特許 7445980 生殖補助医療手法の転帰の予測方法およびキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-02-29

(45)【発行日】2024-03-08

(54)【発明の名称】生殖補助医療手法の転帰の予測方法およびキット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/06 20060101AFI20240301BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20240301BHJP

   C12Q 1/689 20180101ALI20240301BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240301BHJP

   C12M 1/34 20060101ALN20240301BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/06 ZNA

C12Q1/6851 Z

C12Q1/689 Z

C12N15/11 Z

C12M1/34 B

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2020565743

(86)(22)【出願日】2019-05-09

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-09-13

(86)【国際出願番号】 EP2019061967

(87)【国際公開番号】W WO2019224012

(87)【国際公開日】2019-11-28

【審査請求日】2022-02-22

(31)【優先権主張番号】18173578.8

(32)【優先日】2018-05-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】515208717

【氏名又は名称】アートプレッド ビー． ブイ．

(74)【代理人】

【識別番号】100105924

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 賢樹

(72)【発明者】

【氏名】デヨング、ジョナサン デニス

(72)【発明者】

【氏名】バディング、ドリス

(72)【発明者】

【氏名】デモニンク、ユップ

【審査官】太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５２２６６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－２０９０６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５２４４４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】Human Reproduction，2016年02月23日，Vol. 31, No. 4，p. 795-803

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生殖補助医療（ＡＲＴ）手法の結果が妊娠とならない可能性を予測する方法であって、
ＡＲＴ手法の前または最中に採取した雌の哺乳類対象由来の試料を、ガルドネラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）ＩＳＴ１の存在および以下のパラメータ：
ａ）ラクトバシラス種の相対存在量、
ｂ）ラクトバシラス・イエンセン（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）の相対存在量、
ｃ）プロテオバクテリアの相対存在量
について分析し
前記試料がガルドネラ・バギナリスＩＳＴ１を含む場合、または以下のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ：
Ｉ．前記ラクトバシラス種の相対存在量が、２０％の値未満である、
ＩＩ．前記ラクトバシラス・イエンセンの相対存在量が、３５％の値を超えている、
ＩＩＩ．前記プロテオバクテリアの相対存在量が、２８％の値を超えている、
の少なくとも１つに当てはまる場合、前記対象が前記ＡＲＴ手法の結果、妊娠していない可能性が高いと結論づけられることを特徴とする方法。

【請求項2】

前記ガルドネラ・バギナリスＩＳＴ１の存在は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって決定される請求項１に記載の方法。

【請求項3】

フォワードプライマーＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＡＷＧ（配列番号１）およびリバースプライマーＡＧＧＣＡＴＣＣＲＣＣＡＴＧＣＧＣＣＣＴ（配列番号２）（ＷはＡまたはＴを示し、ＲはＡまたはＧを示す）を用いて前記ＰＣＲを実施し、４２８－４３０ヌクレオチドの長さの増幅産物を検出する請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記試料が膣のスワブである請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記哺乳類対象がヒトである請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記ＡＲＴ手法が、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）などの体外受精（ＩＶＦ）手法である請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記試料が、ＩＶＦ手法の２ヶ月以内に提供されたものである請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

ガルドネラ・バギナリスＩＳＴ１ ＤＮＡの増幅産物の検出のためのフォワードプライマーＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＡＷＧ（配列番号１）と、リバースプライマーＡＧＧＣＡＴＣＣＲＣＣＡＴＧＣＧＣＣＣＴ（配列番号２）と、を含み、ガルドネラ・バギナリスＩＳＴ１ ＤＮＡ増幅産物の長さは４２８～４３０ヌクレオチドであり、ＷはＡまたはＴを示し、ＲはＡまたはＧを示すことを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の方法を行うキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒト生殖分野、より詳細には、ヒト生殖が失敗する状況に関する。本発明は、体外受精法および卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）などの生殖補助医療（ＡＲＴ）手法が成功した妊娠をもたらさない可能性を予測する確実かつ非常に正確な方法を提供する。また、本発明は、体外受精および卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）などの生殖補助医療（ＡＲＴ）手法が妊娠成功をもたらす可能性を予測する手段および方法も提供する。

【背景技術】

【0002】

西欧諸国の男女のカップルの１０～１５％が低受胎の影響を受けている。この低受胎は、半分が女性の生殖システムに関連して引き起こされ得、２０～２６％が男性に起因し、２５～３０％が原因不明である（Ｅｖｅｒｓ，Ｊ．Ｌ．，２００２，Ｌａｎｃｅｔ ３６０：１５１－１５９）。多くの男女のカップルが、子供を授かるために体外受精（ＩＶＦ）または卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）などの生殖補助医療（ＡＲＴ）手法に頼る。

【0003】

これらの技術の成功率は開始した周期当たり約２５％である（Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ａ．ら．２００７，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．２２：１５１３－１５２５）。この成功率を改善できるのであれば、情緒面と経済面での大きな利益となる。

【0004】

また、ＡＲＴ手法の個人負担および社会的負担の観点から、手法での成功の可能性が低い男女のカップルを非常に早く同定して、子供の希望を叶えるために代替の手法を提案できることが望ましい。

【0005】

したがって、治療を改善し、かつ個別のケースにおいて進めるかどうかを決定するために、ＩＶＦ／ＩＣＳＩ後に女性が妊娠せず、生児出生がないかどうかを正確に予測できるモデルが必要とされている。

【0006】

１０年超にわたって、年齢、以前に失敗したＩＶＦの試みの数および不妊の可能性の高い理由を含む臨床データに基づいて生児出生の可能性を予測するモデルが利用可能となっている（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，Ｗ．ら．，１９９６，Ｌａｎｃｅｔ ３４８：１４０２－１４０６）。ＮｅｌｓｏｎおよびＬａｗｌｏｒ（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ Ｌａｗｌｏｒ Ｄ．Ａ．２０１１，ＰＬＯＳ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ８：１－１０）は、１４０．０００人超の女性からのデータに基づいて、不妊の年齢および原因、使用（される）手法、卵の源および子供を望んでいる期間の階層化を用いてモデルを開発した。Ｓｅｌｍａｎら（Ｊ．Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４：３９５－３９９（２００７））は、ＩＶＦ／妊娠転帰と関連するラクトバシラスおよびスタフィロコッカスの検出を開示している。欧州特許第２７４２３５９号明細書には、尿または膣試料中のラクトバシラス科の群に属する細菌およびスタフィロコッカスの種に属する細菌の相対量に基づいて、対象の成功または失敗妊娠の可能性を予測する方法が記載されている。

【0007】

それにもかかわらず、不必要なＡＲＴ手法の数を制限し、ＡＲＴ手法の失敗の転帰の可能性を予測するより優れ、より確実な、簡便な方法が必要とされ続けている。これは、健康管理のコストを減少させる手助けとなる。また、子供を望む女性をより早く代替の解決法に向けることができる。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、生殖補助医療（ＡＲＴ）手法の結果が妊娠とならない可能性を予測する方法であって、ＡＲＴ手法の前または最中に採取した雌の哺乳類対象由来の試料を、ガルドネラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）ＩＳＴ１の存在および以下のパラメータ：
ａ）ラクトバシラス種の相対存在量
ｂ）ラクトバシラス・イエンセン（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）の相対存在量、
ｃ）プロテオバクテリアの相対存在量、
の少なくとも１つについて分析し、試料がガルドネラ・バギナリスＩＳＴ１を含み、かつ
Ｉ．ラクトバシラス種の相対存在量が、１５％～２５％の間で選択される値未満である、または
ＩＩ．ラクトバシラス・イエンセンの相対存在量が、２５％～４５％の間で選択される値を超えている、または
ＩＩＩ．プロテオバクテリアの相対存在量が、１８％～３８％の間で選択される値を超えている、
の少なくとも１つに当てはまる場合、対象がＡＲＴ手法の結果、妊娠していない可能性が高いと結論付けられる方法に関する。

【0009】

本発明は、本発明に従う方法を行うキットにも関し、該キットは、ガルドネラ・バギナリスＩＳＴ１ ＤＮＡの増幅産物の検出のためのフォワードプライマーＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＡＷＧ（配列番号１）およびリバースプライマーＡＧＧＣＡＴＣＣＲＣＣＡＴＧＣＧＣＣＣＴ（配列番号２）を含み、ガルドネラ・バギナリスＩＳＴ１ ＤＮＡ増幅産物の長さは４２８～４３０ヌクレオチドであり、ＷはＡまたはＴを示し、ＲはＡまたはＧを示す。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】本明細書に例示の方法のうちの１つで得られたデータのＳｃａｔｔｅｒプロットである。［ＬＣ］が６０％未満である場合に妊娠の可能性が増加している。 ［ＬＣ}＜（ａ＊［ＬＩ］）＋ｂおよび ［ＬＣ}＞（ｃ＊［ＬＩ］）＋ｄであり、 ａ＝－０．６２、 ｂ＝０．８５、 ｃ＝－０．５８および ｄ＝０．３８である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本明細書において、生殖補助医療（ＡＲＴ）手法の結果が妊娠とならない可能性を予測する方法であって、
ＡＲＴ手法の前または最中に採取した雌の哺乳類対象由来の試料を、ガルドネラ・バギナリスの存在および以下のパラメータ：
ａ）ラクトバシラス種の相対存在量
ｂ）ラクトバシラス・イエンセンの相対存在量、
ｃ）プロテオバクテリアの相対存在量、
の少なくとも１つについて分析し、
試料がガルドネラ・バギナリスＩＳＴ１を含み、かつ
Ｉ．ラクトバシラス種の相対存在量が、１５％～２５％の間で選択される値未満である、または
ＩＩ．ラクトバシラス・イエンセンの相対存在量が、２５％～４５％の間で選択される値を超えている、または
ＩＩＩ．プロテオバクテリアの相対存在量が、１８％～３８％の間で選択される値を超えている、
の少なくとも１つに当てはまる場合、対象がＡＲＴ手法の結果、妊娠していない可能性が高いと結論づけられる方法が提供される。

【0012】

１５％～２５％の間で選択される値、２５％および４５％および１８％および３８％のそれぞれは、多くの場合カットオフ値または閾値とも称される。それは、方法が望ましい特異性および感度をもたらすように選択され得る。当業者であれば、適した値を決定する条件および境界をよく理解するものである。

【0013】

上記の本発明の好ましい実施形態では、ガルドネラ・バギナリスの存在に加えて、ラクトバシラス種の相対存在量、ラクトバシラス・イエンセンの相対存在量およびプロテオバクテリアの相対存在量が決定される。

【0014】

さらに好ましい実施形態では、本発明は、ガルドネラ・バギナリスがガルドネラ・バギナリスＩＳＴ１である上記方法に関する。ガルドネラ・バギナリスＩＳＴ１は、製造者（ＩＳ－ｐｒｏ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ＩＳ－Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって提供されているプロトコルに従って、遺伝子間の空間（ＩＳ）の増幅を用いて、膣の微生物集団分析を行うことによって同定され得る特定のガルドネレラ属種と本明細書では定義される。ＩＳ－ｐｒｏは、１６Ｓ～２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子ＩＳ領域の長さの検出およびカテゴリー化に基づく真正細菌技術である。このＩＳ領域の長さは、微生物種それぞれに特異的である。これによって、ガルドネラ・バギナリスＩＳＴ１は、配列番号１および配列番号２に従うプライマーを使用した際に、４２８、４２９または４３０ヌクレオチドの長さの特異的なＩＳ－断片を生じるガルドネラ・バギナリスの種としてさらに定義される。

【0015】

本明細書で、ＡＲＴ手法は、人工生殖技術を示す。特に、この用語は、体外受精（ＩＶＦ）、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）および人工授精（ＩＵＩ）に関する。

【0016】

相対存在量は、試料中の細菌の合計量比または数を示す。比は、パーセンテージ（％）または０～１の数として表される。

【0017】

本明細書で、ＡＲＴ手法の可能性の予測に関する「高い可能性」は、予測された成功率または失敗率が、ＡＲＴ手法を受ける女性の一般の集団におけるものより高いことを示す。特に、妊娠していない可能性は、本明細書に記載の陰性の予測基準が満たされる場合にＡＲＴ手法の結果６５％妊娠していない可能性などの、対象が妊娠していない可能性が６０％より高い場合、「増加した」とされる。これに関する６５％より高いは、例えば、８８％以上または９４％以上などの、７７％より高いを含む。

【0018】

また、本明細書に記載の陽性の予測基準が満たされている場合にＡＲＴ手法の結果、対象が妊娠している可能性が３５％より高い場合、妊娠している可能性が増加している。これに関する３５％より高いは、４１％、４９％または５０％以上を意味する。

【0019】

ガルドネレラは、グラム不定染色通性嫌気性細菌の属であり、ガルドネラ・バギナリスがその唯一の種である。細菌は小さく（直径１．０～１．５μＭ）、非胞子形成、非運動性の球桿菌である。一度ヘモフィルス・バギナリス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）と分類され、その後、コリネバクテリウム・バギナリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）と分類され、Ｇ．バギナリスは、チョコレート寒天上で小さい円形の凸状灰色コロニーとして増殖し、ＨＢＴ寒天上でも増殖する。Ｇ．バギナリスに対する選択培地はコリスチン－オキソリン酸血液寒天である。ガルドネラ・バギナリスの存在の決定は、好ましくは定量的ＰＣＲなどのＰＣＲで行われる。

【0020】

ラクトバシラスは、グラム陽性通性嫌気性細菌または微好気性非胞子形成桿菌の属である。それらは、乳酸細菌群（すなわち糖を乳酸へ転換する）の大部分である。ヒトでは、それらは、消化系、泌尿器系、生殖系などの多くの身体部位における微生物糞の重要な成分を構成している。ヨーロッパ系の女性では、ラクトバシラス種は通常、膣の微生物糞の大部分である。ラクトバシラスは、膣および消化管のフローラのバイオフィルムを形成し、厳しい環境条件の中で持続し、十分な集団を維持できるようにする。ラクトバシラスは、病原体による潜在的な侵入から宿主を守り、宿主は栄養素の源をもたらすことから、人体と共生関係を示す。

【0021】

本明細書でラクトバシラス種とは、すべてのラクトバシラス種をまとめて指す。

【0022】

ラクトバシラス・イエンセンは、健康な女性における再生力が低い管の常在菌である。正常な集団において、Ｌ．イエンセンは、自然発生の膣のマイクロフローラの約２３％に入る。

【0023】

プロテオバクテリアは、細菌の主要な門である。それらはグラム陰性細菌である。これは、グラム染色プロトコルのバイオレット染料を保持しないことを意味する。グラム染色試験では、対比染色（一般にサフラニン）がクリスタルバイオレットの後に添加され、すべてのグラム陰性細菌をピンク色で染色する。試験それ自体は、それらの細胞壁の構造的な違いに基づいて細菌の２つの異なるタイプに分類するのに有用である。

【0024】

プロテオバクテリアは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ、ビブリオ、ヘリコバクター、および多くの他の注目すべき属などの幅広い多様な病原体を含む。他のものたちは自由生活性であり、窒素固定を担う細菌の多くを含む。群は、主としてリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列の観点から定められる。

【0025】

これらの微生物を決定する多くの方法があり、当業者であれば、試料中のガルドネレラ属、ラクトバシラス種、Ｌ．イエンセンおよびプロテオバクテリアの相対量を決定し、定量する方法についての技術をよく理解する。本明細書では１９２人のＡＲＴ手法を受ける女性の集団から得られた試料中のこれらの細菌の存在および相対量を決定する調査の結果を提供する。

【0026】

これらの微生物の存在および相対量を相互に関連付け、それらの存在および／または存在量がＡＲＴ手法の成功率または失敗率の指標であることを見出した。

【0027】

１９２人の女性のうち、１２５人が第１の試みの後に妊娠しなかった一方で、６７人が妊娠した。これは６５％のＡＲＴ手法の失敗率および３５％の成功率である（表１および表２）。

【0028】

本発明に従う方法では、細菌の特定の種または属の相対存在量は、所定の参照値またはカットオフ値と比較する必要がある。所定の参照値はいずれの適したカットオフ値であり得る。適したカットオフ値を決定するこのプロセスは、当業者に周知であり、当業者によって実験的に容易に決定できる。

【0029】

好ましくは、参照値は試験集団と同等な集団から得られた試料の細菌組成から得られる値である。参照値は、参照集団でのＡＲＴ手法のいくつかの独立した実験の平均値から得られたものであることがさらにより好ましい。当業者であれば、細菌の相対存在量を測定し、決定するための参照値を決定する詳細を理解する。

【0030】

それ故に、方法の適切な特異性および／または感度を達成するために、所定の参照値は実験的に決定され得るか、または任意に選択され得る。当業者であれば、適切な参照値を選択する方法をよく理解する。当業者であれば、方法の望ましい特異性および感度を得るために、所定の参照値を変更する方法を知っている。

【0031】

例として、上記方法では、第１の所定の参照値は、２０％などの１５～２５％であり得、第２の所定の参照値は、３５％などの２５～４５％であり得、第３の所定の参照値は、２８％などの１８～３８％であり得る。

【0032】

第１、第２および第３の参照値が、それぞれ２０％、３５％および２８％と選択され、表１からのデータを、膣の細菌集団の微生物組成のデータと組み合わせた際に、１２５人のうち３２人の失敗したＡＲＴ転帰が正確に予測され得、すなわち、ＡＲＴ手法が失敗した２６％の事例が、正確に予測され得る（表２）ことが見られた。

【0033】

それ故に、上記に開示した本発明に従う方法は、信頼性の高い結果をもたらし、すなわち、２つの事例のみでＡＲＴ手法の失敗した転帰を予測するのを失敗した。これらの２つのケースでは、ＡＲＴ手法が望ましい結果と考えられる妊娠、すなわち成功した転帰をもたらした。したがって、上記の通り、対象が妊娠していないことを予測する方法の正確さは、３２／３４＝９４％である（表５）。

【表1】

【0034】

上記の本発明に従う方法がこの調査の除外基準として使用される場合、３４人の女性がこの調査から除外され、１９２人ではなく１５８人の女性が手法への参入を許可され、そのうち６５人が妊娠した。これは、その場合でのＡＲＴ手法の成功率が、６７人／１９２人＝３５％から６５／１５８＝４１％に増加したことを意味する。これは、ＡＲＴ手法の相対効率の６％の増加である。さらなる利点は、３４人の女性が、代替のアプローチを提案される前に、１つまたは複数のＡＲＴ手法を受ける必要がないことである。

【0035】

本明細書に記載の調査における本集団に適用される場合、選択手法は、３４／１９２人＝１８％のＡＲＴ手法の数の低下をもたらす。ＩＶＦまたはＩＣＳＩなどのＡＲＴ手法の合計平均コストは５．０００ユーロのオーダーである。合計で、本発明に従う方法を適用すると、ＩＶＦ／ＩＣＳＩ患者当たり平均９００ユーロの節約となり、言い換えると、手法のコストが１８％減少する。

【0036】

また、Ｇ．バギナリスＩＳＴ、特にＧ．バギナリスＩＳＴ１単独などのガルドネラ・バギナリスの存在に基づく方法の予測値も決定した。ガルドネラ・バギナリスＩＳＴ１を有する女性は、８８％妊娠していない可能性があったことが見られた（表３、表５）。それ故に、ガルドネラ・バギナリスがＧ．バギナリスＩＳＴ１である上記の方法によって、良好な結果を得た。

【表2】

【0037】

それ故に、本発明は、試料中のガルドネラ・バギナリス、好ましくはＧ．バギナリスＩＳＴ１などのＧ．バギナリスＩＳＴの存在を決定し、試料がガルドネラ・バギナリス、好ましくはＧ．バギナリスＩＳＴ１を含む場合、対象がＡＲＴ手法の結果妊娠していない可能性が高い上記の方法にも関する。

【0038】

この上記の方法の精度および他の特徴は、以下のパラメータ：
ａ）ラクトバシラス種の相対存在量
ｂ）ラクトバシラス・イエンセンの相対存在量、
ｃ）プロテオバクテリアの相対存在量、
の少なくとも１つを測定し、
試料がガルドネラ・バギナリスＩＳＴ１を含み、かつ
Ｉ．ラクトバシラス種の相対存在量が、１５％～２５％の間で選択される値未満である、または
ＩＩ．ラクトバシラス・イエンセンの相対存在量が、２５％～４５％の間で選択される値を超えている、または
ＩＩＩ．プロテオバクテリアの相対存在量が、１８％～３８％の間で選択される値を超えている、
の少なくとも１つに当てはまる場合、対象がＡＲＴ手法の結果、妊娠していない可能性が高いと結論づけられる方法を適用することによって、さらに改善され得る。

【0039】

これらの基準が適用される場合、より多くの試料が正確に予測され得る。

【0040】

表１のデータから差し引くことができるように、合計１９２人の試料のうち３４人が妊娠に成功していないと予測された。これらの３４人の試料のうち３２人が、本発明に従う方法によって正確に予測できた（表１、表２）。３２の正確に予測された試料から、１５人がＧ．バギナリスＩＳＴ１の存在に起因していた（基準１）。この基準を１５％未満であるラクトバシラス種の相対存在量の基準（基準２）と組み合わせた場合、これらの３２人のうち追加の７人の試料が正確に予測できた。基準１を、２５％超であるラクトバシラス・イエンセンの相対存在量の基準（基準３）と組み合わせた場合、これらの３２人のうち追加の６人の試料が正確に予測できた。基準１を、１８％超であるプロテオバクテリアの相対存在量の基準（基準４）と組み合わせた場合、これらの３２人のうち追加の５人の試料が正確に予測できた。これらの基準の他の組み合わせも方法の改善をもたらした。以下の表７には、使用した基準に応じた正確な予測の数が記載されている。すべての４つの基準を使用した場合、３２人すべての試料が検出された。

【表3】

【0041】

また、提供された試料中の２種のラクトバシラス種、Ｌ．クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）およびＬ．イネルス（Ｌ．ｉｎｅｒｓ）の存在も、ＩＳＰＲＯ技術（実施例４）を用いて決定した。結果を表４に示す。

【0042】

ラクトバシラス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）は、健康な女性の再生力が低い管の常在菌である。正常集団では、Ｌ．クリスパタスは、生殖年齢のすべての女性の３０％超において優占種である。

【0043】

ラクトバシラス・イネルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｎｅｒｓ）もラクトバシラス属の種である。それは、グラム陽性、カタラーゼ陰性、通性嫌気性桿菌である。ラクトバシラス・イネルスは、健康な女性の再生力が低い管の常在菌である。少なくとも１５株のゲノムが配列決定されており、１，１５２～１，５０６のタンパク質をコードする。それと共に、この種は、Ｌ．クリスパタス（典型的には２倍を超える多くのタンパク質をコードする）などの他の種と比較して、最も小さいラクトバシラスゲノムの１つを有する。

【0044】

これらの微生物を決定する多くの方法があり、当業者であれば、試料中のラクトバシラス種、Ｌ．クリスパタスおよびＬ．イネルスの相対量を決定し、定量する技術をよく理解する。

【0045】

これらの２つの種（Ｌ．クリスパタスおよびＬ．イネルス）も、ＡＲＴ手法の失敗または成功の指標であることを見出した。

【0046】

特に、ラクトバシラス・クリスパタスの相対存在量が第４の所定の参照値を超える場合、ＡＲＴ手法の結果、対象が妊娠していない可能性が高いことを見出した。この第４の所定の参照値は好ましくは６０％などの５０～７０％で選択された。６０％を第４の参照値として採用した場合、６５人の女性がこの基準を満たし、そのうち１５人がＡＲＴ手法の結果妊娠した（表６）。これは７７％の失敗率であり、すべての群の失敗率より高い（表５）。

【0047】

ラクトバシラス・クリスパタスの相対存在量が第５の所定の参照値未満である場合、対象が、ＡＲＴ手法の結果、妊娠している可能性が高いことも見出した。この第５の所定の参照値は、好ましくは６０％などの５０～７０％で選択された。第５の参照値として６０％を採用した場合、１２７人の女性がこの基準を満たし、そのうち５２人がＡＲＴ手法の結果妊娠した（表６）。これは４１％の成功率であり、すべての群の成功率より高い（表５）。これらの結果を表６および表５に示す。

【表4】

【0048】

また、ラクトバシラス・イネルスの相対存在量を決定し、ラクトバシラス・イネルスの相対存在量が第６の所定の参照値を超える場合、ＡＲＴ手法の結果、対象が妊娠する可能性が高いことを見出した。この第６の所定の参照値は、好ましくは６０％などの５０～７０％で選択された。６０％を第６の参照値として採用した場合、３８人の女性がこの基準を満たし、そのうち１９人がＡＲＴ手法の結果妊娠した（表５）。これは５０％の成功率であり、すべての群の成功率より高い（表５）。

【0049】

それ故に、生殖補助医療（ＡＲＴ）手法の結果が妊娠とならない可能性を予測する方法であって、ＡＲＴ手法の前または最中に採取した雌の哺乳類対象由来の試料を、ラクトバシラス・クリスパタスの相対存在量について分析し、ラクトバシラス・クリスパタスの相対存在量が、第４の所定の参照値を超えている場合、対象がＡＲＴ手法の結果妊娠していない可能性が高い方法が記載されている。

【0050】

生殖補助医療（ＡＲＴ）手法の結果妊娠がもたらされる可能性を予測する方法であって、ＡＲＴ手法の前または最中に採取した雌の哺乳類対象由来の試料を、ラクトバシラス・クリスパタスの相対存在量について分析し、対象がＡＲＴ手法の結果妊娠する可能性が高い、ラクトバシラス・クリスパタスの相対存在量が、第５の所定の参照値未満である場合、も記載されている。

【0051】

生殖補助医療（ＡＲＴ）手法の結果妊娠がもたらされる可能性を予測する方法であって、ＡＲＴ手法の前または最中に採取した雌の哺乳類対象由来の試料を、ラクトバシラス・イネルスの相対存在量について分析し、ラクトバシラス・イネルスの相対存在量が、第６の所定の参照値未満である場合、対象がＡＲＴ手法の結果妊娠する可能性が高い方法も記載されている。

【0052】

本明細書には、生殖補助医療（ＡＲＴ）手法の結果妊娠がもたらされる可能性を予測する方法であって、ＡＲＴ手法の前または最中に採取した雌の哺乳類対象由来の試料を、について分析したラクトバシラス・クリスパタスおよびラクトバシラス・イネルスの存在について分析し、Ｌ．クリスパタスの相対量［ＬＣ］およびＬ．イネルスの相対量［ＬＩ］を決定し、妊娠の可能性が増加しているｉｆ［ＬＣ］が、第７の所定の参照値未満であり、
ａ．［ＬＣ｝＜（ａ＊［ＬＩ］）＋ｂおよび
ｂ．［ＬＣ｝＞（ｃ＊［ＬＩ］）＋ｄである
（式中、ａは－０．５５～－０．７０の値であり、ｂは０．８０～０．９０の値であり、ｃは－０．５０～－０．６５の値であり、ｄは０．３～０．４５の値である。）
方法も記載されている。

【0053】

好ましい実施形態では、ａ＝－０．６２、ｂ＝０．８５、ｃ＝－０．５８およびｄ＝０．３８である。この場合、本明細書に記載の１９２人の女性のうち７７人が基準を満たしていることが見られ、そのうち３８人（４９％）がＡＲＴ手法の結果妊娠した（表５）。これらの結果を図１に図示する。

【0054】

特に良好な結果が、第４、第５、第６および第７の所定の参照値が互いに独立に５０％～７０％、さらにより特に６０％で選択される場合に得られた。

【表5】

【実施例】

【0055】

実施例１：調査集団
生殖年齢の低受精率の女性の膣のマイクロバイオームのこの有望な研究は、オランダ国の８つのＩＶＦセンターで実施した。参加センターは、Ｅｒａｓｍｕｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ）、Ｒａｄｂｏｕｄ ＵＭＣ（Ｎｉｊｍｅｇｅｎ）、ＵＭＣ Ｕｔｒｅｃｈｔ（Ｕｔｒｅｃｈｔ）、ＶＵ ＭＣ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）、Ｉｓａｌａ ｋｌｉｎｉｅｋ（Ｚｗｏｌｌｅ）、Ｓｉｎｔ Ｅｌｉｓａｂｅｔｈ Ｚｉｅｋｅｎｈｕｉｓ（Ｔｉｌｂｕｒｇ）、ＭＣ Ｋｉｎｄｅｒｗｅｎｓ（Ｌｅｉｄｅｒｄｏｒｐ）、ＭＵＭＣ＋（Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ）である。調査は、ほぼ１年間（２０１５年１月１日～２０１６年３月３１日）にわたって行われた。プロトコルは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｅｒａｓｍｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅによって承認された。同意書はすべての参加者から得られた。

【0056】

生殖診療所の外来診察室を訪れ、最初のＩＶＦ（ＩＣＳＩあり、またはなし）手法を２ヶ月以内に受けることが予想された女性に、この調査への参加を提案した。満たすべき基準は、男性パートナーを有する２０～４４歳の女性であった。癌または他の理由での緊急ＩＶＦの指示がある女性、子宮内膜症ＡＦＳ ＩＩＩ／ＩＶの女性、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アナログで予め処置された女性、ＩＶＦまたはＩＶＦ－ＩＣＳＩの開始３ヶ月前にホルモンの避妊具を使用した女性（周期の調節のための経口避妊薬の３週間の使用を除く）、医療病歴において以前に妊娠または流産した女性は調査から除外した。

【0057】

この調査では、３０１人の女性が最初に登録した。２１人の患者が除外基準に基づいて除外され、別の８６人が個人のまたは未知の理由で調査に残った。２つの試料がエラー処理によりなくなり、それ故に、１９２人の個体から試料を用いて、調査を最終的に行った。

【0058】

実施例２：材料
参加者は、ＩＶＦまたはＩＶＦ－ＩＣＳＩ手法の開始前にそれら自身の膣のスワブを得た。患者にとって最小限の侵襲であり、それ故に毎日実施するのに適していることから、自己収集方法が選択された。膣試料をＦＬＯＱｓｗａｂｓ（商標）（Ｃｏｐａｎ Ｉｔａｌｉａ Ｓ．ｐ．Ａ．，Ｉｔａｌｙ）によって採取し、参加者はスワブを３～５ｃｍ膣に挿入し、その後、膣壁に沿って１０～１５秒間こするように指示された。この手順の後、輸送減少液体（ＲＴＦ）緩衝液（ＩＳ－Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＩＳ－Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手）で満たしたエッペンドルフチューブ内にスワブをすぐに入れた。分析まで、試料を－２０～－８０℃で、フリーザー内で保存した。

【0059】

尿試料を、１００ｍＬの滅菌尿回収デバイスにて回収した。１０ｍｌの試料を１０分間１５００ＲＣＦで遠心した。上清をデカンテーションし、ペレットを３ｍｌの尿に再懸濁した。さらなる処理のために、再懸濁した試料を－２０℃で保存した。

【0060】

試料を８つの診療所からＩＳ－Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓの微生物学研究室へドライアイス上で輸送し、解析を実施した。

【0061】

実施例３：ＤＮＡ単離
Ｃｈｅｍａｇｅｎ（Ｃｈｅｍａｇｅｎ，Ｂａｅｓｗｅｉｌｅｒ，ドイツ）自動ＤＮＡ抽出機で、製造者の説明書に従って口腔内スワブ抽出キットを用いて、膣のスワブからのＤＮＡ抽出を実施した。最初に、スワブを解凍し、ボルテックスした。２００μｌの試料を２００μｌのＣｈｅｍａｇｅｎ溶解バッファーおよび１０μｌプロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）と、５００ｒｐｍで振盪しながら５６℃でインキュベートした。プロトコル口腔内スワブプレフィリングを用いて、ＤＮＡを抽出した。１００μｌのＣｈｅｍａｇｅｎ Ｅｌｕｔｉｏｎ緩衝液中でＤＮＡを溶出した。

【0062】

濃縮尿懸濁液から、Ｃｈｅｍａｇｅｎ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ、Ｂａｅｓｗｅｉｌｅｒ、ドイツ）自動化ＤＮＡ抽出機で、製造者の説明書に従って口腔内スワブ抽出キットを用いて、ＤＮＡを抽出した。要すれば、尿試料を解凍し、ボルテックスした。２００μＬの試料を、２００μＬのＣｈｅｍａｇｅｎ溶解緩衝液および１０μＬプロテイナーゼＫと、５００ｒｐｍで振盪しながら５６℃でインキュベートした。１００μＬのＣｈｅｍａｇｅｎ Ｅｌｕｔｉｏｎ緩衝液中でＤＮＡを溶出した。

【0063】

実施例４：空間（ＩＳ）プロファイリング
遺伝子間の空間（ＩＳ）領域の増幅を、ＩＳ－ｐｒｏアッセイで、製造者（ＩＳ－Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって提供されたプロトコルに従って実施した。ＩＳ－ｐｒｏは、１６Ｓ～２３ＳｒＲＮＡ遺伝子ＩＳ領域の長さの検出およびカテゴリー化に基づく真正細菌技術である。このＩＳ領域の長さは、微生物種それぞれに特異的である。門特異的な蛍光標識ＰＣＲプライマーが分類学上の分類に使用される。

【0064】

簡潔に言うと、手順は２つの別個の標準ＰＣＲからなり、第１のＰＣＲ混合物は、異なる細菌群を標的とする２つの異なる蛍光標識したフォワードプライマーと、それらの群のあらゆる範囲を取り上げる３つのリバースプライマーとを含有する。第１のフォワードプライマーは、ファーミキューテス門、アクチノバクテリア門、フクソバクテリウム門、およびベルコミクロビア門（ＦＡＦＶ）に特異的であり、第２の標識したフォワードプライマーは、バクテロイデス門に特異的である。７つリバースプライマーと組み合わせた標識したフォワードプライマーを用いる別々のＰＣＲは、プロテオバクテリア門に特異的である［Ｂｕｄｄｉｎｇ，Ｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．ＭｉｃｒｏｂｉｏＬ．（２０１６）５４：９３４－９４３］。

【0065】

ＧｅｎｅＡｍｐ９７００ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって増幅が行われた。ＰＣＲ後、５μＬのＰＣＲ産物を、２０μＬのホルムアミドおよび０．２μＬのカスタムサイズマーカー（ＩＳ－Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と混合した。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３５００ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＤＮＡ断片分析を実施した。データをＩＳ－ｐｒｏ専用ソフトウェア・スイート（ＩＳ－Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で分析し、結果を微生物プロフィールとして示した。自動化した種ｃａｌｌｉｎｇｏｆＩＳ－ｐｒｏピークｗａｓｄｏｎｅｗｉｔｈ専用ＩＳ－ｐｒｏソフトウェア・スイート（ＩＳ－Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で行い、ピークを、＞５００微生物種のＩＳ－プロフィール情報を含むデータベースにつなげた。＜１２８相対蛍光単位（ＲＦＵ）のピークは、バックグランドノイズとみなし、さらなる分析から破棄した。ＤＮＡ単離からデータ分析までの全手順を５時間以内に実施した。

【0066】

実施例５：転帰測定
第１の胚移植（ＥＴ）後の妊娠転帰を終点として使用した。妊娠継続は、妊娠の７～９週での超音波の使用によって確立した心臓活動を有する胎児と定義した。

【0067】

実施例６：ガルドネラ・バギナリスＩＳＴ１の決定
ガルドネラ・バギナリスＩＳＴ１を、ＩＳ－ｐｒｏ技術による膣の微生物集団分析によって同定した。Ｇ．バギナリスＩＳＴ１は、４２８～４３０ヌクレオチドの長さの特異的なＩＳ－断片の存在によって検出された。

【0068】

実施例７：マイクロバイオームの決定
マイクロバイオーム分析を、前述したＩＳ－ｐｒｏ技術を用いて実施した［Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｂｒｏａｄ－Ｒａｎｇｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓａｍｐｌｅｓ．Ｂｕｄｄｉｎｇ ＡＥ、Ｈｏｏｇｅｗｅｒｆ Ｍ、Ｖａｎｄｅｎｂｒｏｕｃｋｅ－Ｇｒａｕｌｓ ＣＭ，Ｓａｖｅｌｋｏｕｌ ＰＨ．Ｊ Ｃｌｉｎ ＭｉｃｒｏｂｉｏＬ．２０１６年４月；５４（４）：９３４－４３．ＤＯＩ：１０．１１２８／ＪＣＭ．０２８８６－１５．Ｅｐｕｂ２０１６年１月１３日；ＩＳ－ｐｒｏ：ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｕｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ．，Ｂｕｄｄｉｎｇ ＡＥ，Ｇｒａｓｍａｎ ＭＥ，Ｌｉｎ Ｆ，Ｂｏｇａａｒｄｓ ＪＡ、Ｓｏｅｌｔａｎ－Ｋａｅｒｓｅｎｈｏｕｔ ＤＪ，Ｖａｎｄｅｎｂｒｏｕｃｋｅ－Ｇｒａｕｌｓ ＣＭ，ｖａｎ Ｂｏｄｅｇｒａｖｅｎ ＡＡ，Ｓａｖｅｌｋｏｕｌ ＰＨ．］

【表6】

【表7】

【0069】

要約すると、本明細書にて提示したデータは、以下の結論または条項をもたらす。

【0070】

生殖補助医療（ＡＲＴ）手法の結果が妊娠とならない可能性を予測する方法であって、
ＡＲＴ手法の前または最中に採取した雌の哺乳類対象由来の試料を以下のパラメータ：
ガルドネラ・バギナリスの存在、
ラクトバシラス種の相対存在量、
ラクトバシラス・イエンセンの相対存在量、
プロテオバクテリアの相対存在量、
の少なくとも１つについて分析し、
試料がガルドネラ・バギナリスを含む場合、または
ラクトバシラス種の相対存在量が、第１の所定の参照値未満である場合、または
ラクトバシラス・イエンセンの相対存在量が、第２の所定の参照値を超えている場合、または
プロテオバクテリアの相対存在量が、第３の所定の参照値を超えている場合、対象がＡＲＴ手法の結果、妊娠していない可能性が高い方法。

【0071】

本明細書に記載の方法において、試料中のガルドネラ・バギナリスの存在を決定し、試料がガルドネラ・バギナリス、好ましくはガルドネラ・バギナリスＩＳＴ１を含む場合、対象がＡＲＴ手法の結果、妊娠していない可能性が高い。

【0072】

本明細書に記載の方法において、以下のパラメータ：
ラクトバシラス種の相対存在量、
ラクトバシラス・イエンセンの相対存在量および
プロテオバクテリアの相対存在量、
について試料を分析し、
ラクトバシラス種の相対存在量が、第１の所定の参照値未満である場合、および／またはラクトバシラス・イエンセンの相対存在量が、第２の所定の参照値を超えている場合、および／またはプロテオバクテリアの存在量が、第３の所定の参照値を超えている場合、対象がＡＲＴ手法の結果、妊娠していない可能性が高い。

【0073】

本明細書に記載の方法において、第１の所定の参照値は１５％～２５％であり、第２の所定の参照値は２５％～４５％であり、第３の所定の参照値は１８％～３８％である。

【0074】

本明細書に記載の方法において、第１の所定の参照値は２０％であり、第２の所定の参照値は３５％であり、第３の所定の参照値は２８％である。

【0075】

本明細書に記載の方法において、ガルドネラ・バギナリスの存在は定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって決定される。

【0076】

本明細書に記載の方法において、ＰＣＲがフォワードプライマーＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＡＷＧおよびリバースプライマーＡＧＧＣＡＴＣＣＲＣＣＡＴＧＣＧＣＣＣＴを用いて実施され、４２８～４３０ヌクレオチドの長さの増幅産物が検出され、ここで、ＷはＡまたはＴを示し、ＲはＡまたはＧを示す。

【0077】

生殖補助医療（ＡＲＴ）手法の結果が妊娠とならない可能性を予測する方法であって、ＡＲＴ手法の前または最中に採取した雌の哺乳類対象由来の試料中のラクトバシラス・クリスパタスの相対量を決定し、ラクトバシラス・クリスパタスの相対存在量が、第４の所定の参照値を超えている場合、ＡＲＴの結果妊娠していない可能性が増加している方法。

【0078】

生殖補助医療（ＡＲＴ）手法の結果妊娠がもたらされる可能性を予測する方法であって、ＡＲＴ手法の前または最中に採取した雌の哺乳類対象由来の試料中のラクトバシラス・クリスパタスの相対量を決定し、ラクトバシラス・クリスパタスの相対存在量が、第５の所定の参照値未満である場合、ＡＲＴの結果として妊娠する可能性が増加している方法。

【0079】

生殖補助医療（ＡＲＴ）手法の結果妊娠がもたらされる可能性を予測する方法であって、ＡＲＴ手法の前または最中に採取した雌の哺乳類対象由来の試料中のラクトバシラス・イネルスの相対量を決定し、ラクトバシラス・イネルスの相対存在量が、第６の所定の参照値を超えている場合、ＡＲＴの結果として妊娠する可能性が増加している方法。

【0080】

生殖補助医療（ＡＲＴ）手法の結果妊娠がもたらされる可能性を予測する方法であって、ＡＲＴ手法の前または最中に採取した雌の哺乳類対象由来の試料中のラクトバシラス・クリスパタスの相対量［ＬＣ］（０～１の割合で表される）およびラクトバシラス・イネルスの相対量［ＬＩ］（０～１の割合で表される）を決定し、
［ＬＣ］が、第７の所定の参照値未満であり、かつ
［ＬＣ}＜（ａ＊［ＬＩ］）＋ｂ、かつ
［ＬＣ}＞（ｃ＊［ＬＩ］）＋ｄ
（式中、ａは－０．５５～－０．７０の値であり、ｂは０．８～０．９のの値であり、ｃは－０．５０～－０．６５の値であり、ｄは０．３０～０．４５の値である。）
である場合、妊娠する可能性が増加している方法。

【0081】

本明細書に記載の方法において、ａ＝－０．６２、ｂ＝０．８５、ｃ＝－０．５８およびｄ＝０．３８である。

【0082】

本明細書に記載の方法において、第４、第５、第６または第７の所定の参照値は互いに独立に０．５～０．７である。

【0083】

本明細書に記載の方法において、第４の、第５、第６または第７の所定の参照値は０．６である。

【0084】

本明細書に記載の方法を行うキットは、ガルドネラ・バギナリスＤＮＡの増幅産物の検出のための、フォワードプライマーＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＡＷＧと、リバースプライマーＡＧＧＣＡＴＣＣＲＣＣＡＴＧＣＧＣＣＣＴと、を含み、ガルドネラ・バギナリスＤＮＡ増幅産物の長さは４２８～４３０ヌクレオチドであり、ＷはＡまたはＴを示し、ＲはＡまたはＧを示す。

【0085】

本明細書に記載の方法において、試料は膣のスワブであるか、かつ／または哺乳類対象はヒトである。

【0086】

本明細書に記載の方法において、ＡＲＴ手法は、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）などの体外受精（ＩＶＦ）手法である。

【図1】

【配列表】

0007445980000001.app