(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-05
(45)【発行日】2024-03-13
(54)【発明の名称】抗体精製
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20240306BHJP
C07K 1/22 20060101ALI20240306BHJP
C07K 1/18 20060101ALI20240306BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240306BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C07K1/22
C07K1/18
C12N15/13
【請求項の数】
16
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2019031207
(22)【出願日】2019-02-25
(65)【公開番号】P2019147793
(43)【公開日】2019-09-05
【審査請求日】2022-02-21
(31)【優先権主張番号】62/635,943
(32)【優先日】2018-02-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】593141953
【氏名又は名称】ファイザー・インク
(74)【代理人】
【識別番号】100133927
【弁理士】
【氏名又は名称】四本 能尚
(74)【代理人】
【識別番号】100137040
【弁理士】
【氏名又は名称】宮澤 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100147186
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 眞紀
(74)【代理人】
【識別番号】100174447
【弁理士】
【氏名又は名称】龍田 美幸
(74)【代理人】
【識別番号】100185960
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 理愛
(72)【発明者】
【氏名】ティモシー イスクラ
(72)【発明者】
【氏名】アシュレイ マーガレット サクラモ
【審査官】大久保 元浩
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１５／０２４８９６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／１６６６２９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Prep. Biochem. Biotechnol.，2016年，46(3)，pp.215-221
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
二重特異性抗体を精製する方法であって、Ａ）ロード緩衝液中の抗体調製物を、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）樹脂上にロードするステップであって、
抗体調製物は、Ｉ）目的のインタクトな二重特異性抗体；およびＩＩ）目的のインタクトな二重特異性抗体からの分解産物であり、目的のインタクトな二重特異性抗体の質量とは１％未満異なる質量を有する目的の二重特異性抗体のクリップ型バージョンを含む、ステップ；
Ｂ）ロードされたＨＡ樹脂を１０から５０ｍＭの濃度のリン酸イオンを含む洗浄緩衝液で洗浄するステップ、ならびに
Ｃ）４０から１００ｍＭの濃度のリン酸イオンを含む溶出緩衝液を用いてＨＡ樹脂から目的のインタクトな二重特異性抗体を溶出させるステップであって、イオンの濃度は、洗浄緩衝液よりも増加している、
ステップ
を含む方法であって、ここでロード緩衝液、洗浄緩衝液、および溶出緩衝液のうち少なくとも一つの緩衝液のｐＨは７．０と８．０の間であり、
さらにここで二重特異性抗体が抗ＢＣＭＡアームおよび抗ＣＤ３アームを含む抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体でありかつＩｇＧ２アイソタイプであり、
（ａ）該抗ＣＤ３アームが、ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ領域）および配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ領域）；またはｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、のうち少なくとも１つを含み、
（ｂ）該抗ＢＣＭＡアームが、ｉ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域；またはｉｖ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、
のうち少なくとも１つを含み、
ここで、該クリップ型バージョンが、抗ＣＤ３重鎖のペプチド結合における切断を含み、ここで該切断は、抗ＣＤ３アームの、抗ＣＤ３重鎖可変領域および／または抗ＣＤ３重鎖の「ＲＧ」配列中のアミノ酸ＲとＧとの間で生じるものである、
方法。
【請求項2】
二重特異性抗体を精製する請求項１に記載の方法であって、抗体調製物中のクリップ型二重特異性抗体の分子対インタクトな二重特異性抗体の分子の比は１：５０から１：５の間であるステップを含む方法。
【請求項3】
二重特異性抗体を精製する請求項１または２に記載の方法であって、更に、ＨＡ樹脂から溶出された精製された画分を収集するステップであって、精製された画分は、目的のインタクトな二重特異性抗体を含む、ステップを含む方法。
【請求項4】
抗体調製物が、５ｇ／Ｌと２０ｇ／Ｌとの間の樹脂上密度になるように、ＨＡ樹脂上にロードされる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
少なくとも１グラムの抗体調製物がＨＡ樹脂上にロードされる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
抗体調製物が、少なくとも５０質量％であるが９５質量％未満の目的のインタクトな抗体を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
精製された画分が目的のインタクトな抗体を含み、少なくとも９ ５ 質量％ 、９ ６ 質量％ 、９ ７ 質量％ 、９ ８ 質量％ または９ ９ 質量％ の目的のインタクトな抗体を含む、請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
精製された画分が、インタクトな二重特異性抗体およびクリップ型二重特異性抗体を含み、さらに、精製された画分中のクリップ型二重特異性抗体分子対インタクトな二重特異性抗体分子の比が１ ： １ ０ ０ 以下である、請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
クリップ型抗体が、抗体のポリペプチド鎖中に切断されたペプチド結合を有し、切断されたペプチド結合が、抗体の重鎖中にある、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
クリップ型抗体が、インタクトな抗体と同じ数のアミノ酸および同じアミノ酸配列を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
クリップ型抗体が、インタクトな抗体とは異なる数のアミノ酸を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
ＨＡ樹脂がセラミックヒドロキシアパタイト（ｃＨＡ）樹脂である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
リン酸イオンの濃度が、溶出の間に４０ｍＭから１００ｍＭまで増加する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
抗体調製物が、ｉ）プロテインＡ樹脂およびｉｉ）イオン交換樹脂のうち少なくとも１つ以上に以前にロードされそこから溶出されたタンパク質を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
抗体が、医薬としての使用のためまたは医薬の調製における使用のために単離および／または精製される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法であって、抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の：
（ａ）該抗ＣＤ３アームが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含み、
（ｂ）該抗ＢＣＭＡアームが、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖および配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、その内容の全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１８年２月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／６３５，９４３号の利益を主張する。
【0002】
本発明は、抗体分解産物などの不純物から抗体を精製するための方法に関する。本明細書に開示された精製方法には、ヒドロキシアパタイト樹脂の使用が関与する。
【背景技術】
【0003】
抗体は、医学、診断、産業などの使用のための重要な生物学的分子である。例えば、抗体のサイズおよび分子の複雑さに起因して、多くの方法および試薬が抗体の組換え産生のために利用可能であるが、特に、大規模／産業規模の産生レベルで目的の組換え抗体を効率的に産生および精製することは、しばしば、依然として困難である。
【0004】
例えば、目的の組換え抗体の産生の間、時折、目的の抗体と関連する分解産物が生じ得る；この分解産物は、望ましくない不純物である。この分解産物は、目的の抗体と非常に類似したいくつかの分子特性（例えば、同一またはほぼ同一のアミノ酸配列または質量）を有し得る。目的のインタクトな抗体と抗体の分解されたバージョンとの間の分子類似性に起因して、分解された抗体からインタクトな抗体を効率的に分離することは非常に困難であり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】米国仮特許出願第６２／６３５，９４３号
【文献】国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６４１９（ＷＯ２０１１／１４３５４５）
【文献】国際特許出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０５４８９９（ＷＯ２０１２／０５９８８２）
【文献】米国特許出願第１５／０８５，６４４号（米国公開第２０１６０２９７８８５号）
【文献】米国特許出願第１５／９９３，８７４号（米国公開第２０１８０３４６６０１号）
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０、１９８６
【文献】ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ ３０５、５３７～５３９、１９８３
【文献】Ｇｉｅｓｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｎｏｂ ａｎｄ Ｈｏｌｅ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、２０１８年１月１７日
【文献】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ
【文献】Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）
【文献】Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
【文献】Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）
【文献】Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ
【文献】Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３～１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ
【文献】Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）
【文献】Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）
【文献】Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）
【文献】Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）
【文献】ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）
【文献】Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）
【文献】Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９９）
【文献】Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）
【文献】Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）
【文献】Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８～１９８９）
【文献】Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）
【文献】Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）
【文献】Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
従って、不純物からの抗体の精製のための新たな改善された方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0008】
１つまたは複数の不純物から目的の抗体を精製するための方法が、本明細書で提供される。
【0009】
一部の実施形態では、抗体を精製する方法であって、Ａ）ロード緩衝液中の抗体調製物を、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）樹脂上にロードするステップであって、抗体調製物は、Ｉ）目的のインタクトな抗体、およびＩＩ）目的のインタクトな抗体からの分解産物であり、目的のインタクトな抗体の質量とは１０％未満異なる質量を有する目的の抗体のクリップ型バージョンを含む、ステップ；ならびにＢ）溶出緩衝液を用いてＨＡ樹脂から目的のインタクトな抗体を溶出させるステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【0010】
一部の実施形態では、二重特異性抗体を精製する方法であって、Ａ）ロード緩衝液中の抗体調製物を、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）樹脂上にロードするステップであって、抗体調製物は、Ｉ）目的のインタクトな二重特異性抗体；およびＩＩ）少なくとも１つの不純物種を含み、不純物種は、ａ）目的のインタクトな二重特異性抗体からの分解産物であり、目的のインタクトな二重特異性抗体の質量とは１０％未満異なる質量を有する目的の二重特異性抗体のクリップ型バージョン；ｂ）インタクトな二重特異性抗体の第１のアームと同じ抗原特異性を有する単一特異性抗体である第１の親抗体；ｃ）インタクトな二重特異性抗体の第２のアームと同じ抗原特異性を有する単一特異性抗体である第２の親抗体；およびｄ）高分子質量種（ＨＭＭＳ）からなる群から選択される、ステップ；ならびにＢ）溶出緩衝液を用いてＨＡ樹脂から目的のインタクトな二重特異性抗体を溶出させるステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【0011】
一部の実施形態では、二重特異性抗体を精製する方法であって、Ａ）ロード緩衝液中の抗体調製物を、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）樹脂上にロードするステップであって、Ｉ）抗体調製物は、ａ）目的のインタクトな二重特異性抗体、およびｂ）目的のインタクトな二重特異性抗体からの分解産物であり、目的のインタクトな二重特異性抗体の質量とは１０％未満異なる質量を有する目的の二重特異性抗体のクリップ型バージョンを含み；ＩＩ）抗体調製物中のクリップ型二重特異性抗体の分子対インタクトな二重特異性抗体の分子の比は、少なくとも１：５０と１：５以下との間である、ステップ；Ｂ）溶出緩衝液を用いてＨＡ樹脂からインタクトな二重特異性抗体を溶出させるステップを含む方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、この方法は、Ｃ）ＨＡ樹脂から溶出された精製された画分を収集するステップであって、精製された画分は、インタクトな二重特異性抗体を含む、ステップをさらに含む。
【0012】
一部の実施形態では、抗体を精製する方法であって、Ａ）ロード緩衝液中の抗体調製物を、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）樹脂上にロードするステップであって、Ｉ）抗体調製物は、ａ）目的のインタクトな抗体およびｂ）目的のインタクトな抗体からの分解産物であり、目的のインタクトな抗体の質量とは１０％未満異なる質量を有する目的の抗体のクリップ型バージョンを含み；ＩＩ）抗体のクリップ型バージョンは、抗体調製物の少なくとも１質量％、２質量％、３質量％、４質量％、５質量％、６質量％、７質量％、８質量％、９質量％、１０質量％、１５質量％または２０質量％を構成する、ステップ；Ｂ）溶出緩衝液を用いてＨＡ樹脂からインタクトな抗体を溶出させるステップ、ならびにＣ）ＨＡ樹脂から溶出された精製された画分を収集するステップであって、精製された画分は、インタクトな抗体を含み、１質量％、２質量％、３質量％、４質量％、５質量％、６質量％、７質量％、８質量％、９質量％、１０質量％、１５質量％または２０質量％未満のクリップ型抗体を含み、精製された画分は、抗体調製物よりも低い質量％のクリップ型抗体を含む、ステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【0013】
一部の実施形態では、溶出緩衝液を用いてＨＡ樹脂から目的の抗体を溶出させるステップが関与する本明細書で提供される方法では、この溶出緩衝液は、イオンを含む。緩衝液中のイオンの濃度は、溶出の間に増加してもよい。ＨＡ樹脂周囲の緩衝液中のイオンの濃度は、溶出の間に増加してもよい。
【0014】
一部の実施形態では、抗体が関与する本明細書で提供される方法では、この抗体は、ヘテロダイマー性二重特異性抗体である。
【0015】
一部の実施形態では、ＨＡ樹脂から溶出された精製された画分を収集するステップであって、精製された画分が目的のインタクトな抗体を含むステップが関与する本明細書で提供される方法では、この精製された画分は、少なくとも８０質量％、９０質量％、９５質量％、９６質量％、９７質量％、９８質量％または９９質量％の目的のインタクトな抗体を含む。
【0016】
一部の実施形態では、インタクトな二重特異性抗体およびクリップ型二重特異性抗体を含む精製された画分が関与する本明細書で提供される方法では、精製された画分中のクリップ型二重特異性抗体分子対インタクトな二重特異性抗体分子の比は、１：４００、１：２００、１：１００または１：５０以下である。
【0017】
一部の実施形態では、抗ＣＤ３抗体であるまたは抗ＣＤ３アームを含む二重特異性抗体である目的の抗体が関与する本明細書で提供される方法では、この抗体は、ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域；ｉｉ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖；ｉｉｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域；またはｉｖ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、のうち少なくとも１つを含む。
【0018】
一部の実施形態では、二重特異性抗体が関与する本明細書で提供される方法では、この二重特異性抗体は、ｉ）抗ＢＣＭＡアームおよび抗ＣＤ３アームを含む抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、またはｉｉ）抗ＦＬＴ３アームおよび抗ＣＤ３アームを含む抗ＦＬＴ３／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。
【0019】
一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡアームを含む二重特異性抗体が関与する本明細書で提供される方法では、この抗ＢＣＭＡアームは、ｉ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域；ｉｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む重鎖；ｉｉｉ）配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域；またはｉｖ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、のうち少なくとも１つを含む。
【0020】
一部の実施形態では、抗ＦＬＴ３アームを含む二重特異性抗体が関与する本明細書で提供される方法では、この抗ＦＬＴ３アームは、ｉ）配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域；ｉｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖；ｉｉｉ）配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域；またはｉｖ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖、のうち少なくとも１つを含む。
【0021】
一部の実施形態では、抗体調製物をＨＡ樹脂上にロードするステップが関与する本明細書で提供される方法では、この抗体調製物は、２、３、４または５ｇ／Ｌと８、９、１０、１２、１５または２０ｇ／Ｌとの間の樹脂上密度になるように、ＨＡ樹脂上にロードされる。
【0022】
一部の実施形態では、抗体調製物をＨＡ樹脂上にロードするステップが関与する本明細書で提供される方法では、少なくとも１、５、１０、５０、１００、５００、１０００または５０００グラムの抗体調製物が、ＨＡ樹脂上にロードされる。
【0023】
一部の実施形態では、抗体調製物が関与する本明細書で提供される方法では、この抗体調製物は、少なくとも５０質量％、６０質量％、７０質量％または８０質量％であるが９０質量％、９５質量％、９７質量％、９８質量％または９９質量％未満の目的のインタクトな抗体を含む。
【0024】
一部の実施形態では、クリップ型抗体が関与する本明細書で提供される方法では、このクリップ型抗体は、インタクトな抗体の質量とは０．１％、０．５％、１％または２％未満異なる質量を有する。一部の実施形態では、クリップ型抗体が関与する本明細書で提供される方法では、このクリップ型抗体は、インタクトな抗体の質量よりも約５ダルトンと１００ダルトンとの間だけ大きい質量を有する。一部の実施形態では、クリップ型抗体が関与する本明細書で提供される方法では、このクリップ型抗体は、インタクトな抗体の質量よりも約１８ダルトン大きい質量を有する。
【0025】
一部の実施形態では、クリップ型抗体が関与する本明細書で提供される方法では、このクリップ型抗体は、抗体のポリペプチド鎖中に切断されたペプチド結合を有し、切断されたペプチド結合は、抗体の重鎖中にある。一部の実施形態では、クリップ型抗体が関与する本明細書で提供される方法では、このクリップ型抗体は、抗体のポリペプチド鎖中に切断されたペプチド結合を有し、切断されたペプチド結合は、抗体の軽鎖中にある。
【0026】
一部の実施形態では、クリップ型抗体が関与する本明細書で提供される方法では、このクリップ型抗体は、インタクトな抗体と同じ数のアミノ酸および同じアミノ酸配列を含む。あるいは、一部の実施形態では、このクリップ型抗体は、インタクトな抗体とは異なる数のアミノ酸を含む。
【0027】
一部の実施形態では、ＣＤ３に特異的に結合するＶＨおよびＶＬドメインを含む目的の抗体が関与する本明細書で提供される方法では、対応するクリップ型抗体は、ＣＤ３に特異的に結合するＶＨドメイン中に切断されたペプチド結合を含む。
【0028】
一部の実施形態では、ＨＡ樹脂が関与する本明細書で提供される方法では、このＨＡ樹脂はセラミックヒドロキシアパタイト（ｃＨＡ）樹脂である。
【0029】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法では、抗体調製物をＨＡ樹脂上にロードするステップの後であるがインタクトな二重特異性抗体を樹脂から溶出させるステップの前に、ＨＡ樹脂は、リン酸イオンを含む洗浄緩衝液で洗浄される。この洗浄緩衝液は、約５、１０、１５、２０ｍＭと３０、４０または５０ｍＭとの間の濃度でリン酸イオンを含んでいてもよい。
【0030】
一部の実施形態では、イオンを含む溶出緩衝液が関与する本明細書で提供される方法では、このイオンはリン酸である。一部の実施形態では、溶出の間のリン酸イオンの濃度は、約３０、４０または５０ｍＭから約６０、７０、８０、１００、１５０または２００ｍＭまで増加し得る。
【0031】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法では、ロード緩衝液、洗浄緩衝液および溶出緩衝液のうち少なくとも１つのｐＨは、約ｐＨ７．０および８．０である、または約ｐＨ７．０と８．０との間である。
【0032】
一部の実施形態では、抗体調製物が関与する本明細書で提供される方法では、この抗体調製物は、ｉ）プロテインＡ樹脂およびｉｉ）イオン交換樹脂のうち少なくとも１つ上に以前にロードされそこから溶出されたタンパク質を含む。この抗体調製物は、ｉ）プロテインＡ樹脂およびｉｉ）イオン交換樹脂の両方上に以前にロードされそこから溶出されたタンパク質を含んでいてもよい。
【0033】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して調製された抗体は、医薬としての使用のためまたは医薬の調製における使用のために単離および／または精製される。
【0034】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して調製された抗体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1】本明細書で提供される方法に従って精製され得る二重特異性抗体を調製する方法の模式図を示す。
【図2】例示的なｉ）インタクトな二重特異性抗体（左側のパネル）およびｉｉ）二重特異性抗体のクリップ型バージョン（右側のパネル）の模式図を示し、このクリップ型二重特異性抗体は、インタクトな二重特異性抗体と共に抗体調製物中に存在し得る不純物である。
【図3】ＨＡ樹脂からの溶出を介した、複数の異なる不純物からの目的の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体（「ＰＯＩ」）の分離を示すクロマトグラムを示す。
【図5】ＨＡ樹脂からの溶出を介した、複数の異なる不純物からの目的の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体（「ＰＯＩ」）の分離を示すクロマトグラムを示す。
【図6】図５のクロマトグラムに示されるＨＡクロマトグラフィー実行に従ってＨＡ樹脂から溶出された異なる画分中の異なるタンパク質種（目的の抗体および種々の不純物を含む）の相対的な量を示すグラフを示し、このとき、目的の抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＨＡ樹脂からの溶出を介して、複数の異なる不純物から分離される。
【図7】ＨＡクロマトグラフィー実行に従ってＨＡ樹脂から溶出された異なる画分中の異なるタンパク質種（目的の抗体および種々の不純物を含む）の相対的な量を示すグラフを示し、このとき、目的の抗ＦＬＴ３／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＨＡ樹脂からの溶出を介して、複数の異なる不純物から分離される。
【発明を実施するための形態】
【0036】
１つまたは複数の不純物から目的の抗体を精製するための方法が、本明細書で提供される。本明細書で提供される方法には、不純物から目的の抗体を分離するためのヒドロキシアパタイト樹脂の使用が関与する。一部の実施形態では、この目的の抗体は二重特異性抗体である。一部の実施形態では、不純物は、目的の抗体と関連する抗体である（即ち、目的の抗体と類似または同じアミノ酸配列（複数可）を有する）が、目的の抗体と比較して１つまたは複数の方法で改変され、目的の抗体とは異なる質量を有する。抗体不純物種の質量は、目的の抗体の質量と非常に類似していてもよい。例えば、一部の実施形態では、抗体不純物種の質量は、目的の抗体の質量とは５％、２％、１％、０．５％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０２％または０．０１％未満異なる。本明細書で提供される方法は、１つまたは複数の不純物からの目的の抗体の大規模精製のために使用してもよい。
【0037】
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される当該分野の全ての用語、表記法および他の科学用語または用語法は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有することを意図する。一部の例では、一般に理解される意味を有する用語は、明確さのためおよび／またはすぐに参照できるように本明細書で定義され、本明細書にかかる定義を含めることは、当該分野で一般的に理解される定義にまつわる実質的な差異を表すとかならずしも解釈すべきではない。
特に定義しない限り、本明細書で使用される当該分野の全ての用語、表記法および他の科学用語または用語法は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有することを意図する。一部の例では、一般に理解される意味を有する用語は、明確さのためおよび／またはすぐに参照できるように本明細書で定義され、本明細書にかかる定義を含めることは、当該分野で一般的に理解される定義にまつわる実質的な差異を表すとかならずしも解釈すべきではない。
【0038】
以下の用語は、特に示さない限り、以下の意味を有すると理解するものとする：
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、標的、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどに特異的に結合することが可能な免疫グロブリン分子である。本明細書で使用する場合、この用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ＳｃＦｖ）およびドメイン抗体（例えば、サメおよびラクダ科動物（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体を含む）、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、および抗体を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された立体配置もまた包含する。用語「抗体」は、単一特異性、二重特異性および多特異性抗体を含む。抗体は、任意のクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ（またはそれらのサブクラス）の抗体を含み、抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なるクラスに割当てられ得る。５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２へとさらに分割され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は、周知である。
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、標的、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどに特異的に結合することが可能な免疫グロブリン分子である。本明細書で使用する場合、この用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ＳｃＦｖ）およびドメイン抗体（例えば、サメおよびラクダ科動物（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体を含む）、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、および抗体を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された立体配置もまた包含する。用語「抗体」は、単一特異性、二重特異性および多特異性抗体を含む。抗体は、任意のクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ（またはそれらのサブクラス）の抗体を含み、抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なるクラスに割当てられ得る。５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２へとさらに分割され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は、周知である。
【0039】
本明細書で使用する場合、用語「重鎖」、「軽鎖」、「可変領域」または「可変ドメイン」、「フレームワーク領域」、「定常ドメイン」などは、免疫学の分野におけるそれらの通常の意味を有し、天然に存在する免疫グロブリン中のドメインおよび組換え結合タンパク質（例えば、ヒト化抗体、二重特異性抗体、単鎖抗体、キメラ抗体など）の対応するドメインを指す。天然に存在する免疫グロブリンの基礎的な構造単位は、約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として通常発現される、２つの軽鎖および２つの重鎖を有するテトラマーである。各鎖のアミノ末端（Ｎ末端）部分は、抗原認識を主に担う、約１００～１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端（Ｃ末端）部分は、定常領域を規定する。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）から構成される。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびにＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する重鎖定常領域から構成される。ＩｇＧ分子の可変領域は、抗原と接触する残基を含む、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域、および構造をおおまかに維持し、ＣＤＲループの位置決めを決定する、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる非ＣＤＲセグメント（ある特定のフレームワーク残基もまた、抗原を接触し得るが）を含む。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の構造で配置された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む：ｎ－ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４－ｃ。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）およびクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。
【0040】
「二重特異性」または「二重－特異性」は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異性抗体の２つの抗原結合部位は、同じまたは異なるタンパク質標的上に存在し得る２つの異なるエピトープに結合する。
【0041】
「インタクトな」抗体とは、組換え抗体の予測されたペプチド結合およびアミノ酸（即ち、抗体のポリペプチド（複数可）をコードする核酸配列（複数可）に基づいて予測される）の全てを含む組換え抗体を指す。対照的に、「クリップ型」抗体とは、対応する「インタクトな」抗体と比較して少なくとも１つのペプチド結合を欠く、対応する「インタクトな」抗体のバージョンを指す。「目的の抗体」に対する本明細書の言及は、文脈が他を明確に示さない限り、目的のインタクトな抗体を一般に指す。
【0042】
「約」ある値またはパラメーターに対する本明細書の言及は、その値またはパラメーター自体に関する実施形態、ならびにそのパラメーターについて述べられた数値を１０％下回り得るまたは上回り得る値またはパラメーターを含む。例えば、「約５ｍｇ」に対する言及は、５ｍｇを含み、４．５ｍｇと５．５ｍｇとの間の任意の値もまた含む。
【0043】
方法
本明細書で提供される方法は、１つまたは複数の不純物から目的の抗体を精製するために使用され得る。本明細書で提供される方法では、目的の抗体および１つまたは複数の不純物分子を含む抗体調製物（本明細書で「出発サンプル」とも呼ばれる）は、目的の抗体および任意選択により１つまたは複数の不純物分子に結合するヒドロキシアパタイト（ＨＡ）樹脂上にロードされる。次いで、このＨＡ樹脂は、任意のゆるく結合した不純物を除去するために洗浄される（一部の実施形態では、全ての不純物分子がＨＡ樹脂を通って流れ得、ＨＡ樹脂には結合しない）。次に、目的の抗体は、漸増するリン酸イオン濃度の勾配を介して、樹脂上に典型的には導入されるリン酸溶出緩衝液を使用してＨＡ樹脂から溶出される。ＨＡ樹脂からの目的の抗体の溶出は、目的の抗体を含み、出発サンプル中に目的の抗体と共に存在した不純物をわずかに含む（または全く含まない）精製されたサンプルを生じる。ＨＡ樹脂からの目的の抗体の溶出の間に、ＨＡ樹脂に結合した任意の不純物分子もまた、漸増するリン酸イオン濃度の勾配の間のいくつかのポイントにおいて溶出し得る。しかし、目的の抗体が溶出プロセスの間に不純物分子から効率的に分離され得るように、不純物分子は、目的の抗体の溶出の条件とは十分に異なる条件下でＨＡ樹脂から溶出する。上の方法ステップならびに関連する材料およびステップについてのさらなる詳細は、以下に提供される。
本明細書で提供される方法は、１つまたは複数の不純物から目的の抗体を精製するために使用され得る。本明細書で提供される方法では、目的の抗体および１つまたは複数の不純物分子を含む抗体調製物（本明細書で「出発サンプル」とも呼ばれる）は、目的の抗体および任意選択により１つまたは複数の不純物分子に結合するヒドロキシアパタイト（ＨＡ）樹脂上にロードされる。次いで、このＨＡ樹脂は、任意のゆるく結合した不純物を除去するために洗浄される（一部の実施形態では、全ての不純物分子がＨＡ樹脂を通って流れ得、ＨＡ樹脂には結合しない）。次に、目的の抗体は、漸増するリン酸イオン濃度の勾配を介して、樹脂上に典型的には導入されるリン酸溶出緩衝液を使用してＨＡ樹脂から溶出される。ＨＡ樹脂からの目的の抗体の溶出は、目的の抗体を含み、出発サンプル中に目的の抗体と共に存在した不純物をわずかに含む（または全く含まない）精製されたサンプルを生じる。ＨＡ樹脂からの目的の抗体の溶出の間に、ＨＡ樹脂に結合した任意の不純物分子もまた、漸増するリン酸イオン濃度の勾配の間のいくつかのポイントにおいて溶出し得る。しかし、目的の抗体が溶出プロセスの間に不純物分子から効率的に分離され得るように、不純物分子は、目的の抗体の溶出の条件とは十分に異なる条件下でＨＡ樹脂から溶出する。上の方法ステップならびに関連する材料およびステップについてのさらなる詳細は、以下に提供される。
【0044】
ヒドロキシアパタイト樹脂
種々のヒドロキシアパタイト樹脂が市販されており、任意の入手可能な形態の材料が、本明細書で提供される方法で使用され得る。ヒドロキシアパタイトは、結晶形態にあってもよい。ヒドロキシアパタイトは、粒子を形成するように集塊化され、安定な多孔性セラミック塊へと高温で焼結してもよい。
種々のヒドロキシアパタイト樹脂が市販されており、任意の入手可能な形態の材料が、本明細書で提供される方法で使用され得る。ヒドロキシアパタイトは、結晶形態にあってもよい。ヒドロキシアパタイトは、粒子を形成するように集塊化され、安定な多孔性セラミック塊へと高温で焼結してもよい。
【0045】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるＨＡ樹脂は、セラミックヒドロキシアパタイト（ｃＨＡ）樹脂である。「セラミックヒドロキシアパタイト」／「ｃＨＡ」とは、球状のマクロ多孔性セラミックへと高温で焼結された、式Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２の不溶性ヒドロキシル化リン酸カルシウムを指す。本明細書で使用する場合、「セラミックヒドロキシアパタイト」／「ｃＨＡ」は、Ｉ型およびＩＩ型のセラミックヒドロキシアパタイトを包含するがこれらに限定されず、特に明記しない限り、任意の適切な粒子サイズもまた包含する。本明細書で提供される方法で使用され得る典型的なｃＨＡ粒子サイズには、例えば、直径が１～１００μｍの間または１～１０００μｍの間、例えば、２０μｍ、４０μｍまたは８０μｍの粒子サイズが含まれる。本明細書で提供される方法で使用され得る例示的なｃＨＡ樹脂には、ＣＨＴ（商標）Ｉ型およびＩＩ型樹脂（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）が含まれる。「ＨＡ樹脂」などに対する本明細書の任意の言及は、ｃＨＡ樹脂を包含する。
【0046】
典型的には、本明細書で提供される方法では、このＨＡ樹脂は、１つまたは複数のクロマトグラフィーカラム中で提供される。カラム特性、例えば、カラムの直径、長さおよび充填密度は、特定の精製計画の要求（即ち、精製されるタンパク質の量）、ならびにカラムにおいて使用されるＨＡ樹脂に関する要因、例えば、そのポアサイズ、粒子サイズ、圧縮性、ロード能および動的結合能を含む種々の要因に基づいて選択され得る。さらに、本明細書で提供される方法は、クロマトグラフィーカラム中のＨＡ樹脂に関して頻繁に記載される；しかし、この樹脂についての他の適切な関連の立体配置は排除されない。また、「ＨＡカラム」などに対する本明細書の言及は、ＨＡ樹脂が充填されたクロマトグラフィーカラムを指す。
【0047】
タンパク質ロードの前にＨＡカラムを平衡化する
一部の実施形態では、目的の抗体を含むサンプルをＨＡカラム上にロードするステップの前に、本明細書で提供される方法は、１つまたは複数の平衡化緩衝液（複数可）を用いてカラムを事前平衡化するステップを含み得る。これらの平衡化緩衝液は、例えば、方法の開始時にＨＡ樹脂がきれいであることを確実にするため（即ち、樹脂が、樹脂に既に結合した不純物を有さないことを確実にするため）、および／またはＨＡ樹脂を取り囲む溶液が、樹脂上にロードされるサンプルと適合性であることを確実にするために、カラム上に導入され得る。
一部の実施形態では、目的の抗体を含むサンプルをＨＡカラム上にロードするステップの前に、本明細書で提供される方法は、１つまたは複数の平衡化緩衝液（複数可）を用いてカラムを事前平衡化するステップを含み得る。これらの平衡化緩衝液は、例えば、方法の開始時にＨＡ樹脂がきれいであることを確実にするため（即ち、樹脂が、樹脂に既に結合した不純物を有さないことを確実にするため）、および／またはＨＡ樹脂を取り囲む溶液が、樹脂上にロードされるサンプルと適合性であることを確実にするために、カラム上に導入され得る。
【0048】
一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、例えばリン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝液であり、緩衝液中のリン酸イオンの濃度は、約１００～５００ｍＭである。かかる平衡化緩衝液は、本明細書で「高リン酸平衡化緩衝液」などとも呼ばれ得る。例えば、ある実施形態では、高リン酸平衡化緩衝液は、約２５０～４５０ｍＭのリン酸イオンを含み得；他の実施形態では、約２００、２５０、３００、３５０、４００または４５０ｍＭのリン酸イオンを含み得る。この平衡化緩衝液は、ＨＡ樹脂上に既に存在する任意の混入物／不純物（即ち、目的のタンパク質を含むサンプルが樹脂上にロードされる前に存在する；かかる不純物は、例えば、ＨＡ樹脂が精製方法のために以前に使用され、以前の使用の後に樹脂が完全には浄化されなかった場合に存在し得る）を溶出させるために、緩衝液中に比較的高い濃度のリン酸イオンを含む。高リン酸平衡化緩衝液は、約６．０～９．０のｐＨを有し得る。例えば、ある実施形態では、高リン酸平衡化緩衝液は、約７．０～８．０のｐＨを有し得；他の実施形態では、約７．０、７．５または８．０のｐＨを有し得る。一実施形態では、高リン酸平衡化緩衝液は、約４００ｍＭのリン酸イオンを含み、約７．５のｐＨを有する。一部の実施形態では、高リン酸平衡化緩衝液は、本明細書で「平衡化緩衝液１」とも呼ばれ得る。
【0049】
一部の実施形態では、平衡化緩衝液は、例えばリン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝液であり、緩衝液中のリン酸イオンの濃度は、約１～２０ｍＭである。かかる平衡化緩衝液は、本明細書で「低リン酸平衡化緩衝液」などとも呼ばれ得る。例えば、ある実施形態では、低リン酸平衡化緩衝液は、約１～１０ｍＭのリン酸イオンを含み得；他の実施形態では、約１、２、３、４、５または１０ｍＭのリン酸イオンを含み得る。この平衡化緩衝液は、目的のタンパク質が樹脂に結合するのに資する条件をＨＡ樹脂の周囲に生成するために、緩衝液中に比較的低い濃度のリン酸イオンを含む。低リン酸平衡化緩衝液は、約１～５０ｍＭの濃度でＨＥＰＥＳをさらに含んでいてもよい。例えば、ある実施形態では、低リン酸平衡化緩衝液は、約２～３０ｍＭのＨＥＰＥＳを含み得；他の実施形態では、約５、１０、１５、２０または２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含み得る。低リン酸平衡化緩衝液は、約６．０～９．０のｐＨを有し得る。例えば、ある実施形態では、低リン酸平衡化緩衝液は、約７．０～８．０のｐＨを有し得；他の実施形態では、約７．０、７．５または８．０のｐＨを有し得る。一実施形態では、低リン酸平衡化緩衝液は、約２ｍＭのリン酸イオン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含み、約７．５のｐＨを有する。一部の実施形態では、低リン酸平衡化緩衝液は、本明細書で「平衡化緩衝液２」とも呼ばれ得る。しかし、重要なことに、本明細書で提供される方法を用いる場合、低リン酸平衡化緩衝液は、この方法の間の高リン酸平衡化緩衝液の事前の使用を伴わずに、樹脂を事前平衡化するために使用され得る。
【0050】
目的の抗体を含むサンプルをＨＡカラムにロードする
ＨＡカラムがタンパク質ロードに備えた状態になると、目的の抗体および不純物を含むサンプルがＨＡカラム上にロードされる。サンプルがその中でＨＡカラム上にロードされる緩衝液は、本明細書で「ロード緩衝液」と呼ばれ得る。一部の実施形態では、目的の抗体を含むサンプルが本明細書で提供される方法での使用のために最初に取得される場合、このサンプルは既に、サンプルをＨＡカラム上にロードするのに適切なロード緩衝液中にある。しかし、他の実施形態では、このサンプルがカラム上へのロードのために適切な緩衝液中にあるようにサンプルの緩衝液条件を改変するために、サンプルをＨＡカラム上にロードする前に、サンプルは処理（例えば、希釈、濃縮または緩衝液交換）され得る。例えば、本明細書で提供される方法を用いる場合、ロード緩衝液は、ＨＡ樹脂への目的の抗体の結合を妨害する高い濃度のリン酸イオンを有することができない。従って、目的の抗体を含む初期サンプルが高い濃度のリン酸イオンを含む場合、そのサンプルは、サンプル中のリン酸イオンの濃度が、ＨＡ樹脂への目的の抗体の結合を可能にする適切に低い濃度まで低減されるまで、例えば、希釈または緩衝液交換される必要がある。
ＨＡカラムがタンパク質ロードに備えた状態になると、目的の抗体および不純物を含むサンプルがＨＡカラム上にロードされる。サンプルがその中でＨＡカラム上にロードされる緩衝液は、本明細書で「ロード緩衝液」と呼ばれ得る。一部の実施形態では、目的の抗体を含むサンプルが本明細書で提供される方法での使用のために最初に取得される場合、このサンプルは既に、サンプルをＨＡカラム上にロードするのに適切なロード緩衝液中にある。しかし、他の実施形態では、このサンプルがカラム上へのロードのために適切な緩衝液中にあるようにサンプルの緩衝液条件を改変するために、サンプルをＨＡカラム上にロードする前に、サンプルは処理（例えば、希釈、濃縮または緩衝液交換）され得る。例えば、本明細書で提供される方法を用いる場合、ロード緩衝液は、ＨＡ樹脂への目的の抗体の結合を妨害する高い濃度のリン酸イオンを有することができない。従って、目的の抗体を含む初期サンプルが高い濃度のリン酸イオンを含む場合、そのサンプルは、サンプル中のリン酸イオンの濃度が、ＨＡ樹脂への目的の抗体の結合を可能にする適切に低い濃度まで低減されるまで、例えば、希釈または緩衝液交換される必要がある。
【0051】
一部の実施形態では、ロード緩衝液は、約１０ｍＭ以下のリン酸イオンを含む。例えば、一部の実施形態では、ロード緩衝液は、約１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭまたは１ｍＭ未満のリン酸イオンを含む。一部の実施形態では、ロード緩衝液は、０ｍＭのリン酸イオンを含む。ロード緩衝液は、種々の他の塩または緩衝液成分（例えば、Ｔｒｉｓ、グリシン）を含んでいてもよい。ロード緩衝液は、約６．０～９．０のｐＨを有し得る。例えば、ある実施形態では、ロード緩衝液は、約７．０～８．０のｐＨを有し得；他の実施形態では、約７．０、７．５または８．０のｐＨを有し得る。
【0052】
一部の実施形態では、目的の抗体を含むサンプルは、少なくとも１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌまたは３０ｇ／Ｌの樹脂上密度になるように、ＨＡ樹脂上にロードされ得る。一部の実施形態では、目的の抗体を含むサンプルは、少なくとも１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌまたは２５ｇ／Ｌと２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌまたは３０ｇ／Ｌ以下との間の樹脂上密度になるように、ＨＡ樹脂上にロードされ得、ここで、２番目の値は、最初の値よりも大きい。
【0053】
ＨＡカラムを洗浄する
目的の抗体および不純物を含むサンプルをＨＡカラム上にロードするステップの後であるが、目的の抗体の溶出の前に、本明細書で提供される方法は、例えば、非特異的に固定化された不純物を除去するため、または溶出ステップのためにカラムを他の方法で準備もしくは平衡化するために、ロードされたカラムを１つまたは複数の洗浄緩衝液（複数可）で洗浄するさらなるステップを含んでいてもよい。任意の洗浄緩衝液の特性は、当業者によって決定され得る。一実施形態では、この洗浄緩衝液は、例えばリン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝液であり、緩衝液中のリン酸イオンの濃度は、約５～５０ｍＭである。例えば、ある実施形態では、洗浄緩衝液は、約１０～４０ｍＭのリン酸イオンを含み得；他の実施形態では、約１０、２０、３０、４０または５０ｍＭのリン酸イオンを含んでいてもよい。洗浄緩衝液は、約１～５０ｍＭの濃度でＨＥＰＥＳをさらに含み得る。例えば、ある実施形態では、洗浄緩衝液は、約２～３０ｍＭのＨＥＰＥＳを含み得；他の実施形態では、約５、１０、１５、２０または２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含み得る。洗浄緩衝液は、約６．０～９．０のｐＨを有し得る。例えば、ある実施形態では、洗浄緩衝液は、約７．０～８．０のｐＨを有し得；他の実施形態では、約７．０、７．５または８．０のｐＨを有し得る。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約４０ｍＭのリン酸イオン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含み、約７．５のｐＨを有する。
目的の抗体および不純物を含むサンプルをＨＡカラム上にロードするステップの後であるが、目的の抗体の溶出の前に、本明細書で提供される方法は、例えば、非特異的に固定化された不純物を除去するため、または溶出ステップのためにカラムを他の方法で準備もしくは平衡化するために、ロードされたカラムを１つまたは複数の洗浄緩衝液（複数可）で洗浄するさらなるステップを含んでいてもよい。任意の洗浄緩衝液の特性は、当業者によって決定され得る。一実施形態では、この洗浄緩衝液は、例えばリン酸ナトリウムを含むリン酸緩衝液であり、緩衝液中のリン酸イオンの濃度は、約５～５０ｍＭである。例えば、ある実施形態では、洗浄緩衝液は、約１０～４０ｍＭのリン酸イオンを含み得；他の実施形態では、約１０、２０、３０、４０または５０ｍＭのリン酸イオンを含んでいてもよい。洗浄緩衝液は、約１～５０ｍＭの濃度でＨＥＰＥＳをさらに含み得る。例えば、ある実施形態では、洗浄緩衝液は、約２～３０ｍＭのＨＥＰＥＳを含み得；他の実施形態では、約５、１０、１５、２０または２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含み得る。洗浄緩衝液は、約６．０～９．０のｐＨを有し得る。例えば、ある実施形態では、洗浄緩衝液は、約７．０～８．０のｐＨを有し得；他の実施形態では、約７．０、７．５または８．０のｐＨを有し得る。一実施形態では、洗浄緩衝液は、約４０ｍＭのリン酸イオン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含み、約７．５のｐＨを有する。
【0054】
ＨＡカラムから目的の抗体を溶出させる
本明細書で提供される方法は、ＨＡ樹脂から結合した目的の抗体を溶出させるステップを含む。結合した目的の抗体は、１つまたは複数の溶出緩衝液によって溶出される。典型的には、この溶出緩衝液は、１種または複数種の塩またはイオンを含み、この塩またはイオンの濃度は、溶出の間に増加する。
本明細書で提供される方法は、ＨＡ樹脂から結合した目的の抗体を溶出させるステップを含む。結合した目的の抗体は、１つまたは複数の溶出緩衝液によって溶出される。典型的には、この溶出緩衝液は、１種または複数種の塩またはイオンを含み、この塩またはイオンの濃度は、溶出の間に増加する。
【0055】
一部の実施形態では、本明細書で提供される溶出緩衝液は、リン酸イオンを含む。溶出緩衝液中のリン酸イオンの濃度は、溶出の間に、約２０ｍＭの初期濃度から約２００ｍＭまで増加してもよい。例えば、ある実施形態では、溶出緩衝液中のリン酸イオンの濃度は、溶出の間に、約４０ｍＭの初期濃度から約８０ｍＭまで、または約４０ｍＭから約１００ｍＭまで増加する。溶出緩衝液中のリン酸イオンの濃度を増加させる具体的な様式および速度は、目的の抗体に適切なように、そしてこれもまたＨＡ樹脂に結合した不純物分子の型を考慮に入れて、決定され得る。例えば、溶出緩衝液中のリン酸イオンの濃度は、漸進的／浅い直線勾配で上昇され得る。浅い勾配の使用は、類似であるが異なる条件下でＨＡ樹脂から溶出する１つまたは複数の分子の効率的な分離を可能にし得る。あるいは、一部の実施形態では、溶出緩衝液中のリン酸イオンの濃度は、急な勾配で上昇され得、または段階的に上昇され得る。溶出緩衝液は、約１～５０ｍＭの濃度でＨＥＰＥＳをさらに含んでいてもよい。例えば、ある実施形態では、溶出緩衝液は、約２～３０ｍＭのＨＥＰＥＳを含み得；他の実施形態では、約５、１０、１５、２０または２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含み得る。溶出緩衝液は、約６．０～９．０のｐＨを有し得る。例えば、ある実施形態では、溶出緩衝液は、約７．０～８．０のｐＨを有し得；他の実施形態では、約７．０、７．５または８．０のｐＨを有し得る。一実施形態では、溶出緩衝液は、約４０～８０ｍＭの（勾配にわたって漸増する）リン酸イオン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含み、約７．５のｐＨを有する。
【0056】
ＨＡ樹脂との使用に適切な溶出緩衝液の特性（例えば、緩衝液組成、ｐＨ、濃度、イオン強度など）；任意の必要なステップまたは溶出緩衝液の特性における勾配変化；使用される溶出緩衝液のカラム容量数；流速などが含まれるがこれらに限定されない溶出条件は、ＨＡカラムからの目的の抗体の溶出ならびに不純物分子からの目的の抗体の分離を最適化するために決定され得る。
【0057】
溶出後、目的の抗体を含む１つまたは複数のピーク画分は、任意選択により個々にまたは別々に収集され、任意選択によりプールされ、ｐＨが任意選択により調整され、任意選択により濾過され、次いで、所望によるさらなる処理の前に、任意選択により貯蔵される。収集のためのピーク画分は、Ａ２８０における紫外線を使用し、紫外線シグナルが所望の量を超えて上昇したときおよび／または溶出条件中の所望のポイントにおいて収集を開始する同定など、任意の適切な手段によって、同定され得る。
【0058】
ＨＡ樹脂から溶出された、目的の抗体を含む材料は、任意選択により、本明細書で「精製された画分」などと呼ばれ得る。この精製された画分は、ＨＡ樹脂から溶出された単一の画分由来の材料を含み得、または一緒にプールされたＨＡ樹脂から溶出された複数の画分の組み合わせであり得る。典型的には、この精製された画分は、高い量の目的の抗体を収集するが低い量の不純物分子を収集する間で調和するように、調製される。例えば、目的の抗体がＨＡ樹脂から溶出する条件と不純物分子の種がＨＡ樹脂から溶出する条件との間には少なくとも部分的な重複が存在し得るので、これらの競合するゴールはしばしば調和させなければならない。
【0059】
本明細書で提供される方法のための緩衝液（例えば、平衡化緩衝液、ロード緩衝液、洗浄緩衝液または溶出緩衝液）のいずれかは、さらなるまたは代替的な適切な成分、例えば、アセテート、サクシネート、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、ＢＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＡＭＰＳＯ、ＴＲＩＣＩＮＥ、ＥＰＰＳ、ビシン、ＤＩＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、ＴＡＰＳ、アルギニン、グリシン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）または他の界面活性剤などもまた含み得る。
【0060】
一部の実施形態では、本明細書で提供される緩衝液のいずれかは、約６．０～９．０のｐＨを有し得る。他の実施形態では、本明細書で提供される緩衝液のいずれかは、約５．０～９．０、５．５～９．０、６．５～９．０、７．０～９．０、７．５～９．０、７．０～８．０または６．５～８．５のｐＨを有し得る。
【0061】
「リン酸イオン」を含むと記載される本明細書で提供される緩衝液では、リン酸イオンは、任意の適切なリン酸塩、例えば、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムから、緩衝液中で生成され得る。さらに、「リン酸ナトリウム」を用いて調製されると記載される本明細書で提供される溶液は、任意の適切なリン酸ナトリウム塩（例えば、一塩基性または二塩基性）を用いて調製され得る。
【0062】
目的の抗体がＨＡカラムから溶出された後、このＨＡカラムは、不純物およびカラム樹脂を分解する他の成分を除去し、それを、使用に引き続く貯蔵のために準備するために浄化してもよい。一実施形態では、このカラムは、緩衝液、例えば、約０．４Ｍの濃度のリン酸ナトリウムを含み、約７．５のｐＨのものを使用して最初に再生され、その後、浄化溶液、例えば、約１ＭのＮａＯＨおよび約０．５Ｍのリン酸カリウムを使用する任意選択の清浄化ステップが続き、次いで、貯蔵溶液、例えば約０．１ＭのＮａＯＨを使用して貯蔵のために準備される。
【0063】
抗体
本明細書で提供される方法は、１つまたは複数の不純物から目的の抗体を精製するために使用され得る。例えば、この精製された抗体は、医薬として、または医薬の調製において使用され得る。
本明細書で提供される方法は、１つまたは複数の不純物から目的の抗体を精製するために使用され得る。例えば、この精製された抗体は、医薬として、または医薬の調製において使用され得る。
【0064】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って精製される抗体は、本明細書で提供される任意の型の抗体である。例えば、本明細書で提供される方法に従って精製される抗体は、全長抗体または抗体断片（例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂ）であり得、単一特異性または二重特異性であり得る。典型的には、本明細書で提供される方法に従って精製される目的の抗体は、組換え抗体である。
【0065】
ＩｇＧ抗体
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って精製され得る抗体は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体である。当該分野で公知のように、ＩｇＧ抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含み、おおまかに「Ｙ」形状を有する。標準的なＩｇＧ分子では、２つの重鎖は同じアミノ酸配列を有し、２つの軽鎖は同じアミノ酸配列を有する。ＩｇＧ抗体は、２つの「アーム」（即ち、「第１のアーム」および「第２のアーム」）を有すると記載され得、ここで、各アームは、ジスルフィド結合によって一緒に連結された１つの重鎖および１つの軽鎖を含む。標準的なＩｇＧ分子では、抗体の第１のアームは、抗体の第２のアームと同一である（それぞれ、他方のアーム中の重鎖および軽鎖と同じアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含む各アームに起因する）。重鎖のＮ末端領域は、重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、軽鎖のＮ末端領域は、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、抗原に特異的に結合する抗体の部分を含む。従って、ＩｇＧ抗体の各アームは、抗原に特異的に結合できる。標準的なＩｇＧ分子では、ＩｇＧ抗体の第１のアームおよび第２のアームは共に、同じ抗原に結合する（両方のアームが、同じそれぞれのアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含むという事実に起因する）。標準的なＩｇＧ抗体は、同じ２つのアームを有することに基づいて、「ホモダイマー性」であると言われ得る。本明細書で提供される方法に従って精製されるＩｇＧ抗体は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のものであり得る。
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って精製され得る抗体は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体である。当該分野で公知のように、ＩｇＧ抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含み、おおまかに「Ｙ」形状を有する。標準的なＩｇＧ分子では、２つの重鎖は同じアミノ酸配列を有し、２つの軽鎖は同じアミノ酸配列を有する。ＩｇＧ抗体は、２つの「アーム」（即ち、「第１のアーム」および「第２のアーム」）を有すると記載され得、ここで、各アームは、ジスルフィド結合によって一緒に連結された１つの重鎖および１つの軽鎖を含む。標準的なＩｇＧ分子では、抗体の第１のアームは、抗体の第２のアームと同一である（それぞれ、他方のアーム中の重鎖および軽鎖と同じアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含む各アームに起因する）。重鎖のＮ末端領域は、重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、軽鎖のＮ末端領域は、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、抗原に特異的に結合する抗体の部分を含む。従って、ＩｇＧ抗体の各アームは、抗原に特異的に結合できる。標準的なＩｇＧ分子では、ＩｇＧ抗体の第１のアームおよび第２のアームは共に、同じ抗原に結合する（両方のアームが、同じそれぞれのアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含むという事実に起因する）。標準的なＩｇＧ抗体は、同じ２つのアームを有することに基づいて、「ホモダイマー性」であると言われ得る。本明細書で提供される方法に従って精製されるＩｇＧ抗体は、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のものであり得る。
【0066】
二重特異性ＩｇＧ抗体
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って精製され得る抗体は、二重特異性ＩｇＧ抗体である。二重特異性ＩｇＧ抗体では、抗体の２つのアームの各々は、異なる抗原に特異的に結合する。さらに、二重特異性ＩｇＧ抗体の第１のアーム中の重鎖のアミノ酸配列は、同じ二重特異性ＩｇＧ抗体の第２のアーム中の重鎖のアミノ酸配列とは異なり、同様に、二重特異性ＩｇＧ抗体の第１のアーム中の軽鎖のアミノ酸配列は、典型的には、同じ二重特異性ＩｇＧ抗体の第２のアーム中の軽鎖のアミノ酸配列とは異なる。従って、二重特異性ＩｇＧ抗体は、異なる２つのアームを有することに基づいて、「ヘテロダイマー性」であると言われ得る。二重特異性ＩｇＧ抗体の第１のアームは、「第１の抗原」に対して特異的であると記述され得、二重特異性ＩｇＧ抗体の第２のアームは、「第２の抗原」に対して特異的であると記述され得る。一部の実施形態では、この二重特異性抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。一部の実施形態では、この二重特異性抗体は、免疫学的に不活性なＦｃ領域を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って精製され得る抗体は、二重特異性ＩｇＧ抗体である。二重特異性ＩｇＧ抗体では、抗体の２つのアームの各々は、異なる抗原に特異的に結合する。さらに、二重特異性ＩｇＧ抗体の第１のアーム中の重鎖のアミノ酸配列は、同じ二重特異性ＩｇＧ抗体の第２のアーム中の重鎖のアミノ酸配列とは異なり、同様に、二重特異性ＩｇＧ抗体の第１のアーム中の軽鎖のアミノ酸配列は、典型的には、同じ二重特異性ＩｇＧ抗体の第２のアーム中の軽鎖のアミノ酸配列とは異なる。従って、二重特異性ＩｇＧ抗体は、異なる２つのアームを有することに基づいて、「ヘテロダイマー性」であると言われ得る。二重特異性ＩｇＧ抗体の第１のアームは、「第１の抗原」に対して特異的であると記述され得、二重特異性ＩｇＧ抗体の第２のアームは、「第２の抗原」に対して特異的であると記述され得る。一部の実施形態では、この二重特異性抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプを有する。一部の実施形態では、この二重特異性抗体は、免疫学的に不活性なＦｃ領域を含む。
【0067】
二重特異性ＩｇＧ抗体－作製する方法
二重特異性抗体を作製するための方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０、１９８６を参照のこと）。伝統的には、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の共発現に基づき、２つの重鎖は異なる特異性を有した（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ ３０５、５３７～５３９、１９８３）。
二重特異性抗体を作製するための方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０、１９８６を参照のこと）。伝統的には、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の共発現に基づき、２つの重鎖は異なる特異性を有した（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ ３０５、５３７～５３９、１９８３）。
【0068】
より最近、二重特異性ヘテロダイマー性抗体を調製するために以下の一般的なステップがとられる方法が開発されている：
１）第１のホモダイマー性抗体（本明細書で「第１の親抗体」とも呼ばれる）および第２のホモダイマー性抗体（本明細書で「第２の親抗体」とも呼ばれる）が個々に発現され、精製される。この第１のホモダイマー性抗体は、調製されている二重特異性抗体の第１の標的抗原に対して特異的であり、第２のホモダイマー性抗体は、調製されている二重特異性抗体の第２の標的抗原に対して特異的である。従って、例えば、ＢＣＭＡおよびＣＤ３に対する特異性を有する二重特異性抗体を調製することが目的である場合、モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体（「第１の親抗体」）およびモノクローナル抗ＣＤ３抗体（「第２の親抗体」）は、別々に発現され、精製される。
１）第１のホモダイマー性抗体（本明細書で「第１の親抗体」とも呼ばれる）および第２のホモダイマー性抗体（本明細書で「第２の親抗体」とも呼ばれる）が個々に発現され、精製される。この第１のホモダイマー性抗体は、調製されている二重特異性抗体の第１の標的抗原に対して特異的であり、第２のホモダイマー性抗体は、調製されている二重特異性抗体の第２の標的抗原に対して特異的である。従って、例えば、ＢＣＭＡおよびＣＤ３に対する特異性を有する二重特異性抗体を調製することが目的である場合、モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体（「第１の親抗体」）およびモノクローナル抗ＣＤ３抗体（「第２の親抗体」）は、別々に発現され、精製される。
【0069】
２）次に、精製された第１のホモダイマー性／親抗体および精製された第２のホモダイマー性／親抗体は混合され、第１の親抗体由来の第１のアームおよび第２の親抗体由来の第２のアームを含むヘテロダイマー性二重特異性抗体が形成されるように抗体アーム交換を促進する条件下で、一緒にインキュベートされる。これらの条件には、典型的には、還元性条件とその後の酸化性条件の連続が関与する。この還元性条件は、ホモダイマー性抗体の２つの重鎖を一緒に保持するジスルフィド結合の切断を促進し、それによって、第１の親抗体と第２の親抗体との間での抗体アームの交換を可能にする。次いで、引き続く酸化性条件が、新たに形成された二重特異性抗体を安定化する新たなジスルフィド架橋を形成する。二重特異性抗体を生成するためのこの一般的アプローチは、図１に概説される。図１には、第１の親抗体（「親抗体Ａ」；白色）および第２の親抗体（「親抗体Ｂ」；黒色）が示され、その各々は、単一特異性ホモダイマーであり、第１のアームおよび第２のアームを含む。典型的には、第１の親抗体と第２の親抗体とは、異なる抗原に対して特異的である。次いで、第１の親抗体および第２の親抗体は一緒に混合され、親抗体Ａ由来の第１のアームおよび親抗体Ｂ由来の第２のアームならびに両方のアームのそれぞれの特異性を含む目的の二重特異性抗体の形成を生じる還元および酸化ステップに曝露される。
【0070】
抗体重鎖のアミノ酸配列は、二重特異性抗体の形成を促進するために１つまたは複数の方法で改変してもよい。二重特異性抗体の一方のアームの重鎖は、第１のヒンジ領域中に、例えば、第１のヒンジ領域中の置換された／置き換えられたアミノ酸が、形成された二重特異性抗体の他方のアームのヒンジ領域中の対応するアミノ酸とは反対の電荷を有するようなアミノ酸改変を含み得る。これは、例えば、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６４１９（ＷＯ２０１１／１４３５４５）に記載されている。別のアプローチでは、所望のヘテロマルチマー性またはヘテロダイマー性タンパク質（例えば、二重特異性抗体）の形成は、第１の免疫グロブリン様Ｆｃ領域と第２の免疫グロブリン様Ｆｃ領域（例えば、ヒンジ領域および／またはＣＨ３領域）との間の界面を変更または操作することによって増強される。このアプローチでは、二重特異性抗体は、ＣＨ３領域を含み得、このＣＨ３領域は、一緒に相互作用してＣＨ３界面を形成する第１のＣＨ３ポリペプチドおよび第２のＣＨ３ポリペプチドを含み、このＣＨ３界面内の１つまたは複数のアミノ酸は、ホモダイマー形成を不安定化し、ホモダイマー形成には静電気的に好ましくない。このアプローチも、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６４１９（ＷＯ２０１１／１４３５４５）に記載されている。
【0071】
二重特異性抗体を調製するための上記方法および他の方法は、例えば、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０５４８９９（ＷＯ２０１２／０５９８８２）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６４１９（ＷＯ２０１１／１４３５４５）およびＧｉｅｓｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｎｏｂ ａｎｄ Ｈｏｌｅ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、２０１８年１月１７日、ならびにそれらの中で引用された参考文献にさらに記載されており、これらは各々、全ての目的のために本明細書で参照によって組み込まれる。抗体の精製のための本明細書で提供される方法は、任意の適切な方法によって調製された二重特異性抗体を精製するために使用され得る。
【0072】
二重特異性ＩｇＧ抗体－特異性
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って精製され得る抗体は、全長ヒト二重特異性ＩｇＧ抗体であり、この二重特異性抗体の第１のアームの第１の抗体可変ドメインは、第１の抗原に結合することが可能であり、二重特異性抗体の第２のアームの第２の抗体可変ドメインは、第２の抗原に結合することが可能である。この第１の抗原および第２の抗原は、本明細書に記載される抗原の任意の特徴を有し得る。一部の実施形態では、第１の抗原は、第１の細胞型上に存在し、第２の抗原は、第２の細胞型上に存在する。
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って精製され得る抗体は、全長ヒト二重特異性ＩｇＧ抗体であり、この二重特異性抗体の第１のアームの第１の抗体可変ドメインは、第１の抗原に結合することが可能であり、二重特異性抗体の第２のアームの第２の抗体可変ドメインは、第２の抗原に結合することが可能である。この第１の抗原および第２の抗原は、本明細書に記載される抗原の任意の特徴を有し得る。一部の実施形態では、第１の抗原は、第１の細胞型上に存在し、第２の抗原は、第２の細胞型上に存在する。
【0073】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って精製され得る抗体は、全長ヒト二重特異性ＩｇＧ抗体であり、この抗体の第１の抗体可変ドメインは、ヒト免疫エフェクター細胞上に位置するエフェクター抗原に特異的に結合することによってこのヒト免疫エフェクター細胞の活性を動員することが可能であり、抗体の第２の抗体可変ドメインは、標的抗原に特異的に結合することが可能である。
【0074】
本明細書で提供される抗体が結合し得るヒト免疫エフェクター細胞は、当該分野で公知の種々の免疫エフェクター細胞のいずれかであり得る。例えば、この免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれるがこれらに限定されない、ヒトリンパ系細胞系譜のメンバーであり得る。この免疫エフェクター細胞はまた、例えば、単球、好中球性顆粒球および樹状細胞が含まれるがこれらに限定されない、ヒト骨髄系系譜のメンバーであり得る。かかる免疫エフェクター細胞は、標的細胞に対する細胞傷害効果もしくはアポトーシス効果またはエフェクター抗原の結合による活性化の際の他の所望の効果のいずれかを有し得る。このエフェクター抗原は、ヒト免疫エフェクター細胞上で発現される抗原（例えば、タンパク質またはポリペプチド）である。本明細書で提供される抗体が結合し得るエフェクター抗原の例には、ヒトＣＤ３（またはＣＤ３（表面抗原分類）複合体）、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＣＤ２、ＣＤ２８、ＣＤ２５、ＣＤ６４およびＣＤ８９が含まれるがこれらに限定されない。
【0075】
この標的抗原は、疾患状態（例えば、炎症性疾患、増殖性疾患（例えば、がん）、免疫学的障害、神経学的疾患、神経変性疾患、自己免疫疾患、感染性疾患（例えば、ウイルス感染症または寄生生物感染症）、アレルギー反応、移植片対宿主病または宿主対移植片病）における標的細胞上で発現される。標的抗原は、エフェクター抗原ではない。標的抗原の例には、ＢＣＭＡ、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＣＣＲ５（ケモカイン受容体５型）、ＣＤ１９、ＨＥＲ（ヒト上皮増殖因子受容体）－２／ｎｅｕ、ＨＥＲ－３、ＨＥＲ－４、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）、ＦＬＴ３（Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３）、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭＵＣ－１（ムチン）、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＣＩｈＣＧ、ルイス－Ｙ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ガングリオシドＧＤ３、９－Ｏ－アセチル－ＧＤ３、ＧＭ２、グロボＨ、フコシルＧＭ１、ポリＳＡ、ＧＤ２、炭酸脱水酵素（Ｃａｒｂｏａｎｈｙｄｒａｓｅ）ＩＸ（ＭＮ／ＣＡ ＩＸ）、ＣＤ４４ｖ６、Ｓｈｈ（ソニックヘッジホッグ）、Ｗｕｅ－１、形質細胞抗原、（膜結合型）ＩｇＥ、ＭＣＳＰ（黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、ＣＣＲ８、ＴＮＦ－アルファ前駆体、ＳＴＥＡＰ、メソテリン、Ａ３３抗原、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、Ｌｙ－６；デスモグレイン４、Ｅ－カドヘリンネオエピトープ、胎児アセチルコリン受容体、ＣＤ２５、ＣＡ１９－９マーカー、ＣＡ－１２５マーカーおよびＭＩＳ（ミュラー菅阻害物質）受容体ＩＩ型、ｓＴｎ（シアリル化Ｔｎ抗原；ＴＡＧ－７２）、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化抗原）、エンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＬＧ、ＳＡＳならびにＣＤ６３が含まれるがこれらに限定されない。
【0076】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って精製される抗体は、全ての目的のためにその全体が本明細書で参照によって組み込まれる、２０１６年３月３０日出願の米国特許出願第１５／０８５，６４４号（米国公開第２０１６０２９７８８５号）または２０１８年５月３１日出願の米国特許出願第１５／９９３，８７４号（米国公開第２０１８０３４６６０１号）に記載される任意の抗体であり得る。
【0077】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って精製される抗体は、抗体の一方のアームが表面抗原分類３（ＣＤ３）に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体であり得る。ＣＤ３についての情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ番号Ｐ０７７６６を介して提供される。
【0078】
一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＣＤ３に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＣＤ３結合アームの重鎖のＶＨ領域は、アミノ酸配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＮＲＡＲＧＹＴＳＤＨＮＰＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＰＳＹＹＶＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１）を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＣＤ３に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＣＤ３結合アームの重鎖は、アミノ酸配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＲＮＲＡＲＧＹＴＳＤＨＮＰＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＰＳＹＹＶＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＲＶＲＣＰＲＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＡＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２）を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＣＤ３に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＣＤ３結合アームの重鎖のＶＨ領域は、配列番号１に示されるＶＨ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を有する。
【0079】
一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＣＤ３に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＣＤ３結合アームの軽鎖のＶＬ領域は、アミノ酸配列：ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＦＮＶＲＳＲＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＳＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＤＬＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３）を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＣＤ３に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＣＤ３結合アームの軽鎖は、アミノ酸配列：ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＦＮＶＲＳＲＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＳＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＤＬＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号４）を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＣＤ３に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＣＤ３結合アームの軽鎖のＶＬ領域は、配列番号３に示されるＶＬ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を有する。
【0080】
一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＣＤ３に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＣＤ３結合アームの重鎖のＶＨ領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤ３結合アームの軽鎖のＶＬ領域は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＣＤ３に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＣＤ３結合アームの重鎖は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤ３結合アームの軽鎖は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＣＤ３に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＣＤ３結合アームの重鎖のＶＨ領域は、配列番号１に示されるＶＨ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を有し、ＣＤ３結合アームの軽鎖のＶＬ領域は、配列番号３に示されるＶＬ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を有する。
【0081】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って精製される抗体は、抗体の一方のアームがＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体であり得る。ＢＣＭＡについての情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ番号Ｑ０２２２３を介して提供される。
【0082】
一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＢＣＭＡ結合アームの重鎖のＶＨ領域は、アミノ酸配列：ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＰＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＧＧＳＧＧＳＬＰＹＡＤＩＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＷＰＭＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５）を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＢＣＭＡ結合アームの重鎖は、アミノ酸配列：ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＰＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＧＧＳＧＧＳＬＰＹＡＤＩＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＷＰＭＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＥＶＥＣＰＥＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＡＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＥＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６）を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＢＣＭＡ結合アームの重鎖のＶＨ領域は、配列番号５に示されるＶＨ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を有する。
【0083】
一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＢＣＭＡ結合アームの軽鎖のＶＬ領域は、アミノ酸配列：ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＭＹＤＡＳＩＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＱＳＷＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号７）を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＢＣＭＡ結合アームの軽鎖は、アミノ酸配列：ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＭＹＤＡＳＩＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＱＳＷＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号８）を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＢＣＭＡ結合アームの軽鎖のＶＬ領域は、配列番号７に示されるＶＬ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を有する。
【0084】
一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＢＣＭＡ結合アームの重鎖のＶＨ領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、ＢＣＭＡ結合アームの軽鎖のＶＬ領域は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＢＣＭＡ結合アームの重鎖は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、ＢＣＭＡ結合アームの軽鎖は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＢＣＭＡ結合アームの重鎖のＶＨ領域は、配列番号５に示されるＶＨ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を有し、ＢＣＭＡ結合アームの軽鎖のＶＬ領域は、配列番号７に示されるＶＬ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を有する。
【0085】
一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＢＣＭＡ結合アームの重鎖のＶＨ領域は、アミノ酸配列：ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＰＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＧＧＳＧＧＳＬＰＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＷＰＭＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１３）を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＢＣＭＡに特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＢＣＭＡ結合アームの軽鎖のＶＬ領域は、アミノ酸配列：ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＴＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＭＹＤＡＳＩＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＱＥＷＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１４）を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するＶＨ領域を含む抗体に対する本明細書の任意の言及では、この抗体は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域を代替的に含み得る。一部の実施形態では、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含む抗体に対する本明細書の任意の言及では、この抗体は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域を代替的に含み得る。同様に、それぞれ、配列番号１３および配列番号１４のＶＨおよびＶＬ配列を含む抗ＢＣＭＡ重鎖および軽鎖もまた、本明細書に含まれる。
【0086】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って精製される抗体は、抗体の一方のアームがｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体であり得る。ＦＬＴ３についての情報は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ番号Ｐ３６８８８を介して提供される。
【0087】
一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＦＬＴ３に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＦＬＴ３結合アームの重鎖のＶＨ領域は、アミノ酸配列：ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＧＧＲＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＳＰＳＤＶＧＷＧＹＧＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９）を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＦＬＴ３に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＦＬＴ３結合アームの重鎖は、アミノ酸配列：ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＧＧＲＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＬＳＰＳＤＶＧＷＧＹＧＦＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＥＶＥＣＰＥＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＡＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＥＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１０）を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＦＬＴ３に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＦＬＴ３結合アームの重鎖のＶＨ領域は、配列番号９に示されるＶＨ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を有する。
【0088】
一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＦＬＴ３に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＦＬＴ３結合アームの軽鎖のＶＬ領域は、アミノ酸配列：ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＴＦＴＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＰＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ（配列番号１１）を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＦＬＴ３に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＦＬＴ３結合アームの軽鎖は、アミノ酸配列：ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＴＦＴＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＰＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１２）を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＦＬＴ３に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＦＬＴ３結合アームの軽鎖のＶＬ領域は、配列番号１１に示されるＶＬ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を有する。
【0089】
一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＦＬＴ３に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＦＬＴ３結合アームの重鎖のＶＨ領域は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、ＦＬＴ３結合アームの軽鎖のＶＬ領域は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＦＬＴ３に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＦＬＴ３結合アームの重鎖は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有し、ＦＬＴ３結合アームの軽鎖は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、抗体の一方のアームがＦＬＴ３に特異的に結合する二重特異性ＩｇＧ抗体では、ＦＬＴ３結合アームの重鎖のＶＨ領域は、配列番号９に示されるＶＨ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を有し、ＦＬＴ３結合アームの軽鎖のＶＬ領域は、配列番号１１に示されるＶＬ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を有する。
【0090】
一部の実施形態では、抗体の抗ＢＣＭＡアームが抗ＢＣＭＡアームについて上記した特徴のいずれかを有し、抗体の抗ＣＤ３アームが抗ＣＤ３アームについて上記した特徴のいずれかを有する二重特異性抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３抗体が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、抗体の抗ＦＬＴ３アームが抗ＦＬＴ３アームについて上記した特徴のいずれかを有し、抗体の抗ＣＤ３アームが抗ＣＤ３アームについて上記した特徴のいずれかを有する二重特異性抗ＦＬＴ３／抗ＣＤ３抗体が、本明細書で提供される。
【0091】
上記抗原のいずれかに対して親和性を有し、および／または上記アミノ酸配列のいずれかを含む単一特異性抗体を精製する方法もまた、本明細書で提供される。例えば、配列番号１に示されるＶＨアミノ酸配列を含む単一特異性ホモダイマー性抗ＣＤ３抗体の精製もまた、本明細書で提供される。
【0092】
不純物
本明細書で提供される方法は、１つまたは複数の不純物から目的の抗体を精製するために使用され得る。
本明細書で提供される方法は、１つまたは複数の不純物から目的の抗体を精製するために使用され得る。
【0093】
不純物には、例えば、目的の抗体のクリップ型バージョン、タンパク質凝集体、および目的の二重特異性抗体の場合には、目的の二重特異性抗体の形成と関連する親単一特異性抗体が含まれる。これらの異なる不純物は、本明細書で異なる「種の不純物」、「不純物分子」などとも呼ばれ得る。
【0094】
目的の抗体のクリップ型バージョン
「目的の抗体のクリップ型バージョン」、「クリップ型抗体」などは、抗体中の１つまたは複数のポリペプチド結合が目的の対応するインタクトな抗体と比較して切断された組換え抗体を指す。対照的に、「インタクトな」抗体とは、組換え抗体の予測されたペプチド結合およびアミノ酸（即ち、抗体のポリペプチド（複数可）をコードする核酸配列（複数可）に基づいて予測される）の全てを含む組換え抗体を指す。
「目的の抗体のクリップ型バージョン」、「クリップ型抗体」などは、抗体中の１つまたは複数のポリペプチド結合が目的の対応するインタクトな抗体と比較して切断された組換え抗体を指す。対照的に、「インタクトな」抗体とは、組換え抗体の予測されたペプチド結合およびアミノ酸（即ち、抗体のポリペプチド（複数可）をコードする核酸配列（複数可）に基づいて予測される）の全てを含む組換え抗体を指す。
【0095】
このように、クリップ型抗体は、目的の抗体と関連する分解産物であるとみなされ得る。抗体中のペプチド結合の切断は、例えば、酵素（例えば、プロテアーゼ媒介性）または非酵素活性を介して生じ得る。
【0096】
一部の実施形態では、抗体のポリペプチド中のペプチド結合が切断される場合、切断後、ポリペプチド鎖の切断された部分は、抗体の残部にもはや共有結合していない場合がある；その場合、ポリペプチド鎖の切断された部分は、抗体の残部から解離し得る。これは、切断がポリペプチド鎖のＮまたはＣ末端の近傍のペプチド結合においてである場合に最も一般に生じ、対応するインタクトな抗体と比較して１つまたは複数のアミノ酸を喪失したクリップ型抗体を生じる。これらのクリップ型抗体は、抗体からの１つまたは複数のアミノ酸の喪失に起因して、対応するインタクトな抗体よりも小さい質量を有する。
【0097】
あるいは、一部の他の実施形態では、抗体のポリペプチド中のペプチド結合が切断される場合、切断後、ポリペプチド鎖の切断された部分は、抗体の残部と（例えば、鎖内または鎖間ジスルフィド結合によって）なおも共有結合したままであり得る。この場合、抗体のペプチド結合の切断が存在する場合であっても、ポリペプチド鎖の切断された部分は、ポリペプチド鎖の切断された部分を抗体の残部に連結する残存するインタクトな共有結合（複数可）を介して、抗体の残部に係留されたままになる。この状況では、クリップ型抗体は、インタクトな抗体と比較して、同じ数のアミノ酸およびアミノ酸配列をなおも有する。さらに、少なくとも一部の実施形態では、この型のクリップ型抗体は、対応するインタクトな抗体よりもわずかに大きい質量を有し得る。質量のこの獲得は、例えば、ペプチド結合の切断の際に生じる１つまたは複数の化学反応の結果であり得る。かかる反応の間、１つまたは複数の原子（例えば、Ｈ、Ｏ）は、抗体ポリペプチド鎖の原子と反応し得、抗体鎖と共有結合して、対応するインタクトな抗体と比較して、クリップ型抗体による質量の獲得を生じる。
【0098】
「クリップ型」抗体は対応する「インタクトな」抗体から生成されるので、抗体の「クリップ型」バージョンは、抗体の対応する「インタクトな」バージョンと同じアミノ酸配列（ペプチド結合切断の結果としての抗体からのアミノ酸の喪失がない場合）またはほぼ同じアミノ酸配列（ペプチド結合切断の結果としての抗体からの１つまたは複数のアミノ酸配列の喪失がある場合）を有する。
【0099】
典型的には、抗体のクリップ型バージョンは、対応するインタクトな抗体の質量と類似の質量を有する。上記したように、一部の実施形態では、クリップ型抗体は、（例えば、クリッピングが抗体からの１つまたは複数のアミノ酸の喪失を生じる場合には）対応するインタクトな抗体よりも小さい質量を有し得る。あるいは、一部の実施形態では、クリップ型抗体は、（クリッピングが抗体からのいずれのアミノ酸の喪失も生じず、その代わりに、ペプチド結合の切断の結果として生じる１つまたは複数の反応を介した抗体による少なくとも１原子の獲得を生じる場合には）対応するインタクトな抗体よりも大きい質量を有し得る。
【0100】
一部の実施形態では、抗体のクリップ型バージョンは、目的の対応するインタクトな抗体の質量とは５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％以下異なる質量を有する。言い換えれば、一部の実施形態では、目的の抗体のクリップ型バージョンは、目的の対応するインタクトな抗体の質量とは５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％または０．０１％以下異なる質量を有する。
【0101】
上記したように、一部の実施形態では、目的の抗体のクリップ型バージョンは、目的の対応するインタクトな抗体よりも小さい質量を有する。例えば、一部の実施形態では、抗体のクリップ型バージョンは、目的の対応するインタクトな抗体の質量よりも、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％以下小さい質量を有する。言い換えると、抗体のクリップ型バージョンが、目的の対応するインタクトな抗体の質量よりも１０％以下小さい質量を有し、例えば、目的のインタクトな抗体が１００，０００Ｄａの質量を有する場合、抗体のクリップ型バージョンは、それよりも１０，０００Ｄａ以下小さい（１００，０００の１０％は１０，０００である）質量を有する－即ち、９０，０００Ｄａと１００，０００Ｄａとの間の質量を有する。
【0102】
これもまた上記したように、一部の実施形態では、目的の抗体のクリップ型バージョンは、目的の対応するインタクトな抗体よりも大きい質量を有する。例えば、一部の実施形態では、抗体のクリップ型バージョンは、目的の対応するインタクトな抗体の質量よりも５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％または０．０１％以下大きい質量を有する。言い換えると、抗体のクリップ型バージョンが、目的の対応するインタクトな抗体の質量よりも１％以下大きい質量を有し、例えば、目的のインタクトな抗体が、１００，０００Ｄａの質量を有する場合、抗体のクリップ型バージョンは、それよりも１，０００Ｄａ以下大きい（１００，０００の１％は１，０００である）質量を有する－即ち、１００，０００Ｄａと１０１，０００Ｄａとの間の質量を有する。
【0103】
高分子質量種（ＨＭＭＳ）／タンパク質凝集体
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に適切な不純物は、「高分子質量種」（ＨＭＭＳ）と呼ばれる。ＨＭＭＳとは、任意の高分子質量の混入物または不純物を指すが、典型的には、凝集体を形成する少なくとも２つのタンパク質の連合である。例として、ＨＭＭＳは、一緒に凝集した目的の抗体の複数の分子、および／または目的の抗体を産生するために使用した宿主細胞由来のタンパク質の凝集体を含み得る。凝集体は、例えば、分子の共有結合または非共有結合を含む任意のプロセスによって生じ得る。
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に適切な不純物は、「高分子質量種」（ＨＭＭＳ）と呼ばれる。ＨＭＭＳとは、任意の高分子質量の混入物または不純物を指すが、典型的には、凝集体を形成する少なくとも２つのタンパク質の連合である。例として、ＨＭＭＳは、一緒に凝集した目的の抗体の複数の分子、および／または目的の抗体を産生するために使用した宿主細胞由来のタンパク質の凝集体を含み得る。凝集体は、例えば、分子の共有結合または非共有結合を含む任意のプロセスによって生じ得る。
【0104】
親抗体
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に適切な不純物は、「親（ｐａｒｅｎｔ）抗体」または「親（ｐａｒｅｎｔａｌ）抗体」などである。この型の不純物分子は、目的の抗体が、例えば図１に概説した２つの異なる親抗体から生成された二重特異性抗体である、本明細書で提供される方法に適切である。これらの親抗体は、単一特異性ホモダイマーである。親抗体は、例えば、ｉ）一部の状況では、一部の親抗体分子は、別々の第１のアームおよび第２のアームへと親抗体を分離するための還元ステップの間に、第１のアームおよび第２のアームへと分離しない（従って、抗体は単一特異性ホモダイマーのままである）；またはｉｉ）一部の状況では、同じ型の親抗体由来の分離された第１のアームおよび第２のアームが一緒に連結し、従って、これらは（ヘテロダイマー二重特異性抗体の形成に関与するのではなく）単一特異性ホモダイマーを形成するなどの複数の可能な機構に起因して、目的の二重特異性抗体と共に抗体調製物中に存在し得る。本明細書で使用する場合、「親抗体」とは、上記機構のいずれかによって生じるホモダイマー性分子を指す。さらに、本明細書で提供される抗体調製物は、不純物として、一方または両方の親種由来の親抗体を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に適切な不純物は、「親（ｐａｒｅｎｔ）抗体」または「親（ｐａｒｅｎｔａｌ）抗体」などである。この型の不純物分子は、目的の抗体が、例えば図１に概説した２つの異なる親抗体から生成された二重特異性抗体である、本明細書で提供される方法に適切である。これらの親抗体は、単一特異性ホモダイマーである。親抗体は、例えば、ｉ）一部の状況では、一部の親抗体分子は、別々の第１のアームおよび第２のアームへと親抗体を分離するための還元ステップの間に、第１のアームおよび第２のアームへと分離しない（従って、抗体は単一特異性ホモダイマーのままである）；またはｉｉ）一部の状況では、同じ型の親抗体由来の分離された第１のアームおよび第２のアームが一緒に連結し、従って、これらは（ヘテロダイマー二重特異性抗体の形成に関与するのではなく）単一特異性ホモダイマーを形成するなどの複数の可能な機構に起因して、目的の二重特異性抗体と共に抗体調製物中に存在し得る。本明細書で使用する場合、「親抗体」とは、上記機構のいずれかによって生じるホモダイマー性分子を指す。さらに、本明細書で提供される抗体調製物は、不純物として、一方または両方の親種由来の親抗体を含み得る。
【0105】
不純物からの目的の抗体の精製
１つまたは複数の不純物から目的の抗体を精製するための方法が、本明細書で提供される。
１つまたは複数の不純物から目的の抗体を精製するための方法が、本明細書で提供される。
【0106】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法では、目的の抗体は、目的の抗体ならびに１つまたは複数の種の不純物分子を含む抗体調製物（本明細書で「出発サンプル」とも呼ばれる）中にある。本明細書で提供される方法のためのこの出発材料中で、目的の抗体は、例えば、抗体調製物中のタンパク質の少なくとも約１０質量％、２０質量％、３０質量％、４０質量％、５０質量％、６０質量％、７０質量％、７５質量％、８０質量％、８５質量％、９０質量％または９５質量％を構成し得る。次いで、本明細書で提供される方法の一部の実施形態では、精製された画分（本明細書で「精製されたサンプル」とも呼ばれる）は、ＨＡ樹脂からの溶出物として収集される。この精製された画分は、目的の抗体を含み、一部の実施形態では、１つまたは複数の不純物分子をなおも含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される精製された画分中で、目的の抗体は、例えば、精製された画分中のタンパク質の少なくとも約２０質量％、３０質量％、４０質量％、５０質量％、６０質量％、７０質量％、７５質量％、８０質量％、８５質量％、９０質量％、９５質量％、９６質量％、９７質量％、９８質量％または９９質量％を構成し得る。
【0107】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法では、出発サンプルは、少なくとも約１０質量％、２０質量％、３０質量％、４０質量％、５０質量％、６０質量％、７０質量％、７５質量％、８０質量％、８５質量％、９０質量％または９５質量％の目的の抗体であり、同じ方法における引き続く精製されたサンプルは、少なくとも約２０質量％、３０質量％、４０質量％、５０質量％、６０質量％、７０質量％、７５質量％、８０質量％、８５質量％、９０質量％、９５質量％、９６質量％、９７質量％、９８質量％または９９質量％の目的の抗体であり、ここで、２番目の値は、最初の値よりも大きい。
【0108】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法では、出発サンプルは、少なくとも約０．１質量％、０．５質量％、１質量％、２質量％、３質量％、４質量％、５質量％、６質量％、７質量％、８質量％、９質量％、１０質量％、１５質量％、２０質量％または２５質量％の目的の抗体のクリップ型バージョンを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法では、精製されたサンプルは、約０．０１質量％、０．０５質量％、０．１質量％、０．５質量％、１質量％、２質量％、３質量％、４質量％、５質量％、６質量％、７質量％、８質量％、９質量％、１０質量％、１５質量％または２０質量％以下の目的の抗体のクリップ型バージョンを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法では、出発サンプルは、少なくとも約０．１質量％、０．５質量％、１質量％、２質量％、３質量％、４質量％、５質量％、６質量％、７質量％、８質量％、９質量％、１０質量％、１５質量％、２０質量％または２５質量％の目的の抗体のクリップ型バージョンを含み、同じ方法における引き続く精製されたサンプルは、約０．０１質量％、０．０５質量％、０．１質量％、０．５質量％、１質量％、２質量％、３質量％、４質量％、５質量％、６質量％、７質量％、８質量％、９質量％、１０質量％、１５質量％または２０質量％以下の目的の抗体のクリップ型バージョンを含み、ここで、２番目の値は、最初の値よりも小さい。
【0109】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法では、出発サンプルは、目的のインタクトな抗体および目的の抗体のクリップ型バージョンを含み、クリップ型抗体対インタクトな抗体の比は、少なくとも約１：１００、１：５０、１：２５、１：２０、１：１０、１：５、１：４または１：３である。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法では、精製されたサンプルは、目的のインタクトな抗体および目的の抗体のクリップ型バージョンを含み、クリップ型抗体対インタクトな抗体の比は、約１：１００、１：５０、１：２５、１：２０または１：１０以下である。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法では、出発サンプルは、目的のインタクトな抗体および目的の抗体のクリップ型バージョンを含み、出発サンプル中のクリップ型抗体対インタクトな抗体の比は、少なくとも約１：１００、１：５０、１：２５、１：２０、１：１０、１：５、１：４または１：３であり、同じ方法における引き続く精製されたサンプル中のクリップ型抗体対インタクトな抗体の比は、約１：２００、１：１００、１：５０、１：２５、１：２０または１：１０以下であり、ここで、２番目の比は、最初の比よりも小さい。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法では、出発サンプルは、目的のインタクトな抗体および目的の抗体のクリップ型バージョンを含み、出発サンプル中のクリップ型抗体対インタクトな抗体の比は、Ａ群における比のうち約１つ（Ａ群の比：１：１００、１：５０、１：２５、１：２０、１：１０、１：５または１：４）とＢ群における比のうち１つ（Ｂ群の比：１：５０、１：２５、１：２０、１：１０、１：５、１：４または１：３）との間であり、同じ方法における引き続く精製されたサンプル中のクリップ型抗体対インタクトな抗体の比は、約１：２００、１：１００、１：５０、１：２５、１：２０または１：１０以下であり、ここで、精製されたサンプルにおける比は、出発サンプルにおける比よりも小さい。
【0110】
一部の実施形態では、明細書で提供される方法に従って提供される出発サンプルは、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００または１０，０００グラムの目的のインタクトな抗体を含む。一部の実施形態では、明細書で提供される方法に従って提供される精製されたサンプルは、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００または１０，０００グラムの目的のインタクトな抗体を含む。一部の実施形態では、明細書で提供される方法に従って提供される出発サンプルは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００または１０，０００グラムの目的のインタクトな抗体を含み、同じ方法における引き続く精製されたサンプルは、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００または５０００グラムの目的のインタクトな抗体を含み、ここで、最初の値は、２番目の値よりも大きい。
【0111】
さらに、出発サンプルまたは精製されたサンプル中の目的の抗体のａ）量またはｂ）純度に関する任意の上記記載は、同じサンプルに関して総合され得る。例えば、上述のように、出発サンプルは、少なくとも約８０質量％の目的の抗体を含み得る；さらに、これもまた上述のように、出発サンプルは、少なくとも約１０グラムの目的の抗体を含み得る。従って、少なくとも約８０質量％の目的の抗体および少なくとも１０グラムの目的の抗体を含む出発サンプルなどもまた、本明細書で提供される。
【0112】
一般技術
本発明の実施は、特に示さない限り、当業者の技術範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用する。かかる技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３～１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８～１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）などの文献中、ならびに該当する場合には、上記参考文献の引き続く版および対応するウェブサイト中に完全に説明されている。
本発明の実施は、特に示さない限り、当業者の技術範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用する。かかる技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３～１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８～１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）などの文献中、ならびに該当する場合には、上記参考文献の引き続く版および対応するウェブサイト中に完全に説明されている。
【0113】
以下の実施例は、例示目的のためにのみ提供され、本発明の範囲を制限することは決して意図しない。実際、本明細書に示され記載されたものに加えた本発明の種々の改変は、上述の説明から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲内に入る。
【実施例】
【0114】
（実施例１）
ｃＨＡ樹脂クロマトグラフィーによる抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の精製
目的：
この実施例では、種々の不純物から目的の全長二重特異性ヒトＩｇＧを分離するための方法を試験した。目的の抗体は、ヘテロダイマー性二重特異性抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３抗体であった（即ち、二重特異性抗体の一方のアームはＢＣＭＡに対して特異的であり、他方のアームはＣＤ３に対して特異的であった）。精製の開始時に目的の二重特異性抗体と共に存在する不純物は、以下を含んだ：ｉ）目的のインタクトな抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体のクリップ型バージョン；ｉｉ）ホモダイマー性単一特異性抗ＢＣＭＡ親抗体；ｉｉｉ）ホモダイマー性単一特異性抗ＣＤ３抗体；およびｉｖ）タンパク質凝集体／高分子質量種（ＨＭＭＳ）。
ｃＨＡ樹脂クロマトグラフィーによる抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の精製
目的：
この実施例では、種々の不純物から目的の全長二重特異性ヒトＩｇＧを分離するための方法を試験した。目的の抗体は、ヘテロダイマー性二重特異性抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３抗体であった（即ち、二重特異性抗体の一方のアームはＢＣＭＡに対して特異的であり、他方のアームはＣＤ３に対して特異的であった）。精製の開始時に目的の二重特異性抗体と共に存在する不純物は、以下を含んだ：ｉ）目的のインタクトな抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体のクリップ型バージョン；ｉｉ）ホモダイマー性単一特異性抗ＢＣＭＡ親抗体；ｉｉｉ）ホモダイマー性単一特異性抗ＣＤ３抗体；およびｉｖ）タンパク質凝集体／高分子質量種（ＨＭＭＳ）。
【0115】
二重特異性抗体のクリップ型バージョンは、目的のインタクトな二重特異性抗体と同じ数のアミノ酸および同じアミノ酸配列を含み、インタクトな二重特異性抗体の質量とは１８ダルトン（Ｄａ）だけ異なるので、二重特異性抗体のクリップ型バージョンからの目的のインタクトな二重特異性抗体の精製は、特定の課題を提示した。具体的には、インタクトな抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体の質量は１４８０９５．５Ｄａであり、二重特異性抗体の対応するクリップ型バージョンの質量は１４８１１３．５である（質量分析によって決定した）。従って、クリップ型二重特異性抗体は、インタクトな二重特異性抗体の質量と比較して、０．１％未満（さらには０．０２％未満）の、質量における差異を有する（即ち、１４８０９５Ｄａの０．１％は１４８Ｄａであり；１４８０９５Ｄａの０．０２％は２９．６Ｄａである）。言い換えれば、クリップ型二重特異性抗体の質量は、目的のインタクトな二重特異性抗体の質量の約１００．０１％である。従って、クリップ型二重特異性抗体の質量は、目的のインタクトな二重特異性抗体の質量と非常に類似している。
【0116】
二重特異性抗体のクリップ型バージョンは、重鎖中の５６番目のアミノ酸と５７番目のアミノ酸との間に、抗ＣＤ３重鎖のペプチド結合における切断を含む。抗ＣＤ３重鎖は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、従って、切断は、配列番号２の「ＲＧ」配列中のアミノ酸ＲとＧとの間で生じる（「ＲＧ」は、配列番号２中に１回だけ出現する）。この切断は、インタクトな二重特異性抗体と比較して、クリップ型二重特異性抗体における１つの酸素原子および２つの水素原子の獲得（これは、１８Ｄａの質量の獲得と対応する）を生じると考えられる。また、抗ＣＤ３重鎖中に切断されたペプチド結合が存在するものの、重鎖の切断された５６アミノ酸の部分（即ち、鎖の最初の５６アミノ酸）は、インタクトな残留する鎖内ジスルフィド結合を介して抗体の残部に結合したままである。鎖内ジスルフィド結合は、抗ＣＤ３重鎖のＣ２２とＣ９８との間（即ち、配列番号２に示される配列のＣ２２とＣ９８との間）である。鎖内ペプチド結合による、抗体の残部への、切断された５６アミノ酸の部分の存続した係留は、図２に模式的に示される。
【0117】
図２では、左の模式図は、二重特異性抗体の抗ＣＤ３アームおよび抗ＢＣＭＡアームの両方についてインタクトな重鎖および軽鎖を含む目的のインタクトな二重特異性抗体を示す（図中、長い方の鎖は抗体の重鎖を示し、短い方の鎖は軽鎖を示す）。さらに、図２は、鎖内ジスルフィド結合（例えば、同じ軽鎖または重鎖中の異なるアミノ酸を連結する）、およびまた鎖間ジスルフィド結合（例えば、抗ＢＣＭＡアームの重鎖を抗ＣＤ３アームの重鎖に連結する、または抗ＣＤ３アームの軽鎖を抗ＣＤ３アームの重鎖に連結する）を含む、種々の抗体内ジスルフィド結合もまた示す。
【0118】
種々の不純物から目的のインタクトな二重特異性抗体を精製する方法を開発する際に提示される別の課題は、比較的大量の目的の二重特異性抗体が精製される場合に、不純物から目的の二重特異性抗体を効率的に分離する方法を開発するという目的であった。例えば、この実施例に関連する作業の１つの目的は、少なくとも１グラムの二重特異性抗体が精製される方法にとって有効な、二重特異性抗体の精製のための方法を開発することであった。当該分野で公知のように、大規模でのタンパク質の精製は、例えば、クロマトグラフィーを大規模で実施する場合の異なるタンパク質間のはっきりしたクロマトグラフィー分解を得る際の困難に起因して、小規模での同じタンパク質の精製の間には存在しない（または顕著には問題にならない）多数の困難を提示する場合が多い。
【0119】
材料および方法：
この作業のための出発材料は、目的の二重特異性ＩｇＧ抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３抗体ならびに種々の不純物、例えば、上に示されたものを含む抗体調製物であった。この二重特異性抗体のポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の配列番号に示される：ＢＣＭＡ重鎖：配列番号６；ＢＣＭＡ軽鎖：配列番号８；ＣＤ３重鎖：配列番号２；ＣＤ３軽鎖：配列番号４。目的の二重特異性抗体は、本明細書で以前に記載したように、２つの別々の親抗体から調製されたものであった。より具体的には、親単一特異性抗ＣＤ３および抗ＢＣＭＡ抗体は、プロテインＡクロマトグラフィーを介して精製されており、これらの精製された親単一特異性抗ＣＤ３および抗ＢＣＭＡ抗体を使用して、目的の二重特異性抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３抗体を生成した。次いで、生成された二重特異性抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３抗体は、イオン交換クロマトグラフィーを介して精製されていた。この実施例における精製作業のための出発材料として使用される抗体調製物は、目的の二重特異性抗体および種々の残存する不純物を含むイオン交換カラムからの溶出物であり、５０ｍＭのＴｒｉｓおよび６０ｍＭのグリシンのおよその濃度、ｐＨ７．５で、緩衝液／塩を有した。この抗体調製物は、８５質量％を超える目的のインタクトな二重特異性抗体を含んだ；これは、約８％のクリップ型二重特異性抗体、約１％の単一特異性抗ＢＣＭＡ親抗体、約１％の単一特異性抗ＣＤ３親抗体および約２％のタンパク質凝集体／高分子質量種（ＨＭＭＳ）もまた含んだ。従って、この方法において出発材料として使用される抗体調製物は、既に比較的純粋な目的のインタクトな二重特異性抗体を含んだが、この方法の目的は、このインタクトな二重特異性抗体の純度を増加させるための方法を開発することであった。
この作業のための出発材料は、目的の二重特異性ＩｇＧ抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３抗体ならびに種々の不純物、例えば、上に示されたものを含む抗体調製物であった。この二重特異性抗体のポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の配列番号に示される：ＢＣＭＡ重鎖：配列番号６；ＢＣＭＡ軽鎖：配列番号８；ＣＤ３重鎖：配列番号２；ＣＤ３軽鎖：配列番号４。目的の二重特異性抗体は、本明細書で以前に記載したように、２つの別々の親抗体から調製されたものであった。より具体的には、親単一特異性抗ＣＤ３および抗ＢＣＭＡ抗体は、プロテインＡクロマトグラフィーを介して精製されており、これらの精製された親単一特異性抗ＣＤ３および抗ＢＣＭＡ抗体を使用して、目的の二重特異性抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３抗体を生成した。次いで、生成された二重特異性抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３抗体は、イオン交換クロマトグラフィーを介して精製されていた。この実施例における精製作業のための出発材料として使用される抗体調製物は、目的の二重特異性抗体および種々の残存する不純物を含むイオン交換カラムからの溶出物であり、５０ｍＭのＴｒｉｓおよび６０ｍＭのグリシンのおよその濃度、ｐＨ７．５で、緩衝液／塩を有した。この抗体調製物は、８５質量％を超える目的のインタクトな二重特異性抗体を含んだ；これは、約８％のクリップ型二重特異性抗体、約１％の単一特異性抗ＢＣＭＡ親抗体、約１％の単一特異性抗ＣＤ３親抗体および約２％のタンパク質凝集体／高分子質量種（ＨＭＭＳ）もまた含んだ。従って、この方法において出発材料として使用される抗体調製物は、既に比較的純粋な目的のインタクトな二重特異性抗体を含んだが、この方法の目的は、このインタクトな二重特異性抗体の純度を増加させるための方法を開発することであった。
【0120】
結果：
クリップ型二重特異性抗体、単一特異性親抗体およびタンパク質凝集体からの目的のインタクトな抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体の効率的な精製を可能にする適切な樹脂および緩衝液条件を同定することを試みるために、複数の異なるクロマトグラフィー樹脂および条件を試験した。このプロセスの間に、例えば、複数の異なるイオン交換および疎水性相互作用樹脂、ならびに種々の緩衝液およびｐＨ条件を試験した。広範な試験の後、ヒドロキシアパタイト樹脂は、クリップ型二重特異性抗体を含む種々の不純物からのインタクトな抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体の効率的な精製を可能にできた唯一の同定された樹脂であった。
クリップ型二重特異性抗体、単一特異性親抗体およびタンパク質凝集体からの目的のインタクトな抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体の効率的な精製を可能にする適切な樹脂および緩衝液条件を同定することを試みるために、複数の異なるクロマトグラフィー樹脂および条件を試験した。このプロセスの間に、例えば、複数の異なるイオン交換および疎水性相互作用樹脂、ならびに種々の緩衝液およびｐＨ条件を試験した。広範な試験の後、ヒドロキシアパタイト樹脂は、クリップ型二重特異性抗体を含む種々の不純物からのインタクトな抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体の効率的な精製を可能にできた唯一の同定された樹脂であった。
【0121】
図３は、セラミックヒドロキシアパタイト（「ｃＨＡ」）樹脂カラムからの目的の二重特異性抗体の溶出、ならびに二重特異性抗体のクリップ型バージョン、両方の親抗体種および高分子質量タンパク質種を含む複数の異なる不純物からの目的の抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体の同時発生的な分離のクロマトグラフィープロファイルを示す。図３に示されるクロマトグラフィー実行では、ｃＨＡ樹脂上にロードされた抗体調製物を、ｃＨＡカラムからのこれらの分子の溶出の位置をより明確に同定するために、余分な親抗ＢＣＭＡおよび親抗ＣＤ３抗体をスパイクとして添加した（しかし、余分なインタクトなまたはクリップ型二重特異性抗体は添加しなかった）。図３では、Ｘ軸は、左から右に、ｃＨＡカラムからの溶出物の順序を示す（即ち、左側の材料は、右側の材料よりもより早期に／より低い塩で、ｃＨＡカラムから溶出される）。典型的には、溶出物は、カラムから逐次的な画分中に収集される；従って、Ｘ軸は、ｃＨＡ樹脂カラムからの溶出物画分の順序を示すともみなされ得る。Ｙ軸は、グラフ中に別々に示される、ＵＶ吸光度（２８０ｎＭでの）および伝導率の両方を示す。ＵＶ吸光度は、溶出したタンパク質の存在に対応し、伝導率は、溶出した材料中の塩濃度に対応する。従って、図３は、ｃＨＡ樹脂を通って流れる溶出緩衝液中の塩濃度が増加する際の、ｃＨＡ樹脂カラムからの異なるタンパク質の溶出のプロファイルを示す。図３のＵＶグラフを左から右にたどると、このグラフは、インタクトな目的の二重特異性抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３抗体または種々の不純物のいずれかに対応する種々のピークおよび肩を示す。具体的には、左から右に、第１のＵＶピークは、第１の親抗体（「親１」；単一特異性抗ＢＣＭＡホモダイマー）の溶出に対応する。次の主要ピーク（グラフ中の最も大きいピーク）の初期部分は、目的のインタクトな二重特異性抗体タンパク質（「ＰＯＩ」）に対応する。その同じ主要ピークの後期／尾の終わりは、二重特異性抗体のクリップ型バージョン（「クリップ」）に対応する。インタクトな二重特異性抗体とクリップ型二重特異性抗体との間では溶出プロファイルにいくらかの重複が存在するが、これら２つの抗体型は、二重特異性抗体のクリップ型バージョンからインタクトな二重特異性抗体を顕著に分離するために、十分に異なる塩条件および画分下でｃＨＡカラムから溶出する。最後に、二重特異性抗体のクリップ型バージョンが溶出した後、ｃＨＡカラムからの最後の主要ピーク／肩は、ｃＨＡカラムからの第２の親抗体（単一特異性抗ＣＤ３ホモダイマー）ならびに高分子質量種（「ＨＭＭＳ」）（タンパク質凝集体とも呼ばれる）の溶出に対応する。従って、図３のグラフは、インタクトな抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３抗体が、ｃＨＡ樹脂クロマトグラフィーによって、関連するクリップ型および親抗体種を含む複数の不純物から効率的に精製できることを示している。
【0122】
図４は、図３に示されるｃＨＡ溶出プロファイルに従ってｃＨＡ樹脂カラムから逐次的に溶出した画分中に存在する異なる分子種についてのより詳細な情報を示すグラフを提供する。具体的には、図４は、ｃＨＡカラムから溶出した異なる画分中の、ｉ）目的のインタクトな抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体タンパク質（「ＰＯＩ」）；ｉｉ）二重特異性抗体のクリップ型バージョン；ｉｉｉ）第１の親抗体／単一特異性抗ＢＣＭＡ抗体；ｉｖ）第２の親抗体／単一特異性抗ＣＤ３抗体；およびｖ）高分子質量種（「ＨＭＭＳ」）、の相対的な量についての詳細な情報を提供する。図４のＸ軸は、左から右に、ｃＨＡカラムからの溶出物の順序を示す（即ち、低い塩から高い塩へ；各データポイントは、カラムから溶出した画分を示す）。図４のＹ軸は、左側に、各画分中の、ｉ）目的のインタクトな抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体タンパク質（「ＰＯＩ」）；ｉｉ）二重特異性抗体のクリップ型バージョン；ｉｉｉ）第１の親抗体／単一特異性抗ＢＣＭＡ抗体；およびｉｖ）第２の親抗体／単一特異性抗ＣＤ３抗体、の各々の百分率を示す。図４のＹ軸は、右側に、各画分中の％ＨＭＭＳを示す。
【0123】
図３のデータを生成するために使用した方法を、いずれのさらなる抗体もスパイクとして添加していない抗体調製物でも使用した；このクロマトグラフィー実行からのデータは、図５に示される。従って、図５中のデータは、抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体の調製の間にイオン交換カラムから溶出された典型的な抗体調製物の、ｃＨＡ樹脂を介した精製を反映し、この抗体調製物は、目的のインタクトな抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体、ならびに二重特異性抗体のクリップ型バージョンを含む種々の不純物を主に含む。図５では、Ｘ軸は、左から右に、ｃＨＡカラムから溶出した材料の順序を示す。Ｙ軸は、グラフ中に別々に示される、ＵＶ吸光度（２８０ｎＭでの）および伝導率の両方を示す。親１および親２のピークは、図５では図３よりも小さいが、それは、図５のｃＨＡカラム上にロードされたサンプルが、さらなる親１および親２抗体をスパイクとして添加されなかったからである（一方、図３については、サンプルは、さらなる親１および親２抗体をスパイクとして添加した）。
【0124】
図６は、ｃＨＡ樹脂からの目的のインタクトな抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体の回収、ならびにｃＨＡ樹脂からの種々の溶出した画分中のクリップ型二重特異性抗体の相対的な量についてのさらなる情報を示すグラフを提供する。Ｘ軸は、左から右に、ｃＨＡカラムからの溶出物の順序を示す（即ち、低い塩から高い塩へ；各データポイントは、カラムから溶出した画分を示す）。垂直／Ｙ軸に沿って、３つの異なる変数が各画分についてプロットされる：変数１）（菱形）：クロマトグラフィー実行においてその画分までｃＨＡカラムから回収されたインタクトな抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体（即ち、目的のタンパク質）の総量である累積のインタクトな二重特異性抗体回収（「％ＰＯＩ」）（言い換えれば、その画分までのおよびその画分を含む実行の間にｃＨＡカラムから溶出された全ての材料が収集およびプールされる場合に、そのプールされた材料中のインタクトな抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体の総量が測定されるのと同様）；また、「％ＰＯＩ」値は、ｃＨＡカラム上にロードされた目的のインタクトな抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体／タンパク質の回収された総量の百分率として示される（即ち、グラムの値として示されるのではなく）。変数２）（四角）：各それぞれの画分中の、クリップ型二重特異性抗体であるタンパク質の％（「％クリップ」）。変数３）（三角）：クロマトグラフィー実行においてその画分までｃＨＡカラムから回収されたクリップ型二重特異性抗体の総量である累積クリップ型二重特異性抗体回収（「累積クリップ」）。さらに、図６のグラフでは、左側のＹ軸は、％ＰＯＩについての値を列挙し、右側のＹ軸は、％クリップについての値を列挙する。
【0125】
図６も、図６中の特定の異なる画分が、図５に示されるクロマトグラフィープロファイル中のＵＶ吸光度における異なるポイントにどのように対応するかを示す情報を含む。従って、例えば、図５は、ｃＨＡ樹脂からのＵＶ吸光度／タンパク質溶出の最も大きいピークが目的のタンパク質／インタクトな抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体に対応することを示している。ｃＨＡカラムからのＵＶ吸光度／タンパク質溶出のこの大きいピークの頂点は、実行の「Ａｐｅｘ」とも呼ばれる；このＡｐｅｘポイントに対応するクロマトグラフィー画分ピークが、図６上に示される。次いで、Ａｐｅｘピーク後の種々のポイントもまた、図６中に示される。これらのポイントは、「９０％」、「８０％」、「７０％」、「６０％」および「５０％」であり、以下のように計算される。ＡｐｅｘにおけるＵＶ吸光度値を、さらなる計算のための出発点として設定する。次いで、Ａｐｅｘ ＵＶ値の９０％であるＵＶ値を決定する。Ａｐｅｘ ＵＶ値がクロマトグラフィー実行の間に達成された後に（即ち、ピークの尾の終わりの側で）生じる９０％Ａｐｅｘ ＵＶ値は、「９０％」画分と示される；これは、本明細書で「９０％ポストピークＡｐｅｘ」画分などとも呼ばれ得る。このプロセスは、８０％、７０％、６０％および５０％値について反復される（即ち、これらの値の各々は、ピークから、尾の終わりを下った部分にあり、従って、収集された材料の量が漸増的に大きくなることに相当する）。図６が示すように、Ａｐｅｘ値の％が減少するにつれ、画分中の％クリップは増加する。これは、インタクトな抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体よりも後期の時点で／より高い塩条件下でｃＨＡカラムからクリップ型二重特異性抗体が溶出するプロセスと一致する。従って、Ａｐｅｘピークのより大きい画分が（即ち、より低い％ポストピークＡｐｅｘ画分まで）収集される場合、より多くのクリップ型二重特異性抗体もまた、インタクトな二重特異性抗体およびクリップ型二重特異性抗体の溶出プロファイル間の部分的重複に起因して収集される。
【0126】
図６からの種々の値は、以下の表１にも提供される。表１に示されるように、本明細書で提供されるｃＨＡ精製方法によれば、例えば、ｃＨＡカラムから９０％ポストピークＡｐｅｘ溶出物が収集される場合（即ち、「９０％ポストピークＡｐｅｘ」画分までのＰＯＩ％回収）、ｃＨＡカラム上にロードされた目的のインタクトな二重特異性抗体／タンパク質の５４％が回収され、この回収されたタンパク質プールは、０％のクリップ型二重特異性抗体を含む。別の例では、ｃＨＡカラムから５０％ポストピークＡｐｅｘ溶出物が収集される場合（即ち、「５０％ポストピークＡｐｅｘ」画分までのＰＯＩ％回収）、ｃＨＡカラム上にロードされた目的のインタクトな二重特異性抗体／タンパク質の７４％が回収され、この回収されたタンパク質プールは、０．２％のクリップ型二重特異性抗体を含む。従って、図６および表１に示されるように、クリップ型二重特異性抗体からの目的のインタクトな二重特異性抗体のロバストな精製が、ｃＨＡ樹脂を介して効率的に達成できる。
【0127】
【表1】
【0128】
図３～６に示されるｃＨＡクロマトグラフィー結果について、ｃＨＡクロマトグラフィーを以下のように実施した。目的の二重特異性抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３抗体および種々の不純物を含む抗体調製物を、ｃＨＡ樹脂を含むクロマトグラフィーカラム上にロードした。このｃＨＡ樹脂は、ｃＨＡ １型、４０μＭビーズサイズ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）であった。図３および４に示されるクロマトグラフィー実行では、ｃＨＡ樹脂に、３０ｇ／ＬのｃＨＡ樹脂上タンパク質密度になるように、サンプルをロードした。図５および６に示されるクロマトグラフィー実行では、ｃＨＡ樹脂に、１０ｇ／ＬのｃＨＡ樹脂上タンパク質密度になるように、サンプルをロードした。サンプルをｃＨＡ樹脂上にロードする前に、この樹脂を、５カラム容量の平衡化緩衝液１で、その後５カラム容量の平衡化緩衝液２で、事前平衡化した。この方法において記載される種々の緩衝液の組成は、以下の表２に列挙される。部分的に精製された目的の二重特異性抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３抗体を含む抗体調製物を、およそ５０ｍＭのＴｒｉｓおよび６０ｍＭのグリシンを含むロード緩衝液、ｐＨ７．５中で、ｃＨＡ樹脂カラム上にロードした。抗体調製物をｃＨＡ樹脂カラム上にロードした後、カラムを、３カラム容量の洗浄緩衝液で洗浄した。次いで、目的の二重特異性抗体（即ち、インタクトな二重特異性抗体）を、２０カラム容量の溶出緩衝液を使用してｃＨＡ樹脂から溶出させ、このとき、溶出緩衝液中のリン酸ナトリウム濃度は、溶出の過程にわたって、４０ｍＭから８０ｍＭまで増加した。図３～６に示されるように、目的の二重特異性抗体と共に抗体調製物中に存在した種々の不純物もまた、溶出緩衝液に応じてｃＨＡカラムから溶出したが、これらは、インタクトな二重特異性抗体が、インタクトな二重特異性抗体のクリップ型バージョンを含む種々の不純物から効率的に分離できるように、目的のインタクトな抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３二重特異性抗体とは十分に異なる塩濃度下で溶出する。
【0129】
目的のタンパク質を上記プロトコールに従って溶出緩衝液によってｃＨＡ樹脂カラムから溶出させた後、次いで、このｃＨＡ樹脂は、５カラム容量のストリップ緩衝液によってストリップされ得、その後５カラム容量の清浄化緩衝液によって清浄化され得、その後５カラム容量の貯蔵緩衝液が続き得る。
【0130】
ｃＨＡカラムから溶出した異なる材料の上記分析の各々について、種々の画分／プール中の異なる分子種の型および量を、分析的カチオン交換（ＣＥＸ）分析によって決定した。
【0131】
【表2】
【0132】
（実施例２）
ｃＨＡ樹脂クロマトグラフィーによる抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の精製－質量ローディングチャレンジ
目的：
この実施例における目的は、実施例１に記載される二重特異性抗体精製方法が、種々のｃＨＡ樹脂カラム質量ローディングチャレンジで効率的に使用できるかどうかを決定することであった。例えば、具体的な目的は、ｃＨＡ樹脂カラム上での種々の質量ローディングチャレンジについて、これが、回収された精製された二重特異性抗体産物中に不純物として１％以下のクリップ型二重特異性抗体を同時に有しつつ、インプット二重特異性抗体の５０％よりも多くを一貫して回収することが可能かどうかを決定することであった。
ｃＨＡ樹脂クロマトグラフィーによる抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の精製－質量ローディングチャレンジ
目的：
この実施例における目的は、実施例１に記載される二重特異性抗体精製方法が、種々のｃＨＡ樹脂カラム質量ローディングチャレンジで効率的に使用できるかどうかを決定することであった。例えば、具体的な目的は、ｃＨＡ樹脂カラム上での種々の質量ローディングチャレンジについて、これが、回収された精製された二重特異性抗体産物中に不純物として１％以下のクリップ型二重特異性抗体を同時に有しつつ、インプット二重特異性抗体の５０％よりも多くを一貫して回収することが可能かどうかを決定することであった。
【0133】
材料および方法：
この実施例のための材料および方法は、ｃＨＡ樹脂に、（異なるクロマトグラフィー実行において）８ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌまたは１２ｇ／ＬのｃＨＡ樹脂上タンパク質密度になるように抗体調製物サンプルをロードしたこと以外、実施例１と同じであった。
この実施例のための材料および方法は、ｃＨＡ樹脂に、（異なるクロマトグラフィー実行において）８ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌまたは１２ｇ／ＬのｃＨＡ樹脂上タンパク質密度になるように抗体調製物サンプルをロードしたこと以外、実施例１と同じであった。
【0134】
結果：
これらのクロマトグラフィー実行からの結果を、以下の表３にまとめる。３つ全てのクロマトグラフィー実行では、９０％ポストピークＡｐｅｘ材料（実施例１に記載されるとおり）を収集および分析した。表３に示されるように、８ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌおよび１２ｇ／Ｌの質量チャレンジの各々について、５０％を超えるロードされたインタクトな二重特異性抗体が、精製された二重特異性抗体として回収され、回収された精製された二重特異性抗体産物は、不純物として１％未満のクリップ型二重特異性抗体を含んだ。
これらのクロマトグラフィー実行からの結果を、以下の表３にまとめる。３つ全てのクロマトグラフィー実行では、９０％ポストピークＡｐｅｘ材料（実施例１に記載されるとおり）を収集および分析した。表３に示されるように、８ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌおよび１２ｇ／Ｌの質量チャレンジの各々について、５０％を超えるロードされたインタクトな二重特異性抗体が、精製された二重特異性抗体として回収され、回収された精製された二重特異性抗体産物は、不純物として１％未満のクリップ型二重特異性抗体を含んだ。
【0135】
従って、これらの実験は、目的のインタクトな二重特異性抗体が、種々のｃＨＡ樹脂質量ローディングチャレンジにおいて、ｃＨＡ樹脂クロマトグラフィーによってクリップ型二重特異性抗体から一貫して効率的に分離できることを示している。
【0136】
【表3】
【0137】
（実施例３）
ｃＨＡ樹脂クロマトグラフィーによる抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の精製－異なるｐＨチャレンジ
目的：
この実施例における目的は、実施例１に記載される二重特異性抗体精製方法が、異なるｐＨ条件下で効率的に機能できるかどうかを決定することであった。
ｃＨＡ樹脂クロマトグラフィーによる抗ＢＣＭＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体の精製－異なるｐＨチャレンジ
目的：
この実施例における目的は、実施例１に記載される二重特異性抗体精製方法が、異なるｐＨ条件下で効率的に機能できるかどうかを決定することであった。
【0138】
材料および方法：
この実施例のための材料および方法は、この方法を通じて使用される緩衝液のｐＨが（異なるクロマトグラフィー実行において）ｐＨ７．０、ｐＨ７．５またはｐＨ８．０であったこと以外、実施例１と同じであった。これらのクロマトグラフィー実行のために、ｃＨＡ樹脂に、３０ｇ／ＬのｃＨＡ樹脂上タンパク質密度になるように、抗体調製物サンプルをロードした。
この実施例のための材料および方法は、この方法を通じて使用される緩衝液のｐＨが（異なるクロマトグラフィー実行において）ｐＨ７．０、ｐＨ７．５またはｐＨ８．０であったこと以外、実施例１と同じであった。これらのクロマトグラフィー実行のために、ｃＨＡ樹脂に、３０ｇ／ＬのｃＨＡ樹脂上タンパク質密度になるように、抗体調製物サンプルをロードした。
【0139】
結果：
これらのクロマトグラフィー実行からの結果を、以下の表４にまとめる。３つ全てのクロマトグラフィー実行では、ピークＡｐｅｘ材料（実施例１に記載されるとおり）を収集および分析した。表４に示されるように、目的のインタクトな二重特異性抗体タンパク質が、異なる試験したｐＨ条件の各々について首尾よく回収され、ｐＨ７．５が、目的のタンパク質の最も高い回収を生じた（これらのクロマトグラフィー実行では、精製された材料中のクリップ型二重特異性抗体の量を別々に決定することはしなかった）。
これらのクロマトグラフィー実行からの結果を、以下の表４にまとめる。３つ全てのクロマトグラフィー実行では、ピークＡｐｅｘ材料（実施例１に記載されるとおり）を収集および分析した。表４に示されるように、目的のインタクトな二重特異性抗体タンパク質が、異なる試験したｐＨ条件の各々について首尾よく回収され、ｐＨ７．５が、目的のタンパク質の最も高い回収を生じた（これらのクロマトグラフィー実行では、精製された材料中のクリップ型二重特異性抗体の量を別々に決定することはしなかった）。
【0140】
従って、これらの実験は、目的のインタクトな二重特異性抗体が、異なるｐＨ条件においてｃＨＡ樹脂クロマトグラフィーによって効率的に精製できることを示している。
【0141】
【表4】
【0142】
（実施例４）
ｃＨＡ樹脂クロマトグラフィーによる抗ＦＬＴ３／抗ＣＤ３二重特異性抗体の精製
目的：
この実施例の目的は、実施例１に記載される二重特異性抗体精製方法が、実施例１で使用されたものとは異なる二重特異性抗体を用いて効率的に実施できるかどうかを決定することであり、このとき、類似の質量の関連するクリップ型二重特異性抗体を含む種々の不純物から目的のインタクトな二重特異性抗体を分離することも必要であった。この実施例では、目的の抗体は、ヘテロダイマー性二重特異性抗ＦＬＴ３／抗ＣＤ３抗体であった。
ｃＨＡ樹脂クロマトグラフィーによる抗ＦＬＴ３／抗ＣＤ３二重特異性抗体の精製
目的：
この実施例の目的は、実施例１に記載される二重特異性抗体精製方法が、実施例１で使用されたものとは異なる二重特異性抗体を用いて効率的に実施できるかどうかを決定することであり、このとき、類似の質量の関連するクリップ型二重特異性抗体を含む種々の不純物から目的のインタクトな二重特異性抗体を分離することも必要であった。この実施例では、目的の抗体は、ヘテロダイマー性二重特異性抗ＦＬＴ３／抗ＣＤ３抗体であった。
【0143】
材料および方法：
この実施例で使用したヘテロダイマー性二重特異性抗ＦＬＴ３／抗ＣＤ３抗体は、実施例１と同じ抗ＣＤ３重鎖および軽鎖を含んだ。この二重特異性抗体のＦＬＴ３アーム中のポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の配列番号に示される：ＦＬＴ３重鎖：配列番号１０；ＦＬＴ３軽鎖：配列番号１２。
この実施例で使用したヘテロダイマー性二重特異性抗ＦＬＴ３／抗ＣＤ３抗体は、実施例１と同じ抗ＣＤ３重鎖および軽鎖を含んだ。この二重特異性抗体のＦＬＴ３アーム中のポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の配列番号に示される：ＦＬＴ３重鎖：配列番号１０；ＦＬＴ３軽鎖：配列番号１２。
【0144】
この実施例における二重特異性抗体のクリップ型バージョンは、抗ＣＤ３重鎖の、実施例１に記載されるのと同じ位置に、クリップを有した。
【0145】
この実施例のための材料および方法は、上記したように、抗体調製物サンプルが二重特異性抗ＦＬＴ３／抗ＣＤ３抗体を含んだこと以外、実施例１と同じであった。ｃＨＡ樹脂に、１０ｇ／ＬのｃＨＡ樹脂上タンパク質密度になるように、抗体調製物サンプルをロードした。
【0146】
結果：
図７は、ｃＨＡ樹脂からの目的のインタクトな二重特異性抗ＦＬＴ３／ＣＤ３抗体の回収、ならびにｃＨＡ樹脂からの種々の溶出した画分中のクリップ型二重特異性抗体の相対的な量についての情報を提供するグラフを示す。Ｘ軸は、左から右に、ｃＨＡカラムからの溶出物の順序を示す（即ち、低い塩から高い塩へ；各データポイントは、カラムから溶出した画分を示す）。垂直／Ｙ軸に沿って、３つの異なる変数が各画分についてプロットされる：変数１）（菱形）：％ＰＯＩ；変数２）（四角）：％クリップ；および変数３）（三角）：累積クリップ、これらの各々は、図６について実施例１に記載したように決定した。さらに、図７のグラフでは、左側のＹ軸は、％ＰＯＩについての値を列挙し、右側のＹ軸は、％クリップについての値を列挙する。図７はまた、図７中の特定の異なる画分が、対応するクロマトグラフィープロファイル（示さず）中のＵＶ吸光度における異なるポイントにどのように対応するかを示す情報を含む。「Ａｐｅｘ」、「８５％」および「６０％」として示されるポイントは、図６について記載したのと同じ方法で決定した。
図７は、ｃＨＡ樹脂からの目的のインタクトな二重特異性抗ＦＬＴ３／ＣＤ３抗体の回収、ならびにｃＨＡ樹脂からの種々の溶出した画分中のクリップ型二重特異性抗体の相対的な量についての情報を提供するグラフを示す。Ｘ軸は、左から右に、ｃＨＡカラムからの溶出物の順序を示す（即ち、低い塩から高い塩へ；各データポイントは、カラムから溶出した画分を示す）。垂直／Ｙ軸に沿って、３つの異なる変数が各画分についてプロットされる：変数１）（菱形）：％ＰＯＩ；変数２）（四角）：％クリップ；および変数３）（三角）：累積クリップ、これらの各々は、図６について実施例１に記載したように決定した。さらに、図７のグラフでは、左側のＹ軸は、％ＰＯＩについての値を列挙し、右側のＹ軸は、％クリップについての値を列挙する。図７はまた、図７中の特定の異なる画分が、対応するクロマトグラフィープロファイル（示さず）中のＵＶ吸光度における異なるポイントにどのように対応するかを示す情報を含む。「Ａｐｅｘ」、「８５％」および「６０％」として示されるポイントは、図６について記載したのと同じ方法で決定した。
【0147】
図７からの種々の値もまた、以下の表５に提供される。表５に示されるように、本明細書で提供されるｃＨＡ樹脂精製方法は、例えば、精製された抗体産物中に１％未満のクリップ型二重特異性抗体を有しながらの、８０％を超える目的のインタクトな二重特異性抗ＦＬＴ３／ＣＤ３抗体の回収を可能にする。
【0148】
従って、図７および表５に示されるように、クリップ型二重特異性抗体からのインタクトな二重特異性抗ＦＬＴ３／ＣＤ３の精製は、ｃＨＡ樹脂を介して効率的に達成できる。
【0149】
【表5】
【0150】
開示された教示は、種々の適用、方法、キットおよび組成物に関連して記載されてきたが、種々の変化および改変が、本明細書の教示および以下の特許請求した発明から逸脱することなしになされ得ることが理解されよう。上述の実施例は、開示された教示をよりよく説明するために提供されるのであって、本明細書に提示された教示の範囲を限定することは意図しない。本明細書の教示は、これらの例示的な実施形態に関して記載されてきたが、当業者は、これらの例示的な実施形態の多数のバリエーションおよび改変が過度の実験なしに可能であることを容易に理解するであろう。全てのかかるバリエーションおよび改変は、本明細書の教示の範囲内である。
【0151】
特許、特許出願、論文、教科書などを含む本明細書で引用された全ての参考文献、およびそれらの中で引用された参考文献は、それらがまだ組み込まれていない範囲で、それらの全体が本明細書で参照によって組み込まれる。定義された用語、用語の用法、記載された技術などが含まれるがこれらに限定されない、組み込まれた文献および同様の資料のうち１つまたは複数が本出願とは異なるまたは本出願と矛盾する場合には、本出願が優先される。
【0152】
上述の説明および実施例は、本発明の特定の具体的な実施形態を詳述し、本発明者らが企図する最良の形態を記載している。しかし、上述がどれほど詳細にテキスト中に書かれようとも、本発明が多くの方法で実施され得ること、および本発明が添付の特許請求の範囲およびその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されよう。
【0153】
実施形態が言葉「含む」を用いて本明細書のどこに記載されようとも、「～からなる」および／または「～から本質的になる」という用語で記載される他の同様の実施形態もまた提供されることが理解される。
【0154】
本発明の態様または実施形態がマーカッシュ群または選択肢の他の群化の観点から記載される場合、本発明は、全体として列挙された群全体だけでなく、群の各メンバー個々に、および主要な群の全ての可能な下位群、群のメンバーのうち１つまたは複数が存在しない主要な群もまた包含する。本発明は、特許請求された発明中の群メンバーのいずれかのうち１つまたは複数の明示的な排除もまた想定する。
【0155】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。本明細書および特許請求の範囲を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのバリエーションは、示された整数または整数の群を含むことを意味するが、任意の他の整数または整数の群を排除することを意味しないと理解される。文脈が他を要求しない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。用語「例えば（ｅ．ｇ．）」または「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」の後の任意の例（複数可）は、網羅的でも限定的でもないことを意味する。用語「または」は、複数の選択肢の列挙との関連で使用される場合（例えば、「Ａ、ＢまたはＣ」）、文脈が明確に他を示さない限り、これらの選択肢の任意の１つまたは複数を含むと解釈するものとする。
【0156】
例示的な方法および材料が本明細書に記載されているが、本明細書に記載されるものと類似または等価な方法および材料もまた、本発明の実施または試験において使用され得る。材料、方法および例は、例示に過ぎず、限定を意図しない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】