特許 7448217 キメラ受容体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-04

(45)【発行日】2024-03-12

(54)【発明の名称】キメラ受容体

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240305BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20240305BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240305BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

G01N33/68 ZNA

C12Q1/06

C12N15/09 Z

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2020212785

(22)【出願日】2020-12-22

(65)【公開番号】P2022099043

(43)【公開日】2022-07-04

【審査請求日】2022-10-07

(73)【特許権者】

【識別番号】000006770

【氏名又は名称】ヤマサ醤油株式会社

(72)【発明者】

【氏名】保科 元気

【審査官】松村 真里

(56)【参考文献】

【文献】The Journal of Biological Chemistry，1996年，Vol.271, No.49，p.31593-31601

【文献】Eur. J. Biochem.，1999年，Vol.266, No.2，p.538-548

【文献】European Journal of Pharmacology，2005年，Vol.510, No.1-2，p.9-16

【文献】ACS CHEMICAL BIOLOGY，2008年，Vol.3, No.6，p.346-351

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｖ２受容体の第一細胞外領域配列をオキシトシン受容体の第一細胞外領域配列へと置換したキメラ受容体とｃＡＭＰバイオセンサーが発現されていることを特徴とする、動物細胞を含む、オキシトシン測定キット。

【請求項2】

Ｖ２受容体の第一・第二・第三細胞外領域配列をオキシトシン受容体の第一・第二・第三細胞外領域配列へと置換したキメラ受容体とｃＡＭＰバイオセンサーが発現されていることを特徴とする、動物細胞を含む、オキシトシン測定キット。

【請求項3】

Ｖ２受容体の第一細胞外領域配列をオキシトシン受容体の第一細胞外領域配列へと置換したキメラ受容体を用いることを特徴とする、ｃＡＭＰバイオセンサーを用いたオキシトシン測定系のＳ／Ｎ比向上方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、オキシトシン（Ｏｘｙｔｏｃｉｎ）受容体とＶ２受容体のキメラ受容体に関する。

【背景技術】

【0002】

オキシトシンは、下垂体後葉から分泌される９アミノ酸からなるホルモンである。子宮筋の収縮作用による分娩の促進や出産後授乳時の射乳反射を惹起する機能があり、分娩誘発剤として臨床的に用いられている。近年では、神経伝達物質として、精神神経疾患、社会的／性的なふるまいに関与している可能性が示唆されており、精神神経疾患などのバイオマーカーとして応用が期待されている。

【0003】

オキシトシン受容体（ＯＸＴＲ）は、中枢神経、子宮、乳腺等の細胞膜上に存在するオキシトシンの受容体であり、Ｇタンパク質共役受容体の一種である。下垂体後葉から分泌されるオキシトシンがＯＸＴＲに結合すると、その刺激によりＧタンパク質αｑ（Ｇαｑ）を介して細胞中のホスホリパーゼＣが活性化、ホスファチジルイノシトール４，５－ビスリン酸（ＰＩＰ２）が分解され、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５－トリスリン酸（ＩＰ３）が産生される。ＩＰ３は小胞体上のカルシウムチャネルであるＩＰ３受容体に結合して細胞質内にカルシウムを流入させる。ＤＡＧはカルシウムとともにプロテインキナーゼＣを活性化、さらに下流にシグナルを伝達する。ＯＸＴＲはオキシトシンだけでなくアルギニンバソプレシン（ＡＶＰ : Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）にも強い親和性を有する。

【0004】

ＡＶＰは、オキシトシン同様、下垂体後葉から分泌され、腎臓における水再吸収を調節するホルモンである。９アミノ酸からなり、オキシトシンとは２アミノ酸が異なる。中枢性尿崩症では血中ＡＶＰ濃度が低下することから、診断補助にＡＶＰ測定が用いられている。

【0005】

Ｖ２受容体（Ｖ２Ｒ）は、腎集合管の細胞膜上に存在するＡＶＰ受容体であり、Ｇタンパク質共役受容体の一種である。下垂体後葉から分泌されるＡＶＰがＶ２Ｒに結合すると、その刺激により細胞中のＧタンパク質αｓ（Ｇαｓ）を介してアデニレートシクラーゼが活性化されて環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）が産生され、ｃＡＭＰシグナルによるプロテインキナーゼＡ活性化を介して、腎臓における水の再吸収が行われる。ＡＶＰの受容体として、Ｖ２Ｒのほかに、Ｖ１ａ受容体（Ｖ１ａＲ）、Ｖ１ｂ受容体（Ｖ１ｂＲ）が知られているが、それぞれ発現組織が異なる。また、Ｖ２ＲはＧαｓと、Ｖ１ａＲおよびＶ１ｂＲはＧαｑと共役することが知られている。これらの受容体はオキシトシンにも弱いながらも親和性を有する。

【0006】

オキシトシンの測定法として、質量分析（特許文献１）や、抗体を用いた免疫学的測定法であるＲＩＡ法（非特許文献１、２）、酵素免疫測定法（特許文献１、非特許文献１、２、３）、免疫生物発光測定法（特許文献２）等が知られている。

【0007】

Ｇタンパク質共役受容体に対するリガンドや自己抗体活性を迅速に測定する方法の１つとして、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＧタンパク質共役受容体の両方が発現する哺乳動物細胞を用いてｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを測定する方法が検討されている（特許文献３）。当該方法においては、以下の工程（ａ）～（ｃ）を行うことにより、被験者試料のＴＳＨＲに対する自己抗体活性を算定することができる。
（ａ）ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨＲの両方が発現する動物細胞を、被験者から採取された血液試料存在下でインキュベートする工程；
（ｂ）工程（ａ）の後、前記ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを測定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で測定した活性化レベルと、対照における活性化レベルとを比較し、ＴＳＨＲ活性化レベルを算定する工程；
しかし、当該測定原理をオキシトシンの測定系に応用した知見は存在しない。

【0008】

Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換することで、オキシトシンへの親和性が向上するとの先行研究が存在している（非特許文献３）。しかし、当該報告は受容体の機能学的側面に対する研究であり、オキシトシンの測定法に応用するための研究・検討は一切行われてこなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【文献】特許第６４４５８６１号

【文献】特許第６７３４２５８号

【文献】ＷＯ２０２０／０５０２０８

【非特許文献】

【0010】

【文献】Szeto Angela et al, STATISTICS AND METHODS, Vol. 73, 5, 393-400, 2011

【文献】Arthur Lefevre et al, Scientific Reports, DOI:10.1038 / s41598‐017‐17674‐7

【文献】Rolf Postina et al. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 271, No. 49, December 6, 31593‐31601, 1996

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明の第一の課題は、既存のオキシトシン測定系に存在した、測定に放射性同位元素の利用が必要、反応に一晩程度の時間がかかる、前処理が必要である、という問題を解決することにある。

【0012】

さらに、本発明者らは、オキシトシン測定法の検討を行う中で、放射性同位元素を用いない測定系（例えば、特許文献３に記載の測定系）は、オキシトシン受容体の特性に起因してシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が低く、実用化に適さないことを確認した。

【0013】

本発明の第二の課題は、オキシトシン測定系のＳ／Ｎ比を改善し、実用的なオキシトシン測定系を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体及びｃＡＭＰバイオセンサーを用いることで、受容体の活性化シグナルを良好なＳ／Ｎ比で測定できることを見出した。さらに、検討を進めることにより、本発明を完成させた。

【0015】

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
[１]Ｖ２受容体の細胞外領域配列の一部をオキシトシン受容体の細胞外領域配列へと置換したキメラ受容体とｃＡＭＰバイオセンサーが発現されていることを特徴とする、動物細胞。
[２]Ｖ２受容体の第一細胞外領域配列をオキシトシン受容体の第一細胞外領域配列へと置換したキメラ受容体とｃＡＭＰバイオセンサーが発現されていることを特徴とする、動物細胞。
[３]Ｖ２受容体の第一・第二・第三細胞外領域配列をオキシトシン受容体の第一・第二・第三細胞外領域配列へと置換したキメラ受容体とｃＡＭＰバイオセンサーが発現されていることを特徴とする、動物細胞。
[４] [１]から[３]のいずれか１項に記載の動物細胞を含む、オキシトシン測定キット。
[５]Ｖ２受容体の細胞外領域配列の一部をオキシトシン受容体の細胞外領域配列へと置換したキメラ受容体を用いることを特徴とする、ｃＡＭＰバイオセンサーを用いたオキシトシン測定系のＳ／Ｎ比向上方法。

【発明の効果】

【0016】

本発明は、既存のオキシトシン測定系に存在した、測定に放射性同位元素の利用が必要、反応に一晩程度の時間がかかる、前処理が必要である、といった問題を解決することが可能である。さらに、本発明のキメラ受容体は、受容体の恒常活性が抑制されていることに起因して、Ｓ／Ｎ比が改善し、オキシトシン測定感度が向上している。この特性により、オキシトシンの迅速測定に好適に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１は、本明細書実施例１にて作製されたキメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１）－Ｖ２Ｒを示す模式図である。ＯＸＴＲ（Ｅ１）－Ｖ２Ｒでは、Ｖ２Ｒの第一細胞外領域（Ｅ１）配列がＯＸＴＲの第一細胞外領域（Ｅ１）配列に置換されている。Ｖ２Ｒに由来する部分は黒色で、ＯＸＴＲに由来する部分は点線／網かけで示されている。

【図2】図２は、本明細書実施例１にて作製されたキメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１）－Ｖ２Ｒについて、配列の由来を示したものである。キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１）－Ｖ２Ｒでは、第一細胞外領域（Ｅ１）配列がＯＸＴＲの第一細胞外領域（Ｅ１）配列に置換されている。ＯＸＴＲに由来する配列に下線が引かれている。

【図3】図３は、本明細書実施例１にて作製されたキメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒを示す模式図である。ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒでは、Ｖ２Ｒの第一、第二、第三細胞外領域（Ｅ１, Ｅ２, Ｅ３）配列がそれぞれＯＸＴＲの第一、第二、第三細胞外領域（Ｅ１, Ｅ２, Ｅ３）配列に置換されている。Ｖ２Ｒに由来する部分は黒色で、ＯＸＴＲに由来する部分は点線／網かけで示されている。

【図4】図４は、本明細書実施例１にて作製されたキメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒについて、配列の由来を示したものである。キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒでは、第一、第二、第三細胞外領域（Ｅ１, Ｅ２, Ｅ３）配列がそれぞれＯＸＴＲの第一、第二、第三細胞外領域（Ｅ１, Ｅ２, Ｅ３）配列に置換されている。ＯＸＴＲに由来する配列に下線が引かれている。

【図5】図５は、本明細書実施例１にて作製されたキメラ受容体ＯＸＴＲ－Ｖ２Ｒ（ＩＣ）を示す模式図である。ＯＸＴＲ－Ｖ２Ｒ（ＩＣ）では、ＯＸＴＲの第一、第二、第三、第四細胞内領域配列がそれぞれＶ２Ｒの第一、第二、第三、第四細胞内領域配列に置換されている。Ｖ２Ｒに由来する部分は黒色で、ＯＸＴＲに由来する部分は点線／網かけで示されている。

【図6】図６は、本明細書実施例１にて作製されたキメラ受容体ＯＸＴＲ－Ｖ２Ｒ（ＩＣ）について、配列の由来を示したものである。キメラ受容体ＯＸＴＲ－Ｖ２Ｒ（ＩＣ）では、ＯＸＴＲの第一、第二、第三、第四細胞内領域配列がそれぞれＶ２Ｒの第一、第二、第三、第四細胞内領域配列に置換されている。ＯＸＴＲに由来する配列に下線が引かれている。

【図7】図７は、本明細書実施例２の野生型Ｖ２Ｒ、野生型ＯＸＴＲ及びキメラ受容体における、オキシトシンを１０～１０００００ｐｇ／ｍＬ添加したときのＳ／Ｎ比（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を示している。縦軸はＳ／Ｎ比（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）の値を示している。横軸は添加したオキシトシン濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本明細書において、ＯＸＴＲおよびＶ２Ｒのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースに登録されているＯＸＴＲおよびＶ２Ｒアミノ酸配列であることとする。本明細書において、ＯＸＴＲおよびＶ２Ｒの由来はヒトに限定されないが、由来について特に記載のない場合、ＯＸＴＲおよびＶ２Ｒはヒト由来であることを意味する。ヒト由来ＯＸＴＲのアミノ酸配列を配列番号１に、ヒト由来Ｖ２Ｒのアミノ酸配列を配列番号２に示す。

【0019】

本明細書において、「Ｖ２Ｒの配列の一部がＯＸＴＲの配列へと置換される」とは、Ｖ２Ｒの２以上連続するアミノ酸配列が、対応するＯＸＴＲのアミノ酸配列に置換されていることを意味する。

【0020】

本明細書において、「Ｖ２受容体の細胞外領域配列」とは、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースに登録されているＯＸＴＲおよびＶ２Ｒの細胞膜貫通領域で分断されるアミノ酸配列区画の１，３，５，７番目であることとする。ただし、Ｖ２Ｒの２番目の細胞膜貫通領域はＯＸＴＲおよびＶ２Ｒのアラインメントの結果、８９番目のＡｌａまでとした。

【0021】

本明細書において、ＯＸＴＲおよびＶ２Ｒの細胞膜貫通領域で分断されるアミノ酸配列区画の１番目、すなわちＮ末端から１番目の細胞外領域を第一細胞外領域と定義し、Ｅ１と表記することがある。同様に、ＯＸＴＲおよびＶ２Ｒの細胞膜貫通領域で分断されるアミノ酸配列区画の３番目、すなわちＮ末端から２番目の細胞外領域を第二細胞外領域と定義しＥ２と表記し、細胞膜貫通領域で分断されるアミノ酸配列区画の５番目を第三細胞外領域と定義しＥ３と表記することがある。

【0022】

本明細書において、Ｖ２ＲのＥ１配列をＯＸＴＲのＥ１配列へと置換したキメラ受容体を、ＯＸＴＲ（Ｅ１）－Ｖ２Ｒと表記することがある。同様に、Ｖ２ＲのＥ１、Ｅ２、Ｅ３配列をそれぞれＯＸＴＲのＥ１、Ｅ２、Ｅ３配列へと置換したキメラ受容体を、ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒと表記することがある。

【0023】

本明細書において、「ｃＡＭＰレベル」とは、キメラ受容体に起因して哺乳動物細胞内で産生されるｃＡＭＰ量を意味し、以下に記載の方法で測定した際のＲＬＵと定義する。

【0024】

［使用動物細胞］ヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）（ＥＣＡＣＣ［European Collection of Authenticated Cell Cultures］より入手、Cat no. 85120602）。

【0025】

［使用ベクター］GloSensor cAMP、すなわち、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase）の３５９～５４４番目のアミノ酸残基と、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の制御サブユニットのｃＡＭＰ結合領域と、ホタルルシフェラーゼの４～３５５番目のアミノ酸残基とを含むタンパク質が発現するプラスミドベクター（pGloSensor-22F、Promega社製）と、野生型ヒトＶ２Ｒを発現するベクターpYS_CMV_V2R_Puro。なお、以下に記載の方法において、pYS_CMV_V2R_Puroの代わりに、適宜キメラ受容体が発現するpYS_CMVベクターを用いることもある。

【0026】

[細胞調製法]
〔１〕１．５×１０^４個のＨＥＫ２９３細胞を１０％ＦＢＳ含有Ｄ－ＭＥＭ培地に播種し、２４時間培養する。
〔２〕pGloSenso-22FとpYS_CMV_V2R_Puroを、PEI MAX（Polyscience社製）を用いて１：４の比率で混合、２０分静置した後、ＨＥＫ２９３細胞に添加してトランスフェクションする。
〔３〕トランスフェクションされた細胞を２４時間培養した後、受容体刺激物質（例えばオキシトシンやオキシトシンを含む検体）の添加により発光強度の増加が見られるものを選抜する。

【0027】

[活性測定条件]
〔１〕細胞を２４時間培養した後、細胞を回収、インキュベート用液に６．０×１０^５cells/mLとなるよう置換し、９６ウェルハーフエリアホワイトプレート（Corning社製）に２６μＬずつ分注する。８ｍＭ D-Luciferin（OZBIOACIENCE社製、１０ｍＭ HEPES-KOH, ｐＨ７．５で溶解）を１０μLずつ加え、室温で２時間平衡化処理を行う。
〔２〕オキシトシンを添加し、２０分間インキュベーションした後、ルミノメーターを用いてＲＬＵを測定する。測定されたＲＬＵを、ｃＡＭＰレベルと定義する。

【0028】

なお、本明細書におけるｃＡＭＰレベルの測定法は、上記測定法と同等性が担保される範囲内で、適宜改変することもできる。

【0029】

本明細書において、「受容体活性化レベル」とは、オキシトシンに対するＶ２Ｒあるいはキメラ受容体の応答性を意味し、哺乳動物細胞中のオキシトシン非添加条件のＲＬＵに対する、オキシトシン存在下におけるｃＡＭＰレベルの比（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）によって定義される。

【0030】

本明細書において、「シグナル／ノイズ比」及び「Ｓ／Ｎ比」、「Ｓ／Ｎ ｒａｔｉｏ」とは、前記ｃＡＭＰレベル測定法に従いＶ２Ｒあるいはキメラ受容体を一過性発現する株において、オキシトシンを添加したときの、受容体活性化レベルを意味する。ある濃度Ｘ（ｐｇ／ｍＬ）のオキシトシンを添加したときの受容体活性化レベルをＸ（ｐｇ／ｍＬ）におけるＳ／Ｎ比と定義する。

【0031】

本明細書において、「Ｓ／Ｎ比が高い（低い）」とは、あるオキシトシン濃度において、一方のＳ／Ｎ比が、他方の１．２倍以上高い（低い）ことを意味する。すなわち、ある濃度Ｘ（ｐｇ／ｍＬ）において、キメラ受容体がＶ２ＲよりもＳ／Ｎ比が高いといったときには、Ｘ（ｐｇ／ｍＬ）におけるキメラ受容体のＳ／Ｎ比が、Ｘ（ｐｇ／ｍＬ）におけるＶ２ＲのＳ／Ｎ比よりも１．２倍以上であることを意味する。キメラ受容体のＳ／Ｎ比が高いことは、そのキメラ受容体をオキシトシン測定系に用いた場合、感度及び鑑別能力に優れていることを意味する。

【0032】

本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドもしくは塩基、又はそれらの等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。ヌクレオチド及び塩基は、ＤＮＡ塩基又はＲＮＡ塩基を含む。上記の等価物は、例えばＤＮＡ塩基又はＲＮＡ塩基がメチル化等の化学修飾を受けているもの、又はヌクレオチドアナログを含む。ヌクレオチドアナログは、非天然のヌクレオチドを含む。
「ＤＮＡ鎖」とは、ＤＮＡ塩基又はそれらの等価物が２個以上連結した形態のことを表す。
「ＲＮＡ鎖」とは、ＲＮＡ塩基又はそれらの等価物が２個以上連結した形態のことを表す。

【0033】

本明細書において「ベクター」は、例えば大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１２、ｐＥＴ－Ｂｌｕｅ－２）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５）、酵母由来プラスミド（例えばｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、動物細胞発現プラスミド（例えばｐＡ１－１１、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）、λファージなどのバクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルスなどのウイルス由来のベクターなどを用いることができる。これらのベクターは、プロモーター、複製開始点、又は抗生物質耐性遺伝子など、タンパク質発現に必要な構成要素を含んでいてもよい。ベクターは発現ベクターであってもよい。

【0034】

本明細書において「ｃＡＭＰバイオセンサー」とは、哺乳動物細胞中のｃＡＭＰの産生量及び／又は濃度に依存し、可視化（イメージング）及び／又は定量可能な、自身に由来する指標（例えば、酵素活性レベル、発色レベル、発光［蛍光］レベル）が変化するタンパク質を意味する。上記ｃＡＭＰバイオセンサーは、通常、ｃＡＭＰ結合領域を有し、かかるｃＡＭＰ結合領域にｃＡＭＰが結合することにより、ｃＡＭＰバイオセンサーの立体構造が変化し、不活性化状態から活性化状態への変化、不可視化状態から可視化状態への変化等のアロステリックな効果を有する。

【0035】

本発明の一態様は、Ｖ２受容体の細胞外領域配列の一部をオキシトシン受容体の細胞外領域配列へと置換したキメラ受容体を発現し、細胞内にｃＡＭＰバイオセンサーを有することを特徴とする、動物細胞である。Ｖ２Ｒの配列中に含まれるＯＸＴＲの配列は、連続する２以上のアミノ酸配列である必要があり、５以上のアミノ酸配列であることが好ましく、１０以上のアミノ酸配列であることがより好ましく、２０以上のアミノ酸配列であることがより好ましい。一方、受容体の機能を保持する観点から、置換される領域はアミノ酸配列全体の５０％以下であることが好ましい。

【0036】

本発明に係るキメラ受容体は、ｃＡＭＰバイオセンサーを用いてオキシトシンを測定する際に、低濃度域（１０ｐｇ／ｍＬ）、中濃度域（１００ｐｇ／ｍＬ）、高濃度域（１０００ｐｇ／ｍＬ）の少なくとも１つの濃度域において、Ｓ／Ｎ比が向上している。当該キメラ受容体は、Ｓ／Ｎ比が向上している濃度域において感度よく受容体活性化レベルを測定できるため、好適にオキシトシンの測定に用いることができる。

【0037】

本発明に係る置換は、機能的ないし構造的な単位で行われることが、受容体の機能保持の観点から好ましい。機能的ないし構造的な単位の例としては、タンパク質のドメインなどが挙げられ、具体的には細胞膜貫通領域、細胞外領域、細胞内領域などが挙げられる。

【0038】

本発明に係る置換の中でも、Ｓ／Ｎ比が向上することが後述の実施例にて実証されていることから、少なくともＶ２ＲのＥ１配列がＯＸＴＲのＥ１配列に置換されていることがより好ましい。中でも、低濃度域のオキシトシンを感度良く測定できることから、Ｅ１, Ｅ２, Ｅ３がいずれも置換されていることがより好ましい。

【0039】

今回我々は当該置換により、オキシトシン未添加時のｃＡＭＰレベル、すなわち受容体の恒常活性が低下することで、結果的にオキシトシン測定系のＳ／Ｎ比が向上して、オキシトシン測定感度が向上することを明らかにした。

【0040】

本願発明の特徴は、後述する実施例２に記載するように、オキシトシン添加時のｃＡＭＰレベルは、特に低濃度域においてＶ２Ｒ受容体よりも低下するが、それ以上にオキシトシン非添加時のｃＡＭＰレベル（受容体の恒常活性）が低下することで、オキシトシン測定系のＳ／Ｎ比を向上させ、オキシトシン測定系の感度を向上させることである。
これに対し、非特許文献４においては、Ｖ２ＲやＯＸＴＲ、キメラ受容体の恒常活性について、一切の記載がない。
さらに、非特許文献４には、Ｖ２Ｒの配列の一部をＯＸＴＲの配列へと置換することで、受容体のオキシトシンに対する親和性が向上することが記載されているが、この場合、親和性向上に伴いオキシトシン添加時のｃＡＭＰレベルは増大すると考えられる。
一方、本願発明においては、この考えに反し、特にオキシトシン低濃度域において、置換前と比較してｃＡＭＰレベルは低下している。
すなわち、本願発明の効果は、非特許文献４に記載の内容からは全く予想することのできない顕著なものであった。

【0041】

本発明に用いることができるＯＸＴＲおよびＶ２Ｒは、オキシトシンなどの測定対象に反応を示す限りにおいて、その由来に制限はない。動物細胞にて発現した際にヒトのＯＸＴＲおよびＶ２Ｒと近い反応性を示すことから、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等由来の細胞を例示することができる。中でも、生体内のオキシトシンなどのリガンドに対する受容体活性を比較的よく反映できる点から、ヒトＯＸＴＲ（配列番号１）及びヒトＶ２Ｒ（配列番号２）であることがより好ましい。

【0042】

本発明のキメラ受容体は、これまで記載した変異の他に、ＯＸＴＲ活性の顕著な低下やＳ／Ｎ比の顕著な低下を引き起こさない範囲内で、さらにアミノ酸配列を欠失、置換、挿入もしくは付加する変異を有していても良い。一般に、特に活性と直接的に関与しない部位において、１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、又は他のアミノ酸による置換を受けたポリペプチドが、その生物学的活性を維持しうる(Mark et al., Proc Natl Acad Sci U S A.1984 Sep;81(18):5662-5666.、Zoller et al., Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25;10(20):6487-6500.、Wang et al., Science. 1984 Jun 29;224(4656):1431-1433.)ことが知られている。

【0043】

本発明の実施形態に係るキメラ受容体が特定のアミノ酸配列を含むとき、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が化学修飾を受けていてもよい。そのような場合でも、本発明の実施形態に係るキメラ受容体は、特定のアミノ酸配列を含むといえる。一般的に、タンパク質に含まれるアミノ酸が生体内で受ける化学修飾としては、例えばＮ末端修飾（例えば、アセチル化 、ミリストイル化等）、Ｃ末端修飾（例えば、アミド化、グリコシルホスファチジルイノシトール付加等）、又は側鎖修飾（例えば、リン酸化、糖鎖付加等）等が知られている。

【0044】

本発明に係るポリヌクレオチドは、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて合成可能である。その他、ＤＮＡ塩基又はＲＮＡ塩基合成の受託会社（例えば、インビトロジェン社やタカラバイオ社等）から購入することもできる。本発明のポリヌクレオチド配列は、本発明のキメラ受容体のアミノ酸配列と、遺伝暗号表から、適宜設計することができる。

【0045】

前記ポリヌクレオチドを含むベクターは、一般に知られている分子生物学的手法によって調製することができ、その調製方法として、例えばＴＡクローニング法、平滑末端クローニング法、ライゲーション法、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニング法、Ｇａｔｅｗａｙクローニング法、アッセンブリ―法等が例示される。

【0046】

本発明の一態様である動物細胞は、前記ベクターの導入により、前記キメラ受容体が一過的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）又は安定的（ｓｔａｂｌｅ）に発現する動物細胞であればよい。使用される細胞株に特に限定は無いが、購入や実験のし易さの点から、ヒト胎児腎細胞由来細胞株［ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等］、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株［ＣＨＯ細胞］、ヒト骨肉腫細胞株［Ｕ２ＯＳ細胞］が好ましく、中でも遺伝子導入効率や安定増殖の点からヒト胎児腎細胞由来細胞株［ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等］、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株［ＣＨＯ細胞］がより好ましい。

【0047】

本発明の動物細胞は、この分野で一般的に用いられている遺伝子工学的手法により作製することができる。例えば、プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス［ＣＭＶ］のＩＥ［immediate early］遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０［Simian virus 40］の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、ＨＩＦプロモーター）と、かかるプロモーターの下流に作動可能に連結されているＴＳＨ受容体をコードする遺伝子を含むベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＭ８、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＳ３－３、ｐＣＤＭ８）を、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ（Diethylaminoethyl）デキストラン法、ウイルス感染法等の方法を用いて、哺乳動物細胞へ導入（トランスフェクション）することにより得ることができる。リガンドの測定に用いられるために、適宜キメラ受容体をコードする遺伝子以外の遺伝子が導入されていても良く、例えばｃＡＭＰバイオセンサーをコードする遺伝子が導入されていても良い。

【0048】

本発明に用いることのできるｃＡＭＰバイオセンサーとしては、例えば、ｃＡＭＰ結合領域（例えば、プロテインキナーゼＡ［ＰＫＡ］の制御サブユニット由来のｃＡＭＰ結合領域、Ｅｐａｃ１由来のｃＡＭＰ結合領域）を含むレポータータンパク質（例えば、ＨＲＰ［horseradish peroxidase］；アルカリホスファターゼ；β－Ｄ－ガラクトシダーゼ；緑色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＧ］、橙色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＯ］、赤色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＲ］等のルシフェラーゼ；緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］、赤色蛍光タンパク質［ＤｓＲｅｄ］、シアン色蛍光タンパク質［ＣＦＰ］等の蛍光タンパク質）を挙げることができ、具体的には、ＰＫＡの制御サブユニット由来のｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼであるGloSensor cAMP（Promega社製）や、Ｅｐａｃ１由来のｃＡＭＰ結合領域を含む赤色蛍光タンパク質であるPink Flamindo（Pink Fluorescent cAMP indicator）（文献「Harada K., et al., Sci Rep. 2017 Aug 4;7(1):7351. doi: 10.1038/s41598-017-07820-6.」参照）を挙げることができ、本実施例において、その効果が実証されているため、GloSensor cAMP（Promega社製）が好ましい。

【0049】

本発明の一態様は、前記キメラ受容体を発現する動物細胞を含む、オキシトシンの測定キットである。

【0050】

本発明の一態様であるオキシトシン測定キットは、常用されている試薬を適宜用いることができる。一例として、動物細胞液、発光基質液、反応プレート、標準液、希釈液のようなキット構成が考えられる。 ｃＡＭＰバイオセンサーの可視化及び／又は定量が可能な基質としては、例えば、上記ｃＡＭＰバイオセンサーがアルカリホスファターゼの場合、ｐ－ニトロフェニルリン酸を挙げることができ、上記ｃＡＭＰバイオセンサーがβ－Ｄ－ガラクトシダーゼである場合、Ｘ－ｇａｌ(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside)、ＯＮＰＧ（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）を挙げることができ、上記ｃＡＭＰバイオセンサーがルシフェラーゼである場合、ルシフェリン、セレンテラジンを挙げることができる。

【0051】

本発明の一態様は、Ｖ２受容体の細胞外領域配列の一部をオキシトシン受容体の細胞外領域配列へと置換したキメラ受容体を用いることを特徴とする、ｃＡＭＰバイオセンサーを用いたオキシトシン測定系のＳ／Ｎ比向上方法である。ｃＡＭＰバイオセンサーを用いたオキシトシン測定に、Ｖ２受容体の細胞外領域配列の一部をオキシトシン受容体の細胞外領域配列へと置換したキメラ受容体を用いることで、Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。

【0052】

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

【実施例】

【0053】

実施例１．キメラ受容体の調製
以下に示す方法に従い、野生型Ｖ２Ｒ及びＯＸＴＲをもとに、各キメラ受容体を調製した。

【0054】

１－１．キメラ受容体の設計
Ｖ２Ｒの細胞外領域をＯＸＴＲの細胞外領域に置換した以下のキメラ受容体を検討した。
ＯＸＴＲ（Ｅ１）－Ｖ２Ｒ：配列番号３
ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒ：配列番号４
また、比較対象として、ＯＸＴＲの細胞内領域をＶ２Ｒの細胞内領域に置換した以下のキメラ受容体についても、検討した。
ＯＸＴＲ－Ｖ２Ｒ（ＩＣ）：配列番号５

【0055】

キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１）－Ｖ２Ｒのタンパク質構造を、図１に模式的に示す。当該タンパク質のアミノ酸配列について、配列番号３に示す。当該タンパク質のアミノ酸配列の由来について、図２に示す。

【0056】

同様に、キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒのタンパク質構造を、図３に模式的に示す。当該タンパク質のアミノ酸配列について、配列番号４に示す。当該タンパク質のアミノ酸配列の由来について、図４に示す。
キメラ受容体ＯＸＴＲ－Ｖ２Ｒ（ＩＣ）のタンパク質構造を、図５に模式的に示す。当該タンパク質のアミノ酸配列について、配列番号５に示す。当該タンパク質のアミノ酸配列の由来について、図６に示す。

【0057】

１－２．キメラ受容体の発現ベクター調製
１－１．に記載したキメラ受容体に対応するよう、野生型ヒトＶ２Ｒを発現するベクターpYS_CMV_V2R_Puroの内、置換したい領域の外側に向けて３’側と５’側に２０～３０ｍｅｒの人工プライマーを設計し、タカラバイオ社PrimeStarHS（Ｃｏｄｅ Ｎｏ. Ｒ０１０Ａ）によるＰＣＲ増幅を行った。また、野生型ヒトＯＸＴＲを発現するベクターpFN21AE0658（かずさＤＮＡ研究所）の、置換したい領域の内側に向けて３’側と５’側に人工プライマーを設計するが、その際Ｖ２Ｒの置換領域の外側に重複する配列を１５～２５ｍｅｒほど付加しておき、当該プライマーを用いてNEB社Q5 Hot Start High Fidelity DNA Polymerase（Code No. M0494S）でＰＣＲ増幅を行った。これらＰＣＲをタカラバイオ社Nucleospin Gel and PCR Clean-up（Code No. 740609.250）で精製した後、NEB社NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix（Code No. E2621S）によるアッセンブリ―法でベクター構築を行い、コンピテントセルDH5αに形質転換した。ＯＸＴＲ－Ｖ２Ｒ（ＩＣ）については、人工遺伝子合成した配列を上記同様に、アッセンブリ―法で発現ベクターを構築し、コンピテントセルＤＨ５αに形質転換した。プラスミドを形質転換した大腸菌シングルコロニーをコロニーＰＣＲにて目的配列の置換を確認、さらに精製したプラスミドのシーケンス解析により目的配列の置換を確認した。

【0058】

１－３．キメラ受容体一過性発現細胞株の取得
１．５×１０^４個のヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）（ＥＣＡＣＣ［European Collection of Authenticated Cell Cultures］より入手、Cat no. 85120602）を、１０％ＦＢＳ含有Ｄ－ＭＥＭ培地とともに６ウェルマルチプレートに播種し、２４時間培養した。
１－２．にて取得したキメラ受容体ベクター０.５μｇと、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase）の３５９～５４４番目のアミノ酸残基と、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の制御サブユニットのｃＡＭＰ結合領域と、ホタルルシフェラーゼの４～３５５番目のアミノ酸残基とを含むタンパク質が発現するプラスミドベクター（pGloSenso-22F、Promega社製）１．５μｇを、PEI MAX（Polyscience社製）と１：４の比率で混合、２０分静置した後、ＨＥＫ２９３細胞に添加してトランスフェクションした。上記操作によって、キメラ受容体を一過性発現する、ＨＥＫ２９３細胞を取得した。

【0059】

キメラ受容体の一過性発現株に対する対照として用いるため、１－２記載の野生型ヒトＶ２Ｒおよび野生型ヒトＯＸＴＲの発現ベクターにより、野生型ヒトＶ２Ｒおよび野生型ヒトＯＸＴＲ一過性発現株も取得した。

【0060】

実施例２．キメラ受容体のオキシトシンに対する活性測定
実施例１にて得られたキメラ受容体ないし野生型ヒトＶ２Ｒおよび野生型ヒトＯＸＴＲを一過性発現するＨＥＫ２９３細胞に、オキシトシンを添加して、各キメラ受容体のＳ／Ｎ比を測定した。

【0061】

測定法は以下の通りである。
[測定条件]
キメラ受容体を一過性発現するＨＥＫ２９３細胞及び野生型ヒトＶ２Ｒおよび野生型ヒトＯＸＴＲを一過性発現するＨＥＫ２９３細胞を２４時間培養後、細胞を回収、インキュベート用液に６．０×１０^５cells/mLとなるよう置換し、９６ウェルハーフエリアホワイトプレート（Corning社製）に２６μLずつ分注した。８ｍＭ D-Luciferin（OZBIOACIENCE社製、１０ｍＭ HEPES-KOH, ｐＨ７．５で溶解）を１０μＬずつ加え、遮光して室温で２時間静置した。２時間後、オキシトシンを０、０．１、１、１０、１００、１０００、１００００、１０００００ｐｇ／ｍＬとなるよう添加、２０分間インキュベーションした後のＲＬＵ値を９６ウェルマルチプレートルミノメーター（Promega社製）で測定した。

【0062】

各キメラ受容体の各濃度におけるＳ／Ｎ比（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を、図７及び表１に示す。

【0063】

【表1】

【0064】

上記結果より、ＯＸＴＲ（Ｅ１）－Ｖ２Ｒ、ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒのキメラ受容体において、野生型ヒトＶ２Ｒよりも複数濃度域におけるＳ／Ｎ比が向上していることが読み取れる。ＯＸＴＲ－Ｖ２Ｒ（ＩＣ）や野生型ＯＸＴＲでは、オキシトシン濃度依存的なＳ／Ｎ比の上昇は見られなかった。

【0065】

上記キメラ受容体の中でも、特にＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒにおいて、野生型ヒトＶ２Ｒよりも１０～１０００００ｐｇ／ｍＬにおけるＳ／Ｎ比が向上していることが読み取れる。Ｓ／Ｎ比１．５以上の濃度を測定可能と判定すると、野生型Ｖ２Ｒは１０００ｐｇ／ｍＬ以上で測定可能である一方、ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒでは１０ｐｇ／ｍＬ以上で測定可能となり、オキシトシン測定感度がおおよそ１００倍向上した。

【産業上の利用可能性】

【0066】

本発明は、オキシトシンの迅速な測定に資するものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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