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特許7447011エフェクターＴ細胞をリプログラムするためのヒストン修飾因子の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-01
(45)【発行日】2024-03-11
(54)【発明の名称】エフェクターＴ細胞をリプログラムするためのヒストン修飾因子の使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20240304BHJP
A61K 35/17 20150101ALN20240304BHJP
A61K 45/00 20060101ALN20240304BHJP
A61K 48/00 20060101ALN20240304BHJP
A61P 43/00 20060101ALN20240304BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783 ZNA
A61K35/17
A61K45/00
A61K48/00
A61P43/00 121
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2020551874
(86)(22)【出願日】2019-03-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-08-10
(86)【国際出願番号】 US2019024693
(87)【国際公開番号】W WO2019191501
(87)【国際公開日】2019-10-03
【審査請求日】2022-03-25
(31)【優先権主張番号】62/649,265
(32)【優先日】2018-03-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】518256430
【氏名又は名称】ボード オブ リージェンツ ザ ユニヴァーシティ オブ テキサス システム
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】イー カッシアン
(72)【発明者】
【氏名】ワン ジュンメイ
【審査官】西澤 龍彦
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／２１９１５０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】HO, LP et al.，The Road to Memory: An Early Rest for the Long Journey，The Journal of Immunology，2013年，Vol. 191, No. 11，pp. 5603-5614
【文献】LOSCHINSKI, R et al.，IL-21 modulates memory and exhaustion phenotype of T-cells in a fatty acid oxidation-dependent manner，Oncotarget，2018年02月，Vol. 9, No. 17，pp. 13125-13138
【文献】BAE, J et al.，Histone deacetylase (HDAC) inhibitor ACY241 enhances anti-tumor activities of antigen-specific central memory cytotoxic T lymphocytes against multiple myeloma and solid tumors，Leukemia，2018年02月，Vol. 32，pp. 1932-1947
【文献】SODRE, AL et al.，Abstract 638: Epigenetic reprograming of immune cells through selective inhibition of HDAC6 reduces suppressive phenotypes and augments anti-tumor properties of T-cells，Cancer Res，2017年，Vol. 77, 13_Supplement，638
【文献】McCAW, TR et al.，Modulation of antitumor immunity with histone deacetylase inhibitors，Immunotherapy，2017年，Vol. 9, No. 16，pp. 1359-1372
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗原特異的エフェクターＴ細胞（ＴEFF細胞）をセントラルメモリーＴ細胞（ＴCM細胞）にリプログラミングするための方法であって：（ａ）腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の試料から得られたＴ EFF 細胞を含むリンパ球の開始集団、又は
（ｂ）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む試料から得られたＴ EFF 細胞を含むリンパ球の開始集団、又は
（ｃ）ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団から得られたＴEFF細胞に富む試料、
を培養することを含み、
培養が、それぞれＴEFF細胞をＴCM細胞にリプログラムするのに十分な量のヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）及びインターロイキン－２１（ＩＬ－２１）の存在下においてであり、
前記リプログラミングにより、対象から得たＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団におけるＴCM細胞の数と比較して、ＴCM細胞に富むリンパ球の集団が生成され、
前記ＨＤＡＣｉがクラスＩまたはクラスＩＩのＨＤＡＣｉである、方法。
【請求項2】
前記Ｔ
EFF
細胞に富む試料が、前記ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団からＣＤ８+ ＴEFF細胞を単離することによって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団からＴEFF細胞に富む試料を得ることが、前記ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団から骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、ＴREGs、ＮＫ細胞、及びマクロファージを枯渇させることをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＣＤ８+ ＴEFF細胞がＣＤ４５ＲＯを発現する、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記ＣＤ８+ ＴEFF細胞が、ＩＬ－２１を添加する前にＨＤＡＣｉの存在下で培養される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ＣＤ８+ ＴEFF細胞が、ＨＤＡＣｉを添加する前にＩＬ－２１の存在下で培養される、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記ＣＤ８+ ＴEFF細胞が、ＨＤＡＣｉ及びＩＬ－２１の存在下で同時に培養される、請求項４に記載の方法。
【請求項8】
前記ＩＬ－２１が１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記ＨＤＡＣｉが１ｎＭ～５ｎＭの濃度で存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記ＩＬ－２１が２０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在し、前記ＨＤＡＣｉが２ｎＭ～４ｎＭの濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記ＨＤＡＣｉが古典的なＨＤＡＣｉである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記古典的なＨＤＡＣｉが、トリコスタチンＡ、トラポキシンＢ、フェニルブチレート、バルプロ酸、ボリノスタット（スベラニロヒドロキサム酸又はＳＡＨＡ、Ｚｏｌｉｎｚａ（登録商標）として販売されている）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１、Ｂｅｌｅｏｄａｑ（登録商標）として販売されている）、パノビノスタット（Ｆａｒｙｄａｑ（登録商標）として販売されている）、ダシノスタット（ＬＡＱ８２４）、エンチノスタット（ＳＮＤＸ－２７５又はＭＳ－２７５）、タセジナリン（ＣＩ９９４）、及びモセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ＨＤＡＣｉがＳＡＨＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ＨＤＡＣｉがパノビノスタットである、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
得られるＴCM細胞がＣＤ８+であり、また、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＣＲ７のうちの少なくとも２つを発現する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
Ｔ
CM
細胞に富むリンパ球の集団における前記Ｔ
CM
細胞がまた、増加したレベルのグランザイムＢ及びパーフォリン１を発現する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
それぞれＴEFF細胞をＴCM細胞にリプログラムするのに十分な量のＨＤＡＣｉ及びＩＬ－２１の存在下で、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料を培養するステップの前に、又はそれと同時に、前記ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又は前記ＴEFF細胞に富む試料をＩＬ－２と接触させるステップをさらに含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記ＴCM細胞に富むリンパ球の集団が、前記ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団よりも少なくとも５倍多いＴCM細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
ＴEFF細胞からＴCM細胞を生成するための方法であって：（ａ）２ｎＭ～４ｎＭの濃度のＨＤＡＣｉと２０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－２１を、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団に同時に添加すること；並びに
（ｂ）前記ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団を１２～１６日間培養し、それにより、前記ＴEFF細胞をリプログラミングして、前記ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団におけるＴCM細胞の数と比較してＴCM細胞に富むリンパ球の集団を生成することを含み、前記ＨＤＡＣｉがクラスＩまたはクラスＩＩのＨＤＡＣｉである、方法。
【請求項20】
請求項１から１８の何れか一項に記載の方法により製造された組成物であって、Ｔ細胞の少なくとも２０％がＣＤ２８+ＣＤ６２Ｌ+ＣＤ１２７-ＣＣＲ７-Ｔ細胞である、ヒトセントラルメモリー様ＣＤ８+ Ｔ細胞の集団を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年３月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／６４９，２６５号の利益を主張する。
【0002】
配列表の組み込み
「ＵＴＦＣ．Ｐ１３１１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルに含まれる、３．８１ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓで測定）である、２０１９年３月２８日に作成された配列表は、電子提出によって本明細書と共に出願され、参照により本明細書に組み込まれる。
「ＵＴＦＣ．Ｐ１３１１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルに含まれる、３．８１ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓで測定）である、２０１９年３月２８日に作成された配列表は、電子提出によって本明細書と共に出願され、参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
本発明は、一般に、医学及び免疫学の分野に関する。より詳細には、本発明は、セントラルメモリー表現型（ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を有するＴ細胞を生成する方法に関する。
【背景技術】
【0004】
エクスビボで活性化され、増殖された自己腫瘍特異的Ｔリンパ球の投与である養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）は、従来の療法に対して以前は抵抗性であった転移性黒色腫患者において臨床応答を誘導することが示されている。患者の応答率は、インビボで注入されたＴ細胞の持続性と相関している。しかしながら、多くの場合、末梢血及び腫瘍部位に見られる抗原特異的Ｔ細胞は、高分化型エフェクター、エフェクターメモリー、及び時には増殖能力が非常に限られた末端エフェクター細胞である。セントラルメモリーＣＤ８+ Ｔ細胞は、自己複製が可能であり、共刺激受容体ＣＤ２８及びその他のメモリー関連マーカー（例えば、ＣＤ１２７及びＣＤ６２Ｌ）を高度に発現する（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，２００５）。従って、高分化型エフェクター細胞から自己複製することができるセントラルメモリーＴ細胞を生成する方法には満たされていない要求がある。セントラルメモリー表現型を有するこれらのＴ細胞は、インビボでの持続性が高いため、高い応答率でＡＣＴに使用できる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本開示のある実施形態は、リプログラミング又は脱分化などによって、エフェクター表現型を有するＴ細胞からセントラルメモリー表現型を有するＴ細胞を生成するための方法（例えば、インビトロ又はエクスビボ）を提供する。
【0006】
一実施形態では、抗原特異的エフェクターＴ細胞（ＴEFF細胞）をセントラルメモリーＴ細胞（ＴCM細胞）にリプログラミングするための方法が提供され、この方法は、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団を対象から得ること；所望により、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団からＴEFF細胞に富む試料を調製すること；並びにそれぞれＴEFF細胞をＴCM細胞にリプログラムするのに十分な量のヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）及びインターロイキン－２１（ＩＬ－２１）の存在下で、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料を培養することを含み、このリプログラミングにより、対象から得たＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団におけるＴCM細胞の数と比較してＴCM細胞に富むリンパ球の集団が生成される。
【0007】
いくつかの態様では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団を得ることは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の試料又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む試料を対象から採取することを含む。追加の態様では、この方法は、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団から、ＴEFF細胞に富む試料を調製するステップをさらに含む。いくつかの態様では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団からＴEFF細胞に富む試料を調製するステップは、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団からＣＤ８+ ＴEFF細胞を単離することを含む。
【0008】
ある態様では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団からＴEFF細胞に富む試料を調製するステップは、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団から骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、ＴREGs、ＮＫ細胞、及びマクロファージを枯渇させることをさらに含む。いくつかの態様では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団からＴEFF細胞に富む試料を調製するステップは、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団から骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、ＴREGs、ＮＫ細胞、及びマクロファージを枯渇させることを含む。いくつかの態様では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団からＴEFF細胞に富む試料を調製するステップは、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団からＣＤ８+ ＴEFF細胞を単離することをさらに含む。
【0009】
いくつかの態様では、ＣＤ８+ ＴEFF細胞はＣＤ４５ＲＯを発現する。ある態様では、ＣＤ８+ ＴEFF細胞はＣＤ４５ＲＯを高発現する。特定の態様では、細胞表面マーカー、抗原、又はタンパク質の陽性発現、高発現、又は低発現は、対照集団における前記細胞表面マーカー、抗原、又はタンパク質の発現レベルと比較して定義される。特定の態様では、対照集団は、細胞表面マーカー、抗原、又はタンパク質の検出不可能なレベルが陰性であるか、又はそれらを有する集団である。いくつかの態様では、対照集団は、陽性発現、高発現、又は低発現の集団と同じ試料中にある。他の態様では、対照集団は、陽性発現、高発現、又は低発現の集団を含む試料と実質的に同様の試料中にある。例えば、ＣＤ８+ ＴEFF細胞でのＣＤ４５ＲＯの高発現は、対照集団のＣＤ８+ ＴEFF細胞におけるＣＤ４５ＲＯの発現レベルと比較して高い発現レベルとして定義することができる。相対的発現レベルは、特にフローサイトメトリーによって測定されるように、細胞表面マーカー、抗原、又はタンパク質の相対的蛍光シグナルとして測定することができる。
【0010】
特定の例では、細胞表面マーカー、抗原、又はタンパク質の高発現は、低発現集団で決定された発現レベルよりも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍（又はこれらから導き出せる任意の値）高い発現に相当し得る。具体的には、細胞表面マーカー、抗原、又はタンパク質の高発現は、対照細胞集団の蛍光シグナルと比較して、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍（又はこれらから導き出せる任意の値）高い蛍光シグナルに相当し得る。対照細胞集団は、細胞表面マーカー、抗原、又はタンパク質の発現が低い、検出できない、又は正常な細胞集団であり得る。他の例では、細胞表面マーカー、抗原、又はタンパク質の高発現は、低発現集団で決定された発現レベルよりも２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、又は１０，０００倍（又はこれらから導き出せる任意の値）高い発現に相当し得る。細胞表面マーカー、抗原、又はタンパク質の高発現は、対照細胞集団の蛍光シグナルと比較して２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、又は１０，０００倍（又はこれらから導き出せる任意の値）高い蛍光シグナルに相当し得る。
【0011】
細胞表面マーカー、抗原、又はタンパク質の低発現は、前記表面マーカー又は抗原についての陰性又は検出不可能な発現レベルに対応する蛍光シグナルと比較して２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍（又はそこから導き出せる任意の値）高い蛍光シグナルに相当し得る。細胞表面マーカー、抗原、又はタンパク質の低発現は、前記表面マーカー又は抗原についての陰性又は検出不可能な発現レベルに対応する蛍光シグナルと比較して２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、又は１０，０００倍（又はそこから導き出せる任意の値）高い蛍光シグナルに相当し得る。
【0012】
陽性発現は、蛍光シグナルの検出などの所与の検出方法によって検出可能な細胞表面マーカー、抗原、又はタンパク質の発現レベルを指す。本明細書で使用される高発現レベル及び低発現レベルの両方が陽性発現と見なされ得る。
【0013】
ある態様では、ＣＤ８+ ＴEFF細胞は、ＩＬ－２１を添加する前にＨＤＡＣｉの存在下で培養される。特定の態様では、ＣＤ８+ ＴEFF細胞は、ＩＬ－２１を添加する１２～４８時間（例えば、１２～１５時間、１５～２０時間、２０～２５時間、２５～３０時間、３０～３５時間、３５～４０時間、又は４０～４８時間）前にＨＤＡＣｉの存在下で培養される。ある態様では、ＣＤ８+ ＴEFF細胞は、ＩＬ－２１を添加する１～３日（例えば、１日、２日、又は３日）前にＨＤＡＣｉの存在下で培養される。具体的な態様では、ＣＤ８+ ＴEFF細胞は、ＨＤＡＣｉを添加する前にＩＬ－２１の存在下で培養される。いくつかの態様では、ＣＤ８+ ＴEFF細胞は、ＨＤＡＣｉを添加する１２～４８時間（例えば、１２～１５時間、１５～２０時間、２０～２５時間、２５～３０時間、３０～３５時間、３５～４０時間、又は４０～４８時間）前にＩＬ－２１の存在下で培養される。特定の態様では、ＣＤ８+ ＴEFF細胞は、ＨＤＡＣｉを添加する１～３日、例えば１日、２日、又は３日前にＩＬ－２１の存在下で培養される。いくつかの態様では、ＣＤ８+ ＴEFF細胞は、ＨＤＡＣｉ及びＩＬ－２１の存在下で同時に培養される。ある態様では、培養は、７～２０日間（例えば、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、又は２０日間）である。いくつかの態様では、培養は、１２～１６日間（例えば、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、又は１６日間）である。具体的な態様では、ＩＬ－２１は、１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１０～２０ｎｇ／ｍＬ、２０～３０ｎｇ／ｍＬ、３０～４０ｎｇ／ｍＬ、又は４０～５０ｎｇ／ｍＬ）の濃度で存在する。特定の態様では、ＩＬ－２１は、２０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２０～２５ｎｇ／ｍＬ、２５～３０ｎｇ／ｍＬ、３０～３５ｎｇ／ｍＬ、又は３５～４０ｎｇ／ｍＬ）の濃度で存在する。いくつかの態様では、ＨＤＡＣｉは、１ｎＭ～５ｎＭ（例えば、１～２ｎＭ、２～３ｎＭ、３～４ｎＭ、又は４～５ｎＭ）の濃度で存在する。特定の態様では、ＨＤＡＣｉは、２ｎＭ～４ｎＭ（例えば、２ｎＭ、３ｎＭ、又は４ｎＭ）の濃度で存在する。いくつかの態様では、ＩＬ－２１は、１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１０～２０ｎｇ／ｍＬ、２０～３０ｎｇ／ｍＬ、３０～４０ｎｇ／ｍＬ、又は４０～５０ｎｇ／ｍＬ）の濃度で存在し、ＨＤＡＣｉは、１ｎＭ～５ｎＭ（例えば、１～２ｎＭ、２～３ｎＭ、３～４ｎＭ、又は４～５ｎＭ）の濃度で存在する。ある態様では、ＩＬ－２１は、２０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２０～２５ｎｇ／ｍＬ、２５～３０ｎｇ／ｍＬ、３０～３５ｎｇ／ｍＬ、又は３５～４０ｎｇ／ｍＬ）の濃度で存在し、ＨＤＡＣｉは、２ｎＭ～４ｎＭ（例えば、２ｎＭ、３ｎＭ、又は４ｎＭ）の濃度で存在する。
【0014】
ある態様では、ＨＤＡＣｉは古典的なＨＤＡＣｉである。いくつかの態様では、古典的なＨＤＡＣｉは、トリコスタチンＡ、トラポキシンＢ、フェニルブチレート、バルプロ酸、ボリノスタット（スベラニロヒドロキサム酸又はＳＡＨＡ、Ｚｏｌｉｎｚａ（登録商標）として販売されている）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１、Ｂｅｌｅｏｄａｑ（登録商標）として販売されている）、パノビノスタット（Ｆａｒｙｄａｑ（登録商標）として販売されている）、ダシノスタット（ｄａｃｉｎｏｓｔａｔ）（ＬＡＱ８２４）、エンチノスタット（ＳＮＤＸ－２７５又はＭＳ－２７５）、タセジナリン（ｔａｃｅｄｉｎａｌｉｎｅ）（ＣＩ９９４）、及びモセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）からなる群から選択される。特定の態様では、ＨＤＡＣｉはＳＡＨＡである。他の態様では、ＨＤＡＣはパノビノスタットである。
【0015】
いくつかの態様では、得られるＴCM細胞はＣＤ８+であり、また、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＣＲ７のうちの少なくとも２つを発現する。いくつかの態様では、得られるＴCM細胞はＣＤ８+であり、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＣＲ７の少なくとも２つを高発現する。ある態様では、得られるＴCM細胞はＣＤ８+であり、また、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＣＲ７の少なくとも３つを発現する（即ち、ＣＤ８+／ＣＤ４５ＲＯ+／ＣＤ２８+／ＣＤ６２Ｌ+／ＣＣＲ７+である）。いくつかの態様では、得られるＴCM細胞はＣＤ８+であり、また、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＣＲ７を高発現する。ある態様では、得られるＴCM細胞はまた、高レベルのグランザイムＢ及びパーフォリン１を発現する。
【0016】
追加の態様では、この方法は、ＴCM細胞を増殖させるステップをさらに含む。いくつかの態様では、増殖は、ＴCM細胞を抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及び抗ＣＤ１３７／４－１ＢＢのうちの少なくとも１つで処理することを含む。ある態様では、増殖させることは、ＴCM細胞を抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で処理することを含む。具体的な態様では、増殖させることは、ＴCM細胞を抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、及び抗ＣＤ１３７／４－１ＢＢで処理することを含む。
【0017】
さらなる態様では、この方法は、それぞれＴEFF細胞をＴCM細胞にリプログラムするのに十分な量のＨＤＡＣｉ及びＩＬ－２１の存在下で、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料を培養するステップの前に、又はそれと同時に、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料をＩＬ－２と接触させるステップをさらに含む。いくつかの態様では、ＴCM細胞に富むリンパ球の集団は、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団よりも少なくとも５倍（例えば、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍以上）多いＴCM細胞を含む。ある態様では、ＴCM細胞に富むリンパ球の集団は、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団よりも少なくとも１０倍多いＴCM細胞を含む。具体的な態様では、ＴCM細胞に富むリンパ球の集団は、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団よりも少なくとも３０倍多いＴCM細胞を含む。いくつかの態様では、ＴCM細胞に富むリンパ球の集団は、ＩＬ－２及び／又はＩＬ－１５での処理に応答したＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団と比較して、ＩＬ－２及び／又はＩＬ－１５での処理に応答した高い増殖を示す。
【0018】
別の実施形態では、実施形態（例えば、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団を対象から得ること；所望により、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団からＴEFF細胞に富む試料を調製すること；並びにそれぞれＴEFF細胞をＴCM細胞にリプログラムするのに十分な量のヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）及びインターロイキン－２１（ＩＬ－２１）の存在下で、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料を培養すること、ここで、リプログラミングにより、対象から得られたＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団におけるＴCM細胞の数と比較してＴCM細胞に富むリンパ球の集団が生成される）に従って生成されたＴCM細胞に富むリンパ球の集団を含む医薬組成物が提供される。本明細書では、癌の処置に使用するための実施形態の医薬組成物がさらに提供される。
【0019】
さらなる実施形態は、癌の処置のための、実施形態（例えば、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団を対象から得ること；所望により、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団からＴEFF細胞に富む試料を調製すること；並びにそれぞれＴEFF細胞をＴCM細胞にリプログラムするのに十分な量のヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）及びインターロイキン－２１（ＩＬ－２１）の存在下で、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料を培養すること、ここで、リプログラミングにより、対象から得られたＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団におけるＴCM細胞の数と比較してＴCM細胞に富むリンパ球の集団が生成される）に従って生成された、治療有効量のＴCM細胞に富むリンパ球の集団の使用をさらに提供する。
【0020】
別の実施形態では、対象の癌の処置のため、実施形態（例えば、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団を対象から得ること；所望により、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団からＴEFF細胞に富む試料を調製すること；並びにそれぞれＴEFF細胞をＴCM細胞にリプログラムするのに十分な量のヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）及びインターロイキン－２１（ＩＬ－２１）の存在下で、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料を培養すること、ここで、リプログラミングにより、対象から得られたＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団におけるＴCM細胞の数と比較してＴCM細胞に富むリンパ球の集団が生成される）の方法によって生成された、治療有効量のＴCM細胞に富むリンパ球の集団を含む組成物が提供される。
【0021】
さらなる実施形態は、実施形態の方法によって生成された治療有効量のＴCM細胞に富むリンパ球の集団又は実施形態の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象の癌を処置する方法を提供する。いくつかの態様では、この方法は、治療有効量のＴCM細胞に富むリンパ球の集団を投与する前に、対象に対してリンパ球枯渇を行うステップをさらに含む。ある態様では、治療有効量のＴCM細胞に富むリンパ球の集団は、抗腫瘍活性を有する自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の試料に由来する。いくつかの態様では、ＴCM細胞に富むリンパ球の集団は、対象に静脈内投与、腹腔内投与、又は腫瘍内投与される。特定の態様では、対象はヒトである。
【0022】
さらなる態様では、この方法は、少なくとも１つの追加の治療薬を対象に投与するステップをさらに含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの追加の治療薬は、化学療法、放射線療法、及び免疫療法からなる群から選択される。特定の態様では、少なくとも１つの追加の治療薬は免疫療法である。具体的な態様では、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＴＩＭ３、ＫＩＲ、又はアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）からなる群から選択される免疫チェックポイントタンパク質又はそのリガンドを阻害する。特定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１を阻害する。ある態様では、免疫チェックポイント阻害剤はＣＴＬＡ－４を阻害する。
【0023】
さらに別の実施形態では、ＴEFF細胞からＴCM細胞を生成するための方法が提供され、この方法は、対象からのＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団を得ること；２ｎＭ～４ｎＭの濃度のＨＤＡＣｉと２０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ－２１を、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団に同時に添加すること；ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団を１２～１６日間培養し、それにより、ＴEFF細胞をリプログラミングして、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団におけるＴCM細胞の数と比較してＴCM細胞に富むリンパ球の集団を生成することを含む。
【0024】
別の実施形態では、ヒトセントラルメモリー様ＣＤ８+ Ｔ細胞の集団を含む組成物が提供され、Ｔ細胞の少なくとも２０％（例えば、少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、又はそれ以上）は、ＣＤ１２７及びＣＣＲ７を低発現すると共に、ＣＤ２８及びＣＤ６２Ｌを高発現するＣＤ２８+ＣＤ６２Ｌ+ＣＤ１２７-ＣＣＲ７-Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞の少なくとも５０％又は６０％は、ＣＤ２８+ＣＤ６２Ｌ+ＣＤ１２７-ＣＣＲ７-Ｔ細胞である。ある態様では、ＣＤ２８+ＣＤ６２Ｌ+ＣＤ１２７-ＣＣＲ７-Ｔ細胞は、Ｌｅｆ１及び／又はＴｃｆ１をさらに発現するか、又はこれらを高発現する。特定の態様では、ＣＤ２８+ＣＤ６２Ｌ+ＣＤ１２７-ＣＣＲ７-Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ及び／又はＣＤ４５ＲＯの発現を本質的に有さない。いくつかの態様では、ＣＤ２８+ＣＤ６２Ｌ+ＣＤ１２７-ＣＣＲ７-Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ及び／又はＣＤ４５ＲＯを低発現する。
【0025】
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、本発明のある態様をさらに実証するために含まれている。本発明は、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ又は複数を参照することによってよりよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1A-1C】図１Ａ～図１Ｃ：エフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ-ＣＣＲ７-）ＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＣＤ２８プロモーター上のＡｃＨ３レベルの低下。（Ａ）ＣＤ２８プロモーター上のＡｃＨ３レベルのＣｈＩＰ結果。プライマー８～１０は、転写開始部位の下流のゲノムＤＮＡ領域にまたがっている。結果を、入力量のパーセンテージに対して正規化した。ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ+ＣＣＲ７+）ＣＤ８＋ Ｔ細胞を比較に使用した。（Ｂ）ＳＡＨＡによるＡｃＨ３レベルの用量依存的増加のウェスタンブロットの結果。Ｈ３及びβ－アクチンをローディング対照として使用した。（Ｃ）ＣＴＬにおけるＩＬ－２１誘導ｐＳＴＡＴ３のウェスタンブロットの結果。ＳＴＡＴ３及びβ－アクチンをローディング対照として使用した。２つの独立した実験の代表的な結果を示す。
【0027】
【図2A-2C】図２Ａ～図２Ｃ：ＩＬ－２１とＳＡＨＡは相乗作用してＣＤ２８及びＣＤ６２Ｌ発現をアップレギュレートする。（Ａ）示された条件で４日間処理したＣＴＬにおけるＣＤ２８レベルの代表的なヒストグラム。各パネル内の数字は、ＣＤ２８染色のＭＦＩを示す。（Ｂ）示された条件で２週間増殖されたＴＩＬにおけるＣＤ２８及びＣＤ６２Ｌレベルの代表的なプロット。プロット内の数字は、各象限の細胞のパーセンテージを示す。（Ｃ）ＣＤ２８プロモーター上のＳＴＡＴ結合部位付近のＡｃＨ３及びＳＴＡＴ３の濃縮のＣｈＩＰ結果。結果を、入力量のパーセンテージに対して正規化した。ＩｇＧを陰性対照として使用した。２つの独立した実験のうちの代表的な結果を示す。ＭＦＩ：平均蛍光強度。ＡｃＨ３：Ｈ３アセチル化。**ｐ＜０．０ｌ、***ｐ＜０．００ｌ。
【0028】
【0029】
【図4A-4C】図４Ａ～図４Ｃ：ＩＬ－２１とパノビノスタット（Ｐａｎｏ）が協同して、セントラルメモリー様Ｔ細胞を誘導する。（Ａ）示された条件で２週間増殖されたＣＴＬにおけるＣＤ２８及びＣＤ６２Ｌレベルの代表的なプロット。プロット内の数字は、各象限の細胞のパーセンテージを示す。（Ｂ）ＣＦＳＥ希釈によって示されるＩＬ－２又はＩＬ－１５のいずれかで処理された場合の増殖したＣＴＬの増殖。ゲートは、２日間で２回以上分裂された細胞のパーセンテージを表す。（Ｃ）定期的に又はＩＬ－２１で増殖されたＣＴＬにおけるＣＤ１３２（ｇＣ）レベルの代表的なヒストグラム。示された条件で増殖されたＣＴＬにおけるＣＤ１３２ ＭＦＩの要約。３～５回の独立した実験の代表的な結果を示す。Ｐａｎｏ：パノビノスタット。ＭＦＩ：平均蛍光強度。**ｐ＜０．０ｌ。
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【図9A-9F】図９Ａ～図９Ｆ：ＩＬ－２１は、活性化ヒトナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＣＤ２８発現をアップレギュレートする。（Ａ）Ｍ２７特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞及びアイソタイプ対照抗体におけるＣＤ２８表面レベルの代表的なヒストグラムを陰性染色対照として使用した。（Ｂ）Ｍ２７特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞の表面におけるＣＤ２８タンパク質レベルのＭＦＩ。（ｎ＝ｌ２、平均±ＳＥＭ、****ｐ＜０．０００１、対応のないｔ検定）。ＭＦＩ：平均蛍光強度。（Ｃ）活性化後７日目に染色されたヒトナイーブＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＣＤ２８表面レベルの代表的なヒストグラム。アイソタイプ対照抗体を陰性染色対照として使用した。（Ｄ）示された条件で７日間活性化されたＣＤ８+ Ｔ細胞の表面におけるＣＤ２８タンパク質レベルのＭＦＩ。（ｎ＝４、平均±ＳＥＭ、*ｐ＜０．０５、対応のあるｔ検定）。（Ｅ）ＩＬ－２１を用いて又は用いずに生成された選別精製ヒトＭａｒｔ１（Ｍ２７）特異的ＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＣＤ２８ ｍＲＮＡレベルの定量的ＲＴ－ＰＣＲ結果。ＩＬ－２１を用いずに増殖された細胞における発現レベルを１に設定した。（ｎ＝２、平均±ＳＥＭ、**ｐ＜０．０１、対応のないｔ検定）。（Ｆ）示された条件で７日間活性化されたヒトＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＣＤ２８ ｍＲＮＡレベルの定量的ＲＴ－ＰＣＲ結果。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで７日間活性化された細胞の発現レベルを１に設定した。（ｎ＝６、平均±ＳＥＭ、**ｐ＜０．０１、対応のあるｔ検定）。ＣＤ２８遺伝子の定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を、ＲＰＬ１３Ａに対して正規化した。Ａ、Ｂ、及びＥの結果は、異なる健康なドナーからの細胞を使用して２つ（Ｅ）又は３つ（Ａ～Ｂ）の独立した実験の代表的な結果であった。パネルＣは、異なる健康なドナーからの細胞を使用した４つの独立した実験の代表的なものであった。Ｄ及びＦの結果は、異なる健康なドナーからの細胞を使用した４つ（Ｄ）又は６つ（Ｆ）の独立した実験からプールしたものであった。
【0035】
【図10A-10G】図１０Ａ～図１０Ｇ：ＳＴＡＴ３の活性化は、ＩＬ－２１誘導ＣＤ２８のアップレギュレーションに不可欠である。（Ａ）健康なドナー又はヨブ症候群患者からの活性化ヒトＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＣＤ２８表面レベルの代表的なヒストグラム。ＨＤ：健康なドナー。（Ｂ）ＣＤ２８ ＭＦＩの倍率変化であり、抗ＣＤ３／ＣＤ２８のみで活性化された細胞のＭＦＩに対する抗ＣＤ３／ＣＤ２８及びＩＬ－２１で活性化された細胞のＭＦＩの倍率として表される。（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ、*ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定）。（Ｃ）抗ＣＤ３／ＣＤ２８又はＩＬ－２１と一緒に７日間活性化された、健康なドナー又はヨブ症候群患者からのヒトＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＣＤ２８ ｍＲＮＡレベルの定量的ＲＴ－ＰＣＲ結果の倍率変化。抗ＣＤ３／２８ビーズのみで７日間活性化された、健康なドナー又はヨブ症候群患者からの細胞における発現レベルを１に設定した。（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ、**ｐ＜０．０１、対応のないｔ検定）。（Ｄ）対照、ＳＴＡＴ１、又はＳＴＡＴ３ ｓｈＲＮＡでトランスフェクトされ、示された条件で７日間活性化されたヒトＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＣＤ２８表面レベルの代表的なヒストグラム。（Ｅ）陰性対照（対照）又は示された条件で７日間活性化されたＳＴＡＴノックダウンＣＤ８+ Ｔ細胞の表面におけるＣＤ２８ ＭＦＩの倍率変化。データは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８のみで活性化された細胞のＭＦＩに対する、抗ＣＤ３／ＣＤ２８及びＩＬ－２１で活性化された細胞のＭＦＩの倍率として表される。（ｎ＝６、平均±ＳＥＭ、*ｐ＜０．０５、一元配置分散分析）。（Ｆ）対照、ＳＴＡＴ１、又はＳＴＡＴ３ ｓｈＲＮＡでトランスフェクトされ、抗ＣＤ３／ＣＤ２８又はＩＬ－２１と一緒に７日間活性化されたヒトＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＣＤ２８ ｍＲＮＡレベルの定量的ＰＣＲ結果の倍率変化。ＣＤ３／２８ビーズのみで７日間活性化された細胞の発現レベルを１に設定した。（ｎ＝４、平均±ＳＥＭ、*ｐ＜０．０５、一元配置分散分析）。（Ｇ）ヒトＣＤ２８プロモーター上の近位及び遠位ＳＴＡＴ部位へのＳＴＡＴ３の結合のＣｈＩＰ結果。（ｎ＝６、平均±ＳＥＭ、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、二元配置分散分析）。結果は、代表的（Ａ、Ｄ、Ｇ）なものであるか、又は様々なドナーからの細胞を使用した３つ（Ｂ、Ｃ、Ｇ）、４つ（Ｆ）、又は６つ（Ｅ）の独立した実験からプールしたものであった。
【0036】
【図11A-11F】図１１Ａ～図１１Ｆ：ＩＬ－２１に応答したＣＤ２８の分化誘導は、ナイーブ及びエフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞におけるヒストンＨ３アセチル化レベルと相関している。（Ａ～Ｂ）ＩＬ－２１の存在下又は非存在下で４日間、Ｍ２７パルス成熟樹状細胞で活性化されたＭ２７特異的エフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＣＤ２８レベルの代表的なヒストグラム及び要約。アイソタイプ抗体を陰性染色対照として使用した。［ｎ＝３；平均±ＳＥＭ；ｎｓ：有意ではない；対応のあるｔ検定］。（Ｃ）ナイーブ及びＭ２７特異的エフェクターＣＴＬにおけるＩＬ－２１誘導ｐＳＴＡＴ３のウェスタンブロットの結果。ＳＴＡＴ３及びβ－アクチンをローディング対照として使用した。バンドを、ＩｍａｇｅＪを使用して定量し、対応する試料中のアクチンの密度に対して正規化した。分子量はキロダルトンで示す。ＵＴ：未処理。（Ｄ）ナイーブをＣＤ４５ＲＡ+ＥＭ（ＴEMRA）ＣＤ８+ Ｔ細胞と比較しているＣＤ２８プロモーター上のＨ３アセチル化レベルのＣｈＩＰ結果。結果を入力量のパーセンテージに対して正規化した。ＴＳＳ：転写開始部位。［ｎ＝３；平均±ＳＥＭ；*ｐ＜０．０５、***ｐ＜０．００ｌ；二元配置分散分析］。（Ｅ）抗ＣＤ３／ＣＤ２８又はＩＬ－２１と一緒に４日間活性化されたナイーブ及びＴEMRA ＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＣＤ２８レベルの代表的なヒストグラム。（Ｆ）ナイーブＴ細胞をＭ２７特異的エフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞と比較しているＣＤ２８プロモーターにおけるＨ３アセチル化レベルのＣｈＩＰ結果。結果を入力量のパーセンテージに対して正規化した。［ｎ＝３；平均±ＳＥＭ；**ｐ＜０．０ｌ、***ｐ＜０．００ｌ；二元配置分散分析］。結果は、２つ（Ｃ、Ｅ、Ｆ）又は３つ（Ａ、Ｄ）のうちの代表的なものであるか、又は異なるドナーからの細胞を使用した３つ（Ｂ）の独立した実験からプールしたものであった。
【0037】
【図12A-12F】図１２Ａ～図１２Ｆ：ＳＡＨＡは、ＩＬ－２１誘導ｐＳＴＡＴ３がＣＤ２８プロモーターにアクセスしてエフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＣＤ２８発現をアップレギュレートすることを可能にする。（Ａ）未処理のまま（なし）又はＳＡＨＡで２４時間処理したＭ２７特異的エフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞のＣＤ２８プロモーターにおけるＨ３アセチル化レベルのＣｈＩＰ結果。［ｎ＝３；平均±ＳＥＭ；***ｐ＜０．００ｌ；二元配置分散分析］。（Ｂ）未処理のまま又はＳＡＨＡで２４時間処理し、続いてＩＬ－２１で３０分間刺激したＭ２７特異的エフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞のＣＤ２８プロモーターへのＳＴＡＴ３結合のＣｈＩＰ結果。［ｎ＝３；平均±ＳＥＭ；ｎｓ：有意ではない、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０ｌ；二元配置分散分析］。（Ｃ）示された条件で４日間処理されたＣＴＬにおけるＣＤ２８レベルの代表的なヒストグラム。ヒストグラムグラフ内の数字は、各条件での代表的なＣＤ２８ ＭＦＩを示し、垂直線はＣＤ２８-集団とＣＤ２８+集団を分離している。（Ｄ）独立した実験からのＣＴＬにおけるＣＤ２８のＭＦＩ（ｎ＝４；平均±ＳＥＭ；*ｐ＜０．０５；一元配置分散分析、ＩＬ－２＋ＳＡＨＡを他の条件と比較）。（Ｅ）示された条件で２週間増殖されたＴＩＬにおけるＣＤ２８及びＣＤ６２Ｌレベルの代表的なプロット。プロット内の数字は、各象限の細胞のパーセンテージを示す。（Ｆ）独立した実験からの、示された条件で増殖されたＴＩＬのＣＤ２８+ＣＤ６２Ｌ+細胞のパーセンテージ（ｎ＝４；*ｐ＜０．０５；一元配置分散分析）。２つ（Ｂ）、３つ（Ａ）、又は４つ（Ｃ、Ｅ）の独立した実験の代表的な結果を示す。
【0038】
【0039】
【図14A-14D】図１４Ａ～図１４Ｄ：ＩＬ－２１／パノビノスタットで増殖されたＣＴＬは、インビトロでセントラルメモリーのような特徴を示す。（Ａ）ＣＦＳＥ希釈によって示されるＩＬ－２又はＩＬ－１５のいずれかで処理された場合の増殖されたＣＴＬの増殖。数字は、２日間で２回以上分裂した細胞のパーセンテージを示す。（Ｂ）示された条件で増殖されたＣＴＬにおけるＣＤ１３２（γＣ）レベルの代表的なヒストグラム。数字は、各条件でのＣＤ１３２の代表的なＭＦＩを示す。（Ｃ）独立した実験による、示された条件で増殖されたＣＴＬにおけるＣＤ１３２ ＭＦＩの要約（ｎ＝６；平均±ＳＥＭ；*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０ｌ；一元配置分散分析、通常のプロトコルで増殖されたＣＴＬと比較）。（Ｄ）ＩＬ－２１及びパノビノスタットで増殖されたＣＴＬから選別されたＣＤ２８－ＣＤ６２Ｌ－及びＣＤ２８+ＣＤ６２Ｌ+細胞におけるｍＲＮＡ遺伝子発現の代表的な結果。遺伝子発現を、ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１３Ａ発現に対して正規化した。（ｎ＝２；平均＋ＳＤ；**ｐ＜０．０ｌ、ｎｓ：有意ではない；両側ｔ検定）。２つ（Ａ）、３つ（Ｄ）、又は６つ（Ｂ）の独立した実験の代表的な結果を示す。
【0040】
【図15A-15B】図１５Ａ及び図１５Ｂ：ＳＴＡＴ３は、ヒトナイーブＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＩＬ－２１媒介ＣＤ２８のアップレギュレーションに必要である。（Ａ）細胞処理の３０分後のｐＳＴＡＴ１、ｐＳＴＡＴ３、及びｐＳＴＡＴ５レベルの代表的なウェスタンの結果。（Ｂ）陰性対照、ＳＴＡＴ１、又はＳＴＡＴ３ ｓｈＲＮＡでトランスフェクトされたヒトＣＤ８+ Ｔ細胞における総ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３レベルのウェスタンの結果。β－アクチンをローディング対照として使用した。バンドを、ＩｍａｇｅＪを使用して定量し、対応する試料中のアクチンの密度に対して正規化した。分子量はキロダルトンで示す。２つ（Ｂ）又は３つ（Ａ）の独立した実験の代表的な結果を示す。ＵＴ：未処理。Ｃｔｌ：対照。
【0041】
【0042】
【0043】
【0044】
【発明を実施するための形態】
【0045】
Ｉ．定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」という単数形の用語は、文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「ペプチド」への言及は、当業者に公知である１つ又は複数のペプチド及びその同等物（例えば、ポリペプチド）への言及を含む。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」という単数形の用語は、文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「ペプチド」への言及は、当業者に公知である１つ又は複数のペプチド及びその同等物（例えば、ポリペプチド）への言及を含む。
【0046】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される「又は」という用語は、代替物のみを指すように明示的に示されない限り、又は代替物が互いに矛盾する場合を除き、「及び／又は」を意味する。
【0047】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される「別の」という用語は、少なくとも第２以上を意味し得る。
【0048】
本明細書で使用される「約」という用語は、特定の値又は測定値が、測定値を得るため、値を計算するために使用される装置に関連する固有の変動、又は試験対象間に存在する自然の変動を含むことを示す。
【0049】
溶液の成分（例えば、１つ又は複数のタンパク質、ポリマー、又は小分子の調製物）に関して本明細書で使用される「本質的に含まない」という用語は、調製物がその成分を含むように製剤化されなかったこと、又はそのような成分が（例えば、汚染物質として）微量しか存在しないことを意味する。ある実施形態では、目的の分子の調製物は、この調製物が０．０５％（ｗ／ｗ）未満の特定の成分を含む場合、本質的にその成分を含まない。ある実施形態では、目的の分子の調製物は、この調製物が０．０１％（ｗ／ｗ）未満の特定の成分を含む場合、本質的にその成分を含まない。ある実施形態では、目的の分子の調製物は、標準的な分析方法（例えば、ＵＶ分光光度法、質量分析法、核磁気共鳴分光法など）を用いてこの調製物で特定の成分が一切検出できない場合は、この特定の成分を本質的に含まない。
【0050】
溶液又は懸濁液の成分（例えば、１つ又は複数の細胞型、タンパク質、ポリマー、又は小分子の調製物）に関して本明細書で使用される「～に富む」という用語は、この調製物が、通常の濃度よりも高く、又は通常の数よりも多く成分を含むように製剤化されたことを意味する（例えば、リンパ球の懸濁液はエフェクターＴリンパ球に富み得る）。
【0051】
本明細書で使用される「Ｔ細胞」又は「Ｔリンパ球」という用語は、胸腺によって産生又は処理され、適応免疫応答に積極的に関与するタイプのリンパ球又は白血球を指す。この用語には、限定されるものではないが、エフェクターＴ細胞（ＴEFF細胞）、ＣＤ４+ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４+ Ｔ細胞又はＴH細胞）、ＣＤ８+細胞毒性又はキラーＴ細胞（ＣＤ８+又はＣＴＬ）、メモリーＴ細胞、制御性又はサプレッサーＴ細胞（ＴREGs）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＴNK）、粘膜関連不変Ｔ細胞、及びガンマデルタ又はγδ+ Ｔ細胞（Ｔγδ）が含まれる。
【0052】
各Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し、このＴ細胞受容体は、抗原提示細胞又は病原体感染細胞の表面に表示される主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子との関連でペプチド抗原を認識する。主要なＴＣＲ種は、アルファ（α）サブユニット及びベータ（β）サブユニットを含み、それぞれのサブユニットは、体細胞Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換えされて、それぞれ個々に最大で可能な１０14個のユニークなＴＣＲαβヘテロ二量体が存在する抗原反応性Ｔ細胞の多様なレパートリーを産生する遺伝子によってコードされる。非主要なＴＣＲ種（Ｔγδ）もまた、体細胞Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えによって生成される。機能的なＴＣＲの組換え及び胸腺からの発現が成功すると、主に二次リンパ組織（リンパ節と脾臓）及び末梢循環を介して移動できるが、まだ感染性の課題に対処できるいかなる種類の応答も生成できない休止状態の「ナイーブ」Ｔ細胞が得られる。
【0053】
免疫保護を媒介することができるＴ細胞を生成することは、最初に、ナイーブＴ細胞の「活性化」を必要とする。これには、Ｔ細胞上の多数の分子と、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ又はクラスＩＩ分子に非共有結合した感染因子に由来する抗原ペプチドを有する細胞である抗原提示細胞（ＡＰＣ）との間の協調的相互作用が含まれる。ＴＣＲは、２つの鎖（α及びβ）から構成され、適切なクラスＩ又はクラスＩＩＭＨＣ分子との関連で結合した場合にのみペプチド抗原を認識する。Ｔ細胞上で、ＴＣＲは、ＣＤ３（γ－、δ－、ε－、ζ－サブユニットから構成される）と総称される膜タンパク質の複合体と結合し、この複合体の細胞質領域が、ＴＣＲライゲーション後の細胞内シグナルの伝播を担っている。各ＴＣＲは、Ｔ細胞のタイプに応じて、ＣＤ４又はＣＤ８補助受容体にも結合する。これらの２つの分子は、ＭＨＣ（ＣＤ８のクラスＩ及びＣＤ４のクラスＩＩ）に結合し、Ｔ細胞とＡＰＣとの間の相互作用をさらに安定させる。
【0054】
ＴEFFのカテゴリーは、ＴH、ＣＴＬ、ＴREGs、及び可能性がある他のＴ細胞型を含む、免疫刺激（例えば、共刺激）に能動的に応答する様々なＴ細胞型を含む。ＴH細胞は、Ｂ細胞の形質細胞及び記憶Ｂ細胞への成熟、並びにＣＴＬ及びマクロファージの活性化を含む免疫学的プロセスにおいて他のリンパ球を支援する。ＴH細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現するＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した細胞外タンパク質に由来するペプチド抗原が提示されると活性化される。ＴH細胞には、限定されるものではないが、ＴH１、ＴH２、ＴH３、ＴH９、ＴH１７、ＴH２２、及びＴ濾胞ヘルパー細胞（ＴFH）を含むＴH細胞のいくつかのサブタイプが存在し、それぞれが１つ又は複数の異なるシグナル伝達タンパク質（即ち、サイトカイン）を分泌して、適応免疫応答の様々な側面をアップレギュレート又はダウンレギュレートする。ＣＴＬは、ウイルス感染細胞や腫瘍細胞を殺すことができ、移植された組織の拒絶に関与している。ＣＴＬは、標的細胞の表面に発現するＭＨＣクラスＩ分子に結合した非自己細胞内タンパク質に由来するペプチドが提示されると活性化される。ＴREGsは、免疫反応の終了に向かってＴ細胞性免疫を止める又は抑制すること、及び胸腺での陰性選択を回避した自己応答性Ｔ細胞を抑制することによって、免疫寛容の維持に重要な役割を果たす。ＴREGsの少なくとも３つの主要なクラス：ＣＤ４+ＦｏｘＰ３+、ＣＤ４+ＦｏｘＰ３- ＴREGs、及びタイプ１制御性Ｔ細胞（Ｔr1細胞）が存在し、これらはＣＤ４+ＣＤ４９ｂ+ＬＡＧ－３+ＣＤ２２６+である。
【0055】
ＣＤ４+及びＣＤ８+ Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞（ＴMEM）及びＴEFF細胞を含む、ナイーブ又は抗原を経験した集団として最も単純に分類される。ＴMEM細胞の２つの主要なサブタイプであるＴCM細胞及びＴEM細胞は、それらのエフェクター機能及び様々な解剖学的部位に帰巣する能力が異なることが知られている。Ｔ細胞の様々なタイプ及びサブタイプ、例えば、ナイーブＴ細胞、ＴCM細胞、ＴEM細胞、ＴEFF細胞は、各タイプに特徴的な１つ又は複数の細胞表面タンパク質の発現を分析することによって区別することができる。例えば、ｓｒｃファミリーキナーゼを調節するタンパク質チロシンホスファターゼであるＣＤ４５を含む標準的なマーカーは、すべての造血細胞で発現する。ヒトＣＤ４５は、細胞外ドメインの一部を構成する３つのエクソンの選択的スプライシングによって、いくつかのアイソフォームの１つとして発現させることができる。ヒトでは、選択的にスプライシングされたエクソン：ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＡＢ、ＣＤ４５ＲＢＣ、及びＣＤ４５ＲＡＢＣのうちの１つ、２つ、又は３つのいずれかを有する変異体を含む６つのアイソフォームが従来同定されている。
【0056】
ナイーブＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）、インターロイキン受容体７－アルファサブユニット（ＩＬ７Ｒα；ＣＤ１２７）、及びＣＤ２８を発現する。メモリーＴ細胞（ＴMEM）のカテゴリーは、限定されるものではないが、セントラルメモリーＴ細胞（ＴCM細胞）及びエフェクターメモリーＴ細胞（ＴEM及びＴEMRA細胞）を含め、様々なサブタイプを含む。ＴCM細胞は、ＣＤ４５ＲＯ、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）、インターロイキン受容体７－アルファサブユニット（ＩＬ７Ｒα；ＣＤ１２７）、ＣＤ２８、及びＣ－Ｃケモカイン受容体７型（ＣＣＲ７）を発現する。ＴEM細胞は、ＣＤ４５ＲＯ、低レベルでやや不均一なレベルのＬ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）、インターロイキン受容体７－アルファサブユニット（ＩＬ７Ｒα；ＣＤ１２７）、及びＣＤ２８を発現するが、ＣＣＲ７は発現しない。ＴEMRA細胞（ＣＤ４５ＲＡを再発現する最終分化エフェクターメモリー細胞）は、ＣＤ４５ＲＡ、低レベルでやや不均一なレベルのＬ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）、インターロイキン受容体７－アルファサブユニット（ＩＬ７Ｒα；ＣＤ１２７）、及びＣＤ２８を発現するが、ＣＣＲ７は発現しない。
【0057】
本明細書で使用される「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」という用語は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）とヘルパーＴ細胞（ＴH細胞）、並びにＢ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、及びプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば樹状細胞などとの混合物を含む、多数の異なるタイプの固形腫瘍で観察された又は該固形腫瘍から単離された免疫細胞の複雑な混合物を指す。
【0058】
本明細書で使用される「抗原」という用語は、脊椎動物、例えば、ヒトにおいて体液性又は細胞性免疫応答、特に抗体の産生、Ｂ細胞の活性化、及び／又はＴ細胞の活性化を誘導する毒素、タンパク質、又は他の外来物質を指す。抗原は、１つ又は複数のエピトープを含む。
【0059】
本明細書で使用される「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、免疫系によって、例えば、抗体、Ｂ細胞、又はＴ細胞などによって認識される特定の抗原の１つ又は複数の部分を指す。従って、エピトープは、抗体が結合する抗原の特定の部分、又はＴ細胞受容体が結合する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合する特定のペプチドである。抗体によって認識されるエピトープは、線状又は立体構造であり得る。線状エピトープは、その一次アミノ酸配列を介して抗体と相互作用するエピトープであり、例えば、抗原中のアミノ酸の連続的な線状配列によって形成される。立体構造エピトープは、抗原の三次元構造又は形状（即ち、その三次構造）に基づいて抗体と相互作用するエピトープであり、例えば、抗原中のアミノ酸の不連続又は非線形セグメントによって形成される。
【0060】
本明細書で使用される「ネオエピトープ」という用語は、新しいエピトープ、又は、例えば癌細胞又は癌性組織に存在するが健康な組織には存在しない非自然発生の突然変異の結果として癌細胞又は癌性組織に存在する抗原などの新しい抗原（「ネオ抗原」）上のエピトープを指す。
【0061】
「腫瘍関連抗原」、「腫瘍抗原」、「腫瘍特異的抗原」、又は「癌細胞抗原」という用語は、本明細書では互換的に使用され、正常な非癌性組織と比較して１つ又は複数の特定の腫瘍型で独自に又はより豊富に発現し、癌患者の抗原特異的な体液性及び／又は細胞性免疫応答を刺激することができるタンパク質、炭水化物、又は他の分子を指す。
【0062】
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」、「ＣＡＲ」、「キメラＴ細胞受容体」、「人工Ｔ細胞受容体」、又は「キメラ免疫受容体」という用語は、所望の非ＭＨＣ制限抗原結合特異性を免疫エフェクター細胞、例えばエフェクターＴ細胞に移植する、エンジニアリングされたキメラ受容体構築物を指す。ＣＡＲは、例えば、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、抗体又は抗体断片、例えば所望の抗原特異性を有する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）など）、スペーサー配列、膜貫通ドメイン、及び１つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。例示的な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ζ）などの１つ又は複数の細胞内チロシンベースの活性化モチーフ（「ＩＴＡＭ」）、及び／又は１つ又は複数の共刺激シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ２８、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、又はそれらの組み合わせなどを含み得る。
【0063】
本明細書で使用される「抗原提示細胞」又は「ＡＰＣ」という用語は、抗原提示することができる、即ち、細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体分子によって１つ又は複数の他の免疫細胞、例えばＴ細胞に結合された抗原ペプチドを提示することができる免疫細胞のクラスを指す。ほとんどの免疫細胞型は、ある種のＡＰＣとして機能し得るが、プロフェッショナルＡＰＣ、例えばマクロファージ、Ｂ細胞、及び樹状細胞は、ＴH細胞に外来抗原を提示し、他の細胞型は、細胞内抗原をＣＴＬに提示することができる。ＣＴＬ及びＴH細胞の両方の機能がＡＰＣ活性に依存するため、ＡＰＣは適応免疫応答の必須の要素である。抗原提示は、適応免疫の特異性を可能にし、細胞内及び細胞外病原体の両方に対する適応免疫応答を可能にし、且つ腫瘍に対する防御に関与する。
【0064】
本明細書で使用される「ヒストンデアセチラーゼ」、「ＨＤＡＣ酵素」、又は「ＨＤＡＣ」という用語は、例えば、ヒストン上のε－Ｎ－アセチル－リジンアミノ酸からのアセチル基（ＣＨ3－ＣＯ－Ｒ）の除去を触媒する酵素のクラス（ＥＣ３．５．１．９８）を指す。例えば、Ｓｅｔｏ ａｎｄ Ｙｏｓｈｉｄａ，２０１４を参照されたい。ヒストンのアセチル化及び脱アセチル化は、遺伝子発現の調節に重要な役割を果たす。ヒストンのアセチル化は、それらの正電荷を中和し、負電荷を帯びたＤＮＡとの相互作用を緩めると考えられている。これにより、クロマチン構造が開き、転写因子の結合が促進され、続いて遺伝子の転写が促進される。ＨＤＡＣによるヒストンの脱アセチル化は、ＤＮＡとの相互作用を強化し、閉じたクロマチン構造及び遺伝子転写の阻害をもたらす。ヒストンリジンのアセチル化は非常に可逆的である。リジン残基は、ヒストン／リジンアセチルトランスフェラーゼ酵素（ＨＡＴ）の作用によってアセチル化され、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）によって脱アセチル化される。
【0065】
本明細書で使用される「ＨＤＡＣ阻害剤」又は「ＨＤＡＣｉ」という用語は、１つ又は複数のＨＤＡＣ酵素のヒストンデアセチラーゼ活性を強力且つ特異的に阻害することができる広範な化合物のクラスを指す。古典的なＨＤＡＣｉは、デアセチラーゼ活性の補因子としてＺｎ2+を必要とするＨＤＡＣを含む、クラスＩ、ＩＩ、及びＩＶの従来のＨＤＡＣのみに作用する。古典的なＨＤＡＣｉは、典型的には、チオール基で亜鉛イオンに結合する環状テトラペプチドを除いて、亜鉛イオンへの結合に関与する化学部分に従って分類される。例示的で古典的なＨＤＡＣｉには、ヒドロキサム酸又はヒドロキサメート（例えば、トリコスタチンＡ）、環状テトラペプチド（例えば、トラポキシンＢ）及びデプシペプチド、ベンズアミド、求電子性ケトン、及び脂肪酸（例えば、フェニルブチレート及びバルプロ酸）が含まれる。第２世代の古典的なＨＤＡＣｉには、ヒドロキサム酸ボリノスタット（スベラニロヒドロキサム酸又はＳＡＨＡ、Ｚｏｌｉｎｚａ（登録商標）として販売されている）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１、Ｂｅｌｅｏｄａｑ（登録商標）として販売されている）、パノビノスタット（Ｆａｒｙｄａｑ（登録商標）として販売されている）、及びダシノスタット（ＬＡＱ８２４）、及びベンズアミドエンチノスタット（ＳＮＤＸ－２７５又はＭＳ－２７５）、タセジナリン（ＣＩ９９４）、及びモセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）が含まれる。
【0066】
本明細書で使用される「抗体」又は「免疫グロブリン」という用語は、互換的に使用され、典型的には、ジスルフィド結合によって連結された４つの別個のポリペプチド（２つの重鎖及び２つの軽鎖）を含む、いくつかの高分子量糖タンパク質のいずれかを指す。抗体は通常、抗原刺激後にＢ細胞と呼ばれる特殊なリンパ球によって産生される。抗体は、体液性免疫応答の一部としてＢ細胞を刺激した抗原上の特定のエピトープに特異的に結合することができる。抗体は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、アイソタイプと呼ばれる５つの異なる形態で発生し、それぞれが異なる重鎖：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの存在によって区別される。抗体は、例えば、Ｆａｂ（断片、抗原結合）、抗原特異性を決定する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＦｖ（断片、可変領域）、及びＦｃ（断片、定常領域）を含む一連の断片を放出させるために、プロテアーゼ酵素によって切断することができる。
【0067】
抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであり得る。ポリクローナル抗体は、体内の異なるＢ細胞系統によって分泌される抗体の混合物であり、同じ抗原に対して反応し、それぞれが異なるエピトープに結合する抗体のコレクションを含む。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株などの細胞の単一クローンによって産生される抗体であり、同一の特異性（即ち、それぞれが同じエピトープに結合する）を有する抗体を含む。「抗体」という用語は、所望の生物学的活性、例えば、抗原結合、補体結合、及びＦｃ受容体結合などを保持する、すべての天然に存在するエンジニアリングされた抗体断片を包含する。エンジニアリングされた抗体及び抗体断片には、例えば、二重特異性抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、単一特異性Ｆａｂ2、二重特異性Ｆａｂ2、三重特異性Ｆａｂ3、一価ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、二重特異性ダイアボディ、三重特異性ダイアボディ、及びｓｃＦｖ－Ｆｃなどが含まれる。抗体の供給源及び所望の用途（即ち、ヒト治療薬として使用するためのマウスモノクローナル抗体）に応じて、結合親和性を改善するか、又は「ヒト化」と呼ばれるプロセスによって免疫原性を低下させるようにさらにエンジニアリングすることができる。
【0068】
本明細書で使用される「免疫療法（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」又は「免疫療法（ｉｍｍｕｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）」という用語は、癌を予防又は検出又は処置するためのあらゆるアプローチを指し、このようなアプローチは、ワクチン、細胞療法、並びに細胞療法、腫瘍溶解性ウイルス、抗体（例えば、裸抗体、薬物結合抗体、及び二重特異性抗体など）、免疫調節剤（例えば、アジュバント、サイトカイン、増殖因子など）、及び免疫抑制を低減し、免疫細胞の輸送及び／又は活性化を増強し、又は腫瘍微小環境を有利に変化させる他のカテゴリーの薬剤の生成及び使用に関与する任意のベクター又は関連成分などの免疫系が関与するメカニズム、並びに癌又はその影響に対する免疫応答の特性評価に関連する任意の実験技術に依存する。
【0069】
本明細書で使用される「免疫チェックポイント」又は「免疫チェックポイントタンパク質」という用語は、免疫応答の１つ又は複数の態様、例えば、細胞性免疫応答を負に調節するプロセス又は経路に関与する多数のタンパク質のいずれかを指し、自己免疫寛容の維持、自己免疫の予防、末梢組織における生理的免疫応答の持続時間と大きさの調節、及び側副組織損傷の最小化において重要な役割を果たす。免疫チェックポイントタンパク質には、例えば、プログラムされた細胞死経路１（ＰＤ－１／ＣＤ２７９）とそのリガンド（ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４及びＰＤ－Ｌ２／ＣＤ２７３）、細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４／ＣＤ１５２）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３／ＣＤ２２３）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｉｇ及び免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）ドメインを含むＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン、及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３／ＨＡＶｃｒ２）、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ／ＣＤ１５８）、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、並びにアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）が含まれる。
【0070】
本明細書で使用される「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、免疫チェックポイントタンパク質に結合することができ、且つ免疫応答のそれらの負の調節を軽減することができる治療薬のクラスを指す。例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、例えば、イピリムマブ（ＣＴＬＡ－４を標的とし、Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）として販売されている）、ペンブロリズマブ（ＰＤ－１を標的とし、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）として販売されている）、ニボルマブ（ＰＤ－１を標的とし、Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）として販売されている）、アテゾリズマブ（ＰＤ－Ｌ１を標的とし、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）として販売されている）、アベルマブ（ＰＤ－Ｌ１を標的とし、Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標）として販売されている）、及びデュルバルマブ（ＰＤ－Ｌ１を標的とし、Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標）として販売されている）が含まれる。免疫チェックポイント阻害は、機能の低下及び完全な遮断の両方を包含する。
【0071】
本明細書で使用される「抗癌剤」及び「化学療法剤」などの用語は、癌性又は悪性の細胞又は組織、即ち、高い増殖率の細胞又は組織に対して選択的に毒性である化学物質又は化合物のあらゆるクラスを指す。化学療法剤は、対象の癌を治療、制御、又は緩和するために使用することができる。化学療法剤には、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞骨格破壊剤、エポチロン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（上記参照）、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体及びヌクレオチド前駆体類似体、ペプチド抗生物質、プラチナベースの化合物、レチノイド、並びにビンカアルカロイド及び誘導体などを含む多数の異なるクラスが存在する。アルキル化剤には、限定されるものではないが、シクロホスファミド、メクロロエタミン、クロラムブシル、メルファラン、ダカルバジン、ニトロソウレア、及びテモゾロミドが含まれる。アントラサイクリンには、限定されるものではないが、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、及びバルルビシンが含まれる。細胞骨格破壊剤（例えば、タキサン）には、限定されるものではないが、パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン（ｎａｂ－パクリタキセル）、及びタキソテールが含まれる。トポイソメラーゼＩの阻害剤には、限定されるものではないが、イリノテカン及びトポテカンが含まれる。トポイソメラーゼＩＩの阻害剤には、限定されるものではないが、エトポシド、テニポシド、及びタフルポシドが含まれる。キナーゼ阻害剤には、限定されるものではないが、ボルテゾミブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ（ｖｅｎｕｒａｆｅｎｉｂ）、及びビスモデギブが含まれる。ヌクレオチド類似体及びヌクレオチド前駆体類似体には、限定されるものではないが、アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メトトレキサート、及びチオグアニンが含まれる。ペプチド抗生物質には、限定されるものではないが、ブレオマイシン及びアクチノマイシンが含まれる。プラチナベースの薬剤には、限定されるものではないが、カルボプラチン、シスプラチン、及びオキサリプラチンが含まれる。レチノイドには、限定されるものではないが、トレチノイン、アリトレチノイン、及びベキサロテンが含まれる。ビンカアルカロイド及び誘導体には、限定されるものではないが、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビンが含まれる。
【0072】
本明細書で使用される「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、及び「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などの用語は、例えば、治療薬を対象に投与することによって、又は外科的、臨床的、若しくは他の医療処置を対象に対して実行することによって、対象の疾患の症状又は状態を改善する、軽減する、又は他の方法で緩和するプロセスを指す。
【0073】
本明細書で使用される「対象」又は「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、個体、例えば、ヒト、又は霊長類、哺乳動物、若しくは脊椎動物などの非ヒト生物を指す。
【0074】
本明細書で使用される「治療的に有効な」又は「治療的に有益な」などの用語は、治療薬、又は他の方法で疾患、障害、若しくは状態の１つ若しくは複数の症状を改善、緩和、若しくは軽減し、これにより、例えば、疾患、障害、若しくは状態の徴候若しくは症状の頻度若しくは重症度を低下させることによって疾患、障害、又は状態を有する対象の幸福度を高める外科的、臨床的、若しくは他の医学的処置を指す。従って、治療的に有効な又は治療的に有益な癌処置は、例えば、腫瘍のサイズを縮小し、腫瘍の成長速度を低下させ、腫瘍の播種又は転移の可能性を低下させ得る。
【0075】
本明細書で使用される「薬学的に許容される」又は「薬理学的に許容される」という用語は、哺乳動物又は脊椎動物の対象に投与されたときに有害、アレルギー、又は他の望ましくない応答を生じさせない治療薬の医薬製剤を指す。このような製剤は、無菌性、発熱性、純度に関する適正製造基準（ＧＭＰ）、及びＦＤＡ事務局の生物学的基準によって要求されるその他の関連基準に準拠して製剤化する必要がある。
【0076】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、哺乳動物又は脊椎動物の対象に送達するための治療薬を製剤化するために使用されるありとあらゆる化合物又は溶媒を指し、このような溶媒には、例えば、水性溶媒（例えば、水、アルコール／水溶液、食塩水、塩化ナトリウムなどの非経口ビヒクル、リンガーデキストロースなど）、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及びエチルオレイン酸などの注射可能な有機エステル）、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤又は抗真菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、香料、染料、液体及び栄養補給剤、並びにこれらの任意の組み合わせなどが含まれ、これらは当業者には公知であろう。
【0077】
本明細書で使用される「単位用量」、「用量」、又は「薬用量」という用語は、適切な経路で、所望の治療計画に従って投与されたときに対象において治療上有効であると予想される所定量の薬剤を含む、哺乳動物又は脊椎動物の対象への投与に適した治療薬の製剤を指す。対象に投与される特定の治療薬の実際の薬用量は、例えば、対象の体重、年齢、健康、及び性別、治療される疾患の種類、疾患の進行の程度、事前又は同時の治療的介入、投与経路、及び特定の治療剤の効力、安定性、及び毒性を含む様々な身体的及び生理学的パラメーターに照らして医療提供者によって経験的に決定することができる。
【0078】
ＩＩ．ＴEFF細胞をリプログラミングする方法
一態様では、本開示は、抗原特異的エフェクターＴ細胞（ＴEFF細胞）を、例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴCM細胞）などの別の所望のタイプのＴ細胞にリプログラミングするための方法を提供する。従って、本明細書では、抗原特異的エフェクターＴ細胞（ＴEFF細胞）をセントラルメモリーＴ細胞（ＴCM細胞）にリプログラミングするための方法が提供される。
一態様では、本開示は、抗原特異的エフェクターＴ細胞（ＴEFF細胞）を、例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴCM細胞）などの別の所望のタイプのＴ細胞にリプログラミングするための方法を提供する。従って、本明細書では、抗原特異的エフェクターＴ細胞（ＴEFF細胞）をセントラルメモリーＴ細胞（ＴCM細胞）にリプログラミングするための方法が提供される。
【0079】
ある実施形態では、この方法は：ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団を対象から得るステップ；所望により、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団からＴEFF細胞に富む試料を調製するステップ；並びにそれぞれＴEFF細胞をＴCM細胞にリプログラムするのに十分な量のヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）及びインターロイキン－２１（ＩＬ－２１）の存在下で、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料を培養するステップを含み、このリプログラミングにより、対象から得られたＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団におけるＴCM細胞の数と比較してＴCM細胞に富むリンパ球の集団が生成される。
【0080】
ある実施形態では、ＣＤ８+ ＴEFF細胞は、ＩＬ－２１を添加する前にＨＤＡＣｉの存在下で培養される。ある実施形態では、ＣＤ８+ ＴEFF細胞は、ＩＬ－２１を添加する前に、ＨＤＡＣｉの存在下で１２～４８時間培養される。ある実施形態では、ＣＤ８+ ＴEFF細胞は、ＩＬ－２１を添加する前に、ＨＤＡＣｉの存在下で１～３日間培養される。ある実施形態では、ＣＤ８+ ＴEFF細胞は、ＨＤＡＣｉを添加する前にＩＬ－２１の存在下で培養される。ある実施形態では、ＣＤ８+ ＴEFF細胞は、ＨＤＡＣｉを添加する前に、ＩＬ－２１の存在下で１２～４８時間培養される。ある実施形態では、ＣＤ８+ ＴEFF細胞は、ＨＤＡＣｉを添加する前に、ＩＬ－２１の存在下で１～３日間培養される。
【0081】
ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団は、対象から血液試料を採取することによって得られる。ある実施形態では、血液試料は、アフェレーシスによってさらに精製される。ある実施形態では、アフェレーシスは、白血球アフェレーシスを含み、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団を生成する。ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団は、対象から採取された新鮮な腫瘍生検組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の試料を単離することによって得られる。ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団は、対象から採取された新鮮な腫瘍生検組織から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の試料を単離し、ＩＬ－２の存在下でそれらを培養することでＴＩＬを増殖させることによって得られる。ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団は、対象から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の試料を採取することによって得られる。ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団は、対象（例えば、高齢の対象）から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の試料を採取し、ＩＬ－２の存在下でそれらを培養することでＴEFF細胞を増殖させることによって得られる。特定の態様では、リンパ球の開始集団の前処理（例えば、活性化）は必要ない。ある実施形態では、対象は哺乳動物である。ある実施形態では、哺乳動物は、高齢者などのヒトである。
【0082】
ある実施形態では、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の試料は、対象から採取された新鮮な腫瘍生検組織から調製された細胞懸濁液を含む。ある実施形態では、細胞懸濁液は、例えば、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ａｕｂｕｒｎ， ＣＡ）を使用する腫瘍組織の機械的な分離によって得られる。ある実施形態では、細胞懸濁液は、例えばコラゲナーゼを使用する腫瘍組織の酵素的分離によって得られる。
【0083】
ある実施形態では、この方法は、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団からＴEFF細胞に富む試料を調製するステップをさらに含む。ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団からＴEFF細胞に富む試料を調製するステップは、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団から所望のＴEFF細胞型及び亜型を単離することを含む。ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団から単離された所望のＴEFF細胞型又は亜型はＣＤ８+ ＴEFF細胞を含む。ある実施形態では、ＣＤ８+ ＴEFF細胞はＣＤ４５ＲＯも発現する。ある実施形態では、単離されたＣＤ８＋ ＴEFF細胞はさらに精製される。ある実施形態では、さらなる精製は、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）のＴEFF細胞、ＴＲＥＧ、ＮＫ細胞、及びマクロファージを含むリンパ球の開始集団を枯渇させるステップを含む。ある実施形態では、ＣＤ８＋ ＴEFF細胞は、例えば、沈降、濾過、又は異なる細胞型の物理的特性の違い（例えば、サイズ、密度）を利用する密度勾配遠心分離などの当業者に周知の免疫細胞型を分離する様々な方法のいずれかを使用して単離又はさらに精製される；表面電荷の違いを利用したプラスチック又は他のポリマー表面への付着、及び付着細胞を懸濁液中の浮遊細胞から分離するための付着；特定の細胞表面表現型に基づいて異なる細胞型を選択的に捕捉するための、細胞表面抗原の１つ又は複数の特異的結合剤（例えば、抗体、核酸アプタマー）への結合；次に、捕捉された細胞を、フローサイトメトリー、カラムクロマトグラフィー、磁気ビーズの単離、又は使用される抗体試薬に応じた他の方法によって細胞の複雑な混合物から分離することができる。
【0084】
ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団からＴEFF細胞に富む試料を調製するステップは、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団から骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、ＴREGs、ＮＫ細胞、及びマクロファージを枯渇させることを含む。ある実施形態では、ＭＤＳＣ、ＴREGs、ＮＫ細胞、及びマクロファージが枯渇したＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団はさらに精製される。ある実施形態では、さらなる精製は、ＭＤＳＣ、ＴREGs、ＮＫ細胞、及びマクロファージが枯渇したＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団から所望のＴEFF細胞型及び亜型を単離することを含む。ある実施形態では、ＭＤＳＣ、ＴREGs、ＮＫ細胞、及びマクロファージが枯渇したＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団から単離された所望のＴEFF細胞型又は亜型はＣＤ８＋ ＴEFF細胞を含む。ある実施形態では、ＣＤ８+ ＴEFF細胞はＣＤ４５ＲＯも発現する。ある実施形態では、ＣＤ８＋ ＴEFF細胞は、例えば、沈降、濾過、又は異なる細胞型の物理的特性の違い（例えば、サイズ、密度）を利用する密度勾配遠心分離などの当業者に周知の免疫細胞型を分離する様々な方法のいずれかを使用して単離又はさらに精製される；表面電荷の違いを利用したプラスチック又は他のポリマー表面への付着、及び付着細胞を懸濁液中の浮遊細胞から分離するための付着；特定の細胞表面表現型に基づいて異なる細胞型を選択的に捕捉するための、細胞表面抗原の１つ又は複数の特異的結合剤（例えば、抗体、核酸アプタマー）への結合；次に、捕捉された細胞を、フローサイトメトリー、カラムクロマトグラフィー、磁気ビーズの単離、又は使用される抗体試薬に応じた他の方法によって細胞の複雑な混合物から分離することができる。
【0085】
ある実施形態では、本明細書で提供される方法で使用するための１つ又は複数の所望のＴEFF細胞型又は亜型は、１つ又は複数の細胞表面マーカーの存在又は非存在に基づいて、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団によって識別され、且つ／又は該開始集団から単離される。そのような識別及び／又は単離に有用な例示的な細胞表面マーカーには、限定されるものではないが、例えば、ＣＤ３４、造血前駆幹細胞抗原、例えばＢ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ２８、及びＬ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）などの共刺激分子が含まれる。ある実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するためのＴEFFの集団は、ＣＤ４５ＲＯ及び／又はＣＤ４５ＲＡのそれらの発現に基づいて単離又は特徴付けられる。ある実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するためのＴEFFの集団は、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、及び／又はＣＤ１２７の発現の欠如に基づいて単離又は特徴付けられる。ある実施形態では、単離は、所望のタイプのＴEFF細胞、例えば、ＣＤ８+ ＴEFF細胞が保持されるように、例えばＣＤ８などの細胞表面マーカーの発現についての正の選択を含む。ある実施形態では、単離は、望ましくないタイプのＴEFF細胞、例えばＴREGsが除去されるように、例えばＦｏｘｐ３などの細胞表面マーカーの発現についての負の選択を含む。
【0086】
ある実施形態では、細胞表面マーカーの発現に基づくＴEFFの所望の型又は亜型の識別及び／又は単離は、限定されるものではないが、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、カラムクロマトグラフィー及び他のクロマトグラフィー法、磁気ビーズによるパンニング、ウェスタンブロッティング、オートラジオグラフィー、電気泳動、及び、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの他の様々な周知の免疫学的方法などを含む、当技術分野で知られている様々な標準的な方法のいずれかによって達成される。
【0087】
ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）及びインターロイキン－２１（ＩＬ－２１）の存在下で培養される前にさらに培養又は増殖される。ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）でさらに培養される。ある実施形態では、ＩＬ－２は、５０Ｕ／ｍｌ～６０００Ｕ／ｍｌの濃度で３日ごとに投与される。ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料は、コンフルエントになるまで、例えば、約２～約２１日間、好ましくは約１０～約１４日間培養される。ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料は、１０10個以上の細胞などの所望の濃度に届くまで培養される。
【0088】
ある実施形態では、培養された、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料は、プールされ、増殖される。ある実施形態では、増殖により、ＴEFF細胞の数が、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料と比較して、約１０日間～約１４日間の期間で少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、又は少なくとも約１００倍に増加する。ある実施形態では、増殖により、ＴEFF細胞の数が、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料と比較して、約１０日間～約１４日間の期間で少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、又は少なくとも約１０００倍に増加する。
【0089】
ある実施形態では、培養された、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料の増殖は、限定されるものではないが、例えば、フィーダーリンパ球及びインターロイキン－２（ＩＬ－２）又はインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）のいずれかの存在下での非特異的Ｔ細胞受容体刺激を含む、当技術分野で公知の様々な標準的方法のいずれかによって達成される。ある実施形態では、非特異的Ｔ細胞受容体刺激は、３０ｎｇ／ｍｌの用量のＯＫＴ３、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ｏｒｔｈｏ－ＭｃＮｅｉｌ（登録商標），Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ）を含む。
【0090】
ある実施形態では、本明細書で提供される方法は、１つ又は複数の細胞表面マーカーの存在又は非存在に基づいて、リプログラムされたＴCM細胞を識別及び／又は単離するステップをさらに含む。そのような識別及び／又は単離に有用な例示的な細胞表面マーカーには、限定されるものではないが、例えば、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、及びＣＤ２７が含まれる。ある実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成されたＴCMの集団は、それらのＣＤ２８及び／又はＣＤ６２Ｌの発現に基づいて単離又は特徴付けられる。ある実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成されたＴCMの集団は、ＣＤ４５ＲＡの発現の欠如に基づいて単離又は特徴付けられる。ある実施形態では、この単離は、所望のタイプのＴ細胞、例えば、ＣＤ８+ ＴCM細胞が保持されるように、例えばＣＤ８などの細胞表面マーカーの発現についての正の選択を含む。ある実施形態では、単離は、望ましくないタイプのＴ細胞、例えばＴNが除去されるように、例えばＣＤ４５ＲＡなどの細胞表面マーカーの発現についての負の選択を含む。
【0091】
ある実施形態では、細胞表面マーカーの発現に基づくＴCMの識別及び／又は単離は、限定されるものではないが、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、カラムクロマトグラフィー及び他のクロマトグラフィー法、磁気ビーズによるパンニング、ウェスタンブロッティング、オートラジオグラフィー、電気泳動、及び、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの他の様々な周知の免疫学的方法などを含む、当技術分野で知られている様々な標準的な方法のいずれかによって達成される。
【0092】
Ａ．エンジニアリングされたＴEFF細胞
別の態様では、本明細書で提供される、抗原特異的ＴEFF細胞をＴCM細胞にリプログラミングするための方法で使用するためのＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団はエンジニアリングされたＴ細胞を含む。ある実施形態では、エンジニアリングされたＴ細胞は、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）を含む。ある実施形態では、エンジニアリングされたＴ細胞は、腫瘍特異的エピトープ又はネオエピトープに結合することができる組換えＴ細胞受容体を発現するＴ細胞を含む。
別の態様では、本明細書で提供される、抗原特異的ＴEFF細胞をＴCM細胞にリプログラミングするための方法で使用するためのＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団はエンジニアリングされたＴ細胞を含む。ある実施形態では、エンジニアリングされたＴ細胞は、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）を含む。ある実施形態では、エンジニアリングされたＴ細胞は、腫瘍特異的エピトープ又はネオエピトープに結合することができる組換えＴ細胞受容体を発現するＴ細胞を含む。
【0093】
いくつかの実施形態では、エンジニアリングされたＴ細胞は、当業者に公知の多数の十分に確立された遺伝子導入法のいずれかを使用して作製される。ある実施形態では、エンジニアリングされた細胞は、所望の標的腫瘍抗原に特異的なキメラ抗原受容体をコードするか、又は所望の腫瘍特異的エピトープ若しくはネオエピトープに特異的な組換えＴＣＲをコードする核酸を導入するためにウイルスベクターベースの遺伝子導入法を使用して作製される。ある実施形態では、エンジニアリングされた細胞は、所望の標的腫瘍抗原に特異的なキメラ抗原受容体をコードするか、又は所望の腫瘍特異的エピトープ若しくはネオエピトープに特異的な組換えＴＣＲをコードする核酸を導入するために非ウイルスベクターベースの遺伝子導入法を使用して作製される。ある実施形態では、ウイルスベクターベースの遺伝子導入法は、レンチウイルスベクターを含む。ある実施形態では、ウイルスベクターベースの遺伝子導入法は、レトロウイルスベクターを含む。ある実施形態では、ウイルスベクターベースの遺伝子導入法は、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクターを含む。ある実施形態では、非ウイルスベクターベースの遺伝子導入法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）ヌクレアーゼからなる群から選択される遺伝子編集法を含む。ある実施形態では、非ウイルスベクターベースの遺伝子編集法は、リポフェクション、ヌクレオフェクション、バイオリスティックス、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、ポリカチオン、又は脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤で強化されたＤＮＡの取り込みからなる群から選択されるトランスフェクション又は形質転換法を含む。
【0094】
ある実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、細胞外抗原結合ドメイン、任意選択のスペーサー配列、膜貫通ドメイン、１つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメイン、及びＣＡＲ Ｔ細胞を活性化又は不活性化するための１つ又は複数の任意選択の調節配列を含むＣＡＲ構築物を発現する。
【0095】
ある実施形態では、細胞外抗原結合ドメインは、所望の標的に特異的に結合することができる部分を含む。ある実施形態では、所望の標的に特異的に結合することができる部分は、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む。ある実施形態では、その抗原結合断片は、所望の標的に特異的に結合することができるモノクローナル抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。ある実施形態では、所望の標的は腫瘍特異的抗原である。ある実施形態では、腫瘍特異的抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）（例えば、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－１１、又はＭＡＧＥ－Ａ）、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４ｌ、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ－Ｍｅｔ、メソセリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－１１Ｒα、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）からなる群から選択される。ある実施形態では、所望の標的は、腫瘍特異的ネオエピトープである。ある実施形態では、腫瘍特異的ネオエピトープは、インシリコ分析によって識別される。ある実施形態では、腫瘍特異的ネオエピトープは、ヒト対象に由来する自己ＴＩＬの集団から識別され、精製される。
【0096】
ある実施形態では、膜貫通ドメインは、細胞膜にまたがることができる構造を形成することができる任意の合成又は天然アミノ酸配列を含む。ある実施形態では、細胞膜にまたがることができる構造は、アルファヘリックスを含む。ある実施形態では、膜貫通領域は、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）／ＣＤ２７８、グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）／ＣＤ３５７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＣＲα及びＴＣＲβからなる群から選択される天然に存在する膜貫通タンパク質に由来する。ある実施形態では、天然に存在する膜貫通タンパク質に由来する膜貫通領域は、他のシグナル伝達タンパク質との相互作用に関与することが知られている配列における１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。
【0097】
ある実施形態では、１つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ又は複数の細胞内チロシンベース活性化モチーフ（「ＩＴＡＭ」）を含む。ある実施形態では、１つ又は複数のＩＴＡＭは、ＣＤ３－ゼータ（ＣＤ３ζ）分子上に存在する。ある実施形態では、１つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７、Ｌｉｇｈｔ－Ｒ、ＧＩＴＲ、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。
【0098】
Ｂ．組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）
ある実施形態では、Ｔ細胞は、腫瘍特異的エピトープ又はネオエピトープに結合することができる組換えＴ細胞受容体を含む。ある実施形態では、組換えＴ細胞受容体は、対象から単離されたＴ細胞からクローニングされた天然に存在するＴＣＲを含む。ある実施形態では、組換えＴＣＲは、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）ポリペプチド及びＴＣＲベータ（ＴＣＲβ）ポリペプチドを含むヘテロ二量体（即ち、ＴＣＲαβ）を含む。ある実施形態では、組換えＴＣＲは、ＴＣＲガンマ（ＴＣＲγ）ポリペプチド及びＴＣＲデルタ（ＴＣＲδ）ポリペプチドを含むヘテロ二量体（即ち、ＴＣＲγδ）を含む。
ある実施形態では、Ｔ細胞は、腫瘍特異的エピトープ又はネオエピトープに結合することができる組換えＴ細胞受容体を含む。ある実施形態では、組換えＴ細胞受容体は、対象から単離されたＴ細胞からクローニングされた天然に存在するＴＣＲを含む。ある実施形態では、組換えＴＣＲは、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）ポリペプチド及びＴＣＲベータ（ＴＣＲβ）ポリペプチドを含むヘテロ二量体（即ち、ＴＣＲαβ）を含む。ある実施形態では、組換えＴＣＲは、ＴＣＲガンマ（ＴＣＲγ）ポリペプチド及びＴＣＲデルタ（ＴＣＲδ）ポリペプチドを含むヘテロ二量体（即ち、ＴＣＲγδ）を含む。
【0099】
ある実施形態では、組換えＴＣＲαβは、対象から単離され、所望の標的に由来するペプチド抗原に特異的なクローニングされたＴＣＲαβを含む。ある実施形態では、対象は哺乳動物である。ある実施形態では、哺乳動物はヒトである。ある実施形態では、所望の標的は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４ｌ、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ－Ｍｅｔ、メソセリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－１１Ｒα、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、及びＶＥＧＦＲ２からなる群から選択される腫瘍特異的抗原である。ある実施形態では、組換えＴＣＲγδは、対象から単離され、所望の標的に由来するペプチド抗原に特異的なクローニングされたＴＣＲγδを含む。ある実施形態では、対象は哺乳動物である。ある実施形態では、哺乳動物はヒトである。ある実施形態では、所望の標的は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４ｌ、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ－Ｍｅｔ、メソセリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ－Ｋ、ＩＬ－１１Ｒα、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、及びＶＥＧＦＲ２からなる群から選択される腫瘍特異的抗原である。
【0100】
Ｃ．ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）
本明細書では、抗原特異的エフェクターＴ細胞（ＴEFF細胞）をセントラルメモリーＴ細胞（ＴCM細胞）にリプログラミングするための方法が提供され、この方法は、それぞれＴEFF細胞をＴCM細胞にリプログラムするのに十分な量のヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）及びインターロイキン－２１（ＩＬ－２１）の存在下で、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料を培養するステップを含み、このリプログラミングにより、対象から得られたＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団におけるＴCM細胞の数と比較してＴCM細胞に富むリンパ球の集団が生成される。ＩＬ－２１とＨＤＡＣｉの併用処置は、エフェクターＴ細胞からセントラルメモリー表現型を誘導して、ＩＬ－２及びＩＬ－１５への応答を増強する相加効果よりも優れている。
本明細書では、抗原特異的エフェクターＴ細胞（ＴEFF細胞）をセントラルメモリーＴ細胞（ＴCM細胞）にリプログラミングするための方法が提供され、この方法は、それぞれＴEFF細胞をＴCM細胞にリプログラムするのに十分な量のヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）及びインターロイキン－２１（ＩＬ－２１）の存在下で、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料を培養するステップを含み、このリプログラミングにより、対象から得られたＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団におけるＴCM細胞の数と比較してＴCM細胞に富むリンパ球の集団が生成される。ＩＬ－２１とＨＤＡＣｉの併用処置は、エフェクターＴ細胞からセントラルメモリー表現型を誘導して、ＩＬ－２及びＩＬ－１５への応答を増強する相加効果よりも優れている。
【0101】
ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料は、ＨＤＡＣｉ及びＩＬ－２１と共に連続的に培養される。ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料は、最初にＨＤＡＣｉ（例えば、０．１～５ｎＭ、例えば１～３ｎＭ）と共に培養され、次にＩＬ－２１（例えば、１０～５０ｎｇ／ｍＬ、例えば２０～４０ｎｇ／ｍＬ、具体的には約３０ｎｇ／ｍＬ）と共に培養される。ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料は、最初にＩＬ－２１（例えば、１０～５０ｎｇ／ｍＬ、例えば２０～４０ｎｇ／ｍＬ、具体的には約３０ｎｇ／ｍＬ）と共に培養され、次にＨＤＡＣｉ（例えば、０．１～５ｎＭ、例えば１～３ｎＭ）と共に培養される。ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料は、ＨＤＡＣｉ及びＩＬ－２１の存在下で同時に培養される。ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料は、ＴCM表現型を誘導するのに十分な期間、ＨＤＡＣｉ及びＩＬ－２１の存在下で同時に培養される。ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料は、ＨＤＡＣｉ及びＩＬ－２１の存在下で７～２０日間、同時に培養される。ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料は、ＨＤＡＣｉ及びＩＬ－２１の存在下で１２～１６日間、同時に培養される。ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料は、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、又は２０日間、ＨＤＡＣｉ及びＩＬ－２１の存在下で同時に培養される。ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料は、ＨＤＡＣｉ及びＩＬ－２１の存在下で１３日間、１４日間、又は１５日間同時に培養される。
【0102】
ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料は、１つ又は複数の追加のサイトカイン、ケモカイン、又は増殖因子の存在下でさらに培養される。ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料は、ＩＬ－２の存在下でさらに培養される。ある実施形態では、ＴEFF細胞を含むリンパ球の開始集団又はＴEFF細胞に富む試料は、ＨＤＡＣｉ及びＩＬ－２１の存在下で同時に培養する前にＩＬ－２の存在下で培養される。
【0103】
ある実施形態では、ＨＤＡＣｉは、そのデアセチラーゼ活性の補因子としてＺｎ2+を必要とする古典的なＨＤＡＣｉを含む。ある実施形態では、古典的なＨＤＡＣｉは、ヒドロキサム酸又はヒドロキサメート、環状テトラペプチド及びデプシペプチド、ベンズアミド、求電子性ケトン、及び脂肪酸からなる群から選択される。ある実施形態では、ＨＤＡＣｉは、ヒドロキサム酸又はヒドロキサメートを含む。ある実施形態では、ヒドロキサム酸又はヒドロキサメートは、ボリノスタット（スベラニロヒドロキサム酸又はＳＡＨＡ、Ｚｏｌｉｎｚａ（登録商標）として販売されている）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１、Ｂｅｌｅｏｄａｑ（登録商標）として販売されている）、パノビノスタット（Ｆａｒｙｄａｑ（登録商標）として販売されている）、及びダシノスタット（ＬＡＱ８２４）からなる群から選択される。ある実施形態では、ＨＤＡＣｉはベンズアミドを含む。ある実施形態では、ベンズアミドは、エンチノスタット（ＳＮＤＸ－２７５又はＭＳ－２７５）、タセジナリン（ＣＩ９９４）、及びモセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）からなる群から選択される。ある実施形態では、ＨＤＡＣｉは、環状テトラペプチド又はデプシペプチドを含む。ある実施形態では、環状テトラペプチド又はデプシペプチドはトラポキシンＢである。ある実施形態では、ＨＤＡＣｉは脂肪酸である。ある実施形態では、脂肪酸は、フェニルブチレート及びバルプロ酸からなる群から選択される。
【0104】
Ｄ．インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）
ヒトインターロイキン２１（ＩＬ－２１）は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びウイルス感染又は癌性細胞を破壊することができる細胞傷害性Ｔ細胞を含む免疫系の細胞に対して強力な調節効果を有するＩＬ－２１遺伝子によってコードされるサイトカインタンパク質である。１６２個のアミノ酸のヒトＩＬ－２１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＢＡ２２６４３；配列番号１）は、共にあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，３０７，０２４号明細書及び同第６，６８６，１７８号明細書に記載されている。本方法は、セントラルメモリーＴ細胞の生成のためのＨＤＡＣｉと組み合わせたＩＬ－２１によるエフェクターＴ細胞の処理に関する。いくつかの態様では、ＩＬ－２１は、１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、例えば１５ｎｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬ、例えば２０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、特に約２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、又は３５ｎｇ／ｍＬの濃度で培地中に存在する。
ヒトインターロイキン２１（ＩＬ－２１）は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びウイルス感染又は癌性細胞を破壊することができる細胞傷害性Ｔ細胞を含む免疫系の細胞に対して強力な調節効果を有するＩＬ－２１遺伝子によってコードされるサイトカインタンパク質である。１６２個のアミノ酸のヒトＩＬ－２１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＢＡ２２６４３；配列番号１）は、共にあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，３０７，０２４号明細書及び同第６，６８６，１７８号明細書に記載されている。本方法は、セントラルメモリーＴ細胞の生成のためのＨＤＡＣｉと組み合わせたＩＬ－２１によるエフェクターＴ細胞の処理に関する。いくつかの態様では、ＩＬ－２１は、１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、例えば１５ｎｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬ、例えば２０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、特に約２５ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、又は３５ｎｇ／ｍＬの濃度で培地中に存在する。
【0105】
ＩＩＩ．使用方法
別の態様では、対象における癌又は感染症を処置するための方法が本明細書で提供され、この方法は、本明細書で提供されるいずれかの方法によって生成された、治療有効量のＴCM細胞に富むリンパ球の集団を対象に投与することを含む。この細胞を、ＴＩＬを培養することができる癌を有する対象に養子移入してもよいし、又は腫瘍抗原特異的ＣＴＬをインビトロで生成してもよい。
別の態様では、対象における癌又は感染症を処置するための方法が本明細書で提供され、この方法は、本明細書で提供されるいずれかの方法によって生成された、治療有効量のＴCM細胞に富むリンパ球の集団を対象に投与することを含む。この細胞を、ＴＩＬを培養することができる癌を有する対象に養子移入してもよいし、又は腫瘍抗原特異的ＣＴＬをインビトロで生成してもよい。
【0106】
本処置法が有用である腫瘍には、固形腫瘍又は血液腫瘍に見られる癌などのあらゆる悪性細胞型が含まれる。例示的な固形腫瘍には、限定されるものではないが、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭、首、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、黒色腫、前立腺、及び乳房からなる群から選択される器官の腫瘍が含まれ得る。例示的な血液腫瘍には、骨髄の腫瘍、Ｔ細胞又はＢ細胞の悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽細胞腫、及び骨髄腫などが含まれる。本明細書で提供される方法を使用して処置することができる癌のさらなる例には、限定されるものではないが、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）又は胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）（消化管癌及び消化管間質癌を含む）、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌又は腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、様々な種類の頭頸部癌、及び黒色腫が含まれる。
【0107】
癌は、限定されるものではないが、特に以下の組織型の癌であり得る：新生物、悪性；癌腫；未分化癌；巨大及び紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌（ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；肝細胞癌と胆管癌の混合型；索状腺癌（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープ腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス腺癌；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；気管支・肺胞腺癌；乳頭腺癌；色素嫌性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭状及び濾胞腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質細胞癌；子宮内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢腺癌；乳頭状漿液嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液癌；印環細胞癌；浸潤性乳管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫、悪性；セルトリ間質細胞腫瘍、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在性大型黒色腫；悪性黒子黒色腫；末端黒子型黒色腫；結節型黒色腫；巨大色素性母斑における悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；骨髄芽球性歯肉肉腫；エナメル上皮歯牙肉腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫瘍、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質星状細胞腫；線維性星細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起膠芽細胞腫；原始神経外胚葉；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；その他の特定の非ホジキンリンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；ワルデンストレームマクログロブリン血症；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；有毛細胞白血病；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；及び慢性骨髄芽球性白血病。
【0108】
ある実施形態では、この方法は、治療有効量のＴCM細胞の集団を投与する前にリンパ球枯渇を行うステップをさらに含む。ある実施形態では、リンパ球枯渇は、非骨髄破壊的リンパ球枯渇化学療法を含む。ある実施形態では、非骨髄破壊的リンパ球枯渇化学療法は、シクロホスファミド及びフルダラビンの投与を含む。
【0109】
ある実施形態では、この方法は、自己Ｔ細胞と同時に又は自己Ｔ細胞の後に、自己Ｔ細胞の増殖及び活性化を促進するＴ細胞増殖因子を対象に投与するステップをさらに含む。ある実施形態では、Ｔ細胞増殖因子は、自己Ｔ細胞の増殖及び活性化を促進する任意の適切な増殖因子を含む。ある実施形態では、Ｔ細胞増殖因子は、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１２、並びにこれらの組み合わせ（例えば、ＩＬ－２とＩＬ－７、ＩＬ－２とＩＬ－１５、ＩＬ－７とＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－７とＩＬ－１５、ＩＬ－１２とＩＬ－７、ＩＬ－１２とＩＬ－１５、又はＩＬ－１２とＩＬ－２）からなる群から選択される。
【0110】
ある実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかによって生成された、治療有効量のＴCM細胞に富むリンパ球の集団が、対象に静脈内、腫瘍内、又は腹腔内投与される。Ｔ細胞療法の適切な薬用量は、処置される癌の種類、疾患の重症度及び経過、個人の臨床状態、個人の病歴及び処置に対する応答、並びに主治医の判断に基づいて決定することができる。
【0111】
Ａ．併用療法
ある実施形態では、本明細書で提供される方法は、少なくとも１つの追加の治療薬を対象に投与するステップをさらに含む。本明細書に開示されるすべての追加の治療薬は、あらゆる潜在的な毒性、起こり得る副作用、及びその他の関連する要因を考慮に入れた、特定の組成物又は療法ごとの良好な臨床診療に従って対象に投与される。
ある実施形態では、本明細書で提供される方法は、少なくとも１つの追加の治療薬を対象に投与するステップをさらに含む。本明細書に開示されるすべての追加の治療薬は、あらゆる潜在的な毒性、起こり得る副作用、及びその他の関連する要因を考慮に入れた、特定の組成物又は療法ごとの良好な臨床診療に従って対象に投与される。
【0112】
ある実施形態では、追加の療法は、免疫療法、放射線療法、外科手術（例えば、腫瘍の外科的切除）、化学療法、骨髄移植、又は前述の組み合わせであり得る。追加の療法は、標的療法であり得る。ある実施形態では、追加の療法は、最初の処置の前に（即ち、アジュバント療法として）施される。ある実施形態では、追加の療法は、最初の処置の後に（即ち、ネオアジュバント療法として）施される。
【0113】
ある実施形態では、追加の療法は免疫療法を含む。ある実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤を含む。ある実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、プログラムされた細胞死経路１（ＰＤ－１／ＣＤ２７９）及びそのリガンド（ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４及びＰＤ－Ｌ２／ＣＤ２７３）、細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４／ＣＤ１５２）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３／ＣＤ２２３）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｉｇドメイン及び免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）ドメインを含むＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３／ＨＡＶｃｒ２）、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ／ＣＤ１５８）、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、並びにアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）からなる群から選択される免疫チェックポイントタンパク質を阻害する。
【0114】
ある実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ－１結合アンタゴニストである。ある実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは抗ＰＤ－１抗体である。ある実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、及びＣＴ－０１１からなる群から選択される。ある実施形態では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、免疫アドヘシン（例えば、免疫グロブリン定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤＬ１又はＰＤＬ２の細胞外又はＰＤ－１結合部分を含む免疫アドヘシン）である。
【0115】
ある実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４結合アンタゴニストである。ある実施形態では、ＣＴＬＡ－４結合アンタゴニストは抗ＣＴＬＡ－４抗体である。ある実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ及びトレメリムマブからなる群から選択される。
【0116】
ある実施形態では、追加の治療薬は、放射線療法による処置を含む。ある実施形態では、放射線療法は、ガンマ線（γ線）、Ｘ線、マイクロ波、陽子線照射、紫外線照射、及び腫瘍への放射性同位元素の直接送達からなる群から選択される。ある実施形態では、放射線療法はＸ線による処置を含む。ある実施形態では、Ｘ線は、３～４週間にわたって５０～２００レントゲンの１日量で投与される。ある実施形態では、Ｘ線は、２０００～６０００レントゲンの単回線量で投与される。ある実施形態では、放射線療法は、腫瘍への放射性同位元素の直接送達を含む。放射性同位元素の線量範囲は、同位元素の半減期、放出される放射線の強度及び種類、並びに腫瘍細胞によって取り込まれる程度によって大きく異なるが、適切な治療有効量の決定は、当業者のレベルの範囲内である。
【0117】
ある実施形態では、追加の治療薬は、最初の処置に関連する副作用（例えば、悪心、悪液質など）を処置するための薬剤の投与を含む。ある実施形態では、追加の療法は免疫療法を含む。ある実施形態では、追加の療法は放射線療法を含む。いくつかの実施形態では、放射線療法はガンマ線照射を含む。ある実施形態では、追加の療法は外科手術を含む。ある実施形態では、追加の療法は、放射線療法と外科手術の組み合わせを含む。ある実施形態では、追加の療法は、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞骨格破壊剤、エポチロン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ヌクレオチド類似体及びヌクレオチド前駆体類似体、ペプチド抗生物質、プラチナベースの化合物、レチノイド、ビンカアルカロイド及びその誘導体からなる群から選択される化学療法剤のクラスによる処置を含む。
【0118】
本明細書で企図される追加の療法は、本明細書で提供される組成物の投与の前、後、又は同時に施すことができる。ある実施形態では、追加の療法は、本明細書で提供される組成物の前に施される。ある実施形態では、追加の療法は、本明細書で提供される組成物の後に施される。ある実施形態では、追加の療法は、本明細書で提供される組成物の投与の前又は後に、１つ又は複数の間隔で施される。処置される対象が併用療法から利益を得るような追加の療法を施すための適切な間隔の決定は、当業者のレベルの範囲内である。
【0119】
Ｂ．医薬組成物
別の態様では、本明細書では、ＴCM細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物及び製剤が提供される。
別の態様では、本明細書では、ＴCM細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物及び製剤が提供される。
【0120】
本明細書に記載の医薬組成物及び製剤は、通常の生理食塩水（例えば、０．９％）及びヒト血清アルブミン（例えば、１０％）などの水溶液の形態で、所望の純度を有する活性成分（例えば、抗体又はポリペプチドなど）を１つ又は複数の任意選択の薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２２ndｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２）と混合することによって調製することができる。薬学的に許容される担体は、一般に、使用される薬用量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、このような担体には、限定されるものではないが：リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸とメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【実施例】
【0121】
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含められる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するように本発明者によって発見された技術を表し、従って、その実施のための好ましいモードを構成すると見なすことができることを当業者は理解されよう。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、それでもなお本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果が得られることを理解されたい。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含められる。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するように本発明者によって発見された技術を表し、従って、その実施のための好ましいモードを構成すると見なすことができることを当業者は理解されよう。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、それでもなお本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果が得られることを理解されたい。
【0122】
実施例１－エフェクターＴ細胞のセントラルメモリーＴ細胞へのリプログラミング
高いＣＤ２８発現と一致して、ナイーブＣＤ８+ Ｔ細胞は、エフェクターメモリーＣＤ８+ Ｔ細胞と比較して、プロモーター上及びＣＤ２８の転写開始部位の近くで劇的に増加したアセチル化ヒストンＨ３（ＡｃＨ３）レベルを示した（図１Ａ）。これらの結果は、ＣＤ８+ Ｔ細胞の分化がヒストンのアセチル化の減少を伴い、ヒストンの脱アセチル化を阻害するとＣＤ８+ Ｔ細胞の分化が逆転し得ることを示唆した。図１Ｂは、１ｕＭ以上のＳＡＨＡがエフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＡｃＨ３レベルを増大させたことを示し、図１Ｃは、ＩＬ－２１がエフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ３リン酸化を誘導したことを示している。
高いＣＤ２８発現と一致して、ナイーブＣＤ８+ Ｔ細胞は、エフェクターメモリーＣＤ８+ Ｔ細胞と比較して、プロモーター上及びＣＤ２８の転写開始部位の近くで劇的に増加したアセチル化ヒストンＨ３（ＡｃＨ３）レベルを示した（図１Ａ）。これらの結果は、ＣＤ８+ Ｔ細胞の分化がヒストンのアセチル化の減少を伴い、ヒストンの脱アセチル化を阻害するとＣＤ８+ Ｔ細胞の分化が逆転し得ることを示唆した。図１Ｂは、１ｕＭ以上のＳＡＨＡがエフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＡｃＨ３レベルを増大させたことを示し、図１Ｃは、ＩＬ－２１がエフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ３リン酸化を誘導したことを示している。
【0123】
この試験は、ＣＤ４５ＲＯを発現するエフェクターＴ細胞を、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ２８を発現するセントラルメモリーＴ細胞にリプログラム又は脱分化する方法を開発するために行った（図８）。セントラルメモリーマーカーＣＤ２８及びＣＤ６２Ｌに対するＩＬ－２１及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）処理の効果を評価した。ＭＡＲＴ１（Ｍ２７）特異的エフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞を、未処理のまま又はＳＡＨＡで２４時間前処理した後、ＳＡＨＡ／ＩＬ－２１の存在下又は非存在下、Ｍ２７パルス成熟樹状細胞で４日間活性化させた。対照細胞（ＳＡＨＡなし、ＩＬ－２１なし）と比較して、ＩＬ－２１のみではＣＤ２８発現がわずかにしか増加しなかった。ＳＡＨＡのみではＣＤ２８発現をアップレギュレートしたが、興味深いことに、ＳＡＨＡとＩＬ－２１は一緒になってＣＤ２８発現を劇的に増強し、ＣＤ２８発現に対するＳＡＨＡとＩＬ－２１の協同的効果を示した（図２Ａ）。
【0124】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離し、次いでサイトカインＩＬ－２で増殖させた。ＴＩＬを、ＩＬ－２１（３０ｎｇ／ｍＬ）又はＩＬ－２１とＨＤＡＣｉ（ＳＡＨＡ）との組み合わせで２週間処理した。増殖の最後に、ＴＩＬをＣＤ８、ＣＤ２８、及びＣＤ６２Ｌに対する抗体で染色し、ＣＤ８+ゲートを用いて分析した。結果は、ＨＤＡＣｉとＩＬ－２１の処理の組み合わせがセントラルメモリーＴ細胞のパーセンテージの有意な増加をもたらしたことを示した（図２Ｂ）。
【0125】
加えて、ＣＤ２８プロモーター上のＳＴＡＴ結合部位の近くのＡｃＨ３及びＳＴＡＴ３の濃縮のＣｈＩＰ結果は、ＨＤＡＣｉ（ＳＡＨＡ）処理がＣＤ２８プロモーター上のアセチル化Ｈ３（ＡｃＨ３）レベルを増加させ、ＩＬ－２１誘導ＳＴＡＴ３の同じＤＮＡ領域への結合を可能にすることを示した（図２Ｃ）。
【0126】
パノビノスタットは、０．５ｎＭ以上の用量でＡｃＨ３レベルを増加させた（図３Ａ）。パノビノスタットの有無にかかわらずＩＬ－２１をｍｉｎｉ－ＲＥＰに添加すると、細胞増殖の収量が劇的に増加し（図３Ｂ）、パノビノスタットは、ＩＬ－２１によるＣＤ２８+ＣＤ６２Ｌ+細胞集団の誘導を有意に増強した（図３Ｃ）。通常のＲＥＰでは、パノビノスタット（Ｐａｎｏ）のみのＲＥＰへの追加は増殖収率をわずかに低下させたが、増殖倍率は他の３つの条件で同様であった（図３Ｄ）。
【0127】
これらの結果を検証するために、セントラルメモリー及びエフェクターＴ細胞を含む抗原特異的ＣＴＬ細胞株を増殖させ、ＣＤ８、ＣＤ２８、及びＣＤ６２Ｌに対する抗体で染色し、ＣＤ８+ゲートで分析した。ＩＬ－２１とＨＤＡＣｉパノビノスタットの併用処理により、セントラルメモリーＴ細胞を約０．５％から１９％超に増加させたことが分かった（図４Ａ）。
【0128】
また、増殖させたＴＩＬ／ＣＴＬをＣＤ８及びＣＤ１３２に対する抗体で染色し、そしてＣＤ８+ゲートを用いて分析した。ＩＬ－２１は、ＣＤ１３２（γ鎖）の発現をアップレギュレートすることが分かった（図４Ｃ）。加えて、増殖させたＣＴＬをカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、ＩＬ－２又はＩＬ－１５で２日間培養して細胞分裂を確認した。ＩＬ－２１及びパノビノスタットで処理した細胞は、γ鎖サイトカインＩＬ－２及びＩＬ－１５に対する応答の増強を示した。（図４Ｂ）。
【0129】
図５Ａは、ＩＬ－２１及びパノビノスタット誘導ＣＤ２８+ＣＤ６２Ｌ+細胞がＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、Ｌｅｆ１、及びＴｃｆ１を高度に発現したことを示し、これらの細胞がＣＤ２８-ＣＤ６２Ｌ-細胞よりも分化していないことを示唆した。
【0130】
臨床関連ＴＩＬ増殖におけるＩＬ－２１及びパノビノスタットの効果を評価した。パノビノスタットのみを増殖に含めると、１つのＴＩＬ株での生成物の収量が減少したが、増殖倍率は、通常の増殖及びＩＬ－２１／パノビノスタットの増殖で同様であった（図５Ｂ）。
【0131】
増殖の終了時に、クロム放出アッセイ（ＣＲＡ）を行って、異なる条件下で増殖させた細胞の殺腫瘍効率を評価した。ＩＬ－２１処理及びパノビノスタット＋ＩＬ－２１の併用処理は、腫瘍細胞の死滅を増強した（図６Ａ）。増殖後、腫瘍抗原特異的ＣＴＬ細胞を腫瘍細胞で再刺激し、続いて細胞内染色を行った。ＩＬ－２１は、ＩＦＮγ及びグランザイムＢ発現を増強した（図６Ｂ）。
【0132】
別の実験では、最終分化及び非最終分化ＴＩＬの不均一な集団を増殖させ、ＣＤ８、ＣＤ２８及びＣＤ６２Ｌに対する抗体で染色し、そしてＣＤ８+ゲートを用いて分析した。ＩＬ－２１及びパノビノスタット（Ｐａｎｏ）処理は、ＴＩＬ上のセントラルメモリーマーカーＣＤ２８及びＣＤ６２Ｌ発現をアップレギュレートした（図７Ａ）。
【0133】
従って、ＨＤＡＣｉを使用して、エフェクターＴ細胞をリプログラムして、エフェクターＴ細胞がメモリーＴ細胞に対して感受性となるようにすることができる。結論として、ＩＬ－２１とＨＤＡＣｉの併用処理は、エフェクターＴ細胞からセントラルメモリー表現型を誘導してＩＬ－２及びＩＬ－１５への応答を増強する相乗効果を有することが示された。
【0134】
実施例２－材料及び方法
腫瘍抗原特異的ＣＴＬ株又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の増殖：ＣＴＬ株又はＴＩＬを、抗ＣＤ３及び照射された同種異系ＰＢＭＣ又はリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）（ＣＴＬ株の場合）を急速な増殖のためのフィーダー細胞として使用して増殖させた。ＴＩＬは、患者の黒色腫腫瘍から培養した。培養物には、５０Ｕ／ｍｌ（ＣＴＬ株の場合）又は６０００Ｕ／ｍｌ（ＴＩＬの場合）のＩＬ－２を３日ごとにフィードした。ＩＬ－２１（３０ｎｇ／ｍｌ）又はＨＤＡＣｉパノビノスタット（３ｎＭ）（対照として）又はＩＬ－２１とＨＤＡＣｉの組み合わせを、０日目、４日目、及び７日目にフィードした。１４日後、細胞をさらなる分析に使用した。ＳＡＨＡを用いた試験（図２）では、ＳＡＨＡは１～５μＭで使用した。
腫瘍抗原特異的ＣＴＬ株又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の増殖：ＣＴＬ株又はＴＩＬを、抗ＣＤ３及び照射された同種異系ＰＢＭＣ又はリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）（ＣＴＬ株の場合）を急速な増殖のためのフィーダー細胞として使用して増殖させた。ＴＩＬは、患者の黒色腫腫瘍から培養した。培養物には、５０Ｕ／ｍｌ（ＣＴＬ株の場合）又は６０００Ｕ／ｍｌ（ＴＩＬの場合）のＩＬ－２を３日ごとにフィードした。ＩＬ－２１（３０ｎｇ／ｍｌ）又はＨＤＡＣｉパノビノスタット（３ｎＭ）（対照として）又はＩＬ－２１とＨＤＡＣｉの組み合わせを、０日目、４日目、及び７日目にフィードした。１４日後、細胞をさらなる分析に使用した。ＳＡＨＡを用いた試験（図２）では、ＳＡＨＡは１～５μＭで使用した。
【0135】
フローサイトメトリー：細胞を、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、又はＣＤ１３２に対する抗体で染色した。すべてのＦＡＣＳデータを、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを介して取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ， Ｉｎｃ．）によって分析した。
【0136】
細胞内染色：細胞を、腫瘍細胞で１６時間再刺激し、ＣＤ８に対する抗体で染色し、続いて固定し、透過化緩衝液中のＩＦＮ－γ及びグランザイムＢに対する抗体で染色した。細胞を洗浄し、分析前にＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
【0137】
定量的リアルタイムＰＣＲ：全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡ精製キットを用いて調製した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素及びオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてｃＤＮＡを作製し、ｉＱ ＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を用いてＢｉｏ－Ｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍで遺伝子発現を検出した。データを、参照遺伝子ＲＰＬ１３Ａに対して正規化した。ＲＰＬ１３ＡプライマーはＱｉａｇｅｎから購入した。使用した他のプライマー対は：ＣＤ２８ フォワード：ＣＴＣＡＣＡＣＴＴＣＧＧＧＴＴＣＣＴＣＧＧ（配列番号２）、リバース：ＧＡＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧ（配列番号３）；ＣＤ６２Ｌ フォワード：ＡＴＧＧＡＡＣＧＡＴＧＡＣＧＣＣＴＧＣＣ（配列番号４）、リバース：ＧＧＣＣＴＣＣＡＡＡＧＧＣＴＣＡＣＡＣＴ（配列番号５）であった；追加のプライマーには、リンパ球エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１） フォワード：ＣＡＣＡＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＡＴＣＣＣＡ（配列番号６）、リバース：ＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧ（配列番号７）；転写因子１（ＴＣＦ１） フォワード：ＴＧＣＡＧＣＴＡＴＡＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧ（配列番号８）、リバース：ＣＣＴＣＧＡＣＣＧＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣ（配列番号９）が含まれていた。
【0138】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）：ＣｈＩＰは、製造者の指示（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に従って、ＣｈＩＰアッセイキットを用いて行った。定量的リアルタイムＰＣＲを、プライマー：ＣＤ２８プロモーター近位ＳＴＡＴ部位：フォワード ＴＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＧＣＡＣＣＣ（配列番号１０）、リバース ＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ（配列番号１１）；遠位ＳＴＡＴ部位：フォワード ＴＧＣＴＴＧＣＡＣＧＴＡＧＡＡＴＧＧＧＴ（配列番号１２）、リバース ＧＧＡＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＴＴＧＴＧＴＣ（配列番号１３）を用いて行った；ウサギＩｇＧを陰性対照として使用した。
【0139】
クロム放出アッセイ（ＣＲＡ）：腫瘍細胞を、２０：１のエフェクター：腫瘍で抗原特異的ＣＴＬと共に４時間インキュベートする前に、Ｃｒ５１で標識した。上清中のＣｒ５１の量を測定し、死滅効率を死滅（％）＝１００％×（試料平均－陰性対照の平均）／（陽性対照の平均－陰性対照の平均）として計算した。
【0140】
Ｍｉｎｉ－ＲＥＰは、Ｔ２５フラスコから２４ウェルプレートへのスケールダウンを適宜開始した。ＩＬ－２１及びパノビノスタットの用量は変更しなかった。
【0141】
統計分析：データのグラフ表示及び統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ６，ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）及びＥｘｃｅｌを用いて行った。データは、平均及びＳＴＤとして示される。実験群間の結果を、スチューデントｔ検定を用いて比較した。ｐ＜０．０５は統計的に有意であると見なした。統計的有意性は、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１として示される。
【0142】
実施例３－ヒトエフェクターのメモリーＣＤ８+ Ｔ細胞へのリプログラミング
ＩＬ－２１は、活性化ヒトナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＣＤ２８発現をアップレギュレートする：ＣＤ２８は、ナイーブＴ細胞活性化及びメモリーＴ細胞機能のための極めて重要な共刺激分子である。インビトロでの腫瘍抗原特異的ＣＴＬの生成に対する様々なγＣサイトカインの影響を比較した以前の試験で、ＩＬ－２１が、養子移入後に持続性の向上及び患者の臨床反応の改善を示すＣＤ２８hi ＣＴＬを濃縮する独自の能力を有することが分かった。ＩＬ－２１誘導ＣＤ２８発現の分子メカニズムを調べるために、Ｔ細胞（ＭＡＲＴ１、Ｍ２７）特異的ＣＴＬによって認識される黒色腫抗原を、前述のようにＩＬ－２１の非存在下又は存在下で生成した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＩＬ－２１で生成されたＭ２７特異的ＣＴＬは、ＩＬ－２１の非存在下で生成された細胞よりも有意に高いＣＤ２８発現を示した（図９Ａ及び図９Ｂ）。試験結果をさらに裏付けるために、健康なドナーからの選別精製されたナイーブヒトＣＤ８+ Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＡ+ＣＣＲ７+）を、ＩＬ－２１の非存在下又は存在下で抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化し、表面ＣＤ２８発現をフローサイトメトリーによって検出した。抗原特異的ＣＴＬ（図９Ａ及び図９Ｂ）と一致して、ＣＤ２８の表面レベルの発現は、ポリクローナル活性化ＩＬ－２１処理ヒトナイーブＣＤ８+ Ｔ細胞において有意に増加した（図９Ｃ及び図９Ｄ）。増強されたＣＤ２８タンパク質発現と一致して、大幅に増加したＣＤ２８ ｍＲＮＡレベルが、ＩＬ－２１の存在下で生成されたＭ２７特異的ＣＴＬ（図９Ｅ）及びＩＬ－２１処理抗ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ヒトナイーブＣＤ８+ Ｔ細胞（図９Ｆ）で一貫して検出された。これらの結果を総合すると、ＩＬ－２１は、ＣＤ２８ ｍＲＮＡ発現をアップレギュレートして、ＣＤ２８の表面レベルの発現を増加させることを示した。
ＩＬ－２１は、活性化ヒトナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＣＤ２８発現をアップレギュレートする：ＣＤ２８は、ナイーブＴ細胞活性化及びメモリーＴ細胞機能のための極めて重要な共刺激分子である。インビトロでの腫瘍抗原特異的ＣＴＬの生成に対する様々なγＣサイトカインの影響を比較した以前の試験で、ＩＬ－２１が、養子移入後に持続性の向上及び患者の臨床反応の改善を示すＣＤ２８hi ＣＴＬを濃縮する独自の能力を有することが分かった。ＩＬ－２１誘導ＣＤ２８発現の分子メカニズムを調べるために、Ｔ細胞（ＭＡＲＴ１、Ｍ２７）特異的ＣＴＬによって認識される黒色腫抗原を、前述のようにＩＬ－２１の非存在下又は存在下で生成した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＩＬ－２１で生成されたＭ２７特異的ＣＴＬは、ＩＬ－２１の非存在下で生成された細胞よりも有意に高いＣＤ２８発現を示した（図９Ａ及び図９Ｂ）。試験結果をさらに裏付けるために、健康なドナーからの選別精製されたナイーブヒトＣＤ８+ Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＡ+ＣＣＲ７+）を、ＩＬ－２１の非存在下又は存在下で抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化し、表面ＣＤ２８発現をフローサイトメトリーによって検出した。抗原特異的ＣＴＬ（図９Ａ及び図９Ｂ）と一致して、ＣＤ２８の表面レベルの発現は、ポリクローナル活性化ＩＬ－２１処理ヒトナイーブＣＤ８+ Ｔ細胞において有意に増加した（図９Ｃ及び図９Ｄ）。増強されたＣＤ２８タンパク質発現と一致して、大幅に増加したＣＤ２８ ｍＲＮＡレベルが、ＩＬ－２１の存在下で生成されたＭ２７特異的ＣＴＬ（図９Ｅ）及びＩＬ－２１処理抗ＣＤ３／ＣＤ２８活性化ヒトナイーブＣＤ８+ Ｔ細胞（図９Ｆ）で一貫して検出された。これらの結果を総合すると、ＩＬ－２１は、ＣＤ２８ ｍＲＮＡ発現をアップレギュレートして、ＣＤ２８の表面レベルの発現を増加させることを示した。
【0143】
ＳＴＡＴ３活性化は、ＩＬ－２１が媒介するＣＤ２８発現の増強に必要である：ＩＬ－２１は、ヤヌス活性化キナーゼ１（ＪＡＫ１）及びＪＡＫ３の活性化、並びにその後のシグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）－３、及び程度は低いがＳＴＡＴ１とＳＴＡＴ５のリン酸化によって機能する。従って、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、及びＳＴＡＴ５のリン酸化を、培養条件下でナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞で調べた。健康なドナーからのヒトナイーブＣＤ８+ Ｔ細胞を、ＩＬ－２１の非存在下又は存在下で、様々な期間にわたって抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化した。ＩＬ－２１刺激は、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３の強いリン酸化を誘導したが、活性化の３０分後にはＳＴＡＴ５の弱いリン酸化を誘導した（図１６Ａ）。ＩＬ－２１はＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３の強い活性化を誘導するため、この試験は、ＳＴＡＴ１及び／又はＳＴＡＴ３の活性化がＩＬ－２１によるＣＤ２８のアップレギュレーションに不可欠であるかどうかを解明することが目的であった。ＳＴＡＴ３の役割を調べるために、ヨブ症候群患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用した。ヨブ症候群（血中の免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の異常に高いレベルを特徴とするハイパーＩｇＥ症候群としても知られている）は、ＳＴＡＴ３遺伝子のドミナントネガティブ変異によるＳＴＡＴ３機能の低下によって引き起こされる。全ＣＤ８+ Ｔ細胞を、健康なドナー又はヨブ症候群患者のＰＢＭＣから分離し、上記のように活性化した。ＩＬ－２１は、健康なドナーのＣＤ８+ Ｔ細胞におけるタンパク質レベル及びｍＲＮＡレベルの両方でＣＤ２８の発現を増加させたが、ＩＬ－２１が媒介したＣＤ２８発現の増強は、ヨブ症候群患者の細胞では完全に抑制された（図１７Ａ～図１７Ｃ）。これらの結果は、ＳＴＡＴ３活性が活性化ヒトＣＤ８+ Ｔ細胞のＩＬ－２１によるＣＤ２８発現のアップレギュレーションに重要であることを示した。
【0144】
試験結果をさらに確認するため、及びＩＬ－２１誘導性ＣＤ２８アップレギュレーションにおけるＳＴＡＴ１の役割も評価するために、ヒトＳＴＡＴ１又はＳＴＡＴ３遺伝子の様々な領域を標的とする異なるｓｈＲＮＡ構築物を使用して、未処理のヒトＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ１又はＳＴＡＴ３発現をノックダウンした。全ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３レベルは、ＳＴＡＴ１又はＳＴＡＴ３ ｓｈＲＮＡがそれぞれのタンパク質の発現を特異的且つ効率的に減少させることを示した（図１６Ｂ）。図１０Ｄ～図１０Ｆに示されているように、対照細胞と比較して、ＩＬ－２１誘導ＣＤ２８タンパク質及びｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ＳＴＡＴ３ ｓｈＲＮＡをトランスフェクトして活性化したＣＤ８+ Ｔ細胞で減少したが、ＳＴＡＴ１ ｓｈＲＮＡをトランスフェクトして活性化した細胞では減少しなかった。これらの結果は、活性化ヒトＣＤ８+ Ｔ細胞でのＣＤ２８発現のＩＬ－２１誘導アップレギュレーションにおける、ＳＴＡＴ１ではなくＳＴＡＴ３の重要な役割を支持した。試験結果と一致して、患者のＳＴＡＴ３変異細胞、ＳＴＡＴ１変異細胞、及びＩＬ２１Ｒ変異細胞の以前の試験では、ＳＴＡＴ１ではなくＩＬ２１／ＳＴＡＴ３が、インビボでのＣＤ８＋セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＡ-ＣＣＲ７+）及びエフェクターメモリー細胞（ＣＤ４５ＲＡ-ＣＣＲ７-）の分化に必要であることを示した。
【0145】
ＳＴＡＴ３が活性化ヒトＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＣＤ２８発現のＩＬ－２１誘導アップレギュレーションを媒介する分子メカニズムをさらに詳しく説明するために、ヒトＣＤ２８プロモーターを分析し、いくつかのコンセンサスＳＴＡＴ部位が、ＣＤ２８プロモーターの近位及び遠位部分でクラスター化して確認された。ＣｈＩＰアッセイは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８処理のみと比較して、抗ＣＤ３／ＣＤ２８及びＩＬ－２１で活性化された細胞の近位及び遠位のＣＤ２８プロモーター領域の両方でのＳＴＡＴ３の２～３倍の濃縮を示した（図１０Ｇ）。まとめると、これらの結果は、ＩＬ－２１活性化ＳＴＡＴ３がヒトＣＤ２８プロモーターに結合してＣＤ２８転写を促進することを示唆した。
【0146】
ＩＬ－２１に応答したＣＤ２８の分化誘導は、ナイーブ及びエフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞におけるヒストンＨ３アセチル化レベルと相関する：試験は、ＩＬ－２１が、活性化後のナイーブＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＣＤ２８発現をユニークに増強することを実証した（図９）。しかしながら、ＩＬ－２１によるＣＤ２８の誘導は、それらの同族ペプチドパルス成熟樹状細胞で活性化されたＭＡＲＴ１（Ｍ２７）特異的エフェクターＣＤ８＋ Ｔ細胞では観察されなかった（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。ＩＬ－２１は、主にＳＴＡＴ３のリン酸化を介して機能するため（図１０）、ＩＬ－２１誘導ＳＴＡＴ３リン酸化レベルをナイーブ及びエフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞で比較し、同等であることが分かり（図１１Ｃ）、ＩＬ－２１がエフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＣＤ２８発現を増加させることができないことは、ＩＬ－２１シグナル伝達の欠如によるものではなく、その結合部位へのｐＳＴＡＴ３のアクセスの欠如によるものであったことを示唆している。
【0147】
クロマチンのアクセス可能性及び遺伝子発現は、ヒストンアセチル化によって調節することができる。ヒストンアセチル化レベルがＣＤ２８発現と相関するかどうかを判断するために、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を、それぞれ高レベル及び低レベルのＣＤ２８を有するナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ+ＣＣＲ７+）及びＴEMRAエフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ+ＣＣＲ７-）ＣＤ８+ Ｔ細胞で行った。それらの高いＣＤ２８発現と一致して、ナイーブＣＤ８+ Ｔ細胞は、ＴEMRA ＣＤ８+ Ｔ細胞と比較して、プロモーターの遠位及び近位ＳＴＡＴ３結合部位の周り、及びＣＤ２８遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の周りのアセチル化ヒストンＨ３（ＡｃＨ３）の増加を示した（図１１Ｄ）。ＩＬ－２１処理は、活性化ＴEMRA ＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＣＤ２８発現を最小限にアップレギュレートした（図１１Ｅ）。同様に、ＭＡＲＴ１（Ｍ２７）特異的ＣＤ２８ｎｅｇエフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ８+ Ｔ細胞と比較して、ＣＤ２８遺伝子座のＡｃＨ３レベルの有意な低下を示した（図１１Ｆ）。これらの結果は、ＣＤ２８転写がヒストンアセチル化によって調節されていることを示し、これは、ナイーブ及びエフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＩＬ－２１が媒介するＣＤ２８の分化誘導と相関している。従って、ＡｃＨ３の調節は、エフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＩＬ－２１が媒介するＣＤ２８のアップレギュレーションを可能にし得る。
【0148】
ＳＡＨＡは、ＩＬ－２１誘導ｐＳＴＡＴ３がＣＤ２８プロモーターにアクセスして、エフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＣＤ２８発現をアップレギュレートすることを可能にする：上記の試験結果は、ＣＤ２８転写がヒストンアセチル化によって調節されることを示し、これは、ヒストンアセチル化レベルの低下が、ＣＤ８+ Ｔ細胞の分化及びナイーブ／セントラルメモリーマーカー発現の低下をもたらし得ることを示唆する。ＨＤＡＣｉの使用によるヒストンアセチル化の増加はＣＤ８+ Ｔ細胞の分化を逆転させるとの仮説を立てた。ＩＬ－２１は、ナイーブＣＤ８+ Ｔ細胞における、より高いレベルのヒストンアセチル化を有する（図１１Ｄ）ＣＤ２８発現を有意に増強するため（図９）、ＨＤＡＣｉとＩＬ－２１との組み合わせがＣＤ２８発現に対して相乗効果を有するであろうと推論された。仮説を検証するために、皮膚Ｔ細胞リンパ腫の処置が承認され、他の疾患の処置のための臨床試験で使用されている、臨床的に利用可能な化合物であり、広義のヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）であるスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ、ボリノスタット）の効果を評価した。有効量を決定するための用量調節試験は、１μＭ以上の濃度のＳＡＨＡがエフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞のＡｃＨ３レベルを増大させ得ることを示した（図１６）。
【0149】
より生理学的な抗原特異的（非特異的ポリクローナルとは対照的）刺激との関連でＣＤ２８発現に対するＳＡＨＡ／ＩＬ－２１の効果を評価するために、この効果を、ペプチドパルス自己樹状細胞を使用して生成したＭＡＲＴ１（Ｍ２７）特異的エフェクター／エフェクターメモリー細胞で評価した。ＭＡＲＴ１（Ｍ２７）特異的エフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＯ+、ＣＤ２８－ｎｅｇ、ＣＤ６２Ｌ－ｎｅｇ）を、インビトロ刺激、Ｍ２７特異的ＣＴＬの四量体誘導選別、及び均一な増殖（＞９５％ ＭＡＲＴ－ｌ－特異的エフェクターＣＴＬ）の反復サイクルの後に生成した。まず、ＣＤ２８プロモーター領域へのｐＳＴＡＴ３の結合に対するＳＡＨＡの効果を評価した。ＳＡＨＡ処理は、ＣＤ２８遺伝子のプロモーター及びＴＳＳ領域のＡｃＨ３レベルを有意に増加させた（図１２Ａ）。ＡｃＨ３レベルの増加と相関して、ＳＡＨＡ処理は、ＣＤ２８プロモーターへのＩＬ－２１誘導ｐＳＴＡＴ３結合を増加させた（図１２Ｂ）。次に、Ｍ２７特異的エフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞を未処理のままか、又はＳＡＨＡで２４時間前処理した後、ＳＡＨＡ／ＩＬ－２１の存在下又は非存在下でＭ２７パルス成熟樹状細胞で４日間活性化させた。興味深いことに、ＳＡＨＡとＩＬ－２１は一緒になってＣＤ２８発現を有意に増強し（図１２Ｃ及び図１２Ｄ）、ＣＤ２８発現に対するＳＡＨＡ及びＩＬ－２１の協同的効果を示している。これらの結果は、ＳＡＨＡ処理がＭ２７特異的エフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞におけるＡｃＨ３レベル及びクロマチンのアクセス可能性を増加させることを示唆し、従って、ＩＬ－２１活性化ＳＴＡＴ３がそのプロモーター部位に結合してＣＤ２８発現を誘導することを可能にする。
【0150】
ＩＬ－２１とＳＡＨＡは相乗作用してＣＤ２８及びＣＤ６２Ｌ発現をアップレギュレートする：翻訳の設定におけるＳＡＨＡ／ＩＬ－２１の効果を評価するために、このプログラムを腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）で評価した。転移性黒色腫及び他のＴＩＬ+固形腫瘍の患者の処置のためのＴＩＬ細胞の養子移入は、浸潤リンパ球の腫瘍生検からの抽出、高用量ＩＬ－２によるインビトロ処理、高速増殖プロトコル（ＲＥＰ：Ｒａｐｉｄ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）によるインビトロ増殖、次の高用量のリンパ球枯渇コンディショニング後のエクスビボ増殖ＴＩＬの注入を含む。ＴＩＬ療法は、転移性黒色腫患者の処置である程度の成功を収めているが、多くの患者は、１つには注入された細胞の限定された持続性が原因でＴＩＬ療法に応答しない。ＴＩＬ製品中のＣＤ８+ Ｔ細胞は通常、高分化型エフェクター細胞、エフェクターメモリー細胞、及び増殖能が低下した末端エフェクター細胞である。ＨＤＡＣ阻害剤／ＩＬ－２１の組み合わせの可能な脱分化効果を調べるために、ＴＩＬを未処理のままか、又はＳＡＨＡで２４時間前処理した後、通常のＲＥＰ（照射されたＰＢＭＣ及びＬＣＬ細胞、抗ＣＤ３及びＩＬ－２）又はＳＡＨＡ／ＩＬ－２１を用いたＲＥＰに供した。ＳＡＨＡのみをＲＥＰ培養物に加えると、劇的な細胞死が引き起こされ、血球計のカウントにより、ＲＥＰの終了時に生存細胞がほとんど存在しないことが示された。ＲＥＰのみ又はＩＬ－２１のみを用いたＲＥＰと比較して、ＲＥＰ中に組み合わせて与えられたＳＡＨＡ及びＩＬ－２１は、ＣＤ２８だけでなくＣＤ６２Ｌ発現も増加させ（図１２Ｅ及び図１２Ｆ）、２つのマーカーが、ナイーブ及びセントラルメモリーＴ細胞で高度に発現した。これらの結果は、Ｍ２７エフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞の結果と同様に、ＳＡＨＡ処理により、ＴＩＬのＡｃＨ３レベル及びクロマチンのアクセス可能性が高まり、従って、ＩＬ－２１活性化ＳＴＡＴ３がそのプロモーター部位に結合して、ＣＤ２８の発現及びエフェクターＣＤ８+ Ｔ細胞の脱分化の表現型の証拠を誘導できることを示唆した。
【0151】
ＩＬ－２１及びパノビノスタット（Ｐａｎｏ）は協同してセントラルメモリー様Ｔ細胞を誘導する：ＳＡＨＡの細胞毒性は、ＡＣＴにおけるその適用を制限するため、他の薬理学的に利用可能なＨＤＡＣｉ（図１７Ａ）をスクリーニングし、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９、Ｐａｎｏ）は、ＳＡＨＡと同様の効果を有していたが、細胞毒性が最小限であったことが分かった。パノビノスタットは、０．５ｎＭ以上の用量でＡｃＨ３レベルを増加させた（図１７Ｂ）。パノビノスタットの効果を、最初にＲＥＰのＴＩＬで小規模に調べ、前処理（Ｐａｎｏ及びＩＬ－２１での急速な増殖の２４時間前にパノビノスタットで細胞を前処理した）を共処理（細胞増殖を開始するときにパノビノスタット及びＩＬ－２１を追加）と比較した。これらの２つの戦略は、ＴＩＬのＣＤ２８+ＣＤ６２Ｌ+細胞集団の誘導に同等の効果があったため（図１８Ａ及び図１８Ｂ）、単純化のためにその後の試験では同時処理スキームに従った。
【0152】
抗原特異的ＡＣＴの設定におけるパノビノスタット（Ｐａｎｏ）の臨床的適用性を調べるために、以前に記載されたように、ＥＴＣアプローチを介して生成されたＭＡＲＴ１（Ｍ２７）特異的エフェクター／エフェクターメモリー細胞を使用し、ＲＥＰによってインビトロで増殖させた（Ｙｅｅ， ２０１４）。細胞は、４つの異なるプロトコル（通常、ＩＬ－２１のみの追加、Ｐａｎｏのみの追加、又はＩＬ－２１＋Ｐａｎｏ）で増殖させた。パノビノスタットのみをＲＥＰに添加すると、全体の収量がわずかに減少したが、増殖倍率は他の３つの条件でも同様であった（図１８Ｃ）。パノビノスタットの添加は、ＩＬ－２１の添加と組み合わせた場合にさらに増強されたＣＤ２８+ＣＤ６２Ｌ+細胞集団を誘導した（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。パノビノスタットは、ＳＡＨＡと同様に、ＳＴＡＴ３及びその他の転写因子／補因子が結合部位にアクセスして、ＣＤ２８及びＣＤ６２Ｌの発現を誘導できるようにしたと位置づけた。
【0153】
ＩＬ－２１／Ｐａｎｏ誘導ＣＤ２８+ＣＤ６２Ｌ+集団に関連するセントラルメモリー機能を、ＩＬ－７及びＩＬ－１５に応答して恒常的増殖を受けるこれらのセントラルメモリー様Ｔ細胞の能力によって評価した。４つの異なるプロトコル（通常、ＩＬ－２１のみの追加、Ｐａｎｏのみの追加、又はＩＬ－２１＋Ｐａｎｏ）で増殖させたＥＴＣ細胞を、ＣＦＳＥで標識し、ＩＬ－２、ＩＬ－７、又はＩＬ－１５と共に２日間培養した。ＩＬ－７は、おそらく低レベルのＣＤ１２７発現が原因で細胞分裂を誘導しなかった。ＩＬ－２１の存在下で増殖した細胞は、増強されたＩＬ－２及びＩＬ－１５誘導増殖を示した（図１４Ａ）。パノビノスタットのみをＲＥＰに添加すると、ＩＬ－１５に応答して細胞増殖が増加したが、ＩＬ－２には応答しなかった。興味深いことに、ＩＬ－２１とパノビノスタットの組み合わせで増殖させた細胞は、他のどのコホートよりもＩＬ－２及びＩＬ－１５に対してより大きな増殖応答を示した（図１４Ａ）。ＩＬ－２とＩＬ－１５は、ＣＤ１３２（γＣ）及びＣＤ１２２受容体サブユニットを共有しているため、ＣＤ１３２及びＣＤ１２２のレベルをこれらの細胞の表面で評価した。ＩＬ－２１＋／－パノビノスタットによる処理は、表面ＣＤ１３２レベルを有意に増加させ（図１４Ｂ及び図１４Ｃ）、これは、ＩＬ－２及びＩＬ－１５へのそれらの自己複製の増加に寄与し得る。
【0154】
ＨＤＡＣｉ／ＩＬ－２１で処理されたＣＴＬのセントラルメモリー様特性をさらに確認するために、関連分化遺伝子の発現を評価した。セントラルメモリー／幹細胞メモリーＣＤ８+ Ｔ細胞の分化に役割を果たすことが知られているセントラルメモリー関連転写シグネチャー（Ｌｅｆ１hi、Ｔｃｆ７hi）は、パノビノスタットとＩＬ－２１処理の組み合わせによって生成されたＣＤ２８+ＣＤ６２Ｌ+細胞間で高度に発現することが分かった（図１４Ｄ）。転写因子Ｔ－ｂｅｔ及びエオメソデルミン（ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ）（Ｅｏｍｅｓ）は、エフェクター及びメモリーＴ細胞形成に重要な役割を担い、それらの発現は分化したＣＤ８+ Ｔ細胞で増加する。興味深いことに、Ｔｂｘ２１及びＥｏｍｅｓの発現は、ＣＤ２８+ＣＤ６２Ｌ+細胞とＣＤ２８－ＣＤ６２Ｌ－細胞との間で類似していた（図１４Ｄ）。
【0155】
この試験では、ＩＬ－２１とＨＤＡＣｉの組み合わせを使用して、高い複製能力を有する低分化セントラルメモリー様Ｔ細胞になるようにエフェクター細胞をリプログラムできることが実証された。全体として、２つの臨床的に関連するＡＣＴモダリティへのＩＬ－２１＋Ｐａｎｏアプローチの潜在的な応用を実証した：ＥＴＣ及びＴＩＬ。この試験は、臨床転帰の改善につながり得る、低分化ＡＣＴ製品を生成するための翻訳可能なアプローチを実証した。
【0156】
実施例４－材料及び方法
腫瘍抗原特異的ＣＴＬ株又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の増殖：ＣＴＬ株又はＴＩＬを、抗ＣＤ３及び照射された同種異系ＰＢＭＣ又はリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）（ＣＴＬ株の場合）を急速な増殖のためのフィーダー細胞として使用して増殖させた。ＴＩＬは、患者の黒色腫腫瘍から培養した。培養物には、５０Ｕ／ｍｌ（ＣＴＬ株の場合）又は６０００Ｕ／ｍｌ（ＴＩＬの場合）のＩＬ－２を３日ごとにフィードした。ＩＬ－２１（３０ｎｇ／ｍｌ）又はＨＤＡＣｉパノビノスタット（３ｎＭ）（対照として）又はＩＬ－２１とＨＤＡＣｉの組み合わせを、０日目、４日目、及び７日目にフィードした。１４日後、細胞をさらなる分析に使用した。ＳＡＨＡを用いた試験では、ＳＡＨＡは１～５μＭで使用した。
腫瘍抗原特異的ＣＴＬ株又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の増殖：ＣＴＬ株又はＴＩＬを、抗ＣＤ３及び照射された同種異系ＰＢＭＣ又はリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）（ＣＴＬ株の場合）を急速な増殖のためのフィーダー細胞として使用して増殖させた。ＴＩＬは、患者の黒色腫腫瘍から培養した。培養物には、５０Ｕ／ｍｌ（ＣＴＬ株の場合）又は６０００Ｕ／ｍｌ（ＴＩＬの場合）のＩＬ－２を３日ごとにフィードした。ＩＬ－２１（３０ｎｇ／ｍｌ）又はＨＤＡＣｉパノビノスタット（３ｎＭ）（対照として）又はＩＬ－２１とＨＤＡＣｉの組み合わせを、０日目、４日目、及び７日目にフィードした。１４日後、細胞をさらなる分析に使用した。ＳＡＨＡを用いた試験では、ＳＡＨＡは１～５μＭで使用した。
【0157】
ＣＤ８＋ Ｔ細胞のポリクローナル刺激：ナイーブＣＤ８+ Ｔ細胞（ＣＤ８+ＣＤ４５ＲＡ+ＣＣＲ７+）をフローサイトメトリーで選別するか、又はＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトナイーブＣＤ８+ Ｔ細胞濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用して単離した。一部の実験では、全ＣＤ８+ Ｔ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ８+ Ｔ細胞濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用して陰性選択した。ナイーブ又は全ＣＤ８+ Ｔ細胞の純度は、フローサイトメトリーで測定すると９５％超であった。ＣＤ８+ Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０で培養した。ＣＤ８+ Ｔ細胞を、Ｔ細胞の増殖及び活性化用のＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ヒトＴ活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、１：１のビーズ：細胞比で、又は３０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）と共に活性化した。示された時点で、Ｔ細胞を回収し、下流分析の前に磁石を使用してビーズを除去した。
【0158】
細胞培養及び急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）：ＣＴＬ株の培地は、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、４μＭグルタミン、及び２－メルカプトエタノールであった。ＴＩＬは、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ヒトＡＢ血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び２－メルカプトエタノールを含む５０％ＡＩＭ－Ｖ、５０％ＴＩＬ完全培地で培養した。ＲＥＰでは、ＣＴＬ株又はＴＩＬを、３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）及び２００倍照射同種異系ＰＢＭＣ又はＬＣＬをフィーダー細胞として使用して増殖させた。培養物には、５０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を３日ごとにフィードした。ＩＬ－２１（３０ｎｇ／ｍｌ）又はＨＤＡＣｉ ＳＡＨＡ（１～５μＭ）又はパノビノスタット（１～３ｎＭ）を、増殖に含んでいた場合は、０日目、４日目、及び７日目に追加した。１４日後に、増殖した細胞をさらに分析した。
【0159】
フローサイトメトリー：細胞を、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、又はＣＤ１３２に対する抗体で染色した。すべてのＦＡＣＳデータを、ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターを介して取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ， Ｉｎｃ．）によって分析した。
【0160】
細胞内染色：細胞を、腫瘍細胞で１６時間再刺激し、ＣＤ８に対する抗体で染色し、続いて固定し、透過化緩衝液中のＩＦＮ－γ及びグランザイムＢに対する抗体で染色した。細胞を洗浄し、分析前にＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
【0161】
定量的リアルタイムＰＣＲ：全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡ精製キットを用いて調製した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素及びオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてｃＤＮＡを作製し、ｉＱ ＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を用いてＢｉｏ－Ｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍで遺伝子発現を検出した。データを、参照遺伝子ＲＰＬ１３Ａに対して正規化した。ＲＰＬ１３ＡプライマーはＱｉａｇｅｎから購入した。使用した他のプライマー対は：ＣＤ２８ フォワード：ＣＴＣＡＣＡＣＴＴＣＧＧＧＴＴＣＣＴＣＧＧ（配列番号２）、リバース：ＧＡＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧ（配列番号３）；ＣＤ６２Ｌ フォワード：ＡＴＧＧＡＡＣＧＡＴＧＡＣＧＣＣＴＧＣＣ（配列番号４）、リバース：ＧＧＣＣＴＣＣＡＡＡＧＧＣＴＣＡＣＡＣＴ（配列番号５）であった；追加のプライマーには、リンパ球エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１） フォワード：ＣＡＣＡＣＣＣＧＴＣＡＣＡＣＡＴＣＣＣＡ（配列番号６）、リバース：ＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＡＧＡＧＧＴＧ（配列番号７）；転写因子１（ＴＣＦ１） フォワード：ＴＧＣＡＧＣＴＡＴＡＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧ（配列番号８）、リバース：ＣＣＴＣＧＡＣＣＧＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣ（配列番号９）が含まれていた。
【0162】
ヒトｓｈＲＮＡノックダウン：全ＣＤ８+ Ｔ細胞を単離し、製造者の指示（Ｌｏｎｚａ）に従ってＡｍａｘａヒトＴ細胞Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットを使用して、５μｇの陰性対照、ＳＴＡＴ１ ｓｈＲＮＡ、又はＳＴＡＴ３ ｓｈＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）でトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、１～２日間静置し、さらなる分析の前に前述のように生きたＧＦＰ+細胞を免疫ブロット分析のために選別精製するか、又は７日間刺激した。
【0163】
ウェスタンブロット分析：同数の細胞を、２×ＳＤＳローディング緩衝液に溶解し、異なる抗体を用いた免疫ブロット分析のためにロードした（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。抗β－アクチン－ＨＲＰは、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手した。β－アクチンは、すべての免疫ブロット実験でローディング対照として使用した。結果を、ＩｍａｇｅＪを使用して定量し、対応する試料中のアクチンの密度に対して正規化した。
【0164】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）：ＣｈＩＰを、製造者の指示（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に従ってＣｈＩＰアッセイキットを用いて行った。定量的リアルタイムＰＣＲをプライマー：ＣＤ２８プロモーター近位ＳＴＡＴ部位：フォワード ＴＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＡＡＧＣＡＣＣＣ（配列番号１０）、リバース ＧＡＣＴＧＣＡＧＣＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ（配列番号１１）；遠位ＳＴＡＴ部位：フォワード ＴＧＣＴＴＧＣＡＣＧＴＡＧＡＡＴＧＧＧＴ（配列番号１２）、リバース ＧＧＡＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＴＴＧＴＧＴＣ（配列番号１３）を用いて行った；ウサギＩｇＧを陰性対照として使用した。
【0165】
クロム放出アッセイ（ＣＲＡ）：腫瘍細胞を、２０：１のエフェクター：腫瘍で抗原特異的ＣＴＬと共に４時間インキュベートする前に、Ｃｒ５１で標識した。上清中のＣｒ５１の量を測定し、死滅効率を死滅（％）＝１００％×（試料平均－陰性対照の平均）／（陽性対照の平均－陰性対照の平均）として計算した。
【0166】
Ｍｉｎｉ－ＲＥＰは、Ｔ２５フラスコから２４ウェルプレートへのスケールダウンを適宜開始した。ＩＬ－２１及びパノビノスタットの用量は変更しなかった。
【0167】
統計分析：データのグラフ表示及び統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ６，ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）及びＥｘｃｅｌを用いて行った。データは、平均及びＳＴＤとして示される。実験群間の結果を、スチューデントｔ検定を用いて比較した。ｐ＜０．０５は統計的に有意であると見なした。統計的有意性は、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１として示される。
【0168】
本明細書で開示及び請求されるすべての方法は、本開示に照らして過度の実験なしに構築し、実行することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して説明してきたが、当業者には、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法及び方法のステップ又は一連のステップを様々に変更できることは明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤が、本明細書に記載の薬剤の代わりになり得、同じ又は同様の結果を達成することになることは明らかであろう。当業者に明らかなそのようなすべての類似の代替物及び変更は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲、及び概念に含まれると見なされる。
参考文献
以下の参考文献は、これらが本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順又は他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１０２（２７）：９５７１－６，２００５．
Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５，２２６１－２２６９，２００５．
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２nd Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ．２０１３．
Ｓｅｔｏ ａｎｄ Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．６（４）：ａ０１８７１３，２０１４．
米国特許第６，３０７，０２４号明細書
米国特許第６，６８６，１７８号明細書
Ｙｅｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５７，２５０－２６３，２０１４．
参考文献
以下の参考文献は、これらが本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順又は他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１０２（２７）：９５７１－６，２００５．
Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５，２２６１－２２６９，２００５．
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２nd Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ．２０１３．
Ｓｅｔｏ ａｎｄ Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．６（４）：ａ０１８７１３，２０１４．
米国特許第６，３０７，０２４号明細書
米国特許第６，６８６，１７８号明細書
Ｙｅｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２５７，２５０－２６３，２０１４．
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A-1】
【図4A-2】
【図4B】
【図4C】
【図5A-1】
【図5A-2】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図10F】
【図10G】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図11F】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E-1】
【図12E-2】
【図12F】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17A-1】
【図17A-2】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図19】
【配列表】