモニウム）塩（ｂＧＤＰ）をInvitrogenから入手した。
【0081】
抗体及びそれらの供給元は、抗ＧＡＰＤＨ、抗Ｒａｐ１、抗Ｅｐａｃ１、抗Ｅｐａｃ２及び抗ＧＲＫ２（１／１０００）（Cell Signaling）；抗チューブリン（１／５０００）（Sigma-Aldrich）；抗ＧＲＫ５（１／１０００）（Santa Cruz）；西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（Santa Cruz）とした。
【0082】
細胞培養
全ての手法を実験動物のケア及び使用に関するガイドに従って行い、獣医委員会に、使用された心筋細胞単離プロトコールについて情報提供した。
全ての手法を実験動物のケア及び使用に関するガイドに従って行い、獣医委員会に、使用された心筋細胞単離プロトコールについて情報提供した。
【0083】
新生仔ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）単離：１～２日齢の新生仔ラットを断頭により安楽死させた。心臓を切除し、心房を除去した。続けて、ＮＲＶＭの初代培養を以前に記載されたように（Morel E, Marcantoni A, Gastineau M, Birkedal R, Rochais F, Garnier A, Lompre AM, Vandecasteele G, Lezoualc'h F (2005) cAMP-binding protein Epac induces cardiomyocyte hypertrophy. Circ Res 97:1296-1304）行った。
【0084】
成体マウス心筋細胞単離：ペントバルビタール（３００mg/kg)及びヘパリン（１５０単位）の腹腔内注射後、ＷＴ及びＥｐａｃ１－／－からの心臓を迅速に単離し、氷冷Ｔｙｒｏｄｅカルシウム非含有バッファー（１３０mmol/L ＮａＣｌ、５．４mmol/L ＫＣｌ、１．４mmol/L ＭｇＣｌ２、０．４mmol/L ＮａＨ２ＰＯ４、４．２mmol/L ＨＥＰＥＳ、１０ｍｍｏｌ/L グルコース、２０mmol/L タウリン及び１０mmol/L クレアチン一水和物、ｐＨ７．２）に入れた。続けて、成体マウス心筋細胞の初代培養を以前に記載されたように（Fazal L, Laudette M, Paula-Gomes S, Pons S, Conte C, Tortosa F, Sicard P, Sainte-Marie Y, Bisserier M, Lairez O, Lucas A, Roy J, Ghaleh B, Fauconnier J, Mialet-Perez J, Lezoualc'h F (2017) Multifunctional Mitochondrial Epac1 Controls Myocardial Cell Death. Circ Res 120(4):645-657）行った。
【0085】
ヒト胚性腎臓細胞系統（ＨＥＫ２９３）：ＨＥＫ２９３細胞を、ＦＢＳ（１０％）及びペニシリン－ストレプトマイシン（１％）を含む最少必須培地で維持した。細胞培養に使用された全ての培地、血清及び抗生物質をInvitrogenから購入した。
【0086】
プラスミド構築物及びトランスフェクション
Ｅｐａｃ１－ＢＲＥＴセンサーであるＣＡＭＹＥＬをｐＱＥ３０－ＣＡＭＹＥＬ原核生物発現ベクター（Dr L. I. Jiangから提供された）から、以前に記載されたように（Courilleau D, Bisserier M, Jullian JC, Lucas A, Bouyssou P, Fischmeister R, Blondeau JP, Lezoualc'h F (2012) Identification of a tetrahydroquinoline analog as a pharmacological inhibitor of the cAMP-binding protein Epac. J Biol Chem 287:44192-44202）構築した。ヒトＥｐａｃ１／Ｅｐａｃ２発現ベクターは、Dr J. L. Bosから提供された。細胞を、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を使用して、製造メーカーの説明書に従ってトランスフェクションした。ＨＥＫ２９３細胞をＦＢＳ（ウシ胎児血清；１０％）及びペニシリン－ストレプトマイシン（１％）を含むＭＥＭで維持した。細胞培養に使用された全ての培地、血清及び抗生物質をInvitrogen（Cergy Pontoise, France）から購入した。一過性トランスフェクション実験を、Lipofectamine 2000（Invitrogen Life Technologies）により、製造メーカーの説明書に従って、種々の量のプラスミド構築物の存在下で行った。
Ｅｐａｃ１－ＢＲＥＴセンサーであるＣＡＭＹＥＬをｐＱＥ３０－ＣＡＭＹＥＬ原核生物発現ベクター（Dr L. I. Jiangから提供された）から、以前に記載されたように（Courilleau D, Bisserier M, Jullian JC, Lucas A, Bouyssou P, Fischmeister R, Blondeau JP, Lezoualc'h F (2012) Identification of a tetrahydroquinoline analog as a pharmacological inhibitor of the cAMP-binding protein Epac. J Biol Chem 287:44192-44202）構築した。ヒトＥｐａｃ１／Ｅｐａｃ２発現ベクターは、Dr J. L. Bosから提供された。細胞を、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を使用して、製造メーカーの説明書に従ってトランスフェクションした。ＨＥＫ２９３細胞をＦＢＳ（ウシ胎児血清；１０％）及びペニシリン－ストレプトマイシン（１％）を含むＭＥＭで維持した。細胞培養に使用された全ての培地、血清及び抗生物質をInvitrogen（Cergy Pontoise, France）から購入した。一過性トランスフェクション実験を、Lipofectamine 2000（Invitrogen Life Technologies）により、製造メーカーの説明書に従って、種々の量のプラスミド構築物の存在下で行った。
【0087】
動物
全ての動物手法を動物実験に関する施設ガイドライン及びフランス農業省の許可に従って行った。さらに、この調査は、欧州議会の指令２０１０／６３／ＥＵにより公表された実験動物のケア及び使用のためのガイドに準拠した。マウスを、病原体を含まない施設で飼育し、全ての動物実験は、トゥールーズ大学の動物のケア及び使用委員会により承認された。
全ての動物手法を動物実験に関する施設ガイドライン及びフランス農業省の許可に従って行った。さらに、この調査は、欧州議会の指令２０１０／６３／ＥＵにより公表された実験動物のケア及び使用のためのガイドに準拠した。マウスを、病原体を含まない施設で飼育し、全ての動物実験は、トゥールーズ大学の動物のケア及び使用委員会により承認された。
【0088】
心筋Ｉ／Ｒ ｉｎ ｖｉｖｏ、リスク領域及び梗塞サイズの評価
マウスを腹腔内ケタミン（６０mg/kg）及びキシラジン（６mg/kg）で麻酔し、挿管し、機械的に換気した。麻酔を１．５％ イソフルランにより、外科手術の間にわたって維持した。体温を３７℃に維持した。７－０プロレン糸を左冠動脈の周囲に４５分間置くことにより冠動脈閉塞を可能にするために、左開胸術を行った。続けて、２４時間再潅流した。マウスを再灌流の５分前に、冠動脈への静脈内注射により、ＡＭ－００１（１０mg/kg）又は滅菌生理食塩水のボーラスで処置した。心筋虚血を局所チアノーゼの存在により確認した。再潅流を充血反応の可視化により確認した。この時点で、胸部を重ねて閉じた。再潅流の２４時間後、マウスを再度麻酔し、冠動脈を前の部位で再閉塞させ、心臓をエバンスブルー潅流後に切除した。リスク領域及び梗塞領域をそれぞれ、エバンスブルー及び２，３，５－トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）染色により決定した。リスク領域を非青色領域として特定し、％ 左心室重量として表現した。梗塞領域をＴＴＣ陰性ゾーンとして特定し、％ リスク領域として表現した。
マウスを腹腔内ケタミン（６０mg/kg）及びキシラジン（６mg/kg）で麻酔し、挿管し、機械的に換気した。麻酔を１．５％ イソフルランにより、外科手術の間にわたって維持した。体温を３７℃に維持した。７－０プロレン糸を左冠動脈の周囲に４５分間置くことにより冠動脈閉塞を可能にするために、左開胸術を行った。続けて、２４時間再潅流した。マウスを再灌流の５分前に、冠動脈への静脈内注射により、ＡＭ－００１（１０mg/kg）又は滅菌生理食塩水のボーラスで処置した。心筋虚血を局所チアノーゼの存在により確認した。再潅流を充血反応の可視化により確認した。この時点で、胸部を重ねて閉じた。再潅流の２４時間後、マウスを再度麻酔し、冠動脈を前の部位で再閉塞させ、心臓をエバンスブルー潅流後に切除した。リスク領域及び梗塞領域をそれぞれ、エバンスブルー及び２，３，５－トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）染色により決定した。リスク領域を非青色領域として特定し、％ 左心室重量として表現した。梗塞領域をＴＴＣ陰性ゾーンとして特定し、％ リスク領域として表現した。
【0089】
ＩＳＯの慢性注入
浸透圧ミニポンプ（Alzet）を、イソフルラン（１％）で麻酔されたマウスの皮下に埋め込んだ。ポンプにＩＳＯ又は無菌生理食塩水を満たし、ＩＳＯを６０mg/kg/日で１４日間送るように設定して、心肥大を誘引させた。ＡＭ－００１処置（１０mg/kg/日、１０％ ＤＭＳＯ／２０％ Kolliphor／７０％ 無菌生理食塩水中で希釈）をＩＳＯ注入の３日目から与える。続けて、マウスをバルビツラート過剰用量（ペントバルビタール、１５０mg/kg、ｉ．ｐ．）で安楽死させ、完全な拡散を確認するために，ミニポンプの重量を測定した。
浸透圧ミニポンプ（Alzet）を、イソフルラン（１％）で麻酔されたマウスの皮下に埋め込んだ。ポンプにＩＳＯ又は無菌生理食塩水を満たし、ＩＳＯを６０mg/kg/日で１４日間送るように設定して、心肥大を誘引させた。ＡＭ－００１処置（１０mg/kg/日、１０％ ＤＭＳＯ／２０％ Kolliphor／７０％ 無菌生理食塩水中で希釈）をＩＳＯ注入の３日目から与える。続けて、マウスをバルビツラート過剰用量（ペントバルビタール、１５０mg/kg、ｉ．ｐ．）で安楽死させ、完全な拡散を確認するために，ミニポンプの重量を測定した。
【0090】
心エコー検査
心エコー検査を軽く麻酔され（空気中１％ イソフルラン）、加熱パッド上に置かれたマウスに行った。左心室寸法を、Vevo2100 ivid7エコーグラフ及び４０１４MHzトランスデューサー（M550i13L、VisualsonicsGE Healthcare）を使用して、乳頭筋の中心室レベルでの傍胸骨短軸ビューからのＴｉｍｅＭｏｕｖｅｍｅｎｔモード取得中に得た。画像を移し、VevolabソフトウェアEchoPAC（GE Healthcare）により、オフラインで分析した。オペレーターは、マウスの処置群遺伝子型に対して盲検とした。
心エコー検査を軽く麻酔され（空気中１％ イソフルラン）、加熱パッド上に置かれたマウスに行った。左心室寸法を、Vevo2100 ivid7エコーグラフ及び４０１４MHzトランスデューサー（M550i13L、VisualsonicsGE Healthcare）を使用して、乳頭筋の中心室レベルでの傍胸骨短軸ビューからのＴｉｍｅＭｏｕｖｅｍｅｎｔモード取得中に得た。画像を移し、VevolabソフトウェアEchoPAC（GE Healthcare）により、オフラインで分析した。オペレーターは、マウスの処置群遺伝子型に対して盲検とした。
【0091】
線維症の判定
心臓を厚み１０μmで横方向に切断し、４％ パラホルムアルデヒドで固定し、Sirius Redで染色した。スライドをNanoZoomer（Hamamatsu v1.2）でスキャンし、線維症をSirius Redによる陽性染色面積として測定し、ImageJソフトウェア（RSB）を使用して、％ 総面積として表現した。
心臓を厚み１０μmで横方向に切断し、４％ パラホルムアルデヒドで固定し、Sirius Redで染色した。スライドをNanoZoomer（Hamamatsu v1.2）でスキャンし、線維症をSirius Redによる陽性染色面積として測定し、ImageJソフトウェア（RSB）を使用して、％ 総面積として表現した。
【0092】
ヘマトキシリン及びエオシン染色
心臓を回収し、４％ パラホルムアルデヒド中で固定し、脱水し、OCT組織包埋コンパウンド（Tissue Tek, EMS）中に包埋した。長手方向切断を厚み１０μmで行い、組織学的検査のためにヘマトキシリン及びエオシンにより染色した。
心臓を回収し、４％ パラホルムアルデヒド中で固定し、脱水し、OCT組織包埋コンパウンド（Tissue Tek, EMS）中に包埋した。長手方向切断を厚み１０μmで行い、組織学的検査のためにヘマトキシリン及びエオシンにより染色した。
【0093】
肝毒性分析
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）を血清中で測定して、ScienCell Research Laboratoriesから購入した特定のキットを使用して、製造メーカーの説明書に従って細胞毒性を決定した。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）を血清中で測定して、ScienCell Research Laboratoriesから購入した特定のキットを使用して、製造メーカーの説明書に従って細胞毒性を決定した。
【0094】
データ分析
データを平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表現する。定量変数の差異を、一元配置又は二元配置分散分析、続けて、Graphpad Prismを使用するＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正事後検定により調べた。統計的有意差は、ｐ＜０．０５に設定した。ＥＣ５０値及びＩＣ５０値を、３パラメータ用量応答モデルに従って計算し、Graphpad Prismを使用して、余分な二乗和（ｅｘｔｒａ ｓｕｍ－ｏｆ ｓｑｕａｒｅ）Ｆ検定に基づいて比較した。
データを平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表現する。定量変数の差異を、一元配置又は二元配置分散分析、続けて、Graphpad Prismを使用するＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正事後検定により調べた。統計的有意差は、ｐ＜０．０５に設定した。ＥＣ５０値及びＩＣ５０値を、３パラメータ用量応答モデルに従って計算し、Graphpad Prismを使用して、余分な二乗和（ｅｘｔｒａ ｓｕｍ－ｏｆ ｓｑｕａｒｅ）Ｆ検定に基づいて比較した。
【0095】
Ｂ－結果
１．ｃＡＭＰのためのＥｐａｃ１ベースのＢＲＥＴセンサーの阻害
ＣＡＭＹＥＬは、Ｅｐａｃ１－ＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）センサー（Jiang LI, Collins J, Davis R, Lin KM, DeCamp D, Roach T, Hsueh R, Rebres RA, Ross EM, Taussig R, Fraser I, Sternweis PC (2007) Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J Biol Chem 282(14):10576-10584）に基づく確立されたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系であり、様々な社内化学物質コレクションをスクリーニングするのに使用されている。ＣＡＭＹＥＬプローブは、ウミシイタケルシフェラーゼとシトリン（ｃｉｔｒｉｎｅ）との間に挿入されたＥｐａｃ１から構成され、Ｅｐａｃ１活性化を評価するための手段として、ｃＡＭＰの結合時に誘引されるＥｐａｃ１のコンホーメーション変化を利用する。ｃＡＭＰが結合すると、Ｅｐａｃ１は、シトリンから離れるシフェラーゼによるエネルギー移動の減少をもたらすコンホーメーション変化を受ける。
１．ｃＡＭＰのためのＥｐａｃ１ベースのＢＲＥＴセンサーの阻害
ＣＡＭＹＥＬは、Ｅｐａｃ１－ＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）センサー（Jiang LI, Collins J, Davis R, Lin KM, DeCamp D, Roach T, Hsueh R, Rebres RA, Ross EM, Taussig R, Fraser I, Sternweis PC (2007) Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J Biol Chem 282(14):10576-10584）に基づく確立されたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系であり、様々な社内化学物質コレクションをスクリーニングするのに使用されている。ＣＡＭＹＥＬプローブは、ウミシイタケルシフェラーゼとシトリン（ｃｉｔｒｉｎｅ）との間に挿入されたＥｐａｃ１から構成され、Ｅｐａｃ１活性化を評価するための手段として、ｃＡＭＰの結合時に誘引されるＥｐａｃ１のコンホーメーション変化を利用する。ｃＡＭＰが結合すると、Ｅｐａｃ１は、シトリンから離れるシフェラーゼによるエネルギー移動の減少をもたらすコンホーメーション変化を受ける。
【0096】
「ＡＭ－００１」とも名付けられた化合物１は、３－アミノ－Ｎ－（４－フルオロフェニル）－４－フェニル－６－（チオフェン－２－イル）チエノ［２，３－ｂ］ピリジン－２－カルボキサミドであり、ｃＡＭＰ誘引ＣＡＭＹＥＬコンホーメーション変化の新規な阻害剤として特定されている。ＡＭ－００１（２０μM）は、以前の実験において標準として使用されたＥｐａｃ１非競合的阻害剤である（Ｒ）－ＣＥ３Ｆ４（２０μM）と同オーダーで、１００μM ｃＡＭＰにより誘引されるＢＲＥＴ変化を阻害した（約５０％減少）（図１）。ＡＭ－００１により、ＢＲＥＴ最大応答は、濃度依存的に低下したが、最大半量応答を与えたｃＡＭＰの有効濃度は低下しなかった（ＥＣ５０＝３０．７±１．０μM）（図２）。さらに、ｃＡＭＰの濃度上昇によっては、ＡＭ－００１の最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）は変化しなかった（５３．７±１．０μM）。このことは、ＡＭ－００１がＥｐａｃ１の非競合的阻害剤として挙動することを示唆している（図３）。
【0097】
２．ＡＭ－００１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＥｐａｃ１触媒活性を阻害するが、Ｅｐａｃ２触媒活性は阻害しない
次に、ＡＭ－００１の効果を、Ｅｐａｃ ＧＥＦ活性アッセイ（Courilleau D, Bisserier M, Jullian JC, Lucas A, Bouyssou P, Fischmeister R, Blondeau JP, Lezoualc'h F (2012) Identification of a tetrahydroquinoline analog as a pharmacological inhibitor of the cAMP-binding protein Epac. J Biol Chem 287:44192-44202）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＥｐａｃ１及びＥｐａｃ２の触媒活性について調査した。この方法は、過剰の非蛍光ＧＤＰの存在下でのリコンビナントＲａｐ１からの蛍光ｂ－ＧＤＰのＥｐａｃ刺激解離に基づいている。蛍光の減衰の初速度は、交換活性を反映している。まず、本発明者らは、ＡＭ－００１の物理化学的性質がＥｐａｃ ＧＥＦアッセイに適合するかどうかを分析した。本発明者らは、ＡＭ－００１吸光度と濃度との間の線形相関を見出した。このことは、ＡＭ－００１が交換反応バッファー中において、６０μMまで可溶性であることを示している。加えて、種々の濃度でのＡＭ－００１のＵＶスペクトルから、この化合物は、ｂＧＤＰの蛍光励起／発光ウィンドウにおいて吸収しないことが示しされた。重要なことに、ｂＧＤＰの発光蛍光強度は、ＡＭ－００１を６０μMまでの濃度で使用した場合に影響を受けなかった。まとめると、これらのデータから、ＡＭ－００１の物理化学的性質は、Ｅｐａｃ ＧＥＦアッセイに適合していることが示された。
次に、ＡＭ－００１の効果を、Ｅｐａｃ ＧＥＦ活性アッセイ（Courilleau D, Bisserier M, Jullian JC, Lucas A, Bouyssou P, Fischmeister R, Blondeau JP, Lezoualc'h F (2012) Identification of a tetrahydroquinoline analog as a pharmacological inhibitor of the cAMP-binding protein Epac. J Biol Chem 287:44192-44202）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＥｐａｃ１及びＥｐａｃ２の触媒活性について調査した。この方法は、過剰の非蛍光ＧＤＰの存在下でのリコンビナントＲａｐ１からの蛍光ｂ－ＧＤＰのＥｐａｃ刺激解離に基づいている。蛍光の減衰の初速度は、交換活性を反映している。まず、本発明者らは、ＡＭ－００１の物理化学的性質がＥｐａｃ ＧＥＦアッセイに適合するかどうかを分析した。本発明者らは、ＡＭ－００１吸光度と濃度との間の線形相関を見出した。このことは、ＡＭ－００１が交換反応バッファー中において、６０μMまで可溶性であることを示している。加えて、種々の濃度でのＡＭ－００１のＵＶスペクトルから、この化合物は、ｂＧＤＰの蛍光励起／発光ウィンドウにおいて吸収しないことが示しされた。重要なことに、ｂＧＤＰの発光蛍光強度は、ＡＭ－００１を６０μMまでの濃度で使用した場合に影響を受けなかった。まとめると、これらのデータから、ＡＭ－００１の物理化学的性質は、Ｅｐａｃ ＧＥＦアッセイに適合していることが示された。
【0098】
種々の濃度のＳｐ－８－ＣＰＴ（８－（４－クロロフェニルチオ）－２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’，５’－環状モノホスホロチオアート、Ｓｐ－異性体）（強力なＰＤＥ抵抗性膜透過型Ｅｐａｃアゴニスト）での交換の初速度の測定から、Ｅｐａｃ１及びＥｐａｃ２それぞれについて、７．５±１．１μM及び５．６±１．１μMのＥＣ５０値が与えられた。加えて、ｃＡＭＰ ＥＣ５０値は、Ｅｐａｃ１及びＥｐａｃ２それぞれについて、１３．１±１．１μM及び２．８±１．１μMであった。その結果、Ｅｐａｃ１の見かけの親和性は、ｃＡＭＰよりＳｐ－８－ＣＰＴの方が１．７倍高く、Ｓｐ－８－ＣＰＴ活性化Ｅｐａｃ１のＶｍａｘは、ｃＡＭＰ活性化Ｅｐａｃ１のＶｍａｘより２．５倍高かった。対照的に、Ｅｐａｃ２の見かけの親和性は、Ｓｐ－８－ＣＰＴよりｃＡＭＰの方が２倍高く、ｃＡＭＰ活性化Ｅｐａｃ２のＶｍａｘは、Ｓｐ－８－ＣＰＴ活性化Ｅｐａｃ２のＶｍａｘより１．３倍高かった。したがって、Ｓｐ－８－ＣＰＴの飽和濃度（３０μM）を、その後の阻害実験に選択した。両Ｅｐａｃイソフォームともに、３０μM Ｓｐ－８－ＣＰＴの存在下において、蛍光の急速な減少を誘引した（図４及び図６）。以前に報告されたように、アゴニスト（３０μM Ｓｐ－８－ＣＰＴ）により誘引されたＥｐａｃ１の交換活性は、（Ｒ）－ＣＥ３Ｆ４（２０μM）により低下した（図４及び図５）。ＡＭ－００１により、Ｅｐａｃ１ ＧＥＦ活性が阻害されたが（図４、図５及び図８）、Ｅｐａｃ２ ＧＥＦ活性に対する阻害効果はなかった（図６、図７及び図８）。飽和濃度のＳｐ－８－ＣＰＴの存在下において、ＡＭ－００１ ＩＣ５０値は、Ｅｐａｃ１については４８．５±１．０μMであったが、Ｅｐａｃ２については定量できなかった（ＩＣ５０＞＞１０００μM）。このことは、ＡＭ－００１がＥｐａｃ２ ＧＥＦ活性をサプレッションするのに無効であったことを示している（図７）。同様の結果（Ｅｐａｃ１についてのＡＭ－００１ ＩＣ５０＝４７．８±１．１μM対Ｅｐａｃ２についてのＩＣ５０＞＞１０００μM）を各ＥｐａｃアイソフォームについてのＥＣ５０に対応する濃度のＳｐ－８－ＣＰＴを使用して得た。ＡＭ－００１によるＥｐａｃ１阻害のＩＣ５０が、アゴニスト濃度とは無関係であったという事実から、ＡＭ－００１の非競合的挙動が確認された。加えて、ＡＭ－００１により、濃度依存的に最大Ｅｐａｃ１ ＧＥＦ活性が低下したが、Ｓｐ－８－ＣＰＴのＥＣ５０は低下しなかった。これらの結果から、ＡＭ－００１がＢＲＥＴセンサー実験により既に示唆されているように、Ｅｐａｃ１非競合的阻害剤として作用することが確認された（図２及び図３）。
【0099】
また、本発明者らは、ＡＭ－００１（３０μM）が１０μM ｃＡＭＰの存在下及び非存在下において、Ｉ型及びＩＩ型ＰＫＡホロ酵素活性化に影響を及ぼさず、Ｅｐａｃ１に対するこの化合物の特異性をさらに強化することも見出した。最後に、タンパク質変性のモニタリングを可能にする熱シフトアッセイを使用して、ＡＭ－００１の添加により、アゴニストであるＳｐ－８－ＣＰＴが存在するか否かにかかわらず、漸増濃度のＡＭ－００１の存在下において、Ｅｐａｃ１の融解温度Ｔｍ（熱変性の中間点と定義される）は変化しないことが観察された。それにより、ＡＭ－００１の任意の非特異的タンパク質変性作用を除外する。
【0100】
３．Ｅｐａｃ１活性化に対するＡＭ－００１誘導体の特異性
ついで、いくつかの市販のＡＭ－００１の類似体又は誘導体を、ＣＡＭＹＥＬアッセイ系を使用して、Ｅｐａｃ１活性化に対するそれらの阻害作用について研究した。
ついで、いくつかの市販のＡＭ－００１の類似体又は誘導体を、ＣＡＭＹＥＬアッセイ系を使用して、Ｅｐａｃ１活性化に対するそれらの阻害作用について研究した。
【0101】
式（Ｉ）で示される化合物についての結果を以下の表１に示す。
【表1】
【0102】
フッ素原子をＮ－フェニル基から４－フェニル基に交換すること（ＡＭ－００５）と、これらのフェニル基にフッ素原子が何ら存在しないこと（ＡＭ－００４）とは、化合物の阻害効力に顕著な影響を及ぼさなかった。４－フェニル基を欠く（ＡＭ－００９）又はＮ－フェニル基（ＡＭ－００６）を欠く化合物の阻害活性は低下したが、消失はしなかった。一方、Ｎ－イソプロピル基によるＮ－フェニル基の置換（ＡＭ－００３）により、阻害効果が消失した。ＡＭ－０１０の低い活性から、阻害活性には６－チエニル基の存在が重要であることが指摘される。最後に、顕著な阻害活性は、ＡＭ－００２では観察されなかった。ＡＭ－００２は、２－カルボキサミド結合が自由に回転できず、ＡＭ－００１の第一級アミノ基が追加のチエノ［３，２－ｄ］ピリミジン足場に関与する化合物である。この予備的構造活性研究から、フェニル基及び６－チエニル基が、その阻害活性を発揮するために、ＡＭ－００１に必須であることが示された。したがって、これらのデータから、ｃＡＭＰ誘引Ｅｐａｃ１コンホーメーション変化を減少させる能力において、この化合物ファミリーには化学的特異性があることが示された。
【0103】
４．ＡＭ－００１は、培養細胞においてＥｐａｃ１シグナル伝達を阻害する
ＡＭ－００１により、新生仔ラット心室筋細胞を含む種々のタイプの培養細胞において明らかな細胞傷害性は示されなかった。ＡＭ－００１が培養細胞において効率的なＥｐａｃ１アイソフォーム特異的アンタゴニストであることを確認するために、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞において、Ｅｐａｃ下流エフェクターであるＲａｐ１の活性化を遮断するその能力をさらに試験した（図９～図１３）。この細胞系統は、異所的に発現されたＥｐａｃ１及びＥｐａｃ２アイソフォームの細胞シグナル伝達に対するＥｐａｃ薬理学的モデュレーターの評価に一般的に使用されている。高度に膜透過性で代謝活性化可能なＥｐａｃアゴニストである８－ＣＰＴ－ＡＭ（８－（４－クロロフェニルチオ）－２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’，５’－環状モノホスファート，アセトキシメチルエステル）により、Ｅｐａｃ１を過剰発現する細胞において、Ｒａｐ１の堅牢な活性化が誘引された。Ｅｐａｃ１ ＢＲＥＴセンサー及びＥｐａｃ１交換反応によりｉｎ ｖｉｔｒｏで得られたデータと一致して、ＡＭ－００１により、Ｅｐａｃ１誘引Ｒａｐ１活性化が阻害されたが、不活性類似体であるＡＭ－００２及びＡＭ－００３では阻害されなかった（図９～図１１）。次に、本発明者らは、２つのＥｐａｃ２スプライス変異体であるＥｐａｃ２Ａ及びＥｐａｃ２Ｂに対する８－ＣＰＴ－ＡＭの効果を調査した（図１２～図１３）。以前に特徴付けられた特異的Ｅｐａｃ２阻害剤であるＥＳＩ－０５（Tsalkova T, Mei FC, Cheng X (2012) A Fluorescence-Based High-Throughput Assay for the Discovery of Exchange Protein Directly Activated by Cyclic AMP (EPAC) Antagonists. PLoS One 7(1): e30441）とは対照的に、ＡＭ－００１により、Ｅｐａｃ２Ａ誘引Ｒａｐ１活性化は阻害されなかった（図１２）。さらに、ＡＭ－００１は、Ｅｐａｃ２Ｂトランスフェクション細胞において、Ｓ－２２０により誘引されるＲａｐ１－ＧＴＰ量の増加を阻害する効果がなかった。全体として、これらのデータから、ＡＭ－００１は、培養細胞におけるＥｐａｃ１誘引Ｒａｐ１活性化の防止に効率的かつ特異的であることが示された。
ＡＭ－００１により、新生仔ラット心室筋細胞を含む種々のタイプの培養細胞において明らかな細胞傷害性は示されなかった。ＡＭ－００１が培養細胞において効率的なＥｐａｃ１アイソフォーム特異的アンタゴニストであることを確認するために、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞において、Ｅｐａｃ下流エフェクターであるＲａｐ１の活性化を遮断するその能力をさらに試験した（図９～図１３）。この細胞系統は、異所的に発現されたＥｐａｃ１及びＥｐａｃ２アイソフォームの細胞シグナル伝達に対するＥｐａｃ薬理学的モデュレーターの評価に一般的に使用されている。高度に膜透過性で代謝活性化可能なＥｐａｃアゴニストである８－ＣＰＴ－ＡＭ（８－（４－クロロフェニルチオ）－２’－Ｏ－メチルアデノシン－３’，５’－環状モノホスファート，アセトキシメチルエステル）により、Ｅｐａｃ１を過剰発現する細胞において、Ｒａｐ１の堅牢な活性化が誘引された。Ｅｐａｃ１ ＢＲＥＴセンサー及びＥｐａｃ１交換反応によりｉｎ ｖｉｔｒｏで得られたデータと一致して、ＡＭ－００１により、Ｅｐａｃ１誘引Ｒａｐ１活性化が阻害されたが、不活性類似体であるＡＭ－００２及びＡＭ－００３では阻害されなかった（図９～図１１）。次に、本発明者らは、２つのＥｐａｃ２スプライス変異体であるＥｐａｃ２Ａ及びＥｐａｃ２Ｂに対する８－ＣＰＴ－ＡＭの効果を調査した（図１２～図１３）。以前に特徴付けられた特異的Ｅｐａｃ２阻害剤であるＥＳＩ－０５（Tsalkova T, Mei FC, Cheng X (2012) A Fluorescence-Based High-Throughput Assay for the Discovery of Exchange Protein Directly Activated by Cyclic AMP (EPAC) Antagonists. PLoS One 7(1): e30441）とは対照的に、ＡＭ－００１により、Ｅｐａｃ２Ａ誘引Ｒａｐ１活性化は阻害されなかった（図１２）。さらに、ＡＭ－００１は、Ｅｐａｃ２Ｂトランスフェクション細胞において、Ｓ－２２０により誘引されるＲａｐ１－ＧＴＰ量の増加を阻害する効果がなかった。全体として、これらのデータから、ＡＭ－００１は、培養細胞におけるＥｐａｃ１誘引Ｒａｐ１活性化の防止に効率的かつ特異的であることが示された。
【0104】
５．ＡＭ－００１は、虚血－再潅流（Ｉ／Ｒ）傷害を防止する
次に、本発明者らは、ＡＭ－００１が生理学的に関連する系において、Ｅｐａｃ１の活性に影響を及ぼすことができるかどうかを試験した。Ｅｐａｃ１の遺伝子除去が、虚血状態中の心筋細胞死を防止することが以前に示されている（Fazal L, Laudette M, Paula-Gomes S, Pons S, Conte C, Tortosa F, Sicard P, Sainte-Marie Y, Bisserier M, Lairez O, Lucas A, Roy J, Ghaleh B, Fauconnier J, Mialet-Perez J, Lezoualc'h F (2017) Multifunctional Mitochondrial Epac1 Controls Myocardial Cell Death. Circ Res 120(4):645-657）。本発明者らは、低酸素－再酸素化（ＨＸ＋Ｒ）傷害に対するＡＭ－００１の潜在的保護作用を試験した。対照細胞と比較して、ＡＭ－００１により、ＨＸ＋Ｒ条件におけるＬＤＨ放出によりアッセイされるように、心筋細胞生存が顕著に増加した（図１４）。さらに、ＡＭ－００１により、膜透過型Ｅｐａｃ１特異的アゴニストである８－ｐＣＰＴ－２’－Ｏ－ＭｅｃＡＭＰ－ＡＭ（８－ＣＰＴ－ＡＭ）の心筋細胞死及び肥大に対する作用が阻害された（図１４）。このことは、ＡＭ－００１のＥｐａｃ１有害作用に対抗する能力を強調している。
次に、本発明者らは、ＡＭ－００１が生理学的に関連する系において、Ｅｐａｃ１の活性に影響を及ぼすことができるかどうかを試験した。Ｅｐａｃ１の遺伝子除去が、虚血状態中の心筋細胞死を防止することが以前に示されている（Fazal L, Laudette M, Paula-Gomes S, Pons S, Conte C, Tortosa F, Sicard P, Sainte-Marie Y, Bisserier M, Lairez O, Lucas A, Roy J, Ghaleh B, Fauconnier J, Mialet-Perez J, Lezoualc'h F (2017) Multifunctional Mitochondrial Epac1 Controls Myocardial Cell Death. Circ Res 120(4):645-657）。本発明者らは、低酸素－再酸素化（ＨＸ＋Ｒ）傷害に対するＡＭ－００１の潜在的保護作用を試験した。対照細胞と比較して、ＡＭ－００１により、ＨＸ＋Ｒ条件におけるＬＤＨ放出によりアッセイされるように、心筋細胞生存が顕著に増加した（図１４）。さらに、ＡＭ－００１により、膜透過型Ｅｐａｃ１特異的アゴニストである８－ｐＣＰＴ－２’－Ｏ－ＭｅｃＡＭＰ－ＡＭ（８－ＣＰＴ－ＡＭ）の心筋細胞死及び肥大に対する作用が阻害された（図１４）。このことは、ＡＭ－００１のＥｐａｃ１有害作用に対抗する能力を強調している。
【0105】
ついで、ＡＭ－００１の急性投与の治療効力を急性心筋Ｉ／Ｒ傷害のマウスモデルで調査した。ＡＭ－００１（８mg/kg）又は媒体の単回ボーラスを再潅流の５分前に静脈内注射した。リスク領域に対する梗塞サイズの比は、ＡＭ－００１処置動物において、媒体処置マウスのそれ（５０±３％）と比較して、有意に小さくなった（３６±３％）（図１５）。興味深いことに、（Ｒ）－ＣＥ３Ｆ４は、ＢＲＥＴセンサーアッセイにおいて、ＡＭ－００１よりＩＣ５０が低く、種々の細胞モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＥｐａｃ１依存性生物学的作用を効率的かつ選択的に阻害することが示されていたが、この阻害剤（８mg/kg 体重）では、梗塞サイズを小さくすることができなかった。このことは、ＣＥ３Ｆ４が、ＡＭ－００１と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏでのバイオアベイラビリティが劣る可能性があることを示唆している（図１６）。まとめると、これらの結果から、ＡＭ－００１の急性注射は、心筋再潅流傷害を予防するのに効率的であることが実証される。
【0106】
６．ＡＭ－００１により、慢性β－ＡＲ活性化中の心機能が改善された
次に、本発明者らは、ＡＭ－００１が慢性β－ＡＲ活性化中の心機能の改善及びリモデリングを提供できるかどうかを決定するのを試みた。この目的で、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＡＭ－００１（１０mg/kg ｉ．ｐ．３日目から１４日目）又はその媒体の存在下において、非選択的β－ＡＲアゴニストであるイソプロテレノール（ＩＳＯ）（６０mg/kg/日）又は媒体のいずれかで１４日間処置した。ＡＭ－００１処置マウスからの肝臓及び腎臓組織サンプルは、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色により実証されたように、明らかな組織学的変化を何ら示さなかった。加えて、肝毒性を示すアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血漿濃度は、各群で同等であった（図１７）。さらに、左心室内径短縮率（ＦＳ）及び脛骨長に対する左心室重量（ＬＶＷ）の比（ＬＶＷ／ＴＬ）並びに心拍数は、媒体処置マウス及びＡＭ－００１処置マウスにおいて、ベースライン時と同様であった（図１８）。したがって、ＡＭ－００１の慢性注射は、動物において毒性作用を示さず、使用された実験条件下では、基礎心機能を変化させなかった。
次に、本発明者らは、ＡＭ－００１が慢性β－ＡＲ活性化中の心機能の改善及びリモデリングを提供できるかどうかを決定するのを試みた。この目的で、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＡＭ－００１（１０mg/kg ｉ．ｐ．３日目から１４日目）又はその媒体の存在下において、非選択的β－ＡＲアゴニストであるイソプロテレノール（ＩＳＯ）（６０mg/kg/日）又は媒体のいずれかで１４日間処置した。ＡＭ－００１処置マウスからの肝臓及び腎臓組織サンプルは、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色により実証されたように、明らかな組織学的変化を何ら示さなかった。加えて、肝毒性を示すアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血漿濃度は、各群で同等であった（図１７）。さらに、左心室内径短縮率（ＦＳ）及び脛骨長に対する左心室重量（ＬＶＷ）の比（ＬＶＷ／ＴＬ）並びに心拍数は、媒体処置マウス及びＡＭ－００１処置マウスにおいて、ベースライン時と同様であった（図１８）。したがって、ＡＭ－００１の慢性注射は、動物において毒性作用を示さず、使用された実験条件下では、基礎心機能を変化させなかった。
【0107】
ＩＳＯの慢性注入により、対照媒体と比較して、ＬＶＷ／ＴＬ比が有意に大きくなった（図１８）。逆に、アドレナリン作動性ストレスの開始３日後でのＡＭ－００１の注射により、このパラメータはさらに低下した（図１８）。加えて、線維化は、ＡＭ－００１処置マウスにおいて大きく減少した（１．１±０．５％ｖｓ媒体＋ＩＳＯ処置マウスにおける３．０±１．１％）（図１９）。重要なことに、１４日間のＩＳＯ注入後、ＡＭ－００１の効果は、心機能の改善と関連していた。このことは、ＡＭ－００１処置マウスにおけるＦＳが媒体処置マウスにおけるより高かったことにより実証されている（図２０、上部パネル）。一貫して、ＩＳＯ処置中にＡＭ－００１存在下で観察されたこのより良好な収縮性は、左心室収縮末期内径（ＬＶＩＤ）及び左心室拡張末期内径（ＬＶＩＤｄ）が小さくなることと相関していた（図２０、下部パネル）。最後に、本発明者らは、ＡＭ－００１がＧプロテインレセプターキナーゼ２（ＧＲＫ２）及びＧＲＫ５の発現レベルを変化させることができるかどうかを調査した。実際に、これらの両ＧＲＫにより、β－ＡＲが脱感作し、心臓ストレス状態におけるそのアップレギュレーションは、有害なリモデリング及び収縮機能不全に関与する（２４）。予想どおり、ＩＳＯ処理により、ＧＲＫ２及びＧＲＫ５発現が増加した（図２１）。興味深いことに、ＧＲＫ５のアップレギュレーションは、ＡＭ－００１処置動物において、顕著に低下したが、ＧＲＫ２のアップレギュレーションは低下しなかった。
【0108】
まとめると、これらのデータから、ＡＭ－００１により、β－ＡＲの慢性的な活性化に応答して、心肥大及び線形症が緩和され、おそらく、β－ＡＲ応答性の回復を通じて心機能が改善されることが示されている。
【0109】
まとめると、これらの結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で機能するＥｐａｃ１の特異的薬理学的阻害剤としての新規なチエノ［２，３－ｂ］ピリジン類似体の特定に関する。これらのことは、この化合物がＥｐａｃ１によりレギュレーションされるシグナル伝達経路に関連する生理学的及び病理学的プロセスを探索するための価値ある薬理学的ツールであるだけでなく、関連するヒト疾患のための新規な分子治療剤（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）として開発される大きな可能性を有することを示している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】