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特許7450983サイトカインストーム又は炎症性疾患を抑制するために改善された細胞透過性核輸送阻害剤合成ペプチド及びその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-08
(45)【発行日】2024-03-18
(54)【発明の名称】サイトカインストーム又は炎症性疾患を抑制するために改善された細胞透過性核輸送阻害剤合成ペプチド及びその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240311BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20240311BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240311BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240311BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240311BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20240311BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240311BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
A61K38/10 ZNA
A61K38/16
A61P29/00
A61P37/06
C07K7/08
C07K14/47
【請求項の数】
22
(21)【出願番号】P 2022540791
(86)(22)【出願日】2021-02-16
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-06
(86)【国際出願番号】 KR2021001976
(87)【国際公開番号】W WO2021167324
(87)【国際公開日】2021-08-26
【審査請求日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】62/977,832
(32)【優先日】2020-02-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】517051898
【氏名又は名称】セリベリー セラピューティクス，インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100115255
【弁理士】
【氏名又は名称】辻丸 光一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100201732
【弁理士】
【氏名又は名称】松縄 正登
(74)【代理人】
【識別番号】100154081
【弁理士】
【氏名又は名称】伊佐治 創
(74)【代理人】
【識別番号】100227019
【弁理士】
【氏名又は名称】安 修央
(72)【発明者】
【氏名】ジョ、デウォン
【審査官】上條 のぶよ
(56)【参考文献】
【文献】特表２００３－５１４８５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／２３２３８３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／０３０９１５９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１７－５２７２８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０２６７７９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１８－５２４９９４（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０１３７４８２（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １９／００
Ａ６１Ｋ ３８／１０
Ａ６１Ｋ ３８／１６
Ａ６１Ｐ ２９／００
Ａ６１Ｐ ３７／０６
Ｃ０７Ｋ ７／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
サイトカインストーム又は炎症性疾患を抑制するために改善された細胞透過性核輸送阻害剤（ｉＣＰ－ＮＩ）合成ペプチドであって、前記ｉＣＰ－ＮＩ合成ペプチドは、ＮＦ－κＢ核局在化配列（ＮＬＳ）及びａＭＴＤ（ａｄｖａｎｃｅｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）からなり、
前記ＮＦ－κＢ ＮＬＳは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、
前記ａＭＴＤは、配列番号２～６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ｉＣＰ－ＮＩ合成ペプチド。
【請求項2】
前記ｉＣＰ－ＮＩ合成ペプチドは、ＳＲＴＦ（ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）核輸送を阻害するものである、請求項１に記載のｉＣＰ－ＮＩ合成ペプチド。
【請求項3】
前記ＳＲＴＦは、ＮＦ－κＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ κＢ）、ＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ）、ＡＰ１（ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＳＴＡＴ１（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ １）、又はＮｒｆ２（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ２－ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２）である、請求項２に記載のｉＣＰ－ＮＩ合成ペプチド。
【請求項4】
前記炎症性疾患は、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、移植片拒絶（ｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、膵炎（ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）、急性気管支炎（ａｃｕｔｅ ｂｒｏｎｃｈｉｔｓ）、慢性気管支炎（ｃｈｒｏｎｉｃ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）、急性細気管支炎（ａｃｕｔｅ ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ）、慢性細気管支炎（ｃｈｒｏｎｉｃ ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ）、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、敗血症性ショック（ｓｅｐｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）、急性呼吸窮迫症候群（ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、多臓器不全（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｒｇａｎ ｆａｉｌｕｒｅ）、又は慢性閉塞性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）を含む、請求項１に記載のｉＣＰ－ＮＩ合成ペプチド。
【請求項5】
前記自己免疫疾患は、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、視神経炎（ｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｉｔｉｓ）、慢性閉塞性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、喘息（ａｓｔｈｍａ）、Ｉ型糖尿病（ｔｙｐｅ Ｉ ｄｉａｂｅｔｅｓ）、視神経脊髄炎（ｎｅｕｒｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｏｐｔｉｃａ）、重症筋無力症（Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ Ｇａｖｉｓ）、ブドウ膜炎（ｕｖｅｉｔｉｓ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｉｎ－Ｂａｒｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、乾癬性関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、Ｇａｖｅｓ病（Ｇａｖｅｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ）、又はアレルギー（ａｌｌｅｒｇｙ）を含む、請求項４に記載のｉＣＰ－ＮＩ合成ペプチド。
【請求項6】
請求項１～５のうちのいずれか１項に記載のｉＣＰ－ＮＩ合成ペプチドを含む、サイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療のための薬学的組成物。
【請求項7】
前記サイトカインストーム又は炎症性疾患は、ウイルス（ｖｉｒｕｓｅｓ）、バクテリア（ｂａｃｔｅｒｉａ）、真菌（ｆｕｎｇｉ）、又は寄生虫（ｐａｒａｓｉｔｅｓ）による炎症性感染により誘発される、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項8】
前記ウイルスは、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、ハンタウイルス（Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ）、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、エプスタインバールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、エボラウイルス（Ｅｂｏｌａ ｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、又はバリオラウイルス（ｖａｒｉｏｌａ ｖｉｒｕｓ）を含む、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項9】
前記バクテリア感染は、菌血症（ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ）、細菌性敗血症（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｅｐｓｉｓ）、肺炎（ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、蜂窩織炎（ｃｅｌｌｕｌｉｔｉｓ）、髄膜炎（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）、丹毒（ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ）、感染性心内膜炎（ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ）、壊死性筋膜炎（ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ ｆａｓｃｉｉｔｉｓ）、前立腺炎（ｐｒｏｓｔａｔｉｔｉｓ）、偽膜性大腸炎（ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｃｏｌｉｔｉｓ）、腎盂腎炎（ｐｙｅｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、又は敗血性関節炎（ｓｅｐｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）を含む、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項10】
前記真菌は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、又はクリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）を含む、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項11】
前記寄生虫は、熱帯熱原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）を含む、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項12】
抗生剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）、抗ウイルス剤（ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ ａｇｅｎｔ）、抗ＨＩＶ剤（ａｎｔｉ－ＨＩＶ ａｇｅｎｔ）、抗寄生虫剤（ａｎｔｉ－ｐａｒａｓｉｔｅ ａｇｅｎｔ）、抗原虫剤（ａｎｔｉ－ｐｒｏｔｏｚｏａｌ ａｇｅｎｔ）、ステロイド剤（ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｇｅｎｔ）、ステロイド性又は非ステロイド性抗炎症剤（ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ｏｒ ｎｏｎ－ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）、抗ヒスタミン剤（ａｎｔｉｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ ａｇｅｎｔ）、又はこれらの組み合わせをさらに含む、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項13】
前記抗生剤は、セファロスポリン系（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ ｓｅｒｉｅｓ）、β－ラクタム系（ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍ ｓｅｒｉｅｓ）、β－ラクタム／β－ラクタマーゼ阻害剤系（ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍ／ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｅｒｉｅｓ）、キノロン系（ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ ｓｅｒｉｅｓ）、グリコペプチド系（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｒｉｅｓ）、カルバペネム系（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ ｓｅｒｉｅｓ）、アミノグリコシド系（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｓｅｒｉｅｓ）、マクロライド系（ｍａｃｒｏｌｉｄｅ ｓｅｒｉｅｓ）、サルファ剤系（ｓｕｌｆａ ｄｒｕｇ ｓｅｒｉｅｓ）、アズトレオナム（ａｚｔｒｅｏｎａｍ）、クリンダマイシン（ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ）、チゲサイクリン（ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎｅ）、コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム（ｃｏｌｉｓｔｉｎ ｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、メトロニダゾール（ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ）、スピラマイシン（ｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ）、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項14】
前記炎症性疾患は、自己免疫疾患、移植片拒絶、多発性硬化症、膵炎、急性気管支炎、慢性気管支炎、急性細気管支炎、慢性細気管支炎、敗血症、敗血症性ショック、急性呼吸窮迫症候群、多臓器不全、又は慢性閉塞性肺疾患を含む、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項15】
前記自己免疫疾患は、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、視神経炎（ｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｉｔｉｓ）、慢性閉塞性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、喘息（ａｓｔｈｍａ）、Ｉ型糖尿病（ｔｙｐｅ Ｉ ｄｉａｂｅｔｅｓ）、視神経脊髄炎（ｎｅｕｒｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｏｐｔｉｃａ）、重症筋無力症（Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ Ｇａｖｉｓ）、ブドウ膜炎（ｕｖｅｉｔｉｓ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｉｎ－Ｂａｒｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、乾癬性関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、Ｇａｖｅｓ病（Ｇａｖｅｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ）、又はアレルギー（ａｌｌｅｒｇｙ）を含む、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項16】
請求項１～５のうちのいずれか１項に記載のｉＣＰ－ＮＩ合成ペプチドを対象体に投与するステップを含む、サイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療方法（但し、ヒトに対する医療行為を除く。）。
【請求項17】
前記ｉＣＰ－ＮＩ合成ペプチドは、抗生剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）、抗ウイルス剤（ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ ａｇｅｎｔ）、抗ＨＩＶ剤（ａｎｔｉ－ＨＩＶ ａｇｅｎｔ）、抗寄生虫剤（ａｎｔｉ－ｐａｒａｓｉｔｅ ａｇｅｎｔ）、抗原虫剤（ａｎｔｉ－ｐｒｏｔｏｚｏａｌ ａｇｅｎｔ）、ステロイド剤（ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｇｅｎｔ）、ステロイド性又は非ステロイド性抗炎症剤（ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ｏｒ ｎｏｎ－ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）、抗ヒスタミン剤（ａｎｔｉｈｉｓｔａｍｉｎｅ）、免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ ａｇｅｎｔ）、又はこれらの組み合わせと併用して投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記抗生剤は、セファロスポリン系（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ ｓｅｒｉｅｓ）、β－ラクタム系（ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍ ｓｅｒｉｅｓ）、β－ラクタム／β－ラクタマーゼ阻害剤系（ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍ／ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｅｒｉｅｓ）、キノロン系（ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ ｓｅｒｉｅｓ）、グリコペプチド系（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｒｉｅｓ）、カルバペネム系（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ ｓｅｒｉｅｓ）、アミノグリコシド系（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｓｅｒｉｅｓ）、マクロライド系（ｍａｃｒｏｌｉｄｅ ｓｅｒｉｅｓ）、サルファ剤（ｓｕｌｆａ ｄｒｕｇ ｓｅｒｉｅｓ）、アズトレオナム（ａｚｔｒｅｏｎａｍ）、クリンダマイシン（ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ）、チゲサイクリン（ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎｅ）、コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム（ｃｏｌｉｓｔｉｎ ｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、メトロニダゾール（ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ）、スピラマイシン（ｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ）、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記投与は、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）、非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）、頭蓋内（ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ）、眼窩内（ｉｎｔｒａｏｒｂｉｔａｌ）、眼内（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ）、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、被膜内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ）、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、鼻腔内（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ）、直腸内（ｉｎｔｒａｒｅｃｔａｌ）、膣内（ｉｎｔｒａｖａｇｉｎａｌ）、噴霧（ｓｐｒａｙｉｎｇ）、経口（ｏｒａｌ）投与を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項20】
前記サイトカインストーム又は炎症性疾患は、ウイルス、バクテリア、真菌、又は寄生虫による炎症性感染により誘発される、請求項１６に記載の方法。
【請求項21】
前記サイトカインストーム又は炎症性疾患は、外傷（ｔｒａｕｍａ）、負傷（ｉｎｊｕｒｙ）、火傷（ｂｕｒｎｓ）、毒素（ｔｏｘｉｎｓ）、又は発癌物質（ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ）により誘発される、請求項１６に記載の方法。
【請求項22】
前記炎症性疾患は、自己免疫疾患、移植片拒絶、多発性硬化症、膵炎、急性気管支炎、慢性気管支炎、急性細気管支炎、慢性細気管支炎、敗血症、敗血症性ショック、急性呼吸窮迫症候群、多臓器不全、又は慢性閉塞性肺疾患を含む、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、サイトカインストーム（ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔｏｒｍ）又は炎症性疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｅｓｅａｓｅ）を抑制するために改善された細胞浸透性核輸送阻害剤（ｃｅｌｌ－ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｉｍｐｏｒｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（ｉＣＰ－ＮＩ）合成ペプチドに関するものであり、細胞透過性核輸入阻害剤（ＣＰ－ＮＩ、ｃＳＮ５０．１ペプチド）に、ＴＳＤＴ（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を基盤とするａＭＴＤ（ａｄｖａｎｃｅｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）を導入し、溶解性及び安定性が向上した。本発明に係る改善された細胞透過性核輸入阻害剤合成ペプチドは、優れた細胞透過性を基に、ＮＦ－κＢを含むストレス応答性転写因子（ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ）（ＳＲＴＦｓ）により媒介されるシグナル伝達をより効率的に遮断し、従って、サイトカインストーム又は炎症性疾患に対する優れた予防又は治療剤として使用可能である。
【背景技術】
【0002】
炎症反応とは、微生物感染や外部ダメージから生体を保護するための防御メカニズムを意味する。炎症の目的は、初期に細胞のダメージを抑制し、ダメージを受けた組織や壊死細胞を傷部から除去すると同時に組織再生を開始させることにある。炎症自体は、疾病ではなく、生命体に必要な自己防衛システム（ｓｅｌｆ－ｄｅｆｅｎｓｅ ｓｙｓｔｅｍ）に該当する。しかし、身体の防御システムが過度に活性化されると、統制されない免疫反応が原因で「サイトカインストーム」と呼ばれる現象が発生する。サイトカインストームは、身体全体に激しい炎症反応が起こり、結果的に血管拡張、発熱、肝臓からの急性期蛋白質（ａｃｕｔｅ ｐｈａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の放出、炎症性病巣（ｆｏｃｉ）への白血球招集、また、酷い場合は、低血圧と臓器不全（ｏｒｇａｎ ｆａｉｌｕｒｅ）により患者が死亡することになる。また、過度な炎症とサイトカインストームは、様々な炎症性疾患の原因として知られている。
【0003】
炎症性疾患の一つである敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）は、バクテリアやウイルス感染、酷い外傷などにより発生する症状であり、身体に侵入した病原体に由来する病原体関連分子パターン（ｐａｔｈｏｇｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｐａｔｔｅｒｎ）（ＰＡＭＰ）、又はダメージを受けた組織に由来するダメージ関連分子パターン（ｄａｍａｇｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｐａｔｔｅｒｎ）（ＤＡＭＰ）のような原因物質は、マクロファージ及びサイトカインストームのような自己防御システムの過度な活性化を誘発する。このような過度な全身炎症反応は、循環系異常を誘発し、毛細血管漏出による血管透過性の増加で血圧が下がり、結局、全身の複数の臓器への血液供給が不足して多臓器不全（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｒｇａｎ ｆａｉｌｕｒｅ）（ＭＯＦ）を誘発する。敗血症は、致死率が約３０％の代表的な難治性疾患であり、世界的に毎年２，７００万人の患者が発生する。敗血症は、癌と心臓病に次いで世界で３番目に高い死亡原因と言われている。従って、身体と細胞の炎症反応を抑制し、サイトカインストームを遮断することを敗血症治療の目標とする必要がある。
【0004】
また、２０１９年１２月にコロナウイルス疾患の原因病原体である重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が最初報告された。
【0005】
２０１９年１２月に中国武漢でＣＯＶＩＤ－１９の初期事例が報告されて以来（Ｈｕａｎｇ，Ｃ．ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｗｈｈａｎ，Ｃｈｉｎａ．Ｌａｎｃｅｔ ３９５，４９７－５０６（２０２０））、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、医療システムを圧倒して脅威となるような侵襲的外部換気（ｉｎｖａｓｉｖｅ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ）を必要とする重症事例の数が増加し続け、世界的大流行として浮上した（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ（ＣＯＶＩＤ－２０１９） ｓｉｔｕａｔｉｏｎ ｒｅｐｏｒｔｓ．Ｓｅｅ ｗｅｂｓｉｔｅ ｍａｄｅ ｕｐ ｏｆ “ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．” ｂｅｆｏｒｅ “ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｅｍｅｒｇｅｎｃｉｅｓ／ｄｉｓｅａｓｅ／ｎｏｖｅｌ－ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ－２０１９／ｓｉｔｕａｔｉｏｎ－ｒｅｐｏｒｔｓ”）。ＣＯＶＩＤ－１９患者が無症状から重症まで様々な臨床結果を経験する理由は、まだ明らかではないが、ＣＯＶＩＤ－１９の病因及び死亡率の著しい特徴は、蔓延した炎症とＡＲＤＳに繋がるＣＲＳである（Ｍｅｈｔａ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．ＣＯＶＩＤ－１９：ｃｏｎｓｉｄｅｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔｏｒｍ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｌａｎｃｅｔ ３９５，１０３３－１０３４（２０２０）；Ｑｉｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ１９ ｉｎ Ｗｕｈａｎ，Ｃｈｉｎａ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２０２０））。実際に、肺への過度な免疫細胞の浸透（ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、サイトカインストーム及びＡＲＤＳは、密接に関連したベータコロナウイルス属ＳＡＲＳ－ＣｏＶに感染したヒトの重症疾病の特徴を定義するものと既に説明されている。
【0006】
一方、炎症誘発シグナルの増幅は、核内因子κＢ（ＮＦ－κＢ）、活性蛋白質１（ＡＰ－１）、シグナル変換器及び転写活性剤（ＳＴＡＴ）を含む、限られた数の転写因子（ここでは、ストレス応答性因子、ＳＲＴＦと指定されている）と、ＰＲＲ及び炎症誘発性サイトカイン受容体により開始されたシグナルに反応し、サイトカイン及びその他の炎症性遺伝子の発現を調節するものである活性化されたＴ細胞の核因子（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ）（ＮＦＡＴ）に依存する。炎症に素早く反応するため、先天免疫系（ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）の細胞は、不活性状態で細胞質に隔離されたＳＲＴＦｓのプール（ｐｏｏｌ）を維持する。ＳＲＴＦｓは、ＮＬＳ（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を露出するリン酸化依存的変化により活性化され、蛋白質が核に移動できるようにする。ＮＦ－κＢは、抑制蛋白質（ＩｋＢ）のリン酸化により活性化される;ＡＰ－１及びＳＴＡＴ１／３は、リン酸化により活性化され、ＮＦＡＴ１は、脱リン酸化により活性化される。
【0007】
以前の研究では、ＳＲＴＦ核輸送を標的にして炎症反応を抑制する可能性をテストした。各転写因子のＮＬＳが同一の輸送アダプタ蛋白質であるＩｍｐｏｒｔｉｎ－５αにより認識されるという事実により作業が単純化された。細胞透過性ペプチド（ｃＳＮ５０．１）は、４つのＳＲＴＦ全ての核輸入を競争的に抑制し、サイトカイン遺伝子発現の脂質多糖類（ＬＰＳ）依存的活性化を遮断するため、十分な数のＮＬＳ配列を細胞に伝達して合成された。さらに、ｃＳＮ５０．１は、致死量のＬＰＳ及びその他の染症誘発作用剤で攻撃されたマウスを保護することができた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明者等は、既存の細胞透過性核輸送阻害剤（ＣＰ－ＮＩ，ｃＳＮ５０．１ペプチド）の限界を克服するために多くの努力を傾けた結果、ＣＰ－ＮＩに、ＴＳＤＴ（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｅｃｈｏｌｏｇｙ）に基づくａＭＴＤ（ａｄｖａｎｃｅｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）を導入することにより、溶解性及び安定性が向上されることを見出し、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の目的は、サイトカインストーム又は炎症性疾患を抑制するために改善された細胞透過性核輸送阻害剤（ｉＣＰ－ＮＩ）合成ペプチドを提供することにあり、ｉＣＰ－ＮＩ合成ペプチドは、ＮＦ－κＢ ＮＬＳ及びａＭＴＤを含み、前記ＮＦ－κＢ ＮＬＳは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記ａＭＴＤは、配列番号２～６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。本発明に係るｉＣＰ－ＮＩ合成ペプチドは、ｉｍｐｏｔｉｎ αと結合してＮＦ－κＢを含むＳＲＴＦ（ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）の核内移動を抑制することにより、サイトカインストームの発生を事前に防止することができる。
【0010】
発明の他の目的は、ｉＣＰ－ＮＩ合成ペプチドを含む、サイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療のための薬学的組成物を提供することにある。
【0011】
本発明のまた他の目的は、ＮＦ－κＢ ＮＬＳ及びａＭＴＤを含むｉＣＰ－ＮＩ合成ペプチドを対象体に投与するステップを含む、サイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療方法を提供することにある。
【発明の効果】
【0012】
本発明による改善された細胞透過性核輸送阻害剤（ｉＣＰ－ＮＩ）合成ペプチドは、優れた細胞透過性に基づき、ＮＦ－κＢを含むＳＲＴＦにより媒介されるシグナル伝達をより効率的に遮断し、従って、ｉＣＰ－ＮＩ合成ペプチドは、サイトカインストーム又は炎症性疾患に対する優れた予防又は治療剤として使用可能であるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図8】図８は、培養されたＲＡＷ２６４．７細胞においてフルオレセインイソチオシアン酸塩（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）（ＦＩＴＣ）が結合されたｉＣＰ－ＮＩに関するフローサイトメトリー解析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明の具体的な実施例に係るサイトカインストーム又は炎症性疾患を抑制するための改善された細胞透過性核輸入阻害剤合成ペプチド、ＮＦ－κＢ核局在化配列及びａＭＴＤを含む改善された細胞透過性核輸入阻害剤合成ペプチド、サイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療のための薬学的組成物、改善された細胞透過性核輸入阻害剤合成ペプチドを含む薬学的組成物、及びサイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療方法を詳細に説明する。但し、これは例示のための実施例に過ぎず、本発明の範囲がこれらによって限定されることはなく、本発明の範囲内で種々に変更できることは当業者にとって明らかである。
【0015】
「含有する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」の用語は、本明細書全体にわたって、他に述べられない限り、特に制限なく特定の構成（又は、要素）を含むことを意味し、他の構成（又は、要素）の追加を排除するものとは解釈されない。
【0016】
本発明で使用された用語「アミノ酸」とは、最も広い意味で自然発生したＬ－α－アミノ酸又はその残基だけでなく、Ｄ－アミノ酸、及び化学的に変形したアミノ酸を含む。例えば、アミノ酸は、前述したアミノ酸の模倣体及び類似体を含むことができる。本開示において、模倣体及び類似体には、機能的等価物が含まれる。
【0017】
本発明で使用された用語「炎症」とは、一般的に異物又は有害な刺激による宿主侵入に対する身体組織の局部的保護反応の結果である。このような炎症の原因は、バクテリア、ウイルス、寄生虫などの感染性原因、火傷や放射線などの物理的原因、又は毒素、薬物や産業用試薬のような化学物質、又はアレルギー及び自己免疫反応のような免疫反応、又は酸化ストレスに関連した異常状態が挙げられる。
【0018】
本発明で使用された「予防」という用語は、本発明により改善された細胞透過性核輸送阻害剤合成ペプチド（ｃｅｌｌ－ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｉｍｐｏｒｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｙｎｔｅｈｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）を投与することで、サイトカインストーム又は炎症性疾患の発生を抑制又は遅延させる全ての作用を意味し、また、「治療」という用語は、本発明により改善された細胞透過性核輸送阻害剤合成ペプチドを投与することで、サイトカインストーム又は炎症性疾患の症状が改善、又は有利に変形する全ての作用を意味する。
【0019】
本発明で使用された「投与」するとは、任意の好適な方式で対象体に本発明の予め決定された薬学的組成物を提供することを意味する。
【0020】
本発明で使用された用語「対象体」とは、サイトカインストーム又は炎症性疾患が発症又は発症する可能性のあるヒトを含む全ての動物を意味する。動物には、ヒトのみならず、類似症状の治療を必要とする牛、馬、羊、豚、山羊、ラクダ、羚羊、犬又は猫が含まれるが、これらに制限されない。
【0021】
第１の実施例によれば、本発明は、サイトカインストーム又は炎症性疾患を抑制するための改善された細胞透過性核輸送阻害剤（ｉＣＰ－ＮＩ）合成ペプチド、ＮＦ－κＢ核局在化配列（ＮＬＳ）及びａＭＴＤを含む、改善された細胞透過性核輸送阻害剤合成ペプチドを提供する。
【0022】
本発明の改善された細胞透過性核輸送阻害剤合成ペプチドと関連して、ＮＦ－κＢ ＮＬＳは、線状ＮＦ－κＢ ＮＬＳ及び２つの追加システインを有する円状ＮＬＳであり得る。本発明の改善された細胞透過性核輸送阻害剤合成ペプチドと関連して、円状ＮＦ－κＢ核局在化配列番号１のアミノ酸配列を含むことができる。
【0023】
本発明の改善された細胞透過性核輸送阻害剤合成ペプチドにおいて、ａＭＴＤは、配列番号２～６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
【0024】
本発明の改善された細胞透過性核輸送阻害剤合成ペプチドと関連して、改善された細胞透過性核輸送阻害剤合成ペプチドは、ストレス応答性転写因子（ＳＲＴＦｓ）の核輸送を抑制することができる。
【0025】
例えば、ＳＲＴＦは、ＮＦ－κＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ κＢ）、ＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ）、ＡＰ１（ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＳＴＡＴ１（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ １）、又はＮｒｆ２（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ２－ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２）であり得る。
【0026】
本発明の改善された細胞透過性核輸送阻害剤合成ペプチドについて、サイトカインストームには、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、移植片拒絶（ｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、膵炎（ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ）、急性気管支炎（ａｃｕｔｅ ｂｒｏｎｃｈｉｔｓ）、慢性気管支炎（ｃｈｒｏｎｉｃ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）、急性細気管支炎（ａｃｕｔｅ ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ）、慢性細気管支炎（ｃｈｒｏｎｉｃ ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ）、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、敗血症性ショック（ｓｅｐｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）、急性呼吸窮迫症候群（ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、多臓器不全（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｒｇａｎ ｆａｉｌｕｒｅ）、又は慢性閉塞性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）を誘発することがある。例えば、自己免疫疾患には、関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、視神経炎（ｏｐｔｉｃ ｎｅｕｒｉｔｉｓ）、慢性閉塞性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、喘息（ａｓｔｈｍａ）、Ｉ型糖尿病（ｔｙｐｅ Ｉ ｄｉａｂｅｔｅｓ）、視神経脊髄炎（ｎｅｕｒｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｏｐｔｉｃａ）、重症筋無力症（Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ Ｇａｖｉｓ）、ブドウ膜炎（ｕｖｅｉｔｉｓ）、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｉｎ－Ｂａｒｒｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、乾癬性関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、Ｇａｖｅｓ病（Ｇａｖｅｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ）、又はアレルギー（ａｌｌｅｒｇｙ）が含まれるが、これらに制限されない。
【0027】
第２の実施例によれば、本発明は、ＮＦ－κＢ ＮＬＳ及びａＭＴＤを含む改善された細胞透過性核輸送阻害剤（ｉＣＰ－ＮＩ）合成ペプチドを含む、サイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療のための薬学的組成物を提供する。
【0028】
本発明に係るサイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療のための薬学的組成物において、ＮＦ－κＢ ＮＬＳは、線状ＮＦ－κＢ ＮＬＳ及び２つの追加システインを有する円状ＮＬＳであり得る。
【0029】
本発明に係るサイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療のための薬学的組成物において、円状ＮＦ－κＢ ＮＬＳは、配列番号１のアミノ酸配列を含むことができる。
【0030】
本発明に係るサイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療のための薬学的組成物において、ａＭＴＤは、配列番号２～６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
【0031】
本発明に係るサイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療のための薬学的組成物において、改善された細胞透過性核輸送阻害剤合成ペプチドは、ストレス応答性転写因子（ＳＲＴＦ）の核輸送を抑制することができる。例えば、ＳＲＴＦは、ＮＦ－κＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ κＢ）、ＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ）、ＡＰ１（ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＳＴＡＴ１（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ １）、又はＮｒｆ２（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ２－ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２）であり得る。
【0032】
本発明に係るサイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療のための薬学的組成物において、サイトカインストーム又は炎症性疾患は、ウイルス、バクテリア、カビ、又は寄生虫による炎症性感染により誘発され得る。炎症性感染は、ウイルス、バクテリア、真菌又は寄生虫により誘発され得る。例えば、ウイルスには、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、ハンタウイルス（Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ）、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、エプスタインバールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、エボラウイルス（Ｅｂｏｌａ ｖｉｒｕｓ）、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、又は痘瘡ウイルス（ｖａｒｉｏｌａ ｖｉｒｕｓ）が含まれるが、これらに制限されない。コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）であり得る。バクテリア感染には、菌血症（ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ）、細菌性敗血症（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｅｐｓｉｓ）、肺炎（ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、蜂窩織炎（ｃｅｌｌｕｌｉｔｉｓ）、髄膜炎（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）、丹毒（ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ）、感染性心内膜炎（ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ）、壊死性筋膜炎（ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ ｆａｓｃｉｉｔｉｓ）、前立腺炎（ｐｒｏｓｔａｔｉｔｉｓ）、偽膜性大腸炎（ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｃｏｌｉｔｉｓ）、腎盂腎炎（ｐｙｅｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、又は敗血性関節炎（ｓｅｐｔｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）が含まれるが、これらに制限されない。バクテリア感染は、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、サルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、シュードモナス属菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）、クロストリジウム属菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、ビブリオ属菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ．）、マイコバクテリウム属菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、又はヘモフィルス属菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．）により誘発され得るが、これらに制限されない。前記真菌には、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、又はクリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）が含まれるが、これらに制限されない。前記寄生虫には、熱帯熱原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のようなマラリア寄生虫が含まれるが、これらに制限されない。
【0033】
本発明に係るサイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療のための薬学的組成物において、前記サイトカインストーム又は炎症性疾患は、外傷、傷害、毒素又は発癌性物質により誘発され得る。毒素には、リポ多糖誘発毒素（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｘｉｎｓ）、スーパー抗原誘発毒素（ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｘｉｎｓ）（例えば、ブドウ球菌腸毒素Ａ又はＢ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ａ ｏｒ Ｂ）、連鎖球菌発熱毒素（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ ｔｏｘｉｎ）及びＭ蛋白質（Ｍ ｐｒｏｔｅｉｎ）、又はバクテリアにより生成される全てのスーパー抗原）、植物性毒素（ｐｌａｎｔ ｔｏｘｉｎｓ）（例えば、ポイズン・アイビー（ｐｏｉｓｏｎ ｉｖｙ））、ニッケル（ｎｉｃｋｅｌ）、ラテックス（ｌａｔｅｘ）、環境毒素（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｔｏｘｉｎｓ）（例えば、ポイズン（ｐｏｉｓｉｏｎｓ））、又はアレルギーが含まれるが、これらに制限されない。
【0034】
本発明に係るサイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療のための薬学的組成物において、サイトカインストームは、例えば、自己免疫疾患、移植片拒絶、多発性硬化症、膵炎、急性気管支炎、慢性気管支炎、急性細気管支炎、慢性細気管支炎、敗血症、敗血症性ショック、急性呼吸窮迫症候群、多臓器不全、又は慢性閉塞性肺疾患のような炎症性感染を誘発することがある。例えば、自己免疫疾患には、関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、クローン病、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群、視神経炎、慢性閉塞性肺疾患、喘息、Ｉ型糖尿病、視神経脊髄炎、重症筋無力症、ブドウ膜炎、ギラン・バレー症候群、乾癬性関節炎、Ｇａｖｅｓ病、又はアレルギーが含まれるが、これらに制限されない。
【0035】
本発明に係るサイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療のための薬学的組成物において、薬学的組成物には、抗生剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）、抗ウイルス剤（ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ ａｇｅｎｔ）（例えば、レムデシビル（ｒｅｍｄｅｓｉｖｉｒ））、抗ＨＩＶ剤（ａｎｔｉ－ＨＩＶ ａｇｅｎｔ）、抗寄生虫剤（ａｎｔｉ－ｐａｒａｓｉｔｅ ａｇｅｎｔ）、抗原虫剤（ａｎｔｉ－ｐｒｏｔｏｚｏａｌ ａｇｅｎｔ）、ステロイド剤（ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｇｅｎｔ）、ステロイド性又は非ステロイド性抗炎症剤（ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ｏｒ ｎｏｎ－ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）、抗ヒスタミン剤（ａｎｔｉｈｉｓｔａｍｉｎｅ）（例えば、ジフェンヒドラミン（ｄｉｐｈｅｎｈｙｄｒａｍｉｎｅ））、免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ ａｇｅｎｔ）、又はこれらの組み合わせがさらに含まれる。例えば、抗生剤には、セファロスポリン系（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ ｓｅｒｉｅｓ）、β－ラクタム系（ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍ ｓｅｒｉｅｓ）、β－ラクタム／β－ラクタマーゼ阻害剤系（ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍ／ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｅｒｉｅｓ）、キノロン系（ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ ｓｅｒｉｅｓ）、グリコペプチド系（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｒｉｅｓ）、カルバペネム系（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ ｓｅｒｉｅｓ）、アミノグリコシド系（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｓｅｒｉｅｓ）、マクロライド系（ｍａｃｒｏｌｉｄｅ ｓｅｒｉｅｓ）、サルファ剤系（ｓｕｌｆａ ｄｒｕｇ ｓｅｒｉｅｓ）、アズトレオナム（ａｚｔｒｅｏｎａｍ）、クリンダマイシン（ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ）、チゲサイクリン（ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎｅ）、コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム（ｃｏｌｉｓｔｉｎ ｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、メトロニダゾール（ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ）、スピラマイシン（ｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ）、又はこれらの組み合わせが含まれるが、これらに制限されない。セファロスポリン系抗生剤には、セファゾリン（ｃｅｆａｚｏｌｉｎ）、セフカペンピボキシル（ｃｅｆｃａｐｅｎｅ ｐｉｖｏｘｉｌ）、セフポドキシムプロキセチル（ｃｅｆｐｏｄｏｘｉｍｅ ｐｒｏｘｅｔｉｌ）、セフラジン（ｃｅｐｈｒａｄｉｎｅ）、セフトリアキソン（ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅ）、セフブペラゾン（ｃｅｆｂｕｐｅｒａｚｏｎｅ）、セフォタキシム（ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ）、セフミノクス（ｃｅｆｍｉｎｏｘ）、セフタジジム（ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ）、セフピロム（ｃｅｆｐｉｒｏｍｅ）、セフィキシム（ｃｅｆｉｘｉｍｅ）、セファレキシン（ｃｅｐｈａｌｅｘｉｎ）、セフジニル（ｃｅｆｄｉｎｉｒ）、セフロキサジン（ｃｅｆｒｏｘａｄｉｎｅ）、セフロキシム（ｃｅｆｕｒｏｘｉｍｅ）、セファドロキシル（ｃｅｆａｄｒｏｘｉｌ）、セフォキシチン（ｃｅｆｏｘｉｔｉｎ）、セフェタメットピボキシル（ｃｅｆｅｔａｍｅｔ ｐｉｖｏｘｉｌ）、セフチゾキシム（ｃｅｆｔｉｚｏｘｉｍｅ）、セファマンドールナファート（ｃｅｆａｍａｎｄｏｌｅ ｎａｆａｔｅ）、セファゼドン（ｃｅｆａｚｅｄｏｎｅ）、セフテラムピボキシル（ｃｅｆｔｅｒａｍ ｐｉｖｏｘｉｌ）、セフテゾル（ｃｅｆｔｅｚｏｌｅ）、セフプロジル（ｃｅｆｐｒｏｚｉｌ）、セフォテタン（ｃｅｆｏｔｅｔａｎ）、セフメノキシム（ｃｅｆｍｅｎｏｘｉｍｅ）、セフジトレンピボキシル（ｃｅｆｄｉｔｏｒｅｎ ｐｉｖｏｘｉｌ）、セファトリジンプロピレングリコール（ｃｅｆａｔｒｉｚｉｎｅ ｐｒｏｐｌｙｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、セフォチアム（ｃｅｆｏｔｉａｍ）、セフォチアムヘキセチルＨＣｌ（ｃｅｆｏｔｉａｍ ｈｅｘｅｔｉｌ ＨＣｌ）、セフチブテン（ｃｅｆｔｉｂｕｔｅｎ）、セファクロル（ｃｅｆａｃｌｏｒ）、セフォペラゾン（ｃｅｆｏｐｅｒａｚｏｎｅ）、セフピラミド（ｃｅｆｐｉｒａｍｉｄｅ）、セファロチン（ｃｅｐｈａｌｏｔｈｉｎ）、セフォジジム（ｃｅｆｏｄｉｚｉｍｅ）、セフォニシド（ｃｅｆｏｎｉｃｉｄ）、セフメタゾール（ｃｅｆｍｅｔａｚｏｌｅ）、又はセフェピム（ｃｅｆｅｐｉｍｅ）が含まれる。β－ラクタム系抗生剤には、ナフシリン（ｎａｆｃｉｌｌｉｎ）、ピペラシリン（ｐｉｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ）、又はアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれる。β－ラクタマーゼ阻害剤系抗生剤には、スルバクタム（ｓｕｌｂａｃｔａｍ）、タゾバクタム（ｔａｚｏｂａｃｔａｍ）、スルタミシリントシル酸塩（ｓｕｌｔａｍｉｃｉｌｌｉｎｔｏｓｙｌａｔｅ）、アモキシシリン（ａｍｏｘｉｃｉｌｌｉｎ）、クラブラン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｌａｖｕｌａｎａｔｅ）、チカルシリン（ｔｉｃａｒｃｉｌｌｉｎ）、又はピボキシルスルバクタム（ｐｉｖｏｘｉｌ ｓｕｌｂａｃｔａｍ）が含まれる。キノロン系抗生剤には、シプロフロキサシン（ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、モキシフロキサシン（ｍｏｘｉｆｌｏｘａｃｉｎ）、レボフロキサシン（ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、又はロメフロキサシン（ｌｏｍｅｆｌｏｘａｃｉｎ）が含まれる。グリコペプチド系抗生剤には、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）、リネゾリド（ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ）、又はテイコプラニン（ｔｅｉｃｏｐｌａｎｉｎ）が含まれる。カルバペネム系抗生剤には、メロペネム（ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ）、ドリペネム一水和物（ｄｏｒｉｐｅｎｅｍ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）、シラスタチン（ｃｉｌａｓｔａｔｉｎ）、イミペネム一水和物（ｉｍｉｐｅｎｅｍ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）が含まれる。アミノグリコシド系抗生剤には、アミカシン（ａｍｉｋａｃｉｎ）、トブラマイシン（ｔｏｂｒａｍｙｃｉｎ）、ネチルマイシン（ｎｅｔｉｌｍｉｃｉｎ）、シソマイシン（ｓｉｓｏｍｉｃｉｎ）、イセパマイシン（ｉｓｅｐａｍｉｃｉｎ）、ホスホマイシン（Ｆｏｓｆｏｍｙｃｉｎ）、又はゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）が含まれる。マクロライド系抗生剤には、クラリスロマイシン（ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、ロキシスロマイシン（ｒｏｘｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、又はアジスロマイシン（ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）が含まれる。サルファ剤系抗生剤には、スルファメトキサゾール（ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｅ）、又はトリメトプリム（ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ）が含まれる。
【0036】
本発明の薬学組成物は、通常使用される適切な担体、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）又は希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）をさらに含むことができる。本発明の薬学組成物に含まれる担体、賦形剤又は希釈剤には、乳糖（ｌａｃｔｏｓｅ）、ブドウ糖（ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、ショ糖（ｓｕｃｒｏｓｅ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、マンニトール（ｍａｎｎｉｔｏｌ）、キシリトール（ｘｙｌｉｔｏｌ）、エリスリトール（ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ）、マルチトール（ｍａｌｔｉｔｏｌ）、澱粉（ｓｔａｒｃｈ）、アカシアゴム（ａｃａｃｉａ ｒｕｂｂｅｒ）、アルギネート（ａｌｇｉｎａｔｅ）、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）、リン酸カルシウム（ｃｌａｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ケイ酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｌｉｃａｔｅ）、セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、メチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、結晶セルロース（ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、水、メチルヒドロキシベンゾエート（ｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ）、プロピルヒドロキシベンゾエート（ｐｒｏｐｙｌ ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ）、滑石（ｔａｌｃ）、マグネシウムステアレート（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｔｅａｒａｔｅ）、ミネラルオイル（ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）が含まれるが、これらに制限されない。
【0037】
本発明の薬学組成物は、通常の方法で経口又は非経口剤形で投与することができ、剤形化の際には、充填剤（ｆｉｌｌｅｒｓ）、増量剤（ｅｘｔｅｎｄｅｒｓ ）、結合剤（ｂｉｎｄｅｒｓ）、湿潤剤（ｗｅｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、崩解剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ）、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）などのように一般的に使用される希釈剤又は賦形剤を使用することができる。経口投与用固形製剤としては、錠剤（ｔａｂｌｅｔｓ）、丸剤（ｐｉｌｌｓ）、散剤（ｐｏｗｄｅｒｓ）、顆粒剤（ｇｒａｎｕｌｅｓ）、カプセル剤（ｃａｐｓｕｌｅｓ）などが挙げられ、このような固形製剤は、組成物に少なくとも一つの賦形剤、例えば、澱粉（ｓｔａｒｃｈ）、炭酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ショ糖、乳糖、ゼラチンなどを混合して製造される。単純な浮形剤の他に、マグネシウムステアレート（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｔｅａｒａｔｅ）及び滑石のような潤滑剤も使用される。経口投与用液剤には、懸濁液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ）、内服用液剤（ｌｉｑｕｉｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｌｎｔｅｒｎａｌ ｕｓｅ）、乳剤（ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）、シロップ剤（ｓｙｒｕｐｓ）などが含まれる。一般的に使用される単純希釈剤である水及び流動パラフィン（ｌｉｑｕｉｄ ｐａｒａｆｆｉｎ）の他に、湿潤剤、甘味剤（ｓｗｅｅｔｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、香料（ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ）、防腐剤（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ）などの様々な賦形剤が含まれる。 非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液（ｓｔｅｒｉｌｅ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、非水溶媒（ｎｏｎ－ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｖｅｎｔｓ）、懸濁液、乳剤、凍結乾燥製剤（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ）及び坐剤（ｓｕｐｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）が含まれる。非水溶媒及び懸濁液には、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、オリーブオイル（ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ）のような植物性油（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｏｉｌ）、オレイン酸エチル（ｅｔｈｙｌ ｏｌｅａｔｅ）のような注射可能なエステル（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｅｓｔｅｒ）などが使用される。坐剤の基剤には、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール（ｍａｃｒｏｇｏｌ）、ツイーン６１（ｔｗｅｅｎ６１）、カカオ脂（ｃａｃａｏ ｂｕｔｔｅｒ）、ラウリン脂（ｌａｕｒｉｎ ｂｕｔｔｅｒ）、グリセロゼラチン（ｇｌｙｃｅｒｏｇｅｌａｔｉｎ）などが使用されるが、これらに制限されない。
【0038】
本発明の薬学組成物の好適な投与量は、対象体の病理状態及び体重、疾患の深刻度、薬物の種類、投与経路、並びに期間によって異なるが、当業者が適切に選択可能である。好ましい効果を得るため、本発明の薬学的組成物は、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～１０００ｍｇ／ｋｇ／日の容量範囲で投与することができる。投与は、一日一回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。前記投与量は、いかなる面においても本発明の範囲を限定することはない。
【0039】
第３の実施例によれば、本発明は、ＮＦ－κＢ核局在化配列（ＮＬＳ）及びａＭＴＤを含む改善された細胞透過性核輸送阻害剤合成ペプチドを対象体に投与するステップを含む、サイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療方法を提供する。
【0040】
本発明に係るサイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療方法において、ＮＦ－κＢ ＮＬＳは、線状ＮＦ－κＢ ＮＬＳ、及び２つの追加システインを有する円状ＮＬＳであり得る。
【0041】
本発明に係るサイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療方法において、円状ＮＦ－κＢ ＮＬＳは、配列番号１のアミノ酸配列を含むことができる。
【0042】
本発明に係るサイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療方法において、ａＭＴＤは、配列番号２～６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
【0043】
本発明に係るサイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療方法において、改善された細胞透過性核輸送阻害剤合成ペプチドは、ストレス応答性転写因子（ＳＲＴＦ）の核輸送を抑制することができる。ＳＲＴＦは、ＮＦ－κＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ κＢ）、ＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ）、ＡＰ１（ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＳＴＡＴ１（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ １）、又はＮｒｆ２（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ２－ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２）であり得る。
【0044】
本発明に係るサイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療方法において、改善された細胞透過性核輸送阻害剤合成ペプチドは、抗生物質（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）、抗ウイルス剤（ａｎｔｉ－ｖｉｒａｌ ａｇｅｎｔ）（例えば、レムデシビル（ｒｅｍｄｅｓｉｖｉｒ））、抗ＨＩＶ剤（ａｎｔｉ－ＨＩＶ ａｇｅｎｔ）、駆虫剤（ａｎｔｉ－ｐａｒａｓｉｔｅ ａｇｅｎｔ）、抗原虫剤（ａｎｔｉ－ｐｒｏｔｏｚｏａｌ ａｇｅｎｔ）、ステロイド剤（ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｇｅｎｔ）、ステロイド性又は非ステロイド性抗炎症剤（ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ｏｒ ｎｏｎ－ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）、抗ヒスタミン剤（ａｎｔｉｈｉｓｔａｍｉｎｅ）（例えば、ジフェンヒドラミン（ｄｉｐｈｅｎｈｙｄｒａｍｉｎｅ））、免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ ａｇｅｎｔ）、又はこれらの組み合わせと併用投与（ｃｏ－ａｄｍｉｎｉｓｔｅｄ）することができる。例えば、抗生剤には、セファロスポリン系（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ ｓｅｒｉｅｓ）、β－ラクタム系（ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍ ｓｅｒｉｅｓ）、β－ラクタム／β－ラクタマーゼ阻害剤系（ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍ／ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｅｒｉｅｓ）、キノロン系（ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ ｓｅｒｉｅｓ）、グリコペプチド系（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｒｉｅｓ）、カルバペネム系（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ ｓｅｒｉｅｓ）、アミノグリコシド系（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｓｅｒｉｅｓ）、マクロライド系（ｍａｃｒｏｌｉｄｅ ｓｅｒｉｅｓ）、サルファ剤系（ｓｕｌｆａ ｄｒｕｇ ｓｅｒｉｅｓ）、アズトレオナム（ａｚｔｒｅｏｎａｍ）、クリンダマイシン（ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ）、チゲサイクリン（ｔｉｇｅｃｙｃｌｉｎｅ）、コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム（ｃｏｌｉｓｔｉｎ ｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、メトロニダゾール（ｍｅｔｒｏｎｉｄａｚｏｌｅ）、スピラマイシン（ｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ）、又はこれらの組み合わせが含まれるが、これらに制限されない。
【0045】
本発明に係るサイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療方法において、投与には、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）、非経口（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）、頭蓋内（ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ）、眼窩内（ｉｎｔｒａｏｒｂｉｔａｌ）、眼内（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ）、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、被膜内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ）、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）、鼻腔内（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ）、直腸内（ｉｎｔｒａｒｅｃｔａｌ）、膣内（ｉｎｔｒａｖａｇｉｎａｌ）、噴霧（ｓｐｒａｙｉｎｇ）、又は経口（ｏｒａｌ）投与が含まれる。
【0046】
本発明に係るサイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療方法において、サイトカインストームは、ウイルス、バクテリア、真菌、又は寄生虫による炎症感染により誘発され得る。
【0047】
本発明に係るサイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療方法において、サイトカインストーム又は炎症性疾患は、外傷、負傷、火傷、毒素、又は発癌物質により誘発され得る。
【0048】
本発明に係るサイトカインストーム又は炎症性疾患の予防又は治療方法において、炎症性疾患には、自己免疫疾患、移植片拒絶、多発性硬化症、膵炎、急性気管支炎、慢性気管支炎、急性細気管支炎、慢性細気管支炎、敗血症、敗血症性ショック、急性呼吸窮迫症候群、多臓器不全、又は慢性閉塞性肺疾患が含まれる。例えば、自己免疫疾患には、関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、クローン病、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群、視神経炎、慢性閉塞性肺疾患、喘息、Ｉ型糖尿病、視神経脊髄炎、重症筋無力症、ブドウ膜炎、ギラン・バレー症候群、乾癬性関節炎、Ｇａｖｅｓ病、又はアレルギーが含まれるが、これらに制限されない。
【0049】
以下、実施例及び実験例を挙げて本発明を詳述する。但し、後述の実施例及び実験例は、本発明の例示に過ぎず、本発明の内容が後述の実施例及び実験例に限定されることはない。
【実施例】
【0050】
１．逆相高圧液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ－ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を用いた安定性の検証
ｉＣＰ－ＮＩの安定性は、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を用いて検証された。２つの種々の条件で保管されたｉＣＰ－ＮＩの吸光度を測定、比較した：１）凍結乾燥粉末として２５℃で３か月保管し、２）凍結乾燥粉末として－２０℃で保管した。各条件におけるｉＣＰ－ＮＩ凍結乾燥粉末１ｍｇが、ＨＰＬＣ等級の水１ｍＬに溶解され、溶液が０．２μｍ孔径のシリンジフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社、Ｃａｔ Ｎｏ．１３ＨＰ０２０ＡＮ）でろ過された。５０μＬのｉＣＰ－ＮＩが、逆相カラム（ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ－ｃｏｌｕｍｎ）（２５ｃｍ×４．６ｍｍ、ＨＲＣ－ＯＤＳ；ＳＨＩＭＡＤＺＵ社、Ｃａｔ Ｎｏ．２２８－２３４６３－９２）に注入された。条件は、次の通りである：緩衝液Ａ；蒸留水及び緩衝液Ｂ中の０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；アセトニトリル中の０．０５％ＴＦＡ。クロマトグラフィーは、３５℃で１ｍＬ／ｍｉｎの流速で６０分間、０～１００％バッファーＢの傾きを適用して行われた。ピークは、２３０ｎｍにおいて吸光度を測定し、モニタリングされた。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｏｐｅｎ ＬＡＢ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐａｎｅｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてクロマトグラムを導出し、解析を行った。
ｉＣＰ－ＮＩの安定性は、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を用いて検証された。２つの種々の条件で保管されたｉＣＰ－ＮＩの吸光度を測定、比較した：１）凍結乾燥粉末として２５℃で３か月保管し、２）凍結乾燥粉末として－２０℃で保管した。各条件におけるｉＣＰ－ＮＩ凍結乾燥粉末１ｍｇが、ＨＰＬＣ等級の水１ｍＬに溶解され、溶液が０．２μｍ孔径のシリンジフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社、Ｃａｔ Ｎｏ．１３ＨＰ０２０ＡＮ）でろ過された。５０μＬのｉＣＰ－ＮＩが、逆相カラム（ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ－ｃｏｌｕｍｎ）（２５ｃｍ×４．６ｍｍ、ＨＲＣ－ＯＤＳ；ＳＨＩＭＡＤＺＵ社、Ｃａｔ Ｎｏ．２２８－２３４６３－９２）に注入された。条件は、次の通りである：緩衝液Ａ；蒸留水及び緩衝液Ｂ中の０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；アセトニトリル中の０．０５％ＴＦＡ。クロマトグラフィーは、３５℃で１ｍＬ／ｍｉｎの流速で６０分間、０～１００％バッファーＢの傾きを適用して行われた。ピークは、２３０ｎｍにおいて吸光度を測定し、モニタリングされた。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｏｐｅｎ ＬＡＢ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐａｎｅｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてクロマトグラムを導出し、解析を行った。
【0051】
２．表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）（ＳＰＲ）を用いた結合親和度の測定
ｉＣＰ－ＮＩとインポーチンα５との間の直接的な相互作用を確認するため、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が行われた。Ｃｙｔｉｖａ社製のＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置は、ＳＰＲの運搬に使用された。全実験において、温度は、２５℃固定にした。ランニングバッファー（Ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）は、次のように再蒸留水（ｄｏｕｂｌｅ－ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）（ＤＷ）が準備された：２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．５。流動システム（ｆｌｏｗ ｓｙｓｔｅｍ）は、実験を開始する前に３回プライミングされた。全実験には、ＣＭ５センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ社、ＢＲ１００５３０、１０２８５２４２）が使用された。センサーチップの表面は、α５固定化前に、ランニングバッファーを３回注入して濯いだ。インポーチンα５は、ＣＭ５センサーチップに注入され、１９００ＲＵのＲｍａｘ値を達成した。希釈された濃度（１０、２５、５０、７０、及び１００μＭの間）のｉＣＰ－ＮＩが、合計１８０秒間、３０μＬ／ｍｉｎの速度でセンサーチップに注入された。ＣＭ５センサーチップ表面の再生は、１００ｎＭ ＮａＯＨ（６０秒間、３０μＬ／ｍｉｎ）で行われた。各実験の前後に、基準反応値を比較して表面再生の効果を評価した。ｉＣＰ－ＮＩとインポーチンα５との間の親和度測定が完了した後、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ３．１を用いて解離定数（ＫＤ）を計算した。
ｉＣＰ－ＮＩとインポーチンα５との間の直接的な相互作用を確認するため、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が行われた。Ｃｙｔｉｖａ社製のＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置は、ＳＰＲの運搬に使用された。全実験において、温度は、２５℃固定にした。ランニングバッファー（Ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）は、次のように再蒸留水（ｄｏｕｂｌｅ－ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）（ＤＷ）が準備された：２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．５。流動システム（ｆｌｏｗ ｓｙｓｔｅｍ）は、実験を開始する前に３回プライミングされた。全実験には、ＣＭ５センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ社、ＢＲ１００５３０、１０２８５２４２）が使用された。センサーチップの表面は、α５固定化前に、ランニングバッファーを３回注入して濯いだ。インポーチンα５は、ＣＭ５センサーチップに注入され、１９００ＲＵのＲｍａｘ値を達成した。希釈された濃度（１０、２５、５０、７０、及び１００μＭの間）のｉＣＰ－ＮＩが、合計１８０秒間、３０μＬ／ｍｉｎの速度でセンサーチップに注入された。ＣＭ５センサーチップ表面の再生は、１００ｎＭ ＮａＯＨ（６０秒間、３０μＬ／ｍｉｎ）で行われた。各実験の前後に、基準反応値を比較して表面再生の効果を評価した。ｉＣＰ－ＮＩとインポーチンα５との間の親和度測定が完了した後、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ３．１を用いて解離定数（ＫＤ）を計算した。
【0052】
３．ｉＣＰ－ＮＩの薬物動態解析及び分布
肺においてｉＣＰ－ＮＩの薬物動態を評価するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）に、ＦＩＴＣが結合されたｉＣＰ－ＮＩ １００ｍｇ／ｋｇが静脈内投与された。その後、様々な時点でマウスを犠牲にして薬物動態解析のために肺組織を得た。また、ｉＣＰ－ＮＩ解析の分布のため、他の組織（脳、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、小腸・大腸及び膵臓）を収集した。代表的な肺組織の標本が４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＰＦＡ；ＢＩＳＥＳＡＮＧ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ＰＣ２０３１－１００－００）で灌流固定され、３０％ショ糖溶液において４℃で一晩培養された。次に、標本が最適切除温度（ＯＣＴ）化合物（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃａｔ Ｎｏ．３８０１４８０）に包埋され、顕微鏡のガラススライド上に１０μｍ厚さの冷凍切片にした。冷凍切片のサンプルがＰＢＳで徹底的に洗浄され、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ９４３４）溶液と共に室温（ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（ＲＴ）で２０分間インキュベーションされた。サンプルがＤＡＰＩ含有マウンティング溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ Ｎｏ．００－４９５９－５２）に適用され、共焦点レーザー走査顕微鏡システム（Ｌｅｉｃａ ＳＰ８）を用いて蛍光顕微鏡で視覚化され、イメージがＬｅｉｃａ ＬＡＳ Ｘソフトウェアで処理された。
肺においてｉＣＰ－ＮＩの薬物動態を評価するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）に、ＦＩＴＣが結合されたｉＣＰ－ＮＩ １００ｍｇ／ｋｇが静脈内投与された。その後、様々な時点でマウスを犠牲にして薬物動態解析のために肺組織を得た。また、ｉＣＰ－ＮＩ解析の分布のため、他の組織（脳、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、小腸・大腸及び膵臓）を収集した。代表的な肺組織の標本が４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＰＦＡ；ＢＩＳＥＳＡＮＧ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ＰＣ２０３１－１００－００）で灌流固定され、３０％ショ糖溶液において４℃で一晩培養された。次に、標本が最適切除温度（ＯＣＴ）化合物（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃａｔ Ｎｏ．３８０１４８０）に包埋され、顕微鏡のガラススライド上に１０μｍ厚さの冷凍切片にした。冷凍切片のサンプルがＰＢＳで徹底的に洗浄され、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ９４３４）溶液と共に室温（ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（ＲＴ）で２０分間インキュベーションされた。サンプルがＤＡＰＩ含有マウンティング溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ Ｎｏ．００－４９５９－５２）に適用され、共焦点レーザー走査顕微鏡システム（Ｌｅｉｃａ ＳＰ８）を用いて蛍光顕微鏡で視覚化され、イメージがＬｅｉｃａ ＬＡＳ Ｘソフトウェアで処理された。
【0053】
４．細胞培養システム
マウス（ｍｕｒｉｎｅ）マクロファージ様細胞株（ＲＡＷ２６４．７）、マウス樹状細胞株（ＤＣ２．４）、ヒト単核球細胞株（ＴＨＰ－１）及びヒト肺胞上皮細胞株（Ａ５４９）は、韓国細胞株バンク（ＫＣＬＢ）から購入し、ヒトＴリンパ球（Ｊｕｒｋａｔ Ｔ ｃｅｌｌ、Ｅ６－１）は、米国ティッシュ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣ）から購入した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）－ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＳＶ３００１０）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏの変形されたＥａｇｌｅ培地にて維持された。ＤＣ２．４、ＴＨＰ－１、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ及びＡ５４９細胞は、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＳＨ３０２５５．０１）にて培養された。全細胞は、５％ＣＯ２インキュベーターを備えた加湿環境で３７℃に維持された。
マウス（ｍｕｒｉｎｅ）マクロファージ様細胞株（ＲＡＷ２６４．７）、マウス樹状細胞株（ＤＣ２．４）、ヒト単核球細胞株（ＴＨＰ－１）及びヒト肺胞上皮細胞株（Ａ５４９）は、韓国細胞株バンク（ＫＣＬＢ）から購入し、ヒトＴリンパ球（Ｊｕｒｋａｔ Ｔ ｃｅｌｌ、Ｅ６－１）は、米国ティッシュ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣ）から購入した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）－ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＳＶ３００１０）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏの変形されたＥａｇｌｅ培地にて維持された。ＤＣ２．４、ＴＨＰ－１、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ及びＡ５４９細胞は、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｃａｔ Ｎｏ．ＳＨ３０２５５．０１）にて培養された。全細胞は、５％ＣＯ２インキュベーターを備えた加湿環境で３７℃に維持された。
【0054】
５．マウス骨髄に由来するマクロファージ（ＢＭＤＭ）の分離
骨髄に由来するマクロファージ（ＢＭＤＭ）は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢）の骨髄（ＢＭ）から分離した。ＢＭ細胞は、マウスの大腿骨及び脛骨から得られ、無血清ＤＭＥＭ培地にてフラッシュされた。その後、単細胞懸濁液がナイロンセルストレーナー（ｎｙｌｏｎ ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）（７０－μｍナイロンメッシュ）にてろ過され、ＨＢＳＳ 培地で２回洗浄された。細胞が遠心分離され（２００Ｘｇ、５分）、上清液が吸引された。細胞が室温で３分間、赤血球細胞溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｒ７７５７）で溶解され、溶解緩衝液を血清含有ＤＭＥＭ培地にて希釈し、反応が遮断された。細胞が遠心分離され（２００Ｘｇ、５分）、上清液を捨てた。細胞は、完全ＢＭＤＭ培地［１０％ＦＢＳ、５０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．３１５－２０）が補充された１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ］と共に、１２ウェル組織培養プレート（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）で培養され、加湿インキュベーターで３７℃及び５％ＣＯ２に維持された。１日目と３日目には、培地が交換され、５日目には、分化したＢＭＤＭが付着され、実験に供された。
骨髄に由来するマクロファージ（ＢＭＤＭ）は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢）の骨髄（ＢＭ）から分離した。ＢＭ細胞は、マウスの大腿骨及び脛骨から得られ、無血清ＤＭＥＭ培地にてフラッシュされた。その後、単細胞懸濁液がナイロンセルストレーナー（ｎｙｌｏｎ ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）（７０－μｍナイロンメッシュ）にてろ過され、ＨＢＳＳ 培地で２回洗浄された。細胞が遠心分離され（２００Ｘｇ、５分）、上清液が吸引された。細胞が室温で３分間、赤血球細胞溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｒ７７５７）で溶解され、溶解緩衝液を血清含有ＤＭＥＭ培地にて希釈し、反応が遮断された。細胞が遠心分離され（２００Ｘｇ、５分）、上清液を捨てた。細胞は、完全ＢＭＤＭ培地［１０％ＦＢＳ、５０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．３１５－２０）が補充された１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ］と共に、１２ウェル組織培養プレート（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）で培養され、加湿インキュベーターで３７℃及び５％ＣＯ２に維持された。１日目と３日目には、培地が交換され、５日目には、分化したＢＭＤＭが付着され、実験に供された。
【0055】
６．細胞刺激、活性化及び形質感染
全細胞は、ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｌ３０１２）、ヒトＩＦＮ－γ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃａｔ Ｎｏ．２８５－ＩＦ）、マウスＩＦＮ－γ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃａｔ Ｎｏ．４８５－ＭＩ－１００）、ホルボールミリステートアセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ ａｃｅｔａｔｅ）（ＰＭＡ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｐ１５８５）、イオノマイシン（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｉ０６３４）及びポリＩ：Ｃ（Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｐ１５３０）を用いて刺激された。各実験に対する活性化プロトコル及び活性化時間のポイントは、個別に図面において凡例で示されている。ポリＩ：Ｃ細胞内伝達のため、ＲＡＷ２６４．７細胞は、メーカーの指針に従ってリポフェクタミン３０００（ｌｏｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｌ３０００－０１５）を用いてポリＩ：Ｃで形質感染された。
全細胞は、ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｌ３０１２）、ヒトＩＦＮ－γ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃａｔ Ｎｏ．２８５－ＩＦ）、マウスＩＦＮ－γ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃａｔ Ｎｏ．４８５－ＭＩ－１００）、ホルボールミリステートアセテート（ｐｈｏｒｂｏｌ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ ａｃｅｔａｔｅ）（ＰＭＡ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｐ１５８５）、イオノマイシン（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｉ０６３４）及びポリＩ：Ｃ（Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｐ１５３０）を用いて刺激された。各実験に対する活性化プロトコル及び活性化時間のポイントは、個別に図面において凡例で示されている。ポリＩ：Ｃ細胞内伝達のため、ＲＡＷ２６４．７細胞は、メーカーの指針に従ってリポフェクタミン３０００（ｌｏｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｌ３０００－０１５）を用いてポリＩ：Ｃで形質感染された。
【0056】
7. 動物システム
雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）は、Ｎａｒａ－Ｂｉｏｔｅｃｈ社及びＳａｍｔａｋｏ社から購入し、全動物実験は、実験動物の管理及び使用に関する国家指針の機関推奨事項に従って行われた。全プロトコルは、Ｃｅｌｌｉｖｅｒｙの実験室動物資源研究所の機関動物管理及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ；Ａｐｐｒｏｖａｌ Ｎｏ．ＣＶ－２０１９－３２） の承認を受けた。
雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）は、Ｎａｒａ－Ｂｉｏｔｅｃｈ社及びＳａｍｔａｋｏ社から購入し、全動物実験は、実験動物の管理及び使用に関する国家指針の機関推奨事項に従って行われた。全プロトコルは、Ｃｅｌｌｉｖｅｒｙの実験室動物資源研究所の機関動物管理及び使用委員会（ＩＡＣＵＣ；Ａｐｐｒｏｖａｌ Ｎｏ．ＣＶ－２０１９－３２） の承認を受けた。
【0057】
８．ＬＰＳ／Ｄ－ガラクトサミン誘発急性肝障害モデル
ＬＰＳ及びＤ－ガラクトサミン（Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｇ０５００）が急性肝障害モデルに使用された。雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（６週齢）にＰＢＳ（１００μＬ／マウス）又はｉＣＰ－ＮＩ（５０ｍｇ／ｋｇ、１００μＬ／マウス）が静脈内（ＩＶ）注射で投与された。１時間後、ＬＰＳ（２００μＬに５０μｇ／ｋｇ）及びＤ－ガラクトサミン（２００μＬに４００ｍｇ／ｋｇ）が個別にマウスに腹腔内注射された。ＬＰＳ／Ｄ－ガラクトサミン誘発マウスに、各時点でＩＶによりＰＢＳ（１００μＬ／マウス）又はｉＣＰ－ＮＩ（１００μＬ／マウス）が注射された。個別に図面において凡例で示された特定のプロトコル。全動物がモニタリングされ、ＬＰＳ／Ｄ－ｇａｌ誘発後、１６時間で犠牲にした。
ＬＰＳ及びＤ－ガラクトサミン（Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｇ０５００）が急性肝障害モデルに使用された。雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（６週齢）にＰＢＳ（１００μＬ／マウス）又はｉＣＰ－ＮＩ（５０ｍｇ／ｋｇ、１００μＬ／マウス）が静脈内（ＩＶ）注射で投与された。１時間後、ＬＰＳ（２００μＬに５０μｇ／ｋｇ）及びＤ－ガラクトサミン（２００μＬに４００ｍｇ／ｋｇ）が個別にマウスに腹腔内注射された。ＬＰＳ／Ｄ－ガラクトサミン誘発マウスに、各時点でＩＶによりＰＢＳ（１００μＬ／マウス）又はｉＣＰ－ＮＩ（１００μＬ／マウス）が注射された。個別に図面において凡例で示された特定のプロトコル。全動物がモニタリングされ、ＬＰＳ／Ｄ－ｇａｌ誘発後、１６時間で犠牲にした。
【0058】
９．毒素吸入誘発急性肺炎モデル
雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）に、ＰＢＳ（１００μＬ／マウス）又はｉＣＰ－ＮＩ（５０ｍｇ／ｋｇ、１００μＬ／マウス）がＩＶ注射で投与された。ＰＢＳ又はｉＣＰ－ＮＩ注射のマウスにネブライザー（オムロン社、Ｃａｔ Ｎｏ．ＮＥ－Ｕ２２）を用いて吸入によりＬＰＳ又はポリＩ：Ｃが投与された。全マウスがＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｍＬ、７ｍＬ）又はポリＩ：Ｃ（１ｍｇ／ｍＬ、５ｍＬ）を吸入しながら３０分間オーダーメード型アクリルケージに収容された。次に、個別に図面において凡例で示されるように、吸入完了後、尾静脈注射によりｉＣＰ－ＮＩが投与された。
雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）に、ＰＢＳ（１００μＬ／マウス）又はｉＣＰ－ＮＩ（５０ｍｇ／ｋｇ、１００μＬ／マウス）がＩＶ注射で投与された。ＰＢＳ又はｉＣＰ－ＮＩ注射のマウスにネブライザー（オムロン社、Ｃａｔ Ｎｏ．ＮＥ－Ｕ２２）を用いて吸入によりＬＰＳ又はポリＩ：Ｃが投与された。全マウスがＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｍＬ、７ｍＬ）又はポリＩ：Ｃ（１ｍｇ／ｍＬ、５ｍＬ）を吸入しながら３０分間オーダーメード型アクリルケージに収容された。次に、個別に図面において凡例で示されるように、吸入完了後、尾静脈注射によりｉＣＰ－ＮＩが投与された。
【0059】
１０．ＩＴ ＬＰＳ／ポリＩ：Ｃマウスモデル
雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）がイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）で麻酔され、気管内投与によりＬＰＳとポリＩ：Ｃとがいずれも投与された。正常動物には、５０μＬのＰＢＳのみが提供された。ＰＢＳに溶解されたＬＰＳ及び１０ｍｇ／ｋｇのＬＰＳ（５０μＬ／マウス）が投与された。４時間後、ＬＰＳ感作マウス（ＬＰＳ－ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｍｉｃｅ）がイソフルランで麻酔され、５０ｍｇ／ｋｇのポリＩ：Ｃ（１００μＬ／マウス）が気管内注射された。ＬＰＳ／ポリＩ：Ｃ誘発されたマウスが２つの別のグループに無作為に割り当てられた。処理群は、以下の通りである：（１）ＩＴ ＬＰＳ／ポリＩ：Ｃ、ＰＢＳ、３８匹。（２）ＩＴ ＬＰＳ／ポリＩ：Ｃ、ｉＣＰ－ＮＩ、２５匹。マウスは、ポリＩ：Ｃ注入後、４、１６、２８及び５２時間で、ＩＶ注入により投与されたＰＢＳ（１００μＬ／マウス）又はｉＣＰ－ＮＩ（３０ｍｇ／ｋｇ、１００μＬ／マウス）で処理された。
雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）がイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）で麻酔され、気管内投与によりＬＰＳとポリＩ：Ｃとがいずれも投与された。正常動物には、５０μＬのＰＢＳのみが提供された。ＰＢＳに溶解されたＬＰＳ及び１０ｍｇ／ｋｇのＬＰＳ（５０μＬ／マウス）が投与された。４時間後、ＬＰＳ感作マウス（ＬＰＳ－ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ ｍｉｃｅ）がイソフルランで麻酔され、５０ｍｇ／ｋｇのポリＩ：Ｃ（１００μＬ／マウス）が気管内注射された。ＬＰＳ／ポリＩ：Ｃ誘発されたマウスが２つの別のグループに無作為に割り当てられた。処理群は、以下の通りである：（１）ＩＴ ＬＰＳ／ポリＩ：Ｃ、ＰＢＳ、３８匹。（２）ＩＴ ＬＰＳ／ポリＩ：Ｃ、ｉＣＰ－ＮＩ、２５匹。マウスは、ポリＩ：Ｃ注入後、４、１６、２８及び５２時間で、ＩＶ注入により投与されたＰＢＳ（１００μＬ／マウス）又はｉＣＰ－ＮＩ（３０ｍｇ／ｋｇ、１００μＬ／マウス）で処理された。
【0060】
１１．盲腸スラリー誘発腹膜炎モデル（Ｃｅｃａｌ ｓｌｕｒｒｙ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ ｍｏｄｅｌ）
多菌性敗血症（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｅｐｓｉｓ）は、盲腸スラリー（ＣＳ）で誘発された腹膜炎モデル（１－３）を用いて研究を行った。雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）を安楽死して犠牲にし、各マウスの切除のために盲腸全体が分離された。全盲腸内容物が収集され、４ｍＬのＰＢＳと混合して１ｇ／ｍＬ濃度のＣＳが生成された。このＣＳが殺菌した７０μｍストレーナー（ｓｔｒａｉｎｅｒｓ）にてろ過され、ＰＢＳ内の３０％グリセロールの同一体積と混合され、１５％グリセロールの最終のストック溶液（ｆｉｎａｌ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１×ＣＳ）が生成された。その後、最終の溶液が分取され，－８０℃で保管された。マウス敗血症誘導のため、凍結されたＣＳストック（１．５ｍｇ／ｋｇ）が３７℃で解凍され、１ｍＬシリンジを用いてマウスモデルに腹膜注射した。２５ｍｇ／ｋｇのメロペネム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．１３９２４５４）が、ＣＳ注入２時間後、最初投与されてから２４時間ごとに定期的に投与された。ｉＣＰ－ＮＩ（５０ｍｇ／ｋｇ）は、盲腸スラリー投与後、２時間後に最初注射され、２時間の間隔で４回投与された。メロペネムとｉＣＰ－ＮＩは、いずれも静脈注射された。
多菌性敗血症（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｅｐｓｉｓ）は、盲腸スラリー（ＣＳ）で誘発された腹膜炎モデル（１－３）を用いて研究を行った。雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）を安楽死して犠牲にし、各マウスの切除のために盲腸全体が分離された。全盲腸内容物が収集され、４ｍＬのＰＢＳと混合して１ｇ／ｍＬ濃度のＣＳが生成された。このＣＳが殺菌した７０μｍストレーナー（ｓｔｒａｉｎｅｒｓ）にてろ過され、ＰＢＳ内の３０％グリセロールの同一体積と混合され、１５％グリセロールの最終のストック溶液（ｆｉｎａｌ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１×ＣＳ）が生成された。その後、最終の溶液が分取され，－８０℃で保管された。マウス敗血症誘導のため、凍結されたＣＳストック（１．５ｍｇ／ｋｇ）が３７℃で解凍され、１ｍＬシリンジを用いてマウスモデルに腹膜注射した。２５ｍｇ／ｋｇのメロペネム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．１３９２４５４）が、ＣＳ注入２時間後、最初投与されてから２４時間ごとに定期的に投与された。ｉＣＰ－ＮＩ（５０ｍｇ／ｋｇ）は、盲腸スラリー投与後、２時間後に最初注射され、２時間の間隔で４回投与された。メロペネムとｉＣＰ－ＮＩは、いずれも静脈注射された。
【0061】
１２．ＣＬＰ（Ｃｅｃａｌ－ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｎｃｔｕｒｅ）誘発腹膜炎モデル
Ｃｅｃａｌ－ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｎｃｔｕｒｅ（ＣＬＰ）誘発腹膜炎モデルは、ヒトの敗血症と類似した敗血症を起こす傾向があるため、研究目的に最適であるものとみなされ、これは、全身菌血症、器官機能障害及び究極的な全身炎症を誘発する(４－６)。雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）が筋肉内注射により適用されたアルファキサン（ａｌｆａｘａｎ）（Ｊｕｒｏｘ社、Ｃａｔ Ｎｏ．４７０７６０）とロンプン（ｒｏｍｐｕｎ）（Ｂａｙｅｒ社）との混合物（７：３）で麻酔され、仰向けに寝た姿勢で置かれた。剃刀及び無菌を準備した後、腹壁を通して１～２ｃｍ正中切開した。盲腸は、６－０の絹製縫合糸で部分的に結紮された。盲腸壁の穿刺は、１９ゲージの針で行われ、盲腸の内容物がスムーズに漏出された。切開部は、６－０絹製縫合糸のオートクリップ（ａｕｔｏｃｌｉｐ）で縫合された。手術部位の感染を避けるため、縫合部位にポビドンヨードを塗布した。
Ｃｅｃａｌ－ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｎｃｔｕｒｅ（ＣＬＰ）誘発腹膜炎モデルは、ヒトの敗血症と類似した敗血症を起こす傾向があるため、研究目的に最適であるものとみなされ、これは、全身菌血症、器官機能障害及び究極的な全身炎症を誘発する(４－６)。雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）が筋肉内注射により適用されたアルファキサン（ａｌｆａｘａｎ）（Ｊｕｒｏｘ社、Ｃａｔ Ｎｏ．４７０７６０）とロンプン（ｒｏｍｐｕｎ）（Ｂａｙｅｒ社）との混合物（７：３）で麻酔され、仰向けに寝た姿勢で置かれた。剃刀及び無菌を準備した後、腹壁を通して１～２ｃｍ正中切開した。盲腸は、６－０の絹製縫合糸で部分的に結紮された。盲腸壁の穿刺は、１９ゲージの針で行われ、盲腸の内容物がスムーズに漏出された。切開部は、６－０絹製縫合糸のオートクリップ（ａｕｔｏｃｌｉｐ）で縫合された。手術部位の感染を避けるため、縫合部位にポビドンヨードを塗布した。
【0062】
１３．肺炎誘発全身炎症モデル（ポリＩ：Ｃ／ＳＥＢ）
ポリＩ：Ｃ及び連鎖球菌腸毒素Ｂ（ＳＥＢ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ＢＴ２０２）は、肺炎誘発全身炎症モデルに使用された。雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（６週齢）に、ＰＢＳ（１００μＬ／マウス）又はｉＣＰ－ＮＩ（５０ｍｇ／ｋｇ、１００μＬ／マウス）がＩＶ注射で投与された。ＰＢＳ又はｉＣＰ－ＮＩ注射されたマウスは、ネブライザーを用いて３０分間ポリＩ：Ｃ（１ｍｇ／ｍＬ、５ｍＬ）を吸入した。その後、マウスを筋肉内注射によりアルファキサンとロンプンとの混合物（７：３）で麻酔させ、鼻腔経路を介してＳＥＢ（０．２５ｍｇ／ｋｇ、２０μＬ／マウス）が投与された。ポリＩ：Ｃ／ＳＥＢ誘導マウスに、ＰＢＳ（１００μＬ／マウス）又はｉＣＰ－ＮＩ（５０ｍｇ／ｋｇ、１００μＬ／マウス）が、各時点でＩＶにより注射された。個別に図面において凡例に示される特定のプロトコル。全動物は、ポリＩ：Ｃ／ＳＥＢ誘発後、０．５、１、２、４又は６時間で犠牲にした。
ポリＩ：Ｃ及び連鎖球菌腸毒素Ｂ（ＳＥＢ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ＢＴ２０２）は、肺炎誘発全身炎症モデルに使用された。雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（６週齢）に、ＰＢＳ（１００μＬ／マウス）又はｉＣＰ－ＮＩ（５０ｍｇ／ｋｇ、１００μＬ／マウス）がＩＶ注射で投与された。ＰＢＳ又はｉＣＰ－ＮＩ注射されたマウスは、ネブライザーを用いて３０分間ポリＩ：Ｃ（１ｍｇ／ｍＬ、５ｍＬ）を吸入した。その後、マウスを筋肉内注射によりアルファキサンとロンプンとの混合物（７：３）で麻酔させ、鼻腔経路を介してＳＥＢ（０．２５ｍｇ／ｋｇ、２０μＬ／マウス）が投与された。ポリＩ：Ｃ／ＳＥＢ誘導マウスに、ＰＢＳ（１００μＬ／マウス）又はｉＣＰ－ＮＩ（５０ｍｇ／ｋｇ、１００μＬ／マウス）が、各時点でＩＶにより注射された。個別に図面において凡例に示される特定のプロトコル。全動物は、ポリＩ：Ｃ／ＳＥＢ誘発後、０．５、１、２、４又は６時間で犠牲にした。
【0063】
１４．ブレオマイシン誘発肺線維症モデル
ブレオマイシンは、肺線維症の実験モデルを開発するために使用された（７、８）。ブレオマイシンサルフェート（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ ｓｕｌｐｈａｔｅ）（ＢＬＭ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｂ２４３４）が滅菌ＰＢＳに溶解され、実験に供された。雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）がイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）で麻酔され、０日目（Ｄａｙ０）に気管内を通じてＰＢＳ又はブレオマイシンが投与された。 ブレオマイシン（５０μＬ ＰＢＳ中、３ｍｇ／ｋｇ）の単一器官内（ＩＴ）注射が動物（ｎ＝４１）マウスに投与された。正常動物（ｎ＝１０）には５０μＬのＰＢＳのみが投与された。ブレオマイシンが投与されたマウスは、無作為に２つの別のグループに割り当てられた。治療グループは以下の通りである：（１）ＩＴブレオマイシン、ＰＢＳ、２１匹。（２）ＩＴブレオマイシン、ｉＣＰ－ＮＩ、２０匹。マウスは、静脈内（ＩＶ）注射でＰＢＳ（１００μＬ／マウス）又はｉＣＰ－ＮＩ（５０ｍｇ／ｋｇ、１日２回、１００μＬ／マウス）が７日間処理された。マイクロコンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャニングのためにマウスがイソフルランで麻酔され、マウスの肺の画像がＩｎ Ｖｉｖｏ Ｘ線放射線撮影Ｍｉｃｒｏ－ＣＴシステム（Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｘ－ｒａｙ Ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ Ｍｉｃｒｏ－ＣＴ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて撮影された。マウスを犠牲にし、病理組織学的に解析するため、肺組織を収集した。
ブレオマイシンは、肺線維症の実験モデルを開発するために使用された（７、８）。ブレオマイシンサルフェート（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ ｓｕｌｐｈａｔｅ）（ＢＬＭ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｂ２４３４）が滅菌ＰＢＳに溶解され、実験に供された。雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）がイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）で麻酔され、０日目（Ｄａｙ０）に気管内を通じてＰＢＳ又はブレオマイシンが投与された。 ブレオマイシン（５０μＬ ＰＢＳ中、３ｍｇ／ｋｇ）の単一器官内（ＩＴ）注射が動物（ｎ＝４１）マウスに投与された。正常動物（ｎ＝１０）には５０μＬのＰＢＳのみが投与された。ブレオマイシンが投与されたマウスは、無作為に２つの別のグループに割り当てられた。治療グループは以下の通りである：（１）ＩＴブレオマイシン、ＰＢＳ、２１匹。（２）ＩＴブレオマイシン、ｉＣＰ－ＮＩ、２０匹。マウスは、静脈内（ＩＶ）注射でＰＢＳ（１００μＬ／マウス）又はｉＣＰ－ＮＩ（５０ｍｇ／ｋｇ、１日２回、１００μＬ／マウス）が７日間処理された。マイクロコンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャニングのためにマウスがイソフルランで麻酔され、マウスの肺の画像がＩｎ Ｖｉｖｏ Ｘ線放射線撮影Ｍｉｃｒｏ－ＣＴシステム（Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｘ－ｒａｙ Ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ Ｍｉｃｒｏ－ＣＴ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて撮影された。マウスを犠牲にし、病理組織学的に解析するため、肺組織を収集した。
【0064】
１５．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の研究
１５－１．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデル
この研究は、赤毛猿（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）（ＲＭ）と、アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙｓ）（ＡＧＭ）において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するｉＣＰ－ＮＩの治療効能を評価するために設計された。動物は、研究期間中、サザンリサーチ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ’ｓ）（ＳＲ）Ａ／ＢＳＬ－３施設に収容された。ウイルス菌株（２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０）は、ＣＤＣ由来のものであり、ＵＴＭＢ Ｇａｌｖｅｓｔｏｎから提供された。動物が麻酔され、供給チューブが気管に挿入された。チューブの先端が気管の中間地点に到達すると、動物が座った姿勢を保ち、接種チューブにより接種物（１．０又は４．０ｍＬ）が注入された後、十分な量のフラッシュ物質（Ｍｇ２＋／Ｃａ２＋がない滅菌ＤＰＢＳ）が注入され、誘発物質の完全な伝達を確実にさせた。誘発ウイルスは、０日（Ｄａｙ０） に４．０×１０６ ＴＣＩＤ ５０／ｍＬで使用された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバイアル（Ｖｉａｌｓ）が解凍され、誘発の準備前に、１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｅｄ）され、氷の単位用量投与に貯蔵された。動物は、接種のためにケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）とキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）で麻酔された。誘発後、概ね２４時間後に、静脈内（ＩＶ）で、指定された動物に３０分間、ｉＣＰ－ＮＩ２００ｍｇ／ｋｇ／動物の単一ＩＶ注入が投与された。投与物質は、注入ポンプにより投与され、使用された血管は、文書として記録された。用量は、毎分１ｍＬの速度で約３０ｍＬの体積が伝達された。全動物は、臨床徴候、体温、ブドウ糖レベル、Ｏ２飽和度、心拍数（ＢＰＭ）、呼吸数、及び体重についてモニタリングされた。５日及び８日目に、病理組織学のために剖検が行われ、組織が収集された。
１５－１．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデル
この研究は、赤毛猿（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）（ＲＭ）と、アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙｓ）（ＡＧＭ）において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するｉＣＰ－ＮＩの治療効能を評価するために設計された。動物は、研究期間中、サザンリサーチ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ’ｓ）（ＳＲ）Ａ／ＢＳＬ－３施設に収容された。ウイルス菌株（２０１９－ｎＣｏＶ／ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０）は、ＣＤＣ由来のものであり、ＵＴＭＢ Ｇａｌｖｅｓｔｏｎから提供された。動物が麻酔され、供給チューブが気管に挿入された。チューブの先端が気管の中間地点に到達すると、動物が座った姿勢を保ち、接種チューブにより接種物（１．０又は４．０ｍＬ）が注入された後、十分な量のフラッシュ物質（Ｍｇ２＋／Ｃａ２＋がない滅菌ＤＰＢＳ）が注入され、誘発物質の完全な伝達を確実にさせた。誘発ウイルスは、０日（Ｄａｙ０） に４．０×１０６ ＴＣＩＤ ５０／ｍＬで使用された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバイアル（Ｖｉａｌｓ）が解凍され、誘発の準備前に、１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｅｄ）され、氷の単位用量投与に貯蔵された。動物は、接種のためにケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）とキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）で麻酔された。誘発後、概ね２４時間後に、静脈内（ＩＶ）で、指定された動物に３０分間、ｉＣＰ－ＮＩ２００ｍｇ／ｋｇ／動物の単一ＩＶ注入が投与された。投与物質は、注入ポンプにより投与され、使用された血管は、文書として記録された。用量は、毎分１ｍＬの速度で約３０ｍＬの体積が伝達された。全動物は、臨床徴候、体温、ブドウ糖レベル、Ｏ２飽和度、心拍数（ＢＰＭ）、呼吸数、及び体重についてモニタリングされた。５日及び８日目に、病理組織学のために剖検が行われ、組織が収集された。
【0065】
１５－２．血液収集、処理及びサイトカイン解析
全動物について、サイトカイン及びブドウ糖のレベル評価のために血液が収集された。麻酔された動物から概ね６ｍＬが収集され、２ｍＬはＥＤＴＡチューブで血漿（サイトカイン解析）を処理するために使用され、４ｍＬは－３、２、４、５、６及び８日目（Ｄａｙｓ －３、２、４、５、６、８）にナトリウムヘパリンチューブ（ｓｏｄｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎ ｔｕｂｅｓ）においてＰＢＭＣに使用された。指や足の指から収集された血液から、ブドウ糖レベルがモニタリングされた。アクセス可能な全静脈から血液サンプルが採取された。安楽死前に瀕死状態動物の血液が収集された。ＥＤＴＡ及びナトリウムヘパリン抗凝固剤が含まれたチューブに収集された血液は、収集直後、柔らかにインバーティングされた。Ｌｕｍｉｎｅｘを用いて、サイトカインレベル（ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＭＣＰ１、ＩＮＦ－β、ＩＮＦ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、4及びＩＬ－１７ａ）が測定された。
全動物について、サイトカイン及びブドウ糖のレベル評価のために血液が収集された。麻酔された動物から概ね６ｍＬが収集され、２ｍＬはＥＤＴＡチューブで血漿（サイトカイン解析）を処理するために使用され、４ｍＬは－３、２、４、５、６及び８日目（Ｄａｙｓ －３、２、４、５、６、８）にナトリウムヘパリンチューブ（ｓｏｄｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎ ｔｕｂｅｓ）においてＰＢＭＣに使用された。指や足の指から収集された血液から、ブドウ糖レベルがモニタリングされた。アクセス可能な全静脈から血液サンプルが採取された。安楽死前に瀕死状態動物の血液が収集された。ＥＤＴＡ及びナトリウムヘパリン抗凝固剤が含まれたチューブに収集された血液は、収集直後、柔らかにインバーティングされた。Ｌｕｍｉｎｅｘを用いて、サイトカインレベル（ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＭＣＰ１、ＩＮＦ－β、ＩＮＦ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、4及びＩＬ－１７ａ）が測定された。
【0066】
１５－３．剖検及び病理組織学
全動物は、肺、肝臓，腎臓及び脾臓の限られた事後検査を受けた。組織サンプルは、１０％中性緩衝ホルマリン（ｎｅｕｔｒａｌ ｂｕｆｆｅｒｄ ｆｏｒｍａｌｉｎ）に固定された。肺、肝臓、腎臓及び脾臓組織が全剖検動物から収集され、体重を測定し、病理組織学のために１０％中性緩衝ホルマリンに固定された。収集された組織がスライドに処理され、ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）－エオシン（ｅｏｓｉｎ）（全組織に該当）及びトリクローム（ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）（肺のみに該当）で染色された。
全動物は、肺、肝臓，腎臓及び脾臓の限られた事後検査を受けた。組織サンプルは、１０％中性緩衝ホルマリン（ｎｅｕｔｒａｌ ｂｕｆｆｅｒｄ ｆｏｒｍａｌｉｎ）に固定された。肺、肝臓、腎臓及び脾臓組織が全剖検動物から収集され、体重を測定し、病理組織学のために１０％中性緩衝ホルマリンに固定された。収集された組織がスライドに処理され、ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）－エオシン（ｅｏｓｉｎ）（全組織に該当）及びトリクローム（ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）（肺のみに該当）で染色された。
【0067】
１６．細胞測定ビーズアレイ（ＣＢＡ）及び酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）
１６－１．マウス血漿及び組織におけるサイトカインの測定
ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１０及びＩＦＮ－γの濃度は、血漿サンプル、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）又は肺組織においてメーカーのプロトコルに従って細胞測定ビーズアレイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃａｔ Ｎｏ．５５２３６４）を用いて測定された。血漿は、ＬＰＳ／Ｄ－ガラクトサミン誘発急性肝障害マウス（ＬＰＳ／Ｄ－Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｕｔｅ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ ｍｉｃｅ）、ＬＰＳ又はポリＩ：Ｃ吸入誘発肺炎マウス（ＬＰＳ ｏｒ Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｔｉｓ ｍｉｃｅ）から収集された。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）は、ＬＰＳ又はポリＩ：Ｃ吸入誘発肺炎マウスから収集された。肺組織均質液は、ＬＰＳ／ポリＩ：Ｃ誘発肺炎マウスから収集された。ＬＳＲIIフローサイトメーター（ＬＳＲII ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でデータが収集され、ＦＣＡＰアレイソフトウェア（ＦＣＡＰ Ａｒｒａｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で分析された。
１６－１．マウス血漿及び組織におけるサイトカインの測定
ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１０及びＩＦＮ－γの濃度は、血漿サンプル、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）又は肺組織においてメーカーのプロトコルに従って細胞測定ビーズアレイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｃａｔ Ｎｏ．５５２３６４）を用いて測定された。血漿は、ＬＰＳ／Ｄ－ガラクトサミン誘発急性肝障害マウス（ＬＰＳ／Ｄ－Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｕｔｅ ｌｉｖｅｒ ｉｎｊｕｒｙ ｍｉｃｅ）、ＬＰＳ又はポリＩ：Ｃ吸入誘発肺炎マウス（ＬＰＳ ｏｒ Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｔｉｓ ｍｉｃｅ）から収集された。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）は、ＬＰＳ又はポリＩ：Ｃ吸入誘発肺炎マウスから収集された。肺組織均質液は、ＬＰＳ／ポリＩ：Ｃ誘発肺炎マウスから収集された。ＬＳＲIIフローサイトメーター（ＬＳＲII ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）でデータが収集され、ＦＣＡＰアレイソフトウェア（ＦＣＡＰ Ａｒｒａｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で分析された。
【0068】
１６－２．酵素結合免疫吸着検査
細胞培養液の上清液に含まれたサイトカインがマウスＴＮＦ－α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ Ｎｏ．８８－７３２４－８８）、マウスＩＬ－６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ Ｎｏ．８８－７０６４－８８）及びマウスＩＬ－１β（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ Ｎｏ．８８－７０１３－８８）用に市販されるＥＬＩＳＡキットを用いて二重にＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１βの含有量の分析が行われた。分析は、メーカーのプロトコルに従って行われた。
細胞培養液の上清液に含まれたサイトカインがマウスＴＮＦ－α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ Ｎｏ．８８－７３２４－８８）、マウスＩＬ－６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ Ｎｏ．８８－７０６４－８８）及びマウスＩＬ－１β（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ Ｎｏ．８８－７０１３－８８）用に市販されるＥＬＩＳＡキットを用いて二重にＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１βの含有量の分析が行われた。分析は、メーカーのプロトコルに従って行われた。
【0069】
１７． 細胞質／核抽出物の準備
免疫細胞においてＳＲＴＦ（ストレス応答性転写因子）の核内移動阻害を分析するため、メーカーの指針に従ってＮＥ－ＰＥＲ核細胞質抽出試薬キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ Ｎｏ．７８８３５）を用いて細胞質及び核抽出を準備した。簡単に言えば、刺激された細胞が氷冷ＰＢＳ（ｉｃｅ－ｃｏｌｄ ＰＢＳ）で２回洗浄され、５００Ｘｇで３分間遠心分離された。上清液が慎重に除去され、細胞ペレット（ｃｅｌｌ ｐｅｌｌｅｔ）がボルテックによりプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤が補充された細胞質抽出試薬Ｉ（ＣＥＲＩ）で懸濁された。懸濁液が氷上で１０分間培養された後、細胞質抽出試薬II（ＣＥＲII）が添加され、５秒間ボルテックスされ、氷上で１分間培養され、１６，０００Ｘｇで５分間遠心分離された。上清液（細胞質抽出物）が予め冷却されたチューブに移動された。核を含む不溶性ペレット画分（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｐｅｌｌｅｔ ｆｒａｃｔｉｏｎ）が１０分ごとに１５秒間ボルテックスされ、核抽出試薬（ＮＥＲ）で再懸濁され、氷上で４０分間培養された後、１６，０００Ｘｇで１０分間遠心分離された。核抽出物を構成する上清液が後続の実験に供された。
免疫細胞においてＳＲＴＦ（ストレス応答性転写因子）の核内移動阻害を分析するため、メーカーの指針に従ってＮＥ－ＰＥＲ核細胞質抽出試薬キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ Ｎｏ．７８８３５）を用いて細胞質及び核抽出を準備した。簡単に言えば、刺激された細胞が氷冷ＰＢＳ（ｉｃｅ－ｃｏｌｄ ＰＢＳ）で２回洗浄され、５００Ｘｇで３分間遠心分離された。上清液が慎重に除去され、細胞ペレット（ｃｅｌｌ ｐｅｌｌｅｔ）がボルテックによりプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤が補充された細胞質抽出試薬Ｉ（ＣＥＲＩ）で懸濁された。懸濁液が氷上で１０分間培養された後、細胞質抽出試薬II（ＣＥＲII）が添加され、５秒間ボルテックスされ、氷上で１分間培養され、１６，０００Ｘｇで５分間遠心分離された。上清液（細胞質抽出物）が予め冷却されたチューブに移動された。核を含む不溶性ペレット画分（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｐｅｌｌｅｔ ｆｒａｃｔｉｏｎ）が１０分ごとに１５秒間ボルテックスされ、核抽出試薬（ＮＥＲ）で再懸濁され、氷上で４０分間培養された後、１６，０００Ｘｇで１０分間遠心分離された。核抽出物を構成する上清液が後続の実験に供された。
【0070】
１８．ウエスタンブロット解析
全ての細胞溶解物及び細胞質／核蛋白質が実験に供された。全細胞ペレットがプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃５８７２Ｓ）が補充されたＲＩＰＡ緩衝液（ＢＩＯＳＥＳＡＮＧ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ＲＣ２００２－０５０－００）で溶解され、溶解物が収集された。蛋白質サンプルが、Ｂｒａｄｆｏｒｄ解析（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いて定量化された。３０μｇの蛋白質を含有するサンプルをＳＤＳ－サンプル緩衝液と混合し、５分間沸かした。蛋白質が１０％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離され、ポリビニリデンフルオライド（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）（ＰＶＤＦ；Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ＩＰＶＨ０００１０）メンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移動された。ブロッティングされたメンブレンは、室温で１時間、０．１％ツイーン２０を含有するトリス緩衝食塩水（Ｂｉｏｐｕｒｅ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ＴＷＮ５０８－５００）中の５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ；ＢＩＯＳＥＳＡＮＧ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ１０２５）で遮断された後、４℃で１次抗体とともに一晩インキュベーションされ、次に、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合された２次抗体とともに室温で１時間インキュベーションされた。この蛋白質バンド（ｐｒｏｔｅｉｎ ｂａｎｄｓ）は、化学発光試薬（Ｓｕｐｅｒ ＳｉｇｎａｌＴＭ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ Ｎｏ．３４０７５）を用いて、ＣｈｅｍｉＤｏｃイメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）により視覚化され、ＩｍａｇｅＪソフトウエアで定量化された。使用された抗体は、次の通りである：ａｎｔｉ－ｐｈｏｐｈｏ－ＮＦ－κＢ ｐ６５ Ｓｅｒ５３６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃３０３３），ａｎｔｉ－ＮＦ－κＢ ｐ６５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－８００８），ａｎｔｉ－ＮＦＡＴｃ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－７２９４），ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－ｃ－Ｊｕｎ Ｓｅｒ６３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９１９５２），ａｎｔｉ－ｃ－Ｊｕｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－７４７５４３），ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ３ Ｔｙｒ７０５（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９１４５），ａｎｔｉ－ＳＴＡＴ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９１３９），ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ１ Ｔｙｒ７０１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９１６７），ａｎｔｉ－ＳＴＡＴ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－４６４），ａｎｔｉ－ＩＬ－１β（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＡＦ－４０１－ＮＡ），ａｎｔｉ－ｓｎａｉｌ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃３８７９），ａｎｔｉ－ｓｌｕｇ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９５８５），ａｎｔｉ－ｔｗｉｓｔ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－８１４１７），β－Ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ３８５４），ａｎｔｉ－ＬａｍｉｎＢ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－３７４０１５），ａｎｔｉ－ＧＡＰＤＨ（Ｂｉｏｗｏｒｌｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＭＢ００１Ｈ），ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃７０７４），及びｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｚｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃７０７６）．
全ての細胞溶解物及び細胞質／核蛋白質が実験に供された。全細胞ペレットがプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃５８７２Ｓ）が補充されたＲＩＰＡ緩衝液（ＢＩＯＳＥＳＡＮＧ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ＲＣ２００２－０５０－００）で溶解され、溶解物が収集された。蛋白質サンプルが、Ｂｒａｄｆｏｒｄ解析（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）を用いて定量化された。３０μｇの蛋白質を含有するサンプルをＳＤＳ－サンプル緩衝液と混合し、５分間沸かした。蛋白質が１０％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離され、ポリビニリデンフルオライド（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）（ＰＶＤＦ；Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ＩＰＶＨ０００１０）メンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移動された。ブロッティングされたメンブレンは、室温で１時間、０．１％ツイーン２０を含有するトリス緩衝食塩水（Ｂｉｏｐｕｒｅ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ＴＷＮ５０８－５００）中の５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ；ＢＩＯＳＥＳＡＮＧ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ１０２５）で遮断された後、４℃で１次抗体とともに一晩インキュベーションされ、次に、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合された２次抗体とともに室温で１時間インキュベーションされた。この蛋白質バンド（ｐｒｏｔｅｉｎ ｂａｎｄｓ）は、化学発光試薬（Ｓｕｐｅｒ ＳｉｇｎａｌＴＭ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ Ｎｏ．３４０７５）を用いて、ＣｈｅｍｉＤｏｃイメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）により視覚化され、ＩｍａｇｅＪソフトウエアで定量化された。使用された抗体は、次の通りである：ａｎｔｉ－ｐｈｏｐｈｏ－ＮＦ－κＢ ｐ６５ Ｓｅｒ５３６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃３０３３），ａｎｔｉ－ＮＦ－κＢ ｐ６５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－８００８），ａｎｔｉ－ＮＦＡＴｃ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－７２９４），ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－ｃ－Ｊｕｎ Ｓｅｒ６３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９１９５２），ａｎｔｉ－ｃ－Ｊｕｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－７４７５４３），ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ３ Ｔｙｒ７０５（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９１４５），ａｎｔｉ－ＳＴＡＴ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９１３９），ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ１ Ｔｙｒ７０１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９１６７），ａｎｔｉ－ＳＴＡＴ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－４６４），ａｎｔｉ－ＩＬ－１β（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＡＦ－４０１－ＮＡ），ａｎｔｉ－ｓｎａｉｌ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃３８７９），ａｎｔｉ－ｓｌｕｇ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９５８５），ａｎｔｉ－ｔｗｉｓｔ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－８１４１７），β－Ａｃｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ３８５４），ａｎｔｉ－ＬａｍｉｎＢ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ｓｃ－３７４０１５），ａｎｔｉ－ＧＡＰＤＨ（Ｂｉｏｗｏｒｌｄ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＭＢ００１Ｈ），ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃７０７４），及びｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｚｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃７０７６）．
【0071】
１９．ＲＮＡ抽出及び定量的ＲＴ－ＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ Ｎｏ．１５５９６０１８）を用いて、細胞又は組織からトータルＲＮＡが分離され、メーカーの指針に従ってｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社、Ｃａｔ Ｎｏ．１７０８８９７）を用いて、総１μｇのＲＮＡからｃＤＮＡが合成された。ｑＰＣＲは、次のステップに従ってＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）でｉＱ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社、カタログ番号１７０８８８０）で行われた：（１）ポリメラーゼ及びＤＮＡの変性、９５℃で５分、（２）変性、９５℃で１０秒間、（３）３５サイクルの間、３０秒間、６０℃のアーニリング及び延長、（４）溶融曲線分析、６０－９５℃の増分、５秒／ステップ。ｍＲＮＡの相対的な量（２ΔΔＣｔ）は、β－アクチン遺伝子のレベルに正規化して得られた。
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ Ｎｏ．１５５９６０１８）を用いて、細胞又は組織からトータルＲＮＡが分離され、メーカーの指針に従ってｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社、Ｃａｔ Ｎｏ．１７０８８９７）を用いて、総１μｇのＲＮＡからｃＤＮＡが合成された。ｑＰＣＲは、次のステップに従ってＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）でｉＱ ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社、カタログ番号１７０８８８０）で行われた：（１）ポリメラーゼ及びＤＮＡの変性、９５℃で５分、（２）変性、９５℃で１０秒間、（３）３５サイクルの間、３０秒間、６０℃のアーニリング及び延長、（４）溶融曲線分析、６０－９５℃の増分、５秒／ステップ。ｍＲＮＡの相対的な量（２ΔΔＣｔ）は、β－アクチン遺伝子のレベルに正規化して得られた。
【0072】
２０．細胞透過性測定のためのフローサイトメトリー
ＲＡＷ２６４．７細胞（５×１０５細胞／ウェル）が１２ウェルにシーディングされ、２４時間インキュベーションされた。細胞がＰＢＳで２回洗浄され、ＦＢＳ－ｆｒｅｅ培地でＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｉＣＰ－ＮＩ、ＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ－ｃＮＬＳ又はＦＩＴＣペプチド対照群で３７℃又は４℃で１時間処理された。次に、細胞上層液が除去され、細胞ペレットが収集され、ｉｃｅ－ｃｏｌｄ ＰＢＳで３回洗浄された。次に、７０％ＥｔＯＨを用いて、４℃で３０分間細胞が固定され、ｉｃｅ－ｃｏｌｄ ＰＢＳで３回洗浄された。細胞の内在化したペプチドが、ＬＳＲIIフローサイトメトリーシステム（ＬＳＲII ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）（ＢＤ）を用いて解析された。ペプチドの細胞吸収を評価するため、ＲＡＷ２６４．７細胞が細胞内メカニズムと関連した様々なタイプの製剤で処理された。ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ２３８３）－ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ（Ａｎｔｉｍｙｃｉｎ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ８６７４），ｐｒｏｔｅｎｉａｓｅ Ｋ（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＣＭＢ－０２２），ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔａｘｏｌ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｔ７４０２），ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｂｌｏｃｋｅｒ（ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｃ８１３８），ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｂｌｏｃｋｅｒ（ｍｅｔｈｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｃ４５５５）、又はｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ ｂｌｏｃｋｅｒ（ａｍｉｌｏｒｉｄｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ７４１０）が解析に供された。手順は次の通りである：ＲＡＷ２６４．７細胞は、（１）２時間、１ｍＭ ＡＴＰの存在又は不在下で、１０μＭのアンチマイシン、（２）１０分間、１０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、（３）タキソール２０μＭ、（４）３０分間、３μＭのクロルプロマジン、（５）３０分間、５ｍＭのメチル－β－シクロデキストリン、（６）無血清培地で２時間、１ｍＭ ＡＴＰの存在又は不在下で、１０μＭアンチマイシンで前処理された。その後、細胞がＦＩＴＣ結合ｉＣＰ－ＮＩ、ＦＩＴＣ結合ｃＮＬＳ又はＦＩＴＣペプチド対照群で後処理された。細胞固定及び解析は、上述の通りである。
ＲＡＷ２６４．７細胞（５×１０５細胞／ウェル）が１２ウェルにシーディングされ、２４時間インキュベーションされた。細胞がＰＢＳで２回洗浄され、ＦＢＳ－ｆｒｅｅ培地でＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｉＣＰ－ＮＩ、ＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ－ｃＮＬＳ又はＦＩＴＣペプチド対照群で３７℃又は４℃で１時間処理された。次に、細胞上層液が除去され、細胞ペレットが収集され、ｉｃｅ－ｃｏｌｄ ＰＢＳで３回洗浄された。次に、７０％ＥｔＯＨを用いて、４℃で３０分間細胞が固定され、ｉｃｅ－ｃｏｌｄ ＰＢＳで３回洗浄された。細胞の内在化したペプチドが、ＬＳＲIIフローサイトメトリーシステム（ＬＳＲII ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）（ＢＤ）を用いて解析された。ペプチドの細胞吸収を評価するため、ＲＡＷ２６４．７細胞が細胞内メカニズムと関連した様々なタイプの製剤で処理された。ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ２３８３）－ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ（Ａｎｔｉｍｙｃｉｎ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ８６７４），ｐｒｏｔｅｎｉａｓｅ Ｋ（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＣＭＢ－０２２），ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔａｘｏｌ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｔ７４０２），ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｂｌｏｃｋｅｒ（ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｃ８１３８），ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｂｌｏｃｋｅｒ（ｍｅｔｈｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｃ４５５５）、又はｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ ｂｌｏｃｋｅｒ（ａｍｉｌｏｒｉｄｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ７４１０）が解析に供された。手順は次の通りである：ＲＡＷ２６４．７細胞は、（１）２時間、１ｍＭ ＡＴＰの存在又は不在下で、１０μＭのアンチマイシン、（２）１０分間、１０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ、（３）タキソール２０μＭ、（４）３０分間、３μＭのクロルプロマジン、（５）３０分間、５ｍＭのメチル－β－シクロデキストリン、（６）無血清培地で２時間、１ｍＭ ＡＴＰの存在又は不在下で、１０μＭアンチマイシンで前処理された。その後、細胞がＦＩＴＣ結合ｉＣＰ－ＮＩ、ＦＩＴＣ結合ｃＮＬＳ又はＦＩＴＣペプチド対照群で後処理された。細胞固定及び解析は、上述の通りである。
【0073】
２１．免疫細胞化学（ＩＣＣ）
細胞が室温で１５分間、４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）に固定され、－２０℃でメタノールを用いて透過化された。次に、細胞がブロッキング溶液（ＰＢＳ中、３％ＢＳＡ及び０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）でインキュベーションされた後、１次抗体と共に室温で６０分間インキュベーションされた。１次抗体が４℃で一晩添加され、ＰＢＳで細胞が洗浄された。また、２次抗体が室温で１時間添加された。次に、細胞がＰＢＳで洗浄され、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｅ１３２１３９）を備えたＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－ＧＴＭでスライドに装着された。得られた製剤が、デジタルイメージングシステム（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８－ＳＴＥＤ）付共焦点顕微鏡を用いて観察及び写真撮影された。画像は、Ｌｅｉｃａ ＬＡＳ Ｘソフトウェアで処理及び記録された。使用された抗体は次の通りである：ａｎｔｉ－ｐｈｏｐｈｏ－ＮＦ－κＢ ｐ６５ Ｓｅｒ５３６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃３０３３），ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－ｃ－Ｊｕｎ Ｓｅｒ６３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９１９５２），ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ１ Ｔｙｒ７０１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９１６７），ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ３ Ｔｙｒ７０５（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９１４５），ＮＦＡＴ（Ａｂｃａｍ，ａｂ２７２２），ｖｉｍｅｎｔｉｎ（Ａｂｃａｍ，ａｂ８９７８），ａｎｔｉ－Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（Ａｂｃａｍ，ａｂ４０７７２），Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ１１０３４），Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ１１００１），Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ２１２４５），Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ２１２３５），ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ３ ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社，Ｃａｔ Ｎｏ．ＦＡＢ４８４１Ｐ），ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ４５Ｒ ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｅＢＩｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ Ｎｏ．１２－０４５２－８２），ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ１１ｂ－ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ Ｎｏ．１２－４８０１－８２）。
細胞が室温で１５分間、４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）に固定され、－２０℃でメタノールを用いて透過化された。次に、細胞がブロッキング溶液（ＰＢＳ中、３％ＢＳＡ及び０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）でインキュベーションされた後、１次抗体と共に室温で６０分間インキュベーションされた。１次抗体が４℃で一晩添加され、ＰＢＳで細胞が洗浄された。また、２次抗体が室温で１時間添加された。次に、細胞がＰＢＳで洗浄され、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｅ１３２１３９）を備えたＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－ＧＴＭでスライドに装着された。得られた製剤が、デジタルイメージングシステム（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８－ＳＴＥＤ）付共焦点顕微鏡を用いて観察及び写真撮影された。画像は、Ｌｅｉｃａ ＬＡＳ Ｘソフトウェアで処理及び記録された。使用された抗体は次の通りである：ａｎｔｉ－ｐｈｏｐｈｏ－ＮＦ－κＢ ｐ６５ Ｓｅｒ５３６（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃３０３３），ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－ｃ－Ｊｕｎ Ｓｅｒ６３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９１９５２），ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ１ Ｔｙｒ７０１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９１６７），ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ３ Ｔｙｒ７０５（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，＃９１４５），ＮＦＡＴ（Ａｂｃａｍ，ａｂ２７２２），ｖｉｍｅｎｔｉｎ（Ａｂｃａｍ，ａｂ８９７８），ａｎｔｉ－Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ（Ａｂｃａｍ，ａｂ４０７７２），Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ１１０３４），Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ１１００１），Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ２１２４５），Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ２１２３５），ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ３ ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社，Ｃａｔ Ｎｏ．ＦＡＢ４８４１Ｐ），ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ４５Ｒ ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｅＢＩｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ Ｎｏ．１２－０４５２－８２），ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ１１ｂ－ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ Ｎｏ．１２－４８０１－８２）。
【0074】
２２．免疫組織化学 （ＩＨＣ）
全組織が１０％緩衝ホルマリン（ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｆｏｒｍａｌｕｉｎ）で２４時間固定され、パラフィン（ｐａｒａｆｆｉｎ）包埋された。パラフィンが包埋された組織が厚さ４μｍで切片にされた。脱パラフィン化のため、サンプルが６５℃で３０分間培養された後、新鮮なキシレン（ｘｙｌｅｎｅ）で、それぞれ２０分間、３回培養された。サンプルの再水化（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）は、それぞれ１００％、９０％及び７０％ＥｔＯＨで５分間行われた。その後、サンプルが沸かしたｐＨ６のクエン酸ナトリウム溶液で３０分間インキュベーションされ、抗原を回収し、２０分間インキュベーションを行う間、ＮＨ４Ｃｌ溶液に移動された。ＰＢＳで洗浄された後、サンプルがブロッキング溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（３％ＢＳＡ、ＰＢＳ中、０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）でインキュベーションされ、室温で１時間インキュベーションされた。好中球を識別するＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｌｙ６Ｇマウス単クローン１次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ Ｎｏ．１２－９６６８－８２）がブロッキング溶液で希釈され、４℃でサンプルと共に一晩培養された。ＰＢＳで濯いだ後、ＤＡＰＩが含まれたマウンティング溶液（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）でサンプルがマウンティングされた。全サンプルは、共焦点レーザースキャニング顕微鏡システム（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８）を用いて蛍光顕微鏡で視覚化し、画像は、Ｌｅｉｃａ ＬＡＳ Ｘソフトウェアで処理された。
全組織が１０％緩衝ホルマリン（ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｆｏｒｍａｌｕｉｎ）で２４時間固定され、パラフィン（ｐａｒａｆｆｉｎ）包埋された。パラフィンが包埋された組織が厚さ４μｍで切片にされた。脱パラフィン化のため、サンプルが６５℃で３０分間培養された後、新鮮なキシレン（ｘｙｌｅｎｅ）で、それぞれ２０分間、３回培養された。サンプルの再水化（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）は、それぞれ１００％、９０％及び７０％ＥｔＯＨで５分間行われた。その後、サンプルが沸かしたｐＨ６のクエン酸ナトリウム溶液で３０分間インキュベーションされ、抗原を回収し、２０分間インキュベーションを行う間、ＮＨ４Ｃｌ溶液に移動された。ＰＢＳで洗浄された後、サンプルがブロッキング溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（３％ＢＳＡ、ＰＢＳ中、０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）でインキュベーションされ、室温で１時間インキュベーションされた。好中球を識別するＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｌｙ６Ｇマウス単クローン１次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃａｔ Ｎｏ．１２－９６６８－８２）がブロッキング溶液で希釈され、４℃でサンプルと共に一晩培養された。ＰＢＳで濯いだ後、ＤＡＰＩが含まれたマウンティング溶液（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）でサンプルがマウンティングされた。全サンプルは、共焦点レーザースキャニング顕微鏡システム（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８）を用いて蛍光顕微鏡で視覚化し、画像は、Ｌｅｉｃａ ＬＡＳ Ｘソフトウェアで処理された。
【0075】
２３．病理組織学的解析のための組織染色
全組織は、１０％緩衝ホルマリンで４８時間固定され、パラフィン包埋された。４－μｍセクションが、炎症、コラーゲン沈着及び繊維をそれぞれ評価するため、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ；Ａｂｃａｍ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ａｂ２４５８８０）、Ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ（Ａｂｃａｍ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ａｂ１５０６８６）、シリウスレッド （Ａｂｃａｍ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ａｂ１５０６８１）で染色された。また、ＡｐｏｐＴａｇ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ染色キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃Ｓ７１０１）を用いてＴＵＮＥＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｌａｂｅｌｉｎｇ）染色が行われた。デジタルイメージングシステム（ニコン社、ＤＳ－Ｒｉ２）付顕微鏡を用いて全サンプルを観察し、写真撮影した。全実験は、メーカーのプロトコルに従って行われた。
全組織は、１０％緩衝ホルマリンで４８時間固定され、パラフィン包埋された。４－μｍセクションが、炎症、コラーゲン沈着及び繊維をそれぞれ評価するため、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ；Ａｂｃａｍ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ａｂ２４５８８０）、Ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ（Ａｂｃａｍ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ａｂ１５０６８６）、シリウスレッド （Ａｂｃａｍ社、Ｃａｔ Ｎｏ．ａｂ１５０６８１）で染色された。また、ＡｐｏｐＴａｇ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ染色キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃Ｓ７１０１）を用いてＴＵＮＥＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｄＵＴＰ ｎｉｃｋ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｌａｂｅｌｉｎｇ）染色が行われた。デジタルイメージングシステム（ニコン社、ＤＳ－Ｒｉ２）付顕微鏡を用いて全サンプルを観察し、写真撮影した。全実験は、メーカーのプロトコルに従って行われた。
【0076】
２４．統計分析
グラフパッド・プリズム・ソフトウエア５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ５）、及びマイクロソフト・エクセル・ソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて統計分析を行った。全結果は、２回の生物学的複製と少なくとも３回の独立実験として行われた。全実験データは、平均±標準偏差（ＳＤ）で示され、グループ間の差を比較するため、スチューデントｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ‘ｓ ｔ ｔｅｓｔ）が使用された。 ＊＜０．０５、＜０．０１又は＜０．００１のＰ値は、統計的に有意なものと見なされた。
グラフパッド・プリズム・ソフトウエア５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ５）、及びマイクロソフト・エクセル・ソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて統計分析を行った。全結果は、２回の生物学的複製と少なくとも３回の独立実験として行われた。全実験データは、平均±標準偏差（ＳＤ）で示され、グループ間の差を比較するため、スチューデントｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ‘ｓ ｔ ｔｅｓｔ）が使用された。 ＊＜０．０５、＜０．０１又は＜０．００１のＰ値は、統計的に有意なものと見なされた。
【0077】
＜実験例＞
１．改善された細胞透過性核輸送阻害剤ｉＣＰ－ＮＩの開発
我々は、細胞内蛋白質伝達に最適化された配列、指定された巨大分子伝達ドメイン又はａＭＴＤを用いて、改善された細胞透過性核輸送阻害剤（ｉＣＰ－ＮＩ）を開発した。ａＭＴＤは、６つの重要な特徴（アミノ酸の長さ（１２個アミノ酸）、曲げ可能性、剛性・柔軟性、構造的特徴、疎水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）、及びアミノ酸組成を統合し（国際特許（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｐａｔｅｎｔ）ＷＯ２０１６０２８０３６Ａ１）、向上した緑色蛍光蛋白質（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、パーキン（Ｐａｒｋｉｎ）及びサイトカインシグナル伝達３の阻害因子（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ３）（ＳＯＣＳ３）のような大きな蛋白質貨物（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｒｇｏ）を伝達するため、前の世代における最適化されていない配列を大きく凌駕した。
１．改善された細胞透過性核輸送阻害剤ｉＣＰ－ＮＩの開発
我々は、細胞内蛋白質伝達に最適化された配列、指定された巨大分子伝達ドメイン又はａＭＴＤを用いて、改善された細胞透過性核輸送阻害剤（ｉＣＰ－ＮＩ）を開発した。ａＭＴＤは、６つの重要な特徴（アミノ酸の長さ（１２個アミノ酸）、曲げ可能性、剛性・柔軟性、構造的特徴、疎水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）、及びアミノ酸組成を統合し（国際特許（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｐａｔｅｎｔ）ＷＯ２０１６０２８０３６Ａ１）、向上した緑色蛍光蛋白質（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、パーキン（Ｐａｒｋｉｎ）及びサイトカインシグナル伝達３の阻害因子（Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ３）（ＳＯＣＳ３）のような大きな蛋白質貨物（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃａｒｇｏ）を伝達するため、前の世代における最適化されていない配列を大きく凌駕した。
【0078】
本研究に使用されたペプチドは、表１に示される。線状ＮＬＳ（ｌＮＬＳ）は、２つのシスチンが側面にあるＮＦ－κＢ１（ｐ５０）の線状核局在化配列から構成される。円状ＮＬＳ（ｃＮＬＳ）は、二硫化結合により円形化された同一の配列を有する。６つのペプチドは、円形化されたＮＬＳと細胞内蛋白質伝達を促進する他の配列を含む：最適化されていないＦＧＦ－４配列（ｃＳＮ５０．１）及び５つのａＭＴＤ（ａＭＴＤ３８５－ｃＮＬＳ、ａＭＴＤ６６６－ｃＮＬＳ、ａＭＴＤ８９１－ｃＮＬＳ、ａＭＴＤ８３１－ｃＮＬＳ、及びａＭＴＤ８２７－ｃＮＬＳ）。追加ペプチド（ａＭＴＤ８２７－１ＮＬＳ）は、ＮＬＳが円形化されていない以外は、ａＭＴＤ８２７－ｃＮＬＳと同様である。
【表1】
【0079】
２．最適なｉＣＰ－ＮＩの選定
２－１．表１中のペプチドの抗炎活性
細菌性リポ多糖類（ＬＰＳ）と感作剤であるＤ－ガラクトサミン（Ｄ－Ｇａｌ）とを投与した後、９０％以上のマウスが致命的な炎症反応に負けたマウス急性肝障害モデルにおいて、各ペプチドの抗炎症活性が評価された。５つのａＭＴＤ含有ペプチドを用いた処理は、試験動物の２０～１００％を保護した。円状（ａＭＴＤ８２７－ｃＮＬＳ）及び線状（ａＭＴＤ８２７－ｌＮＬＳ）が同等に効果的であった（図１）。線状（ｌＮＩＳ）又は円状（ｃＮＬＳ）形態のＮＬＳ配列単独で処理しても生存が向上しなかったので、ａＭＴＤ８２７配列は、ａＭＴＤ８２７－ｃＮＬＳの抗炎症活性のために厳しく要求された（図２）。ａＭＴＤ８２７－ｃＮＬＳは、腹腔内（ＩＰ）注射より静脈（ＩＶ）投与時に一層効果的であった（それぞれ１００％及び７５％保護、図３）。ｃＳＮ５０．１ペプチドは、投与経路とは無関係に、ａＭＴＤ８２７－ｃＮＬＳより効果が少なかった（図４）。このような観察に基づき、ａＭＴＤ８２７－ｃＮＬＳが候補の抗炎症性ＣＯＶＩＤ１９治療剤として選択された。
２－１．表１中のペプチドの抗炎活性
細菌性リポ多糖類（ＬＰＳ）と感作剤であるＤ－ガラクトサミン（Ｄ－Ｇａｌ）とを投与した後、９０％以上のマウスが致命的な炎症反応に負けたマウス急性肝障害モデルにおいて、各ペプチドの抗炎症活性が評価された。５つのａＭＴＤ含有ペプチドを用いた処理は、試験動物の２０～１００％を保護した。円状（ａＭＴＤ８２７－ｃＮＬＳ）及び線状（ａＭＴＤ８２７－ｌＮＬＳ）が同等に効果的であった（図１）。線状（ｌＮＩＳ）又は円状（ｃＮＬＳ）形態のＮＬＳ配列単独で処理しても生存が向上しなかったので、ａＭＴＤ８２７配列は、ａＭＴＤ８２７－ｃＮＬＳの抗炎症活性のために厳しく要求された（図２）。ａＭＴＤ８２７－ｃＮＬＳは、腹腔内（ＩＰ）注射より静脈（ＩＶ）投与時に一層効果的であった（それぞれ１００％及び７５％保護、図３）。ｃＳＮ５０．１ペプチドは、投与経路とは無関係に、ａＭＴＤ８２７－ｃＮＬＳより効果が少なかった（図４）。このような観察に基づき、ａＭＴＤ８２７－ｃＮＬＳが候補の抗炎症性ＣＯＶＩＤ１９治療剤として選択された。
【0080】
２－２．ｉＣＰ－ＮＩの治療プロトコル
我々は、急性肝臓障害モデルにおいて様々な治療療法をテストし、４つの５０ｍｇ／ｋｇ治療又は６つの２５ｍｇ／ｋｇ治療で１００％保護を達成した。４回の２５ｍｇ／ｋｇ又は３回の２５ｍｇ／ｋｇ治療療法は、統計的に有意な差ではないが、比較的効果が少なかった。４回の５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ４０を投与した療法では、より高い水準の死亡率が観察された（それぞれ２５％及び３８％生存）。また、我々は、急性肝障害モデルの治療プロトコルを樹立し、このモデルにおいて６回の５０ｍｇ／ｋｇ投与マウスの６０％治療効果を観察した（図５）。
我々は、急性肝臓障害モデルにおいて様々な治療療法をテストし、４つの５０ｍｇ／ｋｇ治療又は６つの２５ｍｇ／ｋｇ治療で１００％保護を達成した。４回の２５ｍｇ／ｋｇ又は３回の２５ｍｇ／ｋｇ治療療法は、統計的に有意な差ではないが、比較的効果が少なかった。４回の５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ４０を投与した療法では、より高い水準の死亡率が観察された（それぞれ２５％及び３８％生存）。また、我々は、急性肝障害モデルの治療プロトコルを樹立し、このモデルにおいて６回の５０ｍｇ／ｋｇ投与マウスの６０％治療効果を観察した（図５）。
【0081】
２－３．ｉＣＰ－ＮＩの安定性及びインポーチン－５に対する結合力
ｉＣＰ－ＮＩは、溶解性に優れているため、２５℃で３か月以上凍結乾燥粉末として安定的であり（図６）、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）で評価したインポーチンα５に対する結合能を維持した（図７）。
ｉＣＰ－ＮＩは、溶解性に優れているため、２５℃で３か月以上凍結乾燥粉末として安定的であり（図６）、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）で評価したインポーチンα５に対する結合能を維持した（図７）。
【0082】
２－４．ｉＣＰ－ＮＩの細胞内伝達
細胞内伝達を分析するため、ｉＣＰ－ＮＩがＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で標識して培養されたＲＡＷ２６４．７細胞の吸収をフローサイトメトリーでモニタリングした。ｉＣＰ－ＮＩは、ａＭＴＤ８２７を有しないＮＬＳより１０００倍も高い細胞透過性を示した（図８）。ＩＶ投与後、ＦＩＴＣ－ｉＣＰ－ＮＩは、肺をはじめとした脳、心臓、肝臓、脾臓、腎臓を含む主要臓器に広く分布した（図９）。高い水準のｉＣＰ－ＮＩは、最低８時間の間、肺組織に残存し、経時的に減少した（図１０）。
細胞内伝達を分析するため、ｉＣＰ－ＮＩがＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で標識して培養されたＲＡＷ２６４．７細胞の吸収をフローサイトメトリーでモニタリングした。ｉＣＰ－ＮＩは、ａＭＴＤ８２７を有しないＮＬＳより１０００倍も高い細胞透過性を示した（図８）。ＩＶ投与後、ＦＩＴＣ－ｉＣＰ－ＮＩは、肺をはじめとした脳、心臓、肝臓、脾臓、腎臓を含む主要臓器に広く分布した（図９）。高い水準のｉＣＰ－ＮＩは、最低８時間の間、肺組織に残存し、経時的に減少した（図１０）。
【0083】
３．ＳＲＴＦの核内移動に対するｉＣＰ－ＮＩの効能
ストレス応答性転写因子（ＳＲＴＦ）は、炎症誘発刺激に対する反応として、サイトカイン及びケモカイン遺伝子発現プログラムを活性化する。多くのＳＲＴＦは、ＮＦ－κＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ）、ＡＰ－１（ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＳＴＡＴ１、及びＳＴＡＴ３（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ １ ａｎｄ ３）、並びにＬＰＳとポリＩ：Ｃ、又はＬＰＳとインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）で処理されたＲＡＷ２６４．７細胞の核においてＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌｓ）の蓄積で説明されるように、核内移動レベルで調節される。ｉＣＰ－ＮＩは、核及び細胞質画分のウエスタンブロット解析（図１１）及び免疫染色（図１２）により評価されたように、ＮＦ－κＢ（リン酸化及び非リン酸化ｐ６５）と、活性蛋白質１及びＡＰ－１（リン酸化ｃ－Ｊｕｎ）及びＳＴＡＴ３の核内移動を抑制した。ｉＣＰ－ＮＩは、また、ウェスタンブロット解析（図１３）と免疫染色（図１４）により評価されたように、ＬＰＳ／ＩＦＮ－γに対する反応として、ＮＦ－κＢ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ａｎｄ ｕｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｐ６５）、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ｐ－ＳＴＡＴ１ ａｎｄ ｐ－ＳＴＡＴ３）、ＡＰ－１（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｃ－Ｊｕｎ）、及びＮＦＡＴの核蓄積を遮断した。
ストレス応答性転写因子（ＳＲＴＦ）は、炎症誘発刺激に対する反応として、サイトカイン及びケモカイン遺伝子発現プログラムを活性化する。多くのＳＲＴＦは、ＮＦ－κＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ）、ＡＰ－１（ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＳＴＡＴ１、及びＳＴＡＴ３（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ １ ａｎｄ ３）、並びにＬＰＳとポリＩ：Ｃ、又はＬＰＳとインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）で処理されたＲＡＷ２６４．７細胞の核においてＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌｓ）の蓄積で説明されるように、核内移動レベルで調節される。ｉＣＰ－ＮＩは、核及び細胞質画分のウエスタンブロット解析（図１１）及び免疫染色（図１２）により評価されたように、ＮＦ－κＢ（リン酸化及び非リン酸化ｐ６５）と、活性蛋白質１及びＡＰ－１（リン酸化ｃ－Ｊｕｎ）及びＳＴＡＴ３の核内移動を抑制した。ｉＣＰ－ＮＩは、また、ウェスタンブロット解析（図１３）と免疫染色（図１４）により評価されたように、ＬＰＳ／ＩＦＮ－γに対する反応として、ＮＦ－κＢ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ａｎｄ ｕｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｐ６５）、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ｐ－ＳＴＡＴ１ ａｎｄ ｐ－ＳＴＡＴ３）、ＡＰ－１（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｃ－Ｊｕｎ）、及びＮＦＡＴの核蓄積を遮断した。
【0084】
４．急性炎症モデルにおけるｉＣＰ－ＮＩの効能
ｉＣＰ－ＮＩによるＳＲＴＦ核内移動の抑制は、ｉＣＰ－ＮＩにより運搬されるＮＬＳ配列がインポーチンα５に結合するためＳＲＴＦと競争してＳＲＴＦ核輸送を阻害するモデルと一致する。結果的に、ｉＣＰ－ＮＩの全身伝達は、ＳＲＴＦとこれらが発現を調節するサイトカイン及びケモカインが重要な病理学的役割を果たす炎症性障害を抑制することが予想される。このような予測は、急性炎症の複数の末端マウスモデルにおいてテストされた：ＬＰＳ／Ｄ－Ｇａｌ誘発肝炎、ＬＰＳ／ポリＩ：Ｃ誘発肺炎、並びにＣＬＰ（ｃｅｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｎｃｔｕｒｅ）及びＣＳ（ｃｅｃａｌ ｓｌｕｒｒｙ）により誘発された腹膜炎。
ｉＣＰ－ＮＩによるＳＲＴＦ核内移動の抑制は、ｉＣＰ－ＮＩにより運搬されるＮＬＳ配列がインポーチンα５に結合するためＳＲＴＦと競争してＳＲＴＦ核輸送を阻害するモデルと一致する。結果的に、ｉＣＰ－ＮＩの全身伝達は、ＳＲＴＦとこれらが発現を調節するサイトカイン及びケモカインが重要な病理学的役割を果たす炎症性障害を抑制することが予想される。このような予測は、急性炎症の複数の末端マウスモデルにおいてテストされた：ＬＰＳ／Ｄ－Ｇａｌ誘発肝炎、ＬＰＳ／ポリＩ：Ｃ誘発肺炎、並びにＣＬＰ（ｃｅｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｎｃｔｕｒｅ）及びＣＳ（ｃｅｃａｌ ｓｌｕｒｒｙ）により誘発された腹膜炎。
【0085】
４－１．ＬＰＳ／Ｄ－Ｇａｌ誘発肝炎
静脈内投与されたｉＣＰ－ＮＩは、１００％生存（ｎ＝１６３）で立証されるように、ＬＰＳ／Ｄ－Ｇａｌにより誘発された、依然として致命的な（ｎ＝１２０）肝炎からマウスを保護した（図１５）。ｉＣＰ－ＮＩ処理は、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α及びＩＬ－６）の発現を抑制し、抗炎症性サイトカインであるＩＬ－１０の発現を誘導し（図１６）、肝障害及び大規模な肝細胞のアポトーシスから保護した（図１７）。ＬＰＳ／Ｄ－Ｇａｌ肝炎モデルにおいて予防的ｉＣＰ－ＮＩの顕著な利点は、ＳＲＴＦ活性化の急性結果と肝臓の恒常性に伴う炎症反応が説明される。
静脈内投与されたｉＣＰ－ＮＩは、１００％生存（ｎ＝１６３）で立証されるように、ＬＰＳ／Ｄ－Ｇａｌにより誘発された、依然として致命的な（ｎ＝１２０）肝炎からマウスを保護した（図１５）。ｉＣＰ－ＮＩ処理は、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α及びＩＬ－６）の発現を抑制し、抗炎症性サイトカインであるＩＬ－１０の発現を誘導し（図１６）、肝障害及び大規模な肝細胞のアポトーシスから保護した（図１７）。ＬＰＳ／Ｄ－Ｇａｌ肝炎モデルにおいて予防的ｉＣＰ－ＮＩの顕著な利点は、ＳＲＴＦ活性化の急性結果と肝臓の恒常性に伴う炎症反応が説明される。
【0086】
４－２．ＬＰＳ／ポリＩ：Ｃ誘発肺炎
ＬＰＳが先に投与され、４時間後にポリＩ：Ｃが投与された。いずれもＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて気管内投与された。単独療法は致命的ではなかったが（データは示されない）、動物の７９%において組み合わせが致命的であった。マウスは、ポリＩ：Ｃを投与してから１２０時間以内に、肺音と共に荒い呼吸、大きく減少した活動及び死亡を含めて、ＡＲＤＳと類似した症状を示した。対照的に、ポリＩ：Ｃ４時間後に開始したｉＣＰ－ＮＩの処理は、生存が８４％（治療効能の７０．６％）に増加された（図１８）。上皮増殖、単核球浸潤及び肺胞構造のダメージを特徴とする肺組織学においてもｉＣＰ－ＮＩ処理により著しく改善され（図１９）、肺胞障害の程度も同様であった（図２０）。
ＬＰＳが先に投与され、４時間後にポリＩ：Ｃが投与された。いずれもＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて気管内投与された。単独療法は致命的ではなかったが（データは示されない）、動物の７９%において組み合わせが致命的であった。マウスは、ポリＩ：Ｃを投与してから１２０時間以内に、肺音と共に荒い呼吸、大きく減少した活動及び死亡を含めて、ＡＲＤＳと類似した症状を示した。対照的に、ポリＩ：Ｃ４時間後に開始したｉＣＰ－ＮＩの処理は、生存が８４％（治療効能の７０．６％）に増加された（図１８）。上皮増殖、単核球浸潤及び肺胞構造のダメージを特徴とする肺組織学においてもｉＣＰ－ＮＩ処理により著しく改善され（図１９）、肺胞障害の程度も同様であった（図２０）。
【0087】
４－３．ＣＬＰ（ｃｅｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｎｃｔｕｒｅ）及びＣＳ（ｃｅｃａｌ ｓｌｕｒｒｙ）により誘発された腹膜炎
ｉＣＰ－ＮＩは、また、ＣＬＰ（図２１）及びＣＳ（図２２）プロトコルにより誘発された重症敗血症の治療に有益であることが立証された。ｉＣＰ－ＮＩは、抗生剤メロペネムだけで達成した以上に両モデル共に生存を向上させた。
ｉＣＰ－ＮＩは、また、ＣＬＰ（図２１）及びＣＳ（図２２）プロトコルにより誘発された重症敗血症の治療に有益であることが立証された。ｉＣＰ－ＮＩは、抗生剤メロペネムだけで達成した以上に両モデル共に生存を向上させた。
【0088】
５．亜急性肺炎症モデルにおけるｉＣＰ－ＮＩの効能
ＣＯＶＩＤ－１９は、非常に多様な疾病の重症度と進行状況を示している。 これは、ウイルスに感染した近位（呼吸器及び肺）組織と遠位組織との間の複雑な相互作用、宿主炎症反応の全身効果及び随伴疾患、遺伝学及び療法（例えば、人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ））のような患者変数の結果であると考えられる。ヒトＣＯＶＩＤ―１９の複雑性によって、動物モデルの開発が複雑化し、よって、ＣＯＶＩＤ－１９治療剤としてのｉＣＰ－ＮＩの前臨床評価が複雑化する。そこで、我々は、様々な病理学的エンドポイントに対するｉＣＰ－ＮＩの影響を評価するため、広範なアクセス方式をとり、いくつかの致命的でない肺炎モデルを使用した：肺組織学、ＬＰＳ吸入後のＢＡＬＦ細胞数及びサイトカイン発現；肺組織学、ポリ（Ｉ：Ｃ）吸入後のＢＡＬＦ細胞数及びサイトカイン発現；肺組織学、ポリＩ：Ｃ吸入及びブドウ球菌腸毒素Ｂ（ＳＥＢ）の鼻腔投与後の好中球浸潤及び肝臓及び脾臓全身効果；並びに、ブレオマイシン誘発肺線維症。また、我々は、Ａ５４９ヒト肺胞上皮細胞においてＴＧＦ－ｂで誘発された上皮から間葉への転移に対するｉＣＰ－ＮＩの効果を調査した。
ＣＯＶＩＤ－１９は、非常に多様な疾病の重症度と進行状況を示している。 これは、ウイルスに感染した近位（呼吸器及び肺）組織と遠位組織との間の複雑な相互作用、宿主炎症反応の全身効果及び随伴疾患、遺伝学及び療法（例えば、人工呼吸器誘発肺障害（ＶＩＬＩ））のような患者変数の結果であると考えられる。ヒトＣＯＶＩＤ―１９の複雑性によって、動物モデルの開発が複雑化し、よって、ＣＯＶＩＤ－１９治療剤としてのｉＣＰ－ＮＩの前臨床評価が複雑化する。そこで、我々は、様々な病理学的エンドポイントに対するｉＣＰ－ＮＩの影響を評価するため、広範なアクセス方式をとり、いくつかの致命的でない肺炎モデルを使用した：肺組織学、ＬＰＳ吸入後のＢＡＬＦ細胞数及びサイトカイン発現；肺組織学、ポリ（Ｉ：Ｃ）吸入後のＢＡＬＦ細胞数及びサイトカイン発現；肺組織学、ポリＩ：Ｃ吸入及びブドウ球菌腸毒素Ｂ（ＳＥＢ）の鼻腔投与後の好中球浸潤及び肝臓及び脾臓全身効果；並びに、ブレオマイシン誘発肺線維症。また、我々は、Ａ５４９ヒト肺胞上皮細胞においてＴＧＦ－ｂで誘発された上皮から間葉への転移に対するｉＣＰ－ＮＩの効果を調査した。
【0089】
吸入ＬＰＳ又はポリＩ：Ｃは、上皮増殖、単核球浸潤及び肺胞構造のダメージを特徴とする肺組織学の一時的な変化を誘導した。ＬＰＳ又はポリＩ：Ｃ以前に開始されたｉＣＰ－ＮＩ処理は、正常対照群に比べてこれらの反応の大部分を遮断し、肺胞構造を保存し（図２３及び２４）、ＢＡＬＦから回収された細胞数が５～６倍増加した（図２５）。ｉＣＰ－ＮＩの抗炎効果は、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６及びＭＣＰ－１発現の減少をもたらした（図２６）。さらに、ＬＰＳによるサイトカイン発現の類似した活性化が、ＲＡＷ２６４．７細胞において観察された。ＴＮＦ－α、ＩＬ－６及びＩＬ－１βの水準は、ｉＣＰ－ＮＩの濃度依存的にｉＣＰ－ＮＩ処理された細胞から減少した（図２７）。
【0090】
ポリＩ：Ｃ吸入後、ＳＥＢの鼻腔（ＩＮ）投与は、ｉＣＰ－ＮＩ処理により抑制された細胞性、好中球浸潤（Ｌｙ－６Ｇ陽性細胞）及び好中球数の増加を誘導した。ｉＣＰ－ＮＩは、好中球浸潤及び肝数値（図２８）及び肺の肺胞体積（図２９）を減少させた。脾臓において観察された潜在的な活性化結果－依存的細胞死滅でもあり得る死滅細胞数の減少を含め、全身効果もｉＣＰ－ＮＩ処理により顕著に改善された（図２８及び３０）。
【0091】
ＡＲＤＳ及び中等度から重症のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染は、間質性線維症と関連がある。我々は、ｉＣＰ－ＮＩの抗線維症効果を検証するため、肺線維症のブレオマイシン（ＢＬＭ）誘発マウスモデルを使用した。ＢＬＭ誘発１５時間後、ＢＬＭ処理されたマウスの肺は、マイクロ－ＣＴ（図３１）によりイメージ化されるように、広範な肺胞障害が示され、肺胞構造のダメージ、炎症細胞浸潤、ガラス質化及びコラーゲン沈着のような特徴を示した（図３２）。このような線維化変化は、ＩＶ ｉＣＰ－ＮＩ治療により大きく遮断された。
【0092】
これと共に、このような結果は、肺炎症が感染症刺激の以前に開始された静脈内投与されたｉＣＰ－ＮＩに良く反応することを示唆する。ケモカインＭＣＰ－１の生成が制限され、免疫細胞、特に中等度から重症のＣＯＶＩＤ－１９疾病で観察されるサイトカインストームの主要原因である好中球の走化性が抑制される。従って、ｉＣＰ－ＮＩは、ケモカイン／サイトカインの発現を抑制し、肺胞構造を保存し、微細血管のダメージ及び多臓器不全につながる全身炎症を抑制する能力がある、効果的なＣＯＶＩＤ－１９治療剤になることが可能である。
【0093】
６．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した非ヒト霊長類のサイトカイン／ケモカイン分泌及び肺炎症に対するｉＣＰ－ＮＩの効能
非ヒト霊長類（アフリカミドリサル：ＡＧＭ、赤毛猿：ＲＭ）にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた後、ｉＣＰ－ＮＩを注入して臨床徴候（Ｏ２飽和度、呼吸数、心拍数、血糖数値、体温）の改善を観察した。全動物のサイトカイン／ケモカイン血漿水準及びＢＡＬＦを追跡した。全動物を犠牲にして病理組織学的解析を行った。不幸にもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したサルは、軽微な症状しか現れず、ＢＡＬ液及び炎症誘発性サイトカイン／ケモカイン血漿の水準が低かった。
非ヒト霊長類（アフリカミドリサル：ＡＧＭ、赤毛猿：ＲＭ）にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた後、ｉＣＰ－ＮＩを注入して臨床徴候（Ｏ２飽和度、呼吸数、心拍数、血糖数値、体温）の改善を観察した。全動物のサイトカイン／ケモカイン血漿水準及びＢＡＬＦを追跡した。全動物を犠牲にして病理組織学的解析を行った。不幸にもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したサルは、軽微な症状しか現れず、ＢＡＬ液及び炎症誘発性サイトカイン／ケモカイン血漿の水準が低かった。
【0094】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した猿の軽い症状と低いサイトカイン／ケモカイン分泌にもかかわらず、ｉＣＰ－ＮＩ処理動物において臨床症状が改善され、サイトカイン（ＩＦＮ－γ）／ケモカイン（ＭＣＰ－１）の分泌が減少した。１～５ｄｐｉ（感染後１日）において、Ｏ２飽和度は、８６％に落ち、呼吸数は、１分当たり３２回に増加し、心拍数は、１６３ｂｐｍに増加し、血糖は、２８６ｍｇ／ｄＬに増加したが、ｉＣＰ－ＮＩ投与の猿は、正常状態（酸素飽和度９８％、呼吸数２０回、心拍数１１３回、血糖１０３ｍｇ／ｄＬ）を維持した（図３３）。ＩＦＮ－γの分泌水準は、血漿において１２．９１ｐｇ／ｍＬに増加し、これは、ｉＣＰ－ＮＩ投与後、５０．５％減少した６．３９ｐｇ／ｍＬであった。直接感染及び炎症部位であるＢＡＬＦにおいてＭＣＰ－１は、感染５日後に２０１０．９ｐｇ／ｍＬまで増加したが、ｉＣＰ－ＮＩ処理動物においては、９９．９％減少し、２４．８７ｐｇ／ｍＬと示された（図３４）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス力価は、臨床症状の水準と相関関係がなかったが、ｉＣＰ－ＮＩ処理によってその消滅率が高く維持された。ｉＣＰ－ＮＩ投与初日（処理前）と比較して、希釈動物のウイルス力価は７０％の減少率を示し、これに対し、ｉＣＰ－ＮＩ処理動物は、完全に確立したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サルモデルにおいて９１％の減少率を示した。同じく、部分及び未確立グループの希釈動物は、ウイルス力価が増加した倍数を示したが（それぞれ６４１％、４２６％）、これに対し、ｉＣＰ－ＮＩ処理動物は、それぞれ３７％及び９８％の減少率を示した（図３５）。ｉＣＰ－ＮＩ処理をしなかった動物の肺からは、免疫細胞浸潤、増殖、出血、線維症が観察されたが、ｉＣＰ－ＮＩ処理動物では、このような病理学的所見は観察されなかった（図３６）。
【0095】
本発明は、例示的な実施例を参照して説明されている。本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者であれば、本発明の思想及び範囲を逸脱しない範囲内で本発明を種々に変更して実施可能であることが理解されるだろう。従って、本明細書に開示の実施例は、制限的な側面でなく例示的な側面から考慮されるべきである。本発明の範囲は、特許請求の範囲により定義され、均等な範囲内の全ての差異点は、本発明に含まれるものと解析されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【0096】
本発明による改善された細胞透過性核輸送阻害剤合成ペプチドは、優れた細胞透過性を基に、ＮＦ－κＢを含むＳＲＴＦ（ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）により媒介されるシグナル伝達をより効率的に遮断し、従って、サイトカインストーム又は炎症性疾患に対する優れた予防又は治療剤として使用可能である。
［参照］
１．Ｍ．Ｅ．Ｓｔａｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｅｗ ｃｅｃａｌ ｓｌｕｒｒｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｓｅｐｓｉｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９，ｅ１１５７０５（２０１４）．
２．Ｊ．Ｌ．Ｗｙｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ａｎｄ ａｌｔｅｒｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｓｅｐｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ． Ｓｈｏｃｋ ２８，６７５－６８３（２００７）．
３．Ｂ．Ｓｈｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｒｏｂｕｓｔ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｓｅｐｓｉｓ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｉｎ ａｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ． ＢＭＣ Ｒｅｓ Ｎｏｔｅｓ ７，２３３（２０１４）．
４．Ｌ．Ｄｅｊａｇｅｒ，Ｉ．Ｐｉｎｈｅｉｒｏ，Ｅ．Ｄｅｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ，Ｃ．Ｌｉｂｅｒｔ，Ｃｅｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｎｃｔｕｒｅ：ｔｈｅ ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｐｏｌｙｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｅｐｓｉｓ Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９，１９８－２０８（２０１１）．
５．Ｍ．Ｇ．Ｔｏｓｃａｎｏ，Ｄ．Ｇａｎｅａ，Ａ．Ｍ．Ｇａｍｅｒｏ，Ｃｅｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｐｕｎｃｔｕｒｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ，（２０１１）．
６．Ｓ．Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｐｓｉｓ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｉｎ ｍｉｃｅ：ｌｉｇａｔｉｏｎ ｌｅｎｇｔｈ ｉｓ ａ ｍａｊｏｒ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｃｅｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｎｃｔｕｒｅ．４，１－１３（２０１６）．
７．Ｇ．Ｉｚｂｉｃｋｉ，Ｍ．Ｊ．Ｓｅｇｅｌ，Ｔ．Ｇ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｗ．Ｃｏｎｎｅｒ，Ｒ．Ｂｒｅｕｅｒ，Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｅｘｐ Ｐａｔｈｏｌ ８３，１１１－１１９（２００２）．
８．Ｖ．Ｄｅｌｌａ Ｌａｔｔａ，Ａ．Ｃｅｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｓ．Ｄｅｌ Ｒｙ，Ｍ．Ａ．Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｔｔｉｎｇ ｏｆ ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｔｏ ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｓ ９７，１２２－１３０（２０１５）．
［参照］
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８．Ｖ．Ｄｅｌｌａ Ｌａｔｔａ，Ａ．Ｃｅｃｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｓ．Ｄｅｌ Ｒｙ，Ｍ．Ａ．Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｔｔｉｎｇ ｏｆ ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ：Ｆｒｏｍ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｔｏ ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｓ ９７，１２２－１３０（２０１５）．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
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【図8】
【図9】
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【図11】
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【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
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【図28】
【図29】
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【図35】
【図36】
【配列表】