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特許7445657オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症を処置するための組成物および方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-02-28

(45)【発行日】2024-03-07

(54)【発明の名称】オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症を処置するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

C12N 15/54 20060101AFI20240229BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20240229BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20240229BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20240229BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20240229BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20240229BHJP

C12N 9/10 20060101ALI20240229BHJP

A61K 38/43 20060101ALI20240229BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20240229BHJP

A61P 3/00 20060101ALI20240229BHJP

A61P 7/00 20060101ALI20240229BHJP

【ＦＩ】

C12N15/54 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/19

C12N1/15

C12N1/21

C12N5/10

C12N9/10

A61K38/43

A61K48/00

A61P3/00

A61P7/00

【請求項の数】 21

(21)【出願番号】P 2021531945

(86)(22)【出願日】2019-12-05

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-09

(86)【国際出願番号】 US2019064786

(87)【国際公開番号】W WO2020118115

(87)【国際公開日】2020-06-11

【審査請求日】2022-12-02

(31)【優先権主張番号】62/776,302

(32)【優先日】2018-12-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】513269893

【氏名又は名称】アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＡｒｃｔｕｒｕｓＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江雄介

(72)【発明者】

【氏名】ペレス－ガルシア，カルロスジー

(72)【発明者】

【氏名】立川清

(72)【発明者】

【氏名】松田大輝

(72)【発明者】

【氏名】チブクラ，パドマナブ

【審査官】福間信子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／２１８５２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／１３８３４８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／０１７５１９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／１１８６９７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１４／１７０８９６（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０１８／１２７３８２（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号４のアミノ酸配列を含み、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）酵素活性を有するＯＴＣタンパク質。

【請求項2】

請求項１に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

【請求項3】

配列番号４をコードする最適化コード領域を含む、請求項２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項4】

ＤＮＡである、請求項３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項5】

ｍＲＮＡである、請求項３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項6】

（ａ）非ヒト５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）；または
（ｂ）シロイヌナズナによって発現される遺伝子に由来する５’ＵＴＲ；または
（ｃ）配列番号６、配列番号１２５～１２７、または配列番号２３０～２５０の配列を含む５’ＵＴＲ；または
（ｄ）配列番号６の配列を含む５’ＵＴＲ；または
（ｅ）マウスベータグロビン、ヒトＩＬ－６、アラニンアミノトランスフェラーゼ１、ヒトアポリポタンパク質Ｅ、ヒトフィブリノーゲンアルファ鎖、ヒトトランスサイレチン、ヒトハプトグロビン、ヒトアルファ－１－アンチキモトリプシン、ヒトアンチトロンビン、ヒトアルファ－１－アンチトリプシン、ヒトアルブミン、ヒトベータグロビン、ヒト補体Ｃ３、ヒト補体Ｃ５、ＳｙｎＫ（シアノバクテリア、シネコシスティス属の種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ．）由来のチラコイドカリウムチャネルタンパク質）、マウスアルブミン、またはタバコエッチウイルスの５’ＵＴＲ配列から選択される配列を含む５’ＵＴＲ；または
（ｆ）マウスベータグロビンの５’ＵＴＲ配列を含む５’ＵＴＲ；または
（ｇ）３’ポリＡテール；または
（ｈ）約６０個の連続アデニンヌクレオチドから約１２５個の連続アデニンヌクレオチドを含む３’ポリＡテール；または
（ｉ）約１００個の連続アデニンヌクレオチドから約１２５個の連続アデニンヌクレオチドを含む３’ポリＡテール、
を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項7】

（ａ）３’ＵＴＲ；または
（ｂ）配列番号２１、１６、１７、１８、１９、２０または２２の配列を含む、３’ＵＴＲ；または
（ｃ）配列番号２３のコザック配列または配列番号２４の部分的コザック配列；または
（ｄ）５’キャップ；または
（ｅ）以下の構造：

【化1】

を有するｍ７ＧｐｐｐＧｍである５’キャップ、
を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項8】

最適化コード領域が配列番号２２１を含む、請求項４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項9】

（ａ）配列番号１１９の配列；または
（ｂ）配列番号２２１の配列、ここで、ＴはＵに置換されており、ポリヌクレオチドが任意にさらに配列番号６の配列および／または配列番号２１の配列を含む；または
（ｃ）配列番号２５１または２５２の配列、
を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項10】

（ａ）ポリヌクレオチドのコード領域におけるウラシル核酸塩基のパーセンテージが、野生型ＯＴＣ核酸配列におけるウラシル核酸塩基のパーセンテージに対して低減されている；または
（ｂ）ウリジンの１～１００％が修飾ウリジンである；または
（ｃ）ウリジンヌクレオチドの１００％が５－メトキシウリジンである；または
（ｄ）ウリジンヌクレオチドの１００％がＮ^１－メチルシュードウリジンである、
請求項５に記載のポリヌクレオチド。

【請求項11】

（ａ）ウリジンの１～１００％が修飾ウリジンである；または
（ｂ）ウリジンヌクレオチドの１００％が５－メトキシウリジンである；または
（ｃ）ウリジンヌクレオチドの１００％がＮ^１－メチルシュードウリジンである、
請求項９に記載のポリヌクレオチド。

【請求項12】

請求項９または１１に記載のポリヌクレオチドを含む医薬組成物。

【請求項13】

薬学的に許容される担体を含み、薬学的に許容される担体が脂質製剤である、請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

ＯＴＣ欠損症に罹患していると同定された患者におけるＯＴＣ欠損症を処置する方法において使用するための、請求項２～１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２または１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

請求項４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項16】

請求項１５に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。

【請求項17】

配列番号４のアミノ酸配列を有するＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡであって、ｍＲＮＡが配列番号１１９、配列番号２５１または配列番号２５２のポリヌクレオチド配列を有し、コードされたタンパク質がＯＴＣ酵素活性を有する、ｍＲＮＡ。

【請求項18】

（ａ）ウリジンの１～１００％が修飾ウリジンである；または
（ｂ）ウリジンヌクレオチドの１００％が５－メトキシウリジンである；または
（ｃ）ウリジンヌクレオチドの１００％がＮ^１－メチルシュードウリジンである、
請求項１７に記載のｍＲＮＡ。

【請求項19】

請求項１７または１８に記載のｍＲＮＡを含む医薬組成物。

【請求項20】

薬学的に許容される担体を含み、薬学的に許容される担体が脂質製剤である、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

ＯＴＣ欠損症に罹患していると同定された患者におけるＯＴＣ欠損症を処置する方法に使用される、請求項１９に記載の医薬組成物であって、ｍＲＮＡが患者において配列番号４のタンパク質を発現するものである、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月６日に出願された米国仮出願第６２／７７６，３０２号の優先権を主張するものである。この出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含んでおり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１９年１１月２５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名称は０４９３８６＿５２３００１ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、３６３キロバイトのサイズである。

【背景技術】

【0003】

オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）は、哺乳類に存在するミトコンドリア酵素であり、これは有毒アンモニアから生物を解毒する際に不可欠な役割を果たす。ＯＴＣｍＲＮＡは、新生プレペプチドをサイトゾルからミトコンドリアに向け直すのに重要なミトコンドリアシグナル伝達ペプチド（ＭＳＰ）を有する。ＯＴＣタンパク質は、サイトゾルにおいて前駆体として存在しており、ＭＳＰの存在によってプロペプチドがミトコンドリアに再指示され、そこでシグナルペプチドの除去および機能性タンパク質のミトコンドリアマトリックスへのデリバリーが行われる。ＯＴＣは、肝細胞で生じる代謝プロセスであり、尿素サイクルとして公知のプロセスである、タンパク質の分解および体外へのアンモニアの排出を担う６つの酵素のうちの１つである。ＯＴＣは、カルバモイルリン酸とオルニチンをシトルリンに変換することに関与している。

【0004】

ＯＴＣ酵素の欠損により、血液中に窒素がアンモニアの形態で過剰に蓄積する（高アンモニア血症）。神経毒素である過剰アンモニアは、中枢神経系に血液を介して移動し、ＯＴＣ欠損症に関連する症状および身体所見をもたらす。これらの症状には、嘔吐、食欲不振、進行性無気力、または昏睡が含まれる。処置せずに放置した場合、高アンモニア血症のエピソードが昏睡および生命にかかわる合併症に進行する可能性がある。

【0005】

ＯＴＣ欠損症の重症度および発症年齢は、同じ家族内であっても人によって異なる。この障害の重度の形態は、生後まもない（新生児期）一部の乳児、典型的には男性に影響を及ぼす。より軽度の障害が乳児期以降の一部の子供に影響を及ぼす。男性および女性の両方とも、幼年期にＯＴＣ欠損症の症状を発症し得る。現在、ＯＴＣ欠損症の処置は、過剰アンモニアが生成されるのを防ぐこと、または高アンモニア血症のエピソード中に過剰アンモニアを除去することを目的としている。ＯＴＣ欠損症の長期療法は、食事制限と、窒素を体内から変換および排出する代替方法（代替経路療法）の促進を組み合わせている。

【0006】

ＯＴＣ欠損症の人の食事制限は、過剰アンモニアの発生を回避するために、タンパク質の摂取量を制限することを目的としている。しかし、罹患した乳児が確実に適切な成長を遂げるには、十分なタンパク質を摂取する必要がある。ＯＴＣ欠損症の乳児には、必須アミノ酸が補充された低タンパク質、高カロリーの食事が与えられる。

【0007】

ＯＴＣ欠損症の人は、食事制限に加えて、体内からの窒素の排出を刺激する医薬によって処置される。これらの医薬は、尿素サイクルの代替方法を提供し、窒素廃棄物を変換および除去する。これらの医薬は、多くの患者が口にすることができず、多くの場合、腹壁から胃に入れるチューブ（胃瘻チューブ）、または鼻から胃に達する細いチューブ（経鼻胃チューブ）を介して投与される。

【0008】

改善がない場合または高アンモニア血性昏睡が発生した場合は、罹患した個体の血液を機械によって濾過して老廃物を除去すること（血液透析）が必要になり得る。血液透析はまた、高アンモニア血症性昏睡中に初めてＯＴＣ欠損症と診断された乳児、小児、成人の処置にも使用される。

【0009】

いくつかの場合には、肝移植が適切な処置の選択肢となることがある。肝移植は、ＯＴＣ欠損症における高アンモニア血症を治すことができる。しかし、この手術はリスクが高く、術後に合併症が起こり得る。また、肝移植後、患者は生涯にわたって、免疫抑制のために投薬レジメンを受ける必要がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

ＯＴＣ酵素欠損症の処置には、依存として新規のアプローチおよび治療法が必要とされている。例えば、遺伝子治療に関連した課題および制限を克服する戦略が必要とされている。不十分な安定性、ミトコンドリア内での十分なＯＴＣの確保、標的細胞への効率的なデリバリーは、依然として課題である。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本開示は、患者におけるＯＴＣ欠損症を処置するための改善された特性を有する配列番号４の修飾ヒトＯＴＣタンパク質を提供する。配列番号４は、１つまたは複数の予測されるユビキチン化部位を除去してユビキチン化およびユビキチンリガーゼによる分解を受けにくいタンパク質が得られるように野生型ＯＴＣから修飾されている。しかし、配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質は、ヒト野生型ＯＴＣの触媒酵素活性を維持する。予測されるユビキチン化部位の除去は、好ましくは、アスパラギン、アルギニン、ロイシン、リジン、またはフェニルアラニンなどのユビキチン化をサポートすることが判明しているＮ末端残基を、アラニン、グリシン、メチオニン、セリン、スレオニン、バリン、プロリンなどのユビキチン化に対して安定化することが判明しているＮ末端残基で置き換えることを含む。この方法において配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質を安定化することは、サイトゾルから酵素活性を発揮するミトコンドリアへの輸送の間、修飾ＯＴＣタンパク質の安定性を維持するために特に有利である。

【0012】

好ましくは、本明細書に記載した配列番号４のタンパク質は、配列番号４のタンパク質をコードする核酸から生成される。核酸は、配列番号４のタンパク質をコードするＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。好ましくは、核酸は、配列番号４の修飾タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む異種ｍＲＮＡコンストラクトである。好ましくは、オープンリーディングフレームは、コドン最適化オープンリーディングフレームである。好ましくは、オープンリーディングフレーム配列は、修飾タンパク質をコードすることが可能な理論的に最小のウリジンを有するように最適化される。好ましくは、異種ｍＲＮＡコンストラクトは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、配列番号４の修飾タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、および３’ポリＡテールを含む。好ましくは、５’ＵＴＲは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）によって発現される遺伝子に由来する。好ましくは、シロイヌナズナによって発現される遺伝子に由来する５’ＵＴＲは、表２で確認される。

【0013】

本開示はまた、配列番号３の野生型ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードする最適化コード領域、または配列番号３の完全長に対して少なくとも９５％同一であり、ＯＴＣタンパク質の酵素活性を有するＯＴＣタンパク質配列を含むｍＲＮＡ（本明細書ではｍＲＮＡコンストラクトまたはｍＲＮＡ配列とも称する）であって、ｍＲＮＡ配列がシロイヌナズナによって発現される遺伝子に由来する５’ＵＴＲを含む、ｍＲＮＡも提供する。

【0014】

本明細書に記載したｍＲＮＡコンストラクトは、本明細書に記載したＯＴＣタンパク質の高効率発現を提供する。発現は、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）、エキソビボ（ｅｘｖｉｖｏ）、またはインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）であり得る。

【0015】

本開示はまた、本明細書に記載したｍＲＮＡ配列を含む医薬組成物、および本明細書に記載したｍＲＮＡ配列を含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することによってオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を処置する方法であって、配列番号３または配列番号４のＯＴＣタンパク質が患者において発現される、方法も提供する。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１Ａ～Ｂは、肝細胞株Ｈｅｐａ１，６（マウス）およびＨｅｐ３Ｂ（ヒト）における２４時間（図１Ａ）および４８時間（図１Ｂ）でのオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質発現を、細胞内ウエスタン（ＩＣＷ）アッセイを使用して示した散布図である。

【0017】

【図2】図２Ａ～Ｂは、ラウンド１の２４時間でＨｅｐａ１，６細胞（図２Ａ）およびＨｅｐ３Ｂ細胞（図２Ｂ）においてスクリーニングされたタンパク質安定性化合物の相関を示す散布図を示す。

【0018】

【図3】図３Ａ～Ｂは、図３Ａおよび図３Ｂに示したように、ラウンド２の２４時間および４８時間でヒト初代肝細胞においてスクリーニングされたタンパク質安定性化合物（ラウンド１に基づいて新たに最適化された化合物）の相関を示す散布図を示す。

【0019】

【図4】図４Ａ～Ｂは、図４Ａおよび図４Ｂに示したように、ラウンド３の２４時間および４８時間でヒト初代肝細胞においてスクリーニングされたタンパク質安定性化合物（ラウンド１および２に基づいて新たに最適化された化合物）の相関を示す散布図を示す。

【0020】

【図5】図５は、リードＯＴＣｍＲＮＡをトランスフェクトしたヒト初代肝細胞におけるＯＴＣタンパク質の発現レベルを示すプロットである。１７９９．１は、配列番号１７５の配列を有するｍＲＮＡであり、配列番号１７５のウリジンの１００％はＮ^１－メチルシュードウリジン（Ｎ１ＭＰＵ）である。

【0021】

【図6】図６Ａ～Ｂは、ヒト特異的ＯＴＣ－ｍＲＮＡエピトープ（図６Ａ）またはマウス特異的ＯＴＣ－ｍＲＮＡエピトープ（図６Ｂ）を１０ｍｇ／ｋｇで投与したｓｐｆ／ａｓｈマウスにおける時間経過によるＯＴＣ発現レベルを示す棒グラフを示す。

【0022】

【図7】図７は、ウリジンの１００％がＮ^１－メチルシュードウリジン（Ｎ１ＭＰＵ）であり、ウリジンの１００％が５－メトキシウリジン（５ＭｅＯＵ）である、２つの異なる化学物質を使用し、ＯＴＣｍＲＮＡを３ｍｇ／ｋｇで投与したｓｐｆ／ａｓｈマウスにおけるＯＴＣ発現レベルを示す棒グラフである。

【0023】

【図8】図８は、２つの異なる化学物質（Ｎ１ＭＰＵおよび５ＭｅＯＵ）を使用し、ＯＴＣ－ｍＲＮＡを３つの異なる用量で投与したＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＯＴＣ発現レベルを示すグラフである。

【0024】

【図9】図９は、ＯＴＣ－ｍＲＮＡ１７９９．７を３つの異なる用量：０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇで投与したｓｐｆ／ａｓｈマウスにおいて測定された尿中オロト酸塩レベルを示すグラフである。１７９９．１は配列番号１７５の配列を有するｍＲＮＡであり、配列番号１７５のウリジンの１００％は５ＭｅＯＵである。

【0025】

【図10】図１０は、２つの異なる化学物質（Ｎ１ＭＰＵおよび５ＭｅＯＵ）を使用し、ＯＴＣ－ｍＲＮＡを１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇで投与したｓｐｆ／ａｓｈマウスにおける９６時間のヒトＯＴＣ発現レベルと尿中オロト酸塩を比較する散布図である。

【0026】

【図11】図１１は、リードＯＴＣ－ｍＲＮＡを１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇで投与したｓｐｆ／ａｓｈマウスにおけるＯＴＣ－ｍＲＮＡのタンパク質発現レベルを示すウエスタンブロットである。

【0027】

【図12】図１２は、リードＯＴＣ－ｍＲＮＡで処置したｓｐｆ／ａｓｈマウスのミトコンドリア画分対サイトゾル画分におけるタンパク質発現レベルを示すウエスタンブロットである。

【0028】

【図13】図１３は、リードＯＴＣ－ｍＲＮＡで処置したｓｐｆ／ａｓｈマウスにおける時間経過による尿中オロト酸塩レベルの発現を示すプロットである。

【0029】

【図14】図１４は、３つの異なる用量のＯＴＣ－ｍＲＮＡ１７９９．７による処置の際の高タンパク質食におけるＯＴＣ欠損マウス（ｓｐｆ／ａｓｈ）の生存を示すプロットである。

【0030】

【図15】図１５は、異なる修飾を有するＯＴＣ－ｍＲＮＡ（２２６２）を投与したオスＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるｈＯＴＣ発現レベルを示すプロットである。

【発明を実施するための形態】

【0031】

定義：

【0032】

「ＯＴＣ」または「ｈＯＴＣ」または「ＯＴＣ＿ＨＵＭＡＮ」と本明細書において互換的に使用される用語「オルニチントランスカルバミラーゼ」とは、一般に、ＵｎｉＰＲｏｔＫＢ－Ｐ００４８０に関連するヒトタンパク質を指す。野生型ヒトＯＴＣタンパク質のアミノ酸配列は、本明細書においては配列番号３によって表される。

【0033】

用語「核酸」とは、その最も広い意味において、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。これらのポリマーは、多くの場合、ポリヌクレオチドと呼ばれる。本明細書に記載した例示的な核酸またはポリヌクレオチドとしては、限定するものではないが、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ、β－Ｄ－リボ配置を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ配置を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能基化を有する２’－アミノＬＮＡ、および２’－アミノ官能基化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡを含む）またはそのハイブリッドが挙げられる。

【0034】

本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、一般に、核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を指すために使用される。ｍＲＮＡなどのＲＮＡが具体的に言及されている場合、用語ポリリボヌクレオチドが使用され得る。用語のポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、核酸、リボ核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどには、標準残基または非修飾残基；非標準残基または修飾残基（例えば類似体）；標準残基および非標準（例えば類似体）残基の混合物で構成され得るそのような分子が含まれる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドは、修飾ポリヌクレオチドまたは修飾ポリリボヌクレオチドである。本開示の文脈では、本明細書に挙げたそれぞれのＲＮＡ（ポリリボヌクレオチド）配列について、対応するＤＮＡ（ポリデオキシリボヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）配列が考えられ、また逆も同様である。「ポリヌクレオチド」は、「オリゴマー」と互換的に使用することができる。本明細書に示したポリヌクレオチド配列は、特に明記のない限り、左から右へ、５’から３’へである。

【0035】

本明細書で使用される場合、用語「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）とは、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードしており、翻訳され、コードされた目的のタンパク質またはポリペプチドをインビトロ、インビボ、インサイチュ（ｉｎｓｉｔｕ）またはエキソビボで生成することを可能にする、任意のポリヌクレオチドを指す。

【0036】

本明細書で使用される場合、用語「翻訳」とは、リボソームがポリペプチドを作製するプロセスである。翻訳では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、リボソーム複合体の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）によって解読され、特定のアミノ酸鎖、またはポリペプチドを生成する。コード配列またはＣＤＳとしても知られているポリヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）のコード領域は、翻訳のプロセスによってタンパク質またはその断片に変換することが可能である。

【0037】

本明細書で使用される場合、用語「コドン最適化」とは、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく異なるコドンを選択することにより再設計された天然の（または意図的に設計された天然の変異体）コード配列を意味する。コドン最適化配列は、他の利点を提供する中でもコード化されたタンパク質のタンパク質発現レベルを増加させることができる（Gustafsson et al. Codon bias and heterologous protein expression. 2004, Trends Biotechnol 22: 346-53）。高コドン適応指数（ＣＡＩ）、ＬｏｗＵ法、ｍＲＮＡ二次構造、シス制御配列、ＧＣ含量などの変数および他の多くの同様の変数は、タンパク質発現レベルとある程度の相関関係があることが示されている（Villalobos et al., Gene Designer: a synthetic biology tool for constructing artificial DNA segments. 2006, BMC Bioinformatics 7:285）。高ＣＡＩ（コドン適応指数）法では、タンパク質コード配列全体に対して最も頻繁に使用される同義コドン（ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓｃｏｄｏｎ）をピックアップする。それぞれのアミノ酸に対して最も頻繁に使用されるコドンは、ヒトゲノム由来の７４，２１８個のタンパク質コード遺伝子から推定される。ＬｏｗＵ法は、Ｕ部分が少ない同義コドンに置き換えることができるＵ含有コドンのみを標的とする。置換に関していくつかの選択肢がある場合には、使用頻度が高いコドンが選択される。配列内の残りのコドンは、ＬｏｗＵ法によって変化されない。この方法は、開示したｍＲＮＡと組み合わせて使用し、例えば５－メトキシウリジンまたはＮ^１－メチルシュードウリジンを用いて合成されるコード配列を設計することができる。

【0038】

本明細書で使用される場合、「修飾された」とは、本明細書に開示した分子の状態または構造における変化を指す。分子は、化学的、構造的、または官能基的などの多くの方法において変化させることができる。好ましくは、本開示のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの天然型と比較して、または参照ポリヌクレオチド配列もしくはポリヌクレオチド配列と比較して修飾されている。例えば、本明細書に開示したｍＲＮＡは、コドン最適化によって、または非天然のヌクレオシドもしくはヌクレオチドの挿入によって修飾することができる。ポリペプチドは、例えば、部位特異的アミノ酸欠失または置換によって修飾され、ポリペプチドの特性が変化され得る。

【0039】

本明細書で使用される場合、用語「相同性」とは、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間、ならびに／あるいはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一または類似である場合、相互に「相同」であると考えられる。用語「相同」とは、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列）間の比較を指す。本開示によれば、２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチに対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらには９９％である場合、相同であると考えられる。いくつかの実施形態では、相同ポリヌクレオチド配列は、少なくとも４～５個の固有に特定されたアミノ酸のストレッチをコードする能力を特徴とする。６０ヌクレオチド未満の長さのポリヌクレオチド配列の場合、相同性は、少なくとも４～５個の固有に特定されたアミノ酸のストレッチをコードする能力を特徴とする。本開示によれば、タンパク質が少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つのストレッチに対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である場合、２つのタンパク質配列は相同であると考えられる。

【0040】

本明細書で使用される場合、用語「同一性」とは、ポリマー分子間、例えばオリゴヌクレオチド分子（例えばＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間、ならびに／あるいはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。例えば、２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、最適な比較目的において２つの配列をアラインさせることによって実施することができる。ある特定の実施形態では、比較目的においてアラインされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドが比較される。第１の配列内の位置が第２の配列内の対応する位置が同じヌクレオチドで占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数とそれぞれのギャップの長さを考慮する。配列の比較と、２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般的に用いられる方法には、限定するものではないが、参照により本明細書に組み込まれる、Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988)において開示されているものが含まれる。同一性を決定する技術は、公的に利用可能なコンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列間の相同性を決定するための例示的なコンピュータソフトウェアには、限定するものではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984)、BLASTP、BLASTN、およびＦＡＳＴＡ、Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215, 403 (1990)が含まれる。

【0041】

オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）タンパク質またはその対応する組成物をコードするｍＲＮＡ配列の「有効量」とは、一般に、細胞において効率的なＯＲＦタンパク質の生産を提供するｍＲＮＡの量である。好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡ組成物を使用するタンパク質の生産は、ＯＲＦタンパク質をコードする対応する野生型ｍＲＮＡを含む組成物よりも効率的である。効率の向上は、細胞トランスフェクションの増加（すなわち、核酸でトランスフェクトされた細胞のパーセンテージ）、核酸からのタンパク質翻訳の増加、核酸分解の減少（例えば、修飾された核酸からのタンパク質翻訳の持続時間の増加によって示される）、または宿主細胞の自然免疫応答の低下によって示され得る。本明細書に記載したＯＲＦタンパク質に言及する場合、有効量は、細胞におけるＯＲＦタンパク質欠損を克服するＯＲＦタンパク質の量である。

【0042】

本明細書で使用される場合、用語「インビトロ」とは、生物（例えば、動物、植物、または微生物）内ではなく、人工的環境、例えば、試験管または反応容器、細胞培養、ペトリ皿などにおいて起こる事象を指す。

【0043】

本明細書で使用される場合、用語「インビボ」とは、生物（例えば、動物、植物、もしくは微生物、またはそれらの細胞もしくは組織）内で起こる事象を指す。

【0044】

本明細書で使用される場合、用語「単離された」とは、関連していた（自然界または実験な環境であるかを問わず）成分の少なくとも一部から分離された物質または実体を指す。単離された物質は、関連していた物質と比較して、様々なレベルの純度を有し得る。単離された物質および／または実体は、それらが最初に関連していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超の純度を有する。本明細書で使用される場合、物質は、他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。実質的に単離された：「実質的に単離された」とは、化合物が形成または検出された環境から実質的に分離されていることを意味する。部分的分離は、例えば、本明細書に記載した化合物に富む組成物を含み得る。実質的分離は、本明細書に記載した化合物またはその塩の少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、または少なくとも約９９重量％を含有する組成物を含み得る。化合物およびそれらの塩を単離する方法は、当技術分野においては日常的である。

【0045】

本明細書で使用される場合、用語「対象」または「患者」とは、本開示による組成物が、例えば実験、診断、予防および／または治療の目的で投与され得る任意の生物を指す。典型的な対象には、動物（例えば哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒト）ならびに／あるいは植物が含まれる。好ましくは、「患者」は、処置を求めているかもしくは必要としている可能性がある、処置を必要とする、処置を受けている、処置を受ける予定であるヒト対象、または特定の疾患もしくは状態について訓練を受けた専門家によるケアを受けている対象を指す。

【0046】

本明細書で使用される句「薬学的に許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症がなく、妥当なベネフィット／リスク比に見合った、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適した化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために使用される。

【0047】

本明細書で使用される場合、用語「予防する」とは、感染、疾患、障害および／または状態の発症を部分的または完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、および／または状態の１つまたは複数の症状、特徴、または臨床徴候の発症を部分的または完全に遅延させること；特定の感染、疾患、障害、および／または状態の１つまたは複数の症状、特徴、または徴候の発症を部分的または完全に遅延させること；感染、特定の疾患、障害および／または状態からの進行を部分的または完全に遅延させること；ならびに／あるいは感染、疾患、障害、および／または状態に関連する病態を発症するリスクを低減すること、を指す。

【0048】

本明細書で使用される場合、用語「実質的に」とは、対象の特徴または特性の完全なまたはほぼ完全な範囲または程度を示す定性的状態を指す。生物学的分野の当業者には、生物学的現象および化学的現象は、完結に至ること、および／または完全に進むこと、または絶対的な結果を達成もしくは回避することはほとんどないことが理解されよう。したがって、用語「実質的に」は、本明細書では、多くの生物学的現象および化学的現象における本来的な完全性の欠如の可能性を表現するために使用される。

【0049】

本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」とは、感染、疾患、障害、および／または状態に罹患しているか、あるいはそれらに罹患しやすい対象に対して投与された場合に、感染、疾患、障害、および／または状態の処置、症状の改善、診断、予防、および／または発症の遅延に十分な量のデリバリーされる薬剤（例えば、核酸、タンパク質またはペプチド、薬物、治療薬、診断薬、予防薬など）の量を意味する。

【0050】

本明細書で使用される場合、「総一日量」は、２４時間に投与または処方される量である。それは、単回単位用量として投与され得る。

【0051】

本明細書で使用される場合、用語「処置する」とは、ＯＴＣ欠損症の１つまたは複数の症状または特徴の部分的または完全な緩和、回復、改善、軽減、発症の遅延、進行の抑制、重症度の軽減、および／または発生の低下を指す。処置は、疾患、障害、および／または状態に関連する病態を発症するリスクを軽減する目的で、ＯＴＣ欠損症の徴候を示さない対象および／またはＯＴＣ欠損症の初期徴候のみを示す対象に施すことができる。

【0052】

本明細書で使用される場合、用語「トランスフェクトする」または「トランスフェクション」とは、細胞への、好ましくは標的細胞への、核酸の細胞内導入を意味する。導入された核酸は、標的細胞において、安定的にまたは一過的に維持され得る。用語「トランスフェクション効率」とは、トランスフェクションに供される標的細胞によって取り込まれる核酸の相対量を指す。実際には、トランスフェクション効率は、トランスフェクション後に標的細胞によって発現されるレポーター核酸産物の量によって推定される。高いトランスフェクション効率の組成物、特に非標的細胞および組織のトランスフェクションによって媒介される副作用を最小限にする組成物が好ましい。

【0053】

本明細書で使用される場合、用語「標的細胞」とは、本開示の組成物が向けられるか、または標的とされる細胞または組織を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞は、目的のタンパク質または酵素が欠損している。例えば、核酸を肝細胞にデリバリーすることが望まれる場合、肝細胞は標的細胞を表す。いくつかの実施形態では、本開示の核酸および組成物は、差異的根拠に基づき標的細胞をトランスフェクトする（すなわち、非標的細胞をトランスフェクトしない）。本開示の組成物および方法は、限定するものではないが、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、肺細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞（例えば、髄膜、星状膠細胞、運動ニューロン、後根神経節および前角運動ニューロンの細胞）、光受容細胞（例えば桿状体および錘状体）、網膜色素上皮細胞、分泌細胞、心臓細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、ベータ細胞、下垂体細胞、滑膜管壁細胞、卵巣細胞、精巣細胞、繊維芽細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球および腫瘍細胞を含む、様々な標的細胞を優先的に標的とするように調製され得る。

【0054】

本明細書に記載した組成物および核酸による１つまたは複数の標的細胞のトランスフェクションの後、そのような核酸によってコードされるタンパク質の発現は、好ましくは刺激され得、目的のタンパク質を発現するそのような標的細胞の能力が増強される。例えば、ＯＴＣｍＲＮＡを用いた標的細胞のトランスフェクションは、核酸の翻訳後、ＯＴＣタンパク質産物を発現させることができる。本明細書で提供した組成物および／または方法の核酸は、好ましくは、産物（例えば、タンパク質、酵素、ポリペプチド、ペプチド、機能性ＲＮＡ、および／またはアンチセンス分子）をコードし、好ましくは、インビボ生成が望まれる産物をコードする。

【0055】

本明細書で使用される場合、「ＯＴＣタンパク質酵素活性」は、カルバモイルリン酸とオルニチンとの間の反応を触媒して、哺乳動物における尿素回路の一部としてのシトルリンを形成する酵素活性を指す。

【0056】

本明細書で使用される場合、目的の１つまたは複数の値に適用される用語「約」または「およそ」とは、記載した参照値に類似した値を指す。特定の実施形態では、用語の「およそ」または「約」とは、別段の記載のある場合または文脈から明らかな場合を除き、記載された参照値のいずれかの方向（より大きい方向またはより小さい方向）の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満に収まる値の範囲を指す（ただし、そのような数値が可能な値の１００％を超える場合を除く）。

【0057】

ポリヌクレオチド配列
本開示は、例えば、ｍＲＮＡ療法を使用するオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を処置するための改善された方法および組成物を提供する。本開示は、ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質、修飾型のヒトＯＴＣタンパク質またはＯＴＣタンパク質の活性断片をコードする本明細書に記載したｍＲＮＡ配列を含む組成物を、処置を必要とする対象に、ＯＴＣ欠損症の少なくとも１つの症状または特徴が強度、重症度、もしくは頻度において低減されるか、または発症が遅延されるような有効量および投与間隔で投与することを含む、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を処置する方法を提供する。本開示はまた、野生型ヒトＯＴＣタンパク質と比較して、改善された特性、例えば、安定性およびタンパク質分解に対する耐性および半減期の増強などを有する、ｍＲＮＡ配列によってコードされている修飾ＯＴＣタンパク質も提供する。

【0058】

好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡ組成物の投与は、対照レベルと比較して、対象のＯＴＣタンパク質の発現または活性の増加をもたらす。好ましくは、対照レベルは、処置前の対象におけるベースライン血清ＯＴＣタンパク質の発現または活性レベルであり、および／または対照レベルは、処置していないＯＴＣ患者における平均の血清ＯＴＣタンパク質の発現または活性レベルを示す。

【0059】

好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡ組成物の投与は、対照オロト酸レベルと比較して、対象における尿中オロト酸レベルの低下をもたらす。好ましくは、対照オロト酸レベルは、処置前の対象におけるベースライン尿中オロト酸レベルであり、および／または対照オロト酸レベルは、処置していないＯＴＣ患者における平均の尿中オロト酸レベルを示す基準レベルである。

【0060】

好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡによってコードされるＯＴＣタンパク質は、本明細書ではＯＴＣタンパク質をコードする「コード配列」（ＣＤＳ）とも呼ばれるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む異種ｍＲＮＡコンストラクトから生成される。好ましくは、コード配列は、コドン最適化されている。好ましくは、コード配列は、ＯＴＣタンパク質をコードすることが可能な理論上最小のウリジンを有するように最適化される。好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡコンストラクトは、以下の１つまたは複数の特徴を含む：５’キャップ；５’ＵＴＲ、５’ＵＴＲエンハンサー配列、コザック配列または部分的コザック配列、３’ＵＴＲ、ＯＴＣタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびポリＡテール。好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡコンストラクトは、ＯＴＣタンパク質の高効率発現を提供することができる。発現は、インビトロ、エキソビボ、またはインビボであり得る。

【0061】

好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡによってコードされるヒトＯＴＣタンパク質は、表１に示す配列番号４の修飾ヒトＯＴＣタンパク質を含む。配列番号４は、配列番号３（表１）の野生型ＯＴＣから修飾されており、１つまたは複数の予測されるユビキチン化部位が除去され、それによりユビキチン化およびユビキチンリガーゼによる分解の影響を受けにくいタンパク質が得られる。予測されるユビキチン化部位の除去は、好ましくは、ユビキチン化をサポートすることが確認されているＮ末端残基、例えばアスパラギン、アルギニン、ロイシン、リジン、またはフェニルアラニンを、ユビキチン化に対して安定化していることが確認されているＮ末端残基、例えばアラニン、グリシン、メチオニン、セリン、スレオニン、バリン、プロリンで置き換えることを含む。配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質をこの方法で安定化させることは、修飾ＯＴＣタンパク質がサイトゾルからミトコンドリアに輸送され、そこで酵素活性を発揮する間の安定性を維持するのに特に有利である。

【0062】

好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡによってコードされるＯＴＣタンパク質は、は表１に示す配列番号３のヒト野生型ＯＴＣタンパク質と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、また１００％同一であるタンパク質配列を含み、一方、カルバミルリン酸およびオルニチンからのシトルリンの（肝臓および小腸での）合成を触媒するＯＴＣタンパク質活性を保持している。

【表1-1】

【表1-2】

* OTCタンパク質は、翻訳され、ミトコンドリアへの転座に関与するシグナルペプチドを含む。このシグナルペプチドは、配列番号3および配列番号4において下線を付けた最初の32アミノ酸によって表される。配列番号4のシグナル配列はまた、配列番号3と比較して修飾されている。アミノ酸のバリンが配列番号4の3位に挿入されている。この修飾は、配列番号3の野生型ヒトOTCと比較して、配列番号4の修飾OTCのより良好なミトコンドリア局在を提供する。

【0063】

好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡ配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）またはコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列をコードする。

【0064】

好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡ配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）またはコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号３の野生型ヒトＯＴＣタンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列をコードする。好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡによってコードされるＯＴＣタンパク質は、表１に示す配列番号３の修飾ヒトＯＴＣタンパク質と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるタンパク質配列を含み、一方、カルバミルリン酸およびオルニチンからのシトルリンの（肝臓および小腸における）合成を触媒するＯＴＣタンパク質活性を保持している。

【0065】

好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡのＯＲＦまたはＣＤＳは、配列番号４の修飾ヒトＯＴＣタンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列をコードする。

【0066】

好ましくは、ヒトＯＴＣタンパク質をコードする本明細書に記載したｍＲＮＡのＯＲＦまたはＣＤＳは、表１の配列番号１のｍＲＮＡコード配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のコドン最適化ポリヌクレオチド配列を含む。

【0067】

好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡは、トリプル終止コドンを作製するＣＤＳのすぐ下流（すなわち、ＣＤＳから３’方向）の配列をさらに含む。トリプル終止コドンは、翻訳効率を増強するために組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、翻訳可能なオリゴマーは、本明細書に記載したｍＲＮＡ配列のＯＴＣＣＤＳのすぐ下流の配列ＡＵＡＡＧＵＧＡＡ（配列番号２５）を含み得る。

【0068】

好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡは、５'非翻訳領域（ＵＴＲ）配列をさらに含む。当技術分野において理解されているように、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響し得る。５’ＵＴＲは、翻訳可能なオリゴマーの安定性を高めるために、比較的安定していることが当技術分野において知られているｍＲＮＡ分子（例えば、ヒストン、チューブリン、グロビン、グリセルアルデヒド１－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、アクチン、またはクエン酸回路酵素）に由来し得る。他の実施形態では、５’ＵＴＲ配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分配列を含んでいてもよい。

【0069】

好ましくは、５’ＵＴＲは、ヒトＩＬ－６、アラニンアミノトランスフェラーゼ１、ヒトアポリポタンパク質Ｅ、ヒトフィブリノーゲンアルファ鎖、ヒトトランスサイレチン（ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ）、ヒトハプトグロビン、ヒトアルファ－１－アンチキモトリプシン、ヒトアンチトロンビン、ヒトアルファ－１－アンチトリプシン、ヒトアルブミン、ヒトベータグロビン、ヒト補体Ｃ３、ヒト補体Ｃ５、ＳｙｎＫ（シアノバクテリア、シネコシスティス属の種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ．）由来のチラコイドカリウムチャネルタンパク質）、マウスベータグロビン、マウスアルブミン、およびタバコエッチウイルス、または前述のいずれかの断片の５’ＵＴＲから選択される配列を含む。好ましくは、５’ＵＴＲは、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）に由来する。好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡは、シロイヌナズナによって発現される遺伝子に由来する５’ＵＴＲ配列を含む。好ましくは、シロイヌナズナによって発現される遺伝子の５’ＵＴＲ配列は、ＡＴ１Ｇ５８４２０である。好ましい５’ＵＴＲ配列は、表２に示すような配列番号５～１０、１２５～１２７および２３０～２５０を含む。

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【0070】

好ましくは、５’ＵＴＲ配列は、配列番号６（ＡＴ１Ｇ５８４２０）を含む。

【0071】

好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡは、翻訳エンハンサー配列を含む。翻訳エンハンサー配列は、本明細書に記載したｍＲＮＡの翻訳効率を増大し、それによりｍＲＮＡによってコードされているタンパク質の生成の増加を提供する。翻訳エンハンサー領域は、ｍＲＮＡ配列の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲに位置することができる。翻訳エンハンサー領域の例としては、ＴＥＶ５’ＵＴＲおよびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）ベータ－グロビン３’ＵＴＲ由来の天然起源のエンハンサー領域が挙げられる。好ましい５’ＵＴＲエンハンサー配列には、限定するものではないが、ＨＳＰ７０－Ｐ２、ＨＳＰ７０－Ｍ１、ＨＳＰ７２－Ｍ２、ＨＳＰ１７．９およびＨＳＰ７０－Ｐ１を含む、ヒト熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）をコードするｍＲＮＡに由来する配列が挙げられる。本開示の実施形態によって使用される好ましい翻訳エンハンサー配列は、表３に示す配列番号１１～１５によって表される。

【表3】

【0072】

好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡは、コザック配列を含む。当技術分野において理解されているように、コザック配列は、ｍＲＮＡの翻訳の効率的に開始することができる、真核生物ｍＲＮＡの翻訳開始部位を中心とした短いコンセンサス配列である。リボソーム翻訳機構は、コザック配列のコンテキストでＡＵＧ開始コドンを認識する。コザック配列は、ＯＴＣのコード配列の上流、５’ＵＴＲの下流に挿入され得るか、またはＯＴＣのコード配列の上流および５’ＵＴＲの下流に挿入され得る。好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡは、アミノ酸配列ＧＣＣＡＣＣ（配列番号２３）を有するコザック配列を含む。好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡは、アミノ酸配列ＧＣＣＡ（配列番号２４）を有する部分的コザック配列「ｐ」を含む。

【0073】

好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡは、３’ＵＴＲを含む。好ましくは、３’ＵＴＲは、アラニンアミノトランスフェラーゼ１、ヒトアポリポタンパク質Ｅ、ヒトフィブリノーゲンアルファ鎖、ヒトハプトグロビン、ヒト抗トロンビン、ヒトアルファグロビン、ヒトベータグロビン、ヒト補体Ｃ３、ヒト増殖因子、ヒトヘプシジン、ＭＡＬＡＴ－１、マウスベータグロビン、マウスアルブミン、アフリカツメガエルベータグロビン、または前述のいずれかの断片の３’ＵＴＲから選択される配列を含む。好ましくは、３’ＵＴＲは、アフリカツメガエルのベータグロビンに由来する。好ましい３’ＵＴＲ配列としては、表４に示す配列番号１６～２２が挙げられる。

【表4】

【0074】

好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡは、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護するのに有用であり得る３’テール領域を含む。テール領域は、３’ポリ（Ａ）領域および／または３’ポリ（Ｃ）領域であり得る。好ましくは、テール領域は、３’ポリ（Ａ）テールである。本明細書で使用される場合、「３’ポリ（Ａ）テール」は、連続するアデニンヌクレオチドのポリマーであり、例えば、１０～２５０個の連続アデニンヌクレオチド；６０～１２５個の連続アデニンヌクレオチド、９０～１２５個の連続アデニンヌクレオチド、９５～１２５個の連続アデニンヌクレオチド、９５～１２１個の連続アデニンヌクレオチド、１００～１２１個の連続アデニンヌクレオチド、１１０～１２１個の連続アデニンヌクレオチド；連続アデニンヌクレオチド、１１２～１２１個の連続アデニンヌクレオチド；１１４～１２１個のアデニン連続ヌクレオチド；および１１５～１２１個の連続アデニンヌクレオチドのサイズに及び得る。好ましくは、本明細書に記載した３’ポリＡテールは、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、または１２５個の連続アデニンヌクレオチドを含む。３’ポリ（Ａ）テールは、当技術分野において公知である様々な方法を使用して、例えば、合成またはインビトロ転写されたＲＮＡにテールを付加するためにポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して付加され得る。他の方法としては、ポリＡテールをコードするための転写ベクターの使用、あるいはリガーゼの使用（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼおよび／またはＴ４ＤＮＡリガーゼを使用するスプリントライゲーションを介した）が挙げられ、ポリ（Ａ）は、センスＲＮＡの３’末端に連結され得る。好ましくは、上記の方法のいずれかの組合せが用いられる。

【0075】

好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡは、５’キャップを含む。様々な基でキャップされた５’末端およびそれらの類似体が当技術分野において公知である。５’キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ；非メチル化キャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＧ）；ジメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称キャップ類似体（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、またはアンチリバースキャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ；ｍ７，２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ｄＧｐｐｐＧおよびそれらの四リン酸塩誘導体）［例えば、Jemielity, J. et al., RNA 9: 1108-1122 (2003)を参照されたい］から選択することができる。５’キャップは、ＡＲＣＡキャップ（３’－ＯＭｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐＧ）であり得る。５’キャップは、ｍＣＡＰ［ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、Ｎ^７－メチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン］であり得る。５’キャップは、加水分解に対して耐性であり得る。好ましい５’キャップは、本明細書では「ｍ７ＧｐｐｐＧｍキャップ」と呼ばれ、また本明細書では「Ｃａｐ１」とも呼ばれるが、以下のコア構造を有する：

【化1】

【0076】

好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡは、１つまたは複数の化学修飾されたヌクレオチドを含む。核酸モノマーの例としては、非天然の、修飾された、および化学修飾されたヌクレオチドが挙げられ、当技術分野において公知である任意のそのようなヌクレオチドが含まれる。化学修飾されたヌクレオチドを含むｍＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡ発現、発現率、半減期および／または発現タンパク質濃度を改善することが示されている。化学修飾されたヌクレオチドを含むｍＲＮＡ配列はまた、タンパク質局在化を最適化し、それにより有害な生体応答、例えば、免疫応答および／または分解経路を回避するのにも有用であった。

【0077】

修飾または化学修飾されたヌクレオチドの例としては、５－ヒドロキシシチジン、５－アルキルシチジン、５－ヒドロキシアルキルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－アルコキシシチジン、５－アルキニルシチジン、５－ハロシチジン、２－チオシチジン、Ｎ^４－アルキルシチジン、Ｎ^４－アミノシチジン、Ｎ^４－アセチルシチジン、およびＮ^４，Ｎ^４－ジアルキルシチジンが挙げられる。

【0078】

修飾または化学修飾されたヌクレオチドの例としては、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジン、５－プロピニルシチジン、５－ブロモシチジン、５－ヨードシチジン、２－チオシチジン；Ｎ^４－メチルシチジン、Ｎ^４－アミノシチジン、Ｎ^４－アセチルシチジン、およびＮ^４，Ｎ^４－ジメチルシチジンが挙げられる。

【0079】

修飾または化学修飾ヌクレオチドの例としては、５－ヒドロキシウリジン、５－アルキルウリジン、５－ヒドロキシアルキルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－カルボキシアルキルエステルウリジン、５－ホルミルウリジン、５－アルコキシウリジン、５－アルキニルウリジン、５－ハロウリジン、２－チオウリジン、および６－アルキルウリジンが挙げられる。

【0080】

修飾または化学修飾ヌクレオチドの例には、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－カルボキシメチルエステルウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン（本明細書では「５ＭｅＯＵ」とも呼ばれる）、５－プロピニルウリジン、５－ブロモウリジン、５－フルオロウリジン、５－ヨードウリジン、２－チオウリジン、および６－メチルウリジンが挙げられる。

【0081】

修飾または化学修飾されたヌクレオチドの例としては、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルバモイルメチルウリジン、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン、５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン、５－カルボキシメチルウリジン、５－メチルジヒドロウリジン、５－タウリノメチルウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン、２’－Ｏ－メチルシュードウリジン、２－チオ－２’Ｏ－メチルウリジン、および３，２’－Ｏ－ジメチルウリジンが挙げられる。

【0082】

修飾または化学修飾されたヌクレオチドの例としては、Ｎ^６－メチルアデノシン、２－アミノアデノシン、３－メチルアデノシン、８－アザアデノシン、７－デアザアデノシン、８－オキソアデノシン、８－ブロモアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ^６－メチルアデノシン、Ｎ^６－イソペンテニルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ^６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ^６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ^６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ^６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ^６－スレオニルカルバモイル－アデノシン、Ｎ^６－メチル－Ｎ^６－スレオニルカルバモイル－アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ^６－スレオニルカルバモイル－アデノシン、Ｎ^６，Ｎ^６－ジメチルアデノシン、Ｎ^６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ^６－ヒドロキシノルバリルカルバモイル－アデノシン、Ｎ^６－アセチル－アデノシン、７－メチル－アデニン、２－メチルチオ－アデニン、２－メトキシ－アデニン、アルファ－チオ－アデノシン、２’－Ｏ－メチル－アデノシン、Ｎ^６，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン、Ｎ^６，Ｎ^６，２’－Ｏ－トリメチル－アデノシン、１，２’－Ｏ－ジメチル－アデノシン、２’－Ｏ－リボシルアデノシン、２－アミノ－Ｎ^６－メチル－プリン、１－チオ－アデノシン、２’－Ｆ－ａｒａ－アデノシン、２’－Ｆ－アデノシン、２’－ＯＨ－ａｒａ－アデノシン、およびＮ^６－（１９－アミノ－ペンタオキサノナデシル）－アデノシンが挙げられる。

【0083】

修飾または化学修飾されたヌクレオチドの例としては、Ｎ^１－アルキルグアノシン、Ｎ^２－アルキルグアノシン、チエノグアノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソグアノシン、８－ブロモグアノシン、Ｏ^６－アルキルグアノシン、キサントシン、イノシン、およびＮ^１－アルキノシンが挙げられる。

【0084】

修飾または化学修飾されたヌクレオチドの例としては、Ｎ^１－メチルグアノシン、Ｎ^２－メチルグアノシン、チエノグアノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソグアノシン、８－ブロモグアノシン、Ｏ^６－メチルグアノシン、キサントシン、イノシン、およびＮ^１－メチルイノシンが挙げられる。

【0085】

修飾または化学修飾されたヌクレオチドの例としては、シュードウリジンが挙げられる。シュードウリジンの例としては、Ｎ^１－アルキルシュードウリジン、Ｎ^１－シクロアルキルシュードウリジン、Ｎ^１－ヒドロキシシュードウリジン、Ｎ^１－ヒドロキシアルキルシュードウリジン、Ｎ^１－フェニルシュードウリジン、Ｎ^１－フェニルアルキルシュードウリジン、Ｎ^１－アミノアルキルシュードウリジン、Ｎ^３－アルキルシュードウリジン、Ｎ^６－アルキルシュードウリジン、Ｎ^６－アルコキシシュードウリジン、Ｎ^６－ヒドロキシシュードウリジン、Ｎ^６－ヒドロキシアルキルシュードウリジン、Ｎ^６－モルホリノシュードウリジン、Ｎ^６－フェニルシュードウリジン、およびＮ^６－ハロシュードウリジンが挙げられる。シュードウリジンの例としては、Ｎ^１－アルキル－Ｎ^６－アルキルシュードウリジン、Ｎ^１－アルキル－Ｎ^６－アルコキシシュードウリジン、Ｎ^１－アルキル－Ｎ^６－ヒドロキシシュードウリジン、Ｎ^１－アルキル－Ｎ^６－ヒドロキシアルキルシュードウリジン、Ｎ^１－アルキル－Ｎ^６－モルホリノシュードウリジン、Ｎ^１－アルキル－Ｎ^６－フェニルシュードウリジン、およびＮ^１－アルキル－Ｎ^６－ハロシュードウリジンが挙げられる。これらの例において、アルキル、シクロアルキル、およびフェニル置換基は、非置換であり得るか、またはアルキル、ハロ、ハロアルキル、アミノ、もしくはニトロ置換基でさらに置換されていてもよい。

【0086】

シュードウリジンの例としては、Ｎ^１－メチルシュードウリジン（本明細書では「Ｎ１ＭＰＵ」とも呼ばれる）、Ｎ^１－エチルシュードウリジン、Ｎ^１－プロピルシュードウリジン、Ｎ^１－シクロプロピルシュードウリジン、Ｎ^１－フェニルシュードウリジン、Ｎ^１－アミノメチルシュードウリジン、Ｎ^３－メチルシュードウリジン、Ｎ^１－ヒドロキシシュードウリジン、およびＮ^１－ヒドロキシメチルシュードウリジンが挙げられる。

【0087】

核酸モノマーの例としては、当技術分野において公知である任意のそのようなヌクレオチドを含む、修飾および化学修飾ヌクレオチドが挙げられる。

【0088】

修飾および化学修飾されたヌクレオチドモノマーの例としては、当技術分野において公知である任意のそのようなヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルプリンヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチド、２’－デオキシリボヌクレオチド、２’－デオキシプリンヌクレオチド、ユニバーサル塩基ヌクレオチド、５－Ｃ－メチル－ヌクレオチド、および逆方向デオキシ脱塩基モノマー残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄｄｅｏｘｙａｂａｓｉｃｍｏｎｏｍｅｒｒｅｓｉｄｕｅｓ）が挙げられる。

【0089】

修飾および化学修飾されたヌクレオチドモノマーの例としては、３’－末端安定化ヌクレオチド、３’－グリセリルヌクレオチド、３’－逆方向脱塩基ヌクレオチド、および３’－逆方向チミジンが挙げられる。

【0090】

修飾および化学修飾されたヌクレオチドモノマーの例としては、ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－（Ｄ－リボフラノシル）ヌクレオチド、２’－メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’－メチル－チオ－エチル、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、および２’－Ｏ－メチルヌクレオチドが挙げられる。例示的な実施形態では、修飾されたモノマーは、ロックド核酸ヌクレオチド（ＬＮＡ）である。

【0091】

修飾および化学修飾されたヌクレオチドモノマーの例としては、２’，４’－拘束２’－Ｏ－メトキシエチル（２’，４’－ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ２’－Ｏ－ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ、ｃＭＯＥ）および２’－Ｏ－エチル（ｃＥｔ）修飾ＤＮＡが挙げられる。

【0092】

修飾および化学修飾されたヌクレオチドモノマーの例としては、２’－アミノヌクレオチド、２’－Ｏ－アミノヌクレオチド、２’－Ｃ－アリルヌクレオチド、および２’－Ｏ－アリルヌクレオチドが挙げられる。

【0093】

修飾および化学修飾されたヌクレオチドモノマーの例としては、Ｎ^６－メチルアデノシンヌクレオチドが挙げられる。

【0094】

修飾および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、修飾塩基の５－（３－アミノ）プロピルウリジン、５－（２－メルカプト）エチルウリジン、５－ブロモウリジン；８－ブロモグアノシン、または７－デアザアデノシンを有するヌクレオチドモノマーが挙げられる。

【0095】

修飾および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例としては、２’－Ｏ－アミノプロピル置換ヌクレオチドが挙げられる。

【0096】

修飾および化学修飾ヌクレオチドモノマーの例は、ヌクレオチドの２’－ＯＨ基を２’－Ｒ、２’－ＯＲ、２’－ハロゲン、２’－ＳＲ、または２’－アミノで置き換えることを含み、式中、Ｒは、Ｈ、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり得る。

【0097】

上記の塩基修飾の例は、糖修飾および結合修飾を含む、ヌクレオシドまたはヌクレオチド構造のさらなる修飾と組み合わせることができる。ある特定の修飾または化学修飾ヌクレオチドモノマーは、天然に見出され得る。

【0098】

好ましいヌクレオチド修飾としては、Ｎ^１－メチルシュードウリジンおよび５－メトキシウリジンが挙げられる。
好ましいｍＲＮＡ配列のコンストラクトを表５に示す。

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【表5-4】

【表5-5】

*コザック配列は、GCCACC(配列番号23)として定義されている。部分的(P)コザックは、GCCA(配列番号24)として定義されている。
**コンストラクトは、配列番号4の修飾ヒトOTCタンパク質をコードしている。

【0099】

好ましいｍＲＮＡ配列には、表５に挙げられているすべてのｍＲＮＡ配列が含まれる。好ましいｍＲＮＡ配列には、ｍＲＮＡ配列のウラシルヌクレオチドの０％～１００％、好ましくは１％～１００％、好ましくは２５％～１００％、好ましくは５０％～１００％、好ましくは７５％～１００％が修飾されている、列挙されているすべてのｍＲＮＡ配列が含まれる。好ましくは、ウラシルヌクレオチドの１％～１００％は、Ｎ^１－メチルシュードウリジンまたは５－メトキシウリジンである。好ましくは、ウラシルヌクレオチドの１００％はＮ^１－メチルシュードウリジンである。好ましくは、ウラシルヌクレオチドの１００％は５－メトキシウリジンである。

【0100】

好ましいｍＲＮＡ配列は、５’キャップ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）によって発現される遺伝子に由来する５’ＵＴＲ、任意の翻訳エンハンサー配列、任意のコザック配列または部分的コザック配列、ＯＴＣタンパク質をコードするコドン最適化コード配列（ＣＤＳ／ＯＲＦ）、３’ＵＴＲおよびポリＡテールを含む。好ましくは、コドン最適化ＣＤＳは、配列番号３または配列番号４のタンパク質をコードする。好ましくは、シロイヌナズナによって発現される遺伝子に由来する５’ＵＴＲは、表５で確認されるものから選択される。好ましくは、シロイヌナズナによって発現される遺伝子に由来する５’ＵＴＲは、配列番号６、配列番号１２５～１２７、および配列番号２２７～２４７からなる群から選択される。好ましくは、５’ＵＴＲ配列は、配列番号６の配列を有するＡＴ１Ｇ５８４２０である。好ましくは、コドン最適化配列のウラシル含有量は、配列番号１のウラシル含有量のパーセンテージに対して減少している。好ましくは、ｍＲＮＡ配列のウラシルヌクレオチドの０％～１００％は修飾されている。好ましくは、ウラシルヌクレオチドの０％～１００％は、Ｎ^１－メチルシュードウリジンまたは５－メトキシウリジンである。好ましくは、ウラシルヌクレオチドの１００％は、Ｎ^１－メチルシュードウリジンである。好ましくは、ウラシルヌクレオチドの１００％は、５－メトキシウリジンである。

【0101】

好ましいｍＲＮＡコンストラクトは、コドン最適化されたコード配列およびシロイヌナズナによって発現される遺伝子由来の５’ＵＴＲを含み、配列番号６２、６７、６８、６９、７３、１１３～１１９、１２１～１２７から選択される。

【0102】

本開示の好ましいｍＲＮＡコンストラクトは、配列番号４の修飾ヒトＯＴＣタンパク質をコードする最適化ＯＲＦを有し、１２１ヌクレオチドの３’ポリＡテールを含むｍＲＮＡコンストラクト１９２１（配列番号１１９）を含む。別の好ましいｍＲＮＡコンストラクトは、配列番号４の修飾ヒトＯＴＣタンパク質をコードし、１００ヌクレオチドの３’ポリＡテールを含むコンストラクト２２６０（配列番号２５１）を含む。別の好ましいｍＲＮＡコンストラクトは、配列番号４の修飾ヒトＯＴＣタンパク質をコードし、１００ヌクレオチドの３’ポリＡテールを含むコンストラクト２２６２（配列番号２５２）を含む。

【0103】

本開示の好ましいｍＲＮＡ配列には、配列番号３の野生型ヒトＯＴＣをコードするコドン最適化ＯＲＦを有し、１２１ヌクレオチドの３’ポリＡテールを有するｍＲＮＡコンストラクト１７９９（配列番号７３）が含まれる。本開示の別の好ましいｍＲＮＡコンストラクトには、配列番号３の野生型ヒトＯＴＣをコードするコドン最適化ＯＲＦを有し、１００ヌクレオチドの３’ポリＡテールを含むｍＲＮＡコンストラクト２０１６（配列番号２５３）が含まれる。

【0104】

好ましくは、ｍＲＮＡコンストラクト１７９９、２０１６、１９２１、２２６０および２２６２のウリジンヌクレオチドの１００％は、Ｎ^１－メチルシュードウリジンである。好ましくは、ｍＲＮＡコンストラクト１７９９、２０１６、１９２１、２２６０および２２６２のウラシルヌクレオチドの１００％は、５－メトキシウリジンである。

【0105】

本開示による使用のためのｍＲＮＡは、増大した翻訳効率を示し得る。本明細書で使用される場合、翻訳効率とは、本開示によるｍＲＮＡの翻訳によるタンパク質またはポリペプチドの生成の尺度を指す。好ましくは、本開示のｍＲＮＡは、本開示によってコドン最適化されていない、および／または本開示の好ましいＵＴＲを含まない、配列番号３または配列番号４をコードするｍＲＮＡと比較して、インビボで少なくとも２倍、３倍、５倍、または１０倍増大した翻訳効率を示し得る。好ましくは、本開示のｍＲＮＡは、コドン最適化されていない、および／または本開示の好ましいＵＴＲを含まない、配列番号３または配列番号４をコードするｍＲＮＡと比較して、インビボで少なくとも２倍、３倍、５倍、または１０倍増大したポリペプチドまたはタンパク質レベルを提供し得る。好ましくは、本開示のｍＲＮＡは、本開示によってコドン最適化されていない、および／または本開示の好ましいＵＴＲを含んでいない、配列番号３または配列番号４をコードするｍＲＮＡと比較して、インビボでポリペプチドまたはタンパク質の増大したレベルを提供し得る。例えば、ポリペプチドまたはタンパク質のレベルは、１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、またはそれ以上増大され得る。

【0106】

好ましくは、本開示のｍＲＮＡは、本開示によってコドン最適化されていない、および／または本開示の好ましいＵＴＲを含んでいない、配列番号３または配列番号４をコードするｍＲＮＡよりも、哺乳動物細胞の細胞質における増大した機能的半減期を提供し得る。本発明の翻訳可能な分子は、本開示によってコドン最適化されていない、および／または本開示の好ましいＵＴＲを含んでいない、配列番号３または配列番号４をコードするｍＲＮＡと比較して、増大した活性の半減期を有し得る。

【0107】

好ましくは、本開示のｍＲＮＡは、本開示によってコドン最適化されていない、および／または本開示の好ましいＵＴＲを含んでいない、配列番号３または配列番号４をコードするｍＲＮＡと比較して、細胞の自然免疫応答を低減することができる。

【0108】

好ましくは、本開示のｍＲＮＡは、本開示によってコドン最適化されていない、および／または本開示の好ましいＵＴＲを含んでいない、配列番号３または配列番号４をコードするｍＲＮＡと比較して、有効な治療に必要な用量レベルを低減することができる。

【0109】

ｍＲＮＡ配列の設計および合成
本開示によって使用するためのｍＲＮＡは、限定するものではないが、化学合成、インビトロ転写（ＩＶＴ）、またはより長い前駆体の酵素的切断または化学的切断などを含む、任意の利用可能な技術によって調製することができる。ＲＮＡを合成する方法は、当技術分野において公知である。

【0110】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、一次相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）コンストラクトから生成される。本明細書に記載した一次ｃＤＮＡコンストラクトの設計および合成のプロセスは、一般に、遺伝子コンストラクション、ｍＲＮＡ生成（修飾の有無にかかわらず）および精製のステップを含む。ＩＶＴ法においては、ＯＴＣタンパク質をコードする標的ポリヌクレオチド配列がベクターに組み込むために最初に選択され、これが増幅されてｃＤＮＡ鋳型が生成される。標的ポリヌクレオチド配列および／または任意の隣接配列は、コドン最適化されていてもよい。次いで、ｃＤＮＡ鋳型を使用して、インビトロ転写（ＩＶＴ）を介してｍＲＮＡを生成する。生成後、ｍＲＮＡは、精製およびクリーンアップのプロセスを受けることができる。そのステップは、以下でより詳細に説明する。

【0111】

遺伝子コンストラクションのステップには、限定するものではないが、遺伝子合成、ベクター増幅、プラスミド精製、プラスミド線状化およびクリーンアップ、ならびにｃＤＮＡ鋳型合成およびクリーンアップが含まれる。ヒトＯＴＣタンパク質（例えば、配列番号３または配列番号４）が生成のために選択されると、一次コンストラクトが設計される。一次コンストラクト内で、目的のポリペプチドをコードする連結されたヌクレオシドの第１の領域は、選択された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）転写物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を使用してコンストラクトされ得る。ＯＲＦは、野生型ＯＲＦ、そのアイソフォーム、変異体またはその断片を含み得る。本明細書で使用される場合、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」とは、目的のポリペプチドをコードすることが可能な核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指すことを意味する。ＯＲＦは、多くの場合、開始コドンＡＴＧで始まり、ナンセンスまたは終止のコドンまたはシグナルで終わる。

【0112】

さらに、ｍＲＮＡ鋳型またはＤＮＡ鋳型の任意の領域のヌクレオチド配列をコドン最適化することができる。コドン最適化方法は当技術分野において公知であり、いくつかの目標のうちの１つまたは複数を達成するための取り組みにも有用であり得る。これらの目標には、標的生物と宿主生物におけるコドン頻度をマッチさせて適切なフォールディングを確実にすること、ＧＣ含有量にバイアスをかけてｍＲＮＡ安定性を高めるか、または二次構造を低減すること、遺伝子の構築または発現を損い得るタンデムリピートコドンまたはベースランを最小限に抑えること、転写制御領域および翻訳制御領域をカスタマイズすること、タンパク質輸送配列を挿入または除去すること、コードされたタンパク質内の翻訳後修飾部位（例えばグリコシル化部位）を除去／付加すること、タンパク質ドメインを付加、除去またはシャッフルすること、制限部位を挿入または削除すること、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡ分解部位を修飾すること、タンパク質の様々なドメインが適切に折りたたまれ得るように翻訳速度を調節すること、あるいはｍＲＮＡ内の問題の二次構造を低減または排除することが含まれる。適切なコドン最適化ツール、アルゴリズムおよびサービスは、当技術分野において公知である。

【0113】

好ましくは、一次ｃＤＮＡ鋳型は、鋳型鎖における特定のヌクレオチドの存在または出現頻度を低減することを含み得る。例えば、鋳型におけるヌクレオチドの存在は、鋳型におけるヌクレオチドの２５％未満のレベルまで低減され得る。さらなる例では、鋳型におけるヌクレオチドの存在は、鋳型におけるヌクレオチドの２０％未満のレベルまで低減され得る。いくつかの例では、鋳型におけるヌクレオチドの存在は、鋳型におけるヌクレオチドの１６％未満のレベルまで低減され得る。好ましくは、鋳型におけるヌクレオチドの存在は、鋳型におけるヌクレオチドの１５％未満のレベルまで低減され、好ましくは１２％未満のレベルまで低減され得る。

【0114】

例えば、本開示は、ウラシル含有量が改変され（ａｌｔｅｒｅｄ）、野生型配列における少なくとも１つのコドンが代替コドンで置き換えられウラシル改変配列が生じた核酸を提供する。改変されたウラシル配列は、以下の特性の少なくとも１つを有することができる：
（ｉ）全体的なウラシル含有量の増加または減少（すなわち、核酸のセクション、例えばオープンリーディングフレームの核酸における総ヌクレオチド含有量のウラシルのパーセンテージ）；または、
（ｉｉ）局所的なウラシル含有量の増加または減少（すなわち、ウラシル含有量の変化は特定のサブ配列に限定される）；または、
（ｉｉｉ）全体的なウラシル含有量において変化を伴わないウラシル分布における変化；または、
（ｉｖ）ウラシルクラスター形成における変化（例えば、クラスターの数、クラスターの位置、もしくはクラスター間の距離）；または、
（ｖ）それらの組合せ。

【0115】

好ましくは、核酸配列におけるウラシル核酸塩基のパーセンテージは、野生型核酸配列におけるウラシル核酸塩基のパーセンテージに対して低減される。例えば、核酸塩基の３０％は野生型配列中のウラシルであり得るが、ウラシルである核酸塩基は開示の核酸配列中の核酸塩基の好ましくは１５％未満、好ましくは１２％未満、好ましくは１０％未満である。ウラシル含有量のパーセンテージは、配列中のウラシルの数をヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることによって決定することができる。

【0116】

好ましくは、核酸配列のサブ配列中のウラシル核酸塩基のパーセンテージは、野生型配列の対応するサブ配列中のウラシル核酸塩基のパーセンテージに対して低減される。例えば、野生型配列は、局所的なウラシル含有量が３０％の５’末端領域（例えば３０コドン）を有することができ、その同じ領域中のウラシル含有量は、本開示の核酸配列において、好ましくは１５％以下、好ましくは１２％以下、好ましくは１０％以下まで低減され得る。

【0117】

好ましくは、本発明の核酸配列中のコドンは、例えば、タンパク質翻訳に悪影響を及ぼし得るウラシルクラスターの数、サイズ、位置、または分布を低減または変更する。より低いウラシル含有量が望まれるが、ある特定の態様では、野生型配列のいくつかのサブ配列のウラシル含有量、特に局所的なウラシル含有量は、野生型配列よりも多くなる可能性があり、有益な特徴（例えば、増加した発現）を依然として維持する。

【0118】

好ましくは、ウラシル修飾配列は、野生型配列と比較した場合、より低いＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）応答を誘導する。いくつかのＴＬＲは、核酸を認識し、応答する。頻出するウイルス成分である二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、ＴＬＲ３を活性化することが示されている。一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡは、ＴＬＲ７を活性化する。ＲＮＡオリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を有するＲＮＡは、ヒトＴＬＲ８のリガンドである。細菌ＤＮＡおよびウイルスＤＮＡの特徴である、非メチル化ＣｐＧモチーフを含有するＤＮＡは、ＴＬＲ９を活性化する。

【0119】

本明細書で使用される場合、用語「ＴＬＲ応答」とは、ＴＬＲ７受容体による一本鎖ＲＮＡの認識として定義され、好ましくは、ＲＮＡの分解および／または受容体による一本鎖ＲＮＡの認識によって起こる生理学的応答を含む。ＲＮＡのＴＬＲ７への結合を判定および定量する方法は、当技術分野においては公知である。同様に、ＲＮＡがＴＬＲ７媒介性生理学的応答（例えばサイトカイン分泌）を引き起こしたかどうかを判定する方法は、当技術分野において周知である。好ましくは、ＴＬＲ応答は、ＴＬＲ７の代わりに、ＴＬＲ３、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９によって媒介され得る。ＴＬＲ７媒介性応答の抑制は、ヌクレオシド修飾を介して達成され得る。ＲＮＡは、自然界において１００を超える異なるヌクレオシド修飾を受ける。ヒトｒＲＮＡは、例えば、細菌ｒＲＮＡよりも１０倍多くのシュードウラシル（’Ｒ）と２５倍多くの２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを有する。細菌ｍＲＮＡはヌクレオシド修飾を含んでいないが、哺乳動物ｍＲＮＡは、ヌクレオシドが修飾、例えば、Ｎ^７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）に加えて、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ^６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、イノシン、および多くの２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを有する。

【0120】

好ましくは、本明細書に開示したポリヌクレオチド、好ましくは配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドのウラシル含有量は、基準配列の配列中の全核酸塩基の５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９０％、８０％、７０％、６０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満である。好ましくは、本明細書に開示したポリヌクレオチド、好ましくは配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドのウラシル含有量は、約５％～約２５％である。好ましくは、本明細書に開示したポリヌクレオチド、好ましくは配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質をコードするポリヌクレオチドのウラシル含有量は、約１５％～約２５％である。

【0121】

ｃＤＮＡ鋳型は、インビトロ転写（ＩＶＴ）システムを使用して、転写して本明細書に記載したｍＲＮＡ配列を生成することができる。このシステムは、典型的には、転写バッファー、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、およびポリメラーゼを含む。ＮＴＰは、限定するものではないが、天然および非天然の（修飾）ＮＴＰを含む本明細書に記載されているものから選択され得る。ポリメラーゼは、限定するものではないが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、および突然変異体ポリメラーゼ、例えば、限定するものではないが、修飾核酸を組み込むことができるポリメラーゼから選択することができる。

【0122】

一次ｃＤＮＡ鋳型または転写されたｍＲＮＡ配列はまた、キャッピング反応および／またはテーリング反応を受け得る。キャッピング反応は、一次コンストラクトの５’末端に５’キャップを付加するための当技術分野において公知の方法によって実施することができる。キャッピングの方法としては、限定するものではないが、ワクシニアキャッピング酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）またはＣＬＥＡＮＣＡＰ（登録商標）技術（ＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の使用が挙げられる。ポリ－Ａテーリング反応は、当技術分野において公知の方法、例えば、限定するものではないが、２’Ｏ－メチルトランスフェラーゼによって、および本明細書に記載した方法によって実施することができる。ｃＤＮＡから生成された一次コンストラクトがポリ－Ｔを含まない場合、一次コンストラクトを洗浄する前に、ポリ－Ａテーリング反応を実施することが有益であり得る。

【0123】

オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードするコドン最適化ｃＤＮＡコンストラクトは、本明細書に記載したｍＲＮＡ配列の生成に特に適している。例えば、そのようなｃＤＮＡコンストラクトは、インビトロで、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードするポリリボヌクレオチドを転写するための基礎として使用することができる。表６は、表５に挙げたｍＲＮＡ配列のインビトロ転写に使用される例示的なｃＤＮＡＯＲＦ鋳型のリストを提供する。

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【表6-4】

*配列番号3は、野生型ヒトOTCのアミノ酸配列である。
**配列番号4は、修飾ヒトOTCのアミノ酸配列である。
***プラスミド配列全体は含まれていない。

【0124】

好ましいｃＤＮＡ鋳型配列には、配列番号３の野生型ヒトＯＴＣをコードする最適化コード配列を有する配列番号１７５のＤＮＡ配列（ｐ１７７９）が含まれる。好ましいｃＤＮＡ鋳型配列にはまた、配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質をコードする最適化コード配列を有する配列番号２２１のｃＤＮＡ配列（ｐ１９２１）も含まれる。

【0125】

本開示はまた、発現コンストラクト、例えばベクターまたはプラスミド中の１つまたは複数の制御ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得るヒトＯＴＣタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ）も提供する。特定の実施形態では、そのようなコンストラクトは、ＤＮＡコンストラクトである。制御ヌクレオチド配列は、一般には、発現に使用される宿主細胞に適している。多くのタイプの適切な発現ベクターおよび適切な制御配列が様々な宿主細胞に関して当技術分野において公知である。

【0126】

典型的には、前記の１つまたは複数の制御ヌクレオチド配列には、限定するものではないが、プロモーター配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および終結配列、翻訳開始配列および終結配列、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列が含まれ得る。当技術分野において公知の構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターは、本開示の実施形態で検討されている。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または複数のプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。

【0127】

発現コンストラクトは、エピソーム上の細胞、例えばプラスミドに存在していてもよいし、または発現コンストラクトは染色体に挿入されていてもよい。好ましくは、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選択することができる選択可能マーカー遺伝子を含有する。選択可能マーカー遺伝子は当技術分野において周知であり、使用される宿主細胞によって変わる。

【0128】

本開示はまた、好ましくは少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結されているオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。制御配列は技術認識されており、コードされたポリペプチドの発現を導くように選択される。

【0129】

したがって、用語の制御配列には、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメントが含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現が所望されるタンパク質のタイプなどの要因に依存し得る。

【0130】

本開示はまた、本明細書に記載したオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドをコードする本明細書に記載したｍＲＮＡまたはＤＮＡでトランスフェクトされている宿主細胞を提供する。好ましくは、ヒトＯＴＣポリペプチドは、配列番号４の配列を有する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドは、細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系の使用）、酵母細胞、または哺乳動物細胞で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者には公知である。

【0131】

本開示はまた、配列番号２６～２２９のいずれか１つのｍＲＮＡ配列をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0132】

本開示はまた、配列番号３のヒト野生型ＯＴＣタンパク質または修飾ヒトＯＴＣタンパク質配列番号４を生成する方法も提供する。好ましくは、ＯＴＣタンパク質は配列番号４であり、配列番号１１９のｍＲＮＡによってコードされている。例えば、ＯＴＣタンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞は、ポリペプチドの発現を生じさせることができる適切な条件下で培養され得る。ポリペプチドは分泌され、細胞とポリペプチド含有培地との混合物から単離され得る。あるいは、ポリペプチドは、細胞質または膜画分に保持されていてもよく、細胞を回収し、溶解させ、タンパク質を単離することができる。細胞培養物には、宿主細胞、培地、および他の副産物が含まれる。細胞培養に適した培地は、当技術分野においては周知である。

【0133】

本明細書に記載した発現されたＯＴＣタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびＯＴＣポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体による免疫親和性精製を含む、タンパク質を精製するための当技術分野において公知の技術を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはその両方から単離することができる。

【0134】

脂質ベースの製剤
脂質ベースの製剤は、それらの生体適合性と大規模生産の容易さから、ＲＮＡの最も有望なデリバリーシステム（本明細書ではデリバリー媒体または担体とも呼ばれる）の１つとして次第に認識されてきた。カチオン性脂質は、ＲＮＡデリバリーのための合成材料として広く研究されてきた。一緒に混合した後、核酸はカチオン性脂質によって凝縮され、リポプレックスとして公知である脂質／核酸複合体を形成する。これらの脂質複合体は、遺伝物質をヌクレアーゼの作用から保護し、負に帯電した細胞膜と相互作用することにより、細胞に遺伝物質をデリバリーすることができる。リポプレックスは、生理学的ｐＨで正に荷電した脂質と負に荷電した核酸とを直接混合することによって調製することができる。

【0135】

従来のリポソームは、カチオン性、アニオン性、または中性の（リン）脂質とコレステロールから構成され得る脂質二重層で構成されており、水性コアを封入している。脂質二重層と水性空間の両方に、それぞれ疎水性化合物または親水性化合物を組み込むことができる。インビボにおけるリポソームの特性および挙動は、親水性ポリマーコーティング、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をリポソーム表面に加えることによって修飾し、立体安定化を付与することができる。さらに、リポソームは、リガンド（抗体、ペプチド、炭水化物など）をその表面に、または結合したＰＥＧ鎖の末端に結合させることにより、特定の標的化に使用することができる（Front Pharmacol. 2015 Dec 1;6:286）。

【0136】

リポソームは、水性区画を囲むリン脂質二重層で構成されるコロイド状脂質ベースのおよび界面活性剤ベースのデリバリーシステムである。それらは球状の小胞として存在していてもよく、サイズは２０ｎｍ～数ミクロンの範囲となり得る。カチオン性脂質ベースのリポソームは、静電相互作用を介して負に帯電した核酸と複合体を形成することができ、生体適合性、低毒性、およびインビボでの臨床応用に必要とされる大規模生産の可能性を提供する複合体をもたらす。リポソームは、取り込みのために細胞膜と融合することができる；細胞内に入ると、リポソームはエンドサイトーシス経路を介して処理され、次いで遺伝物質はエンドソーム／担体から細胞質に放出される。リポソームは基本的に生体膜の類似体であり、天然および合成リン脂質の両方から調製することができるということが考慮され、リポソームの優れた生体適合性のため、リポソームは薬物デリバリー媒体として長い間認められてきた（Int J Nanomedicine. 2014; 9: 1833-1843）。

【0137】

カチオン性リポソームは、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴ、およびｓｉＲＮＡ／スモールヘアピンＲＡ－ｓｈＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドのための伝統的に最も一般的に使用される非ウイルスデリバリーシステムであった。カチオン性脂質、例えば、ＤＯＴＡＰ、（１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムメチルサルフェート）は、負に帯電した核酸と複合体またはリポプレックスを形成し、静電相互作用によりナノ粒子を形成し、高いインビトロでのトランスフェクション効率を提供する。さらに、例えば中性１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）ベースのナノリポソームとしてのＲＮＡデリバリーのための中性脂質ベースのナノリポソームが開発された（Adv Drug Deliv. Rev. 2014 Feb; 66: 110-116.）。

【0138】

好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡコンストラクトは、脂質製剤化されている。脂質製剤は、好ましくは、限定するものではないが、リポソーム、リポプレックス、コポリマー、例えばＰＬＧＡ、および脂質ナノ粒子から選択される。好ましくは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、以下を含む：
（ａ）核酸、
（ｂ）カチオン性脂質、
（ｃ）凝集低減剤（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質またはＰＥＧ修飾脂質）、
（ｄ）適宜、非カチオン性脂質（例えば中性脂質）、および
（ｅ）適宜、ステロール。
好ましくは、脂質ナノ粒子製剤は、約２０～６０％のカチオン性脂質：５～２５％の中性脂質：２５～５５％のステロール；０．５～１５％のＰＥＧ－脂質のモル比で、（ｉ）少なくとも１つのカチオン性脂質；（ｉｉ）中性脂質；（ｉｉｉ）ステロール、例えばコレステロール；および、（ｉｖ）ＰＥＧ－脂質からなる。

【0139】

本開示の活性分子のデリバリーのための脂質および脂質組成物のいくつかの例は、ＷＯ２０１５／０７４０８５、Ｕ．Ｓ．２０１８／０１６９２６８、ＷＯ２０１８／１１９１６３、ＷＯ２０１８５／１１８１０２、Ｕ．Ｓ．２０１８／０２２２８６３、ＷＯ２０１６／０８１０２９、ＷＯ２０１７／０２３８１７、ＷＯ２０１７／１１７５３０に示されており、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、脂質は、以下の式Ｉの化合物：

【化2】

（式中、
Ｒ_１およびＲ_２は両方とも、１～１４個の炭素からなる直鎖アルキル、または２～１４個の炭素からなるアルケニルまたはアルキニルからなり；
Ｌ_１およびＬ_２は両方とも、５～１８個の炭素からなるか、またはＮと複素環を形成する、直鎖アルキレンまたはアルケニレンからなり；
ＸはＳであり；
Ｌ_３は、結合、または１～６個の炭素からなるか、もしくはＮと複素環を形成する、直鎖アルキレンからなり；
Ｒ_３は、１～６個の炭素からなる直鎖または分岐アルキレンからなり；
Ｒ_４およびＲ_５は同一であるかまたは異なり、それぞれ水素、または１～６個の炭素からなる直鎖または分岐アルキルからなる）
あるいは、その薬学的に許容される塩
である。

【0140】

脂質製剤は、以下の中から選択される１つまたは複数のイオン化可能なカチオン性脂質（本明細書では「ＡＴＸ脂質」とも呼ばれる）を含み得る：

【化3】

【化4】

【化5】

【化6】

【0141】

脂質ナノ粒子は、好ましくは、脂質ナノ粒子を形成するのに適したカチオン性脂質を含む。好ましくは、カチオン性脂質は、ほぼ生理学的ｐＨで正味の正電荷を保有する。カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンクロリド（ＤＯＴＡＰ）［またＮ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリドおよびｌ，２－ジオレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩としても公知である］、Ｎ－（ｌ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、ｌ，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、ｌ，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、ｌ，２－ジ－ｙ－リノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（γ－ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、ｌ，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、ｌ，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、ｌ，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、ｌ，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、ｌ－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、ｌ，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．ＣＩ）、ｌ，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．ＣＩ）、ｌ，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、または３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－ｌ，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－ｌ，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、ｌ，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［ｌ，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、またはその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［ｌ，３］ジオキソール－５－アミン、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－へプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、ｌ，ｌ’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－ｌ－イル）エチルアザネジイル）ジドデカン－２－オール（Ｃ１２－２００）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［ｌ，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［ｌ，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ）、３－（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－ｌ－アミン（ＭＣ３エーテル）、４－（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルブタン－ｌ－アミン（ＭＣ４エーテル）、または前述のいずれかの任意の組合せであり得る。他のカチオン性脂質としては、限定するものではないが、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、３Ｐ－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｉ）、Ｎ－（ｌ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、ｌ，２－ジレオイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ｌ，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ－（ｌ，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、および２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［ｌ，３］－ジオキソラン（ＸＴＣ）が挙げられる。さらに、例えば、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む）、ならびにリポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能なＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む）などのカチオン性脂質の市販製品を使用することができる。

【0142】

他の適したカチオン性脂質は、国際公開第ＷＯ０９／０８６５５８号、同第ＷＯ０９／１２７０６０号、同第ＷＯ１０／０４８５３６号、同第ＷＯ１０／０５４４０６号、同第ＷＯ１０／０８８５３７号、同第ＷＯ１０／１２９７０９号、および同第ＷＯ２０１１／１５３４９３号；米国特許公開第２０１１／０２５６１７５号、同第２０１２／０１２８７６０号、および同第２０１２／００２７８０３号；米国特許第８，１５８，６０１号；ならびにLove et al., PNAS, 107(5), 1864-69, 2010に開示されている。

【0143】

他の適切なアミノ脂質には、アルキル置換基が異なるもの（例えば、Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ－、およびＮ－プロピル－Ｎ－エチルアミノ－）を含む、代替脂肪酸基および他のジアルキルアミノ基を有するものが含まれる。一般に、飽和度のより低いアシル鎖を有するアミノ脂質は、特にフィルター滅菌の目的で複合体を約０．３ミクロン未満のサイズにする必要がある場合、より容易にサイズ区分される。Ｃ１４～Ｃ２２の範囲の炭素鎖長を有する不飽和脂肪酸を含有するアミノ脂質を使用することができる。他の足場を使用して、アミノ基とアミノ脂質の脂肪酸または脂肪族アルキル部分とを分離することもできる。

【0144】

好ましくは、ＬＮＰは、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６４０６６に記載の式（ＩＩＩ）のカチオン性脂質を含む。この文脈において、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０６４０６６の開示もまた、参照により本明細書に組み込まれる。

【0145】

好ましくは、本開示のアミノまたはカチオン性脂質は、少なくとも１つのプロトン化可能な基または脱プロトン化可能な基を有しており、その結果、脂質は生理学的ｐＨ（例えばｐＨ７．４）以下のｐＨで正に荷電し、第２のｐＨ、好ましくは生理学的ｐＨ以上では中性である。もちろん、ｐＨの関数としてのプロトンの付加または除去は平衡プロセスであること、荷電脂質または中性脂質への言及は主要な種の性質を指し、すべて脂質が荷電形態または中性形態で存在することを必要としないことは理解されよう。複数のプロトン化可能な基または脱プロトン化可能な基を有する脂質、または両性イオン性である脂質は、本開示における使用から除外されない。ある特定の実施形態では、プロトン化可能な脂質は、約４～約１１の範囲のプロトン化可能な基のｐＫａ、例えば約５～約７のｐＫａを有する。

【0146】

カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０ｍｏｌ％～約７０もしくは７５ｍｏｌ％、または約４５～約６５ｍｏｌ％、または約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、もしくは約７０ｍｏｌ％を含む。別の実施形態では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質のモル基準で約２５％～約７５％、例えば、モル基準で（脂質ナノ粒子中の脂質の総モル１００％に基づく）約２０～約７０％、約３５～約６５％、約４５～約６５％、約６０％、約５７．５％、約５７．１％、約５０％、または約４０％を含む。一実施形態では、カチオン性脂質の核酸に対する比は、約３～約１５、例えば、約５～約１３または約７～約１１である。

【0147】

医薬組成物
好ましくは、本開示は、配列番号３または配列番号４のヒトＯＴＣタンパク質をコードするコドン最適化ｍＲＮＡを含んでおり、好ましくは、脂質デリバリーシステムまたは脂質担体中で製剤化され、好ましくは、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。本明細書に開示した医薬組成物は、好ましくは、インビボでのｍＲＮＡの発現を促進する。

【0148】

適切な投与経路には、例えば、経口投与、直腸内投与、膣内投与、口腔粘膜投与、気管内投与もしくは吸入を含む肺投与、または腸内投与；皮内注射、経皮（局所）注射、筋肉内注射、皮下注射、髄内注射、ならびに髄腔内注射、脳室内直接注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射を含む非経口デリバリーが含まれる。

【0149】

好ましくは、筋肉内投与は、骨格筋、平滑筋および心筋からなる群から選択される筋肉に対するものである。いくつかの実施形態では、投与は、ｍＲＮＡの筋細胞へのデリバリーをもたらす。いくつかの実施形態では、投与は、ｍＲＮＡの肝細胞（すなわち肝臓細胞）へのデリバリーをもたらす。特定の実施形態では、筋肉内投与は、ｍＲＮＡの筋肉細胞へのデリバリーをもたらす。

【0150】

好ましくは、ｍＲＮＡおよびその脂質製剤は、全身ではなく局所的に、例えば、医薬組成物を標的組織に直接的に、好ましくは徐放性製剤で注射することによって投与することができる。局所デリバリーは、様々な形で、標的にされる組織に応じて、影響され得る。例えば、本開示の組成物を含むエアロゾルは、吸入することができる（鼻腔、気管または気管支デリバリーのため）；胃または腸に投与するために液体、錠剤、またはカプセルの剤形で供給することができ、直腸または膣に適用するために坐剤の剤形で供給することができる；あるいは、クリーム、点眼剤、さらには注射を使用することによって眼にデリバリーすることもできる。治療用分子またはリガンドと複合体形成した、提供された組成物を含む製剤は、例えば、移植の部位から周囲細胞に組成物を拡散させることを可能にするポリマーまたは他の構造もしくは物質と組み合わせて、外科的に投与することさえできる。あるいは、それらは、ポリマーまたは支持体を使用することなく外科的に適用することができる。

【0151】

医薬組成物は、任意の所望する組織に投与され得る。いくつかの実施形態では、提供されたリポソームまたは組成物によってデリバリーされるＯＴＣｍＲＮＡは、リポソームおよび／または組成物が投与された組織において発現される。いくつかの実施形態では、デリバリーされるｍＲＮＡは、リポソームおよび／または組成物が投与された組織とは異なる組織において発現される。デリバリーされたｍＲＮＡがデリバリーおよび／または発現され得る例示的な組織には、限定するものではないが、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、血清、脳、骨格筋、リンパ節、皮膚、および／または脳脊髄液が含まれる。

【0152】

好ましくは、医薬組成物は、本明細書に記載したポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載した一次ＤＮＡコンストラクトまたはｍＲＮＡをウイルスベクターまたは細菌ベクター内に含むことができる。

【0153】

好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡの一次ＤＮＡコンストラクトまたは本明細書に記載したｍＲＮＡは、（１）安定性を高める；（２）細胞トランスフェクションを増大させる；（３）持続放出または遅延放出を可能にする（例えば、ポリヌクレオチド、一次コンストラクト、またはｍＲＮＡのデポー製剤から）；（４）体内分布を変える（例えば、ポリヌクレオチド、一次コンストラクト、またはｍＲＮＡを特定の組織または細胞型に標的化する）；（５）コードされたタンパク質のインビボでの翻訳を増加させる；ならびに／あるいは、（６）コードされたタンパク質のインビボでの放出プロファイルを変える、ために、１つまたは複数の賦形剤を使用して製剤化することができる。

【0154】

従来の賦形剤、例えば任意のおよびすべての溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体媒体に加えて、本開示の分散剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、賦形剤は、限定するものではないが、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、一次ＤＮＡコンストラクトでトランスフェクトされた細胞、またはｍＲＮＡ（例えば対象に移植するため）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、およびそれらの組合せを含むことができる。

【0155】

したがって、本明細書に記載した製剤は、一緒に、一次ＤＮＡコンストラクトもしくはｍＲＮＡの安定性を高め、一次コンストラクトまたはｍＲＮＡによる細胞トランスフェクションを増加させ、ポリヌクレオチド、一次コンストラクトもしくはｍＲＮＡコードされたタンパク質の発現を増加させ、および／またはポリヌクレオチド、一次コンストラクト、もしくはｍＲＮＡコードされたタンパク質の放出プロファイルを変化させるそれぞれの量の１つまたは複数の賦形剤を含むことができる。さらに、本開示の一次コンストラクトおよびｍＲＮＡは、自己組織化核酸ナノ粒子を使用して製剤化することができる。

【0156】

本明細書に記載した医薬組成物の製剤は、薬理学の分野において公知の任意の方法または今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つもしくは複数の他の副成分と組み合わせる工程を含む。

【0157】

本開示による医薬組成物は、単一の単位用量として、および／または複数の単一の単位用量として、大量に調製、包装および／または販売され得る。本明細書で使用される場合、「単位用量」とは、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量を指す。活性成分の量は、一般に、対象に投与される活性成分の投与量および／またはそのような投与量の都合のよい一部分、限定するものではないが、そのような用量の２分の１もしくは３分の１を含む量と等しくあり得る。

【0158】

本開示による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意の追加成分の相対量は、処置される対象の個性、サイズ、および／または状態に応じて、さらには組成物が投与される経路に応じて変わり得る。例えば、組成物は、０．１％～９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。

【0159】

医薬製剤は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができ、本明細書で使用される場合、限定するものではないが、所望する特定の剤形に適切な、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体媒体、分散または懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤などを含む。

【0160】

医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤および組成物を調製するための技術は、当技術分野において公知である（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, Md., 2006を参照されたい）。従来の賦形剤媒体の使用は、任意の望ましくない生物学的影響が生じることにより、または医薬組成物の任意の他の成分（複数可）と有害性のある方法で相互作用することにより、任意の従来の賦形剤媒体が物質またはその誘導体と不適合であり得る場合を除き、本開示の実施形態の範囲内であると考えられ得る。

【0161】

治療上の使用

【0162】

ｍＲＮＡ配列、本明細書に記載したｍＲＮＡ配列を転写する一次ＤＮＡコンストラクト、およびそれらの医薬組成物は、多数のインビボおよびインビトロ方法を提供し、ＯＴＣ欠損症を処置するのに有用である。処置は、ＯＴＣ欠損症のヒト患者を処置することを含み得る。同様に、本明細書に記載した組成物は、細胞または動物に基づくモデルにおけるＯＴＣ欠損症を研究するためにインビトロまたはエキソビボ（ｅｘｖｉｖｏ）で使用することができる。例えば、ＯＴＣ発現を欠損した細胞を使用して、ＯＴＣ発現および／または活性を回復する能力、ならびに発現および／または活性が持続する期間を分析することができる。そのような細胞および動物モデルはまた、同じ生化学経路における結合パートナーまたは因子であるかどうかにかかわらず、経路に関与している他の因子を同定するのに適切である。他の実施形態では、本明細書に記載した組成物を使用して、ミトコンドリアデリバリーを研究または追跡することができる。

【0163】

本明細書に記載したポリヌクレオチド、例えば、本明細書に記載したＤＮＡコンストラクトもしくは鋳型またはｍＲＮＡ配列は、ＯＴＣ欠損症に罹患している患者または細胞にデリバリーすることができる。好ましくは、ｍＲＮＡ配列は、配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質をコードする配列番号１１９を含む。好ましくは、ＤＮＡ配列は、配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質をコードする配列番号２２１を含む。

【0164】

投与後、ＯＴＣは、細胞または対象において発現される。好ましくは、本明細書に記載した組成物は、ミトコンドリアにデリバリーされる。好ましくは、本明細書に記載した組成物は、肝細胞にデリバリーされる。

【0165】

好ましくは、本明細書に記載した治療方法は、例えばＯＴＣ欠損症を有する対象などの、それを必要とする対象の血漿および／または尿あるいは培養の細胞におけるアンモニアレベルを低下させる。好ましくは、本明細書に記載した治療方法は、それを必要とする対象の血漿および／または尿あるいは培養の細胞におけるオロト酸レベルを低下させる。好ましくは、本明細書に記載した治療方法は、それを必要とする対象の血漿および／または尿あるいは培養の細胞におけるシトルリンを増加させる。好ましくは、アンモニアレベル、オロト酸レベル、および／またはシトルリンレベルをバイオマーカーとして使用して、（ｉ）処置を必要とする対象を特定し、および／または、（ｉｉ）本明細書に記載したｍＲＮＡまたはＤＮＡ鋳型を使用する処置の有効性を評価する。

【0166】

これらの方法を用いて使用するためのｍＲＮＡ配列の例には、表５に挙げたものが含まれる。好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡ配列の転写に使用されるｃＤＮＡ鋳型は、表６に挙げられている。ＯＴＣ欠損症を処置するために患者に投与する好ましいｍＲＮＡ配列は、配列番号１７９９および配列番号１９２１である。好ましくは、配列番号１７９９および配列番号１９２１のｍＲＮＡ配列が好ましい。

【0167】

投与

【0168】

本開示のｍＲＮＡ、タンパク質またはその医薬製剤の有効用量は、細胞および／または患者におけるＯＲＦタンパク質欠損症を処置するのに十分な量であり得る。治療有効用量は、治療効果をもたらすのに十分な薬剤または製剤の量であり得る。治療有効用量は、１回または複数回の別々の投与で、異なる経路により投与することができる。一般に、治療有効用量は、対象に有意な利益を達成するのに十分である（例えば、フェニルケトン尿症を処置、調節、治癒、予防、および／または改善する）。例えば、治療有効量は、所望の治療効果および／または予防効果を達成するのに十分な量であり得る。一般に、それを必要とする対象に投与される治療剤の量は、対象の特徴に依存する。そのような特徴には、対象の状態、疾患の重症度、全体的健康状態、年齢、性別および体重が含まれる。当業者は、これらのおよび他の関連要因に応じて適切な用量を容易に決定することができる。さらに、客観的アッセイおよび主観的アッセイの両方を、最適な用量範囲を特定するために使用してもよい。

【0169】

本明細書で提供した方法は、本明細書に記載したｍＲＮＡ配列の治療有効量の単回投与および複数回の投与を意図する。本明細書に記載したＯＲＦタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を含む医薬組成物は、対象の状態の性質、重症度および程度に応じて、規則的な間隔で投与され得る。好ましくは、本開示のｍＲＮＡ配列の治療有効量は、規則的な間隔で（例えば、１年に１回、６か月に１回、４か月に１回、３か月に１回、２か月に１回、１か月に１回）、隔週、毎週、毎日、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、または連続的に、定期的に投与され得る。

【0170】

好ましくは、本開示のｍＲＮＡの医薬組成物は、そこに含まれる本明細書に記載した修飾タンパク質をコードする翻訳可能な化合物の徐放に適するように製剤化される。そのような徐放組成物は、延長された投与間隔で対象に都合よく投与され得る。例えば、一実施形態では、本開示の医薬組成物は、対象に１日２回、毎日、または１日おきに投与される。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、対象に、週に２回、週に１回、１０日ごと、２週間ごと、２８日ごと、毎月、６週間ごと、８週間ごと、隔月ごと、３か月ごと、４か月ごと、６か月ごと、９か月ごと、または年に１回、投与される。また本明細書では、長期にわたって、本明細書に記載したＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列をデリバリーまたは放出するデポー投与（例えば、皮下、筋肉内）のために製剤化された医薬組成物も意図している。好ましくは、用いられる徐放手段は、安定性を高めるために、本明細書に記載したＯＴＣタンパク質をコードする翻訳可能な化合物に作製された修飾と組み合わされる。

【0171】

治療有効用量は、投与時に、１～１０００ｐｇ／ｍｌ、または１～１０００ｎｇ／ｍｌ、または１～１０００μｇ／ｍｌ、またはそれ以上のＯＴＣの血清レベルまたは血漿レベルをもたらし得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載したｍＲＮＡ配列を含む組成物の治療有効用量を投与すると、処置対象における肝臓修飾タンパク質レベルの増加がもたらされ得る。好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡを含む組成物を投与すると、処置前の対象におけるベースライン修飾タンパク質レベルに対して、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の肝臓修飾タンパク質レベルにおける増加がもたらされる。好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡを含む組成物の治療有効用量を投与すると、処置前の対象におけるベースライン肝臓ＯＴＣレベルに対して、肝臓ＯＴＣレベルの増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、ベースライン肝臓ＯＴＣレベルに対する肝臓ＯＴＣレベルの増加は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２００％、またはそれ以上である。

【0172】

好ましくは、治療有効用量は、規則的に投与される場合、処置前のベースラインレベルと比較して、肝臓におけるＯＴＣの発現の増加をもたらす。好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡ配列を含む組成物の治療有効用量を投与すると、処置対象の肝臓の総タンパク質の約１０ｎｇ／ｍｇ、約２０ｎｇ／ｍｇ、約５０ｎｇ／ｍｇ、約１００ｎｇ／ｍｇ、約１５０ｎｇ／ｍｇ、約２００ｎｇ／ｍｇ、約２５０ｎｇ／ｍｇ、約３００ｎｇ／ｍｇ、約３５０ｎｇ／ｍｇ、約４００ｎｇ／ｍｇ、約４５０ｎｇ／ｍｇ、約５００ｎｇ／ｍｇ、約６００ｎｇ／ｍｇ、約７００ｎｇ／ｍｇ、約８００ｎｇ／ｍｇ、約９００ｎｇ／ｍｇ、約１０００ｎｇ／ｍｇ、約１２００ｎｇ／ｍｇ、または約１５００ｎｇ／ｍｇ以上の修飾タンパク質レベルの発現がもたらされる。

【0173】

好ましくは、治療有効用量は、規則的に投与された場合、生体サンプル中のオロト酸レベルの低下をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載したｍＲＮＡを含む組成物の治療有効用量を投与すると、処置前のベースラインのオロト酸レベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、生体サンプル（例えば、尿、血漿または血清サンプル）中のオロト酸レベルの低下がもたらされる。好ましくは、生体サンプルは、血漿、血清、全血、尿、または脳脊髄液から選択される。好ましくは、本明細書に記載したｍＲＮＡを含む組成物の治療有効用量を投与すると、血清または血漿中のオロト酸レベルを約１０００μｍｏｌ／Ｌ以下、約９００μｍｏｌ／Ｌ以下、約８００μｍｏｌ／Ｌ以下、約μｍｏｌ／Ｌ以下、約６００μｍｏｌ／Ｌ以下、約５００μｍｏｌ／Ｌ以下、約４００μｍｏｌ／Ｌ以下、約３００μｍｏｌ／Ｌ以下、約２００μｍｏｌ／Ｌ以下、約１００μｍｏｌ／Ｌ以下、または約５０μｍｏｌ／Ｌ以下に低下させる。好ましくは、治療有効用量は、規則的に投与された場合、血清または血漿中のオロト酸レベルを約６００μｍｏｌ／Ｌ以下に低下させる。別の例示的な実施形態では、治療有効用量は、規則的に投与された場合、血清または血漿中のオロト酸レベルを約３６０μｍｏｌ／Ｌ以下に低下させる。好ましくは、治療有効用量は、規則的に投与された場合、血清または血漿中のオロト酸レベルを約１２０μｍｏｌ／Ｌ以下に低下させる。

【0174】

インビボでの本明細書に記載したｍＲＮＡの治療有効用量は、約０．００１～約５００ｍｇ／ｋｇ体重の用量であり得る。例えば、治療有効用量は、約０．００１～０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、または０．０１～０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．１～１ｍｇ／ｋｇ、または１～１０ｍｇ／ｋｇ、または１０～１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。好ましくは、本明細書に記載したＯＴＣタンパク質をコードする、脂質有効化および非固定化核モノマー剤修飾ＲＮＡ（ＬＵＮＡＲ）－ｍＲＮＡ（ＷＯ２０１５／０７４０８５および米国特許公開第２０１８／０１６９２６８号を参照されたい）は、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で提供される。

【0175】

組合せ

【0176】

本明細書に記載したｃＤＮＡ一次コンストラクト、ｍＲＮＡまたはコードされたＯＴＣタンパク質は、１つまたは複数の他の治療剤、予防剤、診断剤、または画像化剤と組み合わせて使用することができる。「と組み合わせて」とは、これらのデリバリーの方法は本開示の範囲内であるが、薬剤が同時に投与され、および／またはデリバリーのために一緒に製剤化されなければならないことを意味することを意図しない。組成物は、１つまたは複数の他の所望する治療手順または医療手順と同時に、その前に、またはその後に投与され得る。一般に、それぞれの薬剤は、その薬剤に対して決定された用量および／または時間スケジュールで投与される。好ましくは、本開示の処置の方法は、バイオアベイラビリティを改善し、代謝を低下および／または修正し、排出を抑制し、および／または体内分布の修正し得る薬剤と組み合わせた、医薬組成物、予防組成物、診断組成物、または画像化組成物のデリバリーを包含する。非限定的な例として、本明細書に記載したｍＲＮＡ、好ましくは配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質をコードする配列番号１１９を含むｍＲＮＡ配列は、ＯＴＣ欠損症を処置するための薬剤と組み合わせて使用することができる。薬剤には、限定するものではないが、フェニル酪酸ナトリウム、フェニル酪酸グリセロール、フェニル酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、アルギニン、シトルリン、マルチビタミン、カルシウムサプリメント、または低タンパク質／高カロリー食と組み合わせたものの１つまたは複数が含まれる。一般に、組み合わせて用いられる薬剤は、個別に使用されるレベルを超えないレベルで使用されることが期待される。いくつかの実施形態では、組み合わせて用いられるレベルは、個別に使用されるレベルよりも低くなる。一実施形態では、組合せは、それぞれまたは一緒に、当技術分野において公知の分割投与レジメンによって投与され得る。

【実施例】

【0177】

実施例１：材料および方法
インビトロ転写プロトコル
ｍＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ媒介型ＤＮＡ依存性ＲＮＡ転写を使用してインビトロで合成し、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を、それぞれのＵＴＲの組合せにごとに直鎖状の鋳型を使用して、修飾ＵＴＰ、例えば５メトキシＵＴＰ（５ＭｅＯＵ）、Ｎ^１－メトキシメチルシュードＵＴＰ（Ｎ^１－ＭＯＭ）、５－ヒドロキシメチルＵＴＰ、５－カルボキシＵＴＰ、および修飾の混合物で置換および非置換した。ｍＲＮＡはカラムクロマトグラフィーを使用して精製し、酵素反応を使用してＤＮＡおよびすべてのｍＲＮＡの二本鎖ｍＲＮＡ混入を除去し、ｍＲＮＡを濃縮し、バッファー交換した。

【0178】

脂質カプセル化ｍＲＮＡの調製
脂質カプセル化ｍＲＮＡ粒子は、エタノール中の脂質（ＡＴＸ脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ－ＤＭＧ）を、クエン酸バッファーに溶解したＯＴＣｍＲＮＡと混合することにより調製した。この混合材料をリン酸バッファーで瞬間的に希釈した。エタノールを、再生セルロース膜（１００ｋＤＭＷＣＯ）を使用したリン酸バッファーで透析するか、または変性ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）中空糸膜（１００ｋＤＭＷＣＯ）を使用したタンジェンシャルフロー濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌｆｌｏｗｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＴＦＦ）によって除去した。エタノールを完全に除去した後、緩衝液を、５０ｍＭのＮａＣｌおよび９％のスクロースを含有するＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液、ｐＨ７．３と交換した。この製剤を濃縮し、続いてＰＥＳフィルターを使用して０．２μｍ濾過を行った。次いで、この製剤中のｍＲＮＡ濃度をＲｉｂｏｇｒｅｅｎ蛍光アッセイによって測定した後、グリセロールを含有する、５０ｍＭのＮａＣｌ、９％スクロース含むＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．３で希釈することにより、濃度を所望する最終濃度に調整した。次いで、最終製剤を０．２μｍフィルターで濾過し、ガラス製バイアルに充填して栓をし、蓋をして－７０±５℃に置いた。この凍結製剤を、ＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイによるｍＲＮＡ含有量およびカプセル化率、フラグメントアナライザーによるｍＲＮＡ完全性、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による脂質含有量、ＭａｌｖｅｒｎＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏＺＳでの動的光散乱による粒子サイズ、ｐＨおよびオスモラリティに関して特徴付けた。

【0179】

Ｉｎ－ＣｅｌｌＷｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ）
９６ウェルのコラーゲンプレートを使用して、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／ウシ胎児血清（ＦＢＳ）培地に適切な密度で細胞を播種した。最適なコンフルエンスで、細胞を、トランスフェクション試薬ミックス（ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘおよびＯｐｔｉ－ＭＥＭ）で希釈した標的ｍＲＮＡでトランスフェクトした。細胞をＣＯ２インキュベーター内も置き、増殖させた。所望する時点で、培地を除去し、細胞を４％の新鮮なパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で２０分間固定した。その後、固定液を除去し、細胞を、ＴＷＥＥＮを入れたトリスバッファー生理食塩水（ＴＢＳＴ）で５分間にわたり数回、透過処理した。透過処理洗浄が完了したら、細胞をブロッキングバッファー［ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）ブロッキングバッファー（ＰＢＳ）（Ｌｉ－Ｃｏｒ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）］と共に４５分間インキュベートした。次いで、一次抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、細胞をＴＢＳＴで数回洗浄し、ブロッキングバッファーで希釈し、ＣｅｌｌＴａｇ７００染色剤を含む二次抗体と１時間インキュベートした。最後に、細胞をＴＢＳＴで数回洗浄し、続いてトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で最終洗浄を実施した。プレートはＬｉｃｏｒ検出システムを使用して画像化し、データはＣｅｌｌＴａｇ７００で標識した細胞の総数に対して正規化した。

【0180】

実施例２：Ｈｅｐａ１，６およびＨｅｐ３ＢにおけるＵＴＲスクリーニング－２４時間および４８時間での相関。
ＵＴＲライブラリーは、配列番号３４の配列をＣＤＳ（コード配列）として含むｍＲＮＡコンストラクト＃５７１を使用して、インビトロでスクリーニングした。実施例１に記載したＩｎ－ＣｅｌｌＷｅｓｔｅｒｎアッセイを使用して、市販のトランスフェクション試薬を使用し、異なるｍＲＮＡをＨｅｐａ１，６およびＨｅｐ３Ｂにトランスフェクトした。ＯＴＣタンパク質の発現レベルは、近赤外蛍光イメージングシステムによって測定した。市販のＯＴＣ用抗体を検出に使用した。トランスフェクトされていない配列および参照配列を内部対照として使用した。図１のパネルＡは、２４時間でのＨｅｐａ１，６細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞において確認されたＯＴＣタンパク質の発現レベルの散布図である。図１のパネルＢは、４８時間でのＨｅｐａ１，６細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞において確認されたＯＴＣタンパク質の発現レベルの散布図である。スクリーニングの目的は、ヒト（Ｈｅｐ３Ｂ）およびマウス（Ｈｅｐａ１，６）肝細胞株においてＯＴＣ発現レベルに対するＵＴＲ固有の影響を判定することであり、どのＵＴＲが両モデルにおいて最も有益であり得るのか、特にマウスからヒトへの翻訳可能性を判断する上で有益である。高発現ＵＴＲをさらなるプロファイリング試験において使用した。

【0181】

実施例３：２４時間でＨｅｐａ１，６およびＨｅｐ３Ｂにおいてスクリーニングされたタンパク質安定性化合物のラウンド１－相関。
タンパク質安定性のアプローチに基づいて設計された表５の特定のｍＲＮＡコンストラクトのインビトロスクリーニングを実施した。ｍＲＮＡコンストラクトは、２つの異なる化学物質Ｎ^１－メチルシュードウリジン（Ｎ１ＭＰＵ）および５－メトキシウリジン（５ＭｅＯＵ）で試験したが、このことは、各ｍＲＮＡ中のウリジンの１００％がＮ１ＭＰＵのみであったか、または５ＭｅＯＵのみであった（５ＭｅＯＵまたはＮ１ＭＰＵの組み合わせではない）ことを意味する。実施例１に記載したＩｎ－ＣｅｌｌＷｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ）アッセイを使用して、市販のトランスフェクション試薬を使用し、異なるｍＲＮＡをＨｅｐａ１，６およびＨｅｐ３Ｂにトランスフェクトした。ＯＴＣタンパク質の発現レベルは、近赤外蛍光イメージングシステムによって測定した。市販のＯＴＣ用抗体を検出に使用した。トランスフェクトされていない配列および参照配列を内部対照として使用した。図２のパネルＡは、Ｎ１ＭＰＵおよび５ＭｅＯＵ化学物質で試験したｍＲＮＡの関数として、２４時間でのＨｅｐａ１，６細胞におけるＯＴＣタンパク質の発現レベルの相関を示す散布図である。図２、パネルＢは、Ｎ１ＭＰＵおよび５ＭｅＯＵ化学物質で試験したｍＲＮＡの関数として、２４時間でのＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＯＴＣタンパク質の発現レベルの相関を示す散布図である。これらの図は、２つの異なる化学物質からのｍＲＮＡをマウス肝細胞株およびヒト肝細胞株において試験した場合の発現レベルの変動の程度を示す。この実験においては、Ｎ１ＭＰＵ化学物質をｍＲＮＡで使用した場合、ほとんどの化合物がより良好に発現することが明らかであり得る。

【0182】

実施例４：２４時間および４８時間でヒト初代肝細胞においてスクリーニングされたタンパク質安定性化合物のラウンド２－相関。
タンパク質安定性アプローチに基づいて設計された表５のある特定のｍＲＮＡコンストラクトのインビトロスクリーニングを実施した。ウリジンの１００％がｍＲＮＡコンストラクトの名称の後に続いて「．１」が示されたＮ１ＭＰＵであり、ウリジンの１００％がｍＲＮＡコンストラクトの名称の後に続いて「．７」で示された５ＭｅＯＵである、２つの異なる化学物質でｍＲＮＡを試験した。実施例１に記載したＩｎ－ＣｅｌｌＷｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ）アッセイを使用して、市販のトランスフェクション試薬を使用し、異なるｍＲＮＡをヒト初代肝細胞にトランスフェクトした。ＯＴＣタンパク質の発現レベルは、近赤外蛍光イメージングシステムによって測定した。市販のＯＴＣ用抗体を検出に使用した。トランスフェクトされていない配列および参照配列を内部対照として使用した。（図３、パネルＡおよびＢ）。結果は、がん細胞株で実施された実験（Ｈｅｐａ１，６；Ｈｅｐ３Ｂ；実施例３）とは対照的に、両方の化学物質がヒト初代肝細胞において同様に発現することを示唆している。

【0183】

実施例５：２４時間および４８時間でのヒト初代肝細胞におけるタンパク質安定性化合物スクリーニングのラウンド３－相関。
タンパク質安定性アプローチに基づいて設計した新規化合物のインビトロスクリーニングを実施した。ｍＲＮＡコンストラクトの名称の後に続いて「．１」が示されたＮ１ＭＰＵと、ｍＲＮＡコンストラクトの名称の後に続いて「．７」で示された５ＭｅＯＵである、２つの異なる化学物質でｍＲＮＡを試験した。実施例１に記載したＩｎ－ＣｅｌｌＷｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ）アッセイを使用して、市販のトランスフェクション試薬を使用し、異なるｍＲＮＡをヒト初代肝細胞にトランスフェクトした。ＯＴＣタンパク質の発現レベルは、近赤外蛍光イメージングシステムによって測定した。市販のＯＴＣタンパク質用抗体を検出に使用した。トランスフェクトされていない配列および参照配列を内部対照として使用した。（図４、パネルＡおよびＢ）。結果は、がん細胞株で実施された実験（Ｈｅｐａ１，６；Ｈｅｐ３Ｂ；実施例３）とは対照的に、両方の化学物質がヒト初代肝細胞において同様に発現することを示唆している。

【0184】

実施例６：配列番号３のＯＴＣタンパク質をコードするＯＴＣｍＲＮＡコンストラクト１７９９．７（５ＭｅＯＵ化学物質）および配列番号４の修飾ＯＴＣタンパク質をコードする１９２１．７（５ＭｅＯＵ化学物質）をトランスフェクトしたヒト初代細胞におけるＯＴＣタンパク質の発現レベル。
実施例１に記載したＩｎ－ＣｅｌｌＷｅｓｔｅｒｎ（ＩＣＷ）アッセイを使用して、市販のトランスフェクション試薬を使用し、ＯＴＣｍＲＮＡをヒト初代肝細胞にトランスフェクトした。ＯＴＣタンパク質の発現レベルは、９６時間までの経時的試験の間、近赤外蛍光イメージングシステムによって測定した。市販のＯＴＣ用抗体を検出に使用した。トランスフェクトされていない配列を内部対照として使用した。プロットは、トランスフェクトされていない対照に対して正規化したＯＴＣタンパク質レベルを示している。（図５）。この試験の目的は、トランスフェクトされたヒト初代肝細胞におけるインビトロ条件下での未修飾タンパク質配列と修飾タンパク質配列（それぞれ、コンストラクト１７９９．７、１９２１．７によってコードされている）との半減期を評価することであった。結果は、１９２１．７が１７９９．７よりもより安定した発現を示したことを示唆している。
実施例７：１０ｍｇ／ｋｇで投与されたｓｐｆ／ａｓｈマウスにおける多重反応モニタリング（ＭＲＭ）質量分析法によって測定されたＯＴＣ発現レベル。Ｓｐｆ／ａｓｈマウスに、ＰＢＳまたは脂質製剤化（実施例１に記載）ＯＴＣ－ｍＲＮＡのいずれかを１０ｍｇ／ｋｇ用量でＩＶ注射した。ＷＴマウスを内部対照として使用して、内因性レベルを決定した。時間経過（６時間、２４時間、４８時間）を実施し、発現レベルをＯＴＣのヒトおよびマウス特異的エピトープを使用してＭＲＭによって測定した。ヒトＯＴＣ（図６、パネルＡ）またはマウス（図６、パネルＢ）に特異的なＭＲＭによって検出されたタンパク質の量（ｎｇ／組織ｍｇ）を示すグラフを作成した。ヒト特異的およびマウス特異的重ペプチドは、両種におけるＯＴＣの総レベルを測定するように設計された。このデータセットは、デリバリーされたｍＲＮＡの翻訳に由来するヒト特異的ＯＴＣの定量的レベルが検出されたことを示唆している。この発現は、４８時間まで高レベルの安定性を維持する。

【0185】

実施例８：３ｍｇ／ｋｇで投与されたＷＴマウスにおけるウエスタンブロットによって測定したＯＴＣ発現レベル。
Ｓｐｆ／ａｓｈマウスに、２つの異なる化学物質（Ｎ１ＭＰＵおよび５ＭｅＯＵ）を使用して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または脂質製剤化ＯＴＣ－ｍＲＮＡのいずれかを３ｍｇ／ｋｇの用量でＩＶ注射した。ＷＴマウスを内部対照として使用して、内因性レベルを決定した。動物は、投与の２４時間後に安楽死させた。ＯＴＣ発現レベルは、ＯＴＣ特異的抗体を使用したウエスタンブロット（ＷＢ）によって測定した。図７に提供した結果において、棒はＷＴレベル（１００％）に対する発現のパーセンテージを示す。この図で作成されたデータは、マウスバックグラウンドでの総ＯＴＣのＷＴレベルがいくつかのコドン最適化配列において達成されたことを明らかにしている。

【0186】

実施例９：用量範囲設定試験においてＭＲＭにより測定されたＯＴＣ発現レベル。
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＰＢＳまたは脂質製剤化ＯＴＣ－ｍＲＮＡのいずれかを３つの異なる用量：０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇで、２つの異なる化学物質（Ｎ１ＭＰＵおよび５ＭｅＯＵ）を使用して、ＩＶ注射した。投与の２４時間後に動物を安楽死させ、ＯＴＣのヒト特異的およびマウス特異的エピトープを使用し、ＭＲＭによって発現レベルを測定した。図８のグラフは、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける肝臓組織１ｍｇ当たりのヒトＯＴＣの発現のパーセンテージ（ｎｇ）を示す。水平の点線は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける相対的なマウスＯＴＣレベルを示す。（図８）。ｍＲＮＡコンストラクト７１３５ＭｅＯＵおよびｍＲＮＡコンストラクト５７１Ｎ１ＭＰＵに関するｈＯＴＣタンパク質の発現レベルは、図８において矢印によって示されている。この図では、ＭＲＭを使用して、ヒト選択的およびマウス選択的ＯＴＣタンパク質レベルを定量的に測定した。この図で作成したデータは、用量依存的に、マウスのバックグラウンドでのヒトＯＴＣのＷＴレベルが本明細書に開示したコドン最適化配列で達成されることを明らかにしている。

【0187】

実施例１０：ＰＢＳおよび処置したｓｐｆ／ａｓｈマウスにおいて測定された尿中オロト酸塩レベル。
Ｓｐｆ／ａｓｈマウスに、ＰＢＳまたは脂質製剤化ＯＴＣ－ｍＲＮＡコンストラクト１７９９．７（５ＭｅＯＵ化学物質）のいずれかを３つの異なる用量：０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇでＩＶ注射した。ＷＴおよびｓｐｆ／ａｓｈマウスを使用して、ベースラインおよび高尿中オロト酸塩レベルをそれぞれ決定した。ｓｐｆ／ａｓｈの時間経過が決定され、尿中オロト酸塩レベルが各時点で測定された。結果は図９で見ることができる。尿中オロト酸塩はクレアチニンに対して正規化され、これは時間経過を通じてＹ軸のグラフに示され、また注射後のＯＴＣ活性の機能回復の概念実証として有用である。３ｍｇ／ｋｇで、最大１４日間まで尿中オロト酸塩レベルの持続的減少が観察された。

【0188】

実施例１１：９６時間でのヒトＯＴＣ発現レベルおよび尿中オロト酸塩を比較する薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）分析。
Ｓｐｆ／ａｓｈマウスに、ＰＢＳまたは表５の特定の脂質製剤化ＯＴＣ－ｍＲＮＡを１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇで、２つの異なる化学物質（Ｎ１ＭＰＵおよび５ＭｅＯＵ）を使用して、ＩＶ注射した。ＷＴマウスを内部対照として使用した。ヒト特異的ＯＴＣレベルはＭＲＭによって測定し、尿中オロト酸塩は各サンプルで測定し、クレアチニンに対して正規化した。ＰＫ／ＰＤが図１０にプロットされている。ＰＫ／ＰＤ分析は、タンパク質発現レベルと尿中オロト酸塩の減少との相関関係を化合物特異的な方法で示している。コンストラクト１７９９．７は、高いＰＫ／ＰＤ相関を示している。

【0189】

実施例１２：選択したｍＲＮＡで処置したインビボサンプルにおけるｓｐｆ／ａｓｈマウスの分画。
ｓｐｆ／ａｓｈマウスに、ＰＢＳまたは脂質製剤化（実施例１に記載）ＯＴＣ－ｍＲＮＡのいずれかを１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇでＩＶ注射した。ＷＴマウスを内部対照として使用した。サンプル分画は、肝臓サンプルで、サイトゾル分画とミトコンドリア分画を分離して実施した。ＯＴＣレベルは、ヒト特異的（ｈＯＴＣ）抗体および交差反応性（ｃｒＯＴＣ）抗体を使用して、ＷＢによって測定した（図１１）。シクロオキシゲナーゼＩＶ（ＣｏｘＩＶ）をミトコンドリア対照として使用した。ＯＴＣタンパク質の発現レベルは、近赤外蛍光イメージングシステムによって測定し、総タンパク質に対して正規化した。ＷＢは、２０１６ｍＲＮＡおよび２２６０ｍＲＮＡがｓｐｆ／ａｓｈマウスに送られた場合のミトコンドリア分画およびサイトゾル分画内のＯＴＣ発現レベルの差異を示している。これらの結果は、両化合物がミトコンドリアを効率的に標的化することができることを示唆している。

【0190】

実施例１３：ｍＲＮＡコンストラクト２０１６および２２６０で処置したｓｐｆ／ａｓｈマウスサンプルのミトコンドリア分画およびサイトゾル分画のプロット。
Ｓｐｆ／ａｓｈマウスに、ＰＢＳまたは脂質製剤化ＯＴＣ－ｍＲＮＡのいずれかを３ｍｇ／ｋｇでＩＶ注射した。ＷＴマウスを内部対照として使用した。サンプル分画は、肝臓サンプルで、サイトゾル分画とミトコンドリア分画を分離して実施した。ＯＴＣレベルは、ヒト特異的抗体を使用して、ウエスタンブロットによって測定した。ＯＴＣタンパク質の発現レベルは、近赤外蛍光イメージングシステムによって測定し、総タンパク質に対して正規化された両方の分画をプロットした（図１２）。図１１（実施例１２）に示したタンパク質発現レベルのプロットは、２０１６と２２６０の両化合物がサイトゾルで同様のタンパク質レベルをデリバリーするにもかかわらず、２２６０が２０１６よりも多くのヒトＯＴＣをデリバリーするのはミトコンドリアにおいてであることを示唆している。２２６０は、本発明の修飾ミトコンドリアシグナル伝達ペプチド配列を含む。

【0191】

実施例１４：ｍＲＮＡコンストラクト２２６０で処置したｓｐｆ／ａｓｈマウスにおける尿中オロト酸塩レベル。
Ｓｐｆ／ａｓｈマウスに、ＰＢＳまたは脂質製剤化（実施例１に記載）ＯＴＣ－ｍＲＮＡのいずれかを１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇでＩＶ注射した。ＷＴマウスを内部対照として使用した。尿中オロト酸塩レベルを０、１、３、７および１４日目に測定し、レベルをクレアチニンに対して標準化した（図１３）。このアッセイの機能的読み出しは、尿中オロト酸塩レベルが化合物２２６０により最大１４日間まで用量依存的に減少することを示している。

【0192】

実施例１５：ＯＴＣ－ｍＲＮＡコンストラクト１７９９．７（５ＭｅＯＵ化学物質）による処置期間の高タンパク質食でのｓｐｆ／ａｈマウスの生存。
Ｓｐｆ／ａｓｈマウスに、ＰＢＳまたは脂質製剤化ＯＴＣ－ｍＲＮＡ（１７９９．７）のいずれかを３つの用量：０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇでＩＶ注射した。マウスに０日目から試験終了まで高タンパク食を与えた。処置した動物に、０、７、１４、２１および２８日目に静脈内注射した（矢印）。生存率を毎週決定した。図１４のプロットには、試験全体のタイムラインと異なる群で観察された生存率がまとめられている。結果からは、本明細書に記載したヒトＯＴＣｍＲＮＡで処置した動物が高アンモニア血症の発症期間中、生存する確率が高いことが明らかであり、動物を有毒アンモニアから解毒するにあたって本明細書に記載したＯＴＣｍＲＮＡの保護的役割を示唆している。この生存率は用量依存的であり、３ｍｇ／ｋｇの用量で処置した動物は、１ｍｇ／ｋｇまたは０．３ｍｇ／ｋｇで処置した動物よりも高い生存率を有した。

【0193】

実施例１６：異なる修飾によるｈＯＴＣ発現レベルの比較。
脂質製剤化ＯＴＣ－ｍＲＮＡコンストラクト２２６２投与は、８週齢のオスＣ５７ＢＬ／６マウスに１ｍｇ／ｋｇの用量でＩＶ注射した。図１５に提供したチャートの下軸に示したように、異なる化学物質をこの試験では使用した。マウス肝臓をＩＶ投与の２４時間後に採取し、ｈＯＴＣ特異的抗体を使用してウエスタンブロットを実施した。レベルを総タンパク質に対して正規化した（図１５）。それぞれのコンストラクトは、実施例１に記載したようにＡＴＸ脂質を含む脂質ナノ粒子として製剤化した。このデータセットは、本発明者らのコドン最適化ｍＲＮＡの発現レベルに対する異なるウリジン化学物質の効果を示している。

【0194】

本明細書で言及されている特許および科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立している。本明細書に引用されているすべての米国特許および公開または未公開の米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書に引用されているすべての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用されているすべての他の公開された参考文献、文書、原稿、および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0195】

本開示は、その好ましい実施形態を参照して詳細に示され、説明されてきたが、当業者には、添付の特許請求の範囲に包含される開示の範囲から逸脱することなく、形態および詳細に様々な変更を行うことができることは理解されよう。また、本明細書に記載した実施形態は相互に排他的なものではなく、本開示に従って様々な実施形態の特徴を全体的または部分的に組み合わせることができることも理解されたい。

【0196】

配列表

【表7】