ホーム > 特許ランキング > セリーセル ゲーエムベーハー
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-05
(45)【発行日】2024-03-13
(54)【発明の名称】逆免疫抑制
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240306BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240306BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240306BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12N5/0783
C12N15/12 ZNA
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2021547320
(86)(22)【出願日】2020-02-12
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-12
(86)【国際出願番号】 EP2020053648
(87)【国際公開番号】W WO2020165283
(87)【国際公開日】2020-08-20
【審査請求日】2022-10-28
(31)【優先権主張番号】19156745.2
(32)【優先日】2019-02-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】521355751
【氏名又は名称】セリーセル ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】100149032
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 敏明
(72)【発明者】
【氏名】ハマー，ルドルフ
(72)【発明者】
【氏名】ヘニグ，ステフェン
【審査官】坂崎 恵美子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／０４８６１４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１１－５００００８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５１８９７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】Protein Cell，2018年，Vol.9, No.3，p.254-266
【文献】Clinical Cancer Research，2015年，Vol.21, No.5，p.1019-1027
【文献】Blood，2009年，Vol.114, No.3，p.535-546
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ ５／０７８３
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
腫瘍特異的Ｔ細胞の調製物を生成するための方法であって、以下の工程：－ 腫瘍Ｔ細胞の単離の工程において、患者から取得された腫瘍サンプルから制御性Ｔ細胞を単離する工程；
－ 腫瘍Ｔ細胞のシーケンシングの工程において、前記制御性Ｔ細胞から腫瘍浸潤性Ｔ細胞受容体をコードする複数の核酸配列を取得して、腫瘍ＴＣＲ配列のセットを得る工程；
－ 前記患者から取得される非腫瘍組織サンプルから、複数の非腫瘍組織のＴ細胞受容体配列を取得して、非腫瘍組織ＴＣＲ配列のセットを得る工程；
－ 配列選択の工程において、腫瘍ＴＣＲ配列の前記セットから腫瘍浸潤性制御性Ｔ細胞受容体（ｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ）をコードする１つ又は複数の核酸配列を選択し、１つ又は複数の選択されたｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ配列を得る工程；
－ 患者の単離サンプルから取得されたレシピエントＴ細胞を提供する工程であり、前記レシピエントＴ細胞は制御性Ｔ細胞ではない、前記工程；及び
－ 遺伝子導入工程において、前記レシピエントＴ細胞で作動可能なプロモーター配列の制御下で前記選択されたｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲをコードする核酸を前記レシピエントＴ細胞に導入し、それにより腫瘍特異的Ｔ細胞の調製物を得る工程、
を含み、
前記配列選択の工程は、以下の工程：
－ アラインメント工程において、腫瘍ＴＣＲ配列のセットをアラインメントし、前記複数の非腫瘍組織のＴ細胞受容体配列をアラインメントする工程；
－ 前記アラインメント工程においてアラインメントされた腫瘍ＴＣＲ配列を複数の腫瘍サンプルのクロノタイプに分類する工程であり、非腫瘍組織のＴ細胞受容体配列を複数の非腫瘍組織のクロノタイプに分類する工程であり、特定のクロノタイプ内に含まれる配列は、同一の配列を示し、
配列の比較は、ＣＤＲ３配列トラクトに関して実行され、かつ特定のクロノタイプは、同一のＣＤＲ３配列を示す、前記工程；
－ 各クロノタイプに関連する腫瘍ＴＣＲ配列の数を決定し、各クロノタイプに関連する非腫瘍組織のＴ細胞受容体配列の数を決定し、それにより、前記クロノタイプのそれぞれについてのクロノタイプの頻度を得る工程；及び
－ 前記複数の腫瘍サンプルのクロノタイプから腫瘍特異的なクロノタイプを選択する工程であり、
前記腫瘍特異的なクロノタイプは、前記複数の腫瘍サンプルのクロノタイプの最も頻度の高い１００個のクロノタイプのうちの１つである、及び
前記腫瘍特異的なクロノタイプは、非腫瘍組織のＴＣＲ配列のセット内で＜２０％の頻度を示すか、又は存在しないかである、及び
腫瘍浸潤性制御性Ｔ細胞受容体（ｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ）をコードする核酸配列は、
ａ． クロノタイプがｔｉＴｒｅｇ（ＣＤ４ ＋ ＣＤ２５ ｈｉｇｈ ＣＤ１２７ ｌｏｗ 又はＣＤ４ ＋ ＦＯＸＰ３ ＋ ）集団及びｔｉＴｃｏｎｖ（ＣＤ４ ＋ ＣＤ２５ ｌｏｗ ＣＤ１２７ ＋ 又はＣＤ４ ＋ ＦＯＸＰ３ － ）集団の両方に存在する場合、又は
ｂ． 単一細胞発現分析により、腫瘍浸潤性ＣＤ４ ＋ 細胞の間でＦＯＸＰ３発現細胞及びＦＯＸＰ３陰性細胞を検出する場合、
腫瘍ＴＣＲ配列の前記セットから選択される、前記工程、
を含む、前記方法。
【請求項2】
腫瘍Ｔ細胞の単離の工程において、ＣＤ４の発現、及び－ ＣＤ２５の発現及びＣＤ１２７の低発現（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ）及び／又は
－ ＦＯＸＰ３の発現（ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋）、
を特徴とするＴ細胞が単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記配列選択の工程は、前記腫瘍ＴＣＲ配列を、データベースからの腫瘍由来の制御性Ｔ細胞受容体配列である参照ＴＣＲ配列のセットに対して比較することをさらに含む、請求項１～２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項4】
配列選択の工程の前に、核酸配列がアミノ酸配列に翻訳され、腫瘍ＴＣＲ配列の比較がアミノ酸配列に基づいて実行される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
－ 前記患者から取得される血液サンプルから、複数の血液Ｔ細胞受容体配列を取得し、血液ＴＣＲ配列のセットを得る工程；－ 前記複数の血液Ｔ細胞受容体配列をアラインメントする工程；
－ 血液Ｔ細胞受容体配列を複数の血液クロノタイプに分類する工程であり、特定のクロノタイプ内に含まれるＴ細胞受容体配列は、実質的に同一又は同一の配列を示す、前記工程；
－ 各クロノタイプに関連する血液Ｔ細胞受容体配列の数を決定し、それにより、前記クロノタイプのそれぞれについてのクロノタイプの頻度を得る工程；
－ 前記複数の腫瘍サンプルのクロノタイプから腫瘍特異的なクロノタイプを選択する工程であり、前記腫瘍特異的なクロノタイプは、血液ＴＣＲ配列のセット内で＜２０％の頻度を示すか、又は存在しないかである、前記工程、
をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
Ｔ細胞受容体配列を取得することは、以下の工程：ａ． 前記腫瘍サンプル、非腫瘍組織サンプル、及び血液サンプルからＴ細胞を単離し、単離したＴ細胞から核酸を単離する工程、及び
ｂ． Ｔ細胞受容体核酸配列を特異的に増幅する核酸増幅反応を行う工程、
を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
核酸増幅反応は、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖又はベータ鎖のＣＤＲ３領域をコードする配列を特異的に増幅する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
レシピエントＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞を含む群から選択され、前記方法は、以下の工程：ａ． 患者から得られたサンプルからヘルパーＴ細胞を選択し、濃縮されたヘルパーＴ細胞調製物を生成する工程、又は
ｂ． 患者から得られたサンプルから細胞傷害性Ｔ細胞を選択し、濃縮された細胞傷害性Ｔ細胞調製物を生成する工程、
及び前記濃縮されたＴ細胞調製物を遺伝子導入工程に供する工程、
を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記レシピエントＴ細胞は、前記患者のリンパ球調製物からのＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の枯渇によって調製されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
遺伝子導入工程の前に導入遺伝子生成工程があり、前記選択されたｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲをコードする核酸は、プロモーター配列の制御下にあり、ａ． 前記腫瘍サンプルから得られる複数の制御性Ｔ細胞を単一細胞に分離すること；
ｂ． 前記複数の細胞から複数の完全なＴＣＲ配列セットを取得し、各ＴＣＲ配列セットは、完全なＴＣＲα及びＴＣＲβのポリペプチド配列を含むこと；
ｃ． 選択されたｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ配列を完全なＴＣＲ配列セットに割り当てて、完全なｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ配列セットを得ること；
ｄ． 前の工程で決定した前記完全なｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ配列セットの完全なＴＣＲα及びＴＣＲβのポリペプチド配列をコードする配列を、遺伝子発現コンストラクトに挿入すること、
によって生成される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１９年２月１２日に出願された欧州公開特許第１９１５６７４５．２号の優先権の利益を主張し、これは参照により本明細書に組み込まれている。
【0002】
本発明は、腫瘍の免疫回避に対抗する腫瘍特異的Ｔ細胞を生成するための方法に関する。
【背景技術】
【0003】
近年のがん治療の免疫療法の大きな進歩と同時に、腫瘍エスケープによって引き起こされる治療の失敗はますます重要な問題になっている。腫瘍エスケープの主要なメカニズムは、ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＴＬ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）の活性により説明できることが示されている。ＣＴＬの初期の腫瘍破壊活性は患者にとって有益であるが、腫瘍の除去が不完全な状況では、ＣＴＬの活性により、免疫編集と呼ばれるプロセスで腫瘍細胞から同族抗原が選択的に失われ、腫瘍エスケープが促進される可能性がある。
【0004】
ＣＤ８＋Ｔ細胞がそれらの腫瘍標的細胞を特異的に排除する一方で、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌ）はその逆の働きを示す。それらの免疫抑制活性を通して、Ｔｒｅｇは、これらのＴｒｅｇの同族抗原を持つ腫瘍細胞に増殖のアドバンテージを提供する。実際、Ｔｒｅｇは進行中の腫瘍全体に存在し、その数は腫瘍のサイズと相関していることが多い。これは、Ｔｒｅｇによって認識される特定の腫瘍抗原の継続的な存在を示している。
【0005】
腫瘍及び腫瘍由来転移におけるＴｒｅｇの特異的抗原の持続性を考えると、Ｔｒｅｇの同族Ｔ細胞受容体（Ｔｒｅｇ ＴＣＲ：Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｏｆ Ｔｒｅｇ）は、腫瘍エスケープに対抗する免疫療法の開発のために採用できる主要な腫瘍特異的認識要素を構成し得ることになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
この背景に基づいて、本発明の根底にある問題は、Ｔ細胞媒介性腫瘍エスケープを克服するがんの治療のための手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
この問題の解決は、独立請求項の主題によって提供され、特定の実施形態は、従属請求項及び以下の説明で論じられている。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図3-1】図３は、ある腫瘍患者（Ｖ８４／１３）のＴＣＲβシーケンシング実行の結果を示す。各行は、固有の種類のＴ細胞（クロノタイプ）に見られる１つの固有のβＴＣＲ／ＣＤＲ３に対応している。左から右の列は：ａ． その型のＴ細胞の相対頻度、ｂ． シーケンシングリードの数で与えられる頻度、ｃ． ＶセグメントＩＤ、ｄ． ＪセグメントＩＤ、ｅ． ＣＤＲ３ペプチド、ｆ． 完全なＣＤＲ３をカバーする核酸配列としてのシーケンシングされた領域、を示す。
【図3-2】図３は、ある腫瘍患者（Ｖ８４／１３）のＴＣＲβシーケンシング実行の結果を示す。各行は、固有の種類のＴ細胞（クロノタイプ）に見られる１つの固有のβＴＣＲ／ＣＤＲ３に対応している。左から右の列は：ａ． その型のＴ細胞の相対頻度、ｂ． シーケンシングリードの数で与えられる頻度、ｃ． ＶセグメントＩＤ、ｄ． ＪセグメントＩＤ、ｅ． ＣＤＲ３ペプチド、ｆ． 完全なＣＤＲ３をカバーする核酸配列としてのシーケンシングされた領域、を示す。
【図3-3】図３は、ある腫瘍患者（Ｖ８４／１３）のＴＣＲβシーケンシング実行の結果を示す。各行は、固有の種類のＴ細胞（クロノタイプ）に見られる１つの固有のβＴＣＲ／ＣＤＲ３に対応している。左から右の列は：ａ． その型のＴ細胞の相対頻度、ｂ． シーケンシングリードの数で与えられる頻度、ｃ． ＶセグメントＩＤ、ｄ． ＪセグメントＩＤ、ｅ． ＣＤＲ３ペプチド、ｆ． 完全なＣＤＲ３をカバーする核酸配列としてのシーケンシングされた領域、を示す。
【図4-1】図４は、患者における誘導型腫瘍特異的Ｔｒｅｇ ＴＣＲ配列の割り当てを示す。すべてのサンプルは１人の患者由来のものである。この表は、上位３０のＣＤ４＋ＴＩＬクロノタイプのそれぞれのＣＤＲ３βペプチド、Ｖセグメント及びＪセグメントを示す。選別は、ＴＩＬ ＣＤ４＋クロノタイプ（列Ｆ）に関するものである。列Ｉの濃い灰色の網掛けの数字は、隣接する非腫瘍組織と比較して、腫瘍内の固有のクロノタイプの５倍以上の濃縮よって決定されるとおりの腫瘍特異性を示している。Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇマーカーによる選別は、それぞれ列Ｇ及びＨに示されている。１０×分析は列Ｊに示されている。選別により、行１０及び２６で誘導型Ｔｒｅｇクロノタイプが同定される。これらのクロノタイプは、制御性Ｔ細胞画分と従来のＴ細胞画分の重複を示している。Ｔｒｅｇの特性評価とＴＣＲのα／βペアリングを一度に含む１０×分析により、行１０と２６のクロノタイプの誘導型Ｔｒｅｇの性質が確認される。さらに、１０×分析では、行２５のクロノタイプが天然のＴｒｅｇとして同定される。行２１のクロノタイプは、１０×分析でいずれのＦＯＸＰ３シグナルが示されなかったため、従来のＴｈ細胞と解釈することができる。列Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＨに示されている頻度値は、クラスのすべての配列に対する配列のパーセントで示されている。一例として、非腫瘍ＣＤ４細胞の中で配列番号３７に割り当てられたＣＤＲ３ペプチドの頻度は０．２％である。
【図4-2】図４は、患者における誘導型腫瘍特異的Ｔｒｅｇ ＴＣＲ配列の割り当てを示す。すべてのサンプルは１人の患者由来のものである。この表は、上位３０のＣＤ４＋ＴＩＬクロノタイプのそれぞれのＣＤＲ３βペプチド、Ｖセグメント及びＪセグメントを示す。選別は、ＴＩＬ ＣＤ４＋クロノタイプ（列Ｆ）に関するものである。列Ｉの濃い灰色の網掛けの数字は、隣接する非腫瘍組織と比較して、腫瘍内の固有のクロノタイプの５倍以上の濃縮よって決定されるとおりの腫瘍特異性を示している。Ｔｃｏｎｖ及びＴｒｅｇマーカーによる選別は、それぞれ列Ｇ及びＨに示されている。１０×分析は列Ｊに示されている。選別により、行１０及び２６で誘導型Ｔｒｅｇクロノタイプが同定される。これらのクロノタイプは、制御性Ｔ細胞画分と従来のＴ細胞画分の重複を示している。Ｔｒｅｇの特性評価とＴＣＲのα／βペアリングを一度に含む１０×分析により、行１０と２６のクロノタイプの誘導型Ｔｒｅｇの性質が確認される。さらに、１０×分析では、行２５のクロノタイプが天然のＴｒｅｇとして同定される。行２１のクロノタイプは、１０×分析でいずれのＦＯＸＰ３シグナルが示されなかったため、従来のＴｈ細胞と解釈することができる。列Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＨに示されている頻度値は、クラスのすべての配列に対する配列のパーセントで示されている。一例として、非腫瘍ＣＤ４細胞の中で配列番号３７に割り当てられたＣＤＲ３ペプチドの頻度は０．２％である。
【図5-1】図５は、図４と同じ患者で誘導型腫瘍特異的ＴｒｅｇＴＣＲ配列の割り当てを示す。すべてのサンプルは１人の患者からのものである。この表は、Ｔｒｅｇマーカーを用いた細胞ソーティングによって濃縮されたＴＯＰ２０の腫瘍特異的ＴＩＬ ＴｒｅｇクロノタイプのそれぞれのＣＤＲ３βペプチド、Ｖセグメント及びＪセグメントを示している。表は列Ｇに関して選別されている。１０×分析の結果は列Ｉに示され、細胞を天然及び誘導制御性Ｔ細胞又は不特定のＣＤ４＋Ｔ細胞に分類される。１０×分析には、Ｔｒｅｇの特性評価とＴＣＲのα／βペアリングが一度に含まれる。
【図5-2】図５は、図４と同じ患者で誘導型腫瘍特異的ＴｒｅｇＴＣＲ配列の割り当てを示す。すべてのサンプルは１人の患者からのものである。この表は、Ｔｒｅｇマーカーを用いた細胞ソーティングによって濃縮されたＴＯＰ２０の腫瘍特異的ＴＩＬ ＴｒｅｇクロノタイプのそれぞれのＣＤＲ３βペプチド、Ｖセグメント及びＪセグメントを示している。表は列Ｇに関して選別されている。１０×分析の結果は列Ｉに示され、細胞を天然及び誘導制御性Ｔ細胞又は不特定のＣＤ４＋Ｔ細胞に分類される。１０×分析には、Ｔｒｅｇの特性評価とＴＣＲのα／βペアリングが一度に含まれる。
【図6-1】図６は、誘導型腫瘍特異的Ｔｒｅｇ ＴＣＲ配列の割り当ての別の例を示している。サンプル（血液、腫瘍、非腫瘍）は、図４及び図５のデータの基となったサンプルを提供した患者とは別の患者から入手した。ＴＩＬ（ＣＤ４＋）と非腫瘍から選択されたＴ細胞クローンとの間の比率は、腫瘍特異性を示す＞５である値でフィルタリングされる。クロノタイプ（行１及び１６）は腫瘍内で有意な頻度のものであり、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ単一細胞シーケンシングテクノロジーを使用したＦＯＸＰ３発現分析によって誘導Ｔｒｅｇとして検出されたことは明らかである。さらに、上位２０のＴＩＬクロノタイプの中に、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ分析によって同定された３つの天然Ｔｒｅｇ（行１３、１５、１７）が存在した。ＴｒｅｇクローンＩＤは、同じＣＤＲ３領域を共有するＦＯＸＰ３陽性細胞とＦＯＸＰ３陰性細胞を持つ誘導Ｔｒｅｇクローンのグループを示す。これらのクローンの場合、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ分析はＴ細胞受容体の両方の鎖を提供した。
【図6-2】図６は、誘導型腫瘍特異的Ｔｒｅｇ ＴＣＲ配列の割り当ての別の例を示している。サンプル（血液、腫瘍、非腫瘍）は、図４及び図５のデータの基となったサンプルを提供した患者とは別の患者から入手した。ＴＩＬ（ＣＤ４＋）と非腫瘍から選択されたＴ細胞クローンとの間の比率は、腫瘍特異性を示す＞５である値でフィルタリングされる。クロノタイプ（行１及び１６）は腫瘍内で有意な頻度のものであり、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ単一細胞シーケンシングテクノロジーを使用したＦＯＸＰ３発現分析によって誘導Ｔｒｅｇとして検出されたことは明らかである。さらに、上位２０のＴＩＬクロノタイプの中に、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ分析によって同定された３つの天然Ｔｒｅｇ（行１３、１５、１７）が存在した。ＴｒｅｇクローンＩＤは、同じＣＤＲ３領域を共有するＦＯＸＰ３陽性細胞とＦＯＸＰ３陰性細胞を持つ誘導Ｔｒｅｇクローンのグループを示す。これらのクローンの場合、１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓ分析はＴ細胞受容体の両方の鎖を提供した。
【発明を実施するための形態】
【0009】
発明の概要
本発明の根底にある基本的な概念は、細胞傷害性Ｔ細胞及び他の免疫応答の阻害を媒介する腫瘍に存在する制御性Ｔ細胞が、重要な情報をそれらのＴ細胞受容体の形で提供することができ、腫瘍特異的抗原を認識するという現実である。この概念の潜在力は、少なくとも２つの方法の治療ツールと変化することができる：
－ 第１に、腫瘍特異的Ｔｒｅｇ ＴＣＲをコードする遺伝情報を単離し、抗腫瘍能を持つＴ細胞のサブセットに、特にＴｈ１細胞に導入すること。このような概念を、本明細書では「逆免疫抑制」と呼ぶことにする。自己免疫のリスクを回避するために、形質導入には腫瘍特異的Ｔｒｅｇ ＴＣＲを選択する必要がある。
－ 第２に、腫瘍特異的Ｔｒｅｇ ＴＣＲは、同族抗原ペプチド－ＭＨＣを見つけるためのプローブとして使用でき、これは、腫瘍エスケープに対抗するための二重特異性抗体又は二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ Ｃｏｒｐ．））関連の免疫療法の開発に道を開く。
本発明の根底にある基本的な概念は、細胞傷害性Ｔ細胞及び他の免疫応答の阻害を媒介する腫瘍に存在する制御性Ｔ細胞が、重要な情報をそれらのＴ細胞受容体の形で提供することができ、腫瘍特異的抗原を認識するという現実である。この概念の潜在力は、少なくとも２つの方法の治療ツールと変化することができる：
－ 第１に、腫瘍特異的Ｔｒｅｇ ＴＣＲをコードする遺伝情報を単離し、抗腫瘍能を持つＴ細胞のサブセットに、特にＴｈ１細胞に導入すること。このような概念を、本明細書では「逆免疫抑制」と呼ぶことにする。自己免疫のリスクを回避するために、形質導入には腫瘍特異的Ｔｒｅｇ ＴＣＲを選択する必要がある。
－ 第２に、腫瘍特異的Ｔｒｅｇ ＴＣＲは、同族抗原ペプチド－ＭＨＣを見つけるためのプローブとして使用でき、これは、腫瘍エスケープに対抗するための二重特異性抗体又は二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ Ｃｏｒｐ．））関連の免疫療法の開発に道を開く。
【0010】
本発明によって提供されるとおり、腫瘍特異的Ｔｒｅｇ ＴＣＲの選択は、免疫療法的アプローチについて明らかな利点を示す。腫瘍の特異性を達成するために、２つの選択工程が組み合わせで採用される：
－ Ｔｒｅｇ ＴＣＲの頻度は、腫瘍組織と非腫瘍組織との間で比較される。これにより、担がん組織細胞の自己反応性Ｔｒｅｇ ＴＣＲ及び担がん器官の感染に関連するＴｒｅｇ ＴＣＲを排除するであろう。
－ Ｔｒｅｇ ＴＣＲは、天然型Ｔｒｅｇ細胞からではなく、誘導型Ｔｒｅｇ細胞から選択される。誘導型Ｔｒｅｇ ＴＣＲは、腫瘍特異的ヘルパーＴ細胞に由来するため、免疫療法の適用に安全であると期待される。
－ Ｔｒｅｇ ＴＣＲの頻度は、腫瘍組織と非腫瘍組織との間で比較される。これにより、担がん組織細胞の自己反応性Ｔｒｅｇ ＴＣＲ及び担がん器官の感染に関連するＴｒｅｇ ＴＣＲを排除するであろう。
－ Ｔｒｅｇ ＴＣＲは、天然型Ｔｒｅｇ細胞からではなく、誘導型Ｔｒｅｇ細胞から選択される。誘導型Ｔｒｅｇ ＴＣＲは、腫瘍特異的ヘルパーＴ細胞に由来するため、免疫療法の適用に安全であると期待される。
【0011】
本発明によって提供される腫瘍特異的Ｔ細胞の調製物は、腫瘍微小環境における抗原提示細胞との相互作用を通じて、又はより直接的にＭＨＣクラスＩＩの提示が可能な悪性細胞との相互作用を通じてベータ－２－ミクログロブリンの機能の損失を有する腫瘍においてさえ抗腫瘍活性を示す。
【0012】
用語と定義
特に定義されていない限り、本明細書で使用されているすべての技術用語及び科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術、及び生化学における）が一般的に理解しているものと同じ意味を持つ。標準的な技術が、分子、遺伝子、及び生化学的手法（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２編．（１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９９） 第４編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照）及び化学的手法に使用される。
特に定義されていない限り、本明細書で使用されているすべての技術用語及び科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術、及び生化学における）が一般的に理解しているものと同じ意味を持つ。標準的な技術が、分子、遺伝子、及び生化学的手法（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２編．（１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９９） 第４編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照）及び化学的手法に使用される。
【0013】
本明細書の文脈における「実質的に同一」という用語は、実質的に同一であると言われる配列に関して≧９８％の同一性を示す配列に関する。「実質的に同一」の配列という用語は、これらに限定されないが、同じ物理的配列又はその同一のコピーのシーケンシングイベントに由来する配列に使用され、シーケンシングプロセス中の方法的なエラー又はミスリードが、配列に人為的エラーを導入している。
【0014】
本明細書の文脈における「核酸配列の翻訳」という用語は、核酸配列の既知のリーディングフレーム及び遺伝コードに基づく核酸配列に対するアミノ酸（ポリペプチド）配列の割り当てに関する。それは、リボソームによって行われる細胞内の翻訳の生物学的行為とは関係がない。
【0015】
本明細書の文脈における用語「ＣＤＲ３」は、ＴＣＲ複合体の可変相補性決定領域３（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ３）に関連する。ＣＤＲ３のサイズは、Ｖβ、又はＶα又はＶγ又はＶδセグメントの保存されたシステインからＪβ又はＪα、Ｊγ又はＪδセグメントの保存されたフェニルアラニンの位置までのアミノ酸（ＡＡ）及びそれぞれのヌクレオチドの総数によって特徴付けられる。
【0016】
本明細書の文脈における「腫瘍サンプル」という用語は、患者の腫瘍から得られたサンプル又はサンプルのプールを指す。腫瘍サンプルはまた、転移又は転移の集合を含むか、又はそれらからなり得る。
【0017】
本明細書の文脈における「非腫瘍組織サンプル」という用語は、腫瘍の起源組織又は転移の場合のその位置と同等又は同一の非腫瘍組織から得られたサンプル又はサンプルのプールを指す。そのような非腫瘍組織サンプルの有利な供給源は、患者の腫瘍に近接した組織である。
【0018】
本明細書において、「陽性」という用語は、マーカーの発現の文脈で使用される場合、蛍光標識抗体によってアッセイされる抗原の発現を指し、「陽性」とされる構造（例えば、細胞）上の標識の蛍光は、同じ標的に特異的に結合しないアイソタイプが一致する蛍光標識抗体で染色した場合と比較して、蛍光強度の中央値が少なくとも３０％高く（≧３０％）、特に≧５０％又は≧８０％である。マーカーのこのような発現は、例えばＣＤ４＋のようにマーカーの名前の後に上付き文字「プラス」（＋）で表示される。本明細書において「発現」という言葉が「遺伝子発現」又は「マーカー又は生体分子の発現」の文脈で使用され、かつ「発現」のさらなる修飾が言及されない場合、これは上記で定義されるとおり「陽性発現」を意味する。
【0019】
本明細書において、「陰性」という用語は、マーカーの発現の文脈で使用される場合、蛍光標識抗体によってアッセイされた抗原の発現を指し、蛍光強度の中央値が、同じ標的に特異的に結合しないアイソタイプの一致の抗体の蛍光強度の中央値よりも、３０％未満、特に１５％未満高い。マーカーのこのような発現は、例えばＣＤ１２７－のように、マーカーの名前の後に上付き文字の「マイナス」（－）で表示される。
【0020】
マーカーの高発現、例えばＣＤ２５の高発現は、細胞あたりのより低い蛍光強度を特徴とする他の集団と比較して細胞あたりの最も高い蛍光強度を示すＦＡＣＳによって検出された明確に区別可能な細胞集団におけるそのようなマーカーの発現レベルを指す。高発現は、例えばＣＤ２５ｈｉｇｈのように、マーカー名の後に上付き文字で「ｈｉｇｈ」又は「ｈｉ」と表示される。「高く発現されている」という用語は、同じ特性に関している。
【0021】
マーカーの低発現、例えばＣＤ１２７の低発現は、細胞あたりの蛍光強度がより高いことを特徴とする他の集団と比較して、細胞あたりの蛍光強度が最も低いことを示すＦＡＣＳによって検出された明確に区別可能な細胞集団におけるそのようなマーカーの発現レベルを指す。低発現は、例えばＣＤ１２７ｌｏｗのようにマーカーの名前の後に上付き文字「ｌｏｗ」又は「ｌｏ」で表示される。「低く発現されている」という用語は、同じ特性に関している。
【0022】
マーカーの発現は、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、又はマルチプレックス分析などの技術を介してアッセイすることができる。
【0023】
本明細書の文脈における「クロノタイプ（ｃｌｏｎｏｔｙｐｅ）」という用語は、ＴＣＲの可変領域に関して実質的に同一の核酸配列を示すＴ細胞受容体核酸配列を含むか、又はＴＣＲの可変領域に関して実質的に同一のアミノ酸配列を示すＴ細胞受容体アミノ酸配列を含むＴ細胞の群を指す。ＴＣＲの可変領域に関して実質的に同一のアミノ酸配列を示すクロノタイプは、クラスタ型と呼ばれることもある。
【0024】
発明の詳細な説明
本発明は、腫瘍特異的Ｔ細胞の調製物を生成する方法に関する。この方法は、以下の工程を含む：
－ サンプル収集の工程：腫瘍に浸潤したＴ細胞を含む腫瘍サンプルが患者から得られる。本発明を定義する目的のために、患者からサンプルを取得する実際の工程は、必ずしもこの方法の一部である必要はない。しかしながら、サンプルが患者特異的であり、本明細書に開示される一般的な方法は、その腫瘍に存在する特定の制御性Ｔ細胞によって媒介される免疫抑制を逆転することによって１つの特定の腫瘍を標的とするＴ細胞の調製物を提供する方法であることが重要である。
－ 腫瘍Ｔ細胞の単離の工程：制御性Ｔ細胞は腫瘍サンプルから単離され、これにより腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ（ｔｉＴｒｅｇ：ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｔｒｅｇ）細胞の調製物を生成する。組織からＴ細胞調製物を生成するための方法が当技術分野で知られている（ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（登録商標）及びＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）。
－ 腫瘍Ｔ細胞のシーケンシングの工程：腫瘍浸潤性Ｔ細胞受容体をコードする複数の核酸配列が、前の工程で得られた制御性Ｔ細胞から得られ、これにより腫瘍ＴＣＲ配列のセットが得られる。理想的には、この配列のセットは、サンプルに含まれる各Ｔ細胞を代表する。腫瘍Ｔ細胞由来の核酸は、クロノタイプ決定（ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ）のための短鎖ＣＤＲ３配列トラクト及びレシピエントＴ細胞に導入される導入遺伝子ＴＣＲ発現カセットを構築するための完全なＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖のその後の生成の両方についての後続の決定に十分である必要がある。
－ 配列選択の工程：腫瘍浸潤性制御性Ｔ細胞受容体（ｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ：ｔｕｍｏｕｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）をコードする１つ又は複数の核酸配列が選択され、１つ又は複数の選択されたｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ配列が得られる。選択されたｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ配列は、腫瘍に特異的である。どのｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ配列がこの特異性を持っているかを決定するためのさまざまな方法が存在し、これは、次に限定されないが、腫瘍特異性の指標として、かつデータベースとの腫瘍由来の制御性Ｔ細胞受容体配列の比較のために、腫瘍と非腫瘍（特に：腫瘍部位に隣接する非腫瘍組織）との間のクロノタイプの頻度の比率によって定量的に決定されるような腫瘍に固有の制御性Ｔ細胞のクローンの好ましい局在化を使用する方法を含む。
－ レシピエントＴ細胞：制御性Ｔ細胞ではないレシピエントＴ細胞が患者から得られる。この場合も、本発明を定義する目的のためには、患者から細胞を取得する実際の工程は、必ずしもこの方法の一部である必要はない。ほとんどの実施形態において、レシピエントＴ細胞は、ナイーブＴ細胞の割合が少ないヘルパー細胞であり、それらの大部分は、末梢血Ｔ細胞レパートリーを代表するセントラル記憶及びエフェクター記憶の表現型を示す。特定の実施形態において、レシピエント細胞としての濃縮されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の使用は有利であり得る。
－ 遺伝子導入の工程：レシピエントＴ細胞で作動可能なプロモーター配列の制御下にある選択されたｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲをコードする核酸は、レシピエントＴ細胞に導入され、それにより、本発明による腫瘍特異的Ｔ細胞の調製物が得られる。本発明の目的のために、導入遺伝子の導入の最も実行可能な方法は、ウイルスＤＮＡ導入としても知られる形質導入であると考えられている。多くの技術で機能することが実証されており、いくつかの試験済み遺伝子導入ビヒクル、すなわちレトロウイルス、特にレンチウイルス遺伝子導入が臨床使用に利用可能である（Ｖｏｓｓら、Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１，２，３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，２００５を参照）。非ウイルス／プラスミドＤＮＡ導入によるトランスフェクションが代替手段となり得る。
本発明は、腫瘍特異的Ｔ細胞の調製物を生成する方法に関する。この方法は、以下の工程を含む：
－ サンプル収集の工程：腫瘍に浸潤したＴ細胞を含む腫瘍サンプルが患者から得られる。本発明を定義する目的のために、患者からサンプルを取得する実際の工程は、必ずしもこの方法の一部である必要はない。しかしながら、サンプルが患者特異的であり、本明細書に開示される一般的な方法は、その腫瘍に存在する特定の制御性Ｔ細胞によって媒介される免疫抑制を逆転することによって１つの特定の腫瘍を標的とするＴ細胞の調製物を提供する方法であることが重要である。
－ 腫瘍Ｔ細胞の単離の工程：制御性Ｔ細胞は腫瘍サンプルから単離され、これにより腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ（ｔｉＴｒｅｇ：ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｔｒｅｇ）細胞の調製物を生成する。組織からＴ細胞調製物を生成するための方法が当技術分野で知られている（ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（登録商標）及びＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）。
－ 腫瘍Ｔ細胞のシーケンシングの工程：腫瘍浸潤性Ｔ細胞受容体をコードする複数の核酸配列が、前の工程で得られた制御性Ｔ細胞から得られ、これにより腫瘍ＴＣＲ配列のセットが得られる。理想的には、この配列のセットは、サンプルに含まれる各Ｔ細胞を代表する。腫瘍Ｔ細胞由来の核酸は、クロノタイプ決定（ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ）のための短鎖ＣＤＲ３配列トラクト及びレシピエントＴ細胞に導入される導入遺伝子ＴＣＲ発現カセットを構築するための完全なＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖のその後の生成の両方についての後続の決定に十分である必要がある。
－ 配列選択の工程：腫瘍浸潤性制御性Ｔ細胞受容体（ｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ：ｔｕｍｏｕｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）をコードする１つ又は複数の核酸配列が選択され、１つ又は複数の選択されたｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ配列が得られる。選択されたｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ配列は、腫瘍に特異的である。どのｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ配列がこの特異性を持っているかを決定するためのさまざまな方法が存在し、これは、次に限定されないが、腫瘍特異性の指標として、かつデータベースとの腫瘍由来の制御性Ｔ細胞受容体配列の比較のために、腫瘍と非腫瘍（特に：腫瘍部位に隣接する非腫瘍組織）との間のクロノタイプの頻度の比率によって定量的に決定されるような腫瘍に固有の制御性Ｔ細胞のクローンの好ましい局在化を使用する方法を含む。
－ レシピエントＴ細胞：制御性Ｔ細胞ではないレシピエントＴ細胞が患者から得られる。この場合も、本発明を定義する目的のためには、患者から細胞を取得する実際の工程は、必ずしもこの方法の一部である必要はない。ほとんどの実施形態において、レシピエントＴ細胞は、ナイーブＴ細胞の割合が少ないヘルパー細胞であり、それらの大部分は、末梢血Ｔ細胞レパートリーを代表するセントラル記憶及びエフェクター記憶の表現型を示す。特定の実施形態において、レシピエント細胞としての濃縮されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の使用は有利であり得る。
－ 遺伝子導入の工程：レシピエントＴ細胞で作動可能なプロモーター配列の制御下にある選択されたｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲをコードする核酸は、レシピエントＴ細胞に導入され、それにより、本発明による腫瘍特異的Ｔ細胞の調製物が得られる。本発明の目的のために、導入遺伝子の導入の最も実行可能な方法は、ウイルスＤＮＡ導入としても知られる形質導入であると考えられている。多くの技術で機能することが実証されており、いくつかの試験済み遺伝子導入ビヒクル、すなわちレトロウイルス、特にレンチウイルス遺伝子導入が臨床使用に利用可能である（Ｖｏｓｓら、Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１，２，３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，２００５を参照）。非ウイルス／プラスミドＤＮＡ導入によるトランスフェクションが代替手段となり得る。
【0025】
単離された制御性Ｔ細胞からＴ細胞受容体をコードする複数の核酸配列を取得することは、該細胞のＴ細胞受容体レパートリーを分析することに等しい。言い換えれば、どのＴＣＲ配列がそのＴ細胞集団に、どのくらいの量で存在するか（ＴＣＲ配列の総数の中での相対的な発生率はどれくらいか）について推定が行われる。
【0026】
腫瘍Ｔ細胞シーケンシング工程の前に、例えばＣＤ４抗体を介しての選択によって、ＣＤ４＋細胞が腫瘍サンプルから単離されたＴ細胞から分離されるか、又は腫瘍から分離された腫瘍浸潤性Ｔ細胞が、最初からＣＤ４＋細胞に限定される。腫瘍Ｔ細胞のシーケンシング工程では、ＣＤ４＋Ｔ細胞に由来するＴ細胞受容体をコードする配列のみ又はそれを主にシーケンシングが行われる。
【0027】
Ｔｒｅｇを分析するためのＴ細胞の選別の非限定的な選択肢には以下を含む：ａ）細胞表面マーカーＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ／－を使用すること、ｂ）ＣＤ４＋及び細胞内ＦｏｘＰ３＋染色を使用すること、ｃ）表面マーカーＣＤ４＋ＣＴＬＡ４ｈｉｇｈ又はＣＤ４＋ＣＤ３９ｈｉｇｈを使用すること。非Ｔｒｅｇの従来型ＣＤ４Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ：ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌ）の細胞の選別には、表面マーカーＣＤ４＋ＣＤ２５－ＣＤ１２７ｈｉｇｈを使用して、ＴｒｅｇとＴｃｏｎｖとのＴＣＲレパートリーの可能な重複を決定することができる。分離されたＴ細胞サブセットは、ＤＮＡ抽出のために選択され、α－及び／又はβ－ＴＣＲ／ＣＤＲ３ ＮＧＳ配列分析が行われる。
【0028】
特定の実施形態では、ＣＤ４及びＣＤ２５の発現、及びＣＤ１２７の低発現（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ）及び／又はＣＤ４とＦＯＸＰ３との両方の発現（ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋）によって特徴付けられるＴ細胞が、腫瘍Ｔ細胞の単離の工程で単離され、続いて排他的にシーケンシングされる。特定の実施形態では、制御性Ｔ細胞の表現型を有するＴ細胞は、限定されないが、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ３、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ－３、ＣＤ６９、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１０を含む当技術分野で既知のマーカーによって特徴付けられ、特にＣＤ４及びＣＤ２５の発現によって特徴付けられる（Ｍａｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５，１９５（５）２０３０－２０３７）。
【0029】
特定の実施形態では、配列選択の工程には、前記腫瘍ＴＣＲ配列を互いに比較し、それによって任意の個々の配列の相対的発生率（頻度）を決定し、かつ腫瘍及び非腫瘍の組織又は血液におけるそれらの発生率に基づいて配列を選択することを含む。この情報は、ＴＣＲ媒介性免疫学的平衡の全体に対する特定の配列の寄与、及びＴ細胞の重要な集団の代表である可能性を、それらが局所的腫瘍組織内に存在する抗原に特異的である可能性が高いという観点で、決定するのに有用である。腫瘍特異的クロノタイプは、非腫瘍組織ＣＤ４＋ＴＣＲ配列のセット内で、存在しないか、又は＜２０％、＜１５％、＜１０％、又は＜５％の頻度を示すかである。逆に、腫瘍内の特定のクロノタイプの頻度と非腫瘍組織内の同じクロノタイプの頻度の間の比率が≧５の場合、腫瘍特異性を示す。
【0030】
特定の実施形態では、配列選択工程には、前記腫瘍ＴＣＲ配列を、同じ患者の非腫瘍組織サンプルから得られるＴ細胞から得られたＴＣＲ配列のセット（特に、ＣＤ４＋Ｔ細胞、より特にＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞、さらにより特にＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ及び／又はＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞）と比較することを含む。これらの２つの部位又はサンプル間で特定のＴＣＲ配列の有病率を比較することにより、ＴＣＲ配列又はＴＣＲ配列のセットが腫瘍に特異的であるか、又は組織特異的自己免疫及び／又は感染症の場合のように腫瘍環境の外側に存在するＴＣＲ配列を代表するかどうかを決定することが可能である。本発明は、腫瘍特異的制御性ＴＣＲ配列を非腫瘍制御性ＴＣＲ配列から区別する方法に依存し、後者は、がん治療として免疫刺激の文脈において導入遺伝子ＴＣＲ配列として単離及び使用される場合、潜在的に有害であるが、前者は、抗腫瘍反応を導く能力を持つ。
【0031】
腫瘍由来Ｔｒｅｇ ＴＣＲ配列を血液ＣＤ４＋細胞由来のものと比較することにより、遍在性の全身的に存在するクロノタイプなどのさらなる情報を得ることができる。
【0032】
特定の実施形態では、配列選択の工程には、前記腫瘍ＴＣＲ配列を参照ＴＣＲ配列のセットと比較することを含む。おそらく、本明細書に開示される本発明の反復的な実行は、患者間で共通の腫瘍及び非腫瘍のＴＣＲ配列のデータベースの作成を可能にする豊富なＴＣＲ情報をもたらし、第２の生物学的サンプルへの参照なしに利用者が腫瘍特異的ＴＣＲ配列を同定することを可能にする。
【0033】
腫瘍における高い発生率（頻度）を特徴とする、及び／又は腫瘍ＴＣＲ配列のセットに固有である配列が選択される。
【0034】
特定の実施形態では、配列選択の工程の前に、核酸配列がアミノ酸配列に翻訳され、腫瘍ＴＣＲ配列の比較がアミノ酸配列に基づいて行われる。当業者は、本明細書に開示されるシーケンシング及び比較の工程のいずれもが、核酸配列レベルで実行できるが、アミノ酸配列レベルでも（多くの場合、第２の工程にて）実行できることを認識している。サンプルから配列を取得することはほとんど常に核酸レベルで実行されるが、配列アラインメント及び比較は、核酸配列の特定の違いがポリペプチドの違いをもたらさない可能性があるため、アミノ酸レベルで実行することもあり、これは、抗原又はＭＨＣ認識の目的のためであり、生物学的レベルで操作可能な実体である。
【0035】
特定の実施形態では、配列選択の工程は以下の工程を含む：
－ アラインメントの工程において、腫瘍ＴＣＲ配列のセットをアラインメントする工程、
－ 前記アラインメントの工程でアラインメントされた腫瘍ＴＣＲ配列を、複数の腫瘍サンプルのクロノタイプに分類する工程であり、特定のクロノタイプに含まれる配列は、実質的に同一の配列又は同一の配列を示す、前記工程、
－ 各クロノタイプに関連する腫瘍ＴＣＲ配列の数を決定し、それにより、前記クロノタイプのそれぞれについてのこのセット内のクロノタイプの頻度を得る工程、
－ 前記複数の腫瘍サンプルのクロノタイプから腫瘍特異的なクロノタイプを選択する工程であり、前記腫瘍特異的なクロノタイプは、前記複数の腫瘍サンプルのクロノタイプのうち、最も頻度の高い１００個のクロノタイプのうちの１つ、特に最も高い５０個、２０個、１０個、又は５個のみのうちの１つである、前記工程。
－ アラインメントの工程において、腫瘍ＴＣＲ配列のセットをアラインメントする工程、
－ 前記アラインメントの工程でアラインメントされた腫瘍ＴＣＲ配列を、複数の腫瘍サンプルのクロノタイプに分類する工程であり、特定のクロノタイプに含まれる配列は、実質的に同一の配列又は同一の配列を示す、前記工程、
－ 各クロノタイプに関連する腫瘍ＴＣＲ配列の数を決定し、それにより、前記クロノタイプのそれぞれについてのこのセット内のクロノタイプの頻度を得る工程、
－ 前記複数の腫瘍サンプルのクロノタイプから腫瘍特異的なクロノタイプを選択する工程であり、前記腫瘍特異的なクロノタイプは、前記複数の腫瘍サンプルのクロノタイプのうち、最も頻度の高い１００個のクロノタイプのうちの１つ、特に最も高い５０個、２０個、１０個、又は５個のみのうちの１つである、前記工程。
【0036】
特に、第１のＴ細胞受容体の核酸配列は、第２のＴ細胞受容体の核酸配列と、両方の配列が１つ以下の塩基対位置で異なる場合、実質的に同一である。
【0037】
特定の実施形態において、第１のＴ細胞受容体の核酸配列は、第２のＴ細胞受容体の核酸配列と、両方の配列が１つの塩基対以下で異なり、かつ第１のＴ細胞受容体の核酸配列がそれぞれのサンプル、特に腫瘍サンプルにて、第２のＴ細胞受容体核酸配列と比較して少なくとも２０倍の頻度を示す場合、実質的に同一である。結果として、第１及び第２のＴ細胞受容体の核酸配列は、ともに同じクロノタイプに割り当てられる。
【0038】
同様に、第１のＴ細胞受容体のアミノ酸配列は、第２のＴ細胞受容体のアミノ酸配列と、両方のアミノ酸配列が１つ又は２つ以下の位置で互いに異なる場合、実質的に同一である。上記のＴ細胞受容体のアミノ酸配列は、ＴＣＲα／βのアルファ鎖及び／又はベータ鎖内、あるいはＴＣＲγ／δのガンマ鎖又はデルタ鎖内に含まれ得る。
【0039】
クロノタイプの頻度は、頻度が決定される配列のセット内のＴＣＲ核酸配列によって同定されるＴ細胞の相対的又は絶対的な頻度の尺度である。
【0040】
特に、所与のサンプルにおけるクロノタイプの頻度は、前記サンプル内のＴＣＲ核酸配列によって同定されるＴ細胞の相対的又は絶対的頻度の尺度である。
【0041】
特定の実施形態において、上記の複数のＴ細胞受容体の核酸配列は、ヒトＴ細胞受容体、特にＴＣＲα／β又はＴＣＲγ／δを形成するポリペプチド鎖の１つをコードする核酸配列内に含まれる。特定の実施形態において、上記の複数のＴ細胞受容体の核酸配列は、非コーディング核酸配列を含まない。非コーディング配列とは、機能しないＴＣＲタンパク質の配列をもたらす終止コドン又はフレームシフトを伴うクロノタイプを指す。
【0042】
特定の実施形態において、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体の核酸配列は、３０ヌクレオチド～１１０ヌクレオチドの長さを特徴とする。
【0043】
特定の実施形態において、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体の核酸配列は、ヒトＴ細胞受容体を形成するポリペプチド鎖（アルファ、ベータ、ガンマ及びデルタ）のいずれか１つに含まれる固有のアミノ酸配列をコードし、前記固有のアミノ酸配列は、特定のクロノタイプ又はクラスタ型でのみ生じ、他のいずれのクロノタイプ又はクラスタ型では生じない。
【0044】
特定の実施形態では、配列の比較は、ＣＤＲ３配列トラクトに関して行われ、特定のクロノタイプのすべてのメンバーは、同一のＣＤＲ３配列を示す。
【0045】
特定の実施形態では、この方法は、非腫瘍配列のセットの取得及び同定を可能にする以下の工程をさらに含む：
－ 非腫瘍組織サンプルが、前記患者から得られる工程（前に説明したように、必ずしも本明細書で請求されるとおりこの方法の技術的部分である必要はなく、このサンプルは前もって得られていてもよい）；
－ 核酸調製物が、核酸単離工程で非腫瘍サンプルから単離される工程；
－ 複数の非腫瘍組織Ｔ細胞受容体の配列が、非腫瘍組織サンプルから得られ、これにより、非腫瘍組織ＴＣＲ配列のセットが生成される工程；
－ 複数の非腫瘍組織Ｔ細胞受容体の配列が、アラインメントされる工程；
－ 非腫瘍組織Ｔ細胞受容体の配列が、複数の非腫瘍組織のクロノタイプに分類される工程。特定のクロノタイプに分類されたＴ細胞受容体の配列は、実質的に同一又は同一の配列を示す；
－ 各クロノタイプに関連する非腫瘍組織Ｔ細胞受容体の配列の数が決定され、それにより、クロノタイプのそれぞれについてのセット内のクロノタイプの頻度が得られる工程；
－ 腫瘍特異的クロノタイプが、複数の腫瘍サンプルのクロノタイプから選択される工程。腫瘍特異的クロノタイプは、非腫瘍組織ＴＣＲ配列のセット内で、存在しないか、又は＜２０％、＜１５％、＜１０％、又は＜５％の頻度を示すかである。
－ 非腫瘍組織サンプルが、前記患者から得られる工程（前に説明したように、必ずしも本明細書で請求されるとおりこの方法の技術的部分である必要はなく、このサンプルは前もって得られていてもよい）；
－ 核酸調製物が、核酸単離工程で非腫瘍サンプルから単離される工程；
－ 複数の非腫瘍組織Ｔ細胞受容体の配列が、非腫瘍組織サンプルから得られ、これにより、非腫瘍組織ＴＣＲ配列のセットが生成される工程；
－ 複数の非腫瘍組織Ｔ細胞受容体の配列が、アラインメントされる工程；
－ 非腫瘍組織Ｔ細胞受容体の配列が、複数の非腫瘍組織のクロノタイプに分類される工程。特定のクロノタイプに分類されたＴ細胞受容体の配列は、実質的に同一又は同一の配列を示す；
－ 各クロノタイプに関連する非腫瘍組織Ｔ細胞受容体の配列の数が決定され、それにより、クロノタイプのそれぞれについてのセット内のクロノタイプの頻度が得られる工程；
－ 腫瘍特異的クロノタイプが、複数の腫瘍サンプルのクロノタイプから選択される工程。腫瘍特異的クロノタイプは、非腫瘍組織ＴＣＲ配列のセット内で、存在しないか、又は＜２０％、＜１５％、＜１０％、又は＜５％の頻度を示すかである。
【0046】
特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体の配列を取得することは、以下の工程を含む：
－ 腫瘍サンプル、非腫瘍組織サンプル、及び血液サンプルからＴ細胞を単離し、単離したＴ細胞から核酸を単離する工程、及び
－ Ｔ細胞受容体の核酸配列を特異的に増幅する核酸増幅反応を行う工程。
－ 腫瘍サンプル、非腫瘍組織サンプル、及び血液サンプルからＴ細胞を単離し、単離したＴ細胞から核酸を単離する工程、及び
－ Ｔ細胞受容体の核酸配列を特異的に増幅する核酸増幅反応を行う工程。
【0047】
ＴＣＲ配列を得るための方法は、当技術分野で知られている。米国特許出願第２０１５／３３７３６８号としても公開されている国際特許出願第２０１４／０９６３９４号は（両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、本実施例で使用される方法を示している。別のシステムは、Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から「ＩｍｍｕｎｏＳＥＱ」の商品名で世界的に入手可能である。
【0048】
特定の実施形態では、核酸増幅反応は、ヒトＴ細胞受容体の鎖のＣＤＲ３領域、特にヒトＴ細胞受容体のアルファ鎖又はベータ鎖のＣＤＲ３領域をコードする配列を特異的に増幅する。
【0049】
ｔｉＴｒｅｇ配列を選択する工程では、個々のアルファ鎖及びベータ鎖に対して関連する完全なＴ細胞受容体の組成についての知識は必要ないが、レシピエント細胞に導入するための機能性ＴＣＲエンコード発現ベクターの再構築にはこの知識が必要である。これを達成するために、いくつかの戦略を採用することができる。
【0050】
現在実施されている手段は、このプロセスにおいてＴＣＲ配列を２回取得するものである：最初に、腫瘍サンプルから取得したＴ細胞の第１の部分が、ＣＲＤ配列トラクトに関してのみシーケンシングされる。これにより、クロノタイプの決定することができる。非腫瘍サンプルも同様にシーケンシングされる。
【0051】
次いで、第２のシーケンシング工程において、腫瘍サンプルから得られたＴ細胞の第２の部分が単一の細胞に分離され、個別にシーケンシングされる。このシーケンシングのラウンド（工程）は、任意の１つの単一細胞で発現する完全なＴＣＲポリペプチド鎖に関する情報を提供し、遺伝子導入工程で採用される導入システムに導入するためのそれぞれの発現ベクターの構築を可能にする。採用できる技術の１つは、米国特許第９，６４４，２０４号、第９，９７５，１２２号、第１０，０５３，７２３号及び第１０，０７１，３７７号に記載されている１０×ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．による１０×シーケンシングであり、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。
【0052】
特定の実施形態では、レシピエントＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞を含む群から選択される。本明細書では、この方法は、患者から得られたサンプルからのヘルパーＴ細胞を選択する工程を含み、濃縮ヘルパーＴ細胞調製物を生成する。レシピエントＴ細胞は、特に患者のリンパ球調製物からのＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の枯渇によって調製される。
【0053】
特定の実施形態において、レシピエントＴ細胞（制御性細胞ではない）は、例えばＣＤ８及びＣＤ２５の陰性選択によって同じ患者のＰＢＭＣから単離されるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ２５－と記載されるヘルパーＴ細胞の濃縮画分に属する。
【0054】
特定の実施形態において、レシピエントＴ細胞は、ＣＤ８陰性及びＣＤ１２７陽性の選択によって同じ患者のＰＢＭＣから単離される、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８－ＣＤ１２７＋と記載されるヘルパーＴ細胞の濃縮画分の一部である。
【0055】
濃縮されたＴ細胞調製物は、遺伝子導入の工程に供される。
【0056】
あるいは、細胞傷害性Ｔ細胞は、患者から得られたサンプルから選択され、濃縮された細胞傷害性Ｔ細胞調製物を生成する。
【0057】
本明細書の文脈における「非腫瘍組織サンプル」という用語は、腫瘍が発生した組織と同じ種類の組織から得られたサンプル又はサンプルのプールを指す。非腫瘍組織の供給源の１つの非限定的な例は、患者の腫瘍に近接した組織である。
【0058】
特に、非腫瘍組織のＴ細胞受容体のアミノ酸配列は、腫瘍から得られたＴ細胞受容体のアミノ酸配列が複数の腫瘍サンプルのクロノタイプに分類されるのと同じ様式で、複数の非腫瘍組織のクロノタイプに分類され、特に、腫瘍サンプルで同定されたクロノタイプを非腫瘍組織のクロノタイプに再割り当てすることを可能にする。
【0059】
特に、あるクロノタイプが、このクロノタイプ内に含まれる複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列のうちのＴ細胞受容体アミノ酸配列のいずれか１つが非腫瘍クロノタイプに含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列と実質的に同一又は同一である場合、非腫瘍のクロノタイプに割り当てることができる。
【0060】
特に、腫瘍で同定されるクロノタイプが、以下のような場合には非腫瘍のクロノタイプに割り当てることができる：
ａ）このクロノタイプ内に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちのＴ細胞受容体核酸配列のいずれか１つが、非腫瘍クロノタイプ内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列と実質的に同一である場合、及び／又は
ｂ）このクロノタイプに含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちのＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列が、非腫瘍サンプルのクロノタイプに含まれるＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合。
ａ）このクロノタイプ内に含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちのＴ細胞受容体核酸配列のいずれか１つが、非腫瘍クロノタイプ内に含まれるＴ細胞受容体核酸配列と実質的に同一である場合、及び／又は
ｂ）このクロノタイプに含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のうちのＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列が、非腫瘍サンプルのクロノタイプに含まれるＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一である場合。
【0061】
特定の実施形態では、非腫瘍サンプルは、腫瘍と同じ種類の組織の非腫瘍組織のサンプル、特に腫瘍に隣接する非腫瘍組織のサンプルである。このような非腫瘍組織は、超音波検査、Ｘ線撮影、ＣＴ、又は免疫染色などの一般的な手法で同定することができる。
【0062】
本明細書の文脈における「血液サンプル」又は「血液からのサンプル」という用語は、患者の血液からのサンプル又は血液から得られたサンプルのプールを指す。
【0063】
特定の実施形態において、血液サンプルから得られたＴ細胞受容体アミノ酸配列は、腫瘍から得られたＴ細胞受容体アミノ酸配列を複数の腫瘍サンプルのクロノタイプに分類するのと同じ様式で、複数の血液サンプルのクロノタイプに分類され、特に腫瘍サンプルのクロノタイプを血液サンプルのクロノタイプに割り当てることができる。
【0064】
特に、腫瘍特異的クロノタイプは、このクロノタイプ内に含まれる複数のＴ細胞受容体アミノ酸配列のうちのＴ細胞受容体アミノ酸配列のいずれか１つが血液サンプルのクロノタイプに含まれるＴ細胞受容体のアミノ酸配列と実質的に同一又は同一の配列を示す場合、血液サンプルのクロノタイプに割り当てることができる。
【0065】
特定の実施形態において、選択された腫瘍特異的クロノタイプは、ヒトサイトメガロウイルス又はエプスタインバーウイルスなどのウイルスに反応性である既知のクロノタイプに割り当てることができない。
【0066】
そのような割り当ては、選択された腫瘍特異的クロノタイプ内に含まれる腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列が、ヒトサイトメガロウイルス又はエプスタインバーウイルスなどのウイルスに反応性である既知のクロノタイプの核酸配列と比較される、バイオインフォマティクス法によって実施され得る。
【0067】
特に、以下の場合に、選択された腫瘍特異的クロノタイプは、ヒトサイトメガロウイルス又はエプスタインバーウイルスなどのウイルスに反応性であることが知られているクロノタイプに割り当てることができない：
ａ）このクロノタイプに含まれる複数のＴ細胞核酸配列のＴ細胞受容体核酸配列のいずれも、既知のクロノタイプに含まれるＴ細胞受容体核酸配列と実質的に同一でない場合、
ｂ）このクロノタイプに含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列のいずれも、既知のクロノタイプに含まれるＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一でない場合、又は
ｃ）このクロノタイプに含まれる複数のＴ細胞アミノ酸配列のＴ細胞受容体アミノ酸配列のいずれも、既知のクロノタイプに含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列と実質的に同一又は同一でない場合。
ａ）このクロノタイプに含まれる複数のＴ細胞核酸配列のＴ細胞受容体核酸配列のいずれも、既知のクロノタイプに含まれるＴ細胞受容体核酸配列と実質的に同一でない場合、
ｂ）このクロノタイプに含まれる複数のＴ細胞受容体核酸配列のＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列のいずれも、既知のクロノタイプに含まれるＴ細胞受容体核酸配列によってコードされるＴ細胞受容体アミノ酸配列と同一でない場合、又は
ｃ）このクロノタイプに含まれる複数のＴ細胞アミノ酸配列のＴ細胞受容体アミノ酸配列のいずれも、既知のクロノタイプに含まれるＴ細胞受容体アミノ酸配列と実質的に同一又は同一でない場合。
【0068】
特定の実施形態において、核酸の単離工程は、以下の工程を含む：
ａ． 前記腫瘍サンプルからＴ細胞を単離し、前記単離されたＴ細胞から核酸を単離する工程、及び／又は
ｂ．Ｔ細胞受容体核酸配列を特異的に増幅する核酸増幅反応を行う工程。
ａ． 前記腫瘍サンプルからＴ細胞を単離し、前記単離されたＴ細胞から核酸を単離する工程、及び／又は
ｂ．Ｔ細胞受容体核酸配列を特異的に増幅する核酸増幅反応を行う工程。
【0069】
特定の実施形態において、腫瘍特異的Ｔ細胞受容体核酸配列は、ヒトＴ細胞受容体の鎖のＣＤＲ３領域、特にヒトＴ細胞受容体のアルファ鎖又はベータ鎖のＣＤＲ３領域をコードするか、又は腫瘍特異的Ｔ細胞受容体アミノ酸配列は、ヒトＴ細胞受容体の鎖のＣＤＲ３領域、特にヒトＴ細胞受容体のアルファ鎖又はベータ鎖のＣＤＲ３領域内に含まれている。
【0070】
特定の実施形態において、腫瘍特異的核酸配列は、ＲＮＡ内に含まれ、特に、ヒトＴ細胞受容体のアルファ鎖又はベータ鎖のＣＤＲ３領域内に含まれるアミノ酸配列をコードする。
【0071】
特定の実施形態において、腫瘍特異的核酸配列は、ＲＮＡ内に含まれ、特に、ヒトＴ細胞受容体のアルファ鎖及びベータ鎖の両方のＣＤＲ３領域内に含まれるアミノ酸配列をコードする。
【0072】
特定の実施形態において、腫瘍特異的核酸配列は、ＲＮＡ内に含まれ、特に、ヒトＴ細胞受容体のアルファ鎖又はベータ鎖のアミノ酸配列の長く伸びる鎖をコードする。
【0073】
特に、本発明の腫瘍特異的Ｔｒｅｇ ＴＣＲ形質導入化Ｔ細胞の調製物の腫瘍反応性は、以下によって確認することができる：
－ 本発明の上記のＴｒｅｇ ＴＣＲ形質導入化腫瘍特異的Ｔ細胞の調製物の少なくともアリコートを、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を刺激するインターフェロンガンマを用いて前処理又は未処理された患者の自己腫瘍の細胞懸濁液（「標的細胞懸濁液」）と、又は患者の自己抗原提示細胞を伴う自己腫瘍の溶解物と共培養すること、及び
－ 標的細胞懸濁液の存在下で前記Ｔ細胞調製物によって産生されるインターフェロンガンマ又はＴＮＦアルファの量を決定すること、及び／又は前記標的細胞懸濁液の存在下で前記Ｔ細胞調製物中のＴ細胞活性化マーカーのレベルを決定すること、特に、ＯＸ４０、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ４、ＰＤ－１、ＣＤ３９；ブチロフィリンのメンバー、ブチロフィリン様タンパク質及び／又はＣＤ６９のレベルを決定すること。
－ 本発明の上記のＴｒｅｇ ＴＣＲ形質導入化腫瘍特異的Ｔ細胞の調製物の少なくともアリコートを、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を刺激するインターフェロンガンマを用いて前処理又は未処理された患者の自己腫瘍の細胞懸濁液（「標的細胞懸濁液」）と、又は患者の自己抗原提示細胞を伴う自己腫瘍の溶解物と共培養すること、及び
－ 標的細胞懸濁液の存在下で前記Ｔ細胞調製物によって産生されるインターフェロンガンマ又はＴＮＦアルファの量を決定すること、及び／又は前記標的細胞懸濁液の存在下で前記Ｔ細胞調製物中のＴ細胞活性化マーカーのレベルを決定すること、特に、ＯＸ４０、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ４、ＰＤ－１、ＣＤ３９；ブチロフィリンのメンバー、ブチロフィリン様タンパク質及び／又はＣＤ６９のレベルを決定すること。
【0074】
一実施形態では、本発明の方法は、以下の工程によって腫瘍特異的Ｔ細胞の調製を提供する：
－ ＣＤ４＋Ｔ細胞が、患者から得られた腫瘍サンプルから単離され、単離された腫瘍浸潤（ＴＩＬ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の代表的なセットのＴ細胞受容体配列が決定され、かつ腫瘍浸潤（ＴＩＬ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のクロノタイプに分類され、すべてのＴＩＬ ＣＤ４＋細胞間の各クロノタイプの頻度が決定される工程。
－ 同様に、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、同じ患者から得られた非腫瘍サンプルから単離され、単離された非腫瘍ＣＤ４＋Ｔ細胞の代表的なセットのＴ細胞受容体配列が決定され、かつクロノタイプに分類され、すべての非腫瘍ＣＤ４＋細胞間の各クロノタイプの頻度が決定される工程。
－ Ｔ細胞受容体配列が、腫瘍浸潤ＣＤ４＋制御性（ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ及び／又はＦＯＸＰ３＋）Ｔ細胞の代表的なセットについて決定される工程。この場合も、クロノタイプの分布とクロノタイプの頻度（ＴＩＬ ＣＤ４制御性細胞のセットのために決定されたすべてのＴＣＲ配列間のクロノタイプの発生）が決定される。
－ Ｔ細胞受容体配列が、腫瘍浸潤ＣＤ４＋従来型（ＣＤ２５－ＣＤ１２７＋及び／又はＦＯＸＰ３－）細胞の代表的なセットについて決定される工程。この場合も、クロノタイプの分布及びクロノタイプの頻度（ＴＩＬ ＣＤ４従来型細胞のセットのために決定されたすべてのＴＣＲ配列間のクロノタイプの発生）が決定される。
－ 選択の工程では、腫瘍浸潤性制御性Ｔ細胞受容体（ｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ：ｔｕｍｏｕｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）をコードする１つ又は複数のＴＣＲ配列が選択され、１つ又は複数の選択されたｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ配列が生成される工程。クロノタイプの選択は、以下の基準を適用して行うことができる：ＴＩＬ ＣＤ４＋細胞間のクロノタイプの頻度が、非腫瘍ＣＤ４＋細胞間のクロノタイプの頻度よりも有意に高く（特定の実施形態では、少なくとも５倍高い）、かつ前記クロノタイプは誘導型Ｔｒｅｇとして特徴付けられ、すなわち、これはｔｉＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗ又はＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋）画分とｔｉＴｃｏｎｖ（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｌｏｗＣＤ１２７＋又はＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－）画分のとの間のＴＣＲｓａｆｅ分析において重複を示し、及び／又は１０×Ｇｅｎｏｍｉｘ単一細胞分析が、ＦＯＸＰ３発現細胞及びＦＯＸＰ３陰性細胞の両方のクロノタイプに属するＴＩＬ ＣＤ４＋細胞で検出される。
－ 遺伝子導入工程では、前の工程で選択したｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲをコードする１つ又は複数の核酸発現ベクターが、レシピエントＴ細胞で操作可能なプロモーター配列の制御下でレシピエントＴ細胞に導入され、それにより腫瘍特異的Ｔ細胞の調製物が得られる工程。
－ ＣＤ４＋Ｔ細胞が、患者から得られた腫瘍サンプルから単離され、単離された腫瘍浸潤（ＴＩＬ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の代表的なセットのＴ細胞受容体配列が決定され、かつ腫瘍浸潤（ＴＩＬ）ＣＤ４＋Ｔ細胞のクロノタイプに分類され、すべてのＴＩＬ ＣＤ４＋細胞間の各クロノタイプの頻度が決定される工程。
－ 同様に、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、同じ患者から得られた非腫瘍サンプルから単離され、単離された非腫瘍ＣＤ４＋Ｔ細胞の代表的なセットのＴ細胞受容体配列が決定され、かつクロノタイプに分類され、すべての非腫瘍ＣＤ４＋細胞間の各クロノタイプの頻度が決定される工程。
－ Ｔ細胞受容体配列が、腫瘍浸潤ＣＤ４＋制御性（ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ及び／又はＦＯＸＰ３＋）Ｔ細胞の代表的なセットについて決定される工程。この場合も、クロノタイプの分布とクロノタイプの頻度（ＴＩＬ ＣＤ４制御性細胞のセットのために決定されたすべてのＴＣＲ配列間のクロノタイプの発生）が決定される。
－ Ｔ細胞受容体配列が、腫瘍浸潤ＣＤ４＋従来型（ＣＤ２５－ＣＤ１２７＋及び／又はＦＯＸＰ３－）細胞の代表的なセットについて決定される工程。この場合も、クロノタイプの分布及びクロノタイプの頻度（ＴＩＬ ＣＤ４従来型細胞のセットのために決定されたすべてのＴＣＲ配列間のクロノタイプの発生）が決定される。
－ 選択の工程では、腫瘍浸潤性制御性Ｔ細胞受容体（ｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ：ｔｕｍｏｕｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）をコードする１つ又は複数のＴＣＲ配列が選択され、１つ又は複数の選択されたｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ配列が生成される工程。クロノタイプの選択は、以下の基準を適用して行うことができる：ＴＩＬ ＣＤ４＋細胞間のクロノタイプの頻度が、非腫瘍ＣＤ４＋細胞間のクロノタイプの頻度よりも有意に高く（特定の実施形態では、少なくとも５倍高い）、かつ前記クロノタイプは誘導型Ｔｒｅｇとして特徴付けられ、すなわち、これはｔｉＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗ又はＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋）画分とｔｉＴｃｏｎｖ（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｌｏｗＣＤ１２７＋又はＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－）画分のとの間のＴＣＲｓａｆｅ分析において重複を示し、及び／又は１０×Ｇｅｎｏｍｉｘ単一細胞分析が、ＦＯＸＰ３発現細胞及びＦＯＸＰ３陰性細胞の両方のクロノタイプに属するＴＩＬ ＣＤ４＋細胞で検出される。
－ 遺伝子導入工程では、前の工程で選択したｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲをコードする１つ又は複数の核酸発現ベクターが、レシピエントＴ細胞で操作可能なプロモーター配列の制御下でレシピエントＴ細胞に導入され、それにより腫瘍特異的Ｔ細胞の調製物が得られる工程。
【0075】
特定の実施形態では、遺伝子導入工程の前に導入遺伝子生成工程があり、プロモーター配列の制御下にある前記選択されたｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲをコードする核酸が、以下によって生成される：
ａ． 前記腫瘍サンプルから得られた複数の制御性Ｔ細胞を単一の細胞に分離すること。
ｃ． 複数の完全なＴＣＲ配列のセットを取得すること。各ＴＣＲ配列のセットは、前記複数の細胞から完全なＴＣＲα及びＴＣＲβのポリペプチド配列を含む。
ｄ． 選択されたｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ配列を完全なＴＣＲ配列のセットに割り当てて、完全なｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ配列のセットを得ること。
ｅ． 前工程で決定した前記完全なｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ配列のセットの完全なＴＣＲα及びＴＣＲβのポリペプチド配列をコードする配列を、遺伝子発現コンストラクトに挿入すること。
ａ． 前記腫瘍サンプルから得られた複数の制御性Ｔ細胞を単一の細胞に分離すること。
ｃ． 複数の完全なＴＣＲ配列のセットを取得すること。各ＴＣＲ配列のセットは、前記複数の細胞から完全なＴＣＲα及びＴＣＲβのポリペプチド配列を含む。
ｄ． 選択されたｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ配列を完全なＴＣＲ配列のセットに割り当てて、完全なｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ配列のセットを得ること。
ｅ． 前工程で決定した前記完全なｔｉＴｒｅｇ ＴＣＲ配列のセットの完全なＴＣＲα及びＴＣＲβのポリペプチド配列をコードする配列を、遺伝子発現コンストラクトに挿入すること。
【0076】
本発明の別の態様は、本発明の方法によって得られるＴ細胞の調製物、特に、がんの治療、又はその再発の予防に使用するための調製物に関する。
【0077】
本発明のさらに別の態様は、本発明の上記の態様及び実施形態に記載されたとおりの同定及び単離された腫瘍特異的Ｔｒｅｇ ＴＣＲを採用することにより、腫瘍特異的新生抗原を同定する方法に関する。これらの新生抗原は、腫瘍ワクチンとして、あるいは腫瘍エスケープに対抗するための二重特異性抗体又は二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ Ｃｏｒｐ．））関連の免疫療法の開発に採用することができる。
【0078】
抗腫瘍Ｔ細胞応答の主な標的は、腫瘍特異的な体細胞変異に起因するいわゆる新生抗原である。それらは、生検又は外科的切除材料に由来する腫瘍細胞のゲノムＤＮＡ及びＲＮＡを使用した全エクソーム及びトランスクリプトームシーケンシングによって同定される。比較のために、腫瘍隣接の正常組織又は末梢血リンパ球からの対応する核酸も同様にシーケンシングされる。次に、新生抗原候補、特に、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦなどの一般的な発癌性ドライバー遺伝子に変異がある候補を、インビトロでＴｒｅｇ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞による認識について試験する。変異した新生抗原に加えて、腫瘍型特異的ながん生殖細胞系列抗原、又は腫瘍細胞にて（代替リーディングフレームにおいて）過剰発現又は異常に発現した抗原などの候補の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ：ｔｕｍｏｕｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）は、トランスクリプトームシーケンシングによっても同定することができ、かつＴｒｅｇ ＴＣＲ形質導入化Ｔ細胞による認識について試験することができる。変異によって交換されたアミノ酸を含有する新生抗原に由来するペプチドと、候補ＴＡＡの完全なアミノ酸配列にわたって長く重複するペプチドライブラリーの両方が合成され、自己又はＨＬＡ適合抗原提示細胞にパルスされ、ＩＦＮ－γ－Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、ＥＬＩＳＡ、又は同等の試験などの機能アッセイを介してＴｒｅｇ ＴＣＲ形質導入化Ｔ細胞による認識について試験される。
【0079】
したがって、一実施形態では、本発明は、腫瘍特異的Ｔ細胞応答を誘発する新生抗原の能力を決定するための方法に関する。この方法は、以下の工程を含む：
－ 新生抗原の候補オリゴペプチド又は新生抗原ポリペプチドを、患者由来の抗原提示細胞、又は患者のＨＬＡレパートリーを代表するＨＬＡ分子を提示する抗原提示細胞株と接触させる工程；又は
－ 腫瘍限定的発現を有する変異していない抗原に由来する候補オリゴペプチド又はポリペプチドを、患者由来の抗原提示細胞、又は患者のＨＬＡレパートリーを代表するＨＬＡ分子を提示する抗原提示細胞株と接触させる工程；
－ 前記抗原提示細胞を、本発明の第１の態様にしたがって同定される腫瘍特異的ＴＣＲ配列を発現するＴ細胞（非Ｔｒｅｇ ＴＣ）と接触させる工程、及び
－ 腫瘍抗原候補を提示する抗原提示細胞と形質導入化Ｔ細胞との相互作用が前記Ｔ細胞の活性化につながるかどうかを決定する工程。活性化が記録される場合、新生抗原候補には新生抗原のステータスが割り当てられる。同様に、このｔｉＴｒｅｇトランスジェニックＴ細胞によって認識される腫瘍限定的発現を伴う変異していない抗原候補には、腫瘍関連抗原が割り当てられる。
－ 新生抗原の候補オリゴペプチド又は新生抗原ポリペプチドを、患者由来の抗原提示細胞、又は患者のＨＬＡレパートリーを代表するＨＬＡ分子を提示する抗原提示細胞株と接触させる工程；又は
－ 腫瘍限定的発現を有する変異していない抗原に由来する候補オリゴペプチド又はポリペプチドを、患者由来の抗原提示細胞、又は患者のＨＬＡレパートリーを代表するＨＬＡ分子を提示する抗原提示細胞株と接触させる工程；
－ 前記抗原提示細胞を、本発明の第１の態様にしたがって同定される腫瘍特異的ＴＣＲ配列を発現するＴ細胞（非Ｔｒｅｇ ＴＣ）と接触させる工程、及び
－ 腫瘍抗原候補を提示する抗原提示細胞と形質導入化Ｔ細胞との相互作用が前記Ｔ細胞の活性化につながるかどうかを決定する工程。活性化が記録される場合、新生抗原候補には新生抗原のステータスが割り当てられる。同様に、このｔｉＴｒｅｇトランスジェニックＴ細胞によって認識される腫瘍限定的発現を伴う変異していない抗原候補には、腫瘍関連抗原が割り当てられる。
【0080】
本発明はさらに、バイオマーカーとしての腫瘍特異的制御性ＴＣＲ配列の使用を提供する。
【0081】
Ｔｒｅｇ ＴＣＲのヌクレオチド配列は、新しいエフェクターＴ細胞に形質導入する目的で合成され、発現ベクターに（非限定的な例として、レトロウイルス発現ベクターにより）導入され得る。α鎖及びβ鎖の配列は、コドン最適化配列として（又はアミノ酸レベルで異なることがない患者に見られるＴＣＲ配列とは有意に異なる核酸配列として）設計することができ、それらに末梢血リンパ球などのエクスビボ材料のハイスループットシーケンシングによって簡単に認識及び定量化できる固有の配列特徴を与えることができる。Ｔｒｅｇ ＴＣＲ形質導入化Ｔ細胞を患者に養子移入した後、該Ｔｒｅｇ ＴＣＲ配列を治療後のさまざまな時点でモニターすることができ、治療を受けた患者の臨床経過と関連付けることができる。
【0082】
本発明は、以下の実施例及び図によってさらに説明され、そこから、さらなる実施形態及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明することを意図しているが、その範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【0083】
さまざまな組織の取り扱いと処理及び細胞選別
ａ）腫瘍サンプルは、腫瘍組織から採取された１つのサンプル又は複製サンプルのセットとしてのいずれかで定義される。実際には、ＴＣＲを分析するための材料は、次のいずれかによって取得される：
ｉ．）別個の生検又は１つの生検の異なる領域を選択すること。これは免疫組織化学的染色が貢献し、特にＴｒｅｇ細胞はＣＤ４、ＦＯＸＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＴＬＡ４、ＣＤ３９などのＴｒｅｇマーカーで免疫組織学的に染色され、そして染色された領域がＤＮＡ抽出のために選択される。
ｉｉ．）腫瘍組織の溶解（例えば、ＴＣＲ分析の開始点としての単一細胞懸濁液の調製のためのビーズに基づく技術によって）。Ｔｒｅｇを分析するためのＴ細胞選別にはいくつかの選択肢がある。これらには、ａ）細胞表面マーカーＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ／－の使用、ｂ）ＣＤ４＋及び細胞内ＦＯＸＰ３＋染色の使用、ｃ）表面マーカーＣＤ４＋ＣＴＬＡ４ｈｉｇｈ又はＣＤ４＋ＣＤ３９ｈｉｇｈの使用が含まれる。
ａ）腫瘍サンプルは、腫瘍組織から採取された１つのサンプル又は複製サンプルのセットとしてのいずれかで定義される。実際には、ＴＣＲを分析するための材料は、次のいずれかによって取得される：
ｉ．）別個の生検又は１つの生検の異なる領域を選択すること。これは免疫組織化学的染色が貢献し、特にＴｒｅｇ細胞はＣＤ４、ＦＯＸＰ３、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＴＬＡ４、ＣＤ３９などのＴｒｅｇマーカーで免疫組織学的に染色され、そして染色された領域がＤＮＡ抽出のために選択される。
ｉｉ．）腫瘍組織の溶解（例えば、ＴＣＲ分析の開始点としての単一細胞懸濁液の調製のためのビーズに基づく技術によって）。Ｔｒｅｇを分析するためのＴ細胞選別にはいくつかの選択肢がある。これらには、ａ）細胞表面マーカーＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ／－の使用、ｂ）ＣＤ４＋及び細胞内ＦＯＸＰ３＋染色の使用、ｃ）表面マーカーＣＤ４＋ＣＴＬＡ４ｈｉｇｈ又はＣＤ４＋ＣＤ３９ｈｉｇｈの使用が含まれる。
【0084】
非Ｔｒｅｇ従来型ＣＤ４Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）の細胞選別では、表面マーカーＣＤ４＋ＣＤ２５－ＣＤ１２７ｈｉｇｈ及び／又はＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－を使用して、Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖのＴＣＲレパートリーの潜在的な重複を決定できる。Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖの画分における固有のクロノタイプのこのような重複は、誘導型Ｔｒｅｇ形成の指標である。免疫療法のアプローチにＴｒｅｇ ＴＣＲを使用する場合、ＴＣＲが天然型制御性Ｔ細胞に由来するか、又は誘導型Ｔ細胞に由来するかの違いができる。誘導型ＴｒｅｇのＴＣＲは、腫瘍特異的ヘルパーＴ細胞に由来する。したがって、その使用は腫瘍特異的かつ安全（ｓａｆｅ）なものでなければならない。一方、天然型制御性Ｔ細胞のＴＣＲは、生物の他の部位で同族の自己抗原を認識し、自己免疫の誘導による悪影響を引き起こす可能性がある。そのような副作用は、細胞毒性ではなく炎症性のものである可能性があり、抗炎症治療を必要とする可能性がある。さらに、末梢性誘導型Ｔｒｅｇ細胞は、表面マーカーのニューロピリン１及び細胞内マーカーのヘリオスの発現がないことにより、胸腺の天然Ｔｒｅｇ細胞と区別することができる。分離されたＴ細胞サブセットは、ＤＮＡ抽出のために選択され、α－及び／又はβ－ＴＣＲ／ＣＤＲ３ ＮＧＳ配列分析が行われる。
【0085】
さらに、腫瘍サンプルは、細胞材料の供給源として細胞保存条件下で保存することができる。
【0086】
ｂ）同じ患者からの非腫瘍サンプルは、再現が可能であれば、別個の組織スポットから可能な限り、腫瘍サンプルに隣接する組織／領域から選択される。組織サンプルを採取するか、又は単一細胞懸濁液を調製する。Ｔｒｅｇを同定するためのＴ細胞選別にはいくつかの選択肢がある。これらには、ａ）細胞表面マーカーＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ／－の使用、ｂ）ＣＤ４＋及び細胞内ＦＯＸＰ３＋染色の使用、ｃ）表面マーカーＣＤ４＋ＣＴＬＡ４ｈｉｇｈ又はＣＤ４＋ＣＤ３９ｈｉｇｈの使用が含まれる。非Ｔｒｅｇ従来型ＣＤ４Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）の細胞選別には、表面マーカーＣＤ４＋ＣＤ２５－ＣＤ１２７ｈｉｇｈを使用して、ＴｒｅｇとＴｃｏｎｖのＴＣＲ－レパートリーの潜在的な重複を判断することができる。組織サンプル又は分離されたＴ細胞サブセットは、ＤＮＡ抽出のために選択され、α－及び／又はβ－ＴＣＲ／ＣＤＲ３ ＮＧＳ配列分析が行われる。
【0087】
血液サンプルは同じ患者から採取される：標準的な血液学的分画により、細胞成分は全血から単離される。細胞成分は、異なるＴ細胞サブセットで分離されてもよい。ＤＮＡ抽出後、α－及び／又はβ－ＴＣＲ／ＣＤＲ３ ＮＧＳ配列分析が実行される。
【0088】
腫瘍特異的Ｔｒｅｇ ＴＣＲの遺伝子導入による抗腫瘍Ｔ細胞の提供
腫瘍（ＮＳＣＬＣ）及び肺組織からのＴリンパ球の細胞懸濁液の調製：
各腫瘍検体は、周囲の正常組織及び壊死領域がないように解剖される。腫瘍及び正常な肺組織からの約０．８ｇの立方体が、各寸法で約２～３ｍｍの小さな塊に切断される。スライスされた腫瘍（及び非腫瘍）生検は、腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用し、製造元の指示にしたがって、市販の機械的／酵素的組織解離システム（ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に供される。
腫瘍（ＮＳＣＬＣ）及び肺組織からのＴリンパ球の細胞懸濁液の調製：
各腫瘍検体は、周囲の正常組織及び壊死領域がないように解剖される。腫瘍及び正常な肺組織からの約０．８ｇの立方体が、各寸法で約２～３ｍｍの小さな塊に切断される。スライスされた腫瘍（及び非腫瘍）生検は、腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用し、製造元の指示にしたがって、市販の機械的／酵素的組織解離システム（ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に供される。
【0089】
穏やかなＭＡＣＳ分離の後、細胞懸濁液を７０μｍストレーナーに通す。この時点で腫瘍細胞のアリコートを採取し、後で使用するために１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び９０％ＦＣＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で凍結保存する。残りの細胞懸濁液は、ＰＢＳ／ＲＰＭＩ １６４０中のＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）の４０％／８０％のステップ勾配を使用する密度勾配遠心分離に供される。Ｔリンパ球を間期から採取し、完全培地（ＲＰＭＩ１６４０、Ｌｏｎｚａ）で洗浄する。続いて、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加した２ｍＬのＴｅｘＭＡＣＳ培地（＝回収培地、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を含む２４ウェル組織培養プレートの各ウェルに０．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で細胞を配置することによりＴリンパ球を培養する。プレートを５％ＣＯ２の加湿３７℃インキュベーターに入れ、一晩培養する。
【0090】
Ｔリンパ球の選別
翌日、細胞を採取し、ウェルからプールする。Ｔｒｅｇ画分（ＣＤ４＋，ＣＤ２５ｈｉｇｈ，ＣＤ１２７ｌｏｗ／ｎｅｇ）及び対応するＴｃｏｎｖ画分（ＣＤ４＋，ＣＤ２５ｌｏｗ／ｎｅｇ，ＣＤ１２７＋）を単離するために、次の抗体パネル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）：ヒトＣＤ３－ＡＰＣ－Ｖｉｏ７７０、ＣＤ４－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０、ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ１２７－ＡＰＣを使用してＦＡＣＳ選別のために細胞を染色する。さらに、細胞を７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して染色して生存率を試験する。ＤＮＡを分離された各画分から抽出し、ライブラリ調製に利用する。
翌日、細胞を採取し、ウェルからプールする。Ｔｒｅｇ画分（ＣＤ４＋，ＣＤ２５ｈｉｇｈ，ＣＤ１２７ｌｏｗ／ｎｅｇ）及び対応するＴｃｏｎｖ画分（ＣＤ４＋，ＣＤ２５ｌｏｗ／ｎｅｇ，ＣＤ１２７＋）を単離するために、次の抗体パネル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）：ヒトＣＤ３－ＡＰＣ－Ｖｉｏ７７０、ＣＤ４－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０、ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ１２７－ＡＰＣを使用してＦＡＣＳ選別のために細胞を染色する。さらに、細胞を７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して染色して生存率を試験する。ＤＮＡを分離された各画分から抽出し、ライブラリ調製に利用する。
【0091】
ゲノムＤＮＡの分離及びＴＣＲｓａｆｅ（登録商標）分析
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ（デューレン、ドイツ）のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）組織キットを使用して組織材料から抽出する。血液ｇＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）又はＡｌｌＰｒｅｐ（登録商標）ＤＮＡ／ＲＮＡ／ｍｉＲＮＡユニバーサルキット（Ｑｉａｇｅｎ）のいずれかを使用して、製造元の手順にしたがって２～３ｍｌの新しい血液から単離する。
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ（デューレン、ドイツ）のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）組織キットを使用して組織材料から抽出する。血液ｇＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）又はＡｌｌＰｒｅｐ（登録商標）ＤＮＡ／ＲＮＡ／ｍｉＲＮＡユニバーサルキット（Ｑｉａｇｅｎ）のいずれかを使用して、製造元の手順にしたがって２～３ｍｌの新しい血液から単離する。
【0092】
ＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３領域を、ＣＤＲ３領域に隣接するＶセグメント及びＪセグメントに特異的に結合するＴＣＲβプライマーを使用する、ＴＣＲｓａｆｅ（登録商標）法、特許権のある２段階ＰＣＲ増幅手順（国際特許出願第２０１４／０９６３９４ Ａ１号に開示）にしたがってＮＧＳ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳＥＱ）技術でシーケンシングする。ゲノムＤＮＡを、ＮＧＳプロセスの出発物質として使用する。
【0093】
ＮＧＳデータからのクロノタイプ（配列クラスタ）頻度の算出
サンプルごとに、多数（＞１０５）のペアリード（ヌクレオチド配列）をＮＧＳによって一般的に生成する。リードペアは通常、４０～８０塩基が重複し、リードペアが連続した配列に統合される。次に、これらの配列は、実質的に同一のヌクレオチド配列のクラスタにアセンブルされ、クラスタあたりのリードの数がクラスタの頻度を決定する。クラスタの頻度は、このクラスタに分類されるこのサンプル内のリードのパーセンテージについての尺度である。
サンプルごとに、多数（＞１０５）のペアリード（ヌクレオチド配列）をＮＧＳによって一般的に生成する。リードペアは通常、４０～８０塩基が重複し、リードペアが連続した配列に統合される。次に、これらの配列は、実質的に同一のヌクレオチド配列のクラスタにアセンブルされ、クラスタあたりのリードの数がクラスタの頻度を決定する。クラスタの頻度は、このクラスタに分類されるこのサンプル内のリードのパーセンテージについての尺度である。
【0094】
クラスタリングは２つのラウンドで機能する：第１の工程では、１００％のヌクレオチド配列同一性を持つすべてのリードがクラスタ配列がリード配列と同一である１クラスタとしてカウントされ、第２の工程では、複数のクラスタを相互に比較し、かつ
－ １ｂｐを超えないミスマッチを有し、かつ
－ 一方のクラスタ（クラスタＡ）が他方のクラスタ（クラスタＢ）より少なくとも２０倍を超えるリードを有する、
クラスタは統合され、かつクラスタＡと同一とみなされる。核酸配列クラスタは、クロノタイプと同等とみなされる。
－ １ｂｐを超えないミスマッチを有し、かつ
－ 一方のクラスタ（クラスタＡ）が他方のクラスタ（クラスタＢ）より少なくとも２０倍を超えるリードを有する、
クラスタは統合され、かつクラスタＡと同一とみなされる。核酸配列クラスタは、クロノタイプと同等とみなされる。
【0095】
ヌクレオチド配列クラスタをアミノ酸配列（ペプチド）に翻訳し、表にする。各クラスタは、上記で定義されたとおりの頻度を有する１つのクロノタイプとみなされる。この頻度は、サンプル内のそれぞれのＴ細胞の頻度の直接的な尺度である。
【0096】
サンプル間でのＴＣＲ配列プロファイルの比較
クロノタイプのＣＤＲ３アミノ酸配列を、同一性試験手順によってサンプル間で比較した。ここではミスマッチのない配列のみが１つの同じＣＤＲ３アミノ酸配列として受け入れられる。複数のサンプル比較の結果は、１行あたり１つ又は複数のサンプルで共有される１つのＴＣＲβ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する表であり、各サンプルは、そのサンプルにおけるそれぞれのＣＤＲ３頻度を含有する１つの列で表される（１つのサンプルを表す図３を参照）。（同じＣＤＲ３アミノ酸配列を共有する）別個のサンプル間の比率は、それぞれの頻度の比率によって算出される。
クロノタイプのＣＤＲ３アミノ酸配列を、同一性試験手順によってサンプル間で比較した。ここではミスマッチのない配列のみが１つの同じＣＤＲ３アミノ酸配列として受け入れられる。複数のサンプル比較の結果は、１行あたり１つ又は複数のサンプルで共有される１つのＴＣＲβ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する表であり、各サンプルは、そのサンプルにおけるそれぞれのＣＤＲ３頻度を含有する１つの列で表される（１つのサンプルを表す図３を参照）。（同じＣＤＲ３アミノ酸配列を共有する）別個のサンプル間の比率は、それぞれの頻度の比率によって算出される。
【0097】
比較配列分析による腫瘍特異的Ｔｒｅｇのクロノタイプの同定
例示的な一実施形態では、腫瘍特異的Ｔｒｅｇのクロノタイプは、４桁のスコア１１００によって同定される。このスコアは、表１にしたがう比較配列分析により組み合わせされる。
例示的な一実施形態では、腫瘍特異的Ｔｒｅｇのクロノタイプは、４桁のスコア１１００によって同定される。このスコアは、表１にしたがう比較配列分析により組み合わせされる。
【0098】
【表1】
【0099】
各ＣＤＲ３ペプチド配列（配列１，２，３，．．．）について、各サンプル（各列）に単純なバイナリスコアが与えられている。「１」は、それぞれのＣＤＲ３ペプチド配列がサンプル中に存在することを意味し、「０」は、存在しないか、又は低レベルであるかのいずれかを意味する。正確な定義は以下のとおりである。バイナリスコアは、表１に示すとおり４桁のスコアにまとめられる。スコアリングスキーマには、血液サンプルが存在しない場合（つまり列Ｄが「０」で埋められる場合）、又は非腫瘍サンプルが存在しない場合（つまり列Ｃが「０」で埋められる場合）も含まれる。列（サンプルの種類）ごとのバイナリスコアは以下のように定義される：
【0100】
Ａ：スコア＝１：配列（配列１，２，３，．．．）は、上位１００のクロノタイプ（頻度の高いものから低いものへの選別）のうちのものであり、完全なオープンリーディングフレームを示し、つまり、終止コドン又はフレームシフトは見つからず、それ以外の場合はスコア＝０である。
【0101】
Ｂ：スコア＝１：配列（配列１，２，３，．．．）がサンプル中に存在する。ＢがＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ／－として選択されたＴＣＲの腫瘍内の頻度であり、かつＡが腫瘍ＣＤ４＋サンプル中の頻度である場合に、比率Ｂ／Ａは０．５より大きくなる。その他のすべての場合は、スコア＝０である。
【0102】
Ｃ：スコア＝０：配列（配列１，２，３，．．．）が、非腫瘍サンプルに存在しないか、又は腫瘍サンプルで同一と検出されるかのいずれかであるが、Ｃが非腫瘍ＣＤ４＋サンプルの頻度であり、かつＡは腫瘍ＣＤ４＋サンプルの頻度である場合、比率はＣ／Ａ≦０．２である。その他のすべての場合は、スコア＝１である。
【0103】
Ｄ：スコア＝０：配列（配列１，２，３，．．．）の頻度は、腫瘍組織（Ａ）のそれぞれの配列の頻度よりも低い。それ以外の場合はスコア＝１である。
【0104】
それぞれのＴＣＲ配列を腫瘍特異的であると同定するには、１１００のスコアが必要である。表１の配列２はスコアが１１００であり、腫瘍特異的Ｔ－ｒｅｇクロノタイプとして同定される。
【0105】
腫瘍特異的ＴｒｅｇクロノタイプのＴＣＲアルファ／ベータ結合シーケンシング及び完全なアルファ／ベータＴｒｅｇＴＣＲの合成とクローニング
Ｔ細胞受容体の両方の鎖のペアシーケンシングは、標的特異的抗原受容体を用いるＴ細胞の調整された産生に不可欠な前提条件であり、ここで前記標的とは、１つ又は複数の腫瘍抗原、ウイルス又は微生物起源の抗原、自己免疫疾患などに関連する抗原であり得る。いずれのＴ細胞受容体の２つの鎖は異なる染色体上にコードされているため、単一細胞レベルで異なる染色体から転写されたそれぞれのＲＮＡを相関させるには、高度なペアシーケンスアプローチが必要である。Ｔ細胞受容体の両方の鎖のペアシーケンシングを実行するための確立された技術が存在し、例えば、１０×ｇｅｎｏｍｉｃｓ社が提供する技術は、このシステムの単一細胞シーケンシングのためのｃｈｒｏｍｉｕｍコントローラーを使用することにより、あらゆる分子生物学研究所で実装できるものである。別のアプローチは、十分にプレートされた細胞アレイ及び深い並列シーケンシングとそれに続く統計分析に基づく（Ｈｏｗｉｅ Ｂ．ら、Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐａｉｒｉｎｇ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α ａｎｄ β ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７，３０１ （２０１５））。
Ｔ細胞受容体の両方の鎖のペアシーケンシングは、標的特異的抗原受容体を用いるＴ細胞の調整された産生に不可欠な前提条件であり、ここで前記標的とは、１つ又は複数の腫瘍抗原、ウイルス又は微生物起源の抗原、自己免疫疾患などに関連する抗原であり得る。いずれのＴ細胞受容体の２つの鎖は異なる染色体上にコードされているため、単一細胞レベルで異なる染色体から転写されたそれぞれのＲＮＡを相関させるには、高度なペアシーケンスアプローチが必要である。Ｔ細胞受容体の両方の鎖のペアシーケンシングを実行するための確立された技術が存在し、例えば、１０×ｇｅｎｏｍｉｃｓ社が提供する技術は、このシステムの単一細胞シーケンシングのためのｃｈｒｏｍｉｕｍコントローラーを使用することにより、あらゆる分子生物学研究所で実装できるものである。別のアプローチは、十分にプレートされた細胞アレイ及び深い並列シーケンシングとそれに続く統計分析に基づく（Ｈｏｗｉｅ Ｂ．ら、Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐａｉｒｉｎｇ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α ａｎｄ β ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７，３０１ （２０１５））。
【0106】
上記の方法で腫瘍特異的と同定されたＴ細胞受容体のＴＣＲβ ＣＤＲ３部分は、通常最大１００００個のＴ細胞のサンプルと、腫瘍特異的ＴＣＲβ ＣＤＲ３サブ配列を含有するそれぞれのペアＴＣＲ配列の選択とを用いて、単一細胞シーケンシングを実行することによって、別の工程においてそれぞれのα鎖とペアにされるであろう。ペアＴＣＲ配列に基づいて、受容体を合成することができる。
【0107】
１０×ｇｅｎｏｍｉｃｓ技術を使用したＴ細胞受容体プロファイリングとＴｒｅｇ細胞のＦＯＸＰ３遺伝子発現解析との組み合わせ
ペアにされたＴＣＲ単一細胞シーケンシングを遺伝子発現解析と組み合わせることで、Ｔ細胞のサブタイプを特徴づけ、その機能状態を解析することができる。ＦＯＸＰ３は、制御性Ｔ細胞の系統を定義する転写因子である。ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ２５の細胞表面発現が高位かつ安定的であること、ＣＤ１２７の発現がないこと、及びＦＯＸＰ３が構成的に発現していることでエフェクター型Ｔ細胞と区別することができる（ＣＤ２５ｈｉｇｈ／ＣＤ１２７－／ＦＯＸＰ３＋）。ＴＩＬの中からＴｒｅｇを同定するために、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ１２７－ Ｔ細胞をＦＡＣＳで選別し、メーカーの指示に従い、１０×ｇｅｎｏｍｉｃ社のＣｈｒｏｍｉｕｍ（商標）Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｖ（Ｄ）Ｊ Ｒｅａｇｅｎｔキットを用いて、ペアＴＣＲ単一細胞シーケンスとＦＯＸＰ３発現解析との組み合わせに供する。シーケンシングライブラリーの作成とその後のシーケンシングのためのＦＯＸＰ３（ジェンバンクアクセッション ＡＦ２７７９９３）のＰＣＲ増幅を、自社で設計したプライマー（ＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡ（配列番号１０１）；ＧＡＣＡＣＣＡＴＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧ（配列番号１０２）；ＴＴＧＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣＣＡＧＴ（配列番号１０３））を使用することで実現する。１０×テクノロジーでは、天然型制御性Ｔ細胞と誘導型制御性Ｔ細胞の両方を検出することができる。誘導型Ｔｒｅｇは、ＦＯＸＰ３発現Ｔ細胞とＦＯＸＰ３陰性Ｔ細胞とからなる同一のα／β－ＴＣＲを持つ所定のクロノタイプの細胞として同定される。
ペアにされたＴＣＲ単一細胞シーケンシングを遺伝子発現解析と組み合わせることで、Ｔ細胞のサブタイプを特徴づけ、その機能状態を解析することができる。ＦＯＸＰ３は、制御性Ｔ細胞の系統を定義する転写因子である。ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ２５の細胞表面発現が高位かつ安定的であること、ＣＤ１２７の発現がないこと、及びＦＯＸＰ３が構成的に発現していることでエフェクター型Ｔ細胞と区別することができる（ＣＤ２５ｈｉｇｈ／ＣＤ１２７－／ＦＯＸＰ３＋）。ＴＩＬの中からＴｒｅｇを同定するために、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ１２７－ Ｔ細胞をＦＡＣＳで選別し、メーカーの指示に従い、１０×ｇｅｎｏｍｉｃ社のＣｈｒｏｍｉｕｍ（商標）Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｖ（Ｄ）Ｊ Ｒｅａｇｅｎｔキットを用いて、ペアＴＣＲ単一細胞シーケンスとＦＯＸＰ３発現解析との組み合わせに供する。シーケンシングライブラリーの作成とその後のシーケンシングのためのＦＯＸＰ３（ジェンバンクアクセッション ＡＦ２７７９９３）のＰＣＲ増幅を、自社で設計したプライマー（ＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡ（配列番号１０１）；ＧＡＣＡＣＣＡＴＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧ（配列番号１０２）；ＴＴＧＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣＣＡＧＴ（配列番号１０３））を使用することで実現する。１０×テクノロジーでは、天然型制御性Ｔ細胞と誘導型制御性Ｔ細胞の両方を検出することができる。誘導型Ｔｒｅｇは、ＦＯＸＰ３発現Ｔ細胞とＦＯＸＰ３陰性Ｔ細胞とからなる同一のα／β－ＴＣＲを持つ所定のクロノタイプの細胞として同定される。
【0108】
Ｔｒｅｇ細胞のα鎖とβ鎖とを合成し、自己腫瘍患者由来の新しいエフェクターＴ細の安定的な導入のためにレトロウイルス発現ベクターにクローニングする（次項参照）。
【0109】
単離及びクローン化された腫瘍特異的Ｔｒｅｇ ＴＣＲの遺伝子導入
これは、レトロウイルス導入システムを用いて達成される（出典 Ｖｏｓｓら、Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１，２，３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，２００５）。組換えＴＣＲトランスジェニックレトロウイルスを、Ｐｈｏｅｎｉｘ－Ａｍｐｈｏパッケージング細胞株を使用して生産する。それらを、ｐＭＸ－ｐｕｒｏ／βＴＣＲ－ｐ２Ａ－αＴＣＲと呼ばれるバイシストロン性コンストラクトＴＣＲ－ベータ鎖－ｐ２Ａ－ＴＣＲ－アルファ鎖をコードする発現ベクターで一過性にトランスフェクトする。同時トランスフェクトされるのは、ウイルス構造タンパク質とポリメラーゼ（逆転写酵素）とをコードするプラスミドｐＨＩＴ６０（マウスモロニー白血病ウイルス由来）、及び両種性エンベロープタンパク質をコードするｐＣＯＬＴ－ＧＡＬＶ（ギボンエイプ白血病ウイルス由来）である。感染性ウイルス粒子を含有する上清は、４０～４８時間後に回収できる。同じ患者のＰＢＭＣに由来する濃縮ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を、ウイルス上清とのインキュベーションによって感染させ、２４ウェルプレートに播種し、インキュベーター（３７°Ｃ、５％ＣＯ２）で２４時間培養する。続いて、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を増加及び濃縮するために、前記細胞を、ピューロマイシンを補充した培地にて抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で刺激する。濃縮は、ＴＣＲ－β鎖特異的抗体を使用したフローサイトメトリーによってモニターする。十分な増加の後、Ｔ細胞をアリコートに凍結し、機能アッセイ用のエフェクターＴ細胞のストックを形成する。
これは、レトロウイルス導入システムを用いて達成される（出典 Ｖｏｓｓら、Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１，２，３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，２００５）。組換えＴＣＲトランスジェニックレトロウイルスを、Ｐｈｏｅｎｉｘ－Ａｍｐｈｏパッケージング細胞株を使用して生産する。それらを、ｐＭＸ－ｐｕｒｏ／βＴＣＲ－ｐ２Ａ－αＴＣＲと呼ばれるバイシストロン性コンストラクトＴＣＲ－ベータ鎖－ｐ２Ａ－ＴＣＲ－アルファ鎖をコードする発現ベクターで一過性にトランスフェクトする。同時トランスフェクトされるのは、ウイルス構造タンパク質とポリメラーゼ（逆転写酵素）とをコードするプラスミドｐＨＩＴ６０（マウスモロニー白血病ウイルス由来）、及び両種性エンベロープタンパク質をコードするｐＣＯＬＴ－ＧＡＬＶ（ギボンエイプ白血病ウイルス由来）である。感染性ウイルス粒子を含有する上清は、４０～４８時間後に回収できる。同じ患者のＰＢＭＣに由来する濃縮ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を、ウイルス上清とのインキュベーションによって感染させ、２４ウェルプレートに播種し、インキュベーター（３７°Ｃ、５％ＣＯ２）で２４時間培養する。続いて、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を増加及び濃縮するために、前記細胞を、ピューロマイシンを補充した培地にて抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で刺激する。濃縮は、ＴＣＲ－β鎖特異的抗体を使用したフローサイトメトリーによってモニターする。十分な増加の後、Ｔ細胞をアリコートに凍結し、機能アッセイ用のエフェクターＴ細胞のストックを形成する。
【0110】
Ｔｒｅｇ ＴＣＲ形質導入Ｔｈ１細胞の腫瘍反応性の検出
Ｔｒｅｇ ＴＣＲを形質導入したＴｈ１細胞（ウェルあたり１×１０５）と腫瘍細胞（ウェルあたり１×１０４）は、未処理か、又は２００ＩＵ ｍｌ－１ＩＦＮガンマで前処理してＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を刺激するかして、１０％の自己ヒト血清、ペニシリン、及びストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した２００μｌのＲＰＭＩ１６４０（Ｌｏｎｚａ）で培養する。４８時間後、培養上清を回収し、サイトメトリービーズアレイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＩＦＮガンマについて分析する。ＩＦＮガンマの細胞内レベルをフローサイトメトリーで検出するために、形質導入されたＴ細胞を腫瘍細胞とゴルジプラグ（Ｇｏｌｇｉ－Ｐｌｕｇ）の存在下で２４時間共培養する（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ； １：１，０００）。続いて、細胞を表面抗体を使用して染色し、死んだ細胞を除外し、細胞内ＩＦＮガンマを、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット及び抗ＩＦＮ－γ染色（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して製造元の手順にしたがって検出する。
Ｔｒｅｇ ＴＣＲを形質導入したＴｈ１細胞（ウェルあたり１×１０５）と腫瘍細胞（ウェルあたり１×１０４）は、未処理か、又は２００ＩＵ ｍｌ－１ＩＦＮガンマで前処理してＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を刺激するかして、１０％の自己ヒト血清、ペニシリン、及びストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した２００μｌのＲＰＭＩ１６４０（Ｌｏｎｚａ）で培養する。４８時間後、培養上清を回収し、サイトメトリービーズアレイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＩＦＮガンマについて分析する。ＩＦＮガンマの細胞内レベルをフローサイトメトリーで検出するために、形質導入されたＴ細胞を腫瘍細胞とゴルジプラグ（Ｇｏｌｇｉ－Ｐｌｕｇ）の存在下で２４時間共培養する（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ； １：１，０００）。続いて、細胞を表面抗体を使用して染色し、死んだ細胞を除外し、細胞内ＩＦＮガンマを、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット及び抗ＩＦＮ－γ染色（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して製造元の手順にしたがって検出する。
【0111】
【0112】
図４の表は、ＴＩＬ ＣＤ４＋（列Ｆ）では下降する頻度に関して選別されている。列Ａ～Ｉは、国際特許出願第２０１４／０９６３９４Ａ１号（米国特許出願第２０１５／３３７３６８ Ａ１号としても公開されている）に開示されているＴＣＲシーケンシング技術によって得られたデータを示す。
【0113】
各列は、特定の組織のサンプル調製物から得られたものであり、及び／又は特定のマーカーに関して選別された細胞サンプルから作られている。
－ 血液（列Ｄ）は単に参照用であり、専用のマーカーについて選別なし
－ 他のすべての列（Ｅ～Ｈ）は、ＣＤ４＋と、場合によって追加のマーカーとに関して選別される
－ 列Ｆ 対 列Ｅ：クロノタイプごとの頻度の比率（列Ｆ／列Ｅ）は、列Ｉで与えられる比率を定義する。＞５の値は、腫瘍の特異性にとって有意であるとみなされる。
－ 列Ｇ 対 列Ｈ：列ＧではＣＤ２５ｌｏｗ／ＣＤ１２７＋（Ｔ従来型）に、列Ｈ（Ｔｒｅｇ）ではＣＤ２５ｈｉｇｈ／ＣＤ１２７ｌｏｗ／－にゲート設定したマーカーＣＤ２５及びＣＤ１２７を使用した古典的な選別により、天然型制御性Ｔ細胞及び／又は誘導型Ｔ細胞を同定するための方法が確立される（ここではＧ及びＨにおける有意なＴｒｅｇが、誘導型Ｔｒｅｇに期待される）。
－ 列Ｉ：ＨＳＤ比：ＴＩＬ ＣＤ４＋／非腫瘍ＣＤ４＋。
－ 血液（列Ｄ）は単に参照用であり、専用のマーカーについて選別なし
－ 他のすべての列（Ｅ～Ｈ）は、ＣＤ４＋と、場合によって追加のマーカーとに関して選別される
－ 列Ｆ 対 列Ｅ：クロノタイプごとの頻度の比率（列Ｆ／列Ｅ）は、列Ｉで与えられる比率を定義する。＞５の値は、腫瘍の特異性にとって有意であるとみなされる。
－ 列Ｇ 対 列Ｈ：列ＧではＣＤ２５ｌｏｗ／ＣＤ１２７＋（Ｔ従来型）に、列Ｈ（Ｔｒｅｇ）ではＣＤ２５ｈｉｇｈ／ＣＤ１２７ｌｏｗ／－にゲート設定したマーカーＣＤ２５及びＣＤ１２７を使用した古典的な選別により、天然型制御性Ｔ細胞及び／又は誘導型Ｔ細胞を同定するための方法が確立される（ここではＧ及びＨにおける有意なＴｒｅｇが、誘導型Ｔｒｅｇに期待される）。
－ 列Ｉ：ＨＳＤ比：ＴＩＬ ＣＤ４＋／非腫瘍ＣＤ４＋。
【0114】
１０×Ｇｅｎｏｍｉｃｓの単一細胞シーケンシング技術により、１つのｃＤＮＡライブラリからＶＤＪペアリング（Ｔ細胞受容体、両方の鎖）と専用の遺伝子（ここではＦＯＸＰ３）の遺伝子発現を同定することができる。この結果は単一細胞特異的であり、つまり、細胞ごとに配列を比較できる。このようにして、それらのＦＯＸＰ３の発現パターンが異なる１つのクロノタイプ（同じＴＣＲ／ＶＤＪ）の別個の細胞を同定することができる：
ａ． 実質的に同じＴＣＲを持つ、ＦＯＸＰ３発現のない１つ又は複数の細胞、及び１つ又は複数のＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞が同定された場合、そのクロノタイプは誘導型とみなされる；
ｂ． １つ又は複数のＦＯＸＰ３陽性のＴ細胞が同定され、かつ同じＶＤＪクロノタイプ内の細胞が他に同定されない場合は、天然型Ｔｒｅｇとみなされる；
ｃ． １０×データ／ＦＯＸＰ３発現解析でａ．又はｂ．をサポートしない場合、そのクロノタイプは純粋なＴｈ細胞であり得、考慮されない。
ａ． 実質的に同じＴＣＲを持つ、ＦＯＸＰ３発現のない１つ又は複数の細胞、及び１つ又は複数のＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞が同定された場合、そのクロノタイプは誘導型とみなされる；
ｂ． １つ又は複数のＦＯＸＰ３陽性のＴ細胞が同定され、かつ同じＶＤＪクロノタイプ内の細胞が他に同定されない場合は、天然型Ｔｒｅｇとみなされる；
ｃ． １０×データ／ＦＯＸＰ３発現解析でａ．又はｂ．をサポートしない場合、そのクロノタイプは純粋なＴｈ細胞であり得、考慮されない。
【0115】
図４の斜線の列は、上記の基準ａ．を満たしている。ＤＮ００ｘは（ＤＮＡ）－群ｘの略であり、β鎖及びα鎖に同じＣＤＲ３領域を持つＴｒｅｇ細胞及びＴｈ細胞すべてを含む。誘導型２つのＴｒｅｇクローンを明確に同定することができ、これらは腫瘍特異的である。さらに、１０×データでは、クローンを作成（ＴＣＲの遺伝子合成など）できるように、完全な受容体配列をもたらす。
【0116】
図５は、図４のものと同じデータセット及び患者を示すが、列Ｇに関して選別し、列ＨのＨＳＤ比が＞５のフィルターを使用している。１０×解析は、ゲート［ＣＤ２５ｈｉ ＣＤ１２７ｌｏ／ｎｅｇ］を使用する対応するＴ細胞部分から誘導される。４行目及び１９行目には、天然型Ｔｒｅｇｓ（上記の定義を参照）を見ることができるが、上位２０の他のほとんどすべてのクロノタイプは誘導型Ｔｒｅｇｓであり、そのすべてが腫瘍特異的である。
【0117】
図６は、１０×データのみに基づく、別の患者のＴｒｅｇ解析を示す。このパターンは異なるように見えるが、前記比率と１０×解析により、２つの誘導型Ｔｒｅｇｓ及び３つの天然型Ｔｒｅｇｓをもたらす。
【0118】
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【配列表】