特許 7447384 方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-04

(45)【発行日】2024-03-12

(54)【発明の名称】方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 41/00 20200101AFI20240305BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20240305BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240305BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 31/5025 20060101ALN20240305BHJP

   A61K 31/357 20060101ALN20240305BHJP

   A61K 31/473 20060101ALN20240305BHJP

   A61K 31/19 20060101ALN20240305BHJP

   A61K 31/122 20060101ALN20240305BHJP

   A61K 31/409 20060101ALN20240305BHJP

   C07F 9/54 20060101ALN20240305BHJP

   C09K 11/06 20060101ALN20240305BHJP

【ＦＩ】

A61K41/00

A61K47/54

A61P43/00 121

A61P35/00

A61K31/5025

A61K31/357

A61K31/473

A61K31/19

A61K31/122

A61K31/409

C07F9/54

C09K11/06

【請求項の数】 25

(21)【出願番号】P 2021520472

(86)(22)【出願日】2018-06-21

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-12-09

(86)【国際出願番号】 GB2018051744

(87)【国際公開番号】W WO2019243757

(87)【国際公開日】2019-12-26

【審査請求日】2021-06-21

(73)【特許権者】

【識別番号】513227446

【氏名又は名称】オスロ ウニヴェルスィテーツスィーケフース ハーエフ

【氏名又は名称原語表記】ＯＳＬＯ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＴＳＳＹＫＥＨＵＳ ＨＦ

【住所又は居所原語表記】Ｐｏｓｔｂｏｋｓ ４５０，Ｎｙｄａｌｅｎ Ｎ－０４２４ Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ

(73)【特許権者】

【識別番号】504339734

【氏名又は名称】コンセホ・スペリオール・デ・インベスティガシオネス・シエンティフィカス

(73)【特許権者】

【識別番号】520503887

【氏名又は名称】ウニヴェルシダッド ポリテクニカ デ バレンシア

(73)【特許権者】

【識別番号】520503223

【氏名又は名称】ヴギウカラキス ゲオルギオス シー

(73)【特許権者】

【識別番号】520503234

【氏名又は名称】ロータス ゲオルギオス

(73)【特許権者】

【識別番号】520503245

【氏名又は名称】ナショナル アンド カポディストリアン ユニヴァーシティー オヴ アテンス

(74)【代理人】

【識別番号】110000109

【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス

(72)【発明者】

【氏名】ヴギウカラキス ゲオルギオス シー

(72)【発明者】

【氏名】ロータス ゲオルギオス

(72)【発明者】

【氏名】テオドッシュウ テオドッシス ア

(72)【発明者】

【氏名】ベルグ クリスチャン

(72)【発明者】

【氏名】ミゲル アンヘル ミランダ アロンソ

【審査官】山村 祥子

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０４４３４８７６（ＣＮ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１７／０２０２９６６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２００９－５４２８１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００９－５１１６２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００８－５３６９１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】THEODOSSIS A THEODOSSIOU; ET AL，A NOVEL MITOTROPIC OLIGOLYSINE NANOCARRIER: TARGETED DELIVERY OF COVALENTLY 以下備考，MITOCHONDRION，NL，ELSEVIER，2011年08月04日，VOL:11,NR:6，PAGE(S):982-986，http://dx.doi.org/10.1016/j.mito.2011.08.004，BOUND D-LUCIFERIN TO CELL MITOCHONDRIA

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ４１／００

Ａ６１Ｋ ３１／００

Ａ６１Ｋ ４７／５０

Ａ６１Ｋ ４５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

光線力学療法による癌の治療で使用するためのミトコンドリアを標的とする化学発光剤を含む医薬組成物であって、前記化学発光剤は、ミトコンドリアを標的とし、かつミトコンドリアに蓄積することができる、少なくとも１つのミトコンドリア指向性部分に結合した少なくとも１つの化学発光部分を含むコンジュゲートであり、前記光線力学療法は、光増感剤またはその前駆体の同時または連続した使用を含み、さらに
前記化学発光部分は、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、およびそれらの誘導体からなる群から選択され、
前記ミトコンドリア指向性部分は、親油性ホスホニウムカチオンであり、かつ
前記光増感剤またはその前駆体は、５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）、５－ＡＬＡの誘導体、もしくはこれらの薬学的に許容される塩、またはヒポクレリンＡ、ヒポクレリンＢ、またはセルコスポリンである、医薬組成物。

【請求項2】

前記コンジュゲートは、一般式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩であって、

【化1】

式中、Ａは請求項１に定義される化学発光部分を表し、
同じであっても異なっていてもよい各Ｌは、直接結合またはリンカー（例えば、有機リンカー）のいずれかであり、
同じであっても異なっていてもよい各Ｂは、請求項１に定義されるミトコンドリア指向性部分を表し、
ｎは、１～３の整数、好ましくは１であり、
ｘは、１～３の整数、好ましくは１である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記コンジュゲートは、式（ＩＩ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩であって、

【化2】

式中、Ａ、Ｌ、およびＢは、請求項２に定義される通りである、請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記リンカーＬは、Ｃ_1-3アルキル、－Ｏ（Ｃ_1-3）アルキル、－ＯＨ、シクロアルキルおよびアリール基から選択される１つ以上の基によって任意選択的に置換されるアルキレン鎖（好ましくはＣ_1-15アルキレン、例えば、Ｃ_2-11アルキレン）を含み、前記アルキレン鎖の１つ以上の－ＣＨ₂－基は、－Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲ－（式中、Ｒは、ＨまたはＣ_1-6アルキル、好ましくはＣ_1-3アルキル、例えば、メチルである）、シクロアルキル、複素環、アリールおよびヘテロアリール基から独立して選択される基によって置き換えられてもよい、請求項２または請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記リンカーＬは、－Ｃ₃Ｈ₆－、－Ｃ₄Ｈ₈－、－Ｃ₆Ｈ₁₂－、－Ｃ₈Ｈ₁₆－、－Ｃ₁₀Ｈ₂₀－、－Ｃ₁₁Ｈ₂₂－、－ＣＯ－ＣＨ₂－、－ＣＯ－Ｃ₃Ｈ₆、－ＣＯ－Ｃ₅Ｈ₁₀－、－ＣＯ－Ｃ₆Ｈ₁₂－、－ＣＯ－Ｃ₁₀Ｈ₂₀－、１～４個のエチレンオキシド単位を含むポリエチレングリコール基、

【化3】

（式中、ａは１～６の整数、例えば、２～５である）からなる群から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記コンジュゲートが、式（ＩＩＩ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩

【化4】

（式中、Ｌ¹はリンカー、例えば、請求項４または５に定義されるようなリンカーであり、
Ｂ¹は、請求項１に定義されるミトコンドリア指向性部分であり、
Ｒ³は、水素、またはＣ_1-3アルキル（例えばメチル）等のアルキル基であり、
各Ｒ⁴は、Ｃ_1-6アルキル、および－ＮＲ⁵Ｒ⁶から独立して選択され、
Ｒ⁵およびＲ⁶は、ＨおよびＣ_1-6アルキルから、好ましくはＨおよびＣ_1-3アルキル（例えば－ＣＨ₃）から独立して選択され、
ｐは、０～３までの整数、好ましくは０、１または２、例えば０または１である）である、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記コンジュゲートが、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）の化合物であって、

【化5】

式中、Ｌ¹、Ｂ¹、Ｒ³、Ｒ⁴、およびｐは、請求項６に定義される通りである、請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

Ｌ¹は、

【化6】

（式中、ａは１～１０の整数、好ましくは３～１０であり、
ｂは１～４までの整数、例えば２である）からなる群から選択される、請求項６または請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

Ｂ¹は、以下の基

【化7】

（式中、Ｒ¹はフェニル、トルエン（例えば、ｏ－トルエン、ｍ－トルエンまたはｐ－トルエン）、またはシクロヘキシルであり、
Ｘは、一価のアニオン、例えばＣｌ、Ｂｒ、またはＩアニオンである）である、請求項６～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記コンジュゲートが、式（ＩＶ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩

【化8】

（式中、Ｌ²はリンカー、例えば、請求項４または５に定義されるようなリンカーであり、
Ｂ²は、請求項１に定義されるミトコンドリア指向性部分であり、
各Ｒ⁶は、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、およびＣ_1-6アルキル（例えばｔＢｕ）から独立して選択され、
ｑは、０～４の整数、好ましくは０または２であり、
Ｚは、一価のアニオン、例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、またはＣＦ₃ＯＳＯ₂アニオンである）である、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

Ｌ²は、以下の基

【化9】

（式中、ａは、１～１０の整数、好ましくは３、４または５である）を表す、請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

Ｂ²は、以下の基

【化10】

（式中、Ｒ¹は、フェニル、トルエン（例えば、ｏ－トルエン、ｍ－トルエンまたはｐ－トルエン）、またはシクロヘキシルであり、Ｘは、一価のアニオン、例えばＣｌ、Ｂｒ、またはＩアニオンである）である、請求項１０または請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記コンジュゲートが、式（Ｖ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩

【化11】

（式中、Ｌ³はリンカー、例えば、請求項４または５に定義されるようなリンカーであり、
Ｂ³は、請求項１に定義されるミトコンドリア指向性部分であり、
各Ｒ⁷は、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、－ＣＯ₂Ｒ⁸（式中、Ｒ⁸は水素またはＣ_1-6アルキルである）、シアノ、およびＣ_1-6アルキル（例えば、ｔＢｕ）から独立して選択され、
ｒは、０～５の整数、好ましくは０または３であり、
Ｚは、一価のアニオン、例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、またはＣＦ₃ＯＳＯ₂アニオンである）である、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物、

【請求項14】

Ｌ³は、Ｃ_1-10アルキレン基、例えばＣ_1-6アルキレンである、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

Ｂ³は、以下の基

【化12】

（式中、Ｒ¹はフェニル、トルエン（例えば、ｏ－トルエン、ｍ－トルエンまたはｐ－トルエン）、またはシクロヘキシルであり、Ｘは、一価のアニオン、例えばＣｌ、Ｂｒ、またはＩアニオンである）である、請求項１３または請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記コンジュゲートが、式（ＶＩＩ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩

【化16】

（式中、Ｌ⁵はリンカー、例えば、請求項４または５に定義されるようなリンカーであり、
Ｂ⁴は、請求項１に定義されるミトコンドリア指向性部分であり、
各Ｒ¹⁰は、Ｃ_1-6アルキル（例えばメチル）、および－ＮＲ¹¹Ｒ¹²から独立して選択され、
Ｒ¹¹およびＲ¹²は、ＨおよびＣ_1-6アルキルから、好ましくはＨおよびＣ_1-3アルキル（例えば、－ＣＨ₃）から独立して選択され、
ｔは、０～３の整数、好ましくは１または２である）である、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記コンジュゲートが、式（ＶＩＩａ）

【化17】

（Ｌ⁵、Ｂ⁴、Ｒ¹¹およびＲ¹²は、請求項１６に定義される通りであり、Ｒ¹³は、ＨまたはＣ_1-3アルキルである）の化合物である、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項18】

Ｌ⁵は、Ｃ_1-11アルキレン、好ましくはＣ_2-8アルキレン、例えばプロピレンである、請求項１６または請求項１７に記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記光増感剤前駆体は、５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）、その誘導体または薬学的に許容される塩である、請求項１～請求項１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項20】

内部癌の治療において、例えば深部癌の治療における、請求項１～請求項１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項21】

前記癌は、神経膠腫および他の脳癌、肝癌および膵臓癌、乳癌、肺癌および前立腺癌、胆管癌、胃癌および結腸癌、膀胱癌、子宮頸部癌、頭頸部癌からなる群から選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

前記癌はＧＢＭである、請求項２１に記載の医薬組成物。

【請求項23】

少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤と一緒に、請求項１～１８のいずれか一項に記載の化学発光剤、および請求項１または請求項１９に記載の光増感剤または光増感剤前駆体を含む、医薬組成物。

【請求項24】

光線力学療法による癌の治療に使用するための、好ましくは内部癌、例えば深部癌の治療に使用するための、請求項２３に記載の医薬組成物。

【請求項25】

（ｉ）請求項１～１８のいずれか一項に記載の化学発光剤、別個に（ｉｉ）請求項１または請求項１９に記載の光増感剤または光増感剤前駆体、ならびに任意選択的に（ｉｉｉ）光線力学療法の方法における（ｉ）および（ｉｉ）の使用のための指示書、を含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、光線力学療法（ＰＤＴ）の方法における改善および該方法に関連する改善に関し、特に、外部光源を必要とせずに、過剰増殖細胞および／または異常な細胞を特徴とする疾患および状態の標的治療のためのそのような方法に関する。より具体的には、本発明は、腫瘍、特に、既存のＰＤＴ方法を使用した場合に到達できない腫瘍を治療するためのそのような方法に関する。

【0002】

本発明はさらに、ミトコンドリア親和性を有する新規化学発光剤、それらの調製方法、および光増感剤または光増感剤前駆体を使用するＰＤＴの方法における細胞内光源としてのそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0003】

内部腫瘍の従来の治療は、典型的には、侵襲的手術、放射線療法、非治癒的化学療法、またはこれらの組み合わせを含む。多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）等の頭蓋内腫瘍は、その位置および悪性度が高い特徴のために治療するのが非常に困難な深部腫瘍の一例である。ＥＵおよび米国では、毎年約２８，０００件のＧＢＭ等の悪性神経膠腫の新しい症例が診断されており、世界的には毎年２４０，０００人の患者が診断されている。現在の標準的な治療法は、腫瘍の約９９％を除去する高侵襲性（開頭）手術からなっているが、約１０億個の細胞が残されるため、再発につながる。放射線療法は、手術の補助として用いられてもよく（６０～６５Ｇｙ）、手術と併せると、残された癌細胞を数百万個に減少させることができるが、放射線耐性癌細胞を内部に有するいくつかの場所にも転移する傾向があるＧＢＭ等の癌には大きな効果は発揮しない。さらに、放射線療法は、正常組織に対する癌性組織の破壊に特異的ではない。放射線療法に加えて、テモゾロミドによる化学療法も使用することができる。しかしながら、これらの治療法は、全体的な患者の生存を制限し、治癒的転帰をもたらさない。これらは主に細胞増殖抑制性であり、最終的に（治療から約１年以内に）細胞が耐性を発現し、治療が無効になる。手術と放射線療法の組み合わせにより、生存期間の中央値が４．５ヶ月（未治療）から１２．１ヶ月に増加する。テモゾロミドによる追加の化学療法は、生存期間を１４．６ヶ月に延長する。ＧＢＭと診断された成人の相対生存率は、診断から１年以内には３０％未満であり、最初の診断から５年以上生存する患者はわずか３％である。

【0004】

そのため、ＧＢＭ等の深部に位置する到達困難な腫瘍は、治療することが依然として非常に困難であり、既存の治療法が提供する生存率の増加はごくわずかである。したがって、改善された有効性を有する、より標的を定めた、低侵襲性の治療手法の開発が緊急に必要とされている。

【0005】

腫瘍の治療に使用されることが知られている他の方法は、ＰＤＴを含む。ＰＤＴは、局所的または全身的に光増感剤を投与した後、周囲の酸素と相互作用して細胞毒性中間体を生成する光活性化光に患部を曝露することを含む。これは、細胞の破壊および腫瘍血管系のシャットダウンをもたらす。

【0006】

ＰＤＴは、３つの、必須ではあるが、個別には化学毒性のない成分の相乗効果によって癌治療を提供する：（ｉ）光増感剤（ＰＳ）、光活性化薬、（ｉｉ）ＰＳを活性化するための適切な波長の光、および（ｉｉｉ）有毒種の最終発生源である酸素の存在。ＰＤＴの抗腫瘍効果は、主に３つの相互に関連する効果に分類することができる：（ｉ）主にタイプＩまたはタイプＩＩ機構のいずれかによって影響を受ける直接的な細胞毒性作用：前者は活性酸素種（ＲＯＳ）を生成し、最終的にはヒドロキシルラジカルを生成するのに対し、ＰＳの大部分において顕著であるタイプＩＩ機構は、有害な一重項酸素［Ｏ_２（^１Δ_ｇ）または^１Ｏ_２］を生成する、（ｉｉ）腫瘍血管系への損傷、および（ｉｉｉ）ＰＤＴ誘発性の酸化ストレスの結果として、全身性免疫の発達につながる可能性のある炎症反応の誘導。

【0007】

光線力学療法および診断の方法における使用が現在承認されている光増感剤には、その生合成非光感受性前駆体である５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）から生成されるプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）が含まれる。５－ＡＬＡの外部投与に続いて、ヘムの生合成サイクルが、細胞ミトコンドリアにおける活性光増感剤ＰｐＩＸへの変換を促進する。５－ＡＬＡで処理された癌細胞は、主にポルフォビリノーゲン脱アミノ酵素の量が多いために、かつ／またはフェロケラターゼの量が大幅に少ないために、大量のＰｐＩＸを蓄積する（この酵素は、ミトコンドリアマトリックス内のＰｐＩＸによる鉄のキレート化を触媒してヘムを生成し、後にヘムはミトコンドリアから輸送される）。その後の光への曝露により、ＰｐＩＸは、その基底一重項状態からその励起一重項状態に励起される。次いで、項間交差を経て、より長寿命の励起された三重項状態になる。三重項状態のＰｐＩＸが酸素分子（基底三重項状態にある）と相互作用すると、ＰｐＩＸから酸素へのエネルギー移動が起こる。これにより、２つの分子が互いにスピン反転する結果となり、ＰｐＩＸが緩和してその基底一重項状態に戻る一方で、細胞毒性のある励起一重項状態の酸素分子が形成される。

【0008】

光増感剤はまた、癌性細胞および組織の光線力学的診断の方法における使用が知られており、腫瘍塊の外科的切除を誘導するためにも使用することができる。例えば、ＰＤＴは膀胱癌の治療における手術の補助として使用される。５－ＡＬＡによって誘発されるＰｐＩＸ蛍光は、現在、ＧＢＭの治療における蛍光誘導切除のために術中にも使用されている（Ｓｔｕｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．，２００６，７（５）：３９２－４０１を参照）。しかしながら、従来のＰＤＴ手順の制限（例えば、光の到達性および組織への光浸透性）に起因して、現在、外科的介入を必要とせずにこの侵襲性状態を治療するためにそれを使用することはできない。

【0009】

抗癌治療としてのＰＤＴの既存の方法の主な制限は、臨床医による治療領域の判断が不十分であること、治療される腫瘍体積の定義が不十分であること、および光活性化光が組織に浸透する深さ（約１．５ｃｍ）が制限されていることである。これは、効果のない治療および生存癌細胞の残存につながる。例えば、５－ＡＬＡベースのＰＤＴは、日光角化症および基底細胞癌の治療に非常に高い治癒率を伴って特異的かつ効率的であるが、それは２ｍｍより薄い病変の場合のみである。より厚い病変または非表在性癌の場合、５－ＡＬＡ ＰＤＴは患者の治癒を保証することはできず、大きな腫瘍の場合は対症療法的であるに過ぎない。これは、ＰｐＩＸの活性化波長（６３５ｎｍ）での光の組織浸透性が制限されているためである。

【0010】

場合によっては、ＰＤＴを用いて、固形臓器または食道等の中空臓器のより深くに位置する標的細胞を治療することができるが、これは通常、光増感剤の光活性化のために、カテーテルまたは内視鏡を誘導する光ファイバー等のデバイスの使用を伴う。これは複雑な手技であるだけでなく、体の特定の領域への到達を妨げ、治療にある程度の侵襲性をもたらす。またこれは、癌細胞全体を根絶することはできず、多病巣性疾患（例えば、神経膠腫）または多病巣性転移には適用することができない。したがって、表在性腫瘍の治療には適しているが、深部腫瘍細胞および解剖学的に到達しにくい病変の治療における既存のＰＤＴ法の使用は非常に制限されている。

【0011】

ＰＤＴの主な制約は、特に癌性病変が脳、肝臓、または膵臓等の深部臓器にある場合の、病変への光の到達であるため、光増感剤の投与後の光線力学的な細胞自殺に必要な光を提供する細胞内光源として生物発光または化学発光を利用するためにいくつかの努力がなされてきた。２００３年に最初に開発されたそのような治療法の１つは、ＢＬＡＤｅ（ＢｉｏＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）である。ＢＬＡＤｅは、ホタルルシフェラーゼ酵素による細胞内トランスフェクションと、それに続く光増感剤、およびルシフェラーゼの天然基質であるルシフェリンの投与に依存する。この方法の主な欠点は、上記３つの因子とＡＴＰとの共局在の必要性、およびルシフェラーゼを産生するように細胞を遺伝子改変する必要性である。また、この共局在は、脆弱な細胞内一重項酸素標的に非常に近接していなければならない。

【0012】

それ以来、所望のＰＤＴ効果を達成するために発光を利用するいくつかの試みがなされてきた（例えば、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１３，３４（４）：１２０４－１２；およびＢａａｃｉｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，２０１１，２６（６）：４１０－５を参照）。Ｌａｐｔｅｖ ｅｔ ａｌ．（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２００６．９５（２）：１８９－９６）は、細胞内発光によって細胞を死滅させるために、トランスフェリン－ヘマトポルフィリンコンジュゲートと一緒にルミノールを使用することを以前に提案した。それらは十分な概念実証（９５％の細胞毒性）を提供したが、以下の欠点がこれらの方法に関連しており、診療所でそれらを実行することを不可能にしている：（ｉ）非特異的な細胞内標的化、（ｉｉ）Ｌａｐｔｅｖらの研究では、鉄供給源としてのトランスフェリンの必要性、および（ｉｉｉ）細胞内ＲＯＳに近接するための設計の欠如。
本発明は、これらの問題に対応し、臨床的に有効な、非侵襲的なＰＤＴの方法を提供する。これは、細胞の過剰増殖を伴う全ての腫瘍型およびあらゆる状態の治療に使用できるが、従来のＰＤＴ技術を用いて到達できない内部腫瘍塊の治療に特に適している。

【発明の概要】

【0013】

本発明者らは、ここに、光増感剤、または光増感剤の前駆体（例えば、５－ＡＬＡ）と、著しいミトコンドリア親和性を有する化学発光剤との併用を含むＰＤＴの方法を提案する。このＰＤＴ法は、本明細書では一般に「ＬＵＭＩＢＬＡＳＴ」と称される。

【0014】

ミトコンドリア親和性は、「修飾された」化学発光剤、具体的には、少なくとも１つの化学発光部分が１つ以上のミトコンドリア標的化部分（本明細書では「ミトコンドリア指向性部分」または「ミトコンドリア指向性薬剤」とも称される）に結合した化学発光剤「コンジュゲート」の使用によって達成される。

【0015】

化学発光剤「コンジュゲート」の一例は、化学修飾されたルミノールである。ルミノールの化学修飾は、ルミノールを細胞ミトコンドリアに標的化し、ミトコンドリア膜を横断して効率的に輸送する化学基の結合を含む。細胞ミトコンドリアは、ルミノール発光に必要な活性酸素種および遷移金属触媒を提供する。さらに、ＰｐＩＸはミトコンドリアで生合成されるため、効率的な活性化および有害な一重項酸素生成のためにルミノールに近接している。ＰｐＩＸ以外の他のミトコンドリアに局在する光増感剤も使用することができ、特に、癌部位の血液脳関門の破壊が、たとえ３０：１の比であってもそれらが癌病変に選択的に蓄積するのに役立つ脳腫瘍に使用することができる。

【0016】

理論に拘束されることを望むものではないが、化学修飾されたルミノール（「ミトコンドリア指向性ルミノール」）は、ミトコンドリア呼吸の結果として発生したＲＯＳを利用すると考えられる。殺細胞性の低い活性酸素種は、電子伝達系（ＥＴＣ）から漏出した電子によって生成され、この電子は、分子状酸素をスーパーオキシドアニオンに還元し、さらに過酸化水素に不均化する。これらの低致死性ＲＯＳは、ルミノールの活性化時に青色発光（λ_ｍａｘ＝４２０ｎｍ）を生成することができる。ミトコンドリアのヘムまたは鉄－硫黄中心酵素は、化学発光を生成するために必要な鉄触媒作用を潜在的に促進し得る。ルミノール発光は、約４０５ｎｍでピークに達するＰｐＩＸ Ｓｏｒｅｔ吸収帯に適合するため、ミトコンドリアでＰｐＩＸをインサイチュで励起し、その結果、有害な一重項酸素を生成して、宿主細胞を死滅させると考えられる。このようにして、細胞の生存に直接の脅威をもたらさないミトコンドリアＲＯＳは、細胞毒性の高いＲＯＳ、すなわち、細胞内から致命的な細胞損傷を与える一重項酸素に「アップグレード」される。標的部位で高レベルのＰｐＩＸが産生されるため、この作用は癌性病変に特異的である。この概念を図１に示す：ここでは、修飾型のルミノールが自立した細胞内光源として使用され、標的細胞ミトコンドリアが「光のスイッチを入れる」ための電源として使用されている。その結果、これは腫瘍細胞内の光増感剤（例えばＰｐＩＸ）の細胞毒性活性を活性化する。この理論的作用機序は、化学発光剤、ルミノール、および光増感剤としての５－ＡＬＡ由来ＰｐＩＸを特に参照して説明されているが、本明細書で論じられるように、他の化学発光剤および他の光増感剤も本発明で使用され得る。

【0017】

したがって、広義に言えば、本発明は、特に過剰増殖細胞および／または異常な細胞、例えば癌細胞に対してＰＤＴを行うためにミトコンドリアを標的とするように、既知の化学発光剤、例えばルミノールの修飾を含む。この修飾の結果として、標的部位で光増感剤を活性化するために必要な発光は「自動」であり、多くの場合、より高いミトコンドリアＲＯＳ形成を示す癌細胞ではさらに強い。

【0018】

例えば、５－ＡＬＡ由来ＰｐＩＸの形成は、癌性ＧＢＭ病変に非常に特異的である。この高い特異性は、侵襲的手法を必要としないＧＢＭ治療の可能性をもたらすが、「ミトコンドリア指向性ルミノール」等のミトコンドリア指向性化学発光剤と５－ＡＬＡの全身投与だけで、脳の全ＧＭＢ病変を根絶するのに十分である。ＧＢＭは、最初に発生した後、脳内で高度に移動し、様々な脳の場所で再表面化するため、これは特に重要である。ＧＢＭを治療するために使用される場合、本発明はまた、血液脳関門のＧＢＭ誘発性破壊を利用するため、修飾された化学発光剤（例えばルミノール）と光増感剤またはその前駆体（例えば５－ＡＬＡ）の両方が、脳のＧＭＢ病変に効率的に到達する。

【0019】

本発明では、ＰＤＴにおいて従来的に使用されるランプまたはレーザー等の外部光源を必要とせずに、ＰＤＴが個々の腫瘍細胞に効果的に適用される（すなわち、ＰＤＴ効果は、集団病変ではなく、単一細胞レベルである）。この新規治療手法は、組織内への光の浸透の深さがもはや制約ではない、ＰＤＴにおけるパラダイムシフトを意味する。これは、光化学的であるにもかかわらず、２つの個々の非化学療法薬の投与を伴う、癌の革新的な治療の基礎を確立する。そのため、有害な副作用のリスクなしに複数回繰り返すことができ、これにより、転移のリスクが最小限に抑えられ、治療の治癒可能性が最大化される。

【0020】

本発明はさらに、侵襲的手術、電離放射線または非治癒的化学療法を必要とすることなく、位置および侵襲性が高い性質のために現在は実質的に不治であるＧＢＭ等の内部癌の効果的な治療の必要性に対応する。そのような治療は、一次治療として、および／または繰り返される非侵襲的治療を通じて生涯にわたって疾患の進行を効果的に制御することができる光化学療法剤としてのいずれかであり得る。到達することができない癌の治療に対するこの新規手法は、過剰増殖細胞および／または異常な細胞を特徴とする他の疾患および状態の治療、特に、浅いまたは表面的なものを含む他の癌の治療にまで及ぶ。

【0021】

本発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用される場合、「化学発光剤」という用語は、細胞ミトコンドリア内で起こる化学反応の結果として発光することができる様々な薬剤のいずれか、すなわち、ミトコンドリアに局在すると「活性化」され得る任意の薬剤を包含することを意図している。より具体的には、化学発光剤は、細胞ミトコンドリアに存在する物質、または活性酸素種もしくは窒素種等の物質等の細胞ミトコンドリアで生成される物質のいずれかと反応した後に発光する薬剤である。そのような酸素種は、例えば、酸素ラジカル、酸素スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカル等の任意の活性酸素種（ＲＯＳ）、および過酸化水素を含む。窒素種は、例えば、一酸化窒素、ペルオキシ亜硝酸、窒素酸化物等を含む。理解されるように、本発明で使用するための任意の化学発光剤は、生理学的に許容されるであろう。

【0022】

本明細書で使用される場合、「化学発光部分」という用語は、任意の化学発光剤、または化学発光剤に由来する任意の部分、すなわちその誘導体を包含する。いずれの誘導体も、上記のように、親分子の発光特性を保持するべきである。これは同様に、インビボでの生理学的忍容性の要件を満たす必要がある。誘導体の例として、１つ以上の追加の官能基または非官能基（例えば、置換基）を担持する化学発光剤が挙げられる。「誘導体」という用語は、化学発光剤の断片または残基にも及ぶ。

【0023】

本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア指向性部分」という用語は、ミトコンドリアを標的としてその中に蓄積することができる任意の生理学的に許容される薬剤を包含することが意図される。それはまた、親分子のミトコンドリア標的化特性を保持するミトコンドリア指向性薬剤の誘導体も包含する。「誘導体」という用語は、ミトコンドリア指向性薬剤の断片または残基にまで及ぶ。

【0024】

本明細書で使用される場合、「光増感剤前駆体」という用語は、代謝的に光増感剤に変換され、したがって本質的にそれと同等である任意の化合物を包含することが意図される。

【0025】

本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書に記載の化合物のいずれかの任意の薬学的に許容される有機塩または無機塩を指す。薬学的に許容される塩は、対イオン等の１つ以上の追加の分子を含み得る。対イオンは、親化合物の電荷を安定させる任意の有機基または無機基であり得る。化合物が塩基である場合、遊離塩基を有機酸または無機酸と反応させることにより、適切な薬学的に許容される塩を調製することができる。化合物が酸である場合、遊離酸を有機塩基または無機塩基と反応させることにより、適切な薬学的に許容される塩を調製することができる。

【0026】

「薬学的に許容される」という用語は、化合物または組成物が、製剤の他の成分または治療される患者（例えば、ヒト）と化学的および／または毒物学的に適合性があることを意味する。

【0027】

「医薬組成物」とは、医療目的で使用するのに適した任意の形態の組成物を意味する。

【0028】

本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、非ヒト哺乳動物）に利益をもたらすことができる任意の治療的適応を含む。ヒトおよび動物の両方の治療が本発明の範囲内であるが、主に本発明はヒトの治療を目的としている。「治療」または「治療法」という用語は、治癒的および予防的な治療または治療法を包含する。

【0029】

本明細書で使用される「アルキル」という用語は、一価の飽和、直鎖状または分枝状の炭素鎖を指す。アルキル基の例として、限定されないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソ－ペンチル、ネオ－ペンチル、ｎ－ヘキシル等が挙げられる。アルキル基は、好ましくは、１～６個の炭素原子、例えば１～４個の炭素原子を含む。

【0030】

本明細書で使用される「アルコキシ」という用語は、－Ｏ－アルキル基を指し、アルキルは、本明細書に定義される通りである。アルコキシ基の例として、限定されないが、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ等が挙げられる。

【0031】

本明細書で使用される「アリール」という用語は、芳香環系を指す。そのような環系は、少なくとも１つの不飽和芳香環を含む。好ましいアリール基はフェニルである。特に明記しない限り、任意のアリール基は、ヒドロキシ、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルコキシ、アミノ、シアノ、およびニトロ基、またはハロゲン原子（例えば、Ｆ、ＣｌまたはＢｒ）から選択される１つ以上の置換基で置換することができる。１つより多くの置換基が存在する場合、これらは同じであっても異なっていてもよい。

【0032】

「シクロアルキル」という用語は、一価の飽和環状炭素系を指す。単環式シクロアルキル環は、３～８個の炭素原子を含み得、例として、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられる。特に指定しない限り、任意のシクロアルキル基は、１つ以上の位置で適切な置換基で置換され得る。１つより多くの置換基が存在する場合、これらは同じであっても異なっていてもよい。適切な置換基として、ヒドロキシ、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_１～６アルコキシ、アミノ、シアノ、およびニトロ基、またはハロゲン原子（例えば、Ｆ、ＣｌまたはＢｒ）が挙げられる。

【0033】

「ハロゲン原子」という用語は、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒまたは－Ｉを指す。

【0034】

本明細書で使用される「複素環」という用語は、飽和または部分的に不飽和の４～６員（好ましくは５または６員）の炭素環系を指し、少なくとも１つの環原子は、窒素、酸素、および硫黄から選択されるヘテロ原子であり、残りの環原子は炭素である。複素環構造は、炭素原子または窒素原子を介して分子の残りの部分に連結され得る。特に明記しない限り、本明細書に記載の任意の複素環は、同一であり得るかまたは異なり得る１つ以上の基、例えば、ヒドロキシ、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルコキシ、アミノ、シアノ、もしくはニトロ基、またはハロゲン原子（Ｆ、ＣｌまたはＢｒ）によって任意選択的に置換され得る。

【0035】

本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」という用語は、複素環式芳香族基を指す。これらが単環式である場合、これらは、窒素、酸素、および硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含み、かつ、芳香族系を形成するのに十分な共役結合を含む、５員環または６員環を含む。特に明記しない限り、本明細書に記載のヘテロアリール環は、任意選択的に、同一であり得るかまたは異なり得る１つ以上の基、例えば、ヒドロキシ、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルコキシ、アミノ、シアノ、もしくはニトロ基、またはハロゲン原子（Ｆ、ＣｌまたはＢｒ）によって任意選択的に置換され得る。

【0036】

特に明記しない限り、全ての置換基は互いに独立している。

【0037】

下付き文字が整数０（すなわちゼロ）である場合、その下付き文字が言及する基が存在しないこと、すなわち、その特定の基の両側の基の間に直接結合が存在することが意図される。

【0038】

一態様では、本発明は、光線力学療法の方法に使用するためのミトコンドリアを標的とする化学発光剤（本明細書では「ミトコンドリア指向性化学発光剤」とも称される）を提供する。

【0039】

一実施形態において、本発明で使用するためのミトコンドリアを標的とする化学発光剤は、ミトコンドリアを選択的に標的とする少なくとも１つのミトコンドリア指向性部分に結合したまたは別様に関連した少なくとも１つの化学発光部分を含む化学発光剤「コンジュゲート」である。このコンジュゲートが１つより多くの化学発光部分を含む場合、これらは同じであっても異なっていてもよい。しかしながら、これらは概して同一である。化学発光部分が１つより多くのミトコンドリア指向性部分に結合している場合、ミトコンドリア指向性部分は同じであっても異なっていてもよいが、好ましくは同じである。一実施形態において、コンジュゲートは、単一のミトコンドリア指向性部分に結合したまたは別様に関連した単一の化学発光部分を含む。

【0040】

化学発光部分（または複数の部分）は、共有結合手段または非共有結合手段を介してミトコンドリア指向性部分（または複数のミトコンドリア指向性部分）に結合することができる。それは、例えば、静電相互作用、ファンデルワールス力、および／または水素結合を介してであり得る。典型的には、化学発光部分（または複数の部分）およびミトコンドリア指向性部分（または複数の部分）は、例えば、１つ以上の共有結合を介して、互いに共有結合する。場合によっては、化学発光部分（または複数の部分）は、連結基（または「スペーサー」）を介してミトコンドリア指向性部分（またはその各々）に共有結合し得る。

【0041】

本発明で使用するための化学発光剤「コンジュゲート」は、以下の一般式（Ｉ）を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩であり得、

【化1】

式中、Ａは化学発光部分を表し、
同じであっても異なっていてもよい各Ｌは、直接結合またはリンカーのいずれかであり、
同じであっても異なっていてもよい各Ｂは、ミトコンドリア指向性部分を表し、
ｎは、１～３の整数、好ましくは１であり、
ｘは、１～３の整数、好ましくは１である。

【0042】

式（Ｉ）の一実施形態において、ｎおよびｘの両方が１である。したがって、本発明で使用するための化学発光剤「コンジュゲート」は、式（ＩＩ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩であり得、

【化2】

式中、Ａ、Ｌ、およびＢは、本明細書に定義される通りである。

【0043】

本発明における使用に適した化学発光剤は当技術分野で既知であり、例えば、ルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル、シュウ酸塩エステル、ならびにそれらの既知の類似体および誘導体を含む。任意の既知の化学発光タンパク質またはその誘導体も使用することができる。本発明で使用するための化学発光部分は、これらの薬剤のいずれかに「由来」し得る。適切な誘導体は、１つ以上の追加の官能基もしくは非官能基（例えば、置換基）を含み得るか、またはこれらは、化学発光活性を保持するそのような薬剤の断片もしくは残基を含み得る。

【0044】

本発明における使用に好ましいのは、ルミノール、イソルミノール、およびアクリジニウムエステルに由来する化学発光部分である。そのような化合物は、１つ以上の追加の置換基、例えば、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルコキシ、アミノ、シアノ、およびニトロ基、またはハロゲン原子によって置換され得る。例えば、ルミノールまたはイソルミノールのフェニル環は、ハロゲン原子、およびＣ_１－６アルキル基から選択される１つ以上（例えば、１つまたは２つ）の基によって置換され得る。

【0045】

理解されるように、共有結合またはリンカーを介してミトコンドリア指向性薬剤（または複数のミトコンドリア指向性薬剤）に結合するために、化学発光部分は、典型的には、親化学発光剤の「誘導体」である。例えば、これは、リンカーへのまたは直接ミトコンドリア指向性薬剤へのいずれかの共有結合の形成に続いて１つ以上の末端原子または基を欠いている可能性があり、したがって、元の分子の「残基」と見なされ得る。例えば、ルミノールの場合、第一級アミン基は、リンカーまたはミトコンドリア指向性部分のいずれかに対する結合点を形成することができるため、単一の水素原子の損失（すなわち－ＮＨ_２から－ＮＨ－へ）によって「誘導体化」される。反応してミトコンドリア指向性薬剤（または複数の薬剤）と共有結合を形成し得る官能基の導入を含む、他の形態の誘導体化が想定され得る。任意の所与の化学発光剤に必要な「誘導体化」の特定の形態は、その構造に依存し、任意の熟練化学者によって容易に決定され得る。

【0046】

式（Ｉ）または（ＩＩ）において、化学発光部分は、以下の構造から選択され得る（式中、＊は、リンカーＬへの、またはミトコンドリア指向性薬剤への直接の結合点（または複数の点）を示す）：

【化3】

（式中、各Ｒは、水素、またはＣ_１－３アルキル（例えばメチル）等のアルキル基であり、
Ｘは、一価のアニオン、例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｏｔｏｓ、ＣｌＯ_４、ＮＯ_３、ＰＦ_６、またはＢＦ_４アニオンであり、
Ｙは、任意選択的に置換されたアリール（またはアリーレン）基、例えば任意選択的に置換されたフェニル（またはフェニレン）である）。

【0047】

Ｙが置換アリールまたはアリーレン基である場合、適切な置換基の例は、１つ以上のハロゲン原子（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ_１－６アルキル（例えば、ｔｅｒｔ．ブチル、プロピル、エチルまたはメチル）、－ＣＯＯＣ_１－６アルキル（例えば－ＣＯＯＣＨ_３）、ニトロまたはシアノ基を含む。

【0048】

適切なミトコンドリア指向性部分は、ミトコンドリア膜を通過する能力のために親油性部分を含む。非局在化カチオン電荷を有する部分も特に適している。親油性カチオン、とりわけ、カチオン電荷が非局在するカチオンが、特に適している。電荷の非局在は、例えば、広範な共役を有する芳香族系、例えば、縮合環構造、および／または分子全体に分布する複数のカチオン中心の存在によって提供され得る。例えば、トリフェニルホスホニウムの場合、中心のリンカチオンの電荷は３つのフェニル基によって共有される。

【0049】

本発明で使用され得るミトコンドリア指向性薬剤の例として、ホスホニウムイオン、デカリニウムおよびデカリニウム誘導体、グアニジニウムおよびグアニジニウム誘導体、ローダミン１２３、ローダミン１１０、トリフェニルエチレン部分（例えば、タモキシフェンおよび誘導体）、および２，６－ビス（４－アミノフェニル）－４－［４－（ジメチルアミノ）フェニル］チオピリリウムクロリドが挙げられる。任意の他の既知のミトコンドリア指向性薬剤も使用することができ、当業者によって適切な化合物が選択され得る。本発明における使用に好ましいのは、ホスホニウムイオン、ローダミン１２３、およびローダミン１１０から選択されるミトコンドリア指向性薬剤である。

【0050】

理解されるように、共有結合またはリンカーを介して化学発光部分（または複数の化学発光部分）に結合するために、ミトコンドリア指向性薬剤は、場合によっては、親ミトコンドリア指向性薬剤の「誘導体」であり得る。例えば、これは、リンカーへのまたは直接化学発光剤（または複数の薬剤）へのいずれかの共有結合の形成に続いて１つ以上の末端原子または基を欠いている可能性があり、したがって元の分子の「残基」と見なされ得る。任意の所与のミトコンドリア指向性薬剤に必要な「誘導体化」の特定の形態は、その構造に依存し、任意の熟練化学者によって容易に決定され得る。

【0051】

本発明において使用するためのミトコンドリア指向性薬剤の例は以下を含む：

【化4】

（式中、同じであっても異なっていてもよい（好ましくは同じである）各Ｒ^１は、例えば、以下から選択され得、

【化5】

Ｘは一価のアニオン、例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｏｔｏｓ、ＣｌＯ_４、ＮＯ_３、ＰＦ_６、またはＢＦ_４アニオンである）。

【0052】

本発明における使用に適したミトコンドリア指向性薬剤の他の例は以下を含む（式中、＊は、リンカーＬへの、または化学発光剤への直接の結合点を示す）：

【化6】

（式中、各Ｒは、水素およびＣ_１－６アルキル等のアルキル（例えば、メチルまたはエチル等のＣ_１－３アルキル）から独立して選択され、
各Ｘは、独立して、一価のアニオン、例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｏｔｏｓ、ＣｌＯ_４、ＮＯ_３、ＰＦ_６、またはＢＦ_４アニオンである）。

【0053】

ミトコンドリア指向性部分として使用され得るホスホニウムイオンは、トリフェニルホスホニウム、トリシクロヘキシルホスホニウムおよびそれらのペルフルオロ誘導体、例えば、トリス－ペンタフルオロフェニルホスホニウム等の親油性ホスホニウムカチオンを含む。本明細書に記載の一例では、ルミノールの化学修飾は、ルミノール－ＴＰＰを生成するように、一連の異なるリンカー（例えば、可変長のアルキレン鎖）を介してルミノールの一級アミンにミトコンドリアに結合した親油性トリフェニルホスホニウムカチオン（ＴＰＰ）を付加することによって達成されるように調整して設計される。この化合物のファミリーは、非局在化カチオン電荷のために、それらの過分極膜に起因して癌細胞によって優先的に取り込まれると予想される。

【0054】

上記の一般式（Ｉ）および（ＩＩ）において、リンカーＬの正確な性質は、これが化学発光部分をミトコンドリア指向性部分（または複数の部分）に連結するという目的の機能を果たし、したがって、化学発光部分のミトコンドリアへの標的化された送達を可能にする限り、本発明の性能にとって重要ではないと考えられる。リンカーは、剛性または可撓性であり得、所望の標的部位においてインビボで切断可能であり得る（例えば、光切断可能であり得る）。一般的に、それは有機基を含む。

【0055】

連結基Ｌは、本質的に親水性または疎水性であり得る。それは分岐（樹状を含む）鎖または直鎖のいずれかであり得るが、好ましくは直鎖である。連結基が分岐している場合、これは、例えば、１つより多くのミトコンドリア指向性部分を担持し得る。連結基は、脂肪族および／または芳香族であり得、１つ以上のシクロアルキル、複素環、アリール、またはヘテロアリール環を含み得る。したがって、連結基は、本質的に脂肪族、（多）環式および／または（多環）芳香族であり得る。

【0056】

リンカーの鎖長は異なり得るが、一般に、これは、１～２０個の原子（例えば、１～２０個の炭素原子）、好ましくは２～１５、例えば、２～１２個の原子を含む骨格を含み得る。

【0057】

リンカーＬは、例えば、Ｃ_１－３アルキル、－Ｏ（Ｃ_１－３）アルキル、－ＯＨ、シクロアルキルおよびアリール基から選択される１つ以上の基によって任意選択的に置換されたアルキレン鎖（好ましくはＣ_１－１５アルキレン、例えばＣ_２－１１アルキレン）を含んでもよく、アルキレン鎖の１つ以上の－ＣＨ_２－基は、－Ｏ－、－ＣＯ－、－ＮＲ－（Ｒは、ＨまたはＣ_１－６アルキル、好ましくはＣ_１－３アルキル、例えばメチルである）、シクロアルキル、複素環、アリールおよびヘテロアリール基から独立して選択される基によって置き換えられ得る。

【0058】

適切なリンカー基は、当技術分野の当業者によって容易に決定され得る。適切なリンカーの例は、任意選択的に置換されたアルキレン基、好ましくは非置換の直鎖アルキレン基、例えば、－Ｃ_３Ｈ_６－、－Ｃ_４Ｈ_８－、－Ｃ_６Ｈ_１２－、－Ｃ_８Ｈ_１６－、－Ｃ_１０Ｈ_２０－、および－Ｃ_１１Ｈ_２２－を含む。

【0059】

アルキレン鎖の１つ以上の－ＣＨ_２－基がある基によって置換されている場合、これらは、－Ｏ－もしくは－ＣＯ－基によって、または複素環（例えば、ピペラジニレン基等の連飽和複素環）、またはアリール環（例えばフェニレン）にのいずれかによって置き換えられてもよい。１つ以上の－ＣＯ－が存在するそのようなリンカーの例は、－ＣＯ－ＣＨ_２－、－ＣＯ－Ｃ_３Ｈ_６、－ＣＯ－Ｃ_５Ｈ_１０－、－ＣＯ－Ｃ_６Ｈ_１２－、および－ＣＯ－Ｃ_１０Ｈ_２０－を含む。２つ以上の－Ｏ－基が存在する適切なリンカーの他の例は、オリゴまたはポリエチレングリコール基、好ましくは１～４個のエチレンオキシド単位、例えば２または４個のエチレンオキシド単位を含むポリエチレングリコール基を含む。

【0060】

他の適切なリンカーの例は、以下を含み（以下の基において、リンカーのいずれかの末端は、化学発光部分に結合され得る）、

【化7】

式中、ａは、１～６の整数、例えば２～５である。

【0061】

特定の実施形態において、本発明で使用するための化学発光剤コンジュゲートは、式（ＩＩＩ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩であり、

【化8】

式中、Ｌ^１は、本明細書に記載の任意のリンカーであり、
Ｂ^１は、本明細書に記載の任意のミトコンドリア指向性薬剤であり、
Ｒ^３は、水素、またはＣ_１－３アルキル（例えばメチル）等のアルキル基であり、
各Ｒ^４は、Ｃ_１－６アルキル、および－ＮＲ^５Ｒ^６から独立して選択され、
Ｒ^５およびＲ^６は、ＨおよびＣ_１－６アルキルから、好ましくはＨおよびＣ_１－３アルキル（例えば－ＣＨ_３）から独立して選択され、
ｐは、０～３の整数、好ましくは０、１または２、例えば０または１である。

【0062】

式（ＩＩＩ）の好ましい化合物は、式（ＩＩＩａ）および（ＩＩＩｂ）の以下の化合物を含み、

【化9】

式中、Ｌ^１、Ｂ^１、Ｒ^３、Ｒ^４、およびｐは、本明細書に定義される通りである。

【0063】

式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）および（ＩＩＩｂ）において、Ｌ^１は、好ましくは以下のうちの１つから選択され、

【化10】

式中、ａは、１～１０の整数、好ましくは３～１０であり、
ｂは、１～４の整数、例えば２である。

【0064】

式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）の一実施形態において、Ｂ^１は以下の基であり得、

【化11】

式中、Ｒ^１は、本明細書に定義される通りであり、例えば、フェニル、トルエン（例えば、ｏ－トルエン、ｍ－トルエンまたはｐ－トルエン）、またはシクロヘキシルであり、Ｘは一価のアニオン、例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩアニオンである。

【0065】

特定の実施形態において、本発明で使用するための化学発光剤コンジュゲートは、式（ＩＶ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩であり、

【化12】

式中、Ｌ^２は、本明細書に記載の任意のリンカーであり、
Ｂ^２は、本明細書に記載の任意のミトコンドリア指向性薬剤であり、
各Ｒ^６は、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、およびＣ_１－６アルキル（例えばｔＢｕ）から独立して選択され、
ｑは、０～４の整数、好ましくは０または２であり、
Ｚは、一価のアニオン、例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、またはＣＦ_３ＯＳＯ_２アニオンである。

【0066】

式（ＩＶ）の一実施形態において、Ｌ^２は以下の基を表し、

【化13】

式中、ａは、１～１０の整数、好ましくは３、４または５である。

【0067】

式（ＩＶ）の一実施形態において、Ｂ^２は以下の基であり得、

【化14】

式中、Ｒ^１は、本明細書に定義される通りであり、例えば、フェニル、トルエン（例えば、ｏ－トルエン、ｍ－トルエンまたはｐ－トルエン）、またはシクロヘキシルであり、Ｘは一価のアニオン、例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩアニオンである。

【0068】

特定の実施形態において、本発明で使用するための化学発光剤コンジュゲートは、式（Ｖ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩であり、

【化15】

式中、Ｌ^３は、本明細書に記載の任意のリンカーであり、
Ｂ^３は、本明細書に記載の任意のミトコンドリア指向性薬剤であり、
各Ｒ^７は、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、－ＣＯ_２Ｒ^８（式中、Ｒ^８は水素またはＣ_１－６アルキルである）、シアノ、およびＣ_１－６アルキル（例えば、ｔＢｕ）から独立して選択され、
ｒは、０～５の整数、好ましくは０または３であり、
Ｚは、一価のアニオン、例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、またはＣＦ_３ＯＳＯ_２アニオンである。

【0069】

式（Ｖ）において、Ｌ^３は、好ましくはＣ_１－１０アルキレン、例えばＣ_１－６アルキレンである。

【0070】

式（ＩＶ）の一実施形態において、Ｂ^３は以下の基であり得、

【化16】

式中、Ｒ^１は、本明細書に定義される通りであり、例えば、フェニル、トルエン（例えば、ｏ－トルエン、ｍ－トルエンまたはｐ－トルエン）、またはシクロヘキシルであり、Ｘは一価のアニオン、例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩアニオンである。

【0071】

特定の実施形態において、本発明で使用するための化学発光剤コンジュゲートは、式（ＶＩ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩であり、

【化17】

式中、Ｌ^４は、本明細書に記載の任意のリンカーであり、

【0072】

Ａ^１は、本明細書に記載の任意の化学発光部分である。

【0073】

式（ＶＩ）において、Ｌ^４は、以下から選択され得、

【化18】

式中、ａは１～１０の整数、好ましくは４、５、または６である。

【0074】

式（ＶＩ）の一実施形態において、Ａ^１は、以下のいずれかから選択され、

【化19】

式中、Ｒ^３は、水素、またはＣ_１－３アルキル（例えばメチル）等のアルキル基であり、
各Ｒ^４は、Ｃ_１－６アルキル、および－ＮＲ^５Ｒ^６から独立して選択され、
Ｒ^５およびＲ^６は、ＨおよびＣ_１－６アルキルから、好ましくはＨおよびＣ_１－３アルキル（例えば－ＣＨ_３）から独立して選択され、
ｐは、０～３の整数、好ましくは０、１または２、例えば０または１であり、
Ｚは、一価のアニオン、例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、またはＣＦ_３ＯＳＯ_２アニオンであり、
各Ｒ^９は、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、およびＣ_１－６アルキル（例えば、ｔＢｕ）から独立して選択され、
ｓは、０～４の整数、好ましくは０、２、または３である。

【0075】

特定の実施形態において、本発明で使用するための化学発光剤コンジュゲートは、式（ＶＩＩ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩であり、

【化20】

式中、Ｌ^５は、本明細書に記載の任意のリンカーであり、
Ｂ^４は、本明細書に記載の任意のミトコンドリア指向性薬剤であり、
各Ｒ^１０は、Ｃ_１－６アルキル（例えばメチル）、および－ＮＲ^１１Ｒ^１２から独立して選択され、
Ｒ^１１およびＲ^１２は、ＨおよびＣ_１－６アルキルから、好ましくはＨおよびＣ_１－３アルキル（例えば、－ＣＨ_３）から独立して選択され、
ｔは、０～３の整数、好ましくは１または２である。

【0076】

式（ＶＩＩ）の好ましい化合物は、以下の式（ＶＩＩａ）の化合物を含み、

【化21】

式中、Ｌ^５、Ｂ^４、Ｒ^１１およびＲ^１２は本明細書に定義される通りであり、Ｒ^１３はＨまたはＣ_１－３アルキルである。

【0077】

式（ＶＩＩ）および（ＶＩＩａ）において、Ｌ^５は、好ましくはＣ_１－１１アルキレン、より好ましくはＣ_２－８アルキレン、例えばプロピレンである。

【0078】

本明細書に記載の化学発光剤コンジュゲートは、当技術分野で既知の方法および手順を使用して調製することができる。化学発光剤をミトコンドリア指向性部分に共有結合させるために使用され得る方法は、既知のカップリング技術を含む。使用される正確な方法は、化学発光剤、ミトコンドリア指向性薬剤、およびリンカー（存在する場合）の正確な性質、特に結合の形成に関与するペンダント官能基の性質に依存する。ペンダント官能基が結合パートナー上に既に存在する場合、これらは様々な部分を連結する際に使用され得る。必要に応じて、例えば、成分を結合するために使用され得る反応性官能基を含めるように、コンジュゲートの１つ以上の成分（すなわち、化学発光部分、リンカー、およびミトコンドリア指向性部分）を官能化することができる。適切な反応性基は、カルボン酸、ヒドロキシ、チオール、カルボニル、酸ハロゲン化物、第一級および第二級アミン、ハロゲン化アリールおよび擬ハロゲン化物、ハロゲン化アルキルおよび擬ハロゲン化物、ハロゲン化アルケニルおよび擬ハロゲン化物、末端アルキン、クリック可能な部分等を含む。そのような官能基を導入するための方法は、当技術分野で周知である。

【0079】

化学発光剤を１つ以上のミトコンドリア指向性薬剤に共有結合させるために使用され得る方法の例は以下を含むが、これらに限定されない：アミド結合形成、エーテル結合形成、エステル結合形成、チオエステル結合形成、クロスカップリング反応、オレフィンメタセシス反応、求電子性芳香族置換、クリック化学、求核性置換反応等。

【0080】

本明細書に記載のコンジュゲートの調製において出発物質として使用するための化合物は、文献から既知であるか、または市販され得る。あるいは、これらは、文献から既知の方法によって容易に得ることができる。本発明に従って使用するための化合物を調製する方法のより詳細な説明は、実施例に見出される。

【0081】

本明細書に記載の化学発光剤コンジュゲートは、それ自体が新規であり、本発明のさらなる態様を形成する。例えば、本明細書に記載の技術のいずれかを使用して、１つ以上の化学発光剤を１つ以上のミトコンドリア指向性薬剤に連結するステップを含むそれらの調製方法は、本発明のさらなる態様を形成する。

【0082】

ＰＤＴで使用するために、本明細書に記載のミトコンドリア指向性化学発光剤は、光増感剤または光増感剤の前駆体と組み合わせて使用される。本発明の鍵は、化学発光剤が光増感剤を「活性化」できるようにするために、これらが細胞ミトコンドリア内で互いに近接しているべきであるということである。これらの薬剤は、ＰＤＴの方法において、患者に別々に、同時に、または連続して投与するために個別に提供され得る。あるいは、これらは、ミトコンドリア指向性化学発光剤および光増感剤（または前駆体）の両方が存在する単一の製剤として提供され得る。そのような製剤は、本発明の一部を形成する。

【0083】

本発明で使用するために、任意の光増感剤（または光増感剤前駆体）は、そのインビボ投与後に標的細胞のミトコンドリアに蓄積して、これが化学発光化合物に近接することを確実にすることができなければならない。例えば、これはミトコンドリアに局在する光増感剤またはその前駆体であり得る。

【0084】

ミトコンドリアを標的とすることができる光増感剤および前駆体の例として、５－ＡＬＡおよびその誘導体、ｍＴＨＰＣ、テモポルフィン、クロリンｅ６、スルホン化アルミニウムフタロシアニン、アントラキノンおよびその誘導体（例えば、ヒペリシン、ヒポクレリン［Ａ、Ｂ］、セルコスポリン、カルホスチン、エルシノクロム［Ａ、Ｂ、Ｃ］）、およびそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。他のミトコンドリアに蓄積する光増感剤は当技術分野で既知であり、これらもまた本発明で使用することができる。

【0085】

他の既知の光増感剤および前駆体は、所望の標的化特性を付与するための適切な修飾を条件として、本発明において使用され得る。例えば、これらは、ミトコンドリア標的化能力を有する適切なナノ担体内にカプセル化され得る。これらの実施形態において、より広い範囲の光増感剤を使用することができ、ＰＤＴにおける使用に適した任意の既知の光増感剤（または前駆体）が使用され得ると想定される。一連の適切な薬剤が当技術分野で既知であり、それらは、例えば、５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）および５－ＡＬＡの誘導体（プロトポルフィリンＩＸの産生をもたらす）；ミトコンドリア指向性ポルフィリン；スルホン化され得るアルミニウムフタロシアニン（すなわちＡｌＰｃＳ）、例えばＡｌＰｃＳ_２もしくはＡｌＰｃＳ_２ａ等のジスルホン化アルミニウムフタロシアニン、またはアルミニウムフタロシアニンテトラスルホン酸（Ａ１ＰｃＳ_４）等のフタロシアニン；スルホン化テトラフェニルポルフィリン（例えば、ＴＰＰＳ_２ａ、ＴＰＰＳ_４、ＴＰＰＳ_１およびＴＰＰＳ_２ｏ）；テトラ（ｍ－ヒドロキシフェニル）クロリン（ｍ－ＴＨＰＣ）等のクロリン（例えば、商品名Ｆｏｓｃａｎで販売されているテモポルフィン）；バクテリオクロリンおよびケトクロリンを含むクロリン誘導体；モノ－Ｌ－アスパルチルクロリンｅ６（ＮＰｅ６）またはクロリンｅ６；ヘマトポルフィリンおよびベンゾポルフィリンを含む天然および合成ポルピリン；アントラキノンおよびその誘導体（例えば、ヒペリシン、ヒポクレリン［Ａ、Ｂ］、セルコスポリン、カルホスチン、エルシノクロム［Ａ、Ｂ、Ｃ］）を含む。

【0086】

これらの光増感剤（または前駆体）のいずれかの薬学的に許容される塩も使用することができる。そのような塩は、薬学的に許容される有機または無機の酸または塩基との塩を含む。

【0087】

本発明で使用され得る５－ＡＬＡの誘導体は、インビボでＰｐＩＸを形成することができる５－ＡＬＡの任意の誘導体を含む。典型的には、そのような誘導体は、ヘムの生合成経路におけるＰｐＩＸの前駆体であり、したがって、投与後に標的部位でＰｐＩＸを産生することができる。ＰｐＩＸの適切な前駆体は、５－ＡＬＡエステル等の５－ＡＬＡプロドラッグを含む。

【0088】

以下は、本発明で使用するためのとりわけ好ましい光増感剤および前駆体である：５－ＡＬＡ、ｍＴＨＰＣ、テモポルフィン、クロリンｅ６、スルホン化アルミニウムフタロシアニン、アントラキノンおよびそれらの誘導体（例えば、ヒペリシン、ヒポクレリン［Ａ、Ｂ］、セルコスポリン、カルホスチン、エルシノクロム［Ａ、Ｂ、Ｃ］）、およびそれらの薬学的に許容される塩。本発明における使用に特に好ましいのは、５－ＡＬＡおよびその薬学的に許容される誘導体（例えば、薬学的に許容される塩、またはメチルもしくはヘキシルエステル）である。

【0089】

化学発光部分の特定の選択は、治療される腫瘍の性質を含む様々な要因に依存するが、当技術分野の当業者は容易に選択することができる。理解されるように、化学発光剤の選択はまた、それが放出する光の波長が光増感剤の光活性化に適しているべきであるため、ＰＤＴ治療で使用される光増感剤にも依存する。

【0090】

適切な化学発光剤と光増感剤の「ペア」の例は、当業者によって容易に決定され得る。以下は、適切な非限定的な例として提供される。光増感剤がＰｐＩＸ（例えば、５－ＡＬＡの投与後にインビボで生成される）である場合、ルミノールまたはイソルミノールを化学発光剤として使用することができる。光増感剤ヒペリシンは、化学発光剤ルシゲニンとの使用に特に適しているが、それは、これらの部分が、特に金属キレート剤ＤＴＰＡおよびＥＤＴＡ等の結合剤の存在下で、非常に効率的な分子内エネルギー移動のためのπスタックを形成できるためである。ルミノールとｍＴＨＰＣは、非常に効率的なエネルギー移動ペアである。他の効率的なエネルギー移動ペアは、ルミノール－エリスロシンＢ、ルミノール－ヒポクレリン、ルミノール－セルコスポリン、ルミノール－カルホスチン、ルミノール－エルシノクロムアクリジンエステル－ヒポクレリン、ルシゲニン－ヒポクレリン、アクリジンエステル－セルコスポリン、ルシゲニン－セルコスポリン、アクリジンエステル－ヒペリシン、およびルシゲニン－ヒペリシンを含む。ヘマトポルフィリン誘導体（ＨＰＤ）またはスルホン化アルミニウムフタロシアニンは、ルミノールまたはルシゲニンのいずれかとともに使用できる。しかしながら、これらは潜在的な機能的ペアの単なる示唆的な例であり、他のものが当業者によって容易に決定され得る。

【0091】

本明細書に記載のミトコンドリア指向性化学発光剤は、光線力学療法の方法における使用を意図しており、光線力学療法に応答する体内の細胞または組織の障害または異常の治療に使用するのに適している。そのような方法は、本明細書に記載の光増感剤または光増感剤の前駆体の同時の、別々の、または連続した使用を伴う。

【0092】

一般に、代謝的に活性な細胞は光線力学的治療に応答する。代謝的に活性な細胞の例は、細胞数の増加／細胞増殖の増加、細胞の異常な成熟および分化、または細胞の異常な増殖等の異常な成長を経験する細胞である。そのような成長パターンを特徴とする任意の状態は、本明細書に記載のＰＤＴ法に従って治療することができる。

【0093】

治療され得る障害または異常は、癌性増殖または腫瘍等の悪性および前悪性の癌状態、ならびにそれらの転移；肉腫および癌腫等の腫瘍、特に固形腫瘍を含む。本発明は、腫瘍、特に皮膚の表面下に位置する腫瘍、すなわち内部癌または深部癌の治療に特に適している。

【0094】

本発明によるＰＤＴは、２つの様式で適用することができる：（ｉ）古典的なＰＤＴのように外部光源を必要とせずに、悪性もしくは前悪性状態（例えば、神経膠腫）の治療として、または（ｉｉ）疾患の再発もしくは播種のいずれかにつながる可能性のある、残された活動性の腫瘍性病巣を鎮圧するための、反復可能な、補助的な術後の光化学的治療として。治療は、反復治療セッションを通して生涯にわたって状態（例えば、脳癌）を管理および抑制するために効果的に使用することができる。原発性疾患の潜在性転移の治療も、事前の診断を必要とせずに実施され得る。

【0095】

本発明を使用して治療することができる腫瘍の例は、骨形成性および軟部組織肉腫を含む肉腫；癌腫、例えば、乳房、肺、脳、膀胱、甲状腺、前立腺、結腸、直腸、膵臓、胃、肝臓、子宮、肝臓、腎臓、前立腺、子宮頸部および卵巣の癌腫；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；神経芽細胞腫、黒色腫、骨髄腫、ウィルムス腫瘍；急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄芽球性白血病を含む白血病；星状細胞腫、神経膠腫および網膜芽細胞腫；中皮腫である。しかしながら、本発明は、非侵襲的に到達することが困難である深部にある癌性病変の治療において特定の価値を見出す。神経膠腫（例えば、ＧＭＢ）の治療は、本発明の好ましい態様を形成する。

【0096】

代謝的に活性な細胞の他の例は、炎症を起こした細胞である。したがって、関節リウマチ等の炎症性疾患もまた、本発明によるＰＤＴ法を使用して治療することができる。

【0097】

本明細書に記載のＰＤＴ法のいずれかで使用するために、ミトコンドリアを標的とする化学発光剤は、一般に、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物として提供される。そのような組成物は、本発明のさらなる態様を形成する。これらはまた、選択された光増感剤（または前駆体）を含み得るが、ほとんどの場合、光増感剤（またはその前駆体）は、患者への別個の投与のために異なる製剤として提供されることが想定される。

【0098】

本明細書に記載の医薬組成物は、当技術分野で周知の技術を使用して製剤化することができる。投与経路は、目的とする用途、特に治療される細胞または組織の位置に依存する。典型的には、これらは全身投与され、したがって、例えば皮内、皮下、腹腔内、静脈内もしくは腫瘍内注射によって、または点滴による注入によって、非経口投与に適合した形態で提供され得る。適切な剤形は、コンジュゲートおよび／または光増感剤（またはその前駆体）を１つ以上の不活性担体または賦形剤とともに含む懸濁液および溶液を含む。適切な担体は、生理食塩水、滅菌水、リン酸緩衝生理食塩水およびそれらの混合物を含む。好ましくは、組成物は、水または生理食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水中の、水性懸濁液または溶液の形態で使用される。

【0099】

組成物は、乳化剤、懸濁剤、分散剤、粘度調整剤、可溶化剤、安定剤、緩衝剤、保存剤等の他の薬剤をさらに含んでもよい。組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌され得る。

【0100】

一実施形態において、ミトコンドリアを標的とする化学発光剤は、静脈内または腫瘍内注射に適した水または生理食塩水（または任意の他の薬学的に関連する生体適合性ビヒクル）中の溶液の形態で提供される。これは、単回投与または反復投与のいずれかで投与することができる。

【0101】

一実施形態において、化学発光剤コンジュゲートは、徐放性製剤の形態で投与することができる。適切な遅延放出製剤は当技術分野で既知であり、インビボで薬剤を連続的に徐放することができる任意の製剤を含む。適切な遅延放出製剤の一例は、インビボでの持続放出を提供する注射可能なインプラントである。そのようなインプラントは、活性化合物のナノ粒子を含む生体適合性および生分解性ポリマーに基づくインサイチュ形成インプラントであり得る。これらは、化学発光剤の持続的な送達を提供して長期の発光を保証し、それにより、治療の最適化された治療効果を達成する。

【0102】

別の態様では、化学発光コンジュゲートは、生理学的温度で（すなわち、いったん体に送達されると）サーモゲルになる熱応答性製剤の形態で提供され得る。これらは、最大１５時間、例えば１０～１５時間の期間にわたってそれらの負荷を最適に放出するように製剤化することができる。温度応答性ポリマーの使用により、皮下注射に適した、体温に応答してインサイチュで相転移を起こしてゲル化する、低粘度溶液の製剤化が可能になる。ゲルネットワークの熱硬化特性を最適化するために、様々なポリマーおよびそのコポリマーを使用することができる。そのようなポリマー材料は、当技術分野で既知であり、かつ使用されており、例えば、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩／ヒアルロン酸、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、およびポロキサマーを含む。

【0103】

化学発光コンジュゲートを含むナノ粒子および／またはマイクロ粒子も、長期間、例えば１０～１５時間にわたって活性物質の制御された連続的な放出をもたらすために提供され得る。そのような担体の例として、（ｉ）ミセル担体、（ｉｉ）リポソーム、（ｉｉｉ）樹状またはポリマーナノ担体、および（ｉｖ）固体脂質ナノ粒子が挙げられる。任意のそのような粒子は、インサイチュで生成されるゲルネットワークにおいて活性物質を放出するためのリザーバを形成するように、本明細書に記載の熱応答性製剤に含まれ得る。

【0104】

本明細書に記載の組成物は、全身的に（例えば、経口的または非経口的に）投与することができるか、あるいは、これらは、患部またはその近くで局所的に（例えば、局部的に）適用することができる。投与経路は、治療される疾患の重症度、性質、および場所、ならびに使用される光増感剤（または前駆体）に依存する。全身投与することができる組成物は、プレーンなまたはコーティングされた錠剤、カプセル、懸濁液および溶液を含む。局所的に（例えば、局部的に）投与することができる組成物には、ゲル、クリーム、軟膏、スプレー、ローション、および当技術分野の他の従来の剤形のいずれかが含まれる。クリーム、軟膏およびゲルは、適切な増粘剤および／またはゲル化剤を添加した水性または油性基剤とともに製剤化することができる。

【0105】

典型的には、本明細書に記載の方法は、例えば静脈内注射による、光増感剤を含む有効量の組成物の投与という最初のステップを含み得る。次に、光増感剤（または前駆体）は、体の所望の標的領域に分布され、例えば、注射および／または点滴のいずれかによって静脈内に、ミトコンドリアを標的とする化学発光剤を投与する前に、活性光増感剤、例えば、ＰｐＩＸのインサイチュ生成を可能にする。５－ＡＬＡ投与後の細胞におけるＰｐＩＸ生成の時間プロファイルは数時間であり得（典型的には、これは投与後２～１０時間の間にピークに達する場合がある）、したがってミトコンドリアを標的とする化学発光剤の送達を遅延させることが望ましい。これは、その投与を遅延させることによって、または本明細書に記載される遅延放出製剤によって達成することができる。光増感剤の投与は、典型的には、ミトコンドリアを標的とする化学発光剤の投与の前に行われることが想定されるが、それにもかかわらず、これらの送達は、例えば、ミトコンドリアを標的とする化学発光剤が遅延放出製剤の形態（例えば、本明細書に記載のナノ粒子および／またはマイクロ粒子担体系のいずれかの形態）で提供される場合、同時であり得る。

【0106】

例えば、患者は、最初に５－ＡＬＡ注射を受け、次に適切な時間枠で適切な治療域内で、ミトコンドリアを標的とする化学発光剤（例えば「ミトコンドリア指向性」ルミノール）の２回目の注射を受けるか、またはこの薬剤を含む点滴を必要な限り行う。この設定では、任意の治療後のモニタリングの対象となる必要性が最小限に抑えられる。

【0107】

本明細書に記載の組成物の有効用量、用量の数、および投与の正確なタイミングは、ミトコンドリアを標的とする化学発光剤の性質、光増感剤（または前駆体）、それらの投与様式（複数可）、治療される状態、患者等を含む様々な要因に依存し、それに応じて調節することができる。

【0108】

本発明のさらなる態様は、患者の細胞または組織の光線力学療法の方法に関し、前記方法は、前記細胞または組織に
（ａ）本明細書に記載の有効量のミトコンドリアを標的とする化学発光剤と、それと同時に、別々に、もしくは連続して、有効量の光増感剤もしくは光増感剤前駆体、または
（ｂ）本明細書に記載のミトコンドリアを標的とする化学発光剤および光増感剤もしくは光増感剤前駆体を含む有効量の医薬組成物、を投与するステップを含む。

【0109】

さらなる態様において、本発明は、例えば本明細書に記載のＰＤＴ法のいずれかにおける、光線力学療法の方法における同時の、別々の、または連続した使用のために、本明細書に記載のミトコンドリアを標的とする化学発光剤、および光増感剤または前駆体を含む製品を提供する。

【0110】

さらにさらなる態様では、本発明は、以下を含むキットを提供する：（ｉ）本明細書に記載のミトコンドリアを標的とする化学発光剤、別個に（ｉｉ）光増感剤または光増感剤前駆体、ならびに任意選択的に（ｉｉｉ）光線力学療法の方法における（ｉ）および（ｉｉ）の使用のための指示書。使用される場合、キットの活性成分（すなわち、（ｉ）および（ｉｉ））は、同時に、別々に、または連続して投与され得る。

【図面の簡単な説明】

【0111】

次に、本発明を、以下の非限定的な実施例および添付の図面を参照してさらに説明する。

【図1】修飾型のルミノールが自立した細胞内光源として使用され、標的ミトコンドリアが、「光のスイッチを入れる」ための電源として使用され、腫瘍細胞内から感光性薬剤（ＰｐＩＸ）の細胞毒性活性を活性化する、本発明の背景にある概念の概略図。この表現は、決して本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。

【図2】ミトコンドリアマトリックス環境に類似した生体模倣条件におけるミトコンドリア指向性ルミノール誘導体の発光。

【図3】－プロピレングリコールにミトコンドリア指向性ルミノール誘導体を適用した後の細胞層からの発光。

【図4】－ルミノール発光と様々な光増感剤との間のエネルギー移動：Ａ）アルカリ性ＤＭＳＯ（ＫＯＨ）中のルミノールの発光、Ｂ）ヒポクレリンＡ（ＨＹＰＡ）の添加、Ｃ）ＨＹＰＡの代わりにヒペリシン（ＨＹＰ）を追加、Ｄ）ローズベンガル（ＲＢ）の存在下でＣｕＳＯ_４および尿素過酸化物を添加した炭酸水素塩水溶液（ｐＨ１０．３）中のルミノール、Ｅ）５３２ｎｍレーザーによる励起、Ｆ）Ｄ）と同様であるが、ＴＰＰＳ４を添加した炭酸緩衝液中のルミノール系。

【図5】ルミノール発光と様々な光増感剤との間のエネルギー移動：Ａ）ＤＭＳＯ－ｔｅｒｔ－ブトキシド中のルミノールのスペクトル、Ｂ）エリスロシンＢは非常に強く、特に約５００を吸収し、５８０ｎｍ付近で非常に強い蛍光を示す、Ｃ）ＤＭＳＯ－ルミノール溶液へのｔｅｒｔ．ブトキシドの添加。

【図6】－ミトコンドリア指向性ルミノール誘導体およびルミノールの共焦点顕微鏡写真。３つの列（左）で、２つの誘導体、すなわちＤＺ１６０およびＡＰ４７のミトコンドリア局在が、乳房腺癌細胞株ＭＣＦ７および神経膠芽腫細胞株Ｕ８７の２つの異なる細胞株において示されている。この３つの列の各列の３つの顕微鏡写真は、誘導体の局在、ミトコンドリアマーカーＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎの局在、およびマージ画像におけるこれら２つの局在のオーバーレイを示している。ルミノールの蛍光は左の列に示され、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎの蛍光は中央の列に示される。それらのオーバーレイは３番目の列に示されている。右側の列（４列目）では、遊離ルミノールの細胞質ゾル局在が上の画像（縁取り付き）に示されているが、２つの例では、ＡＰ４７およびＤＺ１６０の局在は、蛍光スピルオーバー、すなわち、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒとルミノール誘導体チャネルとの間のクロストークを排除するために、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎとともにインキュベートされなかった細胞に示されている。

【図7】Ｕ８７およびＭＣＦ７細胞に対するＬＵＭＩＢＬＡＳＴ実験。

【図8】ＣｕＳＯ_４の存在下におけるＭＣＦ７およびＵ８７細胞中の化合物ＤＺ１６８と、光増感剤としてのＨＹＰＡの使用。

【図9】光増感剤としてのＨＹＰＡ、およびＤＺ１６７トリフェニルホスホニウム－ルミノール誘導体の存在下においてＣｕＳＯ_４によって媒介されるＵ８７細胞中のＬＵＭＩＢＬＡＳＴ効果。

【図10】Ｔ９８Ｇ多形神経膠芽腫細胞におけるセルコスポリンおよびエリスロマイシンｂ（画像では緑色）の細胞内局在。プローブであるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ（画像では赤色）を使用して、２つの色素と細胞ミトコンドリアの共局在を評価した。

【図11】Ｕ８７、ＧＢＭ細胞における光増感剤セルコスポリンと２つのルミノールミトコンドリア指向性誘導体、すなわちＤＺ２０３およびＤＺ１９６の使用によるＬＵＭＩＢＬＡＳＴ効果。セルコスポリンの吸収および発光特性は左上の図に示され、ルミノールの発光は左下のグラフに示される。

【図12】ＤＺ１６７および５－ＡＬＡと個別にまたは組み合わせて（最初に５－ＡＬＡ、次にＤＺ１６７）インキュベートしたＭＣＦ７細胞の代謝分析。酸素消費速度（左）は、細胞呼吸に対する調査された化合物の効果を表し、細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）は、解糖のプロセスに対する選択された化合物の効果を示す。化合物の注射後、続いて細胞に、単一化合物投与の場合はオリゴマイシン、ＦＣＣＰおよびアンチマイシンＡ＋ロテノン（ＤＺ１６７または５－ＡＬＡ）を注射し、組み合わせ投与の場合はＦＣＣＰおよびアンチマイシンＡ＋ロテノンを注射した（５－ＡＬＡおよびＤＺ１６７）。これらの後続の注射は、細胞呼吸への影響を解明するために行われ、オリゴマイシンの場合は、細胞の解糖能力も解明された。

【図13】１００μＭ ＣｕＳＯ_４の存在下（グレーのバー）または非存在下（斜線パターンの白いバー）で、５－ＡＬＡ（１．２ｍＭ）とＤＺ２０３（４００μＭ）を同時投与したＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞におけるＬＵＭＩＢＬＡＳＴ効果。

【実施例】

【0112】

実施例１．アシル化前駆体としてのフタルイミド（中間体）の合成

【化22】

ステップ１：ニトロフタル酸１２ａまたは１２ｂ（１２．６ｇ、０．０６ｍｏｌ）および無水酢酸（１１．１５ｍＬ、０．１２ｍｏｌ）の混合物を１時間還流した。混合物を室温にし、トルエン（３００ｍＬ）を加え、揮発性物質を真空で除去した。残差をジエチルエーテルで数回洗浄して、それぞれの無水物１３ａまたは１３ｂ（１０．２５ｇ、９０％）を白色固体として得た。

【0113】

ステップ２：酢酸（９０ｍＬ）中の無水ニトロフタル酸１３ａまたは１３ｂ（１０ｇ、０．０５２ｍｏｌ）の溶液に、ｓｅｃ－ブチルアミン（７．８５ｍＬ、０．０７８ｍｏｌ）を加え、混合物を５時間還流した。冷却後、混合物を真空で濃縮し、Ｈ_２Ｏ（１００ｍＬ）で希釈し、ＤＣＭ（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液および鹹水で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮して、それぞれのフタルイミド１４ａまたは１４ｂ（６．４５ｇ、５０％）を白色固体として得た。

【0114】

ステップ３：ＭｅＯＨ（２５０ｍＬ）中のニトロフタルイミド１４ａまたは１４ｂ（９ｇ、０．０４ｍｏｌ）の脱気（Ａｒでパージ）溶液に１０％Ｐｄ／Ｃ（１０ｍｏｌ％）を加え、混合物を水素雰囲気（２０バール）中で２４時間撹拌した。次に、溶液をセライトパッドで濾過し、溶媒を留去して、それぞれのフタルイミド１５ａまたは１５ｂ（６．１ｇ、７０％）を黄色固体として得た。

【0115】

実施例２．６－ブロモ－Ｎ－（２－（ｓｅｃ－ブチル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）ヘキサンアミド（中間体）の合成

【化23】

６－ブロモヘキサン酸（２．１４ｇ、０．０１１ｍｏｌ）を塩化オキサリル（約１０ｍＬ）に懸濁し、周囲温度で２時間撹拌し、過剰な塩化オキサリルを減圧下で留去した。残差（酸塩化物）を乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解し、アルゴン下０℃で乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）中の１５ａ（２．２ｇ、０．０１ｍｏｌ）およびピリジン（１．６２ｍｌ、０．０２ｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。添加後、混合物を周囲温度に加温し、２４時間撹拌した。ＤＣＭ（５０ｍＬ）を加え、溶液を、Ｈ_２Ｏ（５０ｍＬ）、１Ｍ ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（５０ｍＬ）、および鹹水（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、溶媒を減圧下で蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＰＥ／ＥｔＯＡｃ ６：１）により残差を精製して、アミド１１ａ（２．８０ｇ、７１％）を白色固体として得た。

【0116】

実施例３．１１－ブロモ－Ｎ－（２－（ｓｅｃ－ブチル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）ウンデカンアミド（中間体）の合成

【化24】

１１－ブロモウンデカン酸（１．１７ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を塩化オキサリル（約７ｍＬ）に懸濁し、周囲温度で２時間撹拌し、過剰な塩化オキサリルを減圧下で留去した。残差（酸塩化物）を乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、アルゴン下０℃で乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）中の１５ａ（０．９ｇ、４ｍｍｏｌ）およびピリジン（０．６５ｍｌ、８ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。添加後、混合物を周囲温度に加温し、２４時間撹拌した。ＤＣＭ（５０ｍＬ）を加え、溶液を、Ｈ_２Ｏ（５０ｍＬ）、１Ｍ ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（５０ｍＬ）、および鹹水（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、溶媒を減圧下で蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＰＥ／ＥｔＯＡｃ ６：１）により残差を精製して、アミド１１ａ（１．３ｇ、７０％）を白色固体として得た。

【0117】

実施例４．６－ブロモ－Ｎ－（２－（ｓｅｃ－ブチル）－１，３－ジオキソイソインドリン－５－イル）ヘキサンアミド（中間体）の合成

【化25】

６－ブロモヘキサン酸（１．２９ｇ、７ｍｍｏｌ）を塩化オキサリル（約１０ｍＬ）に懸濁し、周囲温度で２時間撹拌し、過剰な塩化オキサリルを減圧下で留去した。残差（酸塩化物）を乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、アルゴン下０℃で乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の１５ｂ（１．３ｇ、６ｍｍｏｌ）およびピリジン（０．９８ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。添加後、混合物を周囲温度に加温し、２４時間撹拌した。ＤＣＭ（５０ｍＬ）を加え、溶液を、Ｈ_２Ｏ（５０ｍＬ）、１Ｍ ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（５０ｍＬ）、および鹹水（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、溶媒を減圧下で蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、４％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により残差を精製して、アミド２１ａ（１．１２ｇ、４７％）を白色固体として得た。

【0118】

実施例５．１１－ブロモ－Ｎ－（２－（ｓｅｃ－ブチル）－１，３－ジオキソイソインドリン－５－イル）ウンデカナミド（中間体）の合成

【化26】

１１－ブロモウンデカン酸（１．７４ｇ、７ｍｍｏｌ）を塩化オキサリル（約７ｍＬ）に懸濁し、周囲温度で２時間撹拌し、過剰な塩化オキサリルを減圧下で留去した。残差（酸塩化物）を乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、アルゴン下０℃で乾燥ＤＣＭ（１５ｍＬ）中の１５ｂ（１．３ｇ、６ｍｍｏｌ）およびピリジン（０．９８ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。添加後、混合物を周囲温度に加温し、２４時間撹拌した。ＤＣＭ（５０ｍＬ）を加え、溶液を、Ｈ_２Ｏ（５０ｍＬ）、１Ｍ ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（５０ｍＬ）、および鹹水（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、溶媒を減圧下で蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、４％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により残差を精製して、アミド２１ｂ（１．６２ｇ、５８％）を白色固体として得た。

【0119】

実施例６．（６－（（２－（ｓｅｃ－ブチル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）アミノ）－６－オキソヘキシル）トリフェニルホスホニウムブロミド（中間体）の合成

【化27】

乾燥ＣＨ_３ＣＮ（１５ｍＬ）中の１１ａ（４２９ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（５７０ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ）の溶液を７２時間還流した。混合物を真空で濃縮し、残差をフラッシュクロマトグラフィー（１０％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、表題化合物２２ａ（３６２ｍｇ、５１％）を白色固体として得た。

【0120】

実施例７．（６－（（２－（ｓｅｃ－ブチル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）アミノ）－６－オキソヘキシル）トリ－ｐ－トリルホスホニウムブロミド（中間体）の合成

【化28】

乾燥ＣＨ_３ＣＮ（６ｍＬ）中の１１ａ（１４６ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）およびトリ（ｐ－トリル）ホスフィン（２２５ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ）の溶液を７２時間還流した。混合物を真空で濃縮し、残差をフラッシュクロマトグラフィー（７％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、表題化合物２２ｂ（２５６ｍｇ、９９％）を白色固体として得た。

【0121】

実施例８．（１１－（（２－（ｓｅｃ－ブチル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）アミノ）－１１－オキソウンデシル）トリフェニルホスホニウムブロミド（中間体）の合成

【化29】

乾燥ＣＨ_３ＣＮ（５ｍＬ）中の１１ｂ（４００ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（６７８ｍｇ、２．５８ｍｍｏｌ）の溶液を７２時間還流した。混合物を真空で濃縮し、残差をフラッシュクロマトグラフィー（７％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、表題化合物２２ｃ（３２１ｍｇ、３７％）を白色固体として得た。

【0122】

実施例９．（１１－（（２－（ｓｅｃ－ブチル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）アミノ）－１１－オキソウンデシル）トリ－ｐ－トリルホスホニウムブロミド（中間体）の合成

【化30】

乾燥ＣＨ_３ＣＮ（７ｍＬ）中の１１ｂ（４００ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）およびトリ（ｐ－トリル）ホスフィン（７８５ｍｇ、２．５８ｍｍｏｌ）の溶液を７２時間還流した。混合物を真空で濃縮し、残差をフラッシュクロマトグラフィー（５％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、表題化合物２２ｄ（６３６ｍｇ、９６％）を白色固体として得た。

【0123】

実施例１０．（１１－（（２－（ｓｅｃ－ブチル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）アミノ）－１１－オキソウンデシル）トリシクロヘキシルホスホニウムブロミド（中間体）の合成

【化31】

乾燥ＣＨ_３ＣＮ（５ｍＬ）中の１１ｂ（４００ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）およびトリシクロヘキシルホスフィン（７２３ｍｇ、２．５８ｍｍｏｌ）の溶液を７２時間還流した。混合物を真空で濃縮し、残差をフラッシュクロマトグラフィー（５％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、表題化合物２２ｅ（４０６ｍｇ、６３％）を白色固体として得た。

【0124】

実施例１１．（６－（（２－（ｓｅｃ－ブチル）－１，３－ジオキソイソインドリン－４－イル）アミノ）－６－オキソヘキシル）トリ－ｐ－トリルホスホニウムブロミド（中間体）の合成

【化32】

乾燥ＣＨ_３ＣＮ（４ｍＬ）中の２１ａ（３５０ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）およびトリ（ｐ－トリル）ホスフィン（５３９ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ）の溶液を７２時間還流した。混合物を真空で濃縮し、残差をフラッシュクロマトグラフィー（５％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、表題化合物２３ａ（４４８ｍｇ、７２％）を白色固体として得た。

【0125】

実施例１２．（６－（（２－（ｓｅｃ－ブチル）－１，３－ジオキソイソインドリン－５－イル）アミノ）－６－オキソヘキシル）トリシクロヘキシルホスホニウムブロミド（中間体）の合成

【化33】

乾燥ＣＨ_３ＣＮ（４ｍＬ）中の２１ａ（３５０ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）およびトリシクロヘキシルホスフィン（４９７ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ）の溶液を７２時間還流した。混合物を真空で濃縮し、残差をフラッシュクロマトグラフィー（５％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、表題化合物２３ｂ（５２９ｍｇ、８８％）を白色固体として得た。

【0126】

実施例１３．（１１－（（２－（ｓｅｃ－ブチル）－１，３－ジオキソイソインドリン－５－イル）アミノ）－１１－オキソウンデシル）トリ－ｐ－トリルホスホニウムブロミド（中間体）の合成

【化34】

乾燥ＣＨ_３ＣＮ（５ｍＬ）中の２１ｂ（５２３ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ）およびトリ（ｐ－トリル）ホスフィン（５２３ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ）の溶液を７２時間還流した。混合物を真空で濃縮し、残差をフラッシュクロマトグラフィー（５％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、表題化合物２３ｃ（４４９ｍｇ、６８％）を白色固体として得た。

【0127】

実施例１４．それぞれのフタルイミド２２ａ～ｅのヒドラジン分解からのミトコンドリア指向性５－Ｎ－アシル化ルミノール誘導体１ａ～ｅの合成

【化35】

ヒドラジン水和物（０．１８ｍＬ、３．０４ｍｍｏｌ）を、無水ＥｔＯＨ（６ｍＬ）中の所与のフタルイミド（２２ａ～ｅ、０．３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に加え、混合物を２時間還流した。続いて、溶媒を真空で除去し、残差をＨ_２Ｏ（１０ｍＬ）に溶解し、１ＭＨＣｌ水溶液で酸性化し、ＤＣＭ（３×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を鹹水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗残差をフラッシュクロマトグラフィー（５～１５％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、それぞれのフタルヒドラジド１ａ（６０％）、１ｂ（３２％）、１ｃ（４９％）、１ｄ（６０％）または１ｅ（３０％）を白色固体として得た。

【0128】

実施例１５．それぞれのフタルイミド２３ａ～ｃのヒドラジン分解からのミトコンドリア指向性６－Ｎ－アシル化イソルミノール誘導体２ａ～ｃの合成

【化36】

ヒドラジン水和物（０．３７ｍＬ、６．４ｍｍｏｌ）を、無水ＥｔＯＨ（１５ｍＬ）中の所与のフタルイミド（２３ａ～ｃ、０．６４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に加え、混合物を３時間還流した。続いて、溶媒を真空で除去し、残差をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）に溶解し、１ＭＨＣｌ水溶液で酸性化し、ＤＣＭ（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を鹹水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗残差をフラッシュクロマトグラフィー（１５％ ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、それぞれのフタルヒドラジド２ａ（７８％）、２ｂ（６２％）または２ｃ（３７％）を白色固体として得た。

【0129】

実施例１６．１，２－ビス－（２－ヨードエトキシ）エタン（中間体）の合成

【化37】

ステップ１：公開されている手順に従って、トリエチレングリコールジ－（ｐ－トルエンスルホン酸塩）３９を調製した（Ｂｏｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１５：４８４１－４８５６，２００７を参照）。水酸化カリウム（３ｇ、５３．４７ｍｍｏｌ）をアルゴン下０℃で乾燥ジクロロメタン（２５ｍＬ）中のトリエチレングリコール（１ｇ、６．６６ｍｍｏｌ）および塩化トシル（２．５４ｇ、１３．３２）の撹拌溶液中に少しずつ加え、室温で一晩撹拌したままにした。次に、ＤＣＭ（２５ｍＬ）を加え、混合物を氷／水に注ぎ、相を分離し、水相をＤＣＭ（２×４０ｍＬ）で洗浄し、合わせた有機層を水（４０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させた（Ｎａ_２ＳＯ_４）。溶媒の蒸発により、３９（２．４４ｇ、８０％）が白い細粉として残った。

【0130】

ステップ２：公開されている手順に従って、１，２－ビス－（２－ヨードエトキシ）エタン４０を調製した（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．３６：１６５４，２０１５を参照）。ヨウ化ナトリウム（９．５ｇ、０．０６ｍｏｌ）をアセトン（１５０ｍＬ）中のトシレート３９（１０ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）の溶液に加え、混合物を６０℃で一晩撹拌した。残りの沈殿物を濾別し、濾液を濃縮乾燥させた。残差をＤＣＭと水との間で分配し、水相をＤＣＭで洗浄し、合わせた有機層を水で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ_２ＳＯ_４）、濃縮乾燥すると、４０（６ｇ、７８％）が淡黄色固体として残った。

【0131】

実施例１７．ヨウ化ホスホニウム（中間体）の合成

【化38】

公開されている手順（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１７０４８，２００２）に従って、ジヨード化合物（５ｍｍｏｌ）およびそれぞれのホスフィン（１ｍｍｏｌ）（ジヨード－プロパン、－ヘキサン、－デカンまたは－１，２－ビス（エチレンオキシ）エタン４０）をフラスコ中で混合し、１００℃で加熱し、得られた溶融物を暗所で３時間撹拌した。冷却後、ジエチルエーテルを反応混合物に加え、沈殿物を濾過し、エーテルで洗浄した。生成物をジクロロメタンに再溶解し、エーテルの添加により再度沈殿させ、それぞれのヨウ化ホスホニウム３４（８７％）、３５（４５％）、３６（８３％）、３７（６０％）、３８（８５％）または４１（８７％）を褐色固体として得た。

【0132】

実施例１８．ミトコンドリア指向性５－Ｎ－アルキル化ルミノール誘導体３ａ－ｆの合成

【化39】

Ｎ－メチルピロリドン（２．５ｍＬ）中のヨウ化ホスホニウム（３４～３８または４１、２．２６ｍｍｏｌ）の溶液にルミノール（４００ｍｇ、２．２６ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を１１０℃で２４時間撹拌した。室温まで冷却した後、水（５ｍＬ）を加え、そのようにして形成された沈殿物を濾過し、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３水溶液および水で洗浄した。残差をクロマトグラフィーにかけ（シリカゲル、ＤＣＭ、ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ、最大４０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）、純粋な３ａ（２４％）、３ｂ（１５％）、３ｃ（２５％）、３ｄ（２１％）、３ｅ（２０％）または３ｆ（３％）を得た。

【0133】

実施例１９．一般構造５６のミトコンドリア指向性ルミノール誘導体の合成

【化40】

一般構造５６による化合物は、化合物３ａ～ｄの合成に類似した方法で、式ＸＸの既知の化合物のアルキル化によって調製することができる（Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２１：９９７５，２０１５を参照）。

【0134】

実施例２０．一般構造５７のミトコンドリア指向性ルミノール誘導体の合成

【化41】

一般構造５７（Ｒ＝Ｍｅ）による化合物は、以下の反応スキームに従って調製することができる。

【化42】

【0135】

実施例２１．ミトコンドリア指向性アクリジニウムエステル誘導体の合成

【化43】

アルキル鎖にホスホニウム部分を有するミトコンドリア指向性アクリジウムエステル誘導体Ａ１～５は、化合物１～３を調製するために使用されるのと同様の方法を用いて合成することができる。アクリジニン酸ＡＣＡから出発して、市販の置換フェノールを使用してエステル化を行う。これに続いて、Ａ１～５に直接（化合物３の合成のように）、またはＡＣＣを介して（化合物１および２の合成のように）アルキル化を行う。

【0136】

実施例２２．ミトコンドリア指向性アクリジニウムエステル誘導体の合成
アルキル鎖にホスホニウム部分を有するミトコンドリア指向性アクリジウムエステル誘導体Ｂ１～２は、以下のスキームに従って合成することができる。

【化44】

【0137】

この合成では、ミトコンドリア指向性鎖がフェノール部分に結合し、メチル化によって最終的にアクリジニウム部分が形成される。

【0138】

実施例２３．ルミノール－ローダミンコンジュゲートＲＬｕｍの合成

【化45】

過剰なアジピン酸クロリドをフタルイミド１５ａと反応させ、水による後処理後に酸Ｒ１を得る。Ｒ１塩化物をＢｏｃ保護ピペラジンと反応させてＲ２を形成し、ヒドラジン分解およびそれに続く加水分解後、ルミノール誘導体Ｒ４を生じさせる。次に、これをローダミン１１０とカップリングして、所望のルミノール－ロジウムコンジュゲートＲＬｕｍを得る。

【0139】

実施例２４．アクリジニウム－ローダミンコンジュゲートＲｈＡＣの合成

【化46】

アクリジニウムエステルＣ１は、フェノールとのカップリングおよびそれに続くメチル化によってＡＣＡから調製される。カルボン酸誘導体Ｃ２は、公開されているものと同様の手順でＣ１を加水分解することによって調製される（Ｎａｔｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，ＲＳＣ Ａｄｖ．，４：２１８５２－２１８６３，２０１４を参照）。ローダミン誘導体Ｃ４は、Ｂｏｃ保護ピペラジンとのカップリングおよびそれに続く加水分解によってローダミン１１０から調製される。Ｃ２とＣ４をカップリングし、所望のアクリジニウム－ローダミンコンジュゲートＲｈＡＣを得る。

【0140】

実施例２５～３４．
実施例２５～３４では、本発明によるミトコンドリア指向性コンジュゲートに言及するために以下のコードが使用される。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【0141】

実施例２５．ミトコンドリアマトリックスに類似した条件でのミトコンドリア指向性ルミノール誘導体の発光
ミトコンドリアマトリックス環境に見られるものを模倣する生体模倣条件で、ミトコンドリア指向性ルミノール誘導体の発光を調べた。ミトコンドリアマトリックスの高タンパク質含有量とヘムおよび金属含有酵素の存在量は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）によりモデルで表した。

【0142】

ｐＨ７．９に設定されたトリス緩衝液（２００μＬ、５０ｍＭ）を、ＡＢＥＬ計測器（Ｋｎｉｇｈｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能な携帯発光計）で使用するために試験管に加えた。次に、これに１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した。調査対象の各化合物を１００ｍＭで加え、続いて尿素－Ｈ_２Ｏ_２（１０ｍＭ）を加えた。発光の初期定常状態プロファイルが得られた後、２ｍＭのＣｕＳＯ_４をリアルタイムで注入した。その結果を図２に提示する。

【0143】

実施例２６．ＭＣＦ７細胞におけるミトコンドリア指向性ルミノール誘導体の発光
ＭＣＦ７細胞からの化学発光を、様々なルミノール誘導体の適用時に記録した。これを達成するために、３つのストラテジーを実行した：１）ＤＭＳＯに溶解した化合物を、ルミノメーターの試験管のＵ字型の底にあるペレット化された細胞の単層（約５００万）に適用した；２）化合物をプロピレングリコールに溶解し、上記と同じ細胞単層に適用した；および３）化合物をＤＭＳＯに溶解し、２００μｌのＰＢＳ中の細胞濃縮物（約５００万細胞）に適用した。実験結果の特徴的な例を、ＤＺ１６３（化合物３ｄ）について図３に提供する。

【0144】

細胞をＴ１７５フラスコ中で増殖させ、コンフルエンスまで増殖させた。次に、細胞をトリプシンにより剥離し、遠心分離して大きなペレットにし、１２ｍｌの培地（フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁した。この懸濁液１ｍＬを１２本のフローサイトメトリーチューブの各々に導入し、これらを遠心分離して、細胞がＵ字型の底に膜を形成するようにした。チューブをＡＢＥＬ計測器に入れて走査した。次に、ルミノール部分（プロピレングリコール中１００μＭ）を加え、最後に、必要に応じて、ＤＭＳＯをリアルタイムで注入した。

【0145】

全ての場合において、細胞層の発光は、ルミノール誘導体の溶媒として、またはそれに続く添加剤として、ＤＭＳＯを導入することによってのみ誘導した。過酸化水素等の追加の酸化剤、または金属等の任意の触媒は使用しなかった。純粋なＤＭＳＯは最終的に細胞を死滅させるが、発光の記録は瞬時（注入後数秒）であったことに留意するべきである。しかしながら、細胞死が起こった場合でも、ＤＭＳＯはミトコンドリア指向性化合物の発光を促進した。おそらくは体積増加に起因して、分散した細胞において発光のレベルが実質的に減少した。

【0146】

実施例２７．ルミノール発光と様々な光増感剤との間のエネルギー移動
発光ルミノールから様々な光増感剤へのエネルギー移動の実現可能性を調べた。化学発光の発光プロファイルは、Ｓｙｎａｐｓｅ ＣＣＤヘッドを備えたＨｏｒｉｂａ ｉＨＲ３２０ ｆ／４．１イメージング分光計を使用して記録した。ルミノール（１００μＭ）の発光を、塩基（ＫＯＨまたはカリウムｔｅｒｔ－ブトキシドのいずれか、１００ｍＭ）の添加によりＤＭＳＯ中で励起し、光増感剤を加えた。水に溶解したＴＰＰＳ４の場合、ルミノール発光は尿素－Ｈ_２Ｏ_２（１０ｍＭ）および触媒（２ｍＭのＣｕＳＯ_４）の添加により励起した。一重項酸素の記録は、Ｈａｍａｍａｔｓｕ ５５０９－７３ ＮＩＲ ＰＭＴ検出器を使用することで容易になった。カットオンが約１０００ｎｍのロングパスフィルターと、一重項酸素リン光の中心波長である１２７０ｎｍを中心とするバンドパスフィルターの２つのフィルターを検出器の前に配置した。その結果を図４および図５に提示する。

【0147】

図４は、ルミノール発光とさまざまな光増感剤との間のエネルギー移動を示している。Ａ）アルカリ性ＤＭＳＯ（ＫＯＨ）中のルミノールの発光。Ｂ）ヒポクレリンＡ（ＨＹＰＡ）の添加、特徴的なＨＹＰＡ蛍光が見られる（約６００ｎｍ）。Ｃ）ＨＹＰＡの代わりにヒペリシン（ＨＹＰ）を添加、６００と６５０に特徴的なＨＹＰ蛍光の二重ピークが見られる。Ｄ）ローズベンガル（ＲＢ）の存在下でＣｕＳＯ_４および尿素過酸化物を添加した炭酸水溶液の緩衝液（ｐＨ１０．３）中のルミノール、Ｅ）で５３２ｎｍレーザー励起によって確認されるようにＲＢの特徴的な蛍光が明らかである。Ｆ）Ｄ）と同様に炭酸緩衝液中のルミノール系であるが、５－ＡＬＡ由来ＰｐＩＸとスペクトル的に類似したポルフィリンＴＰＰＳ４を添加、ＴＰＰＳ４の特徴的な蛍光は存在しない。水系でのルミノール発光は、４９０ｎｍ付近のメインピークに加えて、４００ｎｍ付近にこぶを示している。ＴＰＰＳ４の存在下（Ｆ）では、このこぶは著しく低下するが、このことは、４９０ｎｍのメインピークを低下させると思われる他の光増感剤とは対照的に、ＴＰＰＳ４がこの領域で強く吸収することを示している。

【0148】

図５では、光増感剤エリスロシンＢがカリウムｔｅｒｔ．ブトキシドでアルカリ化されたＤＭＳＯ中のルミノールに加えられる。Ａ）ＤＭＳＯ－ｔｅｒｔ－ブトキシド中のルミノールのスペクトル。Ｂ）エリスロシンＢは、特に約５００付近で非常に強く吸収し、５８０ｎｍ付近で非常に強い蛍光を示す。Ｃ）ＤＭＳＯ－ルミノール溶液へのｔｅｒｔ．ブトキシドの添加は、強力かつ長寿命のルミノール発光を引き起こし、また１２７０ｎｍ付近の発光は、この発光がヒスチジンによって消光されたため、一重項酸素の存在を示唆している。

【0149】

これらの実験は、多くの光増感剤がルミノール発光からエネルギーを受け取ることができることを示している。

【0150】

実施例２８．ルミノール誘導体およびルミノールの顕微鏡写真
ルミノール誘導体の細胞内局在を調べた。ガラス底のペトリ皿に細胞を接種し、一晩増殖させた。細胞をルミノール部分で４時間処理してから、イメージングの１５分前に、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭを加えた（１００ｎｍ）。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡にマウントした。ルミノールの蛍光を４０５ｎｍで励起し、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭの蛍光を４８８ｎｍで励起した。ルミノールの発光は４２０～４９０ｎｍ（赤色チャネル）で収集し、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭの蛍光はＦＩＴＣチャネル（緑色チャネル）で収集した。続いて、緑色チャネルと赤色チャネルの画像をＰｈｏｔｏｓｈｏｐで重ね合わせてオーバーレイ画像を得た。これらの画像では、各場合において、黄色は、ルミノール誘導体とＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ（したがって細胞ミトコンドリア）との共局在を示していた。

【0151】

図６の代表的な顕微鏡写真は、ミトコンドリア指向性化合物の細胞内局在と遊離ルミノールの細胞内局在の概要を示している。３つの列（左）で、２つの誘導体、すなわちＤＺ１６０およびＡＰ４７のミトコンドリア局在が、乳房腺癌細胞株ＭＣＦ７および神経膠芽腫細胞株Ｕ８７の２つの異なる細胞株において示されている。この３つの列の各列の３つの顕微鏡写真は、誘導体の局在、ミトコンドリアマーカーＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎの局在、およびマージ画像におけるこれら２つの局在のオーバーレイを示している。ルミノールの蛍光は左の列に示され、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎの蛍光は中央の列に示される。それらのオーバーレイは３番目の列に示されている。右側の列（４列目）では、遊離ルミノールの細胞質ゾル局在が上の画像（縁取り付き）に示されているが、２つの例では、ＡＰ４７およびＤＺ１６０の局在は、蛍光スピルオーバー、すなわち、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒとルミノール誘導体チャネルとの間のクロストークを排除するために、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎとともにインキュベートされなかった細胞に示されている。これは、ルミノール誘導体（ミトコンドリア）と遊離ルミノール（細胞質ゾル）の異なる局在を裏付けるものである。

【0152】

実施例２９．Ｕ８７およびＭＣＦ７細胞に対する５－ＡＬＡ／ヒポクレリンＡおよびＨＤ９２（ＡＰ４７）
ルミノール誘導体の効率を調べた。最初に試験を行った誘導体はＨＤ９２（本明細書では「ＡＰ４７」とも称される）であった。Ｕ８７細胞を９６ウェルプレートに接種した。次に、細胞を以下の群に分割した（群当たり少なくとも６つの並行試験）：対照（培地のみ）、ＡＬＡ対照（２ｍＭ）、ＨＤ９２対照（５００μＭ）、およびＬＵＭＩＢＬＡＳＴ群（２ｍＭ ５－ＡＬＡおよび５００μＭ ＨＤ９２）。それに対応して、ＭＣＦ７細胞を９６ウェルプレートに接種し、一晩増殖させた。次に、細胞を以下の群に分割した（群当たり少なくとも６つの並行試験）：対照（培地のみ）、ヒポクレリンＡ対照（ＨＹＰＡ ７μＭ）、ＨＤ９２対照（５００μＭ）、およびＬＵＭＩＢＬＡＳＴ群（７μＭ ＨＹＰＡおよび５００μＭ ＨＤ９２）。ＨＹＰＡを用いた実験の場合、１０μＭ ＦｅＳＯ_４を用いておよび用いずにこれら４つの群を培地中でインキュベートした。これらのそれぞれの薬物ストラテジーを用いて細胞を一晩（約２０時間）インキュベートした後、標準的なＭＴＴアッセイを用いて細胞群を生存率について試験した。端的に述べると、全ての細胞群を０．５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴとともに３時間インキュベートした。続いて、ＭＴＴ培地をＤＭＳＯ（１００μＬ）と交換して、ホルマザンを可溶化した。Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍプレートリーダーを使用して、５６２ｎｍでの吸光度についてウェルを読み取った。細胞毒性は、細胞を含まないウェルからブランク値を差し引いた後の対照（培地のみ）の吸光度のパーセンテージとして決定した。

【0153】

その結果を図７に提示する。得られたデータから、これらの結果は非常に高濃度のＨＤ９２で得られたものであり、依然として準毒性であるが、化学的毒性の限界に非常に近いことが分かる。また、５－ＡＬＡは、ＬＵＭＩＢＬＡＳＴ効果をもたらす際に光増感剤としてＨＹＰＡよりも効率的ではないが、金属触媒、本発明の場合は低濃度のＦｅＳＯ_４の存在下で、ＨＹＰＡ効果が達成されたことが分かる。このデータはまた、組み合わせた実験群の生存値がＨＤ９２（ＬＴＰＰ１）対照に対して示されているため、組み合わせた細胞毒性効果が、極めて重要であり、光増感剤（ＰＳ）とＨＤ９２の相乗効果の結果であることも示している。

【0154】

実施例３０．ＭＣＦ７およびＵ８７細胞におけるＨＹＰＡ、ＤＺ１６８、およびＣｕＳＯ_４
ＭＣＦ７およびＵ８７細胞を９６ウェルプレートに接種した。次に、細胞を以下の群に分割した（群当たり少なくとも６つの並行試験）：対照（培地のみ）、ＨＹＰＡ対照（３μＭ）、ＤＺ１６８対照（５、１０、２０、および３０μＭ）、およびＬＵＭＩＢＬＡＳＴの組み合わせ（３μＭ ＨＹＰＡ＋ＤＺ１６８ ５～３０μＭ）。これらの細胞群のインキュベーションは、１００μＭのＣｕＳＯ_４を含む培地中でも繰り返した。これらのそれぞれの薬物ストラテジーを用いて細胞を一晩（約２０時間）インキュベートした後、ＭＴＴアッセイを用いて細胞群を生存率について試験した。

【0155】

その結果を図８に提示する。ＨＹＰＡを光増感剤として使用した場合、ＭＣＦ７細胞はＨＹＰＡ＋銅群で毒性の増強を示したが、Ｕ８７細胞群は影響を受けなかった。

【0156】

実施例３１．ＭＣＦ７およびＵ８７細胞におけるＨＹＰＡ、ＤＺ１６７、およびＣｕＳＯ_４
ＭＣＦ７およびＵ８７細胞を９６ウェルプレートに接種した。次に、細胞を以下の群に分割した（群当たり少なくとも６つの並行試験）：対照（培地のみ）、ＨＹＰＡ対照（５μＭ）、ＤＺ１６７対照（２５～２００μＭ）、およびＬＵＭＩＢＬＡＳＴの組み合わせ（５μＭ ＨＹＰＡ＋ＤＺ１６７ ２５～２００μＭ）。これらのインキュベーションは、５０μＭのＣｕＳ_４を含む培地中で行った。これらのそれぞれの薬物ストラテジーを用いて細胞を一晩（約２０時間）インキュベートした後、ＭＴＴアッセイを用いて細胞群を生存率について試験した。

【0157】

その結果を図９に提示する。２００μＭの濃度のＤＺ１６７、５μＭのＨＹＰＡ、および５０μＭのＣｕＳＯ_４で、Ｕ８７細胞に相乗効果が見られる。

【0158】

実施例３２．Ｔ９８Ｇ多形神経膠芽腫細胞におけるセルコスポリンおよびエリスロマイシンＢの細胞内局在

【0159】

セルコスポリンの細胞内局在とともに、エリスロシンＢの細胞内局在を調べた。ガラス底のペトリ皿に細胞を接種し、一晩増殖させた。細胞をエリスロシンＢ（４μＭ）およびセルコスポリン（３μＭ）で４時間処理してから、イメージングの１５分前に、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭを加えた（１００ｎｍ）。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡にマウントした。セルコスポリンおよびエリスロシンＢの蛍光を４８８ｎｍで励起し、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭの蛍光を６３３ｎｍで励起した。セルコスポリンおよびエリスロシンＢの発光は５５０ｎｍ超（緑色チャネル）で収集し、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＦＭの蛍光は６４０ｎｍ超（赤色チャネル）で収集した。続いて、緑色チャネルと赤色チャネルの画像をＰｈｏｔｏｓｈｏｐで重ね合わせてオーバーレイ画像を得た。これらの画像では、各場合において、黄色は、光増感剤とＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ（したがって細胞ミトコンドリア）との共局在を示している。図１０の顕微鏡写真から、セルコスポリンおよびエリスロマイシンＢは細胞ミトコンドリアと部分的に共局在しているため、それらをＬＵＭＩＢＬＡＳＴに使用できることが分かる。

【0160】

実施例３３．Ｕ８７ＧＢＭ細胞におけるセルコスポリンおよびＤＺ２０３／ＤＺ１９６
セルコスポリンの細胞内局在とともに、合成された誘導体ＤＺ２０３（短いアルキルリンカー）およびＤＺ１９６（オリゴＰＥＧリンカー）の細胞内局在を調べた。Ｕ８７細胞を９６ウェルプレートに接種した。次に、細胞を以下の群に分割した（群当たり少なくとも６つの並行試験）：対照（培地のみ）、セルコスポリン対照（３μＭ）、ＤＺ２０３対照（２００μＭ）、ＤＺ１９６対照（５００μＭ）、およびＬＵＭＩＢＬＡＳＴの組み合わせ（３μＭセルコスポリン＋ＤＺ２０３ ２００μＭまたは３μＭセルコスポリン＋ＤＺ１９６ ５００μＭ）。これらのインキュベーションは、１００μＭのＣｕＳＯ_４を含むおよび含まない培地中で行った。これらのそれぞれの薬物ストラテジーを用いて細胞を一晩（約２０時間）インキュベートした後、ＭＴＴアッセイを用いて細胞群を生存率について試験した。その結果は図１１に提示され、Ｃｕ（１５０μＭ）の存在下でＤＺ２０３（２００μＭ）とともに２４時間インキュベートしたセルコスポリンの非常に大きな効果を示している。ＤＺ１９６（５００μＭ）によるより小さな効果は、Ｃｕの触媒効果なしで達成された。

【0161】

実施例３３．ＤＺ１６７および５－ＡＬＡを用いたＭＣＦ７細胞の代謝分析
ルミノール誘導体および光増感剤（ここではそれぞれＡＰ４７および５－ＡＬＡによって例示される）を投与した時の無傷の細胞の呼吸および解糖を調べるために代謝分析を行った。ＭＣＦ７細胞をＳｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６代謝分析装置の９６ウェルプレートに接種し、一晩放置してインキュベートした。実験の１時間前に、ＣＯ_２を含まない３７℃のインキュベーターで、ＦＢＳを含まない非緩衝培地で細胞を１時間インキュベートした。次に、細胞を、呼吸活動に対応するそれらの酸素消費速度（ＯＣＲ）および細胞の解糖活性に対応する細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）について分析した。次に、ＸＦｅ９６代謝分析装置を使用して、図１２のグラフに示されるように、４つの条件（連続注入）で測定を行った。これらの注入は、ルミノールミトコンドリア指向性誘導体ＡＰ４７（２００μＭ）および５－ＡＬＡ（１ｍＭ）を含んでおり、細胞代謝に対するそれらの効果およびそれらの組み合わせの効果を調べた。また、オリゴマイシン（１μＭ）、ＦＣＣＰ（１μＭ）、およびアンチマイシンＡとロテノンの組み合わせ（それぞれ１μＭ）を使用して、細胞呼吸を調節した。オリゴマイシンは、ＡＴＰ合成を阻害し、ＡＴＰ生成に必要な呼吸量を明らかにし、ＦＣＣＰは、ミトコンドリアのプロトン勾配を崩壊させ、最大電子伝達、したがって最大酸素消費を強制する。最後に、ロテノンとアンチマイシンＡの混合物は、ミトコンドリア複合体ＩＩＩへの電子伝達を完全に阻害し、全ての呼吸活動を停止する。２－デオキシグルコース（２ＤＧ）も、細胞の解糖を完全に阻害するため、場合によっては、ＡＰ４７および５－ＡＬＡが細胞の解糖に及ぼす影響を調べるためのツールとして細胞に注入した。

【0162】

実施例３４．ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞における５－ＡＬＡおよびＤＺ２０３
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を９６ウェルプレートに接種した。次に、細胞を以下の群に分割した（群当たり少なくとも６つの並行試験）：対照（培地のみ）、５－ＡＬＡ対照（１．２ｍＭ）、ＤＺ２０３対照（４００μＭ）、およびＬＵＭＩＢＬＡＳＴの組み合わせ（１．２ｍＭ ５－ＡＬＡ＋ＤＺ２０３ ４００μＭ）。これらのインキュベーションは、触媒（１００μＭのＣｕＳＯ_４）の存在下および非存在下で、培地中で行った。これらのそれぞれの薬物ストラテジーを用いて細胞を一晩（約２０時間）インキュベートした後、ＭＴＴアッセイを用いて細胞群を生存率について試験した。その結果は図１３に提示され、触媒としてのＣｕの存在下における実質的な相乗効果を示している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】