特許 7446527 コード核酸の治療可能性についての効力アッセイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-02-29

(45)【発行日】2024-03-08

(54)【発明の名称】コード核酸の治療可能性についての効力アッセイ

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20240301BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240301BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240301BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20240301BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20240301BHJP

   C12N 15/87 20060101ALN20240301BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02 ZNA

A61K48/00

A61P37/02

G01N33/68

G01N27/62 V

C12N15/87 Z

【請求項の数】 20

(21)【出願番号】P 2023534012

(86)(22)【出願日】2022-09-01

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-12-12

(86)【国際出願番号】 EP2022074395

(87)【国際公開番号】W WO2023031367

(87)【国際公開日】2023-03-09

【審査請求日】2023-06-02

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2021/074304

(32)【優先日】2021-09-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】509146023

【氏名又は名称】バイオエヌテック エスエー

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＮＴＥＣＨ ＳＥ

【住所又は居所原語表記】Ａｎ ｄｅｒ Ｇｏｌｄｇｒｕｂｅ １２ ５５１３１ Ｍａｉｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100110928

【弁理士】

【氏名又は名称】速水 進治

(72)【発明者】

【氏名】ハース， ハインリッヒ

(72)【発明者】

【氏名】シューマッハー， イェンス

(72)【発明者】

【氏名】テンザー， シュテファン

【審査官】松田 芳子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／０１１７７３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表２０２０－５１６６５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】Mol. Ther.，2015年，vol.23, no.9，p.1456-1464

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする同じＲＮＡの異なるバッチを分析するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）前記ＲＮＡを提供する工程；
（ｉｉ）インビトロで細胞に前記ＲＮＡをトランスフェクトする工程；
（ｉｉｉ）生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列の発現を可能にする工程；
（ｉｖ）生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列またはその断片の量を決定する工程；および
（ｖ）生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列またはその断片の量を、生物系において生物学的活性を誘導する前記ＲＮＡの効力の指標として使用する工程
を含む方法。

【請求項2】

前記細胞が、動物細胞株の細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列の前記断片が、前記発現されるアミノ酸配列に特異的である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列の前記断片が、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列に含まれない、請求項１または２に記載の方法。

【請求項5】

生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列またはその断片の量が、質量分析を用いて決定される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項6】

生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列またはその断片の量が、前記細胞によって発現される１つ以上のアミノ酸配列を定量化のための参照として使用して決定され、前記細胞によって発現される前記１つ以上のアミノ酸配列がハウスキーピングタンパク質の１つ以上のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項7】

生物系において生物学的活性を誘導する前記ＲＮＡの効力が、前記ＲＮＡの治療効力を含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項8】

生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列またはその断片の量が所定のカットオフを上回る場合、前記ＲＮＡが生物系において生物学的活性を誘導するのに十分な効力を有し、または生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列またはその断片の量が所定のカットオフ未満である場合、前記ＲＮＡが生物系において生物学的活性を誘導するのに十分な効力を有さない、請求項１または２に記載の方法。

【請求項9】

前記所定のカットオフを決定するために使用される前記ＲＮＡと前記分析されるＲＮＡとが同じ化学組成を有する、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

生物系において生物学的活性を誘導するのに十分な効力を有するＲＮＡバッチが治療に使用されるかもしくは使用されることになっており、および／または生物系において生物学的活性を誘導するのに十分な効力を有さないＲＮＡバッチが治療に使用されないかもしくは使用されないことになっている、請求項１または２に記載の方法。

【請求項11】

生物系において生物学的活性を誘導する前記ＲＮＡの効力が、前記ＲＮＡの品質を反映する、請求項１または２に記載の方法。

【請求項12】

前記ＲＮＡの品質が、前記ＲＮＡが有害な条件に曝露されたかどうかおよび／またはどの程度曝露されたかを反映する、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

生物系において生物学的活性を誘導する前記ＲＮＡの効力が、前記ＲＮＡの完全性および／または前記ＲＮＡのキャッピングを反映する、請求項１または２に記載の方法。

【請求項14】

前記ＲＮＡの品質および／または量が生物系において生物学的活性を誘導するのに十分であるかどうかを分析するためのものである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項15】

生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列またはその断片の量が、前記ＲＮＡの品質および／または量が生物系において生物学的活性を誘導するのに十分であるかどうかを示す、請求項１または２に記載の方法。

【請求項16】

前記生物学的活性が、疾患関連系において特異的応答を誘発する能力を含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項17】

前記特異的応答が免疫応答を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記ＲＮＡが粒子として製剤化される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項19】

生物学的活性を有する前記ペプチドまたはポリペプチドがワクチンである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項20】

前記ワクチンがＴ細胞ワクチンである、請求項１９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の治療可能性を測定、決定、同定、定量化、確認および／または検証するための効力アッセイを提供する。効力アッセイは、１つ以上の抗原または１つ以上のエピトープを含む薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドを含む、様々な種類のペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）を用いて実施され得る。治療可能性を有する核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）は、下流の臨床用途、例えば、対象において、免疫応答が治療的または部分的もしくは完全に保護的であり得る、核酸によってコードされる１つ以上の抗原または１つ以上のエピトープに対する免疫応答を誘発するために有用であり得る。したがって、治療可能性を有する核酸は、ワクチン接種に有用であり得る。

【背景技術】

【0002】

生物学的に活性なタンパク質をコードするそれらの周知の能力とは別に、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸は、それらを魅力的な治療薬にする他の注目すべき特性を有する。核酸に基づく治療薬は、製造が容易であり、比較的安価である。

【0003】

一般に、ＤＮＡはＲＮＡよりも安定であるが、抗ＤＮＡ抗体の誘導および導入遺伝子の宿主ゲノムへの組み込みなどのいくつかの潜在的な安全性リスクを有する。

【0004】

外来遺伝子情報を標的細胞に送達するためのＲＮＡの使用は、ＤＮＡの魅力的な代替物を提供する。ＲＮＡの利点には、一過性の発現および非形質転換特性が含まれる。ＲＮＡは発現のために核浸潤を必要とせず、さらに宿主ゲノムに組み込まれることができないため、腫瘍形成のリスクを排除する。

【0005】

効力試験は、製品の品質および製造管理に関連する製品属性を測定するために使用され、臨床試験の全段階中に使用される生成物の同一性、純度、強度（効力）および安定性を保証するために実施される。同様に、効力測定値は、規定された仕様または許容基準を満たす製品ロットのみが臨床調査の全ての段階中および市場承認後に投与されることを実証するために使用される。したがって、生物製剤の効力を定義することは、製品開発中およびその後の中心的存在である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

効力アッセイは、規定された生物学的効果を達成する生成物の能力を表すべき特定の基準の定量的尺度を含む。測定される基準は、生成物の意図される生物学的効果に密接に関連しているべきであり、理想的には、生成物の臨床目的に関連しているべきである。生成物の効力の測定は、臨床効果の測定と同じではない。むしろ、それは、特にＧＭＰの下で、生成物の品質を管理し、適切な出荷基準を提供するための手段である。通常、対象に投与されることになるありとあらゆる生成物について、別個の効力アッセイを開発しなければならない。急速に進化している核酸の世界では、潜在的な数百の異なる構築物があり、ほとんどの場合、検出に利用可能な抗体がないので、新しい生成物に容易に適合させることができる効力アッセイは非常に有益であろう。

【0007】

コード核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の治療可能性、特に、前記コード核酸を含む粒子製剤、例えば核酸製剤の治療可能性およびその関連する使用を測定、決定、同定、定量化、確認および／または検証するための効力アッセイを提供する必要がある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明によれば、インビトロで細胞系においてコードされた薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドを発現する核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の能力は、インビボでの治療可能性に関連することが観察された。この観察に基づいて、薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の治療可能性を測定、決定、同定、定量化、確認および／または検証するための迅速で、費用対効果が高く、信頼性があり、使用および解釈が容易な効力アッセイが提供される。本明細書で提供される効力アッセイは、新しい生成物に容易に適合させることができる。

【0009】

具体的には、核酸産物、例えばＲＮＡ－リポプレックス（ＲＮＡ－ＬＰＸ）またはＤＮＡ－ＬＰＸまたはＲＮＡ－脂質ナノ粒子（ＲＮＡ－ＬＮＰ）産物についてのＬＣ－ＭＳ効力アッセイが本明細書に記載されており、これは、生物学的活性、例えばＴ細胞の活性化に直結する産物特異的作用機構（ＭｏＡ）の重要な工程の試験に基づく。読み出し、すなわち送達された核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）のペプチドへの翻訳の測定値は、核酸産物、例えばＲＮＡ－ＬＰＸ、ＤＮＡ－ＬＰＸまたはＲＮＡ－ＬＮＰ製剤の産物品質を直接示し、安定性を示している。このアッセイは、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の取り込みおよびそれぞれのペプチド、例えば抗原への翻訳の成功をカバーする効力への洞察を可能にし、生物学的活性、例えばＴ細胞活性化を予測する。

【0010】

細胞の取り込みおよび翻訳を測定するために、動物細胞株由来の細胞、特に、レシピエントの細胞（すなわち、樹状細胞（ＤＣ）などの核酸産物を取り込むことになるレシピエントの標的細胞）と同じ機構を使用して核酸産物、例えばＲＮＡ－ＬＰＸ、ＤＮＡ－ＬＰＸまたはＲＮＡ－ＬＮＰを取り込み、任意で、バッチ出荷のためのＱＣ環境（ＧＭＰ ＱＣ環境など）での日常的な試験に適している細胞を使用することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｋ５６２、ＨｅｐＧ２、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＲＡＷ、およびＣ２Ｃ１２細胞からなる群より選択され得る。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞は、樹状細胞（ＤＣ）と同じ機構を使用し、バッチ出荷のためのＱＣ環境（ＧＭＰ ＱＣ環境など）での日常的試験に対するそれらの適合性に基づいて、これらの細胞が核酸産物、例えばＲＮＡ－ＬＰＸまたはＲＮＡ－ＬＮＰを取り込むことを考慮して選択した。翻訳時に、ＣＨＯ細胞は、同族Ｔ細胞に抗原エピトープを提示することができ、それらの刺激をもたらす。したがって、このアッセイは、製剤の生物学的機能を反映する。

【0011】

翻訳されたペプチドを定量化するために、核酸にコードされた（例えばＲＮＡにコードされた）配列のＣ末端に共通のユニークなＭＩＴＤ（ＭＨＣクラスＩ輸送ドメイン）ペプチドを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を使用して全細胞溶解物から定量化し得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、核酸にコードされた（例えばＲＮＡにコードされた）配列の別のペプチドも、発現されたペプチドの定量化に使用することができる。いくつかの実施形態では、別のペプチドは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して定量化することができる。いくつかの実施形態では、別のペプチドは、生物発光を生じるペプチドまたはポリペプチド（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはルシフェラーゼのような）などのレポータペプチドまたはポリペプチドであるか、あるいはレポータペプチドまたはポリペプチドを含む。

【0012】

様々な実施形態では、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の治療可能性についての効力アッセイが企図される。効力アッセイは、対象への投与前に臨床核酸に基づくそのようなＲＮＡベースの治療製品を迅速かつ確実に検証するために使用することができるので、臨床的に重要である。実際に、本明細書で企図される治療可能性についての効力アッセイのための枠組みは、ＲＮＡ産物などの治療用核酸のための「ゴールドスタンダード」検証アッセイになる可能性が高い。

【0013】

いくつかの態様では、本発明は、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする核酸を分析するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）核酸を提供する工程；
（ｉｉ）インビトロで細胞に核酸をトランスフェクトする工程；
（ｉｉｉ）生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列の発現を可能にする工程；および
（ｉｖ）生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量を決定する工程
を含む方法を提供する。

【0014】

いくつかの実施形態では、本方法は、以下の工程：
（ｖ）生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量を、生物系において生物学的活性を誘導する核酸の効力の指標として使用する工程
をさらに含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡ（例えば１つ以上のＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えば１つ以上のＲＮＡ）、またはＤＮＡとＲＮＡとの混合物（例えば１つ以上のＤＮＡおよび１つ以上のＲＮＡ）である。

【0016】

いくつかの態様では、本発明は、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを分析するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）ＤＮＡを提供する工程；
（ｉｉ）インビトロで細胞にＤＮＡをトランスフェクトする工程；
（ｉｉｉ）生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列の発現を可能にする工程；および
（ｉｖ）生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量を決定する工程
を含む方法を提供する。

【0017】

いくつかの実施形態では、本方法は、以下の工程：
（ｖ）生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量を、生物系において生物学的活性を誘導するＤＮＡの効力の指標として使用する工程
をさらに含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、ベクター、例えば生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むベクターの形態で存在する。いくつかの実施形態では、ベクターはＤＮＡベクターである。

【0019】

いくつかの態様では、本発明は、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をそれぞれコードするＤＮＡとＲＮＡとの混合物を分析するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）ＤＮＡとＲＮＡとの混合物を提供する工程；
（ｉｉ）ＤＮＡとＲＮＡとの混合物をインビトロで細胞にトランスフェクトする工程；
（ｉｉｉ）生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列の発現を可能にする工程；および
（ｉｖ）生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量を決定する工程
を含む方法を提供する。

【0020】

いくつかの実施形態では、本方法は、以下の工程：
（ｖ）生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量を、生物系において生物学的活性を誘導するＤＮＡとＲＮＡとの混合物の効力の指標として使用する工程
をさらに含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、ベクター、例えば生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むベクターの形態で存在する。いくつかの実施形態では、ベクターはＤＮＡベクターである。

【0022】

いくつかの態様では、本発明は、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡを分析するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）ＲＮＡを提供する工程；
（ｉｉ）インビトロで細胞にＲＮＡをトランスフェクトする工程；
（ｉｉｉ）生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列の発現を可能にする工程；および
（ｉｖ）生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量を決定する工程
を含む方法を提供する。

【0023】

いくつかの実施形態では、本方法は、以下の工程：
（ｖ）生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量を、生物系において生物学的活性を誘導するＲＮＡの効力の指標として使用する工程
をさらに含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、細胞は、生物系の核酸取り込み機構（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ取り込み機構など）を模倣する。

【0025】

いくつかの実施形態では、生物系はヒト患者に存在する。

【0026】

いくつかの実施形態では、生物系は抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞を含む。

【0027】

いくつかの実施形態では、樹状細胞は未成熟樹状細胞を含む。

【0028】

いくつかの実施形態では、細胞は、マクロピノサイトーシス媒介ＲＮＡ取り込み機構を特徴とする。これらの実施形態では、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）はリポプレックス粒子として製剤化されることが好ましい。

【0029】

いくつかの実施形態では、細胞は、エンドソーム媒介ＲＮＡ取り込み機構を特徴とする。これらの実施形態では、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）は脂質ナノ粒子として製剤化されることが好ましい。

【0030】

いくつかの実施形態では、細胞は、動物細胞株由来の細胞、特に、レシピエントの細胞（すなわち、樹状細胞（ＤＣ）などの核酸産物を取り込むことになるレシピエントの標的細胞）と同じ機構を使用して核酸産物、例えばＲＮＡ－ＬＰＸ、ＤＮＡ－ＬＰＸまたはＲＮＡ－ＬＮＰを取り込み、ＱＣ環境（ＧＭＰ ＱＣ環境など）での日常的な試験に適している細胞である。

【0031】

いくつかの実施形態では、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｋ５６２、ＨｅｐＧ２、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＲＡＷ、およびＣ２Ｃ１２細胞から、例えばＫ５６２、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＲＡＷ、およびＣ２Ｃ１２細胞から選択される。

【0032】

いくつかの実施形態では、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列の断片は、発現されるアミノ酸配列に特異的である。

【0033】

いくつかの実施形態では、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列の断片は、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列に含まれない。

【0034】

いくつかの実施形態では、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列の断片は、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列またはその断片を含む。

【0035】

いくつかの実施形態では、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、ＭＨＣ分子、好ましくはＭＨＣクラスＩ分子の膜貫通および細胞質ドメインに対応するアミノ酸配列を含む。

【0036】

いくつかの実施形態では、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0037】

いくつかの実施形態では、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列の断片は、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列またはその断片を含む。

【0038】

いくつかの実施形態では、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、ヘルパーエピトープ、好ましくは破傷風トキソイド由来のヘルパーエピトープを含む。

【0039】

いくつかの実施形態では、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0040】

いくつかの実施形態では、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列の断片は、生物発光を生じるアミノ酸配列を含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、生物発光を生じるアミノ酸配列は、蛍光を生じる。

【0042】

いくつかでは、生物発光を生じるアミノ酸配列は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、それらの変異体（例えば、増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、スーパーフォルダＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）およびルシフェラーゼ）からなる群より選択される。

【0043】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量を決定する前に細胞を溶解する工程を含む。

【0044】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量を決定する前に細胞溶解物を処理する工程をさらに含む。

【0045】

いくつかの実施形態では、細胞溶解物の処理は、変性、還元、プロテアーゼ消化（例えば、トリプシン、Ｇｌｕ－Ｃ、ＬｙｓＮ、Ｌｙｓ－Ｃ、Ａｓｐ－Ｎキモトリプシン、またはこれらのプロテアーゼのいずれか２つ以上の混合物を用いた消化）、アルキル化、乾燥、再構成および脱塩から、例えばトリプシン消化、アルキル化および脱塩から選択される１つ以上を含む。

【0046】

いくつかの実施形態では、生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量は、質量分析を用いて決定される。

【0047】

いくつかの実施形態では、生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量は、液体クロマトグラフィ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を使用して決定される。

【0048】

いくつかの実施形態では、生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量は、標的ＬＣ－ＭＳを用いて決定される。

【0049】

いくつかの実施形態では、生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量は、細胞によって発現される１つ以上のアミノ酸配列を定量化のための参照として使用して決定される。

【0050】

いくつかの実施形態では、細胞によって発現される１つ以上のアミノ酸配列は、ハウスキーピングタンパク質の１つ以上のアミノ酸配列を含む。

【0051】

いくつかの実施形態では、生物系において生物学的活性を誘導する核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の効力は、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の治療効力を含む。

【0052】

いくつかの実施形態では、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）は、生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量が所定のカットオフを上回る場合、生物系において生物学的活性を誘導するのに十分な効力、例えば治療効力を有する。

【0053】

いくつかの実施形態では、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）は、生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量が所定のカットオフ未満である場合、生物系において生物学的活性を誘導するのに十分な効力、例えば治療効力を有さない。

【0054】

いくつかの実施形態では、所定のカットオフは、生物系において生物学的活性を誘導するための許容される効力、例えば治療効力を有することが公知の核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）を使用して決定される。

【0055】

いくつかの実施形態では、所定のカットオフを決定するために使用される核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）と分析される核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）とは、同じ化学組成を有する。

【0056】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、同じ核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の異なるバッチを分析するためのものである。

【0057】

いくつかの実施形態では、生物系において生物学的活性を誘導するのに十分な効力、例えば治療効力を有する核酸（ＲＮＡおよび／もしくはＤＮＡなど）または核酸バッチ（ＲＮＡおよび／もしくはＤＮＡバッチなど）は、治療に使用されるかまたは使用されることになっており、ならびに／または生物系において生物学的活性を誘導するのに十分な効力、例えば治療効力を有さない核酸（ＲＮＡおよび／もしくはＤＮＡなど）または核酸バッチ（ＲＮＡおよび／もしくはＤＮＡバッチなど）は、治療に使用されないかまたは使用されないことになっている。

【0058】

いくつかの実施形態では、生物系において生物学的活性を誘導する核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の効力、例えば核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の治療効力は、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の治療品質などの品質を反映する。

【0059】

いくつかの実施形態では、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の品質は、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）が有害な条件に曝露されたかどうかおよび／またはどの程度曝露されたかを反映する。

【0060】

いくつかの実施形態では、有害な条件は熱を含む。

【0061】

無細胞系（網状赤血球溶解物など）の代わりに生きている細胞系を使用することは、本明細書で提供される効力アッセイが、生物系において生物学的活性を誘導する核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の効力（核酸の治療効力など）が核酸（またはＲＮＡ－ＬＰＸなどの核酸を含む製剤／組成物）の１つ以上のパラメータを反映するかどうかを示すことができるという利点を提供し得るが、無細胞系に基づく効力アッセイはそのような指標を提供することができない。

【0062】

したがって、いくつかの実施形態では、生物系において生物学的活性を誘導する核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の効力、例えば核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の治療効力は、粒子パラメータ、製剤／組成物パラメータ、ならびに核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）パラメータからなる群より選択される１つ以上のパラメータを反映する。

【0063】

いくつかの実施形態では、粒子パラメータは、サイズ、表面電荷、脂質の質（例えば分解）、粒子構造（例えばラメラ性）、ならびに細胞内核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の放出、Ｎ／Ｐ比、遊離核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の濃度、ならびにアクセス可能な核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の濃度を含む。

【0064】

いくつかの実施形態では、製剤／組成物パラメータは、重量オスモル濃度、ｐＨ、核酸以外の製剤／組成物成分の品質（例えば緩衝液成分の品質）、およびエンドトキシンの濃度を含む。

【0065】

いくつかの実施形態では、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）パラメータは、濃度、配列の正確さ（例えばフレームシフトまたは早期停止）、完全性、およびエンドトキシンの濃度を含む。

【0066】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡパラメータは、ＲＮＡ濃度、配列の正確さ（例えばフレームシフトまたは早期停止）、ＲＮＡの完全性、エンドトキシンの濃度、キャッピング、ポリＡ配列、ｄｓＲＮＡの濃度、ならびにＵＴＲ（５’および／または３’）を含む。特に、これに関して、本明細書で提供される効力アッセイは、生物系において生物学的活性を誘導するＲＮＡの効力（ＲＮＡの治療効力など）がキャッピングを反映するかどうかを示すことができるが（キャップされたＲＮＡのみがコードされたペプチドまたはポリペプチドに翻訳されるため）、無細胞系に基づく効力アッセイはそのような指標を提供することができない（そのような無細胞系では、キャップされていないＲＮＡもコードされたペプチドに翻訳されるため）ことに留意されたい。

【0067】

いくつかの実施形態では、生物系において生物学的活性を誘導する核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の効力、例えば核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の治療効力は、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の完全性を反映する。

【0068】

いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡであり、生物系において生物学的活性を誘導するＲＮＡの効力、例えばＲＮＡの治療効力は、ＲＮＡのキャッピングを反映する。

【0069】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、生物系において生物学的活性を誘導する核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の効力を分析するためのものである。

【0070】

いくつかの実施形態では、生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量は、生物系において生物学的活性を誘導する核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の効力を示す。

【0071】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の品質および／または量が生物系において生物学的活性を誘導するのに十分であるかどうかを分析するためのものである。

【0072】

いくつかの実施形態では、生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量は、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の品質および／または量が生物系において生物学的活性を誘導するのに十分であるかどうかを示す。

【0073】

いくつかの実施形態では、生物学的活性は、疾患関連系において特異的応答を誘発する能力を含む。

【0074】

いくつかの実施形態では、特異的応答は、免疫応答を含むか、または免疫応答である。

【0075】

いくつかの実施形態では、免疫応答はＴ細胞応答を含む。

【0076】

いくつかの実施形態では、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドは、ワクチン（例えば抗原、エピトープ）、補充療法のためのタンパク質、抗体、抗体様分子およびサイトカインからなる群より選択される。

【0077】

いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡである。

【0078】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは一本鎖ＲＮＡである。

【0079】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡはｍＲＮＡである。

【0080】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ＲＮＡのインビトロ転写によって生成される。

【0081】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは５’キャップ構造を含む。

【0082】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは修飾リボヌクレオチドを含まない。

【0083】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾リボヌクレオチドは修飾ウリジンを含む。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはＮ１－メチル－プソイドウリジンを含む。

【0084】

いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡである。

【0085】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡはベクターの形態で存在する。

【0086】

いくつかの実施形態では、ベクターは、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む。

【0087】

いくつかの実施形態では、ベクターはＤＮＡベクターである。

【0088】

いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡとＤＮＡとの混合物である。

【0089】

いくつかの実施形態では、混合物中のＲＮＡは一本鎖ＲＮＡである。

【0090】

いくつかの実施形態では、混合物中のＲＮＡはｍＲＮＡである。

【0091】

いくつかの実施形態では、混合物中のＲＮＡは、ＲＮＡのインビトロ転写によって生成される。

【0092】

いくつかの実施形態では、混合物中のＲＮＡは５’キャップ構造を含む。

【0093】

いくつかの実施形態では、混合物中のＲＮＡは修飾リボヌクレオチドを含まない。

【0094】

いくつかの実施形態では、混合物中のＲＮＡは修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾リボヌクレオチドは修飾ウリジンを含む。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはＮ１－メチル－プソイドウリジンを含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、混合物中のＤＮＡはベクターの形態で存在する。

【0096】

いくつかの実施形態では、混合物中のベクターは、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む。

【0097】

いくつかの実施形態では、混合物中のベクターはＤＮＡベクターである。

【0098】

いくつかの実施形態では、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）は、送達ビヒクルと共に製剤化される。

【0099】

いくつかの実施形態では、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）は、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）を複合体化する１つ以上の化合物と共に製剤化される。

【0100】

いくつかの実施形態では、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）は、粒子として製剤化される。

【0101】

いくつかの実施形態では、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）は、リポプレックス粒子として製剤化される。これらの実施形態では、細胞は、マクロピノサイトーシス媒介ＲＮＡ取り込み機構を特徴とすることが好ましい。

【0102】

いくつかの実施形態では、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）は、脂質ナノ粒子として製剤化される。

【0103】

いくつかの実施形態では、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドはワクチンである。

【0104】

いくつかの実施形態では、ワクチンはＴ細胞ワクチンである。

【0105】

いくつかの実施形態では、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）は、異なる核酸（例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、例えば２つ以上のＲＮＡ、２つ以上のＤＮＡ、または１つ以上のＲＮＡと１つ以上のＤＮＡ）の混合物を含み、各核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）は、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。

【0106】

いくつかの実施形態では、異なる核酸（例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、例えば２つ以上のＲＮＡ、２つ以上のＤＮＡ、または１つ以上のＲＮＡと１つ以上のＤＮＡ）の混合物は、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含む異なるアミノ酸配列をコードする核酸（例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、例えば２つ以上のＲＮＡ、２つ以上のＤＮＡ、または１つ以上のＲＮＡと１つ以上のＤＮＡ）を含む。

【0107】

いくつかの実施形態では、異なるアミノ酸配列は、生物学的活性を有する異なるペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含む。

【0108】

いくつかの実施形態では、生物学的活性を有する異なるペプチドまたはポリペプチドは、異なる抗原を含む。

【0109】

いくつかの実施形態では、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）は、異なる抗原のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする異なる核酸（例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、例えば２つ以上のＲＮＡ、２つ以上のＤＮＡ、または１つ以上のＲＮＡと１つ以上のＤＮＡ）の混合物を含む。

【0110】

いくつかの態様では、本発明は、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする核酸が、生物系において生物学的活性を誘導する効力を分析するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）核酸を提供する工程；
（ｉｉ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの動物細胞株の細胞にインビトロで核酸をトランスフェクトする工程；
（ｉｉｉ）生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列の発現を可能にする工程；
（ｉｖ）細胞を溶解する工程；
（ｖ）細胞溶解物を処理する工程；および
（ｖｉ）生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量を、質量分析を用いて決定する工程であって、ＣＨＯ細胞などの動物細胞株の細胞によって発現される１つ以上のアミノ酸配列を定量化のための参照として使用する、工程
を含む方法を提供する。

【0111】

この方法の実施形態は、本明細書に記載される通りである。

【0112】

いくつかの態様では、本発明は、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡが生物系において生物学的活性を誘導する効力を分析するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）ＤＮＡを提供する工程；
（ｉｉ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの動物細胞株の細胞にインビトロでＤＮＡをトランスフェクトする工程；
（ｉｉｉ）生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列の発現を可能にする工程；
（ｉｖ）細胞を溶解する工程；
（ｖ）細胞溶解物を処理する工程；および
（ｖｉ）生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量を、質量分析を用いて決定する工程であって、ＣＨＯ細胞などの動物細胞株の細胞によって発現される１つ以上のアミノ酸配列を定量化のための参照として使用する、工程
を含む方法を提供する。

【0113】

この方法の実施形態は、本明細書に記載される通りである。

【0114】

いくつかの態様では、本発明は、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡとＤＮＡとの混合物が生物系において生物学的活性を誘導する効力を分析するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）ＲＮＡとＤＮＡとの混合物を提供する工程；
（ｉｉ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの動物細胞株の細胞にインビトロでＲＮＡとＤＮＡとの混合物をトランスフェクトする工程；
（ｉｉｉ）生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列の発現を可能にする工程；
（ｉｖ）細胞を溶解する工程；
（ｖ）細胞溶解物を処理する工程；および
（ｖｉ）生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量を、質量分析を用いて決定する工程であって、ＣＨＯ細胞などの動物細胞株の細胞によって発現される１つ以上のアミノ酸配列を定量化のための参照として使用する、工程
を含む方法を提供する。

【0115】

この方法の実施形態は、本明細書に記載される通りである。

【0116】

いくつかの態様では、本発明は、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡが生物系において生物学的活性を誘導する効力を分析するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）ＲＮＡを提供する工程；
（ｉｉ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの動物細胞株の細胞にインビトロでＲＮＡをトランスフェクトする工程；
（ｉｉｉ）生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列の発現を可能にする工程；
（ｉｖ）細胞を溶解する工程；
（ｖ）細胞溶解物を処理する工程；および
（ｖｉ）生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量を、質量分析を用いて決定する工程であって、ＣＨＯ細胞などの動物細胞株の細胞によって発現される１つ以上のアミノ酸配列を定量化のための参照として使用する、工程
を含む方法を提供する。

【0117】

この方法の実施形態は、本明細書に記載される通りである。

【0118】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは、細胞、例えば本明細書に記載のアッセイで使用される細胞およびレシピエントの細胞に入るとそれぞれのタンパク質に翻訳され得る一本鎖ＲＮＡである。生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチド、例えば抗原配列などの薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする野生型またはコドン最適化配列に加えて、ＲＮＡは、安定性および翻訳効率に関してＲＮＡの最大効果のために最適化された１つ以上の構造要素（５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）尾部）を含み得る。一実施形態では、ＲＮＡはこれらの要素の全てを含む。一実施形態では、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）（ｍ_２ ^{７，２’－Ｏ}ＧｐｐＳｐＧ）またはｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧを、ＲＮＡ原薬の５’末端の特異的キャッピング構造として利用し得る。５’－ＵＴＲ配列として、任意で翻訳効率を高めるために最適化された「コザック配列」を有する、ヒトα－グロビンｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ配列を使用し得る。３’－ＵＴＲ配列として、より高い最大タンパク質レベルおよびｍＲＮＡの長期持続性を確実にするために、コード配列とポリ（Ａ）尾部との間に配置された「スプリットのアミノ末端エンハンサ」（ＡＥＳ）ｍＲＮＡ（Ｆと呼ばれる）およびミトコンドリアコード１２ＳリボソームＲＮＡ（Ｉと呼ばれる）に由来する２つの配列要素（ＦＩ要素）の組合せを使用し得る。これらは、ＲＮＡの安定性を付与し、総タンパク質発現を増強する配列のエクスビボ選択プロセスによって同定された（参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／０６０３１４号参照）。あるいは、３’－ＵＴＲは、ヒトβグロビンｍＲＮＡの２つの反復３’－ＵＴＲであり得る。さらに、３０個のアデノシン残基のストレッチ、それに続く（ランダムヌクレオチドの）１０個のヌクレオチドリンカー配列および別の７０個のアデノシン残基からなる、１１０ヌクレオチド長と測定されるポリ（Ａ）尾部を使用し得る。このポリ（Ａ）尾部配列は、ＲＮＡ安定性および翻訳効率を高めるように設計された。

【0119】

生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチド、例えば抗原配列などの薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列は、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含み得る。そのような他のアミノ酸配列は、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドの機能または活性を支持し得る。いくつかの実施形態では、そのような他のアミノ酸配列は、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列を含む。代替的にまたは追加的に、そのような他のアミノ酸配列は、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列を含む。代替的にまたは追加的に、そのような他のアミノ酸配列は、生物発光を生じるアミノ酸配列を含む。そのような他のアミノ酸配列は、本明細書に記載されるアッセイにおいて、生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列またはその断片の量を決定するために有用であり得る。特に、そのような他のアミノ酸配列は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析による定量化に有用であり得る。

【0120】

本明細書に記載の核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）をポリマー、タンパク質および／または脂質、好ましくは脂質と複合体化して、投与のための核酸粒子を生成し得る。異なる核酸の組合せが使用される場合、核酸は、一緒に複合体化され得るか、または別々に複合体化され得る。

【図面の簡単な説明】

【0121】

【図1】ＣＨＯ細胞におけるＣｙ５標識ＲＮＡ－ＬＰＸのマクロピノサイトーシス駆動の用量依存的取り込み。ＣＨＯ細胞を、選択的マクロピノサイトーシス阻害剤ロットレリンで前処理するかまたは前処理せず、０．２、１．５または３μｇのＣｙ５標識ルシフェラーゼＲＮＡ－ＬＰＸと共にインキュベートした。洗浄後、細胞を固定し、Ｃｙ５シグナルを蛍光顕微鏡法によって分析した（左パネルは代表的な画像を示す）。スケールバー：５０μｍ。（右）Ｃｙ５陽性細胞の定量化（ｎ≧２０．０００細胞／用量／処置を分析した）。エラーバーはＳＥＭを表す。略語：ＣＨＯ＝チャイニーズハムスター卵巣細胞；ＬＰＸ＝ＲＮＡ－リポプレックス；ＳＥＭ＝平均の標準誤差。

【図2】ＤＣまたはＣＨＯ細胞におけるＲＮＡ－ＬＰＸコード抗原の局在化。細胞を腫瘍抗原ＭＡＧＥ－Ａ３－ＲＮＡ－ＬＰＸ（構築物については図１２参照）と共に２４時間インキュベートし、その後、天然条件下でＭＡＧＥ Ａ３特異的抗体（緑色）で染色し、構造化照明顕微鏡法によって分析した。小さい写真は、直交ビューを表す。Ｃ）では、細胞膜を並行して染色した（赤色）。グラフは、重ね合わせ画像からのラインスキャン（白色の点線）を示す。バーは２０μｍ（Ａ／Ｂ）または２５μｍ（Ｃ）を表す。略語：ＣＨＯ＝チャイニーズハムスター卵巣；ＤＣ＝樹状細胞；ＭＡＧＥ Ａ３＝黒色腫関連抗原３。

【図3】ｅＧＦＰ－ＬＰＸ－リポフェクトＤＣ（左）およびＣＨＯ細胞（右）の用量反応曲線。細胞を、レポータｅＧＦＰをコードする滴定量のＲＮＡ－ＬＰＸと共インキュベートした。ｅＧＦＰ蛍光シグナルを分析し、平均相対蛍光単位（ＲＦＵ）を計算した。エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝３）。略語：ＣＨＯ＝チャイニーズハムスター卵巣；ＤＣ＝樹状細胞；ｅＧＦＰ＝増強された緑色蛍光タンパク質；ＬＰＸ＝リポプレックス。

【図4】非ストレス負荷（対照）またはストレス負荷ｅＧＦＰ－ＲＮＡ－ＬＰＸによるリポフェクション後のＤＣ（左）またはＣＨＯ細胞（右）の用量反応曲線。ＲＮＡ－ＬＰＸは、リポフェクションに使用する前に熱ストレスに曝露した。その後、細胞を、レポータｅＧＦＰをコードする滴定量のストレス負荷または非ストレス負荷ＲＮＡ－ＬＰＸ（ｅＧＦＰ－ＬＰＸ）と共インキュベートした。ｅＧＦＰ蛍光シグナルを分析し、平均ＲＦＵを計算する。エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝３）。略語：ＣＨＯ＝チャイニーズハムスター卵巣；ＤＣ＝樹状細胞；ｅＧＦＰ＝増強された緑色蛍光タンパク質；ＲＦＵ＝相対蛍光単位；ＲＮＡ ＬＰＸ＝リボ核酸リポプレックス。

【図5A】効力アッセイに対するＤＰ変動の影響。Ａ）異なるＲＮＡ完全性（９５％；８０％；７４％および４０％）をもたらす４つの熱分解ＲＮＡをＲＮＡ－ＬＰＸの製造に使用した。Ｂ）５’キャップを有する（キャップあり、黒色の線）または５’キャップを有さない（キャップなし、青色の線）ＲＮＡをＲＮＡ－ＬＰＸの製造に使用した。左側に、蛍光シグナルを各製剤用量の関数としてプロットしている。異なる色は、示されている熱分解ＲＮＡを用いて製造されたそれぞれのＤＰでの測定値を表す。右側には、対応するＡＵＣ値をプロットした。Ｃ）使用したＲＮＡの機能性を検証するためのウサギ網状赤血球溶解物を使用したキャップされたＲＮＡ（左）およびキャップされていないＲＮＡ（右）のインビトロ翻訳。エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝３）。

【図5C】効力アッセイに対するＤＰ変動の影響。Ａ）異なるＲＮＡ完全性（９５％；８０％；７４％および４０％）をもたらす４つの熱分解ＲＮＡをＲＮＡ－ＬＰＸの製造に使用した。Ｂ）５’キャップを有する（キャップあり、黒色の線）または５’キャップを有さない（キャップなし、青色の線）ＲＮＡをＲＮＡ－ＬＰＸの製造に使用した。左側に、蛍光シグナルを各製剤用量の関数としてプロットしている。異なる色は、示されている熱分解ＲＮＡを用いて製造されたそれぞれのＤＰでの測定値を表す。右側には、対応するＡＵＣ値をプロットした。Ｃ）使用したＲＮＡの機能性を検証するためのウサギ網状赤血球溶解物を使用したキャップされたＲＮＡ（左）およびキャップされていないＲＮＡ（右）のインビトロ翻訳。エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝３）。

【図6】概念実証。Ａ）ｅＧＦＰをコードするＲＮＡ－リポプレックスによるリポフェクションの２４時間後の細胞の三連測定。３つの異なるＲＮＡ－リポプレックス用量をトランスフェクションに使用した。Ｂ）ｅＧＦＰ構築物のアミノ酸配列。赤色は、ＭＳ／ＭＳによって細胞溶解物中で同定された特異的ペプチド（ｎ＝３）。Ｃ）ｅＧＦＰ ＭＳペプチドシグナル強度（赤色）と比較した溶解物中のｅＧＦＰ蛍光シグナル（青色）の相関。

【図7】代表的なｉＮｅＳＴ ＲＮＡ－ＬＰＸを用いた概念実証。ｉＮｅＳＴデザインスペースＲＮＡ－リポプレックスによるリポフェクションの２４時間後の細胞の正規化したＬＣ－ＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）ＭＩＴＤペプチドの定量化。エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝６）。

【図8】ｉＮｅＳＴリポプレックス化リポフェクトＣＨＯ細胞の用量反応曲線。ＣＨＯ細胞を、異なるネオ抗原（ｉＮｅＳＴ５または６）をコードする滴定量のＲＮＡ－リポプレックスと共インキュベートし、正規化したＭＩＴＤペプチドの定量化（ＭＳ／ＭＳ）をｉＮｅＳＴ構築物５（左）および６（右）について示した。略語：ＣＨＯ＝チャイニーズハムスター卵巣；ＬＰＸ＝リポプレックス。

【図9】ＬＣ－ＭＳ効力に対する加速温度ストレスの影響。６つ全てのｉＮｅＳＴ ＲＮＡ－ＬＰＸ（ｉＮｅＳＴ１～６）に熱ストレスを負荷し（２日間、４０℃）、得られた試料を３つの異なる用量レベルで細胞に適用し、ＬＣ－ＭＳ効力アッセイによって分析した。用量反応曲線を、非ストレス負荷試料（青色）およびストレス負荷試料（橙色）についての正規化したＭＩＴＤペプチド量に対して並行してプロットした。

【図10】加速ストレス条件の２つの時点の影響。６つ全てのｉＮｅＳＴ ＲＮＡ－ＬＰＸ（ｉＮｅＳＴ１～６）に、４０℃で２日間（左のグラフ）または１０日間（右のグラフ）、熱ストレスを負荷した。非ストレス負荷対照試料（灰色のバー）およびストレス負荷試料（橙色のバー）のＲＮＡ完全性を分析している（黄色の点線はＲＮＡ完全性の仕様限界を示す）。並行して、全ての試料を細胞に適用し、ＬＣ－ＭＳ効力アプローチによって分析した。それぞれのＭＩＴＤペプチド量を、非ストレス負荷ＭＩＴＤペプチド量からのシグナル（青色のバー）に対して正規化している。

【図11】異なる読み出しの測定は、ＲＮＡ－ＬＰＸ用量反応曲線関係を示す。Ａ）ＣＨＯ細胞を腫瘍抗原ＭＡＧＥ Ａ３ ＲＮＡ－ＬＰＸで用量依存的にリポフェクトした。細胞を、意図するＬＣ－ＭＳ効力アプローチによってＭＡＧＥ Ａ３翻訳について分析した（ＬＣ－ＭＳ、橙色の点）。細胞を、天然抗体染色および定量的ＨＴ顕微鏡法によって表面局在化（図２参照）について並行して分析した（ＡＢ、青色の点）。細胞を、特殊なＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴアッセイによってＴ細胞を活性化する能力についても分析した（緑色の点）。ＣＨＯ細胞にＨＬＡ－Ａ＊０１０１ ＲＮＡをエレクトロポレーションし、滴定量のＭＡＧＥ－Ａ３コードＲＮＡ－ＬＰＸをトランスフェクトし、ＨＬＡ－Ａ＊０１０１拘束性ＭＡＧＥ－Ａ３－ＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を活性化するそれらの能力について評価した。レポータとしてのルシフェラーゼのＮＦＡＴ駆動発現に基づくＭＡＧＥ－Ａ３－ＴＣＲトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞の同族活性化。Ｂ）Ａと同じ実験で、ＣＨＯ細胞を、抗原（Ｅ７）をコードするＲＮＡ－ＬＰＸでリポフェクトした。ＣＨＯ細胞にＨＬＡ－ＤＱＢＡ１＊０１０２およびＤＱＢ１＊０５０１ ＲＮＡをエレクトロポレーションし、滴定量のＨＰＶ－Ｅ７コードＲＮＡ－ＬＰＸでトランスフェクトし、ＨＬＡ－ＤＱＢＡ１＊０１０２／ＤＱＢ１＊０５０１拘束性ＨＰＶ－Ｅ７－ＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を活性化するそれらの能力について評価した。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を標的ＬＣ－ＭＳアッセイに供して、翻訳されたＨＰＶ－Ｅ７タンパク質のレベルを測定し、並行してＨＴ顕微鏡法によって表面局在化を測定した。レポータとしてのルシフェラーゼのＮＦＡＴ駆動発現に基づくＨＰＶ Ｅ７ ＴＣＲトランスフェクトＪｕｒｋａｔ細胞の同族活性化。エラーバーは標準偏差を表す（ｎ＝３）。

【図12】ＢＮＴ１１１（ＮＹ－ＥＳＯ－１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ－Ａ３、およびＴＰＴＥ）ならびにＢＮＴ１１３（ＨＰＶ－Ｅ６およびＨＰＶ－Ｅ７）腫瘍抗原をコードするＲＮＡの一般構造。５’キャップ、５’および３’非翻訳領域、内因性分泌シグナルペプチドを含むコード配列（該当する場合）、ならびにポリ（Ａ）尾部を有するＲＮＡの一般構造の概略図。個々の要素は、それぞれの配列の長さと比較して正確に縮尺通りに描かれているわけではないことに留意されたい。ＯＲＦ＝オープンリーディングフレーム；ＵＴＲ＝非翻訳領域；ｓｅｃ＝分泌シグナルペプチド。

【図13】一定の５’キャップ［β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１））、５’－および３’－ＵＴＲ（それぞれｈＡｇ－コザックおよびＦＩ）］、Ｎ末端およびＣ末端融合タグ（それぞれｓｅｃ２．０およびＭＩＴＤ）、ならびにポリ（Ａ）尾部（Ａ１２０）、ならびにＧＳリッチリンカーによって融合されたネオエピトープ（ｎｅｏ１～１０）をコードする患者特異的配列を有するｉＮｅＳＴ ＲＮＡ原薬の一般構造の概略図。略語：ＧＳ－グリシンおよびセリン；ＭＩＴＤ－主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ輸送ドメイン；ｓｅｃ－分泌シグナルペプチド；ＵＴＲ－非翻訳領域。

【図14】分析した腫瘍抗原構築物の概要（＃１：ＭＡＧＥ－Ａ３、２＃：チロシナーゼおよび３＃ＮＹ－ＥＳＯ、図１２も参照のこと）。構築物のＣ末端定常部分を強調している（ペプチド＃１；ペプチド＃２およびＭＩＴＤ）。

【図15】３つの（Ａ～Ｃ）腫瘍抗原のＭＳに基づく相対定量化の結果。各構築物について、６つの用量を二連で適用した（ｎ＝２）。エラーバーは標準偏差を表す。

【図16A】細胞を、ＭＡＧＥ Ａ３（図１６Ａ）またはＴＰＴＥ（図１６Ｂ）をコードするＤＰ（ＲＮＡ－ＬＰＸ）で用量依存的にリポフェクトした。分析読み出し（ＬＣ－ＭＳ；Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ（ＨｅｐＧ２またはＣＨＯ細胞を含む）および定量的免疫蛍光顕微鏡法（ＩＦ））を並行して行い、結果を線形適合させ、比較する。２つの条件（３日間（四角）および１０日間（丸））で加速熱ストレス負荷した各ＤＰならびに非ストレス負荷ＤＰ（三角）を用量依存的に細胞に適用した。エラーバーは標準偏差を表す。

【図16B】細胞を、ＭＡＧＥ Ａ３（図１６Ａ）またはＴＰＴＥ（図１６Ｂ）をコードするＤＰ（ＲＮＡ－ＬＰＸ）で用量依存的にリポフェクトした。分析読み出し（ＬＣ－ＭＳ；Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ（ＨｅｐＧ２またはＣＨＯ細胞を含む）および定量的免疫蛍光顕微鏡法（ＩＦ））を並行して行い、結果を線形適合させ、比較する。２つの条件（３日間（四角）および１０日間（丸））で加速熱ストレス負荷した各ＤＰならびに非ストレス負荷ＤＰ（三角）を用量依存的に細胞に適用した。エラーバーは標準偏差を表す。

【図17】非ストレス負荷（右の値）、３日間（中央の値）および１０日間（左の値）ストレス負荷したＤＰの様々な分析結果の評価および比較（ＬＣ－ＭＳ対ＪｕｒｋａｔおよびＲＮＡ完全性（ＣＥ）対ＬＣ－ＭＳ）。様々な分析測定の線形適合の勾配をグラフにプロットし、線形回帰によって適合させた。

【図18】ＬＣ－ＭＳ（図の右側のバー）およびＪｕｒｋａｔアッセイ（図の左側のバー）の結果の評価および比較。用量反応曲線のデータ点を、相対効力ＧＭＰソフトウェアＰＬＡを用いて分析した。異なるストレス負荷試料を非ストレス負荷試料（１００％効力として設定）と比較し、ＰＬＡソフトウェアを使用してそれぞれの効力を計算する。

【図19A】細胞を、ＴＹＲ（図１９Ａ）またはＮＹ－ＥＳＯ（図１９Ｂ）をコードするＤＰ（ＲＮＡ－ＬＰＸ）で用量依存的にリポフェクトした。分析読み出し（ＬＣ－ＭＳ；Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ（ＨｅｐＧ２を含む））を並行して行い、結果を線形適合させ、比較する。２つの条件（３日間（四角）および１０日間（丸））で加速熱ストレス負荷した各ＤＰ、さらに非ストレス負荷ＤＰ（三角）を用量依存的に細胞に適用した。エラーバーは標準偏差を表す。

【図19B】細胞を、ＴＹＲ（図１９Ａ）またはＮＹ－ＥＳＯ（図１９Ｂ）をコードするＤＰ（ＲＮＡ－ＬＰＸ）で用量依存的にリポフェクトした。分析読み出し（ＬＣ－ＭＳ；Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ（ＨｅｐＧ２を含む））を並行して行い、結果を線形適合させ、比較する。２つの条件（３日間（四角）および１０日間（丸））で加速熱ストレス負荷した各ＤＰ、さらに非ストレス負荷ＤＰ（三角）を用量依存的に細胞に適用した。エラーバーは標準偏差を表す。

【図20】非ストレス負荷（右の値）、３日間（中央の値）および１０日間（左の値）ストレス負荷したＤＰの様々な分析結果の評価および比較（ＬＣ－ＭＳ対ＪｕｒｋａｔおよびＲＮＡ完全性（ＣＥ）対ＬＣ－ＭＳ）。様々な分析測定の線形適合の勾配をグラフにプロットし、線形回帰によって適合させた。

【図21】ＬＣ－ＭＳ（図の右側のバー）およびＪｕｒｋａｔアッセイ（図の左側のバー）の結果の評価および比較。用量反応曲線のデータ点を、相対効力ＧＭＰソフトウェアＰＬＡを用いて分析した。異なるストレス負荷試料を非ストレス負荷試料（１００％効力として設定）と比較し、ＰＬＡソフトウェアを使用してそれぞれの効力を計算する。

【図22A】細胞を、Ｅ６（図２２Ａ）またはＥ７（図２２Ｂ）をコードするＤＰ（ＲＮＡ－ＬＰＸ）で用量依存的にリポフェクトした。分析読み出し（ＬＣ－ＭＳ；Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ（ＨｅｐＧ２またはＣＨＯを含む）および定量的免疫蛍光顕微鏡法（ＩＦ））を並行して行い、結果を線形適合させ、比較する。２つの条件（３日間（四角）および１０日間（丸））で加速熱ストレス負荷した各ＤＰ、さらに非ストレス負荷ＤＰ（三角）を用量依存的に細胞に適用した。エラーバーは標準偏差を表す。

【図22B】細胞を、Ｅ６（図２２Ａ）またはＥ７（図２２Ｂ）をコードするＤＰ（ＲＮＡ－ＬＰＸ）で用量依存的にリポフェクトした。分析読み出し（ＬＣ－ＭＳ；Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ（ＨｅｐＧ２またはＣＨＯを含む）および定量的免疫蛍光顕微鏡法（ＩＦ））を並行して行い、結果を線形適合させ、比較する。２つの条件（３日間（四角）および１０日間（丸））で加速熱ストレス負荷した各ＤＰ、さらに非ストレス負荷ＤＰ（三角）を用量依存的に細胞に適用した。エラーバーは標準偏差を表す。

【図23】非ストレス負荷（右の値）、３日間（中央の値）および１０日間（左の値）ストレス負荷したＤＰの様々な分析結果の評価および比較（ＬＣ－ＭＳ対ＪｕｒｋａｔおよびＲＮＡ完全性（ＣＥ）対ＬＣ－ＭＳ）。様々な分析測定の線形適合の勾配をグラフにプロットし、線形回帰によって適合させた。

【図24】ＬＣ－ＭＳ（図の右側のバー）およびＪｕｒｋａｔアッセイ（図の左側のバー）の結果の評価および比較。用量反応曲線のデータ点を、相対効力ＧＭＰソフトウェアＰＬＡを用いて分析した。異なるストレス負荷試料を非ストレス負荷試料（１００％効力として設定）と比較し、ＰＬＡソフトウェアを使用してそれぞれの効力を計算する。

【図25】ＣＨＯ細胞にＡＴＭまたはＣＴＭ ＤＰ（ＬＮＰ）をトランスフェクトした。ＤＰは、Ｔ細胞ストリング融合構築物をコードするＲＮＡを含む。ＤＰを用量依存的に（０．７５～９μｇ、非翻訳細胞（ＵＴ）も対照として分析した）細胞に適用した。ＲＮＡの取り込みおよび翻訳の後、細胞を回収し、溶解し、ＭＳ試料調製に供した。２つのＴ細胞特異的ペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（ＰＲＭ）によって分析し、正規化した発現値をプロットした。

【図26A】ＣＨＯ細胞にｕＲＮＡまたはｍｏｄＲＮＡを含むＤＰ ＡＴＭ（ＬＮＰ）をトランスフェクトした。各ＤＰは、８つのＴＢ抗原から構成される４つの融合タンパク質（Ａｇ８５Ａ＋Ｈｒｐ１；ＥＳＡＴ６＋ＲｐｆＤ；Ｍ７２＋ＶａｐＢ４７；ＲｐｆＡ＋ＨｂｈＡ）をコードする４つのＲＮＡを含む。ＤＰを用量依存的に（１５０～２４００ｎｇ）細胞に適用した。取り込みおよび翻訳の後、細胞を回収し、溶解し、ＭＳ試料調製に供した。ＴＢ抗原特異的ペプチドをＰＲＭによって分析した。エラーバーは標準偏差を表す。

【図26B】ＣＨＯ細胞にｕＲＮＡまたはｍｏｄＲＮＡを含むＤＰ ＡＴＭ（ＬＮＰ）をトランスフェクトした。各ＤＰは、８つのＴＢ抗原から構成される４つの融合タンパク質（Ａｇ８５Ａ＋Ｈｒｐ１；ＥＳＡＴ６＋ＲｐｆＤ；Ｍ７２＋ＶａｐＢ４７；ＲｐｆＡ＋ＨｂｈＡ）をコードする４つのＲＮＡを含む。ＤＰを用量依存的に（１５０～２４００ｎｇ）細胞に適用した。取り込みおよび翻訳の後、細胞を回収し、溶解し、ＭＳ試料調製に供した。ＴＢ抗原特異的ペプチドをＰＲＭによって分析した。エラーバーは標準偏差を表す。

【図27】ＣＨＯ細胞に、レポータルシフェラーゼをコードするＲＮＡを含有するＬＮＰ対照をトランスフェクトし、ルシフェラーゼは分泌型であった。ＤＰを１用量で三連で細胞に適用した。取り込みおよび翻訳の後、細胞を回収し、溶解し、ＭＳ試料調製に供した。ルシフェラーゼ特異的ペプチドをＰＲＭによって分析した。エラーバーは標準偏差を表す。

【図28】ＤＮＡがｅＧＦＰをコードする、ＤＮＡ－リポフェクタミン２０００（リポフェクタミン２０００（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ、１１６６８０３０）、ロット：２４１８９５３）による２４時間のリポフェクション後のＣＨＯ細胞の二重蛍光測定。４つの異なるＤＮＡ－リポフェクタミン用量（２２５～１８００ｎｇ）を細胞に適用した。ＲＮＡの取り込みおよび翻訳の後、細胞を回収し、溶解し、ＭＳ試料調製に供した。細胞のｅＧＦＰ蛍光シグナル（蛍光強度）は、２つの異なるＧＦＰ特異的ペプチド（Ｔｏｐ１およびＴｏｐ２）に由来するｅＧＦＰ ＭＳ／ＭＳペプチドシグナル強度（ＭＳシグナル）と比較して相関していた。

【図29A】細胞を、５つの異なる腫瘍抗原をコードするＤＰ（ＲＮＡ－ＬＰＸ）で用量依存的に（抗原あたり１１の異なる投与量）リポフェクトした。２４時間のインキュベーション時間後、細胞を回収し、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。（ｐ２ｐ１６ドメインの）ペプチド３をＬＣ－ＭＳアプローチによって定量化し、正規化した発現を適用された投与量に対してプロットしている。

【図29B】細胞を、５つの異なる腫瘍抗原をコードするＤＰ（ＲＮＡ－ＬＰＸ）で用量依存的に（抗原あたり１１の異なる投与量）リポフェクトした。２４時間のインキュベーション時間後、細胞を回収し、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。（ｐ２ｐ１６ドメインの）ペプチド３をＬＣ－ＭＳアプローチによって定量化し、正規化した発現を適用された投与量に対してプロットしている。

【図29C】細胞を、５つの異なる腫瘍抗原をコードするＤＰ（ＲＮＡ－ＬＰＸ）で用量依存的に（抗原あたり１１の異なる投与量）リポフェクトした。２４時間のインキュベーション時間後、細胞を回収し、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。（ｐ２ｐ１６ドメインの）ペプチド３をＬＣ－ＭＳアプローチによって定量化し、正規化した発現を適用された投与量に対してプロットしている。

【図30】細胞を、１つの腫瘍抗原をコードするＤＰ（ＲＮＡ－ＬＰＸ）で用量依存的に（抗原あたり１１の異なる投与量）リポフェクトした。２４時間のインキュベーション時間後、細胞を回収し、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。（ｐ２ｐ１６ドメインの）ペプチド３をＬＣ－ＭＳアプローチによって定量化し、正規化した発現を適用された投与量に対してプロットしている。

【0122】

以下の表は、本明細書で参照される特定の配列のリストを提供する。

【0123】

【表1】

【発明を実施するための形態】

【0124】

本開示を以下でより詳細にさらに説明するが、この開示は本明細書に記載される特定の方法、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0125】

以下において、本開示の要素をより詳細に説明する。これらの要素を具体的な実施形態と共に列挙するが、それらは、さらなる実施形態を創出するために任意の方法および任意の数で組み合わせ得ることを理解されたい。様々に説明される例および好ましい実施形態は、本開示を明示的に記載される実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明確に記述される実施形態を任意の数の開示される要素および／または好ましい要素と組み合わせた実施形態を支持し、包含すると理解されるべきである。さらに、本出願において記述される全ての要素の任意の並び替えおよび組合せは、文脈上特に指示されない限り、本出願の説明によって開示されていると見なされるべきである。

【0126】

本開示の実施は、特に明記されない限り、当分野の文献で説明されている従来の化学、生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術を使用する。

【0127】

本明細書および以下の特許請求の範囲を通して、文脈上特に必要とされない限り、「含む」という語および「含むこと」などの変形は、記述される特徴、要素、メンバー、整数もしくは工程または特徴、要素、メンバー、整数もしくは工程の群の包含を意味するが、いかなる他の特徴、要素、メンバー、整数もしくは工程または特徴、要素、メンバー、整数もしくは工程の群の除外も意味しないと理解される。「から本質的になる」という用語は、特許請求の範囲または開示の範囲を、指定された特徴、要素、メンバー、整数または工程、ならびに特許請求の範囲または開示の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。「からなる」という用語は、特許請求の範囲または開示の範囲を、指定された特徴、要素、メンバー、整数または工程に限定する。「含む」という用語は、「から本質的になる」という用語を包含し、これは次に「からなる」という用語を包含する。したがって、本出願における各存在ごとに、「含む」という用語は、「から本質的になる」または「からなる」という用語で置き換えられてもよい。同様に、本出願における各存在ごとに、「から本質的になる」という用語は、「からなる」という用語で置き換えられてもよい。

【0128】

本開示を説明する文脈において（特に特許請求の範囲の文脈において）使用される「１つの」および「その」という用語および同様の言及は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。

【0129】

本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。

【0130】

本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語（例えば「など」）の使用は、単に本開示をよりよく説明することを意図しており、特許請求される本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本開示の実施に不可欠な特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。

【0131】

本明細書で使用される「任意の」または「任意に」という用語は、続いて記述される事象、状況または状態が発生してもよくまたは発生しなくてもよいこと、およびその記述が、前記事象、状況または状態が発生する場合と発生しない場合とを含むことを意味する。

【0132】

本明細書で使用される場合、「および／または」は、他のものを含むまたは含まない、２つの指定された特徴または構成要素のそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。例えば、「Ｘおよび／またはＹ」は、（ｉ）Ｘ、（ｉｉ）Ｙ、ならびに（ｉｉｉ）ＸおよびＹの各々の具体的な開示として、あたかも各々が本明細書に個別に記載されているかのごとくに解釈されるべきである。

【0133】

本開示の文脈において、「約」という用語は、当業者が問題の特徴の技術的効果を依然として保証すると理解する精度の区間を示す。この用語は、典型的には、示された数値からの±１０％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％、±０．９％、±０．８％、±０．７％、±０．６％、±０．５％、±０．４％、±０．３％、±０．２％、±０．１％、±０．０５％、例えば±０．０１％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±１０％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±５％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±４％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±３％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±２％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±１％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．９％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．８％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．７％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．６％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．５％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．４％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．３％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．２％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．１％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．０５％の偏差を示す。いくつかの実施形態では、「約」は、示された数値から±０．０１％の偏差を示す。当業者には理解されるように、所与の技術的効果の数値に対するそのような具体的な偏差は、技術的効果の性質に依存する。例えば、天然または生物学的な技術的効果は、一般に、人工的または工学的な技術的効果のものよりも大きいそのような偏差を有し得る。

【0134】

本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に属する各々別々の値を個別に言及することの簡略方法として機能することが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各個別の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。

【0135】

本明細書の本文全体を通していくつかの資料を引用する。本明細書で引用される資料（全ての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、指示書などを含む）の各々は、上記または下記のいずれでも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明のためにそのような開示に先行する権利を有さないことの承認として解釈されるべきではない。

【0136】

定義
以下において、本開示の全ての態様に適用される定義を提供する。以下の用語は、特に指示されない限り、以下の意味を有する。未定義の用語は、それらの技術分野で広く認められている意味を有する。

【0137】

核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の「治療可能性」または「効力」は、核酸の治療品質、核酸が対象に投与された場合に治療的利益を提供する能力を指す。特定の実施形態では、核酸の治療可能性は、核酸の治療可能性を示す、核酸によってコードされるペプチドまたはポリペプチドの発現、特に強い発現、例えば閾値を超える発現によって測定、決定、同定、定量化、確認および／または検証することができる。一実施形態では、治療可能性は、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）がインビボで薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドを発現する能力を指し、前記薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドは、その薬学的効果、例えば治療的効果を発揮する。

【0138】

いくつかの実施形態では、強い発現、例えば閾値を超える発現を示す核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）は、「十分な治療可能性」を有する。核酸の治療可能性は、核酸が、意味のある薬学的効果、例えば治療効果が達成されるように、コードされた薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドをインビボで発現する能力を有する場合に十分である。

【0139】

本明細書で使用される場合、アミノ酸配列（ペプチドまたはポリペプチド）に関して「量を決定する」または「発現を決定する」などの語句または同様の語句は、アミノ酸配列の量または存在を決定することを指す。

【0140】

本明細書で使用される「低減する」または「阻害する」などの用語は、例えば、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、または約７５％以上のレベルの全体的な減少を生じさせる能力を意味する。「阻害する」という用語または同様の語句は、完全なまたは本質的に完全な阻害、すなわちゼロまたは本質的にゼロへの低減を含む。

【0141】

本明細書で使用される「増強する」という用語は、例えば、少なくとも約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約７５％以上、または約１００％以上のレベルの全体的な増加または増強を生じさせる能力を意味する。

【0142】

本明細書で使用される「生理学的ｐＨ」は、約７．４のｐＨを指す。いくつかの実施形態では、生理学的ｐＨは、７．３～７．５である。いくつかの実施形態では、生理学的ｐＨは、７．３５～７．４５である。いくつかの実施形態では、生理学的ｐＨは、７．３、７．３５、７．４、７．４５または７．５である。

【0143】

本開示で使用される場合、「％ｗ／ｖ」は、ミリリットル（ｍＬ）単位での溶液の総体積のパーセントとして表されるグラム（ｇ）単位での溶質の量を測定する濃度の単位である、重量体積パーセントを指す。

【0144】

本開示で使用される場合、「重量％」は、グラム（ｇ）での全組成物の総重量のパーセントとして表されるグラム（ｇ）での物質の量を測定する濃度の単位である、重量パーセントを指す。

【0145】

本開示で使用される場合、「モル％」は、全ての成分の総モル数に対する１つの成分のモル数の比率に１００を乗じたものとして定義される。

【0146】

本開示で使用される場合、「モル％」は、全ての脂質の総モル数に対する１つの脂質成分のモル数の比率に１００を乗じたものとして定義される。これに関連して、いくつかの実施形態では、「総脂質」という用語は、脂質および脂質様物質を含む。

【0147】

「イオン強度」という用語は、特定の溶液中の異なる種類のイオン種の数とそれらのそれぞれの電荷との間の数学的関係を指す。したがって、イオン強度Ｉは、式：

【0148】

【数1】

【0149】

によって数学的に表され、式中、ｃは特定のイオン種のモル濃度であり、ｚはその電荷の絶対値である。総和Σは、溶液中の全ての異なる種類のイオン（ｉ）に適用される。

【0150】

本開示によれば、いくつかの実施形態における「イオン強度」という用語は、一価イオンの存在に関する。二価イオン、特に二価カチオンの存在に関して、キレート剤の存在により、それらの濃度または有効濃度（遊離イオンの存在）は、いくつかの実施形態では、核酸の分解を防止するのに十分に低い。いくつかの実施形態では、二価イオンの濃度または有効濃度は、ＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチド間のホスホジエステル結合の加水分解のための触媒レベルよりも低い。いくつかの実施形態では、遊離二価イオンの濃度は２０μＭ以下である。いくつかの実施形態では、遊離二価イオンは存在しないか、または本質的に存在しない。

【0151】

「重量オスモル濃度」は、溶媒のキログラムあたりの溶質のオスモル数として表される特定の溶質の濃度を指す。

【0152】

「凍結乾燥する」または「凍結乾燥」という用語は、物質を凍結し、次いで周囲の圧力を低下させて（例えば、１５Ｐａ未満、例えば１０Ｐａ未満、５Ｐａ未満、または１Ｐａ以下）、物質中の凍結媒体を固相から気相に直接昇華させることによる物質の凍結乾燥を指す。したがって、「凍結乾燥する」および「フリーズドライする」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0153】

「噴霧乾燥」という用語は、容器（噴霧乾燥機）内で（加熱された）気体を霧化（噴霧）される流体と混合することによって物質を噴霧乾燥することを指し、形成された液滴からの溶媒が蒸発し、乾燥粉末をもたらす。

【0154】

「再構成する」という用語は、乾燥した生成物をその元の液体状態などの液体状態に戻すために、水などの溶媒を乾燥した生成物に添加することに関する。

【0155】

本開示の文脈における「組換え」という用語は、「遺伝子操作を介して作製された」ことを意味する。一実施形態では、本開示の文脈における「組換え物」は、天然には存在しない。

【0156】

本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、物体が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、自然界の供給源から単離することができ、実験室で人間によって意図的に改変されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在する。「自然界で見出される」という用語は、「自然界に存在する」ことを意味し、公知の物体ならびに自然からまだ発見および／または単離されていないが、天然源から将来発見および／または単離される可能性がある物体を含む。

【0157】

本明細書で使用される場合、「室温」および「周囲温度」という用語は、本明細書では互換的に使用され、少なくとも約１５℃、例えば約１５℃～約３５℃、約１５℃～約３０℃、約１５℃～約２５℃、または約１７℃～約２２℃の温度を指す。そのような温度には、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃および２２℃が含まれる。いくつかの実施形態では、温度は、１５℃～約２５℃である。いくつかの実施形態では、温度は、１７℃～約２５℃である。いくつかの実施形態では、温度は約１５℃である。いくつかの実施形態では、温度は約１６℃である。いくつかの実施形態では、温度は約１７℃である。いくつかの実施形態では、温度は約１８℃である。いくつかの実施形態では、温度は約１９℃である。いくつかの実施形態では、温度は約２０℃である。いくつかの実施形態では、温度は約２１℃である。いくつかの実施形態では、温度は約２２℃である。

【0158】

「ＥＤＴＡ」という用語は、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩を指す。全ての濃度はＥＤＴＡ二ナトリウム塩に関して与えられる。

【0159】

「凍結保護剤」という用語は、凍結段階中に活性成分を保護するために製剤に添加される物質に関する。

【0160】

「凍結乾燥保護剤」という用語は、乾燥段階中に活性成分を保護するために製剤に添加される物質に関する。

【0161】

本開示によれば、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに連結された約２個以上、約３個以上、約４個以上、約６個以上、約８個以上、約１０個以上、約１３個以上、約１６個以上、約２０個以上、および最大約５０個、約１００個または約１５０個までの連続するアミノ酸を含む物質を指す。「ポリペプチド」という用語は、大きなペプチド、特に少なくとも約１５１個のアミノ酸を有するペプチドを指す。「ペプチド」および「ポリペプチド」は、両方ともタンパク質分子である。

【0162】

「生物学的活性」という用語は、分子に対する生物系の応答を意味する。そのような生物系は、例えば、細胞または生物であり得る。いくつかの実施形態では、そのような応答は治療的または薬学的に有用である。いくつかの実施形態では、生物学的活性は、薬学的活性を含む。

【0163】

本明細書で使用される「生物系」という用語は、その挙動が１つ以上の生物学的プロセスまたは機構によって全体的または部分的に特徴付けられ得る、相互作用するまたは潜在的に相互作用する生物学的構成要素の任意の系を指す。生物系は、例えば、個々の細胞、細胞培養物などの細胞の集合体、器官、組織、および個体または対象、例えばヒト患者などの多細胞生物を含むことができる。

【0164】

いくつかの実施形態では、生物系は、個体もしくは対象に存在するか、または個体もしくは対象であり、そのような生物系における生物学的活性は、治療的または薬学的に有用な活性であり、すなわち、生物学的活性は、治療的または薬学的に有用な効果をもたらすか、またはそれに寄与する。

【0165】

本開示の様々な実施形態によれば、ペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）は、インビトロでまたは対象において存在し得る細胞に取り込まれるか、または導入される、すなわちトランスフェクトまたは形質導入され、前記ペプチドまたはポリペプチドの発現をもたらす。細胞は、例えば、コードされたペプチドもしくはポリペプチドを細胞内で（例えば細胞質および／もしくは核内で）発現し得る、コードされたペプチドもしくはポリペプチドを分泌し得る、および／またはそれを表面上で発現し得る。

【0166】

本開示によれば、「発現する核酸」および「コードする核酸」などの用語または同様の用語は、本明細書では互換的に使用され、特定のペプチドまたはポリペプチドに関して、核酸が、適切な環境、例えば細胞内に存在する場合、発現されて前記ペプチドまたはポリペプチドを産生することができることを意味する。

【0167】

「部分」という用語は画分を指す。アミノ酸配列またはタンパク質などの特定の構造に関して、その「部分」という用語は、前記構造の連続または不連続な画分を指し得る。

【0168】

「部分」および「断片」という用語は、本明細書では互換的に使用され、連続する要素を指す。例えば、アミノ酸配列またはタンパク質などの構造の一部は、前記構造の連続する要素を指す。組成物に関連して使用される場合、「部分」という用語は、組成物の一部を意味する。例えば、組成物の一部は、前記組成物の０．１％～９９．９％（例えば０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、５０％、９０％、または９９％）の任意の部分であり得る。

【0169】

アミノ酸配列（ペプチドまたはポリペプチド）に関して、「断片」は、アミノ酸配列の一部、すなわちＮ末端および／またはＣ末端で短縮されたアミノ酸配列を表す配列に関する。Ｃ末端で短縮された断片（Ｎ末端断片）は、例えば、オープンリーディングフレームの３’末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。Ｎ末端で短縮された断片（Ｃ末端断片）は、例えば、トランケートされたオープンリーディングフレームが翻訳を開始させるように働く開始コドンを含む限り、オープンリーディングフレームの５’末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。アミノ酸配列の断片は、例えば、アミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む。アミノ酸配列の断片は、例えば、アミノ酸配列からの少なくとも６個、特に少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、または少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含む。アミノ酸配列の断片は、例えば、アミノ酸配列の最大８個、特に最大１０個、最大１２個、最大１５個、最大２０個、最大３０個または最大５５個の連続するアミノ酸の配列を含む。

【0170】

アミノ酸配列（ペプチドまたはポリペプチド）に関して本明細書で使用される「変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸（例えば、異なるアミノ酸、または同じアミノ酸の改変）によって親アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を意味する。親アミノ酸配列は、天然もしくは野生型（ＷＴ）アミノ酸配列であり得るか、または野生型アミノ酸配列の改変形態であり得る。いくつかの実施形態では、変異体アミノ酸配列は、親アミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸差異、例えば、親と比較して１～約２０個のアミノ酸差異、例えば１～約１０個または１～約５個のアミノ酸差異を有する。

【0171】

本明細書における「野生型」または「ＷＴ」または「天然」とは、対立遺伝子変異を含む、自然界で見出されるアミノ酸配列を意味する。野生型アミノ酸配列、ペプチドまたはポリペプチドは、意図的に改変されていないアミノ酸配列を有する。

【0172】

本開示の目的のために、アミノ酸配列（ペプチドまたはポリペプチド）の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。「変異体」という用語は、全ての突然変異体、スプライス変異体、翻訳後修飾変異体、立体配座変異体、アイソフォーム変異体、対立遺伝子変異体、種変異体、および種ホモログ、特に天然に存在するものを含む。「変異体」という用語は、特にアミノ酸配列の断片を含む。

【0173】

アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列中に１個または２個以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、１個以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、得られた産物の適切なスクリーニングを伴うランダムな挿入も可能である。アミノ酸付加変異体は、１個以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端融合物を含む。アミノ酸欠失変異体は、配列からの１個以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。欠失は、タンパク質の任意の位置にあってよい。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端切断変異体とも呼ばれる。アミノ酸置換変異体は、配列内の少なくとも１個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることを特徴とする。相同なペプチドもしくはペプチド間で保存されていないアミノ酸配列内の位置にある修飾、および／またはアミノ酸を類似の特性を有する他のアミノ酸で置換することが好ましい。いくつかの実施形態では、ペプチドおよびポリペプチド変異体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したアミノ酸または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖が関連するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を含む。天然に存在するアミノ酸は、一般に４つのファミリー：酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）アミノ酸に分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時に芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、以下の群内の置換を含む：
－グリシン、アラニン；
－バリン、イソロイシン、ロイシン；
－アスパラギン酸、グルタミン酸；
－アスパラギン、グルタミン；
－セリン、トレオニン；
－リジン、アルギニン；および
－フェニルアラニン、チロシン。

【0174】

いくつかの実施形態では、所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の同一性などの類似性の程度は、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。いくつかの実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％であるアミノ酸領域について与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００個のアミノ酸からなる場合、類似性または同一性の程度は、例えば、少なくとも約２０個、少なくとも約４０個、少なくとも約６０個、少なくとも約８０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１８０個、または約２００個のアミノ酸、いくつかの実施形態では連続するアミノ酸について与えられる。いくつかの実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長について与えられる。配列同一性などの配列類似性を決定するためのアラインメントは、当技術分野で公知のツールを用いて、例えば最良の配列アラインメントを使用して、例えばＡｌｉｇｎを使用して、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ニードル、マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５を使用して行うことができる。

【0175】

「配列類似性」は、同一であるか、または保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸のパーセンテージを示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。２つの核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるヌクレオチドのパーセンテージを示す。

【0176】

「％同一」および「同一性％」という用語または同様の用語は、特に、比較される配列間の最適なアラインメントにおいて同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指すことが意図されている。前記パーセンテージは純粋に統計的であり、２つの配列間の差は、比較される配列の全長にわたってランダムに分布していてもよいが、必ずしもそうではない。２つの配列の比較は、通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアラインメント後に、セグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して配列を比較することによって行われる。比較のための最適なアラインメントは、手操作によって、またはＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，２４４４の類似性検索アルゴリズムを用いて、もしくは前記アルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）を援用して実施し得る。いくつかの実施形態では、２つの配列の同一性パーセントは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（例えば、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＢＬＡＳＴ＿ＳＰＥＣ＝ｂｌａｓｔ２ｓｅｑ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ａｌｉｇｎ２ｓｅｑ）で入手可能なＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して決定される。いくつかの実施形態では、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＮアルゴリズムに使用されるアルゴリズムパラメータは、以下を含む：（ｉ）１０に設定された期待閾値；（ｉｉ）２８に設定されたワードサイズ；（ｉｉｉ）０に設定されたクエリ範囲内の最大一致；（ｉｖ）１、－２に設定された一致／不一致スコア；（ｖ）線形に設定されたギャップコスト；および（ｖｉ）使用されている低複雑度領域のフィルタ。いくつかの実施形態では、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＰアルゴリズムに使用されるアルゴリズムパラメータは、以下を含む：（ｉ）１０に設定された期待閾値；（ｉｉ）３に設定されたワードサイズ；（ｉｉｉ）０に設定されたクエリ範囲内の最大一致；（ｉｖ）ＢＬＯＳＵＭ６２に設定されたマトリックス；（ｖ）存在：１１、拡張：１に設定されたギャップコスト；および（ｖｉ）条件付き組成スコアマトリックス調整。

【0177】

同一性パーセントは、比較される配列が対応する同一の位置の数を決定し、この数を比較される位置の数（例えば、参照配列中の位置の数）で除し、この結果に１００を乗じることによって得られる。

【0178】

いくつかの実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照配列の全長の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％である領域について与えられる。例えば、参照核酸配列が２００個のヌクレオチドからなる場合、同一性の程度は、少なくとも約１００個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１８０個、または約２００個のヌクレオチド、いくつかの実施形態では連続するヌクレオチドについて与えられる。いくつかの実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照配列の全長について与えられる。

【0179】

相同なアミノ酸配列は、本開示によれば、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８または少なくとも９９％の同一性を示す。

【0180】

本明細書に記載のアミノ酸配列変異体は、例えば組換えＤＮＡ操作により、当業者によって容易に調製され得る。置換、付加、挿入または欠失を有するペプチドまたはポリペプチドを調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ２０１２に詳細に記載されている。さらに、本明細書に記載のペプチド、ポリペプチドおよびアミノ酸変異体は、公知のペプチド合成技術を用いて、例えば固相合成および同様の方法によって容易に調製され得る。

【0181】

いくつかの実施形態では、アミノ酸配列（ペプチドまたはポリペプチド）の断片または変異体は、「機能的断片」または「機能的変異体」である。アミノ酸配列の「機能的断片」または「機能的変異体」という用語は、それが由来するアミノ酸配列のものと同一または類似の１つ以上の機能特性を示す、すなわち機能的に等価である任意の断片または変異体に関する。抗原または抗原配列に関して、１つの特定の機能は、断片または変異体が由来するアミノ酸配列によって示される１つ以上の免疫原性活性である。本明細書で使用される「機能的断片」または「機能的変異体」という用語は、特に、親分子または配列のアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸によって変化しており、それでも親分子または配列の機能の１つ以上を果たす、例えば免疫応答を誘導することができるアミノ酸配列を含む変異体分子または配列を指す。いくつかの実施形態では、親分子または配列のアミノ酸配列の改変は、分子または配列の特徴に有意に影響を及ぼさないかまたは変化させない。異なる実施形態では、機能的断片または機能的変異体の機能は、低減され得るが、依然として有意に存在し得、例えば、機能的断片または機能的変異体の機能は、親分子または配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％であり得る。しかしながら、他の実施形態では、機能的断片または機能的変異体の機能は、親分子または配列と比較して増強され得る。

【0182】

指定されたアミノ酸配列（ペプチドまたはポリペプチド）に「由来する」アミノ酸配列（ペプチドまたはポリペプチド）は、最初のアミノ酸配列の起源を指す。いくつかの実施形態では、特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列またはその断片と同一、本質的に同一または相同であるアミノ酸配列を有する。特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列の変異体またはその断片であり得る。例えば、本明細書での使用に適した抗原は、天然配列の望ましい活性を保持しながら、それらが由来する天然に存在する配列または天然配列とは配列が異なるように改変され得ることが当業者に理解されるであろう。

【0183】

いくつかの実施形態では、「単離された」は、天然の状態から、または製造プロセスからの組成物などの人工組成物から取り出された（例えば精製された）ことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸、ペプチドまたはポリペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸、ペプチドまたはポリペプチドは「単離されて」いる。単離された核酸、ペプチドまたはポリペプチドは、実質的に精製された形態で存在し得るか、または例えば宿主細胞などの非天然環境に存在し得る。

【0184】

「トランスフェクション」という用語は、細胞への核酸、特にＲＮＡの導入に関する。本開示の目的のために、「トランスフェクション」という用語はまた、細胞への核酸の導入またはそのような細胞による核酸の取り込みを含み、細胞は、対象、例えば患者に存在し得るか、または細胞はインビトロ、例えば患者の外部に存在し得る。したがって、本開示によれば、本明細書に記載の核酸のトランスフェクションのための細胞は、インビトロまたはインビボで存在することができ、例えば、細胞は患者の器官、組織および／または身体の一部を形成することができる。本開示によれば、トランスフェクションは一過性または安定であり得る。トランスフェクションのいくつかの用途では、トランスフェクトされた遺伝物質が一過性にのみ発現されれば十分である。ＲＮＡを細胞にトランスフェクトして、そのコードされたタンパク質を一過性に発現させることができる。トランスフェクションの過程で導入された核酸は、通常、核ゲノムに組み込まれないので、外来核酸は有糸分裂によって希釈されるかまたは分解される。核酸のエピソーム増幅を可能にする細胞は、希釈率を大幅に低下させる。トランスフェクトされた核酸が実際に細胞およびその娘細胞のゲノムに残ることが望ましい場合は、安定なトランスフェクションが起こらなければならない。そのような安定なトランスフェクションは、例えば、トランスフェクションのためにウイルスベースの系またはトランスポゾンベースの系を使用することによって達成することができる。一般に、抗原をコードする核酸は、細胞に一過性にトランスフェクトされる。ＲＮＡを細胞にトランスフェクトして、そのコードされたタンパク質を一過性に発現させることができる。

【0185】

本明細書に記載の方法におけるトランスフェクションに有用な細胞には、動物細胞株由来の細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｋ５６２、ＨｅｐＧ２、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＲＡＷ、およびＣ２Ｃ１２細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ、Ｋ５６２、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＲＡＷ、およびＣ２Ｃ１２細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

【0186】

本開示は、ペプチドまたはポリペプチドの類似体を含む。本開示によれば、ペプチドまたはポリペプチドの類似体は、それが由来する前記ペプチドまたはポリペプチドの修飾形態であり、前記ペプチドまたはポリペプチドの少なくとも１つの機能的特性を有する。例えば、ペプチドまたはポリペプチドの薬理学的に活性な類似体は、その類似体が由来するペプチドまたはポリペプチドの薬理学的活性の少なくとも１つを有する。そのような修飾には、任意の化学修飾が含まれ、炭水化物、脂質および／またはペプチドもしくはポリペプチドなどのペプチドまたはポリペプチドに関連する任意の分子の単一または複数の置換、欠失および／または付加が含まれる。いくつかの実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドの「類似体」には、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、パルミトイル化、ミリストイル化、イソプレニル化、脂質化、アルキル化、誘導体化、保護基／ブロッキング基の導入、タンパク質分解切断、または抗体もしくは別の細胞リガンドへの結合から生じる修飾形態が含まれる。「類似体」という用語はまた、前記ペプチドおよびポリペプチドの全ての機能的な化学的等価物に及ぶ。

【0187】

本明細書で使用される場合、「連結された」、「融合された」、または「融合」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、２つ以上の要素または成分またはドメインの結合を指す。

【0188】

本明細書で使用される場合、「内因性」は、生物、細胞、組織もしくは系からの、またはそれらの内部で産生される任意の物質を指す。

【0189】

本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、生物、細胞、組織もしくは系から導入されるか、またはそれらの外部で産生される任意の物質を指す。

【0190】

本明細書で使用される「発現」という用語は、特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義される。

【0191】

本開示の文脈において、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝暗号がＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）に転写されるプロセスに関する。その後、ＲＮＡはペプチドまたはポリペプチドに翻訳され得る。

【0192】

ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、ｍＲＮＡの鎖が、ペプチドまたはポリペプチドを作製するようにアミノ酸の配列のアセンブリを指示する、細胞のリボソームにおけるプロセスに関する。

【0193】

本明細書に記載される特定の化合物のプロドラッグは、個体への投与時に生理学的条件下で化学変換を受けて特定の化合物を提供する化合物である。さらに、プロドラッグは、エクスビボ環境で化学的または生化学的方法によって特定の化合物に変換され得る。例えば、プロドラッグは、例えば、適切な酵素または化学試薬と共に経皮パッチリザーバに入れた場合、特定の化合物にゆっくり変換され得る。例示的なプロドラッグは、インビボで加水分解可能なエステル（特定の化合物に含まれるアルコールもしくはカルボキシ基を使用する）またはアミド（特定の化合物に含まれるアミノもしくはカルボキシ基を使用する）である。具体的には、特定の化合物に含まれ、少なくとも１つの水素原子を担持する任意のアミノ基をプロドラッグ形態に変換することができる。典型的なＮ－プロドラッグ形態には、カルバメート、マンニッヒ塩基、エナミン、およびエナミノンが含まれる。

【0194】

本明細書では、化合物の構造式は、前記化合物のある特定の異性体を表し得る。しかしながら、本発明は、構造的に生じる幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体などの全ての異性体および異性体混合物を含み、式の記述に限定されないことを理解されたい。

【0195】

「異性体」は、同じ分子式を有するが、構造が異なる化合物（「構造異性体」）、または官能基および／もしくは原子の幾何学的（空間的）配置が異なる化合物（「立体異性体」）である。「鏡像異性体」は、重ね合わせることができない互いの鏡像である一対の立体異性体である。「ラセミ混合物」または「ラセミ化合物」は、一対の等量の鏡像異性体を含み、接頭辞（±）によって示される。「ジアステレオマ」は、重ね合わせることができず、互いの鏡像ではない立体異性体である。「互変異性体」は、純粋であっても、個々の原子または原子群の移動のために、自発的かつ可逆的に相互変換する同じ化学物質の構造異性体である；すなわち、互変異性体は互いに動的化学平衡状態にある。互変異性体の一例は、ケト－エノール互変異性の異性体である。「コンフォーマ」は、形式上単結合の周りの回転だけで相互変換することができる立体異性体であり、特に、シクロヘキサンのいす形、半いす形、舟形、およびねじれ舟形などの異なる三次元形態の（複素）環式環をもたらすものを含む。

【0196】

「平均直径」という用語は、いわゆるキュムラントアルゴリズムを使用したデータ分析を伴う動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される粒子の平均流体力学的直径を指し、これは、結果として、長さの次元を有するいわゆるＺ_平均、および無次元である多分散指数（ＰＤＩ）を提供する（Ｋｏｐｐｅｌ，Ｄ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．５７，１９７２，ｐｐ ４８１４－４８２０，ＩＳＯ １３３２１）。ここで、粒子の「平均直径」、「直径」または「サイズ」は、このＺ_平均の値と同義で使用される。

【0197】

いくつかの実施形態では、「多分散指数」は、「平均直径」の定義で言及されているように、いわゆるキュムラント解析による動的光散乱測定に基づいて計算され得る。特定の前提条件下では、これは、ナノ粒子の集合体のサイズ分布の尺度と見なすことができる。

【0198】

回転軸を中心とした粒子の「回転半径」（本明細書ではＲ_ｇと略す）は、粒子の質量全体が集中していると仮定した場合に、所与の軸を中心としたその慣性モーメントがその実際の質量分布と同じになる点の回転軸からの半径方向距離である。数学的には、Ｒ_ｇは、その質量中心または所与の軸のいずれかからの粒子の成分の二乗平均平方根距離である。例えば、質量中心から固定距離ｓ_ｉに位置する質量ｍ_ｉ（ｉ＝１、２、３、．．．、ｎ）のｎ個の質量要素から構成される高分子の場合、Ｒ_ｇは全ての質量要素にわたるｓ_ｉ ^２の質量平均の平方根であり、以下のように計算することができる：

【0199】

【数2】

【0200】

回転半径は、例えば光散乱を使用することによって実験的に決定するまたは計算することができる。特に、小さな散乱ベクトル

【0201】

【数3】

【0202】

の場合、構造関数Ｓは以下のように定義され：

【0203】

【数4】

【0204】

式中、Ｎは成分の数である（ギニエの法則）。

【0205】

粒子の「流体力学的半径」（「ストークス半径」または「ストークス－アインシュタイン半径」と呼ばれることもある）は、前記粒子と同じ速度で拡散する仮想の剛体球の半径である。流体力学的半径は、サイズだけでなく溶媒効果も考慮して、粒子の移動度に関連する。例えば、水和がより強いより小さい荷電粒子は、水和がより弱いより大きい荷電粒子よりも大きい流体力学的半径を有し得る。これは、より小さい粒子が溶液を通って移動するにつれて、より多くの水分子を引きずるためである。溶媒中の粒子の実際の寸法は直接測定できないので、流体力学的半径はストークス－アインシュタイン方程式：

【0206】

【数5】

【0207】

によって定義され得、式中、ｋ_Ｂはボルツマン定数であり、Ｔは温度であり、ηは溶媒の粘度であり、Ｄは拡散係数である。拡散係数は、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用することによって実験的に決定することができる。したがって、粒子または粒子集団の流体力学的半径（例えば、本明細書に開示される試料もしくは対照組成物に含まれる粒子の流体力学的半径、またはそのような試料もしくは対照組成物をフィールドフローフラクショネーションに供することから得られる粒子ピークの流体力学的半径）を決定するための１つの手順は、前記粒子または粒子集団のＤＬＳシグナル（例えば、本明細書に開示される試料もしくは対照組成物に含まれる粒子のＤＬＳシグナル、またはそのような試料もしくは対照組成物をフィールドフローフラクショネーションに供することから得られる粒子ピークのＤＬＳシグナル）を測定することである。

【0208】

本明細書で使用される「光散乱」という表現は、光が通過する媒体内の局所的な不均一性のために、光が１つ以上の経路だけ直線軌道から逸脱することを余儀なくされる物理的プロセスを指す。

【0209】

「ＵＶ」という用語は紫外線を意味し、１０ｎｍ～４００ｎｍの波長、すなわち可視光の波長よりも短いがＸ線よりも長い波長を有する電磁スペクトルの帯域を示す。

【0210】

本明細書で使用される「多角度光散乱」または「ＭＡＬＳ」という表現は、試料によって複数の角度に散乱された光を測定するための技術に関する。「多角度」とは、これに関して、散乱光が、例えば、選択された特定の角度を含む範囲にわたって移動する単一の検出器、または特定の角度位置に固定された検出器のアレイによって測定されるように、異なる離散角度で検出され得ることを意味する。特定の実施形態では、ＭＡＬＳで使用される光源は、レーザー源（ＭＡＬＬＳ：多角度レーザー光散乱）である。粒子を含む組成物のＭＡＬＳシグナルに基づき、適切な形式（例えば、Ｚｉｍｍプロット、Ｂｅｒｒｙプロット、またはＤｅｂｙｅプロット）を使用することによって、回転半径（Ｒ_ｇ）、したがって前記粒子のサイズを決定することが可能である。好ましくは、Ｚｉｍｍプロットは、以下の式：

【0211】

【数6】

【0212】

を使用したグラフ表示であり、式中、ｃは溶媒中の粒子の質量濃度（ｇ／ｍＬ）であり、Ａ_２は第２のビリアル係数（ｍｏｌ・ｍＬ／ｇ^２）であり、Ｐ（θ）は散乱光強度の角度依存性に関するフォームファクタであり、Ｒ_θは過剰レイリー比（ｃｍ^－１）であり、Ｋ^＊は４π^２η_ｏ（ｄｎ／ｄｃ）^２λ_０ ^－４Ｎ_Ａ ^－１に等しい光学定数であり、ここで、η_ｏは入射放射（真空）波長での溶媒の屈折率であり、λ_０は入射放射（真空）波長（ｎｍ）であり、Ｎ_Ａはアボガドロ数（ｍｏｌ^－１）であり、ｄｎ／ｄｃは示差屈折率増分値（ｍＬ／ｇ）である（例えば、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２２（２００１），４１１８－４１２８）；Ｂ．Ｈ．Ｚｉｍｍ（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１３（１９４５），１４１；Ｐ．Ｄｅｂｙｅ（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．１５（１９４４）：３３８；およびＷ．Ｂｕｒｃｈａｒｄ（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５（２００３），４２７９－４２９１参照）。好ましくは、Ｂｅｒｒｙプロットは、以下の項：

【0213】

【数7】

【0214】

で計算され、式中、ｃ、Ｒ_θおよびＫ^＊は上で定義した通りである。好ましくは、Ｄｅｂｙｅプロットは、以下の項：

【0215】

【数8】

【0216】

で計算され、式中、ｃ、Ｒ_θおよびＫ^＊は上で定義した通りである。

【0217】

本明細書で使用される「動的光散乱」または「ＤＬＳ」という表現は、特に粒子の流体力学的半径に関して、粒子のサイズおよびサイズ分布プロファイルを決定する技術を指す。単色光源、通常はレーザーが、偏光子を通して試料に入射する。次いで、散乱光は第２の偏光子を通過し、そこで検出され、得られた画像がスクリーンに投影される。溶液中の粒子は光に当たり、光を全方向に回折させる。粒子からの回折光は、建設的に（明るい領域）または破壊的に（暗い領域）干渉することができる。このプロセスは短い時間間隔で繰り返され、得られたスペックルパターンのセットは、各スポットにおける光の強度を経時的に比較する自己相関器によって分析される。

【0218】

本明細書で使用される「静的光散乱」または「ＳＬＳ」という表現は、特に粒子の回転半径、および／または粒子のモル質量に関して、粒子のサイズおよびサイズ分布プロファイルを決定する技術を指す。高強度単色光、通常はレーザーが、粒子を含有する溶液中で発射される。１つ以上の角度で散乱強度を測定するために、１つ以上の検出器が使用される。角度依存性は、半径の全ての高分子のモル質量とサイズの両方の正確な測定値を得るために必要である。したがって、多角度光散乱（ＭＡＬＳ）または多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）として公知の、入射光の方向に対するいくつかの角度での同時測定は、一般に、静的光散乱の標準的な実施態様と見なされる。

【0219】

核酸
「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、それらの組合せ、およびそれらの修飾形態を含む。この用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産された分子、および化学的に合成された分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡとＲＮＡとの混合物である。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡである。核酸は、一本鎖または二本鎖および直鎖状または共有結合閉環分子として存在し得る。核酸は単離することができる。「単離された核酸」という用語は、本開示によれば、核酸が、（ｉ）例えばＤＮＡについてはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、もしくはＲＮＡについてはインビトロ転写（例えばＲＮＡポリメラーゼを使用して）によって、インビトロで増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル電気泳動による分離によって精製された、または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。

【0220】

「ヌクレオシド」（本明細書では「Ｎ」と略す）という用語は、リン酸基を有さないヌクレオチドと考えることができる化合物に関する。ヌクレオシドは糖（例えばリボースまたはデオキシリボース）に結合した核酸塩基であるが、ヌクレオチドはヌクレオシドと１つ以上のリン酸基から構成される。ヌクレオシドの例としては、シチジン、ウリジン、プソイドウリジン、アデノシン、およびグアノシンが挙げられる。

【0221】

通常天然に存在する核酸を構成する５つの標準的なヌクレオシドは、ウリジン、アデノシン、チミジン、シチジンおよびグアノシンである。５つのヌクレオシドは、一般に、それぞれその１文字コードＵ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧと略される。ただし、チミジンは、ウリジンに見出されるリボフラノース環ではなく２’－デオキシリボフラノース部分を含むので、より一般的には「ｄＴ」（「ｄ」は「デオキシ」を表す）と表記される。これは、チミジンがリボ核酸（ＲＮＡ）ではなくデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に見出されるためである。逆に、ウリジンはＤＮＡではなくＲＮＡに見出される。残りの３つのヌクレオシドは、ＲＮＡとＤＮＡの両方に見出され得る。ＲＮＡでは、それらはＡ、ＣおよびＧとして表され、ＤＮＡでは、ｄＡ、ｄＣおよびｄＧとして表される。

【0222】

修飾されたプリン（ＡもしくはＧ）またはピリミジン（Ｃ、Ｔ、もしくはＵ）塩基部分は、好ましくは１つ以上のアルキル基、より好ましくは１つ以上のＣ_１－４アルキル基、さらにより好ましくは１つ以上のメチル基によって修飾されている。修飾されたプリンまたはピリミジン塩基部分の特定の例としては、Ｎ^７－アルキル－グアニン、Ｎ^６－アルキル－アデニン、５－アルキル－シトシン、５－アルキル－ウラシル、およびＮ（１）－アルキル－ウラシル、例えばＮ^７－Ｃ_１－４アルキル－グアニン、Ｎ^６－Ｃ_１－４アルキル－アデニン、５－Ｃ_１－４アルキル－シトシン、５－Ｃ_１－４アルキル－ウラシル、およびＮ（１）－Ｃ_１－４アルキル－ウラシル、好ましくはＮ^７－メチル－グアニン、Ｎ^６－メチル－アデニン、５－メチル－シトシン、５－メチル－ウラシル、およびＮ（１）－メチル－ウラシルが挙げられる。

【0223】

本明細書では、「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施形態では、ＤＮＡは、デオキシリボヌクレオチド残基の全部または大部分を含む。本明細書で使用される場合、「デオキシリボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を欠くヌクレオチドを指す。ＤＮＡは、限定されないが、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、部分的に精製されたＤＮＡなどの単離されたＤＮＡ、本質的に純粋なＤＮＡ、合成ＤＮＡ、組換え生産されたＤＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＤＮＡとは異なる修飾ＤＮＡを包含する。そのような改変は、内部ＤＮＡヌクレオチドまたはＤＮＡの末端（一方もしくは両方）への非ヌクレオチド物質の付加を指し得る。本明細書では、ＤＮＡ中のヌクレオチドは、化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドであり得ることも企図される。本開示では、これらの改変されたＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡの類似体と見なされる。分子中のデオキシリボヌクレオチド残基の含有量が、分子中のヌクレオチド残基の総数に基づいて５０％（例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）を超える場合、分子は「デオキシリボヌクレオチド残基の大部分」を含む。分子中のヌクレオチド残基の総数は、全てのヌクレオチド残基（ヌクレオチド残基が標準的（すなわち天然に存在する）ヌクレオチド残基であるかその類似体であるかに関わらず）の合計である。

【0224】

ＤＮＡは組換えＤＮＡであり得、核酸、特にｃＤＮＡのクローニングによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。

【0225】

「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施形態では、ＲＮＡは、リボヌクレオチド残基の全部または大部分を含む。本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを指す。ＲＮＡは、限定されないが、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生産されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡを包含する。そのような改変は、内部ＲＮＡヌクレオチドまたはＲＮＡの末端（一方もしくは両方）への非ヌクレオチド物質の付加を指し得る。本明細書では、ＲＮＡ中のヌクレオチドは、化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドであり得ることも企図される。本開示では、これらの改変／修飾ヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドの類似体と呼ぶことができ、そのような改変／修飾ヌクレオチドを含む対応するＲＮＡ（すなわち改変／修飾ＲＮＡ）は、天然に存在するＲＮＡの類似体と呼ぶことができる。分子中のリボヌクレオチド残基の含有量が、分子中のヌクレオチド残基の総数に基づいて５０％（例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）を超える場合、分子は「リボヌクレオチド残基の大部分」を含む。分子中のヌクレオチド残基の総数は、全てのヌクレオチド残基（ヌクレオチド残基が標準的（すなわち天然に存在する）ヌクレオチド残基であるかその類似体であるかに関わらず）の合計である。

【0226】

「ＲＮＡ」には、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ、阻害性ＲＮＡ（例えば、アンチセンスｓｓＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）、活性化ＲＮＡ（例えば低分子活性化ＲＮＡ）および免疫刺激性ＲＮＡ（ｉｓＲＮＡ）が含まれる。いくつかの実施形態では、「ＲＮＡ」はｍＲＮＡを指す。

【0227】

本明細書で使用される「インビトロ転写」または「ＩＶＴ」という用語は、転写（すなわちＲＮＡの生成）が無細胞的に行われることを意味する。すなわち、ＩＶＴは、生存／培養細胞を使用するのではなく、細胞から抽出された転写機構（例えば、細胞溶解物またはＲＮＡポリメラーゼ（好ましくはＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６ポリメラーゼ）を含むその単離された成分）を使用する。

【0228】

ｍＲＮＡ
本開示によれば、「ｍＲＮＡ」という用語は「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を使用することによって生成され得、ペプチドまたはポリペプチドをコードし得る「転写物」に関する。典型的には、ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、ペプチド／ポリペプチドコード領域、および３’ＵＴＲを含む。本開示の文脈において、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写（ＩＶＴ）によって生成され得る。上記のように、インビトロ転写の方法は当業者に公知であり、様々なインビトロ転写キットが市販されている。

【0229】

ｍＲＮＡは一本鎖であるが、ｍＲＮＡの一部が折りたたまれ、それ自体と対合して二重らせんを形成することを可能にする自己相補的配列を含み得る。

【0230】

本開示によれば、「ｄｓＲＮＡ」は二本鎖ＲＮＡを意味し、２つの部分的または完全に相補的な鎖を有するＲＮＡである。

【0231】

本開示の好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは、ペプチドまたはポリペプチドをコードするＲＮＡ転写物に関する。

【0232】

いくつかの実施形態では、好ましくはペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、少なくとも４５ヌクレオチド（例えば、少なくとも６０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１，０００、少なくとも１，５００、少なくとも２，０００、少なくとも２，５００、少なくとも３，０００、少なくとも３，５００、少なくとも４，０００、少なくとも４，５００、少なくとも５，０００、少なくとも６，０００、少なくとも７，０００、少なくとも８，０００、少なくとも９，０００ヌクレオチド）、好ましくは最大１５，０００、例えば最大１４，０００、最大１３，０００、最大１２，０００ヌクレオチド、最大１１，０００ヌクレオチドまたは最大１０，０００ヌクレオチドの長さを有する。

【0233】

当技術分野で確立されているように、ｍＲＮＡは一般に、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、ペプチド／ポリペプチドコード領域および３’非翻訳領域（３’－ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、インビトロ転写または化学合成によって生成される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を使用したインビトロ転写によって生成される。インビトロ転写の方法は当業者に公知である；例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：４^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ２０１２参照。さらに、様々なインビトロ転写キットが、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ（商標）Ｔ７キット、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７キット、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ（登録商標）など）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．（ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７キット、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキットなど）、Ｐｒｏｍｅｇａ（ＲｉｂｏＭＡＸ（商標）、ＨｅＬａＳｃｒｉｂｅ（登録商標）、Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ（登録商標）システムなど）、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＳＰ６またはＴ７転写キットなど）、およびＥｐｉｃｅｎｔｒｅ（ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ（商標）など）から市販されている。修飾されたｍＲＮＡを提供するために、対応して修飾されたヌクレオチド、例えば修飾された天然に存在するヌクレオチド、非天然に存在するヌクレオチドおよび／または修飾された非天然に存在するヌクレオチドを合成（好ましくはインビトロ転写）中に組み込むことができ、または転写後にｍＲＮＡ中で修飾を行うおよび／またはｍＲＮＡに修飾を付加することができる。

【0234】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはインビトロ転写ｍＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモータは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモータであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの特定の例は、Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、インビトロ転写は、Ｔ７またはＳＰ６プロモータによって制御される。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。

【0235】

本開示のいくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、「レプリコンｍＲＮＡ」または単に「レプリコン」、特に「自己複製ｍＲＮＡ」または「自己増幅ｍＲＮＡ」である。特定の実施形態では、レプリコンまたは自己複製ｍＲＮＡは、ｓｓＲＮＡウイルス、特にアルファウイルスなどのプラス鎖ｓｓＲＮＡウイルスに由来するか、またはそれに由来する要素を含む。アルファウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスの典型的な代表例である。アルファウイルスは、感染細胞の細胞質で複製する（アルファウイルスの生活環の総説については、Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，ｖｏｌ．４，ｐｐ．８３７－８５６参照）。多くのアルファウイルスの総ゲノム長は、典型的には１１，０００～１２，０００ヌクレオチドの範囲であり、ゲノムＲＮＡは、典型的には５’キャップおよび３’ポリ（Ａ）尾部を有する。アルファウイルスのゲノムは、非構造タンパク質（ウイルスＲＮＡの転写、修飾および複製ならびにタンパク質修飾に関与する）および構造タンパク質（ウイルス粒子を形成する）をコードする。典型的には、ゲノム内に２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する。４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１～ｎｓＰ４）は、典型的にはゲノムの５’末端付近から始まる第１のＯＲＦによって一緒にコードされ、一方アルファウイルスの構造タンパク質は、第１のＯＲＦの下流に見出され、ゲノムの３’末端付近に延びる第２のＯＲＦによって一緒にコードされる。典型的には、第１のＯＲＦは第２のＯＲＦよりも大きく、その比率はおよそ２：１である。アルファウイルスに感染した細胞では、非構造タンパク質をコードする核酸配列のみがゲノムＲＮＡから翻訳され、一方構造タンパク質をコードする遺伝情報は、真核生物のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ；Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．１１１－１２４）に類似したＲＮＡ分子であるサブゲノム転写物から翻訳可能である。感染後、すなわちウイルス生活環の初期段階に、（＋）鎖ゲノムＲＮＡは、非構造ポリタンパク質（ｎｓＰ１２３４）をコードするオープンリーディングフレームの翻訳のためにメッセンジャーＲＮＡのように直接作用する。アルファウイルス由来のベクターは、外来遺伝情報を標的細胞または標的生物に送達するために提案されている。単純なアプローチでは、アルファウイルス構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームに置き換える。アルファウイルスに基づくトランス複製系は、２つの別個の核酸分子上のアルファウイルスヌクレオチド配列要素に依存する：一方の核酸分子はウイルスレプリカーゼをコードし、他方の核酸分子はトランスで前記レプリカーゼによって複製され得る（したがってトランス複製系という名称）。トランス複製は、所与の宿主細胞内にこれらの両方の核酸分子が存在することを必要とする。トランスでレプリカーゼによって複製され得る核酸分子は、アルファウイルスレプリカーゼによる認識およびＲＮＡ合成を可能にする特定のアルファウイルス配列要素を含まなければならない。

【0236】

本開示のいくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、例えば、その安定性を高め、および／または翻訳効率を高め、および／または免疫原性を低下させ、および／または細胞傷害性を低下させるために、１つ以上の修飾を含む。例えば、ｍＲＮＡの発現を増加させるために、ｍＲＮＡを、好ましくは発現されるペプチドまたはポリペプチドの配列を変化させることなく、コード領域、すなわち発現されるペプチドまたはポリペプチドをコードする配列内で修飾し得る。そのような修飾は、例えば、国際公開第２００７／０３６３６６号およびＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５６５０２号に記載されており、以下を含む：５’キャップ構造；天然に存在するポリ（Ａ）尾部の伸長もしくは切断；５’および／もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の改変、例えば前記ＲＮＡのコード領域に関連しないＵＴＲの導入；１つ以上の天然に存在するヌクレオチドの合成ヌクレオチドによる置換；ならびにコドン最適化（例えば、ＲＮＡのＧＣ含有量を変化させるため、好ましくは増加させるため）。

【0237】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、キャップされていない５’－三リン酸を有さない。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、従来の５’キャップおよび／または５’キャップ類似体を含み得る。「従来の５’キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に見出されるキャップ構造を指し、一般に、その三リン酸部分を介してｍＲＮＡの次のヌクレオチドの５’末端に連結されているグアノシン５’－三リン酸（Ｇｐｐｐ）からなる（すなわち、グアノシンは５’－５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡの残りの部分に連結されている）。グアノシンは、Ｎ^７位でメチル化され得る（キャップ構造ｍ^７Ｇｐｐｐをもたらす）。「５’キャップ類似体」という用語は、従来の５’キャップに基づくが、５’キャップ類似体の逆向きの組み込みを回避するためにｍ^７グアノシン構造の２’位または３’位のいずれかで修飾されている５’キャップを含む（そのような５’キャップ類似体はアンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）とも呼ばれる）。特に好ましい５’キャップ類似体は、ＰＣＴ／ＥＰ第２０１９／０５６５０２号に記載されているように、リン酸架橋中の架橋酸素および非架橋酸素に１つ以上の置換を有するもの、例えばβ－リン酸におけるホスホロチオエート修飾５’キャップ類似体（例えば、ｍ_２ ^{７，２’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ（β－Ｓ－ＡＲＣＡまたはβ－Ｓ－ＡＲＣＡと呼ばれる））である。例えば、本明細書に記載の５’キャップ構造を有するｍＲＮＡを提供することは、対応する５’キャップ化合物の存在下でのＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって達成され得、前記５’キャップ構造は、生成されたｍＲＮＡ鎖に共転写的に組み込まれるか、またはｍＲＮＡは、例えばインビトロ転写によって生成され得、５’キャップ構造は、キャッピング酵素、例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して転写後にｍＲＮＡに結合され得る。

【0238】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍ_２ ^{７，２’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐＳｐ（５’）Ｇ（特にそのＤ１ジアステレオマ）、ｍ_２ ^{７，３’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、およびｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧからなる群より選択される５’キャップ構造を含む。

【0239】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、キャップ０、キャップ１、またはキャップ２、好ましくはキャップ１またはキャップ２を含む。本開示によれば、「キャップ０」という用語は、構造「ｍ^７ＧｐｐｐＮ」を意味し、Ｎは、２’位にＯＨ部分を担持する任意のヌクレオシドである。本開示によれば、「キャップ１」という用語は、構造「ｍ^７ＧｐｐｐＮｍ」を意味し、Ｎｍは、２’位にＯＣＨ_３部分を担持する任意のヌクレオシドである。本開示によれば、「キャップ２」という用語は、構造「ｍ^７ＧｐｐｐＮｍＮｍ」を意味し、各Ｎｍは、独立して、２’位にＯＣＨ_３部分を担持する任意のヌクレオシドである。

【0240】

ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（β－Ｓ－ＡＲＣＡ）のＤ１ジアステレオマは、以下の構造：

【0241】

【化1】

【0242】

を有する。

【0243】

「ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマ」または「ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）」は、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマ（ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２））と比較して、ＨＰＬＣカラムで最初に溶出し、したがってより短い保持時間を示すベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのジアステレオマである。ＨＰＬＣは、好ましくは分析ＨＰＬＣである。いくつかの実施形態では、好ましくは５μｍ、４．６×２５０ｍｍの形式のＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ－１８－Ｔ ＲＰカラムを分離に使用し、それにより１．３ｍｌ／分の流量を適用することができる。いくつかの実施形態では、酢酸アンモニウム中のメタノールの勾配、例えば１５分以内で０．０５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝５．９中のメタノールの０～２５％直線勾配を使用する。ＵＶ検出（ＶＷＤ）は２６０ｎｍで実施することができ、蛍光検出（ＦＬＤ）は２８０ｎｍでの励起および３３７ｎｍでの検出で実施することができる。

【0244】

キャップ１のビルディングブロックである５’キャップ類似体ｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧ（ｍ_２ ^{７，３’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ^２’－ＯＡｐＧとも呼ばれる）は、以下の構造：

【0245】

【化2】

【0246】

を有する。

【0247】

β－Ｓ－ＡＲＣＡおよびｍＲＮＡを含む例示的なキャップ０ｍＲＮＡは、以下の構造：

【0248】

【化3】

【0249】

を有する。

【0250】

ｍ_２ ^{７，３’Ｏ}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧおよびｍＲＮＡを含む例示的なキャップ０ｍＲＮＡは、以下の構造：

【0251】

【化4】

【0252】

を有する。

【0253】

ｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧおよびｍＲＮＡを含む例示的なキャップ１ｍＲＮＡは、以下の構造：

【0254】

【化5】

【0255】

を有する。

【0256】

本発明で使用される場合、「ポリＡ尾部」または「ポリＡ配列」という用語は、典型的にはｍＲＮＡ分子の３’末端に位置するアデニル酸残基の連続的または断続的な配列を指す。ポリＡ尾部またはポリＡ配列は当業者に公知であり、本明細書に記載のｍＲＮＡの３’－ＵＴＲに後続し得る。連続的なポリＡ尾部は、連続するアデニル酸残基を特徴とする。自然界では、連続的なポリＡ尾部が典型的である。本明細書に開示されるｍＲＮＡは、転写後に鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼによってｍＲＮＡの遊離３’末端に結合したポリＡ尾部、またはＤＮＡによってコードされ、鋳型依存性ＲＮＡポリメラーゼによって転写されたポリＡ尾部を有し得る。

【0257】

約１２０個のＡヌクレオチドのポリＡ尾部は、トランスフェクトされた真核細胞中のｍＲＮＡのレベル、およびポリＡ尾部の上流（５’側）に存在するオープンリーディングフレームから翻訳されるタンパク質のレベルに有益な影響を及ぼすことが実証されている（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９－４０１７）。

【0258】

ポリＡ尾部は任意の長さであり得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのＡヌクレオチド、特に約１２０個のＡヌクレオチドを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。この文脈において、「から本質的になる」は、ポリＡ尾部のほとんどのヌクレオチド、典型的にはポリＡ尾部のヌクレオチド数の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％がＡヌクレオチドであるが、残りのヌクレオチドがＡヌクレオチド以外のヌクレオチド、例えばＵヌクレオチド（ウリジル酸）、Ｇヌクレオチド（グアニル酸）、またはＣヌクレオチド（シチジル酸）であることを許容することを意味する。この文脈において、「からなる」は、ポリＡ尾部の全てのヌクレオチド、すなわちポリＡ尾部のヌクレオチド数の１００％がＡヌクレオチドであることを意味する。「Ａヌクレオチド」または「Ａ」という用語は、アデニル酸を指す。

【0259】

いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、コード鎖に相補的な鎖内に反復ｄＴヌクレオチド（デオキシチミジル酸）を含むＤＮＡ鋳型に基づいて、ＲＮＡ転写中、例えばインビトロ転写ＲＮＡの調製中に結合される。ポリＡ尾部をコードするＤＮＡ配列（コード鎖）は、ポリ（Ａ）カセットと呼ばれる。

【0260】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡのコード鎖に存在するポリ（Ａ）カセットは、本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴ）のランダムな配列によって中断されている。そのようなランダムな配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチドの長さであり得る。そのようなカセットは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／００５３２４Ａ１号に開示されている。国際公開第２０１６／００５３２４Ａ１号に開示されている任意のポリ（Ａ）カセットを本開示において使用し得る。本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）が均等に分布し、例えば５～５０ヌクレオチドの長さを有するランダムな配列によって中断されているポリ（Ａ）カセットは、ＤＮＡレベルでは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミドＤＮＡの持続的な増殖を示し、ＲＮＡレベルでは、ＲＮＡの安定性および翻訳効率の支持に関する有益な特性と依然として関連している。結果として、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ分子に含まれるポリＡ尾部は、本質的にＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）のランダムな配列によって中断されている。そのようなランダムな配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチドの長さであり得る。

【0261】

いくつかの実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドは、その３’末端でポリＡ尾部に隣接しておらず、すなわち、ポリＡ尾部はその３’末端でＡ以外のヌクレオチドによってマスクされていないか、または後続されていない。

【0262】

いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、本質的に、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、配列番号８に示されるポリＡ尾部を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は少なくとも１００個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は約１５０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は約１２０個のヌクレオチドを含む。

【0263】

いくつかの実施形態では、本開示において使用されるｍＲＮＡは、５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲを含む。「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」という用語は、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されないＤＮＡ分子内の領域、またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子内の対応する領域に関する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンリーディングフレームの５’側（上流）（５’－ＵＴＲ）および／またはオープンリーディングフレームの３’側（下流）（３’－ＵＴＲ）に存在し得る。５’－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の開始コドンの上流の５’末端に位置する。５’－ＵＴＲは５’キャップ（存在する場合）の下流にあり、例えば５’キャップに直接隣接している。３’－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の終止コドンの下流の３’末端に位置するが、「３’－ＵＴＲ」という用語は、一般にポリ（Ａ）配列を含まない。したがって、３’－ＵＴＲはポリＡ配列（存在する場合）の上流にあり、例えばポリＡ配列に直接隣接している。ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）分子の３’非翻訳領域への３’ＵＴＲの組み込みは、翻訳効率の向上をもたらし得る。そのような３’ＵＴＲの２つ以上を組み込むことによって（好ましくは頭－尾の向きに配置される；例えば、Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０８，４００９－４０１７（２００６）参照）、相乗作用が達成され得る。３’ＵＴＲは、それらが導入されるＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）に対して自己または異種であり得る。特定の実施形態では、３’－ＵＴＲは、グロビン遺伝子またはｍＲＮＡ、例えばα２－グロビン、α１－グロビン、またはβ－グロビン、例えばβ－グロビン、例えばヒトβ－グロビンの遺伝子またはｍＲＮＡに由来する。例えば、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）は、既存の３’－ＵＴＲを、グロビン遺伝子、例えばα２－グロビン、α１－グロビン、β－グロビン、例えばβ－グロビン、例えばヒトβ－グロビンに由来する１コピー以上、例えば２コピーの３’－ＵＴＲで置き換えるまたはそれを挿入することによって修飾され得る。

【0264】

特に好ましい５’－ＵＴＲは、配列番号６のヌクレオチド配列を含む。特に好ましい３’－ＵＴＲは、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。

【0265】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、配列番号６のヌクレオチド配列、または配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’－ＵＴＲを含む。

【0266】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、配列番号７のヌクレオチド配列、または配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’－ＵＴＲを含む。

【0267】

ｍＲＮＡは、その安定性を高め、および／または免疫原性を低下させ、および／または細胞傷害性を低下させるために、修飾リボヌクレオチドを有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ中のウリジンは、修飾されたヌクレオシドによって置き換えられる（部分的または完全に、好ましくは完全に）。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは修飾ウリジンである。

【0268】

いくつかの実施形態では、ウリジンを置換する修飾ウリジンは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）、５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）、およびそれらの組合せからなる群より選択される。

【0269】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ中のウリジンを置換する（部分的または完全に、好ましくは完全に）修飾ヌクレオシドは、３－メチルウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－アザウリジン、６－アザウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、４－チオプソイドウリジン、２－チオプソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５－アミノアリルウリジン、５－ハロウリジン（例えば５－ヨードウリジンもしくは５－ブロモウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチルウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１－カルボキシメチルプソイドウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチルウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１－エチルプソイドウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－プロピニルウリジン、１－プロピニルプソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン（τｍ５Ｕ）、１－タウリノメチルプソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオプソイドウリジン）、５－メチル－２－チオウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１－メチル－４－チオプソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４－チオ－１－メチルプソイドウリジン、３－メチルプソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２－チオ－１－メチルプソイドウリジン、１－メチル－１－デアザプソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザプソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチルジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２－チオジヒドロウリジン、２－チオジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオウリジン、４－メトキシプソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオプソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α－チオウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチルプソイドウリジン（Ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１－チオウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジン、または当技術分野で公知の任意の他の修飾ウリジンのいずれか１つ以上であり得る。

【0270】

プソイドウリジン（ウリジンを部分的または完全に、好ましくは完全に置換する）によって修飾されたＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、本明細書では「Ψ修飾された」と呼ばれ、「ｍ１Ψ修飾された」という用語は、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）がＮ（１）－メチルプソイドウリジン（ウリジンを部分的または完全に、好ましくは完全に置換する）を含むことを意味する。さらに、「ｍ５Ｕ修飾された」という用語は、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）が５－メチルウリジン（ウリジンを部分的または完全に、好ましくは完全に置換する）を含むことを意味する。そのようなΨ－またはｍ１Ψ－またはｍ５Ｕ修飾されたＲＮＡは、通常、それらの非修飾形態と比較して低下した免疫原性を示し、したがって、免疫応答の誘導を回避または最小化すべき用途において好ましい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、ウリジンを完全に置換するＮ（１）－メチルプソイドウリジンを含有する。

【0271】

本開示で使用されるｍＲＮＡのコドンは、例えば、ＲＮＡのＧＣ含有量を増加させるため、および／または目的のペプチドもしくはポリペプチドが発現されるべき細胞（もしくは対象）においてまれなコドンを、前記細胞（もしくは対象）において同義の頻度の高いコドンであるコドンによって置換するために、さらに最適化され得る。いくつかの実施形態では、本開示で使用されるｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列は、コドン最適化されたコード配列および／またはそのＧ／Ｃ含有量が野生型コード配列と比較して増加しているコード配列によってコードされる。これはまた、コード配列の１つ以上の配列領域が、野生型コード配列の対応する配列領域と比較して、コドン最適化されているおよび／またはＧ／Ｃ含有量が増加している実施形態を含む。いくつかの実施形態では、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含有量の増加は、好ましくはコードされるアミノ酸配列の配列を変化させない。

【0272】

「コドン最適化された」という用語は、好ましくは核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を改変することなく、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映するための核酸分子のコード領域中のコドンの改変を指す。本開示の文脈内で、コード領域は、本明細書に記載のｍＲＮＡを使用して治療される対象における最適な発現のためにコドン最適化され得る。コドン最適化は、翻訳効率が、細胞におけるｔＲＮＡの出現の異なる頻度によっても決定されるという所見に基づく。したがって、ｍＲＮＡの配列は、頻繁に生じるｔＲＮＡが利用可能であるコドンが「まれなコドン」の代わりに挿入されるように改変され得る。

【0273】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡのコード領域のグアノシン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含有量は、野生型ＲＮＡの対応するコード配列のＧ／Ｃ含有量と比較して増加しており、ｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列は、好ましくは野生型ＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列と比較して改変されていない。ｍＲＮＡ配列のこの改変は、翻訳される任意のＲＮＡ領域の配列がそのｍＲＮＡの効率的な翻訳のために重要であるという事実に基づく。Ｇ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含有量が増加した配列は、Ａ（アデノシン）／Ｕ（ウラシル）含有量が増加した配列よりも安定である。いくつかのコドンが全く同じアミノ酸をコードする（いわゆる遺伝暗号の縮重）という事実に関して、安定性のために最も好ましいコドンを決定することができる（いわゆる代替的コドン使用頻度）。ｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸に依存して、その野生型配列と比較して、ｍＲＮＡ配列の改変には様々な可能性がある。特に、Ａおよび／またはＵヌクレオチドを含むコドンは、これらのコドンを、同じアミノ酸をコードするがＡおよび／もしくはＵを含まないかまたはより低い含有量のＡおよび／もしくはＵヌクレオチドを含む他のコドンで置換することによって改変することができる。

【0274】

様々な実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量は、野生型ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、またはさらにそれ以上増加している。

【0275】

上述の修飾の組合せ、すなわち、５’キャップ構造の組み込み、ポリＡ配列の組み込み、ポリＡ配列のアンマスキング、５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲの改変（１つ以上の３’－ＵＴＲの組み込みなど）、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドを合成ヌクレオチド（例えば、シチジンの場合は５－メチルシチジン、および／またはウリジンの場合はプソイドウリジン（Ψ）もしくはＮ（１）－メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）もしくは５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ））で置き換えること、ならびにコドン最適化は、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の安定性および翻訳効率の増加に相乗的な影響を及ぼす。したがって、いくつかの実施形態では、本開示において使用されるｍＲＮＡは、上述の修飾の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは５つ全ての組合せ、すなわち、（ｉ）５’キャップ構造の組み込み、（ｉｉ）ポリＡ配列の組み込み、ポリＡ配列のアンマスキング、（ｉｉｉ）５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲの改変（１つ以上の３’－ＵＴＲの組み込みなど）、（ｉｖ）１つ以上の天然に存在するヌクレオチドを合成ヌクレオチド（例えば、シチジンの場合は５－メチルシチジン、および／またはウリジンの場合はプソイドウリジン（Ψ）もしくはＮ（１）－メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）もしくは５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ））で置き換えること、ならびに（ｖ）コドン最適化を含む。

【0276】

本開示のいくつかの態様は、特定の細胞または組織への本明細書に開示されるｍＲＮＡの標的化送達を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、リンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓を標的とすることを含む。投与されるｍＲＮＡが、免疫応答を誘導するための抗原またはエピトープをコードするｍＲＮＡである場合、リンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓を標的とすることが特に好ましい。いくつかの実施形態では、標的細胞は脾臓細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、脾臓におけるプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、脾臓における樹状細胞である。「リンパ系」は、循環系の一部であり、リンパを運ぶリンパ管のネットワークを含む免疫系の重要な部分である。リンパ系は、リンパ器官、リンパ管の伝導ネットワーク、および循環リンパからなる。一次または中枢リンパ器官は、未成熟な前駆細胞からリンパ球を生成する。胸腺および骨髄は一次リンパ器官を構成する。リンパ節および脾臓を含む二次または末梢リンパ器官は、成熟したナイーブリンパ球を維持し、適応免疫応答を開始する。

【0277】

脂質ベースのｍＲＮＡ送達システムは、肝臓に対する固有の選択性を有する。肝臓蓄積は、肝血管系の不連続な性質または脂質代謝（リポソームおよび脂質もしくはコレステロール複合体）によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、標的器官は肝臓であり、標的組織は肝臓組織である。そのような標的組織への送達は、特に、この器官または組織におけるｍＲＮＡまたはコードされたペプチドもしくはポリペプチドの存在が望ましい場合、および／またはコードされたペプチドもしくはポリペプチドを大量に発現することが望ましい場合、および／またはコードされたペプチドもしくはポリペプチドの全身的な存在、特に有意な量での存在が望ましいかもしくは必要とされる場合に好ましい。

【0278】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｍＲＮＡ粒子の投与後、ｍＲＮＡの少なくとも一部が標的細胞または標的器官に送達される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの少なくとも一部が標的細胞のサイトゾルに送達される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡであり、ｍＲＮＡは、標的細胞によって翻訳されてペプチドまたはポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、標的細胞は肝臓における細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は筋細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は内皮細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、腫瘍細胞または腫瘍微小環境における細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は血球である。いくつかの実施形態では、標的細胞はリンパ節内の細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は肺の細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は血球である。いくつかの実施形態では、標的細胞は皮膚の細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は脾臓細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、脾臓におけるプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、脾臓における樹状細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞はＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は単球である。したがって、本明細書に記載のＲＮＡ粒子は、そのような標的細胞にｍＲＮＡを送達するために使用され得る。

【0279】

薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチド
「コードする」は、定義されたヌクレオチドの配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性、およびそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、ある遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物系においてタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方が、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると呼ばれ得る。

【0280】

いくつかの実施形態では、本開示で使用されるｍＲＮＡなどの核酸は、１つ以上のペプチドまたはポリペプチド、好ましくは薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を含む。

【0281】

好ましい実施形態では、本開示で使用されるｍＲＮＡなどの核酸は、ペプチドまたはポリペプチド、好ましくは薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を含み、特に細胞または対象に移入された場合、前記ペプチドまたはポリペプチドを発現することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示で使用される核酸は、ペプチドまたはポリペプチドをコードする、例えば薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドをコードするコード領域（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））を含む。これに関して、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、開始コドンで始まり、終止コドンで終わるコドンの連続した一続きである。薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドをコードするそのような核酸は、本明細書では「薬学的に活性な核酸」とも呼ばれる。特に、薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドをコードするそのようなｍＲＮＡは、本明細書では「薬学的に活性なｍＲＮＡ」とも呼ばれる。

【0282】

本開示によれば、「薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチド」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドの発現が、例えば疾患の症状を改善するのに有益である個体の治療において使用することができるペプチドまたはポリペプチドを意味する。好ましくは、薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドは、治癒特性または緩和特性を有し、疾患の１つ以上の症状を改善する、緩和する、軽減する、逆転させる、発症を遅延させるまたは重症度を軽減するために投与され得る。いくつかの実施形態では、薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドは、治療有効量で個体に投与された場合、個体の状態または病態に対してプラスの効果または有利な効果を及ぼす。薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドは、予防的特性を有し得、疾患の発症を遅延させるため、またはそのような疾患の重症度を軽減するために使用され得る。「薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチド」という用語は、ペプチドまたはポリペプチド全体を含み、その薬学的に活性な断片も指すことができる。この用語はまた、ペプチドまたはポリペプチドの薬学的に活性な変異体および／または類似体を含み得る。

【0283】

薬学的に活性なペプチドおよびポリペプチドの具体例としては、サイトカイン、ホルモン、接着分子、免疫グロブリン、免疫学的に活性な化合物、成長因子、プロテアーゼ阻害剤、酵素、受容体、アポトーシス調節因子、転写因子、腫瘍抑制タンパク質、構造タンパク質、リプログラミング因子、ゲノムエンジニアリングタンパク質、および血液タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。

【0284】

「サイトカイン」という用語は、約５～６０ｋＤａの分子量を有し、細胞シグナル伝達（例えばパラクリン、内分泌、および／または自己分泌シグナル伝達）に関与するタンパク質に関する。特に、サイトカインは、放出された場合、放出された場所周辺の細胞の挙動に影響を及ぼす。サイトカインの例としては、リンホカイン、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロン、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。本開示によれば、サイトカインはホルモンまたは成長因子を含まない。サイトカインは、（ｉ）通常、ホルモンよりもはるかに可変的な濃度で作用し、および（ｉｉ）一般に広範囲の細胞によって作られる（ほぼ全ての有核細胞がサイトカインを産生できる）という点でホルモンとは異なる。インターフェロンは、通常、抗ウイルス活性、抗増殖活性、および免疫調節活性を特徴とする。インターフェロンは、調節される細胞の表面のインターフェロン受容体に結合することによって細胞内の遺伝子の転写を変化させ、調節するタンパク質であり、それにより細胞内のウイルス複製を防止する。インターフェロンは２つのタイプに分類することができる。ＩＦＮ－γは唯一のＩＩ型インターフェロンである；他は全てＩ型インターフェロンである。サイトカインの特定の例としては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）、インターフェロンベータ（ＩＦＮβ）、インターフェロンガンマ（ＩＮＦγ）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン１１（ＩＬ－１１）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、およびインターロイキン２１（ＩＬ－２１）、ならびにそれらの変異体および誘導体が挙げられる。

【0285】

いくつかの実施形態では、薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドは、補充タンパク質を含む。これらの実施形態では、本開示は、タンパク質補充を必要とする障害（例えばタンパク質欠損性障害）を有する対象の治療のための方法であって、補充タンパク質をコードする本明細書に記載の核酸を対象に投与する工程を含む方法を提供する。「タンパク質補充」という用語は、そのようなタンパク質の欠損を有する対象へのタンパク質（その機能的変異体を含む）の導入を指す。この用語はまた、タンパク質の提供を必要とするかまたはタンパク質の提供から利益を得る、例えばタンパク質不足を患っている対象へのタンパク質の導入を指す。「タンパク質欠損を特徴とする障害」という用語は、タンパク質の欠如または不十分な量によって引き起こされる病態を呈する任意の障害を指す。この用語は、生物学的に不活性なタンパク質産物をもたらすタンパク質フォールディング障害、すなわちコンフォメーション障害を包含する。タンパク質不足は、感染症、免疫抑制、臓器不全、腺の障害、放射線症、栄養不足、中毒、または他の環境的もしくは外的傷害に関与し得る。

【0286】

「ホルモン」という用語は、腺によって産生されるシグナル伝達分子のクラスに関し、シグナル伝達は通常、以下の工程：（ｉ）特定の組織におけるホルモンの合成；（ｉｉ）貯蔵および分泌；（ｉｉｉ）ホルモンのその標的への輸送；（ｉｖ）受容体によるホルモンの結合；（ｖ）シグナルの中継および増幅；ならびに（ｖｉ）ホルモンの分解を含む。ホルモンは、（１）通常、あまり可変的でない濃度で作用し、および（２）一般に特定の種類の細胞によって作られるという点でサイトカインとは異なる。いくつかの実施形態では、「ホルモン」は、ペプチドまたはポリペプチドホルモン、例えばインスリン、バソプレシン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、甲状腺ホルモン、成長ホルモン（ヒト成長ホルモンまたはウシソマトトロピンなど）、オキシトシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、グルカゴン、ソマトスタチン、コレシストキニン、ガストリン、およびレプチンである。

【0287】

「接着分子」という用語は、細胞の表面に位置し、細胞と他の細胞または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）との結合に関与するタンパク質に関する。接着分子は、典型的には膜貫通型受容体であり、カルシウム非依存性（例えば、インテグリン、免疫グロブリンスーパーファミリー、リンパ球ホーミング受容体）およびカルシウム依存性（カドヘリンおよびセレクチン）として分類することができる。接着分子の特定の例は、インテグリン、リンパ球ホーミング受容体、セレクチン（例えばＰ－セレクチン）、およびアドレシンである。

【0288】

インテグリンもシグナル伝達に関与する。特に、リガンド結合時に、インテグリンは細胞シグナル伝達経路、例えば、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）などの膜貫通タンパク質キナーゼの経路を調節する。そのような調節は、細胞の成長、分裂、生存もしくは分化、またはアポトーシスをもたらすことができる。インテグリンの特定の例としては、α_１β_１、α_２β_１、α_３β_１、α_４β_１、α_５β_１、α_６β_１、α_７β_１、α_Ｌβ_２、α_Ｍβ_２、α_ＩＩｂβ_３、α_Ｖβ_１、α_Ｖβ_３、α_Ｖβ_５、α_Ｖβ_６、α_Ｖβ_８、およびα_６β_４が挙げられる。

【0289】

「免疫グロブリン」または「免疫グロブリンスーパーファミリー」という用語は、細胞の認識、結合、および／または接着プロセスに関与する分子を指す。このスーパーファミリーに属する分子は、免疫グロブリンドメインまたは免疫グロブリンフォールドとして知られる領域を含むという特徴を共有する。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーには、抗体（例えば、ＩｇＧ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、共受容体（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９）、抗原受容体アクセサリ分子（例えば、ＣＤ－３γ、ＣＤ３－δ、ＣＤ－３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ）、共刺激分子または阻害性分子（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６）などが含まれる。

【0290】

「免疫学的に活性な化合物」という用語は、例えば免疫細胞の成熟を誘導および／もしくは抑制することによって免疫応答を変化させる、サイトカイン生合成を誘導および／もしくは抑制する、ならびに／またはＢ細胞による抗体産生を刺激することによって体液性免疫を変化させる任意の化合物に関する。免疫学的に活性な化合物は、抗ウイルスおよび抗腫瘍活性を含むがこれらに限定されない強力な免疫刺激活性を有し、また免疫応答の他の局面を下方制御する、例えば免疫応答をＴＨ２免疫応答からシフトさせることもでき、これは、広範囲のＴＨ２媒介疾患を治療するのに有用である。免疫学的に活性な化合物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。免疫学的に活性な化合物の特定の例としては、インターロイキン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、インテグリン、アドレシン、セレクチン、ホーミング受容体、ならびに抗原、特に腫瘍関連抗原、病原体関連抗原（細菌抗原、寄生虫抗原、またはウイルス抗原など）、アレルゲン、および自己抗原が挙げられる。免疫学的に活性な化合物は、ワクチン抗原、すなわち、対象への接種が免疫応答を誘導する抗原であり得る。

【0291】

本開示による「抗原」は、免疫応答を誘発する任意の物質ならびに／または免疫応答もしく細胞性応答および／もしくは体液性応答などの免疫機構が向けられる任意の物質を包含する。これはまた、抗原が抗原ペプチドにプロセシングされ、特にＭＨＣ分子に関連して提示される場合、免疫応答または免疫機構が１つ以上の抗原ペプチドに向けられる状況を含む。特に、「抗原」は、抗体またはＴリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応する、ペプチドまたはポリペプチドなどの任意の物質に関する。「抗原」という用語は、Ｔ細胞エピトープなどの少なくとも１つのエピトープを含む分子を含み得る。いくつかの実施形態では、抗原は、任意でプロセシング後に、抗原（抗原を発現する細胞を含む）に特異的であり得る免疫反応を誘導する分子である。いくつかの実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、もしくは細菌抗原などの疾患関連抗原、またはそのような抗原に由来するエピトープである。

【0292】

「自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎまたはｓｅｌｆ－ａｎｔｉｇｅｎ）」という用語は、対象の体内に由来し（すなわち自己抗原は「自家抗原」とも呼ばれ得る）、身体のこの正常な部分に対する異常に激しい免疫応答を生じさせる抗原を指す。自己抗原に対するそのような激しい免疫反応は、「自己免疫疾患」の原因であり得る。

【0293】

本開示によれば、免疫応答の候補である任意の適切な抗原を使用することができ、免疫応答は体液性および細胞性免疫応答の両方であり得る。本開示のいくつかの実施形態の文脈において、抗原は、ＭＨＣ分子に関連して、抗原提示細胞などの細胞によって提示され、抗原に対する免疫応答をもたらす。抗原は、天然に存在する抗原に対応するまたは由来する生成物であり得る。そのような天然に存在する抗原は、アレルゲン、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫ならびに他の感染因子および病原体を含んでもよく、もしくはそれらに由来してもよく、または抗原は腫瘍抗原であってもよい。本開示によれば、抗原は、天然に存在する生成物、例えばウイルスタンパク質、またはその一部に対応し得る。

【0294】

「疾患関連抗原」という用語は、疾患に関連する任意の抗原を指すためにその最も広い意味で使用される。疾患関連抗原は、宿主の免疫系を刺激して、疾患に対する細胞性抗原特異的免疫応答および／または体液性抗体応答を生じさせるエピトープを含む分子である。疾患関連抗原としては、病原体関連抗原、すなわち微生物による感染に関連する抗原、典型的には微生物抗原（細菌抗原もしくはウイルス抗原など）、または癌、典型的には腫瘍に関連する抗原、例えば腫瘍抗原が挙げられる。

【0295】

いくつかの実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、すなわち腫瘍細胞の一部、特に主に細胞内にまたは腫瘍細胞の表面抗原として存在するものである。別の実施形態では、抗原は、病原体関連抗原、すなわち病原体に由来する抗原、例えばウイルス、細菌、単細胞生物、または寄生虫に由来する抗原、例えばウイルスリボ核タンパク質またはコートタンパク質などのウイルス抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は、特にＴ細胞受容体の活性の調節を介して、調節、特にＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球などの免疫系の細胞の活性化をもたらすＭＨＣ分子によって提示されるべきである。

【0296】

「腫瘍抗原」という用語は、細胞質、細胞表面または細胞核に由来し得る癌細胞の成分を指す。特に、この用語は、細胞内でまたは腫瘍細胞上の表面抗原として産生される抗原を指す。例えば、腫瘍抗原としては、癌胎児性抗原、α１－フェトプロテイン、イソフェリチン、および胎児性スルホグリコプロテイン、α２－Ｈ－フェロプロテインおよびγ－フェトプロテイン、ならびに様々なウイルス腫瘍抗原が挙げられる。本開示のいくつかの実施形態によれば、腫瘍抗原は、タイプおよび／または発現レベルに関して腫瘍または癌および腫瘍細胞または癌細胞に特徴的な任意の抗原を含む。

【0297】

「ウイルス抗原」という用語は、抗原特性を有する、すなわち個体において免疫応答を誘発することができる任意のウイルス成分を指す。ウイルス抗原は、ウイルスリボ核タンパク質またはエンベロープタンパク質であり得る。

【0298】

「細菌抗原」という用語は、抗原特性を有する、すなわち個体において免疫応答を誘発することができる任意の細菌成分を指す。細菌抗原は、細菌の細胞壁または細胞質膜に由来し得る。

【0299】

「エピトープ」という用語は、抗原などの分子中の抗原決定基、すなわち免疫系によって認識される、例えば、特にＭＨＣ分子に関連して提示された場合にＴ細胞によって認識される分子の一部または断片を指す。タンパク質のエピトープは、前記タンパク質の連続または不連続部分を含み得、例えば、約５～約１００、約５～約５０、約８～約３０、または約１０～約２５アミノ酸長であり得、例えば、エピトープは、好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の文脈におけるエピトープはＴ細胞エピトープである。

【0300】

「エピトープ」、「抗原の断片」、「免疫原性ペプチド」および「抗原ペプチド」などの用語は、本明細書では互換的に使用され、例えば、抗原または抗原を発現するかもしくは含み、抗原を提示する細胞に対する免疫応答を誘発することができる、抗原の不完全な表示形態に関連し得る。いくつかの実施形態では、これらの用語は、抗原の免疫原性部分に関する。いくつかの実施形態では、これは、特にＭＨＣ分子に関連して提示された場合、Ｔ細胞受容体によって認識される（すなわち特異的に結合される）抗原の一部である。特定の好ましい免疫原性部分は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合する。「エピトープ」という用語は、免疫系によって認識される抗原などの分子の一部または断片を指す。例えば、エピトープは、Ｔ細胞、Ｂ細胞または抗体によって認識され得る。抗原のエピトープは、抗原の連続部分または不連続部分を含み得、約５～約１００アミノ酸、例えば約５～約５０、約８～約３０、または約８～約２５アミノ酸の長さであり得、例えば、エピトープは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸の長さであり得る。いくつかの実施形態では、エピトープは、約１０～約２５アミノ酸の長さである。「エピトープ」という用語は、Ｔ細胞エピトープを含む。

【0301】

「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、ＭＨＣ分子に関連して提示された場合にＴ細胞によって認識されるタンパク質の一部または断片を指す。「主要組織適合遺伝子複合体」という用語および「ＭＨＣ」という略語は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、全ての脊椎動物に存在する遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または疾患細胞との間のシグナル伝達に重要であり、ＭＨＣタンパク質または分子はペプチドエピトープに結合し、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面に発現され、自己抗原（細胞自体からのペプチド断片）および非自己抗原（例えば侵入微生物の断片）の両方をＴ細胞に表示する。クラスＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には約８～約１０アミノ酸長であるが、より長いまたはより短いペプチドも有効であり得る。クラスＩＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には約１０～約２５アミノ酸長であり、特に約１３～約１８アミノ酸長であるが、より長いおよびより短いペプチドも有効であり得る。

【0302】

ペプチドおよびポリペプチド抗原は、例えば、５アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ酸、４０アミノ酸、４５アミノ酸、または５０アミノ酸を含む、２～１００アミノ酸の長さであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、５０個を超えるアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１００個を超えるアミノ酸であり得る。

【0303】

ペプチドまたはポリペプチド抗原は、ペプチドまたはポリペプチドに対する抗体およびＴ細胞応答を生じさせる免疫系の能力を誘導または増加させることができる任意のペプチドまたはポリペプチドであり得る。

【0304】

いくつかの実施形態では、ワクチン抗原、すなわち対象への接種が免疫応答を誘導する抗原は、免疫エフェクタ細胞によって認識される。いくつかの実施形態では、ワクチン抗原は、免疫エフェクタ細胞によって認識される場合、適切な共刺激シグナルの存在下で、ワクチン抗原を認識する抗原受容体を担持する免疫エフェクタ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大を誘導することができる。本開示の実施形態の文脈において、ワクチン抗原は、例えば、抗原提示細胞などの細胞の表面に提示され得るかまたは存在し得る。いくつかの実施形態では、抗原は、疾患細胞（腫瘍細胞または感染細胞など）によって提示される。いくつかの実施形態では、抗原受容体は、ＭＨＣに関連して提示される抗原のエピトープに結合するＴＣＲである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞によって発現される場合および／またはＴ細胞上に存在する場合のＴＣＲの、抗原提示細胞などの細胞によって提示される抗原への結合は、前記Ｔ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞によって発現された場合および／またはＴ細胞上に存在する場合のＴＣＲの、疾患細胞上に提示される抗原への結合は、疾患細胞の細胞溶解および／またはアポトーシスをもたらし、前記Ｔ細胞は、例えば細胞傷害性因子、例えばパーフォリンおよびグランザイムを放出する。

【0305】

いくつかの実施形態によれば、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、直接的に、またはリンカーを介して、抗原ペプチドまたはポリペプチドに融合される。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）は、抗原ペプチドまたはポリペプチドならびに抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列をコードする少なくとも１つのコード領域を含む。

【0306】

いくつかの実施形態では、それをコードする核酸の形態で投与され得るワクチン接種のための抗原は、天然に存在する抗原またはそのエピトープなどの断片を含む。

【0307】

抗原プロセシングおよび／または提示を増強するそのようなアミノ酸配列は、限定されないが、好ましくは抗原ペプチドまたはポリペプチド質のＣ末端に（および任意で免疫寛容を破壊するアミノ酸配列のＣ末端に）位置する。本明細書で定義される抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、好ましくは抗原プロセシングおよび提示を改善する。一実施形態では、本明細書で定義される抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、限定されないが、ヒトＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ－Ｂ５１、ハプロタイプＡ２、Ｂ２７／Ｂ５１、Ｃｗ２／Ｃｗ３）に由来する配列、特に配列番号２のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む配列を含む。抗原プロセシングおよび提示を改善することに加えて、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するそのようなアミノ酸配列はまた、本明細書に記載されるプロセスにおけるアミノ酸配列の発現を決定するために使用され得る。

【0308】

一実施形態では、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列もしくは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。一実施形態では、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。

【0309】

したがって、特に好ましい実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは、抗原ペプチドまたはポリペプチドをコードする少なくとも１つのコード領域ならびに抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列を含み、抗原プロセシングおよび／または提示を増強する前記アミノ酸配列は、好ましくは抗原ペプチドまたはポリペプチド、より好ましくは本明細書に記載の抗原ペプチドまたはポリペプチドのＣ末端に融合されている。

【0310】

さらに、分泌配列、例えば配列番号１のアミノ酸配列を含む配列は、抗原ペプチドまたはポリペプチドのＮ末端に融合され得る。

【0311】

破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）の破傷風トキソイドに由来するアミノ酸配列は、プライミング中にＴ細胞支援を提供することによって自己抗原に対する免疫応答を効率的に開始するために、自己寛容機構を克服するために使用され得る。

【0312】

破傷風トキソイド重鎖は、ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子に無差別に結合し、破傷風ワクチン接種を受けたほぼ全ての個体においてＣＤ４^＋メモリＴ細胞を誘導することができるエピトープを含むことが公知である。さらに、破傷風トキソイド（ＴＴ）ヘルパーエピトープと腫瘍関連抗原との組合せは、プライミング中にＣＤ４^＋媒介Ｔ細胞支援を提供することによって、腫瘍関連抗原単独の適用と比較して免疫刺激を改善することが公知である。腫瘍抗原特異的Ｔ細胞応答の意図された誘導と競合し得る破傷風配列でＣＤ８^＋Ｔ細胞を刺激するリスクを低下させるために、破傷風トキソイドの断片Ｃ全体ではＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープを含有することが公知であるので、断片Ｃ全体は使用しない。可能な限り多くのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子への結合を確実にするために、無差別に結合するヘルパーエピトープを含有する２つのペプチド配列を代替的に選択した。エクスビボ試験のデータに基づいて、周知のエピトープｐ２（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ；ＴＴ_{８３０－８４４}）およびｐ１６（ＭＴＮＳＶＤＤＡＬＩＮＳＴＫＩＹＳＹＦＰＳＶＩＳＫＶＮＱＧＡＱＧ；ＴＴ_{５７８－６０９}）を選択した。ｐ２エピトープは、抗黒色腫活性をブーストするために臨床試験におけるペプチドワクチン接種に既に使用されていた。

【0313】

非臨床データは、腫瘍抗原および無差別に結合する破傷風トキソイド配列の両方をコードするＲＮＡワクチンが、腫瘍抗原に対するＣＤ８^＋Ｔ細胞応答の増強および寛容破壊の改善をもたらすことを示した。腫瘍抗原特異的配列とインフレームで融合した配列を含むワクチンを接種した患者からの免疫モニタリングデータは、選択された破傷風配列がほぼ全ての患者において破傷風特異的Ｔ細胞応答を誘導することができることを明らかにする。

【0314】

いくつかの実施形態によれば、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、直接的に、またはリンカー、例えば配列番号４に従うアミノ酸配列を有するリンカーを介して、抗原ペプチドまたはポリペプチドに融合される。

【0315】

免疫寛容を破壊するそのようなアミノ酸配列は、限定されないが、好ましくは抗原ペプチドまたはポリペプチドのＣ末端に（ならびに任意で抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列のＮ末端に、ここで、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列と抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列とは、直接的に、またはリンカー、例えば配列番号５に従うアミノ酸配列を有するリンカーを介して融合されていてもよい）位置する。本明細書で定義される免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、好ましくはＴ細胞応答を改善する。一実施形態では、本明細書で定義される免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、限定されないが、破傷風トキソイド由来のヘルパー配列ｐ２およびｐ１６（Ｐ２Ｐ１６）に由来する配列、特に配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含む配列を含む。

【0316】

いくつかの実施形態では、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列もしくは配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的断片を含む。一実施形態では、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。

【0317】

いくつかの実施形態によれば、生物発光を生じるアミノ酸配列は、直接的に、またはリンカー、例えば配列番号４に従うアミノ酸配列を有するリンカーを介して、抗原ペプチドまたはポリペプチドに融合される。

【0318】

生物発光を生じるそのようなアミノ酸配列は、限定されないが、好ましくは抗原ペプチドまたはポリペプチドのＣ末端に（ならびに任意で（ｉ）抗原プロセシングおよび／もしくは提示を増強するアミノ酸配列、または（ｉｉ）免疫寛容を破壊するアミノ酸配列のＮ末端に、ここで、生物発光を生じるアミノ酸配列と、（ｉ）抗原プロセシングおよび／もしくは提示を増強するアミノ酸配列、または（ｉｉ）免疫寛容を破壊するアミノ酸配列とは、直接的に、またはリンカー、例えば配列番号５に従うアミノ酸配列を有するリンカーを介して融合されていてもよい）位置する。本明細書で定義される生物発光を生じるアミノ酸配列は、好ましくは抗原ペプチドまたはポリペプチドの量の決定を改善する。いくつかの実施形態では、本明細書で定義される生物発光を生じるアミノ酸配列は、蛍光を生じる。いくつかの実施形態では、本明細書で定義される生物発光を生じるアミノ酸配列は、限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、それらの変異体（例えば、増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、スーパーフォルダＧＦＰ（ｓｆＧＦＰ）およびルシフェラーゼに由来する配列を含む。

【0319】

以下において、ワクチンＲＮＡの実施形態を説明し、その要素を説明する場合に使用される特定の用語は、以下の意味を有する。

【0320】

ｈＡｇ－コザック：翻訳効率を高めるための最適化された「コザック配列」を有するヒトαグロビンｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ配列。

【0321】

ｓｅｃ／ＭＩＴＤ：抗原プロセシングおよび提示を改善することが示されている、ヒトＭＨＣクラスＩ複合体（ＨＬＡ－Ｂ５１、ハプロタイプＡ２、Ｂ２７／Ｂ５１、Ｃｗ２／Ｃｗ３）をコードする配列に由来する融合タンパク質タグ。ｓｅｃは、新生ポリペプチド鎖の小胞体への移行を誘導する分泌シグナルペプチドをコードする７８ｂｐ断片に対応する。ＭＩＴＤは、ＭＨＣクラスＩ輸送ドメインとも呼ばれる、ＭＨＣクラスＩ分子の膜貫通および細胞質ドメインに対応する。

【0322】

抗原：それぞれの抗原／エピトープをコードする配列。

【0323】

グリシン－セリンリンカー（ＧＳ）：融合タンパク質に一般的に使用される、主にアミノ酸グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）からなる短いリンカーペプチドをコードする配列。

【0324】

Ｐ２Ｐ１６：免疫寛容を破壊するための破傷風トキソイド由来ヘルパーエピトープをコードする配列。

【0325】

ＦＩ要素：３’－ＵＴＲは、「スプリットのアミノ末端エンハンサ」（ＡＥＳ）ｍＲＮＡ（Ｆと呼ばれる）およびミトコンドリアにコードされた１２ＳリボソームＲＮＡ（Ｉと呼ばれる）に由来する２つの配列要素の組合せである。これらは、ＲＮＡの安定性を付与し、総タンパク質発現を増強する配列のエクスビボ選択プロセスによって同定された。

【0326】

Ａ３０Ｌ７０：３０個のアデノシン残基のストレッチ、それに続く１０個のヌクレオチドのリンカー配列、および樹状細胞におけるＲＮＡの安定性と翻訳効率を高めるように設計された別の７０個のアデノシン残基からなる、１１０ヌクレオチド長と測定されるポリ（Ａ）尾部。

【0327】

一実施形態では、本明細書に記載のワクチンＲＮＡは、構造：
β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）－ｈＡｇ－コザック－ｓｅｃ－ＧＳ（１）－抗原－ＧＳ（２）－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ（３）－ＭＩＴＤ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
を有する。
一実施形態では、本明細書に記載のワクチン抗原は、構造：
ｓｅｃ－ＧＳ（１）－抗原－ＧＳ（２）－Ｐ２Ｐ１６－ＧＳ（３）－ＭＩＴＤ
を有する。

【0328】

一実施形態では、ｈＡｇ－コザックは、配列番号６のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ｓｅｃは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ｐ２Ｐ１６は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＭＩＴＤは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＧＳ（１）は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＧＳ（２）は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＧＳ（３）は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＦＩは、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、Ａ３０Ｌ７０は、配列番号８のヌクレオチド配列を含む。

【0329】

いくつかの実施形態では、抗原受容体は、抗原中のエピトープに結合する抗体またはＢ細胞受容体である。いくつかの実施形態では、抗体またはＢ細胞受容体は、抗原の天然エピトープに結合する。

【0330】

「細胞表面に発現された」または「細胞表面と会合した」という用語は、抗原などの分子が細胞の原形質膜と会合して位置し、分子の少なくとも一部が前記細胞の細胞外空間に面しており、例えば細胞の外側に位置する抗体によって前記細胞の外側からアクセス可能であることを意味する。この文脈では、一部は、例えば少なくとも４、少なくとも８、少なくとも１２、または少なくとも２０アミノ酸であり得る。会合は、直接的または間接的であり得る。例えば、会合は、１つ以上の膜貫通ドメイン、１つ以上の脂質アンカーによるものであってもよく、または他の任意のタンパク質、脂質、サッカリド、もしくは細胞の原形質膜の外葉に見出され得る他の構造との相互作用によるものであってもよい。例えば、細胞の表面と会合する分子は、細胞外部分を有する膜貫通タンパク質であってもよく、または膜貫通タンパク質である別のタンパク質と相互作用することによって細胞の表面と会合するタンパク質であってもよい。

【0331】

「細胞表面」または「細胞の表面」は、当技術分野におけるその通常の意味に従って使用され、したがって、タンパク質および他の分子による結合にアクセス可能な細胞の外側を含む。抗原は、細胞の表面に位置し、例えば細胞に加えられた抗原特異的抗体による結合にアクセス可能である場合、前記細胞の表面に発現される。

【0332】

本開示の文脈における「細胞外部分」または「エキソドメイン」という用語は、細胞の細胞外空間に面しており、好ましくは、例えば細胞の外側に位置する抗体などの分子に結合することによって、前記細胞の外側からアクセス可能であるタンパク質などの分子の一部を指す。好ましくは、この用語は、１つ以上の細胞外ループもしくはドメインまたはその断片を指す。

【0333】

「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」という用語は、本明細書では互換的に使用され、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）および細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含む。「抗原特異的Ｔ細胞」という用語または同様の用語は、特にＭＨＣ分子に関連して抗原提示細胞または癌細胞などの疾患細胞の表面に提示された場合、Ｔ細胞が標的とする抗原を認識し、好ましくはＴ細胞のエフェクタ機能を発揮するＴ細胞に関する。Ｔ細胞が抗原を発現する標的細胞を死滅させる場合、Ｔ細胞は抗原に特異的であると見なされる。Ｔ細胞特異性は、例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイ内で、様々な標準的技術のいずれかを使用して評価され得る。あるいは、リンホカイン（インターフェロンγなど）の合成を測定することができる。

【0334】

「標的」という用語は、細胞性免疫応答などの免疫応答の標的である細胞または組織などの作用物質を意味する。標的には、抗原または抗原エピトープ、すなわち抗原に由来するペプチド断片を提示する細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、標的細胞は、抗原を発現し、前記抗原をクラスＩ ＭＨＣと共に提示する細胞である。

【0335】

「抗原プロセシング」は、抗原の、前記抗原の断片であるプロセシング産物への分解（例えばポリペプチドのペプチドへの分解）、および抗原提示細胞などの細胞による特異的Ｔ細胞への提示のためのＭＨＣ分子とこれらの断片の１つ以上との会合（例えば結合による）を指す。

【0336】

「抗原応答性ＣＴＬ」とは、抗原提示細胞の表面にクラスＩ ＭＨＣと共に提示される、抗原または前記抗原に由来するペプチドに応答性であるＣＤ８^＋Ｔ細胞を意味する。

【0337】

本開示によれば、ＣＴＬ応答性には、持続的なカルシウム流動、細胞分裂、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカインの産生、ＣＤ４４およびＣＤ６９などの活性化マーカの上方制御、ならびに腫瘍抗原を発現する標的細胞の特異的細胞溶解性死滅が含まれ得る。ＣＴＬ応答性はまた、ＣＴＬ応答性を正確に示す人工レポータを使用して決定され得る。

【0338】

本明細書で使用される「活性化」または「刺激」は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されたＴ細胞などの免疫エフェクタ細胞の状態を指す。活性化はまた、シグナル伝達経路の開始、誘導されたサイトカイン産生、および検出可能なエフェクタ機能に関連し得る。「活性化免疫エフェクタ細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を受けている免疫エフェクタ細胞を指す。

【0339】

「プライミング」という用語は、Ｔ細胞などの免疫エフェクタ細胞がその特異的抗原と最初に接触し、エフェクタＴ細胞などのエフェクタ細胞への分化を引き起こす過程を指す。

【0340】

「拡大」という用語は、特定の実体が増加する過程を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、免疫エフェクタ細胞が抗原によって刺激され、増殖し、前記抗原を認識する特異的免疫エフェクタ細胞が増幅される免疫学的応答に関連して使用される。いくつかの実施形態では、拡大は免疫エフェクタ細胞の分化をもたらす。

【0341】

「免疫応答」および「免疫反応」という用語は、本明細書ではそれらの従来の意味で互換的に使用され、抗原に対する統合された身体応答を指し、細胞性免疫応答、体液性免疫応答、またはその両方を指し得る。本開示によれば、抗原、細胞または組織などの作用物質に関する「への免疫応答」または「に対する免疫応答」という用語は、作用物質に対する細胞応答などの免疫応答に関する。免疫応答は、１つ以上の抗原に対する抗体の発現、ならびにインビトロでの様々な増殖またはサイトカイン産生試験で検出され得るＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔリンパ球、例えばＣＤ８^＋Ｔリンパ球などの抗原特異的Ｔリンパ球の拡大からなる群より選択される１つ以上の反応を含み得る。

【0342】

本開示の文脈における「免疫応答を誘導する」および「免疫応答を誘発する」という用語および同様の用語は、免疫応答の誘導、例えば細胞性免疫応答、体液性免疫応答、またはその両方の誘導を指す。免疫応答は、保護的／防止的／予防的および／または治療的であり得る。免疫応答は、任意の免疫原または抗原または抗原ペプチド、例えば腫瘍関連抗原または病原体関連抗原（例えば、ウイルス（インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型）、ＣＭＶまたはＲＳＶなど）の抗原）に対するものであり得る。この文脈における「誘導する」は、誘導前に特定の抗原または病原体に対する免疫応答が存在しなかったことを意味し得るが、誘導前に特定の抗原または病原体に対するある程度の免疫応答が存在し、誘導後に前記免疫応答が増強されることも意味し得る。したがって、この文脈における「免疫応答を誘導する」には、「免疫応答を増強する」ことも含まれる。いくつかの実施形態では、個体において免疫応答を誘導した後、前記個体は、感染症または癌性疾患などの疾患の発症から保護されるか、または免疫応答を誘導することによって疾患状態が改善される。

【0343】

「細胞性免疫応答」、「細胞応答」、「細胞媒介性免疫」または同様の用語は、抗原の発現および／またはクラスＩもしくはクラスＩＩ ＭＨＣによる抗原の提示を特徴とする細胞に対する細胞応答を含むことを意味する。細胞応答は、「ヘルパー」または「キラー」のいずれかとして働くＴ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４^＋Ｔ細胞とも呼ばれる）は、免疫応答を調節することによって中心的な役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＣＴＬとも呼ばれる）は、疾患細胞などの細胞を死滅させる。

【0344】

「体液性免疫応答」という用語は、作用物質および生物に応答して抗体が産生され、最終的にそれらを中和および／または排除する、生きている生物におけるプロセスを指す。抗体応答の特異性は、単一特異性の抗原に結合する膜結合受容体を介してＴ細胞および／またはＢ細胞によって媒介される。適切な抗原の結合および様々な他の活性化シグナルの受け取り後、Ｂリンパ球が分裂し、メモリＢ細胞および抗体分泌形質細胞クローンを産生し、それぞれが、その抗原受容体によって認識された同一の抗原エピトープを認識する抗体を産生する。メモリＢリンパ球は、その後それらの特異的抗原によって活性化されるまで休眠状態のままである。これらのリンパ球は、記憶の細胞基盤、および特異的抗原に再曝露されたときに生じる抗体応答の増大を提供する。

【0345】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原上のエピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。特に、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を指す。「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および前記のいずれかの組合せを含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）とで構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成される。可変領域および定常領域は、本明細書ではそれぞれ可変ドメインおよび定常ドメインとも呼ばれる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が間に組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。ＶＨのＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と呼ばれ、ＶＬのＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は重鎖定常領域（ＣＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、ＣＨは、定常ドメインＣＨ１、ヒンジ領域、ならびに定常ドメインＣＨ２およびＣＨ３（以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置されている：ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）にさらに細分することができる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクタ細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。抗体は、天然源または組換え供給源に由来する無傷の免疫グロブリンであり得、無傷の免疫グロブリンの免疫活性部分であり得る。抗体は、典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）_２、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む様々な形態で存在し得る。

【0346】

「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質、例えば抗体またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）などの抗原受容体に関する。免疫グロブリンは、特徴的な免疫グロブリン（Ｉｇ）フォールドを有する構造ドメイン、すなわち免疫グロブリンドメインを特徴とする。この用語は、膜結合免疫グロブリンおよび可溶性免疫グロブリンを包含する。膜結合免疫グロブリンは、一般にＢＣＲの一部である、表面免疫グロブリンまたは膜免疫グロブリンとも呼ばれる。可溶性免疫グロブリンは、一般に抗体と呼ばれる。免疫グロブリンは一般に、いくつかの鎖、典型的にはジスルフィド結合を介して連結された２本の同一の重鎖および２本の同一の軽鎖を含む。これらの鎖は、主に、Ｖ_Ｌ（可変軽鎖）ドメイン、Ｃ_Ｌ（定常軽鎖）ドメイン、Ｖ_Ｈ（可変重鎖）ドメイン、ならびにＣ_Ｈ（定常重鎖）ドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３およびＣ_Ｈ４などの免疫グロブリンドメインで構成される。哺乳動物免疫グロブリン重鎖には５つの種類、すなわちα、δ、ε、γおよびμが存在し、これらは抗体の異なるクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを構成する。可溶性免疫グロブリンの重鎖とは対照的に、膜または表面免疫グロブリンの重鎖は、そのカルボキシ末端に膜貫通ドメインおよび短い細胞質ドメインを含む。哺乳動物には、２種類の軽鎖、すなわちラムダおよびカッパが存在する。免疫グロブリン鎖は、可変領域および定常領域を含む。定常領域は、免疫グロブリンの異なるアイソタイプ内で本質的に保存されており、可変部分は高度に多様であり、抗原認識を構成する。

【0347】

「ワクチン接種」および「免疫化」という用語は、治療または予防上の理由で個体を治療するプロセスを表し、本明細書に記載されているように、１つ以上の免疫原または抗原またはその誘導体を、特にそれをコードするＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）の形態で個体に投与し、前記１つ以上の免疫原もしくは抗原または前記１つ以上の免疫原もしくは抗原の提示を特徴とする細胞に対する免疫応答を刺激する手順に関する。

【0348】

「抗原の提示を特徴とする細胞」または「抗原を提示する細胞」または「抗原提示細胞の表面に抗原を提示するＭＨＣ分子」または同様の表現は、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ分子などのＭＨＣ分子に関連して、直接またはプロセシング後のいずれかに、疾患細胞、特に腫瘍細胞もしくは感染細胞、または抗原もしくは抗原ペプチドを提示する抗原提示細胞などの細胞を意味する。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ分子はＭＨＣクラスＩ分子である。

【0349】

「アレルゲン」という用語は、対象の体外に由来し（すなわち、アレルゲンは「異種抗原」とも呼ばれ得る）、対象の免疫系が、さもなければ対象に無害である認識された脅威を撃退する異常に激しい免疫応答を生じさせる、ある種の抗原を指す。「アレルギー」は、アレルゲンに対するそのような激しい免疫反応によって引き起こされる疾患である。アレルゲンは通常、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）応答を介してアトピー性個体におけるＩ型過敏反応を刺激することができる抗原である。アレルゲンの特定の例としては、落花生タンパク質（例えばＡｒａ ｈ ２．０２）、オボアルブミン、イネ科花粉タンパク質（例えばＰｈｌ ｐ ５）、およびイエダニのタンパク質（例えばＤｅｒ ｐ ２）に由来するアレルゲンが挙げられる。

【0350】

「成長因子」という用語は、細胞の成長、増殖、治癒、および／または細胞分化を刺激することができる分子を指す。典型的には、成長因子は細胞間のシグナル伝達分子として機能する。「成長因子」という用語は、その標的細胞の表面上の特異的受容体に結合する特定のサイトカインおよびホルモンを含む。成長因子の例としては、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＶＥＧＦＡなどの血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子、エフリン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ニューレグリン、ニューロトロフィン（例えば脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ））、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、レナラーゼ（ＲＮＬＳ）（抗アポトーシス生存因子）、Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング成長因子（トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－β））、および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）が挙げられる。いくつかの実施形態では、「成長因子」は、ペプチドまたはポリペプチド成長因子である。

【0351】

「プロテアーゼ阻害剤」という用語は、プロテアーゼの機能を阻害する分子、特にペプチドまたはポリペプチドを指す。プロテアーゼ阻害剤は、阻害されるプロテアーゼによって（例えばアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤）またはそれらの作用機序によって（例えばセルピンなどの自殺阻害剤）分類することができる。プロテアーゼ阻害剤の特定の例としては、α１－アンチトリプシン、アプロチニン、およびベスタチンなどのセルピンが挙げられる。

【0352】

「酵素」という用語は、化学反応を加速する高分子生物学的触媒を指す。任意の触媒と同様に、酵素はそれらが触媒する反応で消費されず、前記反応の平衡を変化させない。多くの他の触媒とは異なり、酵素ははるかに特異的である。いくつかの実施形態では、酵素は対象の恒常性に不可欠であり、例えば、酵素の機能不全（特に、突然変異、欠失または産生低下のいずれかによって引き起こされ得る活性低下）は疾患をもたらす。酵素の例としては、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１－ＴＫ）、ヘキソサミニダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、プソイドコリンエステラーゼおよびラクターゼが挙げられる。

【0353】

「受容体」という用語は、細胞の外部からシグナル（特にリガンドと呼ばれる化学シグナル）を受け取るタンパク質分子を指す。受容体へのシグナル（例えばリガンド）の結合は、細胞のある種の応答、例えばキナーゼの細胞内活性化を引き起こす。受容体は、膜貫通型受容体（イオンチャネル連結型（イオンチャネル型）受容体、Ｇタンパク質結合（代謝型）受容体、および酵素結合受容体など）ならびに細胞内受容体（細胞質受容体および核内受容体など）を含む。受容体の特定の例としては、ステロイドホルモン受容体、成長因子受容体、およびＰ－セレクチン糖タンパク質リガンド－１（ＰＳＧＬ－１）などのペプチド受容体（すなわち、そのリガンドがペプチドである受容体）が挙げられる。「成長因子受容体」という用語は、成長因子に結合する受容体を指す。

【0354】

「アポトーシス調節因子」という用語は、アポトーシスを調節する、すなわち、アポトーシスを活性化するかまたは阻害する分子、特にペプチドまたはポリペプチドを指す。アポトーシス調節因子は、ミトコンドリア機能を調節するものとカスパーゼを調節するものの２つの広いクラスに分類することができる。第１のクラスには、ミトコンドリア膜電位の喪失および／またはシトクロムＣなどのアポトーシス促進性タンパク質のサイトゾルへの放出を防止することによってミトコンドリアの完全性を維持するように働くタンパク質（例えばＢＣＬ－２、ＢＣＬ－ｘＬ）が含まれる。また、シトクロムＣの放出を促進するアポトーシス促進性タンパク質（例えばＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＩＭ）もこの第１のクラスに属する。第２のクラスには、カスパーゼの活性化を遮断するアポトーシスタンパク質（例えばＸＩＡＰ）またはＦＬＩＰの阻害剤などのタンパク質が含まれる。

【0355】

「転写因子」という用語は、特に特定のＤＮＡ配列に結合することによって、ＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡへの遺伝情報の転写の速度を調節するタンパク質に関する。転写因子は、生涯を通して細胞分裂、細胞増殖、および細胞死を調節し、胚発生中の細胞移動および組織化を調節し、ならびに／またはホルモンなどの細胞の外側からのシグナルに応答して調節し得る。転写因子は、通常は転写因子によって調節される遺伝子に隣接する、特定のＤＮＡ配列に結合する少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを含む。転写因子の特定の例としては、ＭＥＣＰ２、ＦＯＸＰ２、ＦＯＸＰ３、ＳＴＡＴタンパク質ファミリー、およびＨＯＸタンパク質ファミリーが挙げられる。

【0356】

「腫瘍抑制タンパク質」という用語は、癌への経路の一段階から細胞を保護する分子、特にペプチドまたはポリペプチドに関する。腫瘍抑制タンパク質（通常、対応する腫瘍抑制遺伝子によってコードされる）は、細胞周期の調節に対する弱化もしくは抑制効果を示し、および／またはアポトーシスを促進する。その機能は以下の１つ以上であり得る：細胞周期の継続に不可欠な遺伝子の抑制；ＤＮＡ損傷への細胞周期の結合（損傷したＤＮＡが細胞内に存在する限り、細胞分裂は起こらないはずである）；損傷したＤＮＡを修復できない場合のアポトーシスの開始；転移抑制（例えば腫瘍細胞の分散を防ぎ、接触阻害の喪失をブロックし、および転移を阻害する）；ならびにＤＮＡ修復。腫瘍抑制タンパク質の特定の例としては、ｐ５３、ホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、ＳＷＩ／ＳＮＦ（ＳＷＩｔｃｈ／スクロース非発酵性）、フォンヒッペル－リンダウ腫瘍抑制因子（ｐＶＨＬ）、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）、ＣＤ９５、腫瘍原性抑制５（ＳＴ５）、腫瘍原性抑制５（ＳＴ５）、腫瘍原性の抑制１４（ＳＴ１４）、およびＹｉｐｐｅｅ様３（ＹＰＥＬ３）が挙げられる。

【0357】

「構造タンパク質」という用語は、さもなければ流動性の生物学的成分に堅さと剛性を付与するタンパク質を指す。構造タンパク質は、ほとんどが線維状（コラーゲンおよびエラスチンなど）であるが、球状（アクチンおよびチューブリンなど）の場合もあり得る。通常、球状タンパク質はモノマーとして可溶性であるが、重合して、例えば細胞骨格を構成し得る長い線維を形成する。他の構造タンパク質は、機械力を生成することができるモータタンパク質（ミオシン、キネシン、およびダイニンなど）、ならびにサーファクタントタンパク質である。構造タンパク質の特定の例としては、コラーゲン、サーファクタントタンパク質Ａ、サーファクタントタンパク質Ｂ、サーファクタントタンパク質Ｃ、サーファクタントタンパク質Ｄ、エラスチン、チューブリン、アクチン、およびミオシンが挙げられる。

【0358】

「再プログラミング因子」または「再プログラミング転写因子」という用語は、任意でさらなる再プログラミング因子などのさらなる作用物質と共に体細胞で発現された場合、幹細胞特性、特に多能性を有する細胞への前記体細胞の再プログラミングまたは脱分化をもたらす分子、特にペプチドまたはポリペプチドに関する。再プログラミング因子の特定の例としては、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、およびＮＡＮＯＧが挙げられる。

【0359】

「ゲノム操作タンパク質」という用語は、ＤＮＡを対象のゲノムに挿入する、ゲノムから欠失させるまたは置換することができるタンパク質に関する。ゲノムエンジニアリングタンパク質の特定の例としては、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスタ化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピートＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）が挙げられる。

【0360】

「血液タンパク質」という用語は、対象の血漿、特に健常対象の血漿中に存在するペプチドまたはポリペプチドに関する。血液タンパク質は、輸送（例えばアルブミン、トランスフェリン）、酵素活性（例えばトロンビンまたはセルロプラスミン）、血液凝固（例えばフィブリノーゲン）、病原体に対する防御（例えば補体成分および免疫グロブリン）、プロテアーゼ阻害剤（例えばα１－アンチトリプシン）などの多様な機能を有する。血液タンパク質の特定の例としては、トロンビン、血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、インスリン、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、プロテインＣ、フォン・ヴィレブランド因子、アンチトロンビンＩＩＩ、グルコセレブロシダーゼ、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、修飾第ＶＩＩＩ因子、および抗凝固因子が挙げられる。

【0361】

したがって、いくつかの実施形態では、薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドは、（ｉ）好ましくはエリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターロイキン４（ＩＬ－２）およびインターロイキン１０（ＩＬ－１１）からなる群より選択されるサイトカイン、より好ましくはＥＰＯ；（ｉｉ）接着分子、特にインテグリン；（ｉｉｉ）免疫グロブリン、特に抗体；（ｉｖ）免疫学的に活性な化合物、特に抗原；（ｖ）ホルモン、特にバソプレシン、インスリンまたは成長ホルモン；（ｖｉ）成長因子、特にＶＥＧＦＡ；（ｖｉｉ）プロテアーゼ阻害剤、特にα１－アンチトリプシン；（ｖｉｉｉ）好ましくは単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１－ＴＫ）、ヘキソサミニダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、プソイドコリンエステラーゼ、膵酵素およびラクターゼからなる群より選択される酵素；（ｉｘ）受容体、特に成長因子受容体；（ｘ）アポトーシス調節因子、特にＢＡＸ；（ｘｉ）転写因子、特にＦＯＸＰ３；（ｘｉｉ）腫瘍抑制タンパク質、特にｐ５３；（ｘｉｉｉ）構造タンパク質、特にサーファクタントタンパク質Ｂ；（ｘｉｖ）例えばＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８およびＮＡＮＯＧからなる群より選択される再プログラミング因子；（ｘｖ）ゲノムエンジニアリングタンパク質、特にクラスタ化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピートＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）；ならびに（ｘｖｉ）血液タンパク質、特にフィブリノーゲンである。

【0362】

いくつかの実施形態では、薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチドは、１つ以上の抗原または１つ以上のエピトープを含む、すなわち、対象へのペプチドまたはポリペプチドの投与は、対象において、治療的または部分的もしくは完全に保護的であり得る、１つ以上の抗原または１つ以上のエピトープに対する免疫応答を誘発する。

【0363】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡなどの核酸は、少なくとも１つのエピトープをコードする。

【0364】

いくつかの実施形態では、エピトープは腫瘍抗原に由来する。腫瘍抗原は、様々な癌において発現されることが一般的に知られている「標準」抗原であり得る。腫瘍抗原はまた、個体の腫瘍に特異的であり、免疫系によって以前に認識されていない「ネオ抗原」であり得る。ネオ抗原またはネオエピトープは、アミノ酸変化をもたらす癌細胞のゲノムにおける１つ以上の癌特異的変異から生じ得る。腫瘍抗原の例としては、限定されないが、ｐ５３、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、β－カテニン／ｍ、Ｂｃｒ－ａｂＬ ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディン－６、クローディン－１８．２およびクローディン－１２などのクローディンファミリーの細胞表面タンパク質、ｃ－ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇａｐ １００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＡＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、好ましくはＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、またはＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｂ、ＭＡＧＥ－Ｃ、ＭＡＲＴ－１／メランＡ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ＮＡ８８－Ａ、ＮＦ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ｐｌ９０マイナーＢＣＲ－ａｂＬ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１またはＳＡＲＴ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥ、ＷＴ、およびＷＴ－１が挙げられる。

【0365】

癌の変異は各個体によって異なる。したがって、新規エピトープ（ネオエピトープ）をコードする癌変異は、ワクチン組成物および免疫療法の開発における魅力的な標的である。腫瘍免疫療法の有効性は、宿主内で強力な免疫応答を誘導することができる癌特異的抗原およびエピトープの選択に依存する。ＲＮＡは、患者特異的腫瘍エピトープを患者に送達するために使用することができる。脾臓に存在する樹状細胞（ＤＣ）は、腫瘍エピトープなどの免疫原性エピトープまたは抗原のＲＮＡ発現のための特に興味深い抗原提示細胞である。複数のエピトープの使用は、腫瘍ワクチン組成物における治療効果を促進することが示されている。腫瘍ミュータノームの迅速な配列決定は、本明細書に記載のｍＲＮＡによってコードされ得る個別化ワクチンのための複数のエピトープを、例えば、エピトープが任意でリンカーによって分離されている単一のポリペプチドとして提供し得る。本開示のいくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのエピトープ、少なくとも２つのエピトープ、少なくとも３つのエピトープ、少なくとも４つのエピトープ、少なくとも５つのエピトープ、少なくとも６つのエピトープ、少なくとも７つのエピトープ、少なくとも８つのエピトープ、少なくとも９つのエピトープ、または少なくとも１０個のエピトープをコードする。例示的な実施形態は、少なくとも５つのエピトープ（「ペンタトープ」と呼ばれる）をコードするｍＲＮＡおよび少なくとも１０個のエピトープ（「デカトープ」と呼ばれる）をコードするｍＲＮＡを含む。

【0366】

いくつかの実施形態では、抗原またはエピトープは、病原体関連抗原、特にウイルス抗原に由来する。いくつかの実施形態では、抗原またはエピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性変異体、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の免疫原性断片もしくはその免疫原性変異体に由来する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示で使用されるｍＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性変異体、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の免疫原性断片もしくはその免疫原性変異体を含むアミノ酸配列をコードする。

【0367】

本開示のいくつかの実施形態では、抗原（腫瘍抗原またはワクチン抗原など）は、好ましくは、ＲＮＡが投与される対象の細胞に入るとそれぞれのタンパク質に翻訳される一本鎖５’キャップｍＲＮＡとして投与される。好ましくは、ＲＮＡは、安定性および翻訳効率に関してＲＮＡの最大有効性のために最適化された構造要素（５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）配列）を含む。

【0368】

いくつかの実施形態では、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）をｍＲＮＡの５’末端の特異的キャッピング構造として利用する。いくつかの実施形態では、ｍ_２ ^{７，３’－Ｏ}Ｇｐｐｐ（ｍ_１ ^２’－Ｏ）ＡｐＧをｍＲＮＡの５’－末端の特異的キャッピング構造として利用する。いくつかの実施形態では、５’－ＵＴＲ配列は、ヒトα－グロビンｍＲＮＡに由来し、任意で、翻訳効率を高めるために最適化された「コザック配列」を有する。いくつかの実施形態では、「スプリットのアミノ末端エンハンサ」（ＡＥＳ）ｍＲＮＡ（Ｆと呼ばれる）およびミトコンドリアコード１２ＳリボソームＲＮＡ（Ｉと呼ばれる）に由来する２つの配列要素（ＦＩ要素）の組合せをコード配列とポリ（Ａ）配列との間に配置して、より高い最大タンパク質レベルおよびｍＲＮＡの長期持続性を確実にする。いくつかの実施形態では、ヒトβグロビンｍＲＮＡに由来する２つの反復３’－ＵＴＲをコード配列とポリ（Ａ）尾部との間に配置して、より高い最大タンパク質レベルおよびｍＲＮＡの長期持続性を確実にする。いくつかの実施形態では、３０個のアデノシン残基のストレッチと、それに続く１０個のヌクレオチドリンカー配列および別の７０個のアデノシン残基からなる、１１０ヌクレオチド長と測定されるポリ（Ａ）配列が使用される。このポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡの安定性および翻訳効率を高めるように設計された。

【0369】

いくつかの実施形態では、抗原（腫瘍抗原またはワクチン抗原など）をコードするｍＲＮＡは、治療される対象の細胞で発現されて、抗原を提供する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは対象の細胞において一過性に発現される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはインビトロ転写される。いくつかの実施形態では、抗原の発現は細胞表面においてである。いくつかの実施形態では、抗原はＭＨＣに関連して発現および提示される。いくつかの実施形態では、抗原の発現は細胞外空間に対してであり、すなわち抗原は分泌される。

【0370】

抗原分子またはそのプロセシング産物、例えばその断片は、免疫エフェクタ細胞によって運ばれるＢＣＲまたはＴＣＲなどの抗原受容体、または抗体に結合し得る。

【0371】

抗原がワクチン抗原である、ペプチド抗原およびポリペプチド抗原をコードするｍＲＮＡを投与することによって本開示に従って対象に提供されるペプチド抗原およびポリペプチド抗原は、好ましくは、ペプチド抗原またはポリペプチド抗原が提供される対象において免疫応答、例えば体液性および／または細胞性免疫応答の誘導をもたらす。前記免疫応答は、好ましくは標的抗原に対するものである。したがって、ワクチン抗原は、標的抗原、その変異体、またはその断片を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような断片または変異体は、標的抗原と免疫学的に等価である。本開示の文脈において、「抗原の断片」または「抗原の変異体」という用語は、免疫応答が抗原を標的とする免疫応答の誘導をもたらす作用物質、すなわち標的抗原を意味する。したがって、ワクチン抗原は、標的抗原に対応し得るもしくはそれを含み得る、標的抗原の断片に対応し得るかもしくはそれを含み得る、または標的抗原もしくはその断片に相同な抗原に対応し得るかもしくはそれを含み得る。したがって、本開示によれば、ワクチン抗原は、標的抗原の免疫原性断片または標的抗原の免疫原性断片に相同なアミノ酸配列を含み得る。本開示による「抗原の免疫原性断片」は、好ましくは、標的抗原に対する免疫応答を誘導することができる抗原の断片に関する。ワクチン抗原は組換え抗原であり得る。

【0372】

「免疫学的に等価」という用語は、免疫学的に等価なアミノ酸配列などの免疫学的に等価な分子が、同じもしくは本質的に同じ免疫学的特性を示し、および／または、例えば免疫学的効果の種類に関して、同じもしくは本質的に同じ免疫学的効果を及ぼすことを意味する。本開示の文脈において、「免疫学的に等価」という用語は、好ましくは、免疫化に使用される抗原または抗原変異体の免疫学的効果または特性に関して使用される。例えば、アミノ酸配列が対象の免疫系に曝露されたときに、参照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応を誘導する場合、前記アミノ酸配列は参照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。

【0373】

いくつかの実施形態では、本開示で使用されるｍＲＮＡは非免疫原性である。免疫賦活化剤をコードするＲＮＡを本開示に従って投与して、アジュバント効果を提供し得る。免疫賦活化剤をコードするＲＮＡは、標準ＲＮＡまたは非免疫原性ＲＮＡであり得る。

【0374】

本明細書で使用される「非免疫原性ＲＮＡ」（「非免疫原性ｍＲＮＡ」など）という用語は、例えば哺乳動物に投与したとき免疫系による応答を誘導しないか、または非免疫原性ＲＮＡを非免疫原性にする修飾および処理に供されていないという点においてのみ異なる同じＲＮＡによって誘導されるよりも弱い応答を誘導する、すなわち標準的なＲＮＡ（ｓｔｄＲＮＡ）によって誘導されるよりも弱い応答を誘導するＲＮＡを指す。特定の実施形態では、本明細書では修飾ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）とも呼ばれる非免疫原性ＲＮＡは、自然免疫受容体のＲＮＡ媒介性活性化を抑制する修飾ヌクレオシドをＲＮＡに組み込む工程、および／または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を除去する工程によって非免疫原性にされる。

【0375】

修飾ヌクレオシドの組み込みによって非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）を非免疫原性にするために、ＲＮＡの免疫原性を低下させるまたは抑制する限り、任意の修飾ヌクレオシドを使用し得る。自然免疫受容体のＲＮＡ媒介性活性化を抑制する修飾ヌクレオシドが特に好ましい。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、３－メチル－ウリジン（ｍ^３Ｕ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ^５Ｕ）、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン（ｓ^２Ｕ）、４－チオ－ウリジン（ｓ^４Ｕ）、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン（ｈｏ^５Ｕ）、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン（例えば５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｃｍｏ^５Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ^５Ｕ）、５－カルボキシメチル－ウリジン（ｃｍ^５Ｕ）、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン（ｃｈｍ^５Ｕ）、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ^５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン（ｍｃｍ^５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｃｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－ウリジン（ｍｎｍ^５Ｕ）、１－エチル－プソイドウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｍｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン（ｍｎｍ^５ｓｅ^２Ｕ）、５－カルバモイルメチル－ウリジン（ｎｃｍ^５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン（ｃｍｎｍ^５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン（ｃｍｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン（τｍ^５Ｕ）、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１－タウリノメチル－４－チオ－プソイドウリジン、５－メチル－２－チオ－ウリジン（ｍ^５ｓ^２Ｕ）、１－メチル－４－チオ－プソイドウリジン（ｍ^１ｓ^４Ψ）、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、３－メチル－プソイドウリジン（ｍ^３Ψ）、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン（ｍ^５Ｄ）、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ^３Ｕ）、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ^３Ψ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ^５Ｕ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオ－ウリジン（ｉｎｍ^５ｓ^２Ｕ）、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン（Ｕｍ）、５，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ^５Ｕｍ）、２’－Ｏ－メチル－プソイドウリジン（Ψｍ）、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｓ^２Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｍｃｍ^５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｎｃｍ^５Ｕｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｃｍｎｍ^５Ｕｍ）、３，２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン（ｍ^３Ｕｍ）、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチル－ウリジン（ｉｎｍ^５Ｕｍ）、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－（２－カルボメトキシビニル）ウリジン、および５－［３－（１－Ｅ－プロペニルアミノ）ウリジンからなる群より選択される。特定の実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、プソイドウリジン（ψ）、Ｎ１－メチル－プソイドウリジン（ｍ１ψ）または５－メチル－ウリジン（ｍ５Ｕ）、特にＮ１－メチル－プソイドウリジンである。

【0376】

いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換は、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のウリジンの置換を含む。

【0377】

Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写（ＩＶＴ）によるｍＲＮＡの合成中、酵素の通常とは異なる活性のために二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む有意な量の異常な産物が産生される。ｄｓＲＮＡは、炎症性サイトカインを誘導し、エフェクタ酵素を活性化してタンパク質合成の阻害をもたらす。ｄｓＲＮＡは、例えば、非多孔性または多孔性のＣ－１８ポリスチレン－ジビニルベンゼン（ＰＳ－ＤＶＢ）マトリックスを使用するイオン対逆相ＨＰＬＣによって、ＩＶＴ ＲＮＡなどのＲＮＡから除去することができる。あるいは、ｓｓＲＮＡではなくｄｓＲＮＡを特異的に加水分解し、それによってＩＶＴ ＲＮＡ調製物からｄｓＲＮＡ夾雑物を除去する大腸菌ＲＮａｓｅＩＩＩを用いた酵素ベースの方法を使用することができる。さらに、セルロース材料を使用することによってｄｓＲＮＡをｓｓＲＮＡから分離することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ調製物をセルロース材料と接触させ、ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を許容しない条件下で、ｓｓＲＮＡをセルロース材料から分離する。ｓｓＲＮＡを提供するための適切な方法は、例えば国際公開第２０１７／１８２５２４号に開示されている。

【0378】

本明細書で使用される場合、「除去する」または「除去」という用語は、ｄｓＲＮＡなどの第２の物質の集団の近傍から分離されている、非免疫原性ＲＮＡなどの第１の物質の集団の特徴を指し、ここで、第１の物質の集団は必ずしも第２の物質を欠くわけではなく、第２の物質の集団は必ずしも第１の物質を欠くわけではない。しかしながら、第２の物質の集団の除去を特徴とする第１の物質の集団は、第１の物質と第２の物質との分離されていない混合物と比較して、第２の物質の含有量が測定可能に低い。

【0379】

いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡからのｄｓＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）の除去は、非免疫原性ＲＮＡ組成物中のＲＮＡの１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．３％未満、または０．１％未満がｄｓＲＮＡであるようなｄｓＲＮＡの除去を含む。いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）は、ｄｓＲＮＡを含まないか、または本質的に含まない。いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）組成物は、一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡの精製された調製物を含む。例えば、いくつかの実施形態では、一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）の精製調製物は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、精製調製物は、他の全ての核酸分子（ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）と比較して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％の一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡである。

【0380】

いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）は、同じ配列を有する標準ＲＮＡよりも効率的に細胞内で翻訳される。いくつかの実施形態では、翻訳は、その修飾されていない対応物と比較して２倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は３倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は４倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は５倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は６倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は７倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は８倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は９倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は１０倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は１５倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は２０倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は５０倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は１００倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は２００倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は５００倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は１０００倍増強される。いくつかの実施形態では、翻訳は２０００倍増強される。いくつかの実施形態では、倍数は１０～１０００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は１０～１００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は１０～２００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は１０～３００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は１０～５００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は２０～１０００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は３０～１０００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は５０～１０００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は１００～１０００倍である。いくつかの実施形態では、倍数は２００～１０００倍である。いくつかの実施形態では、翻訳は、任意の他の有意な量または量の範囲だけ増強される。

【0381】

いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）は、同じ配列を有する標準ＲＮＡよりも有意に低い自然免疫原性を示す。いくつかの実施形態では、非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）は、その非修飾対応物よりも２倍低い自然免疫応答を示す。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は３倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は４倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は５倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は６倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は７倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は８倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は９倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は１０倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は１５倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は２０倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は５０倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は１００倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は２００倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は５００倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は１０００倍低下する。いくつかの実施形態では、自然免疫原性は２０００倍低下する。

【0382】

「有意に低い自然免疫原性を示す」という用語は、自然免疫原性の検出可能な低下を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、検出可能な自然免疫応答を誘発することなく有効量の非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）を投与することができるような低下を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）を、非免疫原性ＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生を検出可能に減少させるのに十分な自然免疫応答を誘発することなく繰り返し投与することができるような低下を指す。いくつかの実施形態では、低下は、非免疫原性ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）を、非免疫原性ＲＮＡによってコードされるタンパク質の検出可能な産生を排除するのに十分な自然免疫応答を誘発することなく繰り返し投与することができるようなものである。

【0383】

「免疫原性」は、ＲＮＡなどの異物がヒトまたは他の動物の体内で免疫応答を引き起こす能力である。自然免疫系は、比較的非特異的で即時的な免疫系の構成要素である。これは、適応免疫系と共に、脊椎動物免疫系の２つの主な構成要素のうちの１つである。

【0384】

粒子
本明細書に記載の核酸（例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、特にｍＲＮＡ）は、（ｉ）核酸、および（ｉｉ）核酸を複合体化するポリマーまたは脂質などの少なくとも１つのカチオン性またはカチオン性のイオン化可能な化合物を含む粒子中に存在し得る。ポリマーおよび脂質などの正に帯電した分子と負に帯電した核酸との間の静電相互作用は、粒子形成に関与する。これは、核酸粒子の複合体化および自発的形成をもたらす。

【0385】

様々なタイプのＲＮＡ含有粒子が微粒子形態のＲＮＡの送達に適することが以前に記述されている（例えば、Ｋａｃｚｍａｒｅｋ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９，６０参照）。非ウイルスＲＮＡ送達ビヒクルの場合、ＲＮＡのナノ粒子封入はＲＮＡを分解から物理的に保護し、特定の化学的性質に応じて、細胞取り込みおよびエンドソーム脱出を支援することができる。

【0386】

本開示の文脈において、「粒子」という用語は、分子または分子複合体、特に粒子形成化合物によって形成された構造化実体に関する。いくつかの実施形態では、粒子は、１種類以上の両親媒性物質（例えば両親媒性脂質）から作製されたエンベロープ（例えば１つ以上の層またはラメラ）を含有する。これに関連して、「両親媒性物質」という表現は、物質が親水性および親油性の両方の特性を有することを意味する。エンベロープはまた、両親媒性である必要がないさらなる物質（例えばさらなる脂質）を含み得る。したがって、粒子は、１つ以上の層またはラメラを構成する物質が、任意で、両親媒性である必要がないさらなる物質（例えばさらなる脂質）と組み合わせて、１種類以上の両親媒性物質（特に、両親媒性脂質からなる群より選択される）を含む、モノラメラまたはマルチラメラ構造であり得る。いくつかの実施形態では、「粒子」という用語は、マイクロサイズまたはナノサイズの構造、例えばマイクロサイズまたはナノサイズのコンパクト構造に関する。本開示によれば、「粒子」という用語はナノ粒子を含む。

【0387】

「ＲＮＡ粒子」を使用して、目的の標的部位（例えば細胞、組織、器官など）にＲＮＡを送達することができる。ＲＮＡ粒子は、少なくとも１つのカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質または脂質様物質を含む脂質から形成され得る。いかなる理論にも拘束されることを意図するものではないが、カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質または脂質様物質は、ＲＮＡと一緒に結合して凝集体を形成し、この凝集はコロイド的に安定な粒子をもたらすと考えられる。

【0388】

本明細書に記載の核酸粒子（ＲＮＡ粒子、ＤＮＡ粒子またはＤＮＡ／ＲＮＡ粒子など）は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ベースおよびリポプレックス（ＬＰＸ）ベースの製剤を含む。

【0389】

一般に、リポプレックス（ＬＰＸ）は、２つの水相、すなわち核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）を含む相と脂質の分散液を含む相とを混合することから得ることができる。いくつかの実施形態では、脂質相はリポソームを含む。

【0390】

いくつかの実施形態では、リポソームは自己閉鎖型単層または多層小胞粒子であり、ラメラは脂質二重層を含み、封入された内腔は水相を含む。ナノ粒子形成のためにリポソームを使用するための必要条件は、必要に応じて混合物中の脂質が適用された水性環境中でラメラ（二重層）相を形成することができることである。

【0391】

いくつかの実施形態では、リポソームは、水性コア（本明細書では水性内腔とも呼ばれる）を取り囲む単層または多層リン脂質二重層を含む。それらは、極性頭部（親水性）基および非極性尾部（疎水性）基を有する材料から調製され得る。いくつかの実施形態では、核酸の送達のために設計されたリポソームを製剤化するのに使用されるカチオン性脂質は、本質的に両親媒性であり、グリセロールを介して炭化水素鎖またはコレステロール誘導体に連結された正電荷（カチオン性）アミン頭部基からなる。

【0392】

いくつかの実施形態では、リポプレックスは、カチオン性リポソームと核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）との静電相互作用の際に形成される多層リポソームベースの製剤である。いくつかの実施形態では、形成されたリポプレックスは、リポソーム構造からコンパクト核酸－リポプレックス（ＲＮＡ－リポプレックスおよび／またはＤＮＡ－リポプレックスなど）への変換に起因して生じる分子の異なる内部配置を有する。いくつかの実施形態では、これらの製剤は、核酸（ＲＮＡなど）の封入が不十分であり、核酸（ＲＮＡなど）の捕捉が不完全であることを特徴とする。

【0393】

いくつかの実施形態では、ＬＰＸ粒子は、両親媒性脂質、特にカチオン性またはカチオン性のイオン化可能な両親媒性脂質、および本明細書に記載の核酸（例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、特にｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、正に帯電したリポソーム（１つ以上の両親媒性脂質、特にカチオン性またはカチオン性のイオン化可能な両親媒性脂質から作製される）と負に帯電した核酸（特にｍＲＮＡ）との間の静電相互作用は、核酸リポプレックス粒子の複合体化および自発的形成をもたらす。正に荷帯電したリポソームは、一般に、ＤＯＴＭＡおよび／またはＤＯＤＭＡなどのカチオン性またはカチオン性のイオン化可能な両親媒性脂質、ならびにＤＯＰＥなどのさらなる脂質を使用して合成され得る。いくつかの実施形態では、核酸（例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、特にｍＲＮＡ）リポプレックス粒子はナノ粒子である。

【0394】

一般に、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、水相中の核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）と、エタノールなどの有機溶媒を含む相中の脂質との直接混合から得ることができる。その場合、水中でラメラ（二重層）相を形成しない脂質または脂質混合物を粒子形成に使用することができる。

【0395】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性／イオン化可能脂質ならびにヘルパー脂質、例えばリン脂質、コレステロールおよび／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸ＬＮＰ（例えばＲＮＡ ＬＮＰ、例えばｍＲＮＡ ＬＮＰ）において、核酸（例えばＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、ＬＮＰの中心コアを占めるイオン化可能な脂質によって結合される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、リン脂質と共にＬＮＰの表面を形成する。いくつかの実施形態では、表面は二重層を含む。いくつかの実施形態では、荷電形態および非荷電形態のコレステロールおよびイオン化可能な脂質は、ＬＮＰ全体に分布し得る。

【0396】

いくつかの実施形態では、核酸（例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、例えばｍＲＮＡ）は、本明細書に記載の粒子と非共有結合的に会合し得る。実施形態では、核酸（例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、特にｍＲＮＡ）は、粒子の外面に付着していてもよく（表面核酸（例えば表面ＲＮＡ、特に表面ｍＲＮＡ））、および／または粒子に含まれていてもよい（封入された核酸（例えば封入されたＲＮＡ、特に封入されたｍＲＮＡ））。

【0397】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の粒子（例えば、ＬＮＰおよびＬＰＸ）は、約１０～約２０００ｎｍの範囲、例えば少なくとも約１５ｎｍ（例えば、少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約２５ｎｍ、少なくとも約３０ｎｍ、少なくとも約３５ｎｍ、少なくとも約４０ｎｍ、少なくとも約４５ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約５５ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ、少なくとも約６５ｎｍ、少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約７５ｎｍ、少なくとも約８０ｎｍ、少なくとも約８５ｎｍ、少なくとも約９０ｎｍ、少なくとも約９５ｎｍ、もしくは少なくとも約１００ｎｍ）および／または最大でも１９００ｎｍ（例えば、最大でも約１９００ｎｍ、最大でも約１８００ｎｍ、最大でも約１７００ｎｍ、最大でも約１６００ｎｍ、最大でも約１５００ｎｍ、最大でも約１４００ｎｍ、最大でも約１３００ｎｍ、最大でも約１２００ｎｍ、最大でも約１１００ｎｍ、最大でも約１０００ｎｍ、最大でも約９５０ｎｍ、最大でも約９００ｎｍ、最大でも約８５０ｎｍ、最大でも約８００ｎｍ、最大でも約７５０ｎｍ、最大でも約７００ｎｍ、最大でも約６５０ｎｍ、最大でも約６００ｎｍ、最大でも約５５０ｎｍ、もしくは最大でも約５００ｎｍ）、例えば約２０～約１５００ｎｍ、例えば約３０～約１２００ｎｍ、約４０～約１１００ｎｍ、約５０～約１０００ｎｍ、約６０～約９００ｎｍ、約７０～８００ｎｍ、約８０～７００ｎｍ、約９０～６００ｎｍ、または約５０～５００ｎｍまたは約１００～５００ｎｍの範囲、例えば１０～１０００ｎｍ、１５～５００ｎｍ、２０～４５０ｎｍ、２５～４００ｎｍ、３０～３５０ｎｍ、４０～３００ｎｍ、５０～２５０ｎｍ、６０～２００ｎｍ、または７０～１５０ｎｍの範囲のサイズ（直径など）を有する。

【0398】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の粒子（例えば、ＬＮＰおよびＬＰＸ）は、いくつかの実施形態では、約５０ｎｍ～約１０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約８００ｎｍ、約５０ｎｍ～約７００ｎｍ、約５０ｎｍ～約６００ｎｍ、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約５０ｎｍ～約４５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約４００ｎｍ、約５０ｎｍ～約３５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約１０００ｎｍ、約１００ｎｍ～約８００ｎｍ、約１００ｎｍ～約７００ｎｍ、約１００ｎｍ～約６００ｎｍ、約１００ｎｍ～約５００ｎｍ、約１００ｎｍ～約４５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４００ｎｍ、約１００ｎｍ～約３５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約１０００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約８００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約７００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約６００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約４５０ｎｍ、約１５０ｎｍ～約４００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約３５０ｎｍ、約１５０ｎｍ～約３００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約１５０ｎｍ～約２００ｎｍ、約２００ｎｍ～約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ～約８００ｎｍ、約２００ｎｍ～約７００ｎｍ、約２００ｎｍ～約６００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約２００ｎｍ～約４５０ｎｍ、約２００ｎｍ～約４００ｎｍ、約２００ｎｍ～約３５０ｎｍ、約２００ｎｍ～約３００ｎｍ、または約２００ｎｍ～約２５０ｎｍの範囲の平均直径を有する。

【0399】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の粒子はナノ粒子である。「ナノ粒子」という用語は、本明細書に記載の核酸（特にｍＲＮＡ）および少なくとも１つのカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質を含むナノサイズ粒子に関し、粒子の３つの外形寸法は全てナノスケール、すなわち少なくとも約１ｎｍおよび約１０００ｎｍ未満である。好ましくは、粒子のサイズはその直径である。

【0400】

本明細書に記載の核酸粒子（特にｍＲＮＡ粒子）は、約０．５未満、約０．４未満、約０．３未満、約０．２未満、約０．１未満、または約０．０５未満の多分散指数（ＰＤＩ）を示し得る。例として、核酸粒子は、約０．０１～約０．４または約０．１～約０．３の範囲の多分散指数を示し得る。

【0401】

Ｎ／Ｐ比は、脂質中の窒素基対核酸中のリン酸基の数の比率を与える。窒素原子（ｐＨに依存する）は通常正に帯電し、リン酸基は負に帯電するので、これは電荷比と相関する。電荷平衡が存在する場合、Ｎ／Ｐ比はｐＨに依存する。正に帯電したナノ粒子はトランスフェクションに有利であると考えられているので、脂質製剤は、４より大きく１２までのＮ／Ｐ比で形成されることが多い。その場合、ＲＮＡはナノ粒子に完全に結合していると見なされる。

【0402】

本明細書に記載の核酸粒子（特にｍＲＮＡ粒子などのＲＮＡ粒子）は、少なくとも１つのカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質からコロイドを得る工程、およびコロイドを核酸と混合して核酸粒子を得る工程を含み得る広範囲の方法を使用して調製することができる。

【0403】

本明細書で使用される「コロイド」という用語は、分散した粒子が沈降しない均質な混合物の一種に関する。混合物中の不溶性粒子は微視的であり、粒径は１～１０００ナノメートルである。混合物は、コロイドまたはコロイド懸濁液と呼ばれ得る。「コロイド」という用語は、混合物中の粒子のみを指し、懸濁液全体を指すのではない場合がある。

【0404】

少なくとも１つのカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質を含むコロイドの調製のために、リポソーム小胞を調製するために従来使用され、適切に適合された方法が本明細書で適用可能である。リポソーム小胞を調製するために最も一般的に使用される方法は、以下の基本的な段階を共有する：（ｉ）有機溶媒中での脂質溶解、（ｉｉ）得られた溶液の乾燥、および（ｉｉｉ）乾燥した脂質の水和（様々な水性媒体を使用して）。

【0405】

膜水和法では、脂質を最初に適切な有機溶媒に溶解し、乾燥させてフラスコの底部に薄膜を得る。得られた脂質膜を、適切な水性媒体を用いて水和して、リポソーム分散液を得る。さらに、さらなる小型化工程が含まれてもよい。

【0406】

逆相蒸発は、水相と脂質を含有する有機相との間の油中水型エマルジョンの形成を含む、リポソーム小胞を調製するための膜水和の代替方法である。この混合物の短時間の超音波処理は、系の均質化のために必要である。減圧下での有機相の除去により、その後リポソーム懸濁液に変わる乳白色のゲルが得られる。

【0407】

「エタノール注入技術」という用語は、脂質を含むエタノール溶液が針を通して水溶液に迅速に注入されるプロセスを指す。この作用は、溶液全体に脂質を分散させ、脂質構造形成、例えばリポソーム形成などの脂質小胞形成を促進する。一般に、本明細書に記載の核酸（例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、特にｍＲＮＡ）リポプレックス粒子は、核酸（例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、特にｍＲＮＡ）をコロイドリポソーム分散液に添加することによって得ることができる。エタノール注入技術を使用して、そのようなコロイドリポソーム分散液は、いくつかの実施形態では、以下のように形成される：ＤＯＴＭＡおよび／またはＤＯＤＭＡのようなカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質などの脂質ならびにさらなる脂質を含むエタノール溶液を撹拌下で水溶液に注入する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸（例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、特にｍＲＮＡ）リポプレックス粒子は、押出工程なしで得ることができる。

【0408】

「押し出す」または「押出」という用語は、固定された断面プロファイルを有する粒子の作製を指す。特に、これは粒子の小型化を指し、それによって粒子は規定された細孔を有するフィルタを通過する。

【0409】

有機溶媒を含まない特性を有する他の方法もまた、コロイドを調製するために本開示に従って使用され得る。

【0410】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、４つの成分：イオン化可能なカチオン性脂質、リン脂質などの中性脂質、コレステロールなどのステロイド、およびポリマーコンジュゲート脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、エタノールに溶解した脂質を水性緩衝液中で核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）と迅速に混合することによって調製され得る。本明細書に記載の核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）粒子は、ＰＥＧ脂質などのポリマーコンジュゲート脂質を含み得るが、本明細書では、ＰＥＧ脂質などのポリマーコンジュゲート脂質を含まない核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）粒子も提供される。

【0411】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）と少なくとも１つのカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質とを含むＬＮＰは、（ａ）水および緩衝系を含有する核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）溶液を調製する工程；（ｂ）カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質、および存在する場合は、１つ以上のさらなる脂質を含むエタノール溶液を調製する工程；ならびに（ｃ）（ａ）で調製した核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）溶液を（ｂ）で調製したエタノール溶液と混合し、それによってＬＮＰを含む製剤を調製する工程によって調製される。工程（ｃ）の後に、接線流濾過などの希釈および濾過から選択される１つ以上の工程を行うことができる。

【0412】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）と少なくとも１つのカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質とを含むＬＮＰは、（ａ’）カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質、および存在する場合は、水相中の１つ以上のさらなる脂質のリポソームまたはコロイド調製物を調製する工程；（ｂ’）水および緩衝系を含有する核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）溶液を調製する工程；ならびに（ｃ’）（ａ’）で調製したリポソームまたはコロイド調製物を（ｂ’）で調製した核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）溶液と混合する工程によって調製される。工程（ｃ’）の後に、接線流濾過などの希釈および濾過から選択される１つ以上の工程を行うことができる。

【0413】

本開示は、核酸（例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、特にｍＲＮＡ）と、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）と会合して核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）粒子を形成する少なくとも１つのカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質とを含む粒子、ならびにそのような粒子を含む組成物を記載する。核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）粒子は、粒子に対する非共有結合相互作用によって様々な形態で複合体化された核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）を含み得る。本明細書に記載の粒子は、ウイルス粒子、特に感染性ウイルス粒子ではない、すなわち、それらは細胞にウイルス感染することができない。

【0414】

適切なカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質は、核酸粒子を形成するものであり、「粒子形成成分」または「粒子形成剤」という用語に含まれる。「粒子形成成分」または「粒子形成剤」という用語は、核酸と会合して核酸粒子を形成する任意の成分に関する。そのような成分は、核酸粒子の一部であり得る任意の成分を含む。

【0415】

いくつかの実施形態では、核酸粒子（例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ粒子、特にｍＲＮＡ粒子）は、複数種の核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）分子を含み、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）分子の分子パラメータは、モル質量、または分子構造、キャッピング（ＲＮＡのみ）、コード領域もしくは他の特徴などの基本的構造要素に関してのように、互いに類似し得るかまたは異なり得る。

【0416】

粒子製剤では、各核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）種を個々の粒子製剤として別々に製剤化することが可能である。その場合、各個々の粒子製剤は、１つの核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）種を含む。個々の粒子製剤は、別個の実体として、例えば別個の容器中に存在し得る。そのような製剤は、各核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）種を別々に（典型的にはそれぞれ核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）含有溶液の形態で）粒子形成剤と共に提供し、それによって粒子の形成を可能にすることによって得ることができる。それぞれの粒子は、粒子が形成されるときに提供される特定の核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）種のみを含む（個々の粒子製剤）。いくつかの実施形態では、医薬組成物などの組成物は、複数の個々の粒子製剤を含む。それぞれの医薬組成物は混合粒子製剤と呼ばれる。本発明による混合粒子製剤は、個々の粒子製剤を別々に形成し、続いて個々の粒子製剤を混合する工程によって得ることができる。混合する工程により、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）含有粒子の混合集団を含む製剤を得ることができる。個々の粒子集団は、個々の粒子製剤の混合集団を含む１つの容器に一緒に存在し得る。あるいは、医薬組成物の全ての核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）種を組み合わせた粒子製剤として一緒に製剤化することが可能である。そのような製剤は、全ての核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）種の組合せ製剤（典型的には組合せ溶液）を粒子形成剤と共に提供し、それによって粒子の形成を可能にすることによって得ることができる。混合粒子製剤とは対照的に、組合せ粒子製剤は、典型的には、複数の核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）種を含む粒子を含む。組合せ粒子組成物では、異なる核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）種が、典型的には単一粒子中に一緒に存在する。

【0417】

ポリマー
ポリマーは、それらの高度な化学的柔軟性を考慮して、ナノ粒子ベースの送達のために一般的に使用される材料である。典型的には、カチオン性ポリマーは、負に帯電した核酸をナノ粒子に静電的に凝縮するために使用される。これらの正に帯電した基は、多くの場合、５．５～７．５のｐＨ範囲でプロトン化の状態を変化させるアミンからなり、エンドソーム破裂をもたらすイオン不均衡につながると考えられる。ポリ－Ｌ－リジン、ポリアミドアミン、プロタミンおよびポリエチレンイミンなどのポリマー、ならびにキトサンなどの天然に存在するポリマーは全て核酸送達に適用されており、本明細書におけるカチオン性ポリマーとして適している。さらに、一部の研究者は、特に核酸送達のためのポリマーを合成した。ポリ（β－アミノエステル）は、特に、その合成の容易さと生分解性のために核酸送達において広く使用されている。そのような合成ポリマーは、本明細書におけるカチオン性ポリマーとしても適している。

【0418】

本明細書で使用される「ポリマー」は、その通常の意味、すなわち、共有結合によって連結された１つ以上の繰り返し単位（モノマー）を含む分子構造体という意味を与えられる。繰り返し単位は、全て同一であり得るか、または場合によっては、ポリマー内に複数種の繰り返し単位が存在し得る。場合によっては、ポリマーは生物学的に誘導される、すなわち、タンパク質などのバイオポリマーである。場合によっては、さらなる部分、例えば標的化部分もポリマー中に存在し得る。

【0419】

複数種の繰り返し単位がポリマー内に存在する場合、そのポリマーは「コポリマー」であると言われる。本明細書で使用されるポリマーはコポリマーであり得ることを理解されたい。コポリマーを形成する繰り返し単位は、任意の方法で配置され得る。例えば、繰り返し単位は、ランダムな順序で、交互の順序で、または「ブロック」コポリマーとして、すなわち、それぞれが第１の繰り返し単位（例えば第１のブロック）を含む１つ以上の領域、およびそれぞれが第２の繰り返し単位（例えば第２のブロック）を含む１つ以上の領域、などを含むように配置することができる。ブロックコポリマーは、２つ（ジブロックコポリマー）、３つ（トリブロックコポリマー）、またはそれ以上の数の別個のブロックを有することができる。

【0420】

特定の実施形態では、ポリマーは生体適合性である。生体適合性ポリマーは、典型的には、中程度の濃度で有意な細胞死を引き起こさないポリマーである。特定の実施形態では、生体適合性ポリマーは生分解性であり、すなわち、ポリマーは、体内などの生理学的環境内で、化学的および／または生物学的に分解することができる。

【0421】

特定の実施形態では、ポリマーは、プロタミンまたはポリアルキレンイミンであり得る。

【0422】

「プロタミン」という用語は、アルギニンに富み、様々な動物（魚のような）の精子細胞において体細胞ヒストンの代わりに特にＤＮＡと会合して見出される、比較的低分子量の様々な強塩基性タンパク質のいずれかを指す。特に、「プロタミン」という用語は、強塩基性で、水に可溶性であり、熱によって凝固せず、加水分解時に主にアルギニンを生成する、魚の精子に見出されるタンパク質を指す。精製形態では、それらは、インスリンの長時間作用型製剤において、ヘパリンの抗凝固作用を中和するために使用される。

【0423】

本開示によれば、本明細書で使用される「プロタミン」という用語は、天然源または生物源から得られるまたはそれに由来する任意のプロタミンアミノ酸配列およびその断片、ならびに前記アミノ酸配列またはその断片の多量体形態、ならびに人工の、特定の目的のために特別に設計された、天然源または生物源から単離することができない（合成された）ポリペプチドを含むことが意図されている。

【0424】

一実施形態では、ポリアルキレンイミンは、ポリエチレンイミンおよび／またはポリプロピレンイミン、好ましくはポリエチレンイミンを含む。好ましいポリアルキレンイミンはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ＰＥＩの平均分子量は、好ましくは０．７５×１０^２～１０^７Ｄａ、好ましくは１０００～１０^５Ｄａ、より好ましくは１００００～４００００Ｄａ、より好ましくは１５０００～３００００Ｄａ、さらにより好ましくは２００００～２５０００Ｄａである。

【0425】

本開示によれば、直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの直鎖状ポリアルキレンイミンが好ましい。

【0426】

本明細書での使用が企図されるカチオン性ポリマー（ポリカチオン性ポリマーを含む）には、核酸に静電的に結合することができる任意のカチオン性ポリマーが含まれる。一実施形態では、本明細書での使用が企図されるカチオン性ポリマーは、例えば核酸と複合体を形成することによって、または核酸が封入もしくはカプセル化された小胞を形成することによって、核酸が会合することができる任意のカチオン性ポリマーを含む。

【0427】

本明細書に記載の粒子はまた、カチオン性ポリマー以外のポリマー、すなわち非カチオン性ポリマーおよび／またはアニオン性ポリマーを含み得る。集合的に、アニオン性および中性ポリマーは、本明細書では非カチオン性ポリマーと呼ばれる。

【0428】

脂質
「脂質」および「脂質様物質」という用語は、本明細書では、１つ以上の疎水性部分または基、および任意で１つ以上の親水性部分または基も含む分子として広く定義される。疎水性部分および親水性部分を含む分子はまた、しばしば両親媒性物質として示される。脂質は、通常、水に不溶性または難溶性であるが、多くの有機溶媒に可溶性である。水性環境では、両親媒性の性質は、分子が組織化された構造体および様々な相に自己集合することを可能にする。それらの相の１つは、水性環境で小胞、多層／単層リポソーム、または膜に存在する場合、脂質二重層からなる。疎水性は、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、ならびに１つ以上の芳香族、脂環式、または複素環式基で置換されたそのような基を含むがこれらに限定されない無極性基を含むことによって付与され得る。親水性基は、極性および／または荷電基を含み得、炭水化物、リン酸基、カルボン酸基、硫酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、および他の同様の基を含む。

【0429】

本明細書で使用される場合、「疎水性」という用語は、水溶液中で実質的に非混和性または不溶性である任意の分子、部分または基を指す。疎水性基という用語は、少なくとも６個の炭素原子を有する炭化水素を含む。疎水性基は、水溶液中で実質的に非混和性または不溶性であるという条件を満たす限り、官能基（例えば、エーテル、エステル、ハロゲン化物など）ならびに炭素および水素以外の原子を有することができる。

【0430】

「炭化水素」という用語は、本明細書で定義されるアルキル、アルケニル、またはアルキニルを含む。アルキル、アルケニルまたはアルキニル中の水素の１つ以上は、他の原子、例えばハロゲン、酸素または硫黄で置換されてもよいことを理解されたい。特に明記しない限り、炭化水素基はまた、炭化水素の全体的な極性が比較的無極性のままである限り、環状（アルキル、アルケニルもしくはアルキニル）基またはアリール基を含むことができる。

【0431】

「アルキル」という用語は、６～３０個、典型的には６～２０個、しばしば６～１８個の炭素原子を有し得る飽和直鎖または分岐一価炭化水素部分を指す。例示的な非極性アルキル基としては、ヘキシル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0432】

「アルケニル」という用語は、総炭素原子が６～３０個、典型的には６～２０個、しばしば６～１８個であり得る、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有する直鎖または分岐一価炭化水素部分を指す。

【0433】

「アルキニル」という用語は、総炭素原子が６～３０個、典型的には６～２０個、しばしば６～１８個であり得る、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を有する直鎖または分岐一価炭化水素部分を指す。アルキニル基は、１つ以上の炭素－炭素二重結合を有していてもよい。

【0434】

本明細書で使用される場合、「両親媒性」という用語は、極性部分と非極性部分の両方を有する分子を指す。多くの場合、両親媒性化合物は、長い疎水性尾部に結合した極性頭部を有する。いくつかの実施形態では、極性部分は水に可溶性であるが、非極性部分は水に不溶性である。さらに、極性部分は、形式正電荷または形式負電荷のいずれかを有し得る。あるいは、極性部分は、形式正電荷および形式負電荷の両方を有してもよく、双性イオンまたは内部塩であってもよい。本開示の目的のために、両親媒性化合物は、１つ以上の天然または非天然脂質および脂質様化合物であり得るが、これらに限定されない。

【0435】

「脂質様物質」、「脂質様化合物」または「脂質様分子」という用語は、構造的および／または機能的に脂質に関連するが、厳密な意味で脂質とは見なされない可能性がある物質に関する。例えば、この用語は、水性環境で小胞、多層／単層リポソーム、または膜に存在する場合に両親媒性層を形成することができる化合物を含み、界面活性剤、または親水性部分と疎水性部分の両方を有する合成化合物を含む。一般的に言えば、この用語は、脂質の構造と類似していても類似していなくてもよい、異なる構造組織を有する親水性部分と疎水性部分とを含む分子を指す。細胞膜への自発的な組み込みが可能な脂質様化合物の例としては、合成機能－スペーサ－脂質構築物（ＦＳＬ）、合成機能－スペーサ－ステロール構築物（ＦＳＳ）、および人工両親媒性分子などの機能性脂質構築物が挙げられる。脂質は一般に円筒形である。２つのアルキル鎖が占める面積は、極性頭部基が占める面積と同様である。脂質はモノマーとしての溶解度が低く、水不溶性の平面二重層に凝集する傾向がある。従来の界面活性剤モノマーは、一般に円錐形である。親水性頭部基は、直鎖アルキル鎖よりも多くの分子空間を占める傾向がある。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、水溶性である球形または楕円形のミセルに凝集する傾向がある。脂質はまた、界面活性剤と同じ一般構造－極性親水性頭部基および非極性疎水性尾部－を有するが、脂質は、モノマーの形状、溶液中で形成される凝集体の種類、および凝集に必要な濃度範囲において界面活性剤とは異なる。本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、脂質および脂質様物質の両方を包含すると解釈されるべきである。

【0436】

一般に、脂質は、８つのカテゴリ：脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、ポリケチド（ケトアシルサブユニットの縮合に由来する）、ステロール脂質およびプレノール脂質（イソプレンサブユニットの縮合に由来する）に分けられ得る。「脂質」という用語は時に脂肪の同義語として使用されるが、脂肪はトリグリセリドと呼ばれる脂質のサブグループである。脂質はまた、脂肪酸およびその誘導体（トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質を含む）などの分子、ならびにステロイド、すなわち、コレステロールまたはその誘導体などのステロール含有代謝物を包含する。コレステロール誘導体の例としては、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、トコフェロールおよびそれらの誘導体、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0437】

脂肪酸または脂肪酸残基は、カルボン酸基で終わる炭化水素鎖でできた分子の多様な群である；この配置は、分子に、極性の親水性末端と水に不溶性の非極性の疎水性末端とを付与する。典型的には４～２４炭素長である炭素鎖は、飽和または不飽和であってもよく、酸素、ハロゲン、窒素、および硫黄を含む官能基に結合していてもよい。脂肪酸が二重結合を含む場合、シスまたはトランス幾何異性のいずれかの可能性があり、これは分子の立体配置に有意に影響を及ぼす。シス二重結合は脂肪酸鎖の屈曲を生じさせ、これは、鎖中のより多くの二重結合と組み合わされる影響である。脂肪酸カテゴリにおける他の主要な脂質クラスは、脂肪酸エステルおよび脂肪酸アミドである。

【0438】

グリセロ脂質は、一置換、二置換、および三置換グリセロールから構成され、最もよく知られているのは、トリグリセリドと呼ばれるグリセロールの脂肪酸トリエステルである。「トリアシルグリセロール」という語は、「トリグリセリド」と同義に使用されることがある。これらの化合物では、グリセロールの３つのヒドロキシル基はそれぞれ、典型的には異なる脂肪酸によってエステル化されている。グリセロ脂質のさらなるサブクラスは、グリコシド結合を介してグリセロールに結合した１つ以上の糖残基の存在を特徴とするグリコシルグリセロールによって代表される。

【0439】

グリセロリン脂質は、エステル結合によって２つの脂肪酸由来の「尾部」に、およびリン酸エステル結合によって１つの「頭部」基に結合したグリセロールコアを含む両親媒性分子（疎水性領域と親水性領域の両方を含む）である。通常リン脂質と呼ばれる（スフィンゴミエリンもリン脂質として分類されるが）グリセロリン脂質の例は、ホスファチジルコリン（ＰＣ、ＧＰＣｈｏまたはレシチンとしても知られる）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥまたはＧＰＥｔｎ）およびホスファチジルセリン（ＰＳまたはＧＰＳｅｒ）である。

【0440】

スフィンゴ脂質は、スフィンゴイド塩基骨格という共通の構造的特徴を共有する化合物の複雑なファミリーである。哺乳動物における主要なスフィンゴイド塩基は、一般にスフィンゴシンと呼ばれる。セラミド（Ｎ－アシル－スフィンゴイド塩基）は、アミド結合脂肪酸を有するスフィンゴイド塩基誘導体の主要なサブクラスである。脂肪酸は、典型的には飽和または一不飽和であり、１６～２６個の炭素原子の鎖長を有する。哺乳動物の主要なスフィンゴリン脂質はスフィンゴミエリン（セラミドホスホコリン）であるが、昆虫は主にセラミドホスホエタノールアミンを含有し、真菌はフィトセラミドホスホイノシトールおよびマンノース含有頭部基を有する。スフィンゴ糖脂質は、グリコシド結合を介してスフィンゴイド塩基に結合した１つ以上の糖残基で構成される分子の多様なファミリーである。これらの例は、セレブロシドおよびガングリオシドなどの単純なおよび複雑なスフィンゴ糖脂質である。

【0441】

コレステロールおよびその誘導体、またはトコフェロールおよびその誘導体などのステロール脂質は、グリセロリン脂質およびスフィンゴミエリンと共に膜脂質の重要な成分である。

【0442】

糖脂質は、脂肪酸が糖骨格に直接連結され、膜二重層と適合性である構造を形成する化合物を表す。糖脂質では、単糖がグリセロ脂質およびグリセロリン脂質に存在するグリセロール骨格の代わりになる。最もよく知られている糖脂質は、グラム陰性菌のリポ多糖のリピドＡ成分のアシル化グルコサミン前駆体である。典型的なリピドＡ分子は、７本もの脂肪アシル鎖で誘導体化されている、グルコサミンの二糖である。大腸菌での増殖に必要な最小限のリポ多糖は、２つの３－デオキシ－Ｄ－マンノ－オクツロソン酸（Ｋｄｏ）残基でグリコシル化されたグルコサミンのヘキサアシル化二糖である、Ｋｄｏ２－リピドＡである。

【0443】

ポリケチドは、古典的な酵素、ならびに脂肪酸シンターゼと機構的特徴を共有する反復およびマルチモジュラー酵素によるアセチルおよびプロピオニルサブユニットの重合によって合成される。それらは、動物、植物、細菌、真菌および海洋源からの多数の二次代謝物および天然産物を含み、大きな構造的多様性を有する。多くのポリケチドは、その骨格がしばしばグリコシル化、メチル化、ヒドロキシル化、酸化、または他のプロセスによってさらに修飾される環状分子である。

【0444】

本開示によれば、脂質および脂質様物質は、カチオン性、アニオン性または中性であり得る。中性脂質または脂質様物質は、選択されたｐＨで非荷電または中性の双性イオン形態で存在する。

【0445】

カチオン／カチオン性イオン化可能脂質
本明細書に記載の核酸粒子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ粒子など）は、粒子形成剤として少なくとも１つのカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質を含む。本明細書での使用が企図されるカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質には、核酸に静電的に結合することができる任意のカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質（脂質様材料を含む）が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書での使用が企図されるカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質は、例えば核酸と複合体を形成することによって、または核酸が封入もしくはカプセル化された小胞を形成することによって、核酸と会合することができる。

【0446】

本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」は、正味の正電荷を有する脂質または脂質様物質を指す。カチオン性脂質は、静電相互作用によって負に帯電した核酸に結合する。一般に、カチオン性脂質は、ステロール、アシル鎖、ジアシルまたはそれ以上のアシル鎖などの親油性部分を有し、脂質の頭部基は、典型的には正電荷を担持する。

【0447】

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、特定のｐＨ、特に酸性ｐＨでのみ正味の正電荷を有するが、好ましくは正味の正電荷を有さず、好ましくは電荷を有さず、すなわち、生理学的ｐＨなどの異なる、好ましくはより高いｐＨでは中性である。このイオン化可能な挙動は、生理学的ｐＨでカチオン性のままである粒子と比較して、エンドソーム脱出を助け、毒性を低減することによって有効性を高めると考えられる。

【0448】

本明細書で使用される場合、「カチオン性イオン化可能脂質」は、正味の正電荷を有するかまたは中性である、すなわち永久的にカチオン性ではない脂質または脂質様物質を指す。したがって、カチオン性イオン化可能脂質が溶解している組成物のｐＨに依存して、カチオン性イオン化性可能脂質は正に帯電しているかまたは中性のいずれかである。本開示の目的のために、カチオン性イオン化可能脂質は、状況によって矛盾しない限り、「カチオン性脂質」という用語に包含される。

【0449】

いくつかの実施形態では、カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質は、例えば生理学的条件下で、正に帯電しているかまたはプロトン化され得る少なくとも１つの窒素原子（Ｎ）を含む頭部基を含む。

【0450】

カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質の例としては、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシプロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；１，２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、２，３－ジ（テトラデコキシ）プロピル－（２－ヒドロキシエチル）ジメチルアザニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）、ｌ，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２－ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、および２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパナミウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９，１２－オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５’－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（シス、シス－９’，１２’－オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、２，３－ジリノレオイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロピルアミン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＣＤＡＰ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（ｃｉｓ－９－テトラデセニルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（ドデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＭＲＩＥ）、Ｎ－（２－アミノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（βＡＥ－ＤＭＲＩＥ）、Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロパン－１－アミニウム（ＤＯＢＡＱ）、２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＤＡＰ）、１，２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＤＡＰ）、Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチルカルボキサミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンズアミド（ＭＶＬ５）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、２，３－ビス（ドデシルオキシ）－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アモニウムブロミド（ＤＬＲＩＥ）、Ｎ－（２－アミノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）プロパン－１－アミニウムブロミド（ＤＭＯＲＩＥ）、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）８，８’－（（（（２（ジメチルアミノ）エチル）チオ）カルボニル）アザンジイル）ジオクタノエート（ＡＴＸ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（ドデシルオキシ）プロパン－１－アミン（ＤＬＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）プロパン－１－アミン（ＤＭＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）－９－（（４－（ジメチルアミノブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、Ｎ－ドデシル－３－（（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－｛２－［（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－２－｛（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－［２－（２－ドデシルカルバモイル－エチルアミノ）エチル］－アミノ｝－エチルアミノ）プロピオンアミド（リピドイド９８Ｎ_１２－５）、１－［２－［ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ］エチル－［２－［４－［２－［ビス（２ヒドロキシドデシル）アミノ］エチル］ピペラジン－１－イル］エチル］アミノ］ドデカン－２－オール（リピドイドＣ１２－２００）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0451】

いくつかの実施形態では、カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質はＤＯＴＭＡである。いくつかの実施形態では、カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質はＤＯＤＭＡである。

【0452】

ＤＯＴＭＡは、第四級アミン頭部基を有するカチオン性脂質である。ＤＯＴＭＡの構造は、以下のように表され得る：

【0453】

【化6】

【0454】

ＤＯＤＭＡは、第三級アミン頭部基を有するイオン化可能なカチオン性脂質である。ＤＯＤＭＡの構造は、以下のように表され得る：

【0455】

【化7】

【0456】

いくつかの実施形態では、カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質は、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％～約９５モル％、約２０モル％～約９５モル％、約２０モル％～約９０モル％、約３０モル％～約９０モル％、約４０モル％～約９０モル％、または約４０モル％～約８０モル％を構成し得る。

【0457】

さらなる脂質
本明細書に記載の粒子はまた、カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質（本明細書では集合的にカチオン性脂質とも呼ばれる）以外の脂質（脂質様物質を含む）、すなわち非カチオン性脂質（非カチオン性または非カチオン性イオン化可能脂質または脂質様物質を含む）を含み得る。集合的に、アニオン性および中性脂質または脂質様物質は、本明細書では非カチオン性脂質と呼ばれる。カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質に加えて、コレステロールおよび脂質などの他の疎水性部分を添加することによって核酸粒子の製剤を最適化することにより、粒子の安定性および核酸送達の有効性を高め得る。

【0458】

１つ以上のさらなる脂質は、核酸粒子の全体的な電荷に影響を及ぼしても及ぼさなくてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなる脂質は、非カチオン性脂質または脂質様物質である。非カチオン性脂質は、例えば、１つ以上のアニオン性脂質および／または中性脂質を含み得る。本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」は、選択されたｐＨで負に帯電している任意の脂質を指す。本明細書で使用される場合、「中性脂質」は、選択されたｐＨで非荷電または中性の双性イオン形態で存在するいくつかの脂質種のいずれかを指す。

【0459】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸粒子（特にｍＲＮＡを含む粒子）は、カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質および１つ以上のさらなる脂質を含む。

【0460】

理論に拘束されることを望むものではないが、１つ以上のさらなる脂質の量と比較したカチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質の量は、核酸の電荷、粒径、安定性、組織選択性、および生物活性などの重要な核酸粒子特性に影響を及ぼし得る。したがって、いくつかの実施形態では、カチオン性またはカチオン性イオン化可能脂質対１つ以上のさらなる脂質のモル比は、約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２、約４：１～約１：１、約３：１～約１：１、または約３：１～約２：１である。

【0461】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸粒子（特にｍＲＮＡを含む粒子）に含まれる１つ以上のさらなる脂質は、中性脂質、ステロイド、およびそれらの組合せの１つ以上を含む。

【0462】

いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなる脂質は、リン脂質である中性脂質を含む。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリンからなる群より選択される。使用することができる特定のリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンまたはスフィンゴミエリンが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなリン脂質としては、特に、ジアシルホスファチジルコリン、例えばジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジベヘノイルホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）、ジトリコサノイルホスファチジルコリン（ＤＴＰＣ）、ジリグノセロイルファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン、特にジアシルホスファチジルエタノールアミン、例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＧ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＰＰＧ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、Ｎ－パルミトイル－Ｄ－エリスロ－スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＭ）、および様々な疎水性鎖を有するさらなるホスファチジルエタノールアミン脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＧ、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＳＰＥ、およびＳＭからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質はＤＯＰＥである。

【0463】

いくつかの実施形態では、さらなる脂質は、以下のうちの１つを含む：（１）リン脂質；（２）コレステロールもしくはその誘導体；または（３）リン脂質とコレステロールもしくはその誘導体との混合物。コレステロール誘導体の例としては、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、トコフェロールおよびそれらの誘導体、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0464】

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸粒子（特にｍＲＮＡを含む粒子）は、（１）カチオン性もしくはカチオン性イオン化可能脂質およびＤＯＰＥなどのリン脂質、または（２）カチオン性もしくはカチオン性イオン化可能脂質およびＤＯＰＥなどのリン脂質およびコレステロールを含む。

【0465】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸粒子（特にｍＲＮＡを含む粒子）は、（１）ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥ、（２）ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびコレステロール、（３）ＤＯＤＭＡおよびＤＯＰＥ、または（４）ＤＯＤＭＡ、ＤＯＰＥおよびコレステロールを含む。

【0466】

ＤＯＰＥは中性リン脂質である。ＤＯＰＥの構造は、以下のように表され得る：

【0467】

【化8】

【0468】

コレステロールの構造は、以下のように表され得る：

【0469】

【化9】

【0470】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の粒子は、ペグ化脂質などのポリマーコンジュゲート脂質を含まない。「ペグ化脂質」という用語は、脂質部分とポリエチレングリコール部分の両方を含む分子を指す。ペグ化脂質は当技術分野で公知である。

【0471】

いくつかの実施形態では、さらなる脂質（例えば、１つ以上のリン脂質および／またはコレステロール）は、粒子中に存在する総脂質の約０モル％～約９０モル％、約０モル％～約８０モル％、約２モル％～約８０モル％、約５モル％～約８０モル％、約５モル％～約６０モル％、約５モル％～約５０モル％、約７．５モル％～約５０モル％、または約１０モル％～約４０モル％を構成し得る。いくつかの実施形態では、さらなる脂質（例えば、１つ以上のリン脂質および／またはコレステロール）は、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％、約１５モル％、または約２０モル％を構成する。

【0472】

いくつかの実施形態では、さらなる脂質は、（ｉ）ＤＯＰＥなどのリン脂質と、（ｉｉ）コレステロールまたはその誘導体との混合物を含む。いくつかの実施形態では、ＤＯＰＥなどのリン脂質対コレステロールまたはその誘導体のモル比は、約９：０～約１：１０、約２：１～約１：４、約１：１～約１：４または約１：１～約１：３である。

【0473】

ポリマーコンジュゲート脂質
いくつかの実施形態では、粒子は、少なくとも１つのポリマーコンジュゲート脂質を含み得る。ポリマーコンジュゲート脂質は、典型的には、脂質部分と、それにコンジュゲートしたポリマー部分とを含む分子である。いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲート脂質は、本明細書ではペグ化脂質またはＰＥＧ－脂質とも呼ばれる、ＰＥＧコンジュゲート脂質である。

【0474】

いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲート脂質は、疎水性脂質層を遮蔽する保護親水性層を形成することによって脂質粒子を立体的に安定化するように設計される。いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲート脂質は、そのような脂質粒子がインビボで投与される場合、血清タンパク質とのその会合および／または結果として生じる細網内皮系による取り込みを減少させることができる。

【0475】

様々なＰＥＧコンジュゲート脂質が当技術分野で公知であり、ペグ化ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、例えば１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ）、例えば、４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）、ペグ化セラミド（ＰＥＧ－ｃｅｒ）、またはＰＥＧジアルコキシプロピルカルバメート、例えば、ω－メトキシ（ポリエトキシ）エチル－Ｎ－（２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル）カルバメートまたは２，３－ジ（テトラデカノキシ）プロピル－Ｎ－（ωメトキシ（ポリエトキシ）エチル）カルバメートなどが含まれるが、これらに限定されない。

【0476】

いくつかの実施形態では、粒子は、その各々の内容全体が本明細書に記載の目的のために参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／０７５５３１号および国際公開第２０１８／０８１４８０号に記載されているような１つ以上のＰＥＧコンジュゲート脂質またはペグ化脂質を含み得る。

【0477】

リポプレックス粒子
本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）は、核酸リポプレックス粒子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡリポプレックス粒子など）中に存在し得る。

【0478】

リポプレックス（ＬＰＸ）は、一般に、予め形成されたカチオン性脂質リポソームをアニオン性核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）と混合することによって形成される静電複合体である。形成されたリポプレックスは、リポソーム構造からコンパクト核酸－リポプレックス（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡリポプレックスなど）への変換に起因して生じる分子の異なる内部配置を有する。これらの製剤は、一般に、核酸の封入が不十分であり、核酸の捕捉が不完全であることを特徴とする。

【0479】

特定の実施形態では、核酸リポプレックス粒子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡリポプレックス粒子など）は、カチオン性脂質とさらなる脂質の両方を含む。例示的な実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、さらなる脂質はＤＯＰＥである。

【0480】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質対少なくとも１つのさらなる脂質のモル比は、約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２、または約３：１～約１：１である。特定の実施形態では、モル比は、約３：１、約２．７５：１、約２．５：１、約２．２５：１、約２：１、約１．７５：１、約１．５：１、約１．２５：１、または約１：１であり得る。例示的な実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質対少なくとも１つのさらなる脂質のモル比は、約２：１である。

【0481】

本明細書に記載の核酸リポプレックス粒子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡリポプレックス粒子など）は、いくつかの実施形態では、約２００ｎｍ～約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ～約８００ｎｍ、約２５０～約７００ｎｍ、約４００～約６００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、または約３５０ｎｍ～約４００ｎｍの範囲の平均直径を有する。特定の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２００ｎｍ、約２２５ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２７５ｎｍ、約３００ｎｍ、約３２５ｎｍ、約３５０ｎｍ、約３７５ｎｍ、約４００ｎｍ、約４２５ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４７５ｎｍ、約５００ｎｍ、約５２５ｎｍ、約５５０ｎｍ、約５７５ｎｍ、約６００ｎｍ、約６２５ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７２５ｎｍ、約７５０ｎｍ、約７７５ｎｍ、約８００ｎｍ、約８２５ｎｍ、約８５０ｎｍ、約８７５ｎｍ、約９００ｎｍ、約９２５ｎｍ、約９５０ｎｍ、約９７５ｎｍ、または約１０００ｎｍの平均直径を有する。一実施形態では、核酸リポプレックス粒子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡリポプレックス粒子など）は、約２５０ｎｍ～約７００ｎｍの範囲の平均直径を有する。別の実施形態では、核酸リポプレックス粒子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡリポプレックス粒子など）は、約３００ｎｍ～約５００ｎｍの範囲の平均直径を有する。例示的な実施形態では、核酸リポプレックス粒子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡリポプレックス粒子など）は、約４００ｎｍの平均直径を有する。

【0482】

本明細書に記載の核酸リポプレックス粒子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡリポプレックス粒子など）ならびに核酸リポプレックス粒子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡリポプレックス粒子など）を含む組成物は、非経口投与後、特に静脈内投与後の標的組織への核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の送達に有用である。

【0483】

脾臓を標的とするＲＮＡリポプレックス粒子は、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／１４３６８３号に記載されている。正味の負電荷を有するＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓組織または脾臓細胞、例えば抗原提示細胞、特に樹状細胞を選択的に標的とするために使用し得ることが見出された。したがって、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示の核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）リポプレックス粒子は、脾臓において核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）を発現させるために使用され得る。一実施形態では、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）リポプレックス粒子の投与後、肺および／または肝臓における核酸（ＲＮＡなど）の蓄積および／または核酸（ＲＮＡなど）の発現は起こらないか、または本質的に起こらない。一実施形態では、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）リポプレックス粒子の投与後、脾臓のプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞における核酸（ＲＮＡなど）の蓄積および／または核酸（ＲＮＡなど）の発現が起こる。したがって、本開示の核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）リポプレックス粒子は、そのような抗原提示細胞において、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）、例えば、抗原または少なくとも１つのエピトープをコードする核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）を発現させるために使用され得る。一実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞および／またはマクロファージである。

【0484】

本開示の核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）リポプレックス粒子の電荷は、少なくとも１つのカチオン性脂質に存在する電荷と核酸（ＲＮＡなど）に存在する電荷との和である。電荷比は、少なくとも１つのカチオン性脂質中に存在する正電荷対核酸（ＲＮＡなど）中に存在する負電荷の比である。少なくとも１つのカチオン性脂質中に存在する正電荷対核酸（ＲＮＡなど）中に存在する負電荷の電荷比は、以下の式によって計算される：電荷比＝［（カチオン性脂質濃度（モル））＊（カチオン性脂質中の正電荷の総数）］／［（核酸（ＲＮＡなど）濃度（モル））＊（核酸（ＲＮＡなど）中の負電荷の総数）］。核酸（ＲＮＡなど）の濃度および少なくとも１つのカチオン性脂質の量は、当業者によって日常的な方法を使用して決定され得る。

【0485】

一実施形態では、生理学的ｐＨで、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）リポプレックス粒子における正電荷対負電荷の電荷比は、約１．６：２～約１：２、または約１．６：２～約１．１：２である。特定の実施形態では、生理学的ｐＨでの核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）リポプレックス粒子における正電荷対負電荷の電荷比は、約１．６：２．０、約１．５：２．０、約１．４：２．０、約１．３：２．０、約１．２：２．０、約１．１：２．０、または約１：２．０である。

【0486】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態で存在する。ＬＮＰは、１つ以上の核酸分子が結合している、または１つ以上の核酸分子が封入されている粒子を形成することができる任意の脂質を含み得る。

【0487】

ＬＮＰは、典型的には、４つの成分：イオン化可能なカチオン性脂質、リン脂質などの中性脂質、コレステロールなどのステロイド、およびＰＥＧ脂質などのポリマーコンジュゲート脂質を含む。ＬＮＰは、エタノールに溶解した脂質を水性緩衝液中で核酸と混合することによって調製され得る。

【0488】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）ＬＮＰにおいて、核酸（例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、特にｍＲＮＡ）は、ＬＮＰの中心コアを占めるイオン化可能な脂質によって結合される。ＰＥＧ脂質は、リン脂質と共にＬＮＰの表面を形成する。いくつかの実施形態では、表面は二重層を含む。いくつかの実施形態では、荷電形態および非荷電形態のコレステロールおよびイオン化可能な脂質は、ＬＮＰ全体に分布し得る。

【0489】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上のカチオン性脂質と、１つ以上の安定化脂質とを含む。安定化脂質には、中性脂質およびペグ化脂質が含まれる。

【0490】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質、および脂質ナノ粒子内に封入されているか、または脂質ナノ粒子と会合している核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）を含む。

【0491】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、４０～５５モル％、４０～５０モル％、４１～５０モル％、４２～５０モル％、４３～５０モル％、４４～５０モル％、４５～５０モル％、４６～５０モル％、または４６～４９モル％を含む。

【0492】

いくつかの実施形態では、中性脂質は、５～１５モル％、７～１３モル％、または９～１１モル％の範囲の濃度で存在する。

【0493】

いくつかの実施形態では、ステロイドは、３０～５０モル％、３５～４５モル％または３８～４３モル％の範囲の濃度で存在する。

【0494】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１～１０モル％、１～５モル％、または１～２．５モル％のポリマーコンジュゲート脂質を含む。

【0495】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、４５～５０モル％のカチオン性脂質；５～１５モル％の中性脂質；３５～４５モル％のステロイド；１～５モル％のポリマーコンジュゲート脂質；および脂質ナノ粒子内に封入されているか、または脂質ナノ粒子と会合している核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）を含む。

【0496】

いくつかの実施形態では、モルパーセントは、脂質ナノ粒子中に存在する脂質の総モルに基づいて決定される。いくつかの実施形態では、モルパーセントは、脂質ナノ粒子中に存在するカチオン性脂質、中性脂質、ステロイドおよびポリマーコンジュゲート脂質の総モルに基づいて決定される。

【0497】

いくつかの実施形態性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＧ、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＳＰＥ、およびＳＭからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。

【0498】

いくつかの実施形態では、ステロイドはコレステロールである。

【0499】

いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質である。いくつかの実施形態では、ペグ化脂質は、以下の構造：

【0500】

【化10】

【0501】

またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体を有し、ここで、
Ｒ^１２およびＲ^１３は、それぞれ独立して、１０～３０個の炭素原子を含む直鎖または分岐の飽和または不飽和アルキル鎖であり、アルキル鎖は、１つ以上のエステル結合によって中断されていてもよく、ｗは、３０～６０の範囲の平均値を有する。いくつかの実施形態では、Ｒ^１２およびＲ^１３は、それぞれ独立して、１２～１６個の炭素原子を含む直鎖の飽和アルキル鎖である。いくつかの実施形態では、ｗは、４０～５５の範囲の平均値を有する。いくつかの実施形態では、平均ｗは約４５である。いくつかの実施形態では、Ｒ^１２およびＲ^１３は、それぞれ独立して、約１４個の炭素原子を含む直鎖の飽和アルキル鎖であり、ｗは約４５の平均値を有する。

【0502】

いくつかの実施形態では、ペグ化脂質は、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミドであるか、またはそれを含む。

【0503】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰのカチオン性脂質成分は、式（ＩＩＩ）の構造：

【0504】

【化11】

【0505】

またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体を有し、ここで、
Ｌ^１またはＬ^２の一方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ^１またはＬ^２の他方は、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）_ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ－または－ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｏ－または直接結合であり；
Ｇ^１およびＧ^２は、それぞれ独立して、置換されていないＣ_１－Ｃ_１２アルキレンまたはＣ_１－Ｃ_１２アルケニレンであり；
Ｇ^３は、Ｃ_１－Ｃ_２４アルキレン、Ｃ_１－Ｃ_２４アルケニレン、Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルキレン、Ｃ_３－Ｃ_８シクロアルケニレンであり；
Ｒ^ａは、ＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり；
Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、Ｃ_６－Ｃ_２４アルキルまたはＣ_６－Ｃ_２４アルケニルであり；
Ｒ^３は、Ｈ、ＯＲ^５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^４または－ＮＲ^５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^４であり；
Ｒ^４はＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり；
Ｒ^５は、ＨまたはＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、；および
ｘは、０、１または２である。

【0506】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＡ）または（ＩＩＩＢ）：

【0507】

【化12】

【0508】

の１つを有し、ここで、
Ａは、３～８員のシクロアルキルまたはシクロアルキレン環であり；
Ｒ^６は、各存在において、独立してＨ、ＯＨまたはＣ_１－Ｃ_２４アルキルであり；
ｎは、１～１５の範囲の整数である。

【0509】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、脂質は構造（ＩＩＩＡ）を有し、他の実施形態では、脂質は構造（ＩＩＩＢ）を有する。

【0510】

式（ＩＩＩ）の他の実施形態では、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＣ）または（ＩＩＩＤ）：

【0511】

【化13】

【0512】

の１つを有し、ここで、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、１～１２の範囲の整数である。

【0513】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいずれかでは、Ｌ^１またはＬ^２の一方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２の各々は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。前述のいずれかのいくつかの異なる実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－または－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２の各々は－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－である。

【0514】

式（ＩＩＩ）のいくつかの異なる実施形態では、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＥ）または（ＩＩＩＦ）：

【0515】

【化14】

【0516】

の１つを有する。

【0517】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、脂質は、以下の構造（ＩＩＩＧ）、（ＩＩＩＨ）、（ＩＩＩＩ）または（ＩＩＩＪ）：

【0518】

【化15】

【0519】

の１つを有する。

【0520】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、ｎは、２～１２、例えば２～８または２～４の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｎは、３、４、５または６である。いくつかの実施形態では、ｎは３である。いくつかの実施形態では、ｎは４である。いくつかの実施形態では、ｎは５である。いくつかの実施形態では、ｎは６である。

【0521】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかの他の実施形態では、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、２～１０の範囲の整数である。例えば、いくつかの実施形態では、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、４～９または４～６の範囲の整数である。

【0522】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ^６はＨである。前述の実施形態の他の実施形態では、Ｒ^６はＣ_１－Ｃ_２４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ^６はＯＨである。

【0523】

式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態では、Ｇ^３は非置換である。他の実施形態では、Ｇ３は置換されている。様々な異なる実施形態では、Ｇ^３は、直鎖Ｃ_１－Ｃ_２４アルキレンまたは直鎖Ｃ_１－Ｃ_２４アルケニレンである。

【0524】

式（ＩＩＩ）のいくつかの他の前述の実施形態では、Ｒ^１もしくはＲ^２、またはその両方がＣ_６－Ｃ_２４アルケニルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、以下の構造：

【0525】

【化16】

【0526】

を有し、ここで、
Ｒ^７ａおよびＲ^７ｂは、各存在において、独立してＨまたはＣ_１－Ｃ_１２アルキルであり；ならびに
ａは２～１２の整数であり、
式中、Ｒ^７ａ、Ｒ^７ｂおよびａはそれぞれ、Ｒ^１およびＲ^２がそれぞれ独立して６～２０個の炭素原子を含むように選択される。例えば、いくつかの実施形態では、ａは、５～９または８～１２の範囲の整数である。

【0527】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ^７ａの少なくとも１つの存在はＨである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｒ^７ａは、各存在においてＨである。前述の実施形態の他の異なる実施形態では、Ｒ^７ｂの少なくとも１つの存在はＣ_１－Ｃ_８アルキルである。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ_１－Ｃ_８アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。

【0528】

式（ＩＩＩ）の異なる実施形態では、Ｒ^１もしくはＲ^２、またはその両方が、以下の構造：

【0529】

【化17】

【0530】

の１つを有する。

【0531】

式（ＩＩＩ）の前述の実施形態のいくつかでは、Ｒ^３は、ＯＨ、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^４または－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ^４である。いくつかの実施形態では、Ｒ^４は、メチルまたはエチルである。

【0532】

様々な異なる実施形態では、式（ＩＩＩ）のカチオン性脂質は、以下の表に示される構造の１つを有する。

【0533】

式（ＩＩＩ）の代表的な化合物。

【0534】

【表2】

【0535】

様々な脂質（例えば、カチオン性脂質、中性脂質およびポリマーコンジュゲート脂質を含む）が当技術分野で公知であり、本明細書では、脂質ナノ粒子、例えば特定の細胞型（例えば肝細胞）を標的とする脂質ナノ粒子を形成するために使用することができる。いくつかの実施形態では、中性脂質は、リン脂質もしくはその誘導体（例えば、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＳＣ））および／またはコレステロールであり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリマーコンジュゲート脂質は、ＰＥＧコンジュゲート脂質（例えば、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミドまたはその誘導体）であり得る。

【0536】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、式（ＩＩＩ）の脂質、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）、中性脂質、ステロイドおよびペグ化脂質を含む。いくつかの実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。いくつかの実施形態では、ステロイドはコレステロールである。いくつかの実施形態では、ペグ化脂質はＡＬＣ－０１５９である。

【0537】

ＡＬＣ－０１５９：

【0538】

【化18】

【0539】

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＬＮＰ中に約４５～約５０モル％の量で存在する。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＬＮＰ中に約５～約１５モル％の量で存在する。いくつかの実施形態では、ステロイドは、ＬＮＰ中に約３５～約４５モルパーセントの量で存在する。いくつかの実施形態では、ペグ化脂質は、ＬＮＰ中に約１～約５モル％の量で存在する。

【0540】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約４５～約５０モル％の量のカチオン性脂質、約５～約１５モル％の量のＤＳＰＣ、約３５～約４５モル％の量のコレステロール、および約１～約５モル％の量のＡＬＣ－０１５９を含む。

【0541】

Ｎ／Ｐ値は、好ましくは少なくとも約４である。いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ値は、４～２０、４～１２、４～１０、４～８、または５～７の範囲である。いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ値は約６である。

【0542】

トランスフェクト細胞における核酸の発現の測定
アミノ酸配列をコードする核酸でトランスフェクトした細胞において発現されたアミノ酸配列を定量化するために、核酸コード配列の１つ以上のペプチド、例えばコードされたアミノ酸配列のＣ末端に存在する固有のＭＩＴＤ（ＭＨＣクラスＩ輸送ドメイン）ペプチドまたは生物発光を生成するペプチドの特定の断片を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を使用して全細胞溶解物から定量化し得る。

【0543】

細胞の溶解
細胞を溶解するのに適した任意の方法を、本明細書に記載のアッセイにおいて使用し得る。いくつかの実施形態では、界面活性剤、例えば穏やかな双性イオン性界面活性剤、例えば、ＣＨＡＰＳ（３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホネート）および／またはＣＨＡＰＳＯ（３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホネート）を含む、例えば約７．５のｐＨを有する（例えばＨＣｌで調整された）トリス／ＨＣｌ緩衝液などの緩衝液が溶解緩衝液として使用される。溶解緩衝液は、ＥＤＴＡなどのキレート剤および／または１つ以上のプロテアーゼ阻害剤をさらに含み得る。

【0544】

以下の表は、溶解緩衝液調製物および最終成分濃度の一例を示す。

【0545】

【表3】

【0546】

発現産物の定量化
ペプチドおよびポリペプチドを定量化するのに適した任意の方法を、本明細書に記載のアッセイにおいて使用し得る。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィ－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）が使用される。いくつかの実施形態では、標的ＬＣ－ＭＳが使用される。

【0547】

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、液体クロマトグラフィの分離能と質量分析法の高感度かつ選択的な質量分析能力とを組み合わせた強力な分析技術である。目的の分析物を含有する試料溶液は、高圧で流れる移動相によって固定相（ＬＣカラム）にポンプ輸送される。試料、固定相および移動相の成分間の化学的相互作用は、分離に影響を及ぼすＬＣカラムを通る異なる移動速度に影響する。ＬＣカラムからの溶出後、流出物は質量分析計に導かれる。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステム用の質量分析計は、ＬＣカラム流出物がイオン化されて荷電粒子を生成するイオン化源を有する。次いで、これらの荷電粒子は、電磁場を印加することによって一連の質量分析装置を通って高真空下で移動する。この技術の強みは、ＭＳが目的の各化合物の固有の質量／電荷（ｍ／ｚ）遷移に基づいて高い感度および選択性で化合物を定量化する能力と組み合わされた、広範囲の化合物に対するＬＣの分離能にある。

【0548】

本明細書に記載のアッセイでモニターされるペプチドには、（１）発現された核酸のペプチド、例えばＭＩＴＤ７－２８、ペプチド１および／またはペプチド３（両方とも破傷風毒素由来）および／または生物発光を生成するペプチドの断片、（２）ハウスキーピングペプチド（適合性試験の評価および細胞ベースの構築物の効力の計算に使用される）、例えばＣｉＲＴ－０２、ＣｉＲＴ－０６、ＣｉＲＴ－０７、ＣｉＲＴ－１１、ＣｉＲＴ－１２および／またはＣｉＲＴ－１４、ならびに任意で（３）重標識合成ペプチド（保持時間調整、消化制御、クロマトグラフィ安定性の評価、ならびに試料調製およびＭＳ性能の追加情報に使用される）が含まれ得る。

【0549】

いくつかの実施形態では、記載されるアッセイでモニターされる発現核酸のペプチドは、ＭＩＴＤ７－２８（ＧＧＳＹＳＱＡＡＳＳＤＳＡＱＧＳＤＶＳＬＴＡ）、ペプチド１（ＦＩＧＩＴＥＬＫ）およびペプチド３（ＩＹＳＹＦＰＳＶＩＳＫ）からなる群より選択される１つ以上を含む。

【0550】

いくつかの実施形態では、記載されるアッセイでモニターされるハウスキーピングペプチドは、アクチン、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１２、熱ショックタンパク質ＳＳＡ３、ＡＤＰ／ＡＴＰトランスロカーゼおよび／または１４－３－３タンパク質からなる群より選択されるタンパク質に由来する１つ以上のペプチドを含む。いくつかの実施形態では、記載されるアッセイでモニターされるハウスキーピングペプチドは、ＣｉＲＴ－０２（ＡＧＦＡＧＤＤＡＰＲ；アクチン）、ＣｉＲＴ－０６（ＩＧＰＬＧＬＳＰＫ；６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１２）、ＣｉＲＴ－０７（ＴＴＰＳＹＶＡＦＴＤＴＥＲ；熱ショックタンパク質ＳＳＡ３）、ＣｉＲＴ－１１（ＳＹＥＬＰＤＧＱＶＩＴＩＧＮＥＲ；アクチン）、ＣｉＲＴ－１２（ＹＦＰＴＱＡＬＮＦＡＦＫ；ＡＤＰ／ＡＴＰトランスロカーゼ）および／またはＣｉＲＴ－１４（ＤＳＴＬＩＭＱＬＬＲ；１４－３－３タンパク質）からなる群より選択される１つ以上を含む。

【0551】

核酸を含む組成物
本明細書に記載される１つ以上の核酸を、例えば核酸粒子の形態で含む組成物は、塩、緩衝液、または以下にさらに記載されるような他の成分を含み得る。

【0552】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物に使用するための塩は、塩化ナトリウムを含む。理論に拘束されることを望むものではないが、塩化ナトリウムは、脂質と混合する前に核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）を前処理するためのイオン性浸透圧剤として機能する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、代替の有機塩または無機塩を含み得る。代替の塩としては、限定されないが、塩化カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一カリウム、酢酸カリウム、重炭酸カリウム、硫酸カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩化カルシウム、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のナトリウム塩が挙げられる。

【0553】

一般に、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）粒子を保存するため、例えば核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）粒子を凍結するための組成物は、低い塩化ナトリウム濃度を含むか、または低いイオン強度を含む。いくつかの実施形態では、塩化ナトリウムは、０ｍＭ～約５０ｍＭ、０ｍＭ～約４０ｍＭ、または約１０ｍＭ～約５０ｍＭの濃度である。

【0554】

本開示によれば、本明細書に記載の核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）粒子組成物は、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）粒子の安定性、特に核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）の安定性に適したｐＨを有する。理論に拘束されることを望むものではないが、緩衝系の使用は、組成物の製造、貯蔵および使用中に本明細書に記載の粒子組成物のｐＨを維持する。本開示のいくつかの実施形態では、緩衝系は、溶媒（特に水、例えば脱イオン水、特に注射用水）および緩衝物質を含み得る。緩衝物質は、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオール（トリス）、酢酸塩およびヒスチジンから選択され得る。好ましい緩衝物質はＨＥＰＥＳである。

【0555】

本明細書に記載の組成物はまた、例えば凝集、粒子崩壊、核酸（例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、特にｍＲＮＡ）分解および／または他の種類の損傷を低減または防止するために、生成物の品質の実質的な損失、特に保存、凍結および／または凍結乾燥中の核酸（例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、特にｍＲＮＡ）活性の実質的な損失を回避するための安定剤として凍結保護剤および／または界面活性剤を含み得る。

【0556】

一実施形態では、凍結保護剤は炭水化物である。本明細書で使用される「炭水化物」という用語は、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖および多糖を指し、それらを包含する。

【0557】

一実施形態では、凍結保護剤は単糖である。本明細書で使用される「単糖」という用語は、より単純な炭水化物単位に加水分解することができない単一の炭水化物単位（例えば単純糖）を指す。例示的な単糖凍結保護剤としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、リボースなどが挙げられる。

【0558】

一実施形態では、凍結保護剤は二糖である。本明細書で使用される「二糖」という用語は、グリコシド結合、例えば１～４個の結合または１～６個の結合を介して互いに結合している２つの単糖単位によって形成される化合物または化学部分を指す。二糖は、２つの単糖に加水分解され得る。例示的な二糖凍結保護剤としては、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトースなどが挙げられる。

【0559】

「三糖」という用語は、互いに結合して１つの分子を形成する３つの糖を意味する。三糖の例としては、ラフィノース、メレジトースが挙げられる。

【0560】

一実施形態では、凍結保護剤はオリゴ糖である。本明細書で使用される「オリゴ糖」という用語は、グリコシド結合、例えば１～４個の結合または１～６個の結合を介して互いに結合して直鎖、分岐または環状構造を形成する３～約１５個、例えば３～約１０個の単糖単位によって形成される化合物または化学部分を指す。例示的なオリゴ糖凍結保護剤としては、シクロデキストリン、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース、スタキオース、アカルボースなどが挙げられる。オリゴ糖は、酸化または還元され得る。

【0561】

一実施形態では、凍結保護剤は環状オリゴ糖である。本明細書で使用される「環状オリゴ糖」という用語は、グリコシド結合、例えば１～４個の結合または１～６個の結合を介して互いに結合して環状構造を形成する３～約１５個、例えば６、７、８、９または１０個の単糖単位によって形成される化合物または化学部分を指す。例示的な環状オリゴ糖凍結保護剤としては、αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、またはγシクロデキストリンなどの別個の化合物である環状オリゴ糖が挙げられる。

【0562】

他の例示的な環状オリゴ糖凍結保護剤には、環状オリゴ糖部分を含有するポリマーなどの、より大きな分子構造中にシクロデキストリン部分を含む化合物が含まれる。環状オリゴ糖は、酸化または還元することができ、例えばジカルボニル形態に酸化することができる。本明細書で使用される「シクロデキストリン部分」という用語は、ポリマーなどのより大きな分子構造に組み込まれる、またはその一部であるシクロデキストリン（例えば、α、βまたはγシクロデキストリン）ラジカルを指す。シクロデキストリン部分は、１つ以上の他の部分に直接または任意のリンカーを介して結合することができる。シクロデキストリン部分は、酸化または還元することができ、例えばジカルボニル形態に酸化することができる。

【0563】

炭水化物凍結保護剤、例えば環状オリゴ糖凍結保護剤は、誘導体化された炭水化物であり得る。例えば、一実施形態では、凍結保護剤は、誘導体化環状オリゴ糖、例えば誘導体化シクロデキストリン、例えば２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、例えば部分エーテル化シクロデキストリン（例えば部分的にエーテル化されたβシクロデキストリン）である。

【0564】

例示的な凍結保護剤は多糖である。本明細書で使用される「多糖類」という用語は、グリコシド結合、例えば１～４個の結合または１～６個の結合を介して互いに結合して直鎖、分岐または環状構造を形成する少なくとも１６個の単糖単位によって形成される化合物または化学部分を指し、多糖をその骨格構造の一部として含むポリマーを含む。骨格において、多糖は直鎖状または環状であり得る。例示的な多糖凍結保護剤としては、グリコーゲン、アミラーゼ、セルロース、デキストラン、マルトデキストリンなどが挙げられる。

【0565】

いくつかの実施形態では、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）粒子組成物はスクロースを含み得る。理論に拘束されることを望むものではないが、スクロースは、組成物の凍結保護を促進するように機能し、それにより、核酸（例えばＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、特にｍＲＮＡ）粒子の凝集を防止し、組成物の化学的および物理的安定性を維持する。いくつかの実施形態では、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）粒子組成物は、スクロースに代わる代替凍結保護剤を含み得る。代替の安定剤としては、限定されないが、トレハロースおよびグルコースが挙げられる。特定の実施形態では、スクロースの代替安定剤は、トレハロースまたはスクロースとトレハロースとの混合物である。

【0566】

好ましい凍結保護剤は、スクロース、トレハロース、グルコース、およびそれらの組合せ、例えばスクロースとトレハロースの組合せからなる群より選択される。好ましい実施形態では、凍結保護剤はスクロースである。

【0567】

本開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）組成物におけるキレート剤の使用を企図する。キレート剤とは、金属イオンと少なくとも２つの配位共有結合を形成し、それによって安定な水溶性錯体を生成することができる化合物を指す。理論に拘束されることを望むものではないが、キレート剤は、さもなければ本開示において加速された核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）分解を誘導し得る、遊離二価イオンの濃度を低下させる。適切なキレート剤の例としては、限定されないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＤＴＡの塩、デスフェリオキサミンＢ、デフェロキサミン、ジチオカルブナトリウム、ペニシラミン、ペンテト酸カルシウム、ペンテト酸のナトリウム塩、スクシマー、トリエンチン、ニトリロ三酢酸、トランス－ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、およびビス（アミノエチル）グリコールエーテル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、キレート剤は、ＥＤＴＡまたはＥＤＴＡの塩である。例示的な実施形態では、キレート剤は、ＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物である。いくつかの実施形態では、ＥＤＴＡは、約０．０５ｍＭ～約５ｍＭ、約０．１ｍＭ～約２．５ｍＭ、または約０．２５ｍＭ～約１ｍＭの濃度である。

【0568】

代替的な実施形態では、本明細書に記載の核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡなど）粒子組成物は、キレート剤を含まない。

【0569】

本明細書に記載される核酸を含み、任意で粒子に製剤化された組成物は、治療的または予防的処置のための医薬組成物または薬剤として、または医薬組成物または薬剤を調製するために有用であり得る。

【0570】

「医薬組成物」という用語は、治療上有効な薬剤を、好ましくは薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤と共に含む組成物に関する。前記医薬組成物は、前記医薬組成物を対象に投与することによって疾患を治療する、予防する、または疾患の重症度を軽減するのに有用である。

【0571】

本開示の医薬組成物は、１つ以上のアジュバントを含み得るか、または１つ以上のアジュバントと共に投与され得る。「アジュバント」という用語は、免疫応答を延長、増強または加速する化合物に関する。アジュバントは、油エマルジョン（例えばフロイントアジュバント）、無機化合物（ミョウバンなど）、細菌産物（百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素など）、または免疫刺激複合体などの不均一な群の化合物を含む。アジュバントの例としては、限定されることなく、ＬＰＳ、ＧＰ９６、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、成長因子、およびサイトカイン、例えばモノカイン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカインが挙げられる。ケモカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＮＦａ、ＩＮＦ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＬＴ－ａであり得る。さらなる公知のアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバント、またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１などの油である。本開示で使用するための他の適切なアジュバントとしては、Ｐａｍ３Ｃｙｓなどのリポペプチド、ならびにサポニン、トレハロース－６，６－ジベヘネート（ＴＤＢ）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、モノミコロイルグリセロール（ＭＭＧ）、またはグルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）などの親油性成分が挙げられる。

【0572】

本開示の医薬組成物は、保存可能な形態（例えば、凍結もしくは凍結乾燥／フリーズドライ形態）または「すぐに使用できる形態」（すなわち、例えば希釈などのいかなる処理も行わずに、対象に直ちに投与することができる形態）であり得る。したがって、医薬組成物の保存可能な形態の投与前に、この保存可能な形態をすぐに使用できる形態または投与可能な形態に処理または移行しなければならない。例えば、適切な溶媒（例えば注射用水などの脱イオン水）または液体（例えば水溶液）を使用することによって、凍結医薬組成物を解凍しなければならないか、または凍結乾燥医薬組成物を再構成しなければならない。

【0573】

本開示による医薬組成物は、一般に、「薬学的有効量」および「薬学的に許容される製剤」で適用される。

【0574】

「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。

【0575】

「薬学的有効量」という用語は、単独でまたはさらなる用量と共に所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患の治療に関するいくつかの実施形態では、所望の反応は、疾患の経過の阻害に関連し得る。これは、疾患の進行を遅らせること、およびいくつかの実施形態では、疾患の進行を中断するまたは逆転させることを含む。疾患の治療における所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の予防であり得る。本明細書に記載の医薬組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個々のパラメータ、治療期間、付随する治療の種類（存在する場合）、特定の投与経路ならびに同様の因子に依存する。したがって、本明細書に記載の医薬組成物の投与される用量は、様々なそのようなパラメータに依存し得る。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（または異なる、より局所的な投与経路によって達成される効果的により高い用量）を使用し得る。

【0576】

本開示の医薬組成物は、緩衝剤、防腐剤、および任意で他の治療薬を含有し得る。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、および／または賦形剤を含有する。

【0577】

本開示の医薬組成物で使用するための適切な防腐剤には、限定されることなく、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが含まれる。

【0578】

本明細書で使用される「賦形剤」という用語は、本開示の医薬組成物中に存在し得るが、活性成分ではない物質を指す。賦形剤の例としては、限定されないが、担体、結合剤、希釈剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤、または着色剤が挙げられる。

【0579】

「希釈剤」という用語は、希釈するおよび／または希薄にする薬剤に関する。さらに、「希釈剤」という用語は、流体、液体または固体の懸濁液および／または混合媒体のいずれか１つ以上を含む。適切な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロールおよび水が挙げられる。

【0580】

「担体」という用語は、医薬組成物の投与を容易にする、増強するまたは可能にするために活性成分が組み合わされる、天然、合成、有機、無機であり得る成分を指す。本明細書で使用される担体は、対象への投与に適した１つ以上の適合性の固体または液体充填剤、希釈剤または封入物質であり得る。適切な担体としては、限定されないが、滅菌水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、滅菌塩化ナトリウム溶液、等張食塩水、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に、生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーが挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は等張食塩水を含む。

【0581】

治療的使用のための薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤は、製薬分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。

【0582】

医薬担体、賦形剤または希釈剤は、意図される投与経路および標準的な製薬慣行に関して選択することができる。

【0583】

医薬組成物の投与経路
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、皮内、経皮、節内、筋肉内、腫瘍内、または腫瘍周囲に投与され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与または全身投与用に製剤化される。全身投与には、消化管を介した吸収を含む経腸投与、または非経口投与が含まれ得る。本明細書で使用される場合、「非経口投与」は、静脈内注射などによる、消化管を介する以外の任意の方法での投与を指す。いくつかの実施形態では、医薬組成物は全身投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、全身投与は静脈内投与によるものである。

【0584】

組成物の使用
本明細書に記載される核酸を含み、任意で粒子に製剤化された組成物は、様々な疾患、特にペプチドまたはポリペプチドを対象に提供することが治療効果または予防効果をもたらす疾患の治療的または予防的処置に使用され得る。例えば、ウイルスに由来する抗原またはエピトープを提供することは、前記ウイルスによって引き起こされるウイルス性疾患の治療に有用であり得る。腫瘍抗原またはエピトープを提供することは、癌細胞が前記腫瘍抗原を発現する癌疾患の治療に有用であり得る。機能性タンパク質または酵素を提供することは、例えばリソソーム蓄積症（例えばムコ多糖症）または因子欠乏症における機能不全タンパク質を特徴とする遺伝性障害の治療に有用であり得る。サイトカインまたはサイトカイン融合物を提供することは、腫瘍微小環境を調節するのに有用であり得る。

【0585】

「疾患」（本明細書では「障害」とも呼ばれる）という用語は、個体の身体に影響を及ぼす異常な状態を指す。疾患はしばしば、特定の症状および徴候に関連する医学的状態として解釈される。疾患は、感染症などの外部源に由来する因子によって引き起こされ得るか、または自己免疫疾患などの内部機能不全によって引き起こされ得る。ヒトでは、「疾患」はしばしば、罹患した個体に疼痛、機能不全、窮迫、社会的問題、もしくは死亡を引き起こす、または個体と接触するものに対して同様の問題を引き起こす状態を指すためにより広く使用される。このより広い意味では、疾患は時に、損傷、無力、障害、症候群、感染、孤立した症状、逸脱した挙動、ならびに構造および機能の非定型の変化を含むが、他の状況および他の目的では、これらは区別可能なカテゴリと見なされ得る。多くの疾患を患い、それらと共に生活することは、人生観および人格を変える可能性があるため、疾患は通常、身体的だけでなく感情的にも個体に影響を及ぼす。

【0586】

本文脈において、「治療」、「治療する」または「治療的介入」という用語は、疾患などの状態と闘うことを目的とした対象の管理およびケアに関する。この用語は、症状もしくは合併症を緩和するため、疾患、障害もしくは状態の進行を遅らせるため、症状および合併症を緩和もしくは軽減するため、ならびに／または疾患、障害もしくは状態を治癒もしくは排除するため、ならびに状態を予防するための治療上有効な化合物の投与などの、対象が罹患している所与の状態に対するあらゆる範囲の治療を含むことを意図しており、予防は、疾患、状態または障害と闘うことを目的とした個体の管理およびケアとして理解されるべきであり、症状または合併症の発症を防止するための活性化合物の投与を含む。

【0587】

「治療的処置」という用語は、個体の健康状態を改善する、および／または寿命を延長する（増加させる）任意の治療に関する。前記治療は、個体における疾患を排除し得る、個体における疾患の発症を停止もしくは遅延させ得る、個体における疾患の発症を阻害もしくは遅延させ得る、個体における症状の頻度もしくは重症度を低下させ得る、および／または現在疾患を有しているかもしくは以前に有していたことがある個体における再発を減少させ得る。

【0588】

「予防的処置」または「防止的処置」という用語は、個体において疾患が発生するのを防ぐことを意図した任意の治療に関する。「予防的処置」または「防止的処置」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0589】

「個体」および「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、疾患（例えば癌、感染症）に罹患し得るかもしくは罹患しやすいが、疾患を有していても有していなくてもよい、またはワクチン接種などの予防的介入を必要としてもよく、またはタンパク質補充などによる介入の必要性を有していてもよい、ヒトもしくは別の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマもしくは霊長動物）、または鳥（ニワトリ）、魚もしくは他の任意の動物種を含む他の任意の非哺乳動物を指す。多くの実施形態では、個体はヒトである。特に明記されない限り、「個体」および「対象」という用語は特定の年齢を示すものではなく、したがって成人、高齢者、小児、および新生児を包含する。本開示の実施形態では、「個体」または「対象」は「患者」である。

【0590】

「患者」という用語は、治療のための個体または対象、特に疾患個体または対象を意味する。

【0591】

本明細書に記載のアッセイによる効力を有する核酸、特にＲＮＡは、対象の細胞に核酸を送達するために対象に投与され得る。

【0592】

本明細書に記載のアッセイによる効力を有する核酸、特にＲＮＡは、治療用または予防用ペプチドまたはポリペプチド（例えば、薬学的に活性なペプチドまたはポリペプチド）を対象に送達するために対象に投与され得、ここで、核酸は、治療用または予防用ペプチドまたはポリペプチドをコードする。

【0593】

本明細書に記載のアッセイによる効力を有する核酸、特にＲＮＡは、対象における疾患を治療または予防するために対象に投与され得、対象の細胞に核酸を送達することは、疾患を治療または予防するのに有益である。

【0594】

本明細書に記載のアッセイによる効力を有する核酸、特にＲＮＡは、対象における疾患を治療または予防するために対象に投与され得、ここで、核酸は、治療用または予防用ペプチドまたはポリペプチドをコードし、治療用または予防用ペプチドまたはポリペプチドを対象に送達することは、疾患を治療または予防するのに有益である。

【0595】

いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載の組成物中に存在する。

【0596】

いくつかの実施形態では、核酸は、薬学的有効量で投与される。

【0597】

いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。

【0598】

本開示のいくつかの実施形態では、目的は、ワクチンを提供することによって免疫応答を誘導することである。

【0599】

当業者は、免疫療法およびワクチン接種の原理の１つが、治療される疾患に関して免疫学的に関連する抗原またはエピトープで対象を免疫することによって疾患に対する免疫保護反応が生じるという事実に基づくことを理解するであろう。したがって、本明細書に記載の核酸は、免疫応答を誘導または増強するために適用可能である。したがって、本明細書に記載の核酸は、抗原またはエピトープが関与する疾患の予防的および／または治療的処置に有用である。

【0600】

本開示のいくつかの実施形態では、目的は、ワクチン接種によって癌を治療することである。

【0601】

本開示のいくつかの実施形態では、目的は、ワクチン接種によって感染症に対する保護を提供することである。

【0602】

本開示のいくつかの実施形態では、目的は、抗体、二重特異性抗体、サイトカイン、サイトカイン融合タンパク質、酵素などの分泌された治療用タンパク質を対象、特にそれを必要とする対象に提供することである。

【0603】

本開示のいくつかの実施形態では、目的は、エリスロポエチン、第ＶＩＩ因子、フォン・ヴィレブランド因子、β－ガラクトシダーゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼの産生などのタンパク質補充療法を対象、特にそれを必要とする対象に提供することである。

【0604】

本開示のいくつかの実施形態では、目的は、血液中の免疫細胞を調節／再プログラムすることである。

【0605】

本開示のいくつかの実施形態では、目的は、腫瘍微小環境を調節する１つ以上のサイトカインまたはサイトカイン融合物を対象、特にそれを必要とする対象に提供することである。

【0606】

本開示のいくつかの実施形態では、目的は、抗腫瘍活性を有する１つ以上のサイトカインまたはサイトカイン融合物を対象、特にそれを必要とする対象に提供することである。

【0607】

本明細書で参照される文書および試験の引用は、前述のいずれかが関連する先行技術であることの承認を意図するものではない。これらの文書の内容に関する全ての記述は、出願人が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の内容の正確さに関するいかなる承認も構成しない。

【0608】

説明（以下の実施例を含む）は、当業者が様々な実施形態を作成および使用することを可能にするために提示される。具体的な装置、技術、および用途の説明は、例としてのみ提供される。本明細書に記載される例に対する様々な変更は、当業者には容易に明らかであり、本明細書で定義される一般的な原理は、様々な実施形態の精神および範囲から逸脱することなく他の例および用途に適用され得る。したがって、様々な実施形態は、本明細書に記載され、示される例に限定されることを意図するものではなく、特許請求の範囲と一致する範囲を与えられるべきである。
以下、参考形態の例を付記する。
［１］
生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡを分析するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）前記ＲＮＡを提供する工程；
（ｉｉ）インビトロで細胞に前記ＲＮＡをトランスフェクトする工程；
（ｉｉｉ）生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列の発現を可能にする工程；
（ｉｖ）生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列またはその断片の量を決定する工程；および
（ｖ）生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列またはその断片の量を、生物系において生物学的活性を誘導する前記ＲＮＡの効力の指標として使用する工程
を含む方法。
［２］
前記細胞が生物系のＲＮＡ取り込み機構を模倣する、［１］に記載の方法。
［３］
前記生物系がヒト患者に存在する、［２］に記載の方法。
［４］
前記生物系が抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞を含む、［２］または［３］に記載の方法。
［５］
前記樹状細胞が未成熟樹状細胞を含む、［４］に記載の方法。
［６］
前記細胞が、マクロピノサイトーシス媒介ＲＮＡ取り込み機構および／またはエンドソーム取り込みを特徴とする、［１］～［５］のいずれか一つに記載の方法。
［７］
前記細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの動物細胞株の細胞である、［１］～［６］のいずれか一つに記載の方法。
［８］
生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列の前記断片が、前記発現されるアミノ酸配列に特異的である、［１］～［７］のいずれか一つに記載の方法。
［９］
生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列の前記断片が、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列に含まれない、［１］～［８］のいずれか一つに記載の方法。
［１０］
生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列の前記断片が、抗原プロセシングおよび／または提示を増強するアミノ酸配列またはその断片を含む、［１］～［９］のいずれか一つに記載の方法。
［１１］
抗原プロセシングおよび／または提示を増強する前記アミノ酸配列が、ＭＨＣ分子、好ましくはＭＨＣクラスＩ分子の膜貫通および細胞質ドメインに対応するアミノ酸配列を含む、［１０］に記載の方法。
［１２］
抗原プロセシングおよび／または提示を増強する前記アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、［１０］または［１１］に記載の方法。
［１３］
生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列の前記断片が、免疫寛容を破壊するアミノ酸配列またはその断片を含む、［１］～［９］のいずれか一つに記載の方法。
［１４］
免疫寛容を破壊する前記アミノ酸配列が、ヘルパーエピトープ、好ましくは破傷風トキソイド由来のヘルパーエピトープを含む、［１３］に記載の方法。
［１５］
免疫寛容を破壊する前記アミノ酸配列が、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、もしくは８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、［１３］または［１４］に記載の方法。
［１６］
生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列またはその断片の量を決定する前に細胞を溶解する工程を含む、［１］～［１５］のいずれか一つに記載の方法。
［１７］
生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列またはその断片の量を決定する前に前記細胞溶解物を処理する工程をさらに含む、［１６］に記載の方法。
［１８］
前記細胞溶解物を処理する工程が、変性、還元、プロテアーゼ消化（例えば、トリプシン、Ｇｌｕ－Ｃ、ＬｙｓＮ、Ｌｙｓ－Ｃ、Ａｓｐ－Ｎキモトリプシン、またはこれらのプロテアーゼのいずれか２つ以上の混合物を用いた消化）、アルキル化、乾燥、再構成および脱塩から、例えばトリプシン消化、アルキル化および脱塩から選択される１つ以上を含む、［１７］に記載の方法。
［１９］
生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列またはその断片の量が、質量分析を用いて決定される、［１］～［１８］のいずれか一つに記載の方法。
［２０］
生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列またはその断片の量が、液体クロマトグラフィ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、例えば標的ＬＣ－ＭＳを用いて決定される、［１］～［１９］のいずれか一つに記載の方法。
［２１］
生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列またはその断片の量が、前記細胞によって発現される１つ以上のアミノ酸配列を定量化のための参照として使用して決定される、［１］～［２０］のいずれか一つに記載の方法。
［２２］
前記細胞によって発現される前記１つ以上のアミノ酸配列が、ハウスキーピングタンパク質の１つ以上のアミノ酸配列を含む、［２１］に記載の方法。
［２３］
生物系において生物学的活性を誘導する前記ＲＮＡの効力が、前記ＲＮＡの治療効力を含む、［１］～［２２］のいずれか一つに記載の方法。
［２４］
生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列またはその断片の量が所定のカットオフを上回る場合、前記ＲＮＡが生物系において生物学的活性を誘導するのに十分な効力、例えば治療効力を有する、［１］～［２４］のいずれか一つに記載の方法。
［２５］
生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列またはその断片の量が所定のカットオフ未満である場合、前記ＲＮＡが生物系において生物学的活性を誘導するのに十分な効力、例えば治療効力を有さない、［１］～［２４］のいずれか一つに記載の方法。
［２６］
前記所定のカットオフが、生物系において生物学的活性を誘導するための許容される効力、例えば治療効力を有することが公知のＲＮＡを使用して決定される、［２４］または［２５］に記載の方法。
［２７］
前記所定のカットオフを決定するために使用される前記ＲＮＡと前記分析されるＲＮＡとが同じ化学組成を有する、［２４］～［２６］のいずれか一つに記載の方法。
［２８］
同じＲＮＡの異なるバッチを分析するためのものである、［１］～［２７］のいずれか一つに記載の方法。
［２９］
生物系において生物学的活性を誘導するのに十分な効力、例えば治療効力を有するＲＮＡもしくはＲＮＡバッチが治療に使用されるかもしくは使用されることになっており、および／または生物系において生物学的活性を誘導するのに十分な効力、例えば治療効力を有さないＲＮＡもしくはＲＮＡバッチが治療に使用されないかもしくは使用されないことになっている、［１］～［２８］のいずれか一つに記載の方法。
［３０］
生物系において生物学的活性を誘導する前記ＲＮＡの効力、例えば前記ＲＮＡの治療効力が、前記ＲＮＡの治療品質などの品質を反映する、［１］～［２９］のいずれか一つに記載の方法。
［３１］
前記ＲＮＡの品質が、前記ＲＮＡが有害な条件に曝露されたかどうかおよび／またはどの程度曝露されたかを反映する、［３０］に記載の方法。
［３２］
前記有害な状態が熱を含む、［３１］に記載の方法。
［３３］
生物系において生物学的活性を誘導する前記ＲＮＡの効力、例えば前記ＲＮＡの治療効力が、前記ＲＮＡの完全性および／または前記ＲＮＡのキャッピングを反映する、［１］～［３２］のいずれか一つに記載の方法。
［３４］
生物系において生物学的活性を誘導する前記ＲＮＡの効力を分析するためのものである、［１］～［３３］のいずれか一つに記載の方法。
［３５］
生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列またはその断片の量が、生物系において生物学的活性を誘導する前記ＲＮＡの効力を示す、［１］～［３４］のいずれか一つに記載の方法。
［３６］
前記ＲＮＡの品質および／または量が生物系において生物学的活性を誘導するのに十分であるかどうかを分析するためのものである、［１］～［３５］のいずれか一つに記載の方法。
［３７］
生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列またはその断片の量が、前記ＲＮＡの品質および／または量が生物系において生物学的活性を誘導するのに十分であるかどうかを示す、［１］～［３６］のいずれか一つに記載の方法。
［３８］
前記生物学的活性が、疾患関連系において特異的応答を誘発する能力を含む、［１］～［３７］のいずれか一つに記載の方法。
［３９］
前記特異的応答が免疫応答を含む、［３８］に記載の方法。
［４０］
前記免疫応答がＴ細胞応答を含む、［３９］に記載の方法。
［４１］
生物学的活性を有する前記ペプチドまたはポリペプチドが、ワクチン、補充療法のためのタンパク質、抗体、抗体様分子およびサイトカインからなる群より選択される、［１］～［４０］のいずれか一つに記載の方法。
［４２］
前記ＲＮＡが一本鎖ＲＮＡである、［１］～［４１］のいずれか一つに記載の方法。
［４３］
前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、［１］～［４２］のいずれか一つに記載の組成物。
［４４］
前記ＲＮＡがＲＮＡのインビトロ転写によって生成される、［１］～［４３］のいずれか一つに記載の方法。
［４５］
前記ＲＮＡが５’キャップ構造を含む、［１］～［４４］のいずれか一つに記載の方法。
［４６］
前記ＲＮＡが送達ビヒクルと共に製剤化される、［１］～［４５］のいずれか一つに記載の方法。
［４７］
前記ＲＮＡが、前記ＲＮＡと複合体を形成する１つ以上の化合物と共に製剤化される、［１］～［４５］のいずれか一つに記載の方法。
［４８］
前記ＲＮＡが粒子として製剤化される、［１］～［４７］のいずれか一つに記載の方法。
［４９］
前記ＲＮＡがリポプレックス粒子として製剤化される、［１］～［４８］のいずれか一つに記載の方法。
［５０］
前記ＲＮＡが脂質粒子として製剤化される、［１］～［４９］のいずれか一つに記載の方法。
［５１］
生物学的活性を有する前記ペプチドまたはポリペプチドがワクチンである、［１］～［５０］のいずれか一つに記載の方法。
［５２］
前記ワクチンがＴ細胞ワクチンである、［５１］に記載の方法。
［５３］
前記ＲＮＡが異なるＲＮＡの混合物を含み、各ＲＮＡが、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする、［１］～［５２］のいずれか一つに記載の方法。
［５４］
異なるＲＮＡの前記混合物が、生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含む異なるアミノ酸配列をコードするＲＮＡを含む、［５３］に記載の方法。
［５５］
前記異なるアミノ酸配列が、生物学的活性を有する異なるペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含む、［５４］に記載の方法。
［５６］
生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡが生物系において生物学的活性を誘導する効力を分析するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）前記ＲＮＡを提供する工程；
（ｉｉ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの動物細胞株の細胞にインビトロでＲＮＡをトランスフェクトする工程；
（ｉｉｉ）生物学的活性を有するペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列の発現を可能にする工程；
（ｉｖ）前記細胞を溶解する工程；
（ｖ）前記細胞溶解物を処理する工程；および
（ｖｉ）生物学的活性を有するペプチドもしくはポリペプチドのアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列またはその断片の量を、質量分析を用いて決定する工程であって、前記動物細胞株の細胞によって発現される１つ以上のアミノ酸配列を定量化のための参照として使用する、工程を含む方法。

【実施例】

【0609】

（実施例１）
正当化細胞株（ＣＨＯ）－マクロピノサイトーシスによる取り込み
マクロピノサイトーシスによってＲＮＡ－ＬＰＸを取り込む標的細胞である樹状細胞（ＤＣ）は、ロットレリンによって阻害され得る特殊なプロセスを採用する（Ｋｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．２０１６）。以前の報告は、ＣＨＯ細胞がマクロピノサイトーシスを介して様々なナノ粒子（脂質ベースのナノ粒子を含む）を取り込むこともできることを実証している（Ｈｕｆｎａｇｌｅ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｐｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．２０１４；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１１）。

【0610】

ＣＨＯ細胞の特性評価試験により、ＲＮＡ－ＬＰＸの効率的かつ用量依存的な取り込みが確認された（図１）。この取り込みは、マクロピノサイトーシス阻害剤ロットレリンによって拮抗される。これらのデータは、ＤＣ細胞およびＣＨＯ細胞の両方におけるＲＮＡ－ＬＰＸ取り込み機構が主にマクロピノサイトーシスによって駆動されることを実証する。

【0611】

（実施例２）
正当化細胞株（ＣＨＯ）－ＲＮＡ－ＬＰＸコード抗原の細胞内局在
以前の報告では、ＲＮＡがコードするタンパク質構築物がプロセシングされ、抗原提示細胞から原形質膜に導かれたことが示されている（Ｋｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２００８）。ＤＣおよびＣＨＯ細胞を、腫瘍抗原（ＭＡＧＥ Ａ３）をコードするＲＮＡ－ＬＰＸと共インキュベートし、翻訳されたＭＡＧＥ Ａ３タンパク質の局在化を評価した。両方の細胞型において、ＲＮＡから翻訳されたＭＡＧＥ Ａ３タンパク質は検出可能であり、形質細胞膜の同じ細胞区画に局在していた（図２）。データは、ＤＣおよびＣＨＯ細胞がＲＮＡコードタンパク質を同様の方法で翻訳し、プロセシングすることを示している。

【0612】

（実施例３）
正当化細胞株（ＣＨＯ）－ＲＮＡがコードする機能性タンパク質のＲＮＡ－ＬＰＸ用量依存的検出
定量的効力アッセイの典型的な特徴は、薬物に対する初期の低い応答、線形部分および薬物からの飽和を示すプラトーを伴うシグモイド用量反応関係である。本発明者らは、レポータタンパク質として増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードするＲＮＡ－ＬＰＸの発現を用いてＤＣ細胞およびＣＨＯ細胞におけるＲＮＡ－ＬＰＸ用量反応関係を分析した。両方の細胞型は、初期相および線形相と用量依存性を示し、両方とも高いＲＮＡ－ＬＰＸ投与量に感受性である（プラトー相）（図３、図４；ＣＨＯについては図５にも、およびＬＣ－ＭＳ読み出しは図６のパネルＣにも）。これは、腫瘍抗原および別の読み出しについても実証された（図８および図１１）。対照的に、無細胞アッセイ（網状赤血球溶解物）において同じＲＮＡを使用すると、キャップされたＲＮＡとキャップされていないＲＮＡの両方について用量依存的なシグナル増加が観察された（図５のパネルＣ）。これは、本明細書に開示される効力アッセイが、キャップされていないＲＮＡとキャップされたＲＮＡとを区別することができるのに対して、無細胞アッセイは、キャップされていないＲＮＡとキャップされたＲＮＡとを区別することができない可能性があることを示す。

【0613】

（実施例４）
正当化細胞株（ＣＨＯ）－ストレス負荷試料による分析
ＲＮＡ－ＬＰＸの製品品質の低下に対するＤＣと比較したＣＨＯ細胞の感受性を評価するために、熱ストレスを負荷したｅＧＦＰ ＲＮＡ－ＬＰＸ試料を用いた以下の実験を実施した。まず、ｅＧＦＰ ＲＮＡ－ＬＰＸ試料を、製品品質を低下させる（例えばＲＮＡの完全性の低下）ことが公知のストレス条件である４０℃で３日間保存した。ストレス負荷した試料、ならびにストレス負荷していない対照ｅＧＦＰ ＲＮＡ－ＬＰＸ参照試料をＤＣ細胞およびＣＨＯ細胞にリポフェクトした。レポータタンパク質シグナル（すなわち、タンパク質の翻訳／機能の評価）に対するＲＮＡ－ＬＰＸ産物の品質の影響を直接決定する。アッセイは、両方の細胞型において製剤の変動に対する感受性を有することが分かった（図４）。

【0614】

効力アッセイの読み出しに対するＲＮＡ品質の影響をさらに分析するために、本発明者らは、４０～９５％のＲＮＡ完全性レベルを有するＲＮＡおよび５’キャップなしで製造されたＲＮＡを用いて製造された一連のｅＧＦＰ－ＲＮＡ－ＬＰＸ製剤バッチを試験した。図６に示すように、ｅＧＦＰ蛍光シグナルはＭＳベースの相対的に定量化されたペプチドの量に正比例するので、本発明者らは、製剤バッチの分析のためにｅＧＦＰ蛍光読み取り値を測定した。全てのＲＮＡ－ＬＰＸを、蛍光シグナルを観測した２４時間のインキュベーション時間内に用量依存的方法で試験した（図５）。

【0615】

本発明者らは、ｅＧＦＰタンパク質の活性量とＲＮＡ完全性の程度との直接的な相関関係を見出した（図５Ａ）。さらに、キャップされていないＲＮＡバッチではシグナルは検出されず、機能性の喪失を示した（図５Ｂ）。真核生物ＲＮＡの翻訳効率および安定性は、５’キャップなどのシス作用要素に強く依存するので、これは予想された（Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0616】

（実施例５）
概念実証－細胞溶解物中のコード化ペプチドのＬＣ－ＭＳ検出
ＭＳに基づく効力アッセイの概念実証を、レポータ遺伝子（ｅＧＦＰ）を代理マーカとして用いて示した。ｅＧＦＰの使用は、蛍光の定量化からの読み取り値およびＭＳシグナルの直接的な定量的比較を並行して可能にした。細胞を異なる用量のｅＧＦＰ－ＲＮＡ－リポプレックスと共にインキュベートし、発現を観測した（図６、パネルＡ）。一晩インキュベートした後、細胞を洗浄し、回収し、溶解した。溶解物の蛍光強度を消化前に分析した（図６、パネルＣの青色曲線）。その後、消化した溶解物をｎａｎｏＵＰＬＣシステムで分離し、ペプチドをＭＳ／ＭＳによって分析した。本発明者らは、処理した溶解物中で１６個のｅＧＦＰ特異的ペプチドを同定した（図６、パネルＢ）（モックトランスフェクト細胞溶解物中では全く同定しなかった）。最も適切な３つのペプチド（例えば電荷、長さ／質量に関して）を、標識を含まない相対的な定量化のために選択し、溶解物のｅＧＦＰ蛍光強度シグナルと直接比較した（図６、パネルＣ）。両方のシグナル（ＭＳ対蛍光）は、分析された線量範囲で直接相関し、予想されたシグモイド曲線特性を再び示す。

【0617】

データは、活性なコードされたタンパク質からのシグナル、すなわち蛍光およびＭＳペプチド定量化が、非常に類似した用量反応曲線で直接相関することを明確に実証する。これは、コードされた生物学的に活性なｅＧＦＰタンパク質由来の特異的ペプチドが、無標識ＭＳアプローチを介したリポフェクション後の細胞溶解物において検出および同定され得ることを実証した。さらに、特異的ペプチドは用量依存的方法で相対的に定量化することができ、それらは細胞によって発現される機能性タンパク質の量を直接反映する。

【0618】

ｅＧＦＰレポータタンパク質による概念実証の後、本発明者らは、６つの代表的なｉＮｅＳＴ構築物によってコードされるｉＮｅＳＴ特異的ペプチドをさらに検出および定量化することができるかどうかを分析した（以下の表を参照）。したがって、本発明者らは、６つの異なるＲＮＡ－リポプレックス代表的構築物で細胞を別々にトランスフェクトし、Ｃ末端の定常ＭＩＴＤペプチドの相対量を分析した（図１３参照）。

【0619】

試験した代表的なｉＮｅＳＴ ＲＮＡ配列

【0620】

【表4】

【0621】

６つ全てのｉＮｅＳＴ代表的構築物について、本発明者らは、コードされたＭＩＴＤペプチドを、リポフェクトされた細胞においてのみ特異的に見出した（やはり、モック細胞溶解物またはトランスフェクトされていない細胞溶解物では見出さなかった）。これは、発現されたネオ抗原構築物由来の特異的ペプチドもまた、提案された無標識ＭＳアプローチを介してリポフェクション後の細胞溶解物において検出および同定され得ることを実証した。興味深いことに、翻訳レベル、すなわちＭＩＴＤペプチドの量は、個別化ネオ抗原構築物について約２０倍変動する（図７および図９）。

【0622】

ｉＮｅＳＴ特異的構築物のＲＮＡ－ＬＰＸもシグモイド用量反応関係（正当化細胞株（ＣＨＯ）－ＲＮＡがコードする機能性タンパク質のＲＮＡ－ＬＰＸ用量依存的検出のセクション、図３を参照）を示すかどうかを分析するために、ＭＩＴＤ翻訳レベルが最も低い２つのｉＮｅＳＴ構築物（ｉＮｅＳＴ５および６）を用いて異なる濃度で実験を繰り返した。上述のデータ（図３および図６）と同様に、本発明者らは、ｉＮｅＳＴ構築物について直接的なシグモイド用量反応関係を見出した（図８）。ｅＧＦＰデータと比較して、本発明者らは、コードされた腫瘍抗原の活性（例えば表面局在化および免疫学的読み出し）も用量反応関係に従うことを実証することができた（図１１参照）。要約すると、本発明者らのＬＣ－ＭＳアプローチと組み合わせた本発明者らの細胞モデル系は、定量的効力アッセイの典型的な特徴であるシグモイド用量反応関係を示す。

【0623】

（実施例６）
概念実証－ストレス負荷された試料による分析
効力アッセイの必要性の１つは、放出試験だけでなく安定性試験のための使用でもある。ｉＮｅＳＴ ＬＰＸ試料およびＬＣ－ＭＳ製剤効力アッセイを使用してストレス負荷試料に対する実証された細胞感受性も検出できることを検証するために、一連の異なる実験を実施した。生成物の安定性を評価するために、本発明者らは、熱からの加速ストレスに供した安定性試験から６つ全ての代表的なｉＮｅＳＴデザインスペースＲＮＡ－ＬＰＸを測定した。それぞれの非ストレス負荷対照を含む全ての試料を、３つの異なる用量レベルで細胞に適用し、ＬＣ－ＭＳ効力アッセイによって分析した（図９）。全てのストレス負荷ｉＮｅＳＴデザインスペースＲＮＡ－ＬＰＸ試料について、ＭＩＴＤペプチドの量の明確な減少が見られ、さらに、これは全ての適用したＲＮＡ－ＬＰＸ投与量について可視である。

【0624】

さらに、ＬＣ－ＭＳ効力測定に対する２つの加速ストレス時点（２および１０日）の影響を分析した。２つの時点の理論的根拠は、８０％のＲＮＡ完全性仕様限界を上回るおよび下回る異なるレベルのＲＮＡ完全性を有する試料を得ることであった（図１０）。これらの試料を、未処理対照試料と同様に細胞に添加し、ＬＣ－ＭＳ測定によって分析した。再び、全てのストレス負荷ｉＮｅＳＴ ＲＮＡ－ＬＰＸについて力価の明らかな低下が見られ、これもストレス時間依存性である。興味深いことに、効力の読み出しは、ＲＮＡの完全性の低下に対して非常に感受性である。１０～１５％のＲＮＡ完全性の喪失は、２５％～７５％の効力活性の低下をもたらし、さらに、８０％のＲＮＡ完全性仕様を下回る喪失は、効力活性のさらにより大きな低下をもたらした。

【0625】

要約すると、データは、ＬＣ－ＭＳ効力アッセイが、投与後のタンパク質の翻訳量に影響を及ぼし得る製剤品質の損失を高感度に検出できることを実証する。これらの変化は、ＲＮＡの完全性の喪失、キャッピング効果の変動、ＲＮＡ品質の他の局面の変動、ならびに翻訳に影響を及ぼす複合体化状態の変動を含む。ＬＣ－ＭＳアッセイは、高度に安定であることを示している（これは、効力アッセイのための必須条件と考えられ得る）。

【0626】

（実施例７）
概念実証－ＲＮＡ－ＬＰＸの生物学的効果は生物学的機能と用量依存的に直接相関する
最終的な相関は、（ｉ）ＬＣ－ＭＳアプローチを介して定量化された抗原特異的ペプチドの量、（ｉｉ）ネイティブ染色された細胞の免疫蛍光顕微鏡法を介して測定された抗原構築物のプロセシング、および（ｉｉｉ）Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴアッセイを介して検出された機能的読み出しの間に存在するべきである。２つの異なる腫瘍抗原（ヒト白血球抗原［ＨＬＡ］クラスＩおよびクラスＩＩ拘束性）について、本発明者らは、ＬＣ－ＭＳアプローチによって定量化された抗原特異的ペプチドと抗原構築物の表面局在化（プロセシング）との間の直接的な用量依存関係を検出した。さらに、ＨＬＡ－Ａ＊０１０１を発現する腫瘍抗原ＭＡＧＥ－Ａ３ ＲＮＡ－ＬＰＸトランスフェクトＣＨＯ細胞は、ＭＡＧＥ－Ａ３－ＴＣＲ発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞をＲＮＡ－ＬＰＸ用量依存的に刺激することができることが実証された（図１１Ａ）。ＣＨＯ細胞がＨＬＡクラスＩＩ拘束性エピトープをプロセシングおよび提示して、抗原特異的Ｔ細胞刺激を誘導することができるかどうかを評価するために、ＨＬＡ－ＤＱＢＡ１＊０１０２／ＤＱＢ１＊０５０１拘束性ＨＰＶ－Ｅ７特異的ＴＣＲを使用して同じ実験を行った（図１１Ｂ）。ＨＬＡ－ＤＱＢＡ１＊０１０２／ＤＱＢ１＊０５０１を発現するＨＰＶ－Ｅ７ ＲＮＡ－ＬＰＸトランスフェクトＣＨＯ細胞は、ＨＰＶ－Ｅ７－ＴＣＲ発現Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞をＲＮＡ－ＬＰＸ用量依存的に刺激することができた。

【0627】

３つ全ての読み出し（ＬＣ－ＭＳ；ＡＢおよびＪｕｒｋａｔ）について、ＤＣの関連する測定値と同様のシグモイド用量反応曲線を再び見出すことができる（図３および４参照）。これは、検出されたペプチドの量（ＬＣ－ＭＳ）が活性タンパク質の量（Ｊｕｒｋａｔ）に再び直接的に関連することを実証する（ｅＧＦＰと同様、図６Ｃ参照）。要約すると、これらのデータは、ＣＨＯ細胞がＲＮＡ－ＬＰＸを取り込み、抗原コードＲＮＡを細胞内でプロセシングし、（ＨＬＡ分子を人工的に備えている場合）Ｔ細胞の同族活性化のためにＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子のいずれかでそれを提示する方法に関与する機構に関して、ＣＨＯ細胞がＤＣの適切なモデルであることを示す。これらのデータはまた、ＣＨＯ細胞へのＲＮＡ－ＬＰＸ投与後に得られるトランスフェクトされたＲＮＡおよび翻訳されたタンパク質の量が、ＨＬＡ拘束的にそれぞれの抗原を認識するＴ細胞の活性化のレベルについて直接的に関連し、堅固な指標であることを実証する。ＬＣ－ＭＳ効力の読み出しは、ＲＮＡ－ＬＰＸの生物学的活性を完全に予測する。

【0628】

（実施例８）
ＬＣ－ＭＳアッセイによる腫瘍抗原構築物の試験
レポータｅＧＦＰ遺伝子による検証の後、適用された溶解プロトコルが膜貫通（ＴＲＭ）タンパク質を溶解するのに適していること、および本発明者らの関連するＴＲＭドメインペプチド（ＭＩＴＤ）に対する本発明者らのＭＳアプローチの実現可能性を示すために、３つの腫瘍抗原構築物（図１４）をＬＣ－ＭＳアッセイで試験した。ＴＲＭドメインペプチド（ＭＩＴＤ）の理論的特徴（例えば長さ、電荷／質量）に基づいて、このペプチドはＭＳ分析においてあまり機能しないことが予想される。したがって、本発明者らは、ＭＳベースの相対定量化において良好に機能するはずである免疫学的にコードされた構築物中の２つの代替ペプチド（Ｐ１およびＰ２、ｐ２ｐ１６領域）を分析する（図１５）。

【0629】

実験は、ｅＧＦＰ－ＲＮＡ－リポプレックス概念実証実験と同様の方法で実施した。ここでも、用量依存的方法での細胞のリポフェクションを行った。一晩のインキュベーション後、細胞を溶解し、消化し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定によって相対的に定量化した。事前に、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法を３つの新たな特異的ペプチドに適合させた。予想されたように、３つ全ての構築物の３つのユニークなペプチド（ペプチド＃１；ペプチド＃２およびＭＩＴＤ）が、リポフェクトされた細胞の溶解物において同定された（図１５）。さらに、ペプチドを相対的に定量化することができ、ＲＮＡ－リポプレックス用量依存的に発現させた。ここでも、これらの３つの構築物に由来するペプチドのほとんどについて、予想されるシグモイド用量反応曲線（図１５）の検出を得ることができる。

【0630】

（実施例９）
ＬＣ／ＭＳ効力アッセイ：ブリッジングデータ
ＬＣ－ＭＳ効力アッセイの読み出しが直交分析インビトロ読み出しと相関するかどうかを分析するために以下の試験を実施した（実施例７と同様、図１１）。適用されたＤＰ用量は、アッセイの線形範囲内になるように選択した。

【0631】

試験デザイン：特定の癌タイプ内で共有されるｍＲＮＡコード非変異抗原の２つの異なる固定された組合せ（組合せ１；４つの異なる抗原／組合せ２；２つの異なる抗原）を試験した。６つ全てのＤＰについて、３つの試料（非ストレス負荷、ならびに熱ストレスをそれぞれ３日間および１０日間負荷）をＬＣ－ＭＳ効力に供した；Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ（ＨｅｐＧ２細胞、Ｒ＆Ｄ下で実施したＧＭＰ放出アッセイ）；Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ（ＣＨＯ細胞）；トランスフェクト細胞のネイティブ免疫蛍光（ＩＦ）染色（主な分析はＬＣ－ＭＳ対Ｊｕｒｋａｔ（ＨｅｐＧ２）である）。全てのアッセイが全ての構築物について利用可能であるわけではない（例えばＩＦ；Ｊｕｒｋａｔ ＣＨＯ））。構築物あたり３つ全てのＤＰ（３日間ストレス負荷、１０日間ストレス負荷および非ストレス負荷）を線形用量レベルで分析した。

【0632】

図１６は、ＭＡＧＥ Ａ３（図１６Ａ）またはＴＰＴＥ（図１６Ｂ）腫瘍抗原をコードするＤＰ（ＲＮＡ－ＬＰＸ；組合せ１）で用量依存的にリポフェクトした細胞についての実験を示す。その後、異なる分析読み出し（ＬＣ－ＭＳ；Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ（ＨｅｐＧ２またはＣＨＯ細胞を含む）および定量的免疫蛍光顕微鏡法（ＩＦ））を並行して行い、結果を線形適合させ、比較する。２つの条件（３日間（四角）および１０日間（丸））で加速熱ストレス負荷した各ＤＰ、さらに非ストレス負荷ＤＰ（三角）を用量依存的に細胞に適用した。エラーバーは標準偏差を表す。

【0633】

図１７は、非ストレス負荷（右の値）、３日間（中央の値）および１０日間（左の値）ストレス負荷したＤＰの様々な分析結果の評価および比較（ＬＣ－ＭＳ対ＪｕｒｋａｔおよびＲＮＡ完全性（ＣＥ）対ＬＣ－ＭＳ）を示す。様々な分析測定の線形適合の勾配をグラフにプロットし、線形回帰によって適合させた。

【0634】

全てのアッセイは、ＬＣ－ＭＳアッセイとの直接的な線形相関を示す。

【0635】

図１８は、ＬＣ－ＭＳ（図の右側のバー）およびＪｕｒｋａｔアッセイ（図の左側のバー）の結果のさらなる評価および比較を示す。そのために、用量反応曲線のデータ点をＧＭＰソフトウェアＰＬＡを用いて分析した。異なるストレス負荷試料を非ストレス負荷試料（１００％効力として設定）と比較し、ＰＬＡソフトウェアを使用してそれぞれの効力を計算する。ＬＣ－ＭＳおよびＪｕｒｋａｔアッセイの値は非常によく一致しており、ＬＣ－ＭＳがＴ細胞刺激読み出しを直接示すことを示している。

【0636】

図１９は、ＴＹＲ（図１９Ａ）またはＮＹ－ＥＳＯ（図１９Ｂ）をコードするＤＰ（ＲＮＡ－ＬＰＸ；組合せ１）で用量依存的にリポフェクトした細胞についての実験を示す。その後、異なる分析読み出し（ＬＣ－ＭＳ；Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ（ＨｅｐＧ２を含む））を並行して行い、結果を線形適合させ、比較する。２つの条件（３日間（四角）および１０日間（丸））で加速熱ストレス負荷した各ＤＰ、さらに非ストレス負荷ＤＰ（三角）を用量依存的に細胞に適用した。エラーバーは標準偏差を表す。

【0637】

図２０は、非ストレス負荷（右の値）、３日間（中央の値）および１０日間（左の値）ストレス負荷したＤＰの様々な分析結果の評価および比較（ＬＣ－ＭＳ対ＪｕｒｋａｔおよびＲＮＡ完全性（ＣＥ）対ＬＣ－ＭＳ）を示す。様々な分析測定の線形適合の勾配をグラフにプロットし、線形回帰によって適合させた。

【0638】

全てのアッセイは、直接的な線形相関を示す。

【0639】

図２１は、ＬＣ－ＭＳ（図の右側のバー）およびＪｕｒｋａｔアッセイ（図の左側のバー）の結果のさらなる評価および比較を示す。そのために、用量反応曲線のデータ点をＧＭＰソフトウェアＰＬＡを用いて分析した。異なるストレス負荷試料を非ストレス負荷試料（１００％効力として設定）と比較し、ＰＬＡソフトウェアを使用してそれぞれの効力を計算する。ＬＣ－ＭＳおよびＪｕｒｋａｔアッセイの値は非常によく一致しており、ＬＣ－ＭＳがＴ細胞刺激読み出しを直接示すことを示している。

【0640】

図２２は、Ｅ６（図２２Ａ）またはＥ７（図２２Ｂ）腫瘍抗原をコードするＤＰ（ＲＮＡ－ＬＰＸ；組合せ２）で用量依存的にリポフェクトした細胞についての実験を示す。その後、異なる分析読み出し（ＬＣ－ＭＳ；Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ（ＨｅｐＧ２またはＣＨＯを含む）および定量的免疫蛍光顕微鏡法（ＩＦ））を並行して行い、結果を線形適合させ、比較する。２つの条件（３日間（四角）および１０日間（丸））で加速熱ストレス負荷した各ＤＰ、さらに非ストレス負荷ＤＰ（三角）を用量依存的に細胞に適用した。エラーバーは標準偏差を表す。

【0641】

図２３は、非ストレス負荷（右の値）、３日間（中央の値）および１０日間（左の値）ストレス負荷したＤＰの様々な分析結果の評価および比較（ＬＣ－ＭＳ対ＪｕｒｋａｔおよびＲＮＡ完全性（ＣＥ）対ＬＣ－ＭＳ）を示す。様々な分析測定の線形適合の勾配をグラフにプロットし、線形回帰によって適合させた。

【0642】

全てのアッセイは、直接的な線形相関を示す。

【0643】

図２４は、ＬＣ－ＭＳ（図の右側のバー）およびＪｕｒｋａｔアッセイ（図の左側のバー）の結果のさらなる評価および比較を示す。そのために、用量反応曲線のデータ点を相対効力ＧＭＰソフトウェアＰＬＡを用いて分析した。異なるストレス負荷試料を非ストレス負荷試料（１００％効力として設定）と比較し、ＰＬＡソフトウェアを使用してそれぞれの効力を計算する。ＬＣ－ＭＳおよびＪｕｒｋａｔアッセイの値はよく一致しており、ＬＣ－ＭＳがＴ細胞刺激読み出しを直接示すことを示している。

【0644】

要約すると、全てのアッセイは、（ｉ）試験した全ての抗原について直接的な線形ＤＰ用量関係、（ｉｉ）ストレス負荷したＤＰ試料についてより低い活性、これは試験した全ての投与量について見られる、および（ｉｉｉ）試験した全てのＤＰおよび投与量について活性の非常に類似した相関（非ストレス負荷＞３日間ストレス負荷＞１０日間ストレス負荷）を示す。さらに、ＬＣ－ＭＳの読み出しもＲＮＡの完全性（ＣＱＡ）と相関しており、Ｔ細胞活性化（Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ）と直接相関している。

【0645】

（実施例１０）
ＬＣ／ＭＳ効力アッセイ：ブリッジングデータ
以下の試験は、（ｉ）ＬＣ－ＭＳ効力アッセイの読み出しが他の医薬品製剤、例えばＬＮＰベースの製剤に適用可能であるかどうかを分析し、ＬＣ－ＭＳアッセイをＲＮＡベースのナノ粒子の一般的な効力プラットフォームアッセイとして可能にする；（ｉｉ）１つのＤＰ（１つのＤＰは、４つの異なる抗原をコードする４つの異なるＲＮＡを含む、「１バイアル」アプローチ）中の複数の抗原をＬＣ－ＭＳ効力アッセイによって分析することができるＰｏＣを提供する；（ｉｉｉ）ＬＣ－ＭＳアッセイが異なるＲＮＡ形態（ｕＲＮＡおよびｍｏｄＲＮＡ）に適用可能であることを実証する；（ｉｖ）ＬＣ－ＭＳ効力アッセイがＤＮＡトランスフェクションに適用可能であるＰｏＣを提供する；ならびに（ｖ）ＬＣ－ＭＳ効力がｐ２ｐ１６ペプチド定量化データに基づいて適用可能であることを実証するために実施した。

【0646】

試験デザイン：２つの異なるＬＮＰを試験した。両方のＤＰをＬＣ－ＭＳ効力アッセイに供した（細胞培養部分をＬＮＰにわずかに適合させ（長期および投薬）、ＬＣ－ＭＳ部分を特定のコードされたペプチドに適合させる）。２つ全てのＬＮＰ ＤＰを異なる用量レベルで分析して、用量反応曲線を作成した。Ｔ細胞ストリングをコードするＲＮＡ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｔ細胞エピトープの融合タンパク質をコードするＲＮＡ）および４つの異なる結核抗原をコードするＲＮＡを使用した。

【0647】

Ｔ細胞ストリングをコードするＲＮＡに関して、ＣＨＯ細胞にＡＴＭまたはＣＴＭ ＤＰ（ＬＮＰ）をトランスフェクトした。ＤＰを用量依存的に（０．７５～９μｇ、非翻訳細胞（ＵＴ）も対照として分析した）細胞に適用した。ＲＮＡの取り込みおよび翻訳の後、細胞を回収し、溶解し、ＭＳ試料調製に供した。２つのＴ細胞特異的ペプチドをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（ＰＲＭ）によって分析し、正規化した発現値をプロットした。

【0648】

図２５の結果は、ＬＣ－ＭＳアプローチがＬＮＰ形態に適用可能であることを実証する。Ｔ細胞ストリング融合構築物は、ブランク（ＵＴ）を除く全ての試料において一貫して同定された。さらに、ペプチド量の用量依存的増加が観察された。３～６μｇのトランスフェクトされたＤＰ ＬＮＰの間で飽和が始まり、９μｇをトランスフェクトするとペプチド量の減少が観察された。ＡＴＭのトランスフェクションは、全体として、ＣＴＭと比較してより高い翻訳レベルの融合構築物をもたらす。

【0649】

結核抗原をコードするＲＮＡに関して、ＣＨＯ細胞に、ｕＲＮＡまたはｍｏｄＲＮＡを有するＤＰ ＡＴＭ（ＬＮＰ）をトランスフェクトした。各ＤＰは、８つのＴＢ抗原から構成される４つの融合タンパク質（Ａｇ８５Ａ＋Ｈｒｐ１；ＥＳＡＴ６＋ＲｐｆＤ；Ｍ７２＋ＶａｐＢ４７；ＲｐｆＡ＋ＨｂｈＡ）をコードする４つのＲＮＡを含む。ＤＰを用量依存的に（１５０～２４００ｎｇ）細胞に適用した。取り込みおよび翻訳の後、細胞を回収し、溶解し、ＭＳ試料調製に供した。ＴＢ抗原特異的ペプチドをＰＲＭによって分析した。エラーバーは標準偏差を表す。

【0650】

図２６の結果は、ＬＣ－ＭＳアプローチが、ＬＮＰ形態、他の抗原、および他の特異的ＬＣ－ＭＳ分析ペプチドに適用可能であることを実証する。４つのＲＮＡを含有するＤＰ（「１バイアル」アプローチ）について、全てのＲＮＡが翻訳されることが実証されている。ＬＣ－ＭＳ効力は、１バイアルアプローチに適用可能である。全ての抗原は、ＲＮＡ形態とは無関係に検出することができる（ｍｏｄＲＮＡ対ｕＲＮＡ）。ブランク試料は翻訳を示さない。３つのＲＮＡは用量依存的に翻訳された（ＥＳＡＴ６－ＲｐｆＤはおそらく強く分泌された融合タンパク質であり、および／または翻訳効率が低い）。

【0651】

さらなる実験では、ＣＨＯ細胞に、レポータルシフェラーゼをコードするＲＮＡを含有するＬＮＰ対照をトランスフェクトし、ルシフェラーゼは分泌型であった。ＤＰを１用量で三連で細胞に適用した。取り込みおよび翻訳の後、細胞を回収し、溶解し、ＭＳ試料調製に供した。ルシフェラーゼ特異的ペプチドをＰＲＭによって分析した。エラーバーは標準偏差を表す。

【0652】

図２７の結果は、タンパク質が分泌される場合でさえも、ルシフェラーゼ特異的ペプチドが検出され得ることを実証する。ブランク試料はシグナルを示さず、翻訳を示さない。

【0653】

さらなる実験は、ＤＮＡがｅＧＦＰをコードする、ＤＮＡ－リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ，１１６６８０３０）、ロット：２４１８９５３）による２４時間のリポフェクション後のＣＨＯ細胞の二重蛍光測定を含んだ。４つの異なるＤＮＡ－リポフェクタミン用量（２２５～１８００ｎｇ）を細胞に適用した。ＤＮＡの取り込みおよび翻訳の後、細胞を回収し、溶解し、ＭＳ試料調製に供した。細胞のｅＧＦＰ蛍光シグナル（蛍光強度）は、２つの異なるＧＦＰ特異的ペプチド（Ｔｏｐ１およびＴｏｐ２）に由来するｅＧＦＰ ＭＳ／ＭＳペプチドシグナル強度（ＭＳシグナル）と比較して相関していた。

【0654】

図２８の結果は、ＬＣ－ＭＳ効力アッセイがＤＮＡにも適用可能であることを実証する。ＬＣ－ＭＳ定量化ペプチドはどちらも、細胞の蛍光シグナルに対して直接的な線形相関を示す。

【0655】

さらなる実験では、細胞を、５つの異なる腫瘍抗原をコードするＤＰ（ＲＮＡ－ＬＰＸ）で用量依存的に（抗原あたり１１の異なる投与量）リポフェクトした。２４時間のインキュベーション時間後、細胞を回収し、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。（ｐ２ｐ１６ドメインの）ペプチド３をＬＣ－ＭＳアプローチによって定量化し、正規化した発現を適用された投与量に対してプロットしている。

【0656】

図２９の結果は、ＬＣ－ＭＳ効力がｐ２ｐ１６ペプチド定量データに基づいて製剤に適用可能であることを実証する。

【0657】

さらなる実験では、細胞を、１つの腫瘍抗原をコードするＤＰ（ＲＮＡ－ＬＰＸ）で用量依存的に（抗原あたり１１の異なる投与量）リポフェクトした。２４時間のインキュベーション時間後、細胞を回収し、ＬＣ－ＭＳ分析に供した。（ｐ２ｐ１６ドメインの）ペプチド３をＬＣ－ＭＳアプローチによって定量化し、正規化した発現を適用された投与量に対してプロットしている。

【0658】

図３０の結果は、ＬＣ－ＭＳ効力がｐ２ｐ１６ペプチド定量データに基づいて製剤に適用可能であることを実証する。

【0659】

要約すると、本明細書に記載のデータは、本明細書に記載の効力アッセイが以下に適用可能であることを実証する：
複数の細胞株（接着細胞および懸濁細胞）
複数のＤＰ形態（ＬＰＸ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００、ＬＮＰ、エレクトロポレーション作業も）
複数のタンパク質／抗原の検出（例えば、ＤＰあたり複数のＲＮＡ）
異なるＲＮＡ形態（ｍｏｄＲＮＡおよびｕＲＮＡ）ならびにＤＮＡ
異なる細胞溶解アプローチ
異なるタンパク質（レポータ（ＧＦＰおよびＬｕｃ）、腫瘍抗原、ネオ抗原、ウイルス抗原、分泌タンパク質）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5C】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【図27】

【図28】

【図29A】

【図29B】

【図29C】

【図30】

【配列表】

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