特許 7449605 ＧＨ１０ファミリーの耐高温キシラナーゼ突然変異体群及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-06

(45)【発行日】2024-03-14

(54)【発明の名称】ＧＨ１０ファミリーの耐高温キシラナーゼ突然変異体群及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/56 20060101AFI20240307BHJP

   C12N 9/24 20060101ALI20240307BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240307BHJP

【ＦＩ】

C12N15/56

C12N9/24 ZNA

C12N1/19

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2022575276

(86)(22)【出願日】2021-08-20

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-07

(86)【国際出願番号】 CN2021113743

(87)【国際公開番号】W WO2023004901

(87)【国際公開日】2023-02-02

【審査請求日】2022-12-05

(31)【優先権主張番号】202110854745.4

(32)【優先日】2021-07-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】522474077

【氏名又は名称】江蘇科技大学

【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＳＵ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ

【住所又は居所原語表記】６６６ Ｃｈａｎｇｈｕｉ Ｒｏａｄ，Ｄａｎｔｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｚｈｅｎｊｉａｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２１２１００， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110000291

【氏名又は名称】弁理士法人コスモス国際特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】遊 帥

(72)【発明者】

【氏名】陳 忠立

(72)【発明者】

【氏名】庄 愉

(72)【発明者】

【氏名】儲 呈平

(72)【発明者】

【氏名】葛 研

(72)【発明者】

【氏名】王 俊

【審査官】北田 祐介

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１１２７０８６０８（ＣＮ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ ９／２４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＧＨ１０ファミリーの耐高温キシラナーゼ突然変異体タンパク質をコードする核酸であって
前記突然変異体タンパク質は、ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｎ３１８ＷまたはＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｎ３１８Ｗ／Ｇ３６３Ｒ／Ｔ３２４Ｖ突然変異体タンパク質であり、
前記ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｎ３１８Ｗ突然変異体タンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示され、前記ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｎ３１８Ｗ／Ｇ３６３Ｒ／Ｔ３２４Ｖ突然変異体タンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示される、ことを特徴とするＧＨ１０ファミリーの耐高温キシラナーゼ突然変異体タンパク質をコードする核酸。

【請求項2】

ＧＨ１０ファミリーの耐高温キシラナーゼ突然変異体タンパク質であって
前記突然変異体タンパク質は、ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｎ３１８ＷまたはＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｎ３１８Ｗ／Ｇ３６３Ｒ／Ｔ３２４Ｖ突然変異体タンパク質であり、
前記ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｎ３１８Ｗ突然変異体タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示され、前記ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｎ３１８Ｗ／Ｇ３６３Ｒ／Ｔ３２４Ｖ突然変異体タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示される、ことを特徴とする、ＧＨ１０ファミリーの耐高温キシラナーゼ突然変異体タンパク質。

【請求項3】

請求項１に示すいずれか一つのヌクレオチド配列を含む、組換えベクター。

【請求項4】

請求項３に記載の組換えベクターを含む、組換え菌株。

【請求項5】

請求項１に記載のＧＨ１０ファミリーの耐高温キシラナーゼ突然変異体タンパク質をコードする核酸、または請求項２に記載のＧＨ１０ファミリーの耐高温キシラナーゼ突然変異体タンパク質の、飼料添加剤の調製における使用。

【請求項6】

請求項４に記載の組換え菌株の、飼料添加剤の調製における使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物工学の分野に属し、具体的には、ＧＨ１０ファミリーの耐高温キシラナーゼ突然変異体群及びその構築方法並びに使用に関する。

【背景技術】

【0002】

従来の飼料は、一般的に、トウモロコシ、ふすま、コムギ又はもみなどを主原料としており、セルロース、ヘミセルロース、ペクチンなどが含まれる非澱粉性多糖（non-starch polysaccharides）が多く含まれている。セルロースは、D-グルコピラノスをβ－１，４グリコシド結合で連結して得られた大分子ポリマーであり、植物細胞壁の主成分でもある。ヘミセルロースは、一般的に、自然界で、植物細胞壁においてペクチン及びセルロース類成分以外の他の糖鎖類物質を意味し、主に、キシラン、ガラクトマンナン及びガラクトグルコマンナンを含む。キシランの構造は、非常に複雑であり、主鎖は、キシロピラノースをβ－１，４－Ｄ－キシロシド結合で連結してなるものであり、重合度が１５０～２００の間であり、側鎖は、複数の形式の置換基又は置換基グループを含み、一般的な置換基は、アラビノース、グルコン酸、ガラクトース、フェルラ酸、酢酸及びクマリン酸など（Ｋｕｌｋａｒｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９、Ｌｉａｂ ｅｔ ａｌ．， ２０００、Ｓｑｕｉｎａ ｅｔ ａｌ．， ２００９）を含む。しかし、非反芻動物は、非澱粉性多糖を分解する酵素が欠けるため、それ自体は、ヘミセルロースを消化することが非常に困難であり、粥状の食いもたれを容易に形成し、動物の腸管の内部環境に影響を与える。一方では、動物の腸内微生物集団の種類の変化を招く。他方では、粥状の食いもたれが動物の飼料吸収に影響を与え、飼料利用率を大幅に低下させ、飼料の給餌コストを増加させる。

【0003】

飼料に適切なキシラナーゼを添加することで、植物細胞の細胞壁を破砕でき、ヘミセルロースの加水分解を引き起こし、細胞の内容物を放出して、粥状の食いもたれの粘度を低下させる目的を実現し、飼料利用率を大幅に高め、飼料コストを低減させる。キシランの加水分解生成物は、オリゴ糖であり、そのうちのキシロビオースは、１）虫歯を予防し、２）血中脂肪、血圧、血糖を下げ、３）ミネラル吸収を促進し、４）細菌を抑制し、免疫力を高め、ビタミン代謝を改善する効果を有するビフィドバクテリウムを増殖させるような、優れたヘルスケア機能がある。

【0004】

しかしながら、飼料の工業生産調製では、その作業環境温度が比較的高いとともに、飼料の高圧ペレット化工程では、瞬間的な高温を伴うため、キシラナーゼが、優れた熱安定性を具備し、極端の高温の環境でも優れた熱安定性を具備することが求められる。キシラナーゼは、自然界に広く分布しているが、耐高温性を有するキシラナーゼは、多くない。そのうち微生物由来のキシラナーゼは、現在の実際の使用及び研究に最も多く利用されている材料である。しかし、それらの多くは、熱安定性や触媒活性を両立できず、そして、それらは、天然微生物の特性により、キシラナーゼを大量に発現できないことが多い。

【0005】

天然由来のキシラナーゼをスクリーニングすることの難しさとそれらの悪い特性を考慮して、自然界の酵素について、理性的、半理性的又はランダムな標的進化、突然変異、セグメント組換え、ハイブリッド体の構築及び活性サイト突然変異技術などの方法を用いて研究するとともに、高発現工程菌株を構築することは、現在、改造して優れたキシラナーゼを取得する主な方法である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、ＧＨ１０ファミリーの耐高温キシラナーゼ突然変異体群及びその使用を提供する。この突然変異体群は、真菌Ｈｏｒｔａｅａ ｗｅｒｎｅｃｋｉｉのキシラナーゼＨｗＸｙｌ１０ａから由来するものであり、産業生産に使用するように、相同配列の比較と構造分析により、キシラナーゼＨｗＸｙｌ１０Ａの熱安定性に対して理性的な設計及び標的改良を行う。

【課題を解決するための手段】

【0007】

ＧＨ１０ファミリーの耐高温キシラナーゼ突然変異体群であって、前記突然変異体は、ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｇ３６３Ｒ、ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｔ３２４Ｖ、ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｎ３１８Ｗ及びＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｎ３１８Ｗ／Ｇ３６３Ｒ／Ｔ３２４Ｖ突然変異体であり、前記ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｇ３６３Ｒのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示され、ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｔ３２４Ｖのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示され、ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｎ３１８Ｗのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示され、ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｎ３１８Ｗ／Ｇ３６３Ｒ／Ｔ３２４Ｖのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示される。

【0008】

上記ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｇ３６３Ｒのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示され、ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｔ３２４Ｖのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示され、ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｎ３１８Ｗのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示され、ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｎ３１８Ｗ／Ｇ３６３Ｒ／Ｔ３２４Ｖのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示される。

【0009】

上記いずれか一つのヌクレオチド配列を含む、組換えベクター。

【0010】

上記の組換えベクターを含む、組換え菌株。

【0011】

上記ＧＨ１０ファミリーの耐高温キシラナーゼ突然変異体の、飼料添加剤の調製における使用。

【0012】

上記組換え菌株の、飼料添加剤の調製における使用。

【0013】

耐高温キシラナーゼ突然変異体の構築方法は、ＨｗＸｙｌ１０Ａを出発材料として選択し、マルチ配列の比較及び構造分析により単一サイト突然変異を設計し、その熱安定性に影響を与える可能性のあるキーアミノ酸サイトを仮スクリーニングするステップと、スクリーニングによって得られたキーサイトに対して、標的突然変異プライマーを設計するステップと、ｏｖｅｒ－ｌａｐ ＰＣＲの方法を採用して各突然変異サイトを組み合わせるステップと、キシラナーゼ突然変異体の配列断片を、発現ベクターｐＰＩＣ９ｒのＥｃｏＲ ＩとＮｏｔ Ｉ制限酵素認識サイトの間にクローンし、組換えプラスミドを取得するステップと、突然変異体の組換えプラスミドをピキア・パストリス（pichia pastoris）ＧＳ１１５の受容体状態に形質転換し、発現を誘導して、組換え菌を取得するステップと、組換え菌を培養し、キシラナーゼ突然変異体を発現させるように誘導し、キシラナーゼ突然変異体を回収して精製するステップとを含む。

【発明の効果】

【0014】

本発明は、熱安定性に優れ、飼料添加に適するキシラナーゼ突然変異体群を提供する。このキシラナーゼ突然変異体群の最適なｐＨ値は、３．５～５．５であり、野生型に比べて変化が大きくなく、ｐＨ安定性も野生型と類似しており、ｐＨが２～９である範囲内においていずれも高い酵素活性を維持する。このキシラナーゼ突然変異体群の最適な温度は、７５℃であり、７５℃での熱安定性は、いずれも野生酵素に比べて、異なる程度の向上があり、主に、突然変異体ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｇ３６３Ｒの半衰期が野生型に比べて１２ｍｉｎ延長し、ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｔ３２４Ｖの半衰期が野生型に比べて２０ｍｉｎ延長し、ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｎ３１８Ｗの半衰期が野生型に比べて２４ｍｉｎ延長し、ＨｗＸｙｌ１０Ａ－Ｎ３１８Ｗ／Ｇ３６３Ｒ／Ｔ３２４Ｖの半衰期が野生型に比べて３８ｍｉｎ延長する点に反映されている。飼料のペレット化には、瞬間的な高温工程（８０～９０℃、３～５ｓ）があり、酵素の熱安定性が高まられたから、酵素耐性の高温ペレット化工程により有利となり、最後に非活性化を回避する。このような、酸性ｐＨ環境及び動物体温条件で比較的高い酵素活性を有し且つ高温条件で安定したキシラナーゼは、飼料産業において性質に優れた飼料添加用酵素であると考えられており、適用の見通しが非常に広い。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】耐高温キシラナーゼ突然変異体及び野生型のタンパク質精製である。

【図2】耐高温キシラナーゼ突然変異体及び野生型の最適なｐＨである。

【図3】耐高温キシラナーゼ突然変異体及び野生型のｐＨ安定性である。

【図4】耐高温キシラナーゼ突然変異体及び野生型の最適な温度である。

【図5】７５℃での耐高温キシラナーゼ酵素突然変異体及び野生型の熱安定性である。

【図6】耐高温キシラナーゼ酵素突然変異体及び野生型のＴ_５０値である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、添付図面及び具体的な実施例を結び付けながら本発明について記述する。

【0017】

１、菌株及びベクター：発現宿主Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５、発現プラスミドベクターｐＰＩＣ９ｒは、実験室で調製されたものである。

【0018】

２、酵素類及び他の生化学試薬：Ｐｆｕ酵素は、全式金会社（ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）から購入され、エンドヌクレアーゼは、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ会社から購入され、リガーゼは、Ｐｒｏｍａｇａ会社から購入され、ビーチウッドキシランは、Ｓｉｇｍａ会社から購入され、他は、いずれも、中国産分析用試薬から購入される（いずれも国薬集団から購入される）。

【0019】

３、培地：
（１）ＬＢ培地：０．５％の酵母抽出物、１％のペプトン、１％のＮａＣｌ、ｐＨ ７．０。
（２）ＹＰＤ培地：１％の酵母抽出物、２％のペプトン、２％のグルコース
（３）ＭＤ固体培地：２％のグルコース、１．５％のアガロース、１．３４％のＹＮＢ、０．００００４％のＢｉｏｔｉｎ。
（４）ＭＭ固体培地：１．５％のアガロース、１．３４％のＹＮＢ、０．００００４％のＢｉｏｔｉｎ、０．５％のメタノール。
（５）ＢＭＧＹ培地：１％の酵母抽出物、２％のペプトン、１％のグリセリン（Ｖ／Ｖ）、１．３４％のＹＮＢ、０．００００４％のＢｉｏｔｉｎ。
（６）ＢＭＭＹ培地：１％の酵母抽出物、２％のペプトン、１．３４％ＹＮＢ、０．００００４％のＢｉｏｔｉｎ、０．５％メタノール（Ｖ／Ｖ）。

【0020】

実施例１ 耐高温キシラナーゼ突然変異体をコードする遺伝子のクローン
ＧＨ１０ファミリーから由来する耐高温キシラナーゼ遺伝子ＨｗＸｙｌ１０Ａを親として、キシラナーゼのｌｏｏｐ領域で突然変異プライマーを設計し、ｏｖｅｒ－ｌａｐ ＰＣＲの方法を採用して高い触媒効率のキシラナーゼ突然変異体をコードする遺伝子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（ＨｗＸｙｌ１０ａ－Ｇ３６３Ｒ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２（ＨｗＸｙｌ１０ａ－Ｔ３２４Ｖ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３（ＨｗＸｙｌ１０ａ－Ｎ３１８Ｗ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４（ＨｗＸｙｌ１０ａ－Ｎ３１８Ｗ／Ｇ３６３Ｒ／Ｔ３２４Ｖ）を増幅し、突然変異方法及びクローン方法について文献（Ｙｏｕ、ｅｔ ａｌ．， ２０１６）を参照した。

【0021】

用いられたプライマー配列は、表１に示した。

【0022】

【表1】

【0023】

実施例２ 耐高温キシラナーゼ突然変異体の調製
発現ベクターｐＰＩＣ９ｒを二重消化（ＥｃｏＲ Ｉ＋Ｎｏｔ Ｉ）するとともに、耐高温キシラナーゼ突然変異体をコードする遺伝子を二重消化（ＥｃｏＲ Ｉ＋Ｎｏｔ Ｉ）し、そして消化後に成熟した耐高温キシラナーゼ突然変異体をコードする遺伝子断片を発現ベクターｐＰＩＣ９ｒに連結し、耐高温キシラナーゼ突然変異体遺伝子を含む組換えプラスミドを取得し、ピキア・パストリスＧＳ１１５に形質転換して、組換え酵母菌株を取得した。

【0024】

組換えプラスミドを含むＧＳ１１５菌株をＢＭＧＹ培地が３００ｍＬの１Ｌ三角フラスコに接種し、３０℃且つ２２０ｒｐｍのシェーカーに置いて４８ｈ培養し、その後、３０００ｇの培養液を５ｍｉｎ遠心し、上清を捨て、沈殿物を０．５％のメタノールを含む１００ｍＬのＢＭＭＹ培地で再懸濁し、再び３０℃且つ２２０ｒｐｍの条件で培養を誘導した。菌液中のメタノール濃度を０．５％に維持するように、１２ｈおきに０．５ｍＬのメタノールを補充するとともに、上清を取って酵素活性検出に使用した。

【0025】

実施例３ 耐高温キシラナーゼ突然変異体及び野生型の活性分析
一、ＤＮＳ法：具体的な方法は次のとおりであった。特定のｐＨ及び温度の条件で、１ｍＬの反応系は、１００μＬの酵素液、及び９００μＬの基質を含み、１０ｍｉｎ反応させ、１．５ｍＬのＤＮＳを加えて反応を停止させ、沸騰水で５ｍｉｎ茹でた。冷却後、５４０ｎｍでＯＤ値を測定した。酵素活性の１単位（Ｕ）は、所定の条件で、１分あたりにキシランを分解させて１μｍｏｌの還元糖を生成するに必要な酵素量と定義された。

【0026】

二、組換え耐高温キシラナーゼ突然変異体及び野生型の性質測定
１、組換え耐高温キシラナーゼ突然変異体及び野生型の最適なｐＨの測定は、以下のとおりであった。

【0027】

実施例２で精製された組換え耐高温キシラナーゼ突然変異体及び野生型を異なるｐＨで酵素反応させてその最適なｐＨを測定した。異なるｐＨの０．１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸－リン酸水素二ナトリウムの緩衝液で基質（ビーチウッドキシラン）を希釈し、７５℃でキシラナーゼの活性を測定した。

【0028】

その結果（図２）として、組換え耐高温キシラナーゼ突然変異体及び野生型の最適な反応ｐＨ値は、３．５～５．５であり、ｐＨ２．０～９．０の範囲内において同様な作用傾向を有した（図３）。最適なｐＨを変えずに酵素の熱安定性を高める目的を満たした。

【0029】

２、組換え耐高温キシラナーゼ突然変異体及び野生型の最適な温度の測定は、以下のとおりであった。

【0030】

組換え耐高温キシラナーゼ突然変異体及び野生型の最適な温度の測定は、０．１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸－リン酸水素二ナトリウム緩衝液（ｐＨは３．５）の緩衝液系及び異なる温度で酵素反応を行うことであった。酵素反応の最適な温度の測定結果（図４）として、組換え耐高温キシラナーゼ突然変異体と野生型の最適な温度は、７０～８０℃であり、それらの差は、明らかではなかった。

【0031】

３、組換え耐高温キシラナーゼ突然変異体及び野生型の７５℃での熱安定性の測定は、以下のとおりであった。

【0032】

耐高温キシラナーゼ突然変異体及び野生型を７５℃でそれぞれ一定時間処理し、また処理時の全ての突然変異体及び野生型の濃度が１００μｇ／ｍＬで、体積が１００μＬであることを確保し、異なる時点にサンプリングした後、すばやく氷に置き、７５℃且つｐＨ ４．０の条件で酵素活性を測定し、突然変異体及び野生型の熱安定性状況を評価した。

【0033】

全ての突然変異体の熱安定性は、いずれも野生型よりも優れ、７０℃で２６ｍｉｎ処理した後、野生型キシラナーゼの残留酵素活性は、５０％に低減し（図５）、３８ｍｉｎまで処理を継続したとき、突然変異体Ｇ３６３Ｒの残留酵素活性は、５０％に低減するが、同じ条件で、突然変異体Ｔ３２４Ｖの半衰期は、野生型よりも２０ｍｉｎ延長し、４６ｍｉｎになった。全ての突然変異体のうち、熱安定性の点で最高のパフォーマンスを示したのは、組み合わせ突然変異Ｎ３１８Ｗ／Ｇ３６３Ｒ／Ｔ３２４Ｖであり、６４分間に達した。

【0034】

４、組換え耐高温キシラナーゼ突然変異体及び野生型のＴ５０値の測定は、以下のとおりであった。

【0035】

７５℃での熱安定性は、酵素の耐熱性を示すことができるほか、Ｔ５０値も、酵素の耐熱性を反映することができた。４種の突然変異体及び野生型を異なる温度（６０℃～８５℃）で３０ｍｉｎ処理した後、フィッティングした結果、野生型酵素のＴ５０値は、７４℃であるが、Ｇ３６３ＲのＴ５０値は、７６℃であり、Ｔ３２４ＶのＴ５０値は、７７．５℃に達し、Ｎ３１８ＷのＴ５０値は、さらに高くなり、７８．５℃になった。Ｔ５０値が最も高いのは、組み合わせ突然変異体Ｎ３１８Ｗ／Ｇ３６３Ｒ／Ｔ３２４Ｖであり、８０℃になった。

【0036】

実施例４ 耐高温キシラナーゼ突然変異体及び野生型の動力学分析
最適な条件で、ビーチウッドキシラン基質を用いて４種のキシラナーゼ突然変異体と野生型の動力学パラメータと比活性を測定し、結果は、それぞれ表２に示された。

【0037】

【表2】

【0038】

４種のキシラナーゼ突然変異体及び野生型のＫｍ値は、それぞれ０．８８ｍｇ／ｍＬ、１．０３ｍｇ／ｍＬ、０．９６ｍｇ／ｍＬ、１．２７ｍｇ／ｍＬ及び１．０４ｍｇ／ｍＬであるが、４種のキシラナーゼ突然変異体及び野生型のｋｃａｔ値は、それぞれ２１００ｓ－１、２３００ｓ－１、１９００ｓ－１、２７００ｓ－１及び２４００ｓ－１であり、４種のキシラナーゼ突然変異体及び野生型の触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）は、それぞれ２４００ｍＬ／ｓ・ｍｇ、２２００ｍＬ／ｓ・ｍｇ、２０００ｍＬ／ｓ・ｍｇ、２１００ｍＬ／ｓ・ｍｇ及び１７００ｍＬ／ｓ・ｍｇであった。４種のキシラナーゼ突然変異体の比活性は、野生型酵素に比べて、異なる程度の向上があり、Ｇ３６３Ｒは、野生型に比べて１．３２倍まで高まり、Ｔ３２４Ｖは、野生型に比べて１．０６倍まで高まり、Ｎ３１８Ｗは、野生型に比べて１．５倍まで高まり、比活性の高まりは、最も明らかであるが、組み合わせ突然変異は、野生型に比べて１．２１倍まで高まった。

【0039】

全体として、突然変異後に４種の突然変異体の酵素活性が失われることはなく、熱安定性は、野生型に比べて大幅に高まり、飼料ペレット化時の瞬間的な高温に耐えることができる。加えて、酵素活性が失われず、安定性が高められた場合、この耐高温キシラナーゼ突然変異体群がより長い時間活性を維持し、ヘミセルロースの加水分解を触媒することができることを意味し、産業用途の良好な材料であった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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