▶ ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-02-28
(45)【発行日】2024-03-07
(54)【発明の名称】新規の抗ＰＤ－Ｌ１抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240229BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240229BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240229BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240229BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240229BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240229BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240229BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240229BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240229BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240229BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240229BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240229BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61P43/00 111
A61P35/00
A61P31/00
A61K39/395 N
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2022519049
(86)(22)【出願日】2020-09-24
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-01
(86)【国際出願番号】 CN2020117351
(87)【国際公開番号】W WO2021057836
(87)【国際公開日】2021-04-01
【審査請求日】2022-05-19
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2019/107689
(32)【優先日】2019-09-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】518330176
【氏名又は名称】ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ユンイン
(72)【発明者】
【氏名】リ，ジン
【審査官】田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５３１０３９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／１７９３９６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／０５３７０９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１８－５２６９７４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５２９３７５（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １６／００－１６／４６
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１つの抗ＰＤ－Ｌ１特異的免疫グロブリン単一可変ドメインＶＨＨを含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体であって、前記ＶＨＨがＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１が配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むか配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ２が配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含むか配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ３が配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含むか配列番号３に記載されるアミノ酸配列からなる、抗ＰＤ－Ｌ１抗体。
【請求項2】
前記ＶＨＨが配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体。
【請求項3】
抗ＰＤ－Ｌ１抗体がＰＤ－１アンタゴニストである、請求項１または２に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体。
【請求項4】
抗ＰＤ－Ｌ１抗体が単一ドメイン抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体。
【請求項5】
抗ＰＤ－Ｌ１抗体が重鎖単一ドメイン抗体である、請求項４に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体。
【請求項6】
前記ＶＨＨがアルパカまたはラマを含むラクダ類動物由来である、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体。
【請求項7】
前記ＶＨＨがイムノグロビン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）のＦｃドメイン、蛍光タンパク質または別の特異性を有するＶＨＨを含む別の分子に融合されている、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体。
【請求項8】
前記ＶＨＨがＩｇＧのＦｃドメインに融合されている、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体。
【請求項9】
抗ＰＤ－Ｌ１抗体がラクダ類動物由来のＶＨＨとヒトＩｇＧのＦｃドメインとのキメラ抗体である、請求項８に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体。
【請求項10】
抗ＰＤ－Ｌ１抗体がラクダ類動物由来のＶＨＨとヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃドメインとのキメラ抗体である、請求項９に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子。
【請求項12】
配列番号５に記載の核酸配列を含むかまたはそれからなる、請求項１１に記載の単離された核酸分子。
【請求項13】
請求項１１または１２に記載の単離された核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項14】
請求項１１または１２に記載の単離された核酸分子または請求項１３に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項15】
請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を少なくとも１つおよび薬学的に許容される担体を含む、患者におけるＰＤ－Ｌ１に関連する状態を処置するための医薬組成物。
【請求項16】
ＰＤ－Ｌ１に関連する状態ががんを含む増殖性障害または感染症であり、ここにおいて前記がんは乳房、肺、結腸、卵巣、メラノーマ、膀胱、腎臓、肝臓、唾液腺、胃、神経膠腫、甲状腺、胸腺、上皮、頭頸部、胃および膵臓がんからなる群から選択され、
感染症が慢性感染症である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項17】
－ 請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体をコードする核酸配列を含む宿主細胞を、抗ＰＤ－Ｌ１抗体を前記宿主細胞において発現する条件下で培養するステップ；および－ 前記宿主細胞から前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体を単離するステップ
のステップを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を調製するための方法。
【請求項18】
対象においてＰＤ－Ｌ１に関連する状態の処置に用いるための請求項１～１０のいずれかに１項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体であって、ここにおいて処置は、請求項１～１０のいずれかに１項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の治療有効量を対象に投与するステップを含む、抗ＰＤ－Ｌ１抗体。
【請求項19】
ＰＤ－Ｌ１に関連する状態が、がんを含む増殖性障害または感染症であり、前記がんが、乳房、肺、結腸、卵巣、メラノーマ、膀胱、腎臓、肝臓、唾液腺、胃、神経膠腫、甲状腺、胸腺、上皮、頭頸部、胃および膵臓がんからなる群から選択され、
前記感染症が慢性感染症である、請求項１８に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体。
【請求項20】
ＰＤ－Ｌ１に関連する状態を処置するまたは診断するためのキットであって、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む容器を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権の情報
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年９月２５日出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／１０７６８９の優先権を主張する。
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年９月２５日出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／１０７６８９の優先権を主張する。
【0002】
配列表
本出願は、配列表を含み、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、配列表を含み、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0003】
発明の分野
本出願は、概して、抗体に関する。より具体的には、本出願は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する単一ドメイン抗体、それを調製する方法、およびその使用に関する。
本出願は、概して、抗体に関する。より具体的には、本出願は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する単一ドメイン抗体、それを調製する方法、およびその使用に関する。
【背景技術】
【0004】
発明の背景
免疫チェックポイントを標的とすることが、がんを有する患者を処置するのにもっとも有望なアプローチとなっていることを示している、前臨床および臨床結果による根拠が増加している。
免疫チェックポイントを標的とすることが、がんを有する患者を処置するのにもっとも有望なアプローチとなっていることを示している、前臨床および臨床結果による根拠が増加している。
【0005】
タンパク質プログラム死１（ＰＤ－１）、ＣＤ２８に相同性を有する免疫グロブリンスーパーファミリーの阻害性メンバーは、Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞および骨髄細胞で発現されており（Ａｇａｔａら、上記；Ｏｋａｚａｋｉら、（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４巻：３９１７７９～８２ページ；Ｂｅｎｎｅｔｔら、（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０巻：７１１～８ページ）、免疫系において刺激および抑制シグナルを制御することに重要な役割を有する（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｔａｋｕら、２００７ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９巻：８１３～８２４ページ）。ＰＤ－１は、アポトーシス細胞における差次的発現についてのスクリーニングを通じて発見された（Ｉｓｈｉｄａら、（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ １１巻：３８８７～９５ページ）。
【0006】
ＰＤ－１は、Ｂ７ファミリーの細胞表面発現されているメンバーである、２つの周知のリガンドＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１またはＣＤ２７４とも名付けられる）およびＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣまたはＣＤ２７３とも名付けられる）を有する（Ｆｒｅｅｍａｎら、（２０００）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２巻：１０２７～３４ページ；Ｌａｔｃｈｍａｎら、（２００１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２巻：２６１～８ページ；Ｃａｒｔｅｒら、（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２巻：６３４～４３ページ）。ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２の両方は、ＰＤ－１に結合するＢ７ホモログであるが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しない。
【0007】
活性化Ｔ細胞で発現されるＰＤ－１と腫瘍細胞で発現されるＰＤ－Ｌ１との相互作用は、免疫応答を負に制御し、抗腫瘍免疫を減衰させる。ＰＤ－Ｌ１は、種々のヒトのがんにおいて豊富である（Ｄｏｎｇら、（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ ８巻：７８７～９ページ）。腫瘍でのＰＤ－Ｌ１の発現は、食道、膵臓および他の種類のがんの生存率の低下に関連し、腫瘍免疫治療のための有望な標的としてこの経路を強調している。いくつかのグループは、ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１相互作用が疾患を悪化させ、腫瘍浸潤リンパ球の減少、Ｔ細胞受容体媒介性増殖の減少およびがん性細胞による免疫回避を生じることを示している（Ｄｏｎｇら、（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８１巻：２８１～７ページ；Ｂｌａｎｋら、（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５４巻：３０７～３１４ページ；Ｋｏｎｉｓｈｉら、（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０巻：５０９４～１００ページ）。免疫抑制は、ＰＤ－Ｌ１を用いてＰＤ－１の局所相互作用を阻害することによって逆転され得る。
【0008】
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体である。全抗体と同様にそれは、特定の抗原に選択的に結合することができる。単一ドメイン抗体は、２つの重鎖タンパク質および２つの軽鎖から構成される一般的な抗体よりもはるかに小さい。最初の単一ドメイン抗体は、ラクダにおいて見出される重鎖抗体から操作され（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ，Ａｔａｒｈｏｕｃｈ Ｔ，Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｇ，Ｈａｍｅｒｓ Ｃ，Ｓｏｎｇａ ＥＢ，Ｂｅｎｄａｈｍａｎ Ｎ，Ｈａｍｅｒｓ Ｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３６３巻（６４２８）：４４６～４４８ページ）；これらは、ＶＨＨ断片と呼ばれる。現在、単一ドメイン抗体についての大部分の研究は、重鎖可変ドメインに基づいている。
【0009】
単一ドメイン抗体は、多数の有利点を有する。例えばそれらは、一般に高い溶解度および安定性を示し、酵母、植物および哺乳動物細胞においても容易に産生され得る（Ｈａｒｍｓｅｎ ＭＭ，Ｄｅ Ｈａａｒｄ ＨＪ（２００７）Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｍｅｌｉｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７７巻（１号）：１３～２２ページ）。さらにそれらは、良好な熱安定性および良好な組織浸透を有する。それらは、産生において費用効率も高い。単一ドメイン抗体の有利点は、それらを種々の生物工学的および治療応用のために好適にする。例えばそれらは、これだけに限らないが、がん、感染性、炎症性および神経変性疾患が挙げられる疾患の処置において有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
ＰＤ－Ｌ１に対する抗体が開発されたが、治療剤としてのＰＤ－Ｌ１に対する抗体にはまだ改善の余地がある。さらに、現在ＰＤ－Ｌ１に対する単一ドメイン抗体がほとんどないことは注目に値する。したがって、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、特にＰＤ－Ｌ１に対する単一ドメイン抗体を開発する要求が当該技術分野にある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
発明の概要
これらおよび他の目的が、本開示により提供されるが、本開示は、広義において、改善された有効性を有する抗体を提供する化合物、方法、組成物、および製品を対象とする。本開示によって提供される利点は、抗体治療薬および診断薬の分野において広く適用可能であり、様々な標的と反応する抗体と併せて使用することができる。本開示は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、好ましくは単一ドメイン抗体を提供する。抗体を調製するための方法、抗ＰＤ－Ｌ１抗体をコードする核酸分子、発現ベクターおよび抗ＰＤ－Ｌ１抗体の発現のために使用される宿主細胞も提供される。本開示の抗体は、ＰＤ－Ｌ１に関連する状態を処置するまたは予防するための方法を提供する。
これらおよび他の目的が、本開示により提供されるが、本開示は、広義において、改善された有効性を有する抗体を提供する化合物、方法、組成物、および製品を対象とする。本開示によって提供される利点は、抗体治療薬および診断薬の分野において広く適用可能であり、様々な標的と反応する抗体と併せて使用することができる。本開示は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、好ましくは単一ドメイン抗体を提供する。抗体を調製するための方法、抗ＰＤ－Ｌ１抗体をコードする核酸分子、発現ベクターおよび抗ＰＤ－Ｌ１抗体の発現のために使用される宿主細胞も提供される。本開示の抗体は、ＰＤ－Ｌ１に関連する状態を処置するまたは予防するための方法を提供する。
【0012】
一部の態様では、本開示はＰＤ－Ｌ１結合分子を対象とする。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、以下の特性：
（ａ）ヒトＰＤ－Ｌ１に１×１０－９Ｍまたはそれよりも低いＫＤで結合すること；
（ｂ）ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を阻害すること；
（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＩＦＮ－γまたはＩＬ－２の産生を誘導すること；
（ｄ）ヒトＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８０およびＣＤ８６に実質的に結合しないこと；
（ｅ）ヒト、マウスまたはカニクイザルＰＤ－Ｌ１に交差反応性を有すること；および
（ｆ）少なくとも６０℃で安定であること
のうちの１つまたは複数を有する。
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、以下の特性：
（ａ）ヒトＰＤ－Ｌ１に１×１０－９Ｍまたはそれよりも低いＫＤで結合すること；
（ｂ）ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を阻害すること；
（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＩＦＮ－γまたはＩＬ－２の産生を誘導すること；
（ｄ）ヒトＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８０およびＣＤ８６に実質的に結合しないこと；
（ｅ）ヒト、マウスまたはカニクイザルＰＤ－Ｌ１に交差反応性を有すること；および
（ｆ）少なくとも６０℃で安定であること
のうちの１つまたは複数を有する。
【0013】
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、ここでＶＨＨはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む。
【0014】
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、ここでＶＨＨはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ３は配列番号３に記載されるアミノ酸配列からなる。
【0015】
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、ここでＶＨＨは
（Ａ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；または
（Ｃ）配列番号４と比較して１個もしくは複数（例えば、１個、２個、３個、４、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個）のアミノ酸の付加、欠失および／もしくは置換を含むアミノ酸配列
を含む。
（Ａ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；または
（Ｃ）配列番号４と比較して１個もしくは複数（例えば、１個、２個、３個、４、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個）のアミノ酸の付加、欠失および／もしくは置換を含むアミノ酸配列
を含む。
【0016】
一部の実施形態ではＰＤ－Ｌ１結合分子は、ＰＤ－１アンタゴニスト、例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。
【0017】
一部の実施形態ではＰＤ－Ｌ１結合分子は、単一ドメイン抗体、例えば重鎖単一ドメイン抗体である。
【0018】
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。
一部の実施形態では、ＶＨＨは、アルパカまたはラマを含むラクダ類動物由来である。
一部の実施形態では、ＶＨＨは、アルパカまたはラマを含むラクダ類動物由来である。
【0019】
一部の実施形態では、ＶＨＨはイムノグロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）のＦｃドメイン、蛍光タンパク質または別の特異性を有するＶＨＨを含む別の分子に融合されている。
【0020】
一部の実施形態では、ＶＨＨはＩｇＧのＦｃドメインに融合されている。さらなる実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子はラクダ類動物由来のＶＨＨとヒトＩｇＧのＦｃドメインとのキメラ抗体である。さらなる実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、ラクダ類動物由来のＶＨＨとヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃドメインとのキメラ抗体である。
【0021】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＰＤ－Ｌ１結合分子は、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を阻害するまたは遮断することにおいて使用される。
【0022】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＰＤ－Ｌ１結合分子は、対象においてＰＤ－Ｌ１に関連する状態を処置するまたは予防することにおいて使用される。
【0023】
一部の態様では、本開示は、本明細書に開示されるＰＤ－Ｌ１結合分子と同じエピトープについて競合するＰＤ－Ｌ１結合分子を対象とする。
【0024】
一部の態様では、本開示は、本明細書に開示されるＰＤ－Ｌ１結合分子をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を対象とする。
【0025】
一部の実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号５に記載される核酸配列を含むかまたはそれからなる。
【0026】
一部の態様では、本開示は本明細書に開示されるＰＤ－Ｌ１結合分子をコードする核酸分子を含む発現ベクターを対象とする。
【0027】
一部の態様では、本開示は本明細書に開示される発現ベクターを含む宿主細胞を対象とする。
【0028】
一部の実施形態では、宿主細胞は、これだけに限らないが、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、真菌細胞（例えば、酵母）または哺乳動物細胞から選択される。
【0029】
一部の態様では、本開示は、本明細書に開示される少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１結合分子および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を対象とする。
【0030】
一部の態様では、本開示は、上に定義される発現ベクターを含む宿主細胞を、ＰＤ－Ｌ１結合分子を宿主細胞において発現する条件下で培養するステップ；および宿主細胞からＰＤ－Ｌ１結合分子を単離するステップを含む、ＰＤ－Ｌ１結合分子を調製するための方法を対象とする。
【0031】
一部の態様では、本開示は、本明細書に開示されるＰＤ－Ｌ１結合分子の治療有効量を対象に投与するステップを含む、対象においてＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を阻害するまたは遮断するための方法を対象とする。
【0032】
一部の態様では、本開示は、本明細書に開示されるＰＤ－Ｌ１結合分子の治療有効量を対象に投与するステップを含む、対象においてＰＤ－Ｌ１に関連する状態を処置する方法を対象とする。
【0033】
一部の実施形態では、対象は、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニストに応答しやすい障害または状態を有するとして同定される。
【0034】
一部の態様では、本開示は、本明細書に開示されるＰＤ－Ｌ１結合分子の治療有効量を対象に投与するステップを含む、免疫応答の上方制御から利益を受ける対象における状態を処置する方法を対象とする。
【0035】
一部の実施形態では、対象はＰＤ－Ｌ１の発現が上方制御されている。
一部の態様では、本開示は、がんなどの増殖性障害を処置するまたは予防するための医薬の製造における、本明細書において開示されるＰＤ－Ｌ１結合分子の使用を対象とする。
一部の態様では、本開示は、がんなどの増殖性障害を処置するまたは予防するための医薬の製造における、本明細書において開示されるＰＤ－Ｌ１結合分子の使用を対象とする。
【0036】
一部の態様では、本開示は、免疫応答の上方制御から利益を受ける状態を処置するまたは予防するための医薬の製造における本明細書に開示されるＰＤ－Ｌ１結合分子の使用を対象とする。
【0037】
一部の実施形態では、状態はがんを含む増殖性障害または感染症である。
一部の実施形態では、がんは、乳房、肺、結腸、卵巣、メラノーマ、膀胱、腎臓、肝臓、唾液腺、胃、神経膠腫、甲状腺、胸腺、上皮、頭頸部がん、胃および膵臓がんからなる群から選択される。
一部の実施形態では、がんは、乳房、肺、結腸、卵巣、メラノーマ、膀胱、腎臓、肝臓、唾液腺、胃、神経膠腫、甲状腺、胸腺、上皮、頭頸部がん、胃および膵臓がんからなる群から選択される。
【0038】
一部の実施形態では、感染症は慢性感染症である。
一部の態様では、本開示は、本明細書に開示されるＰＤ－Ｌ１結合分子を使用するキットまたはデバイスおよび関連する方法ならびにがんなどの増殖性障害の処置のために有用である本明細書に開示される医薬組成物を対象とする。この目的で、本開示は、好ましくは、そのような障害を処置するのに有用な製品であって、本明細書に開示されるＰＤ－Ｌ１結合分子を含む容器、ならびに本明細書に開示されるＰＤ－Ｌ１結合分子を増殖性障害またはその進行もしくは再発の処置、緩和、または予防に使用するための指示材料を含む、製品を提供する。選択された実施形態では、デバイスおよび関連方法は、少なくとも１つの循環腫瘍細胞を本明細書に開示されるＰＤ－Ｌ１結合分子に接触させるステップを含む。
一部の態様では、本開示は、本明細書に開示されるＰＤ－Ｌ１結合分子を使用するキットまたはデバイスおよび関連する方法ならびにがんなどの増殖性障害の処置のために有用である本明細書に開示される医薬組成物を対象とする。この目的で、本開示は、好ましくは、そのような障害を処置するのに有用な製品であって、本明細書に開示されるＰＤ－Ｌ１結合分子を含む容器、ならびに本明細書に開示されるＰＤ－Ｌ１結合分子を増殖性障害またはその進行もしくは再発の処置、緩和、または予防に使用するための指示材料を含む、製品を提供する。選択された実施形態では、デバイスおよび関連方法は、少なくとも１つの循環腫瘍細胞を本明細書に開示されるＰＤ－Ｌ１結合分子に接触させるステップを含む。
【0039】
上記は、概要であり、したがって、必然的に、詳細の単純化、一般化、および省略を含み、結果として、当業者であれば、この概要が、例示にすぎず、決して制限することを意図するものではないことが理解される。本明細書に記載される方法、組成物、および／もしくはデバイス、ならびに／または他の主題の他の態様、特徴、および利点は、本明細書に記載される教示において明らかとなろう。この概要は、単純化された形式で概念の抜粋を紹介するために提供されており、この概念は、以下の詳細な説明においてさらに記載されている。この概要は、特許請求される主題の重要な特徴または必須の特徴を特定することを意図するものではなく、特許請求される主題の範囲の決定を支援するものとして使用されることを意図するものでもない。さらに、本出願全体を通じて引用されるすべての参考文献、特許、および公開された特許出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】ＭＦＩ（中央値蛍光強度）によって表され、ＦＡＣＳによって測定された細胞表面ＰＤ－Ｌ１への抗ＰＤ－Ｌ１抗体の結合を示すグラフである。図１Ａは、細胞表面ヒトＰＤ－Ｌ１への抗ＰＤ－Ｌ１抗体の結合を示す。図１Ｂは、細胞表面マウスＰＤ－Ｌ１への抗ＰＤ－Ｌ１抗体の結合を示す。図１Ｃは、細胞表面サルＰＤ－Ｌ１への抗ＰＤ－Ｌ１抗体の結合を示す。
【図2A】ＦＡＣＳによって測定された、細胞表面ＰＤ－Ｌ１またはＣＤ８０へのＰＤ－１の結合の抗ＰＤ－Ｌ１抗体による遮断を示すグラフである。図２Ａは、細胞表面ヒトＰＤ－Ｌ１へのヒトＰＤ－１の結合の抗ＰＤ－Ｌ１抗体による遮断を示す。
【図2B】ＦＡＣＳによって測定された、細胞表面ＰＤ－Ｌ１またはＣＤ８０へのＰＤ－１の結合の抗ＰＤ－Ｌ１抗体による遮断を示すグラフである。図２Ｂは細胞表面マウスＰＤ－Ｌ１へのマウスＰＤ－１の結合の抗ＰＤ－Ｌ１抗体による遮断を示す。
【図2C】ＦＡＣＳによって測定された、細胞表面ＰＤ－Ｌ１またはＣＤ８０へのＰＤ－１の結合の抗ＰＤ－Ｌ１抗体による遮断を示すグラフである。図２Ｃは、細胞表面ヒトＣＤ８０へのヒトＰＤ－Ｌ１の結合の抗ＰＤ－Ｌ１抗体による遮断を示す。
【図3】ＥＬＩＳＡによって測定されたヒトＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８０およびＣＤ８６への交差反応性を示すグラフである。
【図4】基準抗体に対する抗体ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１のエピトープビニングを示すグラフである：（Ａ）ＢＭＫ６およびＢＭＫ８に対するビニング、ならびに（Ｂ）ＢＭＫ９に対するビニング。
【図5】ＥＬＩＳＡによって測定され、ＩＬ－２（ｐｇ／ｍＬ）またはＩＦＮ－γ（ｎｇ／ｍｌ）のレベルに反映されるヒト同種混合リンパ球反応（Ａｌｌｏ－ＭＬＲ）または自己ＭＬＲへの抗ＰＤ－Ｌ１抗体の効果を示すグラフである。図５Ａは、ヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２）のレベルに反映される、ヒトＡｌｌｏ－ＭＬＲへの抗ＰＤ－Ｌ１抗体の効果を示す。図５Ｂは、ヒトＩＦＮ－γ（ｈＩＦＮ－γ）のレベルに反映される、ヒトＡｌｌｏ－ＭＬＲへの抗ＰＤ－Ｌ１抗体の効果を示す。図５Ｃは、ヒトＩＦＮ－γ（ｈＩＦＮ－γ）のレベルに反映される、ヒト自己ＭＬＲへの抗ＰＤ－Ｌ１抗体の効果を示す。
【図6】ＥＬＩＳＡによって測定され、ＩＬ－２（ｐｇ／ｍＬ）のレベルまたはカウント毎分（ＣＰＭ）に反映される、マウス同種ＭＬＲへの抗ＰＤ－Ｌ１抗体の効果を示すグラフである。図６Ａは、マウスＩＬ－２（ｍＩＬ－２）のレベルに反映される、マウス同種ＭＬＲへの抗ＰＤ－Ｌ１抗体の効果を示す。図６Ｂは、ＣＰＭのレベルに反映される、マウス同種ＭＬＲへの抗ＰＤ－Ｌ１抗体の効果を示す。
【図7】ＰＤ－Ｌ１トランスフェクト細胞での抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＡＤＣＣ試験の結果を示すグラフである。
【図8】ＰＤ－Ｌ１トランスフェクト細胞での抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＣＤＣ試験の結果を示すグラフである。
【図9】フローサイトメトリーによって測定された血清安定性試験の結果を示すグラフである。
【図10】ＤＳＦ（示差走査蛍光定量）アッセイによる熱安定性試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0041】
発明の詳細な説明
本開示は、多数の異なる形態で実施され得るが、本明細書では、本開示の原理を例示する、その特定の例示的な実施形態が開示される。本開示は、例示される特定の実施形態に限定されないことが強調されるべきである。さらに、本明細書に使用される任意の節見出しは、構成上の目的のためのものにすぎず、記載される主題を制限するものとみなされるものではない。
本開示は、多数の異なる形態で実施され得るが、本明細書では、本開示の原理を例示する、その特定の例示的な実施形態が開示される。本開示は、例示される特定の実施形態に限定されないことが強調されるべきである。さらに、本明細書に使用される任意の節見出しは、構成上の目的のためのものにすぎず、記載される主題を制限するものとみなされるものではない。
【0042】
本明細書に別途定義されない限り、本開示と関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって別途必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。より具体的には、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別途明確に指示されない限り、複数形の参照物を含む。したがって、例えば、「タンパク質（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」への参照は、複数のタンパク質を含み、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への参照は、細胞の混合物を含むなどである。本出願において、「または」の使用は、別途示されない限り、「および／または」を意味する。さらに、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語、ならびに他の形態、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの使用は、制限するものではない。加えて、本明細書および添付の特許請求の範囲に提供される範囲は、両端点および端点間のすべての点を含む。
【0043】
一般に、本明細書において記載される細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションと関連して使用される命名法ならびにこれらの技法は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されている。本開示の方法および技法は、一般に、別途示されない限り、当該技術分野において周知であり、また様々な一般文書ならびに本明細書を通じて列挙および考察されるより具体的な参考文献に記載されている、従来的な方法に従って行われる。例えば、Ａｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ（２０１０年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２年）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８年）；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３年）を参照されたい。本明細書において記載される解析化学、合成有機化学、ならびに薬化学および医薬化学と関連して使用される命名法ならびにこれらの実験室手順および技法は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されている。さらに、本明細書に使用される任意の節見出しは、構成上の目的のためのものにすぎず、記載される主題を制限するものとみなされるものではない。
【0044】
定義
本開示をより理解するために、関連する用語の定義および説明を、以下に提供する。
本開示をより理解するために、関連する用語の定義および説明を、以下に提供する。
【0045】
「抗体」または「Ａｂ」という用語は、本明細書において使用される場合、所望の生物学的または結合活性を示す任意の形態の抗体を一般に指す。これは、これだけに限らないが、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ抗体および単一ドメイン抗体を網羅する。抗体は、重鎖および軽鎖を含み得る。重鎖は、μ、δ、γ、α、およびεに分類することができ、これらは、抗体のアイソタイプを、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定義する。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）からなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、さらに、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される）に分割することができ、超可変領域には、比較的保存的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と称される）が散在している。それぞれのＶＨおよびＶＬは、以下の順序の３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる：Ｎ末端からＣ末端に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。様々な領域またはドメインにおけるアミノ酸の分布は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７年および１９９１年））またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１～９１７ページ；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ ３４２巻：８７８～８８３ページにおける定義に従う。抗体は、異なる抗体アイソタイプのものであってもよく、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体であってもよい。
【0046】
「ヒト化抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされている抗体を指す。追加のフレームワーク領域改変が、ヒトフレームワーク配列内に行われてもよい。
【0047】
「キメラ抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指す。
【0048】
「ＰＤ－１」という用語は、本明細書において使用される場合、免疫グロブリンのスーパーファミリーに属し、免疫系を負に制御する共抑制（ｃｏ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）受容体として機能するプログラム細胞死タンパク質を指す。ＰＤ－１は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーのメンバーであり、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２を含む２つの周知のリガンドを有する。ＰＤ－１についての代替名または同義語として、ＰＤＣＤ１、ＰＤ１、ＣＤ２７９およびＳＬＥＢ２などが挙げられる。ヒトＰＤ－１の代表的なアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号：ＮＰ＿００５００９．２に開示されており、ヒトＰＤ－１をコードする代表的な核酸配列はＮＣＢＩ受託番号：ＮＭ＿００５０１８．２に示されている。
【0049】
「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、本明細書において使用される場合、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１、例えば、Ｆｒｅｅｍａｎら、（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２巻：１０２７ページを参照されたい）を指す。ＰＤ－Ｌ１についての代替名または同義語として、ＰＤＣＤ１Ｌ１、ＰＤＬ１、Ｂ７Ｈ１、ＣＤ２７４およびＢ７－Ｈなどが挙げられる。ヒトＰＤ－Ｌ１の代表的なアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号：ＮＰ＿０５４８６２．１に開示されており、ヒトＰＤ－Ｌ１をコードする代表的な核酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号：ＮＭ＿０１４１４３．３に示されている。ＰＤ－Ｌ１は、胎盤、脾臓、リンパ節、胸腺、心臓、胎児肝において発現されており、多数の腫瘍またはがん細胞でも見出される。ＰＤ－Ｌ１は、活性Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄系細胞で発現されるその受容体ＰＤ－１またはＢ７－１に結合する。ＰＤ－Ｌ１とその受容体との結合は、サイトカイン産生およびＴ細胞増殖のＴＣＲ媒介性活性化を抑制するシグナル伝達を誘導する。したがって、ＰＤ－Ｌ１は、妊娠、自己免疫疾患、組織同種移植などの特定の事象の際の免疫系の抑制において重要な役割を果たし、腫瘍またはがん細胞が免疫学的チェックポイントを回避し、免疫応答を逃れられるようにすると考えられている。
【0050】
「ＰＤ－Ｌ２」という用語は、本明細書において使用される場合、プログラム細胞死リガンド２を指す。ＰＤ－Ｌ２についての代替名または同義語として、ＰＤＣＤ１Ｌ２、ＰＤＬ２、Ｂ７－ＤＣ、ＢｔｄｃおよびＣＤ２７３などが挙げられる。ヒトＰＤ－Ｌ２の代表的なアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号：ＮＰ＿０７９５１５．２に開示されている。
【0051】
「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、ＰＤ－１（例えば、ヒト、サルまたはサルＰＤ－１）に特異的に結合することができる抗体を指す。抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、診断および／または治療用の使用を提供するために十分である親和性でＰＤ－Ｌ１に特異的に結合することは有利である。
【0052】
「Ｋａ」という用語は、本明細書において使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度を指すことを意図し、一方で、「Ｋｄ」という用語は、本明細書において使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことを意図する。抗体のＫｄ値は、当該技術分野において十分に確立された方法を使用して判定することができる。「ＫＤ」という用語は、本明細書において使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の解離定数を指すことを意図し、これは、ＫｄのＫａに対する比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫｄを判定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用すること、好ましくは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによるものである。
【0053】
「特異的結合」または「特異的に結合」という用語は、本明細書において使用される場合、２つの分子間、例えば、抗体と抗原との間などの非無作為結合反応を指す。
【0054】
「結合を阻害する」「結合を遮断する」または「同じエピトープについて競合する」能力は、本明細書において使用される場合、２つの分子（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１と抗ＰＤ－Ｌ１抗体）の間の結合相互作用を任意の検出可能な程度で阻害する抗体の能力を指す。一部の実施形態では、２つの分子間の結合を遮断する抗体は、２つの分子間の結合相互作用を少なくとも５０％阻害する。一部の実施形態では、この阻害は、６０％を超える、７０％を超える、８０％を超えるまたは９０％を超える場合がある。
【0055】
ＩｇＧ抗体に関する「高親和性」という用語は、本明細書において使用される場合、標的抗原に対して、１×１０－７Ｍまたはそれよりも低い、より好ましくは５×１０－８Ｍまたはそれよりも低い、さらにより好ましくは１×１０－８Ｍまたはそれよりも低い、さらにより好ましくは５×１０－９Ｍまたはそれよりも低い、さらにより好ましくは１×１０－９Ｍまたはそれよりも低いＫＤを有する抗体を指す。
【0056】
「半数効果濃度」とも称される「ＥＣ５０」という用語は、本明細書において使用される場合、指定された曝露時間の後に、ベースラインと最大値との中間の応答を誘導する、薬物、抗体、または毒物の濃度を指す。本出願の文脈において、ＥＣ５０は、「ｎＭ」単位で表される。
【0057】
「エピトープ」という用語は、本明細書において使用される場合、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部分を指す。「エピトープ」は、「抗原決定基」としても知られている。エピトープまたは抗原決定基は、一般に、アミノ酸、炭水化物、または糖側鎖など、分子の化学的に活性な表面基からなり、一般に、特定の３次元構造および特定の電荷特徴を有する。例えば、エピトープは、一般に、「線形」であっても「立体構造」であってもよい固有の空間構成に、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個の保存的または非保存的アミノ酸を含む。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻、Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編（１９９６年）を参照されたい。線形エピトープの場合、タンパク質と相互作用分子（例えば、抗体）との間のすべての相互作用部位は、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線形で存在する。立体構造エピトープの場合、相互作用部位は、タンパク質において互いに離れているアミノ酸残基にわたる。抗体は、当業者に公知の従来的な技法によって、同じエピトープへの結合の競合性に応じて、スクリーニングすることができる。例えば、競合または交差競合に関する研究を行って、抗原への結合に関して互いに競合または交差競合する抗体を得ることができる（例えば、ＲＳＶ融合タンパク質）。交差競合に基づいた、同じエピトープに結合する抗体を得るためのハイスループット方法は、国際特許出願第０３／４８７３１号に記載されている。
【0058】
「単離された」という用語は、本明細書において使用される場合、人工的な手段によって天然の状態から得られた状態を指す。ある特定の「単離された」物質または成分が天然に存在するとすれば、それは、その天然の環境が変化することに起因して可能であるか、またはその物質は天然の環境から単離されているか、またはその両方である。例えば、ある特定の単離されていないポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ある特定の生きた動物の体内に天然に存在しており、そのような天然の状態から高い純度で単離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドと称される。「単離された」という用語は、混合された人工もしくは合成の物質も、単離された物質の活性に影響を及ぼさない他の不純物質も、排除するものではない。
【0059】
「単離された抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、異なる抗原特異性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図する（例えば、ＰＤ－１タンパク質に特異的に結合する単離された抗体は、ＰＤ－１タンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＰＤ－１タンパク質に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原、例えば、他の種に由来するＰＤ－１タンパク質との交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【0060】
「ベクター」という用語は、本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチドが中に挿入され得る核酸ビヒクルを指す。ベクターが、中に挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、ベクターは、発現ベクターと称される。ベクターは、宿主細胞への形質転換、形質導入、またはトランスフェクションによって、保持する遺伝子材料エレメントを宿主細胞において発現させることができる。ベクターは、当業者には周知であり、ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）など、ファージ、例えば、λファージまたはＭ１３ファージなど、ならびに動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターとして使用することができる動物ウイルスとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルスなど）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０など）が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、およびレポーター遺伝子を含むがこれらに限定されない、発現を制御するための複数のエレメントを含み得る。加えて、ベクターは、複製起点を含み得る。
【0061】
「宿主細胞」という用語は、本明細書において使用される場合、ベクターが導入され得る細胞を指し、これだけに限らないが、原核細胞、例えば大腸菌または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、真菌細胞、例えば酵母細胞またはアスペルギルス、昆虫細胞、例えば、Ｓ２ショウジョウバエ細胞またはＳｆ９および動物細胞、例えば、線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞またはヒト細胞が挙げられる。
【0062】
ＣＨＯ細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞を指し、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＧ４４などの多数の市販されているサブクローンを含む。その中でもＣＨＯ－Ｋ１は、発現プラットホームとして一般に使用される。ＣＨＯ－Ｋ１は、ＡＴＣＣ、ＥＣＡＣＣ、ＤＳＭＺおよび多数の他の企業から市販されている。
【0063】
「Ｔ細胞」という用語は、本明細書において使用される場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞、Ｔヘルパー２型Ｔ細胞、Ｔヘルパー１７型Ｔ細胞および抑制性Ｔ細胞を含む。
【0064】
「同一性」という用語は、本明細書において使用される場合、２つもしくはそれより多くのポリペプチド分子または２つもしくはそれより多くの核酸分子の配列間の、配列をアライメントし、比較することによって判定される、関係性を指す。「同一性パーセント」とは、比較される複数の分子のアミノ酸またはヌクレオチド間における同一な残基のパーセントを意味し、比較されている複数の分子のうちの最も小さい方のサイズに基づいて計算される。これらの計算について、アライメントにおけるギャップ（存在する場合）は、好ましくは、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処される。アライメントされた核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用することができる方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）、１９８８年、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）、１９９３年、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ、（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）、１９９４年、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）、１９９１年、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；ならびにＣａｒｉｌｌｏら、１９８８年、ＳＩＡＭＪ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８巻：１０７３ページに記載されるものが挙げられる。
【0065】
「免疫原性」という用語は、本明細書において使用される場合、生物において特定の抗体の形成または感作されたリンパ球を刺激する能力を指す。これは、最終的に抗体および感作されたリンパ球などの免疫学的エフェクター物質を生成するように、抗原が特定の免疫細胞を活性化、増殖、および分化するように刺激する特性を指すだけでなく、生物を抗原で刺激した後に、抗体または感作されたＴリンパ球が生物の免疫系において形成され得る、特定の免疫応答も指す。免疫原性は、抗原のもっとも重要な特性である。抗原が、宿主において免疫応答の生成を誘導するのに成功し得るかどうかは、抗原の特性、宿主の反応性、および免疫付与手段という３つの因子に依存する。
【0066】
「トランスフェクション」または「トランスフェクトする」という用語は、本明細書において使用される場合、核酸が真核生物細胞、特に哺乳動物細胞に導入されるプロセスを指す。トランスフェクションのプロトコールおよび技法としては、脂質トランスフェクション、ならびに化学的および物理的方法、例えば、エレクトロポレーションなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかのトランスフェクション技法が、当該技術分野において周知であり、本明細書に開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２巻：４５６ページ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（上記）；Ｄａｖｉｓら、１９８６年、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕら、１９８１年、Ｇｅｎｅ １３巻：１９７ページを参照されたい。
【0067】
「ＳＰＲ」または「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書において使用される場合、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ ａｎｄ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することにより、リアルタイムでの生体特異的相互作用の分析を可能にする、光学的現象を指し、それを含む。さらなる説明については、実施例５、ならびにＪｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．ら（１９９３年）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１巻：１９～２６ページ、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．ら（１９９１年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１巻：６２０～６２７ページ、Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．ら（１９９５年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８巻：１２５～１３１ページ、およびＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．ら（１９９１年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８巻：２６８～２７７ページを参照されたい。
【0068】
「蛍光活性化細胞分取」または「ＦＡＣＳ」という用語は、本明細書において使用される場合、特化した種類のフローサイトメトリーを指す。これは、生物学的細胞の不均質混合物を、それぞれの細胞の特異的光分散および蛍光特徴に基づいて、一度に１つの細胞ずつ、２つまたはそれより多くの容器へと分取するための方法を提供する（ＦｌｏｗＭｅｔｒｉｃ．「Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｏｕｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ」．２０１７年１１月０９日に取得）。ＦＡＣＳを実行するための機器は、当業者に公知であり、市販されている。そのような機器の例としては、Ｂｅｃｔｏｎ ＤｉｃｋｉｎｓｏｎからのＦＡＣＳ Ｓｔａｒ Ｐｌｕｓ、ＦＡＣＳｃａｎ、およびＦＡＣＳｏｒｔ機器（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＤｉｖｉｓｉｏｎからのＥｐｉｃｓ Ｃ（Ｈｉａｌｅａｈ、Ｆｌａ．）、ならびにＣｙｔｏｍａｔｉｏｎからのＭｏＦｌｏ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ、Ｃｏｌｏ．）が挙げられる。
【0069】
「対象」という用語には、任意のヒトまたは非ヒト動物、好ましくは、ヒトが含まれる。
【0070】
「ＰＤ－Ｌ１に関連する状態」または「ＰＤ－Ｌ１に関連する状態」という用語は、本明細書において使用される場合、ＰＤ－Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１）の発現または活性の増加または減少によって生じる、悪化される、または他に関連する任意の状態を指す。
【0071】
「がん」という用語は、本明細書において使用される場合、任意のまたは腫瘍もしくは悪性細胞の成長、増殖、または転移に媒介される固形腫瘍および非固形腫瘍、例えば、白血病などを指し、医学的状態を開始する。
【0072】
「処置」、「処置すること」、または「処置される」という用語は、本明細書において状態を処置する文脈で使用される場合、概して、ヒトのものか動物のものかにかかわらず、何らかの所望される治療効果、例えば、状態の進行の阻害が達成される、処置および治療法に関し、これには、進行速度の低減、進行速度の停止、状態の退縮、状態の緩和、および状態の治癒が挙げられる。予防的措置（すなわち、予防、防止）としての処置もまた含まれる。がんに関して、「処置すること」とは、腫瘍または悪性細胞の成長、増殖、もしくは転移、またはこれらの何らかの組合せを減衰または減速させることを指し得る。腫瘍に関して、「処置」には、腫瘍の全体もしくは一部の除去、腫瘍の成長および転移を阻害もしくは減速させること、腫瘍の発達を予防もしくは遅延すること、またはこれらの何らかの組合せが含まれる。
【0073】
「治療有効量」という用語は、本明細書において使用される場合、所望される処置レジメンに従って投与したときに、何らかの所望される治療効果をもたらすのに有効であり、妥当な利益／危険性比に見合った、活性化合物、または活性化合物を含む材料、組成物、もしくは投薬形態の量に関する。具体的には「治療有効量」は、ヒトＰＤ－１関連疾患または状態を処置するために有効な量または濃度の抗体を指す。
【0074】
本開示における「宿主細胞」は、本明細書において使用される場合、外来性ポリヌクレオチドが導入された細胞を指す。
【0075】
「治療有効量」または「有効量」という用語は、本明細書において使用される場合、ヒトＰＤ－１関連疾患または状態を処置するために有効な量または濃度の薬物を指す。
【0076】
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書において使用される場合、ビヒクル、希釈剤、賦形剤、および／またはそれらの塩が、製剤中の他の成分と化学的および／または物理的に適合性であり、レシピエントと生理学的に適合性であることを意味する。
【0077】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体および／または賦形剤」という用語は、対象および活性剤と薬理学的および／または生理学的に適合性の担体および／または賦形剤であり、これは、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ編、第１９版、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５年を参照されたい）、これには、ｐＨ調節剤、界面活性剤、アジュバント、およびイオン強度増強剤が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ｐＨ調節剤としては、リン酸緩衝液が挙げられるがこれに限定されず、界面活性剤としては、カチオン性、アニオン性、または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０が挙げられるがこれらに限定されず、イオン強度増強剤としては、塩化ナトリウムが挙げられるがこれに限定されない。
【0078】
本明細書において使用される場合、「アジュバント」という用語は、非特異的免疫強化剤を指し、これは、抗原と一緒に生物に送達されるか、または生物に事前に送達された場合に、抗原に対する免疫応答を増強させることができるか、または生物における免疫応答の種類を変化させることができる。アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント）、コリネバクテリウム・パルバム（ｃｏｒｙｎｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、リポ多糖、サイトカインなどが挙げられるがこれらに限定されない、様々なアジュバントがある。フロイントアジュバントは、現在、動物実験においてもっとも一般的に使用されているアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは、臨床試験においてより一般的に使用されている。
【0079】
ＰＤ－Ｌ１結合分子
一部の態様では、本開示はＰＤ－Ｌ１結合分子を含む。
一部の態様では、本開示はＰＤ－Ｌ１結合分子を含む。
【0080】
一般的な意味ではＰＤ－Ｌ１結合分子は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する任意の分子を含み得る。一部の状況では、「ＰＤ－Ｌ１結合分子」は、「ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト」を含み得る。「ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト」は、免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫＴ細胞）上に発現されるＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合を遮断する任意の化学物質または生体分子を指す。ＰＤ－Ｌ１結合分子またはＰＤ－１アンタゴニストは、ポリペプチドまたはタンパク質、例えば、抗体、さらに詳細には抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり得る。
【0081】
抗体として、これだけに限らないが、キメラ抗体、ヒト化抗体または単一ドメイン抗体が挙げられる。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、単一単量体可変抗体ドメインからなる抗体を一般に指す単一ドメイン抗体である。全抗体と同様に単一ドメイン抗体は、特定の抗原に選択的に結合することができる。
【0082】
さらに具体的には、ＰＤ－Ｌ１結合分子は、単一ドメイン重鎖抗体であり、「ＶＨＨ」、「ＶＨＨ抗体」、「ＶＨＨドメイン」、「ＶＨＨ抗体断片」、「ＶＨＨ」または「ナノボディ」などの用語と互換可能に使用される。その中でラクダ科抗体由来のＶＨＨ分子は、周知の最小のインタクトな抗原結合性ドメイン（およそ１５ｋＤａ、または従来的なＩｇＧの１０分の１）であり、それにより密な組織への送達に、および高分子間の限られた空間に接近するために適している。
【0083】
本明細書で開示される本開示の単一ドメイン抗体は、当該技術分野において周知の方法または任意の今後の方法により当業者によって作製され得る。例えば、ＶＨＨは、ラクダを免疫化し、それからハイブリドーマを得ることによって、または当該技術分野において周知の分子生物学技術を使用する本開示のＶＨＨのライブラリーのクローニングおよび続くファージディスプレイを使用する選択によってなどの当該技術分野において周知の方法を使用して得ることができる。
【0084】
例えば、単一ドメイン抗体は、所望の抗原を用いてラマまたはアルパカを免疫処置することおよび続く、重鎖抗体をコードするｍＲＮＡの単離によって得ることができる。逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応によって、数１００万個のクローンを含有する単一ドメイン抗体の遺伝子ライブラリーは産生される。ファージディスプレイおよびリボソームディスプレイなどのスクリーニング技術は、抗原に結合するクローンを同定することを助ける。１つの技法は、抗体（例えば、ヒト抗体）のライブラリーをファージにおいて合成し、このライブラリーを目的の抗原またはその抗体結合性部分でスクリーニングし、抗原に結合するファージを単離し、そこから免疫反応性断片を得ることができる、ファージディスプレイである。このようなライブラリーを調製し、スクリーニングする方法は、当該技術分野において周知であり、ファージディスプレイライブラリーを生成するためのキットが、市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７－９４００－０１およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリーを生成し、スクリーニングするのに使用することができる他の方法および試薬も存在する（例えば、Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８巻：７９７８～７９８２ページ（１９９１年）を参照されたい）。
【0085】
最も強力なクローンが同定されると、それらのＤＮＡ配列は、例えば、親和性成熟またはヒト化によって最適化される。ヒト化は、抗体に対するヒト生物の免疫学的反応を防ぐことができる。
【0086】
したがって、単一ドメイン抗体は（１）天然に存在する重鎖抗体のＶＨＨドメインを単離することによって；（２）天然に存在するＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列の発現によって；（３）天然に存在するＶＨＨドメインの「ヒト化」（以下に記載される通り）によって、もしくはかかるヒト化ＶＨＨドメインをコードする核酸の発現によって；（４）任意の動物種、特にヒト由来などの哺乳動物種由来の天然に存在するＶＨドメインの「ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚａｔｉｏｎ）」によって、もしくはかかるラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現によって；（５）「ドメイン抗体」もしくはＷａｒｄら、（上記）によって記載された「Ｄａｂ」の「ラクダ化」によって、もしくはかかるラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現によって；（６）タンパク質、ポリペプチドもしくは他のアミノ酸配列を調製するために合成もしくは半合成技術を使用して；（７）核酸合成のための技術を使用して、ＶＨＨをコードする核酸を調製することに続いてそのように得られた核酸の発現によって；および／または（８）前述の任意の組合せによって、得ることができる。前述のものを実施するために好適な方法および技術は、本明細書の開示に基づいて当業者に明らかであり、例えば本明細書以下にさらに詳細に記載される方法および技術を含む。
【0087】
単一ドメイン抗体は、免疫化した動物から得られた血液、リンパ節または脾臓ｃＤＮＡ由来の可変ドメインレパートリーのファージディスプレイベクターへのＰＣＲクローニングによって通常生成される。抗原特異的単一ドメイン抗体は、固定化した抗原、例えば、試験管のプラスチック表面にコートされた抗原、ストレプトアビジンビーズに固定されたビオチン化抗原または細胞の表面に発現された膜タンパク質でファージライブラリーをパニングすることによって一般に選択される。ａｄＡｂの親和性は、この戦略をｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣することによってしばしば改善され得る、例えばＣＤＲ領域の部位特異的変異導入、ストリンジェンシーが増加した条件下（より高い温度、高いまたは低い塩濃度、高いまたは低いｐＨおよび低い抗原濃度）の固定化抗原でのさらなるラウンドのパニングによる（Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉら、Ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｏｏｌｓ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００９）１９８巻：１５７～１７４ページ）。
【0088】
抗原またはエピトープに特異的に結合するＶＨＨを調製するための方法は、参考文献に記載されている、例えば：Ｒ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４０巻（２０００）１８５～１９５ページ；Ｌｉら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２８７巻（２０１２）１３７１３～１３７２１ページ；Ｄｅｆｆａｒら、Ａｆｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８巻（１２号）２６４５ページ，１７ Ｊｕｎｅ，２００９およびＷＯ９４／０４６７８。
【0089】
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子中のＶＨＨは、抗体のＦｃ－ドメイン、例えばＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１）のＦｃ－ドメインに融合される。特定の実施形態では、Ｆｃ－ドメインはヒトＩｇＧ１のＦｃ－ドメインである。ＶＨＨをＦｃドメインに融合することによって、エフェクター機能をリクルートするためにさらに効率的になり得る。同様に、ＶＨＨのＦｃドメインへの融合は、ＰＤ－Ｌ１結合分子が二量体を形成することを助けることができ、ｉｎ ｖｉｖｏでＰＤ－Ｌ１結合分子の半減期の延長も助けられ得る。
【0090】
「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」または「ＡＤＣＣ」という用語は、本明細書において使用される場合、分泌されたＩｇが、ある特定の細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合することにより、これらの細胞毒性エフェクター細胞が、抗原を保持する標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒素により標的細胞を殺滅させることを可能にする、細胞毒性の形態を指す。抗体は、細胞毒性細胞を「武装」させ、そのような殺滅に絶対的に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、一方で単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血系細胞におけるＦｃＲの発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９巻：４５７～９２ページ（１９９１年）の４６４ページの表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイ、例えば、米国特許第５，５００，３６２号および同第５，８２１，３３７号に記載されているものを、行ってもよい。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替として、または追加として、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ） ９５巻：６５２～６５６ページ（１９９８年）に開示されているものなどの動物モデルにおいて、評価することができる。
【0091】
「補体依存性細胞毒性」または「ＣＤＣ」という用語は、補体の存在下における標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化は、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）の、同種抗原に結合した抗体（適切なサブクラスのもの）への結合によって開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２巻：１６３ページ（１９９６年）に記載されているものを、行うことができる。
【0092】
記載の簡便さのために、ＰＤ－Ｌ１結合分子は以下のセクションにおいて抗ＰＤ－Ｌ１抗体と記載される。
【0093】
ある特定の特性を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体
本開示の抗体は、抗体の特定の機能的特長または特性によって特徴付けられる。一部の実施形態では、抗体は、以下の特性：
（ａ）ヒトＰＤ－Ｌ１に１×１０－９Ｍまたはそれよりも低いＫＤで結合すること；
（ｂ）ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を阻害すること；
（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＩＦＮ－γまたはＩＬ－２の産生を誘導すること；
（ｄ）ヒトＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８０およびＣＤ８６に実質的に結合しないこと；
（ｅ）ヒト、マウスまたはカニクイザルＰＤ－Ｌ１に交差反応性を有すること；および
（ｆ）少なくとも６０℃で安定であること
のうちの１つまたは複数を有する。
本開示の抗体は、抗体の特定の機能的特長または特性によって特徴付けられる。一部の実施形態では、抗体は、以下の特性：
（ａ）ヒトＰＤ－Ｌ１に１×１０－９Ｍまたはそれよりも低いＫＤで結合すること；
（ｂ）ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を阻害すること；
（ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＩＦＮ－γまたはＩＬ－２の産生を誘導すること；
（ｄ）ヒトＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８０およびＣＤ８６に実質的に結合しないこと；
（ｅ）ヒト、マウスまたはカニクイザルＰＤ－Ｌ１に交差反応性を有すること；および
（ｆ）少なくとも６０℃で安定であること
のうちの１つまたは複数を有する。
【0094】
本開示の抗体は、細胞表面ＰＤ－Ｌ１に、高い親和性で結合する。本開示の抗体のＰＤ－Ｌ１への結合は、当該技術分野において十分に確立されている１つまたは複数の技法、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して、評価することができる。本開示の抗体の結合特異性はまた、抗体の、ＰＤ－Ｌ１タンパク質を発現する細胞への結合を、例えば、フローサイトメトリーによってモニタリングすることによって、判定することもできる。例えば、抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現する細胞株、例えば、ＰＤ－Ｌ１をその細胞表面上に発現するようにトランスフェクトされているＣＨＯ細胞と抗体を反応させる、フローサイトメトリーアッセイによって試験することができる。追加または代替として、結合動態（例えば、Ｋｄ値）を含む、抗体の結合を、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイにおいて試験することができる。なおも他の好適な結合アッセイとしては、例えば、組換えＰＤ－Ｌ１タンパク質を使用した、ＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。例えば、本開示の抗体は、細胞表面（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１）タンパク質に１×１０－７Ｍまたはそれよりも低い、５×１０－８Ｍまたはそれよりも低い、２×１０－８Ｍまたはそれよりも低い、５×１０－９Ｍまたはそれよりも低い、４×１０－９Ｍまたはそれよりも低い、３×１０－９Ｍまたはそれよりも低い、２×１０－９Ｍまたはそれよりも低い、１×１０－９Ｍまたはそれよりも低い、５×１０－１０Ｍまたはそれよりも低い、１×１０－１０Ｍまたはそれよりも低いＫＤで結合する。
【0095】
一部の実施形態では、本開示の抗体は、カニクイザルまたはサルＰＤ－Ｌ１にＦＡＣＳによる測定で、約１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭまたは０．０１ｎＭ以下のＥＣ５０で結合する。
【0096】
一部の実施形態では、本開示の抗体は、ヒトＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を例えばＥＬＩＳＡによる測定で、０．２ｎＭから１００ｎＭ（例えば、０．２ｎＭから５０ｎＭ、０．２ｎＭから３０ｎＭ、０．２ｎＭから２０ｎＭ、０．２ｎＭから１０ｎＭまたは１ｎＭから１０ｎＭ）のＩＣ５０で阻害する。
【0097】
本開示の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１に特異的である。一部の実施形態では、抗体はＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６に結合しない。例えば、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６との結合親和性は、ＰＤ－Ｌ１との結合親和性の１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満である。
【0098】
一部の実施形態では本開示の抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を遮断し、それにより、例えば、活性化Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞など）からのサイトカイン産生を誘導すること、活性化Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞など）の増殖を誘導すること、ならびにＴ ｒｅｇの抑制機能を元に戻すこと、を含む生物学的活性を提供する。例示的サイトカインは、ＩＬ－２およびＩＦＮγを含む。「ＩＬ－２」という用語は、インターロイキン２、白血球細胞（例えば、白血球）の活性を制御する免疫系におけるサイトカインシグナル伝達分子の一種を指す。「インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）」という用語は、ナチュラルキラー（ＮＫ）、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によって産生されるサイトカインであり、マクロファージの重要な活性化因子、および主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）分子発現の誘導因子である。サイトカイン産生は、当該技術分野において周知の方法を使用して、例えばＥＬＩＳＡによって決定され得る。方法は、Ｔ細胞の増殖を検出するためにも使用でき、［３Ｈ］チミジン取込みアッセイを含む。
【0099】
ＣＤＲを含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体
一部の実施形態では、本明細書に開示される抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、ここでＶＨＨはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、ここでＶＨＨはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む。
【0100】
それぞれのＣＤＲに対するアミノ酸の割り当ては、別途示されない限り、Ｋａｂａｔら（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）、ＵＳ Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＰＨＳ、ＮＩＨ、ＮＩＨ公開番号９１－３２４２、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７年、ＰＭＩＤ：３６８１９８１、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年、ＰＭＩＤ：２６８７６９８、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６年、ＰＭＩＤ：８８７６６５０、またはＤｕｂｅｌ編（２００７年）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第３版、Ｗｉｌｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ａｎｄ Ｃｏによって提供される番号付けスキームのうちのいずれかによるものであり得る。
【0101】
抗体配列の可変領域およびＣＤＲは、当該技術分野において開発された（上述のように、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステムなどの）一般則に従って、または配列を公知の可変領域のデータベースにアライメントすることによって、特定することができる。これらの領域を特定する方法は、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２００１年、およびＤｉｎａｒｅｌｌｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ、２０００年に記載されている。例示的な抗体配列データベースは、Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３３巻（データベース版）：Ｄ６７１～Ｄ６７４（２００５年）に記載されるように、「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ（Ａ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｅｎｇｌａｎｄにより維持されている）およびＶＢＡＳＥ２ウェブサイトｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇに記載されており、これらを通じてアクセスすることができる。好ましくは、配列は、Ａｂｙｓｉｓデータベースを通じて分析され、このデータベースは、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）からの配列データを、ＰＤＢからの構造データと統合するものである。Ｄｒ．Ａｎｄｒｅｗ Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎの著書、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ ＭａｎｕａｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ．の章（編：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＩＳＢＮ－１３巻：９７８－３５４０４１３５４７、ウェブサイトｂｉｏｉｎｆｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓでも入手可能）を参照されたい。Ａｂｙｓｉｓデータベースのウェブサイトは、本明細書の教示に従って使用することができるＣＤＲを特定するために開発された一般則もさらに含む。別途示されない限り、本明細書に記載されるすべてのＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従ってＡｂｙｓｉｓデータベースのウェブサイトにより得られる。
【0102】
一部の実施形態では、本明細書に開示される抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、ここでＶＨＨはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ３は配列番号３に記載されるアミノ酸配列からなる。
【0103】
特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、１つのＶＨＨを含み、ここでＶＨＨはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ２は配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ３は配列番号３に記載されるアミノ酸配列からなる。
【0104】
抗ＰＤ－Ｌ１抗体はＶＨＨの配列を介して定義される
一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、ここでＶＨＨは、
（Ａ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号４に少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；または
（Ｃ）配列番号４と比較して１個もしくは複数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個）のアミノ酸の付加、欠失および／もしくは置換を含むアミノ酸配列
を含むかまたはそれからなる。
一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、ここでＶＨＨは、
（Ａ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号４に少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列；または
（Ｃ）配列番号４と比較して１個もしくは複数（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個）のアミノ酸の付加、欠失および／もしくは置換を含むアミノ酸配列
を含むかまたはそれからなる。
【0105】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４巻：１１～１７ページ、１９８８年）を使用して、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用して、判定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性の割合は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８巻）：４４４～４５３ページ（１９７０年））によって、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかおよび１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ加重および１、２、３、４、５または６の長さ加重を使用して判定することができる。
【0106】
追加または代替として、本開示のタンパク質配列は、さらに、例えば、関連する配列を特定するために公的データベースに対する検索を実施するための「クエリ配列」として使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３～１０ページのＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。本開示の抗体分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行することができる。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻（１７号）：３３８９～３４０２ページに記載されるようなギャップ付きＢＬＡＳＴを利用できる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
【0107】
一部の実施形態では、ＶＨＨのアミノ酸配列は、配列番号４に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【0108】
一部のさらなる実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、重鎖および／または軽鎖の可変領域におけるアミノ酸の保存的置換または改変を含み得る。抗原結合を除去しないある特定の保存的配列改変が行われてもよいことが、当該技術分野において理解される。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２巻：１１８０～８ページ、ｄｅ Ｗｉｌｄｔら（１９９７年）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０巻：８３５～４１ページ、Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖら（１９９７年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２巻：２６８６４～２６８７０ページ、Ｈａｌｌら（１９９２年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９巻：１６０５～１２ページ、ＫｅｌｌｅｙおよびＯ’ Ｃｏｎｎｅｌｌ （１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２巻：６８６２～３５ページ、Ａｄｉｂ－Ｃｏｎｑｕｙら（１９９８年）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０巻：３４１～６ページ、ならびにＢｅｅｒｓら（２０００年）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６巻：２８３５～４３ページを参照されたい。
【0109】
上述のように、「保存的置換」という用語は、本明細書において使用される場合、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的な特性に悪影響を及ぼすこともそれを変化させることもない、アミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、当該技術分野において公知の標準的な技法、例えば、部位特異的突然変異生成およびＰＣＲに媒介される突然変異生成などによって、導入され得る。保存的アミノ酸置換としては、アミノ酸残基が、対応するアミノ酸残基に類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば、物理的または機能的に類似（例えば、類似のサイズ、形状、電荷、共有結合もしくは水素結合を形成する能力を含む化学的特性などを有するなど）の残基で置換される、置換を含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、アルカリ性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、およびヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシンなど）、ならびに芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、対応するアミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基で置換される。アミノ酸の保存的置換を特定するための方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２巻：１１８０～１１８７ページ（１９９３年）、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２巻（１０号）：８７９～８８４ページ（１９９９年）、およびＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４巻：４１２～４１７ページ（１９９７年）を参照されたく、これらは、参照により本明細書に組み込まれる）。
【0110】
一部の特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は１つのＶＨＨを含み、ＶＨＨは配列番号４に記載されるアミノ酸配列からなる。一実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は配列番号４に記載されるアミノ酸配列からなる１つのＶＨＨからなり、この抗体は本開示の文脈において「ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－Ｉｇ４」と名付けられる。
【0111】
一部の他の特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃドメインに融合された１つのＶＨＨを含むキメラ抗体である。一実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、１つのＶＨＨおよびヒトＩｇＧ１のＦｃドメインからなるキメラ抗体であり、本開示の文脈において「ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１」と名付けられる。
【0112】
ビニング（Ｂｉｎｎｉｎｇ）およびエピトープマッピング
開示される抗体が、選択された標的またはその断片によって提示される分離したエピトープまたは免疫原決定基（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）と会合する、またはそれに結合することはさらに理解される。一部の実施形態では、エピトープまたは免疫原決定基として、アミノ酸、糖側鎖、リン酸基またはスルホニル基などの化学的に活性な表面の分子グループが挙げられる。一部の実施形態では、エピトープは、特定の三次元的構造特徴および／または特定の電荷特徴を有する場合がある。したがって、本明細書において使用される場合、用語「エピトープ」は、免疫グロブリンもしくはＴ細胞受容体に特異的に結合できるまたは、そうでなければ分子と相互作用できる任意のタンパク質決定基を含む。一部の実施形態では、タンパク質および／または高分子の複合混合物中のその標的抗原を選択的に認識する場合に、抗体は抗原に特異的に結合する（または免疫特異的に結合もしくは反応する）と称される。一部の実施形態では、平衡解離定数（ＫＤ）が１０－６Ｍ以下または１０－７Ｍ以下である場合、より好ましくはＫＤが１０－８Ｍ以下である場合、およびさらにより好ましくはＫＤが１０－９Ｍ以下である場合に、抗体は抗原に特異的に結合すると称される。
開示される抗体が、選択された標的またはその断片によって提示される分離したエピトープまたは免疫原決定基（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）と会合する、またはそれに結合することはさらに理解される。一部の実施形態では、エピトープまたは免疫原決定基として、アミノ酸、糖側鎖、リン酸基またはスルホニル基などの化学的に活性な表面の分子グループが挙げられる。一部の実施形態では、エピトープは、特定の三次元的構造特徴および／または特定の電荷特徴を有する場合がある。したがって、本明細書において使用される場合、用語「エピトープ」は、免疫グロブリンもしくはＴ細胞受容体に特異的に結合できるまたは、そうでなければ分子と相互作用できる任意のタンパク質決定基を含む。一部の実施形態では、タンパク質および／または高分子の複合混合物中のその標的抗原を選択的に認識する場合に、抗体は抗原に特異的に結合する（または免疫特異的に結合もしくは反応する）と称される。一部の実施形態では、平衡解離定数（ＫＤ）が１０－６Ｍ以下または１０－７Ｍ以下である場合、より好ましくはＫＤが１０－８Ｍ以下である場合、およびさらにより好ましくはＫＤが１０－９Ｍ以下である場合に、抗体は抗原に特異的に結合すると称される。
【0113】
近接アミノ酸から形成されたエピトープ（「直鎖状」または「連続的」エピトープと称される場合もある）は、タンパク質変性の際に典型的には保持される一方で、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、タンパク質変性の際に典型的には失われる。いずれにしても抗体エピトープは、典型的には、固有の空間的コンフォメーションにある少なくとも３個、通常は少なくとも５個または８～１０個のアミノ酸を含む。
【0114】
この点において、一部の実施形態では、エピトープは、例えば抗ＰＤ－Ｌ１抗体の１つまたは複数の領域、ドメインまたはモチーフに会合できるまたはそこに存在し得ることは理解される。同様に、当技術分野において認められている用語「モチーフ」は、その一般的意味に従って使用され、典型的には１０から２０個の近接アミノ酸残基であるタンパク質の短い、保存された領域を一般に指す。
【0115】
いずれにしても、抗原上の望ましいエピトープが決定され、例えば、本開示に記載の技術を使用してエピトープを含むペプチドを用いて免疫化することによって、そのエピトープに対する抗体を生成することができる。代替的に、発見プロセスの際に抗体の生成および特徴付けは、特定のドメインまたはモチーフに位置付けられた望ましいエピトープについての情報を明らかにすることができる。次にこの情報から、同じエピトープへの結合について抗体を競合的にスクリーニングすることができる。これを達成するためのアプローチは、互いに競合的に結合する、すなわち抗体が抗原への結合について競合する、抗体を見出すための競合研究を行うことである。抗体をそれらの交差競合に基づいてビニングするためのハイスループットプロセスは、ＷＯ０３／４８７３１に記載されている。抗体競合または酵母での抗原断片発現を含む、ビニングまたはドメインレベルまたはエピトープマッピングの他の方法は、当技術分野において十分周知である。
【0116】
本明細書において使用される場合、用語「ビニング」は、抗体をそれらの抗原結合特徴および競合に基づいてグループ化または分類するために使用される方法を指す。本技術は、本開示の抗体を定義し、カテゴリー化するために有用である一方でビンは、エピトープと必ずしも直接関連せず、エピトープ結合のそのような仮決定は、当技術分野においておよび本明細書に記載される当技術分野において認められた他の方法によってさらに改良および確認され得る。しかし、個々のビンへの抗体の経験的割り当てが本開示の抗体の治療可能性を示し得る情報を提供することは、理解される。
【0117】
さらに具体的には、当技術分野において周知および本明細書の実施例に記載される方法を使用することによって、選択された参照抗体（またはその断片）が同じエピトープに結合するかどうか、または第２の検査抗体との結合について競合する（すなわち、同じビンにある）かどうかを決定できる。
【0118】
他の適合可能なエピトープマッピング技術として、アラニンスキャンニング突然変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８巻：４４３～６３ページ）（その全体が参照により明確に本明細書に組み込まれる）またはペプチド切断分析が挙げられる。加えて、エピトープの切り出し、エピトープ抽出および抗原の化学修飾などの方法も使用され得る（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９巻：４８７～４９６ページ）（その全体が参照により明確に本明細書に組み込まれる）。
【0119】
本発明の抗体をコードする核酸分子
一部の態様では、本開示は、本明細書において開示されるＶＨＨをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を対象とする。
一部の態様では、本開示は、本明細書において開示されるＶＨＨをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を対象とする。
【0120】
本開示の核酸は、標準的分子生物学技術を使用して得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られた（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）抗体について、かかる抗体をコードする核酸は、遺伝子ライブラリーから回収することができる。
【0121】
本開示の例示的核酸分子は、配列番号５に記載されるものである。一部の実施形態では、核酸は配列番号５に少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）配列同一性を共有する。一部の実施形態では、同一性の百分率は、遺伝コードの縮重に由来し、コードされたタンパク質配列は未変化のままである。
【0122】
抗ＰＤ－Ｌ１抗体をコードする核酸分子は、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のため、または発現のために当該技術分野において周知の組換え技術を使用してベクターに導入され得る。別の実施形態では抗体は、当該技術分野において周知の相同組換えによって産生され得る。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来的な手順（例えば、抗体の重鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）を使用して容易に単離され、配列決定される。多数のベクターは利用可能である。ベクター構成成分は、これだけに限らないが以下の：シグナル配列、複製開始点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１α）および転写終結配列のうちの１つまたは複数を一般に含む。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、および同第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、薬物、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートなどに対する耐性を付与する。選択可能なマーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともに、ｄｈｆｒ－宿主細胞において使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を挙げることができる。
【0123】
一部の実施形態では、ベクター系は、哺乳動物、細菌性、酵母系などを含み、これだけに限らないが、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ－Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ４２０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２などのプラスミドならびに他の実験室および市販のベクターを含む。好適なベクターとして、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。本開示の一実施形態では、ベクターはｐＥＴ、例えばヘキサ－ヒスチジン－およびｃ－Ｍｙｃ－タグの遺伝子を含むｐＥＴｂａｃであり得る。
【0124】
ＰＤ－Ｌ１結合分子をコードする核酸配列を含むベクターは、クローニングまたは遺伝子発現のために宿主細胞に導入され得る。本明細書のベクター中のＤＮＡをクローニングまたは発現するために好適な宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核生物細胞である。この目的のために好適な原核生物として、真正細菌、グラム陰性またはグラム陽性生物など、例えば腸内細菌科、例えばエシェリキア、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えば、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア、例えばセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）および赤痢菌ならびに桿菌、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス、例えば緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ならびにストレプトマイセスが挙げられる。
【0125】
原核生物に加えて、糸状性真菌または酵母などの真核微生物は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体をコードするベクターのための好適なクローニングまたは発現宿主である。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または一般的なパン酵母は、下等真核宿主微生物において最も一般的に使用される。しかしながら、多数の他の属、種および株は、一般に利用可能であり、本明細書において有用である、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）；クリベロマイセス宿主、例えば、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ウィッカーラミ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ウォルティ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）およびＫ．マーキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）など；ヤロウイア（ＥＰ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ；トリコデルマ・レシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）；シュワンニオマイセス、例えばシュワンニオマイセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；ならびに糸状性真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）など、ならびにアスペルギルス宿主、例えば偽巣性コウジ菌（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）など。
【0126】
本明細書で提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体の発現のために好適な他の宿主細胞は、多細胞生物由来である。無脊椎動物細胞の例は、植物および昆虫細胞を含む。多数のバキュロウイルス株および変異体ならびに対応する許容昆虫宿主細胞、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（カ）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（カ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）およびボンビックスモリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）などの宿主由来、が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株は、公的に入手可能である、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ－１変異体およびボンビックスモリＮＰＶのＢｍ－５株、ならびにかかるウイルスは、本開示により本明細書におけるウイルスとして、特に、ヨトウガ細胞のトランスフェクションのために使用され得る。ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物は、宿主としても利用され得る。
【0127】
宿主細胞は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体産生のために上に記載の発現またはクローニングベクターを用いて形質転換され、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択するまたは所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適するように変更された従来的な栄養培地において培養される。
【0128】
本明細書で提供される抗ＰＤ－Ｌ１抗体を産生するために使用される宿主細胞は、種々の培地で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、基礎培地（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）Ｓｉｇｍａ）などの市販されている培地は、宿主細胞を培養するために好適である。加えて、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；もしくは第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許登録（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｒｅ．）第３０，９８５号に記載されている任意の培地は、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。任意のこれらの培地は、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ薬など）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物と定義される）およびグルコースまたは等価のエネルギー源を必要に応じて補充されてよい。任意の他の必要な補充物も当業者に周知である適切な濃度で含まれてよい。温度、ｐＨなどの培養物条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前使用されたものであり、当業者に明らかである。
【0129】
組換え技術を使用する場合、抗体は細胞内で、細胞膜周辺腔で産生され得る、または培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第１のステップとして、粒子性デブリ、宿主細胞または溶解された断片のいずれもは、例えば遠心分離または限外ろ過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０巻：１６３～１６７ページ（１９９２）は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順を記載している。簡潔には、細胞ペーストは、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分かけて解凍される。細胞デブリは、遠心分離によって除かれ得る。抗体が培地に分泌される場合、一般にそのような発現系由来の上清は、市販されているタンパク質濃度フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｕｎｉｔを使用して最初に濃縮される。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために任意の前述のステップに含まれてよく、抗生物質は、外来性の混入物の増殖を妨げるために含まれてよい。
【0130】
細胞から調製される抗体は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、ＤＥＡＥ－セルロースイオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、塩析および、親和性クロマトグラフィーを、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技術であるとして使用して精製され得る。
【0131】
任意の予備精製ステップに続いて、目的の抗体および混入物を含む混合物は、約２．５～４．５の間のｐＨの溶出緩衝液を使用して、好ましくは低塩濃度（例えば、約０～０．２５Ｍ塩）で実施される低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供され得る。
【0132】
医薬組成物
一部の態様では、本開示は、本明細書に開示される少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１結合分子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象とする。
一部の態様では、本開示は、本明細書に開示される少なくとも１つのＰＤ－Ｌ１結合分子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象とする。
【0133】
組成物の構成成分
医薬組成物は、別の抗体または薬物などの１つまたは複数の追加的な薬学的活性成分を任意選択で含有し得る。本開示の医薬組成物は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体がワクチンに対する免疫応答を増強するように、例えば別の免疫刺激剤、抗がん剤、抗ウイルス剤またはワクチンを用いた併用治療で投与されてよい。薬学的に許容される担体として、例えば、薬学的に許容される液体、ゲルまたは固体担体、水性媒体、非水性媒体、抗菌剤、等張剤、緩衝液、抗酸化剤、麻酔剤、懸濁剤／分散剤、キレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤または無毒性補助物質、構成成分の当技術分野において周知の他の種々の組合せなどが少なくとも挙げられる。
医薬組成物は、別の抗体または薬物などの１つまたは複数の追加的な薬学的活性成分を任意選択で含有し得る。本開示の医薬組成物は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体がワクチンに対する免疫応答を増強するように、例えば別の免疫刺激剤、抗がん剤、抗ウイルス剤またはワクチンを用いた併用治療で投与されてよい。薬学的に許容される担体として、例えば、薬学的に許容される液体、ゲルまたは固体担体、水性媒体、非水性媒体、抗菌剤、等張剤、緩衝液、抗酸化剤、麻酔剤、懸濁剤／分散剤、キレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤または無毒性補助物質、構成成分の当技術分野において周知の他の種々の組合せなどが少なくとも挙げられる。
【0134】
好適な構成成分として、例えば、抗酸化剤、注入剤、結合剤、崩壊剤、緩衝液、保存剤、潤滑剤、香味剤、増粘剤、着色剤、乳化剤または糖およびシクロデキストリンなどの安定剤が挙げられる。好適な抗酸化剤として、例えば、メチオニン、アルコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、メルカプトグリセリン、チオグリコール酸、メルカプトソルビトール、ブチルメチルアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンおよび／またはプロピルガラクテ（ｐｒｏｐｙｌｇａｌａｃｔｅ）が挙げられる。本開示に開示されるとおり、抗体を含有する本開示の組成物は、抗体の酸化を低減するためにメチオニンなどの１つまたは複数の抗酸化剤を含む。酸化還元は、結合親和性の減少を妨げるまたは低減することができ、それにより抗体安定性を増強し、保存期間を延長する。したがって一部の実施形態では、本開示は、１つまたは複数の抗体およびメチオニンなどの１つまたは複数の抗酸化剤を含む組成物を提供する。本開示は、抗体がメチオニンなどの１つまたは複数の抗酸化剤と混合されており、それによりその抗体が、保存期間を延長するおよび／または活性の増加のために、酸化を妨げられる種々の方法をさらに提供する。
【0135】
さらに例示するために、薬学的に許容される担体として、例えば、水性ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、等張ブドウ糖注射剤、滅菌注射用水もしくはブドウ糖および乳酸リンゲル注射剤など、非水性ビヒクル、例えば植物由来の固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油もしくはピーナッツ油など、静菌もしくは静真菌濃度での抗菌剤、等張剤、例えば塩化ナトリウムもしくはブドウ糖など、緩衝液、例えばリン酸もしくはクエン酸緩衝液など、抗酸化剤、例えば硫酸水素ナトリウムなど、局所麻酔、例えばプロカイン塩酸塩など、懸濁および分散剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒロドキシプロピルメチルセルロースもしくはポリビニルピロリドンなど、乳化剤、例えばポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ－８０）など、封鎖もしくはキレート剤、例えばＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）もしくはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）など、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸が挙げられる。担体として利用される抗菌剤は、フェノールまたはクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムならびにベンゼトニウム塩化物を含む複数用量容器中で医薬組成物に加えられてよい。好適な賦形剤として、例えば水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセリンまたはエタノールが挙げられる。好適な無毒補助物質として、例えば、湿潤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解促進剤（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｅｒ）または薬剤、例えば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンまたはシクロデキストリンなどが挙げられる。
【0136】
投与、製剤および投与量
本開示の医薬組成物は、これだけに限らないが、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、頭蓋内、心臓内、脳室内、気管内、頬側、直腸内、腹腔内、皮内、局所、経皮的およびくも膜下腔内が挙げられる種々の経路によって、または他にインプラントまたは吸入によってそれを必要とする対象にｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。対象組成物は、これだけに限らないが、錠剤、カプセル、粉剤、顆粒剤、軟膏、液剤、座薬、浣腸、注射、吸入薬およびアエロゾルが挙げられる；固体、流動体、液体またはガス形態にある調製物に製剤化され得る。適切な製剤および投与の経路は、目的の適用および治療レジメンにより選択され得る。
本開示の医薬組成物は、これだけに限らないが、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、頭蓋内、心臓内、脳室内、気管内、頬側、直腸内、腹腔内、皮内、局所、経皮的およびくも膜下腔内が挙げられる種々の経路によって、または他にインプラントまたは吸入によってそれを必要とする対象にｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。対象組成物は、これだけに限らないが、錠剤、カプセル、粉剤、顆粒剤、軟膏、液剤、座薬、浣腸、注射、吸入薬およびアエロゾルが挙げられる；固体、流動体、液体またはガス形態にある調製物に製剤化され得る。適切な製剤および投与の経路は、目的の適用および治療レジメンにより選択され得る。
【0137】
経腸的投与のために好適な製剤として、ハードおよびソフトゼラチンカプセル、丸剤、コート剤を含む錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップまたは吸入剤ならびにこれらの放出制御形態が挙げられる。
【0138】
非経口投与（例えば、注射による）のために好適な製剤として、活性成分が溶解、懸濁または他に（例えば、リポソームもしくは他の微粒子中に）提供される、水性または非水性、等張、発熱物質不含有、滅菌液（例えば、溶液、懸濁物）が挙げられる。かかる液体は、抗酸化剤、緩衝液、保存剤、安定剤、静菌剤、懸濁剤、増粘剤および、製剤を目的のレシピエントの血液（または他の関連する体液）と等張にする溶質などの他の薬学的に許容される成分を追加的に含有できる。賦形剤の例として、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油などが挙げられる。かかる製剤における使用のための好適な等張性担体の例として、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液または乳酸リンゲル注射液が挙げられる。同様に、具体的な投与量レジメン、すなわち用量、時期および反復は具体的な個体および個々の病歴ならびに薬物動態（例えば、半減期、クリアランス速度など）などの経験的考察に依存する。
【0139】
投与の頻度は、治療経過を通じて決定および調整されてよく、増殖性または腫瘍原性細胞の数を低減すること、かかる新生物細胞の低減を維持すること、新生物細胞の増殖を低減することまたは転移の発生を遅延することに基づく。一部の実施形態では、投与される投与量は、潜在的な副作用および／または毒性を管理するために調整または減じられてよい。代替的に、対象治療組成物の持続的連続的な放出製剤（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、好適である場合がある。
【0140】
好適な投与量が患者によって変動する場合があることは、当業者によって理解される。最適投与量を決定することは、治療有効性のレベルに対する任意のリスクまたは有害な副作用のバランスに一般に関与する。選択された投与量レベルは、これだけに限らないが、具体的な化合物の活性、投与の経路、投与の時期、化合物の排出速度、処置の継続期間、併用において使用される他の薬物、化合物および／または材料、状態の重症度ならびに患者の人種、性別、年齢、体重、状態、全体的な健康状態および病歴が挙げられる種々の要因に依存する。一般に投与量は、作用部位で局所濃度を達成し、実質的に害があるまたは有害な副作用を生じることなく望ましい効果を達成するように選択されるが、化合物の量および投与の経路は、最終的には医師、獣医師または臨床医の裁量である。
【0141】
一般にＰＤ－Ｌ１結合分子は、種々の範囲で投与され得る。一部の実施形態では、本明細書で提供するＰＤ－Ｌ１結合分子は、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇまたは約１００ｍｇ／ｋｇ）の治療に有効な投与量で投与され得る。ある特定のこれらの実施形態では、抗体は約５０ｍｇ／ｋｇもしくはそれよりも低い投与量で投与され、ある特定のこれらの実施形態では、投与量は、１０ｍｇ／ｋｇもしくはそれよりも低い、５ｍｇ／ｋｇもしくはそれよりも低い、１ｍｇ／ｋｇもしくはそれよりも低い、０．５ｍｇ／ｋｇもしくはそれよりも低いまたは０．１ｍｇ／ｋｇもしくはそれよりも低い。ある特定の実施形態では、投与の投与量は、処置の経過において変化する場合がある。例えば、ある特定の実施形態では、初期投与の投与量は、続く投与の投与量より高い場合がある。ある特定の実施形態では、投与の投与量は、対象の反応に応じて処置の経過にわたって変動する場合がある。
【0142】
いずれにしても、本開示の抗体は、好ましくはそれを必要とする対象に必要に応じて投与される。投与の頻度の決定は、主治医などの当業者によって、処置される状態、処置される対象の年齢、処置される状態の重症度、処置される対象の全身の健康状態などを考慮して行われ得る。
【0143】
ある特定の好ましい実施形態では、本開示の抗体を含む処置経過は、数週間または数カ月にわたる選択された薬物製品の複数用量を含む。さらに具体的には、本開示の抗体は、毎日、２日ごと、４日ごと、毎週、１０日ごと、２週間ごと、３週間ごと、毎月、６週間ごと、２カ月ごと、１０週間ごとまたは３カ月ごとに１回投与されてよい。これに関して、患者の応答および臨床診療に基づいて投与量が変更され得る、または間隔が調整され得ることは理解される。
【0144】
投与量およびレジメンは、開示される治療用組成物について、１回または複数回の投与（複数可）を与えられた個体において経験的に決定され得る。例えば、個体は、本明細書に記載のとおり産生された治療組成物を投与量を漸増させて与えられてよい。選択された実施形態では、投与量は、経験的に決定されたまたは観察された副作用もしくは毒性にそれぞれに基づいて徐々に増加または低減または減じられてよい。選択された組成物の有効性を評価するために、特定の疾患、障害または状態のマーカーは、以前記載のとおり追跡されてよい。がんについて、これらは、触診または目視を介した腫瘍サイズの直接測定、Ｘ線または他の画像化技術による腫瘍サイズの間接測定；直接腫瘍生検および腫瘍試料の顕微鏡的検査によって評価された改善；間接腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんについてのＰＳＡ）または明細書に記載の方法により同定された腫瘍原性抗原の測定、疼痛または麻痺の減少；発声、視覚、呼吸または腫瘍に関連する他の身体障害の改善；食欲の増加；または認められた検査によって測定される生活の質の向上または生存期間の延長を含む。投与量が、個体、新生物状態の種類、新生物状態のステージ、新生物状態が個体の他所に転移を始めたか否か、ならびに過去に使用されたおよび同時に使用される処置に応じて変動することは、当業者に明らかである。
【0145】
非経口投与（例えば、静脈内注射）に適合性の製剤は、約１０μｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌの濃度で本明細書で提供するＰＤ－Ｌ１結合分子を含み得る。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子の濃度は、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌまたは１ｍｇ／ｍｌを含み得る。他の好ましい実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合分子の濃度は、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌまたは１００ｍｇ／ｍｌを含む。
【0146】
本発明の応用
本開示のＰＤ－Ｌ１結合分子は、多数のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける有用性を有する。例えばこれらの分子は、培養中、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏの細胞に、またはヒト対象に、例えばｉｎ ｖｉｖｏで、種々の状況において免疫を増強するために投与され得る。免疫応答は、増大、刺激または上方制御され得る。
本開示のＰＤ－Ｌ１結合分子は、多数のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける有用性を有する。例えばこれらの分子は、培養中、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏの細胞に、またはヒト対象に、例えばｉｎ ｖｉｖｏで、種々の状況において免疫を増強するために投与され得る。免疫応答は、増大、刺激または上方制御され得る。
【0147】
好ましい対象として、免疫応答の増強を必要とするヒト患者が挙げられる。方法は、免疫応答（例えば、Ｔ細胞性免疫応答）を増大させることによって処置され得る障害を有するヒト患者を処置するために特に好適である。具体的な実施形態では、方法は、ｉｎ ｖｉｖｏでのがんの処置のために特に好適である。免疫の抗原特異的増強を達成するために、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は目的の抗原と共に投与されてよい、または抗原は処置される対象に既に存在する場合もある（例えば、担腫瘍またはウイルス保有対象）。抗ＰＤ－Ｌ１抗体が別の薬剤と共に投与される場合、２つはいずれの順でまたは同時に投与されてよい。
【0148】
本開示は、ＰＤ－Ｌ１結合分子とＰＤ－Ｌ１との間の複合体形成を可能にする条件下で試料および対照試料をＰＤ－Ｌ１結合分子と接触させることを含む、試料中のＰＤ－Ｌ１抗原の存在を検出する、またはヒトＰＤ－Ｌ１抗原の量を測定するための方法をさらに提供する。次いで複合体の形成は、検出され、対照試料と比較した試料間の異なる複合体形成は、試料中のＰＤ－Ｌ１抗原の存在を示す。さらに、本開示のＰＤ－Ｌ１結合分子は、免疫親和性精製を介してヒトＰＤ－Ｌ１を精製するために使用され得る。
【0149】
がんの処置
ＰＤ－Ｌ１に関連する状態および障害は、免疫関連疾患または障害である場合がある。
ＰＤ－Ｌ１に関連する状態および障害は、免疫関連疾患または障害である場合がある。
【0150】
一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１関連状態および障害は、これだけに限らないが、乳房、肺、結腸、卵巣、メラノーマ、膀胱、腎臓、肝臓、唾液腺、胃、神経膠腫、甲状腺、胸腺、上皮、頭頸部がん、胃および膵臓がんを含む腫瘍およびがんを含む。
【0151】
さらに具体的には、ＰＤ－Ｌ１関連状態および障害として、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、胃癌、膀胱がん、食道がん、中皮腫、メラノーマ、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、前立腺がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、胸腺癌、白血病、リンパ腫、ミエローマ、菌状息肉症、メルケル細胞がんならびに、古典的ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）などの他の血液系腫瘍、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型Ｂ細胞リンパ腫（Ｔ－ｃｅｌｌ／ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ－ｒｉｃｈ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ＥＢＶ陽性および陰性ＰＴＬＤならびにＥＢＶ関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽細胞性リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、上咽頭癌ならびにＨＨＶ８関連原発性体液性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、例えば原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫が挙げられる。ある特定の実施形態では、腫瘍およびがんは、転移性、特にＰＤ－Ｌ１を発現する転移性腫瘍である。
【0152】
抗体は、化学療法または放射線療法との併用で使用され得る。
化学療法との併用使用
抗体は、抗がん剤、細胞傷害剤または化学療法剤との併用で使用され得る。
化学療法との併用使用
抗体は、抗がん剤、細胞傷害剤または化学療法剤との併用で使用され得る。
【0153】
用語「抗がん剤」または「抗増殖剤」は、がんなどの細胞増殖性障害を処置するために使用され得る任意の薬剤を意味し、これだけに限らないが、細胞傷害剤、細胞分裂阻害剤、血管新生阻害剤、減量剤、化学療法薬、放射線療法および放射線治療剤、標的化抗がん剤、ＢＲＭ、治療用抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線治療および抗転移剤および免疫療法剤が挙げられる。選択された実施形態では、上に考察したとおり、かかる抗がん剤はコンジュゲートを含んでよく、開示される部位特異的抗体と投与前に会合されてよいことは理解される。さらに具体的には、一部の実施形態では、選択された抗がん剤は、操作された抗体の不対システインに本明細書に記載される操作されたコンジュゲートを提供するように連結される。したがって、かかる操作されたコンジュゲートは、本開示の範囲内であることが明確に期待される。他の実施形態では、開示される抗がん剤は、上に記載される異なる治療剤を含む部位特異的コンジュゲートとの併用で与えられる。
【0154】
本明細書において使用される場合、用語「細胞傷害剤」は、細胞に毒性を有し、細胞の機能を減少させるもしくは阻害する、および／または細胞の破壊を生じる物質を意味する。一部の実施形態では、物質は、生体由来の天然に存在する分子である。細胞傷害剤の例として、これだけに限らないが、小分子毒素または細菌の（例えば、ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素、シュードモナス内毒素および外毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ）、真菌の（例えば、α－サルシン、レストリクトシン）、植物の（例えば、アブリン、リシン、モデシン、ビスクミン（ｖｉｓｃｕｍｉｎ）、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモリジン（ｍｏｍｏｒｉｄｉｎ）、トリコサンチン、オオムギ毒素、アレウリテス・フォルジ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラッカ・メリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ－Ｓ）、モモルディカ・カランチア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィキナリス（ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミテゲリン（ｍｉｔｅｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、ネオマイシンおよびトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ））または動物の（例えば、細胞傷害性ＲＮａｓｅｓ、例えば細胞外膵臓ＲＮａｓｅｓなど；ＤＮａｓｅＩ、その断片および／または変種を含む）酵素的に活性な毒素が挙げられる。
【0155】
本開示の目的のために「化学療法剤」は、がん細胞の成長、増殖、および／または生存を非特異的に減少させるまたは阻害する化学物質を含む（例えば、細胞傷害性または細胞分裂阻害剤）。かかる化学薬品は、細胞成長または分裂のために必要な細胞内プロセスをしばしば対象とし、そのため一般に急速に増殖および分裂するがん性細胞に対して特に有効である。例えば、ビンクリスチンは微小管を脱重合し、それにより細胞が有糸分裂に入ることを阻害する。一般に、化学療法薬は、がん性細胞または、がん性になるもしくは腫瘍原性後代（例えば、ＴＩＣ）を生成する可能性がある細胞を阻害する、または阻害するように設計されている任意の化学薬品を含み得る。かかる薬剤はしばしば投与され、例えばＣＨＯＰまたはＦＯＬＦＩＲＩなどのレジメンにおいて併用でしばしば最も有効である。
【0156】
本開示の部位特異的構築物との併用で（部位特異的コンジュゲートの構成成分としてまたは未コンジュゲート状態のいずれかで）使用され得る抗がん剤の例は、これだけに限らないが、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アジリジン、エチレンイミンおよびメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）、アセトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、ＣＣ－１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン、パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）、サルコディクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンギスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジイン抗生物質、ダイネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質エンジイン抗生物質（ａｎｔｉｏｂｉｏｔｉｃ）発色団、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、エルロチニブ、ベムラフェニブ、クリゾチニブ、ソラフェニブ、イブルチニブ、エンザルタミド、葉酸類似物、プリン類似体、アンドロゲン、抗副腎剤（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌ）、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビスアントレン、エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルチン、ジアジクオン、エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、ガリウム硝酸塩、ヒドロキシウレア、レンチナン、ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）、マイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメト（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、２－エチルヒドラジン、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ－２毒素、ベルラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）Ａおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｎｂｕｃｉｌ）；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（カンプトサール（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、ＣＰＴ－１１）、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；細胞増殖を低減するＰＫＣ－アルファ、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、ＥＧＦＲおよびＶＥＧＦ－Ａの阻害剤、および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。本定義に同様に含まれるのは、腫瘍でホルモン作用を制御するまたは阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーターなど、副腎でのエストロゲン産生を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤および抗アンドロゲン；ならびにトロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似物）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現阻害剤およびＨＥＲ２発現阻害剤など；ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ－２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビンおよびエスペラミシンならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体。
【0157】
放射線療法との併用使用
本開示は、抗体と、放射線療法（すなわち、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡの損傷を誘導するための任意の機構、例えばガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出など）との併用も提供する。放射性同位元素の腫瘍細胞への方向付けられた送達を使用する併用療法も検討され、開示されるコンジュゲートは、標的化抗がん剤または他の標的化手段に関連して使用され得る。典型的には、放射線治療は、約１から約２週間の期間にわたってパルスで投与される。放射線治療は、頭頸部がんを有する対象に約６から７週間投与され得る。任意選択で放射線治療は、単一用量として、または複数、逐次用量として投与され得る。
本開示は、抗体と、放射線療法（すなわち、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡの損傷を誘導するための任意の機構、例えばガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出など）との併用も提供する。放射性同位元素の腫瘍細胞への方向付けられた送達を使用する併用療法も検討され、開示されるコンジュゲートは、標的化抗がん剤または他の標的化手段に関連して使用され得る。典型的には、放射線治療は、約１から約２週間の期間にわたってパルスで投与される。放射線治療は、頭頸部がんを有する対象に約６から７週間投与され得る。任意選択で放射線治療は、単一用量として、または複数、逐次用量として投与され得る。
【0158】
診断
本開示は、増殖性障害を検出する、診断するまたはモニタリングするためのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ方法、および腫瘍原性細胞を含む腫瘍細胞を同定するための患者由来の細胞のスクリーニング方法を提供する。かかる方法は、患者または患者から得た試料（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれか）を本明細書に記載の抗体と接触させること、試料中の標的分子に結合するまたはそれを遊離する抗体の存在もしくは不在または会合のレベルを検出することを含む、がんの処置またはその進行をモニタリングするためにがんを有する個体を同定することを含む。一部の実施形態では、抗体は、本明細書に記載の検出可能な標識またはレポーター分子を含む。
本開示は、増殖性障害を検出する、診断するまたはモニタリングするためのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ方法、および腫瘍原性細胞を含む腫瘍細胞を同定するための患者由来の細胞のスクリーニング方法を提供する。かかる方法は、患者または患者から得た試料（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれか）を本明細書に記載の抗体と接触させること、試料中の標的分子に結合するまたはそれを遊離する抗体の存在もしくは不在または会合のレベルを検出することを含む、がんの処置またはその進行をモニタリングするためにがんを有する個体を同定することを含む。一部の実施形態では、抗体は、本明細書に記載の検出可能な標識またはレポーター分子を含む。
【0159】
一部の実施形態では、試料中の特定の細胞との抗体の会合は、試料が腫瘍原性細胞を含有する可能性があることを意味し、そのためがんを有する個体が本明細書に記載の抗体を用いて有効に処置され得ることを意味する。
【0160】
試料は、多数のアッセイ、例えば放射線イムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）、競合的結合アッセイ、蛍光イムノアッセイ、免疫ブロットアッセイ、ウエスタンブロット分析およびフローサイトメトリーアッセイによって分析され得る。適合可能なｉｎ ｖｉｖｏセラグノスティック（ｔｈｅｒａｇｎｏｓｔｉｃ）または診断アッセイは、当技術分野において認められた画像化またはモニタリング技術、例えば、磁気共鳴画像法、コンピュータ断層撮影（例えばＣＡＴスキャン）、陽電子トモグラフィー（例えば、ＰＥＴスキャン）、Ｘ線撮影、超音波などを当業者によって公知であるとおり含み得る。
【0161】
医薬パック（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐａｃｋ）およびキット
１つまたは複数の容器を含み、抗体の１または複数用量を含む医薬パックおよびキットも提供される。一部の実施形態では、例えば、１つまたは複数の追加的薬剤を含んでまたは含まずに、抗体を含む組成物の所定量を含有する単位投与量は、提供される。他の実施形態について、かかる単位投与量は、注射用の使い捨ての予め充填されたシリンジで供給される。さらに他の実施形態では、単位投与量に含有される組成物は、生理食塩水、ショ糖など；リン酸などの緩衝液を含んでよく；および／または安定で有効なｐＨ範囲に製剤化されてよい。代替的に、一部の実施形態では、コンジュゲート組成物は、適切な液体、例えば滅菌水または生理食塩水の添加で再構成され得る凍結乾燥粉剤として提供されてよい。ある特定の好ましい実施形態では、組成物は、これだけに限らないがショ糖およびアルギニンが挙げられる、タンパク質凝集を阻害する１つまたは複数の物質を含む。容器（複数可）上のまたは関連する任意の表示は、封入されたコンジュゲート組成物が選択される新生物疾患状態を処置するために使用されることを示す。
１つまたは複数の容器を含み、抗体の１または複数用量を含む医薬パックおよびキットも提供される。一部の実施形態では、例えば、１つまたは複数の追加的薬剤を含んでまたは含まずに、抗体を含む組成物の所定量を含有する単位投与量は、提供される。他の実施形態について、かかる単位投与量は、注射用の使い捨ての予め充填されたシリンジで供給される。さらに他の実施形態では、単位投与量に含有される組成物は、生理食塩水、ショ糖など；リン酸などの緩衝液を含んでよく；および／または安定で有効なｐＨ範囲に製剤化されてよい。代替的に、一部の実施形態では、コンジュゲート組成物は、適切な液体、例えば滅菌水または生理食塩水の添加で再構成され得る凍結乾燥粉剤として提供されてよい。ある特定の好ましい実施形態では、組成物は、これだけに限らないがショ糖およびアルギニンが挙げられる、タンパク質凝集を阻害する１つまたは複数の物質を含む。容器（複数可）上のまたは関連する任意の表示は、封入されたコンジュゲート組成物が選択される新生物疾患状態を処置するために使用されることを示す。
【0162】
本開示は、部位特異的コンジュゲートおよび任意選択で１つまたは複数の抗がん剤の単一用量または複数用量投与単位を産生するためのキットも提供する。キットは、容器および、容器上にまたは関連する表示または添付文書を含む。好適な容器として、例えば、ビン、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成されてよく、開示されるコンジュゲートの薬学的有効量をコンジュゲートされたまたは未コンジュゲートの形態で含有する。他の好ましい実施形態では、容器（複数可）は、滅菌アクセスポート（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通できるストッパーを有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルであってよい）を含む。かかるキットは、好適な容器に、操作されたコンジュゲートの薬学的に許容される製剤および任意選択で１つまたは複数の抗がん剤を同じまたは異なる容器に一般に含有する。キットは、診断または併用療法のいずれかのために他の薬学的に許容される製剤も含有し得る。例えば、抗体に加えて、かかるキットは、化学療法剤もしくは放射線治療薬；抗血管新生剤；抗転移剤；標的化抗がん剤；細胞傷害剤；および／または他の抗がん剤などの広範な抗がん剤の任意の１つまたは複数を含み得る。
【0163】
さらに具体的にはキットは、開示される抗体を、追加的構成成分を含んでまたは含まずに含有する単一の容器を有してよく、またはそれらは、望ましい薬剤それぞれについて別の容器を有し得る。コンジュゲーションのために併用治療が提供される場合、単一の溶液は、モル当量の併用で、または１つの構成成分が他を過度に超えてのいずれかで予め混合されていてよい。代替的にコンジュゲートおよびキットの任意の任意選択の抗がん剤は、患者への投与の前は別の容器内で別々に維持されてよい。キットは、滅菌、薬学的に許容される緩衝液または他の希釈剤、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル溶液およびブドウ糖溶液などを含有するために第２の／第３の容器手段も含んでよい。
【0164】
キットの構成成分が１つまたは複数の溶液中に提供される場合、溶液は好ましくは水溶液であり、滅菌水溶液または生理食塩水は特に好ましい。しかし、キットの構成成分は、乾燥粉剤（複数可）として提供されてもよい。試薬または構成成分が乾燥粉剤として提供される場合、粉剤は好適な溶媒の付加によって再構成され得る。溶媒が別の容器でも提供され得ることは想定される。
【0165】
上に簡潔に示したとおり、キットは、それにより抗体および任意の任意選択の構成成分を患者に投与する手段、例えば、それから製剤が動物に注射もしくは導入され得るまたは身体の患部に適用され得る１つもしくは複数の針、Ｉ．Ｖ．バッグまたはシリンジまたは点眼器、ピペットまたは他の同様の装置さえ含有できる。本開示のキットは、バイアルなどおよび他の構成成分を、商業的販売のために封じ込めて入れるための手段、例えば、望ましいバイアルおよび他の装置が置かれ、保持される射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器なども典型的には含む。
【0166】
配列表および概要
多数の核酸およびアミノ酸配列を含む配列表が本出願に添付されている。以下の表Ａは、含まれている配列の概要を提供する。
多数の核酸およびアミノ酸配列を含む配列表が本出願に添付されている。以下の表Ａは、含まれている配列の概要を提供する。
【0167】
【表1】
【実施例】
【0168】
このように全般的に説明された本開示は、例として提供され、本開示の限定であることが意図されていない以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるだろう。実施例は、以下の実験が実施された全てのまたは唯一の実験であるということを示すことを意図していない。
【0169】
実施例１
材料の調製
１．材料の調製
１．１ 市販の材料
実施例において使用される市販されている材料についての情報を表１に提供する。供給源を指定しない材料は市販もされている、または標準的分子または遺伝生物学的方法に従って当業者により容易に調製され得る。
材料の調製
１．材料の調製
１．１ 市販の材料
実施例において使用される市販されている材料についての情報を表１に提供する。供給源を指定しない材料は市販もされている、または標準的分子または遺伝生物学的方法に従って当業者により容易に調製され得る。
【0170】
【表2-1】
【0171】
【表2-2】
【0172】
【表2-3】
【0173】
１．２ 材料コード
基準抗体、細胞外ドメインおよび細胞を含む材料についてのコードおよび略称を表２にまとめる。
基準抗体、細胞外ドメインおよび細胞を含む材料についてのコードおよび略称を表２にまとめる。
【0174】
【表3】
【0175】
２．抗原の産生
抗原Ｗ３０５－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ（ＮＰ＿００５００９．２）、Ｗ３１５－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ（ＮＰ＿０５４８６２．１）およびＷ３０５－ｍＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ（ＮＰ＿０３２８２４．１）、Ｗ３１５－ｍＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ（ＮＰ＿０６８６９３．１）を標準的分子生物学的方法により調製した。簡潔には、抗原の細胞外ドメインセグメントをコードするＤＮＡ配列を、各抗原遺伝子の対応する受託番号に基づいてＧＥＮＥＷＩＺ（Ｓｕｚｈｏｕ、中国）で合成し、次に、Ｃ末端のマウスＦｃタグと共にｐｃＤＮＡ３．３発現ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にサブクローニングした。次に組換えプラスミドをＥｘｐｉ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ａ１４５２７）にトランスフェクトした。細胞培養物を加湿したプラットホーム振とう器で１５０ｒｐｍの回転速度で増殖させた。ＣＯ２レベル８％で温度を３７℃に維持した。５日間のインキュベーション後に、精製のために上清を回収し、ろ過した。
３．基準抗体の産生
抗ヒトＰＤ－Ｌ１対照抗体ＢＭＫ６．ｕＩｇＧ１Ｋ（ＬＦＬＥＰＳ）およびＢＭＫ６．ｈＩｇＧ４の可変配列をＭｅｄＩｍｍｕｎｅによって出願されたＰＣＴ出願ＷＯ２０１５０３６４９９からのクローンＭＥＤＩ４７３６の配列に基づいて合成した；ＢＭＫ６．ｕＩｇＧ１Ｋ（ＬＦＬＥＰＳ）およびＢＭＫ６．ｈＩｇＧ４を市販されているイミフィンジの配列に基づいて調製した。ＢＭＫ８．ｕＩｇＧ１Ｋ（ＲＫＮＡ）およびＢＭＫ８．ｈＩｇＧ４の可変配列をＲｏｃｈｅによって出願されたＰＣＴ出願ＷＯ２０１００７７６３４からのクローンＹＷ２４３．５５．Ｓ７０の配列に基づいて調製した。ＢＭＫ８．ｕＩｇＧ１Ｋ（ＲＫＮＡ）およびＢＭＫ８．ｈＩｇＧ４をテセントリク（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから市販されている）の配列に基づいて調製した。ＢＭＫ９．Ｆｃ（ＩｇＧ１）をＳｕｚｈｏｕ ＡＬＰＨＡＭＡＢによって出願されたＰＣＴ出願ＷＯ２０１７０２０８０２からのクローンＫＮ０３５の配列に基づいて調製した。同じ可変領域を共有するヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体は、ＷｕＸｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＤ ｇｒｏｕｐによって発見され、ＰＳ ｇｒｏｕｐによって調製された。
抗原Ｗ３０５－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ（ＮＰ＿００５００９．２）、Ｗ３１５－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ（ＮＰ＿０５４８６２．１）およびＷ３０５－ｍＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ（ＮＰ＿０３２８２４．１）、Ｗ３１５－ｍＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ（ＮＰ＿０６８６９３．１）を標準的分子生物学的方法により調製した。簡潔には、抗原の細胞外ドメインセグメントをコードするＤＮＡ配列を、各抗原遺伝子の対応する受託番号に基づいてＧＥＮＥＷＩＺ（Ｓｕｚｈｏｕ、中国）で合成し、次に、Ｃ末端のマウスＦｃタグと共にｐｃＤＮＡ３．３発現ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にサブクローニングした。次に組換えプラスミドをＥｘｐｉ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ａ１４５２７）にトランスフェクトした。細胞培養物を加湿したプラットホーム振とう器で１５０ｒｐｍの回転速度で増殖させた。ＣＯ２レベル８％で温度を３７℃に維持した。５日間のインキュベーション後に、精製のために上清を回収し、ろ過した。
３．基準抗体の産生
抗ヒトＰＤ－Ｌ１対照抗体ＢＭＫ６．ｕＩｇＧ１Ｋ（ＬＦＬＥＰＳ）およびＢＭＫ６．ｈＩｇＧ４の可変配列をＭｅｄＩｍｍｕｎｅによって出願されたＰＣＴ出願ＷＯ２０１５０３６４９９からのクローンＭＥＤＩ４７３６の配列に基づいて合成した；ＢＭＫ６．ｕＩｇＧ１Ｋ（ＬＦＬＥＰＳ）およびＢＭＫ６．ｈＩｇＧ４を市販されているイミフィンジの配列に基づいて調製した。ＢＭＫ８．ｕＩｇＧ１Ｋ（ＲＫＮＡ）およびＢＭＫ８．ｈＩｇＧ４の可変配列をＲｏｃｈｅによって出願されたＰＣＴ出願ＷＯ２０１００７７６３４からのクローンＹＷ２４３．５５．Ｓ７０の配列に基づいて調製した。ＢＭＫ８．ｕＩｇＧ１Ｋ（ＲＫＮＡ）およびＢＭＫ８．ｈＩｇＧ４をテセントリク（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈから市販されている）の配列に基づいて調製した。ＢＭＫ９．Ｆｃ（ＩｇＧ１）をＳｕｚｈｏｕ ＡＬＰＨＡＭＡＢによって出願されたＰＣＴ出願ＷＯ２０１７０２０８０２からのクローンＫＮ０３５の配列に基づいて調製した。同じ可変領域を共有するヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体は、ＷｕＸｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＤ ｇｒｏｕｐによって発見され、ＰＳ ｇｒｏｕｐによって調製された。
【0176】
遺伝子をＧＥＮＥＷＩＺ（Ｓｕｚｈｏｕ、中国）で合成し、次に改変ｐｃＤＮＡ３．３発現ベクター（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ）にサブクローニングした。Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ａ１４５２７）を精製された発現ベクターを用いてトランスフェクトした。細胞を５日間培養し、プロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７５４３８）を使用するタンパク質精製のために上清を回収した。精製したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＥＣによって分析し、次いで－８０℃で保存した。
【0177】
４．安定細胞株／細胞プールの確立
ヒトＰＤ－Ｌ１発現細胞株（Ｗ３１５－ＣＨＯ－Ｋ１．ｈＰｒｏ１．Ｃ１１）、マウスＰＤ－Ｌ１発現細胞株（Ｗ３１５－２９３Ｆ．ｍＰｒｏ１．Ｃ１）、カニクイザルサルＰＤ－Ｌ１発現細胞株（Ｗ３１５－２９３Ｆ．ｃｙｎｏＰｒｏ１．２Ａ２）、ヒトＣＤ８０発現細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１．ＣＤ８０．Ｂ９）は、ＷｕＸｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＰＳ ｇｒｏｕｐによって生成された。
ヒトＰＤ－Ｌ１発現細胞株（Ｗ３１５－ＣＨＯ－Ｋ１．ｈＰｒｏ１．Ｃ１１）、マウスＰＤ－Ｌ１発現細胞株（Ｗ３１５－２９３Ｆ．ｍＰｒｏ１．Ｃ１）、カニクイザルサルＰＤ－Ｌ１発現細胞株（Ｗ３１５－２９３Ｆ．ｃｙｎｏＰｒｏ１．２Ａ２）、ヒトＣＤ８０発現細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１．ＣＤ８０．Ｂ９）は、ＷｕＸｉ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＰＳ ｇｒｏｕｐによって生成された。
【0178】
ヒトＰＤ－Ｌ１（ＮＰ＿０５４８６２．１）およびＣＤ８０（ＮＰ＿００５１８２．１）高発現細胞株構築のために、ヒトＰＤ－Ｌ１およびＣＤ８０の遺伝子を発現ベクターｐｃＤＮＡ ３．３にそれぞれ挿入した。次に各発現ベクターをＣＨＯ－Ｋ１細胞にそれぞれトランスフェクトした。簡潔には、トランスフェクションの１日前に、ＣＨＯ－Ｋ１細胞５×１０５個を６ウェル組織培養プレートの１つのウェルに蒔き、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。細胞に１０％ＦＢＳを含む新鮮な培地Ｆ１２－Ｋ ３ｍｌを与えた。トランスフェクション試薬を１０μｇのリポフェクタミン２０００と混合した４μｇのＤＮＡおよびＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を最終容量２００μｌまで含んで１．５ｍＬチューブに調製した。チューブピペット中の溶液を細胞に滴下で加えた。トランスフェクション６から８時間後、細胞をＰＢＳを用いて洗浄し、３ｍｌの新鮮な培地を与えた。発現細胞をトランスフェクション２４～４８時間後にトリプシンを用いて採取し、Ｔ７５フラスコの選択培地（１０％ＦＢＳおよび１０μｇ／ｍｌブラストサイジンを含むＦ１２－Ｋ）に蒔いた。安定単一細胞クローンを限界希釈によって単離した。
【0179】
マウスおよびカニクイザルＰＤ－Ｌ１高発現細胞株構築物のために、マウスＰＤ－Ｌ１（ＮＰ＿０６８６９３．１）およびカニクイザルＰＤ－Ｌ１（ＸＰ＿０１５２９２６９４．１）の遺伝子を発現ベクターｐｃＤＮＡ ３．３にそれぞれ挿入した。次に各発現ベクターを２９３Ｆ細胞にそれぞれトランスフェクトした。簡潔には、細胞を計数し、１．２×１０６個／ｍｌの密度に１２５ｍｌフラスコ中で希釈し、５％ＣＯ２、３７℃で振とうした。細胞に３０ｍｌの新鮮な培地Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３を与えた。トランスフェクション試薬を７５μｌのリポフェクタミン２０００と混合した３０μｇのＤＮＡおよびＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を最終容量３ｍｌまで含んで１５ｍｌチューブに調製した。チューブピペット中の溶液を細胞に滴下で加えた。トランスフェクション後、発現細胞を採取し、１２５ｍｌフラスコの選択培地（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３および４μｇ／ｍｌブラストサイジン）に移した。安定単一細胞クローンを限界希釈によって単離した。
【0180】
実施例２
ＶＨＨおよびＶＨＨ－Ｆｃ融合抗体の産生
１．免疫処置
ラクダ類動物においてＰＤ－Ｌ１に指向された液性免疫応答を誘導するために、動物にヒトおよびマウスＰＤ－Ｌ１ ＥＣＤタンパク質（実施例１の「２．抗原の産生」を参照されたい）を交互に８用量、１から３週間間隔で皮下注射した。用量は注射１回あたり５０ｕｇから２００ｕｇの範囲であった。
ＶＨＨおよびＶＨＨ－Ｆｃ融合抗体の産生
１．免疫処置
ラクダ類動物においてＰＤ－Ｌ１に指向された液性免疫応答を誘導するために、動物にヒトおよびマウスＰＤ－Ｌ１ ＥＣＤタンパク質（実施例１の「２．抗原の産生」を参照されたい）を交互に８用量、１から３週間間隔で皮下注射した。用量は注射１回あたり５０ｕｇから２００ｕｇの範囲であった。
【0181】
２．血清力価検出
免疫処置後、動物血清中に存在する抗ＰＤ－Ｌ１特異的抗体血清力価をＥＬＩＳＡによって決定した。簡潔には、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＭＮ、ＵＳＡ）を１μｇ／ｍｌの組換えｈｉｓタグ化ヒトおよびマウスＰＤ－Ｌ１ ＥＣＤタンパク質を用いてそれぞれコートし、４℃で一晩インキュベートした。ブロッキングおよび洗浄後、プレ免疫または免疫血清の系列希釈物を加え、室温２時間、次にヤギ抗ラマＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｎｏｖａｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ、ＵＳＡ）と室温、１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を加え、反応を２Ｍ ＨＣｌによって停止させた。４５０ｎＭでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して読み取った。
免疫処置後、動物血清中に存在する抗ＰＤ－Ｌ１特異的抗体血清力価をＥＬＩＳＡによって決定した。簡潔には、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＭＮ、ＵＳＡ）を１μｇ／ｍｌの組換えｈｉｓタグ化ヒトおよびマウスＰＤ－Ｌ１ ＥＣＤタンパク質を用いてそれぞれコートし、４℃で一晩インキュベートした。ブロッキングおよび洗浄後、プレ免疫または免疫血清の系列希釈物を加え、室温２時間、次にヤギ抗ラマＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｎｏｖａｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ、ＵＳＡ）と室温、１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を加え、反応を２Ｍ ＨＣｌによって停止させた。４５０ｎＭでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して読み取った。
【0182】
３．ファージライブラリー構築
５０ｍｌの血液試料を最後の２回の注射の６～７日後にそれぞれ回収した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）上での密度勾配遠心分離によって精製し、およそ１×１０８個のＰＢＭＣを単離した。全ＲＮＡをこれらのＰＢＭＣから抽出し、オリゴ－ｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を製造者の推奨に従って使用してｃＤＮＡに転写した。
５０ｍｌの血液試料を最後の２回の注射の６～７日後にそれぞれ回収した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）上での密度勾配遠心分離によって精製し、およそ１×１０８個のＰＢＭＣを単離した。全ＲＮＡをこれらのＰＢＭＣから抽出し、オリゴ－ｄＴプライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を製造者の推奨に従って使用してｃＤＮＡに転写した。
【0183】
精製したｃＤＮＡを、次にシグナルペプチドドメイン特異的プライマーおよびＣＨ２ドメイン特異的プライマーを使用してＩｇ重鎖コード遺伝子セグメントのレパートリーを増幅するための鋳型として使用した。この増幅は、およそ９００ｂｐ（従来的なＩｇＧを表す）および７００ｂｐ（ＣＨ１ドメインを欠いている重鎖ＩｇＧを表す）のＰＣＲ断片を生じた。２つのクラスの重鎖コード遺伝子を次にアガロースゲル上でサイズで分離し、重鎖だけのＩｇＧをコードする遺伝子をＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製した。精製した断片をフレームワーク１（ＦＲ１）およびフレームワーク４（ＦＲ４）特異的プライマー対を使用してＶＨＨレパートリーを増幅するための鋳型として使用した。この増幅手順は、Ｓｆｉ Ｉ制限部位をＦＲ１の５’末端におよびＮｏｔ Ｉ制限部位をＦＲ４の３’末端に導入した。約３００～４００ｂｐのＰＣＲ増幅ＶＨＨ遺伝子のレパートリーをアガロースゲルにロードし、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットによって精製した。次に精製した断片をＳｆｉ ＩおよびＮｏｔ Ｉを用いて切断し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製した。最後にＶＨＨ遺伝子断片をファージミドベクターｐＦＬ２４９（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）にライゲーションし、大腸菌ＴＧ１に電気形質転換（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍ）した。形質転換後、ＴＧ１細胞をＳＯＣ培地で２００ｒｐｍで振とうしながら１ｈ培養し、次に大腸菌ＴＧ１を１００μｇ／ｍＬ Ｃａｒｂおよび１％（ｗ／ｖ）グルコースを補充した固形２ＹＴ培地を含むプレートに蒔き、３７℃、一晩培養した。翌日、コロニーを１／３（ｖ／ｖ）の８０％グリセリンを補充した液体２ＹＴ培地に掻きとり、－８０℃で保存した。
【0184】
４．抗ＰＤ－Ｌ１特異的ＶＨＨ断片のファージディスプレイ選択
ＰＤ－Ｌ１に効果的に結合するＶＨＨ断片を選択するために、タンパク質パニング法を使用した。
ＰＤ－Ｌ１に効果的に結合するＶＨＨ断片を選択するために、タンパク質パニング法を使用した。
【0185】
簡潔には、２０μｇの組換えｈｉｓタグ化ヒトＰＤ－Ｌ１ ＥＣＤタンパク質を５ｍｌ免疫チューブ（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＭＮ、ＵＳＡ）に一晩、４℃、４００ｒｐｍで振とうしながら固定した。翌日、未結合タンパク質を洗浄除去後、チューブを１０％脱脂粉乳を用いて１時間、２５℃でブロッキングした。非特異的結合ファージを枯渇させるために１０％脱脂粉乳を用いてブロッキングした非コート免疫チューブに免疫ファージライブラリーからおよそ１０１２ｃｆｕのファージを加え、次に上に記載のとおり処置したファージをチューブに加え、２５℃、２時間インキュベートした。ＰＢＳＴ（リン酸緩衝液）を用いた繰り返しの洗浄後、非特異的吸着ファージを廃棄し、標的特異的結合ファージをグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）によって溶出し、次に指数関数的に増殖しているＴＧ１細胞の感染のために１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）によって中和した。感染ＴＧ１細胞を２％（ｗ／ｖ）グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２ＹＴアガープレートに蒔き、３７℃、一晩培養した。翌日に、コロニーを３ｍｌ ２ＹＴを用いてプレートから掻きとり、１／３（ｖ／ｖ）８０％グリセリンに加えて、－８０℃で凍結した。掻きとられた細菌ライブラリーを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２ＹＴ－Ｃａｒｂに接種し、ファージレスキューのために５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび１ｍＭ ＩＰＴＧを含む２ＹＴ培地中でヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を用いて感染させ、次のラウンドのパニングのためのインプットとして使用した。
【0186】
５．ＶＨＨタンパク質発現およびスクリーニング
所望のパニングステップ後、プレート上で増殖させたファージ感染ＴＧ１細胞コロニーを掻きとり、ＶＨＨ断片を含有するｐＦＬ２４９ファージミドを抽出した。ＶＨＨ断片をＳｆｉ ＩおよびＮｏｔ Ｉを用いたｐＦＬ２４９プラスミドの消化によってクローニングし、ヘキサ－ヒスチジン－およびｃ－Ｍｙｃ－タグの遺伝子を含有する発現ベクターｐＥＴｂａｃにライゲーションした。ライゲーション産物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、次にＺＹＭ－５０５２培地で２５℃、４８時間、２３０ｒｐｍで振とうしながら培養した。次に細菌培養上清をＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ試験のために回収した。
所望のパニングステップ後、プレート上で増殖させたファージ感染ＴＧ１細胞コロニーを掻きとり、ＶＨＨ断片を含有するｐＦＬ２４９ファージミドを抽出した。ＶＨＨ断片をＳｆｉ ＩおよびＮｏｔ Ｉを用いたｐＦＬ２４９プラスミドの消化によってクローニングし、ヘキサ－ヒスチジン－およびｃ－Ｍｙｃ－タグの遺伝子を含有する発現ベクターｐＥＴｂａｃにライゲーションした。ライゲーション産物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、次にＺＹＭ－５０５２培地で２５℃、４８時間、２３０ｒｐｍで振とうしながら培養した。次に細菌培養上清をＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ試験のために回収した。
【0187】
ＥＬＩＳＡをＶＨＨのヒトＰＤ－Ｌ１ ＥＣＤタンパク質への結合を試験するための第１のスクリーニング方法として使用した。簡潔には、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＭＮ、ＵＳＡ）を組換えｈｉｓタグ化ヒトＰＤ－Ｌ１ ＥＣＤタンパク質を用いて一晩、４℃でコートした。ブロッキングおよび洗浄後、コートしたプレートにＢＬ２１大腸菌上清を移し、室温、１時間インキュベートした。次にプレートを洗浄し、次に二次抗体ヤギ抗ｃ－Ｍｙｃ－ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ、ＵＳＡ）を用いて１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を加え、反応を２Ｍ ＨＣｌによって停止させた。４５０ｎＭでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して読み取った。
【0188】
ヒトＰＤ－Ｌ１への天然結合を確認し、細胞膜上に発現されるコンホメーションＰＤ－Ｌ１分子上のＰＤ１とのその相互作用をブロックするために、フローサイトメトリー分析をＣＨＯＫ１．ＰＤ－Ｌ１細胞を用いて実施した。最初に細胞を大腸菌培養上清試料およびリガンドと、９６ウェルＵ底プレート（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）において細胞１×１０６個／ウェルの密度で４℃、１時間、次に二次抗体ヤギ抗ｃ－Ｍｙｃ－ＰＥ（Ｂｅｔｈｙｌ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ、ＵＳＡ）と４℃、３０分間インキュベートした。２回の洗浄を各ステップの間に適用し、細胞をフローサイトメトリー分析（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ、Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ、ＮＭ、ＵＳＡ）のために１Ｘ ＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁した。
【0189】
６．キメラＶＨＨ－Ｆｃ（ｈＩｇＧ１）タンパク質産生
目的のクローンをＶＨＨ－Ｆｃ（ｈＩｇＧ１）融合抗体に転換した。簡潔には、ＶＨＨ遺伝子を適切な制限部位を含有するＶＨＨ特異的クローニングプライマーを使用してｐＥＴ－ｂａｃベクターからＰＣＲ増幅し、次に、ＶＨＨ－Ｆｃ（ｈＩｇＧ１）キメラ抗体の対応クローンを創出するために、ヒトｈＩｇＧ１のＦｃを含有する改変発現ｐｃＤＮＡ３．３ベクターへの融合によってクローニングした。２９３ＦまたはＥｘｐｉ２９３細胞を抗体発現のためのベクターを用いて一過的にトランスフェクトした。抗体を含有する細胞培養上清を採取し、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製した。
目的のクローンをＶＨＨ－Ｆｃ（ｈＩｇＧ１）融合抗体に転換した。簡潔には、ＶＨＨ遺伝子を適切な制限部位を含有するＶＨＨ特異的クローニングプライマーを使用してｐＥＴ－ｂａｃベクターからＰＣＲ増幅し、次に、ＶＨＨ－Ｆｃ（ｈＩｇＧ１）キメラ抗体の対応クローンを創出するために、ヒトｈＩｇＧ１のＦｃを含有する改変発現ｐｃＤＮＡ３．３ベクターへの融合によってクローニングした。２９３ＦまたはＥｘｐｉ２９３細胞を抗体発現のためのベクターを用いて一過的にトランスフェクトした。抗体を含有する細胞培養上清を採取し、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製した。
【0190】
実施例３
抗体のヒト化
ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳスクリーニング後、ＰＤ－Ｌ１に対する所望の親和性および特異性を有する１つのＶＨＨリードをヒト化のために選択した。「最良のフィット」アプローチをＶＨＨ鎖をヒト化するために使用した。
抗体のヒト化
ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳスクリーニング後、ＰＤ－Ｌ１に対する所望の親和性および特異性を有する１つのＶＨＨリードをヒト化のために選択した。「最良のフィット」アプローチをＶＨＨ鎖をヒト化するために使用した。
【0191】
ＶＨＨフレームワーク領域のアミノ酸配列をヒト生殖系列Ｖ－遺伝子データベースに対してブラストし、ヒト化ＶＨＨ配列をＫａｂａｔ ＣＤＲ定義を使用してトップヒット中のヒトＣＤＲ配列をＶＨＨ ＣＤＲ配列で置き換えることによって生成した。フレームワーク領域中のある特定の残基を親和性を維持するためにＶＨＨのものに逆変異させた。ヒト化遺伝子を逆翻訳（ｂａｃｋ－ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）し、哺乳動物発現のためにコドン最適化し、ＧＥＮＥＷＩＺによって合成した。ＳＰＲを使用してＰＤ－Ｌ１結合について試験した後、ＶＨＨ変異体ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２をヒト化抗体リードとして選択した。その配列情報を表Ａおよび配列表（配列番号４（アミノ酸配列）および５（ヌクレオチド配列）を参照されたい）に提供する。
【0192】
ＶＨＨ ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２の遺伝子を、さらなる特徴付けのためにＶＨＨ－Ｆｃ（ｈＩｇＧ１）またはＶＨＨ－Ｆｃ（ｈＩｇＧ４）の対応するクローンを創出するためにヒトｈＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４のＦｃを含有する改変ｐｃＤＮＡ３．３ベクターにクローニングした。ヒト化クローンをＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１またはＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ４と名付けた。本開示および図において、ヒト化抗体ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１は、Ｗ３１５６－ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１としても表され、ヒト化抗体ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ４はＷ３１５６－ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ４とも表される。２つのヒト化抗体は、本開示において集合的に「Ｗ３１５６抗体」と呼ばれる。
【0193】
実施例４
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける特徴付け
１．ＦＡＣＳによって測定したＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１のヒト、マウスおよびカニクイザルＰＤ－Ｌ１への結合
１．１ヒトＰＤ－Ｌ１結合
ヒトＰＤ－Ｌ１トランスフェクトＷ３１５－ＣＨＯ－Ｋ１．ｈＰｒｏ１．Ｃ１１細胞を細胞１×１０５個／ウェルで９６ウェルＵ底プレート（ＢＤ）に蒔き、種々の濃度の抗ＰＤ－Ｌ１抗体（１３３．３ｎＭから０．００８ｎＭに４倍系列希釈）と４℃、１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いた洗浄後、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを加え、細胞と４℃、１時間インキュベートした。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体ＢＭＫ６．ｈＩｇＧ４、ＢＭＫ８．ｈＩｇＧ４およびＢＭＫ９．Ｆｃ（ＩｇＧ１）を陽性対照として使用した。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。次に細胞を１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で洗浄および再懸濁した。細胞のＭＦＩをフローサイトメーター（ＢＤ）によって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって分析した。データを図１Ａおよび表３に示した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける特徴付け
１．ＦＡＣＳによって測定したＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１のヒト、マウスおよびカニクイザルＰＤ－Ｌ１への結合
１．１ヒトＰＤ－Ｌ１結合
ヒトＰＤ－Ｌ１トランスフェクトＷ３１５－ＣＨＯ－Ｋ１．ｈＰｒｏ１．Ｃ１１細胞を細胞１×１０５個／ウェルで９６ウェルＵ底プレート（ＢＤ）に蒔き、種々の濃度の抗ＰＤ－Ｌ１抗体（１３３．３ｎＭから０．００８ｎＭに４倍系列希釈）と４℃、１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いた洗浄後、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを加え、細胞と４℃、１時間インキュベートした。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体ＢＭＫ６．ｈＩｇＧ４、ＢＭＫ８．ｈＩｇＧ４およびＢＭＫ９．Ｆｃ（ＩｇＧ１）を陽性対照として使用した。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。次に細胞を１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で洗浄および再懸濁した。細胞のＭＦＩをフローサイトメーター（ＢＤ）によって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって分析した。データを図１Ａおよび表３に示した。
【0194】
【表4】
【0195】
図１Ａおよび表３に示すとおり、ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１は細胞表面ヒトＰＤ－Ｌ１にＢＭＫ抗体のものに匹敵するＥＣ５０で結合する。
【0196】
１．２ マウスＰＤ－Ｌ１結合
マウスＰＤ－Ｌ１トランスフェクトＷ３１５－２９３Ｆ．ｍＰｒｏ１．Ｃ１細胞を細胞２×１０５個／ウェルで９６ウェルＵ底プレートに蒔き、種々の濃度の抗ＰＤ－Ｌ１抗体（１３３．３ｎＭから０．００６８ｎＭに３倍系列希釈）と４℃、１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いた洗浄後、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを加え、細胞と４℃、１時間インキュベートした。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体ＢＭＫ８．ｈＩｇＧ４およびＢＭＫ９．Ｆｃ（ＩｇＧ１）を対照抗体として使用した。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。次に細胞を１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で洗浄および再懸濁した。細胞のＭＦＩをフローサイトメーター（ＢＤ）によって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって分析した。データを図１Ｂおよび表４に示した。
マウスＰＤ－Ｌ１トランスフェクトＷ３１５－２９３Ｆ．ｍＰｒｏ１．Ｃ１細胞を細胞２×１０５個／ウェルで９６ウェルＵ底プレートに蒔き、種々の濃度の抗ＰＤ－Ｌ１抗体（１３３．３ｎＭから０．００６８ｎＭに３倍系列希釈）と４℃、１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いた洗浄後、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを加え、細胞と４℃、１時間インキュベートした。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体ＢＭＫ８．ｈＩｇＧ４およびＢＭＫ９．Ｆｃ（ＩｇＧ１）を対照抗体として使用した。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。次に細胞を１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で洗浄および再懸濁した。細胞のＭＦＩをフローサイトメーター（ＢＤ）によって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって分析した。データを図１Ｂおよび表４に示した。
【0197】
【表5】
【0198】
図１Ｂおよび表４に示すとおり、ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１は、細胞表面マウスＰＤ－Ｌ１にＢＭＫ８ Ａｂのものに匹敵するＥＣ５０で結合する。
【0199】
１．３ カニクイザルＰＤ－Ｌ１結合
カニクイザルＰＤ－Ｌ１トランスフェクト２９３Ｆ．ｃｙｎｏＰｒｏ１細胞を細胞２×１０５個／ウェルで９６ウェルＵ底プレートに蒔き、種々の濃度の抗ＰＤ－Ｌ１抗体（１３３．３ｎＭから０．００６８ｎＭに３倍系列希釈）と４℃、１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いた洗浄後、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを加え、細胞と４℃、１時間インキュベートした。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体ＢＭＫ６．ｈＩｇＧ４、ＢＭＫ８．ｈＩｇＧ４およびＢＭＫ９．Ｆｃ（ＩｇＧ１）を対照抗体として使用した。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。次に細胞を１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で洗浄および再懸濁した。細胞のＭＦＩをフローサイトメーター（ＢＤ）によって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって分析した。データを図１Ｃおよび表５に示した。
カニクイザルＰＤ－Ｌ１トランスフェクト２９３Ｆ．ｃｙｎｏＰｒｏ１細胞を細胞２×１０５個／ウェルで９６ウェルＵ底プレートに蒔き、種々の濃度の抗ＰＤ－Ｌ１抗体（１３３．３ｎＭから０．００６８ｎＭに３倍系列希釈）と４℃、１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いた洗浄後、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを加え、細胞と４℃、１時間インキュベートした。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体ＢＭＫ６．ｈＩｇＧ４、ＢＭＫ８．ｈＩｇＧ４およびＢＭＫ９．Ｆｃ（ＩｇＧ１）を対照抗体として使用した。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。次に細胞を１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で洗浄および再懸濁した。細胞のＭＦＩをフローサイトメーター（ＢＤ）によって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって分析した。データを図１Ｃおよび表５に示した。
【0200】
【表6】
【0201】
図１Ｃおよび表５に示すとおり、ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１は、細胞表面サルＰＤＬ－１にＢＭＫ Ａｂのものに匹敵するＥＣ５０で結合する。
【0202】
２．完全動的親和性（ＳＰＲ）
ｈｉｓタグ化ヒトＰＤ－Ｌ１（Ｒ＆Ｄ－９０４９－Ｂ７）、ｈｉｓタグ化カニクイザルＰＤ－Ｌ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ－９０２５１－Ｃ０８Ｈ）およびｈｉｓタグ化マウスＰＤ－Ｌ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ－５００１０－Ｍ０８Ｈ）への抗体結合親和性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによってソフトウェアＰｒｏｔｅＯｎを使用して検出した。試験用抗体をＧＬＭチップ（Ｂｉｏ－ｒａｄ）に固定した抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体に捕捉した。チップを９０°回転させ、泳動用緩衝液を用いてベースラインが安定するまで洗浄した。さまざまな濃度のｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．Ｈｉｓ、ｃｙｎｏＰｒｏ１．ＥＣＤ．ＨｉｓおよびｍＰｒｏ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓを流速１００ｕＬ／分で１２０秒の会合相の間センサーチップに注入し、２４０～８００秒間の解離が続いた。チップを解離相ごとに続いて１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）によって再生した。
ｈｉｓタグ化ヒトＰＤ－Ｌ１（Ｒ＆Ｄ－９０４９－Ｂ７）、ｈｉｓタグ化カニクイザルＰＤ－Ｌ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ－９０２５１－Ｃ０８Ｈ）およびｈｉｓタグ化マウスＰＤ－Ｌ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ－５００１０－Ｍ０８Ｈ）への抗体結合親和性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによってソフトウェアＰｒｏｔｅＯｎを使用して検出した。試験用抗体をＧＬＭチップ（Ｂｉｏ－ｒａｄ）に固定した抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体に捕捉した。チップを９０°回転させ、泳動用緩衝液を用いてベースラインが安定するまで洗浄した。さまざまな濃度のｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．Ｈｉｓ、ｃｙｎｏＰｒｏ１．ＥＣＤ．ＨｉｓおよびｍＰｒｏ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓを流速１００ｕＬ／分で１２０秒の会合相の間センサーチップに注入し、２４０～８００秒間の解離が続いた。チップを解離相ごとに続いて１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）によって再生した。
【0203】
参照チャネルＬ１および緩衝液チャネルＡ６についてのセンサーグラムを試験センサーグラムから減算した。実験データを１：１結合モデルにフィットさせた。分子量４０ｋＤａを分析物ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ）、ｃｙｎｏＰｒｏ１．ＥＣＤ．ＨｉｓおよびｍＰｒｏ１－ＥＣＤ－Ｈｉｓのモル濃度を算出するために使用した。
【0204】
データを表６に示した。
【0205】
【表7】
【0206】
３．細胞表面ＰＤ－Ｌ１への結合親和性（ＦＡＣＳ）
試験用抗体の細胞表面ヒト、カニクイザルおよびマウスＰＤ－Ｌ１への結合親和性を、操作した細胞株それぞれについてフローサイトメトリーによって決定した。細胞を９６ウェルＵ底プレート（ＢＤ）に細胞５×１０４個／ウェルの密度で移した。試験する抗体を１％ＢＳＡ／１ＸＰＢＳ中に１：２倍で系列希釈し、細胞と４℃、１時間インキュベートした。次にプレートを１５００ｒｐｍ、４分間遠心分離し、上清を廃棄した。二次抗体Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－６０５－０９８、ロット番号１２１３６３）を細胞を再懸濁するために加え、４℃、暗所で３０分間インキュベートした。細胞を１回洗浄し、１００μＬ １％ＢＳＡ／１ＸＰＢＳに再懸濁し、次いでフローサイトメトリー（ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ）によって測定し、ＦｌｏｗＪｏによって分析した。蛍光強度を定量的ビーズ（Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）ＭＥＳＦキット、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に基づいて結合分子／細胞に変換した。ＫＤ値をＧｒｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ５によって算出した。
試験用抗体の細胞表面ヒト、カニクイザルおよびマウスＰＤ－Ｌ１への結合親和性を、操作した細胞株それぞれについてフローサイトメトリーによって決定した。細胞を９６ウェルＵ底プレート（ＢＤ）に細胞５×１０４個／ウェルの密度で移した。試験する抗体を１％ＢＳＡ／１ＸＰＢＳ中に１：２倍で系列希釈し、細胞と４℃、１時間インキュベートした。次にプレートを１５００ｒｐｍ、４分間遠心分離し、上清を廃棄した。二次抗体Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号１０９－６０５－０９８、ロット番号１２１３６３）を細胞を再懸濁するために加え、４℃、暗所で３０分間インキュベートした。細胞を１回洗浄し、１００μＬ １％ＢＳＡ／１ＸＰＢＳに再懸濁し、次いでフローサイトメトリー（ＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ）によって測定し、ＦｌｏｗＪｏによって分析した。蛍光強度を定量的ビーズ（Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）ＭＥＳＦキット、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に基づいて結合分子／細胞に変換した。ＫＤ値をＧｒｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ５によって算出した。
【0207】
データを表７－１、表７－２および表７－３に示した。
【0208】
【表8】
【0209】
【表9】
【0210】
【表10】
【0211】
表７－１、表７－２および表７－３に示すとおり、ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１の細胞表面ヒト、カニクイザルおよびマウスＰＤ－Ｌ１への結合親和性は、ＢＭＫ Ａｂｓより良好である／匹敵する。
【0212】
４．ＰＤ－Ｌ１またはＣＤ８０への結合の遮断
４．１ ＦＡＣＳによって測定するヒトＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断
ヒトＰＤ－Ｌ１トランスフェクトＷ３１５－ＣＨＯ－Ｋ１．ｈＰｒｏ１．Ｃ１１細胞を細胞１×１０５個／ウェルの密度で９６ウェルＵ底プレートに移した。種々の濃度の抗体（２６６．７ｎＭから０．０１６ｎＭに４倍系列希釈）および一定濃度、５μｇ／ｍＬのヒトＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質（ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ）を予め混合し、細胞と４℃、１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いて洗浄後、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを加え、細胞と４℃、１時間インキュベートした。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体ＢＭＫ６．ｈＩｇＧ４、ＢＭＫ８．ｈＩｇＧ４およびＢＭＫ９．Ｆｃ（ＩｇＧ１）を陽性対照として使用した。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。次に細胞を１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で洗浄および再懸濁した。細胞のＭＦＩをフローサイトメーター（ＢＤ）によって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって分析した。データを図２Ａおよび表８に示した。
４．１ ＦＡＣＳによって測定するヒトＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断
ヒトＰＤ－Ｌ１トランスフェクトＷ３１５－ＣＨＯ－Ｋ１．ｈＰｒｏ１．Ｃ１１細胞を細胞１×１０５個／ウェルの密度で９６ウェルＵ底プレートに移した。種々の濃度の抗体（２６６．７ｎＭから０．０１６ｎＭに４倍系列希釈）および一定濃度、５μｇ／ｍＬのヒトＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質（ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ）を予め混合し、細胞と４℃、１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いて洗浄後、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを加え、細胞と４℃、１時間インキュベートした。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体ＢＭＫ６．ｈＩｇＧ４、ＢＭＫ８．ｈＩｇＧ４およびＢＭＫ９．Ｆｃ（ＩｇＧ１）を陽性対照として使用した。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。次に細胞を１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で洗浄および再懸濁した。細胞のＭＦＩをフローサイトメーター（ＢＤ）によって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって分析した。データを図２Ａおよび表８に示した。
【0213】
【表11】
【0214】
４．２ ＦＡＣＳによって測定したマウスＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断
マウスＰＤ－Ｌ１トランスフェクトＷ３１５－２９３Ｆ．ｍＰｒｏ１．Ｃ１細胞を細胞２×１０５個／ウェルの密度で９６ウェルＵ底プレートに移した。種々の濃度の抗ＰＤ－Ｌ１抗体（１３３．３ｎＭから０．０６８ｎＭに３倍系列希釈）および一定濃度５μｇ／ｍＬのマウスＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質（Ｗ３０５－ｍＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ）を予め混合し、細胞と４℃、１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いた洗浄後、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを加え、細胞と４℃、１時間インキュベートした。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体ＢＭＫ８．ｈＩｇＧ４およびＢＭＫ９．Ｆｃ（ＩｇＧ１）を対照抗体として使用した。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。次に細胞を１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で洗浄および再懸濁した。細胞のＭＦＩをフローサイトメーター（ＢＤ）によって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって分析した。
マウスＰＤ－Ｌ１トランスフェクトＷ３１５－２９３Ｆ．ｍＰｒｏ１．Ｃ１細胞を細胞２×１０５個／ウェルの密度で９６ウェルＵ底プレートに移した。種々の濃度の抗ＰＤ－Ｌ１抗体（１３３．３ｎＭから０．０６８ｎＭに３倍系列希釈）および一定濃度５μｇ／ｍＬのマウスＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質（Ｗ３０５－ｍＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ）を予め混合し、細胞と４℃、１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いた洗浄後、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを加え、細胞と４℃、１時間インキュベートした。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体ＢＭＫ８．ｈＩｇＧ４およびＢＭＫ９．Ｆｃ（ＩｇＧ１）を対照抗体として使用した。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。次に細胞を１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で洗浄および再懸濁した。細胞のＭＦＩをフローサイトメーター（ＢＤ）によって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって分析した。
【0215】
データを図２Ｂおよび表９に示した。
【0216】
【表12】
【0217】
４．３ ＦＡＣＳによって測定したヒトＰＤ－Ｌ１／ＣＤ８０遮断
ヒトＣＤ８０発現細胞（ＣＨＯ－Ｋ１．ＣＤ８０．Ｂ９）を細胞１×１０５個／ウェルの密度で９６ウェルＵ底プレートに移した。種々の濃度の抗体（６６７ｎＭ、６６．７ｎＭおよび６．６７ｎＭ）ならびに一定濃度５μｇ／ｍＬのヒトＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質（Ｗ３１５－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ）を半時間予め混合し、細胞と４℃、１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いた洗浄後、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを加え、細胞と４℃、１時間インキュベートした。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体ＢＭＫ６．ｈＩｇＧ４、ＢＭＫ８．ｈＩｇＧ４およびＢＭＫ９．Ｆｃ（ＩｇＧ１）を陽性対照として使用した。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。次に細胞を１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で洗浄および再懸濁した。細胞のＭＦＩをフローサイトメーター（ＢＤ）によって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって分析した。データを図２Ｃに示した。
ヒトＣＤ８０発現細胞（ＣＨＯ－Ｋ１．ＣＤ８０．Ｂ９）を細胞１×１０５個／ウェルの密度で９６ウェルＵ底プレートに移した。種々の濃度の抗体（６６７ｎＭ、６６．７ｎＭおよび６．６７ｎＭ）ならびに一定濃度５μｇ／ｍＬのヒトＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質（Ｗ３１５－ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ）を半時間予め混合し、細胞と４℃、１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いた洗浄後、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを加え、細胞と４℃、１時間インキュベートした。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体ＢＭＫ６．ｈＩｇＧ４、ＢＭＫ８．ｈＩｇＧ４およびＢＭＫ９．Ｆｃ（ＩｇＧ１）を陽性対照として使用した。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。次に細胞を１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で洗浄および再懸濁した。細胞のＭＦＩをフローサイトメーター（ＢＤ）によって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって分析した。データを図２Ｃに示した。
【0218】
図２Ｃに示すとおり、ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１はヒトＰＤ－Ｌ１の細胞表面ＣＤ８０への結合を用量依存的様式で遮断することに有効である。
【0219】
５．ＥＬＩＳＡによって測定した交差ファミリータンパク質結合アッセイ
９６ウェルプレートを１μｇ／ｍＬ、ウェルあたり１００μＬのヒトＰＤ－Ｌ１ ＥＣＤタンパク質（Ｒ＆Ｄ－９０４９－Ｂ７）、ｈＰＤ－Ｌ２．ＥＣＤ．Ｈｉｓ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ－１０２９２－Ｈ０８Ｈ）、ｈＣＤ８０．ＥＣＤ．Ｈｉｓ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ－１０６９８－Ｈ０８Ｈ）またはｈＣＤ８６．ＥＣＤ．Ｈｉｓ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ－１０６９９－Ｈ０８Ｈ）を用いて４℃、一晩プレコーティングした。２００μＬの１×ＰＢＳ／２％ＢＳＡを使用した１時間のブロッキング後、試験用抗体をプレートに濃度６６．７ｎＭで加えた。プレートを周囲温度で１時間インキュベートした。抗体の固定化タンパク質への結合をＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体によって検出した。１００μＬのＴＭＢ基質を分注することによって発色させ、次に１００μＬの２Ｎ ＨＣｌによって停止させた。吸光度を４５０ｎｍおよび５４０ｎｍでマイクロプレート分光光度計を使用してそれぞれ読み取った。データを図３に示した。
９６ウェルプレートを１μｇ／ｍＬ、ウェルあたり１００μＬのヒトＰＤ－Ｌ１ ＥＣＤタンパク質（Ｒ＆Ｄ－９０４９－Ｂ７）、ｈＰＤ－Ｌ２．ＥＣＤ．Ｈｉｓ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ－１０２９２－Ｈ０８Ｈ）、ｈＣＤ８０．ＥＣＤ．Ｈｉｓ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ－１０６９８－Ｈ０８Ｈ）またはｈＣＤ８６．ＥＣＤ．Ｈｉｓ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ－１０６９９－Ｈ０８Ｈ）を用いて４℃、一晩プレコーティングした。２００μＬの１×ＰＢＳ／２％ＢＳＡを使用した１時間のブロッキング後、試験用抗体をプレートに濃度６６．７ｎＭで加えた。プレートを周囲温度で１時間インキュベートした。抗体の固定化タンパク質への結合をＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体によって検出した。１００μＬのＴＭＢ基質を分注することによって発色させ、次に１００μＬの２Ｎ ＨＣｌによって停止させた。吸光度を４５０ｎｍおよび５４０ｎｍでマイクロプレート分光光度計を使用してそれぞれ読み取った。データを図３に示した。
【0220】
図３に示すとおり、ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１は、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的であり、ＰＤ－Ｌ２、ＣＤ８０およびＣＤ８６に交差反応しない。
【0221】
６．ＦＡＣＳによるエピトープビニング
ヒトＰＤ－Ｌ１発現細胞Ｗ３１５－ＣＨＯ－Ｋ１．ｈＰｒｏ１．Ｃ１１を細胞１×１０５個／ウェルの密度で９６ウェルＵ底プレートに移した。種々の濃度のＷ３１５６抗体（１３３．３ｎＭから０．００６８ｎＭに３倍系列希釈）を一定濃度のビオチン化ＢＭＫ６．ｈＩｇＧ４（０．５μｇ／ｍＬ）またはビオチン化ＢＭＫ８．ｈＩｇＧ４（０．５μｇ／ｍＬ）とそれぞれ混合した。次に混合物を９６ウェルプレート中の細胞に加え、４℃、１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いて洗浄後、二次抗体ＳＡ－ＰＥを加え、細胞と４℃、１時間インキュベートした。次に細胞を１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄および再懸濁した。細胞のＭＦＩをフローサイトメーターによって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって分析した。
ヒトＰＤ－Ｌ１発現細胞Ｗ３１５－ＣＨＯ－Ｋ１．ｈＰｒｏ１．Ｃ１１を細胞１×１０５個／ウェルの密度で９６ウェルＵ底プレートに移した。種々の濃度のＷ３１５６抗体（１３３．３ｎＭから０．００６８ｎＭに３倍系列希釈）を一定濃度のビオチン化ＢＭＫ６．ｈＩｇＧ４（０．５μｇ／ｍＬ）またはビオチン化ＢＭＫ８．ｈＩｇＧ４（０．５μｇ／ｍＬ）とそれぞれ混合した。次に混合物を９６ウェルプレート中の細胞に加え、４℃、１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いて洗浄後、二次抗体ＳＡ－ＰＥを加え、細胞と４℃、１時間インキュベートした。次に細胞を１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡで洗浄および再懸濁した。細胞のＭＦＩをフローサイトメーターによって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって分析した。
【0222】
ＢＭＫ９ Ｆｃ（ＩｇＧ１）に対するエピトープビニングを試験するために、Ｗ３１５６リード抗体をＣ－ｍｙｃおよびＨｉｓタグにコンジュゲートされたＶＨＨフォーマットで構築した。細胞Ｗ３１５－ＣＨＯ－Ｋ１．ｈＰｒｏ１．Ｃ１１を９６ウェルＵ底プレートに細胞１×１０５個／ウェルの密度で移した。一定濃度のＡＰ３Ｒ２－１Ａ３ ＶＨＨフォーマットを種々の濃度のＢＭＫ９．Ｆｃ（ＩｇＧ１）（１３３．３ｎＭから０．０００８ｎＭに３倍系列希釈）とそれぞれ混合した。次に混合物を９６ウェルプレート中の細胞に加え、４℃、１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いて洗浄後、二次抗体ＰＥ標識抗Ｃ－ｍｙｃを加え、細胞と４℃、１時間インキュベートした。次に細胞を１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で洗浄し、再懸濁した。細胞のＭＦＩをフローサイトメーターによって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって分析した。データを図４に示した。
【0223】
図４に示すとおり、ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１は、ＢＭＫ６、ＢＭＫ８およびＢＭＫ９と同様のエピトープビンを共有している。
【0224】
７．ヒト細胞に基づく機能アッセイ
一方向混合リンパ球反応（一方向ＭＬＲ）をヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカイン分泌および増殖への抗ＰＤ－Ｌ１抗体のアゴニスト効果を試験するために使用した。
一方向混合リンパ球反応（一方向ＭＬＲ）をヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカイン分泌および増殖への抗ＰＤ－Ｌ１抗体のアゴニスト効果を試験するために使用した。
【0225】
ｉ）細胞単離、細胞培養および誘導
ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を健常ドナーからＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ勾配遠心分離を使用して新たに単離した。単離ＰＢＭＣを１００Ｕ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－２を補充した完全ＲＰＭＩ－１６４０（１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳを含有）中で培養した。
ヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を健常ドナーからＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ勾配遠心分離を使用して新たに単離した。単離ＰＢＭＣを１００Ｕ／ｍＬ組換えヒトＩＬ－２を補充した完全ＲＰＭＩ－１６４０（１０％ＦＢＳおよび１％ＰＳを含有）中で培養した。
【0226】
ヒト単球をヒトＣＤ１４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓキットを製造者の説明書に従って使用して単離した。細胞濃度を組換えヒトＧＭ－ＣＳＦを８００Ｕ／ｍＬでおよびＩＬ－４を５０ｎｇ／ｍＬで補充した完全ＲＰＭＩ－１６４０培地中で細胞２×１０６個／ｍＬに調整した。細胞懸濁物を６ウェルプレートに２．５ｍｌ／ウェルで播種した。細胞を５から７日間培養し、樹状細胞（ＤＣ）に分化させた。２～３日ごとに培地の半量をサイトカインを補充した新鮮な培地で置き換えることによってサイトカインを補充した。ＭＬＲの１８から２４時間前に１μｇ／ｍＬ ＬＰＳをＤＣ成熟を誘導するために培養物に加えた。
【0227】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞をヒトＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮キットを製造者のプロトコールに従って使用して単離した。
【0228】
ｉｉ）混合リンパ球反応
ヒト同種ＭＬＲについて、精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を同種成熟ＤＣ（ｍＤＣ）と共培養した。
ヒト同種ＭＬＲについて、精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を同種成熟ＤＣ（ｍＤＣ）と共培養した。
【0229】
ヒト自己ＭＬＲについて、ＰＢＭＣをＣＤ４＋Ｔ細胞単離の前にＣＭＶペプチドを用いて５日間処置した。アッセイの日にＤＣをＣＭＶペプチドを用いて１時間処置し、次に自己ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した。
【0230】
ＭＬＲを完全ＲＰＭＩ－１６４０培地を使用して９６ウェル丸底プレートに準備した。ＣＤ４＋Ｔ細胞、種々の濃度の抗体（１６６．７ｎＭ、６６．７ｎＭ、６．６７ｎＭ、０．６６７ｎＭ、０．０６６７ｎＭおよび０．００６７ｎＭ）ならびに同種ＤＣを適切な比でプレートに加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。ＩＬ－２およびＩＦＮ－γ産生を３日目および５日目にそれぞれ決定した。
【0231】
ｉｉｉ）サイトカイン検出
ヒトＩＦＮ－γおよびＩＬ－２放出を対応する抗体対を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。組換えヒトＩＦＮ－γおよびＩＬ－２を標準としてそれぞれ使用した。ＩＦＮ－γの系列濃度は、８、４、２、１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２５ｎｇ／ｍＬであり、ＩＬ－２のものは、８、４、２、１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２５ｎｇ／ｍＬであった。プレートをヒトＩＦＮ－γまたはＩＬ－２に対して特異的な捕捉抗体を用いてそれぞれプレコーティングした。ブロッキング後、５０μＬの標準物質または試料を各ウェルにピペットで入れ、２時間、周囲温度でインキュベートした。未結合物質の除去後、対応するサイトカインに特異的なビオチン－コンジュゲート検出抗体をウェルに加え、１時間インキュベートした。次にストレプトアビジン－ＨＲＰを３０分間、周囲温度でウェルに加えた。５０μＬのＴＭＢ基質を分注することによって発色させ、次に５０μＬの２Ｎ ＨＣｌによって停止させた。吸光度を４５０ｎｍおよび５４０ｎｍでマイクロプレート分光光度計を使用して読み取った。上清中のサイトカインの濃度を標準曲線から算出した。データを図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃに示した。
ヒトＩＦＮ－γおよびＩＬ－２放出を対応する抗体対を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。組換えヒトＩＦＮ－γおよびＩＬ－２を標準としてそれぞれ使用した。ＩＦＮ－γの系列濃度は、８、４、２、１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２５ｎｇ／ｍＬであり、ＩＬ－２のものは、８、４、２、１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２５ｎｇ／ｍＬであった。プレートをヒトＩＦＮ－γまたはＩＬ－２に対して特異的な捕捉抗体を用いてそれぞれプレコーティングした。ブロッキング後、５０μＬの標準物質または試料を各ウェルにピペットで入れ、２時間、周囲温度でインキュベートした。未結合物質の除去後、対応するサイトカインに特異的なビオチン－コンジュゲート検出抗体をウェルに加え、１時間インキュベートした。次にストレプトアビジン－ＨＲＰを３０分間、周囲温度でウェルに加えた。５０μＬのＴＭＢ基質を分注することによって発色させ、次に５０μＬの２Ｎ ＨＣｌによって停止させた。吸光度を４５０ｎｍおよび５４０ｎｍでマイクロプレート分光光度計を使用して読み取った。上清中のサイトカインの濃度を標準曲線から算出した。データを図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃに示した。
【0232】
図５Ａに示すとおり、同種ＭＬＲアッセイにおいてＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞ＩＬ－２産生を用量依存的様式で促進する。図５Ｂに示すとおり、同種ＭＬＲアッセイにおいてＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＩＦＮγ産生を用量依存的様式で促進する。さらに図５Ｃに示すとおり、自己ＭＬＲアッセイにおいてＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞ＩＦＮ－γ産生を用量依存的様式で促進する。
【0233】
８．マウス細胞に基づく機能アッセイ
一方向ＭＬＲをマウスＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカイン分泌および増殖へのＰＤ－Ｌ１抗体のアゴニスト効果を試験するために使用した。
一方向ＭＬＲをマウスＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカイン分泌および増殖へのＰＤ－Ｌ１抗体のアゴニスト効果を試験するために使用した。
【0234】
ｉ）細胞単離、細胞培養および誘導
Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスをＳｈａｎｇｈａｉ ＳＬＡＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。
Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスをＳｈａｎｇｈａｉ ＳＬＡＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した。
【0235】
マウス骨髄細胞を２０ｎｇ／ｍＬ組換えマウス ＧＭ－ＣＳＦおよび２０ｎｇ／ｍＬマウスＩＬ－４を補充した完全ＲＰＭＩ－１６４０培地に懸濁した。細胞懸濁物を２．５ｍｌ／ウェルで６ウェルプレートに播種した。細胞を５から７日間培養し、樹状細胞（ＤＣ）に分化させた。２～３日ごとに培地の半量をサイトカインを補充した新鮮な培地で置き換えることによってサイトカインを補充した。ＭＬＲの１８から２４時間前に１μｇ／ｍＬ ＬＰＳをＤＣ成熟を誘導するために培養物に加えた。
【0236】
マウスＣＤ４＋Ｔ細胞を製造者のプロトコールに従ってマウスＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮キットを使用して脾臓から単離した。
【0237】
ｉｉ）混合リンパ球反応
ＭＬＲを完全ＲＰＭＩ－１６４０培地を使用して９６ウェル丸底プレートに準備した。Ｂａｌｂ／ｃマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞、種々の濃度の抗体（１６６．７ｎＭ、６６．７ｎＭ、６．６７ｎＭ、０．６６７ｎＭ、０．０６６７ｎＭおよび０．００６７ｎＭ）ならびにＣ５７ＢＬ／６マウス由来ｍＤＣを適切な比でプレートに加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。ＩＬ－２産生を３日目に決定した。細胞を３Ｈ－ＴＤＲによってＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を測定するために５日目に採取した。
ＭＬＲを完全ＲＰＭＩ－１６４０培地を使用して９６ウェル丸底プレートに準備した。Ｂａｌｂ／ｃマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞、種々の濃度の抗体（１６６．７ｎＭ、６６．７ｎＭ、６．６７ｎＭ、０．６６７ｎＭ、０．０６６７ｎＭおよび０．００６７ｎＭ）ならびにＣ５７ＢＬ／６マウス由来ｍＤＣを適切な比でプレートに加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。ＩＬ－２産生を３日目に決定した。細胞を３Ｈ－ＴＤＲによってＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を測定するために５日目に採取した。
【0238】
ｉｉｉ）サイトカイン検出
マウスＩＬ－２放出を対応する抗体対を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。組換えマウスＩＬ－２を標準として使用した。ＩＬ－２の系列濃度は、０．８、０．４、０．２、０．１、０．０５、０．０２５、０．０１２５、０．００６２５、０．００３１２５ｎｇ／ｍＬであった。プレートをマウスＩＬ－２に対して特異的な捕捉抗体を用いてプレコーティングした。ブロッキング後、５０μＬの標準物質または試料を各ウェルにピペットで入れ、２時間、周囲温度でインキュベートした。未結合物質の除去後、ビオチン－コンジュゲート検出抗体をウェルに加え、１時間インキュベートした。次にストレプトアビジン－ＨＲＰを３０分間、周囲温度でウェルに加えた。５０μＬのＴＭＢ基質を分注することによって発色させ、次に５０μＬの２Ｎ ＨＣｌによって停止させた。吸光度を４５０ｎｍおよび５４０ｎｍでマイクロプレート分光光度計を使用して読み取った。上清中のサイトカインの濃度を標準曲線から算出した。
マウスＩＬ－２放出を対応する抗体対を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。組換えマウスＩＬ－２を標準として使用した。ＩＬ－２の系列濃度は、０．８、０．４、０．２、０．１、０．０５、０．０２５、０．０１２５、０．００６２５、０．００３１２５ｎｇ／ｍＬであった。プレートをマウスＩＬ－２に対して特異的な捕捉抗体を用いてプレコーティングした。ブロッキング後、５０μＬの標準物質または試料を各ウェルにピペットで入れ、２時間、周囲温度でインキュベートした。未結合物質の除去後、ビオチン－コンジュゲート検出抗体をウェルに加え、１時間インキュベートした。次にストレプトアビジン－ＨＲＰを３０分間、周囲温度でウェルに加えた。５０μＬのＴＭＢ基質を分注することによって発色させ、次に５０μＬの２Ｎ ＨＣｌによって停止させた。吸光度を４５０ｎｍおよび５４０ｎｍでマイクロプレート分光光度計を使用して読み取った。上清中のサイトカインの濃度を標準曲線から算出した。
【0239】
ｉｖ）増殖検出
３Ｈ－チミジンを０．９％ＮａＣｌ溶液中に希釈し、細胞培養プレートに０．５ｕＣｉ／ウェルで加えた。増殖中の細胞への３Ｈ－チミジンの取込みを決定する前に、プレートを１６から１８時間、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて培養した。
３Ｈ－チミジンを０．９％ＮａＣｌ溶液中に希釈し、細胞培養プレートに０．５ｕＣｉ／ウェルで加えた。増殖中の細胞への３Ｈ－チミジンの取込みを決定する前に、プレートを１６から１８時間、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて培養した。
【0240】
図６Ａに示すとおり、ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１は、ＭＬＲアッセイにおいてマウスＣＤ４＋Ｔ細胞ｍＩＬ－２産生を用量依存的様式で促進する。および図６Ｂに示すとおり、ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１は、ＭＬＲアッセイにおいてマウスＣＤ４＋Ｔ増殖を用量依存的様式で促進する。
【0241】
９．抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）
細胞Ｗ３１５－ＣＨＯ－Ｋ１．ｈＰｒｏ１．Ｃ１１および種々の濃度の試験用抗体（６６．７ｎＭから０．００６６７ｐＭに１０倍希釈）を９６ウェルプレートで混合し、ＰＢＭＣを５０：１（細胞数）のエフェクター／標的比で加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて４～６時間保った。標的細胞溶解をＬＤＨ－ベース細胞毒性検出キットによって決定した。ＢＴ－４７４細胞でのハーセプチン誘導ＡＤＣＣ効果を陽性対照として使用した。ＡＤＣＣ試験についての結果を図７に示した。
細胞Ｗ３１５－ＣＨＯ－Ｋ１．ｈＰｒｏ１．Ｃ１１および種々の濃度の試験用抗体（６６．７ｎＭから０．００６６７ｐＭに１０倍希釈）を９６ウェルプレートで混合し、ＰＢＭＣを５０：１（細胞数）のエフェクター／標的比で加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて４～６時間保った。標的細胞溶解をＬＤＨ－ベース細胞毒性検出キットによって決定した。ＢＴ－４７４細胞でのハーセプチン誘導ＡＤＣＣ効果を陽性対照として使用した。ＡＤＣＣ試験についての結果を図７に示した。
【0242】
図７に示すとおり、ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１はＰＤ－Ｌ１トランスフェクト細胞でＡＤＣＣ効果を弱く誘導できる。
【0243】
１０．補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）
細胞Ｗ３１５－ＣＨＯ－Ｋ１．ｈＰｒｏ１．Ｃ１１および種々の濃度の試験用抗体（２００ｎＭ、２０ｎＭおよび２ｎＭ）を９６ウェルプレートで混合した。ヒト補体を１：５０の希釈比で加えた。プレートを３７℃に５％ＣＯ２インキュベーターで２～３時間保った。標的細胞溶解をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏによって決定した。リツキシマブ誘導Ｒａｊｉ細胞溶解を陽性対照として使用した。ＡＤＣＣ試験についての結果を図８に示した。
細胞Ｗ３１５－ＣＨＯ－Ｋ１．ｈＰｒｏ１．Ｃ１１および種々の濃度の試験用抗体（２００ｎＭ、２０ｎＭおよび２ｎＭ）を９６ウェルプレートで混合した。ヒト補体を１：５０の希釈比で加えた。プレートを３７℃に５％ＣＯ２インキュベーターで２～３時間保った。標的細胞溶解をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏによって決定した。リツキシマブ誘導Ｒａｊｉ細胞溶解を陽性対照として使用した。ＡＤＣＣ試験についての結果を図８に示した。
【0244】
図８に示すとおり、ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１はＣＤＣ効果を誘導しない。
【0245】
１１．ヒト血清中の抗体安定性
新鮮なヒト血清を健常ドナーから遠心分離によって調製した。試験用抗体を血清と混合し、合計容量中の血清含有量＞９０％とした。混合アリコートを３７℃で０日間、１日間、４日間、７日間および１４日間それぞれインキュベートした。示した時点で、試料を液体窒素中で急速凍結し、分析まで－８０℃で保存した。上記の時点でのアリコートのＰＤ－Ｌ１への結合をフローサイトメトリーによってそれぞれ評価した。ＡＤＣＣ試験についての結果を図９に示す。
新鮮なヒト血清を健常ドナーから遠心分離によって調製した。試験用抗体を血清と混合し、合計容量中の血清含有量＞９０％とした。混合アリコートを３７℃で０日間、１日間、４日間、７日間および１４日間それぞれインキュベートした。示した時点で、試料を液体窒素中で急速凍結し、分析まで－８０℃で保存した。上記の時点でのアリコートのＰＤ－Ｌ１への結合をフローサイトメトリーによってそれぞれ評価した。ＡＤＣＣ試験についての結果を図９に示す。
【0246】
図９に示すとおり、ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１はヒト血清中、３７℃で少なくとも１４日間安定である。
【0247】
１２．ＤＳＦアッセイによる熱安定性
試験用抗体の熱安定性をＤＳＦアッセイによって測定した。ＤＳＦアッセイを７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。簡潔には、１９μＬの抗体溶液を１μＬの６２．５ＸＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、９６ウェルプレート（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に加えた。プレートを２６℃から９５℃に２℃／分の速度で加熱し、生じた蛍光データを回収した。異なる温度に関する蛍光変化の負の微分係数を算出し、最大値を融解温度Ｔｈと定義した。タンパク質が複数のアンフォールディング遷移状態を有する場合、最初の２つのＴｈをＴｈ１およびＴｈ２と名付けて報告した。異なるタンパク質間の比較を促進するためにＴｈ１が常に正式な融解温度Ｔｍと解釈される。データ回収およびＴｈ算出は、その操作用ソフトウェアによって自動的に算出された。ＤＳＦアッセイによる熱安定性についての結果を図１０および表１０に示す。
試験用抗体の熱安定性をＤＳＦアッセイによって測定した。ＤＳＦアッセイを７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。簡潔には、１９μＬの抗体溶液を１μＬの６２．５ＸＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、９６ウェルプレート（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に加えた。プレートを２６℃から９５℃に２℃／分の速度で加熱し、生じた蛍光データを回収した。異なる温度に関する蛍光変化の負の微分係数を算出し、最大値を融解温度Ｔｈと定義した。タンパク質が複数のアンフォールディング遷移状態を有する場合、最初の２つのＴｈをＴｈ１およびＴｈ２と名付けて報告した。異なるタンパク質間の比較を促進するためにＴｈ１が常に正式な融解温度Ｔｍと解釈される。データ回収およびＴｈ算出は、その操作用ソフトウェアによって自動的に算出された。ＤＳＦアッセイによる熱安定性についての結果を図１０および表１０に示す。
【0248】
【表13】
【0249】
結果は、ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１が通常のＤＳＦプロファイルを有し、Ｔｈ１が６１．２℃であることを示す。
【0250】
１３．非特異的結合ＥＬＩＳＡ
非特異的結合ＥＬＩＳＡを９６ウェル高結合プレート（Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。プレートを種々の抗原（表１１の左カラムに列挙されるとおり）を２μｇ／ｍＬで用いて一晩、４℃でコーティングした。２％ＢＳＡ－ＰＢＳを用いてブロッキングした後、１０μｇ／ｍｌ抗体をプレートに加え、２時間インキュベートした。次にプレートを二次抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ８０－３０４Ｐ）とさらに１時間インキュベートした。ＨＲＰシグナルをＴＭＢペルオキシダーゼ基質を加えることによって検出し、反応を２Ｍ ＨＣｌを使用して１２分間後に停止させた。４５０ｎＭでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して読み取った。すべてのインキュベーションステップは室温で実施した。プレートはステップの間にＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ）を用いて洗浄した。この試験によって、ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１は非特異的結合を示さない。結果を表１１に示す。
非特異的結合ＥＬＩＳＡを９６ウェル高結合プレート（Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。プレートを種々の抗原（表１１の左カラムに列挙されるとおり）を２μｇ／ｍＬで用いて一晩、４℃でコーティングした。２％ＢＳＡ－ＰＢＳを用いてブロッキングした後、１０μｇ／ｍｌ抗体をプレートに加え、２時間インキュベートした。次にプレートを二次抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ８０－３０４Ｐ）とさらに１時間インキュベートした。ＨＲＰシグナルをＴＭＢペルオキシダーゼ基質を加えることによって検出し、反応を２Ｍ ＨＣｌを使用して１２分間後に停止させた。４５０ｎＭでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して読み取った。すべてのインキュベーションステップは室温で実施した。プレートはステップの間にＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０－ＰＢＳ）を用いて洗浄した。この試験によって、ＡＰ３Ｒ２－１Ａ３－ｚ１２－ｈＩｇＧ１は非特異的結合を示さない。結果を表１１に示す。
【0251】
【表14】
【0252】
当業者は、本開示がその趣旨または中心的性質から逸脱することなく他の具体的な形態において具現化され得ることをさらに理解するだろう。本開示の上述の説明はその例示的な実施形態のみを開示しているという点において、他の変形例が本開示の範囲内であると企図されていることが理解されるべきである。したがって、本開示は、本明細書に詳細に記載された特定の実施形態に限定されない。むしろ、本開示の範囲および内容を示すものとして、添付の特許請求の範囲に対する参照がなされるべきである。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】