特許 7448475 細胞関連アルファヘルペスウイルスワクチン用の改善された希釈液

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-04

(45)【発行日】2024-03-12

(54)【発明の名称】細胞関連アルファヘルペスウイルスワクチン用の改善された希釈液

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/12 20150101AFI20240305BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 39/245 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 39/255 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 39/265 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240305BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240305BHJP

【ＦＩ】

A61K35/12

A61K9/08

A61K39/00 H

A61K39/245

A61K39/255

A61K39/265

A61K47/02

A61K47/20

A61K47/26

A61P31/12

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2020533609

(86)(22)【出願日】2018-12-19

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-02-22

(86)【国際出願番号】 EP2018085801

(87)【国際公開番号】W WO2019121888

(87)【国際公開日】2019-06-27

【審査請求日】2021-11-24

(31)【優先権主張番号】17208992.2

(32)【優先日】2017-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】510000976

【氏名又は名称】インターベット インターナショナル ベー． フェー．

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100203035

【弁理士】

【氏名又は名称】五味渕 琢也

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100202267

【弁理士】

【氏名又は名称】森山 正浩

(74)【代理人】

【識別番号】100182132

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】デ・グルーフ，アド

(72)【発明者】

【氏名】フェルステーヘン，イワン

【審査官】松浦 安紀子

(56)【参考文献】

【文献】NICHOLAS R A; ET AL，A COMPARISON OF TITRATION METHODS FOR MAREK'S DISEASE VACCINES，JOURNAL OF BIOLOGICAL STANDARDIZATION，英国，ACADEMIC PRESS，1978年12月31日，VOL:7, NR:1，PAGE(S):43 - 51，http://dx.doi.org/10.1016/S0092-1157(79)80036-0

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３９／２４５

Ａ６１Ｋ ３９／２５５

Ａ６１Ｋ ３９／２６５

Ａ６１Ｋ ３９／００

Ａ６１Ｋ ４７／２６

Ａ６１Ｋ ４７／０２

Ａ６１Ｋ ４７／２０

Ａ６１Ｐ ３１／１２

Ａ６１Ｋ ９／０８

Ａ６１Ｋ ３５／１２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染した細胞の使用中の安定化のための希釈剤の使用であって、
当該希釈剤がリン酸緩衝液および約１００～３５０ｍＭのスクロースを含み、
当該希釈剤がタンパク質を含まないこと、および
当該希釈剤がグルタミン酸塩を含まないことを特徴とする、使用。

【請求項2】

前記細胞関連アルファヘルペスウイルスが、マルディウイルスおよびイルトウイルスから選択される属のものであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記細胞関連アルファヘルペスウイルスが、マレク病ウイルスおよびシチメンチョウのヘルペスウイルスから選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。

【請求項4】

前記細胞が、鳥類線維芽細胞であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項5】

前記希釈剤が約７．０～約７．８の範囲のｐＨを有することを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか一項に記載の使用であって、
前記希釈剤が、タンパク質を含まず、
前記希釈剤が、細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染した細胞の使用中の安定化用のものであって、
前記細胞関連アルファヘルペスウイルスが、ＭＤＶおよびＨＶＴから選択され、
約７．０～７．５の範囲のｐＨを有し、
リン酸緩衝液中に約１～約４ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４と約５～約９ｍＭの濃度のＮａ_２ＨＯ_４を含み、
スクロースが約１００～３５０ｍＭであり、
ナトリウムが約５０～２５０ｍＭであり、
フェノールスルホンタレインが、約０．０１～０．０２ｍｇ／ｍｌで構成されている、使用。

【請求項7】

細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染した細胞の使用中の安定化方法であって、
請求項１～６に記載の希釈剤と前記感染細胞とを混合する工程を含む方法。

【請求項8】

細胞関連アルファヘルペスウイルスに対するワクチンであって、
当該ワクチンは、前記ウイルスに感染した細胞を含み、
当該細胞が請求項１～６に記載の希釈剤に懸濁されていることを特徴とする、ワクチン。

【請求項9】

前記ワクチンが鳥類用であり、
前記細胞関連アルファヘルペスウイルスがＩＬＴＶ、ＭＤＶおよびＨＶＴから選択されることを特徴とする、請求項８に記載のワクチン。

【請求項10】

請求項８または９に記載のワクチンの調製方法であって、
前記細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染した細胞と、請求項１～６に記載の希釈剤とを混合する工程を含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ワクチン学の分野に関し、より具体的には本発明は、細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染した細胞の使用中の安定化のための希釈剤の使用に関し、さらに本発明は、前記使用中の安定化方法、細胞関連アルファヘルペスウイルスに対するワクチン、および前記ワクチンの調製方法に関する。

【背景技術】

【0002】

アルファヘルペスウイルスは、人間および地球上のほとんどすべての動物種にとって重要な病原体であり、それ故、営農に関連する動物種にとっても重要である。安価かつ効果的に感染症や病気から保護を提供するための選択方法は、ワクチン接種によるものである。たとえば、商業的養鶏事業では、家禽産業において動物福祉と経営の経済性との両方に関連の高い疾患である、マレク病および伝染性喉頭気管炎に対して、鳥にワクチンを接種するのが一般的である。詳細は、例えばメルク獣医マニュアル（２０１０年、第１０版２０１０、ＣＭ Ｋａｈｎ編、ＩＳＢＮ：０９１ １９１０９３Ｘ）、および「家禽の病気」（２００８年、第１２版、Ｙ．Ｓａｉｆ編）、アイオワ州立大学プレス、ＩＳＢＮ－１０：０８１３８０７１８２）に記載される。

【0003】

鳥喉頭気管炎は、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）によって引き起こされる家禽の呼吸器疾患で、ガリペスヘルペスウイルス１または鳥ヘルペスウイルス１とも呼ばれる。ＩＬＴＶは、アルファヘルペスウイルス亜科のｌｌｔｏｖｉｒｕｓ属に属している。感染は、呼吸困難を引き起こし、あえぎや血中滲出液の喀出を伴う。ＩＬＴＶによる感染は急速に広がり、感染した群れの最大１００％に影響を与える可能性がある。この疾患は、産卵の減少、体重減少、二次感染に対する感受性の増加、さらには全身性死亡を引き起こす可能性がある。ＩＬＴＶには弱毒生ワクチンが存在するが、これらは残留毒性または毒性への復帰という潜在的な危険を伴う。近年、Ｉｎｎｏｖａｘ（商標）－ＩＬＴなどのベクターに基づくワクチンが記載されている。以下参照。

【0004】

マレク病は家禽の感染力の高い病気であり、世界中で発生している。疾患の典型的な兆候は、いくつかの臓器や神経のＴ細胞リンパ腫である。これは、とりわけ麻痺や死亡率をはじめとする様々な症状につながる可能性があるが、屠殺時の産卵損失や廃棄についても同様である。マレック病は、アルファヘルペスウイルス亜科のマルディウイルス属に属するマレック病ウイルス（ＭＤＶ）によって引き起こされる。

【0005】

ＭＤＶは生物学的および血清学的特性に基づいて分類学的に３つの主要な血清型に分類されている：ガリドヘルペスウイルス２としても知られるＭＤＶ血清型１（ＭＤＶ１）は、家禽に対して発がん性であるため、マレック病の主な原因であり、異なる病原型が軽度から非常に毒性であると記載されている。弱毒化生ウイルスワクチンに使用される弱毒化ＭＤＶ１株が開発されており、ＭＤＶ１株の例は、ＲＢ１ Ｂ、８１４、およびＣＶＩ－９８８ Ｒｉｓｐｅｎｓ (Ｃｕｉら、２０１３、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、ｖｏｌ．８： ｅ５３３４０）であり、例えば: Ｎｏｂｉｌｉｓ（商標） Ｒｉｓｍａｖａｃ （ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）中のものである。

【0006】

ＭＤＶ血清型２（ＭＤＶ２）（ガリペスヘルペスウイルス３とも呼ばれる）は、家禽に対して病原性がほとんどない。例えば、ＳＢ１株に基づく（Ｐｅｔｈｅｒｂｒｉｄｇｅら、２００９、Ｊ.Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈ．，ｖｏｌ．１５８，ｐ．１１）、たとえば、Ｎｏｂｉｌｉｓ（商標）Ｍａｒｅｘｉｎｅ ＳＢ１（ＭＳＤアニマルヘルス）におけるもののような、生ワクチン株が開発されている。

【0007】

最後に、ＭＤＶ血清型３はメレアグリド（meleagrid）ヘルペスウイルス１としても既知であるが、一般的には七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）と呼ばれている。ＨＶＴは１９７０年に初めて開示され（Ｗｉｔｔｅｒら、１９７０、Ａｍ. Ｊ. Ｖｅｔ. Ｒｅｓ.、ｖｏｌ．３１、ｐ．５２５）、無病原性である。しかし興味深いことに、ＨＶＴによるワクチン接種は、血清型１および２のＭＤＶに対する交差防御免疫を提供し、このウイルスをＭＤＶ１及び２に対する生ワクチンの基礎として自然に適合させている。その結果、ＨＶＴによるワクチン接種は現在、農業のほぼすべての生まれたばかりのひよこに適用されており、世界中で毎年最大５０億回分のＨＶＴワクチンが投与されている。

【0008】

ＨＶＴワクチンは一般に、たとえばＮｏｂｉｌｉｓ（商標）Ｍａｒｅｘｉｎｅ ＣＡ１２６（ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）のように、ＰＢ１やＦＣ－１２６などの株に基づいている。

【0009】

ＭＤＶの非常に毒性の強い変異株に対する防御が必要な場合は、ＭＤＶ１又はＭＤＶ２ワクチン株を用いたＨＶＴワクチンの併用ワクチンを適用してもよい。

【0010】

ＭＤＶワクチンは、例えば２０１３年４月のヨーロッパ薬局方の研究論文０５８９に記載されている。

【0011】

ＨＶＴとＭＤＶは鳥の末梢血リンパ球で複製し、長期間の免疫応答を誘発する。これは、他のトリ病原体由来の様々な免疫原性タンパク質の発現および家禽への送達のためのウイルスベクター－ワクチンとしてのＭＤＶまたはＨＶＴの使用にも適用される（例えば、国際公開第８７／０４４６３号および国際公開第２０１３／０８２３１７号参照）。長年にわたり、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）由来の融合蛋白質遺伝子（Ｆ遺伝子）（Ｓｏｎｄｅｒｍｅｉｊｅｒら、１９９３、Ｖａｃｃｉｎｅ、ｖｏｌ．１１、ｐ．３４９－３５８）；感染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のウイルス蛋白質２（ＶＰ２）遺伝子（Ｄａｒｔｅｉｌら、１９９５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．２１１、ｐ．４８１－４９０）；ＩＬＴＶの糖蛋白質Ｄ及びＩ蛋白質遺伝子（ｇＤ／ｇＩ）；およびエイメリア寄生虫表面抗原のＥａ１ａ遺伝子（Ｃｒｏｎｅｎｂｅｒｇら、１９９９、Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ.、ｖｏｌ．４３、ｐ．１９２－１９７）など、多くの異種遺伝子がこれらのベクターにおいて発現してきた。

【0012】

これによって、さまざまな商用ＨＶＴベクターワクチン製品、例えば、ＮＤＶ－Ｆ遺伝子：Ｉｎｎｏｖａｘ（商標）ＮＤ、Ｖｅｃｔｏｒｍｕｎｅ（商標）ＨＶＴ－ＮＤＶ（Ｃｅｖａ）、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子：Ｖａｘｘｉｔｅｋ（商標）ＨＶＴ＋ＩＢＤ（Ｍｅｒｉａｌ、以前の名前はＧａｌｌｉｖａｃ（商標）ＨＶＴ－ＩＢＤ）、Ｖｅｃｔｏｒｍｕｎｅ（商標）ＨＶＴ－ＩＢＤ（Ｃｅｖａ）；およびＩｎｎｏｖａｘ（商標）ＬＴのＩＬＴＶ ｇＤ／ｇｌ遺伝子を使用したものが誕生した。ＩｎｎｏｖａｘワクチンはすべてＭＳＤアニマルヘルスのものである。

【0013】

ＨＶＴに異種遺伝子を複数挿入することも可能である。たとえば、Ｉｎｎｏｖａｘ（商標）ＮＤ－ＩＢＤのようにＮＤＶ－Ｆ及びＩＢＤＶ－ＶＰ２遺伝子を挿入することができる。また、ＨＶＴベクターワクチンは、ＭＤＶ血清型１または２の古典的なＭＤＶワクチン株（Ｉｎｎｏｖａｘ（商標）ＮＤ－ＳＢなど）と組み合わせることもできる。

【0014】

あるいは、ＨＶＴベクターは、治療用タンパク質、例えばサイトカインの発現および送達のために使用され、ニワトリの免疫応答を制御する（国際公開第２００９／１５６３６７号；およびＴａｒｐｅｙら、２００７、Ｖａｃｃｉｎｅ、ｖｏｌ．２５、ｐ．８５２９－８５３５）。

【0015】

いくつかのアルファヘルペスウイルスはある程度、細胞関連ウイルスである。例としては、水痘帯状疱疹ウイルス、ＩＬＴＶ、ＭＤＶおよびＨＶＴが挙げられる。かかるウイルスは、複製が完了しても宿主細胞を（完全には）溶解しない。その結果、このタイプのウイルスは感染した宿主動物内で細胞間接触を介して広がる。他の動物への広がりは感染した細胞の移動によって起こる。たとえば、ＭＤＶとＨＶＴの場合、これは、感染した鳥の羽毛から放出される感染した皮膚細胞の吸入により、ｉｎ ｖｉｖｏでのウイルス感染が広がることを意味する。

【0016】

生まれたばかりのヒヨコは、生後１日からＭＤＶの感染圧力に直面する。幸いなことに、ＨＶＴおよびＨＶＴ－ｖｅｃｔｏｒワクチンは、安全で、（細胞関連の場合）母体由来の抗体に対して比較的鈍感であるため、非常に早い時期に鶏に適用できる。その結果、ＨＶＴワクチンは、卵から孵化した日（１日目）、または孵化前であっても、まだ卵の中にいるヒナに接種される。この最後のアプローチ、いわゆる「卵内ワクチン接種」は、胚のワクチン接種の一種であり、（鶏の場合）一般的に胚発生（ＥＤ）の１８日目、孵化の約３日前に適用される。この種の予防接種は現在、自動化機器を使用して一般的に行われている。

【0017】

最初のＨＶＴワクチンは１９６０年代の終わりに開発された。歴史的概要は、Ｓｃｈａｔ（２０１６、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ、ｖｏｌ．６０、ｐ．７１５－７２４)によって提供される。当初、主な焦点は無細胞の凍結乾燥ワクチンの開発であった。このタイプのワクチンでは、無細胞ＨＶＴを調製し、ＳＰＧＡと呼ばれるバッファーでショ糖、リン酸、グルタミン酸、およびアルブミンを安定化した（Ｃａｌｎｅｋら、１９７０、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２０、ｐ．７２３－７２６)。ＳＰＧＡは、高品位水中、以下を含む：ショ糖：２１８ ｍＭ（７４．６ｍｇ／ｍｌ）；リン酸一カリウム：３．８ｍＭ（０．５２ｍｇ／ｍｌ）;リン酸二カリウム：７．２ｍＭ（１．２６ｍｇ／ｍｌ）；グルタミン酸一ナトリウム：４．９ｍＭ；および１％ｗ／ｖのウシアルブミン。ＳＰＧＡの任意の変形は、０．２％ｗ／ｖナトリウムエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）の添加、および／または、同じ濃度のタンパク質加水分解物による１％ＢＳＡの置き換えであった。あるいは、ＢＳＡはゼラチン、またはポリビニルピロリドンで置き換えることができる。単純な（plain）ショ糖－リン酸緩衝液でさえも凍結乾燥ＨＶＴワクチンを再構成するために記載されている。スクロース－リン酸緩衝液でさえ、凍結乾燥されたＨＶＴワクチンを再構成することが記載されている。

【0018】

しかし、凍結乾燥ＭＤＶワクチンの有効性は、細胞関連ワクチンの有効性ほど良好ではないことがすぐに理解された。しかし、そのようなワクチンは、ウイルスだけでなく感染した宿主細胞も安定化させるために、はるかに複雑な予防策を必要とした。これは例えば、Ｚａｎｅｌｌａ＆Ｇｒａｎｅｌｌｉ（１９７４、Ａｖｉａｎ Ｐａｔｈｏｌ．、ｖｏｌ．３、ｐ．４５－５０）、およびＤａｍｍ（１９７４、Ｂｕｌｌ． Ｐａｒｅｎｔ． Ｄｒｕｇ Ａｓｓｏｃ．、ｖｏｌ．２８、ｐ．９８－１０２）に記載される。また、コルウェルら（１９７５、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．、ｖｏｌ．１９、ｐ．７８１－７９０）は、細胞関連ＭＤＶワクチンの多くの市販の希釈剤を比較したが、それらの組成についての詳細は提供されていない。比較は、ＴＰＢ（トリプトースリン酸ブロス）を基準としたものであり、これは、ブドウ糖、塩、リン酸塩、および２％ｗ／ｖトリプトースを含み、膵酵素による酵素的加水分解に由来するウシミルクカゼインのペプトン（アミノ酸とペプチドとの混合物）である。

【0019】

Ｇｅｅｒｌｉｇｓ＆Ｈｏｏｇｅｎｄａｍ（2007、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ、ｖｏｌ．51、ｐ．９６９－９７３）は、ＣＶＩ－９８８株の細胞関連ＭＤＶ１ワクチンを解凍および希釈するための条件に関する研究を開示している。使用する希釈剤は、ＳＰＧＡ／ＥＤＴＡまたはＰｏｕｌｖａｃ（商標）Ｍａｒｅｋワクチン（Ｚｏｅｔｉｓ）の市販の希釈剤である。Ｐｏｕｌｖａｃ Ｍａｒｅｋの「製品特性の要約」（ＳｍＰＣ）は、この希釈剤の組成を次のように説明している。スクロース：５１．２ｍｇ／ｍｌ（１５０ｍＭ）；（一）リン酸二水素カリウム：０．５２ｍｇ／ｍｌ（３．８ｍＭ）;（二）リン酸一水素カリウム：１．２６ｍｇ／ｍｌ（７．２ｍＭ）；Ｎ－Ｚ－アミン：１５ｍｇ／ｍｌ（１．５％ｗ／ｖ）;およびｐＨインジケーター。

【0020】

同様に、Ｎｏｂｉｌｉｓ（商標）ワクチン用希釈液のＳｍＰＣ：Ｎｏｂｉｌｉｓ（商標）希釈剤ＣＡは、その構成成分を「スクロース、カゼインの膵臓消化物、リン酸一カリウム」と説明し、ｐＨインジケーターを含む。この希釈剤では、ペプトンの濃度は１．４％ ｗ／ｖでである。

【0021】

１９７０年代半ば以降、細胞関連ＭＤＶ及びＨＶＴワクチンによるワクチン接種は、家禽業界の標準となっている。これは、すべてのプロセスが宿主細胞とワクチンウイルスの両方に対して最適でなければならないため、ＭＤＶ、ＨＶＴおよびＨＶＴベースのベクターの細胞関連ウイルスの生産、ならびに、これらのワクチンの何百万回もの用量の出荷は非常に困難である。主な問題は、適切な宿主細胞の限られた利用可能性、およびウイルスの相対的な不安定性である。

【0022】

宿主細胞に関して：ＩＬＴＶ、ＭＤＶおよびＨＶＴウイルスの増殖は鳥類細胞に限られている。そのタイプのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養に利用できる安定した細胞株はほとんどなく、これらのウイルスが高力価に成長するのはごくわずかである。したがって、培養は通常、新しく調製された初代細胞で行われる。たとえば、新鮮なニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）は、トリプシン消化を使用して、生後１０日のニワトリ胚から数日ごとに調製される。骨の折れるプロセスであることに加えて、一次細胞の品質はバッチごとのばらつきを示すこともある。この点で有望な開発は、国際公開２０１６／０８７５６０号に記載されているように、組み換えにより不死化されたＣＥＦ系統の作製である。

【0023】

安定性に関して：これらのウイルスの細胞関連の性質は重要な要素であり、ウイルスの生存は宿主細胞の活力に大きく依存する。ＩＬＴＶは無細胞ウイルスとして非常に容易に入手できるが、ＨＶＴおよびＭＤＶの場合、これは（極めて）低い範囲に適用され、ホストセル内では（極めて）より安定している。したがって、ＭＤＶおよびＨＶＴの無細胞凍結乾燥ワクチンが利用可能であるが、市販のＭＤＶおよびＨＶＴワクチンの大部分と、ＨＶＴべースのベクターワクチンは、ウイルス感染細胞の濃縮懸濁液として提供され、これは、密封されたガラス製アンプルであり、凍結して保管され、液体窒素で保管される。その後、「コールドチェーン」は、液体窒素の容器に入ったワクチンを世界中のエンドユーザーに出荷することによって維持される。このことは、ロジスティック的には非常に厳しいものであることが明らかである。

【0024】

細胞関連ワクチンの不適切な保管または取り扱いは、ワクチンウイルスの力価の喪失につながり、標的が完全な用量を受け取らず、それによって防御効果が低下する可能性がある。ウイルスに感染した宿主細胞を安定させるため、それらは一般に（子牛）血清とＤＭＳＯを含む凍結保護培地で凍結される。使用の直前に、ワクチンは急速に解凍され、用量あたりの正しい力価に希釈される。これは通常、感染した細胞懸濁液の１：２５～１：１００の希釈で、ワクチンと一緒に送達できる希釈液で再構成することによって行われる。希釈剤は、対象動物のグループにワクチンを投与するのにかかる時間、通常１～２時間の間、使用中の安定性を提供する。

【0025】

マレク病とＩＬＴに対するワクチンの毎年必要とされる膨大な数の投与量を考慮すると、特にこれらのワクチンの要求の厳しい生産とロジスティックスに関連して、ウイルス力価から可能な限り多くを回収して、そのようなワクチン接種を必要とする動物を標的とする。一般に、標準希釈液での再構成により、室温で２時間の使用中に力価の損失が０．４～０．６Ｌｏｇ１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌに減少する。ただし、一部のＨＶＴベクターワクチンでは、ウイルス力価の損失が高くなる場合がある。これらの損失は、より高い開始力価を提供することによって補償される。

【0026】

したがって、本発明の目的は、先行技術の欠点を克服し、細胞関連アルファヘルペスウイルスワクチンの再構成に使用される希釈剤を改善する方法および手段を提供することにより、この分野のこの必要性に対応することである。

【0027】

驚くべきことに、細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染した細胞用の修正希釈剤を使用することにより、この目的を達成することができ、その結果、先行技術の1つまたは複数の欠点を克服できることが見出された。修正された希釈剤は、この分野においてこの目的のために通常使用される希釈剤と比較して、タンパク質性成分の量がはるかに少なくなっている。

【0028】

この希釈液を使用すると、使用中の安定性が向上する。これによって、解凍後の最も敏感な細胞関連アルファヘルペスウイルスの力価の損失を、ワクチンの再構成後、室温、４時間で０．４Ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍｌ以下に低減することができる。力価損失に関するこの有利な減少は、この産業部門に大きな経済的関連性がある。

【0029】

ＭＤＶやＨＶＴなどの細胞関連アルファヘルペスウイルスワクチンの希釈液に、大量のタンパク質性化合物、通常、現在の市販の希釈剤中、１．４～１．５％ｗ／ｖのタンパク質を使用することは４０年以上前から一般的であったため、これは驚くべきことである。

【0030】

それにもかかわらず、発明者らは、優れた使用安定性を提供しながらも、希釈剤中のタンパク質の濃度を大幅に、０．５％ｗ／ｖ未満にまで、さらにはゼロまで下げることができることを見出した。

【0031】

本発明は、提供されるアルファヘルペスウイルスワクチンウイルスのより完全な使用を可能にするか、あるいは、損失の補償として提供される必要のある過剰なウイルスを少なくする。

【0032】

修正された希釈剤が、タンパク質を含まない形態で使用される場合、最も重要な利点が達成される。コスト削減－タンパク質加水分解物は比較的高価な成分である；安全性の向上－外来物質の導入リスクの低減；生産の効率－各生産の実行後に生産ラインを洗浄する必要性を回避する；生産の一貫性の向上－新規な希釈液には、不明確なバルク化合物が含まれなくなったため、成分の品質の制御性と最終製品の再現性が大幅に向上した。さらに、タンパク質を含まない希釈剤は、「動物性成分を含まない」だけでなく、「化学的に定義」されており、これらは安全性と一貫性の重要な側面である。また、希釈剤の成分すべてを滅菌することができる。

【0033】

希釈液のタンパク質含有量を、安定化特性に影響を与えることなく、どのようにして、または、なぜ大幅に減らすことができるかは、正確にはわかっていない。発明者はこれらの発見を説明するかもしれない理論やモデルに縛られることを望まないが、彼らは、一般的に使用されたタンパク質成分が実際には完全に有益ではなかったのではなく、むしろ変動する負の効果を、例えば希釈剤のｐＨに対してもたらしたのではないかと推測する。そのような妨害作用の低減または除去さえすれば、糖を含む緩衝溶液は、使用期間中にウイルス感染細胞の効果的な安定化を提供することができる。

【0034】

したがって、一態様において、本発明は、細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染した細胞の使用中の安定化のための希釈剤の使用に関し、希釈剤は、糖、リン酸緩衝液および約０．７％ｗ／ｖ以下のタンパク質を含有する。

【0035】

本発明による希釈剤の使用は、ウイルス感染細胞が冷凍貯蔵から取り出された後、それらを再構成するのに役立つ。希釈剤は感染した細胞の健康の回復を助け、室温で数時間その健康を維持する。次いで、希釈剤中の再構成された感染細胞を、そのような治療を必要とするヒトまたは動物の標的に投与することができる。

【0036】

「使用中」の語は、欧州薬局方や９ ＣＦＲなどのいくつかの規制ガイドラインで使用されている、使用中の安定性と使用中の保管寿命に関する要件を指す一般的な意味を指す。

【0037】

本発明に関し、使用期間は、細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染した細胞が本発明の希釈剤に含まれる期間である。この期間は、感染した細胞（通常は解凍した細胞懸濁液）と希釈液の混合時に始まり、希釈液中の感染した細胞を標的に投与することで終了する。

【0038】

本発明による使用のための「希釈剤」は、水性液体である。希釈剤はヒトまたは動物の標的への投与を目的としているため、医薬品製造の適切な基準に従って、たとえば無菌で、本質的に発熱物質を含まないように調製する必要がある。

【0039】

ウイルスが、複製サイクルの完了後、宿主細胞内に多かれ少なかれ残っている場合、「細胞関連」である。細胞関連アルファヘルペスウイルスの例は、水痘帯状疱疹ウイルス、ＩＬＴＶ、ＭＤＶおよびＨＶＴである。

【0040】

本発明の「糖」は、典型的には甘味を有する比較的低分子量の水溶性炭水化物の群からの任意の化合物である。「糖」の語は、還元糖（フルクトースおよびマルトースなど）、非還元糖（スクロースおよびトレハロースなど）、糖アルコール（キシリトールおよびソルビトールなど）、糖酸（グルコン酸および酒石酸など）、ならびに、それらの混合物を包含する。糖の語は、単糖類、二糖類または多糖類、六糖類までを含む。

【0041】

本明細書で使用される「含む（comprise）」（ならびに「含む（comprise）」、「含んでいる（comprising）」、および「含んだ（comprised）」などの変形）の語は、すべての要素を指すことを意図し、本発明について考えられるあらゆる可能な組み合わせにおいて、または、この語が使用されているテキストセクション、段落、請求項などに包含されるか、または、含まれる。そのような要素または組み合わせが明示的に列挙されていなくても、そのような要素または組み合わせのいずれも除外されない。

【0042】

したがって、そのようなテキストセクション、段落、請求項などは、「含む（comprise）」の語（またはその変形）が「からなる（consist of）」、「からなる（consisting of）」または「から本質的になる（consist essentially of）」などの語によって置き換えられた１以上の実施形態にも関連する。

【0043】

「タンパク質」の語は、２以上のアミノ酸を有する分子を指す。タンパク質は、天然もしくは成熟タンパク質、プレタンパク質もしくはプロタンパク質、またはタンパク質の一部であり得る。とりわけ、ペプチド、オリゴペプチドおよびポリペプチドはタンパク質の定義に含まれる。本発明に関して、タンパク質は、純粋な、精製された、または単離されたタンパク質であり得、または異なるタイプおよびサイズの２つ以上の異なるタンパク質を含む、多かれ少なかれ粗製の調製物であり得る。粗タンパク質調製物の例は、タンパク質抽出物、またはタンパク質源の酵素消化物もしくは加水分解物である。タンパク質源は、動物起源または植物起源であり得る。抽出物の調製のための一般的なタンパク質源の例は、牛乳カゼイン、動物の皮、動物の肉または組織、酵母および大豆である。

【0044】

本発明の場合、本発明による使用のための希釈剤中のタンパク質の量は、希釈剤中のタンパク質の総量を指し、「％ｗ／ｖ」、すなわち、体積当たりの重量のパーセンテージとして決定される。このパーセンテージは、希釈剤自体の容量に基づいて決定され、したがって、感染細胞と希釈剤との混合により調製される、投与準備ができている最終的なワクチン組成物に基づいて決定されるべきではない。

【0045】

同様に、本発明による使用のための希釈剤中のタンパク質の量は、感染細胞との混合前に、希釈剤自体について決定される。これは、そのような感染細胞が通常、一定量のタンパク質を含む豊富な凍結培地に含有されるためである。

【0046】

本明細書に記載の本発明による使用のための希釈剤の組成の詳細および濃度を損なうことなく、希釈剤はまた、より濃縮された形態、例えば２回以上の濃縮で、例えば、製造、販売、または貯蔵され得る。次に、この濃縮された形態の希釈剤は、本発明による使用の前に、その最終的な１倍濃度に希釈される。希釈剤のこのような濃縮は、例えば物流上の理由から、体積を減らし、包装および輸送のコストを節約するのに有利である。

【0047】

本発明の好ましい実施形態およびさらなる態様の詳細を以下に説明する。

【0048】

本発明に関して、「約」は、数がその示された値の周囲で±１０％の間で変動し得ることを示す。好ましくは、「約」はその値の周囲±９％を意味し、より好ましくは「約」はその値の周囲±８、７、６、５、４、３、２％を意味し、さらに「約」はその値の周囲±１％を意味し、優先順位はこの順である。

【0049】

記載されたとおり、本発明による使用のため、希釈剤中にタンパク質をほとんどまたは全く含まないことが非常に有利である。

【0050】

したがって、本発明による使用の実施形態では、希釈剤は、約０．４５％ｗw／ｖ以下のタンパク質を含む。好ましくは、希釈剤は、約０．６、０．５、０．４５、０．４、０．３５、０．３、０．２５、０．２、０．１５、０．１、０．０５、０．０３、０．０１％ｗ／ｖ以下のタンパク質を、この優先順で含む。

【0051】

したがって、本発明による使用の好ましい実施形態では、希釈剤は、約０．１％ｗ／ｖ以下のタンパク質を含む。

【0052】

本発明による使用のより好ましい実施形態において、希釈剤はタンパク質を含まない。

【0053】

「タンパク質を含まない」とは、希釈剤にタンパク質性化合物が含まれていないことを意味する。すなわち、それはタンパク質を実質的に含まず、タンパク質、加水分解物などは、希釈剤の調製に添加または使用されない。ただし、これは、希釈液中の微量のタンパク質の存在を除外するものではなく、これは、高度または高感度の方法と機器を使用して検出できる場合がある。本発明に関し、希釈剤は、タンパク質を０．０００１％ｗ／ｖ以下、すなわち、希釈剤１リットルあたりタンパク質１ｍｇ以下を１倍濃度で含む場合、タンパク質を含まない。

【0054】

本発明では、片側または両側の範囲の表示は、言及されたエンドポイントを包含することを意図する。

【0055】

記載されたとおり、本発明による使用のための希釈剤は、細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染した細胞と共に使用するのに特に有利である。

【0056】

本発明による使用の実施形態では、細胞関連アルファヘルペスウイルスは、マルディウイルスおよびイルトウイルスから選択される属のものである。

【0057】

好ましくは、細胞関連アルファヘルペスウイルスは、水痘帯状疱疹ウイルス、ＩＬＴＶ、ＭＤＶおよびＨＶＴから選択される。

【0058】

本発明による使用のより好ましい実施形態では、細胞関連アルファヘルペスウイルスは、ＭＤＶおよびＨＶＴから選択される。

【0059】

本発明による使用の実施形態では、細胞関連アルファヘルペスウイルスはシチメンチョウのヘルペスウイルスである。

【0060】

「アルファヘルペスウイルス」とは、形態学的、ゲノム的、生化学的特徴などの分類学的グループメンバーの特徴的な機能や、生理学的、免疫学的、または病理学的行動などの生物学的特徴を持つ、アルファヘルペスウイルス亜科のウイルスを指す。同様のことが、マルディウイルスやイルトウイルスなどの属への参照、および個々のウイルス種の名前への参照にも当てはまる。

【0061】

この分野で既知のとおり、特定の分類群における微生物の分類は、そのような特徴の組み合わせに基づいている。したがって、本発明は、アルファヘルペスウイルスの種も含み、それらは、それから何らかの方法で、例えば亜種、株、分離株、遺伝子型、変異体、亜型または亜群などとして亜分類される。

【0062】

さらに、本発明のアルファヘルペスウイルスの特定の亜科、属または種が現在そのグループに割り当てられている可能性があることは、本発明の分野の当業者には明らかであろう。新しい洞察は、新しいまたは異なる分類群への再分類につながる可能性がある。ただし、これは微生物自体またはその抗原性レパートリーを変更するのではなく、その学名または分類のみを変更するため、そのような再分類された微生物は本発明の範囲内に留まる。

【0063】

本発明で使用するための細胞関連アルファヘルペスウイルスのサンプルは、様々な供給源、例えば人間から、または野生または農場の動物から、あるいはさまざまな研究所、（寄託）施設、または（獣医）大学からフィールド分離株として取得することができる。本発明の細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染する宿主細胞は、好ましくは鳥起源であり、そのような細胞は、鳥類に対して感染性である細胞関連アルファヘルペスウイルスの複製に最適な条件を提供することが分かっている。

【0064】

本発明に関して、「鳥類」は、分類学的クラスＡｖｅｓの生物を指す。好ましくは、宿主細胞のドナー動物は、鶏、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ヤマウズラ、クジャク、ウズラ、ハト、キジ、ホロホロチョウ、またはダチョウなどの農業関連の鳥である。

【0065】

より好ましいのは、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルおよびガチョウからなる群から選択される鳥類である。宿主細胞のためのさらにより好ましいトリドナー生物は鶏である。

【0066】

本発明による使用の実施形態では、感染した細胞は、鳥類の線維芽細胞である。

【0067】

鳥類および線維芽細胞起源のものとして細胞を特徴付ける方法は、核型分析、および細胞によって発現される特定のマーカーの検出など、いくつかの周知技術によって存在する。

【0068】

細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染している本発明の鳥類細胞は、鳥類動物またはその一部から調製された初代細胞であり得る。好ましくは、鳥類細胞はニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）である。

【0069】

あるいは、そして好ましくは、鳥類細胞は二次細胞であり、すなわち、細胞株由来である。

【0070】

さらにより好ましくは、本発明の細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染した鳥類細胞は、国際公開第２０１６／０８７５６０号に記載されている不死化ＣＥＦの細胞株に由来する。

【0071】

本発明による使用のために感染細胞を再構成および安定化するため、本発明による使用のための希釈剤は、好ましくはそれらの細胞の最適ｐＨまたはその近くのｐＨを有する。ＭＤＶ、ＨＶＴまたはＩＬＴＶに感染する可能性のある細胞の場合、このことは、ｐＨが好ましくは約７．０～約７．８の範囲であることを意味する。

【0072】

したがって、本発明による使用の実施形態では、希釈剤は、約７．０～約７．８の範囲のｐＨを有する。

【0073】

より好ましくは、本発明による使用のための希釈剤は、約７．１～約７．７の範囲のｐＨ、より好ましくは、約７．１～約７．６の範囲のｐＨを有する。

【0074】

さらにより好ましい実施形態では、本発明による使用のための希釈剤は、約７．１～約７．５の範囲のｐＨを有する。

【0075】

本発明による使用のための希釈剤のｐＨを所望のレベルに確立および維持するため、希釈剤はリン酸緩衝液を含む。

【0076】

本発明による使用の好ましい実施形態では、希釈剤中のリン酸緩衝液は、一塩基性リン酸二水素および二塩基性リン酸一水素の混合物からなる、いわゆるゴモリ緩衝液（Gomori buffer）である。リン酸化合物は、例えばナトリウム塩またはカリウム塩などの任意の一般的な塩から誘導することができ、それによって両方が同じタイプの塩であるか、または異なってもよい。これらのリン酸化合物にはいくつかの同義語があり、例えば、Ｎａ_２ＨＰＯ_４は、リン酸ナトリウム二塩基性またはリン酸水素二ナトリウムと呼ばれる。同様に、ＫＨ_２ＰＯ_４は、リン酸一カリウム、またはリン酸二水素カリウムと呼ばれる。

【0077】

本発明による使用の好ましい実施形態では、希釈剤中のリン酸緩衝液は、Ｎａ_２ＨＰＯ_４およびＫＨ_２ＰＯ_４からなる。

【0078】

好ましくは、組み合わされたリン酸緩衝液は、約５～２５ｍＭの濃度である。より好ましくは、組み合わされたリン酸緩衝液は、約１０ｍＭの濃度である。

【0079】

好ましくは、Ｎａ_２ＨＰＯ_４は約５～約９ｍＭの濃度であり、ＫＨ_２ＰＯ_４は約１～約４ｍＭの濃度である。好ましくは、Ｎａ_２ＨＰＯ_４は約８ｍＭであり、ＫＨ_２ＰＯ_４は約２．５ｍＭである。

【0080】

本発明の細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染した細胞を安定化するため、本発明による使用のための希釈剤は糖を含む。

【0081】

本発明による使用の実施形態では、希釈剤中の糖は、グルコース、ラクトース、スクロース、マルトース、トレハロース、デキストロース、ソルビトールおよびマンニトールからなる群から選択される少なくとも１つである。

【0082】

本発明による使用の好ましい実施形態では、希釈剤中の糖はスクロースである。

【0083】

本発明による使用の実施形態では、希釈剤中の糖は、約５０～約５００ｍＭの濃度である。

【0084】

好ましい実施形態において、糖は、約７５～４００ｍＭの間の濃度であり、より好ましくは、約１００～３５０ｍＭである。

【0085】

希釈剤の安定化特性を改善することに加え、糖の量を最適化することは、希釈剤の浸透圧を適合させる方法でもある。これは、ワクチン標的への非経口投与の際の組織刺激を防止すること、ならびに本発明の感染細胞の使用中の最適な安定性を保証することに関連する。

【0086】

本発明による使用の実施形態では、本発明の希釈剤の浸透圧は特に制御されず、浸透圧は一般に約１５０～３５０ミリオスモル／キログラム（ｍＯｓｍ／ｋｇ）である。

【0087】

好ましい実施形態では、本発明の希釈剤の浸透圧は、より生理学的な範囲に制御され、好ましくは等張浸透圧である。

【0088】

これは、希釈剤の浸透圧が好ましくは、約２５０～３００ｍＯｓｍ／ｋｇであることを意味する。より好ましくは、約２８０～約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇである。

【0089】

本発明による使用のための希釈剤にかかる浸透圧を提供するため、例えば塩化ナトリウムおよび／または塩化カリウムなどの塩を含めることによって、またはスクロースの濃度を増加させることによって、イオン含有量を適合させることができる。

【0090】

本発明による使用の好ましい実施形態では、希釈剤中のカリウム濃度は、脊椎動物の体の細胞外環境の生理的レベルまたはその近くである。これは、カリウム濃度が約３～約５ｍＭであることを意味する。

【0091】

ナトリウムレベルは、総浸透圧を補正するために変化させることができ、約５０～２５０ｍＭにすることができる。

【0092】

本発明による使用のための希釈剤は、チメロサール、メルチオレート、フェノール化合物、および／またはゲンタマイシンなどの保存剤を含み得る。好ましくは、防腐剤は使用されない。

【0093】

本発明による使用のための希釈剤は、ある量のマグネシウムイオンを組み込んでもよい。マグネシウムイオンは、解凍後の感染した宿主細胞の健康状態の回復に寄与し、細胞関連アルファヘルペスウイルスの力価の損失を減少させることが見出された。驚くべきことに、別の二価カチオンであるカルシウムは有益な効果を持たないことが判明したため、この効果はマグネシウムに特異的であるように見えた。

【0094】

本発明による使用の実施形態では、希釈剤は、１リットルあたり約０．１～約１０ミリモル（ｍＭ）の濃度のマグネシウムイオンを含む。

【0095】

本発明による使用のための希釈剤中のマグネシウムイオンの範囲に関して、マグネシウムの量が多すぎると、例えば、希釈剤中のリン酸化合物との組み合わせにおいて、希釈剤の加熱滅菌時に沈殿物が発生する可能性があるため、上の境界は、実用上の理由で制限される。下の境界は、感染した細胞を安定させる効果がまだあるため、制限される。

【0096】

本発明による使用の好ましい実施形態では、希釈剤は、約０．２～約９ｍＭの濃度のマグネシウムイオンを含む。より好ましくは、優先度の順に、０．３～８ｍＭ、０．４～５ｍＭ、０．５～２．５ｍＭ、０．６～２ｍＭ、０．７～１．５ｍＭ；または０．７５～１．２５ｍＭである。

【0097】

本発明による使用の、さらにより好ましい実施形態では、希釈剤は、約１ｍＭの濃度のマグネシウムイオンを含む。

【0098】

本発明による使用のための希釈剤は、ある量のクエン酸塩を組み込むことができる。クエン酸塩は解凍後の感染した宿主細胞の健康の回復に寄与し、細胞関連アルファヘルペスウイルスの力価の損失が減少することが見出された。この効果は、ウイルス感染細胞の代謝産物としてのクエン酸塩の使用、および／または抗酸化剤としての効果によるものである可能性がある。クエン酸塩を希釈液に加えた場合、２５℃で４時間後の力価は０．５ｐｆｕ／ｍｌまで高くなった。

【0099】

したがって、本発明による使用の実施形態では、希釈剤は、１リットルあたり約０．１～約１０ミリモル（ｍＭ）の濃度のクエン酸塩を含む。

【0100】

より高い濃度のクエン酸塩は、希釈剤のｐＨに影響を与える可能性があり、これはバッファー強度を調整することで補正され得る。

【0101】

本発明による使用の好ましい実施形態では、希釈剤は、約０．２～約９ｍＭの濃度のクエン酸塩を含む。より好ましくは、優先度の順に、０．３～８ｍＭ、０．４～５ｍＭ、０．５～２．５ｍＭ、０．６～２ｍＭ、０．７～１．５ｍＭ、または０．７５～１．２５ｍＭである。

【0102】

本発明による使用の、さらにより好ましい実施形態では、希釈剤は、約１ｍＭの濃度のクエン酸塩を含む。

【0103】

本発明による希釈剤はまた、微生物汚染の目視検査を提供するため、ｐＨ指示薬を含んでもよい。ｐＨ指示薬は、ｐＨ５～８の範囲で有効な、製薬上許容される任意の指示薬であり得る。好ましいｐＨ指示薬は、約０．００５～０．０５ｍｇ／ｍｌの量のフェノールスルホンフタレインである。

【0104】

より好ましくは、フェノールスルホンフタレインは、約０．０１～０．０２ｍｇ／ｍｌで含まれる。

【0105】

本発明による使用の実施形態では、希釈剤について、以下からなる群から選択される１つまたは複数の条件が適用され、以下からなる群より選択される。
－希釈剤は、約０．６、０．５、０．４５、０．４、０．３５、０．３、０．２５、０．２、０．１５、０．１、０．０５、０．０３、０．０１％ｗ／ｖのタンパク質をこの優先順位で含む；
－希釈剤はタンパク質を含まない；
－希釈液中の細胞関連アルファヘルペスウイルスは、マルディウイルスおよびイルトウイルスから選択された属のものである；
－希釈液中の細胞関連アルファヘルペスウイルスは、水痘帯状疱疹ウイルス、ＩＬＴＶ、ＭＤＶ、およびＨＶＴから選択され、好ましくは、ＭＤＶおよびＨＶＴから選択される；
－本発明の細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染した細胞は、好ましくは鳥類起源であり、好ましくは、宿主細胞のドナー動物は、以下のような農業関連の鳥である：鶏、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ヤマウズラ、孔雀、ウズラ、ハト、キジ、ホロホロチョウ、またはダチョウ。より好ましいのは、鶏、七面鳥、アヒルおよびガチョウからなる群から選択される鳥類である。宿主細胞のためのさらにより好ましい鳥ドナー生物は鶏である。
－感染した細胞は鳥類線維芽細胞であり、好ましくは、鳥類細胞は二次細胞であり、本発明のための細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染したより好ましい鳥類の線維芽細胞は、国際公開第２０１６／０８７５６０号に記載されるような不死化ＣＥＦの細胞株に由来する。
－希釈剤は、約７．０～約７．８、好ましくは約７．１～約７．７；約７．１～約７．６；より好ましくは、約７．１～約７．５の範囲のｐＨを有する。
－希釈剤中のリン酸緩衝液は、一塩基性リン酸二水素と二塩基性リン酸一水素の混合物からなる、いわゆるゴモリ緩衝液である。
－希釈剤のリン酸緩衝液は、Ｎａ_２ＨＰＯ_４とＫＨ_２ＰＯ_４で構成され、好ましくは、Ｎａ_２ＨＰＯ_４は約５～約９ｍＭの濃度であり、ＫＨ_２ＰＯ_４は約１～約４ｍＭである。好ましくは、組み合わされたリン酸緩衝液は約１０ｍＭであり、好ましくは、Ｎａ_２ＨＰＯ_４は約８ｍＭの濃度であり、ＫＨ_２ＰＯ_４は約２．５ｍＭである。
－希釈剤において、糖は、グルコース、ラクトース、スクロース、マルトース、トレハロース、デキストロース、ソルビトールおよびマンニトールからなる群から選択される少なくとも1つであり、好ましい実施形態では、糖はスクロースである。
－希釈剤において、糖は約５０～約５００ｍＭ、約７５～４００ｍＭ、または約１００～３５０ｍＭの濃度である。
－希釈剤の浸透圧は、約１５０～３５０ ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは約２５０～３００、または約２８０～約２９０ ｍＯｓｍ／ｋｇである。
－希釈液において、カリウムは約３～５ ｍＭ、ナトリウムは５０～２５０ ｍＭである。
－希釈剤は、１リットルあたり、約０．１～約１０ミリモル（ｍＭ）、０．２～９ ｍＭ、０．３～８ ｍＭ、０．４～５ ｍＭ、０．５～２．５ ｍＭ、０．６～２ ｍＭ、０．７～１．５ ｍＭ、または、０．７５～１．２５ ｍＭの濃度のマグネシウムイオンをこの優先順位で含む。
－希釈剤は、約１ｍＭのマグネシウムイオンを含む。
－希釈剤は、クエン酸塩を、約０．１～約１０ ｍＭ、０．２～９ ｍＭ、０．３～８ ｍＭ、０．４～５ ｍＭ、０．５～２．５ ｍＭ、０．６～２ ｍＭ、０．７～１．５ ｍＭ、または、０．７５～１．２５ ｍＭの濃度をこの優先順位で含む。
－希釈剤は、約１ｍＭのクエン酸塩を含む。
－希釈剤は、薬学的に許容可能であり、かつ、ｐＨ ５～８の範囲で有効なｐＨ指示薬を含み、好ましいｐＨ指示薬は、約０．００５～０．０５ｍｇ／ｍｌの量のフェノールスルホンフタレインであり、より好ましくは、フェノールスルホンフタレインは約０．０１～０．０２ｍｇ／ｍｌ含まれる。

【0106】

本発明による使用の実施形態では、希釈剤はタンパク質を含まず、細胞関連アルファヘルペスウイルス（ＭＤＶおよびＨＶＴから選択された）に感染した細胞の使用中の安定化用であり、約７．０～７．５の範囲のｐＨを有し、リン酸緩衝液ＫＨ_２ＰＯ_４中に、約１～約４ ｍＭの、および約５～約９ ｍＭの濃度のＮａ_２ＨＰＯ_４を含み、糖はスクロースであり、約１００～３５０ ｍＭであり、ナトリウムは約５０～２５０ ｍＭであり、フェノールスルホンフタレインは、約０．０１～０．０２ ｍｇ／ｍｌで構成されている。

【0107】

記載されるとおり、本発明による使用のための希釈剤は、細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染した再構成細胞の使用中の安定性の改善を可能にする。さらに、適合した希釈剤の使用は、多くの実用的および経済的利点を有する。

【0108】

したがって、さらなる態様において、本発明は、細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染した細胞の使用中の安定化方法に関し、この方法は、前記感染細胞の懸濁液を、本発明による使用のための希釈剤と混合する工程を含む。

【0109】

混合は、一般に感染細胞懸濁液の製造元が推奨する一般的なツールおよび方法を使用して行われ、たとえば、細胞懸濁液製品に添付されたリーフレットおよび／または希釈剤に添付されたリーフレットに記載されるとおりである。

【0110】

本発明による方法の例において、凍結培地中の感染細胞の懸濁液は、その凍結貯蔵から取り出され、急速に解凍され、次いで希釈剤と混合される。より詳細な例では、細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染した細胞懸濁液の約２ｍｌのアンプル、例えば、１０００回分のワクチンが水浴で解凍され、アンプルの内容物は、感染細胞懸濁液の約１：１００の希釈である約２００ｍｌの希釈剤に取り込まれる。希釈剤中の細胞の混合物は、皮下または筋肉内に標的あたり０．２ ｍｌ投与される。あるいは、投与が卵内経路で行われる場合、この接種材料は、感染した細胞懸濁液の約１：２５の希釈である５０ｍｌに吸収され、これは卵１つあたり５０ μｌの用量体積である。

【0111】

混合の時点で、希釈剤は室温存在するか、または２～８℃で冷却することができる。好ましくは、希釈剤は、混合の瞬間に室温、すなわち、約１５～約３０℃の温度、または、約２０～約２５℃である。これは、細胞関連アルファヘルペスウイルスのウイルス力価の最良の生存を提供することが見出された。

【0112】

記載されるとおり、本発明による使用および方法はいずれも、本発明の細胞関連アルファヘルペスウイルスによって引き起こされる感染または疾患に対するワクチンの調製に特に適している。

【0113】

したがって、本発明のさらなる態様は、細胞関連アルファヘルペスウイルスに対するワクチンであり、このワクチンは、ウイルスに感染した細胞を含み、細胞が本発明による使用のために希釈剤に懸濁されることを特徴とする。

【0114】

本発明に関して、「ワクチン」は、細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染した細胞の混合物、および本発明による使用のための希釈剤である。実際には、これはワクチン製造業者によって提供される感染細胞の懸濁液の希釈であろう。

【0115】

本発明によるワクチンは、感染および／または細胞関連アルファヘルペスウイルスによって引き起こされる疾患の兆候を低減するために、能動免疫を誘導するための適切なヒトまたは動物標的への投与を意図している。このような感染の減少は、標的動物におけるアルファヘルペスウイルスによる生産的感染の確立または増殖をいう。これは例えば、標的内のウイルス量を減らすか、ウイルス複製の期間を短くすることによって達成される。同様にこれは、標的動物において、病変の数、強度、または重症度の減少、およびウイルス感染によって引き起こされる疾患の結果として生じる臨床的兆候につながる。このようなワクチンは口語的に「アルファヘルペスウイルスに対するワクチン」または「アルファヘルペスウイルスワクチン」と呼ばれる。

【0116】

本発明によるワクチンの実施形態では、ワクチンは鳥類用であり、細胞関連アルファヘルペスウイルスは、ＩＬＴＶ、ＭＤＶおよびＨＶＴから選択される。

【0117】

一実施形態では、ＭＤＶは、ＭＤＶ１およびＭＤＶ２から選択されるワクチン株である。

【0118】

より好ましくは、ＭＤＶは、ＲＢ１ Ｂ、８１４、ＣＶＩ－９８８ ＲｉｓｐｅｎｓおよびＳＢ１から選択される株である。

【0119】

一実施形態では、ＨＶＴは、ＰＢ１およびＦＣ－１２６から選択される株である。

【0120】

本発明によるワクチンの好ましい実施形態では、ＨＶＴは、１つまたは複数の異種抗原を発現する組換えＨＶＴである。本発明によるワクチンに使用するための組換えＨＶＴの例は、国際公開第２０１６／１０２６４７号および国際公開第２０１３／０５７２３６号に記載されているとおりである。

【0121】

本発明によるワクチンのさらにより好ましい態様において、細胞関連アルファヘルペスウイルスは、ＩＬＴＶ、ＮＤＶ、ガンボロ病、ＭＤＶおよびトリインフルエンザウイルスに由来する１または複数の異種抗原を発現する組換えＨＶＴまたはＭＤＶである。

【0122】

本発明によるワクチンの有効性の決定は、通常の開業医の技能の範囲内であり、例えば、ワクチン接種後の免疫学的応答を監視することによって、または攻撃感染後の臨床症状または死亡率の出現を試験することによって、例えば、標的の疾患の兆候、臨床スコア、血清学的パラメーターを監視することによって、または攻撃病原体の再分離によって、これらの結果を模擬ワクチン接種された動物で見られるワクチン接種曝露応答（vaccination-challenge response）と比較することによって行うことができる。マレク病に対するワクチンの有効性を評価するのに、曝露生存（challenge survival）は、卵の生産、飼料の変換とともに、便利な測定である。

【0123】

本発明によるワクチンのさらに有利な効果は、動物群または集団内および／または地理的領域内でのアルファヘルペスウイルスの蔓延の防止または低減である。結果として、本発明によるワクチンの使用は、アルファヘルペスウイルスの有病率の減少をもたらす。

【0124】

したがって、好ましい実施形態では、本発明によるワクチンは、アルファヘルペスウイルスウイルス血症の防止の一助として、および／または、感染したヒトまたは動物によるアルファヘルペスウイルスの脱落の防止の一助として有効である。

【0125】

本発明によるワクチンの別の好ましい実施形態では、ワクチンは、鳥類集団および／または地理的領域におけるアルファヘルペスウイルスの有病率を低下させるためのものである。

【0126】

本発明によるワクチンは、原則として、異なる適用経路によって、およびそれらの寿命の異なる時点で、ヒトまたは動物の標的に与えることができる。

【0127】

しかしながら、ＭＤＶ又はＩＬＴＶによる感染は非常に若い年齢で既に確立されている可能性があるので、本発明によるワクチンをできるだけ早く適用することが有利である。したがって、本発明によるワクチンは、孵化の日（「1日目」）、または卵内に、例えば１８日ＥＤで適用することができる。

【0128】

したがって、一実施形態では、本発明によるワクチンは、卵内投与される。

【0129】

産業規模でのワクチンの卵への自動注射のための装置は、商業的に入手可能であり、例えばＩＮＯＶＯＪＥＣＴ（登録商標）（Ｅｍｂｒｅｘ ＢｉｏＤｅｖｉｃｅｓ）である。これにより、人件費を最小限に抑えながらも、可能な限り早期の保護が提供される。卵黄嚢、胚、尿膜腔など、異なる卵内接種経路が既知であり、これらは必要に応じて最適化することができる。好ましくは、卵内接種は、針が実際に胚に触れるように行われる。

【0130】

一実施形態では、本発明によるワクチンは、非経口経路によって、好ましくは筋肉内または皮下経路によって投与される。

【0131】

本発明によるワクチンについて、ウイルス接種物の好ましい用量は、標的用量あたり１ｘ１０^１～１ｘ１０^５ ｐｆｕの細胞関連アルファヘルペスウイルスである。より好ましくは、１ｘ１０^２～１ｘ１０^４ ｐｆｕ／用量、さらにより好ましくは、５００～５０００ｐｆｕ／用量、最も好ましくは、約１０００～約３０００ｐｆｕ／用量である。

【0132】

本発明によるワクチンの標的用量あたりの体積は、意図される適用経路に従って最適化することができ、卵内接種は、一般に、約０．０１～約０．５ ｍｌ／卵の用量で投与され、非経口注射は一般に、約０．１～約１ ｍｌ／標的の用量で行われる。

【0133】

本発明によるワクチンの免疫学的に有効な量を決定すること、または用量あたりのワクチンの体積の最適化は、どちらも十分に当業者の能力の範囲内である。

【0134】

本発明によるワクチンは、さらなる免疫賦活成分を含み得る。

【0135】

一実施形態では、さらなる免疫賦活成分は、サイトカインまたは免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドである。

【0136】

国際公開第２０１５／０１１２６１号に記載されるように、免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは免疫刺激性非メチル化ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＩＮＯ）である。

【0137】

好ましいＩＮＯは、国際公開第２０１２／０８９，８００号（Ｘ４ファミリ）、国際公開第２０１２／１６０，１８３号（Ｘ４３ファミリ）、または国際公開第２０１２／１６０，１８４号（Ｘ２３ファミリ）に記載されるような鳥類トール様（Toll-like）受容体（ＴＬＲ）２１アゴニストである。

【0138】

本発明によるワクチンの実施形態では、さらなる免疫賦活成分は、鳥類に病原性の微生物に由来する抗原である。これは、任意の適切な方法で、たとえば、鳥類に病原性を示す微生物からの「生きた」弱毒化、不活化、またはサブユニット抗原として「派生」することができる。

【0139】

好ましいさらなる免疫賦活成分は、以下から選択される１または複数の弱毒生ワクチン株である：ニューカッスル病ウイルス株Ｃ２；伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス株（Ｄ７８、ＰＢＧ９８、Ｃｕ－１、ＳＴ－１２又は８９－０３から選択される）；およびエイメリア。

【0140】

本発明によるワクチンは、細胞関連アルファヘルペスウイルスによる感染またはその兆候の確立および進行の両方を妨害するため、予防的または治療的処置として、あるいはその双方として使用することができる。

【0141】

本発明によるワクチンの投与計画は、標的へのストレスを低減し、および／または人件費を低減するために、標的が必要とする可能性がある他のワクチンの既存のワクチン接種スケジュールに統合されることが好ましい。これらの他のワクチンは、それらの登録された使用に適合する方法で、同時、同時または逐次的に投与することができる。

【0142】

好ましくは、本発明によるワクチンは、単回投与として一度だけ投与される。

【0143】

さらなる態様では、本発明は、本発明によるワクチンの調製方法に関し、この方法は、細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染した細胞および本発明による使用のための希釈剤を混合する工程を含む。

【0144】

本発明によるワクチンは、本発明の細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染した細胞の懸濁液、および、本発明による使用のための希釈剤から、本明細書に記載の方法により調製でき、これは当業者によって容易に適用できる。

【0145】

ワクチンの調製に適用される一般的な技術および考慮事項は、当技術分野でよく知られており、たとえば政府の規制および以下のようなハンドブックに記載されている：「レミントン：薬局の科学と実践」（２０００、リピンコット、米国、ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）、および「獣医ワクチン学」（Ｐ. Ｐａｓｔｏｒｅｔ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．、１９９７、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、アムステルダム、ＩＳＢＮ ０４４４８１９６８１）。

【0146】

ここで、本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。

【0147】

実施例
例１：安定性アッセイの概要
本発明による使用のための希釈剤の基剤は、リン酸緩衝液およびスクロースによって形成される。

【0148】

リン酸緩衝液は１０ ｍＭで使用され、２つのリン酸の組成を選択することによって特定のｐＨレベルに設定される。例えば、ｐＨ ７．３の場合、希釈剤には０．３２４ ｍｇ／ｍｌのＫＨ_２ＰＯ_４および１．３５６ｍｇ／ｍｌのＮａ_２ＨＰＯ_４．２Ｈ_２Ｏが含まれていた。

【0149】

スクロースは５０ ｍｇ／ｍｌ（すなわち１５０ ｍＭ）で使用され、試験された一部の希釈液サンプルは９２．５ ｍｇ／ｍｌ（すなわち２７０ ｍＭ）のより高いスクロース含量を有していた。

【0150】

フェノールスルホンフタレインは０．０１または０．０２ ｍｇ／ｍｌで使用した。

【0151】

試験した希釈液サンプルの一部に、１ ｍＭ ＭｇＣｌ_２でマグネシウムを添加した。

【0152】

試験した希釈液サンプルの一部では、ＣａＣｌ_２を０．１３３ ｍｇ／ｍｌまで添加した。

【0153】

試験した希釈液サンプルの一部では、クエン酸ナトリウムを１ ｍＭまで添加した。

【0154】

試験した希釈液サンプルの一部では、ペプトン封入が使用された：ケリー社のＮＺアミンＡＳ、カゼインの膵臓消化物、１～１４ ｍｇ／ｍｌで使用される。

【0155】

安定性試験の陽性対照は、１％ｖ／ｖの新生仔ウシ血清と抗生物質混合物とを含む完全なＣＥＦ培地であった。

【0156】

使用中の安定性インキュベーションは、ＨＶＴに感染したＣＥＦのサンプルを室温（２０～２５℃）で最大４時間インキュベートすることにより行われた。次いで、サンプルを直ちに、ＣＥＦを含むディッシュに一晩滴定した。

【0157】

これらの安定性アッセイに使用されたウイルスは、国際公開第２０１６／１０２６４７号に記載されるように、組換えＨＶＴベクターウイルス、コンストラクトＨＶＰ３６０であった。これは、異種遺伝子であるＮＤＶ－Ｆ遺伝子およびＩＢＤＶ－ＶＰ２遺伝子の二重挿入を含む。この組換えウイルスは、非組換えＨＶＴまたはＭＤＶと比較して、１．４％ｗ／ｖペプトンを含む標準のＭＤＶ希釈液において使用中の安定性が低下していた。

【0158】

滴定アッセイは標準的であった。１０日齢のニワトリ胚からのＣＥＦを調製し、６ｃｍディッシュに播種した。一晩付着させた後（３８℃、５％ＣＯ_２）、翌日、安定性アッセイからの培養サンプルの希釈液をディッシュに接種した。通常約３日後、ｃｐｅが見えるようになるまでディッシュを再度インキュベートした。滴定はｃｐｅを採点することにより、好ましくはＨＶＴウイルスに対する抗体を介して免疫蛍光法を使用して読み取られた。

【0159】

例２：希釈液中のペプトン量のテスト
最初の実験では、ペプトン量の効果を試験した。組換えＨＶＰ３６０に感染したＣＥＦのサンプルは、異なる量のＮＺ－アミンを含む希釈剤組成物中で、室温で４時間インキュベートした。これらの実験で使用した希釈剤のｐＨは７．４であり、マグネシウムイオンとカルシウムイオンが含まれていた。一連のサンプルは、細胞培養培地を模倣するために、希釈液と１％ｖ／ｖ ＮＣＳでインキュベートされた。

【0160】

インキュベーション後、サンプルをＣＥＦで三重に滴定し、インキュベーション前（ｔ ＝ ０時間）とインキュベーション後（ｔ ＝ ４時間）との力価の差を「デルタ」として計算した。力価の標準偏差は典型的には約０．１であった。すべての力価は、１ ｍｌあたり１０ Ｌｏｇプラーク形成単位である。

【0161】

【表1】

【0162】

これらの結果から明らかなように、ペプトンの存在は、逆にＮＣＳの効果を模倣することはできず、ＮＣＳは、試験されたサンプル全てにおいて、最小の力価損失を示し、標準的なＭＤＶ希釈剤、１４ ｍｇ／ｍｌ（１．４％ｗ／ｖ）は、最もネガティブな効果があり、７ ｍｇ／ｍｌ（０．７％ｗ／ｖ）はより良好であり、この実験で最も優れていたのは、１ ｍｇ／ｍｌペプトン（０．１％ ｗ／ｖ）を含む希釈剤の使用であった。結論として、ペプトンが少ないほど、力価の低下が少なかった。

【0163】

例３：少量ペプトンの試験
少量のペプトンの使用を調査するため、フォローアップ実験が行われた。今回は希釈剤にマグネシウムやカルシウムは含まれていないが、様々な異なるｐＨ値が試験された。滴定は重複して行われた。

【0164】

【表2】

【0165】

これらの結果からいくつかの結論を導き出すことができる：
－標準的な商用ＭＤＶ希釈液（１４ ｍｇ／ｍｌペプトンを含む）に保存した場合、この組換えＨＶＴコンストラクトで最悪の損失（２５℃、４時間後において最高のデルタ）が見出された。－完全な培地において見出された損失が最も少なかった。
－スクロースを含むリン酸緩衝液の基本的な希釈剤は、室温で最大４時間まで、ＣＥＦにおける組換えＨＶＴの力価損失の低減に非常に効果的であった。
－マグネシウムおよびカルシウムは必要なかった。
－ｐＨ ７．４の希釈液は、ｐＨ ７．２の希釈液よりも、損失の低減により効果的であった。
－ペプトンの量が少ないほど、良好であり、タンパク質を含まない希釈剤が最も効果的であった。

【0166】

例４：希釈剤のさらなるバリエーション
上記例３の実験の続きで、希釈剤組成物のさらなるバリエーションが試験された：０．１ｍｇ／ｍｌのマグネシウムの添加、塩の添加：３．１６ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌまたは０．１７ ｍｇ／ｍｌ ＫＣＩと２．９２ ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌとの組み合わせによる等浸透圧値の補正。あるいは、スクロースを９２．５ ｍｇ／ｍｌに増やすことによって等浸透圧値が生成され、更なる塩は生成されなかった。

【0167】

また、希釈液に１ ｍＭクエン酸塩を含めることも試験された。

【0168】

これらの異なる組成物の使用中の安定性の結果は、次のことを示している。
－マグネシウムの量が少ないと、力価の損失がさらに減少し、増加したスクロース濃度を用いて、同様のさらなる減少に到達することができた。
－等浸透圧値を作成する種々の方法が同様の効果をもたらした。
－リン酸緩衝液およびスクロースに次いで、希釈液に１ ｍＭクエン酸塩を含めることで、組換えＨＶＴウイルスの使用中の安定性が向上した。

【0169】

例５：動物試験
細胞関連アルファヘルペスウイルスが、本発明による希釈剤を使用した、使用中の安定化後もワクチンとして依然として有効であることを確認するため、ＭＤＶ、または、ＮＤＶもしくはＩＢＤＶによる攻撃感染に対する保護効果を試験する動物試験が準備されている。

【0170】

実験の基本的なセットアップは、適切なコントロールを備えたいくつかの試験群に分割される。

【0171】

ＭＤＶのチャレンジに対する保護効果の試験では、排菌鳥（shedder bird）によってＭＤＶチャレンジを適用するのが一般的である。

【0172】

ＮＤＶまたはＩＢＤＶに対する保護は、それらのウイルス種からの適切な毒性ウイルスを使用して試験される。

【0173】

排菌試験では、通常、約１１４０の受精鶏卵が使用され、そのうち約２４０は、排菌動物となる鳥を作製するために使用される。残りは、多数の試験群と２つの対照群に分けられ、１つはコントロールワクチン接種を受けており、もう１つはワクチン接種を受けていない。

【0174】

計画されている実験の概要は次のとおりである。

【0175】

一般的なプロトコル
－２～４時間の使用中の安定性インキュベーションが、組換えＨＶＴに感染したＣＥＦに適用され、それにより細胞は本発明の希釈剤に取り込まれる。
－ワクチンウイルスは、試験の開始前に滴定され、目標用量の希釈を確立する。
－鶏は、胚発生（ＥＤ）の１４日目に２００個の発育卵、および９００個の未抱卵の胚発育卵（ＥＤ１）として取得される。
－卵は次のように分類および設定される：
・排菌処理用に２４０（ＥＤ １４）
・ワクチン未接種の接触用に１５０（ＥＤ １）
・ワクチン接種処理用に７５０（ＥＤ １）；ＥＤ １８での卵内ワクチン接種に１２５
－ＥＤ １８では、排菌用の卵をキャンデル処理し、孵化トレイに配置した。
－孵化時、排菌鶏は、ニューカッスル病および感染性気管支炎に対して点眼ワクチン接種され、首にタグが付けられ、２００～４００ＰＦＵの毒性ＭＤＶ血清型１が腹腔内に接種され、１つのペン（pen）あたり５０が配置される。
－鳥には餌と水が自由に与えられ、毎日監視され記録される。
－防除およびワクチン接種のためのＥＤ １８では、卵を処理群に分け、卵内でワクチン接種し、孵化トレイに配置する。使用されるワクチンは全て、逆滴定（back-titrated）される。
－孵化時に、ワクチン未接種の接触鳥とワクチン接種鳥は、ＮＤＶ／ＩＢＶ点眼ワクチンを受け、首にタグが付けられ、排菌鳥と接触して配置される。
－鳥には餌と水が自由に与えられ、毎日監視され記録される。
－排菌鳥については、４２日目に安楽死させ、ＭＤＶ関連病変に関してスコアを付す。
－配置後２９日目に、ワクチン未接種の接触鳥およびワクチン接種鳥はすべて、ＮＤＶおよびＩＢＶのブースターワクチンを噴霧により受ける。
－配置後４９日目に、残りの鳥すべてを安楽死させ、ＭＤＶ関連病変に関してスコアを付す。

【0176】

鶏のスコア付け
死亡率、臨床徴候（麻痺、斜頸、赤脚）、および病変のすべてが記録される。

【0177】

終末（剖検）時、すべての病変が記録される。

【0178】

データは、ＭＤＶ、治療生存曲線、および保護指数の影響を受ける割合として報告される。

【0179】

保護指数
保護指数（ＰＩ）は、Ｗｉｔｔｅｒメソッドに基づいている。
PI =（ワクチン未接種のMDの％）-（ワクチン接種済みのMDの％）/（ワクチン未接種のMDの％）x 100
MD =マレク病の兆候

【0180】

ハウジング：
鳥は、自動給餌器とニップル給水器を備えた４つのペン（pen）に分割された単一のブロイラーハウスに収容され、単一の輻射加熱システムと空調システムとを備えている。

【0181】

モニタリング
鳥は全体的な健康、食物、空気循環、水について毎日監視される。配置２週間後に、死んでいると思われる鳥や痩せている鳥（culls）は剖検し、病変を記録する。生後２週間で倒れた鳥は、「非特異的」死亡と見なされる。

【0182】

期間
実験期間は６３日である。排菌鳥はワクチン接種の２週間前に配置され、２８日間一緒に収容される。ワクチン接種鳥／接触鳥は７週間（４９日間）飼育される。

【0183】

例６：例５の動物実験の結果
例５に記載されるワクチン接種負荷実験（vaccination-challenge experiment）は、２０１８年の半ばに行われた。残念ながら、動物施設の気候管理機器の技術的な障害により、種々の処理群の鳥に大規模な熱ストレスイベントが発生した。これにより、多数の鳥が死亡し、残りの鳥は免疫応答を大幅に妨害したため、データを完全に分析することはできなかった。実験の再実行が現在計画されている。

【0184】

例７：さらなる細胞関連アルファヘルペスウイルスの使用中安定性試験
好ましい希釈剤
本発明による、安定化に使用するための希釈剤の好ましい組成は、市販のワクチンおよび実験室株の両方からのさらなる細胞関連アルファヘルペスウイルスに感染した細胞の使用中の安定性を決定するために使用された。

【0185】

本発明の希釈剤の好ましいバージョンはタンパク質を含まず、調製後、ｐＨ７．１を有し、これは加熱滅菌後に７．０にシフトする。

【0186】

【表3】

【0187】

試験されたワクチン
試験した種々のウイルスを表４に示す。ウイルスを冷蔵保存（－１４０℃）から解凍し、標準希釈液Ｎｏｂｉｌｉｓ（商標）ＣＡ希釈液、または本発明の好ましい希釈液で希釈した。滴定用の希釈液を表４に示すように調製し、ウイルス滴定用のｔ＝０サンプルをプレート上のＣＥＦ細胞に直ちに滴定した。希釈液を室温（約２１℃）で４時間保存した後、希釈液を再度サンプリングしてＣＥＦで滴定し、使用中の安定性の終点を決定した。

【0188】

【表4】

【0189】

ウイルス滴定
ペトリ皿（直径６ｃｍ）に、抗生物質を含む４ｍｌの培養液に１．１ｘ１０^５細胞／ｃｍ^２の密度でＣＥＦを播種した。これらのディッシュを３８℃および５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。約２４時間後、ＣＥＦ細胞は約８０％の集密度に達した。安定性試験で採取した各サンプル１００μｌを皿に加えた。反復の数を表４に示す。ウイルスのプラークが見えるようになるまで、ディッシュをさらに３～４日間インキュベートした。

【0190】

ＩＦＴ
ディッシュ上のプラークは、免疫蛍光アッセイを使用して視覚化された。プラークがはっきりと見えるようになった時点で、皿の上の細胞を冷たい（－２０℃）の９６％エタノールを使用して３～５分間固定した。その後、標準的な洗浄バッファーを使用してディッシュを３回洗浄した。３種類のモノクローナル抗体を最初の抗体として使用した。すなわち、試験したウイルスの種類ごとに特定の１つ：ＨＶＴ、ＭＤＶ１またはＭＤＶ２を使用した。モノクローナル抗体を洗浄バッファーで適切な強度に希釈し、プレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ディッシュを洗浄緩衝液で３回洗浄した。二次抗体としてのコンジュゲートヤギ－抗マウス－Ａｌｅｘａ４４８（１：１．０００）、およびエバンスブルー（１：１．５００）による対比染色液を洗浄バッファーのディッシュに加え、３７℃でさらに１時間インキュベートした。次いで、ディッシュを洗浄バッファーで３回洗浄した。最後に、ＰＢＳ中の４４％グリセロールをディッシュに添加した。蛍光顕微鏡を使用してウイルスプラークをカウントし、試験サンプルのウイルス力価をｐｆｕ／ｍｌで計算した。

【0191】

結果：
種々のアルファヘルペスウイルスの使用中安定性試験の結果を、試験開始時および室温で４時間後の力価（ｐｆｕ／ｍｌ）として表５に示す。デルタの列は、２つの時点の間の力価の差を示す。表５の２つのパネルは、標準的な希釈剤の結果を、好ましい発明の希釈剤の結果と比較することを可能にする。

【0192】

【表5】

【0193】

明確に観察できるように、本発明の希釈剤における力価の損失は、標準の希釈剤と比較して同じか、またはそれよりも少なかった。この影響は、ＨＶＴ、ＭＤＶ1、ＭＤＶ2の３種類のウイルスで発生した。ほとんどの場合、力価の低下は、０．４ １０Ｌｏｇ ｐｆｕ／ｍｌ以下であり、通常はそれよりも少ない。

【0194】

１つのサンプル、Ｉｎｎｏｖａｘ ＮＤでは、０．７ １０Ｌｏｇ ｐｆｕ／ｍｌの力価の損失は、本発明の希釈剤ではかなり大きく、力価の通常の最大損失０．４ １０Ｌｏｇ ｐｆｕ／ｍｌを超えた。しかし、このサンプルの場合、標準希釈液での力価の低下は１．２ １０Ｌｏｇ ｐｆｕ／ｍｌでさらに悪化した。これは最小希釈を必要とするウイルスでもあったため、本発明の希釈剤と標準希釈剤との間の安定化能力に印象的な差異はあるが、これはおそらく最初は良質のサンプルではなく、その種類の代表でもなかった。