特許 7446739 ガン細胞の細胞死誘導剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-01

(45)【発行日】2024-03-11

(54)【発明の名称】ガン細胞の細胞死誘導剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/44 20060101AFI20240304BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240304BHJP

   A61K 36/31 20060101ALI20240304BHJP

【ＦＩ】

A61K38/44

A61P35/00

A61K36/31

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2019150728

(22)【出願日】2019-08-01

(65)【公開番号】P2021024849

(43)【公開日】2021-02-22

【審査請求日】2022-05-10

(73)【特許権者】

【識別番号】515204351

【氏名又は名称】野口 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100116861

【弁理士】

【氏名又は名称】田邊 義博

(72)【発明者】

【氏名】野口 誠

【審査官】池上 文緒

(56)【参考文献】

【文献】特開２００９－２１５３０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１１－０６２１２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】Pharmazie (2010) vol.65, no.2, p.122-126

【文献】Cell. Signal. (2004) vol.16, issue 1, p.81-88

【文献】Cancer Gene Ther. (2000) vol.7, issue 1, p.1414-1420

【文献】Food Funct. (2018) vol.9, issue 3, p.1878-1888

【文献】日本分子生物学会年会プログラム，2016年，３９巻，１Ｐ－０３１０

【文献】生化学，vol.84, no.11，2012年，2P-481

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３８／４４

Ａ６１Ｐ ３５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体内のガン細胞の周囲でヒアルロン酸が増加した環境下において使用する誘導剤であって、ペルオキシダーゼを有効成分として含有するガン細胞死誘導剤。

【請求項2】

前記ペルオキシダーゼは溶液に溶解しており、前記ペルオキシダーゼの前記溶液中における酵素活性が０．００４４Ｕ／ｍｌ以上であることを特徴とする請求項１に記載するガン細胞死誘導剤。

【請求項3】

ペルオキシダーゼが植物から抽出された酵素であるペルオキシダーゼを有効成分として含有することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載するガン細胞死誘導剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はガン細胞の細胞死に関し、特に、ペルオキシダーゼを有効成分として含有するガン細胞死誘導剤に関する。

【背景技術】

【0002】

ガンは死亡原因の１位であり、現在においても完治が非常に困難な疾患である。そのため、多くの研究者により抗ガン剤の開発が行われている。

【0003】

しかし、抗ガン剤は投与が長期になるにつれて、抗ガン剤耐性のガン細胞が現れ、抗ガン剤の効果を限定的なものにしている。そのため、最終的に哺乳動物患者は死に至ってしまう。

【0004】

ガンが生体内に発生すると、ガン細胞の周囲で細胞外マトリックスが増加することが知られている。

【0005】

細胞外マトリックスの増加は、抗ガン剤の効果を低下させる。特に細胞外マトリックス中のヒアルロン酸の増加は、ガン患者のガン治療における予後を悪くする指標として知られている（非特許文献１）。

【0006】

本発明者は、深海魚ノロゲンゲから抽出したヒアルロン酸を含む細胞外マトリックスの添加濃度の増加がガン細胞の悪性化に関連する表面マーカーを増加させるという知見を報告している（非特許文献２）。

【0007】

このように、細胞外マトリックスの増加は、ガン細胞を悪性化させ、抗ガン剤の効果を低下させてしまうという問題がある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【文献】Ｌｉｐｐｏｎｅｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｉｇｈ ｓｔｒｏｍａｌ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ｌｅｖｅｌ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３７：８４９－８５６．

【文献】野口誠．（２０１８）深海魚細胞外マトリックスがガン細胞の表面マーカーに及ぼす影響．第９１回日本生化学会大会１Ｐ－２７２．

【文献】Ｔｈｅｏｃｈａｒｉｓ ＡＤ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ ａｎｄ ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５０２：２０１－２０６．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

すなわち、解決しようとする課題は、ガン細胞の周囲で細胞外マトリックスが増加した環境下において、ガン細胞を細胞死へ誘導するガン細胞死誘導剤を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、細胞外マトリックスにペルオキシダーゼを反応させ、その反応によりガン細胞の細胞死を誘導するペルオキシダーゼを有効成分として含有するガン細胞死誘導剤を提供する。

【0011】

請求項１に記載のガン細胞死誘導剤は、生体内のガン細胞の周囲でヒアルロン酸が増加した環境下において使用する誘導剤であって、ペルオキシダーゼを有効成分として含有することを特徴とする。

【0012】

すなわち、請求項１にかかる発明は、生体内のガン細胞の周囲でヒアルロン酸が多い環境下においてガン細胞を細胞死に誘導することが可能になる。有効成分は、主成分と言い換えることもできる。

【0013】

ガン細胞に対するペルオキシダーゼの細胞死誘導効果は、細胞外マトリックスに対するペルオキシダーゼの酸化還元反応が間接的にガン細胞の細胞死を誘導することに起因している。

【0014】

ペルオキシダーゼの効果は、細胞外マトリックスが多い環境下でより発揮される。細胞外マトリックスが多くなると、ペルオキシダーゼによる反応が増し、ガン細胞の細胞死が誘導される。

【0015】

細胞外マトリックスは、例えば、コラーゲン、ラミニン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン等を含有することが挙げられ、これらに限定されない。

【0016】

ガン細胞周囲の細胞外マトリックスは正常な細胞の周囲に比べて、細胞外マトリックスが増加していることが報告されている。ガン細胞周囲では細胞外マトリックスが正常細胞より増加し、特にヒアルロン酸は１２倍に増加することが報告されている（非特許文献３）。

【0017】

現在までに開発されている多くの抗ガン剤は、直接ガン細胞に作用させ、細胞死の誘導、又は、増殖の抑制のために利用されるが、本発明は、ペルオキシダーゼを細胞外マトリックスに作用させ、その作用が間接的にガン細胞を細胞死に誘導するというガン細胞死誘導剤である。

【0018】

請求項２の記載は、請求項１に記載のペルオキシダーゼの酵素活性として特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼのガン細胞死誘導効果は、ペルオキシダーゼの酵素活性が０．００００４Ｕ／ｍｌでガン細胞の細胞死が部分的に確認されるが、ガン細胞の細胞死が明確になる０．００４４Ｕ／ｍｌ以上が好ましい。０．０４４Ｕ／ｍｌとしてもよい。

【0019】

請求項３の記載は、請求項１又は請求項２に記載のペルオキシダーゼが植物から抽出された酵素であることを特徴とする。

【0020】

植物としては、たとえば、西洋ワサビ、ゴーヤ、キュウリなどを挙げることができるが、この限りではない。

【0021】

ペルオキシダーゼは、ペルオキシド構造を酸化的に切断して２つのヒドロキシル基に分解する酸化還元酵素である。ヘム蛋白酵素の一種で，過酸化水素や有機化合物に作用する。多くの植物組織に含まれており，哺乳動物では白血球中，乳汁中のものが知られる。西洋ワサビや牛乳などから抽出，結晶化されている。

【発明の効果】

【0022】

本発明によれば、ガン細胞周囲に存在する細胞外マトリックスにペルオキシダーゼを反応させ、その酸化還元反応によりガン細胞の細胞死を誘導するペルオキシダーゼを有効成分として含有するガン細胞死誘導剤を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（乳ガン）細胞に対する濃縮型ノロゲンゲ抽出液（４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ）並びにペルオキシダーゼ添加による細胞死の顕微鏡写真である。

【図2】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対するペルオキシダーゼ並びに４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ添加濃度の変化による細胞死の顕微鏡写真である。

【図3】Ａ５４９（肺ガン）細胞に対する４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ並びにペルオキシダーゼ添加による細胞死の顕微鏡写真である。

【図4】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞への抗ガン剤５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）と４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ並びにペルオキシダーゼの併用効果の図である。

【図5】４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ並びにペルオキシダーゼの添加によるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対するＡｎｎｅｘｉｎＶ（ＡＮ）―ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）よる細胞死の状況を示した図である。

【図6】ＰＣ－３（前立腺ガン）細胞に対する４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ並びにペルオキシダーゼ添加による細胞死の顕微鏡写真である。

【図7】ガン細胞に対する４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ並びにゴーヤ抽出液、キュウリ抽出液添加による細胞死の顕微鏡写真である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

以下、本発明の実施形態は図面を参照しながら詳細を説明する。
本発明は、ガン細胞周囲に存在する細胞外マトリックスにペルオキシダーゼの酸化還元反応を起こさせることで、ガン細胞を細胞死に導くために鋭意研究を行い開発されたガン細胞死誘導剤の提供を行うものである。

【実施例】

【0025】

＜実験例１：ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞：ヒト乳ガン細胞株＞
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を５０００個／ｗｅｌｌで９６穴マイクロプレート（平底：接着細胞培養プレート）に播種し、ＤＭＥＭ－１５％ＦＢＳ培養液で培養した。

【0026】

細胞外マトリックスとして利用したノロゲンゲ抽出液は、ノロゲンゲの表皮から筋肉組織までの部位より採取された体液を分子量１０万の限外ろ過膜で４倍に濃縮した液体（４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ：（株）アグセル研究所製）でヒアルロン酸を１８００μｇ／ｍｌ含んだ細胞外マトリックスである。細胞播種時に実験区分により、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ並びにペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来）を加え３日間培養した。

【0027】

培養結果を図１に示す。４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ０％の場合（１ａ）は、細胞は単層形態で培養された。４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ０％にペルオキシダーゼ（０．４４Ｕ／ｍｌ）を加えた場合（１ｂ）は、（１ａ）とほとんど変化がなく細胞は単層形態で培養された。４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘを添加しない場合は、ペルオキシダーゼの添加、無添加とも細胞死は起こらなかった。

【0028】

４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％を加えた場合（１ｃ）は、スフェロイド形態で、細胞は生存していた。一方、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％にペルオキシダーゼ（１ｄ：０．４４Ｕ／ｍｌ，１ｅ：０．０４４Ｕ／ｍｌ）を添加して培養すると、１ｄ，１ｅとも細胞死を起こした。

【0029】

なお、同一条件で７日培養した場合は、細胞死を起こすペルキシダーゼ濃度は、０．００００４Ｕ／ｍｌまで部分的に確認される。播種したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞が全体的に細胞死を起こすペルキシダーゼ濃度は、０．０４４Ｕ／ｍｌ以上が好ましい。

【0030】

ペルオキシダーゼの酵素活性（Ｕ／ｍｌ）は、過酸化水素（１．７ｍＭ／Ｌ）溶液１．５ｍｌとフェノール（１７０ｍＭ／Ｌ）含有４－アミノアンチピリン（２．５ｍＭ／Ｌ）溶液１．４ｍｌ並びにペルオキシダーゼ含有溶液０．１ｍｌをｐＨ７．０で反応させ、キノメイミン（ｍＭ／Ｌ当たりの吸光係数６．５８）に変化させるのに１分当たり５１０ｎｍでの吸光度変化から測定する。

【0031】

＜実験例２：ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞：ヒト乳ガン細胞株＞
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を５０００個／ｗｅｌｌで９６穴マイクロプレート（平底：接着細胞培養プレート）に播種し、ＤＭＥＭ－１５％ＦＢＳ培養液で培養した。細胞播種時に実験区分により、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘを２．５％～１０％並びにペルオキシダーゼ０．４４Ｕ／ｍｌを加え３日間培養した。

【0032】

図２に培養結果を示す。４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ２．５％にペルオキシダーゼを添加した場合（２ａ）は、ガン細胞はスフェロイド形態で生存していた。４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ５％にペルオキシダーゼを添加した場合（２ｂ）は、生細胞と死細胞が混在していた。

【0033】

一方、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ７．５％又は１０％にペルオキシダーゼを添加した場合（２ｃ）、（２ｄ）は、ガン細胞は細胞死を起こした。

【0034】

ペルオキシダーゼによるガン細胞の細胞死は、細胞外マトリックス濃度が高い方がより効果を示した。

【0035】

＜実験例３：Ａ５４９細胞：ヒト肺腺ガン細胞株＞
Ａ５４９細胞を５０００個／ｗｅｌｌで９６穴マイクロプレート（平底：接着細胞培養プレート）に播種し、ＥＭＥＭ－１０％ＦＢＳ培養液で培養した。細胞播種時に実験区分により、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％並びにペルオキシダーゼの濃度を変化させて３日間培養した。

【0036】

培養結果を図３に示す。４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％を添加した場合（３ａ）は、スフェロイド形態で細胞は生存していた。一方、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％にペルオキシダーゼをそれぞれ０．４４Ｕ／ｍｌを添加（３ｂ）、０．０４４Ｕ／ｍｌを添加（３ｃ）、０．００４４Ｕ／ｍｌを添加（３ｄ）した場合は、ガン細胞は細胞死を起こした。

【0037】

Ａ５４９細胞の細胞死を起こすペルキシダーゼの濃度は、０．００４４Ｕ／ｍｌ以上が好ましい。

【0038】

＜実験例４：ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞：ヒト乳ガン細胞株＞
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を５０００個／ｗｅｌｌで９６穴マイクロプレート（平底：接着細胞培養プレート）に播種し、ＤＭＥＭ－１５％ＦＢＳ培養液で培養した。細胞播種時に実験区分により、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ０％、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ０％にペルオキシダーゼ（０．４４Ｕ／ｍｌ）添加、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％添加、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％にペルオキシダーゼ（０．４４Ｕ／ｍｌ）添加の４区を作成し、さらに５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）を０～１０００μＭ／ｍｌ加え３日間培養した。

【0039】

３日間培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ ３Ｄキット（プロメガ（株）製）を使用してＡＴＰ量を測定した。播種時のＡＴＰ量を１（基準値）としてそれぞれの区での３日培養後のＡＴＰ量を比較した。

【0040】

ガン細胞の増殖性を測定した結果を図５に示した。４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ０％では、細胞は１４倍まで増殖するが、５－ＦＵの添加濃度が高くなるに従って増殖が阻害され、１０００μＭ／ｍｌの添加で増殖は４倍に低下した。４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ０％にペルオキシダーゼ添加では１２倍まで増殖し、５－ＦＵ１０００μＭ／ｍｌの添加で増殖は３．５倍まで低下した。４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘを添加しない場合は、ペルオキシダーゼの添加、無添加とも５－ＦＵ添加での増殖抑制効果にほとんど差がなく、また、ガン細胞が播種細胞数より増殖することにも変わりはなかった。

【0041】

４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％添加の場合は、細胞は生存状態でＡＴＰ量は１．４倍に増加し、さらに５－ＦＵ１００μＭ／ｍｌの添加でＡＴＰ量は１．２倍、５－ＦＵ１０００μＭ／ｍｌの添加でも０．７５倍であった。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％で培養すると増殖がほとんどなく、さらに５－ＦＵを添加してもＡＴＰの低下はわずかであり、５－ＦＵに対しガン細胞の細胞死への抵抗性があるように観察された。

【0042】

一方、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％にペルオキシダーゼ添加した場合は、５－ＦＵの添加、無添加にかかわらずＡＴＰ量は１／５０に減少し、５－ＦＵに対し抵抗性を示すガン細胞においても細胞死へ誘導することができた。

【0043】

ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、エストロゲン、プロゲストロン、ＨＥＲ２の３つの受容体がないトリプルネガティブな悪性度の高い乳ガン細胞として知られているが、細胞外マトリックスにペルオキシダーゼを加えることでガン細胞は細胞死へ誘導された。

【0044】

＜実験例５：ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞：ヒト乳ガン細胞株＞
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を５００００個／ｗｅｌｌで２４穴マイクロプレート（平底：接着細胞培養プレート）に播種し、ＤＭＥＭ－１５％ＦＢＳ培養液で培養した。細胞播種時に実験区分により４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ０％、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ０％にペルオキシダーゼ（０．４４Ｕ／ｍｌ）を添加、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％添加、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％にペルオキシダーゼ（０．４４Ｕ／ｍｌ）添加の４区を作成し、３日間培養した。

【0045】

３日間培養後に、フローサイトメーターにより細胞死の形態を把握できるＡｎｎｅｘｉｎＶ（ＡＮ）―ＰＩで細胞染色を行った。

【0046】

なお、ＡＮの上昇（ＡＮ^＋）は カルシウム存在下で初期のアポトーシスで生じる細胞膜へ露出するフォスファジルセリンに反応することに起因する。また、ＰＩの上昇（ＰＩ^＋）は、アポトーシスが進行すると細胞内にＰＩが入りＤＮＡと結合することに起因する。そのため、ＡＮとＰＩを利用することによって、生細胞と早期のアポトーシスと後期のアポトーシスを区別することが可能になる。

【0047】

ガン細胞の細胞死の状況を把握できるＡＮ－ＰＩの結果を図５（ａ～ｄ）に示した。４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ０％の場合（５ａ）は、細胞はＡＮ^－ＰＩ^－が多数で細胞死を起こさなかった。また、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ０％にペルオキシダーゼを加えた場合（５ｂ）は、（５ａ）と同じく、細胞はＡＮ^－ＰＩ^－が多数で細胞死を起こさなかった。

【0048】

４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％添加（５ｃ）の場合は、細胞はＡＮ^－ＰＩ^－が多数で生存状態であるが、一部ＡＮ^＋ＰＩ^－が存在し細胞死の前期アポトーシスを示す細胞が現れた。一方、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％にペルオキシダーゼを添加（５ｄ）した場合は、細胞はＡＮ^＋ＰＩ^＋の後期アポトーシス細胞が多数となり、ＡＮ^＋ＰＩ^－の前期アポトーシス細胞と合計で８０％以上が細胞死の状態であることが観察された。４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘとペルオキシダーゼの添加で細胞死があきらかに促進された。

【0049】

＜実験例６：ＰＣ－３細胞：ヒト前立腺ガン細胞株＞
ＰＣ－３細胞を用いて実験を行った。ＰＣ－３細胞を５０００個／ｗｅｌｌで９６穴マイクロプレート（平底：接着細胞培養プレート）に播種し、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２－１０％ＦＢＳ培養液で培養した。細胞播種時に４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％添加（６ａ）、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％にペルオキシダーゼ（０．４４Ｕ／ｍｌ）を添加（６ｂ）し、３日間培養した。

【0050】

培養結果を図６に示す。４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％を加えた場合（６ａ）は、スフェロイド形態で細胞は生存していた。一方、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％にペルオキシダーゼを添加（６ｂ）した場合は、ガン細胞は細胞死を起こした。

【0051】

前立腺ガン細胞でも、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘとペルオキシダーゼによる細胞死の誘導が確認された。

【0052】

＜実験例７：ガン細胞へ４Ｘ―ＨＡｍａｔｒｉｘ並びに植物抽出液添加効果＞
Ａ５４９細胞又はＨＴ－２９細胞（ヒト結腸腺ガン細胞）を用いて実験を行った。各細胞を５０００個／ｗｅｌｌで９６穴マイクロプレート（平底：接着細胞培養プレート）に播種し、Ａ５４９はＥＭＥＭ－１０％ＦＢＳ培養液を使用し、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１０％にゴーヤ抽出液を加えて３日間培養した。ＨＴ－２９細胞はＭｃＣｏｙ’ｓ ５ａ－１０％ＦＢＳ培養液を使用し、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％にキュウリ抽出液を加えて３日間培養した。

【0053】

植物にはペルオキシダーゼが存在するためペルオキシダーゼの代替えとしてゴーヤ抽出液、キュウリ抽出液を利用した。

【0054】

ゴーヤ抽出液は、ゴーヤ重量に対し７０％量の純水を加え、ホモジナイズし、遠心分離器で固形分を除去し、上澄みを抽出液として作成し、メンブランフィルターで無菌化し細胞に加えた。

【0055】

キュウリ抽出液は、キュウリをホモジナイズし、遠心分離器で固形分を除去し、上澄みを抽出液として作成し、メンブランフィルターで無菌化し細胞に加えた。

【0056】

培養結果を図７に示す。Ａ５４９細胞に４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１０％を添加した場合（７ａ）は、スフェロイド形態で細胞は生存していた。一方、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１０％にゴーヤ抽出液３％を添加（７ｂ）して培養すると、細胞死を起こした。

【0057】

ＨＴ－２９細胞に４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％を加えた場合（７ｃ）は、スフェロイド形態で細胞は生存していた。一方、４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘ１５％にキュウリ抽出液（３％）を添加（７ｄ）して培養すると、細胞死を起こした。

【0058】

植物ペルオキシダーゼは、植物の細胞壁に局在することが知られているが、水溶液として抽出することが可能である。４Ｘ－ＨＡｍａｔｒｉｘにゴーヤ又はキュウリ抽出液のペルオキシダーゼを添加することで、ガン細胞の細胞死を誘導することができた。

【0059】

ガン細胞の実施例としてＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ａ５４９，ＰＣ－３、ＨＴ－２９細胞を記載したが、細胞外マトリックス並びにペルオキシダーゼによる細胞死の誘導は、これらの細胞に限定されない。

【産業上の利用可能性】

【0060】

本発明においては、ペルオキシダーゼを利用して、ガン細胞を効率的に細胞死させることができる。特に、生体内では、ガンの悪性化に伴ってガン細胞の周囲で細胞外マトリックスの増加が起こる。ペルオキシダーゼを有効成分として含有するガン細胞死誘導剤は、この増加した細胞外マトリックスを利用してガン細胞を細胞死に誘導することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】