特許 7448219 ＡＤＡＭ１０の生物学的活性を阻害するための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-04

(45)【発行日】2024-03-12

(54)【発明の名称】ＡＤＡＭ１０の生物学的活性を阻害するための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/705 20060101AFI20240305BHJP

   C12N 9/50 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 15/57 20060101ALI20240305BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240305BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240305BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240305BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20240305BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240305BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20240305BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20240305BHJP

【ＦＩ】

C07K14/705 ZNA

C12N9/50

C12N15/12

C12N15/57

A61P43/00 111

A61P43/00 105

A61P35/00

A61P29/00

A61P37/08

A61P31/00

A61P17/02

A61P11/06

A61K38/17

A61K47/60

【請求項の数】 46

(21)【出願番号】P 2020520057

(86)(22)【出願日】2018-10-02

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-01-07

(86)【国際出願番号】 US2018053938

(87)【国際公開番号】W WO2019070685

(87)【国際公開日】2019-04-11

【審査請求日】2021-10-01

(31)【優先権主張番号】62/589,842

(32)【優先日】2017-11-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/566,580

(32)【優先日】2017-10-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】520116791

【氏名又は名称】ヴェラ セラピューティクス エルエルシー

【住所又は居所原語表記】１２７ Ａｓｂｕｒｙ Ｒｄ．，Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ １４８８２，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】マルシア エル モス

(72)【発明者】

【氏名】ロバート ラスムッセン

(72)【発明者】

【氏名】クリス プリンス

【審査官】植原 克典

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１３／００５９７８８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１２／０６４８６５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Furin is an endogenous regulator of α-secretase associated APP processing，Biochemical and Biophysical Research Communications，2006年，Vol. 349，p. 654-659

【文献】The substrate degradome of meprin metalloproteases reveals an unexpected proteolytic link between meprin β and ADAM10，Cellular and Molecular Life Sciences，2013年，Vol. 70，p. 309-333

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３８／００－ ３８／５８

Ａ６１Ｋ ４７／００－ ４７／６９

Ａ６１Ｐ １／００－ ４３／００

Ｃ０７Ｋ １／００－ １９／００

Ｃ１２Ｎ ９／００－ ９／９９

Ｃ１２Ｎ １５／００－ １５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＡＤＡＭ１０活性を特異的に調節するＡＤＡＭ１０調節ペプチドであって、
前記ＡＤＡＭ１０調節ペプチドがフリンによる切断に対して感受性が低く、かつメプリンによる切断に対して感受性が低くなるように、配列番号１のアミノ酸配列を含み、かつアミノ酸位置２６～２９のうちの少なくとも１つのフリン認識部位にアミノ酸置換、および配列番号１のアミノ酸位置５２～５５のうちの少なくとも１つのフリン認識部位にアミノ酸置換、および少なくとも１つのメプリン認識部位にアミノ酸置換をさらに含む、ＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項2】

前記ＡＤＡＭ１０調節ペプチドがメプリンによる切断に対して感受性が低くなるように、（ｉ）配列番号１のアミノ酸位置３４～３６、（ｉｉ）アミノ酸位置６２および／または６３、（ｉｉｉ）アミノ酸位置８８および／または８９、（ｉｖ）アミノ酸位置１３６～１３８、（ｖ）アミノ酸位置１６９および／または１７０、または（ｖｉ）アミノ酸位置１７６～１７８のうちの少なくとも１つのメプリン認識部位にアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項3】

配列番号１のシステイン１５１の修飾をさらに含み、該システイン１５１が、アラニン、セリン、グリシンまたはスレオニンで置換されているかまたはペグ化されている、請求項１または２に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項4】

前記ＡＤＡＭ１０調節ペプチドが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項5】

少なくとも１つの修飾が、
（ｉ）配列番号３の位置２６、２８および２９の１またはそれ以上のアラニン、セリン、グリシンまたはリシン、
（ｉｉ）配列番号３の位置５２、５４および５５の１またはそれ以上のアラニン、セリン、グリシンまたはリシン、
（ｉｉｉ）配列番号３の位置８８および８９の一方または両方にアラニン、セリン、グリシンまたはアスパラギン置換、
（ｉｖ）配列番号３の位置１７６～１７８に１またはそれ以上のアラニン、セリン、グリシンまたはアスパラギン置換、および
（ｖ）配列番号３のシステイン１５１にアラニン、セリン、グリシンまたはスレオニン置換、
またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項6】

前記ＡＤＡＭ１０調節ペプチドが、配列番号３の位置２６、２８または２９の１またはそれ以上にアラニン、配列番号３の位置５２、５４または５５の１またはそれ以上にアラニン、またはそれらの任意の組み合わせを含むアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項7】

配列番号３において、アミノ酸位置２９および５５の一方または両方が、アラニンおよびリジンからなる群から独立して選択される、請求項４に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項8】

前記ＡＤＡＭ１０調節ペプチドが、さらに、配列番号３の位置８８、８９、１７７および１７８の１またはそれ以上に、またはそれらの任意の組み合わせに、アラニンを含む、請求項７に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項9】

前記ＡＤＡＭ１０調節ペプチドが、さらに、アミノ酸１５１のシステインに修飾を含み、該修飾が、該システインのセリン、グリシン、アラニンまたはスレオニンによる置換、および該システインのペグ化からなる群から選択される、請求項７に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項10】

前記アミノ酸１５１がセリンである、請求項９に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項11】

前記システイン１５１がペグ化されている、請求項９に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項12】

前記ＡＤＡＭ１０調節ペプチドが、さらに、アミノ酸１５１のシステインに修飾を含み、該修飾が、該システインのセリン、グリシン、アラニンまたはスレオニンによる置換、および該システインのペグ化からなる群から選択される、請求項８に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項13】

前記アミノ酸１５１がセリンである、請求項１２に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項14】

前記システイン１５１がペグ化されている、請求項１２に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項15】

配列番号３において、アミノ酸位置２９および５５の一方または両方が、セリン、グリシンおよびスレオニンからなる群から独立して選択される、請求項４に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項16】

配列番号３のアミノ酸位置１５１がセリン、グリシン、アラニンまたはスレオニンである、請求項４に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項17】

配列番号３のアミノ酸位置１５１がペグ化されている、請求項４に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項18】

Ｎ末端、Ｃ末端またはこれらの両方がペグ化されている、請求項４に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項19】

配列番号３において、
（ｉ）アミノ酸位置２６はアルギニンではなく、アミノ酸位置２７はアラニンではなく、アミノ酸位置２８はリジンではなく、および／またはアミノ酸位置２９はアルギニンではない、および／または
（ｉｉ）アミノ酸位置５２はアルギニンではなく、アミノ酸位置５３はメチオニンではなく、アミノ酸位置５４はリジンではなく、および／またはアミノ酸位置５５はアルギニンではない、および／または
（ｉｉｉ）アミノ酸位置３４はグルタミン酸ではなく、アミノ酸位置３５はアスパラギン酸ではなく、および／またはアミノ酸位置３６はグルタミンではない、
（ｉｖ）アミノ酸位置６２はアスパラギン酸ではなく、および／またはアミノ酸位置６３はグルタミン酸ではない、および／または
（ｖ）アミノ酸位置８８は、アラニン、セリン、グリシン、スレオニンおよびアスパラギンからなる群から選択され、および／またはアミノ酸位置８９は、アラニン、セリン、グリシン、スレオニンおよびアスパラギンからなる群から選択される、および／または
（ｖｉ）アミノ酸位置１３６はグルタミン酸ではなく、アミノ酸位置１３７はアスパラギン酸ではなく、および／またはアミノ酸位置１３８はアスパラギン酸ではない、および／または
（ｖｉｉ）アミノ酸位置１５１がシステインではない、および／または
（ｖｉｉｉ）アミノ酸位置１６９がグルタミン酸ではなく、および／またはアミノ酸位置１７０がグルタミン酸ではない、および／または
（ｉｘ）配列番号３のアミノ酸位置１７６～１７８は、それぞれ独立して、グルタミン、アラニン、セリン、グリシン、スレオニンおよびアスパラギンからなる群から選択される、ただし、該アミノ酸配列の位置１７６～１７８がグルタミン／グルタミン酸／グルタミン酸ではない、
請求項４に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項20】

位置１５１のアミノ酸がセリン、グリシン、アラニンおよびスレオニンからなる群から選択される、請求項１９に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項21】

Ｎ末端、Ｃ末端、位置１５１のシステイン、またはそれらの任意の組み合わせがペグ化されている、請求項１９に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項22】

前記ＡＤＡＭ１０調節ペプチドが、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸位置２６～２９および５２～５５のフリン認識部位の両方、並びに
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸位置８８および／または８９、およびアミノ酸位置１７６～１７８のメプリン認識部位を不活性化する、
複数の修飾を含む、請求項１に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項23】

前記ＡＤＡＭ１０調節ペプチドが、配列番号５～５４、５６、または５８～７１、８１４のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項24】

前記ＡＤＡＭ１０調節ペプチドが、さらに、配列番号１のＮ末端、Ｃ末端、アミノ酸位置１５１またはそれらの任意の組み合わせにおいてＰＥＧ部分を含む、請求項２３に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項25】

前記ＡＤＡＭ１０調節ペプチドが、配列番号５～５６、または５８～７１、８１４のいずれかと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項26】

配列番号５～６、２８１のアミノ酸配列について、配列番号３で定義されるアミノ酸位置２６、２８、２９、３４～３６、５２、５４、５５、６２、６３、８８、８９、１３６～１３８、１５１、１６９～１７８、１８２および１８３において１またはそれ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項27】

配列番号５、６、９、３４、３６および６２～７１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、ＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項28】

前記ペプチドが、配列番号６２または配列番号６３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項29】

配列番号５、６、９、３４、３６および６２～７１のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、ＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項30】

前記アミノ酸配列が、配列番号６２または６３と少なくとも９０％同一である、請求項２９に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項31】

前記アミノ酸配列が、そのＮ末端、Ｃ末端またはこれらの任意の組み合わせにおいて、内部へ、少なくとも１つのシステインの導入を含み、該少なくとも１つの導入されたシステインが、配列番号５、６、９、３４、３６および６２～７１の１またはそれ以上のアミノ酸の置換、配列番号５、６、９、３４、３６および６２～７１のいずれか１つへのシステインの挿入、またはそれらの任意の組み合わせから生じる、請求項２９に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項32】

前記導入されたシステインがペグ化されている、請求項３１に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項33】

前記ペグ化され導入されたシステインが、配列番号５、６、９、３４、３６および６２～７１のいずれか１つの最初の２０のアミノ酸内、または配列番号５、６、９、３４、３６および６２～７１のいずれか１つの最後の２０のアミノ酸内に存在する、請求項３２に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項34】

前記ＡＤＡＭ１０調節ペプチドが、保存的アミノ酸置換、非天然アミノ酸置換、アミノ酸置換から形成されたＤ－またはＤ、Ｌ－ラセミ混合物異性体、アミノ酸化学的置換、カルボキシまたはアミノ末端修飾、１またはそれ以上のグリコシル基の付加、分子（脂肪酸、ＰＥＧ、糖、蛍光分子、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドの精製および／または単離に使用できるタグ、および抗体またはそのパラトープ含有フラグメントまたはその誘導体からなる群から選択される）への結合、および発色団または放射性核種への結合、からなる群から選択される１またはそれ以上の修飾を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチド。

【請求項35】

請求項１に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチドを含む組成物。

【請求項36】

請求項１に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチドおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。

【請求項37】

前記医薬組成物がヒトにおける使用のために医薬的に許容される、請求項３６に記載の医薬組成物。

【請求項38】

インビトロでＡＤＡＭ１０の生物学的活性を調節する方法であって、ＡＤＡＭ１０ポリペプチドを含む溶液または細胞を、請求項１～３３のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチドまたは請求項３５～３７のいずれか一項に記載の組成物と接触させる段階を含み、該接触させる段階が、該ＡＤＡＭ１０ポリペプチドを、ＡＤＡＭ１０ポリペプチドの生物学的活性を調節するのに十分な量のＡＤＡＭ１０調節ペプチドと接触させる段階を含む、方法。

【請求項39】

請求項１～３３のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチドを含む、インビボでＡＤＡＭ１０の生物学的活性を阻害するための組成物。

【請求項40】

前記ＡＤＡＭ１０調節ペプチドがペグ化されている、請求項３９に記載の組成物。

【請求項41】

請求項１～３３のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチドを含む、患者における疾患、障害または症状に関連するＡＤＡＭ１０の生物学的活性を阻害するための組成物であって、該疾患、障害または症状が、癌、炎症、アレルギー反応、狼瘡、喘息、感染症および線維症からなる群から選択される、組成物。

【請求項42】

前記疾患、障害または症状が、少なくとも部分的に、ＡＤＡＭ１０の生物学的活性に関連する過剰な細胞増殖に起因する、請求項４１に記載の組成物。

【請求項43】

前記疾患、障害または症状が、少なくとも部分的に、過剰なＡＤＡＭ１０の生物学的活性またはタンパク質の存在を特徴とする、請求項４１に記載の組成物。

【請求項44】

インビトロにおける細胞からのＡＤＡＭ１０基質の放出を阻害する方法であって、該細胞を、該細胞からのＡＤＡＭ１０基質の放出を阻害するのに十分な量の請求項１～３３のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチドと接触させる段階を含む方法。

【請求項45】

前記ＡＤＡＭ１０基質が、ＣＤ２３、ＩＬ６－Ｒ、ＥＧＦ、Ｈｅｒ－２、ＨＢ－ＥＧｆ、ベータセルリン、ジャギド１、Ｎｏｔｃｈ受容体１、Ｎｏｔｃｈ受容体３、ＲＡＧＥ、フラクタルカイン、ＭＩＣＡ Ａ、Ｉ－ＴＡＣ、ＨＧＦＲ、ＧＩＴＲ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＧＦ可溶性受容体およびＴＧＦベータからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

請求項１～３３のいずれか一項に記載のＡＤＡＭ１０調節ペプチドを含む、患者に存在する細胞からのＡＤＡＭ１０基質の放出を阻害するための組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照

【0002】

本出願は、２０１７年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６２／５６６，５８０号および２０１７年１１月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／５８９，８４２号の利益を主張する。これらの出願の各々の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本発明は、ＡＤＡＭ１０の生物学的活性の阻害に関する組成物および方法に関する。特に、本発明は、修飾の結果として、フリンおよびフリン様プロテアーゼならびにメプリンおよびメプリン様プロテアーゼによる切断に対して高い安定性を示す、修飾ＡＤＡＭ１０プロドメインペプチドに関する。さらに、本発明は、この修飾ＡＤＡＭ１０プロドメインペプチドの細胞アッセイにおける使用に関し、かつこの修飾ＡＤＡＭ１０プロドメインペプチドの望ましくないＡＤＡＭ１０の生物学的活性に関連する疾患、障害および症状（例えば、癌、炎症、アレルギー反応、狼瘡、喘息、感染症、線維症など）を治療するための使用に関する。

【背景技術】

【0004】

ＡＤＡＭ１０は、ＴＡＣＥ（ＡＤＡＭ１７）、ＡＤＡＭ８およびＡＤＡＭ９などの酵素を含むディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）ファミリー（Ｅｄｗａｒｄｓら， ２００８）の１メンバーである。人間の場合、全部で３３のＡＤＡＭファミリーがある。これらのＡＤＡＭタンパク質は、適正な折りたたみのためおよび酵素が細胞を通過するために重要なプロドメイン、典型的なＨＥＸＸＨモチーフを含む触媒ドメイン、インテグリンと相互作用するために使用されるディスインテグリンドメイン、基質認識に重要であると考えられているシステインリッチ領域、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達現象に関与する細胞質側末端を含む。

【0005】

ＡＤＡＭファミリーのメンバーは、細胞からタイプＩおよびタイプＩＩの単一膜貫通タンパク質を切断して、さまざまな生理学的役割を持つ可溶性成熟タンパク質を生成することが知られている（Ｅｄｗａｒｄｓら， ２００８）。例えば、ＴＡＣＥは、ＴＧＦ－α、アンフィレグリンおよびＨＢ－ＥＧＦなどの可溶性上皮成長因子（ＥＧＦ）リガンドを生成することが知られている（Ｓａｈｉｎら， ２００４）。同様に、ＡＤＡＭ１０活性は可溶性タンパク質を生成し、この可溶性タンパク質には、ＥＧＦリガンド、ＥＧＦ、ＨＢ－ＥＧＦ、ベータセルリン（Ｓａｈｉｎら、２００４）、Ｎｏｔｃｈ、アミロイド前駆体タンパク質、エフリン、カドヘリン、プロトカドヘリン、ＣＸＣＬ１６、ＣＸ３ＣＬ１、ＨＥＲ２、ＡＸＬ、ｃＭＥＴ、およびＣＤ２３などのケモカイン、およびＩｇＥの低親和性受容体（Ｐｒｕｅｓｓｍｅｙｅｒ ＆ Ｌｕｄｗｉｇ， ２００９で概説されている）が含まれるがこれらに限定されない。ＡＤＡＭ１０活性の破壊は、インビボおよび細胞ベースの両アッセイにおいて、可溶性非アミロイド生成ＡＰＰの濃度を低下させることが示されており、ＡＤＡＭ１０活性の維持は、可溶性ＡＰＰ－αの正常プロセシングのためにアルツハイマー病において保護的な役割を果たす可能性があることを示唆している。これとは対照的に、過剰なＡＤＡＭ１０活性は、可溶性上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）リガンドの産生の増加とＮｏｔｃｈおよびＴＧＦベータシグナル伝達経路の活性化により、癌増殖アッセイにおいて細胞増殖を促進する可能性がある。

【0006】

ＴＡＣＥ活性の阻害は、腫瘍細胞増殖アッセイの有益な効果と相関している（Ｗｉｔｔｅｒｓら， ２００８）。腫瘍細胞増殖のこの阻害の機序は、ＥＧＦリガンド放出の阻止によると考えられている。例えば、ＴＧＦ－α、アンフィレギュリン、ＨＢ－ＥＧＦ、ＥＧＦ、およびベータセルリンなどのＥＧＦリガンドは、一旦放出されると、ＥＧＦ受容体を活性化することができ、次に癌増殖をもたらす（Ｐｒｕｅｓｓｍｅｙｅｒ ＆ Ｌｕｄｗｉｇ， ２００９）。ＴＡＣＥと類似して、ＡＤＡＭ１０は、ＥＧＦ、ＨＢ－ＥＧＦ、およびベータセルリンなどの可溶性ＥＧＦリガンドの産生を促進するが、しかしＴＡＣＥとは異なって、ＡＤＡＭ１０は、腫瘍細胞増殖のプロモーターとして知られている可溶性ＮｏｔｃｈおよびＡＸＬも生成する（Ｐｒｕｅｓｓｍｅｙｅｒ ＆ Ｌｕｄｗｉｇ， ２００９）。ＡＤＡＭ１０を阻害することにより、腫瘍増殖が阻止される（Ｃｒａｗｆｏｒｄら， ２００９）。

【0007】

ＥＧＦリガンドに加えて、ＡＤＡＭ１０も可溶性ＣＤ２３を生成する（Ｌｅｍｉｅｕｘら， ２００７）。ＣＤ２３の放出により、ＩｇＥの活性化によるアレルギー反応が促進される。メタロプロテアーゼ阻害剤は、インビトロアッセイおよびインビボアッセイの両方でＣＤ２３シェディングをブロックし、アレルギー反応を阻止することが示されている（Ｍａｔｈｅｗｓら， ２０１１）。

【0008】

したがって、ＡＤＡＭ１０活性を特異的に調節する機能は、タンパク質の生物学的機能を研究するために、および、これに限定されないが、癌、喘息、感染症およびアレルギー反応を含む障害の治療のために有用である。

【0009】

残念ながら、現存している小分子阻害剤は、ＡＤＡＭ１０活性に特異的でない。例えば、ＧＳＫにより開発されたヒドロキサメートは、ＡＤＡＭ１０ならびにマトリックスメタプロテアーゼファミリーの他のメンバーも阻害する（Ｌｕｄｗｉｇら， ２００５）。Ｉｎｃｙｔｅにより開示された阻害剤も、マトリックスメタプロテアーゼ（ＭＭＰ）、およびおそらく他のＡＤＡＭ１０ファミリーメンバーも阻害する（Ｚｈｏｕら， ２００６）。そのような非特異的阻害は、望ましくない副作用をもたらすことが多く、この場合は、化合物が医薬品に発展するのを妨げてきた（Ｍｏｓｓら， ２００８）。

【0010】

ＡＤＡＭファミリーは、酵素を潜伏状態に維持するプロドメインを有するチモーゲンとして発現する。例えば、ＴＡＣＥのプロドメインは、その触媒ドメインの活性を５０ｎＭのＫ_ｉで抑制し、インビボでＴＡＣＥ活性を阻害する（Ｗｏｎｇら， ２０１６）。しかし、ＴＡＣＥの野生型プロドメインには、良好な薬物動態特性がない。上流のフリン部位およびシステイン残基を修飾した変異プロドメインは、インビボでの用途のためにＴＡＣＥプロドメインを安定させた（Ｗｏｎｇら， ２０１６）。同様に、ＡＤＡＭ１０の野生型プロドメインには、良好な薬物動態特性がなく、そのために、薬剤として使用することは困難である。薬物動態学が悪い理由は、上流の切断部位（アミノ酸４８～５１）でのフリンコンバターゼによるプロセシング、および／またはインビトロでＡＤＡＭ１０のプロドメインをアミノ酸１０９と１１０との間で切断することが明らかされているメプリンメタロプロテアーゼによるプロセシングに起因することがあり得る。加えて、位置１７３の１つだけのシステインは、酸化してプロドメインの二量体形を形成し得るので、良好な薬物動態特性を有するプロドメインの能力を妨害することがある。

【0011】

したがって、当技術分野では、タンパク質の生物学的機能を研究するため、ならびに望ましくないＡＤＡＭ１０の生物学的活性に関連する疾患、障害、および症状を治療するためにＡＤＡＭ１０の選択的阻害剤を必要としている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明の概要では、本発明のいくつかの実施形態を記載し、多くの場合、これらの実施形態の変形例および置換例を記載する。本発明の概要は単に、多数の多様な実施形態の例示である。所定の実施形態の１またはそれ以上の代表的な特徴の記載も、同様に例示である。そのような実施形態は、記載の特徴の有無にかかわらず、一般的に存在し得、同様に、これらの特徴は、本発明の概要に記載されているか否かにかかわらず、本発明の他の実施形態に適用し得る。過剰な反復を避けるために、本発明の概要は、そのような特徴のすべての可能な組み合わせの記載または提案を行わない。

【0013】

一部の実施形態では、本発明は、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドがフリンによる、および任意にフリンとメプリンの両方による切断に対して感受性が低くなるように、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１または配列番号２の少なくとも１つのフリン認識部位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、本質的にそれからなり、またはそれのみからなり、任意にさらに、配列番号１または配列番号２の少なくとも１つのメプリン認識部位に少なくとも１つのアミノ酸置換、およびその組み合わせを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのフリン認識部位は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置２６～２９およびアミノ酸位置５２～５５からなる群から選択され、ならびに少なくとも１つのメプリン認識部位は、配列番号１のアミノ酸位置３４～３６、アミノ酸位置６２／６３、アミノ酸位置８８／８９、アミノ酸位置１３６～１３８、アミノ酸位置１６９／１７０、およびアミノ酸位置１７６～１７８、または配列番号２のアミノ酸位置３４～３６、アミノ酸位置６２／６３、アミノ酸位置８８／８９、アミノ酸位置１３６～１３８、およびアミノ酸位置１６９／１７０からなる群から選択される。一部の実施形態では、配列番号１または配列番号２のシステイン１５１は、アラニン、セリン、グリシンまたはトレオニンで置換される、またはペグ化される。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号３および４のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号３または配列番号４の位置２６、２８および２９のうちの１つまたはそれ以上でアラニンを、配列番号３または配列番号４の位置５２、５４および５５のうちの１つまたはそれ以上で、もしくはそれらの任意の組み合わせでアラニンを、および位置８８／８９の１つもしくは両方でアラニンを、配列番号３の位置１７６～１７８のうちの１つまたはそれ以上で、もしくはそれらの任意の組み合わせでアラニンを含む、アミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる。一部の実施形態では、配列番号３または配列番号４のシステイン１５１は、アラニン、セリン、グリシンまたはトレオニンで置換される、またはペグ化される。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号３または配列番号４の位置２６、２８または２９のうちの１つまたはそれ以上でアラニンを、配列番号３または配列番号４の位置５２、５４または５５のうちの１つまたはそれ以上でアラニンを、もしくはその任意の組み合わせを含むアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる。一部の実施形態では、配列番号３または配列番号４に関して、アミノ酸位置２９および５５の１つまたは両方は、独立して、アラニンおよびリジンからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号３の位置８８、８９、１７７および１７８の１つまたはそれ以上で、および／または配列番号４の位置８８／８９で、もしくはその任意の組み合わせでアラニンをさらに含む。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、アミノ酸１５１のシステインにおいて、システインのセリン、グリシン、アラニンまたはトレオニンでの置換、およびシステインのペグ化からなる群から選択される修飾をさらに含む。一部の実施形態では、アミノ酸１５１は、セリンであり、またはシステイン１５１はペグ化される。

【0014】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、アミノ酸１５１のシステインにおいて、システインのセリン、グリシン、アラニンまたはトレオニンでの置換、およびシステインのペグ化からなる群から選択される修飾をさらに含む。一部の実施形態では、アミノ酸１５１はセリンであり、一部の実施形態では、アミノ酸１５１はペグ化される。

【0015】

一部の実施形態では、配列番号３または配列番号４に関して、アミノ酸位置２９および５５の１つまたは両方は、独立して、セリン、グリシンおよびトレオニンからなる群から選択される。一部の実施形態では、配列番号３または配列番号４のアミノ酸位置１５１は、セリン、グリシン、アラニンまたはトレオニンである。一部の実施形態では、配列番号３または配列番号４のアミノ酸位置１５１は、ペグ化される。一部の実施形態では、Ｎ末端、Ｃ末端または両方とも、ペグ化される。

【0016】

一部の実施形態では、配列番号３または配列番号４に関して、アミノ酸位置２６はアルギニンではなく、アミノ酸位置２７はアラニンではなく、アミノ酸位置２８はリジンではなく、および／またはアミノ酸位置２９はアルギニンではない；および／またはアミノ酸位置５２はアルギニンではなく、アミノ酸位置５３はメチオニンではなく、アミノ酸位置５４はリジンではなく、および／または、アミノ酸位置５５はアルギニンではない；および／またはアミノ酸位置３４はグルタミン酸ではなく、アミノ酸位置３５はアスパラギン酸ではなく、および／またはアミノ酸位置３６はグルタミンではない；アミノ酸位置６２はアスパラギン酸ではなく、および／またはアミノ酸位置６３はグルタミン酸ではない；および／またはアミノ酸位置８８はアラニン、セリン、グリシン、トレオニン、およびアスパラギンからなる群から選択され、および／またはアミノ酸位置８９はアラニン、セリン、グリシン、トレオニン、およびアスパラギンからなる群から選択される；および／またはアミノ酸位置１３６はグルタミン酸ではなく、アミノ酸位置１３７はアスパラギン酸ではなく、および／またはアミノ酸位置１３８はアスパラギン酸ではない；および／またはアミノ酸位置１５１はシステインではない；および／またはアミノ酸位置１６９はグルタミン酸ではなく、および／またはアミノ酸位置１７０はグルタミン酸ではない；および／または配列番号３のアミノ酸位置１７６～１７８は、それぞれ独立して、グルタミン、アラニン、セリン、グリシン、トレオニン、およびアスパラギンからなる群から選択されるが、ただし、位置１７６～１７８のアミノ酸配列はグルタミン／グルタミン酸／グルタミン酸ではない。一部の実施形態では、アミノ酸位置１５１は、セリン、グリシン、アラニンおよびトレオニンからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｎ末端、Ｃ末端、位置１５１のシステイン、またはそれらの任意の組み合わせはペグ化される。

【0017】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置２６～２８でフリン認識部位を、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置５２～５４でフリン認識部位を、または両部位を不活性化する１またはそれ以上の修飾を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる。

【0018】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置３４～３６、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置６２／６３、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置８８／８９で、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置１３６～１３８、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置１６９／１７０、配列番号１のアミノ酸位置１７６～１７８、またはそれらの任意の組み合わせにおいて、メプリン認識部位を不活性化する１つまたはそれ以上の修飾を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる。

【0019】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１のアミノ酸位置８８／８９、および配列番号１のアミノ酸位置１７６～１７８でメプリン認識部位を不活性化する少なくとも２つの修飾を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる。

【0020】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置２６～２８および５２～５４でフリン認識部位を、および配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置３４～３６、６２／６３、８８／８９、１３６～１３８、および１６９／１７０でメプリン認識部位を不活性化する、ならびに任意にさらに、配列番号１のアミノ酸位置１７６～１７８でメプリン認識部位を不活性化する複数の修飾を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる。

【0021】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置２６～２８および５２～５４でフリン認識部位を、ならびに配列番号１のアミノ酸位置８８／８９および１７６～１７８でメプリン認識部位を不活性化する複数の修飾を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる。

【0022】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１に関して、アミノ酸位置２６～２９の１つまたはそれ以上、およびアミノ酸位置５２～５５の１つまたはそれ以上、およびアミノ酸位置８８／８９、およびアミノ酸位置１７６～１７８において、配列番号３に定義するアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる。一部の実施形態では、アミノ酸位置１５１は、セリン、グリシン、アラニンおよびトレオニンからなる群から選択され、またはアミノ酸位置１５１のシステインは、ペグ化される。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸位置１５１、またはそれらの任意の組み合わせにおいて、ＰＥＧ部分をさらに含む。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸位置１５１、またはそれらの任意の組み合わせにおいて、ＰＥＧ部分をさらに含む。

【0023】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置３４～３６、６２／６３、１３６～１３８、および１６９／１７０、ならびに任意に、配列番号１の１７６～１７８の１つまたはそれ以上のメプリン認識部位に、配列番号３で定義される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換の少なくとも１つはアラニン置換である。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸位置１５１、またはそれらの任意の組み合わせにおいて、ＰＥＧ部分をさらに含む。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸位置１５１、またはそれらの任意の組み合わせにおいて、ＰＥＧ部分をさらに含む。

【0024】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号５～７１，８１４のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、配列番号１に関して、アミノ酸位置２９および５５のそれぞれは、保存的アミノ酸変化で置換されたセリン、グリシン、トレオニンまたはセリンであり；アミノ酸位置３４～３６のそれぞれの少なくとも１つは、保存的アミノ酸変化で置換されたアスパラギン、セリン、グリシン、トレオニンまたはセリンであり；アミノ酸位置６２および６３の少なくとも１つは、保存的アミノ酸変化で置換されたアスパラギン、セリン、グリシン、トレオニンまたはセリンであり；アミノ酸位置８８および８９の少なくとも１つは保存的アミノ酸変化で置換されたアスパラギン、セリン、グリシン、トレオニンまたはセリンであり；アミノ酸位置１３６～１３８の少なくとも１つは保存的アミノ酸変化で置換されたアスパラギン、セリン、グリシン、トレオニンまたはセリンであり；アミノ酸位置１６９および１７０の少なくとも１つは保存的アミノ酸変化で置換されたアスパラギン、セリン、グリシン、トレオニンまたはセリンであり；アミノ酸位置１７６～１７８の少なくとも１つは保存的アミノ酸変化で置換されたアスパラギン、セリン、グリシン、トレオニンまたはセリンである。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１のＮ末端、Ｃ末端、アミノ酸位置１５１、またはそれらの任意の組み合わせにおいて、ＰＥＧ部分をさらに含む。

【0025】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号５～７１，８１４のいずれかと少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、これらのアミノ酸位置について配列番号３に定義される、アミノ酸位置２６、２８、２９、３４～３６、５２、５４、５５、６２、６３、８８、８９、１３６～１３８、１５１、１６９～１７８、１８２、および１８３からなる群から選択されるアミノ酸位置で、配列番号５～６，２８１のうちの１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸位置１５１は、セリン、グリシン、アラニン、およびトレオニンからなる群から選択され、またはアミノ酸位置１５１でシステインはペグ化される。一部の実施形態では、配列番号１に関して、アミノ酸２６、２８および２９のうちの少なくとも１つおよび／またはアミノ酸５２、５４および５５のうちの少なくとも１つは、保存的アミノ酸変化で置換されたセリン、グリシン、トレオニンまたはセリンであり、ならびにアミノ酸位置８８／８９および／または１７６～１７８のうちの少なくとも１つは、保存的アミノ酸変化で置換されたアスパラギン、セリン、グリシン、トレオニンまたはセリンである。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１のＮ末端、Ｃ末端、アミノ酸位置１５１、またはそれらの任意の組み合わせにおいて、ＰＥＧ部分をさらに含む。

【0026】

本発明は、一部の実施形態では、ＰＥＧ部分に結合された配列番号１または配列番号２を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなるＡＤＡＭ１０調節ペプチドも提供する。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置１５１でシステインに結合される。

【0027】

本発明は、一部の実施形態では、配列番号５、６、９、３４、３６、および６２～７１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなるＡＤＡＭ１０調節ペプチドも提供する。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号６２または配列番号６３に記載のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる。

【0028】

本発明は、一部の実施形態では、配列番号５、６、９、３４、３６、および６２～７１のいずれか１つと少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなるＡＤＡＭ１０調節ペプチドも提供する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号６２または配列番号６３と少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。

【0029】

本発明は、一部の実施形態では、配列番号３または配列番号４と少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなるＡＤＡＭ１０調節ペプチドも提供する。一部の実施形態では、配列番号３と比較して、アミノ酸配列は、配列番号３の位置３９、４８、７３、１０７、１１５、１２６、１３５、１７１～１７５、１８２、および１８３、または配列番号４でこれらに対応する位置からなる群から選択される１またはそれ以上の位置で、１またはそれ以上の保存的アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、配列番号３と比較して、アミノ酸配列は、アミノ酸位置３９にロイシン置換、アミノ酸位置４８にアラニン置換、アミノ酸位置７３にプロリン置換、アミノ酸位置１０７にリジン置換、アミノ酸位置１１５にイソロイシン置換、アミノ酸位置１２６にイソロイシン置換、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、配列番号３と比較して、アミノ酸配列は、配列番号６４～６６からなる群から選択される。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその任意の組み合わせにおいて、配列番号５、６、９、３４、３６、および６２～７１のいずれか１つの内部への少なくとも１つのシステインの導入を含み、ならびにさらに、少なくとも１つの導入されたシステインは、配列番号５、６、９、３４、３６、および６２～７１のうちの１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、配列番号５、６、９、３４、３６、および６２～７１のいずれか１つへのシステインの挿入、またはそれらの任意の組み合わせから生じる。一部の実施形態では、導入されたシステインは、ペグ化される。一部の実施形態では、ペグ化され導入されたシステインは、配列番号５、６、９、３４、３６、および６２～７１のいずれか１つの最初の２０のアミノ酸内、配列番号５、６、９、３４、３６、および６２～７１のいずれか１つの最後の２０のアミノ酸内に位置する。

【0030】

一部の実施形態では、アミノ酸配列は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその任意の組み合わせにおいて、配列番号５～６，２８１のいずれか１つの内部への少なくとも１つのシステインの導入を含み、ならびにさらに、少なくとも１つの導入されたシステインは、配列番号５～６，２８１の１またはそれ以上のアミノ酸の置換、またはそれらの任意の組み合わせから生じる。一部の実施形態では、導入されたシステインは、ペグ化される。一部の実施形態では、ペグ化され導入されたシステインは、配列番号５～６，２８１のいずれか１つの最初の２０のアミノ酸内、配列番号５～６，２８１のいずれか１つの最後の２０のアミノ酸内に位置する。

【0031】

一部の実施形態では、アミノ酸配列は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその任意の組み合わせにおいて、配列番号６，２８２～７１，８１４のいずれか１つの内部への少なくとも１つのシステインの導入を含み、ならびにさらに、少なくとも１つの導入されたシステインは、配列番号６，２８２～７１，８１４の１またはそれ以上のアミノ酸の置換、またはそれらの任意の組み合わせから生じる。一部の実施形態では、導入されたシステインは、ペグ化される。一部の実施形態では、ペグ化され導入されたシステインは、配列番号６，２８２～７１，８１４のいずれか１つの最初の２０のアミノ酸内、配列番号５～６，２８１のいずれか１つの最後の２０のアミノ酸内に位置する。

【0032】

一部の実施形態では、アミノ酸配列は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその任意の組み合わせにおいて、配列番号３および配列番号４のいずれか１つの内部への少なくとも１つのシステインの導入を含み、ならびにさらに、少なくとも１つの導入されたシステインは、配列番号３および配列番号４の１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、またはそれらの任意の組み合わせから生じる。一部の実施形態では、導入されたシステインは、ペグ化される。一部の実施形態では、ペグ化され導入されたシステインは、配列番号３および４のいずれか１つの最初の２０のアミノ酸内、配列番号３および４のいずれか１つの最後の２０のアミノ酸内に位置する。

【0033】

本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドの一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、保存的アミノ酸置換、非天然アミノ酸置換、Ｄ－もしくはＤ，Ｌ－ラセミ混合物異性体型アミノ酸置換、アミノ酸化学置換、カルボキシ末端修飾またはアミノ末端修飾、１またはそれ以上のグリコシル基の付加、および分子（脂肪酸、ＰＥＧ、糖、蛍光分子、発色団、放射性核種、バイオ結合体、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドの精製および／または単離に使用できるタグ、および抗体またはそのパラトープ含有フラグメントもしくはその誘導体からなる群から選択される）への結合、からなる群から選択される１またはそれ以上の修飾を含む。

【0034】

本発明は、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなるＡＤＡＭ１０調節ペプチドも提供する：（ｉ）配列番号３または配列番号４と少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１または配列番号２と少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置２６～２９、３４～３６、５２～５５、６２／６３、８８／８９、１３６～１３８および１６９／１７０、および／または配列番号１のアミノ酸位置１７６～１７８のうちの１つまたはそれ以上において少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、アミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号１または２のＮ末端もしくはその近傍で、Ｃ末端もしくはその近傍で、Ｃｙｓ１５１で、またはそれらの任意の組み合わせにおいて、ペグ化される上記（ｉ）または（ｉｉ）のアミノ酸配列、ならびに（ｉｖ）配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列が、配列番号１または配列番号２のＮ末端もしくはその近傍で、Ｃ末端もしくはその近傍で、Ｃｙｓ１５１で、またはそれらの任意の組み合わせにおいて、ペグ化されるアミノ酸配列。

【0035】

本発明は、一部の実施形態では、本明細書に開示される１またはそれ以上のＡＤＡＭ１０調節ペプチドを含む組成物も提供する。

【0036】

本発明は、一部の実施形態では、本明細書に開示される１またはそれ以上のＡＤＡＭ１０調節ペプチドおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物も提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、ヒトでの使用が薬学的に許容されている。

【0037】

本発明は、一部の実施形態では、配列番号５～７１，８１４のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなるポリペプチドも提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ペグ化される。

【0038】

本発明は、一部の実施形態では、配列番号５～６，２８１のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなるポリペプチドも提供する。一部の実施形態では、ポリペプチドはペグ化される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、さらにタグを含み、任意に、該ポリペプチドの精製および／または単離に使用できるＨｉｓタグもしくは任意の他のペプチドタグもしくは非ペプチドタグを含む。一部の実施形態では、タグは、タンパク質分解的切断によりポリペプチドから放出可能である。

【0039】

一部の実施形態では、ポリペプチドはインビトロでの使用に適合する。一部の実施形態では、ポリペプチドはインビボでの使用に適合する。

【0040】

本発明は、一部の実施形態では、配列番号１または配列番号２を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなるポリペプチドも提供し、該ポリペプチドにおいて少なくとも１つのメプリン切断部位および少なくとも１つのフリン切断部位が、配列番号３または配列番号４に記載のアミノ酸置換を含み、それにより、メプリンおよびフリンによる切断に対してポリペプチドの感受性が低くなる。一部の実施形態では、ポリペプチドはペグ化される。一部の実施形態では、システイン１５１は、野生型ＡＤＡＭ１０ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの効力、溶解性または薬物動態特性を改善する部分、発色団、フルオロフォア、および放射性ヌクレオチドからなる群から選択される１またはそれ以上の部分に結合し、該１またはそれ以上の部分が、該ポリペプチドの薬物動態学的および／または薬力学的特性の研究を容易にする。

【0041】

本発明は、配列番号６，２８２～７１，８１４の１つに記載のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなるポリペプチドも提供し、該ポリペプチドは、そのＮ末端、Ｃ末端、または両方に付加されたＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、およびＬｙｓからなる群から選択される１またはそれ以上の荷電残基を含有するスペーサーをさらに含み、さらに、付加された１またはそれ以上の荷電残基の存在により、１またはそれ以上の荷電残基が付加されてないポリペプチドと比較して、該ポリペプチドの溶解性が向上している。

【0042】

本発明は、一部の実施形態では、配列番号５～６，２８１の１つに記載のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなるポリペプチドも提供し、該ポリペプチドは、そのＮ末端、Ｃ末端、または両方に付加されたＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、およびＬｙｓからなる群から選択される１またはそれ以上の荷電残基を含有するスペーサーをさらに含み、さらに、付加された１またはそれ以上の荷電残基の存在により、１またはそれ以上の荷電残基が付加されてないポリペプチドと比較して、該ポリペプチドの溶解性が向上している。

【0043】

本発明は、一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０生物学的活性をインビトロ、エキソビボ、またはインビボで調節する方法も提供する。一部の実施形態では、該方法は、ＡＤＡＭ１０ポリペプチドを含む溶液または細胞を、本明細書に開示される１またはそれ以上のＡＤＡＭ１０調節ペプチドまたは本明細書に開示される組成物と接触させることを含み、該接触させることは、ＡＤＡＭ１０ポリペプチドを、ＡＤＡＭ１０ポリペプチドの生物学的活性を調節するのに十分な量のＡＤＡＭ１０調節ペプチドと接触させることを含む。

【0044】

本発明は、一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０生物学的活性をインビボで阻害する方法も提供する。一部の実施形態では、該方法は、本明細書に開示される１またはそれ以上のＡＤＡＭ１０調節ペプチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる組成物を、患者においてＡＤＡＭ１０ポリペプチドの生物学的活性を阻害するのに十分な経路および量で、患者に投与することを含む。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、ペグ化される。

【0045】

本発明は、一部の実施形態では、患者における疾患、障害、または症状と関連したＡＤＡＭ１０生物学的活性を阻害する方法も提供する。一部の実施形態では、該方法は、患者内に存在するＡＤＡＭ１０ポリペプチドを、有効量の本明細書に開示される１またはそれ以上のＡＤＡＭ１０調節ペプチドと接触させることを含み、疾患、障害、または症状は、癌、炎症、アレルギー反応、狼瘡、喘息、感染症および線維症からなる群から選択され、さらに該患者は該疾患、障害、または症状を有する、またはそれらの素因を有する。一部の実施形態では、疾患、障害、または症状は、少なくとも一部は、ＡＤＡＭ１０生物学的活性と関連した過剰な細胞増殖から生じる。一部の実施形態では、疾患、障害、または症状は、少なくとも一部は、ＡＤＡＭ１０生物学的活性またはタンパク質の過剰な存在を特徴とする。

【0046】

本発明は、一部の実施形態では、細胞からのＡＤＡＭ１０基質の放出を阻害する方法も提供する。一部の実施形態では、該方法は、細胞を、本明細書に開示される１またはそれ以上のＡＤＡＭ１０調節ペプチドと、ＡＤＡＭ１０基質が細胞から放出されるのを阻害するのに十分な量で、接触させることを含む。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０基質は、ＣＤ２３、ＩＬ６－Ｒ、ＥＧＦ、Ｈｅｒ－２、ＨＢ－ＥＧＦ、ベータセルリン、ジャギド１、Ｎｏｔｃｈ受容体１、Ｎｏｔｃｈ受容体３、ＲＡＧＥ、フラクタルカイン、ＭＩＣＡ Ａ、Ｉ－ＴＡＣ、ＨＧＦＲ、ＧＩＴＲ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＧＦ可溶性受容体、およびＴＧＦベータからなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞は、患者内に存在する、または患者から単離されている。

【0047】

したがって、本発明の一目的は、修飾ＡＤＡＭ１０ペプチドが、修飾がない同様のペプチドと比較して、フリンおよび／またはメプリンによる切断に対してより抵抗性であるように、１またはそれ以上のフリン部位および／または１またはそれ以上のメプリン部位において修飾を含む、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドを提供することである。

【0048】

上述した本発明の一目的、他の目的および利点は、以下の詳細な説明および実施例のレビューに基づいて、とりわけ、図面を考慮して、明白となる。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1】クーマシー染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの画像である。野生型ヒトＡＤＡＭ１０プロドメインのアミノ酸２３～２１１（すなわち、配列番号１）に対応する、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付き野生型（ＷＴ）のフリン切断およびペグ化（Ｐｅｇ）ヒトＡＤＡＭ１０ペプチド染色の結果を０、１３、２６、および６０分で示す。一番左のレーンは、種々の分子量マーカーの位置を示す。非切断ペプチドは約２５キロダルトン（ｋＤａ）で移動し、その位置は、図の右側の上段矢印と中段矢印の間に見ることができる。図の右側の矢印は、Ｈｉｓタグを結合するためにＮｉ－ＮＴＡ樹脂を用いての切断およびＣ末端切断産物の回収後、切断されペグ化されたペプチドの位置（上段矢印）、非ペグ化野生型ヒトＡＤＡＭ１０プロドメインのアミノ酸５１と５２との間（すなわち、配列番号１のアミノ酸２９と３０との間、中段矢印）の切断により生成された１９．７ｋＤａ産物、および非ペグ化野生型ヒトＤＡＭ１０プロドメインのアミノ酸７７と７８との間（すなわち、配列番号１のアミノ酸５５と５６との間、下段矢印）の切断により生成された１６．５ｋＤａ産物を示す。Ｎ末端にはタグが付けられてないので、切断反応あたり、わずかに１つの切断産物が回収されたことに着目されたい。レーン２、４、６、および８の野生型ヒトＡＤＡＭ１０プロドメイン（すなわち、配列番号１）のアミノ酸２３～２１１に対応するペグ化（Ｐｅｇ）ヒトＡＤＡＭ１０ペプチドは、１０ｋＤａのＰＥＧ部分が存在するため、約４０ｋＤａで移動した。

【図2】クーマシー染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの画像である。配列番号６（本明細書ではｍｕｔ２とも称する）および配列番号１（すなわち、野生型）の非ペグ化ペプチドのフリン切断の結果を示す。レーン１は、配列番号６の負の対照（すなわちフリンを含まない）を示す。レーン２は、配列番号６にフリンを加えたものを示す。レーン３は、野生型の負の対照（すなわち、フリンを含まない）を示す。レーン４は、配列番号１にフリンを加えたものを示す。

【図3】クーマシー染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの画像である。配列番号１のメプリン切断の結果を示す。レーン１は、メプリンで切断された配列番号１である。レーン２は、メプリンを活性化するために使用したフリンとともに活性化緩衝液を含む、負の対照である。レーン３は、メプリンを含む活性化緩衝液である。レーン４は空白である。レーン５は、種々の分子量マーカーの位置を示す。配列番号１には複数のメプリン認識部位があり、レーン１に示す切断パターンとなる。切断フラグメントは、非切断配列番号１（非切断）、および配列番号１のアミノ酸１～１７７（１～１７７）、配列番号１のアミノ酸１～１６９（１～１６９）、配列番号１のアミノ酸３４／３５～１８９（～３４～１８９）、配列番号１のアミノ酸１～１３６（１～１３６）、配列番号１のアミノ酸８８～１８９（８８～１８９）を含んだフラグメント、ならびに配列番号１内の複数の切断部位での切断から由来すると推定されるいくつかの小さいフラグメントに対応した。

【図4】クーマシー染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの画像である。配列番号１または配列番号９のペプチドのメプリン切断の結果を示す。本明細書ではｍｕｔ３とも称する、配列番号９は、配列番号１の２つのフリン部位（配列番号１のアミノ酸２８および５４で）を不活性化したアラニン置換、および配列番号１の２つのメプリン部位（配列番号１のアミノ酸８８および１７７で）を不活性化したアラニン置換を含んだ。レーン１は、メプリンのない配列番号１である。レーン２は、メプリンを加えた配列番号１である。レーン３は、メプリンのない配列番号７である。レーン４は、メプリンを加えた配列番号７である。

【図5A】配列番号１（ＷＴ）、システイン１５１でペグ化配列番号１（ＷＴ ＰＥＧ）、配列番号５（ＭＵＴ１）、配列番号６（ＭＵＴ２）、またはペグ化配列番号５（ＭＵＴ１ ＰＥＧ）の存在下でのＭＤＡ－ＭＢ４６８細胞増殖の阻害パーセントの棒グラフである。エラーバーは、４組で実行した試料から算出した平均値±標準誤差（ＳＥＭ）である。

【図5B】溶媒（２０ｍＭのＴｒｉｓ、４０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール）または配列番号６２の存在下でのＭＤＡ－ＭＢ－４６８の細胞増殖速度の棒グラフである。Ｐ＜０．０００１。エラーバーは、４組で実行した試料から算出した平均値±標準誤差（ＳＥＭ）である。

【図6】図６Ａ－図６Ｄ。ＡＤＡＭ１０活性を阻害するために種々の修飾ＡＤＡＭ１０ペプチドの単回腹腔内投与を投与されたマウスから単離された血清の能力により測定された、種々の修飾ＡＤＡＭ１０ペプチドの薬物動態特性を試験した実験の結果を示す棒グラフである。図６Ａは、修飾ＡＤＡＭ１０ペプチドの血清レベル（μＭで）を示す棒グラフである。図６Ｂは、修飾ＡＤＡＭ１０ペプチドの血清レベル（ｎＭで）を示す棒グラフである。図６Ｃは、修飾ＡＤＡＭ１０ペプチドの血清濃度（ｎＭで）を示す棒グラフである。図６Ｄは、修飾ＡＤＡＭ１０ペプチドの血清濃度（ｎＭで）を示す棒グラフである。

【図7】修飾ＡＤＡＭ１０ペプチドの血清濃度（ｎＭで）を示す棒グラフである。

【図8】図８Ａ－図８Ｃ。クーマシー染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの画像である。記載の配列番号のフリンによる切断に対する抵抗性についての試験結果を示す。図８Ａは、配列番号６２、６３、３４、およびペグ化バージョンの配列番号７１にフリンを添加してから、３、１０、２０、および１２０分後の試験結果を示す。図８Ｂは、配列番号６２、６５、および６８にフリンを添加してから、０，２０、４０、および１２０分後の試験結果を示す。図８Ｃは、配列番号６３、およびペグ化バージョンの配列番号６９、７０および７１にフリンを添加してから０、３０、および１２０分後の試験結果を示す。

【図9】図９Ａ－図９Ｃ。クーマシー染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの画像である。記載の配列番号のメプリンによる切断に対する抵抗性についての試験結果を示す。図９Ａは、配列番号５、６２、６３、および３４にメプリンを添加してから、０および１０分後の試験結果を示す。図９Ｂは、配列番号３４、６６、６７、および６８にメプリンを添加してから、０および１７分後の試験結果を示す。図９Ｃは、配列番号６３、およびペグ化バージョンの配列番号６９（６９Ｐ）、７０（７０Ｐ）および７１（７１Ｐ）にメプリンを添加してから２および１０分後の試験結果を示す。

【図10】、配列番号６２対負の溶媒対照のＨｏｌｌｏｗ Ｆｉｂｅｒ Ｍｏｄｅｌ試験の結果を示す棒グラフである。^＊：Ｐ＜０．０５。エラーバーは、６組で実行した試料から算出した平均値±標準誤差（ＳＥＭ）である。

【図11】負の溶媒対照（各対の左側のバー）および配列番号１の野生型配列（各対の右側のバー）と比較して、ｍｕｔ２／配列番号６（各対の中央のバー）によるインビボでのＣＤ２３シェディングの阻害の程度を２４時間と４８時間で示す棒グラフである。エラーバーは、３組で実行した試料から算出した平均値±標準誤差（ＳＥＭ）である。

【0050】

コンパクトディスクで提出されるシーケンシング・リストへの参照
本開示と関連するシーケンス・リストを１２３．３ＭＢファイルとしてコンパクトディスクで提出した。コンパクトディスクには、出願者、表題、ファイル名（ＦＩＮＡＬ＿３２１７－２ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ）、作成日（２０１８年１０月２日）、コンピュータシステム（ＩＢＭ－ＰＣ／ＭＳ－ＤＯＳ／ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ）、整理番号（３２１７／２ ＰＣＴ）、および対応するＰＣＴ国際特許出願番号を確認するために、改ざん防止インクで記載されている。コンパクトディスクで提出したシーケンス・リストは、参照により本開示に組み込まれる。

【0051】

シーケンス・リストの簡単な説明
配列番号１は、野生型ヒトＡＤＡＭ１０プロドメインペプチドのアミノ酸配列である。ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオシーケンスデータベースの受入番号ＮＰ＿００１１０１．１のアミノ酸２３～２１１に対応する。
配列番号２は、野生型マウスＡＤＡＭ１０プロドメインペプチドのアミノ酸配列である。ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオシーケンスデータベースの受入番号ＮＰ＿０３１４２５．２のアミノ酸２３～２１２に対応する。
配列番号３は、配列番号１に基づく本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドのコンセンサスアミノ酸配列である。配列番号１と比較して、配列番号３は、個々に、または任意の組み合わせ、もしくは部分的組み合わせで置換されることができる２４のアミノ酸位置を含む。２４のアミノ酸位置は、２つのフリン認識部位、６つのメプリン認識部位、および配列番号１の位置１５１に存在する１つのシステインに対応する。
配列番号４は、配列番号２に基づく本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドのコンセンサスアミノ酸配列である。配列番号２と比較して、配列番号４は、個々に、または任意の組み合わせ、もしくは部分的組み合わせで置換されることができる２１のアミノ酸位置を含む。２１のアミノ酸位置は、２つのフリン認識部位、５つのメプリン認識部位、および配列番号２の位置１５１に存在する１つのシステインに対応する。
配列番号５～７１，８１４は、配列番号３または配列番号４の実施形態に対応する、本発明の例示的なＡＤＡＭ１０調節ペプチドのアミノ酸配列である。

【発明を実施するための形態】

【0052】

ここで本発明を以下により詳細に述べ、本発明のすべてではないが一部の実施形態を説明する。実際、本発明は、多くの異なる形態で具体化されることができ、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本開示が適用できる法的要件を満たすように、これらの実施形態は提供される。

【0053】

Ｉ．定義
本明細書で用いる用語は、特定の実施形態のみを説明する目的であり、本発明を限定することを意図するものではない。

【0054】

以下の用語は当業者によって十分に理解されるものと考えられ、以下の定義は本発明の説明を容易にするために記載される。

【0055】

本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、以下に別段の定義がない限り、当技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有するように意図される。本明細書で使用する技術への参照は、当技術分野で一般に理解されている技術、例えば、それらの技術の変形例、または当業者には明らかである同等の代替技術を指すことが意図される。次の用語は当技術分野の当業者によって十分に理解されると考えられるが、次の定義は本発明の説明を容易にするために記載される。

【0056】

本発明を説明するに際しては、いくつかの技術およびステップが開示されることが理解されよう。これらの各々には個々の利点があり、各々を他の開示されている技術の１つまたはそれ以上と、あるいは場合によってはすべてと組み合わせて用いることもできる。

【0057】

したがって、分かりやすくするために、この説明は、個別のステップのあらゆる可能な組み合わせを不必要に繰り返すことを控えることにする。それにもかかわらず、明細書および特許請求の範囲は、そのような組み合わせが完全に本発明および請求項の範囲内であることを理解して読む必要がある。

【0058】

長年の特許法慣例に従って、特許請求の範囲を含み、本出願で用いる場合、用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」とは、「１またはそれ以上」を指す。例えば、「抗体」という句は、複数の同じ抗体を含めて、１つまたはそれ以上の抗体を指す。同様に、本明細書で存在物を指すために使用する場合、句「少なくとも１つ」とは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、またはそれ以上のその存在物を指し、１と１００との間および１００を超える全数値を含むが、これに限定されるものではない。

【0059】

別段の指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲で用いられる成分の量、反応条件などを表すすべての数は、いかなる場合も、「約」という用語によって修正されると理解されるべきである。測定可能な値、例えば、質量、重量、時間、容量、濃度、またはパーセンテージの量を指すとき、本明細書で用いる場合、「約」という用語は、一部の実施形態では±２０％、一部の実施形態では±１０％、一部の実施形態では±５％、一部の実施形態では±１％、一部の実施形態では±０．５％、一部の実施形態では±０．１％の指定量からの変形例を包含し、そのような変形例は開示される方法を実施するのに適切であることを意味する。したがって、特にそれとは反対の指示がない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、本発明によって得ることを求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。

【0060】

本明細書で用いる場合、「アミノ酸」という用語は、本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドを生成する際に使用することができるα－アミノ酸を指す。ポリペプチドに天然に生じる「標準」アミノ酸は２０種類あり、これらを表１にまとめる。

【0061】

【表1】

【0062】

本明細書で用いる場合、存在物の一覧と関連して用いる場合、「および／または」という用語は、単独でまたは組み合わせで存在する存在物を指す。したがって、例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤ」という句は、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを個別に含むだけでなく、Ａ、Ｂ、およびＤのありとあらゆる組み合わせと部分的組み合わせを含む。

【0063】

「含める」、「含有する」、または「特徴とする」と同義である「含む」という用語は、包括的すなわち非限定的であり、追加の非列挙された要素および／または方法ステップを除外しない。「含む」は、専門用語であり、挙げた要素および／またはステップが存在するが、他の要素および／またはステップも加えることができ、さらに関連する主題の範囲内に入ることを意味する。

【0064】

本明細書で用いる場合、「それのみからなる」という句は、具体的に列挙されていないいずれの要素、ステップ、または成分を除外する。「それのみからなる」という句が、前提部分の直後よりはむしろ、請求項本文の節に現れるとき、その節に記載の要素だけが限定され、他の要素は全体としてその請求項から除外されないことに着目されたい。

【0065】

本明細書で用いる場合、「本質的にそれからなる」という句は、指定された物質および／またはステップに加えて、開示されるおよび／または主張される主題の基本的および新規の特徴（複数可）に物質的に影響を及ぼさないものに関連した開示または請求項の範囲を限定する。例えば、医薬組成物は、「本質的に」薬学的活性剤または複数の薬学的活性剤「からなる」ことができ、これは、列挙された薬学的活性剤（複数可）がその医薬組成物中に存在する唯一の薬学的活性剤（複数可）であることを意味する。しかし、担体、賦形剤、および他の不活性剤がその医薬組成物に存在し得る、および存在する可能性があることに着目されたい。

【0066】

「含む」、「それのみからなる」、および「本質的にそれからなる」の用語に関して、これらの３つの用語の１つが本明細書で用いられる場合、本開示および主張の主題は、他の２つの用語のうちのいずれか、または両方の使用を含み得る。例えば、一部の実施形態では、本発明はペプチドを含む組成物に関する。したがって、本開示のレビュー後に、本発明が本質的に本発明のペプチドからなる組成物、ならびに本発明のペプチドからなる組成物を包含することを当業者は理解するであろう。

【0067】

本明細書で用いる場合「患者」という用語は、あらゆる無脊椎動物種または脊椎動物種のメンバーを指す。したがって、「患者」という用語は、脊索門（例えば、硬骨魚網（硬骨魚）、両生網（両生類）、爬虫網（爬虫類）、鳥網（鳥類）、および哺乳網（哺乳類）のメンバー）、ならびにそれに包含される目および科すべてを含むがこれに限定されない動物界のあらゆるメンバーを包含することを意図する。

【0068】

本発明の組成物および方法は、温血脊椎動物に特に有用である。したがって、本発明は、哺乳類および鳥類に関する。より詳細には、ヒトおよび他の霊長類などの哺乳類において、ならびに絶滅の危機に瀕しているために重要な哺乳類（例えばアムールトラ）、経済的に重要な哺乳類（ヒトによって消費のために養殖されている動物）および／またはヒトにとって社会的に重要な動物（ペットとしてまたは動物園で飼育されている動物）、例えば、ヒト以外の肉食動物（ネコ、イヌなど）、家畜の豚（ブタ、食用ブタ、イノシシ）、反芻動物（畜牛、雄牛、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、ラクダなど）、齧歯動物（マウス、ラット、ウサギなど）、有袋類、およびウマにおいての使用に由来する、および／または使用するための組成物および方法が提供される。例えば、絶滅の危機に瀕している、動物園で飼育されている鳥の種類、ならびに家禽、より具体的には、家畜化された家禽、例えば、七面鳥、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホ鳥などの飼鳥類を含む、ヒトにとって経済的に重要である鳥類について開示される方法および組成物の用途も提供される。したがって、家畜の豚（ブタ、食用ブタ）、反芻動物、ウマ、飼鳥類などを含むがこれらに限定されない家畜について開示される方法および組成物の用途も提供される。

【0069】

同様に、本明細書で開示される遺伝子、遺伝子名、遺伝子産物のすべては、本明細書で開示される組成物および方法が適用可能なあらゆる種からの相同分子種に対応することが意図される。したがって、この用語には、ヒトおよびマウス由来の遺伝子、遺伝子産物が含まれるが、これらに限定されるものではない。当然のことながら、特定の種由来の遺伝子または遺伝子産物が開示される場合、この開示は例示的であることのみを意図し、それが現れる文脈で明白に指示されない限り、限定として解釈されるべきではない。したがって、例えば、本明細書に提示された遺伝子について、開示されたヒトアミノ酸配列は、これらに限定されないが、他の哺乳動物、魚、両生類、爬虫類、および鳥類を含む他の動物由来の相同遺伝子および遺伝子産物を包含することを意図される。また、対応するＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオシーケンスデータベースエントリーに開示されているものを含むがこれに限定されない、開示されたアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を包含する。

【0070】

「癌」および「腫瘍」という用語は、本明細書では同じ意味で用いられ、乳房；結腸；直腸；肺；中咽頭；下咽頭；食道；胃；膵臓；肝臓；胆嚢；胆管；小腸；腎臓、膀胱と尿路上皮を含む尿路；頸部、子宮、卵巣（例えば、絨毛癌と妊娠性絨毛疾患）を含む女性生殖器；前立腺、精嚢、精巣と胚細胞性腫瘍を含む男性生殖器；甲状腺、副腎と下垂体を含む内分泌腺；皮膚（例えば、血管腫と黒色腫）、骨または軟組織；血管（例えば、カポシ肉腫）；脳、神経、眼と髄膜（例えば、星細胞腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、神経鞘腫と髄膜腫）を含むがこれらの限定されない、患者におけるあらゆる組織の原発固形腫瘍と転移固形腫瘍、および癌の両方を指す。本明細書で用いる場合、「癌」および「腫瘍」という用語は、また、多細胞腫瘍、ならびに個別の腫瘍性細胞または前腫瘍性細胞を指すことを意図される。一部の実施形態では、癌または腫瘍は、これに限定されないが癌腫などの上皮組織の癌または腫瘍を含む。一部の実施形態では、腫瘍は腺癌であり、一部の実施形態では、これは、膵臓、乳房、卵巣、結腸もしくは直腸、および／またはこれらに由来する転移細胞の腺癌である。

【0071】

ＩＩ．ＡＤＡＭ１０調節ペプチドとその結合体、組成物、医薬組成物、およびポリペプチド
ＩＩ．Ａ．ＡＤＡＭ１０調節ペプチド、ポリペプチド、およびその結合体
ＡＤＡＭ１０生物学的活性は、癌、神経障害、喘息、およびアレルギー応答などの疾患、ならびに炎症、過剰な細胞増殖、血管新生、および過剰な可溶性ＣＤ２３のうちの１つまたはそれ以上の存在により少なくとも一部はそれを特徴とする障害に関係づけられてきた。一般に、ＡＤＡＭ１０を含むＡＤＡＭファミリーメンバーは、酵素を潜伏状態に維持するプロドメインを有するチモーゲンとして発現される。一部の実施形態では、本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、ＡＤＡＭ１０プロドメイン配列に基づいているが、野生型ＡＤＡＭ１０プロドメイン配列と比較して、１またはそれ以上の修飾を有し、それに基づいて、安定性およびＡＤＡＭ１０阻害活性の増加となる。

【0072】

より具体的に、配列番号１は、ヒトＡＤＡＭ１０ポリペプチドのアミノ酸２３～２１１（すなわち、野生型ヒトＡＤＡＭ１０プロドメインを表す）に対応し、配列番号２は、マウスＡＤＡＭ１０ポリペプチドのアミノ酸２３～２１２に対応する。したがって、一部の実施形態では、本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１または配列番号２と比較して、１またはそれ以上の修飾を含むアミノ酸配列を有する。配列番号１内には、２つのフリン認識配列と、６つのメプリン認識配列とがあり、配列番号２には、配列番号１のフリン認識配列とともに最初の５つのメプリン認識配列が含まれることが決定されている。

【0073】

任意に１またはそれ以上のメプリン認識配列の修飾と組み合わせて、１またはそれ以上のフリン認識配列を修飾することで、フリンおよび／またはメプリンによる切断に対して本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドの感受性が低くなることがさらに決定された。フリンおよび／またはメプリンによる切断に対してこの感受性の低下は、本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドの安定性を向上させ、これによりＡＤＡＭ１０ポリペプチドの生物学的活性を阻害する本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドの能力の増加ももたらされる。

【0074】

配列番号１に関して、第１の（すなわち、Ｎ末端）フリン認識配列は、配列番号１のアミノ酸２６～２９に対応し、第２の（すなわち、Ｃ末端）フリン認識配列は、配列番号１のアミノ酸５２～５５に対応する。配列番号１のアミノ酸２６～２９および／またはアミノ酸５２～５５のうちの１つまたは複数でアミノ酸配列を修飾することで、本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドを切断するフリンの能力を低減させ得ることが決定された。

【0075】

したがって、一部の実施形態では、本発明はＡＤＡＭ１０調節ペプチドを提供し、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１のアミノ酸２６～２９および／またはアミノ酸５２～５５などに限定されないが、少なくとも１つのフリン認識部位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、本質的にそれからなり、またはそれのみからなり、少なくとも１つのフリン認識部位に少なくとも１つのアミノ酸置換により、フリンによる切断に対してＡＤＡＭ１０調節ペプチドの感受性が低くなる。フリン認識部位に対する例示的な非限定的アミノ酸修飾を表２に示す。

【0076】

【表2】

【0077】

アミノ酸位置２６～２９および５２～５４に関して、本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドの安定性を向上させるために、アミノ酸位置１、２、３、４、５、６、７、または８すべてのアミノ酸位置を修飾することができ、および一部の実施形態では、これらの位置の各々で表２に一覧のいずれのアミノ酸置換を使用することができることに着目されたい。

【0078】

さらに、メプリン認識部位に関して、一部の実施形態では、本発明はＡＤＡＭ１０調節ペプチドを提供し、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１または配列番号２の少なくとも１つのメプリン認識部位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、本質的にそれからなり、またはそれのみからなり、少なくとも１つのメプリン認識部位に少なくとも１つのアミノ酸置換により、メプリンによる切断に対してＡＤＡＭ１０調節ペプチドの感受性が低くなる。メプリン認識部位に対する例示的な非限定的アミノ酸修飾を表３に示す。

【0079】

【表3】

【0080】

したがって、一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドがフリンによる、任意にフリンおよびメプリンの両方による切断に対して感受性が低くなるように、本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、少なくとも１つのフリン認識部位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、本質的にそれからなり、またはそれのみからなり、任意に、配列番号１または配列番号２の少なくとも１つのメプリン認識部位に少なくとも１つのアミノ酸置換、およびその組み合わせを含む。

【0081】

さらに、一部の実施形態では、非アミノ酸置換修飾も、本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドに含めることができる。限定ではなく例として、本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に結合されることができる（すなわち、該ＡＤＡＭ１０はペグ化されることができる）。一部の実施形態では、本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、Ｎ末端もしくはその近傍で、および／またはＣ末端もしくはその近傍でペグ化されることができる。「もしくはその近傍で」という句は、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドの最初の約２０のアミノ酸の１つにおよび／またはＡＤＡＭ１０調節ペプチドの最後の約２０のアミノ酸の１つにＰＥＧ部分を結合することを包含することを意図する。配列番号１および２においてアミノ酸位置１５１には単一システインアミノ酸もあり、一部の実施形態では、ＰＥＧ部分はシステインのスルフヒドリル基を介してＡＤＡＭ１０調節ペプチドに結合されることができる。ＰＥＧ部分以外の他の部分も、これらの位置で結合されることができ、糖、糖鎖、ポリサルコシン、ポリオール、それらを含有するプロリン、アラニン、およびセリン（ＰＡＳ）などの短鎖ペプチドが挙げられるがこれらに限定されるものではない。

【0082】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドが一部の実施形態において、それに結合される１、２、または３つのＰＥＧ部分を有することができるように、本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、Ｎ末端もしくはその近傍で、Ｃ末端もしくはその近傍で、および／またはＣｙｓ１５１での任意の組み合わせでペグ化されることができる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、分子量が約キロダルトン（ｋＤａ）であるが、より大きいあるいはより小さいＰＥＧ部分も用いることができる。

【0083】

一部の実施形態では、Ｃｙｓ１５１もアミノ酸置換によって修飾されることができる。Ｃｙｓ１５１での例示的な置換は、セリン、グリシン、アラニン、およびレオニンを含む。したがって、０～３ＰＥＧ部分をそれに結合させることに加えて、本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、一部の実施形態では１５１位置に加えて、表２～３に一覧したアミノ酸位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３のすべてにおいて修飾を含むことができる。このように、一部の実施形態では、本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１の位置２６～２９、３４～３６，５２～５５、６２、６３、８８、８９、１３６～１３８、１５１、１６９、１７０、および１７６～１７８で１～２４のアミノ酸置換を含む。配列番号３および４は、位置１５１に加えて表２～３に明確にされたこれらのアミノ酸位置とともに、それぞれ、ヒトおよびマウスのＡＤＡＭ１０アミノ酸配列に基づいた共通配列を提供する。

【0084】

当然のことながら、これらの位置でのアミノ酸置換の任意の組み合わせが可能であり、一部の実施形態では、アミノ酸置換は、位置１５１でのセリン、グリシン、アラニンまたはトレオニンに加えて表２～３に記載のものから選択される。本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドのための可能なアミノ酸配列の非限定的なサブセットは、配列番号５～７１，８１４に示される。本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドのさらなる非限定的な例は、以下の通りである。

【0085】

一部の実施形態では、本発明はＡＤＡＭ１０調節ペプチドを提供する。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドがフリンによる、および任意にフリンとメプリンの両方による切断に対して感受性が低くなるように、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１または配列番号２の少なくとも１つのフリン認識部位に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、本質的にそれからなり、またはそれのみからなり、任意にさらに、配列番号１または配列番号２の少なくとも１つのメプリン認識部位に少なくとも１つのアミノ酸置換、およびその組み合わせを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのフリン認識部位は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置２６～２９およびアミノ酸位置５２～５５からなる群から選択され、ならびに少なくとも１つのメプリン認識部位は、配列番号１のアミノ酸位置３４～３６、アミノ酸位置６２／６３、アミノ酸位置８８／８９、アミノ酸位置１３６～１３８、アミノ酸位置１６９／１７０、およびアミノ酸位置１７６～１７８、または配列番号２のアミノ酸位置３４～３６、アミノ酸位置６２／６３、アミノ酸位置８８／８９、アミノ酸位置１３６～１３８、およびアミノ酸位置１６９／１７０からなる群から選択される。一部の実施形態では、配列番号１または配列番号２のシステイン１５１は、アラニン、セリン、グリシンまたはトレオニンで置換される、またはペグ化される。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号３および４のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号３または配列番号４の位置２６、２８および２９のうちの１つまたはそれ以上でアラニンを、配列番号３または配列番号４の位置５２、５４および５５のうちの１つまたはそれ以上で、またはその任意の組み合わせでアラニンを、ならびに配列番号３の位置８８および８９の１つまたは両方でアラニンを、位置１７６～１７８のうちの１つまたはそれ以上で、またはその任意の組み合わせでアラニンを含むアミノ酸配列を含む、本質的それからなる、またはそれのみからなる。一部の実施形態では、配列番号３または配列番号４のシステイン１５１は、アラニン、セリン、グリシンもしくはトレオニンで置換される、またはペグ化される。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号３または配列番号４の位置２６、２８または２９のうちの１つもしくはそれ以上でアラニンを、配列番号３または配列番号４の位置５２、５４または５５のうちの１つもしくはそれ以上で、またはその任意の組み合わせでアラニンを含むアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる。一部の実施形態では、配列番号３または配列番号４に関して、アミノ酸位置２９および５５の１つまたは両方は、独立して、アラニンおよびリジンからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号３の位置８８、８９、１７７および１７８、および／または配列番号４の位置８８および８９のうちの１つまたはそれ以上でアラニンをさらに含む。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、アミノ酸１５１でシステインに、システインのセリン、グリシン、アラニンまたはトレオニンでの置換、およびシステインのペグ化からなる群から選択される修飾をさらに含む。一部の実施形態では、アミノ酸１５１はセリンであり、またはシステイン１５１はペグ化される。

【0086】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、アミノ酸１５１でシステインに、システインのセリン、グリシン、アラニンまたはトレオニンでの置換、およびシステインのペグ化からなる群から選択される修飾をさらに含む。一部の実施形態では、アミノ酸１５１はセリンであり、一部の実施形態では、アミノ酸１５１はペグ化される。

【0087】

一部の実施形態では、配列番号３または配列番号４に関して、アミノ酸位置２９および５５の１つまたは両方は、独立して、セリン、グリシン、およびトレオニンからなる群から選択される。一部の実施形態では、配列番号３または配列番号４のアミノ酸位置１５１は、セリン、グリシン、アラニンまたはトレオニンである。一部の実施形態では、配列番号３または配列番号４のアミノ酸位置１５１は、ペグ化される。一部の実施形態では、Ｎ末端、Ｃ末端または両方とも、ペグ化される。

【0088】

一部の実施形態では、配列番号３または配列番号４に関して、アミノ酸位置２６はアルギニンではなく、アミノ酸位置２７はアラニンではなく、アミノ酸位置２８はリジンではなく、および／またはアミノ酸位置２９はアルギニンではなく；および／またはアミノ酸位置５２はアルギニンではなく、アミノ酸位置５３はメチオニンではなく、アミノ酸位置５４はリジンではなく、および／またはアミノ酸位置５５はアルギニンではなく；および／またはアミノ酸位置３４はグルタミン酸ではなく、アミノ酸位置３５はアスパラギン酸ではなく、および／またはアミノ酸位置３６はグルタミンではなく；アミノ酸位置６２はアスパラギン酸ではなく、および／またはアミノ酸位置６３はグルタミン酸ではなく；および／またはアミノ酸位置８８はアラニン、セリン、グリシン、トレオニン、およびアスパラギンからなる群から選択され、および／またはアミノ酸位置８９はアラニン、セリン、グリシン、トレオニン、およびアスパラギンからなる群から選択され；および／またはアミノ酸位置１３６はグルタミン酸ではなく、アミノ酸位置１３７はアスパラギン酸ではなく、および／またはアミノ酸位置１３８はアスパラギン酸ではなく；および／またはアミノ酸位置１５１はシステインではなく；および／またはアミノ酸位置１６９はグルタミン酸ではなく、および／またはアミノ酸位置１７０はグルタミン酸ではなく；および／または配列番号３のアミノ酸位置１７６～１７８は、それぞれ独立して、グルタミン、アラニン、セリン、グリシン、トレオニン、およびアスパラギンからなる群から選択されるが、ただし、位置１７６～１７８のアミノ酸配列はグルタミン／グルタミン酸／グルタミン酸ではない。一部の実施形態では、位置１５１のアミノ酸は、セリン、グリシン、アラニン、およびトレオニンからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｎ末端、Ｃ末端、位置１５１のシステイン、またはその任意の組み合わせは、ペグ化される。

【0089】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置２６～２８でフリン認識部位を不活性化する、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置５２～５４でフリン認識部位を不活性化する、またはこれらの両方である、１またはそれ以上の修飾を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる。

【0090】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置３４～３６、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置６２／６３、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置８８／８９、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置１３６～１３８、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置１６９／１７０、配列番号１のアミノ酸位置１７６～１７８、またはその任意の組み合わせにおいてメプリン認識部位を不活性化する、１またはそれ以上の修飾を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる。

【0091】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１のアミノ酸位置８８／８９ならびに配列番号１のアミノ酸位置１７６～１７８でメプリン認識部位を不活性化する、少なくとも２つの修飾を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる。

【0092】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置２６～２８および５２～５４のフリン認識部位、ならびに配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置３４～３６、６２／６３、８８／８９、１３６～１３８、および１６９／１７０でメプリン認識部位を不活性化する、ならびに任意にさらに、配列番号１のアミノ酸位置１７６～１７８でメプリン認識部位を不活性化する、複数の修飾を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる。

【0093】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置２６～２８および５２～５４のフリン認識部位、ならびに配列番号１のアミノ酸位置８８／８９および１７６～１７８でメプリン認識部位を不活性化する、複数の修飾を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる。

【0094】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１に関して、アミノ酸位置２６～２９、およびアミノ酸位置５２～５５のうちの１つまたはそれ以上、およびアミノ酸位置８８／８９、およびアミノ酸位置１７８～１７８のうちの１つまたはそれ以上で、配列番号３で定義されるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる。一部の実施形態では、アミノ酸位置１５１は、セリン、グリシン、アラニン、およびトレオニンから選択され、またはアミノ酸位置１５１のシステインはペグ化される。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸位置１５１、またはその任意の組み合わせにおいて、ＰＥＧ部分をさらに含む。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸位置１５１、またはその任意の組み合わせにおいて、ＰＥＧ部分をさらに含む。

【0095】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置３４～３６、６２／６３、１３６～１３８、および１６９／１７０、ならびに任意に、配列番号１の１７６～１７８のうちの１つまたはそれ以上のメプリン認識部位に、配列番号３で定義される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換をさらに含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換の少なくとも１つは、アラニン置換である。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸位置１５１、またはその任意の組み合わせにおいて、ＰＥＧ部分をさらに含む。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、アミノ酸位置１５１、またはその任意の組み合わせにおいて、ＰＥＧ部分をさらに含む。

【0096】

一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号５～７１，８１４のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、配列番号１に関して、アミノ酸位置２９および５５のそれぞれは、保存的アミノ酸変化で置換されたセリン、グリシン、トレオニンまたはセリンであり、アミノ酸位置３４～３６のそれぞれの少なくとも１つは保存的アミノ酸変化で置換されたアスパラギン、セリン、グリシン、トレオニンまたはセリンであり、アミノ酸位置６２および６３の少なくとも１つは保存的アミノ酸変化で置換されたアスパラギン、セリン、グリシン、トレオニンまたはセリンであり、アミノ酸位置８８および８９の少なくとも１つは保存的アミノ酸変化で置換されたアスパラギン、セリン、グリシン、トレオニンまたはセリンであり、アミノ酸位置１３６～１３８の少なくとも１つは保存的アミノ酸変化で置換されたアスパラギン、セリン、グリシン、トレオニンまたはセリンであり、アミノ酸位置１６９および１７０の少なくとも１つは保存的アミノ酸変化で置換されたアスパラギン、セリン、グリシン、トレオニンまたはセリンであり、アミノ酸位置１７６～１７８の少なくとも１つは保存的アミノ酸変化で置換されたアスパラギン、セリン、グリシン、トレオニンまたはセリンである。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１のＮ末端、Ｃ末端、アミノ酸位置１５１、またはその任意の組み合わせにおいて、ＰＥＧ部分をさらに含む。

【0097】

一部の実施形態では、ＡＭＡＤ１０調節ペプチドは、配列番号５～７１，８１４のいずれかと少なくとも、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、アミノ酸位置について配列番号３で定義されるアミノ酸位置２６、２８、２９、３４～３６、５２、５４、５５、６２、６３、８８、８９、１３６～１３８、１５１、１６９～１７８、１８２、および１８３からなる群から選択されるアミノ酸位置で、配列番号５～６，２８１のうちの１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。

【0098】

２つのタンパク質配列と関連して、「同一性パーセント」および「同一パーセント」という句は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または目視検査によって測定し、最大一致のために比較および整列させたとき、一部の実施形態では少なくとも６０％、一部の実施形態では少なくとも７０％、一部の実施形態では少なくとも８０％、一部の実施形態では少なくとも８５％、一部の実施形態では少なくとも８７％、一部の実施形態では少なくとも８８％、一部の実施形態では少なくとも８９％、一部の実施形態では少なくとも９０％、一部の実施形態では少なくとも９１％、一部の実施形態では少なくとも９２％、一部の実施形態では少なくとも９３％、一部の実施形態では少なくとも９４％、一部の実施形態では少なくとも９５％、一部の実施形態では少なくとも９６％、一部の実施形態では少なくとも９７％、一部の実施形態では少なくとも９８％、および一部の実施形態では少なくとも９９％のヌクレオチド残基同一性またはアミノ酸残基同一性を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。同一性パーセントは、一部の実施形態では、長さが少なくとも約５０残基である配列の領域にわたり存在し、一部の実施形態では、少なくとも約１００残基の領域にわたり存在し、および一部の実施形態では、同一性パーセントは、少なくとも約１５０残基にわたり存在する。一部の実施形態では、同一性パーセントは、比較される配列の１つの全長にわたり存在する。一部の実施形態では、同一性パーセントは、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドのアミノ酸配列の全長にわたり算出される。

【0099】

配列比較に関して、一般的に１つの配列は、試験配列が比較される参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて配列座標を指定して、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較して試験配列（複数可）の配列同一性パーセントを算出する。

【0100】

比較のための配列の最適的なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， １９８１に記載の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０に記載の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， １９８８に記載の類似性方法の検索によって、これらのアルゴリズム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａから入手可能なＧＣＧ（登録商標）ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ ＰＡＣＫＡＧＥ（登録商標）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実装によって、または目視検査によって行われることができる。一般に、Ａｕｓｕｂｅｌら， １９８９を参照されたい。

【0101】

配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するのに適しているアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌら， １９９０に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂを介して、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベースの配列中の同じ長さのワードとともに整列すると、ある正値の閾値スコアＴに一致する、またはこれを満たす、のいずれかのクエリー配列中の短いワードの長さＷを特定することによる高スコア配列対（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， １９９０）と称される。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むさらに長いＨＳＰを見つけるために検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。次いで、ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加可能な限り、それぞれの配列に沿って両方向に伸長される。ヌクレオチド配列の場合、累積スコアは、パラメータＭ（一致する残基の対に対するリワードスコア、常に＞０）およびＮ（不一致残基に対するペナルティースコア、常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列の場合、累積スコアを算出するために、スコア行列を用いる。各方向でのワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘ低下した場合、１またはそれ以上の負スコアの残基アライメントの蓄積のため、累積スコアがゼロ以下になった場合、またはいずれかの配列の末端に達した場合、停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズム・パラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびスコア行列ＢＬＯＳＵＭ６２を用いる。Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， １９９２を参照されたい。

【0102】

配列同一性パーセントの算出に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムも２つの配列間の類似性の統計的解析を行う。例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ． １９９３を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これにより２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標が提供される。例えば、参照核酸配列に対する試験核酸配列の比較における最小和確率が、一部の実施形態では約０．１未満、一部の実施形態では約０．０１未満、一部の実施形態では約０．００１未満である場合に、試験核酸配列は参照配列に類似しているとみなされる。

【0103】

一部の実施形態では、アミノ酸位置１５１は、セリン、グリシン、アラニン、およびトレオニンからなる群から選択され、またはアミノ酸位置１５１でシステインはペグ化される。一部の実施形態では、配列番号１に関して、アミノ酸２６、２８および２９の少なくとも１つ、および／またはアミノ酸５２、５４および５５のうちの少なくとも１つは、保存的アミノ酸変化で置換されたセリン、グリシン、トレオニンまたはセリンであり、ならびに位置８８／８９および／または１７６～１７８の少なくとも１つのアミノ酸は、保存的アミノ酸変化で置換されたアスパラギン、セリン、グリシン、トレオニンまたはセリンである。一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１のＮ末端、Ｃ末端、アミノ酸位置１５１、またはその任意の組み合わせにおいて、ＰＥＧ部分をさらに含む。

【0104】

本発明は、一部の実施形態において、ＰＥＧ部分に結合された配列番号１または配列番号２を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなるＡＤＡＭ１０調節ペプチドも提供する。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸位置１５１のシステインに結合される。

【0105】

本発明は、一部の実施形態では、配列番号５、６、９、３４、３６、および６２～７１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなるＡＤＡＭ１０調節ペプチドも提供する。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号６２または配列番号６３に記載のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる。

【0106】

本発明は、一部の実施形態では、配列番号５、６、９、３４、３６、および６２～７１のいずれか１つと少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなるＡＤＡＭ１０調節ペプチドも提供する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号６２または配列番号６３と少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。

【0107】

本発明は、一部の実施形態では、配列番号３または配列番号４と少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなるＡＤＡＭ１０調節ペプチドも提供する。一部の実施形態では、配列番号３と比較して、アミノ酸配列は、配列番号３の位置３９、４８、７３、１０７、１１５、１２６、１３５、１７１～１７５、１８２、および１８３、または配列番号４でこれらに対応する位置からなる群から選択される１またはそれ以上の位置で、１またはそれ以上の保存的アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、配列番号３と比較して、アミノ酸配列は、アミノ酸位置３９にロイシン置換、アミノ酸位置４８にアラニン置換、アミノ酸位置７３にプロリン置換、アミノ酸位置１０７にリジン置換、アミノ酸位置１１５にイソロイシン置換、アミノ酸位置１２６にイソロイシン置換、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、配列番号３と比較して、アミノ酸配列は、配列番号６４～６６からなる群から選択される。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号５、６、９、３４，３６、および６２～７１のいずれか１つと少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその任意の組み合わせにおいて、配列番号５、６、９、３４、３６、および６２～７１のいずれか１つの内部への少なくとも１つのシステインの導入を含み、ならびにさらに、少なくとも１つの導入されたシステインは、配列番号５、６、９、３４、３６、および６２～７１のうちの１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、配列番号５、６、９、３４、３６、および６２～７１のいずれか１つへのシステインの挿入、またはそれらの任意の組み合わせから生じる。一部の実施形態では、導入されたシステインはペグ化される。一部の実施形態では、ペグ化され導入されたシステインは、配列番号５、６、９、３４、３６、および６２～７１のいずれか１つの最初の２０のアミノ酸内、配列番号５、６、９、３４、３６、および６２～７１のいずれか１つの最後の２０のアミノ酸内に位置する。

【0108】

配列番号１～７１，８１４の１つと８７～１００％同一性（例えば、少なくとも８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一）を有するＡＤＡＭ１０調節ペプチドに関して、一部の実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１または配列番号２のフリン認識部位の１つ、メプリン認識部位の１つ、またはＣｙｓ１５１以外の位置で起こる。このように、一部の実施形態では、本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、配列番号１～４の別のアミノ酸位置で、アミノ酸置換、任意に保存的アミノ酸置換を含む。本明細書で用いる場合、「保存的アミノ酸置換」および「保守的アミノ酸変化」という句を同じ意味で用いて、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドの生物学的活性に、可能な限り少ないインパクトを与えることが予想されるアミノ酸置換を指す。表４に、例示的な保存的アミノ酸置換を記載する。

【0109】

【表4】

【0110】

本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドのフリンおよび／またはメプリンの認識部位を修飾する際に用いられ得るものなどのアミノ酸置換は、一般に、しかし必ずしもではないが、アミノ酸側鎖置換の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状およびタイプの解析により、アルギニン、リジン、およびヒスチジンがすべて正荷電残基であり、アラニン、グリシン、およびセリンは、すべて同じようなサイズであり、ならびにフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、すべてほぼ同じ形状を有することが明らかになった。したがって、これらの考慮に基づいて、アルギニン、リジン、およびヒスチジン；アラニン、グリシン、およびセリン；フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、本明細書では生物学的に機能的同等物と定義する。他の生物学的に機能する同等物の変化は、当技術分野の当業者によって理解される。しかし、保存的置換よりはむしろラジカル置換が特定の状況で是認され得ることを当業者が理解できることを上記の考察に暗に含んでいる。本発明の配列番号５～７１，８１４のいずれかのあらゆる位置での非保存的置換も、本発明の一態様である。

【0111】

生物学的に機能的同等のアミノ酸置換を作製する際に、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することができる。各アミノ酸は、それらの疎水性特性および電荷特性に基づいて、疎水性親水性指標が割り当てられている。割り当てられた疎水性親水性指標は以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；トレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；およびアルギニン（－４．５）。

【0112】

タンパク質に相互作用的な生物学的機能を与えることにおける疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、当技術分野で一般に理解されている（Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， １９８２）。特定のアミノ酸が、類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸で置換され得、かつ依然として類似の生物学的活性を保持し得ることが知られている。疎水性親水性指標に基づいて変更を行うとき、アミノ酸置換の疎水性親水性指標は、一実施形態では、元の値±２以内であり得、別の実施形態では、元の値±１以内であり得、およびさらに別の実施形態では、元の値±０．５以内であり得る。

【0113】

アミノ酸のような置換が親水性に基づいて効果的に行われ得ることも、当技術分野で理解されている。参照によって本明細書に組み込まれた、Ｈｏｐｐに付与された米国特許第４，５５４，１０１号は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所平均親水性が、その免疫原性および抗原性、すなわち、そのタンパク質の生物学的性質と相関することを述べている。当然のことながら、アミノ酸が類似の親水性値を有する別のアミノ酸に置換され得、かつ依然として生物学的に同等のタンパク質を得ることができる。

【0114】

米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（－０．４）；プロリン（－０．５±１）；アラニン（－０．５）；ヒスチジン（－０．５）；システイン（－１．０）；メチオニン（－１．３）；バリン（－１．５）；ロイシン（－１．８）；イソロイシン（－１．８）；チロシン（－２．３）；フェニルアラニン（－２．５）；およびトリプトファン（－３．４）。

【0115】

類似の親水性値に基づいて変更を行うとき、アミノ酸置換の親水性値は、一実施形態では、元の値±２以内であり得、別の実施形態では、元の値±１以内であり得、およびさらに別の実施形態では、元の値±０．５以内であり得る。

【0116】

一部の実施形態では、アミノ酸配列は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその任意の組み合わせにおいて、配列番号５～６，２８１のいずれか１つの内部への少なく１つのシステインの導入を含み、ならびにさらに少なくとも１つの導入されたシステインが配列番号５～６，２８１のうちの１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、またはそれらの任意の組み合わせから生じる。一部の実施形態では、導入されたシステインはペグ化される。一部の実施形態では、ペグ化され導入されたシステインは、配列番号５～６，２８１のいずれか１つの最初の２０のアミノ酸内、配列番号５～６，２８１のいずれか１つの最後の２０のアミノ酸内に位置する。

【0117】

一部の実施形態では、アミノ酸配列は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその任意の組み合わせにおいて、配列番号６，２８２～７１，８１４のいずれか１つの内部への少なく１つのシステインの導入を含み、ならびにさらに少なくとも１つの導入されたシステインが配列番号６，２８１～７１，８１４のうちの１またはそれ以上のアミノ酸の置換、またはそれらの任意の組み合わせから生じる。一部の実施形態では、導入されたシステインはペグ化されている。一部の実施形態では、ペグ化され導入されたシステインは、配列番号６，２８２～７１，８１４のいずれか１つの最初の２０のアミノ酸内、配列番号５～６，２８１のいずれか１つの最後の２０のアミノ酸内に位置する。

【0118】

一部の実施形態では、アミノ酸配列は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその任意の組み合わせにおいて、配列番号３および４のいずれか１つの内部への少なく１つのシステインの導入を含み、ならびにさらに少なくとも１つの導入されたシステインが配列番号３および４の１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、またはそれらの任意の組み合わせから生じる。一部の実施形態では、導入されたシステインはペグ化される。一部の実施形態では、ペグ化され導入されたシステインは、配列番号３および４のいずれか１つの最初の２０のアミノ酸内、配列番号３および４のいずれか１つの最後の２０のアミノ酸内に位置する。

【0119】

本発明は、本明細書に開示される１またはそれ以上のＡＤＡＭ１０調節ペプチドを含む組成物、任意に医薬組成物も提供する。

【0120】

本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドの一部の実施形態では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、保存的アミノ酸置換、非天然アミノ酸置換、Ｄ－もしくはＤ，Ｌ－ラセミ混合物異性体型アミノ酸置換、アミノ酸化学置換、カルボキシ末端修飾またはアミノ末端修飾、１またはそれ以上のグリコシル基の付加、および分子（脂肪酸、ＰＥＧ、糖、蛍光分子、発色団、放射性核種、バイオ結合体、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドの精製および／または単離に使用できるタグ、および抗体またはそのパラトープ含有フラグメントもしくはその誘導体からなる群から選択される）への結合からなる群から選択される１またはそれ以上の修飾を含む。

【0121】

ＩＩ．Ｂ．組成物と医薬組成物およびポリペプチド
一部の実施形態では、本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、組成物または医薬組成物中に単独で、または互いに組み合わせて存在する。一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の１またはそれ以上のＡＤＡＭ１０調節ペプチドおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物である。一部の実施形態では、医薬組成物は、ヒトでの使用が薬学的に許容されている。適切な製剤は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、殺菌性抗生物質を含むことができる水性および非水溶無菌注射溶液、および製剤を意図されたレシピエントの体液と等張にする溶質、ならびに懸濁化剤と増粘剤を含むことができる水性および非水溶無菌懸濁液を含む。製剤は、単位用量容器または多用量容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアルで提供することができ、使用直前に、無菌液体担体、例えば注射用蒸留水の添加のみを必要とする凍結またはフリーズドライ（凍結乾燥した）状態で保存することができる。一部の例示的な成分は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（一部の実施形態では０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、一部の実施形態では、約２．０ｍｇ／ｍＬの範囲で）および／またはマンニトールもしくは糖（一部の実施形態では、１０～１００ｍｇ／ｍＬ、一部の実施形態では、約３０ｍｇ／ｍＬの範囲で）、および／またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）がある。問題の製剤のタイプを考慮して、従来の任意の他の薬剤も使用することができる。

【0122】

ＩＩＩ．本開示のＡＤＡＭ１０調節ペプチド、組成物、医薬組成物、およびポリペプチドを用いる方法
一部の実施形態では、本発明は、本開示のＡＤＡＭ１０調節ペプチドを用いる方法も提供する。

【0123】

一部の実施形態では、本発明は、ＡＤＡＭ１０生物学的活性をインビトロで阻害する方法に関する。一部の実施形態では、該方法は、ＡＤＡＭ１０ポリペプチドを含む溶液または細胞を、本明細書に開示される１またはそれ以上のＡＤＡＭ１０調節ペプチドと接触させることを含み、該接触させることは、ＡＤＡＭ１０ポリペプチドを、ＡＤＡＭ１０ポリペプチドの生物学的活性を調節するのに十分な量のＡＤＡＭ１０調節ペプチドと接触させることを含む。

【0124】

一部の実施形態では、本発明は、ＡＤＡＭ１０生物学的活性をインビボで阻害する方法に関する。一部の実施形態では、該方法は、本発明の１またはそれ以上のＡＤＡＭ１０調節ペプチドを含む、本質的にそれからなる、またはそれのみからなる組成物を、患者においてＡＤＡＭ１０ポリペプチドの生物学的活性を阻害するのに十分な経路および量で、患者に投与することを含む。

【0125】

ＩＩＩ．Ａ．患者における疾患、障害、および症状に関連するＡＤＡＭ１０生物学的活性を含む、ＡＤＡＭ１０生物学的活性を阻害する方法
一部の実施形態では、本発明は、患者における疾患、障害、または症状に関連するＡＤＡＭ１０生物学的活性を阻害する方法に関する。一部の実施形態では、該方法は、患者内に存在するＡＤＡＭ１０ポリペプチドを、有効量の本明細書に開示される１またはそれ以上のＡＤＡＭ１０調節ペプチドと接触させることを含み、該疾患または障害は、癌、炎症、アレルギー反応、狼瘡、喘息、感染症および線維症からなる群から選択され、さらに該患者は該疾患、障害、または症状を有する、またはそれらの素因を有する。一部の実施形態では、疾患、障害、または症状は、少なくとも一部は、ＡＤＡＭ１０生物学的活性と関連した過剰な細胞増殖から生じる。一部の実施形態では、疾患、障害、または症状は、少なくとも一部は、ＡＤＡＭ１０生物学的活性またはタンパク質の過剰な存在を特徴とする。

【0126】

ＩＩＩ．Ｂ．ＡＤＡＭ１０基質の放出を阻害する方法
一部の実施形態では、本発明は、細胞からのＡＤＡＭ１０基質の放出を阻害するための方法に関する。一部の実施形態では、方法は、細胞を、本明細書に開示される１またはそれ以上のＡＤＡＭ１０調節ペプチドと、細胞からのＡＤＡＭ１０基質の放出を阻害するのに十分な量で接触させることを含む。本明細書で用いる場合、「ＡＤＡＭ１０基質」という句は、ＡＤＡＭ１０ポリペプチドがそれに作用することができ、および細胞からその基質が放出されるあらゆる基質を指す。例示的、非限定的なＡＤＡＭ１０基質には、ＣＤ２３、ＩＬ６－Ｒ、ＥＧＦ、Ｈｅｒ－２、ＨＢ－ＥＧｆ、ベータセルリン、ジャギド１、Ｎｏｔｃｈ受容体１、Ｎｏｔｃｈ受容体３、ＲＡＧＥ、フラクタルカイン、ＭＩＣＡ Ａ、Ｉ－ＴＡＣ、ＨＧＦＲ、ＧＩＴＲ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＧＦ可溶性受容体、およびＴＧＦベータが挙げられる。一部の実施形態では、細胞は患者内に存在し、ＡＤＡＭ１０基質は患者の血行に放出される。

【実施例】

【0127】

以下の実施例は、具体的な実施形態を提供する。本開示および当技術分野の一般水準の技能の観点から、以下の実施例は例示であることのみを意図するものであり、多くの変化、修正、および変更を本発明の範囲から逸脱することなく用いることができることを当業者なら理解するであろう。
実施例１
ＡＤＡＭ１０の非ペグ化ヒトプロドメインは、インビトロでＡＤＡＭ１０を阻害し、選択的阻害剤である

【0128】

ＡＤＡＭ１０プロドメインペプチドを、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標登録）バイオシーケンスデータベース（配列番号１）の受入番号ＮＰ＿００１１０１．１に記載のヒトＡＤＡＭ１０ポリペプチドのアミノ酸２３～２１１をコードするヌクレオチド配列をＨｉｓタグとともにプラスミドベクターにクローニングすることによって調製した。プロドメインペプチドは、ＢＬ２１ＤＥ３細胞を形質転換し、続いて１６℃で発現させることによって調製した。これにより、封入体中の可溶性プロドメインペプチドおよびプロドメインペプチドが得られた。可溶性プロドメインペプチドを、１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）、ベンゾナーゼ、（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、および１×ＣＥＬＬＹＬＹＴＩＣ（登録商標）溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに、５ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホススフィン（ＴＣＥＰ；Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を含む、または含まない５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）中で、１５～２０分間、室温で細菌を壊すことによって精製した。遠心分離の後ペレットを再び、同じ緩衝液で処理し、次いでもう一度遠心分離した。両方の上清をＮｉ－ＮＴＡカラムに加えた。洗浄後、プロドメインペプチドを、５ｍＭのＴＣＥＰを含む、または含まない１Ｍのイミダゾール、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８）で溶出した。次いで、この物質を、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８）と４０ｍＭのＮａＣｌで平衡化したＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）２００ブランドのカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）上に通した。濃縮し、エンドトキシンを除去した後、グリセロールを１０％まで加え、この物質を－２０℃で保存した。

【0129】

不溶性プロドメインは、尿素で可溶化し、次いでＮｉ－ＮＴＡビーズ上でリフォールディングした後、封入体から調製した。次いで、不溶性プロドメインを、上記のようにＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）２００ブランドのカラムに通すか、または２０ｍＭのトリス（ｐＨ８）および４０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液で平衡化したＺＥＢＡ（商標）ブランドのスピンカラムに直接通した（７Ｋ分画分子量）。下記の表５は、ＡＤＡＭ１０ペプチドに対するＩＣ_５０値および一部の阻害剤の選択性プロファイルを示す。
実施例２

【0130】

ペグ化

【0131】

プロドメインペプチドを、４ｍＭのＴＣＥＰを含む、または含まない、２０ｍＭのホスフェート（ｐＨ７．２）に平衡化したＺＥＢＡ（商標）ブランドのスピンカラムに通した。１０ｋＤａのマレイミドＰＥＧ（Ｎａｎｏｃｓ Ｉｎｃ． Ｂｏｓｔｏｎ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）の１．２倍～５倍の過剰量を加えた。２～８時間後に、反応進行をＳＤＳ ＰＡＧＥゲル電気泳動でモニターした。時々、さらにマレイミドＰＥＧを加え、反応を冷所で終夜、進行させておいた。次いで、この物質を、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８）および４０ｍＭのＮａＣｌで平衡化したＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）２００ブランドのＧ２００カラム上に２回通し、純粋なペグ化物質含有画分を濃縮し、エンドトキシン除去カラムを用いて反応させて、グリセロールを１０％まで添加した後、－２０℃で凍結させた。プロドメインペプチドを上記のように調製し、ペグ化を１０ｋＤａのマレイミドＰＥＧを用いて行った。
実施例３
酵素阻害アッセイ

【0132】

ＡＤＡＭファミリーメンバー用の蛍光エネルギー移動基質のＰＥＰＤＡＢ０６４（ＢｉｏＺｙｍｅ Ｉｎｃ．， Ａｐｅｘ， Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を１０ｍＭのＤＭＳＯ原液から、２５ｍＭのトリス（ｐＨ８）１．５ｍＬおよび０．００１％ＢＲＩＪ（登録商標）３５ブランドの界面活性剤に、１５μＭの最終濃度まで希釈した。ＡＤＡＭ１０のプロドメインペプチドまたはペグ化プロドメインを、基質を含まないトリス／ＢＲＩＪ（登録商標）緩衝液で希釈した後に、３倍に段階希釈した。９６ウェル黒色コーティングプレートに６０μＬの基質／緩衝液の混合液と１０μＬのプロドメインペプチドを加えた。Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）からヒトＡＤＡＭ１０を２μＭで、同じトリス／ＢＲＩＪ（登録商標）緩衝液に１６０倍に希釈した。総計５μＬを添加して、反応を開始した。蛍光測定値は、ＣａｍｂｒｉｄｇｅまたはＦＬＵＯｓｔａｒ蛍光光度計を用いて励起４８５ｎｍおよび発光５３０ｎｍで測定し、測定値を２分毎に読み取った。データをＥｘｃｅｌおよびＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて解析した。実験は、２連で実施した。表５は、試験したプロドメインペプチドのためのＡＤＡＭ１０に対する阻害定数を示す。

【0133】

【表5】

実施例４
選択性プロファイル

【0134】

ヒトプロドメインペグ化ペプチドまたは非ペグ化ペプチドを、ＡＤＡＭ１０について記載のものと同じ基質緩衝液の混合液とともにＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）からのＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ９、またはＡＤＡＭ８と反応させた。変異体およびペグ化バージョンに対してほんのわずかな阻害があった。変異体およびペグ化バージョンも、ＮａＣｌを１５０ｍＭまで、ＣａＣｌ_２を１０ｍＭまで加えたことを除いて同じトリス／ＢＲＩＪ（登録商標）ブランドの緩衝液とともに１５μＭのＰＥＰＤＡＢ０６４を使用して、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓからのＡＤＡＭ８およびＡＤＡＭ９に対して試験した。４～１０μＭで、これらの酵素に対して阻害がない、またはわずかな阻害がある、のいずれかであった。

【0135】

加えて、ＭＭＰの阻害を、ＡＤＡＭ８について上記と同じ緩衝液とともに１５μＭのＰＥＰＤＡＢ００８を使用して、本発明のＡＤＡＭ１０ペプチドとＭＭＰを反応させることで行った。表６は、代表的な試料を要約する。

【0136】

【表6】

【0137】

ＡＤＡＭ１０プロドメインとして試験したメプリンもこの酵素のための基質である。メプリンをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、同メーカーの説明書に従って活性化させた。２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８）と１ｍＭの４－（２－アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に、ＰＥＰＤＡＢ０２２（ＢｉｏＺｙｍｅ Ｉｎｃ．）を１５μＭの最終濃度まで加えた。次いで、変異体もしくは野生型（すなわち配列番号１）ＡＤＡＭ１０調節ペプチドもしくはそのペグ化バージョンを加えた。メプリンをトリプシンで活性化し、その後ＡＥＢＳＦでのクエンチを行うので、緩衝液コントロールはメプリンとの反応と同量のトリプシンおよびＡＥＢＳＦを含んでいた。ＡＤＡＭ１０調節ペプチドの切断を最小限に抑えるために反応は、室温で、少量のメプリンの存在下および短い反応時間で行った。表７は、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドによるメプリンの阻害に対するＩＣ_５０値を示す。最もメプリン安定なＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、２９位および５５位（配列番号６２および配列番号６３）に二重フリン変異を有する、またはマウスプロドメイン（配列番号６４）およびマウスＣ末端尾部（配列番号６７）を有するものであった。さらに、配列番号６３のようなＡＤＡＭ１０調節ペプチドがＮ末端もしくはＣ末端もしくはＣ１５１でペグ化された場合、ＩＣ_５０は約５～７μＭまで増加し、ペグ化がメプリンに対する効力を低下させたことを示す。

【0138】

【表7】

実施例５
ヒトＡＤＡＭ１０のプロドメインはインビトロで細胞増殖を阻害する

【0139】

１日目に細胞をその最適な細胞濃度で９６ウェルプレートに播種した。１０％血清を補充した完全増殖培地に細胞を蒔いた（１００μＬ／ウェル）。翌日（２日目）、培地を除去し、血清を含まない培地で細胞を洗浄し、次いで３％血清を補充した培地で細胞を２４時間飢餓状態にした。被験物質は、培地に希釈することで調製した。飢餓状態の後、培地を除去し、１００μＬの新たな飢餓培地と交換した。２つの被験物質と２倍濃度の溶媒を飢餓培地に希釈し、１００μＬの２×被験物質または溶媒を適切なウェルに充填した。被験物質と溶媒を同じ血清飢餓培地に１０倍希釈し、それぞれ１００μＬを加えた。最終濃度は、２μＭと０．２μＭであった。

【0140】

各処理条件を最低４回実施した。細胞を３７℃で４８時間インキュベートさせておいた。

【0141】

定量的評価：７２時間のインキュベーション時間の終わりに、Ｃｅｌｌ ｇｌｏアッセイを用いて、細胞数を定量化した。培地を採取し、ＥＬＩＳＡを行って、プロドメインペプチドまたは溶媒対照の処理後の培地中のＡＤＡＭ１０基質の濃度を決定した。 変異ＡＤＡＭ１０調節ペプチドおよびペグ化ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、ＭＤＡ－ＭＢ４６８細胞の増殖を野生型プロドメインペプチドよりもかなり阻害した（図５Ａを参照されたい）。

【0142】

別の実験では、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドを試験したように、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の増殖への効果を、配列番号６２を用いて決定した。細胞を９６ウェルプレート中の１００μＬの増殖培地に播種した。細胞を、５％ＣＯ_２および９５％空気を含む加湿インキュベーターに入れて３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、細胞を無血清培地で洗浄して、飢餓培地で４８時間インキュベートした。次いで、飢餓培地を除去し、Ｎｕｃｌｉｇｈｔ Ｒｅｄ染料を含有する新たな飢餓培地（１８０μＬ）を各ウェルに加えた。細胞数を、７２時間にわたりＩＮＣＵＣＹＴＥ（登録商標）ブランドの生細胞解析システム（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， Ｍｉｃｈｉｇａｎ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を用いて定量化した。

【0143】

細胞増殖の速度を図５Ｂに示す。配列番号６２のＡＤＡＭ１０調節ペプチドは、溶媒対照と比較して、１０μＭで細胞増殖をかなり減少させた（７８％）（図５Ｂを参照されたい）。
実施例６
ＡＤＡＭ１０調節ペプチドの薬物動態特性が改善した

【0144】

最良の候補をマウスでの薬物動態試験に検討した。手短に言うと、Ｂａｌｂ／Ｃ雌マウス（３／群）にＡＤＡＭ１０調節ペプチドまたは溶媒対照の単回腹腔内（ｉ．ｐ．）投与を施した。血液試料を採取して、血清を調製し、－８０℃で保存した。ＡＤＡＭ１０調節ペプチドの血清濃度を、ＡＤＡＭ１０酵素活性に対する血清の阻害効力に基づいてバイオアッセイを用いて間接的に決定した。２～５μＬの血清を、プロテアーゼ阻害剤、ペプスタチン、ＡＥＢＳＦ、ベスタチン、およびＥ－６４を含有する２０μＭの基質、ＰＥＰＤＡＢ０６４（ＢｉｏＺｙｍｅ Ｉｎｃ．）を３５μＬ、１０μＬのヒトＡＤＡＭ１０とともに、既知の濃度でＡＤＡＭ１０調節ペプチドの濃度を変えて添加してインキュベートした。血清へのＡＤＡＭ１０プロドメインの既知の濃度を用いて標準曲線を作成するために、パーセントＡＤＡＭ１０阻害を決定した。２～５μＬの試料を採取し、上記で用いた緩衝液を、ＡＤＡＭ１０調節ペプチドを（２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８）、４ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール）に１：３．５の比率で溶解させた緩衝液に希釈して調製した４５μＬの基質溶液に加えた。溶媒対照を注入されたマウスの対照群から採取した血清と比較して、パーセント阻害を決定した。

【0145】

図６Ａ～６Ｄおよび７に実験結果をまとめる。大部分の二重フリン変異体と単一フリン変異体およびペグ化バージョンは、ＡＤＡＭ１０の野生型プロドメイン（配列番号１）よりも良好な薬物動態特性を有していた。例外は、配列番号６８であった。これは、フリンに安定であるが、メプリンによって急速に分解され、野生型タンパク質に類似の薬物動態特性を有した変異体である。システインがＣ１５１、またはＮ末端もしくはＣ末端で組み入れられ得るように、配列番号６３を有するプロドメインを、配列番号６９～７１に記載のように修飾した。配列番号６９～７１のペグ化バージョンのすべては、配列番号６３と比較して、薬物動態特性が改善しており（図７）、以下にさらに詳述するようにフリンおよびメプリン切断により安定していた。
実施例７
切断実験

【0146】

メプリンおよびフリンを用いて、ＡＤＡＭ１０のプロドメインを切断した。図１および３は、野生型タンパク質（配列番号１）がメプリンおよびフリンによって急速に分解されたことを示す。フリン実験のため約２０～５０μｇの野生型（ＷＴ）、ペグ化ＷＴ、または例示的なＡＤＡＭ１０調節ペプチド（ｍｕｔ２；配列番号６）およびメプリン実験のため別の例示的なＡＤＡＭ１０調節ペプチド（ｍｕｔ３；配列番号９）をほぼ１００μＬの量で、１．７ｍＬのエッペンドルフチューブ中でフリンまたはメプリンと反応させた。対照試料にはメプリンまたはフリンが含まれていなかったが、並べて実験を行った。試料を３７℃でインキュベートし、次いで、およそ２０～３０μＬの溶液を取り出し、１０μＬの４×染料充填溶液でクエンチングを行った。試料を１６％Ｎｏｗｅｘゲル上に流し、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅで染色した。図１、２および４に示した結果は、変異ＡＤＡＭ１０調節ペプチドがメプリンおよび／またはフリンによる切断に対して抵抗性があることを示した。

【0147】

二重フリン変異体である配列番号６２、およびペグ化配列番号６９～７１は、フリン切断およびメプリン切断に対して最も抵抗性があった（図８Ａ～８Ｃおよび図９Ａ～９Ｃを参照されたい）。両フリン変異を有することにより、メプリン切断に対しても配列番号６２が安定した（図８Ａにおいて、単一フリン変異体である配列番号３４を、ともに二重フリン変異体である配列番号６２および６３と配列番号６３と比較されたい）。

【0148】

加えて、フリン変異の位置はメプリン切断に影響を及ぼした。ＲＸＫＲ＞ＲＸＡＲのフリン部位修飾を有する、ｍｕｔ２／配列番号６は、配列番号６２（ＲＸＫＲ＞ＲＸＫＡ）および配列番号６３（ＲＸＫＲ＞ＲＸＫＫ）と比較して、フリン切断に対して抵抗性が低かった。さらに、ＡＸＫＲ変異体はかなり安定していたにもかかわらず、配列番号６２は、ＡＸＫＲ変異を含有するフリン変異体、例えば配列番号６５および配列番号６８、（図８Ｂを参照されたい）に対して、より安定であった。

【0149】

配列番号６４および配列番号６７は、そのＣ末端尾部の１７６～１７８にメプリン部位がない、マウスＡＤＡＭ１０プロドメイン配列を有する（配列番号１を配列番号２と比較されたい）。配列番号６７は、ヒトプロドメインがそのＣ末端尾部を対応するマウスプロドメイン配列に置き換えられた、マウス／ヒトのハイブリッドである。これらの配列も、野生型（配列番号１）、Ｍｕｔ２（配列番号６）、および配列番号３４と比較して、メプリン切断に対してはるかに抵抗性であった（図９Ａおよび９Ｂを参照されたい）。

【0150】

Ｍｕｔ３／配列番号９は、二重メプリン二重フリン変異体（Ｋ２８Ａ；Ｋ５４Ａ；Ｅ８８Ａ；Ｅ１７７Ａ；）である。それは、試験した実験条件下で、メプリン切断に対して完全に抵抗性であった（図４を参照されたい）。上記の蛍光アッセイにおいてメプリンに対して極めて阻害性でなかった（表７を参照されたい）ペグ化配列番号６９～７１は、メプリン切断（図９Ｃを参照されたい）フリン切断（図８Ｃを参照されたい）に対して極めて抵抗性であった。
実施例８
ＡＤＡＭ１０調節ペプチドは細胞シェディング現象をインビトロおよびインビボで阻害する

【0151】

ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を９６ウェルプレートに播種した。終夜のインキュベーションの後、細胞を無血清培地で洗浄して、飢餓培地で２４時間インキュベートした。さらに４８～７２時間後、培地を細胞から除去し、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ， Ｇｅｏｒｇｉａ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ ＡｍｅｒｉｃａのＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．から提供されたアレイとともにインキュベートした。

【0152】

表８は、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ３、ジャギド１、ベータセルリン，およびＭｉｃａ Ａのシェディングの阻害に対するＩＣ_５０値を示す。Ｍｕｔ２／配列番号６およびすべての他の構築物と比較して、フリン切断およびメプリン切断に対してはるかに抵抗性である配列番号６２は、Ｎｏｔｃｈ３のＩＣ_５０が１０倍以上（８９０ｖｓ．７６ｎＭ）改善した。

【0153】

【表8】

【0154】

５μＭの配列番号６２で処理した細胞からの培地、対する５μＭの配列番号６５で処理した細胞からの培地も、ＲａｙＢｉｏＴｅｃｈからの増殖因子アレイにかけた。表９は、溶媒対照と比較して、培地中で増加または減少したいくつかの因子を要約する。より安定な配列番号６２は細胞によって放出された調節因子に最も高い影響を与えたことに着目されたい。

【0155】

【表9】

【0156】

薬物動態実験から溶媒で処置された動物から、または配列番号６２で処置された動物から血清を採取して、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈからの１００タンパク質アレイにかけた。表１０は、溶媒と比較して、配列番号６２の処置により調節された統計的に有意な因子を要約する。ＡＤＡＭ１０用の２つの既知の基質、ＲＡＧＥおよびフラクタルキンはともに血清中でかなり減少し、変異プロドメインがＡＤＡＭ１０活性をインビボで阻害することができることを示している。

【0157】

【表10】

実施例９
インビボ試験

【0158】

中空繊維モデル。１日目に、細胞ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＢＴ－２０、およびＡ５４９を中空繊維に充填し、培地を含んでいる細胞培養ディッシュに入れて、３７℃で、５％ＣＯ_２のインキュベーターで終夜、平衡化した。次いで、腫瘍細胞を、培地を用いてＫＲＯＳＦＬＯ（登録商標）ブランドの中空繊維膜に充填した。手術１～２時間前に、マウスにＭｅｌｏｘｉｃａｍ（５ｍＬ／ｋｇ中１ｍｇ／ｋｇ）を皮下に投与した。マウスが吸入イソフルラン麻薬下にある間に、移植を行った。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞、Ａ５４９細胞またはＢＴ－２０細胞のいずれかを含んでいる３個の繊維を２つの異なる区画、すなわち皮下区画と腹腔内区画に移植した。したがって、各マウスには６個の繊維が移植されている。

【0159】

詳細には、繊維を含んでいる外套針を皮膚切開により挿入し、繊維を、同じ皮膚切開を用いて皮下に設置し、さらに腹膜を穿孔することによって腹腔に設置した。縫合クリップを使用して皮膚を閉じた。１０ｍｇ／ｋｇで配列番号６２または溶媒対照の腹腔内投与を３日ごとに２週間の投薬を開始した。体重を週に３回計量した。１５日目（治療後１４日）に、動物を頸椎脱臼法によって犠牲にし、繊維を抽出した。下記に記載のＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）ブランドのルミネセンス細胞生存アッセイプロトコールに従って各繊維を処理した。

【0160】

ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）ブランドのルミネセンス細胞生存アッセイ。各繊維を４片に切断し、それを１ｍＬのエキソビボルシフェラーゼ緩衝液（２５ｍＭのトリス－ホスファート（ｐＨ７．８）、２ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＤＴＴ、０．１％のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ－１００）を４℃で含んでいる２ｍＬ溶解マトリックスＡバイアル（カタログ番号６９１０， ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ， Ｓａｎｔａ Ａｎａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）に直接入れた。繊維をＦＡＳＴＰＲＥＰ－２４（登録商標）ブランドの均質化システム（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ， Ｓａｎｔａ Ａｎａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を用いて３０秒間、５ｍ／ｓで破壊し、その後１００００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離させた。周囲温度で、上清をＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ（登録商標）ブランドのルミネセンス細胞生存アッセイ緩衝液（１：１０）とともに振盪させながら、暗所で１０分間インキュベートした。ルミネセンスをＥｎＳｐｉｒｅプレートリダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を用いて検出した。個々の群のデータは、説明的データ解析（標準誤差を含む平均値、中央値）を用いて解析した。有効性データの統計的解析は、マン・ホイットニー検定および独立スチューデントｔ検定を用いて行った。

【0161】

結果を図１０に示す。配列番号６２は、溶媒対照と比較して、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞のｉｎ ｖｏｖでの増殖をおよそ２０％減少させた。

【0162】

ＣＤ２３シェディングの阻害。本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドがインビボでＣＤ２３シェディングを阻害するかどうかを決定するために、動物に配列番号１（野生型）またはＭｕｔ２／配列番号６のいずれかを腹腔内に投与した。２４時間後および４８時間後に血清を採取し、ＣＤ２３の濃度をＥＬＩＳＡで決定した。溶媒対照と比較してのシェディングのパーセント阻害を決定し、結果を図１１に示す。Ｍｕｔ２／配列番号６はＣＤ２３シェディングを阻害したが、他方、配列番号１は阻害しなく、フリン部位の変異およびシステイン残留物が、ＡＤＡＭ１０がインビボで阻害するプロドメインの能力を改善したことを示している。

【0163】

腫瘍異種移植モデル。本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドがインビボでの腫瘍増殖阻害への治療可能性を有するかどうかを決定するために、有効性試験を胸腺欠損マウスでＭＤＡ－ＭＢ－４６８由来、Ａ５４９由来、またはＨＣ１１６由来の異種移植腫瘍モデルを用いて行った。手短に言うと、１×１０^７細胞を６週齢の雌の胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスの側腹部に皮下移植する。二次元の腫瘍サイズをノギスで測定して、体積を算出する。腫瘍サイズが約２００ｍｍ^３に到達したとき、処置を開始する。薬物動態データから決定されるように、単独の溶媒対照およびＡＤＭＡ１０プロドメインペプチドを２つの投与量で投与する。各処置群（群あたりｎ＝６）を７～８週間までモニターする。体重および腫瘍を週２回測定し、腫瘍増殖速度と退縮速度を決定する。実験の終わりに動物を安楽死させて、肝臓、心臓、内臓脂肪、腎臓、脳を保持し、組織損傷および毒性のために調べる。

【0164】

適切な用量が判明すると、１またはそれ以上のＡＤＡＭ１０調節ペプチドを、異種腫瘍モデルで他の抗癌薬と組み合わせて用いる。抗癌剤を単独で、または１もしくはそれ以上のＡＤＡＭ１０調節ペプチドと組み合わせて投与し、上記のように実験を行う。

【0165】

喘息モデル。本発明のＡＤＡＭ１０調節ペプチドが喘息において治療可能性を有するかどうかを決定するために、有効性試験を、ＴＨ_２依存性であるオボアルブミンモデルを用いて行う。手短に言うと、肥満細胞／ＩｇＥ依存性マウスモデルを用いる。以前にこのモデルを用いて、他の選択性の低い小分子ＡＤＡＭ１０阻害剤（Ｍａｔｈｅｗｓら， ２０１１）を試験した。１日目、３日目、５日目、７日目、９日目、１１日目、および１３日目に、１０μｇのオボアルブミンを、群あたり６匹の雌のＢａｌｂ／Ｃマウスに腹腔内注入する。ペグ化ＡＤＡＭ１０調節ペプチド（２．５ｍｇ／ｋｇ）または溶媒対照を１日おきに、または３日ごとに鼻腔内または腹腔内に投与する。オボアルブミン鼻腔内曝露（２０μｇ）を４０日目、４３日目、および４６日目に行う。４７日目に、最終曝露後の気道抵抗を測定する。ケタミン２０７ｍｇ／ｋｇおよびキラシジン４２ｍｇ／ｋｇを腹腔内注入することでマウスに麻酔をかける。カニューレを挿入し麻痺させた後、マウスに酸素を補給して、ベースライン肺機能を測定する。次いで、マウスをアセチルβメチルコリンクロリドに曝す。ニュートン抵抗、組織ダンピング、および組織エラスタンスを測定する。肺機能の判定後、気管支肺胞洗浄液を収集して、サイトカインおよびケモカイン解析のために保存する。細胞をペレット化し染色して、計数し、存在する細胞型および細胞量を決定する。多重比較を作成したら、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正とともに両側ｔ検定を用いてすべての統計を行う。さらに、マウスでの急性忍容性試験によって最大耐量を決定する。異なる薬物用量に反応しての苦痛の臨床徴候について、マウスを毎日モニターする。実験の終わりに動物を安楽死させて、肝臓、腸、心臓、内臓脂肪、腎臓、脳を保持し、組織損傷および毒性について調べる。

【0166】

狼瘡モデル。Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈｏｒｂｏｒ， Ｍａｉｎｅ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）からの１８～２２週齢の雌のマウス（ＮＺＢＷＦ１）を、それらの背部に３×３ｃｍの小部分を１０回テープ剥離して、損傷およびＣＬＥ症状の発症を誘発させた後、溶媒対照または化合物のいずれかを腹腔内投与する。この品種の雄のマウスはＣＬＥを発症しなく、ヒトにおいてもＣＬＥ患者の大部分は女性なので、雌のマウスだけを用いる。このモデルは以前にＣＬＥのためのモデルとして使用されてきた（Ｇｕｉｄｕｃｃｉら， ２０１０）。ＣＬＥ発症を確実にし、マウスの状態をモニターするための投薬の前に、最初の実験を５匹だけのマウスで行う。最初の実験が完了すると、投薬を開始する。２～３日ごとの投薬を３週間行った後、スコアリングを行う。生検組織をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋する。切片をヘマトキシリンとエオジンで染色する。群あたりの１１匹のマウスの複数の皮膚片を盲検形式で評価する。以下の組織学的特徴を評価して、１～３まで類別する：（ａ）表皮の厚さ；（ｂ）潰瘍の程度；（ｃ）上皮内炎症；（ｄ）皮膚炎症；および（ｅ）脂肪層の炎症。
組織学的悪性度分類を次のとおりに割り当てる：０：正常な皮膚構造、少数の真皮白血球、通常の付属器；１：軽度の炎症、軽微な表皮過形成、皮膚線維芽細胞増殖の徴候；２：中等度の炎症、過角化を伴う顕著な表皮過形成（表皮の厚さが２～４倍増加）、少数のマクロファージとともにかなりの白血球／好中球顆粒球の真皮内浸潤、中等度の真皮線維性硬化症、付属器の数の減少、および皮下脂肪組織の軽微な退行性変化；ならびに３：重度の炎症、過角化を伴う顕著な表皮過形成（表皮の厚さが４倍以上増加）、ケラチン充填クレーターと嚢胞の形成、表皮層のびまん性不連続（潰瘍形成）、大量の好中球とマクロファージを伴う広範囲な真皮内浸潤、顕著な皮膚線維性硬化症、付属器の消滅、および皮下脂肪組織の明白な退行性変化。異なるパラメータを別々にスコアし、総計して、総疾患スコアを得る。群間の統計的有意性をマン・ホイットニーのＵ検定で算出する。ＣＬＥの変化のための試験に加えて、腎機能および抗核抗体量を他の狼瘡の影響がプロドメイン処置によって減弱されるかを見るためにも決定する。ビリルビン、血液、血糖値、ケトン、ｐＨ、タンパク質、比重、尿沈渣、ウロビリノーゲンと尿沈渣、色、およびと外見を調べる尿検査を行う。臓器重量を測定し、脾臓、腎臓、肝臓、リンパ節、腸間膜、心臓の変化の解析および確認のために、組織を保存する。
実施例１０
ＡＤＡＭ１０調節ペプチドはイエダニ抗原に対するアレルギー反応を減少させる

【0167】

１日目～３日目に、野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスおよび／またはＢａｌｂ／ｃマウスの鼻腔内に、４０μＬの１またはそれ以上のＡＤＡＭ１０調節ペプチド、または溶媒対照を曝露し、続いて４日目に２５μＬの生理食塩水または１５μｇ／２５μＬのイエダニ抗原抽出物を曝露する。気管支収縮を、ＦＬＥＸＩＶＥＮＴ（商標）ブランドの呼吸解析システム（ＳＣＩＲＥＱ（登録商標）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｉｎｃ．， Ｍｏｎｔｒｅａｌ， Ｑｕｅｂｅｃ， Ｃａｎａｄａ）を使用して評価する。気道抵抗（Ｒｒ）を、メタコリンの投与量の増加（５、１０、２５ｍｇ／ｍＬ）で決定し、ＰＢＳベースラインからのパーセント増加として示す。

【0168】

ＢＡＬＦ上清を、上記のようにＥＬＩＳＡによってＭＵＣ５ＡＣタンパク質を解析し、細気管支周囲の血管周囲炎症性細胞浸潤について肺の形態を評価する。

【0169】

参考文献
以下に記載するすべの参考文献、ならびに本開示に引用されたすべての参考文献は、これらに限定されないが、すべての特許、特許出願およびそれらの公開、科学誌の論文、ならびにデータベースエントリー（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）データベースエントリーおよびその中の利用可能なすべてのアノテーション）を含んでおり、それら全体を参照により、本明細書で使用する技術、および／または組成物の背景、または教示方法を補充する、説明する、提供する程度まで本明細書に組み込まれている。

【表11】

【0170】

当然ながら、本発明の種々の詳細は、本発明の範囲から逸脱することなく変更されることが可能である。さらに、前述の説明は、説明のためだけであり、限定を目的としていない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10】

【図11】

【配列表】

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