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特許7449588テロメアを伸長するための組成物

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-06

(45)【発行日】2024-03-14

(54)【発明の名称】テロメアを伸長するための組成物

(51)【国際特許分類】

A61K 36/185 20060101AFI20240307BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20240307BHJP

A23L 33/105 20160101ALI20240307BHJP

【ＦＩ】

A61K36/185

A61P43/00 111

A61P43/00 105

A23L33/105

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2021546936

(86)(22)【出願日】2020-09-16

(86)【国際出願番号】 JP2020035121

(87)【国際公開番号】W WO2021054373

(87)【国際公開日】2021-03-25

【審査請求日】2023-07-28

(31)【優先権主張番号】P 2019171916

(32)【優先日】2019-09-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用令和２年２月７日に発行されたＡＮＴＩＯＸＩＤＡＮＴＳ，（２０２０），９，［２］，Ａｒｔｉｃｌｅ．１４４＜ＤＯＩ：１０．３３９０／ＡＮＴＩＯＸ９０２０１４４＞に公表

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用令和２年４月１日に発行されたＥＵＲ．Ｊ．ＴＲＡＮＳＬ．ＭＹＯＬ．，（２０２０），３０，［１］，ｐ．０５８－０６１に公表

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用令和２年４月２７日に発行された大里研究所「ＦＰＰ（パパイヤ発酵食品）のご紹介」に公表

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】509233644

【氏名又は名称】株式会社大里インターナショナル

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100140888

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺欣乃

(72)【発明者】

【氏名】林幸泰

(72)【発明者】

【氏名】ファイスステファノ

(72)【発明者】

【氏名】ロゴッツィマリアントニア

【審査官】柴原直司

(56)【参考文献】

【文献】特許第６４０１７９２（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】特開２００６－０７５０８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／０９３１０４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Cancers(Basel)，2019年01月，11, [1]，Article.118，<doi:10.3390/cancers11010118>

【文献】Expert Rev. Clin. Pharmacol.，2018年，11, [6]，p.545-547

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ３６／００－３６／９０６８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

パパイヤ発酵食品のみを有効成分として含有し、前記パパイヤ発酵食品は、ＦＰＰＦｅｒｍｅｎｔｅｄＰａｐａｙａＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（登録商標）、又はＩｍｍｕｎ’Ａｇｅ（登録商標）のパパイヤ発酵食品である、テロメアを伸長するための組成物。

【請求項2】

前記パパイヤ発酵食品が、パパイヤの酵母発酵食品である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記パパイヤ発酵食品の１００ｇ中、９１．２ｇの炭水化物を含む、請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項4】

加齢によるテロメア短縮を抑制する、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

テロメラーゼ活性を向上させる、請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項6】

生殖細胞又は幹細胞におけるテロメラーゼ活性を向上させる、請求項３に記載の組成物。

【請求項7】

医薬組成物又は食品組成物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

パパイヤ発酵食品の用量が、体重７０ｋｇの成人に対して０．５～３０ｇ／日である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、パパイヤ発酵食品を有効成分として含有する、テロメアを伸長するための組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

カリカパパイヤ（ＣａｒｉｃａｐａｐａｙａＬｉｎｎ）の未熟果を糖と共に食用酵母菌で発酵させることにより製造されるパパイヤ発酵食品（ＦｅｒｍｅｎｔｅｄＰａｐａｙａＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ；ＦＰＰ）は、唾液と混ぜ合わせることにより水と混ぜ合わせる場合に比べ、マルトースとマルトトリオースが増加するものである。

【0003】

ＦＰＰの経口摂取により、オリゴ糖が増加し腸内環境を整える働きが期待され、２型糖尿病患者の血糖値の上昇抑制、エネルギー代謝の向上、並びに、免疫を高めることによる創傷の治癒促進も期待されている（特許文献１～３）。ＦＰＰはまた、抗酸化特性を有し、加齢に伴う諸症状に対する効果を得られることで知られている（非特許文献１）。

【0004】

ＦＰＰは、アミノ酸と糖質に富み、免疫系に働きかけ良い活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を促進し、悪いＲＯＳを消去し、抗酸化剤として作用することが報告されており、加えて、２型糖尿病患者の「呼吸バースト」機能を改善することができる（特許文献４、５）。また、ＦＰＰは特に創傷部のマクロファージの応答に続いて血管新生応答に作用することにより、糖尿病性創傷転帰を改善する可能性があることも報告されている（非特許文献２）。

【0005】

本発明者らは、Ｂ１６メラノーマ細胞を接種した正常免疫能マウスモデル（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）を用い、メラノーマの予防と治療におけるＦＰＰ（登録商標、大里研究所）経口摂取の効果を調査した結果、ＦＰＰは腫瘍のサイズをコントロールし、これは血中のＲＯＳレベルの低下及び天然の抗酸化物質（ＧＳＨ及びＳＯＤ－１）の血漿レベルの上昇と一致したことが分かった（非特許文献３）。また、ＦＰＰを摂取したマウスではいずれも転移が起こらなかった。非特許文献３の結果は、ＦＰＰが生体の自然な抗酸化システムを活性化することで、その結果腫瘍の増殖の予防及び抑制に寄与し得る可能性を強く示唆するものである。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】特開２０１１－０４１４７８号公報

【文献】国際公開２０１６－０２７３３４号

【文献】国際公開２０１６－０２７３３３号

【文献】国際公開２０１６－０２７３３４号

【非特許文献】

【0007】

【文献】Aruoma O.I.ら、Applications and bioefficacy of thefunctional food supplement fermented papaya preparation. Toxicology 278: 6-16,2010.

【文献】Aruoma,O.I.ら、Diabetes as a risk factor to cancer: Functional roleof fermented papaya preparation as phytonutraceutical adjunct in the treatmentof diabetes and cancer. Mutat. Res./Fundam. Mol. Mech. Mutagen. 2014, 768, 60-68

【文献】Logozzi Mら、Oral Administration of Fermented Papaya (FPP) Controls the Growth ofa Murine Melanoma through the In Vivo Induction of a Natural AntioxidantResponse. Cancers (Basel). 2019 Jan 20;11(1)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、パパイヤ発酵食品の新たな用途を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、マウスに対するＦＰＰの経口投与の結果、血漿中の総抗酸化能及びテロメラーゼ活性が向上し、幹細胞及び生殖細胞でのテロメアの長さも増加したことが分かった。

【0010】

すなわち、本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
パパイヤ発酵食品を有効成分として含有する、テロメアを伸長するための組成物。
［２］
加齢によるテロメア短縮を抑制する、［１］に記載の組成物。
［３］
テロメラーゼ活性を向上させる、［１］又は［２］に記載の組成物。
［４］
生殖細胞又は幹細胞におけるテロメラーゼ活性を向上させる、［３］に記載の組成物。
［５］
細胞老化を抑制する、［１］～［４］のいずれかに記載の組成物。
［６］
個体の老化を抑制する、［５］に記載の組成物。
［７］
医薬組成物又は食品組成物である、［１］～［６］のいずれかに記載の組成物。
［８］
パパイヤ発酵食品の用量が、体重７０ｋｇの成人に対して０．５～３０ｇ／日である、［１］～［７］のいずれかに記載の組成物。
［９］
パパイヤ発酵食品の有効量を、これを必要とする患者に投与することを含む、テロメアを伸長するための方法。
［１０］
加齢によるテロメア短縮を抑制する、［９］の方法。
［１１］
テロメラーゼ活性を向上させる、［９］の方法。
［１２］
生殖細胞又は幹細胞におけるテロメラーゼ活性を向上させる、［１１］に記載の方法。
［１３］
細胞老化を抑制する、［９］の方法。
［１４］
個体老化を抑制する、［９］の方法。
［１５］
テロメアを伸長するための食品組成物又は医薬組成物における、パパイヤ発酵食品の使用。

【発明の効果】

【0011】

本発明の組成物によれば、テロメアを伸長することができ、日常的な摂取により抗老化効果が期待できる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】実施例１のマウス血漿中の総抗酸化能（Ａ）及びテロメラーゼ活性（Ｂ）の結果を示す図である。

【図2】実施例１のマウス骨髄（Ａ）及び卵巣（Ｂ）から採取した細胞のテロメアの長さを計測した結果を示す図である。

【図3】実施例２のマウス血漿中のテロメラーゼ活性の結果を示す図である。

【図4】実施例２のマウス血漿中の総抗酸化能の結果を示す図である。

【図5】実施例２のマウス血漿中のグルタチオンの結果を示す図である。

【図6】実施例３のＥＴ－ＦＰＰ群のマウスのテロメラーゼ活性の結果を示す図である（＊＊ｐ＜０．００５）。

【図7】実施例３のＥＴ－ＦＰＰ群のマウス骨髄（Ａ）及び卵巣（Ｂ）から採取した細胞のテロメアの長さを計測した結果を示す図である（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

【図8】実施例３のＬＴ－ＦＰＰ群のマウスのテロメラーゼ活性の結果を示す図である（＊ｐ＜０．０５）。

【図9】実施例３のＬＴ－ＦＰＰ群のマウス骨髄（Ａ）及び卵巣（Ｂ）から採取した細胞のテロメアの長さを計測した結果を示す図である（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０００５）。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本実施形態に係る組成物は、パパイヤ発酵食品を有効成分として含有する、テロメアを伸長するための組成物である。

【0014】

本発明の組成物は、パパイヤ発酵食品（ＦＰＰ）を有効成分として含有する。ＦＰＰは、上述のように、カリカパパイヤ（ＣａｒｉｃａｐａｐａｙａＬｉｎｎ）の未熟果を糖と共に食用酵母菌で発酵させることにより製造されるパパイヤ由来の発酵製品である。

【0015】

ＦＰＰは、大里研究所により開発され、株式会社大里ラボラトリーが製造し、株式会社大里インターナショナルが販売するものであることが好ましい（特許文献１、非特許文献８）。当該ＦＰＰは、「ＦＰＰＦｅｒｍｅｎｔｅｄＰａｐａｙａＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」（登録商標）、又は「Ｉｍｍｕｎ’Ａｇｅ」（登録商標）として入手できる。当該ＦＰＰは、ＩＳＯ９００１：２０１５、ＩＳＯ１４００１：２０１５、ＩＳＯ２２０００：２００５の認証を受け、欧米で最も厳しい食品安全規格であるＦＳＳＣ２２０００をＪＩＡ国内第一号で取得した工場で生産されており品質面、環境面及び安全面で保証がされている。

【0016】

ＦＰＰの製造方法は、例えば特許文献１に記載されている。一例として、ハワイ州で栽培されたカリカパパイヤを約１０ヶ月間食用酵母で発酵させることによって製造される。ＦＰＰは、日本食品分析センターによる分析では、ＦＰＰ１００ｇ中９１．２ｇが炭水化物であり、他に少量のタンパク質（０．３ｇ）、脂質（０．１ｇ未満）、カリウム（１４．９ｍｇ）及び水分（８．５ｇ）が含まれている（ロットＮｏ．０９１；２０１４年５月２７日付け分析試験成績書）。

【0017】

テロメアは、末端小粒ともいい、真核生物の染色体の末端部にある特徴的な繰り返し配列（反復配列）を持つＤＮＡと様々なタンパク質からなる構造を有し、染色体末端を保護する役割を担っている。テロメアはその特異な構造により、ＤＮＡの分解や修復から染色体を保護し、物理的及び遺伝的な安定性を保つことができる。テロメアを欠いた染色体は、細胞によって異常なＤＮＡ末端と見なされ、酵素による分解や、修復機構による染色体末端どうしの異常な融合が起こる。このような染色体の不安定化は細胞死や発癌の原因となる。また、分裂ができない状態又は染色体が不安定な状態の内皮細胞が、動脈硬化等の加齢による脳・心の血管障害、生活習慣病を誘発する可能性があることが示唆されている。

【0018】

テロメアの伸長はテロメラーゼ（ＴＥ）によって行われる。テロメラーゼ（ＴＥ）は、染色体末端のテロメアにＤＮＡの反復配列を付加する酵素である。ＤＮＡ複製のたびにテロメアは短縮するが、テロメラーゼの役割はその完全性を維持することである。テロメラーゼがない細胞では、細胞分裂ごとにテロメアの短縮が進み、やがてヘイフリック限界（分裂回数の限界）と呼ばれる細胞分裂の停止が起き、細胞老化と呼ばれる状態になる。テロメラーゼはヒトの体細胞では発現していないか、弱い活性しか持たない。そのため、ヒトの体細胞を取り出して培養すると、テロメアの短縮が起こる。テロメラーゼ活性とテロメアの長さは現在、老化の分子的特徴と考えられている。また、テロメラーゼは、ヒトでは生殖細胞、幹細胞、ガン細胞などでの活性が認められ、それらの細胞が分裂を継続できる性質に関与している。そのため、テロメラーゼの活性を抑制することによる癌治療、活性を高めることによる細胞分裂寿命の延長の両方から注目されている。

【0019】

テロメア短縮による細胞の老化が、個体の老化の原因となることが示唆されているが、その関連性の解明に至っていない。しかしながら、テロメア短縮の抑制は、細胞寿命の延長、ひいては個体の老化の遅延、寿命の延長につながると期待されている。また、テロメア短縮による細胞の老化が、癌や生活習慣病を誘発する可能性があることから、テロメア短縮の抑制は癌、脳・心の血管障害、生活習慣病の予防につながると期待されている。

【0020】

本明細書においてテロメアを伸長すること（テロメアの伸長）は、テロメアの長さを増加すること（テロメア増長）と、テロメアの長さの短縮（テロメア短縮）を抑制することの両方を含む。テロメア増長は、例えばテロメラーゼ活性の向上によってテロメアの長さを伸ばすことを含む。ＦＰＰは、後述のイン・ビボの実施例によって生殖細胞及び幹細胞においてテロメラーゼ活性を向上させることが証明されており、生殖細胞及び幹細胞の寿命を延ばすこと、また、生殖寿命（生殖できる期間）の延長も予測される。

【0021】

テロメア短縮は、例えば細胞分裂に起因するテロメアの長さの減少を含み、テロメア短縮が抑制された場合、テロメア短縮が抑えられ、特に加齢によるテロメア短縮が抑制され、テロメア短縮が抑制されない通常の細胞に比べてテロメアの長さが長い。テロメア短縮が細胞の老化が繋がるため、テロメア短縮の抑制は細胞老化を抑制できる。そのため、テロメア短縮が抑制されない通常の細胞に比べて細胞の寿命が長い。そのため、個体の老化も抑制され、個体の寿命を延ばし得る。

【0022】

テロメアの長さの測定は、既知の方法によって行うことができる。例えば、実施例３に記載のフローサイトメトリー用の、ＴｅｌｏｍｅｒｅＰＮＡＫｉｔ／ＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ－Ａｇｉｌｅｎｔ、ＳａｎｔａＣｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用することによって測定することができる。

【0023】

テロメラーゼ活性の測定は、既知の方法によって行うことができる。例えば、実施例３に記載のＥＬＩＳＡキット（Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を用いた比色サンドイッチ－ＥＬＩＳＡアッセイによって測定することができる。

【0024】

本実施形態における組成物は、医薬組成物であっても食品組成物であってもよい。上述したように、パパイヤ発酵食品の大部分は炭水化物であり、他に少量のタンパク質が含まれているため、安全性が非常に高い。そのため、パパイヤ発酵食品の使用量は特に限定されず、例えば、体重７０ｋｇの成人に対して０．５～３０ｇ／日であればよく、好ましくは１～２０ｇ／日、さらに好ましくは３～１５ｇ／日又は９ｇ～３０ｇ／日、最も好ましくは３～９ｇ／日、６～９ｇ／日又は９～１５ｇ／日である。

【0025】

本実施形態における組成物は、年齢を問わずいつでも摂取することができるが、テロメアの伸長の観点から、若年層及び中年層で摂取するのがより効果的である。例えば、１３歳～６０歳、１３歳～５０歳、１３歳～４０歳、１３歳～３０歳、１３歳～２５際、又は１３歳～２０歳の間に摂取し始めるのが好ましく、例えば、１３歳、１５歳、１８歳、２０歳から摂取することが好ましい。安全の観点から１歳未満の幼児、３歳未満の幼児又は５歳未満の幼児は、医師又は薬剤師の助言又は処方に基づいて摂取することが好ましい。また、摂取期間はテロメアの伸長の観点から、１ヵ月以上、２ヶ月以上、６ヶ月以上、１年以上、３年以上、５年以上、１０年以上、１５年以上、２０年以上、２５年以上、３０年以上、３５年以上、４０年以上、又は４５年以上が好ましい。

【0026】

パパイヤ発酵食品は、経口摂取に適するよう顆粒剤、散剤、細粒剤など種々の形態に適宜調製することができ、パパイヤ発酵食品を有効成分として含むほか、調製に際し、添加剤、例えば賦形剤、結合剤、滑沢剤など適宜加えることができる。

【0027】

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【実施例】

【0028】

＜実施例１＞
老化研究に適したマウスモデル（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、雌）を、摂取群及び対照群にそれぞれ１５匹ずつ用いた。摂取群には、水道水に溶かしたＦＰＰ（登録商標、大里研究所、日本）（３ｇＦＰＰ／５００ｍＬ）を生後４週間から１０ヶ月間毎日与え、自由摂取させた。対照群には、水道水のみを与えた。ＦＰＰ水溶液及び水道水は毎日新しいものに交換した。

【0029】

経口摂取１０ヶ月後、血液を採取し、マウスを屠殺したのち、脛骨の骨髄及び卵巣を採取した。マウス血漿中の総抗酸化能及びテロメラーゼ活性、並びに骨髄幹細胞及び卵巣胚細胞（生殖細胞）のテロメアの長さの確認実験を行った。血液から血漿を分離し、各血漿サンプルについてＰＡＯアッセイキットを用いて抗酸化能を測定し、テロメラーゼＥＬＩＳＡキットを用いてテロメラーゼ活性を測定した。骨髄から幹細胞を分離するために生理食塩水を用い、卵巣から生殖細胞を分離するためにトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて、それぞれ細胞懸濁液を作成し、セルストレーナーで処置した。骨髄及び卵巣のそれぞれの単一細胞懸濁液に対して、ＴｅｌｏｍｅｒｅＰＮＡＫｉｔ／ＦＩＴＣを用い、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ；登録商標）によってテロメアの長さを測定した。それぞれのキットの使用に際して、指示書とおりに行った。

【0030】

各測定値について、１５匹マウスの平均値を算出した。総抗酸化能の結果は図１の（Ａ）に示し、テロメラーゼ活性の結果は図１の（Ｂ）に示した。図１から、試験終了時、ＦＰＰを摂取したマウスは摂取していない対照マウスに比べて、血漿中の総抗酸化能は約２倍であり、テロメラーゼ活性は約３倍であったことが分かった。

【0031】

骨髄幹細胞のテロメアの長さの測定結果は図２の（Ａ）、卵巣胚細胞のテロメアの長さの測定結果は図２の（Ｂ）にそれぞれ示した。図２から、試験終了時（１０ヶ月）、ＦＰＰを摂取したマウスは摂取していない対照マウスに比べて、幹細胞及び生殖細胞の両方の細胞においてテロメアの長さが約３倍になったことが分かった。

【0032】

これらの結果から、ＦＰＰは抗酸化反応を誘導し、テロメラーゼ活性を向上させ、テロメアの長さを増加させることができることが分かった。このことは、ＦＰＰは老化に関する生物学的指標の明らかな改善をもたらすこと、そして老化を予防し得ることが示唆されている。また、ＦＰＰは生殖期間を引き延ばすであろうと予測できる。さらに、上記作成した骨髄及び卵巣のそれぞれの単一細胞懸濁液を用いて、細胞数を数えた結果、ＦＰＰを摂取したマウスは摂取していない対照マウスに比べて、両方器官における細胞数が約２倍となった。

【0033】

＜実施例２＞
生後１０ヶ月の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ヒトの約５０歳相当）３０匹に、実施例１と同様の条件で２０ヶ月になるまで、ＦＰＰの水溶液を毎日経口摂取させた。対照群は、水道水のみを与えた。

【0034】

経口摂取１０ヶ月後（２０ケ月齢）、血液を採取した。マウス血漿中のテロメラーゼ活性、総抗酸化能及び総グルタチオンの確認実験を行った。テロメラーゼ活性及び総抗酸化能の測定は、実施例１と同様に行った。総グルタチオンの測定はＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＣｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃＤｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、指示書とおりに行った。

【0035】

各測定値について、３０匹マウスの平均値を算出した。テロメラーゼ活性の結果は図３、総抗酸化能の結果は図４、総グルタチオンの結果は図５にそれぞれ示した。図３～５から、試験終了時、ＦＰＰを摂取したマウスは摂取していない対照マウスに比べて、血漿中のテロメラーゼ活性、総抗酸化能及び総グルタチオンは約３倍であったことが分かった。高齢のマウスにおいても抗老化効果があることを裏付けられた。すなわち、ＦＰＰは若齢時から摂取しても老齢から摂取しても、抗老化効果が期待できることが示唆されている。

【0036】

＜実施例３＞
（実験材料）
性別に依存しない骨髄及び性別に依存する卵巣の両方から利用可能な細胞を得るために、雌マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）を用いた。すべての実験は、イタリア国立衛生研究所（イタリア、ローマ）の倫理委員会によって承認され、イタリアの法律（法律２６／２０１４）に従って実施された。４０匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス（１６～２０ｇ、４週齢）をチャールズ・リバー・ラボラトリーズ（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｔａｌｉａｓ．ｒ．ｌ．、Ｃａｌｃｏ、Ｌｅｃｃｏ、イタリア）から購入し、イタリア国立衛生研究所の動物施設に収容した。マウスには１０時間明期及び１４時間暗期を与え、マウスの食餌（Ｍｕｃｅｄｏｌａ、ＳｅｔｔｉｍｏＭｉｌａｎｅｓｅ（ＭＩ）、Ｉｔａｌｙ）及び水を自由に摂取させた。

【0037】

（実験方法）
マウスを２つのＦＰＰ摂取群（処置群）に分けた。ＦＰＰ早期処置群（ＥＴ－ＦＰＰ）は、６週齢のマウスに１０ヶ月間毎日ＦＰＰを投与した（６週齢～５１週齢）。ＦＰＰ後期処置群（ＬＴ－ＦＰＰ）は、５１週齢のマウスに１０カ月間毎日ＦＰＰを投与した（５１週齢～９６週齢）。マウスの年齢とヒトの年齢とを対比すると、６週齢～５１週齢（早期処置群）のマウスは、１３歳～４１歳のヒトに相当し、５１週齢～９６週齢（後期処置群）のマウスは、４１歳～６３歳のヒトに相当する。

【0038】

２つの処置群のマウスには、３ｇのＦＰＰ（登録商標、大里研究所）を５００ｍＬの水道水に溶かした（６ｇ／Ｌ）水溶液を、６ｍｇ／マウス／日に相当する１ｍＬを１０ヶ月間、毎日与えた。対照群のマウスには、水道水のみを与えた。

【0039】

（テロメラーゼ活性の測定）
マウステロメラーゼ活性（テロメラーゼ濃度）は、比色サンドイッチ－ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。マウスＴＥ（テロメラーゼ）ＥＬＩＳＡキット（Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を用いて、屠殺直前のマウスの血漿試料で行った。光学密度（ＯＤ）は４５０±２ｎｍで測定した。

【0040】

（マウスからの骨髄幹細胞の採取）
対照群、ＥＴ－ＦＰＰ及びＬＴ－ＦＰＰマウスを屠殺した直後に、マウスの後肢の脛骨及び大腿骨の両方から骨髄を得た。次いで、骨髄を生理食塩水（ＮａＣｌ）中に置き、５ｍＬシリンジプランジャーの平滑末端で破壊した。Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）１００μｍセルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いて骨髄幹細胞を単離し、骨髄から均一な単一細胞懸濁液を得た。単一細胞懸濁液をＰＢＳで２回洗浄し、直ちにテロメアの長さの測定に用いた。

【0041】

（マウスからの卵巣胚細胞の採取）
対照群、ＥＴ－ＦＰＰ及びＬＴ－ＦＰＰマウスを屠殺した直後に、卵巣を切開し、１％のトリプシン及び０．１μＭのＥＤＴＡを含む生理食塩水（ＮａＣｌ）中に置き、カッターで残りの生殖系から分離し、５ｍｌシリンジプランジャーの平滑末端で破壊した。Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）１００μｍ細胞濾過器（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いて卵巣胚細胞を単離し、結合組織及び破片を沈降させて、卵巣組織から均一な単細胞懸濁液を得た。単一細胞懸濁液をＰＢＳで２回洗浄し、直ちにテロメアの長さの測定に用いた。

【0042】

（テロメアの長さの測定）
上記の屠殺直後に得られた対照群、ＥＴ－ＦＰＰ及びＬＴ－ＦＰＰマウスの骨髄幹細胞及び卵巣胚細胞（生殖細胞）におけるテロメアの検出を行った。そのために、フローサイトメトリー用のテロメアＰＮＡキット／ＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ－Ａｇｉｌｅｎｔ、ＳａｎｔａＣｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した。このキットは、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション及びフルオレセイン結合ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを用いて、有核造血細胞におけるテロメアの検出を可能にする。なお、ＰＮＡはテロメアで反復する６ヌクレオチドの配列（ＴＴＡＧＧＧ）を認識し、当該反復配列とハイブリダイゼーションする。結果は、４８８ｎｍで励起する光源を用いたフローサイトメトリーによって評価した。

【0043】

（統計解析）
結果は平均値±標準誤差（ＳＥ）として報告し、計算はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェア（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。スチューデントｔ検定を適用して結果を分析した。統計的有意性はｐ＜０．０５とした。

【0044】

（結果）
ＥＴ－ＦＰＰの結果
対照群及びＥＴ－ＦＰＰのＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス由来の血漿試料中のテロメラーゼ（ＴＥ）濃度の測定結果を図６に示す。水道水を飲んでいる対照群のマウスと比較して、ＦＰＰ（登録商標）で毎日処置したマウスのテロメラーゼ濃度の増加が確認された。具体的には、ＥＴ－ＦＰＰマウスは、対照群と比べて１．６倍高い（ｐ＜０．００５）ＴＥ濃度を有した（ＥＴ－ＦＰＰ：８８．５±４．５ｎｇ／ｍＬ、対照群：５５．９±６．６ｎｇ／ｍＬ）。

【0045】

対照群及びＥＴ－ＦＰＰのＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスの骨髄及び卵巣から、上記のように単一細胞懸濁液を得た。骨髄細胞及び卵巣生殖細胞の単一細胞懸濁液を光学顕微鏡下でトリパンブルー排除法によって計数した。その結果、ＥＴ－ＦＰＰマウスにおいて、骨髄細胞及び卵巣生殖細胞は、それぞれ、対照細胞よりもほぼ４倍及び２倍多かった（データは示さず）。

【0046】

比較可能な数の骨髄細胞及び卵巣生殖細胞のテロメアの長さを、フルオレセイン結合プローブ（ＰＮＡ）とのハイブリダイゼーションにより分析した。全細胞について、標準化した平均蛍光強度の平均±ＳＥとして表される結果を図７に示す。テロメアのＴＴＡＧＧＧ配列は平均蛍光強度の値と相関する。

【0047】

図７の結果から、ＥＴ－ＦＰＰマウスは、骨髄（Ａ）及び卵巣（Ｂ）の両方において、対照群よりもテロメアの長さの有意な増加を示した。より具体的には、骨髄細胞のテロメアの長さは対照群の４倍であったが（ＥＴ－ＦＰＰ：５０２０±５４２平均蛍光強度、対照群：１２２８±８８平均蛍光強度）（図７（Ａ））、卵巣胚細胞のテロメアの長さは対照群の２．７倍であった（ＥＴ－ＦＰＰ：９１±５平均蛍光強度、：対照群：３３±３平均蛍光強度）（図７（Ｂ））。

【0048】

ＬＴ－ＦＰＰの結果
対照群及びＬＴ－ＦＰＰのＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス由来の血漿試料中のテロメラーゼ（ＴＥ）濃度の測定結果を図８に示す。水道水を飲んでいる対照群のマウスと比較して、ＦＰＰ（登録商標）で毎日処置したマウスのテロメラーゼ濃度の増加が確認された。具体的には、ＬＴ－ＦＰＰマウスは、対照群と比べて１．６倍高い（ｐ＜０．００５）ＴＥ濃度を有した（ＬＴ－ＦＰＰ：１２４．０±９．０ｎｇ／ｍＬ、対照：９２．５±６．５ｎｇ／ｍＬ）。

【0049】

対照群及びＬＴ－ＦＰＰのＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスの骨髄及び卵巣から、上記のように単一細胞懸濁液を得た。骨髄細胞及び卵巣生殖細胞の単一細胞懸濁液を光学顕微鏡下でトリパンブルー排除法によって計数した。その結果、ＬＴ－ＦＰＰマウスにおいて、骨髄細胞及び卵巣生殖細胞は、それぞれ、対照細胞よりもほぼ１．８倍及び２倍多かった（データは示さず）。

【0050】

比較可能な数の骨髄細胞及び卵巣生殖細胞のテロメアの長さを、フルオレセイン結合プローブ（ＰＮＡ）とのハイブリダイゼーションにより分析した。全細胞について、標準化した平均蛍光強度の平均±ＳＥとして表される結果を図９に示す。テロメアのＴＴＡＧＧＧ配列は平均蛍光強度の値と相関する。

【0051】

図９の結果から、ＬＴ－ＦＰＰマウスは、骨髄（Ａ）及び卵巣（Ｂ）の両方において、対照群よりもテロメアの長さの有意な増加を示した。より具体的には、骨髄細胞のテロメアの長さは対照群の２倍であったが（ＬＴ－ＦＰＰ：１２１±６平均蛍光強度、対照群：５９±９平均蛍光強度）（図９（Ａ））、卵巣胚細胞のテロメアの長さは対照群よりは有意に長かった（ＬＴ－ＦＰＰ：８．６９±０．２５平均蛍光強度、：対照群：７．２９±０．４４平均蛍光強度）（図９（Ｂ））。また、骨髄細胞及び卵巣生殖細胞における平均蛍光強度は、ＥＴ－ＦＰＰと比較して、ＬＴ－ＦＰＰにおいて有意に減少した。

【0052】

未処理（対照）マウスに対するＦＰＰ処置マウスにおける結果の増加割合（又は減少割合）を下記の表１に示す。表１にはテロメラーゼ及びテロメアの長さの他に、総抗酸化能、総グルタチオン、ＳＯＤ－１及び総活性酸素種（ＲＯＳ）の結果も示す。それぞれの値は、（ＦＰＰ処置－対照群）／対照群（％）で得られた値である。

【表1】