特許 7451005 ヘレナリン誘導体を含有する前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-08

(45)【発行日】2024-03-18

(54)【発明の名称】ヘレナリン誘導体を含有する前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/365 20060101AFI20240311BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240311BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240311BHJP

   A61K 8/49 20060101ALI20240311BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20240311BHJP

   A61K 36/28 20060101ALN20240311BHJP

【ＦＩ】

A61K31/365

A61P43/00 105

A61P17/00

A61K8/49

A61Q19/00

A61K36/28

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2023575625

(86)(22)【出願日】2023-04-11

(86)【国際出願番号】 JP2023014689

【審査請求日】2023-12-07

(31)【優先権主張番号】P 2022082055

(32)【優先日】2022-05-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】000119472

【氏名又は名称】一丸ファルコス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002697

【氏名又は名称】めぶき弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100110973

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 洋

(74)【代理人】

【識別番号】100116528

【弁理士】

【氏名又は名称】三宅 俊男

(72)【発明者】

【氏名】坂元 孝太郎

(72)【発明者】

【氏名】光永 徹

(72)【発明者】

【氏名】山内 恒生

【審査官】高橋 樹理

(56)【参考文献】

【文献】特開２０２０－０２３４７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１１－０３２２３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】FERNANDES, K.M. et al.，Helenalin-Mediated Post-Transcriptional Regulation of p21(Cip1) Inhibits 3T3-L1 Preadipocyte Prolife，Journal of Cellular Biochemistry，2008年，Vol.105，p.913-921

【文献】AULD, C.A. et al.，Novel effect of helenalin on Akt signaling and Skp2 expression in 3T3-L1 preadipocytes，Biochemical and Biophysical Research Communications，2006年，Vol.346，p.314-320

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（Ｉ）：

【化1】

（式中、Ｒは、水素原子、アセチル基、メタクリロイル基又はイソブチリル基である。）で表される化合物を有効成分として含有する剤であって、質量比にて前記有効成分の総量を超える６－Ｏ－チグロイルヘレナリンを含まない、前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進剤。

【請求項2】

前記化合物が、６－Ｏ－メタクリロイルヘレナリン又は６－Ｏ－イソブチリルヘレナリンである、請求項１に記載の前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進剤。

【請求項3】

６－Ｏ－メタクリロイルヘレナリン及び６－Ｏ－イソブチリルヘレナリンの両方を含む請求項１に記載の前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進剤。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか一項に記載の前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進剤の有効量を含有する前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進用の皮膚外用剤で、質量比にて前記有効成分の総量を超える６－Ｏ－チグロイルヘレナリンを含まない、前記外用剤。

【請求項5】

６－Ｏ－メタクリロイルヘレナリン及び／又は６－Ｏ－イソブチリルヘレナリンの含有量が、少なくとも０．１×１０^－７質量％である、請求項４に記載の皮膚外用剤。

【発明の詳細な説明】

【クロスリファレンス】

【0001】

本出願は、２０２２年５月１９日に日本国において出願された特願２０２２－０８２０５５に基づき優先権を主張し、当該出願に記載された内容は、本明細書に援用する。

【技術分野】

【0002】

本発明は、ヘレナリン誘導体を含有する前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進剤に関する。

【背景技術】

【0003】

脂肪細胞は、表皮、真皮、皮下組織の三層からなる皮膚構造の最下層にみられ、脂肪をトリグリセリドとして蓄えるエネルギー貯蔵組織を構成している。脂肪組織は、長寿ホルモンとして知られるアディポネクチンなど、種々のアディポカインを分泌することで他組織を刺激する。脂肪組織は、その生理的な機能だけでなく、女性においてはふくよかさを演出し、局所的な脂肪の蓄積によってシワの改善につながるなど、外観美を創り出す機能も有している。

【0004】

脂肪細胞は上述のように生理的及び外観美的に重要な機能を有しているにも関わらず、近年のダイエット志向によって、脂肪細胞は悪玉として捉えられる風潮にある。そのため、専ら前駆脂肪細胞の増殖抑制や脂肪細胞への分化抑制につながる成分を含む化粧品、食品、医薬品の開発が行われている。一方、皮膚の老化現象などを抑制すべく、皮膚より内方側にある筋肉のもととなる筋芽細胞の増殖を促進するため、アルニカ抽出物と紅藻抽出物とを含有する皮膚外用組成物が開示されている（例えば、特許文献１参照）。

【0005】

キク科・アルニカ花から抽出したエキスは、抗炎症効果や血液循環作用をもつメディカルハーブとして古来より使用されている。このアルニカ抽出物は、脂肪細胞を増やす働きを持ち、脂肪層をボリュームアップさせ、肌のハリと弾力を向上させることも報告されている（例えば、特許文献２参照）。しかしながら、アルニカ花エキスに含まれる、前駆脂肪細胞の増殖、分化促進に関わる有効成分は未だ明らかではない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】特開２０１１－３２２３３号公報

【文献】特開２０２０－０２３４７６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明が解決しようとする課題は、アルニカ抽出物に含まれる前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化を促進する化合物を見出し、この化合物を用いて脂肪層をボリュームアップさせて外観美を創り出すための化粧品、食品、医薬品等、及び／又はこれらに配合する素材など、を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、上記課題を解決するためになされたものである。アルニカ花抽出物からカラムクロマトグラフィー等を用いて分画、精製した特定の化合物が、前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化を促進することなどを見出したことにより、本発明を創作した。
すなわち、本発明は以下の実施形態を含む。

【0009】

（１）下記式（Ｉ）：

【化1】

（式中、Ｒは、水素原子又は炭素数１～５のアシル基である。）で表される化合物を有効成分として含有する、前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進剤。
（２）化合物が、６－Ｏ－メタクリロイルヘレナリン又は６－Ｏ－イソブチリルヘレナリンである（１）に記載の、前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進剤。
（３）化合物が、ヘレナリン又は６－Ｏ－アセチルヘレナリンである（１）に記載の前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進剤。
（４）化合物が、６－Ｏ－チグロイルヘレナリンを含まないか又は質量比にて有効成分の総量以下の６－Ｏ－チグロイルヘレナリンを含有する、（１）に記載の前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進剤。
（５）上記式（Ｉ）で表される化合物を有効成分として含有する、前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進用の皮膚外用剤。
（６）各有効成分の含有量が、少なくとも０．１×１０^－９質量％である、（５）に記載の皮膚外用剤。
（７）６－Ｏ－チグロイルヘレナリンを含まないか又は約１×１０^－７質量％以下の濃度で含有する、（５）又は（４）に記載の皮膚外用剤。

【発明の効果】

【0010】

本発明の前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進剤は、前駆脂肪細胞の増殖及び分化を促進し、脂肪層をボリュームアップさせて外観美を創り出すための化粧品、食品、医薬品等、及び／又はこれらに配合する素材を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は、アルニカ抽出物から有効成分を分画精製するスキームを示す。

【図2】図２は、アルニカ抽出物をジエチルエーテル抽出及びシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー分画した各画分のヒト皮下前駆脂肪細胞の増殖試験及び分化試験の結果を示す。

【図3】図３は、ＤＥＦｒ．４－２画分からシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー及び分取ＨＰＬＣ等を用いて単離した化合物１及び化合物３～１０のヒト皮下前駆脂肪細胞の増殖試験及び分化試験の結果を示す。

【図4】図４は、化合物７、８及び９を単独で又はそれぞれ混合した場合のヒト皮下前駆脂肪細胞の増殖試験及び分化試験の結果を示す。

【図5】図５は、ＤＥＦｒ．３及びＤＥＦｒ．５～ＤＥＦｒ．８をさらに精製し、新たな化合物１２～１９を単離するための分画スキームを示す。

【図6】図６は、化合物１１（Ｃｍｐｄ１１）から化合物１９（Ｃｍｐｄ１９）のヒト皮下前駆脂肪細胞の増殖試験及び分化試験の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

次に、本発明の各実施形態について、図面を参照して説明する。なお、以下に説明する各実施形態は、特許請求の範囲に係る発明を限定するものではなく、また、各実施形態の中で説明されている諸要素及びその組み合わせの全てが本発明の解決手段に必須であるとは限らない。

【0013】

（定義）
本明細書において、「前駆脂肪細胞」とは、脂肪細胞へ分化する能力を有する脂肪組織由来の細胞をいう。成熟した脂肪細胞とは異なり、前駆脂肪細胞は細胞内に脂肪をまだ含有しておらず、増殖性を有する線維芽細胞様の細胞である。成熟脂肪細胞とは、この前駆脂肪細胞が細胞内に脂肪を蓄積できるように分化した細胞を指し、その形態としては細胞内に脂肪を蓄積した状態である。肌が老化する原因の一つに、加齢や紫外線による皮下脂肪の退縮・減少がある。皮下脂肪層がボリュームダウンすると、肌のハリが無くなり、肌表面に凹凸が生じ、シワやくぼみへとつながる。従って、主にヒトなどの生体の前駆脂肪細胞を増やし、脂肪細胞に分化させることで、局所的な肌（バスト、唇、涙袋、手の甲など）のボリューム減少を予防し、治療し及び／又は改善する作用を有する。そして、皮下脂肪細胞が増加することによって、ほうれい線などとともに、肌の透明感やツヤが改善されると考えられる。

【0014】

本実施形態における「前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進剤」（以下、単に「本実施形態の剤」と称する場合がある。）とは、これらの用途に使用される有効成分を含有する組成物等を意味し、化粧品や医薬品に添加して用いることができる素材である。この剤は、液体だけでなく、例えば固形等も挙げられ、具体的な用途としては皮膚外用剤だけでなく、経口組成物（例えば、固体でも液体でも作製可能）であってもよい。

【0015】

（有効成分）
本実施形態の前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進剤は、下記式（Ｉ）：

【化2】

【0016】

（式中、Ｒは、水素原子又は炭素数１～５のアシル基である。）で表される化合物を有効成分として含有する。ここで、「炭素数１～５のアシル基」におけるアシル基とは、置換されたカルボニル基を意味し、直鎖状、分岐状、環状、飽和、不飽和の脂肪族炭化水素基であり、具体的にはアセチル基、プロピオニル基、イソプロピオニル基、イソブチリル基、チグロイル基、イソバレリル基、ピバロイル基、メタクリロイル基、アクロイル基、クロトノイル基、２－メチルクロトノイル基などがあげられる。好ましい実施形態では、上記式（Ｉ）におけるＲが水素原子又は炭素数１～４のアシル基である。さらに好ましい実施形態としては、Ｒが水素原子、アセチル基、メタクリロイル基又はイソブチリル基である。

【0017】

１つの実施形態において、本発明の有効成分は、６－Ｏ－メタクリロイルヘレナリン及び／又は６－Ｏ－イソブチリルヘレナリンである。ここで、６－Ｏ－メタクリロイルヘレナリンとは、上記一般式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒがメタクリロイル基を示す化合物８である。また、６－Ｏ－イソブチリルヘレナリンは、上記一般式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒがイソブチリル基を示す化合物９である。

【0018】

他の１つの実施形態において、本発明の有効成分は、ヘレナリン又は６－Ｏ－アセチルヘレナリンである。ここで、ヘレナリンとは、上記一般式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒが水素原子を示す化合物１２である。また、６－Ｏ－アセチルヘレナリンは、上記一般式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒがアセチル基を示す化合物１３である。

【0019】

これらの化合物は、例えば、アルニカ花から直接抽出するか、あるいは、アルニカ等の薬用植物から抽出したヘレナリンを母化合物として化学修飾により合成してもよい。例えば、ヘレナリンの６位の水酸基に無水酢酸を用いてアセチル化する方法が報告されている（Ｍａｒｉａ Ｆ Ｂｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１９；２４（６）：１１１３、スキーム２参照）。これらに基づき、ヘレナリンと酸無水物とを用いて当業者であれば容易に上記化合物８及び化合物９を合成することができる。

【0020】

本実施形態の有効成分をアルニカ花から抽出する場合、「アルニカ」は、キク科、アルニカ属の植物（学名Ａｒｎｉｃａ ｍｏｎｔａｎａ）である。アルニカの抽出物を製造する際には、材料として、例えば、根、根茎、葉、茎、花、果実、果皮、種子、全草、又はこれらの混合物を用いることができる。アルニカの抽出物は、例えば、材料を生のまま又は乾燥したものを粉砕後に溶媒で抽出して作製する。例えば、アルニカの花乾燥物５０ｇを３０％１，３－ブチレングリコール溶液１ｋｇに浸漬し、約１０℃～約３０℃の環境で５～１０日間抽出する。あるいは、アルニカの花乾燥物５０ｇを約３０℃～約５０℃の温水１ｋｇに浸漬して、２～１０時間抽出してもよい。この浸漬を経て得られる溶液を、所定の濾過材（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｆｉｌｅ保持時間（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製Ｇｆ－７５）とＭｉｘｅｄ Ｃｅｌｌｕｒｏｓｅ ｅｓｔｅｒ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製Ａ０４５Ａ０４７Ａ）など）を用いて、濾過する。濾過後の溶液を約０℃～約１０℃の環境で５～１０日間、静置する。再度、所定の濾過材を用いて、濾過し、得られる溶液をアルニカの抽出物として用いる。

【0021】

（有効成分の単離精製操作）
本実施形態の有効成分は、アルニカ抽出物から溶媒による分液抽出、種々の分離モード（イオン交換、親水性吸着、疎水性吸着、サイズ排除、配位子交換、アフィニティー等）によるクロマトグラフィーを用いた分画、濾紙やメンブランフィルター、限外濾過膜等を用いた分子量分画濾過、加圧又は減圧、加温又は冷却、乾燥、ｐＨ調整、脱臭、脱色、長時間の静置保管等を用いて行うことができ、これらを任意に選択し、組み合わせて処理することも可能である。１つの実施形態として、後述する実施例で用いたカラムクロマトグラフィー及び分取ＨＰＬＣ等を組み合わせて行うことが好ましい。精製した化合物は、ＮＭＲや質量分析法により構造決定することができる。

【0022】

（前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進剤）
本実施形態の剤における、各有効成分の含有比率は、特に限定されるものではない。例えば、本実施形態の剤は、６－Ｏ－メタクリロイルヘレナリン及び６－Ｏ－イソブチリルヘレナリンのいずれか一方だけを含んでもよいし、又は両方を任意の比率にて含有することができる。好ましい実施形態では６－Ｏ－メタクリロイルヘレナリン及び６－Ｏ－イソブチリルヘレナリンの両方を含み、より好ましくはこれらをほぼ１：１の割合で含む。本実施形態の剤は、これら有効成分以外に任意の化合物を含んでもよい。例えば、アルニカをはじめとするキク科植物には、多種類のヘレナリン、その誘導体又はその類縁体が含まれる。これらは、ラクトン環を持つ親油性の１５炭素のテルペノイド化合物であるセスキテルペンラクトン類と総称されている。

【0023】

民間療法において、セスキテルペンラクトン類は様々な症状に対する漢方薬として使用されている。その多様性は、その生物学的活性の多様性と一致し、抗炎症作用、細胞毒性、抗癌作用、抗菌作用、抗真菌作用、殺虫作用、抗原虫作用を発揮することが示されている。従って、本実施形態の剤がその他の成分としてセスキテルペンラクトン類を含む場合、これらの各種生理活性、特に、細胞毒性に注意する必要がある。例えば、後述する実施例で示すように、アルニカ抽出物には、多種類のセスキテルペンラクトン類が含まれるが、それらの中で細胞毒性の強い成分の含有比率を低下させることが好ましい。細胞毒性の強いヘレナリン誘導体としては、例えば、６－Ｏ－チグロイルヘレナリンが挙げられる。一方、本実施形態の有効成分より少量の６－Ｏ－チグロイルヘレナリンを含むことで、前記脂肪細胞の分化が促進される場合がある。従って、本実施形態の剤は、６－Ｏ－チグロイルヘレナリンを含まないか又は質量比にて有効成分の総量以下の６－Ｏ－チグロイルヘレナリンを含有することが好ましい。これにより、その他の成分による細胞毒性作用を抑制するとともに、本実施形態の有効成分との相乗作用も期待することができるからである。

【0024】

（皮膚外用剤に含まれる有効成分の含有量）
本実施形態の剤は、１つの用途として皮膚外用剤が挙げられる。皮膚外用剤における各有効成分の含有量は、その投与形態および投与方法等を考慮し、前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進作用が得られるような量であればよく、特に限定されるものではない。例えば、各有効成分の含有量は、当該皮膚外用剤の全重量に対して、好ましくは０．１×１０^－9質量％以上、より好ましくは０．１×１０^－７質量％（水溶液として用いる場合は約０．１ｎｇ／ｍＬ）以上、さらに好ましくは０．３×１０^－７質量％以上であり、さらになお好ましくは１×１０^－７質量％以上である。また、ヘレナリン誘導体としての細胞毒性を考慮して、好ましくは１×１０^－２質量％以下、より好ましくは１×１０^－３質量％以下、さらに好ましくは１×１０^－４質量％以下である。１つの実施形態において、６－Ｏ－チグロイルヘレナリン（化合物７）を含む場合は、約１×１０^―７質量％以下の濃度で含有するか、又はこれを含有しないことが好ましい。

【0025】

（皮膚外用剤の形態）
本発明による皮膚外用剤は、アンプル、カプセル、粉末、顆粒、液体、ゲル、気泡、エマルジョン、シート、ミスト、スプレー剤等利用上の適当な形態の１）医薬品類、２）医薬部外品類、３）局所用又は全身用の皮膚外用剤類（例えば、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パック等の基礎化粧料、固形石鹸、液体ソープ、ハンドウォッシュ等の洗顔料や皮膚洗浄料、マッサージ用剤、クレンジング用剤、除毛剤、脱毛剤、髭剃り処理料、アフターシェーブローション、プレシェーブローション、シェービングクリーム、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ等のメークアップ化粧料、香水類、美爪剤、美爪エナメル、美爪エナメル除去剤、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、貼付剤、エアゾール剤等）、４）頭皮・頭髪に適用する薬用又は／及び化粧用の製剤類（例えば、シャンプー剤、リンス剤、ヘアートリートメント剤、プレヘアートリートメント剤、パーマネント液、染毛料、整髪料、ヘアートニック剤、育毛・養毛料、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、エアゾール剤等）、５）浴湯に投じて使用する浴用剤、６）その他、腋臭防止剤や消臭剤、制汗剤、衛生用品、衛生綿類、ウエットティシュ等が挙げられる。

【0026】

（皮膚外用剤の構成成分）
また、このような剤には、必要に応じて、本発明の効果を損ねない範囲で以下に例示する成分や添加剤を任意に選択・併用して製造することができ、これらの処方系中への配合量は、特に規定するものではないが、通常、０．０００１～５０％程度が好ましいと考えられる。

【0027】

（１）各種油脂類
アボカド油、アーモンド油、ウイキョウ油、エゴマ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、ゴマ油、カカオ脂、カミツレ油、カロット油、キューカンバー油、牛脂脂肪酸、ククイナッツ油、サフラワー油、シア脂、液状シア脂、大豆油、ツバキ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油、落花生油、タートル油、ミンク油、卵黄油、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、牛脂、豚脂、スクワレン、スクワラン、プリスタン又はこれら油脂類の水素添加物（硬化油等）等。

【0028】

（２）ロウ類
ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウ、ライスワックス等。

【0029】

（３）鉱物油
流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタンワックス等。

【0030】

（４）脂肪酸類
ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、１２－ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸等の天然脂肪酸、イソノナン酸、カプロン酸、２－エチルブタン酸、イソペンタン酸、２－メチルペンタン酸、２－エチルヘキサン酸、イソペンタン酸等の合成脂肪酸。

【0031】

（５）アルコール類
エタノール、イソプロパノール、ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、フェノキシエタノール等の天然アルコール、２－ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、２－オクチルドデカノール等の合成アルコール。

【0032】

（６）多価アルコール類
酸化エチレン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ポリエチレングリコール、酸化プロピレン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、１、３－ブチレングリコール、ペンチルグリコール、グリセリン、ペンタエリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、ガラクチトール、ソルビトール、マンニトール、ラクチトール、マルチトール等。

【0033】

（７）エステル類
ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸オレイル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、酢酸ラノリン、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ジオレイン酸プロピレングリコール等。

【0034】

（８）金属セッケン類
ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、パルミチン酸亜鉛、ミリスチン酸マグネシウム、ラウリン酸亜鉛、ウンデシレン酸亜鉛等。

【0035】

（９）ガム質、糖類又は水溶性高分子化合物
アラビアゴム、ベンゾインゴム、ダンマルゴム、グアヤク脂、アイルランド苔、カラヤゴム、トラガントゴム、キャロブゴム、クインシード、寒天、カゼイン、乳糖、果糖、ショ糖又はそのエステル、トレハロース又はその誘導体、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、カラギーナン、カルボキシメチルキチン又はキトサン、エチレンオキサイド等のアルキレン（Ｃ２～Ｃ４）オキサイドが付加されたヒドロキシアルキル（Ｃ２～Ｃ４）キチン又はキトサン、低分子キチン又はキトサン、キトサン塩、硫酸化キチン又はキトサン、リン酸化キチン又はキトサン、アルギン酸又はその塩、ヒアルロン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸又はその塩、ヘパリン、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、結晶セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸塩、ポリエチレンオキサイドやポリプロピレンオキサイド等のポリアルキレンオキサイド又はその架橋重合物、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンイミン等。

【0036】

（１０）界面活性剤
アニオン界面活性剤（アルキルカルボン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩）、カチオン界面活性剤（アルキルアミン塩、アルキル四級アンモニウム塩）、両性界面活性剤：カルボン酸型両性界面活性剤（アミノ型、ベタイン型）、硫酸エステル型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル型両性界面活性剤、非イオン界面活性剤（エーテル型非イオン界面活性剤、エーテルエステル型非イオン界面活性剤、エステル型非イオン界面活性剤、ブロックポリマー型非イオン界面活性剤、含窒素型非イオン界面活性剤）、その他の界面活性剤（天然界面活性剤、タンパク質加水分解物の誘導体、高分子界面活性剤、チタン・ケイ素を含む界面活性剤、フッ化炭素系界面活性剤）等。

【0037】

（１１）各種ビタミン類
ビタミンＡ群：レチノール、レチナール（ビタミンＡ１）、デヒドロレチナール（ビタミンＡ２）、カロチン、リコピン（プロビタミンＡ）、ビタミンＢ群：チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、葉酸類、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン類、コリン、イノシトール類、ビタミンＣ群：ビタミンＣ酸又はその誘導体、ビタミンＤ群：エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）、コレカルシフェロール（ビタミンＤ３）、ジヒドロタキステロール、ビタミンＥ群：ビタミンＥ又はその誘導体、ユビキノン類、ビタミンＫ群：フィトナジオン（ビタミンＫ１）、メナキノン（ビタミンＫ２）、メナジオン（ビタミンＫ３）、メナジオール（ビタミンＫ４）、その他、必須脂肪酸（ビタミンＦ）、カルニチン、フェルラ酸、γ－オリザノール、オロット酸、ビタミンＰ類（ルチン、エリオシトリン、ヘスペリジン）、ビタミンＵ等。

【0038】

（１２）各種アミノ酸類
バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシリジン、アルギニン、オルニチン、ヒスチジン等や、それらの硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、或いはピロリドンカルボン酸のごときアミノ酸誘導体等。

【0039】

（１３）植物又は動物系原料由来の種々の添加物
これらは、添加しようとする製品種別、形態に応じて常法的に行われる加工（例えば、粉砕、製粉、洗浄、加水分解、醗酵、精製、圧搾、抽出、分画、ろ過、乾燥、粉末化、造粒、溶解、滅菌、ｐＨ調整、脱臭、脱色等を任意に選択、組み合わせた処理）を行い、各種の素材から任意に選択して供すれば良い。

【0040】

次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例において、各種成分の添加量を示す数値の単位％は、質量％を意味する。

【実施例】

【0041】

［実施例１］
（アルニカ花熱水抽出物の成分分画）
アルニカの花乾燥物を約５０℃の温水に５時間浸漬した。この浸漬を経て得られる溶液を、所定の濾過材（ガラス濾紙、Ｇｆ－７５、ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）とセルロース混合エステルメンブレンフィルタ、Ａ０４５Ａ０４７Ａ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）を用いて濾過した。濾過後の溶液をエバポレーターで濃縮後に凍結乾燥機を用いて粉体とし、アルニカの抽出物として用いた。このアルニカ抽出物を図１に示した分画スキームにより成分分画した。

【0042】

アルニカ花熱水抽出物（２１１．８ｇ）は、蒸留水（５００ｍＬ）に懸濁し、ジエチルエーテル（５×２５０ｍＬ、Ｓ０１）、酢酸エチル（５×２５０ｍＬ、Ｓ０２）、ブタノール（５×２５０ｍＬ、Ｓ０３）を用いてそれぞれ液液分配し、ジエチルエーテル画分（ＤＥＦｒ．３．９ｇ）、酢酸エチル画分（ＥＦｒ．２．８ｇ）、ブタノール画分（ＢＦｒ．１０．８ｇ）及び水画分（ＷＦｒ．収量測定不能）を得た。

【0043】

最も活性の高かったＤＥＦｒ．（３．９ｇ）はシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー（５７ｍｍφ×３５５ｍｍＬ(直径５７ｍｍ、長さ３５５ｍｍ)、Ｓ０４）に供し、ヘキサン：アセトン＝３：１、３：２、１：１を用いて溶出した。溶出液はＴＬＣで分析し、１３画分（ＤＥＦｒ．１～ＤＥＦｒ．１３）を得た。ＤＥＦｒ．９（２８１．９ｍｇ）は分取ＨＰＬＣ（条件１、Ｓ０６）に供し、化合物１（６．４ｍｇ、保持時間１９．７ｍｉｎ）を得た。細画分のうち高い活性がみられたＤＥＦｒ．４（６５９．２ｍｇ）はＬＨ－２０ゲルオープンカラムクロマトグラフィー（２０ｍｍφ×５１５ｍｍＬ、Ｓ０５）に供し、クロロホルム：メタノール＝１：１を用いて溶出した．溶出液はＴＬＣで分析し、７画分（ＤＥＦｒ．４－１～ＤＥＦｒ．４－７）を得た。

【0044】

ＤＥＦｒ．４－２（４６２．６ｍｇ）はシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー（３５ｍｍφ×３６３ｍｍＬ、Ｓ０７）に供し、Ｈｅｘａｎｅ：Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ＝１：１：０．１、１：１：０．３、１：１：１、Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：ＭｅＯＨ＝１：１を用いて溶出した。溶出液はＴＬＣで分析し、１３画分（ＤＥＦｒ．４－２－１～ＤＥＦｒ．４－２－１３）を得た。

【0045】

ＤＥＦｒ．４－２－６（６６．５ｍｇ）は分取ＨＰＬＣ（条件２、Ｓ０９）に供し、化合物２（５．１ｍｇ、保持時間３１．２ｍｉｎ）、化合物３（１３．５ｍｇ、保持時間３１．８ｍｉｎ）、化合物４（１９．３ｍｇ、保持時間３２．０ｍｉｎ）を得た。

【0046】

ＤＥＦｒ．４－２－２（３４８．４ｍｇ）はＯＤＳゲルオープンカラムクロマトグラフィー（３０ ｍｍφ×１１２ｍｍＬ、Ｓ０８）に供し、水：メタノール＝１：１、１：２、０：１を用いて溶出した。溶出液はＴＬＣで分析し、１３画分（ＤＥＦｒ．４－２－２－１～ＤＥＦｒ．４－２－２－１３）を得た。

【0047】

ＤＥＦｒ．４－２－２－４（５０．９ｍｇ）は分取ＨＰＬＣ（条件３、Ｓ１０）に供し、化合物５（５．１ｍｇ、保持時間３０．８ｍｉｎ）、化合物６（１０．８ｍｇ、保持時間３１．６ｍｉｎ）を得た。

【0048】

ＤＥＦｒ．４－２－２－８（７７．２ｍｇ）は分取ＨＰＬＣ（条件４、Ｓ１２）に供し、化合物７（４３．２ｍｇ、保持時間３３．３ｍｉｎ）を得た。

【0049】

ＤＥＦｒ．４－２－２－６、７（８０．９ｍｇ）は分取ＨＰＬＣ（条件５、Ｓ１１）に供し、化合物８（９．５ｍｇ、保持時間３１．６ｍｉｎ）、化合物９（１０．９ｍｇ、保持時間３２．２ｍｉｎ）、化合物１０（１５．９ｍｇ、保持時間３２．５ｍｉｎ）を得た。

【0050】

（単離化合物の構造解析）
化合物１の構造解析
ＤＥＦｒ．９－１（６．４ｍｇ）は重メタノールに溶解し、ＦＴ－ＮＭＲ分析に供した。また、メタノールに溶解し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析に供した。

【0051】

化合物２の構造解析
ＤＥＦｒ．４－２－６－１（５．１ｍｇ）は重アセトン、重クロロホルムに溶解し、ＦＴ－ＮＭＲ分析に供した。また、メタノールに溶解し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析に供した。

【0052】

化合物３の構造解析
ＤＥＦｒ．４－２－６－２（１３．５ｍｇ）は重アセトン、重クロロホルムに溶解し、ＦＴ－ＮＭＲ分析に供した。また、メタノールに溶解し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析に供した。

【0053】

化合物４の構造解析
ＤＥＦｒ．４－２－６－３（１９．１ｍｇ）は重アセトン、重クロロホルムに溶解し、ＦＴ－ＮＭＲ分析に供した。また、メタノールに溶解し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析に供した。

【0054】

化合物５の構造解析
ＤＥＦｒ．４－２－２－４－１（５．１ｍｇ）は重クロロホルムに溶解し、ＦＴ－ＮＭＲ分析に供した。また、メタノールに溶解し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析に供した。

【0055】

化合物６の構造解析
ＤＥＦｒ．４－２－２－４－２（１０．８ｍｇ）は重クロロホルムに溶解し、ＦＴ－ＮＭＲ分析に供した。また、メタノールに溶解し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析に供した。

【0056】

化合物７の構造解析
ＤＥＦｒ．４－２－２－８－１（４３．２ｍｇ）は重クロロホルムに溶解し、ＦＴ－ＮＭＲ分析に供した。また、メタノールに溶解し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析に供した。

【0057】

化合物８の構造解析
ＤＥＦｒ．４－２－２－６－１（９．５ｍｇ）は重クロロホルムに溶解し、ＦＴ－ＮＭＲ分析に供した。また、メタノールに溶解し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析に供した。

【0058】

化合物９の構造解析
ＤＥＦｒ．４－２－２－６－２（１０．９ｍｇ）は重クロロホルムに溶解し、ＦＴ－ＮＭＲ分析に供した。また、メタノールに溶解し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析に供した。

【0059】

化合物１０の構造解析
ＤＥＦｒ．４－２－２－６－３（３．２ｍｇ）は重クロロホルムに溶解し、ＦＴ－ＮＭＲ分析に供した。また、メタノールに溶解し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析に供した。

【0060】

なお、上述の構造解析で用いたサンプルにおける対象化合物の純度を、後述する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析し、その結果を以下表１に示す。

【0061】

【表1】

【0062】

＜高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）＞
装置：ＳＨＩＭＡＤＺＵ
ポンプ：ＬＣ－２０ＡＤ
ダイオードアレイ検出器：ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ
カラムオーブン：ＣＴＯ－２０ＡＤ
システムコントローラ：ＣＢＭ－２０Ａ
デガッサ：ＤＧＵ－２０Ａ
オートサンプラ：ＳＩＬ－２０Ａ
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ－３、５（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍＬ）
注入量：１０μｌ
分析時間：６０ｍｉｎ
検出器波長：２１０～６００ｎｍ
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
グラジエントプログラム：ＭｅＯＨ：０．０５％ＴＦＡａｑ．＝５％：９５％→１００％：０％（４０ｍｉｎ）

【0063】

＜分取高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ＨＰＬＣ）＞
装置：ＪＡＳＣＯ
ポンプ：８８０－ＰＵ
検出器：８７０－ＵＶ
デガッサ：８８０－５１
システムコントローラ：８８０－３０
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ－３、５（２０ｍｍφ×２５０ｍｍＬ）
注入量：３５０μｌ
検出器波長：２８０．０ｎｍ
流速：９．０ｍｌ／ｍｉｎ

【0064】

（条件１）
グラジエントプログラム：ＭｅＯＨ：０．０５％ＴＦＡ ａｑ．＝２５：７５→１００：０（３０ｍｉｎ）

【0065】

（条件２）
グラジエントプログラム：ＭｅＯＨ：０．０５％ＴＦＡ ａｑ．＝６０：４０→８５：１５（３０ｍｉｎ）

【0066】

（条件３）
グラジエントプログラム：ＭｅＯＨ：Ｗａｔｅｒ＝６０：４０（３０ｍｉｎ）

【0067】

（条件４）
グラジエントプログラム：Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ：Ｗａｔｅｒ＝６０：４０→８５：１５（３０ｍｉｎ）

【0068】

（条件５）
グラジエントプログラム：Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ：０．０５％ＴＦＡ ａｑ．＝５０：５０（３０ｍｉｎ）

【0069】

（条件６）
グラジエントプログラム：ＭｅＯＨ：Ｗａｔｅｒ＝６５：３５（３０ｍｉｎ）

【0070】

＜変換核磁気共鳴装置（ＦＴ－ＮＭＲ）＞
装置：ＪＥＯＬ ＥＣ ６００ＭＨｚ（ＪＥＯＬ、ＴＯＫＹＯ、ＪＡＰＡＮ）
溶媒：Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｒ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．ＣＡＳ８６５－４９－６）
Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４（関東化学株式会社、ＣＡＳ２５２２１－９６）
Ａｃｅｔｏｎｅ－ｄ６（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ、ＣＡＳ６６６－５２－４）

【0071】

＜マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ）＞
装置：ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＢＩＯＴＥＣＨ ＡＸＩＭＡ ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ
イオンモード：ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｄｅ
質量範囲：Ｌｏｗ１００＋、Ｌｏｗ３００＋
Ｐｏｗｅｒ：１２０～１５０
マトリクス：２、５－ｄｉｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＤＨＢ）

【0072】

＜旋光度計＞
装置：ＪＡＳＣＯ－Ｐ２３００ ｓｙｓｔｅｍ
溶媒：Ｍｅｔｈａｎｏｌ、Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ

【0073】

それぞれのサンプルについて上記測定により得られた^１３Ｃ－ＮＭＲスペクトル、^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル、ＣＯＳＹスペクトル、ＨＭＢＣスペクトル、ＨＭＱＣスペクトル及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルから推定された化合物１及び化合物３～１０の構造を以下に示す。

【0074】

【化3】

【0075】

（ヒト皮下前駆脂肪細胞の増殖試験）
ヒトの皮下前駆脂肪細胞に対して上記精製画分を添加することにより、細胞増殖が促進されるかどうかを確認した。この評価で用いる各精製画分は、アルニカ花熱水抽出物から回収された質量に基づき、元の抽出物中に存在する割合となるように、表２及び表３に記載のように、調製した。まず、各精製画分をＤＭＳＯに溶解して保存液を作製した。これを３０％ＢＧに０．７５％となるように溶解した後、細胞に対して１０００倍又は３０００倍希釈で添加した。親となるアルニカ花熱水抽出物の粉体は、５０ｍｇを５００μＬの３０％ＢＧに溶解した後、これを３０％ＢＧに０．７５％となるように希釈し、さらにＤＭＳＯを０．７５％となるように添加したものを、細胞に対して１０００倍又は３０００倍希釈で添加した。また、比較対象として、３０％ＢＧに０．７５％となるようにＤＭＳＯを添加したものを調製し、細胞に対して１０００倍又は３０００倍希釈で添加した。

【0076】

【表2】

【0077】

【表3】

【0078】

ヒト皮下前駆脂肪細胞（ロンザ製、ＰＴ－５０２０）を、１０％ＦＢＳを含むＰｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ロンザ製 ＰＴ－８００２）を用いて、９６ウェルプレートに対して１×１０^３（個）／ウェルで撒き、５％ＣＯ_２培養機にて３７℃で１６時間培養した。その後、各精製画分を上記濃度となるように添加し、５％ＣＯ_２培養機にて３７℃で７２時間培養した。培養後、ウェル内の細胞数を測定した。本実験のコントロールとして、各精製画分を含まない抽出溶媒である３０％１、３ブチレングリコールを添加したウェルを設定し、この設定したウェルの細胞数も測定した。この設定したウェルの細胞数を１００として、各精製画分を添加したウェルの細胞数の割合（相対値）を算出した。

【0079】

（ヒト皮下前駆脂肪細胞の分化試験）
前駆脂肪細胞から脂肪細胞に分化することで、細胞内に脂肪滴が貯めこまれることが知られている（肥満研究ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．１，２００７，８４～８６ページ）。ヒトの皮下前駆脂肪細胞に対して上記各精製画分を添加することにより、脂肪細胞への分化が促進されるかどうかを脂肪滴の形成で確認した。この評価で用いる各精製画分は、アルニカ花熱水抽出物から回収された質量に基づき、元の抽出物中に存在する濃度となるように調製し、細胞に対して１０００倍又は３０００倍希釈で添加した。

【0080】

ヒト皮下前駆脂肪細胞（ロンザ製、ＰＴ－５０２０）を、１０％ＦＢＳを含むＰｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ロンザ製、ＰＴ－８００２）を用いて、９６ウェルプレートに対して１×１０^４（個）／ウェルで撒き、５％ＣＯ_２培養機にて３７℃で１６時間培養した。顕微鏡による目視でコンフルエントになっていることを確認後、分化誘導培地（ロンザ製、ＰＴ－８００２）をロンザ社の推奨の１／２倍濃度で添加した。その際に、各精製画分を上記濃度となるように添加し、５％ＣＯ_２培養機にて３７℃で１０日間培養した。脂肪滴の蓄積を顕微鏡による目視で確認後、培養液を抜き取り、ウェルをＰＢＳで二回洗浄した。細胞を１０％中性緩衝ホルマリン（和光純薬製、０６２－０１６６１）で固定後、６０％イソプロピルアルコールに飽和溶解させたオイルレッドＯ（和光純薬製、１５４－０２０７２）を用いて、脂肪滴を染色した。精製水でウェルを洗浄後、１００％イソプロピルアルコールを用いて、染色された脂肪滴を抽出し、吸光度５１０ｎｍを測定した。各精製画分の代わりに抽出溶媒である３０％の１、３ブチレングリコールを上記濃度となるように添加したウェルの吸光度値を１として、アルニカの抽出物を添加したウェルの吸光度の割合（相対値）を算出し、分化の割合（相対値）とした。

【0081】

その結果を図２～４に示す。図２～４において、「Ｐａｒｅｎｔは、精製原料として用いたアルニカ花熱水抽出物」、「Ｃｏｎｔは、３０％の１、３ブチレングリコール」、を表す。図２の結果より、アルニカ抽出物を、ジエチルエーテル抽出（Ｓ０１）した画分ＤＥＦｒ．及びこの画分をシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー分画（Ｓ０４）したＤＥＦｒ．４画分に、ヒト皮下前駆脂肪細胞の増殖及び分化促進活性が見出された。そこで、ＤＥＦｒ．４画分をさらにシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィー及び分取ＨＰＬＣで分画した。得られた分画（表３に記載の、ＤＥＦｒ．２、Ｃｍｐｄ１、Ｃｍｐｄ３、Ｃｍｐｄ４、Ｃｍｐｄ５、Ｃｍｐｄ６、Ｃｍｐｄ７、Ｃｍｐｄ８、Ｃｍｐｄ９及びＣｍｐｄ１０）について、上記方法により測定した結果を図３に示す。図３の結果より、Ｃｍｐｄ７（化合物７を含有）、Ｃｍｐｄ８（化合物８を含有）及びＣｍｐｄ９（化合物９を含有）がヒト皮下前駆脂肪細胞の増殖及び分化促進活性を有することが分かった。Ｃｍｐｄ７の１０００倍希釈でヒト皮下前駆脂肪細胞の増殖活性が低下している理由は、この化合物の有する細胞毒性に起因すると考えられる。

【0082】

そこで、Ｃｍｐｄ７（化合物７を含有）、Ｃｍｐｄ８（化合物８を含有）及びＣｍｐｄ９（化合物９を含有）を単独で又はそれぞれ混合した場合のヒト皮下前駆脂肪細胞の増殖試験及び分化試験の結果を図４に示す。なお、図４において、「Ｃｍｐｄ７＋８」はＣｍｐｄ７及びＣｍｐｄ８を共に添加、「Ｃｍｐｄ７＋９」はＣｍｐｄ７及びＣｍｐｄ９を共に添加、「Ｃｍｐｄ８＋９」はＣｍｐｄ８及びＣｍｐｄ９を共に添加、「Ｃｍｐ７＋８＋９」はＣｍｐｄ７とＣｏｍｐ８とＣｍｐｄ９を共に添加、を示す。図４の結果より、Ｃｍｐｄ８とＣｍｐｄ９の組み合わせが、ヒト皮下前駆脂肪細胞の増殖及び分化促進の両方において最も強い活性を示すことが分かった。なお、図２～４において、＊はＣｏｎｔに対し、ダネット検定（片側のみ）によりｐ＜０．０５の有意差を有し、＊＊は、同じくＣｏｎｔに対し、ダネット検定（片側のみ）によりｐ＜０．０１の有意差を有することを示す。

【0083】

［実施例２］
実施例１で得たジエチルエーテル可溶部をシリカゲルオープンカラムクロマトグラフィーで分画した１３画分（ＤＥＦｒ．１～ＤＥＦｒ．１３）のうち、ＤＥＦｒ．３及びＤＥＦｒ．５～８の各画分をさらに精製し、新たな化合物１２～１９を単離した。この新たな化合物を単離するための分画スキームを図５に示す。

【0084】

ＤＥＦｒ．３（３４０．０ｍｇ）はＯＤＳゲルオープンカラムクロマトグラフィー（３０ｍｍφ×１１２ｍｍＬ、Ｓ１４）に供し、水：メタノール＝３：２を用いて溶出した。細画分のうち活性がみられたＤＥＦｒ．３－８（１５６．０ｍｇ）は分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル：水＝３９：６１、Ｓ１５）に供し化合物１７（８．３ｍｇ）を得た。一方、得られた画分ＤＥＦｒ．３－８－５をさらに分取ＨＰＬＣ（ヘキサン：２－プロパノール＝９０：１０、Ｓ１６）に供し化合物１６（１５．８ｍｇ）を得た。

【0085】

ＤＥＦｒ．５（５０４．６ｍｇ）はＬＨ－２０ゲルオープンカラムクロマトグラフィー（２０ｍｍφ×５１５ｍｍＬ、Ｓ１７）に供し、メタノール：クロロホルム＝３：２を用いて溶出した。溶出液はＴＬＣで分析し、２つの画分（ＤＥＦｒ．５－２及びＤＥＦｒ．５－３）を得た。この画分ＤＥＦｒ．５－２（１６７．０ｍｇ）は、分取ＨＰＬＣ（メタノール：水＝４５：５５、Ｓ１８）に供し、化合物１３（１１．２ｍｇ）を得た。一方、得られた画分ＤＥＦｒ．５－２－１をさらに分取ＨＰＬＣ（アセトニトリル：水＝３０：７０、Ｓ１９）に供し化合物１４（２．１ｍｇ）を得た。画分ＤＥＦｒ．５－３（１３０．１ｍｇ）は、ＯＤＳゲルオープンカラムクロマトグラフィー（Ｓ２０）に供した。水：メタノール＝２：３、１：１及び１：０を用いてそれぞれ溶出した。得られた画分ＤＥＦｒ．５－３－２３（５．０ｍｇ）をさらに分取ＨＰＬＣ（メタノール：水＝４０：６０、Ｓ２１）に供し化合物１５（２．９ｍｇ）を、画分ＤＥＦｒ．５－３－４（４０．０ｍｇ）をさらに分取ＨＰＬＣ（メタノール：水＝２５：７５、Ｓ２２）に供し化合物１５（１３．４ｍｇ）を得た。

【0086】

ＤＥＦｒ．６（２９９．０ｍｇ）はＯＤＳゲルオープンカラムクロマトグラフィー（３０ｍｍφ×１１２ｍｍＬ、Ｓ２３）に供し、水：メタノール＝１：１、１：２、０：１を用いて溶出した。得られた画分ＤＥＦｒ．６－３（５９．１ｍｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、クロロフォルム：メタノール＝２０：１で溶出し（Ｓ２４）、1つの溶出画分ＤＥＦｒ．６－３－１（４０．０ｍｇ）をさらに分取ＨＰＬＣ（メタノール：水＝４０：６０、Ｓ２５）に供し化合物１２（９．５ｍｇ）を得た。

【0087】

ＤＥＦｒ．７（５１５．０ｍｇ）は、ＬＨ－２０ゲルオープンカラムクロマトグラフィー（２０ｍｍφ×５１５ｍｍＬ、Ｓ０５）に供し、クロロホルム：メタノール＝１：１を用いて溶出した．溶出液はＴＬＣで分析し、６画分（ＤＥＦｒ．７－１～ＤＥＦｒ．７－６）を得た。ＤＥＦｒ．７－４（３２．０ｍｇ）は分取ＨＰＬＣに供し、メタノール：水（０．０５％ＴＦＡ）＝３０：７０、Ｓ２７）で溶出して化合物１８（１８．２ｍｇ）を得た。

【0088】

ＤＥＦｒ．８（５４８．２ｍｇ）は、ＬＨ－２０ゲルオープンカラムクロマトグラフィー（２０ｍｍφ×５１５ｍｍＬ、Ｓ０５）に供し、クロロホルム：メタノール＝１：１を用いて溶出した。得られた1つの画分ＤＥＦｒ．８－７（２５．３ｍｇ）を分取ＨＰＬＣに供し、メタノール：水（０．０５％ＴＦＡ）＝２５：７５、Ｓ２９）で溶出して化合物１９（１１．３ｍｇ）を得た。

【0089】

（単離化合物の構造解析）
実施例１と同様の方法により、^１３Ｃ－ＮＭＲスペクトル、^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル、ＣＯＳＹスペクトル、ＨＭＢＣスペクトル、ＨＭＱＣスペクトル及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルから推定された化合物１１～１９の構造を以下に示す。

【0090】

【化4】

【0091】

実施例1と同様の方法により、ヒト皮下前駆脂肪細胞の増殖試験及び分化試験を行った。その結果を以下の表４及び図６に示す。表４及び図６において、サンプル名として記載した「ＫＳ００１９」と「ＫＳ００２０」は、それぞれロットの異なるアルニカ抽出液を表す。「ＢＧ／ＤＭＳＯ」は、精製画分を含まない抽出溶媒である３０％１、３ブチレングリコールとＤＭＳＯを添加した群を表す。Ｃｍｐｄ１１～Ｃｍｐｄ１９は、それぞれ化合物１１～１９を含有する。いずれのサンプルも化合物の濃度がアルニカ抽出液中と同じになるように濃度調整して、細胞に１０００倍希釈で添加した。

【0092】

【表4】

【0093】

表４及び図６の結果より、Ｃｍｐｄ１２（化合物１２を含有）及びＣｍｐｄ１３（化合物１３を含有）がヒト皮下前駆脂肪細胞の分化を有意に促進した。
なお、図６において、＊はＢＧ／ＤＭＳＯに対し、ダネット検定（片側のみ）によりｐ＜０．０５の有意差を有し、＊＊は、同じくＢＧ／ＤＭＳＯに対し、ダネット検定（片側のみ）によりｐ＜０．０１の有意差を有し、＊＊＊は、同じくＢＧ／ＤＭＳＯに対し、ダネット検定（片側のみ）によりｐ＜０．００１の有意差を有することを示す。

【産業上の利用可能性】

【0094】

本発明の前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進剤は、化粧品、食品、医薬品等、及び／又はこれらに配合する素材として産業上利用することができる。

【要約】

【課題】アルニカ抽出物に含まれる前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化を促進する化合物を見出し、この化合物を用いて脂肪層をボリュームアップさせて外観美を創り出すための化粧品、食品、医薬品等、及び／又はこれらに配合する素材を提供する。
【解決手段】下記式（Ｉ）：

（式中、Ｒは、水素原子又は炭素数１～５のアシル基である。）で表される化合物を有効成分として含有する、前駆脂肪細胞の増殖及び／又は分化促進剤。
【選択図】図１

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】