ホーム > 特許ランキング > ＬＥＭＯＮＥＸ ＩＮＣ．
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-07
(45)【発行日】2024-03-15
(54)【発明の名称】ＲＮＡおよびそれを含む核酸キャリア
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240308BHJP
C12N 15/87 20060101ALI20240308BHJP
C12N 15/117 20100101ALI20240308BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240308BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240308BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20240308BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20240308BHJP
A61K 47/04 20060101ALI20240308BHJP
A61K 47/55 20170101ALI20240308BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240308BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240308BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 130Z
C12N15/87 Z ZNA
C12N15/117 Z
A61P35/00
A61P35/02
A61P35/04
A61K9/14
A61K47/04
A61K47/55
A61K31/7105
A61K31/713
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2022520088
(86)(22)【出願日】2021-07-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-01
(86)【国際出願番号】 KR2021008530
(87)【国際公開番号】W WO2022005268
(87)【国際公開日】2022-01-06
【審査請求日】2022-03-30
(31)【優先権主張番号】63/048,072
(32)【優先日】2020-07-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】10-2021-0088160
(32)【優先日】2021-07-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】517022072
【氏名又は名称】レモネックス インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＬＥＭＯＮＥＸ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】（ＤＭ Ｔｏｗｅｒ， Ｂａｎｇｂａｅ－ｄｏｎｇ） １０３， Ｂａｎｇｂａｅ－ｒｏ， Ｓｅｏｃｈｏ－ｇｕ， Ｓｅｏｕｌ ０６６８３ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100137095
【弁理士】
【氏名又は名称】江部 武史
(74)【代理人】
【識別番号】100091627
【弁理士】
【氏名又は名称】朝比 一夫
(72)【発明者】
【氏名】ウォン， チョル ヘ
(72)【発明者】
【氏名】キム， ジュン
【審査官】大久保 智之
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１８／０１４２２３９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許第０８３８９７０８（ＵＳ，Ｂ２）
【文献】small，2012年，Vol.8, No.11，p.1752-1761
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ａ６１Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣｐＧ－ＯＤＮ－ＲＮＡコンジュゲートおよびそれを気孔内に担持した多孔性シリカ粒子を含み、前記多孔性シリカ粒子は、平均気孔直径が７～３０ｎｍであり、前記ＲＮＡは、ＩＤＯ（インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（indoleamine 2,3-dioxygenase））ｓｉＲＮＡである核酸キャリア。
【請求項2】
前記ＣｐＧ－ＯＤＮと前記ＲＮＡとはリンカーを介して結合している、請求項１に記載の核酸キャリア。
【請求項3】
前記リンカーは、飽和アルキル鎖（Ｃ３～Ｃ１８）、トリゾールリンカー（trizole linker）、または４－メチル－６，７，８，９，１０，１０ａ－ヘキサヒドロ－５Ｈ－３λ２－シクロオクタ［ｄ］ピリダジンリンカー（4-methyl-6，7，8，9，10，10a-hexahydro-5H-3λ2-cycloocta［d］pyridazine linker）である、請求項２に記載の核酸キャリア。
【請求項4】
前記ＩＤＯ ｓｉＲＮＡは、配列番号１および２のｓｉＲＮＡ、配列番号３および４のｓｉＲＮＡ、配列番号５および６のｓｉＲＮＡ、配列番号７および８のｓｉＲＮＡ、または配列番号９および１０のｓｉＲＮＡを含む、請求項１に記載の核酸キャリア。
【請求項5】
前記ｓｉＲＮＡは、Ｎ末端またはＣ末端に、ＩＤＯ ｍＲＮＡに対して相補的な配列を１～１０ｎｔさらに含む、請求項１に記載の核酸キャリア。
【請求項6】
前記ＩＤＯ ｓｉＲＮＡは、配列番号１１および１２のｓｉＲＮＡを含む、請求項１に記載の核酸キャリア。
【請求項7】
前記ＣｐＧ－ＯＤＮは、ＣｐＧ－Ａ ＯＤＮ、ＣｐＧ－Ｂ ＯＤＮまたはＣｐＧ－Ｃ ＯＤＮである、請求項１に記載の核酸キャリア。
【請求項8】
前記ＣｐＧ－ＯＤＮは、配列番号１３～１５のいずれか１つのヌクレオチドを含む、請求項１に記載の核酸キャリア。
【請求項9】
前記多孔性シリカ粒子は、気孔内部が陽電荷に帯電されたものである、請求項１に記載の核酸キャリア。
【請求項10】
前記多孔性シリカ粒子は、前記ＣｐＧ－ＯＤＮ－ＲＮＡコンジュゲートの担持前のゼータ電位が５～８０ｍＶである、請求項１に記載の核酸キャリア。
【請求項11】
前記ＣｐＧ－ＯＤＮ－ＲＮＡコンジュゲートと前記多孔性シリカ粒子との重量比は１：１～２０である、請求項１に記載の核酸キャリア。
【請求項12】
前記多孔性シリカ粒子のＢＥＴ表面積は２００～７００ｍ２／ｇであり、粒径は５０～１０００ｎｍである、請求項１に記載の核酸キャリア。
【請求項13】
請求項１に記載の核酸キャリアを含み、前記ＲＮＡは、ＩＤＯ（インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（indoleamine 2,3-dioxygenase）） ｓｉＲＮＡである、癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項14】
前記癌は、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵胞癌、婦人癌、泌尿器癌、前立腺癌、腎臓癌、精巣癌、陰茎癌、尿生殖路癌、精巣腫、膀胱癌、皮膚癌、肉腫、骨肉腫、悪性骨腫瘍、軟部組織肉腫、角化棘細胞腫、黒色腫、肺癌、小細胞肺癌腫、非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、肺扁平細胞癌、結腸癌、乳頭癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、乳房内分泌癌、肝胆膵癌、肝癌、胆管癌、胆嚢癌、胆道癌、膵臓癌、骨癌、骨髄障害、リンパ障害、ヘアリー細胞癌、口腔および咽頭（経口）癌、口唇癌、舌癌、口腔癌、唾液腺癌、咽頭癌、甲状腺癌、喉頭癌、食道癌、胃癌、胃腸管癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、大腸癌、子宮内膜癌、子宮癌、脳癌、神経膠腫、非膠腫性腫瘍、悪性神経膠腫、脳転移癌、脳髄膜腫、聴神経鞘腫、脳下垂体腫瘍、頭頸部癌、中枢神経系の癌、腹膜癌、肝細胞癌、頭部癌、頸部癌、原発性腫瘍、転移性腫瘍、リンパ腫、扁平上皮癌、血液癌、内分泌癌、ホジキン、または白血病である、請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＲＮＡおよびそれを含む核酸キャリアに関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍は、ＩＤＯ（indoleamine 2,3-dioxygenase）を用いて、免疫反応から防御壁を構築することができる。ＩＤＯは本来胎児が母体の拒絶反応を回避するために使用する酵素であり、強力な調節Ｔ細胞（Tregs：regulatory T cells）を動員して免疫反応を抑制することができる。Ｔｒｅｇｓは、関節リウマチや１型糖尿病などの自己免疫疾患を予防する上で重要な役割を果たす免疫細胞であるが、腫瘍細胞が動員したＴｒｅｇｓは人体の他の部位に存在するＴｒｅｇｓよりもさらに攻撃的で抑制力に優れている。癌患者は、活性化された腫瘍特異的Ｔ細胞を多く保有しているにもかかわらず、実際には腫瘍を退治できないことが多いが、これはＴｒｅｇｓが腫瘍特異的ＣＴＬ（CD8 T cytotoxic）細胞とＴｈ（CD4 T helper）細胞を抑制して、癌が免疫系の攻撃を回避することを助けるためである。したがって、ＩＤＯを抑制することにより、癌の治療効果を高めることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明は、免疫または疾患に関連する遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを含む核酸分子を提供することを目的とする。
【0004】
本発明は、ｓｉＲＮＡにＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ）をさらに含む核酸分子を提供することを目的とする。
【0005】
本発明は、ｓｉＲＮＡおよびＣｐＧ－ＯＤＮを含む核酸分子を担持した核酸キャリアを提供することを目的とする。
【0006】
本発明は、癌の予防または治療用医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
１．ＣｐＧ－ＯＤＮ－ＲＮＡコンジュゲートおよびそれを気孔内に担持した多孔性シリカ粒子を含み、前記多孔性シリカ粒子は、平均気孔直径が７～３０ｎｍである、核酸キャリア。
【0008】
２．前記項目１において、前記ＲＮＡはｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ａＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、環状（circular）ＲＮＡまたはｐｉＲＮＡである、核酸キャリア。
【0009】
３．前記項目１において、前記ＲＮＡは、ＩＤＯ（indoleamine 2,3-dioxygenase） ｓｉＲＮＡである、核酸キャリア。
【0010】
４．前記項目１において、前記ＣｐＧ－ＯＤＮと前記ＲＮＡはリンカーを介して結合している、核酸キャリア。
【0011】
５．前記項目４において、前記リンカーは、飽和アルキル鎖（Ｃ３～Ｃ１８）、トリゾールリンカー（trizole linker）、または４－メチル－６，７，８，９，１０，１０ａ－ヘキサヒドロ－５Ｈ－３λ２－シクロオクタ［ｄ］ピリダジンリンカー（4-methyl-6，7，8，9，10，10a-hexahydro-5H-3λ2-cycloocta［d］pyridazine linker）である、核酸キャリア。
【0012】
６．前記項目３において、前記ＩＤＯ ｓｉＲＮＡは、配列番号１および２のｓｉＲＮＡ、配列番号３および４のｓｉＲＮＡ、配列番号５および６のｓｉＲＮＡ、配列番号７および８のｓｉＲＮＡ、または配列番号９および１０のｓｉＲＮＡを含む、核酸キャリア。
【0013】
７．前記項目３において、前記ｓｉＲＮＡは、Ｎ末端またはＣ末端に、ＩＤＯ ｍＲＮＡに対して相補的な配列を１～１０ｎｔさらに含む、核酸キャリア。
【0014】
８．前記項目３において、前記ＩＤＯ ｓｉＲＮＡは、配列番号１１および１２のｓｉＲＮＡを含む、核酸キャリア。
【0015】
９．前記項目１において、前記ＣｐＧ－ＯＤＮは、ＣｐＧ－Ａ ＯＤＮ、ＣｐＧ－Ｂ ＯＤＮ、またはＣｐＧ－Ｃ ＯＤＮである、核酸キャリア。
【0016】
１０．前記項目１において、前記ＣｐＧ－ＯＤＮは、配列番号１３～１５のいずれか１つのヌクレオチドを含む、核酸キャリア。
【0017】
１１．前記項目１において、前記多孔性シリカ粒子は、気孔内部が陽電荷に帯電されたものである、核酸キャリア。
【0018】
１２．前記項目１において、前記多孔性シリカ粒子は、前記コンジュゲート担持前のゼータ電位が５～８０ｍＶである、核酸キャリア。
【0019】
１３．前記項目１において、前記コンジュゲートと前記粒子の重量比は１：１～２０である、核酸キャリア。
【0020】
１４．前記項目１において、前記粒子のＢＥＴ表面積は２００～７００ｍ２／ｇであり、粒径は５０～１０００ｎｍである、核酸キャリア。
【0021】
１５．前記項目１の核酸キャリアを含み、前記ＲＮＡは、ＩＤＯ（indoleamine 2,3-dioxygenase） ｓｉＲＮＡである、癌の予防または治療用薬学組成物。
【0022】
１６．前記項目１５において、前記癌は、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵胞癌腫、婦人癌、泌尿器癌、前立腺癌、腎臓癌、精巣癌、陰茎癌、尿生殖路癌、精巣腫、膀胱癌、皮膚癌、肉腫、骨肉腫、悪性骨腫瘍、軟部組織肉腫、角化棘細胞腫、黒色腫、肺癌、小細胞肺癌腫、非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、肺扁平細胞癌、結腸癌、乳頭癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、乳房内分泌癌、肝胆膵癌、肝癌、胆管癌、胆嚢癌、胆道癌、膵臓癌、骨癌、骨髄障害、リンパ障害、ヘアリー細胞癌、口腔および咽頭（経口）癌、口唇癌、舌癌、口腔癌、唾液腺癌、咽頭癌、甲状腺癌、喉頭癌、食道癌、胃癌、胃腸管癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、大腸癌、子宮内膜癌、子宮癌、脳癌、神経膠腫、非膠腫性腫瘍、悪性神経膠腫、脳転移癌、脳髄膜腫、聴神経鞘腫、脳下垂体腫瘍、頭頸部癌、中枢神経系の癌、腹膜癌、肝細胞癌、頭部癌、頸部癌、原発性腫瘍、転移性腫瘍、リンパ腫、扁平上皮癌、血液癌、内分泌癌、ホジキン、または白血病である、組成物。
【0023】
１７．下記配列で構成されるＲＮＡ。
（１）配列番号１および２のｓｉＲＮＡ、
（２）配列番号３および４のｓｉＲＮＡ、
（３）配列番号５および６のｓｉＲＮＡ、
（４）配列番号７および８のｓｉＲＮＡ、または
（５）配列番号９および１０のｓｉＲＮＡ
（１）配列番号１および２のｓｉＲＮＡ、
（２）配列番号３および４のｓｉＲＮＡ、
（３）配列番号５および６のｓｉＲＮＡ、
（４）配列番号７および８のｓｉＲＮＡ、または
（５）配列番号９および１０のｓｉＲＮＡ
【0024】
１８．前記項目１７において、前記ｓｉＲＮＡは、Ｎ末端またはＣ末端に、ＩＤＯ ｍＲＮＡに対して相補的な配列を１～１０ｎｔさらに含む、ＲＮＡ。
【0025】
１９．前記項目１７において、前記ＲＮＡは、配列番号１１および１２のｓｉＲＮＡで構成される、ＲＮＡ。
【0026】
２０．前記項目１７において、前記ＲＮＡは、Ｎ末端またはＣ末端に結合したＣｐＧ－ＯＤＮをさらに含む、ＲＮＡ。
【0027】
２１．前記項目２０において、前記ＣｐＧ－ＯＤＮは、ＣｐＧ－Ａ ＯＤＮ、ＣｐＧ－Ｂ ＯＤＮ、またはＣｐＧ－Ｃ ＯＤＮである、ＲＮＡ。
【0028】
２２．前記項目２０において、前記ＣｐＧ－ＯＤＮは、配列番号１３～１５のいずれか１つのヌクレオチドを含む、ＲＮＡ。
【0029】
２３．前記項目２０において、前記ＣｐＧ－ＯＤＮとｓｉＲＮＡは、リンカーを介して結合している、ＲＮＡ。
【0030】
２４．前記項目２３において、前記リンカーは、飽和アルキル鎖（Ｃ３～Ｃ１８）、トリゾールリンカー（trizole linker）、または４－メチル－６，７，８，９，１０，１０ａ－ヘキサヒドロ－５Ｈ－３λ２－シクロオクタ［ｄ］ピリダジンリンカー（4-methyl-6，7，8，9，10，10a-hexahydro-5H-3λ2-cycloocta［d］pyridazine linker）である、ＲＮＡ。
【発明の効果】
【0031】
本発明のＲＮＡを含む核酸分子は、ＩＤＯ（indoleamine 2,3-dioxygenase）の発現を高効率で阻害することができる。
【0032】
本発明のＲＮＡおよびＣｐＧ－ＯＤＮを含む核酸分子は、Ｉ型インターフェロンを増加させ、そのＲＮＡの固有の機能を示すことができる。
【0033】
本発明の核酸キャリアは、担持された核酸分子を体内に安定に送達し、標的に放出して、Ｉ型インターフェロンを増加させ、そのＲＮＡの固有の機能を示すことができる。
【0034】
本発明の組成物は、優れた抗癌活性を示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図5】図５は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の気孔直径別の顕微鏡写真である。ＤＤＶ（Degradable Delivery Vehicle（分解性送達賦形剤））は、実施例の粒子であり、括弧内の数字は粒子の直径を、下付き文字の数字は気孔の直径を意味する。例えば、ＤＤＶ（２００）１０は、粒子直径が２００ｎｍ、気孔直径が１０ｎｍである実施例の粒子を意味する。
【図13a】図１３ａは、本発明の一実施形態による核酸分子を担持した多孔性シリカ粒子（ＬＥＭ－Ｓ４０３）の特性を分析した結果である。図１３ａのａは、ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯの送達に最適化されたＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬのＴＥＭ画像および物理的特性（表面積、気孔サイズ、ゼータ電位、平均サイズ、気孔サイズおよびロード容量）を示す。図１３ａのａの左下のバーは、長さが２００ｎｍであることを示す。図１３ａのｂは、ヒトおよび動物研究のためのＬＥＭ－Ｓ４０３の配列を示す。
【図13b】図１３ｂは、本発明の一実施形態による核酸分子を担持した多孔性シリカ粒子（ＬＥＭ－Ｓ４０３）の特性を分析した結果である。図１３ｂのｃは、様々な量のＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬに担持されるＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯの担持容量を示す。担持容量は、重量比が１対５（Cargo対DegradaBALL）のとき、ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯの９０％が室温で３０分以内にＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬに担持された。図１３ｂのｄは、３７℃の擬似生体溶液におけるＬＥＭ－Ｓ４０３の累積放出運動プロファイルを示す。図１３ｂのｅは、ＲＴ－ＰＣＲによるＡ５４９細胞およびＣＴ２６腫瘍におけるＬＥＭ－Ｓ４０３によるＩＤＯ１のノックダウンを示す。図１３ｂのｆは、マウスＰＢＭＣにおけるＬＥＭ－Ｓ４０３の細胞取り込み効率テストを示す。マウスＰＢＭＣを分離し、バッファー、ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ（ＦＩＴＣ）（１００ｎＭ）またはＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ（ＦＩＴＣ）ｗｉｔｈ ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ（１００ｎＭ）で６時間処理した。ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ（ＦＩＴＣ）の担持効率は、フローサイトメトリーによって分析した。図１３ｂのｈは、ｆのｇａｔｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓに基づくＰＢＭＣの形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）およびｎｏｎ－ｐＤＣ中の細胞内ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ（ＦＩＴＣ）の定量分析を示す。データ（群当たりｎ＝３）は、平均±ＳＤで示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１ ｖｓ 他の群。
【図14】図１４は、ＬＥＭＩＤＯのＩＤＯ１遺伝子ノックダウン効率およびＩ型ＩＦＮの誘導効率を示す。図１４のａでは、Ａ５４９細胞を様々な濃度（１０、５０および１５０ｎＭ）のＬＥＭ－Ｓ４０３または比較対照群サンプルで１２時間処理した。その後、ＩＦＮ－γの８０ｎｇ／ｍｌをさらに１２時間加えて、ＩＤＯ１遺伝子の発現を誘導した。データ（群当たりｎ＝３）は平均±ＳＥＭで示す。群の比較は一元分散分析を利用した。＊ｐ＜０．０５および＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｓ ＩＦＮ－γのみを処理した群。図１４のｂは、Ａ５４９細胞におけるＬＥＭ－Ｓ４０３の長期ＩＤＯ１遺伝子ノックダウン効率を示す。比較のために、細胞をそれぞれ１５０ｎＭのＬＥＭ－Ｓ４０３およびＬＮＰに担持されたＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯで処理した。１２時間のＩＦＮ－γ誘導を含んで細胞を２４、４８および７２時間培養した。群の比較は一元分散分析を利用した。＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１。図１４のｃは、ヒトＰＭＢＣを様々な濃度（７．８２、１５．６３、３１．２５、６２．５、１２５、２５０および５００ｎＭ）のＬＥＭ－Ｓ４０３で１２時間処理した後、ＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭ ＩＮＦ－ａ／ｂ細胞を用いて、上澄み液に存在する分泌されたI型ＩＦＮを分析した結果を示す。グラフは、群当たりの平均±ＳＥＭ、ｎ＝３を示す。図１４のｄは、ヒトＰＭＢＣを、ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬを有するかまたは有しないｓｉＩＤＯ（１２５ｎＭ）、ＣｐＧ－ＯＤＮ（１２５ｎＭ）、ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ（１２５ｎＭ）で処理し、細胞を２２時間さらに培養した後、ＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭ ＩＮＦ－ａ／ｂ細胞を用いて、上澄み液に存在する分泌されたI型ＩＦＮを分析した結果を示す。データ（群当たりｎ＝４）は平均±ＳＤを示す。群の比較は一元分散分析を利用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｓ 非処理群。図１４のｅは、５つの異なる配置のヒトＰＭＢＣを用いたＬＥＭ－Ｓ４０３のＩ型ＩＦＮ誘導テストを示す。データ（群当たりｎ＝５）は平均±ＳＤで示す。群の比較は一元分散分析を利用した。＊ｐ＜０．０５。
【図15a】図１５ａは、ＣＴ２６同系マウスモデルにおけるＬＥＭ－Ｓ４０３の持続放出システムおよび向上した生体分布を示す。図１５ａのａは、腫瘍イメージングおよびフローサイトメトリーのための治療スケジュールを示す。腫瘍イメージング試験において、マウスは、バッファー、７０μｇのＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ（ＴＡＭＲＡ）、１４μｇのＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ（Ｃｙ５）または１４μｇのＬＥＭＩＤＯ（ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ（Ｃｙ５）ｗｉｔｈ ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ（ＴＡＭＲＡ））で処理された。治療後１日目及び３日目に腫瘍を体外イメージングおよび免疫蛍光染色をするために分離した。フローサイトメトリーにおいて、マウスは７０μｇのＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ、１４μｇのＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ（ＦＩＴＣ）、またはＬＥＭＩＤＯ（ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ（Ｃｙ５））ｗｉｔｈ ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ（ＴＡＭＲＡ）が処理された。治療後１日目及び３日目にフローサイトメトリーのために腫瘍とリンパ節を分離した。図１５ａのｂは、ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬと結合しているかまたは結合していない場合におけるＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯの持続放出プロフィールを示す。図１５ａのｃは、樹状細胞（ｃｄ１１ｃ）、ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬおよびＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯの分布を示す腫瘍組織の組織学的断面画像を示す。
【図15b】図１５ｂは、ＣＴ２６同系マウスモデルにおけるＬＥＭ－Ｓ４０３の持続放出システムおよび向上した生体分布を示す。図１５ｂのｄは、リンパ球、非リンパ球（主に腫瘍細胞）および腫瘍の全細胞におけるＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ（ＦＩＴＣ）の時間依存的（１日及び３日）な内在化を示す。ＦＩＴＣ－接合されたＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯの百分率は、フローサイトメトリーによって決定された。データ（ｎ＝群当たりマウス３匹）は平均±ＳＤで示す。両群の比較は、スチューデントのt検定（student's t-test（two-tailed））で行った。＊ｐ＜０．０５及び＊＊＊ｐ＜０．００１。図１５ｂのｅは、流入領域リンパ節（draining lymph nodes）におけるＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ（ＦＩＴＣ）の時間依存的（１日及び３日）な内在化を示す。両群の比較は、スチューデントのt検定（student's t-test（two-tailed））で行った。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図16a】図１６ａは、ＣＴ２６同系マウスモデルにおけるＬＥＭＩＤＯの腫瘍内注射の治療効果を示す。図１６ａのａは、ａＰＤ－１ ａｂ、ＣｐＧ－ＯＤＮ、ｓｉＩＤＯおよびＬＥＭ－Ｓ４０３の投与経路および注射当たりの投与量（活性医薬成分（ＡＰＩ）およびＤｅｇｒａＢＡＬＬ）をまとめた治療スケジュールおよび表を示す。図１６ａのｂは、ＣＴ２６同系マウスモデルにおける平均腫瘍体積を用いた腫瘍成長曲線を示す（ｎ＝群当たりマウス６匹）。データは平均±ＳＥＭで示す。両群の比較は、スチューデントのt検定（student's t-test（two-tailed））で行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｓ ビヒクル（vehicle）群。図１６ａのｃは、バッファー、ビヒクル、ａＰＤ－１ ａｂ、ＣｐＧ－ＯＤＮ＋ビヒクル、ｓｉＩＤＯ＋ビヒクル、ＬＥＭ－Ｓ４０３（３．５／７／１４μｇ）またはＬＥＭ－Ｓ４０３（１４μｇ）ｗｉｔｈ ａＰＡ－１ ａｂで処理されたマウスの生存百分率を示す。バッファー、ビヒクル、ａＰＤ－１ ａｂ、ＣｐＧ－ＯＤＮ＋ビヒクル、ｓｉＩＤＯ＋ビヒクルおよびＬＥＭ－Ｓ４０３の３．５μｇの群とは非常に異なる値を示す（＊＊ｐ＜０．０１、ログランクＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。図４ａのｄは、ａＰＤ－１ ａｂ、ａＣＴＬＡ－４ ａｂおよびＬＥＭ－Ｓ４０３の投与経路および注射当たりの投与量（活性医薬成分（ＡＰＩ）およびＤｅｇｒａＢＡＬＬ）をまとめた表を示す。図１６ａのｅは、ＣＴ２６同系マウスモデルにおける平均腫瘍体積による腫瘍成長曲線を示す（ｎ＝群当たりマウス６匹）。データは平均±ＳＥＭで示す。両群の比較は、スチューデントのt検定（student's t-test（two-tailed））で行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１ vs ビヒクル群。＃ｐ＜０．０５及び＃＃ｐ＜０．０１ ｖｓ ＬＥＭ－Ｓ４０３群。図１６ａのｆは、図１６ａのｅのマウスの生存百分率を示す。ＬＥＭ－Ｓ４０３群とは大きく異なる値を示す（＊＊＊ｐ＜０．００１、ログランクＭａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ検定）。
【図16b】図１６ｂは、ＣＴ２６同系マウスモデルにおけるＬＥＭＩＤＯの腫瘍内注射の治療効果を示す。図１６ｂのｇは、ＣＴ２６同系マウスモデルにおけるＬＥＭ－Ｓ４０３の抗腫瘍メカニズム試験のための処理スケジュールを示す。マウスをバッファー、ビヒクル、ＣｐＧ－ＯＤＮ＋ビヒクル、ｓｉＩＤＯ＋ビヒクルまたはＬＥＭ－Ｓ４０３で０日目及び３日目に２回処理し、最後の処理から２４時間後にマウスを犠牲にした。図１６ｂのｈでは、腫瘍内細胞の割合は、アネキシンＶ（Annexin V）およびＰＩで二重染色した後、フローサイトメトリーに基づいて決定された。データ（ｎ＝群当たりマウス６匹）は平均±ＳＤで示す。群の比較は一元分散分析を利用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１対バッファー、ビヒクルおよびＣｐＧ－ＯＤＮ＋ビヒクル群。＃ｐ＜０．０５ ｖｓ ｓｉＩＤＯ＋ビヒクル群。図１６ｂのｉは、切片化された腫瘍のＴＵＮＥＬ染色を示す。スケールバーは１００μｍを示す。図１６ｂのｊは、腫瘍におけるｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ１、ＩＤＯ１およびキヌレニン（Kynurenine）の免疫蛍光染色を示す。図１６ｂのｋは、ｊに示される画像に基づく蛍光信号の定量化データを示す。データ（ｎ＝群当たりマウス３匹）は平均±ＳＤで示す。群の比較は一元分散分析を利用した。＊＊＊ｐ＜０．００１。１、４日目にＩＤＯ１のｍＲＮＡ発現レベルをＲＴ－ＰＣＲで測定した。データ（ｎ＝群当たりマウス３匹）は平均±ＳＤで示す。群の比較は一元分散分析を利用した。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図17a】図１７ａは、ＣＴ２６同系マウスモデルにおけるＬＥＭ－Ｓ４０３の抗腫瘍免疫反応を示す。図１７ａのａは、モデルにおける抗腫瘍免疫反応を分析するための治療スケジュールを示す。図１７ａのｂは、腫瘍微小環境（Tumor microenvironment、TME）における樹状細胞の成熟頻度および最後の処理から２４時間後の流入領域リンパ節（draining lymph nodes、dLNs）を示す。データ（ｎ＝群当たりマウス５匹）は平均±ＳＤで示す。群の比較は一元分散分析を利用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｓ バッファー群。図１７ａのｃは、ＴＭＥでＣＤ８６を示す代表的なフローサイトメトリーグラフである。
【図17b】図１７ｂは、ＣＴ２６同系マウスモデルにおけるＬＥＭ－Ｓ４０３の抗腫瘍免疫反応を示す。図１７ｂのｄ及びｅは、腫瘍におけるＮＫ１．１＋細胞およびＮＫ１．１＋ＣＤ６９＋細胞の免疫細胞浸潤および免疫蛍光染色を示す。両群の比較は一元分散分析を利用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１。図１７ｂのｆ及びｇは、腫瘍におけるＣＤ８＋細胞およびＣＤ８＋ＣＤ６９＋細胞の免疫細胞浸潤および免疫蛍光染色を示す。両群の比較は一元分散分析を利用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１。図１７ｂのｈは、最後の処理から２４時間後の腫瘍におけるＴｒｅｇ細胞の頻度を示す。両群の比較は一元分散分析を利用した。＊＊＊ｐ＜０．００１。図１７ｂのｉは腫瘍におけるＣＤ８／ｔｒｅｇ細胞比を示す。両群の比較は一元分散分析を利用した。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図18a】図１８ａは、ＣＴ２６同系モデルにおける遠隔腫瘍に対するＬＥＭ－Ｓ４０３の治療効果（アブスコパル効果）を示す。図１８ａのａは、モデルにおけるアブスコパル（abscopal）効果を評価するための治療スケジュールを示す。マウスは、バッファー、ビヒクル、ａＰＤ－１ ａｂ、ＣｐＧ－ＯＤＮ＋ビヒクル、ｓｉＩＤＯ＋ビヒクル、ＬＥＭ－Ｓ４０３（１４μｇ）、ＬＥＭ－Ｓ４０３（１４μｇ）ｗｉｔｈ ａＰＤ－１ ａｂまたはＬＥＭ－Ｓ４０３（１４μｇ）ｗｉｔｈ ａＣＴＬＡ－４ ａｂを３～４日毎に４回投与した。図１８ａのｂは、Ｂａｌｂ／ｃマウスの相対的な平均腫瘍体積を有する末端腫瘍（非注入）増殖曲線（ｎ＝群当たりマウス６匹）を示す。データは平均±ＳＥＭで示す。両群の比較は、スチューデントのt検定（student's t-test（two-tailed））を利用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｓ ビヒクル群。＃ｐ＜０．０５ ｖs ＬＥＭ－Ｓ４０３群。図１８ａのｃは、遠隔腫瘍における抗腫瘍活性および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）分析に関する治療スケジュールを示す。
【図18b】図１８ｂは、ＣＴ２６同系モデルにおける遠隔腫瘍に対するＬＥＭ－Ｓ４０３の治療効果（アブスコパル効果）を示す。図１８ｂのｄは、切開された遠隔腫瘍のＴＵＮＥＬ染色を示し、スケールバーは１００μｍを示す。図１８ｂのｅは、白血球、好中球およびリンパ球の細胞数を示す。循環する白血球、好中球およびリンパ球の細胞数は、全血中でＨｅｍａｖｅｔを用いて評価した。データ（ｎ＝群当たりマウス５匹）は平均±ＳＤで示す。両群の比較は、スチューデントのt検定（student's t-test（two-tailed））を利用した。＊ｐ＜０．０５ ｖｓ バッファー群。図１８ｂのｆ、ｇ及びｈは、遠隔腫瘍（ｎ＝マウス５匹）における免疫細胞集団（ｆ，ＮＫ１．１＋細胞およびＮＫ１．１＋ＣＤ６９＋細胞、ｇ，ＣＤ８＋細胞およびＣＤ８＋ＣＤ６９＋細胞、ｈ，Ｔｒｅｇ細胞）はフローサイトメトリーによって分析した。両群の比較は一元分散分析を利用した。＊ｐ＜０．０５及び＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【0036】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0037】
本発明は核酸キャリアに関するものである。
【0038】
本発明の核酸キャリアは、ＣｐＧ－ＯＤＮ－ＲＮＡコンジュゲートおよびそれを気孔内に担持した多孔性シリカ粒子を含む。
【0039】
ＣｐＧ－ＯＤＮ－ＲＮＡコンジュゲートは、ＣｐＧ－ＯＤＮ（オリゴジオキシヌクレオチド）とＲＮＡのコンジュゲートである。ＣｐＧ－ＯＤＮは、メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む短い合成の一本鎖オリゴヌクレオチドである。メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドは、メチル化されていないシトシン－グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、「ＣｐＧ ＤＮＡ」、または５’シトシンに３’グアニンが続き、ホスフェート結合によって連結されたＤＮＡ）を含み、免疫系を活性化する核酸分子である。全ＣｐＧオリゴヌクレオチドがメチル化されていなくてもよいし、一部がメチル化されていなくてもよいが、少なくとも５’ＣＧ３’のＣはメチル化されてはいけない。本明細書で使用される用語「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」または「ＣｐＧ核酸」とは、特に取り立てて言及しない限り、免疫刺激性のＣｐＧオリゴヌクレオチドまたは核酸を指す。
【0040】
ＣｐＧ－ＯＤＮをコンジュゲートすることにより、Ｉ型インターフェロンを増加させることができる。
【0041】
ＣｐＧ－ＯＤＮは、その種類（class）を限定しないが、例えば、Ａ、ＢまたはＣクラスであってもよく、Ａクラス（ＣｐＧ－Ａ ＯＤＮ）であってもよい。Ａクラスを使用する場合は、Ｉ型ＩＦＮの誘発（induction）の観点から好ましい。
【0042】
ＣｐＧ－ＯＤＮとしては、当該分野で公知の配列を制限なく用いることができ、例えば、配列番号１３～１５の配列を用いることができ、具体的には配列番号１３の配列を用いることができる。
【0043】
ＣｐＧ－ＯＤＮは、例えば、その長さは１０～１００ｎｔ、１０～８０ｎｔ、１０～５０ｎｔ、１５～８０ｎｔ、１５～５０ｎｔ、１０～４０ｎｔ、１０～３０ｎｔ、１５～４０ｎｔ、１５～３０ｎｔ、１０～２５ｎｔ、１５～２５ｎｔ、２０～２５ｎｔであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0044】
ＣｐＧ－ＯＤＮは、リンカーを介して前記ＲＮＡに結合することができる。リンカーとしては、当該分野で公知のものを制限なく使用することができ、例えば、飽和アルキル鎖（Ｃ３～Ｃ１８）、トリゾールリンカー（trizole linker）、または４－メチル－６，７，８，９，１０，１０ａ－ヘキサヒドロ－５Ｈ－３λ２－シクロオクタ［ｄ］ピリダジンリンカー（4-methyl-6，7，8，9，10，10a-hexahydro-5H-3λ2-cycloocta［d］pyridazine linker）などを用いることができる。体内副反応、副作用を最小限に抑える観点から、好ましくは飽和アルキル鎖を使用することができる。飽和アルキル鎖としては、Ｃ３～Ｃ１８、Ｃ３～Ｃ１５、Ｃ３～Ｃ１２、Ｃ３～Ｃ１０、Ｃ４～Ｃ１５、Ｃ４～Ｃ１２、Ｃ４～Ｃ１０、Ｃ４～Ｃ８、Ｃ５～Ｃ１５、Ｃ５～Ｃ１２、Ｃ５～Ｃ１０、Ｃ３ ～Ｃ８、Ｃ３～Ｃ６、Ｃ４～Ｃ６のものを使用することができる。ＣｐＧ ＯＤＮとＲＮＡがリンカーを介して強く結合することによって、ＣｐＧ ＯＤＮの使用時の副作用であるＴ ｒｅｇ細胞をインクルト（incruit）する問題を防止することができる。
【0045】
ＲＮＡとしては、送達が必要なものであれば制限なく使用することができ、例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ａＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、環状（circul）ＲＮＡまたはｐｉＲＮＡであってもよい。例えば、薬理活性を示すＲＮＡであってもよい。
【0046】
具体的には、ＲＮＡはＩＤＯ ｓｉＲＮＡであってもよい。
【0047】
ＲＮＡは、ＣｐＧ－ＯＤＮの５’末端または３’末端に結合しているものであってもよい。
【0048】
ＩＤＯ（インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（indoleamine 2,3-dioxygenase））は、ＩＤＯ１またはＩＤＯ２であってもよい。ＩＤＯ ｓｉＲＮＡは、ヒトＩＤＯ ｍＲＮＡまたはイヌＩＤＯ ｍＲＮＡを標的とするものであってもよい。例えば、配列番号３２（ヒトＩＤＯ１ ｍＲＮＡ）または配列番号３３（イヌＩＤＯ１ ｍＲＮＡ）のｍＲＮＡを標的とすることができる。
【0049】
ＩＤＯ ｓｉＲＮＡは、ＩＤＯ ｍＲＮＡの発現を阻害できるものであれば、その配列、長さなどを制限しない。例えば、配列番号１および２のｓｉＲＮＡ、配列番号３および４のｓｉＲＮＡ、配列番号５および６のｓｉＲＮＡ、配列番号７および８のｓｉＲＮＡ、または配列番号９および１０のｓｉＲＮＡを含むことができ、その発現抑制率の観点から、好ましくは、配列番号５および６のｓｉＲＮＡ、配列番号７および８のｓｉＲＮＡ、または配列番号９および１０のｓｉＲＮＡを含むことができる。
【0050】
ＩＤＯ ｓｉＲＮＡは、そのＮ末端またはＣ末端に結合した１～１０ｎｔの塩基をさらに含むことができる。このような長さの延長は安定性を改善するためのものであってもよい。追加に含まれる塩基は、標的ｍＲＮＡに対する発現抑制効率を阻害するものでなければ制限なく使用することができ、例えば標的に対する相補的な塩基であってもよい。その長さは１～１０ｎｔ、１～８ｎｔ、１～６ｎｔなどであってもよい。例えば、配列番号１１および１２のｓｉＲＮＡを用いることができる。
【0051】
ＲＮＡは、例えば、その長さが１０～５０ｎｔ、１０～３０ｎｔ、１０～２５ｎｔ、１５～２５ｎｔ、１７～２５ｎｔ、１８～２５ｎｔ、１７～２３ｎｔ、１８～２３ｎｔなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0052】
コンジュゲートは、粒子への担持のためにＣｐＧ ＯＤＮまたはＲＮＡの一端または両端に、多孔性シリカ粒子と結合できる官能基がさらに結合したものであってもよい。生物学、化学分野で互いにカップリング可能な官能基、またはそれを有する化合物を制限なく適用することができる。そのようなカップリングされる官能基が前記コンジュゲートと粒子の気孔内部に使用され、その官能基間のカップリング反応によってコンジュゲートを多孔性シリカ粒子に担持させることができる。
【0053】
多孔性シリカ粒子は、前記コンジュゲートを気孔内に担持したものである。前記コンジュゲートは、気孔内に担持することによって、外部環境から保護することができる。
【0054】
また、ＣｐＧ－ＯＤＮとＲＮＡがコンジュゲートの形で気孔内に担持されるので、ＣｐＧ－ＯＤＮのみを担持して送達する場合に比べてＴｒｅｇ細胞収集防止効果を示すことができ、ＲＮＡのみ担持して送達する場合に比べてＣｐＧ－ＯＤＮの使用による免疫改善効果を示すことができる。これらをそれぞれ担持して送達する場合に比べてもＴｒｅｇ細胞群をさらに減少させることができ、腫瘍のＣＤ８／Ｔｅｇ比が高い。
【0055】
多孔性シリカ粒子はシリカ（ＳｉＯ２）素材の粒子であり、ナノサイズの粒径を有する。
【0056】
多孔性シリカナノ粒子は多孔性粒子であり、ナノサイズの気孔を有し、その表面及び／又は気孔内部に核酸分子を担持することができる。
【0057】
多孔性シリカ粒子は平均気孔直径が７～３０ｎｍである。
【0058】
平均気孔直径は、前記範囲内で、例えば７～３０ｎｍ、前記範囲内で、例えば７～２５ｎｍ、７～２３ｎｍ、１０～２５ｎｍ、１３～２５ｎｍ、７～２０ｎｍ、７～１８ｎｍ、１０～２０ｎｍ、１０～１８ｎｍ、１２～１８ｎｍ、１２～１６ｎｍ、１４～１８ｎｍ、１４～１６ｎｍ、１５～１６ｎｍなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0059】
多孔性シリカ粒子は、前記平均気孔直径を有することにより、その気孔内部に前記核酸分子を十分に担持して送達することができる。
【0060】
多孔性シリカ粒子は、気孔内部が陽電荷に帯電されたものであってもよい。例えば、ゼータ電位は５～８０ｍＶであってもよい。前記範囲内で、例えば５～８０ｍＶ、５～７０ｍＶ、５～６０ｍＶ、５～５５ｍＶ、１０～８０ｍＶ、１０～７０ｍＶ、１０～６０ｍＶ、１０～５５ｍＶ、２０～８０ｍＶ、２０～７０ｍＶ、２０～６０ｍＶ、２０～５５ｍＶ、３０～８０ｍＶ、３０～７０ｍＶ、３０～６０ｍＶ、３０～５５ｍＶ、４０～８０ｍＶ、４０～７０ｍＶ、４０～６０ｍＶ、４０～５５ｍＶ、５０～８０ｍＶ、５０～７０ｍＶ、５０～６０ｍＶ、５０～５５ｍＶなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0061】
電荷を帯びる粒子が標的細胞に取り込まれるとき（例えば、エンドサイトーシスなどの過程によって）、細胞内に入った粒子はエンドソーム内の低いｐＨによって強い陽電荷を帯びることになる。これはエンドソームの膜を横切る水の拡散による浸透圧を誘発し、液胞（vacuole、空胞）の形成につながることがある。
【0062】
粒子の陽電荷が強い場合には、細胞膜が粒子を包むとき、より大きく開くようになって粒子以外の細胞外液（extracellular fluid）、又はそれに含まれているいくつかのタンパク質などの異物が標的細胞内に共に流入することがある。その場合には、異物の流入による予期せぬ効果が発生したり、異物が流入しない場合に比べて粒子が相対的に少なく流入し、粒子の十分な送達による薬効の発現が困難になることがある。これに対して、本発明は、ＣｐＧ ＯＤＮ－ＲＮＡ複合体を担持した粒子の電荷を最適化することにより、この問題を防止することができる。
【0063】
また、粒子の陽電荷が弱い場合には、担持効率が低下することがあるので、本発明は、ＣｐＧ ＯＤＮ－ＲＮＡ複合体を担持した粒子の電荷を最適化することにより、この問題を防止することができる。
【0064】
コンジュゲートが、ＣｐＧ ＯＤＮまたはＲＮＡの一端または両端にカップリング官能基を有するものであれば、多孔性シリカ粒子は、気孔内部にそれとカップリングできる官能基を有するように表面改質されたものであってもよい。
【0065】
核酸分子（コンジュゲート）の粒子への担持割合は、例えば核酸分子と多孔性シリカ粒子の重量比が１：１～２０であってもよい。含有量比が前記範囲内であると、核酸分子が十分に担持され、核酸分子が担持されていない空の多孔性シリカ粒子が発生することを防止することができる。これにより、強い陽電荷を持つ粒子が細胞に送達されることを防止することができる。前記範囲内で、例えば１：１～２０、１：３～２０、１：３～１５、１：３～１２、１：３～１０、１：５～２０、１：５～１５、１：５～１０などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0066】
具体的には、本発明の送達体を個体に投与するために、核酸分子を担持した多孔性シリカ粒子は分散媒に分散されているものであってもよく、これは多孔性シリカ粒子と核酸分子を分散媒に入れて攪拌して得られたものであってもよい。これに関し、核酸分子に対して粒子の量が多すぎると、核酸分子を十分に担持していない空の粒子が発生することがある。核酸分子に対して粒子の量が少なすぎると、粒子に担持されない残りの核酸分子が発生することがある。
【0067】
本発明の一実施形態では、多孔性シリカ粒子は下記仕様を有するものであってもよい。例えば、気孔サイズは７～３０ｎｍ、具体的には１２～１８ｎｍ、より具体的には１４～１６ｎｍであってもよい。粒径は５０～１０００ｎｍ、具体的には２００～５００ｎｍ、より具体的には２５０～３５０ｎｍであってもよい。表面積は２００～７００ｍ２／ｇ、具体的には３６０～４８０ｍ２／ｇであってもよい。ゼータ電位は、核酸分子担持前の状態で５ｍＶ以上、具体的には２０ｍＶ～７０ｍＶ、より具体的には４０ｍＶ～６０ｍＶであってもよい。粒子は、核酸分子を重量比が１：１～２０、具体的には１：５～１０となるように担持することができる。
【0068】
多孔性シリカ粒子は、図２３に例示するように、複数の気孔を有し、前記気孔は粒子の表面から内部までつながっていてもよい。これにより、核酸分子を気孔内部に十分に担持させることができる。各気孔は互いに連結されていてもよい（inter connected）。
【0069】
多孔性シリカ粒子は生分解性粒子であってもよい。これにより、核酸分子を担持して体内に投与した場合、体内で生分解されて核酸分子を放出することができるが、体内で徐々に分解され、担持された核酸分子を徐放的に放出させることができる。例えば、下記数式１の吸光度の比が１／２となるｔは２４以上である。
【0070】
［数式１］
Ａｔ／Ａ０
（式中、Ａ０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
前記懸濁液のｐＨは、７．４であり、
Ａｔは、前記Ａ０の測定時からｔ時間経過後に測定した多孔性シリカ粒子の吸光度である。）
Ａｔ／Ａ０
（式中、Ａ０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
前記懸濁液のｐＨは、７．４であり、
Ａｔは、前記Ａ０の測定時からｔ時間経過後に測定した多孔性シリカ粒子の吸光度である。）
【0071】
前記数式１は、多孔性シリカ粒子が体内と同様の環境でどの程度の速度で分解されるかを意味するものである。
【0072】
前記数式１における吸光度Ａ０、Ａｔは、例えば図３４に示されているように、円筒状の透過膜に多孔性シリカ粒子および懸濁液を入れ、透過膜の外部にも同じ懸濁液を入れて測定したものであってもよい。
【0073】
多孔性シリカ粒子は生分解性であり、懸濁液中で徐々に分解され得る。直径５０ｋＤａは約５ｎｍに相当するものであり、生分解された多孔性シリカ粒子は直径５０ｋＤａの透過膜を通過することができる。円筒状の透過膜は、６０ｒｐｍの水平攪拌下にあるので、懸濁液を均一に混合することができ、分解された多孔性シリカ粒子は透過膜の外部に放出され得る。
【0074】
前記数式１における吸光度は、例えば、透過膜の外部の懸濁液が新しい懸濁液に入れ替わる環境下で測定したものであってもよい。懸濁液は、持続的に入れ替わるものであってもよく、一定期間ごとに入れ替わるものであってもよい。前記一定期間は、定期的または不定期的な期間であってもよい。例えば、１時間～１週間の範囲内で、１時間おき、２時間おき、３時間おき、６時間おき、１２時間おき、２４時間おき、２日おき、３日おき、４日おき、７日おきなどに入れ替えることができるが、これらに限定されるものではない。
【0075】
前記「吸光度の比が１／２となる」ということは、ｔ時間後の吸光度が初期吸光度の半分になるということであり、これは多孔性シリカ粒子の約半分が分解されたことを意味する。
【0076】
前記懸濁液は緩衝溶液であってもよく、具体例としては、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）およびＳＢＦ（疑似体液）からなる群より選択される１種以上であってもよく、より具体的にはＰＢＳであってもよい。
【0077】
前記数式１の吸光度の比が１／２となるｔは２０以上であり、例えばｔは２４～１２０であってもよく、例えば、前記範囲内で２０～９６、２４～９６、２４～７２、３０～７０、４０～７０、５０～６５などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0078】
多孔性シリカ粒子は、前記数式１の吸光度の比が１／５となるｔが、例えば７０～１４０であってもよく、例えば、前記範囲内で８０～１４０、８０～１２０、８０～１１０、７０～１４０、７０～１２０、７０～１１０などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0079】
多孔性シリカ粒子は、前記数式１の吸光度の比が１／２０となるｔが、例えば１３０～２２０であってもよく、例えば、前記範囲内で１３０～２００、１４０～２００、１４０～１８０、１５０～１８０などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0080】
多孔性シリカ粒子は、測定される吸光度が０．０１以下となるｔが、例えば、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、５００以上、１，０００以上などであってもよく、その上限は２，０００であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0081】
多孔性シリカ粒子における前記数式１の吸光度の比とｔは、高い正の相関関係を有するものであり、例えば、ピアソン相関係数が０．８以上であってもよく、例えば０．９以上、０．９５以上であってもよい。
【0082】
前記数式１のｔは、多孔性シリカ粒子が体内と同様の環境でどの程度の速度で分解されるかを意味するものである。これは、例えば多孔性シリカ粒子の表面積、粒径、気孔直径、表面及び／又は気孔内部の置換基、表面の緻密さの程度などを調節することによって調節できる。
【0083】
例えば、粒子の表面積を増加させてｔを減少させるか、表面積を減少させてｔを増加させることができる。表面積は、粒子の直径、気孔の直径を調節することによって調節できる。また、表面及び／又は気孔内部に置換基を位置させ、多孔性シリカ粒子が環境（溶媒など）に直接露出することを減らしてｔを増加させることができる。また、多孔性シリカ粒子に核酸分子を担持させ、核酸分子と多孔性シリカ粒子間の親和度を増加させ、多孔性シリカ粒子が環境に直接露出することを減らしてｔを増加させることができる。また、粒子の製造時に表面をより緻密に製造してｔを増加させることもできる。前記に数式１のｔを調節できる様々な例を示したが、それらに限定されるものではない。
【0084】
多孔性シリカ粒子は、例えば球状粒子であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0085】
多孔性シリカ粒子の粒径は、例えば５０～１，０００ｎｍであってもよい。前記範囲内で、例えば５０～１，０００ｎｍ、５０～５００ｎｍ、５０～４００ｎｍ、５０～３５０ｎｍ、１００～１，０００ｎｍ、１００～５００ｎｍ、１００～４５０ｎｍ、１００～４００ｎｍ、１００～３５０ｎｍ、１５０～４００ｎｍ、１５０～３５０ｎｍ、２００～４００ｎｍ、２００～３５０ｎｍ、２５０～４００ｎｍ、２５０～３５０ｎｍ、２８０～３５０ｎｍなどであってもよいが、これらに制限されるものではない。
【0086】
多孔性シリカ粒子のＢＥＴ表面積は、例えば２００～７００ｍ２／ｇであってもよい。例えば、前記範囲内で２００ｍ２／ｇ～７００ｍ２／ｇ、２２０ｍ２／ｇ～６８０ｍ２／ｇ、２２０ｍ２／ｇ～６２０ｍ２／ｇ、２８０ｍ２／ｇ～６８０ｍ２／ｇ、２８０ｍ２／ｇ～５８０ｍ２／ｇ、２８０ｍ２／ｇ～５２０ｍ２／ｇ、２８０ｍ２／ｇ～４８０ｍ２／ｇ、３２０ｍ２／ｇ～６２０ｍ２／ｇ、３２０ｍ２／ｇ～５８０ｍ２／ｇ、３２０ｍ２／ｇ～５２０ｍ２／ｇ、３２０ｍ２／ｇ～４８０ｍ２／ｇ、３２０ｍ２／ｇ～４５０ｍ２／ｇ、３２０ｍ２／ｇ～４２０ｍ２／ｇ、３６０ｍ２／ｇ～４８０ｍ２／ｇ、３６０ｍ２／ｇ～４２０ｍ２／ｇなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0087】
本発明の多孔性シリカナノ粒子は、気孔のｇ当たりの体積が例えば０．７ｍｌ～２．２ｍｌであってもよい。例えば、前記範囲内で０．７ｍｌ～２．０ｍｌ、０．８ｍｌ～２．２ｍｌ、０．８ｍｌ～２．０ｍｌ、０．９ｍｌ～２．０ｍｌ、１．０ｍｌ～２．０ｍｌなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0088】
多孔性シリカ粒子は、平均気孔直径５ｎｍ未満の小気孔粒子の気孔が平均直径７～３０ｎｍに拡張されたものであってもよい。これにより、気孔直径が大きくなって大きな核酸分子を気孔内部に担持することができ、気孔直径に比べて粒径自体は大きくないため、細胞内への送達および吸収が容易である。
【0089】
本発明の多孔性シリカ粒子は、外部表面及び／又は気孔内部が陽電荷に帯電されたものであってもよい。例えば、表面および気孔内部の両方が陽電荷に帯電されてもよく、表面または気孔内部のみが陽電荷に帯電されてもよい。前記帯電は、例えば、陽イオン性置換基が存在することによって行われたものであり得る。
【0090】
前記陽イオン性置換基は、例えば、塩基性基としてアミノ基、その他の窒素含有基などであってもよく、前記陰イオン性置換基は、例えば、酸性基としてカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、スルホン酸基（－ＳＯ３Ｈ）、チオール基（－ＳＨ）などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0091】
前記帯電によって前記置換基の調節により核酸分子の放出環境に対する多孔性シリカ粒子の相互作用を調節し、ナノ粒子自体の分解速度を調節して、核酸分子の放出速度を調節することができる。また、核酸分子は、ナノ粒子から拡散して放出することもできるが、前記置換基の調節により核酸分子のナノ粒子への結合力を調節し、核酸分子の放出を調節することができる。
【0092】
また、多孔性シリカ粒子は、その表面及び／又は気孔内部に前記の他に核酸分子の担持、核酸分子の標的細胞への移動、その他の目的のための物質の担持、又はその他の追加置換基の結合などのための置換基が存在してもよく、それに結合された抗体、リガンド、細胞透過性のペプチドまたはアプタマーなどをさらに含んでいてもよい。
【0093】
前述した表面及び／又は気孔内部の置換基、電荷、結合物質などは、例えば、表面改質によって付加することができる。
【0094】
表面改質は、例えば、導入しようとする置換基を有する化合物を粒子と反応させて行うことができる。前記化合物は、例えば、Ｃ１～Ｃ１０のアルコキシ基を有するアルコキシシランであってもよいが、これに限定されるものではない。前記アルコキシシランは、前記アルコキシ基を１つ以上有するものであり、例えば１～３つを有することができ、アルコキシ基の結合していない部位に導入しようとする置換基があるか、又はそれで置換された置換基があってもよい。
【0095】
多孔性シリカ粒子は、例えば、小気孔の粒子の製造および気孔拡張工程を経て製造したものであってもよく、必要に応じて、か焼（calcination）工程、表面改質工程などをさらに経て製造したものであってもよい。か焼および表面改質工程をすべて経た場合は、か焼後に表面改質されたものであってもよい。
【0096】
前記小気孔の粒子は、例えば、平均気孔直径が１ｎｍ～５ｎｍの粒子であってもよい。
【0097】
前記小気孔の粒子は、溶媒に界面活性剤とシリカ前駆物質を入れて攪拌および均質化して得ることができる。
【0098】
前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、γ－ブチロラクトン、１，３－ジメチル－イミダゾリジノン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、４－ヒドロキシ－４－メチル－２－ペンタノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラメチルベンゼンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類（セロソルブ）；その他ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ－ジエチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルメトキシアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルホスホアミド、テトラメチル尿素、Ｎ－メチルカプロラクタム、テトラヒドロフラン、ｍ－ジオキサン、Ｐ－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタンなどを使用でき、具体的にはアルコール、より具体的にはメタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【0099】
前記溶媒において、水と有機溶媒の混合溶媒の使用時の割合は、例えば、水と有機溶媒を１：０．７～１．５の体積比、例えば１：０．８～１．３の体積比で使用できるが、これらに限定されるものではない。
【0100】
前記界面活性剤は、例えば、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、ＴＭＡＢｒ（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム）、ＴＭＰｒＣｌ（塩化ヘキサデシルトリメチルピリジニウム）、ＴＭＡＣｌ（塩化テトラメチルアンモニウム）などであってもよく、具体的にはＣＴＡＢを使用することができる。
【0101】
前記界面活性剤は、例えば、溶媒１リットル当たりに１ｇ～１０ｇ、例えば、前記範囲内で１ｇ～８ｇ、２ｇ～８ｇ、３ｇ～８ｇなどの量で添加できるが、これらに限定されるものではない。
【0102】
前記シリカ前駆物質は、溶媒に界面活性剤を添加して攪拌した後に添加することができる。シリカ前駆物質は、例えば、ＴＭＯＳ（テトラメチルオルソシリケート）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0103】
前記攪拌は、例えば１０分～３０分間行うことができるが、これに限定されるものではない。
【0104】
前記シリカ前駆物質は、例えば溶媒１リットル当たりに０．５ｍｌ～５ｍｌ、例えば、前記範囲内で０．５ｍｌ～４ｍｌ、０．５ｍｌ～３ｍｌ、０．５ｍｌ～２ｍｌ、１ｍｌ～２ｍｌなどの量で添加できるが、これらに限定されるものではない。
【0105】
必要に応じて、触媒として水酸化ナトリウムをさらに使用することができるが、これは溶媒に界面活性剤を添加した後、シリカ前駆物質の添加前に撹拌しながら添加することができる。
【0106】
前記水酸化ナトリウムは、例えば、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を基準で溶媒１リットル当たりに０．５ｍｌ～８ｍｌ、例えば、前記範囲内で０．５ｍｌ～５ｍｌ、０．５ｍｌ～４ｍｌ、１ｍｌ～４ｍｌ、１ｍｌ～３ｍｌ、２ｍｌ～３ｍｌなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0107】
前記シリカ前駆物質の添加後に溶液を攪拌して反応させることができる。攪拌は、例えば２時間～１５時間行うことができ、例えば、前記範囲内で３時間～１５時間、４時間～１５時間、４時間～１３時間、５時間～１２時間、６時間～１２時間、６時間～１０時間などであってもよいが、これらに限定されるものではない。攪拌時間（反応時間）が短すぎると、結晶核生成（nucleation）が不足することがある。
【0108】
前記攪拌の後には、溶液を熟成（aging）させることができる。熟成は、例えば、８時間～２４時間行うことができ、例えば、前記範囲内で８時間～２０時間、８時間～１８時間、８時間～１６時間、８時間～１４時間、１０時間～１６時間、１０時間～１４時間などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0109】
その後、反応産物を洗浄および乾燥して多孔性シリカ粒子を得ることができる。必要に応じて、洗浄の前に未反応物質の分離を先行することができる。
【0110】
前記未反応物質の分離は、例えば、遠心分離で上澄み液を分離して行うことができる。遠心分離は、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、例えば、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0111】
前記洗浄は、水及び／又は有機溶媒で行うことができ、具体的には、溶媒ごとに溶解できる物質が異なるので、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記洗浄する回数は、例えば２回以上１０回以下、例えば、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
【0112】
前記有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、γ－ブチロラクトン、１，３－ジメチル－イミダゾリジノン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、４－ヒドロキシ－４－メチル－２－ペンタノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラメチルベンゼンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類（セロソルブ）；その他ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ－ジエチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルメトキシアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルホスホアミド、テトラメチル尿素、Ｎ－メチルカプロラクタム、テトラヒドロフラン、ｍ－ジオキサン、Ｐ－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタンなどを使用でき、具体的にはアルコール、より具体的にはエタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【0113】
前記洗浄は遠心分離下で行うことができ、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、例えば、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0114】
前記洗浄は、遠心分離をせずに、フィルタで粒子をろ過して行うこともできる。フィルタは、多孔性シリカ粒子の直径以下の気孔を有するものであってもよい。反応液を、そのようなフィルタでろ過すると、粒子だけがフィルタの上に残り、そのフィルタの上に水及び／又は有機溶媒を注ぎ、洗浄することができる。
【0115】
前記洗浄時には、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記洗浄する回数は、例えば、２回以上１０回以下、例えば、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
【0116】
先に例示した方法により製造される粒子は、その表面および気孔内部に、反応に用いられた残留有機物質（界面活性剤など）が残っていることがあるので、それを除去するために洗浄が行われるものであり得る。通常、この有機物質の除去のために、酸処理（または酸性の有機溶媒処理）を行うことができるが、本発明は、この酸処理を行わないため、洗浄後も気孔内部に残留有機物質が残っているものであり得る。
【0117】
前記乾燥は、例えば２０℃～１００℃で行うことができるが、これらに限定されず、真空状態で行うこともできる。
【0118】
その後、前記で得られた多孔性シリカ粒子の気孔を拡張する。気孔の拡張は、気孔膨張剤を用いて行うことができる。
【0119】
前記気孔膨張剤としては、例えば、トリメチルベンゼン、トリエチルベンゼン、トリプロピルベンゼン、トリブチルベンゼン、トリペンチルベンゼン、トリヘキシルベンゼン、トルエン、ベンゼンなどを使用でき、具体的にはトリメチルベンゼンを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【0120】
また、前記気孔膨張剤としては、例えばＮ，Ｎ－ジメチルヘキサデシルアミン（N,N-dimethylhexadecylamine、DMHA）を使用できるが、これに限定されるものではない。
【0121】
前記気孔の拡張は、例えば、溶媒中の多孔性シリカ粒子を気孔膨張剤と混合し、加熱して反応させて行うことができる。
【0122】
前記溶媒は、例えば、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；などを使用でき、具体的にはアルコール、より具体的にはエタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【0123】
前記多孔性シリカ粒子は、例えば、溶媒１リットル当たりに１０ｇ～２００ｇ、例えば、前記範囲内で１０ｇ～１５０ｇ、１０ｇ～１００ｇ、３０ｇ～１００ｇ、４０ｇ～１００ｇ、５０ｇ～１００ｇ、５０ｇ～８０ｇ、６０ｇ～８０ｇなどの割合で添加できるが、これらに限定されるものではない。
【0124】
前記多孔性シリカ粒子は、溶媒中に均一に分散されているものであってもよく、例えば、溶媒に多孔性シリカ粒子を添加して超音波分散したものであってもよい。混合溶媒を使用する場合には、第１の溶媒に多孔性シリカ粒子を分散した後、第２の溶媒を添加したものであってもよい。
【0125】
前記気孔膨張剤は、例えば、溶媒１００体積部に対して１０～２００体積部、前記範囲内で１０～１５０体積部、１０～１００体積部、１０～８０体積部、３０～８０体積部、３０～７０体積部などの割合で添加できるが、これらに限定されるものではない。
【0126】
前記反応は、例えば１２０℃～１９０℃で行うことができる。例えば、前記範囲内で１２０℃～１９０℃、１２０℃～１８０℃、１２０℃～１７０℃、１３０℃～１７０℃、１３０℃～１６０℃、１３０℃～１５０℃、１３０℃～１４０℃などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【0127】
前記反応は、例えば６時間～９６時間行うことができる。例えば、前記範囲内で３０時間～９６時間、３０時間～９６時間、３０時間～８０時間、３０時間～７２時間、２４時間～８０時間、２４時間～７２時間、３６時間～９６時間、３６時間～８０時間、３６時間～７２時間、３６時間～６６時間、３６時間～６０時間、４８時間～９６時間、４８時間～８８時間、４８時間～８０時間、４８時間～７２時間、６時間～９６時間、７時間～９６時間、８時間～８０時間、９時間～７２時間、９時間～８０時間、６時間～７２時間、９時間～９６時間、１０時間～８０時間、１０時間～７２時間、１２時間～６６時間、１３時間～６０時間、１４時間～９６時間、１５時間～８８時間、１６時間～８０時間、１７時間～７２時間などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0128】
前記例示した範囲内で時間および温度を調節して、反応が過剰せずに十分に行われるようにすることができる。例えば、反応温度が低くなると反応時間を増やしたり、反応温度が高くなると反応時間を短くしたりすることができる。反応が十分でないと、気孔の拡張が十分でないことがあり、反応が進行しすぎると、気孔の過剰拡張により粒子が崩壊することがある。
【0129】
前記反応は、例えば、段階的に昇温して行うことができる。具体的には、常温から前記温度まで０．５℃／分～１５℃／分の速度で段階的に昇温して行うことができ、例えば、前記範囲内で１℃／分～１５℃／分、３℃／分～１５℃／分、３℃／分～１２℃／分、３℃／分～１０℃／分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0130】
前記反応は、攪拌下で行うことができる。例えば１００ｒｐｍ以上の速度で攪拌することができ、具体的には１００ｒｐｍ～１，０００ｒｐｍの速度で行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【0131】
前記反応後は、反応液を徐々に冷却することができ、例えば、段階的に減温して冷却することができる。具体的には、前記温度から常温まで０．５℃／分～２０℃／分の速度で段階的に減温して行うことができ、例えば、前記範囲内で１℃／分～２０℃／分、３℃／分～２０℃／分、３℃／分～１２℃／分、３℃／分～１０℃／分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0132】
粒子の製造後に酸処理で洗浄していない場合には、気孔内部の残留物質が前記気孔の拡張にも関与して、より十分に均一に気孔を拡張することができる。
【0133】
前記冷却後に反応産物を洗浄および乾燥し、気孔が拡張された多孔性シリカ粒子を得ることができる。必要に応じて、洗浄の前に未反応物質の分離を先行することができる。
【0134】
前記未反応物質の分離は、例えば、遠心分離で上澄み液を分離して行うことができる。遠心分離は、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、例えば、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0135】
前記洗浄は、水及び／又は有機溶媒で行うことができる。具体的には、溶媒ごとに溶解できる物質が異なるので、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記洗浄する回数は、例えば２回以上、１０回以下、例えば、３回、４回、５回、６回、７回、８回などであってもよい。
【0136】
前記有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；などを使用することができ、具体的にはアルコール、より具体的にはエタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【0137】
前記洗浄は遠心分離下で行うことができ、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、例えば、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0138】
前記洗浄は遠心分離をせずに、フィルタで粒子をろ過して行うこともできる。フィルタは、多孔性シリカ粒子の直径以下の気孔を有するものであってもよい。反応液を、そのようなフィルタでろ過すると、粒子だけがフィルタの上に残り、そのフィルタの上に水及び／又は有機溶媒を注ぎ、洗浄することができる。
【0139】
前記洗浄時には、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記洗浄する回数は、例えば２回以上１０回以下、例えば、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
【0140】
粒子の製造後に酸処理で洗浄していない場合には、気孔拡張後も気孔内部の残留物質が残っていることがあり、気孔拡張後の洗浄時にも酸処理を行うことができるが、本発明は、酸処理を行うことなく、後述するか焼によって残留物質を除去することができる。
【0141】
前記乾燥は、例えば２０℃～１００℃で行うことができるが、これに限定されるものではなく、真空状態で行うこともできる。
【0142】
その後、得られた粒子は、か焼することができる。か焼は、粒子を加熱してその表面および内部のシラノール基を除去して粒子の反応性を下げ、より緻密な構造にし、気孔を満たす有機物を除去する工程であり、例えば４００℃以上の温度に加熱して行うことができる。その上限は特に限定されず、例えば１，０００℃、９００℃、８００℃、７００℃等であってもよい。加熱は、例えば３時間以上、４時間以上などを行うことができる。その上限は特に限定されず、例えば２４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、５時間などであってもよい。具体的には、４００℃～７００℃で３時間～８時間、より具体的には５００℃～６００℃で４時間～５時間行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【0143】
気孔を満たす有機物を除去することにより、残存有機物によって示される細胞毒性、泡の発生などの問題を防止することができる。
【0144】
その後、得られた多孔性シリカ粒子は、表面改質することができる。表面改質は、表面及び／又は気孔内部に行うことができる。粒子表面と気孔内部は、同じように表面改質してもよく、異なるように表面改質してもよい。
【0145】
前記表面改質により粒子が帯電されるようにすることができる。
【0146】
表面改質は、例えば、導入しようとする陽イオン性置換基を有する化合物を粒子と反応させて行うことができる。前記化合物は、例えばＣ１～Ｃ１０のアルコキシ基を有するアルコキシシランであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0147】
前記アルコキシシランは、前記アルコキシ基を１個以上有するものであり、例えば１～３個有することができ、アルコキシ基が結合していない部位に導入しようとする置換基があるか、又はそれで置換された置換基があってもよい。
【0148】
前記アルコキシシランを多孔性シリカ粒子と反応させると、シリコン原子と酸素原子との共有結合が形成され、アルコキシシランが多孔性シリカ粒子の表面及び／又は気孔内部と結合することができる。前記アルコキシシランは、導入しようとする置換基を有しているので、当該置換基を多孔性シリカ粒子の表面及び／又は気孔内部に導入することができる。
【0149】
前記反応は、溶媒に分散した多孔性シリカ粒子をアルコキシシランと反応させて行うことができる。
【0150】
前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、γ－ブチロラクトン、１，３－ジメチル－イミダゾリジノン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、４－ヒドロキシ－４－メチル－２－ペンタノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラメチルベンゼンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類（セロソルブ）；その他ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ－ジエチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルメトキシアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルホスホアミド、テトラメチル尿素、Ｎ－メチルカプロラクタム、テトラヒドロフラン、ｍ－ジオキサン、Ｐ－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタンなどを使用でき、具体的にはトルエンを使用できるが、これらに制限されるものではない。
【0151】
前記陽電荷での帯電は、例えばアミノ基、アミノアルキル基などの窒素含有基などの塩基性基を有するアルコキシシランと反応させて行うことができる。具体的には、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（N-［3-（Trimethoxysilyl）propyl］ethylenediamine）、Ｎ１－（３－トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン（N1-（3-Trimethoxysilylpropyl）diethylenetriamine）、（３－アミノプロピル）トリメトキシシラン（（3-Aminopropyl）trimethoxysilane）、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］アニリン（N-［3-（Trimethoxysilyl）propyl］aniline）、トリメトキシ［３－（メチルアミノ）プロピル］シラン（Trimethoxy［3－（methylamino）propyl］silane）、３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン（3-（2-Aminoethylamino）propyldimethoxymethylsilane）などを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【0152】
また、前記表面改質は、複合的に行うこともできる。例えば、外部表面または気孔内部に２回以上の表面改質を行うこともできる。具体例として、アミノ基が導入されたシリカ粒子にカルボキシル基を含む化合物をアミド結合で結合して陽電荷に帯電した粒子を、他の表面特性を持つように変化させることができるが、これに限定されるものではない。
【0153】
前記多孔性シリカ粒子のアルコキシシランとの反応は、例えば、加熱下で行うことができる。加熱は、例えば８０℃～１８０℃、例えば、前記範囲内で８０℃～１６０℃、８０℃～１５０℃、１００℃～１６０℃、１００℃～１５０℃、１１０℃～１５０℃などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【0154】
前記多孔性シリカ粒子のアルコキシシランとの反応は、例えば４時間～２０時間、例えば、前記範囲内で４時間～１８時間、４時間～１６時間、６時間～１８時間、６時間～１６時間、８時間～１８時間、８時間～１６時間、８時間～１４時間、１０時間～１４時間などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【0155】
前記反応温度、時間、そして表面改質に使用される化合物の量などは、表面改質しようとする程度によって選択でき、核酸分子の電荷の程度によって反応条件を変えて多孔性シリカ粒子の電荷の程度を調節することにより、核酸分子の放出速度を調節することができる。例えば、核酸分子が中性のｐＨで強い陰電荷を帯びる場合には、多孔性シリカ粒子が強い陽電荷を帯びるようにするために、反応温度を高くしたり、反応時間を長くしたり、化合物の処理量を増やすことができるが、これらに限定されるものではない。
【0156】
また、本発明の多孔性シリカ粒子は、例えば、小気孔の粒子の製造、気孔の拡張、表面改質、気孔内部の改質工程を経て製造されたものであってもよい。
【0157】
前記小気孔の粒子の製造および気孔拡張工程は前述通りの工程によって行うことができ、小気孔の粒子の製造後、そして気孔拡張工程の後に洗浄および乾燥工程を行うことができる。
【0158】
必要に応じて、洗浄の前に未反応物質の分離を先行することができる。未反応物質の分離は、例えば遠心分離で上澄み液を分離して行うことができる。
【0159】
前記遠心分離は、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、具体的には、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0160】
前記小気孔の粒子の製造後の洗浄は、先に例示した範囲内の方法／条件で行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【0161】
前記気孔拡張後の洗浄は、先の例示よりは緩和された条件で行うことができる。例えば、洗浄を３回以内行うことができるが、これに限定されるものではない。
【0162】
前記表面改質と気孔内部改質のそれぞれは、前述通りの工程によって行うことができる。表面改質と気孔内部改質の順に工程を行うことができ、前記両工程の間に粒子の洗浄工程をさらに行うことができる。
【0163】
前記小気孔の粒子の製造および気孔拡張の後に洗浄をより緩和された条件で行う場合、気孔内部には粒子製造、気孔拡張に使用された界面活性剤などの反応液が満たされているため、表面改質時に気孔内部が改質されずに、表面だけが改質され得る。その後、粒子を洗浄すると、気孔内部の反応液が除去され得る。
【0164】
前記表面改質工程と気孔内部改質工程との間の粒子の洗浄は、水及び／又は有機溶媒で行うことができる。具体的には、溶媒ごとに溶解できる物質が異なるので、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記洗浄する回数は、例えば２回以上１０回以下、具体的には、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
【0165】
前記洗浄は遠心分離下で行うことができ、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、具体的には、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0166】
前記洗浄は遠心分離をせずに、フィルタで粒子をろ過して行うこともできる。フィルタは、多孔性シリカ粒子の直径以下の気孔を有するものであってもよい。反応液をそのようなフィルタでろ過すると、粒子だけがフィルタの上に残り、そのフィルタの上に水及び／又は有機溶媒を注ぎ、洗浄することができる。
【0167】
前記洗浄時には、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記洗浄する回数は、例えば２回以上１０回以下、具体的には、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
【0168】
前記乾燥は、例えば２０℃～１００℃で行うことができるが、これに限定されるものではなく、真空状態で行うこともできる。
【0169】
核酸分子は、多孔性シリカ粒子の表面及び／又は気孔内部に担持することができる。担持は、例えば、溶媒中の多孔性シリカ粒子と核酸分子とを混合して行うことができる。
【0170】
前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；などを使用することができる。
【0171】
また、前記溶媒として、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、ＳＢＦ（疑似体液）、ホウ酸塩－緩衝食塩水（Borate-buffered saline）、トリス－緩衝食塩水（Tris-buffered saline）などを使用することもできる。
【0172】
前記多孔性シリカ粒子に担持された核酸分子は、延長された時間をかけて段階的に放出され得る。このような遅い放出は、連続または非連続性、線形または非線形であってもよく、多孔性シリカ粒子の特徴及び／又はそれと核酸分子との相互作用に起因して異なり得る。
【0173】
前記多孔性シリカ粒子に担持された核酸分子は、多孔性シリカ粒子が生分解されながら放出されるが、本発明に係る多孔性シリカ粒子は徐々に分解され、担持された核酸分子が徐放的に放出されるようにすることができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子の表面積、粒径、気孔直径、表面及び／又は気孔内部の置換基、表面の緻密さの程度などを調節することで調節できるが、これらに限定されるものではない。
【0174】
また、前記多孔性シリカ粒子に担持された核酸分子は、多孔性シリカ粒子から離脱して拡散しながらも放出できる。これは多孔性シリカ粒子と核酸分子、核酸分子の放出環境との関係に影響を受けるものであるところ、これを調整して、核酸分子の放出を調節することができる。例えば、表面改質によって多孔性シリカ粒子の核酸分子との結合力を強化または弱化させることによって調節することができる。
【0175】
核酸分子は、必要な治療の種類、放出環境、使用される多孔性シリカ粒子に依存して、例えば７日～１年またはそれ以上の期間にわたって放出され得る。
【0176】
また、多孔性シリカ粒子は、生分解性で１００％分解され得るので、これに担持された核酸分子は、１００％放出され得る。
【0177】
また、本発明は、癌の予防または治療用医薬組成物に関するものである。
【0178】
本発明の医薬組成物は前記核酸キャリアを含む。
【0179】
核酸分子および多孔性シリカ粒子は、前述の範囲内のものであってもよい。
【0180】
本発明の組成物は抗癌効果を有するものであり、この効果は担持された核酸分子を体内に安定的に送達し、標的に放出して、ＩＤＯ－１（インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（indoleamine 2,3-dioxygenase））の発現阻害によるものであり得る。
【0181】
ＩＤＯ１の発現を阻害することにより、ＩＤＯ１によるキヌレニン（ＫＹＮ）の生成を防止でき、Ｔｒｅｇ細胞の分化を抑制することができる。
【0182】
本発明の組成物の予防または治療対象となる癌は、前記経路によって予防または治療できる全ての癌であり、例えば、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵胞癌腫、婦人癌、泌尿器癌、前立腺癌、腎臓癌、精巣癌、陰茎癌、尿生殖路癌、精巣腫、膀胱癌、皮膚癌、肉腫、骨肉腫、悪性骨腫瘍、軟部組織肉腫、角化棘細胞腫、黒色腫、肺癌、小細胞肺癌腫、非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、肺扁平細胞癌、結腸癌、乳頭癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、乳房内分泌癌、肝胆膵癌、肝癌、胆管癌、胆嚢癌、胆道癌、膵臓癌、骨癌、骨髄障害、リンパ障害、ヘアリー細胞癌、口腔および咽頭（経口）癌、口唇癌、舌癌、口腔癌、唾液腺癌、咽頭癌、甲状腺癌、喉頭癌、食道癌、胃癌、胃腸管癌、小腸癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、大腸癌、子宮内膜癌、子宮癌、脳癌、神経膠腫、非膠腫性腫瘍、悪性神経膠腫、脳転移癌、脳髄膜腫、聴神経鞘腫、脳下垂体腫瘍、頭頸部癌、中枢神経系の癌、腹膜癌、肝細胞癌、頭部癌、頸部癌、原発性腫瘍、転移性腫瘍、リンパ腫、扁平上皮癌、血液癌、内分泌癌、ホジキン、または白血病などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0183】
本発明の組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、担体と共に製剤化することができる。本発明で用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せず投与化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤を意味する。液状溶液に製剤化される組成物において薬学的に許容可能な担体は、滅菌および生体に適したものとして、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のうち１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液および静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。
【0184】
本発明の組成物は、いずれの剤型にも適用可能であり、経口用または非経口用の剤形に製造することができる。本発明の薬学的剤形は、口腔（oral）、直腸（rectal）、鼻腔（nasal）、局所（topical；頬および舌下を含む）、皮下、膣（vaginal）または非経口（parenteral；筋肉内、皮下および静脈内を含む）投与に適したもの、あるいは吸入（inhalation）または注入（insufflation）による投与に適した形態を含む。
【0185】
本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与する。有効容量は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、排出割合、治療期間、同時使用される薬物を含む要素、およびその他の医学分野でよく知られている要素によって決定できる。本発明の薬学的組成物は、個々の治療剤として投与してもよく、他の治療剤と併用して投与してもよい。また、従来の治療剤と順次または同時に投与することができ、単一または多重投与することができる。前記の要素をすべて考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定され得る。
【0186】
本発明の組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食物、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによってその範囲が非常に多様である。適正な投与量は、例えば、患者の体内に蓄積された薬物の量及び／又は使用される本発明の送達体の具体的な効能程度によって異なり得る。例えば、体重１ｋｇ当たりに０．０１μｇ～１ｇであってもよい。日、週、月、または年の単位期間に、単位期間当たりに一回または数回に分けて投与してもよく、若しくはインフュージョンポンプを用いて長期間連続して投与してもよい。反復投与の回数は、薬物の体内滞在時間、体内薬物濃度などを考慮して決定する。疾患の治療経過によっては、治療された後でも再発防止のために組成物を投与することができる。
【0187】
本発明の組成物は、例えば腫瘍内に投与されるものであってもよい。
【0188】
本発明の組成物は、創傷の治療に関して同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上、または有効成分の溶解性及び／又は吸収性を維持／増加させる化合物をさらに含有することができる。
【0189】
また、本発明の組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供できるように、当該分野で公知の方法を用いて剤形化することができる。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質のゼラチンカプセル、滅菌注射液、滅菌粉末の形態であってもよい。
【0190】
また、本発明はＲＮＡに関するものである。
【0191】
本発明のＲＮＡは、下記配列で構成することができる。
（１）配列番号１および２のｓｉＲＮＡ、
（２）配列番号３および４のｓｉＲＮＡ、
（３）配列番号５および６のｓｉＲＮＡ、
（４）配列番号７および８のｓｉＲＮＡ、または
（５）配列番号９および１０のｓｉＲＮＡ
（１）配列番号１および２のｓｉＲＮＡ、
（２）配列番号３および４のｓｉＲＮＡ、
（３）配列番号５および６のｓｉＲＮＡ、
（４）配列番号７および８のｓｉＲＮＡ、または
（５）配列番号９および１０のｓｉＲＮＡ
【0192】
本発明のｓｉＲＮＡは、ＩＤＯ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡであってもよい。
【0193】
本発明のｓｉＲＮＡは、そのＮ末端またはＣ末端に結合した１～１０ｎｔの塩基をさらに含むことができる。このような長さの延長は安定性を改善するためのものであってもよい。追加に含まれる塩基は、そのｓｉＲＮＡのｍＲＮＡに対する発現抑制効率を阻害するものでなければ制限なく使用することができ、例えば標的に対する相補的な塩基であってもよい。その長さは１～１０ｎｔ、１～８ｎｔ、１～６ｎｔなどであってもよい。例えば、配列番号１１および１２のｓｉＲＮＡを用いることができる。
【0194】
ＩＤＯ ｓｉＲＮＡは、例えば、その長さが１０～５０ｎｔ、１０～３０ｎｔ、１０～２５ｎｔ、１５～２５ｎｔ、１７～２５ｎｔ、１７～２３ｎｔなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0195】
本発明のＲＮＡは、そのＮ末端に結合したＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ）をさらに含むことができる。すなわち、本発明のＲＮＡはＣｐＧ－ＯＤＮ－ＩＤＯ ｓｉＲＮＡコンジュゲートであってもよい。
【0196】
ＣｐＧ－ＯＤＮは、その種類（class）は限定されないが、例えば、Ａ、ＢまたはＣクラスであってもよく、Ａクラス（ＣｐＧ－Ａ ＯＤＮ）であってもよい。Ａクラスを使用する場合は、Ｉ型ＩＦＮの誘発 (induction)の観点から好ましい。
【0197】
ＣｐＧ－ＯＤＮとしては、当該分野で公知の配列を制限なく用いることができる。例えば、配列番号１３～１５の配列を用いることができ、具体的には配列番号１３の配列を用いることができる。
【0198】
ＣｐＧ－ＯＤＮは、例えば、その長さが１０～１００ｎｔ、１０～８０ｎｔ、１０～５０ｎｔ、１５～８０ｎｔ、１５～５０ｎｔ、１０～４０ｎｔ、１０～３０ｎｔ、１５～４０ｎｔ、１５～３０ｎｔ、１０～２５ｎｔ、１５～２５ｎｔ、２０～２５ｎｔであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0199】
ＣｐＧ－ＯＤＮは前記ｓｉＲＮＡのリンカーを介して結合することができる。リンカーとしては、当該分野で公知のものを制限なく使用することができる。例えば、飽和アルキル鎖（Ｃ３～Ｃ１８）、トリゾールリンカー（trizole linker）、４－メチル－６，７，８，９，１０，１０ａ－ヘキサヒドロ－５Ｈ－３λ２－シクロオクタ［ｄ］ピリダジンリンカー（4-methyl-6，7，8，9，10，10a-hexahydro-5H-3λ2-cycloocta［d］pyridazine linker）などを用いることができる。体内副反応、副作用を最小限に抑える観点から、好ましくは飽和アルキル鎖を使用することができる。飽和アルキル鎖としては、前述のように、Ｃ３～Ｃ１８、Ｃ３～Ｃ１５、Ｃ３～Ｃ１２、Ｃ３～Ｃ１０、Ｃ４～Ｃ１５、Ｃ４～Ｃ１２、Ｃ４～Ｃ１０、Ｃ４～Ｃ８、Ｃ５～Ｃ１５、Ｃ５～Ｃ１２、Ｃ５～Ｃ１０、Ｃ３～Ｃ８、Ｃ３～Ｃ６、Ｃ４～Ｃ６のものを使用することができる。
【0200】
ＲＮＡは、粒子への担持のためにＣｐＧ ＯＤＮまたはＩＤＯ ｓｉＲＮＡの一端または両端に多孔性シリカ粒子と結合できる官能基がさらに結合したものであってもよい。生物学、化学分野で互いにカップリング可能な官能基、またはそれを有する化合物を制限なく適用することができる。そのようなカップリングされる官能基が前記コンジュゲートと粒子の気孔内部に使用され、その官能基間のカップリング反応によってコンジュゲートを多孔性シリカ粒子に担持させることができる。
【0201】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【0202】
実施例
実施例１．多孔性シリカ粒子（ＤＤＶまたはＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ）
１．多孔性シリカ粒子の製造
（１）多孔性シリカ粒子の製造
１）小気孔粒子の製造
２Ｌ丸底フラスコに蒸留水（ＤＷ）の９６０ｍｌとＭｅＯＨの８１０ｍｌを入れた。前記フラスコにＣＴＡＢを７．８８ｇ入れた後、攪拌しながら１Ｍ ＮａＯＨの４．５２ｍｌを素早く入れた。１０分間攪拌して均一な混合液を得た後、ＴＭＯＳの２．６ｍｌを入れた。６時間攪拌して均一に混合した後、２４時間熟成し、反応液を得た。
実施例１．多孔性シリカ粒子（ＤＤＶまたはＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ）
１．多孔性シリカ粒子の製造
（１）多孔性シリカ粒子の製造
１）小気孔粒子の製造
２Ｌ丸底フラスコに蒸留水（ＤＷ）の９６０ｍｌとＭｅＯＨの８１０ｍｌを入れた。前記フラスコにＣＴＡＢを７．８８ｇ入れた後、攪拌しながら１Ｍ ＮａＯＨの４．５２ｍｌを素早く入れた。１０分間攪拌して均一な混合液を得た後、ＴＭＯＳの２．６ｍｌを入れた。６時間攪拌して均一に混合した後、２４時間熟成し、反応液を得た。
【0203】
その後、前記反応液を２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に５回洗浄した。
【0204】
その後、７０℃のオーブンで乾燥し、１．５ｇの粉末状の小気孔多孔性シリカ粒子（気孔平均直径２ｎｍ、粒径２００ｎｍ）を得た。
【0205】
２）気孔の拡張
１．５ｇの小気孔多孔性シリカ粒子の粉末をエタノール１０ｍｌに添加して超音波分散し、水１０ｍｌ、ＴＭＢ（trimethyl benzene）１０ｍｌを添加して超音波分散し、分散液を得た。
１．５ｇの小気孔多孔性シリカ粒子の粉末をエタノール１０ｍｌに添加して超音波分散し、水１０ｍｌ、ＴＭＢ（trimethyl benzene）１０ｍｌを添加して超音波分散し、分散液を得た。
【0206】
その後、前記分散液をオートクレーブに入れて１６０℃、４８時間反応させた。
【0207】
反応は２５℃で開始し、１０℃／分の速度で昇温して行った。その後、オートクレーブ内で１～１０℃／分の速度で徐々に冷却した。
【0208】
冷却した反応液を２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に５回洗浄した。
【0209】
その後、７０℃のオーブンで乾燥し、粉末状の多孔性シリカ粒子（気孔直径１０～１５ｎｍ、粒径２００ｎｍ）を得た。
【0210】
３）か焼
前記２）で製造された多孔性シリカ粒子をガラスバイアル（vial）に入れて５５０℃で５時間加熱し、反応終了後、常温まで徐々に冷却して粒子を製造した。
前記２）で製造された多孔性シリカ粒子をガラスバイアル（vial）に入れて５５０℃で５時間加熱し、反応終了後、常温まで徐々に冷却して粒子を製造した。
【0211】
（２）多孔性シリカ粒子の製造
気孔拡張時の反応条件を１４０℃、７２時間に変更した以外は、前記１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
気孔拡張時の反応条件を１４０℃、７２時間に変更した以外は、前記１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【0212】
（３）多孔性シリカ粒子の製造（１０Ｌスケール）
５倍大きな容器を使用し、各物質をいずれも５倍の容量で使用した以外は、実施例１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
５倍大きな容器を使用し、各物質をいずれも５倍の容量で使用した以外は、実施例１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【0213】
（４）多孔性シリカ粒子の製造（粒径３００ｎｍ）
小気孔粒子の製造時に蒸留水９２０ｍｌ、メタノール８５０ｍｌを使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
小気孔粒子の製造時に蒸留水９２０ｍｌ、メタノール８５０ｍｌを使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【0214】
（５）多孔性シリカ粒子の製造（粒径５００ｎｍ）
小気孔粒子の製造時に蒸留水８００ｍｌ、メタノール１，０１０ｍｌ、ＣＴＡＢ １０．６ｇを使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
小気孔粒子の製造時に蒸留水８００ｍｌ、メタノール１，０１０ｍｌ、ＣＴＡＢ １０．６ｇを使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【0215】
（６）多孔性シリカ粒子の製造（粒径１，０００ｎｍ）
小気孔粒子の製造時に蒸留水６２０ｍｌ、メタノール１，３８０ｍｌ、ＣＴＡＢ ７．８８ｇを使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
小気孔粒子の製造時に蒸留水６２０ｍｌ、メタノール１，３８０ｍｌ、ＣＴＡＢ ７．８８ｇを使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【0216】
（７）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径４ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを２．５ｍｌ使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
気孔拡張時にＴＭＢを２．５ｍｌ使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【0217】
（８）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径７ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを４．５ｍｌ使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
気孔拡張時にＴＭＢを４．５ｍｌ使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【0218】
（９）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径１７ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを１１ｍｌ使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
気孔拡張時にＴＭＢを１１ｍｌ使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【0219】
（１０）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径２３ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを１２．５ｍｌ使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
気孔拡張時にＴＭＢを１２．５ｍｌ使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【0220】
（１１）多孔性シリカ粒子の製造
小気孔粒子の製造時に蒸留水９００ｍｌ、メタノール８５０ｍｌ、ＣＴＡＢ ８ｇを使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
小気孔粒子の製造時に蒸留水９００ｍｌ、メタノール８５０ｍｌ、ＣＴＡＢ ８ｇを使用した以外は、１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【0221】
２．多孔性シリカ粒子の表面改質
（１）実施例１－１－（１）の多孔性シリカ粒子を（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3-Aminopropyl）triethoxysilane，ＡＰＴＥＳ）と反応させて、陽電荷に帯電させた。
（１）実施例１－１－（１）の多孔性シリカ粒子を（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3-Aminopropyl）triethoxysilane，ＡＰＴＥＳ）と反応させて、陽電荷に帯電させた。
【0222】
具体的には、１００ｍＬ丸底フラスコにおいて、１００ｍｇの多孔性シリカ粒子を１０ｍＬのトルエンに洗浄器（bath sonicator）で分散させた。その後、１ｍＬのＡＰＴＥＳを添加し、４００ｒｐｍで攪拌し、１３０℃で攪拌して１２時間反応させた。
【0223】
反応後、常温まで徐々に冷却し、１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に５回洗浄した。
【0224】
その後、７０℃のオーブン中で乾燥し、表面および気孔内部にアミノ基を有する粉末状の多孔性シリカ粒子を得た。
【0225】
（２）１．８ｍＬのＡＰＴＥＳを使用した以外は、前記と同様な方法で実施例１－１－（１１）を表面改質して、表面および気孔内部にアミノ基を有する粉末状の多孔性シリカ粒子を得た。
【0226】
３．粒子の形成および気孔拡張の確認
実施例１－１－（１）～（３）の粒子の小気孔粒子、製造された多孔性シリカ粒子を顕微鏡で観察し、小気孔粒子が均一に生成されているか、気孔が十分に拡張されて多孔性シリカ粒子が均一に形成されているかを確認した（図１～４）。
実施例１－１－（１）～（３）の粒子の小気孔粒子、製造された多孔性シリカ粒子を顕微鏡で観察し、小気孔粒子が均一に生成されているか、気孔が十分に拡張されて多孔性シリカ粒子が均一に形成されているかを確認した（図１～４）。
【0227】
図１は、実施例１－１－（１）の多孔性シリカ粒子の写真、図２は、実施例１－１－（２）の多孔性シリカ粒子の写真であり、気孔が十分に拡張された球状の多孔性シリカ粒子が均一に生成されたことを確認することができる。
【0228】
【0229】
４．気孔直径およびＢＥＴ表面積の計算
実施例１－１－（１）の小気孔粒子、実施例１－１－（１）、（７）、（８）、（１０）、（１１）の多孔性シリカ粒子の表面積を計算した。表面積は、ブルナウアー－エメット－テラー（Brunauer-Emmett-Teller）（ＢＥＴ）方法により計算し、気孔直径の分布は、バーレット－ジョイナー－ハレンダ（Barrett-Joyner-Halenda）（ＢＪＨ）方法により計算した。
前記各粒子の顕微鏡写真を図５に、計算の結果を下記表１に示す。
実施例１－１－（１）の小気孔粒子、実施例１－１－（１）、（７）、（８）、（１０）、（１１）の多孔性シリカ粒子の表面積を計算した。表面積は、ブルナウアー－エメット－テラー（Brunauer-Emmett-Teller）（ＢＥＴ）方法により計算し、気孔直径の分布は、バーレット－ジョイナー－ハレンダ（Barrett-Joyner-Halenda）（ＢＪＨ）方法により計算した。
前記各粒子の顕微鏡写真を図５に、計算の結果を下記表１に示す。
【0230】
【表1】
【0231】
５．生分解性の確認
実施例１－１－（１）の多孔性シリカ粒子の生分解性を確認するために、３７℃、ＳＢＦ（ｐＨ７．４）における生分解の程度を０時間、１２０時間、３６０時間に顕微鏡で観察した。それを図６に示す。
それを参照すると、多孔性シリカ粒子が生分解され、３６０時間経過後はほぼすべてが分解されたことを確認することができる。
実施例１－１－（１）の多孔性シリカ粒子の生分解性を確認するために、３７℃、ＳＢＦ（ｐＨ７．４）における生分解の程度を０時間、１２０時間、３６０時間に顕微鏡で観察した。それを図６に示す。
それを参照すると、多孔性シリカ粒子が生分解され、３６０時間経過後はほぼすべてが分解されたことを確認することができる。
【0232】
６．吸光度比の測定
時間別に下記数式１による吸光度比を測定した。
時間別に下記数式１による吸光度比を測定した。
【0233】
［数式１］
Ａｔ／Ａ０
（式中、Ａ０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は、３７℃において６０ｒｐｍで水平攪拌され、
Ａｔは、前記Ａ０の測定時からｔ時間経過後に測定した多孔性シリカ粒子の吸光度である。）
Ａｔ／Ａ０
（式中、Ａ０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は、３７℃において６０ｒｐｍで水平攪拌され、
Ａｔは、前記Ａ０の測定時からｔ時間経過後に測定した多孔性シリカ粒子の吸光度である。）
【0234】
具体的には、多孔性シリカ粒子粉末５ｍｇをＳＢＦ（ｐＨ７．４）５ｍｌに溶かした。その後、５ｍｌの多孔性シリカ粒子溶液を、図７に示す直径５０ｋＤａの気孔を有する透過膜に入れた。外部膜に１５ｍｌのＳＢＦを添加し、外部膜のＳＢＦは１２時間ごとに入れ替えた。多孔性シリカ粒子の分解は、３７℃において６０ｒｐｍで水平攪拌して行った。
その後、紫外・可視分光法（UV-vis spectroscopy）によって吸光度を測定し、λ＝６４０ｎｍで分析した。
その後、紫外・可視分光法（UV-vis spectroscopy）によって吸光度を測定し、λ＝６４０ｎｍで分析した。
【0235】
（１）吸光度比の測定
実施例１－１－（１）の多孔性シリカ粒子の吸光度比を前記方法に従って測定した。その結果を図８に示す。
これを参照すると、吸光度比が１／２となるｔは約５８時間であり、非常にゆっくりと分解されることが確認できた。
実施例１－１－（１）の多孔性シリカ粒子の吸光度比を前記方法に従って測定した。その結果を図８に示す。
これを参照すると、吸光度比が１／２となるｔは約５８時間であり、非常にゆっくりと分解されることが確認できた。
【0236】
（２）粒径別
実施例１－１－（１）、（５）、（６）の多孔性シリカ粒子の吸光度を前記数式１により測定した。その結果を図９に示す（懸濁液と溶媒としては、ＳＢＦを使用した。）。
これを参照すると、粒径の増加によってｔが減少することが分かる。
実施例１－１－（１）、（５）、（６）の多孔性シリカ粒子の吸光度を前記数式１により測定した。その結果を図９に示す（懸濁液と溶媒としては、ＳＢＦを使用した。）。
これを参照すると、粒径の増加によってｔが減少することが分かる。
【0237】
（３）気孔の平均直径別
実施例１－１－（１）、（９）の多孔性シリカ粒子、そしてコントロールとして実施例１－１－（１）の小気孔多孔性シリカ粒子の吸光度を前記数式１により測定した。その結果を図１０に示す（懸濁液と溶媒としては、ＳＢＦを使用した。）。
これを参照すると、実施例の多孔性シリカ粒子は、コントロールに比べてｔが非常に大きいことが確認できる。
実施例１－１－（１）、（９）の多孔性シリカ粒子、そしてコントロールとして実施例１－１－（１）の小気孔多孔性シリカ粒子の吸光度を前記数式１により測定した。その結果を図１０に示す（懸濁液と溶媒としては、ＳＢＦを使用した。）。
これを参照すると、実施例の多孔性シリカ粒子は、コントロールに比べてｔが非常に大きいことが確認できる。
【0238】
（４）ｐＨ別
実施例１－１－（４）の多孔性シリカ粒子のｐＨ別吸光度を測定した。吸光度は、ＳＢＦで、そしてｐＨ２、５および７．４のＴｒｉｓで測定した。その結果を図１１に示す。
これを参照すると、ｐＨ別にｔの差はあるが、いずれも吸光度の比が１／２となるｔは２４時間以上であった。
実施例１－１－（４）の多孔性シリカ粒子のｐＨ別吸光度を測定した。吸光度は、ＳＢＦで、そしてｐＨ２、５および７．４のＴｒｉｓで測定した。その結果を図１１に示す。
これを参照すると、ｐＨ別にｔの差はあるが、いずれも吸光度の比が１／２となるｔは２４時間以上であった。
【0239】
（５）帯電
実施例１－２－（１）－１）の多孔性シリカ粒子の吸光度を測定し、その結果を図１２に示す（懸濁液と溶媒としては、トリス（Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４）を使用した。）。
これを参照すると、陽電荷に帯電した粒子も吸光度の比が１／２となるｔは２４時間以上であった。
実施例１－２－（１）－１）の多孔性シリカ粒子の吸光度を測定し、その結果を図１２に示す（懸濁液と溶媒としては、トリス（Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４）を使用した。）。
これを参照すると、陽電荷に帯電した粒子も吸光度の比が１／２となるｔは２４時間以上であった。
【0240】
実施例２．ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの製造、並びにＣｐＧ－ＯＤＮおよびｓｉＩＤＯの選定
１．ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの製造
小気孔粒子の製造時に蒸留水９２０ｍｌ、メタノール８５０ｍｌを使用したこと、気孔拡張時にＴＭＢを１１ｍＬ使用したこと以外は１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。その後、２ｍＬのＡＰＴＥＳを用いて、２－（１）の方法で表面改質を行った。その結果、図１３ａのａのようなＤｅｇｒａｄｅＢＡＬＬが得られた。
１．ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの製造
小気孔粒子の製造時に蒸留水９２０ｍｌ、メタノール８５０ｍｌを使用したこと、気孔拡張時にＴＭＢを１１ｍＬ使用したこと以外は１－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。その後、２ｍＬのＡＰＴＥＳを用いて、２－（１）の方法で表面改質を行った。その結果、図１３ａのａのようなＤｅｇｒａｄｅＢＡＬＬが得られた。
【0241】
２．ｓｉＩＤＯの選定およびノックダウン効率
配列番号７および８のｓｉＲＮＡの安定性のために、４ｍｅｒをさらに延長して実験を行った。４ｍｅｒを延長した配列番号１１および１２の配列においても優れたＫ／Ｄ効果が観察され（図１９）、最終のｓｉＩＤＯ１の配列番号１１および１２の配列を本実験のｓｉＩＤＯに選定した。
配列番号７および８のｓｉＲＮＡの安定性のために、４ｍｅｒをさらに延長して実験を行った。４ｍｅｒを延長した配列番号１１および１２の配列においても優れたＫ／Ｄ効果が観察され（図１９）、最終のｓｉＩＤＯ１の配列番号１１および１２の配列を本実験のｓｉＩＤＯに選定した。
【0242】
【表2】
【0243】
３．ＣｐＧ－ＯＤＮの選定
選定されたｓｉＩＤＯ １（＃４、＃４’）をそれぞれ異なるクラス（class）のＣｐＧ（Ａ、Ｂ、Ｃ）と連結して効果を確認した。各テストは、ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬに担持して行った。
ＣｐＧクラスとは関係なく、いずれもｓｉＩＤＯ１が正常にＫ／Ｏさせることを確認した（図２５）。
実験の結果、ＣｐＧ－ＯＤＮクラスＡに連結されたｓｉＩＤＯ１が、クラスＢまたはＣに連結されたｓｉＩＤＯ１に比べて優れたＩ型ＩＦＮ誘発(induction)効果があることを確認した（図２６）。
したがって、ＣｐＧ－ＯＤＮクラスＡを本実験のＣｐＧ－ＯＤＮに選定した。
選定されたｓｉＩＤＯ １（＃４、＃４’）をそれぞれ異なるクラス（class）のＣｐＧ（Ａ、Ｂ、Ｃ）と連結して効果を確認した。各テストは、ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬに担持して行った。
ＣｐＧクラスとは関係なく、いずれもｓｉＩＤＯ１が正常にＫ／Ｏさせることを確認した（図２５）。
実験の結果、ＣｐＧ－ＯＤＮクラスＡに連結されたｓｉＩＤＯ１が、クラスＢまたはＣに連結されたｓｉＩＤＯ１に比べて優れたＩ型ＩＦＮ誘発(induction)効果があることを確認した（図２６）。
したがって、ＣｐＧ－ＯＤＮクラスＡを本実験のＣｐＧ－ＯＤＮに選定した。
【0244】
実施例３．ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯがＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬに担持されたＬＥＭ－Ｓ４０３の製造
１．ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯを担持するための材料
ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬとしては、実施例２－１の粒子を使用した。エタノールは、シグマ・アルドリッチ（Sigma-aldrich、ミズーリ州、米国）から購入した。フィコール・パケ（Ficoll-paque）は、Ｇｅヘルスケア・バイオサイエンス（GE Healthcare Bio Sciences AB、Uppsala、Sweden）から購入した。ＴＡＭＲＡ ＮＨＳエステルは、サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific、Massachusetts、USA）から購入した。１０ｘリン酸緩衝食塩水（Phosphate buffered saline（10x PBS）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地（F-12K）、最少必須培地（Minimum Essential Medium、MEM）、ロズウェルパーク記念研究所１６４０培地（Roswell Park Memorial Institute 1640、RPMI1640）、ウシ胎児血清（fetal bovine serum、FBS）、仔ウシ血清（bobvine calf serum、BCS）、ペニシリン－ストレプトマイシン（penicillin-streptomycin）およびトリプシン（trypsin）－ＥＤＴＡは、ウェルジン（WelGene、ソウル、韓国）から購入した。抗マウスＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４抗体は、バイオ・エックス・セル（Bio X Cell、NH、USA）から購入した。ヒトおよびマウスＣｐＧ－ＯＤＮ、ｓｉＩＤＯ、ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ、ＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ、Ｃｙ５－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯおよびＰＣＲプライマーは、バイオニア（Bioneer，Inc、テジョン、韓国）で合成された。ＰＣＲプライマーの配列情報は表３に示されている。フローサイトメトリー用抗体（Alexa Fluor（登録商標） 647 anti-mouse CD11c，Alexa Fluor（登録商標） R-PE anti-Ly6C，Alexa Fluor（登録商標） 647 anti-mouse FOXP3，Alexa Fluor（登録商標） 488 anti-mouse NK-1.1，PE/Cy7 anti-mouse CD4、APC anti-mouse CD3、FITC and Alexa Fluor（登録商標） 488 anti-mouse CD8a、PE anti-mouse CD122、PE anti-mouse CD25、Alexa Fluor（登録商標） 647 anti-mouse CD69、および Alexa Fluor（登録商標） 647 anti-mouse CD86）は、バイオレジェンド（Biolegend、CA、USA）から購入した。抗ウサギｐ－ＳＴＡＴ－１抗体は、ＣＳＴ（MA， USA）から購入し、ＦＩＴＣ抗マウスＩＤＯ１抗体は、サンタクルズバイオテクノロジー（Santa Cruz biotechnology、CA、USA）から購入した。抗ウサギＬ－キヌレニン抗体は、イムスモル（ImmuSmol、CA、USA）から購入した。ＴＵＮＥＬ分析キットは、プロメガ（Promega、WA、USA）から購入した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ２０００、ＴＲＩｚｏｌおよびパワーＳＹＢＲ（登録商標） グリーンＰＣＲマスターミックス（Power SYBRGreen PCR Master Mix）は、サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific、MA、USA）から購入した。組換えヒトインターフェロン－γ（Recombinant human interferon-gamma、IFN-γ）は、ペプロテック（Peprotech Inc、NJ、USA）から購入した。ＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭ ＩＦＮ－α／β細胞は、インビボゲン（Invivogen、CA、USA）から購入した。ＰＣＲプライマーの塩基配列の情報は表３に示されている。
１．ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯを担持するための材料
ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬとしては、実施例２－１の粒子を使用した。エタノールは、シグマ・アルドリッチ（Sigma-aldrich、ミズーリ州、米国）から購入した。フィコール・パケ（Ficoll-paque）は、Ｇｅヘルスケア・バイオサイエンス（GE Healthcare Bio Sciences AB、Uppsala、Sweden）から購入した。ＴＡＭＲＡ ＮＨＳエステルは、サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific、Massachusetts、USA）から購入した。１０ｘリン酸緩衝食塩水（Phosphate buffered saline（10x PBS）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地（F-12K）、最少必須培地（Minimum Essential Medium、MEM）、ロズウェルパーク記念研究所１６４０培地（Roswell Park Memorial Institute 1640、RPMI1640）、ウシ胎児血清（fetal bovine serum、FBS）、仔ウシ血清（bobvine calf serum、BCS）、ペニシリン－ストレプトマイシン（penicillin-streptomycin）およびトリプシン（trypsin）－ＥＤＴＡは、ウェルジン（WelGene、ソウル、韓国）から購入した。抗マウスＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４抗体は、バイオ・エックス・セル（Bio X Cell、NH、USA）から購入した。ヒトおよびマウスＣｐＧ－ＯＤＮ、ｓｉＩＤＯ、ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ、ＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ、Ｃｙ５－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯおよびＰＣＲプライマーは、バイオニア（Bioneer，Inc、テジョン、韓国）で合成された。ＰＣＲプライマーの配列情報は表３に示されている。フローサイトメトリー用抗体（Alexa Fluor（登録商標） 647 anti-mouse CD11c，Alexa Fluor（登録商標） R-PE anti-Ly6C，Alexa Fluor（登録商標） 647 anti-mouse FOXP3，Alexa Fluor（登録商標） 488 anti-mouse NK-1.1，PE/Cy7 anti-mouse CD4、APC anti-mouse CD3、FITC and Alexa Fluor（登録商標） 488 anti-mouse CD8a、PE anti-mouse CD122、PE anti-mouse CD25、Alexa Fluor（登録商標） 647 anti-mouse CD69、および Alexa Fluor（登録商標） 647 anti-mouse CD86）は、バイオレジェンド（Biolegend、CA、USA）から購入した。抗ウサギｐ－ＳＴＡＴ－１抗体は、ＣＳＴ（MA， USA）から購入し、ＦＩＴＣ抗マウスＩＤＯ１抗体は、サンタクルズバイオテクノロジー（Santa Cruz biotechnology、CA、USA）から購入した。抗ウサギＬ－キヌレニン抗体は、イムスモル（ImmuSmol、CA、USA）から購入した。ＴＵＮＥＬ分析キットは、プロメガ（Promega、WA、USA）から購入した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ２０００、ＴＲＩｚｏｌおよびパワーＳＹＢＲ（登録商標） グリーンＰＣＲマスターミックス（Power SYBRGreen PCR Master Mix）は、サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific、MA、USA）から購入した。組換えヒトインターフェロン－γ（Recombinant human interferon-gamma、IFN-γ）は、ペプロテック（Peprotech Inc、NJ、USA）から購入した。ＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭ ＩＦＮ－α／β細胞は、インビボゲン（Invivogen、CA、USA）から購入した。ＰＣＲプライマーの塩基配列の情報は表３に示されている。
【0245】
【表3】
【0246】
２．ＬＥＭ－Ｓ４０３の製造に使用されるＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの特性
ＤｅｇｒａｄａＢＬＬのＴＥＭ画像は、ＬＩＢＲＡ １２０ ＥＦ－ＴＥＭ（Carl Zeiss、Germany）から得た。ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬのゼータ電位および流体力学的サイズは、ゼータサイザーナノＳ（Zetasizer Nano S、Malvern Instruments、UK）によって測定した。窒素吸着等温線はＮＯＶＡ吸着装置を用いて測定した。ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの表面積は、ブルナウアー－エメット－テラー（Brunauer-Emmitt-Teller）法を用いて計算した。
ＤｅｇｒａｄａＢＬＬのＴＥＭ画像は、ＬＩＢＲＡ １２０ ＥＦ－ＴＥＭ（Carl Zeiss、Germany）から得た。ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬのゼータ電位および流体力学的サイズは、ゼータサイザーナノＳ（Zetasizer Nano S、Malvern Instruments、UK）によって測定した。窒素吸着等温線はＮＯＶＡ吸着装置を用いて測定した。ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの表面積は、ブルナウアー－エメット－テラー（Brunauer-Emmitt-Teller）法を用いて計算した。
【0247】
３．ＬＥＭ－Ｓ４０３の担持容量
担持容量を測定するために、様々な濃度のＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ（１、２、３、４、５、７および１０μｇ）を１０μＬの１ｘＰＢＳ溶液に１μｇのヒトＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯと混合した。室温で３０分間培養した後、混合物を８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次に、上澄み液を新しいマイクロチューブに移し、残留ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯの濃度をＣｉｔａｔｉｏｎ５（Biotech、VT、USA）で測定した。上澄み液の残留ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯの量は、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することで決定した。担持容量は、上澄み液のＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ残留量を基準に計算した。
担持容量を測定するために、様々な濃度のＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ（１、２、３、４、５、７および１０μｇ）を１０μＬの１ｘＰＢＳ溶液に１μｇのヒトＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯと混合した。室温で３０分間培養した後、混合物を８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次に、上澄み液を新しいマイクロチューブに移し、残留ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯの濃度をＣｉｔａｔｉｏｎ５（Biotech、VT、USA）で測定した。上澄み液の残留ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯの量は、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することで決定した。担持容量は、上澄み液のＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ残留量を基準に計算した。
【0248】
ＬＥＭ－Ｓ４０３の投与量は、ＬＥＭ－Ｓ４０３のＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ含有量を示す。ＬＥＭ－Ｓ４０３は、ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬで１：５の重量比（ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ：ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ）で製造されたＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯである。
【0249】
４．ＬＥＭ－Ｓ４０３の放出プロファイリング
ＬＥＭ－Ｓ４０３の放出プロファイリングのために、ＬＥＭ－Ｓ４０３（１００μｇ／ｍＬ、容積＝１００μＬ）を疑似体液（ＳＢＦ、ｐＨ７．４、［Ｎａ＋］＝１４２ｍＭ、［Ｋ＋］＝５ｍＭ、［Ｍｇ２＋］＝１．５ｍＭ、［Ｃａ２＋］＝２．５ｍＭ、［Ｃｌ－］＝１４８．８ｍＭ、［ＨＣＯ３－］＝４．２ｍＭ、［ＨＰＯ４２－］＝１．０ｍＭ（ｐＨ７．４ Ｔｒｉｓ緩衝液（［Ｔｒｉｓ］＝５０ｍＭ）））に３７℃で１０日間拡散させた。指定した時点（１、２、３、４、７および１０日）で混合物を８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してＬＥＭ－Ｓ４０３をプルダウンし、上澄み液を新鮮なＳＢＦに交換した。上澄み液から放出されたＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯの量は、２６０ｎｍにおける吸光度を基準に測定された。
ＬＥＭ－Ｓ４０３の放出プロファイリングのために、ＬＥＭ－Ｓ４０３（１００μｇ／ｍＬ、容積＝１００μＬ）を疑似体液（ＳＢＦ、ｐＨ７．４、［Ｎａ＋］＝１４２ｍＭ、［Ｋ＋］＝５ｍＭ、［Ｍｇ２＋］＝１．５ｍＭ、［Ｃａ２＋］＝２．５ｍＭ、［Ｃｌ－］＝１４８．８ｍＭ、［ＨＣＯ３－］＝４．２ｍＭ、［ＨＰＯ４２－］＝１．０ｍＭ（ｐＨ７．４ Ｔｒｉｓ緩衝液（［Ｔｒｉｓ］＝５０ｍＭ）））に３７℃で１０日間拡散させた。指定した時点（１、２、３、４、７および１０日）で混合物を８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してＬＥＭ－Ｓ４０３をプルダウンし、上澄み液を新鮮なＳＢＦに交換した。上澄み液から放出されたＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯの量は、２６０ｎｍにおける吸光度を基準に測定された。
【0250】
５．細胞の培養
全ての細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でＣＯ２培養器（SANYO Electric、Osaka、Japan）で培養された。Ａ５４９細胞は、１０％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）および１０ｕｎｉｔ／ｍＬのペニシリン・ストレプトマイシンを含むＦ－１２Ｋ培地で培養された。ＣＴ２６細胞は、１０％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）および１０ｕｎｉｔ／ｍＬのペニシリン・ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ－１６４０培地で培養された。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ロンザ（Lonza、Basel、Switzerland）から購入した。マウスＰＢＭＣは、生後５週齢のＢａｌｂ／ｃマウスから、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋のない条件でフィコール（ficoll）勾配法を用いて分離した。
全ての細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下でＣＯ２培養器（SANYO Electric、Osaka、Japan）で培養された。Ａ５４９細胞は、１０％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）および１０ｕｎｉｔ／ｍＬのペニシリン・ストレプトマイシンを含むＦ－１２Ｋ培地で培養された。ＣＴ２６細胞は、１０％ＦＢＳ（ｖ／ｖ）および１０ｕｎｉｔ／ｍＬのペニシリン・ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ－１６４０培地で培養された。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ロンザ（Lonza、Basel、Switzerland）から購入した。マウスＰＢＭＣは、生後５週齢のＢａｌｂ／ｃマウスから、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋のない条件でフィコール（ficoll）勾配法を用いて分離した。
【0251】
６．マウスＰＢＭＣにおけるＬＥＭ－Ｓ４０３の細胞取り込み効率のテスト
マウスＰＭＢＣを２４ウェルプレートに２．５×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。次に、ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬを有するかまたは有しないバッファーまたはＦＩＴＣ接合されたＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ（１００ｎＭ）を各ウェルに添加した。６時間培養した後、細胞を１ｘＰＢＳで洗浄し、染色のために採集した。細胞を室温で１０分間培養緩衝液（１ｘＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ）に懸濁した。ブロッキングの後、細胞を１，２５０ｒｐｍで２分間遠心分離し、上澄み液を除去した。次いで、細胞を一次抗体溶液（１ｘＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ）（１：２００希釈）で処理し、室温で１時間培養した。細胞を遠心分離し、培養緩衝液で洗浄した。洗浄した細胞を２００μＬの培養緩衝液に再懸濁し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Thermo Fisher、MA、USA）を用いて分析した。
マウスＰＭＢＣを２４ウェルプレートに２．５×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。次に、ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬを有するかまたは有しないバッファーまたはＦＩＴＣ接合されたＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ（１００ｎＭ）を各ウェルに添加した。６時間培養した後、細胞を１ｘＰＢＳで洗浄し、染色のために採集した。細胞を室温で１０分間培養緩衝液（１ｘＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ）に懸濁した。ブロッキングの後、細胞を１，２５０ｒｐｍで２分間遠心分離し、上澄み液を除去した。次いで、細胞を一次抗体溶液（１ｘＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ）（１：２００希釈）で処理し、室温で１時間培養した。細胞を遠心分離し、培養緩衝液で洗浄した。洗浄した細胞を２００μＬの培養緩衝液に再懸濁し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Thermo Fisher、MA、USA）を用いて分析した。
【0252】
７．Ａ５４９細胞におけるＩＤＯ１ノックダウン効率のテスト
Ａ５４９細胞を２４ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間培養した後、細胞を１ｘＰＢＳで洗浄した。次に、ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ、ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ（１５０ｎＭ）、ｓｉＩＤＯ（１５０ｎＭ）、ＣｐＧ－ＯＤＮ（１５０ｎＭ）、ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ ｗｉｔｈ ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ（１０、５０及び１５０ｎＭ）、ｓｉＩＤＯ ｗｉｔｈ ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ（１５０ｎＭ）またはＣｐＧ－ＯＤＮ ｗｉｔｈ ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ（１５０ｎＭ）を５００μＬのＦ－１２Ｋ培地（無血清）に分散し、各ウェルに添加した。ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬと担持される物質の割合は、５：１（ｗ／ｗ）で準備した。６時間培養した後、細胞を１ｘＰＢＳで洗浄し、ＩＦＮ－γ（８０ｎｇ／ｍＬ）を含む新鮮な増殖培地で指定の時間さらに培養した。リアルタイムｑＰＣＲによってＩＤＯ１の阻害が検出された。
Ａ５４９細胞を２４ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間培養した後、細胞を１ｘＰＢＳで洗浄した。次に、ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ、ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ（１５０ｎＭ）、ｓｉＩＤＯ（１５０ｎＭ）、ＣｐＧ－ＯＤＮ（１５０ｎＭ）、ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ ｗｉｔｈ ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ（１０、５０及び１５０ｎＭ）、ｓｉＩＤＯ ｗｉｔｈ ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ（１５０ｎＭ）またはＣｐＧ－ＯＤＮ ｗｉｔｈ ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ（１５０ｎＭ）を５００μＬのＦ－１２Ｋ培地（無血清）に分散し、各ウェルに添加した。ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬと担持される物質の割合は、５：１（ｗ／ｗ）で準備した。６時間培養した後、細胞を１ｘＰＢＳで洗浄し、ＩＦＮ－γ（８０ｎｇ／ｍＬ）を含む新鮮な増殖培地で指定の時間さらに培養した。リアルタイムｑＰＣＲによってＩＤＯ１の阻害が検出された。
【0253】
ノックダウン効率の持続時間を調べるために、Ａ５４９細胞を２４ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間培養した後、細胞を１ｘＰＢＳで洗浄した。その後、ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬに担持されたＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ（１５０ｎＭ）とリポフェクタミン（Lipofectamine）に担持されたＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯを５００μＬのＦ－１２Ｋ培地（無血清）に分散し、ウェルに添加した。６時間培養した後、細胞を１ｘＰＢＳで洗浄し、ＩＦＮ－γ（８０ｎｇ／ｍＬ）を含む新しい増殖培地で指定の時間さらに培養した。リアルタイムｑＰＣＲによってＩＤＯ１の阻害が検出された。
【0254】
８．Ｉ型ＩＦＮの分泌の誘導
ヒトＰＢＭＣを５０μＬのＭＥＭ培地と共に９６ウェルプレート（５×１０５細胞／ウェル）に播種した。２時間培養した後、緩衝液、ｓｉＩＤＯ（１２５ｎＭ）、ＣｐＧ－ＯＤＮ（１２５ｎＭ）、ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ（１２５ｎＭ）を、ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬを有するかまたは有しない５０μＬのＭＥＭ培地に分散し、各ウェルに添加した。細胞をさらに２２時間培養した。培地中の１型ＩＦＮは、メーカーの指針に従ってレポーター細胞システム（ＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭ ＩＦＮ－α／β細胞）を用いて決定した。
ヒトＰＢＭＣを５０μＬのＭＥＭ培地と共に９６ウェルプレート（５×１０５細胞／ウェル）に播種した。２時間培養した後、緩衝液、ｓｉＩＤＯ（１２５ｎＭ）、ＣｐＧ－ＯＤＮ（１２５ｎＭ）、ＣｐＧ－ＯＤＮ－ｓｉＩＤＯ（１２５ｎＭ）を、ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬを有するかまたは有しない５０μＬのＭＥＭ培地に分散し、各ウェルに添加した。細胞をさらに２２時間培養した。培地中の１型ＩＦＮは、メーカーの指針に従ってレポーター細胞システム（ＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭ ＩＦＮ－α／β細胞）を用いて決定した。
【0255】
ヒトＰＢＭＣを５０μＬのＭＥＭ培地と共に９６ウェルプレート（５×１０５細胞／ウェル）に播種した。２時間培養した後、５０μＬのＭＥＭ培地に分散された５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６３および７．８１ｎＭのＬＥＭ－Ｓ４０３を各ウェルに添加した。細胞をさらに２２時間培養した。培地のＩ型ＩＦＮは、メーカーの指針に従ってレポーター細胞システム（ＨＥＫ－ＢｌｕｅＴＭ ＩＦＮ－α／β細胞）を用いて決定した。
【0256】
９．動物実験
すべての動物実験は、ソウル大学動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ）の指針に従って行った。Ｂａｌｂ／ｃ雄マウス（５週齢）は、オリエント・バイオ（ORIENT BIO、ソンナム、韓国）から購入した。実験期間中、動物は１９～２５℃、湿度４０～７０％、光１２時間、暗闇１２時間の周期などの環境条件下で収容された。
すべての動物実験は、ソウル大学動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ）の指針に従って行った。Ｂａｌｂ／ｃ雄マウス（５週齢）は、オリエント・バイオ（ORIENT BIO、ソンナム、韓国）から購入した。実験期間中、動物は１９～２５℃、湿度４０～７０％、光１２時間、暗闇１２時間の周期などの環境条件下で収容された。
【0257】
１０．腫瘍内注射後のＬＥＭ－Ｓ４０３の持続能
腫瘍保有マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）は、マトリゲル（Matrigel）を含む１００μＬの滅菌１ｘＰＢＳ溶液にＣＴ２６細胞（１×１０６細胞）を皮下注射することで準備した。腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達したとき、マウスに対して、腫瘍内注射によってＴＡＭＲＡ接合されたＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬを使用するかまたは使用せずに、緩衝液、ＴＡＭＲＡ接合されたＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬまたはＣｙ５接合されたＣｐＧ－ｓｉＩＤＯを処理した。注射後１日目及び３日目に、分析のために腫瘍を切除した。全腫瘍の蛍光画像は、ＦＯＢＩインビボ・イメージング・システム（NeoScience、Seoul、Korea）を用いて得た。腫瘍は４％ＰＦＡ溶液中で培養された。ショ糖の浸透後、サンプルをＯＣＴコンパウンド（optimal cutting temperature compound）に含め、１０μｍの厚さに切片化した。切片スライドを滅菌水で洗浄し、ＤＡＰＩで染色した。サンプルは、１０倍の対物レンズを備えたＢＸ７１顕微鏡で観察した。
腫瘍保有マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）は、マトリゲル（Matrigel）を含む１００μＬの滅菌１ｘＰＢＳ溶液にＣＴ２６細胞（１×１０６細胞）を皮下注射することで準備した。腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達したとき、マウスに対して、腫瘍内注射によってＴＡＭＲＡ接合されたＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬを使用するかまたは使用せずに、緩衝液、ＴＡＭＲＡ接合されたＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬまたはＣｙ５接合されたＣｐＧ－ｓｉＩＤＯを処理した。注射後１日目及び３日目に、分析のために腫瘍を切除した。全腫瘍の蛍光画像は、ＦＯＢＩインビボ・イメージング・システム（NeoScience、Seoul、Korea）を用いて得た。腫瘍は４％ＰＦＡ溶液中で培養された。ショ糖の浸透後、サンプルをＯＣＴコンパウンド（optimal cutting temperature compound）に含め、１０μｍの厚さに切片化した。切片スライドを滅菌水で洗浄し、ＤＡＰＩで染色した。サンプルは、１０倍の対物レンズを備えたＢＸ７１顕微鏡で観察した。
【0258】
フローサイトメトリーのために、腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達したとき、ＦＩＴＣ接合ＣｐＧ－ｓｉＩＤＯをＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬと共にまたはＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬなしで腫瘍（ＣＴ２６）保有マウスの腫瘍に注入した。注射後１日目及び３日目に腫瘍を採取した。採取した腫瘍を細かく切り、１ｍＬのコラーゲン分解酵素溶液中において３７℃で３０分間培養した。セルストレーナーを用いて細胞を採集し、フローサイトメトリーを行った。
【0259】
１１．ＬＥＭ－Ｓ４０３単独療法および免疫チェックポイント阻害剤を用いた併用療法の治療効果
マトリゲル（matrigel）を含む１００μＬの滅菌１ｘＰＢＳ溶液に入っているＣＴ２６細胞（１×１０６細胞）を、Ｂａｌｂ／ｃマウスの右脇腹または両脇腹に皮下注射した。緩衝液、ビヒクル（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの７０μｇ）、ＣｐＧ－ＯＤＮ（４．５μｇ）＋ビヒクル（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの２２．５μｇ）、ｓｉＩＤＯ（９．５μｇ）＋ビヒクル（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの４７．５μｇ）またはＬＥＭＩＤＯ（３．５、７及び１４μｇ）を、腫瘍体積が約１００ｍｍ３になってから０日目、３日目、７日目及び１０日目に右脇腹に注射した。腫瘍体積は週３回測定した。生存率はカプラン・マイヤー・プロット（Kaplan-Meier plot）として提示された。
マトリゲル（matrigel）を含む１００μＬの滅菌１ｘＰＢＳ溶液に入っているＣＴ２６細胞（１×１０６細胞）を、Ｂａｌｂ／ｃマウスの右脇腹または両脇腹に皮下注射した。緩衝液、ビヒクル（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの７０μｇ）、ＣｐＧ－ＯＤＮ（４．５μｇ）＋ビヒクル（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの２２．５μｇ）、ｓｉＩＤＯ（９．５μｇ）＋ビヒクル（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの４７．５μｇ）またはＬＥＭＩＤＯ（３．５、７及び１４μｇ）を、腫瘍体積が約１００ｍｍ３になってから０日目、３日目、７日目及び１０日目に右脇腹に注射した。腫瘍体積は週３回測定した。生存率はカプラン・マイヤー・プロット（Kaplan-Meier plot）として提示された。
【0260】
前記方法により腫瘍（ＣＴ２６）保有マウスを作製した。バッファー、ビヒクル（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの７０μｇ）、抗ＰＤ－１ ａｂ（ａＰＤ－１；１０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＣＴＬＡ－４ ａｂ（ａＣＴＬＡ－４；１０ｍｇ／ｋｇ）、ＬＥＭＩＤＯ（１４μｇ）、ＬＥＭＩＤＯ＋ａＰＤ－１ ａｂまたはＬＥＭＩＤＯ＋ａＣＴＬＡ－４ ａｂを、腫瘍体積が約１００ｍｍ３になってから０日目、３日目、７日目及び１０日目に注入した。バッファー、ビヒクルおよびＬＥＭＩＤＯは右脇腹に腫瘍内注射し、ａＰＤ－１およびａＣＴＬＡ－４は腹腔内注射した。腫瘍体積は週３回測定した。生存率はカプラン・マイヤー・プロットとして提示された。
【0261】
１２．ＬＥＭ－Ｓ４０３単独療法の治療メカニズム
前記方法により腫瘍（ＣＴ２６）保有マウスを準備した。バッファー、ビヒクル（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの７０μｇ）、ＣｐＧ－ＯＤＮ（４．５μｇ）＋ビヒクル（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの２２．５μｇ）、ｓｉＩＤＯ（９．５μｇ）＋ビヒクル（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの４７．５μｇ）またはＬＥＭＩＤＯ（１４μｇ）を、腫瘍体積１００ｍｍ３になってから０日目及び３日目に右脇腹に腫瘍内注射した。４日目にマウスを犠牲にし、注入されたかまたは遠く離れた腫瘍をさらなる分析のために採取した。犠牲の過程でＥＤＴＡ処理されたチューブを用いてマウスの全血を採取した。採取した血液を、Ｈｅｍａｖｅｔ９５０を用いて分析した。
前記方法により腫瘍（ＣＴ２６）保有マウスを準備した。バッファー、ビヒクル（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの７０μｇ）、ＣｐＧ－ＯＤＮ（４．５μｇ）＋ビヒクル（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの２２．５μｇ）、ｓｉＩＤＯ（９．５μｇ）＋ビヒクル（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの４７．５μｇ）またはＬＥＭＩＤＯ（１４μｇ）を、腫瘍体積１００ｍｍ３になってから０日目及び３日目に右脇腹に腫瘍内注射した。４日目にマウスを犠牲にし、注入されたかまたは遠く離れた腫瘍をさらなる分析のために採取した。犠牲の過程でＥＤＴＡ処理されたチューブを用いてマウスの全血を採取した。採取した血液を、Ｈｅｍａｖｅｔ９５０を用いて分析した。
【0262】
１３．ネキシンＶ（Annexin V）
採取した腫瘍を細かく切り、１ｍＬのコラーゲン分解酵素溶液中において３７℃で３０分間培養した。細胞は、セルストレーナーを用いて採集した。アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム（propidum iodide）染色は、メーカーの指針に従ってＰＩ（Biolegend、CA、USA）と共にＦＩＴＣアネキシンＶアポトーシス検出キット（Apoptosis Detection Kit）を用いて行った。
採取した腫瘍を細かく切り、１ｍＬのコラーゲン分解酵素溶液中において３７℃で３０分間培養した。細胞は、セルストレーナーを用いて採集した。アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム（propidum iodide）染色は、メーカーの指針に従ってＰＩ（Biolegend、CA、USA）と共にＦＩＴＣアネキシンＶアポトーシス検出キット（Apoptosis Detection Kit）を用いて行った。
【0263】
１４．逆転写酵素ＰＣＲ（RT-PCR）
結合ＧＩＴＣカラム（combined GITC-column）に基づいて採取した細胞または腫瘍から全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡの合成は以下の条件で行った：６５℃で５分間、４２℃で２分間、４２℃で５０分間、そして７０℃で１５分間、不活性化の条件で１サイクル。ゲル遅延のために、ｃＤＮＡの増幅は以下の条件で行った：９５℃で３０秒、５５℃で６０秒、および７２℃で３０秒の条件で３０サイクル。生成物は電気泳動によって２％ＴＡＥアガロースゲルで遅延され、Ｇｅｌ－ＤＯＣ ＸＲ＋システム（Bio-rad、CA、USA）を用いて可視化された。ｑＰＣＲは、メーカーの指針に従ってＣＦＸ９６タッチリアルタイムＰＣＲ検出システム（CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System、Bio-rad）およびパワーＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＰＣＲマスターミックス（Power SYBR（登録商標） Green PCR Master Mix）を用いて行った。
結合ＧＩＴＣカラム（combined GITC-column）に基づいて採取した細胞または腫瘍から全ＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡの合成は以下の条件で行った：６５℃で５分間、４２℃で２分間、４２℃で５０分間、そして７０℃で１５分間、不活性化の条件で１サイクル。ゲル遅延のために、ｃＤＮＡの増幅は以下の条件で行った：９５℃で３０秒、５５℃で６０秒、および７２℃で３０秒の条件で３０サイクル。生成物は電気泳動によって２％ＴＡＥアガロースゲルで遅延され、Ｇｅｌ－ＤＯＣ ＸＲ＋システム（Bio-rad、CA、USA）を用いて可視化された。ｑＰＣＲは、メーカーの指針に従ってＣＦＸ９６タッチリアルタイムＰＣＲ検出システム（CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System、Bio-rad）およびパワーＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＰＣＲマスターミックス（Power SYBR（登録商標） Green PCR Master Mix）を用いて行った。
【0264】
１５．組織学的評価と蛍光染色
採取した腫瘍を４％ＰＦＡ溶液で培養した。ショ糖の浸透後、臓器をＯＣＴコンパウンドに入れ、１０μｍ厚に切片化した。切片化した組織をＨ＆Ｅ染色試薬（BBC Biochemical、Mt Vernon、WA、USA）で染色した。
採取した腫瘍を４％ＰＦＡ溶液で培養した。ショ糖の浸透後、臓器をＯＣＴコンパウンドに入れ、１０μｍ厚に切片化した。切片化した組織をＨ＆Ｅ染色試薬（BBC Biochemical、Mt Vernon、WA、USA）で染色した。
【0265】
免疫蛍光染色のために、５％正常ヤギ血清が含まれたＰＢＳを用いて４５分間ブロッキングした後、組織切片を蛍光染料結合抗体または一次抗体に続いて蛍光染料結合の二次抗体で染色した。核はＤＡＰＩを用いて染色した。染色された組織切片は、１０倍の対物レンズを備えたＢＸ７１顕微鏡で観察した。
【0266】
１６．フローサイトメトリー
腫瘍組織の場合、採取した腫瘍を１ｍＬのコラーゲン分解酵素溶液中において３７℃で３０分間培養し、セルストレーナーを用いて細胞を採取した。一次細胞（１×１０５細胞）を４％ＰＦＡ中において３７℃で１０分間培養した後、培養緩衝液で洗浄した。細胞を培養緩衝液（１ｘＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ）に室温で１０分間懸濁した。ブロッキングの後、細胞を１，２５０ｒｐｍで２分間遠心分離し、上澄み液を除去した。次いで、細胞を一次抗体溶液（１ｘＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ、１：２００希釈）で処理し、室温で１時間培養した。細胞を遠心分離し、培養緩衝液で洗浄した。洗浄した細胞を２００μＬの培養バッファーに再懸濁し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Thermo Fisher、MA、USA）を用いて分析した。
腫瘍組織の場合、採取した腫瘍を１ｍＬのコラーゲン分解酵素溶液中において３７℃で３０分間培養し、セルストレーナーを用いて細胞を採取した。一次細胞（１×１０５細胞）を４％ＰＦＡ中において３７℃で１０分間培養した後、培養緩衝液で洗浄した。細胞を培養緩衝液（１ｘＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ）に室温で１０分間懸濁した。ブロッキングの後、細胞を１，２５０ｒｐｍで２分間遠心分離し、上澄み液を除去した。次いで、細胞を一次抗体溶液（１ｘＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡ、１：２００希釈）で処理し、室温で１時間培養した。細胞を遠心分離し、培養緩衝液で洗浄した。洗浄した細胞を２００μＬの培養バッファーに再懸濁し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Thermo Fisher、MA、USA）を用いて分析した。
【0267】
１７．ｃｐＧＯＤＮとｓｉＩＤＯとをカーボンリンカーを介して連結した場合の相乗効果
連結された形態のＬＥＭ－Ｓ４０３に相乗効果があるか否かを確認するために比較試験を行った。マウスに対して、０日目と３日目にビヒクル、ＣｐＧＯＤＮ＋ビヒクル、ＬＥＭ－Ｓ４０３またはカクテル（ＣｐＧＯＤＮ＋ｓｉＩＤＯ＋ビヒクル）で処理した。４日目には流量細胞測定法で腫瘍を採取して分析した。カクテル療法群は、ＣｐＧ－ＯＤＮおよびＬＥＭ－Ｓ４０３群の場合と類似したＣＤ８＋Ｔ細胞増加を示したが、ＬＥＭ－Ｓ４０３のようなＴｒｅｇ細胞群を減少させることはなかった。この差異から、腫瘍のＣＤ８／Ｔｅｇ比に優れていた。この結果は、治療上の有益性のために、ｓｉＩＤＯとＣｐＧＯＤＮを連結する戦略が必須であることを示している。
連結された形態のＬＥＭ－Ｓ４０３に相乗効果があるか否かを確認するために比較試験を行った。マウスに対して、０日目と３日目にビヒクル、ＣｐＧＯＤＮ＋ビヒクル、ＬＥＭ－Ｓ４０３またはカクテル（ＣｐＧＯＤＮ＋ｓｉＩＤＯ＋ビヒクル）で処理した。４日目には流量細胞測定法で腫瘍を採取して分析した。カクテル療法群は、ＣｐＧ－ＯＤＮおよびＬＥＭ－Ｓ４０３群の場合と類似したＣＤ８＋Ｔ細胞増加を示したが、ＬＥＭ－Ｓ４０３のようなＴｒｅｇ細胞群を減少させることはなかった。この差異から、腫瘍のＣＤ８／Ｔｅｇ比に優れていた。この結果は、治療上の有益性のために、ｓｉＩＤＯとＣｐＧＯＤＮを連結する戦略が必須であることを示している。
【0268】
１８．ＬＥＭ－Ｓ４０３の治療機構、並びにＣｐＧ－ＯＤＮおよびｓｉＩＤＯを用いたカクテル療法
マウス内腫瘍（ＣＴ２６）を前述の方法によって準備した。腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達したとき、ビヒクル（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの７０μｇ）、ＣｐＧ－ＯＤＮ（４．５μｇ）＋ビヒクル（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの２２．５μｇ）、ＬＥＭ－Ｓ４０３（１４μｇ）またはＣｐＧ－ＯＤＮ（４．５μｇ）＋ｓｉＩＤＯ（９．５μｇ）＋ビヒクル（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの７０μｇ）を０日目及び３日目に右脇腹の腫瘍内に注射した。４日目にマウスを犠牲にし、流量細胞の測定のために注射された腫瘍を採取した。
マウス内腫瘍（ＣＴ２６）を前述の方法によって準備した。腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達したとき、ビヒクル（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの７０μｇ）、ＣｐＧ－ＯＤＮ（４．５μｇ）＋ビヒクル（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの２２．５μｇ）、ＬＥＭ－Ｓ４０３（１４μｇ）またはＣｐＧ－ＯＤＮ（４．５μｇ）＋ｓｉＩＤＯ（９．５μｇ）＋ビヒクル（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの７０μｇ）を０日目及び３日目に右脇腹の腫瘍内に注射した。４日目にマウスを犠牲にし、流量細胞の測定のために注射された腫瘍を採取した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13a】
【図13b】
【図14】
【図15a】
【図15b】
【図16a】
【図16b】
【図17a】
【図17b】
【図18a】
【図18b】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【配列表】