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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-08
(45)【発行日】2024-03-18
(54)【発明の名称】腫瘍特異的細胞枯渇のための抗ＣＤ２５
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20240311BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240311BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240311BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240311BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240311BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240311BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240311BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240311BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240311BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240311BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C12P21/08
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K16/28
A61K39/395 T
A61P35/02
【請求項の数】
29
(21)【出願番号】P 2020547399
(86)(22)【出願日】2019-03-13
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-12-09
(86)【国際出願番号】 EP2019056249
(87)【国際公開番号】W WO2019175217
(87)【国際公開日】2019-09-19
【審査請求日】2022-03-10
(31)【優先権主張番号】62/642232
(32)【優先日】2018-03-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】PCT/EP2018/056312
(32)【優先日】2018-03-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】62/642248
(32)【優先日】2018-03-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/642218
(32)【優先日】2018-03-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/642230
(32)【優先日】2018-03-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/642243
(32)【優先日】2018-03-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】1804027.9
(32)【優先日】2018-03-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】1804028.7
(32)【優先日】2018-03-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】1804029.5
(32)【優先日】2018-03-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】519328637
【氏名又は名称】タスク セラピューティクス リミテッド
(73)【特許権者】
【識別番号】598176569
【氏名又は名称】キャンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】グビエ アンヌ
(72)【発明者】
【氏名】ゴイエンチェア コルソ ベアトリス
(72)【発明者】
【氏名】サリム ジョセフィン
(72)【発明者】
【氏名】モウルダー ケヴィン
(72)【発明者】
【氏名】メルヒールス パスカル
(72)【発明者】
【氏名】ブラウン マーク
(72)【発明者】
【氏名】ゲーガン ジェームズ
(72)【発明者】
【氏名】プリンツ ビアンカ
(72)【発明者】
【氏名】ケサダ セルジオ
【審査官】大久保 智之
(56)【参考文献】
【文献】特表２０２０－５１４３６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】Cancer Research，2000年，60，6977-6984
【文献】Journal of Oncology，2009年，Article ID 963037，p. 1-8
【文献】Crinical Cancer Research，2010年，16，5067-5078
【文献】Journal of Experimental Medicine，194，2001年，823-832
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ１２Ｋ
Ａ６１Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）可変重鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４）、可変重鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号２）、可変重鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号３）、可変軽鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号６）、可変軽鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号７）、及び可変軽鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号８）、ｂ）可変重鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４）、可変重鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１０）、可変重鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１２）、可変軽鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号６）、可変軽鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号７）、及び可変軽鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号８）、
ｃ）可変重鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４）、可変重鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１１）、可変重鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１３）、可変軽鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号６）、可変軽鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号７）、及び可変軽鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号８）、
ｄ）可変重鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４）、可変重鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１１）、可変重鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１４）、可変軽鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号６）、可変軽鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号７）、及び可変軽鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号８）、
ｅ）可変重鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４）、可変重鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１１）、可変重鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１２）、可変軽鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号６）、可変軽鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号７）、及び可変軽鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号８）、又は
ｆ）可変重鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４）、可変重鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１１）、可変重鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１５）、可変軽鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号６）、可変軽鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号７）、及び可変軽鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号８）
を含む抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項2】
ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号５）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１６）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１７）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１８）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１９）、及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号２０）から選択される配列を含む可変重鎖を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項3】
ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項4】
モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメント、又は一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項5】
前記抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４アイソタイプ抗体からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項6】
二重特異性抗体、多重特異性抗体、又は治療剤若しくは診断剤を更に含む免疫複合体に含まれる、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項7】
ＣＤ２５へのインターロイキン－２（ＩＬ－２）の結合を阻害しない、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項8】
ＣＤ２５を介したインターロイキン－２（ＩＬ－２）のシグナル伝達を阻害しない、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項9】
脱フコシル化された、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項10】
ａ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号５）を含む可変重鎖及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖；ｂ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１６）を含む可変重鎖及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖；
ｃ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１７）を含む可変重鎖及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖；
ｄ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１８）を含む可変重鎖及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖；
ｅ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１９）を含む可変重鎖及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖；又は、
ｆ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号２０）を含む可変重鎖及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖；
を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子。
【請求項12】
請求項１１に記載の核酸分子を含む核酸ベクター。
【請求項13】
請求項１２に記載の核酸ベクターを含む宿主細胞。
【請求項14】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを作製する方法であって、請求項１３に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項15】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物。
【請求項16】
薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を更に含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
癌の治療に使用される、請求項１５又は１６に記載の組成物。
【請求項18】
第２の作用物質が同時に又は任意の順序で順次に投与されることを更に特徴とする、請求項１７に記載の組成物。
【請求項19】
前記第２の作用物質が免疫チェックポイント阻害剤又は癌ワクチンである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
前記第２の作用物質が免疫チェックポイント阻害剤であり、該免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ－１アンタゴニストである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項21】
前記ＰＤ－１アンタゴニストが抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項22】
前記癌が固形腫瘍を含む、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項23】
前記癌が血液癌腫瘍を含む、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項24】
腫瘍中の制御性Ｔ細胞を枯渇させるための組成物であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、組成物。
【請求項25】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項26】
前記腫瘍が血液癌腫瘍である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項27】
容器内に請求項１５又は１６に記載の組成物を含むキット。
【請求項28】
抗ＣＤ２５抗体を作製する方法であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体を準備することと、該抗体を親和性成熟に供することとを含み、作製される抗ＣＤ２５抗体がＣＤ２５に対して親抗体よりも大きな親和性を有する、方法。
【請求項29】
医薬組成物を作製する方法であって、請求項２８に記載の方法に従って作製された抗体を準備することと、該抗体と少なくとも１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤とを共配合することとを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ２５抗体を含む医薬組成物、及びかかる抗体の治療的使用に関する。
【背景技術】
【0002】
癌免疫療法は、癌を治療又は予防するために被験体自身の免疫系の使用を伴う。免疫療法は、癌細胞が表面上に免疫系によって検出され得る微妙に異なる分子を有することが多いという事実を利用する。これらの分子、すなわち癌抗原は、最も一般的にはタンパク質であるが、炭水化物等の分子も含まれる。このため、免疫療法は、これらの標的抗原を介して腫瘍細胞を攻撃するように免疫系を誘発することを含む。しかしながら、悪性腫瘍、特に固形腫瘍は、腫瘍細胞に固有であり、かつ腫瘍微小環境の構成要素によって媒介される様々な機構を用いて免疫監視を免れることができる。後者の中でも、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞又はＴｒｅｇ）による腫瘍浸潤、より具体的には、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）対Ｔｒｅｇの好ましくないバランス（すなわち、ＴｅｆｆのＴｒｅｇに対する低い比率）が決定的因子として提唱されている（非特許文献１）。
【0003】
Ｔｒｅｇは、その発見以来、免疫恒常性を媒介し、末梢性トレランスの確立及び維持を促進するのに重要であることが見出されている。しかしながら、癌の状況下でのＴｒｅｇの役割は、より複雑である。癌細胞が自己抗原及び腫瘍関連抗原の両方を発現することから、エフェクター細胞応答を抑えようとするＴｒｅｇの存在は、腫瘍の進行に寄与し得る。したがって、定着腫瘍におけるＴｒｅｇの浸潤は、効果的な抗腫瘍応答及び癌治療の全般に対する主な障害の１つである。Ｔｒｅｇによって用いられる抑制機構は、現行の療法、特に抗腫瘍応答の誘導又は強化に依存する免疫療法の制限又は更には失敗に大きく寄与すると考えられる（非特許文献２）。
【0004】
Ｔｒｅｇ細胞がマウスモデルにおいて腫瘍の定着及び進行に寄与し、Ｔｒｅｇ細胞の欠如が腫瘍進行を遅らせることが一貫して実証されている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。ヒトにおいては、Ｔｒｅｇ細胞による高い腫瘍浸潤、より重要なことには、エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞のＴｒｅｇ細胞に対する低い比率が、複数の癌での転帰不良と関連付けられる（非特許文献８）。逆に、高いＴｅｆｆ／Ｔｒｅｇ細胞比は、ヒト及びマウスの両方で免疫療法に対する好ましい応答と関連付けられる（非特許文献９、非特許文献１０）。それにもかかわらず、腫瘍におけるＴｒｅｇの枯渇は複雑であり、この領域における前臨床研究及び臨床研究の結果は、主にＴｒｅｇに特異的な標的の特定の難しさから一貫していない。
【0005】
ＣＤ２５は、Ｔｒｅｇの枯渇を達成する可能性がある分子標的の１つである。実際、インターロイキン－２高親和性受容体α鎖（ＩＬ－２Ｒα）としても知られるＣＤ２５は、Ｔｒｅｇ細胞上では高レベルで構成的に発現され、Ｔエフェクター細胞上では存在しないか又は低レベルで発現されるため、Ｔｒｅｇ枯渇の有望な標的である。ＩＬ－２／ＣＤ２５相互作用は、殆どがラット抗マウスＣＤ２５抗体であるＰＣ６１の使用を伴う、マウスモデルにおける幾つかの研究の対象とされている（非特許文献１１）。この抗体のＣＤ２５結合及び機能活性が、異なる著者によって生成されたモノクローナル抗体のパネルと比較されている（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）。元の研究では、ＰＣ６１の治療活性ではなく予防活性が実証されているが、最近の研究から、この抗ＣＤ２５抗体のＦｃ最適化型が幾つかのマウス腫瘍モデルにおいて腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇につながり、有意な治療的有用性をもたらすことが示された（非特許文献１６）。
【0006】
ＰＣ６１等の利用可能な抗ＣＤ２５抗体は、多くの他の抗マウスＣＤ２５抗体及び抗ヒトＣＤ２５抗体として開示されている殆どの抗体と同様、ＣＤ２５へのＩＬ－２の結合を遮断又は阻害する。例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４及び特許文献５を参照されたい。例えば、バシリキシマブ及びダクリズマブは、ＣＤ２５へのＩＬ－２の結合を阻害し、Ｔエフェクター細胞の活性化を低減するように開発されている抗ヒトＣＤ２５抗体である（非特許文献１７及び非特許文献１８）。バシリキシマブは、移植片対宿主病に現在認可されているキメラマウス－ヒトＣＤ２５抗体であり、ダクリズマブは、多発性硬化症の治療に認可されているヒト化ＣＤ２５抗体である。
【0007】
クローン７Ｄ４（抗マウスＣＤ２５）、クローン２Ｅ４（抗マウスＣＤ２５）、クローンＭＡ２５１（抗ヒトＣＤ２５）又は７Ｇ７Ｂ６（抗ヒトＣＤ２５）等の他の幾つかの抗ＣＤ２５抗体は、依然としてＣＤ２５へのＩＬ－２の結合を可能にする（すなわち、非遮断抗体）。イノリモマブ（Inolimomab）／ＢＴ５３６は、ＣＤ２５へのＩＬ－２の結合を遮断しないとされているが、ＣＤ２５を介したＩＬ－２のシグナル伝達を遮断する。７Ｄ４は、ＰＣ６１又は同様の結合特性を有する抗体の存在下で又はそれによる処理後にＣＤ２５陽性細胞を検出するために広く使用されているラットＩｇＭ抗マウスＣＤ２５抗体である（非特許文献６）。単独での又はＰＣ６１と比較した７Ｄ４－ＩｇＭ抗体の任意の機能特性を開示している文献は極めて少ない（非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献１１、非特許文献２３）。実際、改善された抗体、特に癌療法に使用することができる抗体を得るために７Ｄ４のアイソタイプ又は他の構造的特徴を適合させるか又は何らかの形で変更する可能性は、従来技術では教示されていない。７Ｄ４－ＩｇＭ（それ自体で又は改変抗体として）、又はマウスＣＤ２５に対する７Ｄ４の結合特徴と同様のＣＤ２５結合特徴を有するように設計若しくは特性評価された、任意の抗ヒトＣＤ２５の能力は、Ｔｒｅｇ細胞の最適化枯渇に関して詳細に評価されていない。
【0008】
上記で論考されるように、腫瘍におけるＴｒｅｇ細胞の浸潤、特にエフェクターＴｅｆｆ細胞のＴｒｅｇ細胞に対する低い比率は、臨床転帰不良を引き起こし得る。ＣＤ２５は、Ｔｒｅｇマーカーとして特定されているため、Ｔｒｅｇを枯渇させることを目的とする治療用抗体の興味深い標的となる可能性がある。重要なことには、ＣＤ２５は、ＩＬ－２の受容体のαサブユニットであり、ＩＬ－２は、Ｔｅｆｆ応答にとって重要なサイトカインである。これまで臨床試験が行われた抗ＣＤ２５抗体は、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させる一方で、ＣＤ２５（特にＣＤ２５／ＣＤ１２２／ＣＤ１３２複合体）を介したＩＬ－２シグナル伝達を遮断する。本発明者らは今回、このようなＩＬ－２シグナル伝達の遮断がＴｅｆｆ応答を制限し、ＩＬ２シグナル伝達を遮断しない抗ＣＤ２５抗体が、ＩＬ－２がＴｅｆｆ細胞を刺激することを可能にしながら、Ｔｒｅｇ細胞を効果的に枯渇させ、強い抗癌効果を示す抗体を提供する可能性があることを見出した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】国際公開第２００４／０４５５１２号
【文献】国際公開第２００６／１０８６７０号
【文献】国際公開第１９９３／０１１２３８号
【文献】国際公開第１９９０／００７８６１号
【文献】国際公開第２０１７／１７４３３１号
【非特許文献】
【0010】
【文献】Smyth M et al., 2014
【文献】Onishi H et al; 2012
【文献】Elpek et al., 2007
【文献】Golgher et al., 2002
【文献】Jones et al., 2002
【文献】Onizuka et al., 1999
【文献】Shimizu et al., 1999
【文献】Shang et al., 2015
【文献】Hodi et al., 2008
【文献】Quezada et al., 2006
【文献】Setiady Y et al., 2010
【文献】Lowenthal J.W et al., 1985
【文献】Moreau, J.-L et al.
【文献】Volk HD et al., 1989
【文献】Dantal J et al., 1991
【文献】Vargas A et al., 2017
【文献】Queen C et al, 1989
【文献】Bielekova B, 2013
【文献】Kohm A et al., 2006
【文献】Hallett W et al., 2008
【文献】Fecci P et al., 2006
【文献】McNeill A et al., 2007
【文献】Couper K et al., 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
このため、当該技術分野では、改善された抗ＣＤ２５抗体、特にＩＬ－２へのＣＤ２５の結合又はＩＬ－２シグナル伝達を遮断せず、Ｔｒｅｇを特に腫瘍内で枯渇させ、癌の治療方法に使用することができる抗ＣＤ２５抗体が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明は、新たな抗ＣＤ２５抗体剤を提供する。幾つかの実施の形態では、提供される抗ＣＤ２５抗体剤は、ＣＤ２５へのインターロイキン２（ＩＬ－２）の結合又はＣＤ２５を介したＩＬ－２のシグナル伝達を遮断することなくＣＤ２５、特にヒトＣＤ２５に特異的に結合し、Ｔｒｅｇを特に腫瘍内で効率的に枯渇させる抗体又は抗原結合フラグメントである。この抗ＣＤ２５抗体剤は、抗ＣＤ２５抗体剤の非存在下でのシグナル伝達のレベルと比較して、ＣＤ２５へのＩＬ－２結合に応答したＩＬ－２シグナル伝達を少なくとも５０％可能にする。したがって、この抗ＣＤ２５抗体剤は、非遮断又は非ＩＬ－２遮断抗ＣＤ２５抗体剤と称される。
【0013】
幾つかの実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体剤又は抗原結合フラグメントは、ＣＤ２５へのＩＬ－２の結合又はＣＤ２５を介したＩＬ－２のシグナル伝達を遮断することなくＣＤ２５に結合する。すなわち、幾つかの実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体は、抗体の非存在下でのＩＬ－２シグナル伝達と比較して５０％未満のＩＬ－２シグナル伝達を阻害する。抗ＣＤ２５抗体は、ＣＤ２５へのＩＬ－２の結合又はそのシグナル伝達を遮断することなくＣＤ２５への結合を可能にする構造要素を特徴とする。
【0014】
驚くべきことに、ＩＬ－２結合又はＣＤ２５を介したシグナル伝達を遮断せず、Ｔｒｅｇを枯渇させる抗ＣＤ２５抗体が強い抗腫瘍効果を有し、特にＴｒｅｇを枯渇させるが、ＩＬ－２シグナル伝達を遮断する抗ＣＤ２５抗体よりも強い抗腫瘍効果を有することが見出された。この抗体は、ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比及びＣＤ８＋Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比を増大させた。Ｔｅｆｆ細胞に対するＩＬ－２シグナル伝達を維持した上での腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ細胞の効果的な枯渇は、単独で又は他の抗癌剤と組み合わせて癌の治療に用いられる治療アプローチにつながる。
【0015】
しかしながら、当業者には、提供される抗体又はその抗原結合フラグメントの特定の作用機構によって本開示の教示が限定されないことが理解される。提供される抗体の関連した構造的及び／又は機能的特徴は、本明細書に記載されており、自明である。
【0016】
幾つかの実施の形態では、提供される抗ＣＤ２５抗体剤は、ヒトＣＤ２５細胞外ドメイン中の特異的エピトープへの結合と関連付けられ、及び／又は抗ＣＤ２５抗体剤を薬学的使用及び／又は製造に特に適したものとする１つ以上の特徴を特徴とする。
【0017】
提供される抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、提供される抗体又はその抗原結合フラグメント）、抗ＣＤ２５抗体剤を含む組成物、及び／又は抗ＣＤ２５抗体剤の使用を含む提供される技術は、医学に有用である。幾つかの実施の形態では、このような提供される技術は、癌の療法及び／又は予防法に有用である。
【0018】
幾つかの実施の形態では、提供される抗ＣＤ２５抗体剤は、ａＣＤ２５－ａ－６４６の配列を有する抗体、より一般には、１つ以上の抗原結合フラグメント又はその一部であるか又はそれを含み、例えば可変重鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、及び／又は幾つかの実施の形態では、ａＣＤ２５－ａ－６４６ ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２配列の一方又は両方を含む抗体又は抗体剤によって例示される。本明細書の抗ＣＤ２５抗体剤、例えばａＣＤ２５－ａ－６４６への言及には、文脈からそうではないことが示唆されていない限り、親和性成熟変異体ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４、及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５を含むその変異体が含まれる。
【0019】
一実施の形態では、ａＣＤ２５－ａ－６４６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む抗ＣＤ２５抗体剤が提供される。別の実施の形態では、ａＣＤ２５－ａ－６４６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む抗ＣＤ２５抗体剤が提供される。別の実施の形態では、ａＣＤ２５－ａ－６４６の可変重鎖アミノ酸配列を含む抗ＣＤ２５抗体剤が提供される。別の実施の形態では、ａＣＤ２５－ａ－６４６又はその変異体（例えば、親和性成熟変異体）の可変重鎖及び可変軽鎖アミノ酸配列を含む抗ＣＤ２５抗体剤が提供される。親和性成熟変異体ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４、及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５をベースとする同等の抗ＣＤ２５抗体剤も特に企図される。
【0020】
幾つかの実施の形態では、ヒトＣＤ２５細胞外ドメインへの結合についてａＣＤ２５－ａ－６４６（又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体若しくは変異体（親和性成熟変異体を含む））と競合する抗ＣＤ２５抗体剤が提供される。
【0021】
幾つかの実施の形態では、提供される抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、親和性成熟変異体等のその変異体及び誘導体を含む、提供される抗体又はその抗原結合フラグメント）は、１０－７Ｍ以下の範囲（例えば、１０－８Ｍ又は１０－９Ｍ又は１０－１０Ｍ又は１０－１１Ｍ又は１０－１２Ｍ又は１０－１３Ｍの範囲）のＫｄでヒトＣＤ２５に結合する。幾つかの実施の形態では、提供される抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、親和性成熟変異体等のその変異体及び誘導体を含む、提供される抗体又はその抗原結合フラグメント）は、１０－７Ｍ～１０－１０Ｍ又は１０－７Ｍ～１０－９ＭのＫｄ値でヒトＣＤ２５に結合する。
【0022】
幾つかの実施の形態では、提供される抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、その変異体及び誘導体を含む、提供される抗体又はその抗原結合フラグメント）は、ａＣＤ２５－ａ－６４６（又はその抗原結合フラグメント若しくは誘導体若しくは変異体）が結合するヒトＣＤ２５上のエピトープに結合する。幾つかの実施の形態では、このような提供される抗ＣＤ２５抗体剤は、ヒトＣＤ２５細胞外ドメインに結合し得る。幾つかの実施の形態では、提供される抗ＣＤ２５抗体剤は、（例えば、本明細書に記載されるか又はそうでなければ当該技術分野で既知の１つ以上のアッセイを用いて評定した場合に）ＣＤ２５のエピトープ、特にａＣＤ２５ｅｐ－ａとして特定されるものに結合し得る。幾つかの実施の形態では、提供される抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト及び非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）のＣＤ２５（例えば、ヒト及び／又はカニクイザルＣＤ２５上の細胞外エピトープ）に１０－７Ｍ範囲以下、例えば１０－８Ｍ又は１０－９Ｍ又は１０－１０Ｍ又は１０－１１Ｍ又は１０－１２Ｍ又は１０－１３Ｍの範囲のＫｄ値で結合し得る。幾つかの実施の形態では、提供される抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、親和性成熟変異体等のその変異体及び誘導体を含む、提供される抗体又はその抗原結合フラグメント）は、１０－７Ｍ～１０－１０Ｍ又は１０－７Ｍ～１０－９ＭのＫｄ値でヒトＣＤ２５に結合する。
【0023】
特に、本開示は、本明細書に記載される特に有用な抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合フラグメント）（例えば、ヒトＣＤ２５（例えば、その細胞外エピトープ）への特異的結合、本明細書に記載される１つ以上のＣＤＲ配列要素の組込み（特に、任意にＨＣＤＲ１及び／又はＨＣＤＲ２要素と組み合わせたＨＣＤＲ３配列要素の組込み）、本明細書に記載されるＩＬ－２シグナル伝達活性、本明細書に記載される細胞毒性活性（例えば、免疫制御性細胞又はＣＤ２５発現癌細胞等のＣＤ２５陽性細胞に対する）への影響及びそれらの組合せ等の或る特定の構造的及び／又は機能的特徴を特徴とする抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合フラグメント）を特定及び／又は特性評価するために利用することができる手順を提供する。幾つかの実施の形態では、本明細書に記載される特に有用な抗ＣＤ２５抗体は、複数のかかる特徴を特徴とする。幾つかの実施の形態では、本明細書に記載される１つ以上の抗体は、抗ＣＤ２５抗体剤として特徴付けられ得る。
【0024】
このため、本明細書で例示されるように、ａＣＤ２５－ａ－６４６配列（特にａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３及び／又はａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ３）を含む或る特定の抗体及び／又は抗原結合フラグメントは、このような望ましい構造的及び／又は機能的特徴を特徴とする。かかる抗体及び／又はその抗原結合フラグメントは、本明細書で抗ＣＤ２５抗体剤と称され得る。さらに、本開示に従うと、ａＣＤ２５－ａ－６４６と競合する抗体及びその抗原結合フラグメントは、特に有用な抗体である可能性がある。かかる抗体及び／又はその抗原結合フラグメントも本明細書で抗ＣＤ２５抗体剤と称され得る。
【0025】
本明細書に記載される抗体（及び／又はその抗原結合フラグメント）は、医学（例えば、療法及び／又は予防法、例えば癌の治療）に特に有用であり、及び／又はヒトＣＤ２５細胞外ドメイン内のエピトープ、例えばａＣＤ２５ｅｐ－ａとして特定されるものの標的化を要する又は伴う方法に対して使用することができる。提供される抗体又はその抗原結合フラグメントは、最も適切なアイソタイプ、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４アイソタイプ抗体からなる群のヒトアイソタイプ、特にヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ２、好ましくはヒトＩｇＧ１を呈するように作製することができる。
【0026】
一態様では、本発明は、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列及びそれを含むポリペプチド、例えば可変重鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４）を含む抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。幾つかの実施の形態では、かかる抗体又は抗原結合フラグメントは、ａＣＤ２５－ａ－アミノ酸配列要素、例えば、
ａ）可変重鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号２）、及び／又は、
ｂ）可変重鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号３）、
を更に含むことを更に特徴とし得る。
ａ）可変重鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号２）、及び／又は、
ｂ）可変重鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号３）、
を更に含むことを更に特徴とし得る。
【0027】
幾つかの実施の形態では、提供される抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記で規定される可変重鎖相補性決定領域（すなわち、ａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列要素）を、特にそれらの結合及び機能特性が正確に発揮されるように更に正確な順序で、特にａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号５）に含まれるもののような抗体フレーム配列を隔てて含み得る。例えば、幾つかの実施の形態では、提供される抗体又はその抗原結合フラグメントは、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号５）と、任意に、
ａ）可変軽鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号６）、
ｂ）可変軽鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号７）、及び、
ｃ）可変軽鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号８）と、
を含み得る。
ａ）可変軽鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号６）、
ｂ）可変軽鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号７）、及び、
ｃ）可変軽鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号８）と、
を含み得る。
【0028】
このため、幾つかの実施の形態では、本発明は、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号５）を含む可変重鎖を含む単離抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。かかる単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、実施例に記載されるように、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖を更に含むのが好ましい。さらに、ａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列は、上記で規定されるａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列要素に対する多数の置換によって規定される抗体配列も指す。例えば、かかる配列は、可変重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）として、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３（配列番号４）内に１個、２個、３個、４個又はそれ以上のアミノ酸置換を有する配列を含み得る。更なる実施の形態では、ａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列は、可変重鎖相補性決定領域１、２及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）として、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ１（配列番号２）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ２（配列番号３）及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３（配列番号４）内に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のアミノ酸置換を有する配列、より好ましくはａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ１２３（配列番号５）内に１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のアミノ酸置換を有する配列を含む抗体配列も指す。かかるａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列要素及びかかる置換を呈する抗体は、依然としてａＣＤ２５－ａ－６４６、概して抗ＣＤ２５抗体剤の結合特性及び／又は機能特性を呈することができる。
【0029】
したがって、一実施の形態では、本発明は、
ａ． ａＣＤ２５－ａ－６４６の可変重鎖領域配列（配列番号５）（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）、又はａＣＤ２５－ａ－６４６の可変重鎖領域配列（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）と比較して最大５個のアミノ酸置換を有する可変重鎖領域配列、及び／又は、
ｂ． ａＣＤ２５－ａ－６４６の可変軽鎖領域配列（配列番号９）（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）、又はａＣＤ２５－ａ－６４６の可変軽鎖領域配列（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）と比較して最大５個のアミノ酸置換を有する可変軽鎖領域配列、
を含む抗ＣＤ２５抗体剤（すなわち、抗体又はその抗原結合フラグメント）を提供する。
ａ． ａＣＤ２５－ａ－６４６の可変重鎖領域配列（配列番号５）（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）、又はａＣＤ２５－ａ－６４６の可変重鎖領域配列（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）と比較して最大５個のアミノ酸置換を有する可変重鎖領域配列、及び／又は、
ｂ． ａＣＤ２５－ａ－６４６の可変軽鎖領域配列（配列番号９）（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）、又はａＣＤ２５－ａ－６４６の可変軽鎖領域配列（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）と比較して最大５個のアミノ酸置換を有する可変軽鎖領域配列、
を含む抗ＣＤ２５抗体剤（すなわち、抗体又はその抗原結合フラグメント）を提供する。
【0030】
幾つかの実施の形態では、アミノ酸置換はＣＤＲ配列では起こらない。
【0031】
幾つかの実施の形態では、本発明は、
ａ． ａＣＤ２５－ａ－６４６の可変重鎖領域配列（配列番号５）（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）、又はａＣＤ２５－ａ－６４６の可変重鎖領域配列（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する可変重鎖領域配列、及び／又は、
ｂ． ａＣＤ２５－ａ－６４６の可変軽鎖領域配列（配列番号９）（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）、又はａＣＤ２５－ａ－６４６の可変軽鎖領域配列（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する可変軽鎖領域配列、
を含む抗ＣＤ２５抗体剤（すなわち、抗体又はその抗原結合フラグメント）を提供する。
ａ． ａＣＤ２５－ａ－６４６の可変重鎖領域配列（配列番号５）（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）、又はａＣＤ２５－ａ－６４６の可変重鎖領域配列（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する可変重鎖領域配列、及び／又は、
ｂ． ａＣＤ２５－ａ－６４６の可変軽鎖領域配列（配列番号９）（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）、又はａＣＤ２５－ａ－６４６の可変軽鎖領域配列（又はその親和性成熟変異体等のその変異体）に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する可変軽鎖領域配列、
を含む抗ＣＤ２５抗体剤（すなわち、抗体又はその抗原結合フラグメント）を提供する。
【0032】
幾つかの実施の形態では、％配列同一性は、ａＣＤ２５－ａ－６８６（又は本明細書に開示されるようなその変異体、例えばその親和性成熟変異体）の６つ全てのＣＤＲの配列を用いずに算出される。例えば、抗ＣＤ２５抗体剤は、ａＣＤ２５－ａ－６８６（又はその変異体、例えばその親和性成熟変異体）の可変重鎖領域配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖領域配列、及び／又はａＣＤ２５－ａ－６８６（又はその変異体、例えばその親和性成熟変異体）の可変軽鎖領域配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖領域配列を含み得て、任意のアミノ酸変異は、可変重鎖領域配列及び可変軽鎖領域配列のフレームワーク領域でのみ生じる。かかる実施の形態では、或る特定の配列同一性を有する抗ＣＤ２５抗体剤は、それらが由来する抗ＣＤ２５抗体剤の完全な重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。
【0033】
本発明は、本明細書に記載される抗体の変異抗体又はその抗原結合フラグメントも提供する。本発明は、抗体の軽鎖又は重鎖中の任意のＤＧモチーフが、例えばアスパラギン酸異性化が低減するように変更されていてもよく、及び／又は抗体の軽鎖又は重鎖中の任意のＮＧモチーフが、例えばアスパラギン脱アミド化が低減するように変更されていてもよく、及び／又は抗体の軽鎖又は重鎖中の任意のメチオニンが、例えばメチオニン酸化が低減するように変更されていてもよい抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。例えば、ＤＧモチーフが、モチーフ内のアミノ酸の一方又は両方が異なるアミノ酸で置換されるように変更されていてもよい。ＮＧモチーフが、モチーフ内のアミノ酸の一方又は両方が異なるアミノ酸で置換されるように変更されていてもよい。例えば、かかるモチーフはＥＧ、ＤＱ又はＤＡに突然変異していてもよい。メチオニン残基が異なるアミノ酸、例えばロイシン又はフェニルアラニンで置き換えられるように変更されていてもよい。
【0034】
かかる実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えばａＣＤ２５－ａ－６４６であり得る又はそれに由来し得る。変異抗ＣＤ２５抗体は、ａＣＤ２５－ａ－６４６の結合特性及び機能特性のいずれか、場合によっては全てを有する更なる抗体をもたらす。例えば、変異抗ＣＤ２５抗体は、非ＩＬ－２遮断抗体である。
【0035】
したがって、幾つかの実施の形態では、本明細書で提供される抗体又はそのフラグメントは、当該技術分野で標準であるようにＤＧモチーフ又はＮＧモチーフ、特にＣＤＲ領域に見られるＤＧ又はＮＧモチーフが除去又は修飾されるように突然変異させ、化学修飾に対する感受性を低減することができる。このようにして修飾された、かかる抗体は、最終配列に至る前に更なる修飾（例えば、親和性成熟）を行う必要がある場合がある。
【0036】
本発明の一実施の形態では、本明細書で開示される抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列）、又は本明細書で開示される任意の抗体の可変重鎖及び可変軽鎖（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６のいずれかの可変重鎖及び可変軽鎖）を有するが、指定の配列とはＣＤＲ中の少なくとも１つ又は少なくとも２つのＤＧ又はＮＧモチーフ（存在する場合）が異なるモチーフに変化しているという点で異なる変異抗体が提供される。開示の変異体は、ａＣＤ２５－６４６について記載されているように使用及び配合することができる。
【0037】
本発明は、親和性成熟抗体、例えば本明細書で開示される抗体のいずれかに由来する親和性成熟変異体も提供する。幾つかの実施の形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、
ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１０）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１１）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１１）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１１）及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１１）からなる群から選択される可変重鎖相補性領域１；及び／又は、
ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１２）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１３）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１４）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１２）及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１５）からなる群から選択される可変重鎖相補性領域２；及び／又は、
ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４）及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４）からなる群から選択される可変重鎖相補性領域３；
を含む。
ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１０）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１１）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１１）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１１）及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号１１）からなる群から選択される可変重鎖相補性領域１；及び／又は、
ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１２）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１３）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１４）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１２）及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号１５）からなる群から選択される可変重鎖相補性領域２；及び／又は、
ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４）及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４）からなる群から選択される可変重鎖相補性領域３；
を含む。
【0038】
本発明の幾つかの実施の形態では、変異抗体又はその抗原結合フラグメントは、表２で与えられる（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４又はａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５の）重鎖ＣＤＲ配列を有する。幾つかの実施の形態では、変異抗体又はその抗体結合フラグメントは、表３で与えられる（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４又はａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５の）軽鎖ＣＤＲ配列を有し得る。本発明は特に、本明細書でａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５と称されるａＣＤ２５－ａ－６４６の親和性成熟変異体、並びにそれらのフラグメントを提供する。開示される親和性成熟変異体は、ａＣＤ２５－ａ－６４６について記載されるように使用及び配合され得る。
【0039】
一実施の形態では、変異抗体又はその抗体結合フラグメントは、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１６）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１７）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１８）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１９）、及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号２０）から選択される配列を含む可変重鎖を含むことができる。一実施の形態では、変異抗体又はその抗体結合フラグメントは、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）、及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）から選択される配列を含む可変軽鎖を含むことができる。ａＣＤ２５－ａ－６４６について記載されるようなアミノ酸置換を有する変異体（例えば、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のそれぞれに最大５つのアミノ酸置換を有する変異体）も提供される。一実施の形態では、親和性成熟抗体は、改変ＤＧモチーフ及び／又はＮＧモチーフを有する、及び／又は任意のメチオニン残基を取り除く若しくは変異させるように改変された親和性成熟抗体である。
【0040】
幾つかの実施の形態では、本発明は、抗ＣＤ２５抗体を作製する方法であって、本明細書に記載される抗体（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６、又はその抗原結合フラグメント若しくは変異体）を準備することと、抗体を親和性成熟に供することとを含み、作製される抗体が親抗体よりも大きな親和性でＣＤ２５に結合する、方法を提供する。作製される抗体は、例えばＫｄによって測定されるように、親抗体がＣＤ２５に結合するよりも少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％大きい親和性でＣＤ２５に結合するのが好ましい。親和性を測定する方法は、当該技術分野で既知であり、下記実施例に記載されている。かかる方法によって作製される親和性成熟抗体は、他の抗ＣＤ２５抗体剤について本明細書に記載されるように配合及び使用することができる。
【0041】
親和性成熟は、当業者に既知の任意の好適な方法に従って行うことができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗体ディスプレイシステムが高い親和性を有する特異抗体の生成に広く使用されている。これらのシステムでは、表現型（すなわち、抗体フラグメント）が遺伝子型（すなわち、抗体遺伝子）に結び付けられ、抗体の配列の直接的決定が可能である。抗体レパートリーのディスプレイを達成し、その後の結合剤の選択を可能にする幾つかのシステムが開発されており、選択の厳密性を高めることで、さらに高い親和性の変異体の選択が可能となる。抗体フラグメントは、酵母、リボソーム、ファージディスプレイ粒子において又はＤＮＡへの直接カップリングによって発現させることができる。
【0042】
現在の抗体親和性成熟方法は、確率論的及び非確率論的の２つの突然変異誘発のカテゴリーに属する。変異性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、突然変異誘発細菌株及び飽和突然変異誘発が確率論的突然変異誘発方法の典型例である。非確率論的技法では、特異的変異体の限られたコレクションを生成するためにアラニンスキャニング又は部位特異的突然変異誘発を用いることが多い。加えて、親抗体のシャッフリング変異体を得るためのシャッフリングアプローチを用いて、抗体の親和性を更に改善することもできる。
【0043】
したがって、本発明の一実施の形態では、親和性成熟の方法は、確率論的突然変異誘発（例えば、変異性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、突然変異誘発細菌株又は飽和突然変異誘発）、非確率論的突然変異誘発（例えば、アラニンスキャニング又は部位特異的突然変異誘発）、シャッフリング（例えば、ＤＮＡシャッフリング、鎖シャッフリング又はＣＤＲシャッフリング）、及び修飾を導入するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムの使用からなる群から選択される。
【0044】
親和性成熟方法は、例えばRajpal et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(24):8466－71、Steinwand et al., MAbs, 2014, 6(1):204－18及びHandbook of Therapeutic Antibodies, Wiley, 2014, Chapter 6, Antibody Affinity (pages 115－140)に記載されている。
【0045】
幾つかの実施の形態では、医薬組成物を作製する方法であって、上記の方法（すなわち、抗体を親和性成熟によって作製する方法）に従って作製された抗体を準備することと、抗体と少なくとも１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤とを同時配合する（co－formulating）こととを含む、方法が提供される。医薬組成物の作製に使用される抗体は、ａＣＤ２５－ａ－６４６の親和性成熟変異体であり得る。かかる方法によって作製される医薬組成物は、他の抗ＣＤ２５抗体剤について本明細書に記載されるように本発明の治療方法に使用することができる。
【0046】
本明細書に記載されるＣＤ２５に特異的に結合する抗体及び／又は抗原結合フラグメント（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３又はａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ１２３等の１つ以上のａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列要素を含み得る、及び／又はヒトＣＤ２５及び非ヒト霊長類ＣＤ２５、例えばカニクイザルＣＤ２５等への結合についてａＣＤ２５－ａ－６４６と競合し得る抗ＣＤ２５抗体剤）は、任意の様々なフォーマットで提供することができる。例えば、幾つかの実施の形態では、適切なフォーマットは、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）、アプタマー又はナノボディであり得るか又はそれを含み得る。幾つかの実施の形態では、抗体又はその抗原結合フラグメント（特にモノクローナル抗体）は、ウサギ、マウス、キメラ、ヒト化又は完全ヒト抗体又はその抗原結合フラグメントであり得る。幾つかの実施の形態では、提供される抗体又はその抗原結合フラグメントは、所与の用途に最も適切である可能性があることから、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭアイソタイプ（好ましくはヒトのもの）であり得る。幾つかの実施の形態では、提供される抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧアイソタイプ、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプである（幾つかの実施の形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。別の実施の形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ２サブクラスのものである）。幾つかの実施の形態では、例えば、提供される抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば更なる結合及び／又は官能基をａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列等の抗ＣＤ２５抗体剤に結合させることが望ましい場合に多重特異性結合剤の一部として提供され、単離抗体又は抗原結合フラグメントが二重特異性抗体、多重特異性抗体、又は当該技術分野で利用可能であり得る他の多重特異性フォーマットに含まれ得る。
【0047】
幾つかの実施の形態では、提供される抗ＣＤ２５抗体剤は、ＣＤ２５結合物質（entity）（例えば、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合フラグメント）と治療剤又は診断剤等のコンジュゲートペイロードとを含む。多くのかかる実施の形態では、この抗体剤は、「免疫複合体」とみなされる及び／又は称される。抗体医薬等の特異的免疫複合体の生成に使用することができる技術及び化合物の例は、文献に開示されており（Beck A et al., 2017）、幾つかの既知の抗ＣＤ２５抗体に適用可能と記載されている（O'Mahony D et al, 2008、Oh et al, 2017、Kreitman RJ et al, 2016、Flynn MJ et al 2016）。
【0048】
幾つかの実施の形態では、本発明は、提供される抗体又はその抗原結合フラグメント（又は提供される親和性成熟変異体を含むその変異体）を特定するａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列を提供する。幾つかの実施の形態では、かかる配列は、単離タンパク質として又はＣＤ２５を発現する細胞（免疫細胞又は細胞株、例えばＳＵ－ＤＨＬ１細胞等）の表面上でのヒトＣＤ２５中のエピトープ（例えば、ａＣＤ２５ｅｐ－ａ）、更には任意に非ヒト霊長類、例えばカニクイザルのＣＤ２５及び／又はマウスＣＤ２５の対応するエピトープに結合する、提供される抗体又はその抗原結合フラグメントを特定する。
【0049】
幾つかの実施の形態では、本発明は、ヒトＣＤ２５のエピトープと特異的に結合する抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合フラグメントを提供し、ここで、エピトープは、配列番号１のアミノ酸４２～５６に含まれる１つ以上のアミノ酸残基を含む。好ましくは、エピトープは、少なくとも４つのアミノ酸を含み、ここで、エピトープは、配列番号１のアミノ酸４２～５６に含まれる１つ以上のアミノ酸を含む。好ましくは、エピトープは、少なくとも５つのアミノ酸、少なくとも６つのアミノ酸、少なくとも７つのアミノ酸、少なくとも８つのアミノ酸、少なくとも９つのアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１１個のアミノ酸、少なくとも１２個のアミノ酸、少なくとも１３個のアミノ酸、又は少なくとも１４個以上のアミノ酸を含み、ここで、エピトープは、配列番号１のアミノ酸４２～５６に含まれる１つ以上のアミノ酸を含む。エピトープは、線形又は立体配座、すなわち不連続性のいずれであってもよい。幾つかの実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトＣＤ２５のエピトープに特異的に結合し、ここで、エピトープは、配列番号１のアミノ酸４２～５６に含まれる、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、又は少なくとも１４個以上のアミノ酸残基を含む。幾つかの実施の形態では、抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号１のアミノ酸４２～５６を含むエピトープに結合する。
【0050】
幾つかの実施の形態では、本発明は、ａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列を含み、及び／又は単離タンパク質としてヒトＣＤ２５細胞外ドメインに、またヒトＣＤ２５を発現する細胞の表面上にて結合し、同じエピトープ、特にａＣＤ２５ｅｐ－ａ（タンパク質配列ＫＥＧＴＭＬＮＣＥＣＫＲＧＦＲ（配列番号２１）；Ｕｎｉｐｒｏｔ配列Ｐ０１５８９におけるアミノ酸４２～５６）として実施例にて特定されるエピトープに対して競合することが可能な１つ以上のａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列要素（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、及び／又はａＣＤ２５－ａ－６４６と競合する）を含む抗体又はその抗原結合フラグメントと同程度の結合特徴を示す抗体又は抗原結合フラグメントをスクリーニング及び／又は特性評価する手法を提供する。
【0051】
さらに、本発明は、１つ以上のａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列要素を含む抗体又はその抗原結合フラグメントと同等の機能的特徴を呈する抗体又はその抗原結合フラグメントをスクリーニングする手順も提供し、かかる特徴にはＩＬ－２とＣＤ２５との相互作用の阻害の欠如、ＩＬ－２シグナル伝達の阻害の欠如、及び細胞毒性活性、及び抗ＣＤ２５抗体剤としての作用が含まれる。これらの範囲で、候補抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｅｘ ｖｉｖｏアッセイ、セルベースアッセイ及び／又は動物モデルにおいて評価する場合に、かかる特徴のいずれか、場合によっては全ての存在を確立するための実施例に記載されるアッセイ又は当該技術分野で既知の他のアッセイにおいて試験することができる。
【0052】
幾つかの実施の形態では、本発明は、ａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列（又は提供される親和性成熟変異体を含むその変異体）等の抗ＣＤ２５抗体剤を含む単離抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子を提供する。幾つかの実施の形態では、このような提供される核酸分子は、コドン最適化核酸配列を含有してもよく、及び／又は例えば細菌、酵母、昆虫、魚、マウス、サル又はヒトの細胞等の宿主細胞における発現のための適切な核酸ベクター内の発現カセットに含まれていてもよい。
【0053】
幾つかの実施の形態では、本発明は、抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列を含む）の、例えば本明細書に記載される１つ以上の特性を有する、提供される抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント）を発現する異種核酸分子（例えば、ＤＮＡベクター）を含む宿主細胞を提供する。幾つかの実施の形態では、本開示は、抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列を含む）の、例えば本明細書に記載される１つ以上の特性を有する抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント）を作製する方法を提供する。幾つかの実施の形態では、かかる方法は、核酸（例えば、宿主細胞を構成し得る及び／又はベクターによって宿主細胞に送達され得る異種核酸）を含む宿主細胞を培養することを含み得る。幾つかの実施の形態では、かかる宿主細胞（及び／又は異種核酸配列）は、抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント）が宿主細胞から分泌され（例えば、それにより細胞培養上清から単離することができる）、及び／又は細胞表面上に露出する（例えば、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に付与する人工Ｔ細胞受容体のように、かかるａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列及び配列要素が、かかる細胞の状況下で又はかかる細胞と共に使用されることが意図される場合）ように配置及び構築される。
【0054】
幾つかの実施の形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、脱フコシル化（afucosylated：アフコシル化）されていてもよい。抗体グリコシル化は、抗体（例えば、モノクローナル抗体、組み換え抗体、及び／又は別の形で改変又は単離された抗体）及びＦｃ融合タンパク質の活性、薬物動態及び薬力学に影響を及ぼす可能性があり、特定の技術を利用して所望のグリコシル化プロファイルを有する抗体を得ることができることがよく知られている（Liu L, 2015）。本発明に従って使用される抗体（例えば、抗ＣＤ２５抗体剤であり得る又は抗ＣＤ２５抗体剤と称され得る抗体を含む、例えば本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体）の細胞毒性を支持するエフェクター機能は、抗体フコシル化レベルを低下させる方法を用いて高めることができる。かかる特性を呈する特定のａＣＤ２５－ａ－６４６配列要素を含む抗体は、例えばフコシル化能を欠く若しくはフコシル化能が低下した細胞株を遺伝子操作する技術（その一部はＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（Lonza）、ＧｌｙＭＡＸＸ（ProBiogen）、Evitriaによって提供されるもののように市販されている）を用いてａＣＤ２５－ａ－６４６配列を発現させるか、又は製造プロセスを操作すること、例えばオスモル濃度を制御し、及び／又は酵素阻害剤を使用することによって生成することができる。例えば、欧州特許第２４８０６７１号に記載の方法も参照されたい。
【0055】
幾つかの実施の形態では、本発明は、本明細書に記載される（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又はＣＤ２５との結合についてａＣＤ２５－ａ－６４６抗体と競合する抗体若しくはその抗原結合フラグメントを特に含む、例えば本明細書で抗ＣＤ２５抗体剤と称される抗体について記載される）望ましい特性を有する、提供される抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。幾つかの実施の形態では、このような提供される組成物は、治療的、診断的又は予防的用途等の医学的用途を対象とし、及び／又はその用途で使用される。幾つかの実施の形態では、このような提供される組成物は、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を更に含んでいてもよく、及び／又は癌の治療に使用することができる。幾つかの実施の形態では、当該技術分野で既知のように、医薬組成物に１つ以上の担体、賦形剤、塩、緩衝剤等を配合してもよい。当業者は、所与の方法及び／又は投与部位、例えば非経口（例えば、皮下、筋肉又は静脈注射）、粘膜、腫瘍内、腫瘍周囲、経口又は局所投与に特に望ましい及び／又は有用であり得る技術を含む様々な配合技術を認識し、容易に利用することができる。多くの実施の形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合部分）を含む、提供される医薬組成物は、非経口送達（例えば、注射及び／又は点滴による）のために配合される。幾つかの実施の形態では、このような提供される医薬組成物は、例えば充填済みのシリンジ又はバイアルのフォーマットで提供することができる。幾つかの実施の形態では、このような提供される医薬組成物は、例えば乾燥（例えば、凍結乾燥）形態で提供及び／又は利用することができる。代替的には、幾つかの実施の形態では、このような提供される医薬組成物は、液体形態（例えば、溶液、懸濁液、分散液、エマルション等として）、ゲル形態等で提供及び／又は利用することができる。
【0056】
幾つかの実施の形態では、本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍、リンパ腫（ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、骨髄腫）、骨髄増殖性障害、固形腫瘍（乳癌、扁平上皮癌、結腸癌、頭頸部癌、肺癌、泌尿生殖器癌、直腸癌、胃癌、肉腫、黒色腫、食道癌、肝癌、精巣癌、子宮頸癌、肥満細胞腫、血管腫、眼癌、喉頭癌、口腔癌、中皮腫、皮膚癌、直腸癌、咽喉癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、肺癌、膵癌、腎癌（renal cancer）、胃癌、非小細胞肺癌、腎臓癌（kidney cancer）、脳癌及び卵巣癌等）等の癌の治療及び／又はその治療のための薬剤の製造における、本明細書に記載される（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列要素を含む）抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合フラグメント）及び／又はそれらを含む組成物の使用を提供する。癌は、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＳＬＡＭ７Ｆ、ＣＤ４７、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＴＩＭ３、ＣＤ２５、ＧＩＴＲ、ＣＤ２５、ＥＧＦＲ等のような特定の腫瘍関連マーカー及び抗原の存在に基づいて確定された癌、又は高頻度マイクロサテライト不安定性（microsatellite instability－high；ＭＳＩ－Ｈ）若しくはミスマッチ修復機構欠損（mismatch repair deficient；ｄＭＭＲ）と称されるバイオマーカーを有することが特定されている癌でもあり得る。さらに、かかる病態は、上皮内癌、くすぶり型骨髄腫、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症、子宮頸部上皮内腫瘍、ＭＡＬＴリンパ腫／ＧＡＬＴリンパ腫（GALTomes）及び様々なリンパ増殖性障害等の上記の癌の前癌性の非侵襲状態を確定する場合にも考慮され得る。幾つかの実施の形態では、治療される被験体は、固形腫瘍を有するのが好ましい。
【0057】
このため、幾つかの実施の形態では、本発明は、被験体において癌を治療する方法であって、被験体に、本明細書に記載される（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列を含む）、提供される抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合フラグメント）、又はＣＤ２５の結合についてａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列を含む抗体と競合する抗体若しくはその抗原結合フラグメントを含む組成物を有効量投与することを含む、方法を提供する。幾つかの実施の形態では、被験体は、固形腫瘍を有するのが好ましい。
【0058】
このため、幾つかの実施の形態では、本発明は、被験体において制御性Ｔ細胞を枯渇させる方法であって、被験体に、本明細書に記載される（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列を含む）、提供される抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合フラグメント）、又はＣＤ２５の結合についてａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列を含む抗体と競合する抗体若しくはその抗原結合フラグメントを含む組成物を有効量投与する工程を含む、方法を提供する。一実施の形態では、被験体は固形腫瘍を有する。一実施の形態では、被験体は血液癌を有する。
【0059】
幾つかの実施の形態では、提供される方法は、被験体に少なくとも１つの付加的な作用物質又は療法を同時に又は任意の順序で順次に投与することを更に含み得る（すなわち、それにより被験体は併用療法を受ける）。幾つかの実施の形態では、かかる少なくとも１つの付加的な作用物質又は療法は、抗癌剤（例えば、化学療法剤）、放射線療法（体外から放射線照射を行うこと又は放射性コンジュゲート化合物を投与することによる）、抗腫瘍抗原若しくはマーカー抗体（抗原又はマーカーは、例えばＣＤ４、ＣＤ３８、ＣＡ１２５、ＰＳＭＡ、ｃ－ＭＥＴ、ＶＥＧＦ、ＣＤ１３７、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３２６、ＣＡＩＸ、ＣＤ４０、ＣＤ４７又はＥＧＦ受容体である）、チェックポイント阻害剤若しくは免疫調節抗体（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ３、ＣＤ３８、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３４、ＣＤ１３４Ｌ、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７ＲＰ１、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＣＤ２８、ＡＰ２Ｍ１、ＳＨＰ－２、ＯＸ－４０、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０等を標的とする抗体）、ワクチン（特に癌ワクチン、例えばＧＶＡＸ）、アジュバント、標準使用プロトコル、癌細胞を標的とする若しくは癌細胞に対する免疫応答を刺激する１つ以上の他の化合物、又はそれらの任意の組合せであるか又はそれを含み得る。付加的な作用物質は、ＰＤ－１アンタゴニスト、例えば抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体等の免疫チェックポイント阻害剤であるのが好ましい。或る特定の実施の形態では、かかる少なくとも１つの付加的な作用物質又は療法が抗体であるか又は抗体を含む場合、かかる抗体のフォーマット及び／又はかかる抗体が標的とする抗原は、文献中に挙げられるものから選ばれ、場合によっては所与の癌に適合させることができる（Sliwkowski M & Mellman I, 2013、Redman JM et al., 2015、Kijanka M et al., 2015）。かかる抗原及び対応する抗体としは、限定されるものではないが、ＣＤ２２（ブリナツモマブ）、ＣＤ２０（リツキシマブ、トシツモマブ）、ＣＤ５６（ロルボツズマブ（Lorvotuzumab））、ＣＤ６６ｅ／ＣＥＡ（ラベツズマブ）、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ－４（イピリムマブ）、ＣＤ２２１／ＩＧＦ１Ｒ（ＭＫ－０６４６）、ＣＤ３２６／Ｅｐｃａｍ（エドレコロマブ）、ＣＤ３４０／ＨＥＲ２（トラスツズマブ、ペルツズマブ）及びＥＧＦＲ（セツキシマブ、パニツムマブ）が挙げられる。少なくとも１つの付加的な作用物質又は療法が化学療法剤である実施の形態では、化学療法剤は、癌療法に使用される当該技術分野で既知の化学療法剤であり得る。かかる化学療法剤としては、限定されるものではないが、アルキル化剤、アントラサイクリン、エポチロン、ニトロソウレア、エチレンイミン／メチルメラミン、スルホン酸アルキル、アルキル化剤、代謝拮抗物質、ピリミジン類似体、エピポドフィロトキシン（epipodophylotoxins）、Ｌ－アスパラギナーゼ等の酵素；ＩＦＮα、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、Ｇ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦ等の生物学的応答調節物質；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン等の白金配位錯体、アントラセンジオン、ヒドロキシウレア等の置換尿素、Ｎ－メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、ミトタン（ｏ，ｐ’－ＤＤＤ）及びアミノグルテチミド等の副腎皮質抑制剤（adrenocortical suppressants）；プレドニゾン及び同等物等の副腎皮質ステロイドアンタゴニスト、デキサメタゾン及びアミノグルテチミドを含むホルモン及びアンタゴニスト；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロール等のプロゲスチン；ジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール同等物等のエストロゲン；タモキシフェン等の抗エストロゲン；プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン／同等物を含むアンドロゲン；フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体及びロイプロリド等の抗アンドロゲン；フルタミド等の非ステロイド性抗アンドロゲン；ＴＧＦβ経路、ＩＤＯ（インドールアミンジオキシゲナーゼ）、アルギナーゼ及び／又はＣＳＦ１Ｒを標的とする分子；オラパリブ、ベリパリブ、イニパリブ、ルカパリブ等のＰＡＲＰ阻害剤；並びにチバンチニブ、ホレチニブ、ゴルバチニブ、カボザンチニブ及びクリゾチニブ等のＭＥＴ阻害剤が挙げられる。
【0060】
さらに、本発明は、かかる単離抗体又は抗原結合フラグメントの投与、貯蔵又は他の用途を可能にする、本明細書に記載される（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列を含む）、提供される抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合フラグメント）又は関連組成物を含む様々なキット又は製品を提供する。幾つかの実施の形態では、提供されるキットは、かかる組成物を、任意に１つ以上の製品、希釈剤、試薬、固相、及び／又はキットの正しい使用のための説明書と共に含むベッセル（vessel）、シリンジ、バイアル又は他の容器を含む。
【0061】
幾つかの実施の形態では、医学的用途等の特定の用途、特に癌の治療のための本明細書に記載される（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列を含む）特定の抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合フラグメント）の特定、特性評価及び／又は検証は、本明細書に記載される１つ以上のアッセイ又はシステムを用いて行うことができる。幾つかの実施の形態では、かかる特定、特性評価及び／又は検証は、例えば様々な実験設定及び／又は選択されたパネル（例えば、癌由来細胞株）を用いた１つ以上のセルベースアッセイにおける活性の分析を含み得る。幾つかの実施の形態では、特に本明細書に記載される或る特定の望ましい抗ＣＤ２５抗体剤の活性に関連した、提案される免疫機構を考えると、望ましい特定、特性評価及び／又は検証は、癌を誘導するか、又は癌細胞を異種移植片若しくは同系／同種癌由来細胞として移植した動物モデルにおいて生成した関連データの収集を含み得る。代替的又は付加的に、幾つかの実施の形態では、モデル系におけるヒト免疫細胞に対する抗ＣＤ２５抗体剤の活性の評価を可能とするＰＢＭＣ（すなわち、ヒト化ＰＢＭＣマウスモデル）若しくはＣＤ３４＋造血幹細胞単独（すなわち、ＣＤ３４＋ヒト化マウス）、又は肝細胞及び胸腺細胞と併せたＣＤ３４＋造血幹細胞（例えば、ＮＳＧ－ＢＬＴマウス）等のヒト細胞の移入を伴う動物モデルを利用することができる。
【0062】
幾つかの実施の形態では、本明細書に記載される（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列を含むか、又は別の形で抗ＣＤ２５抗体剤として本明細書に記載される作用物質の構造的及び／又は機能的特性を有する）抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合フラグメント）の関連配列は、薬学的及び／又は技術的理由でより適切な又は望ましい抗体フレームにクローニングし、及び／又はその状況下で発現させることができる。例えば、かかる配列（場合によってはコドン最適化ＶＨ及びＶＬコード配列として）を、ヒトＩｇＧ１定常領域（ｈＩｇＧ１）と共にクローニングし、適切な抗体発現ベクター及び細胞株（ＣＨＯ由来細胞株、例えばＣＨＯ－Ｓ等）を用いて発現させることができる。幾つかの特定の実施の形態では、ヒトＩｇＧ１フォーマット抗体における提供される抗体配列の発現及び分泌は、トランスフェクション後に細胞溶解物中で還元状態及び上清中で非還元状態にて分析することができ、これが後に抗体の精製（アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過及び／又は他の適切な技法による）に用いられる。ヒトＩｇＧ１フォーマット（例えば、抗ＣＤ２５抗体剤－ｈＩｇＧ１）での提供される抗ＣＤ２５抗体配列の結合特性及び／又は他の機能特性は、例えば下記実施例に記載される１つ以上のアッセイを用いて分析することができる。例えば、かかるｈＩｇＧ１フォーマットの提供される抗体は、ヒト及びカニクイザルＰＢＭＣ又は精製Ｔｒｅｇ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ由来Ｔｒｅｇ又はＣＤ２５陽性細胞株（ＳＵ－ＤＨＬ－１又はＫａｒｐａｓ２９９等）への結合について、例えばフローサイトメトリーを用いて評価することができる。
【0063】
さらに、ヒト健常ドナー及び／又は患者から単離されたヒト初代腫瘍細胞及び／又は制御性Ｔ細胞を含む免疫細胞に対する、本明細書に記載される（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列を含むか、又は別の形で抗ＣＤ２５抗体剤－ｈＩｇＧ１等の抗ＣＤ２５抗体剤として本明細書に記載される作用物質の構造的及び／又は機能的特性を有する）１つ以上の抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合フラグメント）の効果を評定することができる。抗ＣＤ２５抗体剤の潜在的効果を調査するために、抗体を用いてＰＢＭＣ、及び／又は腫瘍（及び／又はリンパ節等の器官）及び／又は腫瘍移植片又は他の３Ｄオルガノイドから単離された細胞、及び／又は精製若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成した制御性Ｔ細胞若しくは幾つかのＮＫ細胞若しくは樹状細胞等の他のＣＤ２５陽性細胞を処理することができる。考え得る読出しには、ＣＤ２５陽性細胞の生存能力、消失及び／又はアポトーシス、腫瘍細胞の殺傷、エフェクター免疫細胞の増殖及び機能（例えば、グランザイムＢ産生、細胞毒性活性、脱顆粒）、抗原特異的応答（例えば抗原に応答した増殖、脱顆粒又はサイトカイン産生によって測定される）が含まれる。代替的又は付加的には、マウス又は非ヒト霊長類を処理することができ、細胞状態を血液サンプル（全血又は単離ＰＢＭＣとして分析される）中で又は動物からの様々な器官及び／又は細胞の単離後に、例えばフローサイトメトリー又は免疫組織化学によって追跡することができる。
【0064】
代替的又は付加的には、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、抗ＣＤ２５抗体又はその抗原結合フラグメント）の１つ以上の特性（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列を含むか、又は別の形で抗ＣＤ２５抗体剤－ｈＩｇＧ１等の抗ＣＤ２５抗体剤として本明細書に記載される作用物質の構造的及び／又は機能的特性を有する）は、単独又は組合せで、ＣＤ２５発現細胞（例えば、Ｔｒｅｇ又はＣＤ２５発現癌細胞）に対するかかる抗ＣＤ２５抗体剤の効果を研究することによって評価することができる。読出しには、細胞殺傷、細胞アポトーシス、細胞内シグナル伝達モニタリング（例えば、Ｓｔａｔ－５リン酸化）、ＣＤ２５へのＩＬ－２結合及びシグナル伝達（例えば、Ｓｔａｔ－５リン酸化又はＩＬ－２受容体の下流の他のシグナル伝達）に対する影響、並びにＩＬ－２依存性機能活性（例えば、増殖及びサイトカイン産生）が含まれ得る。ａＣＤ２５抗体剤－ｈＩｇＧ１抗体をカニクイザル又は関連マウスモデルに投与した場合に、抗体の細胞効果を続いてｉｎ ｖｉｖｏで追跡することができる。
【0065】
提供される抗ＣＤ２５抗体剤とヒトＣＤ２５との分子相互作用についての更なる洞察を得るために、抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、一具体例を挙げると、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｈＩｇＧ１抗体）及びヒトＣＤ２５タンパク質の結晶構造を決定することができる。提供される抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｈＩｇＧ１抗体を特に含む）の溶解性及び／又は安定性は、溶解度研究、加速ストレス研究、凍結融解研究及び正式な安定性研究によって評定することができる。抗体の凝集は、目視検査、サイズ排除クロマトグラフィー、及び動的光散乱、及びＯＤ２８０／３２０吸光度によって追跡することができる。
【図面の簡単な説明】
【0066】
【図1】ａＣＤ２５－ａ－６４６の関連タンパク質配列を示す図である。重鎖（ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ１（配列番号２）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ２（配列番号３）及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３（配列番号４））及び軽鎖（ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ１（配列番号６）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ２（配列番号７）及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ３（配列番号８））の各ＣＤＲを別個に示し、またスクリーニング手順によって初めに特定された重鎖及び軽鎖抗体のフレーム配列（それぞれａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ１２３（配列番号５）及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ１２３（配列番号９））内で下線を付ける。
【図2】ヒトＣＤ２５（ＵｎｉｐｒｏｔコードＰ０１５８９）（配列番号１）のコンセンサス配列を示す図である。アミノ酸２２～２４０に対応する成熟ＣＤ２５の細胞外ドメインに下線を付ける。予め特定されたａＣＤ２５－ａ－６４６エピトープの位置（ａＣＤ２５ｅｐ－ａ）が示される。
【図3】漸増抗体濃度での、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した、ヒトｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇ細胞（Ａ）、ＳＵ－ＤＨＬ－１細胞（Ｂ）又はＳＲ－７８６細胞（Ｃ）上で発現されたＣＤ２５に対するａＣＤ２５－ａ－６４６結合の特性評価を示す図である。
【図4】ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化されたヒト汎Ｔ細胞で発現させた後にＣＤ４＋ Ｔ細胞でゲーティングした（Ａ）、及びＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化されたヒト汎Ｔ細胞で発現させた後にＣＤ８＋ Ｔ細胞でゲーティングした（Ｂ）、又はＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化されたカニクイザル汎Ｔ細胞で発現させた後にＣＤ４＋ Ｔ細胞でゲーティングした（Ｃ）、及びＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化されたカニクイザル汎Ｔ細胞で発現させた後にＣＤ８＋ Ｔ細胞でゲーティングした（Ｄ）、漸増抗体濃度のａＣＤ２５－ａ－６４６のＣＤ２５への結合を特性評価し、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較する図である。
【図5】（Ａ）Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６機器でのバイオレイヤー干渉法及び（Ｂ）Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００機器でのＳＰＲのそれぞれの２つの方法により測定された、ｈｉｓタグ付き組換えヒトＣＤ２５へのａＣＤ２５－ａ－６４６の結合及びＫＤ決定を示す図である。
【図6】標準サンドイッチフォーマットビニングアッセイを用いたＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４でのバイオレイヤー干渉法によるａＣＤ２５－ａ－６４６とＩＬ－２との非競合的結合（Ａ）及びＩＬ－２競合抗体とＩＬ－２との競合的結合（Ｂ）を示す図である。抗ヒトＣＤ２５抗体であるａＣＤ２５－ａ－６４６をＡＨＱセンサー上にロードした。次いで、センサーを１００ｎＭヒトＣＤ２５、続いてヒトＩＬ－２に曝露した。抗原会合後のヒトＩＬ２による追加の結合は、非占有エピトープを示し（非競合物質）、結合がなければエピトープ遮断が示される（競合物質）。
【図7】標準サンドイッチフォーマットビニングアッセイを用いたＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４システムでのバイオレイヤー干渉法によるＣＤ２５へのａＣＤ２５－ａ－６４６及びダクリズマブの非競合的結合を示す図である。参照モノクローナル抗ヒトＣＤ２５抗体ダクリズマブをＡＨＱセンサー上にロードした。次いで、センサーを１００ｎＭヒトＣＤ２５抗原、続いて抗ヒトＣＤ２５抗体（ａＣＤ２５－ａ－６４６）に曝露した。抗原会合後の第２の抗体による追加の結合は、非占有エピトープを示し（非競合物質）、結合がなければエピトープ遮断が示される（競合物質）。
【図8】ヒト起源のＰＢＭＣを用いたＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおけるＩＬ－２シグナル伝達の遮断に関するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照、ダクリズマブ又は一次抗体の非存在下と比較したａＣＤ２５－ａ－６４６の特性評価を示す図である。細胞を１０μｇ／ｍｌ抗体、続いて漸増濃度のＩＬ－２（図中に示される）と共にインキュベートした。分析は、ＳＴＡＴ５をリン酸化するＣＤ３陽性細胞のパーセンテージに限定した。
【図9】汎Ｔ細胞を用いたヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照、ダクリズマブ、又は陽性対照としての市販のマウス抗ヒトＩＬ－２中和抗体（クローン：ＡＢ１２－３Ｇ４）と比較したａＣＤ２５－ａ－６４６の機能的特性評価を示す図である。細胞を１０μｇ／ｍｌ抗体と共にインキュベートした後、フローサイトメトリー分析前にＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで７２時間活性化した。結果としてグランザイムＢ陽性増殖性ＣＤ４（Ａ）又はＣＤ８（Ｂ）Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
【図10】ＡＤＣＣアッセイにおけるＣＤ２５陽性細胞株の殺傷に関するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較したａＣＤ２５－ａ－６４６の機能的特性評価を示す図である。ＣＤ２５高又は低発現細胞、それぞれＳＵ－ＤＨＬ－１（Ａ）又はＳＲ－７８６細胞（Ｂ）を、様々な濃度の抗体（図中に示される）の存在下で精製ＮＫ細胞と同時培養した。標的細胞溶解を、ＮＫ細胞への添加の４時間後に上清へのカルセイン放出によって測定した。データをサポニン処理対照に対して正規化した。
【図11】ＡＤＣＣアッセイにおけるＣＤ２５陽性細胞株の殺傷に関する非改変ａＣＤ２５－ａ－６４６及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した脱フコシル化ａＣＤ２５－ａ－６４６の機能的特性評価を示す図である。ＣＤ２５高又は低発現細胞、それぞれＳＵ－ＤＨＬ－１（Ａ）又はＳＲ－７８６細胞（Ｂ）を、様々な濃度の抗体（図中に示される）の存在下で精製ＮＫ細胞と同時培養した。標的細胞溶解を、ＮＫ細胞への添加の４時間後に上清へのカルセイン放出によって測定した。データをサポニン処理対照に対して正規化した。
【図12】ＡＤＣＰアッセイにおけるｉｎ－ｖｉｔｒｏで分化したＴｒｅｇ細胞の食作用に関するヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較したａＣＤ２５－ａ－６４６の機能的特性評価を示す図である。Ｔｒｅｇを、様々な濃度の抗体（図に示される）の存在下においてＭＣＳＦで分化したマクロファージと同時培養した。二色フローサイトメトリー分析を、ＣＤ１４＋で染色したマクロファージ及びｅＦｌｕｏｒ４５０色素で標識したＴｒｅｇを用いて行った。残留標的細胞は、ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４－である細胞と規定した。二重標識細胞（ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４＋）は、マクロファージによる標的の食作用を表すとみなした。標的細胞の食作用は、以下の式を用いて算出した：食作用（％）＝１００×［（二重陽性率）／（二重陽性率＋残留標的率）］。
【図13】Ｏｃｔｅｔにおける競合アッセイ。固定化ｒｈＣＤ２５へのａＣＤ２５－ａ－６４６、それに続く再度のａＣＤ２５－ａ－６４６（対照として）、又は二次Ａｂとしてのバシリキシマブ（Ａ）、ダクリズマブ（Ｂ）、参照非ブロッカーａＣＤ２５－ａ－６４６（Ｃ）若しくは７Ｇ７Ｂ６（Ｄ）のいずれかの結合を示す図である。ＩＬ－２シグナルｍＡｂの非ブロッカーは、互いに（Ｃ）又は参照非ブロッカーｍＡｂである７Ｇ７Ｂ６（Ｄ）と競合するが、ダクリズマブ又はバシリキシマブ（Ａ及びＢ）等のＩＬ－２シグナル伝達ブロッカーとは競合しない。
【図14】ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１の関連タンパク質配列を示す図である。重鎖についてのＣＤＲ（ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＨＣＤＲ１（配列番号１０）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＨＣＤＲ２（配列番号１２）、及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＨＣＤＲ３（配列番号４））及び軽鎖についてのＣＤＲ（ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＬＣＤＲ１（配列番号６）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＬＣＤＲ２（配列番号７）、及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＬＣＤＲ３（配列番号８））をそれぞれ、別々に示し、スクリーニング手順により最初に特定された重鎖及び軽鎖の抗体のフレーム配列（それぞれ、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＨＣＤＲ１２３（配列番号１６）及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＬＣＤＲ１２３（配列番号９））内で下線処理している。
【図15】ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２の関連タンパク質配列を示す図である。重鎖についてのＣＤＲ（ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＨＣＤＲ１（配列番号１１）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＨＣＤＲ２（配列番号１３）、及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＨＣＤＲ３（配列番号４））及び軽鎖についてのＣＤＲ（ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＬＣＤＲ１（配列番号６）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＬＣＤＲ２（配列番号７）、及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＬＣＤＲ３（配列番号８））をそれぞれ、別々に示し、スクリーニング手順により最初に特定された重鎖及び軽鎖の抗体のフレーム配列（それぞれ、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＨＣＤＲ１２３（配列番号１７）及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＬＣＤＲ１２３（配列番号９））内で下線処理している。
【図16】ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３の関連タンパク質配列を示す図である。重鎖についてのＣＤＲ（ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＨＣＤＲ１（配列番号１１）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＨＣＤＲ２（配列番号１４）、及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＨＣＤＲ３（配列番号４））及び軽鎖についてのＣＤＲ（ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＬＣＤＲ１（配列番号６）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＬＣＤＲ２（配列番号７）、及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＬＣＤＲ３（配列番号８））をそれぞれ、別々に示し、スクリーニング手順により最初に特定された重鎖及び軽鎖の抗体のフレーム配列（それぞれ、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＨＣＤＲ１２３（配列番号１８）及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＬＣＤＲ１２３（配列番号９））内で下線処理している。
【図17】ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４の関連タンパク質配列を示す図である。重鎖についてのＣＤＲ（ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＨＣＤＲ１（配列番号１１）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＨＣＤＲ２（配列番号１２）、及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＨＣＤＲ３（配列番号４））及び軽鎖についてのＣＤＲ（ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＬＣＤＲ１（配列番号６）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＬＣＤＲ２（配列番号７）、及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＬＣＤＲ３（配列番号８））をそれぞれ、別々に示し、スクリーニング手順により最初に特定された重鎖及び軽鎖の抗体のフレーム配列（それぞれ、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＨＣＤＲ１２３（配列番号１９）及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＬＣＤＲ１２３（配列番号９））内で下線処理している。
【図18】ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５の関連タンパク質配列を示す図である。重鎖についてのＣＤＲ（ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＨＣＤＲ１（配列番号１１）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＨＣＤＲ２（配列番号１５）、及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＨＣＤＲ３（配列番号４））及び軽鎖についてのＣＤＲ（ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＬＣＤＲ１（配列番号６）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＬＣＤＲ２（配列番号７）、及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＬＣＤＲ３（配列番号８））をそれぞれ、別々に示し、スクリーニング手順により最初に特定された重鎖及び軽鎖の抗体のフレーム配列（それぞれ、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＨＣＤＲ１２３（配列番号２０）及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＬＣＤＲ１２３（配列番号９））内で下線処理している。
【図19】Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００機器でのＳＰＲにより行った、ｒｈＣＤ２５－ｈｉｓタグに対する精製された親和性成熟抗体（ＩｇＧ１）のＫＤ決定を示す図である。（Ａ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１、（Ｂ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２、（Ｃ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３、（Ｄ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４、及び（Ｅ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５。
【図20】Ｏｃｔｅｔにおける競合アッセイ。固定化ｒｈＣＤ２５へのａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１、それに続く再度のａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１（対照として）、又は二次Ａｂとしてのバシリキシマブ（Ａ）、ダクリズマブ（Ｂ）、参照非ブロッカーａＣＤ２５－ａ－１１０（Ｃ）若しくは７Ｇ７Ｂ６（Ｄ）のいずれかの結合を示す図である。ＩＬ－２シグナルｍＡｂの非ブロッカーは、互いに（Ｃ）又は参照非ブロッカーｍＡｂでもある７Ｇ７Ｂ６（Ｄ）と競合するが、ダクリズマブ又はバシリキシマブ（Ａ及びＢ）等のＩＬ－２シグナル伝達ブロッカーとは競合しない。
【図21】Ｋａｒｐａｓ ２９９細胞で発現されたＣＤ２５への結合についての、漸増抗体濃度での親ａＣＤ２５－ａ－６４６又はヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較した親和性成熟抗体の特性評価、及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照との比較を示す図である。（Ａ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１、（Ｂ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２、（Ｃ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３、（Ｄ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４、及び（Ｅ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５。
【図22】ヒト起源のＰＢＭＣを用いたＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおけるＩＬ－２シグナル伝達の遮断についての親ａＣＤ２５－ａ－６４６、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照、ダクリズマブ－Ｈｙｐ、又は一次抗体なしのものと比較した親和性成熟抗体の特性評価を示す図である。細胞を１０μｇ／ｍｌの抗体、続く１０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２とインキュベートした。分析は、ＳＴＡＴ５をリン酸化するＣＤ３陽性細胞のパーセンテージに限定した。
【図23】雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６同系結腸腫瘍を担持するマウスにおける単独の（Ｄ）及びＩＬ－２中和抗体と組み合わせた（Ｅ）又はＩＬ－２遮断抗体と組み合わせた（Ｆ）、抗マウスＣＤ２５非ＩＬ－２遮断Ｔｒｅｇ枯渇抗体である７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａの治療活性の評価を示す図である。マウスＩｇＧ２ａ対照（Ａ）、ＩＬ－２中和抗体単独（Ｂ）及びＩＬ－２遮断抗体単独（Ｃ）の活性を比較のために試験した。
【発明を実施するための形態】
【0067】
本明細書で使用される用語、技術手段及び実施形態の或る特定の定義を下記に提示するが、その多く又は大部分が当業者の共通の理解を裏付けるものである。
【0068】
投与：本明細書で使用される場合、「投与」という用語は、被験体への組成物の投与を指す。動物被験体（例えば、ヒト）への投与は、任意の適切な経路によるものであり得る。例えば、幾つかの実施形態では、投与は、気管支（気管支内注入（bronchial instillation）によるものを含む）、バッカル、腸内、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、髄腔内、静脈内、脳室内、特定の器官又は組織内（例えば肝内、腫瘍内、腫瘍周囲等）、粘膜、経鼻、経口、直腸、皮下、舌下、局所、気管（気管内注入によるものを含む）、経皮、膣内及び硝子体内（vitreal）であり得る。投与は、間欠投与を含んでいてもよい。代替的には、投与は、少なくとも選択期間にわたる持続投与（例えば、灌流）を含んでいてもよい。当該技術分野で既知のように、抗体療法は一般に、例えば静脈内、皮下又は腫瘍内注射によって非経口的に実施される（例えば、特に腫瘍内で高い用量が所望される場合）。
【0069】
作用物質：「作用物質」という用語は、本明細書で使用される場合、例えばポリペプチド、核酸、糖類、小分子、金属又はそれらの組合せを含む任意の化学的分類の化合物又は物質を指す場合がある。本発明に従って利用することができる作用物質の具体的な実施形態としては、小分子、薬物、ホルモン、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、核酸（例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム）、ペプチド、ペプチド模倣薬等が挙げられる。作用物質は、ポリマーであり得るか又はポリマーを含み得る。
【0070】
抗体：本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、ＣＤ２５、特にヒトＣＤ２５及びヒトＣＤ２５細胞外ドメイン等の特定の標的抗原に対する特異的結合をもたらすのに十分な標準的な免疫グロブリン配列要素を含むポリペプチドを指す。当該技術分野で既知のように、自然に産生される無傷抗体は、互いに会合して「Ｙ字」構造と一般に称されるものとなる２つの同一の重鎖ポリペプチド（各々約５０ｋＤ）及び２つの同一の軽鎖ポリペプチド（各々約２５ｋＤ）で構成される、およそ１５０ｋＤの四量体物質である。各重鎖は、アミノ末端可変（ＶＨ）ドメイン（Ｙ構造の先端に位置する）に続く３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２及びカルボキシ末端ＣＨ３（Ｙのステムの基部に位置する）の少なくとも４つのドメイン（各々約１１０アミノ酸長）で構成される。「スイッチ」として知られる短い領域が重鎖の可変領域と定常領域とを接続する。「ヒンジ」によりＣＨ２及びＣＨ３ドメインが抗体の残りの部分に接続される。このヒンジ領域中の２つのジスルフィド結合が無傷抗体において２つの重鎖ポリペプチドを互いに接続する。各軽鎖は、別の「スイッチ」によって互いに分離したアミノ末端可変（ＶＬ）ドメインに続くカルボキシ末端定常（ＣＬ）ドメインの２つのドメインで構成される。無傷抗体四量体は、２つの重鎖－軽鎖二量体で構成され、重鎖及び軽鎖は、単一のジスルフィド結合によって互いに連結され、他の２つのジスルフィド結合が重鎖ヒンジ領域を互いに接続することで、二量体が互いに接続して、四量体が形成される。また、自然に産生される抗体は、通例ＣＨ２ドメインでグリコシル化され、各ドメインは、圧縮逆平行βバレルにおいて互いに充填された２つのβシート（例えば、３本鎖、４本鎖又は５本鎖のシート）から形成される「免疫グロブリンフォールド」を特徴とする構造を有する。各可変ドメインは、「相補性（complement）決定領域」（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；当該技術分野で理解されるように、例えばＫａｂａｔナンバリングスキームに従って決定される）として知られる３つの超可変ループ及び４つのやや一定の「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を有する。天然抗体が折り畳まれる場合、ＦＲ領域によりドメインに構造的フレームワークをもたらすβシートが形成され、重鎖及び軽鎖の両方のＣＤＲループ領域が三次元空間で集まることで、Ｙ構造の先端に位置する単一の超可変抗原結合部位が生じる。自然発生抗体のＦｃ領域は、補体系の要素に結合し、例えば細胞傷害を媒介するエフェクター細胞を含むエフェクター細胞上の受容体にも結合する。当該技術分野で既知のように、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性及び／又は他の結合属性は、グリコシル化、又は抗体の開発可能性（developability）を改善することができる他の修飾によって調節することができる（Jarasch A et al., 2015）。
【0071】
幾つかの実施形態では、本発明に従って作製及び／又は利用される抗体には、かかるグリコシル化が修飾又は操作されたＦｃドメインを含む、グリコシル化Ｆｃドメインが含まれる。本発明の目的上、或る特定の実施形態では、天然抗体に見られるような十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む任意のポリペプチド又はポリペプチドの複合体は、かかるポリペプチドが自然に産生されるか（例えば、抗原に反応する生物によって生成する）、又は組換え操作、化学合成、又は他の人工システム若しくは方法論によって作製されるかに関わらず、「抗体」と称し、及び／又は「抗体」として使用することができる。幾つかの実施形態では、抗体は、各々が単一の抗体配列に関連（associated）し、抗原内の幾らか異なるエピトープ（異なる参照抗ヒトＣＤ２５抗体に会合するヒトＣＤ２５細胞外ドメイン内の異なるエピトープ等）に結合する抗体のパネルとして生成するポリクローナル又はオリゴクローナルである。
【0072】
ポリクローナル又はオリゴクローナル抗体は、文献中に記載される医学的用途のための単一の調製物中で提供することができる（Kearns JD et al., 2015）。幾つかの実施形態では、抗体はモノクローナルである。幾つかの実施形態では、抗体は、マウス、ウサギ、霊長類又はヒト抗体に特徴的な定常領域配列を有する。幾つかの実施形態では、抗体配列要素は、当該技術分野で既知のようにヒト化、霊長類化（primatized）、キメラ等である。さらに、「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、適切な実施形態では（特に明記されないか又は文脈から明らかでない限り）、抗体の構造的及び機能的特徴を代替的な提示で、例えば下記に規定される抗原結合フラグメントとして利用するための当該技術分野で既知の又は開発された構築物又はフォーマットのいずれかを指す場合がある。例えば、本発明に従って利用される抗体は、無傷ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭ、二重特異性若しくは多重特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｙ（商標）等）、一本鎖可変ドメイン（ｓｃＦｖ）、ポリペプチド－Ｆｃ融合体、Ｆａｂ、ラクダ様（cameloid）抗体、重鎖サメ抗体（ＩｇＮＡＲ）、マスク（masked）抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｙ（商標））、又は（モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に付与するために使用される人工Ｔ細胞受容体を得るための構築物内のｓｃＦｖのように）細胞表面上での発現及び露出を可能にするポリペプチドとの融合タンパク質から選択されるフォーマットであるが、これらに限定されない。マスク抗体は、抗体の抗原結合表面に特異的に結合し、抗体の抗原結合を妨げる遮断又は「マスク」ペプチドを含み得る。マスクペプチドは、切断可能なリンカーによって（例えば、プロテアーゼによって）抗体に連結する。所望の環境、すなわち腫瘍環境におけるリンカーの選択的切断は、マスキング／遮断ペプチドを解離させ、腫瘍において抗原結合が生じるのを可能にすることで、潜在毒性の問題を制限する。幾つかの実施形態では、抗体は、自然に産生された場合にそれが有し得る共有結合修飾（例えば、グリカンの付着）を欠いていてもよい。代替的には、抗体は、共有結合修飾（例えば、グリカン、ペイロード（例えば、検出可能な部分、治療部分、触媒部分等）又は他のペンダント基（例えば、ポリエチレングリコール等）の付着）を有していてもよい。
【0073】
非ＩＬ－２遮断抗体剤：本発明の抗ＣＤ２５抗体剤及び抗原結合フラグメントは、非ＩＬ－２遮断抗体剤である。「非ＩＬ－２遮断抗体剤」という用語は、ＣＤ２５へのＩＬ－２の結合又はＣＤ２５を介したＩＬ－２のシグナル伝達を遮断することなく、ＩＬ－２受容体のＣＤ２５サブユニットへの特異的結合を可能にする抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、抗ＣＤ２５非ＩＬ－２遮断抗体）を指すために本明細書で使用される。抗ＣＤ２５抗体剤は、ＣＤ２５へのＩＬ－２結合に応答して、抗ＣＤ２５抗体剤の非存在下でのシグナル伝達のレベルと比較して少なくとも５０％のＩＬ－２シグナル伝達を可能にする。好ましくは、抗ＣＤ２５抗体剤は、ＣＤ２５に応答して、抗ＣＤ２５抗体剤の非存在下でのシグナル伝達のレベルと比較して少なくとも７５％のＩＬ－２シグナル伝達を可能にする。
【0074】
ＩＬ－２受容体のＣＤ２５サブユニットは、ＩＬ－２受容体のαサブユニットとしても知られ、活性化Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、活性化Ｂ細胞、幾つかの胸腺細胞、骨髄系前駆細胞及び希突起膠細胞上に見られる。ＣＤ２５はＣＤ１２２及びＣＤ１３２と会合し、ＩＬ－２の高親和性受容体として作用するヘテロ三量体複合体を形成する。ヒトＣＤ２５のコンセンサス配列を図２に示す。
【0075】
「特異的結合」、及び「特異的に結合する」（"bind specifically", and "specifically bind"）は、抗体又は抗原結合フラグメントが対象の抗原に対して約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ又は１０－１２Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）を有することを意味するものとして理解される。好ましい実施形態では、解離定数は１０－８Ｍ未満、例えば１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ又は１０－１２Ｍの範囲である。本発明の幾つかの実施形態によれば、「非特異的結合」、「非特異的に結合する（"bind specifically", and "specifically bind"）」は、親和性及び／又はアビディティを指し得る。幾つかの実施形態では、抗ＣＤ２５抗体剤の親和性は、１０－８Ｍ～１０－６Ｍ（例えば、約１０－７Ｍ）である。本発明の幾つかの実施形態では、抗ＣＤ２５抗体剤のアビディティは、約１０－１０Ｍ～１０－８Ｍ（例えば、約１０－９Ｍ）である。本発明の幾つかの実施形態では、抗ＣＤ２５抗体剤の親和性及び／又はアビディティは、約１ｎＭ～７００ｎＭ、又は約１ｎＭ～６００ｎＭ、又は約１ｎＭ～５００ｎＭ、又は約１ｎＭ～４００ｎＭ、又は約１ｎＭ～３００ｎＭである。
【0076】
本明細書で使用される「非ＩＬ－２遮断」、及び「非遮断」、「遮断しない」等への言及（抗ＣＤ２５抗体の存在下でのＣＤ２５へのＩＬ－２結合の非遮断に関して）は、抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合フラグメントが抗体の非存在下でのＩＬ－２シグナル伝達と比較して５０％未満のＩＬ－２シグナル伝達を阻害する実施形態を含む。本明細書に記載される本発明の特定の実施形態では、抗ＣＤ２５抗体又は抗原結合フラグメントは、抗体の非存在下でのＩＬ－２シグナル伝達と比較して、ＩＬ－２シグナル伝達を約４０％、３５％、３０％未満、好ましくは約２５％未満阻害する。抗ＣＤ２５非ＩＬ－２遮断抗体は、ＣＤ２５へのＩＬ－２結合を妨げずに又はＣＤ２５へのＩＬ－２結合を実質的に妨げずに、ＣＤ２５への結合を可能にする。本明細書における非ＩＬ－２遮断抗体への言及は、代替的には、「ＣＤ２５へのインターロイキン－２の結合を阻害しない」抗ＣＤ２５抗体又は「ＩＬ－２のシグナル伝達を阻害しない」抗ＣＤ２５抗体と表現することができる。
【0077】
幾つかの抗ＣＤ２５抗体剤は、ＣＤ２５へのＩＬ－２の結合を可能にし得るが、依然としてＣＤ２５受容体を介したシグナル伝達を遮断する。かかる抗体剤は、本発明の範囲内ではない。代わりに、非ＩＬ－２遮断抗ＣＤ２５抗体剤は、ＣＤ２５へのＩＬ－２の結合を可能にし、抗ＣＤ２５抗体剤の非存在下でのシグナル伝達と比較して、ＣＤ２５受容体を介したシグナル伝達のレベルを少なくとも５０％助長する。
【0078】
ＣＤ２５を介したＩＬ－２シグナル伝達は、実施例において論考され、当該技術分野で既知の方法によって測定することができる。抗ＣＤ２５抗体剤の存在下及び非存在下でのＩＬ－２シグナル伝達の比較は、同じ又は実質的に同じ条件下で行うことができる。
【0079】
幾つかの実施形態では、ＩＬ－２シグナル伝達は、標準Ｓｔａｔ－５リン酸化アッセイを用いて、細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５タンパク質のレベルを測定することによって決定することができる。例えば、ＩＬ－２シグナル伝達を測定するＳｔａｔ－５リン酸化アッセイは、ＰＭＢＣ細胞を１０μｇ／ｍｌ濃度の抗ＣＤ２５抗体の存在下で３０分間培養することと、その後様々な濃度のＩＬ－２（例えば、１０Ｕ／ｍｌで、又は０．２５Ｕ／ｍｌ、０．７４Ｕ／ｍｌ、２．２２Ｕ／ｍｌ、６．６６Ｕ／ｍｌ若しくは２０Ｕ／ｍｌと様々な濃度で）を１０分間添加することとを含み得る。次いで、細胞を透過処理することができ、続いてＳＴＡＴ５タンパク質のレベルをフローサイトメトリーによって分析されるリン酸化ＳＴＡＴ５ペプチドに対する蛍光標識抗体により測定することができる。ＩＬ－２シグナル伝達の遮断率は、以下のように算出することができる：遮断％＝１００×［（Ｓｔａｔ５＋細胞無抗体群（％）－Ｓｔａｔ５＋細胞１０μｇ／ｍｌ抗体群（％））／（Ｓｔａｔ５＋細胞無Ａｂ群（％））］。
【0080】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体剤は、腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を特に腫瘍内で効率的に枯渇させることを特徴とする。
【0081】
幾つかの実施形態では、抗ＣＤ２５抗体剤は、Ｆｃγ受容体に高い親和性で結合し、好ましくは少なくとも１つの活性化Ｆｃγ受容体に高い親和性で結合することを特徴とする。抗体は、少なくとも１つの活性化型Ｆｃγ受容体に約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ又は１０－１０Ｍ未満の解離定数で結合するのが好ましい。幾つかの実施形態では、抗ＣＤ２５抗体剤は、Ｆｃγ受容体に関連した他の特徴を特徴とし、特に、
（ａ）Ｆｃγ受容体に１を上回る活性化型対抑制型比（activatory to inhibitory ratio）（Ａ／Ｉ）で結合し、及び／又は、
（ｂ）ＦｃγＲＩＩｂに結合するよりも高い親和性でＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｃ及びＦｃγＲＩＩＩａの少なくとも１つに結合する。
（ａ）Ｆｃγ受容体に１を上回る活性化型対抑制型比（activatory to inhibitory ratio）（Ａ／Ｉ）で結合し、及び／又は、
（ｂ）ＦｃγＲＩＩｂに結合するよりも高い親和性でＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩｃ及びＦｃγＲＩＩＩａの少なくとも１つに結合する。
【0082】
幾つかの実施形態では、ＣＤ２５抗体剤は、少なくとも１つのＦｃ活性化受容体に結合することが可能であるＩｇＧ１抗体、好ましくはヒトＩｇＧ１抗体である。例えば、抗体はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂから選択される１つ以上の受容体に結合し得る。幾つかの実施形態では、抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａに結合することが可能である。幾つかの実施形態では、抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩａ、並びに任意にＦｃγＲＩに結合することが可能である。幾つかの実施形態では、抗体は、これらの受容体に高い親和性で、例えば約１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ又は１０－１０Ｍ未満の解離定数で結合することが可能である。幾つかの実施形態では、抗体は、抑制型受容体ＦｃγＲＩＩｂに低い親和性で結合する。一態様では、抗体は、ＦｃγＲＩＩｂに１０－７Ｍ超、１０－６Ｍ超又は１０－５Ｍ超の解離定数で結合する。
【0083】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される望ましい抗ＣＤ２５抗体剤は、免疫抑制性細胞又は腫瘍細胞（例えば、いずれの場合にもＣＤ２５を表面上に発現する）等のＣＤ２５発現細胞（例えば、高レベルのＣＤ２５を発現する）に対して細胞傷害であるか、又はその食作用を誘導することを特徴とする。幾つかの実施形態では、抗ＣＤ２５抗体剤は、免疫細胞（例えば、免疫細胞、特にＣＤ２５を発現する免疫細胞と接触した場合）及び腫瘍細胞に対してａＣＤ２５－ａ－６４６と十分に同等の活性（例えば、レベル及び／又はタイプ）を特徴とする。幾つかの実施形態では、関連活性は、ＡＤＣＰ、ＡＤＣＣ又はＣＤＣによるＴｒｅｇ細胞（例えば、固形腫瘍内）又は或る特定のＣＤ２５発現細胞（例えば、高発現細胞）の枯渇、Ｔ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞増加の促進、Ｔ細胞レパートリーの偏重（skewing）等、及びそれらの組合せであるか又はそれを含む。幾つかの実施形態では、レベル及び／又は活性の増大、又はレベルの低下、及び／又はレベル若しくは活性の増大又は無変化は、物質（複数の場合もある）又は部分（複数の場合もある）の非存在下にて、その他の点では同等の条件下で観察されるものと比べて評定又は決定される。代替的又は付加的に、幾つかの実施形態では、レベル及び／又は活性の増大は、参照抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、多くの実施形態では、ダクリズマブ又はバシリキシマブ等のＣＤ２５へのＩＬ－２結合を遮断するＣＤ２５抗体である適切な参照抗ＣＤ２５抗体）が存在する場合に同等の条件下で観察されるものと同等であるか又はそれよりも大きい。多くの実施形態では、本開示に従って使用される抗ＣＤ２５抗体剤は、直接又は間接的にＣＤ２５、通例はその細胞外ドメインに結合する物質又は部分であるか又はそれを含む。幾つかの実施形態では、抗ＣＤ２５抗体剤は、本明細書で例示される抗ＣＤ２５抗体、その抗原結合フラグメント（例えば、１つ以上のＣＤＲ、全ての重鎖ＣＤＲ、全ての軽鎖ＣＤＲ、全てのＣＤＲ、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、又は重鎖及び軽鎖可変領域の両方を含む）、その親和性成熟変異体（又はその抗原結合フラグメント）、又は上述のいずれかの任意の代替フォーマット（例えば、キメラ、ヒト化、多重特異性、代替アイソタイプ等）であるか、それを含むか、又はＣＤ２５への結合についてそれと競合する。代替的又は付加的に、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体剤は、本明細書で開示されるように、スクリーニング、製造（前臨床試験、及び／又はヒトＣＤ２５内の関連エピトープ（例えば、ａＣＤ２５ｅｐ－ａとして特定される配列）の特定）、及び／又は配合、投与、及び／又は特定の状況での有効性（例えば、癌療法に対する）に有利な特徴であり得る１つ以上の特徴を特徴とし得る。
【0084】
抗原：「抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫応答を誘発し、及び／又はＴ細胞受容体（例えば、ＭＨＣ分子によって提示される場合）及び／又はＢ細胞受容体に結合する作用物質を指す。液性応答を誘発する抗原は、抗原特異抗体の産生を伴うか、又はＣＤ２５細胞外ドメインについて実施例に示されるように、抗体ライブラリーのスクリーニング及び更に特性評価すべき候補抗体配列の特定に使用することができる。
【0085】
抗原結合フラグメント：本明細書で使用される場合、「抗原結合フラグメント」という用語は、抗体が標的とする抗原に特異的に結合する能力を抗原結合フラグメントに与えるのに十分な本明細書に記載される抗体の１つ以上の部分を含む（include or comprise）作用物質を包含する。例えば、幾つかの実施形態では、この用語は、特異的結合をもたらすのに十分な免疫グロブリン構造要素を含む任意のポリペプチド又はポリペプチド複合体を包含する。例示的な抗原結合フラグメントとしては、小モジュール免疫薬（Small Modular ImmunoPharmaceuticals；「ＳＭＩＰ（商標）」）、一本鎖抗体、ラクダ様抗体、単一ドメイン抗体（例えば、サメ単一ドメイン抗体）、一本鎖若しくはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（商標）、ミニボディ（minibodies）、ＢｉＴＥ（商標）、アンキリンリピートタンパク質、すなわちＤＡＲＰＩＮ（商標）、Ａｖｉｍｅｒ（商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）、Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｙ（商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（商標）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎ、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ（商標）、ＣｏＶＸ ｂｏｄｙ、ＢｉＣｙｃｌｉｃペプチド、Ｋｕｎｉｔｚドメイン由来の抗体構築物、又は所望の生物活性を示す限りにおいて任意の他の抗体フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、この用語は、ステープルペプチド、抗体様結合ペプチド模倣薬、抗体様結合足場タンパク質、モノボディ（monobodies）、及び／又は例えば文献（Vazquez－Lombardi R et al., 2015）中で概説される他の非抗体タンパク質足場等の他のタンパク質構造を包含する。幾つかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列が当業者によって相補性決定領域（ＣＤＲ）と認められる１つ以上の構造要素を含むポリペプチドであるか又はそれを含む。幾つかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列が、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６アミノ酸配列要素）に見られるものと実質的に同一である、少なくとも１つの参照ＣＤＲ（例えば、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ及び／又は少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ）、特に少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ、例えばＨＣＤＲ３（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３配列）を含むポリペプチドであるか又はそれを含む。幾つかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列が、配列が同一であるか、又はかかる参照ＣＤＲと比べて僅かに（例えば、１つ、２つ、３つ又は４つ）多いアミノ酸変化（例えば、置換、付加又は欠失；多くの場合、置換）を有するが、参照ＣＤＲが得られた抗体（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６）の標的への結合を維持する、少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ及び／又は少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ）を含むポリペプチドであるか又はそれを含む。幾つかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、参照抗体の重鎖又は軽鎖（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６）に由来する３つの全てのＣＤＲ（又は幾つかの実施形態では、それに実質的に同一の配列）を含むポリペプチド又はその複合体であるか又はそれを含む。幾つかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、参照抗体（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６）に由来する６つ全てのＣＤＲ（又は幾つかの実施形態では、それに実質的に同一の配列）を含むポリペプチド又はその複合体であるか又はそれを含む。幾つかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、参照抗体（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６）の重鎖及び／又は軽鎖可変ドメイン（又は幾つかの実施形態では、それに実質的に同一の配列）を含むポリペプチド又はその複合体であるか又はそれを含む。幾つかの実施形態では、「抗原結合フラグメント」という用語は、核酸アプタマー、例えばＲＮＡアプタマー及びＤＮＡアプタマー等の非ペプチド及び非タンパク質構造を包含する。アプタマーは、ポリペプチド等の特定の標的に結合するオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその類似体若しくは誘導体）である。アプタマーは、小分子、タンパク質、核酸、更には細胞及び組織等の様々な分子標的に特異的に結合する短い合成一本鎖オリゴヌクレオチドである。これらの小核酸分子は、タンパク質又は他の細胞標的に特異的に結合することが可能であり、本質的に抗体の化学的同等物である二次及び三次構造を形成することができる。アプタマーは、高度に特異的であり、サイズが比較的小さく、非免疫原性である。アプタマーは概して、ＳＥＬＥＸ（指数的濃縮によるリガンドの系統的進化；Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment））として知られるバイオパニング法によって選択される（例えば、Ellington et al, 1990、Tuerk et al., 1990、Ni et al., 2011を参照されたい）。任意の所与の標的に対するアプタマーを生成する方法は、当該技術分野で既知である。アフィマーを含むペプチドアプタマーも包含される。アフィマーは、特定の標的タンパク質に対する高親和性結合表面をもたらすペプチドループを示すように操作された、小さな高度に安定したタンパク質である。アフィマーは、シスタチンのシステインプロテアーゼ阻害剤ファミリーに由来する１２ｋＤａ～１４ｋＤａと低分子量のタンパク質である。アフィマータンパク質は、シスタチンタンパク質フォールドをベースとする安定したタンパク質である足場から構成される。アフィマータンパク質は、抗体と同様の高い親和性及び特異性で異なる標的タンパク質に結合するように無作為化することができる２つのペプチドループ及びＮ末端配列を示す。タンパク質足場に対するペプチドの安定化は、ペプチドがとることができる可能な立体配座を制約し、それにより遊離ペプチドライブラリーと比較して結合親和性及び特異性を増大させる。
【0086】
生体サンプル。本明細書で使用される場合、「生体サンプル」又は「サンプル」という用語は通例、本明細書に記載される対象の生物学的起源（例えば、組織又は生物又は細胞培養）から得られるか又はそれに由来するサンプルを指す。対象の起源は、動物又はヒト等の生物であり得る。生体サンプルは、生体組織又は体液を含み得る。
【0087】
癌：「癌」、「悪性疾患」、「新生物」、「腫瘍（"tumor", "tumour"）」及び「癌腫」という用語は、相対的に異常な、無制御の及び／又は自律的な成長を示し、顕著な制御不能の細胞増殖を特徴とする異常な成長表現型を示す細胞を指すために本明細書で区別なく用いられる場合もある。概して、本出願の検出又は治療にとって関心が持たれる細胞は、前癌性（例えば、良性）、悪性、前転移性（pre－metastatic）、転移性及び非転移性の細胞を含む。本開示の教示は、あらゆる全ての癌に関連し得る。非限定的な例を幾つか挙げると、幾つかの実施形態では、本開示の教示は、１つ以上の癌、例えば白血病、リンパ腫（ホジキン及び非ホジキン）、骨髄腫及び骨髄増殖性障害を含む造血器癌；肉腫、黒色腫、腺腫、固形組織の癌、口腔、咽喉、喉頭及び肺の扁平上皮癌、肝癌、前立腺癌、子宮頸癌、膀胱癌、子宮癌、並びに子宮内膜癌及び腎細胞癌等の泌尿生殖器癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、皮膚黒色腫又は眼内黒色腫、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、頭頸部癌、乳癌、消化管癌及び神経系癌、乳頭腫等の良性病変等に適用される。本発明の抗体は、ＣＤ２５＋発現腫瘍の治療に使用することができる。ＣＤ２５発現腫瘍を含む癌の治療は、ホジキンリンパ腫等のリンパ腫、及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）等のリンパ性白血病を含み得るが、これらに限定されない。
【0088】
併用療法：本明細書で使用される場合、「併用療法」という用語は、被験体を２つ以上の治療計画（例えば、２つ以上の治療剤）に同時に曝露する状況を指す。幾つかの実施形態では、２つ以上の作用物質を同時に投与することができる。代替的には、かかる作用物質を順次に投与することができ、そうでなければ、かかる作用物質を重複する投与計画で投与する。
【0089】
同等の：本明細書で使用される場合、「同等の」という用語は、互いに同一でなくてもよいが、比較（例えば、レベル及び／又は活性による）を可能にし、観察された差異又は類似性に基づいて結論を合理的に導き出すことができるように十分に似ている、２つ以上の作用物質、物質、状況、効果、条件のセット等を指す。かかる同等の条件のセット、効果、状況、個体又は集団は、複数の実質的に同一の特徴及び１つ又は少数の多様な特徴を特徴とする。当業者には、文脈上、２つ以上のかかる作用物質、物質、状況、条件のセット、効果又は集団等を同等とみなすために任意の所与の状況において必要される同一性の程度が理解される。
【0090】
含む：１つ以上の指定の要素又は工程を「含む」として本明細書に記載される組成物又は方法は、非限定的（open－ended）であり、指定の要素又は工程が不可欠であるが、他の要素又は工程を組成物又は方法の範囲内で加えてもよいことを意味する。１つ以上の指定の要素又は工程を「含む」（"comprising" (or which "comprises")）として記載される任意の組成物又は方法が、同じ指定の要素又は工程「から本質的になる」（"consisting essentially of" (or which "consists essentially of")）対応する、より限定的な組成物又は方法も表すことも理解され、これは、組成物又は方法が指定の不可欠な要素又は工程を含み、組成物又は方法の基本的な新規の特徴（複数の場合もある）に実質的な影響を及ぼさない付加的な要素又は工程を含んでいてもよいことを意味する。
【0091】
枯渇した：本明細書で使用される場合、「枯渇した」又は「枯渇する」への言及（抗ＣＤ２５抗体剤による制御性Ｔ細胞の枯渇に関する）は、Ｔｒｅｇの数、比率又はパーセンテージが、ＣＤ２５へのインターロイキン２の結合を阻害しない抗ＣＤ２５抗体を投与しない場合と比べて減少していることを意味する。本明細書に記載される本発明の特定の実施形態では、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９９％超の腫瘍浸潤制御性Ｔ細胞を枯渇させる。
【0092】
剤形：本明細書で使用される場合、「剤形」という用語は、被験体に投与される活性物質（例えば、治療剤又は診断剤）の物理的に分離した単位を指す。各単位は、所定量の活性物質を含有する。幾つかの実施形態では、かかる量は、適切な母集団に投与した場合に所望の又は有益な結果と相関することが決定された投与計画（すなわち、治療的投与計画）に従う投与に適切な単位投与量（又はその全画分）である。当業者には、特定の被験体に投与される治療用組成物又は作用物質の総量は、１人以上の主治医によって決定され、複数の剤形の投与を伴い得ることが理解される。
【0093】
投与計画：本明細書で使用される場合、「投与計画」という用語は、通例は時間を空けて被験体に個別に投与される単位用量（通例、２つ以上）のセットを指す。幾つかの実施形態では、所与の治療剤は、１回以上の投与を含み得る、推奨される投与計画を有する。幾つかの実施形態では、投与計画は、各々同じ長さの時間を空けた複数回の投与を含む。代替的には、投与計画は複数回の投与を含み、個々の投与は少なくとも２つの異なる時間で隔てられる。幾つかの実施形態では、投与計画内の全ての投与が同じ単位用量である。代替的には、投与計画内の異なる投与は、異なる量である。幾つかの実施形態では、投与計画は、第１の用量での第１の投与に続く、第１の用量とは異なる第２の用量での１回以上の付加的な投与を含む。投与計画は、第１の用量での第１の投与に続く、第１の用量と同じ第２の用量での１回以上の付加的な投与を含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、投与計画は、関連集団にわたって実施した場合に所望の又は有益な転帰と相関する（すなわち、治療的投与計画である）。
【0094】
エピトープ：本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体又は抗原結合フラグメントが結合する抗原の一部分を指す。幾つかの実施形態では、抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、抗原中では共有結合的に連続しないが、抗原が関連の立体配座にある場合に三次元空間内で互いに近接する抗原の部分で構成される立体配座エピトープである。例えば、ＣＤ２５については、立体配座エピトープは、ＣＤ２５細胞外ドメインにおいて連続しないアミノ酸残基で構成されるエピトープであり、線状エピトープは、ＣＤ２５細胞外ドメインにおいて連続したアミノ酸残基で構成されるエピトープである。幾つかの実施形態では、本発明に従って利用されるエピトープは、本明細書で提供される抗ＣＤ２５抗体剤（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６により、またａＣＤ２５ｅｐ－ａとして規定される）が結合するエピトープを参照することによって提供される。ａＣＤ２５－ａ－６４６のエピトープの正確な配列及び／又は特定のアミノ酸残基を決定する手段は、文献及び実施例において既知であり、抗原配列に由来するペプチドとの競合、異なる種に由来するＣＤ２５配列への結合、切断、及び／又は突然変異誘発（例えば、アラニンスキャニング又は他の部位特異的突然変異誘発による）、ファージディスプレイベースのスクリーニング、酵母提示技術又は（共）結晶構造解析法が挙げられる。
【0095】
同一性：当該技術分野で既知の同一率（％）は、配列を比較することによって決定される２つ以上のポリペプチド配列又は２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該技術分野では、同一性は、場合によっては、かかる配列の連続間の一致によって決定されるポリペプチド又はポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。２つのポリペプチド又は２つのポリヌクレオチド配列の間の同一性を測定する多数の方法が存在するが、同一性の決定に一般に用いられる方法は、コンピュータプログラムにコード化されている。２つの配列間の同一性を決定するのに好ましいコンピュータプログラムとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990)）が挙げられるが、これらに限定されない。２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一率は、最適比較目的で配列をアラインメントし（例えば、配列との最良アラインメントのためにギャップを第１の配列に導入することができる）、対応する位置でアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較することによって決定される。「最良アラインメント」は、最も高い同一率をもたらす２つの配列のアラインメントである。同一率は、比較される配列中の同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドの数によって決定される（すなわち、同一性（％）＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。概して、本明細書における同一性（％）への言及は、文脈上他に明示又は暗示されない限り、分子の全長にわたる同一性（％）を指す。
【0096】
免疫エフェクター細胞：免疫エフェクター細胞は、免疫応答のエフェクター相に関与する免疫細胞を指す。例示的な免疫細胞としては、骨髄又はリンパ系起源の細胞、例えばリンパ球（例えば、Ｂ細胞及び細胞溶解性（cytolytic）Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、マスト細胞及び好塩基球が挙げられる。
【0097】
免疫応答のエフェクター相に関与する免疫エフェクター細胞は、特異的Ｆｃ受容体を発現し、特定の免疫機能を行う。エフェクター細胞は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導し得る。例えば、好中球がＡＤＣＣを誘導することが可能である。エフェクター細胞は、標的抗原、標的細胞又は微生物の食作用である抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）を誘導することもできる（例えばＡＤＣＰが可能なマクロファージ）。例えば、ＦｃαＲを発現する単球、マクロファージ、好中球、好酸球及びリンパ球は、標的細胞の特異的殺傷及び免疫系の他の構成要素への抗原の提示、又は抗原を提示する細胞への結合に関与する。本明細書で論考されるように、本発明による抗体は、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰを誘導する能力について最適化することができる。
【0098】
制御性Ｔ細胞：本明細書で使用される場合、「制御性Ｔ細胞」（「Ｔｒｅｇ」、「Ｔｒｅｇ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」）は、自己免疫、アレルギー及び感染の制御に特化したＣＤ４＋Ｔリンパ球の系統を指す。これらは通例、Ｔ細胞集団の活性を調節するが、或る特定の自然免疫系の細胞型に影響を与える場合もある。Ｔｒｅｇは通常、バイオマーカーＣＤ４、ＣＤ２５及びＦｏｘｐ３の発現、並びにＣＤ１２７の低発現によって特定される。自然発生Ｔｒｅｇ細胞は通常、末梢性ＣＤ４＋Ｔリンパ球の約５％～１０％を占める。しかしながら、腫瘍微小環境（すなわち、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ細胞）では、これらは全ＣＤ４＋Ｔリンパ球集団の２０％～３０％も占める場合がある。
【0099】
活性化ヒトＴｒｅｇ細胞は、エフェクターＴ細胞及びＡＰＣ等の標的細胞をパーフォリン依存性経路又はグランザイムＢ依存性経路を介して直接殺傷させることができる。細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４＋）Ｔｒｅｇ細胞は、ＡＰＣによってインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）発現を誘導し、これらが次にトリプトファンを還元することによってＴ細胞活性化を抑制する。Ｔｒｅｇ細胞は、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）及び形質転換成長因子（ＴＧＦβ）をｉｎ ｖｉｖｏで放出することにより、Ｔ細胞活性化を直接阻害し、ＭＨＣ分子、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＩＬ－１２の発現を阻害することによってＡＰＣ機能を抑制する。Ｔｒｅｇ細胞は、抗原提示細胞上のＣＤ８０及びＣＤ８６に結合し得る高レベルのＣＴＬＡ４を発現し、エフェクターＴ細胞の適当な活性化を妨げることによって免疫を抑制することもできる。
【0100】
患者：本明細書で使用される場合、「患者」又は「被験体」という用語は、提供される組成物を例えば実験、診断、予防、美容及び／又は治療目的で投与する又は投与することができる任意の生物を指す。典型的な患者としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類及び／又はヒト等の哺乳動物）が挙げられる。幾つかの実施形態では、患者はヒトである。幾つかの実施形態では、患者は、１つ以上の障害又は病態を患っているか又はその影響を受けやすい。患者は、障害若しくは病態の１つ以上の症状を示していても、又は１つ以上の障害若しくは病態（癌、又は１つ以上の腫瘍の存在等）であると診断されていてもよい。幾つかの実施形態では、患者は、かかる疾患、障害又は病態の診断及び／又は治療のために或る特定の療法を受けている又は受けた。
【0101】
薬学的に許容可能な：本明細書で使用される場合、本明細書で開示される組成物の配合に使用される担体、希釈剤又は賦形剤に適用される「薬学的に許容可能な」という用語は、担体、希釈剤又は賦形剤が組成物の他の成分に適合し、その受容者に有害でない必要があることを意味する。
【0102】
医薬組成物：本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、活性物質が１つ以上の薬学的に許容可能な担体と共に配合された組成物を指す。幾つかの実施形態では、活性物質は、関連集団に投与した場合に所定の治療効果を達成する統計的に有意な可能性を示す治療計画での投与に適切な単位用量で存在する。医薬組成物は、以下に適合したものを含む固体又は液体形態での投与のために配合することができる：経口投与、例えば水薬（drenches）（水性又は非水性の溶液又は懸濁液）、錠剤、例えば口腔、舌下及び全身性吸収を対象とする錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、舌への適用のためのペースト；例えば滅菌溶液若しくは懸濁液、又は徐放性配合物としての皮下、筋肉内、静脈内、腫瘍内又は硬膜外注射による非経口投与；例えば皮膚、肺又は口腔に適用されるクリーム、軟膏、又は制御放出パッチ若しくはスプレーとしての局所適用；膣内、直腸内、舌下、眼内、経皮、経鼻、経肺、及び他の粘膜表面への適用。
【0103】
固形腫瘍：本明細書で使用される場合、「固形腫瘍」という用語は、通常は嚢胞又は液体領域を有しない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は、良性又は悪性であり得る。固形腫瘍の種々のタイプは、固形腫瘍を形成する細胞のタイプから名付けられる。固形腫瘍の例は、肉腫（海綿骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織、造血組織又は線維性結合組織等の組織中の間葉起源の形質転換細胞から生じる癌を含む）、癌腫（上皮細胞から生じる腫瘍を含む）、黒色腫、リンパ腫、中皮腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫等である。固形腫瘍を伴う癌としては、限定されるものではないが、脳癌、肺癌、胃癌、十二指腸癌、食道癌、乳癌、結腸癌及び直腸癌、腎癌、膀胱癌、腎臓癌、膵癌、前立腺癌、卵巣癌、黒色腫、口腔癌、肉腫、眼癌、甲状腺癌、尿道癌、膣癌、頸部癌、リンパ腫等が挙げられる。
【0104】
治療有効量：本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、疾患及び／又は病態を患っているか又はその影響を受けやすい集団に治療的投与計画に従って投与した場合に、かかる疾患及び／又は病態を治療するのに十分な（例えば、作用物質又は医薬組成物の）量を意味する。治療有効量は、疾患、障害及び／又は病態の１つ以上の症状の発生率及び／又は重症度を低減する、安定させる、及び／又は発症を遅らせる量である。当業者には、「治療有効量」が特定の被験体において治療の成功が達成されることを実際に必要としないことが理解される。
【0105】
治療：本明細書で使用される場合、「治療」という用語（「治療する」（"treat" or "treating"）も）は、１つ以上の症状を部分的又は完全に軽減する、改善する、緩和する、阻害する、その発症を遅らせる、その重症度を低減する、及び／又はその発生率を低減する物質（例えば、ａＣＤ２５－ａ－６４６によって例示される、提供される抗ＣＤ２５抗体剤、又は任意の他の作用物質）の任意の投与を指す。幾つかの実施形態では、治療は、ａＣＤ２５－ａ－６４６等の抗ＣＤ２５抗体剤の直接投与（例えば、静脈内、腫瘍内又は腫瘍周囲注射に使用される薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又はアジュバントを任意に含む注射用水性組成物としての）、又は細胞を被験体から得ることと（例えば、マーカーの発現の存在又は非存在に基づく選択を伴い又は伴わずに、血液、組織又は腫瘍から）、上記細胞とａＣＤ２５－ａ－６４６等の抗ＣＤ２５抗体剤とをｅｘ ｖｉｖｏで接触させることと、かかる細胞を被験体に投与することと（マーカーの発現の存在又は非存在に基づく選択を伴う又は伴わない）を含む計画を用いた投与を含み得る。
【0106】
投薬及び投与。本発明に従って使用される、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体剤（例えばａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、例えば抗ＣＤ２５又はその抗原結合フラグメント）を含む医薬組成物は、当業者に既知の及び／又は利用可能な様々な技法及び／又は技術のいずれかを用いて貯蔵及び／又は送達のために調製することができる。幾つかの実施形態では、提供される抗ＣＤ２５抗体剤は、例えば関連適応症についてアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）及び／又は欧州医薬品庁（ＥＭＥＡ）等の規制当局に認可された投与計画に従って投与される。幾つかの実施形態では、提供される抗ＣＤ２５抗体剤は、それ自体が、例えば関連適応症についてアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）及び／又は欧州医薬品庁（ＥＭＥＡ）等の規制当局に認可された投与計画に従って投与され得る１つ以上の他の作用物質又は療法と組み合わせて投与される。しかしながら、幾つかの実施形態では、提供される抗ＣＤ２５抗体剤の使用により、抗ＣＤ２５抗体剤療法と組み合わせて使用される、認可された作用物質又は療法の投薬の低減（例えば、１回以上の投与でより少量の活性物質、より少ない投与回数、及び／又は投与頻度の低下）が可能となり得る。幾つかの実施形態では、投薬及び／又は投与は、同様に投与される他の薬物、患者の状態、及び／又は抗ＣＤ２５抗体剤のフォーマット（例えば、免疫複合体、単一ドメイン抗体又は二重特異性抗体として改変される）に適合することができる。
【0107】
さらに、幾つかの実施形態では、特定の細胞型、特定の腫瘍若しくはそのタイプ、又は特定の患者集団（例えば、遺伝子マーカーを保有する）のいずれかについて投与計画を調整し、特にタイミング及び／又はＣＤ２５の閾値発現レベルに基づいて連続投与計画を設計することが望ましい場合がある。幾つかのかかる実施形態では、治療的投与計画は、療法前及び／又は療法中に１つ以上の誘導性マーカーの発現又は他の基準を評定する検出方法と組み合わせるか、又はそれを考慮して調整することができる。
【0108】
幾つかの実施形態では、本発明による投薬及び投与では、所望の程度の純度を有する活性物質を１つ以上の生理学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤と組み合わせて任意の又は様々な形態で利用する。これらの形態としては、例えば液体、半固体及び固体の剤形、例えば液体溶液（例えば、注射溶液及び注入溶液）、分散液又は懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、リポソーム及び坐剤が挙げられる。好ましい形態は、意図される投与方法及び／又は治療用途によって異なるが、通例、抗体によるヒト被験体の治療に使用されるものと同様の組成物等の注射溶液又は注入溶液の形態であり得る。
【0109】
幾つかの実施形態では、成分（複数の場合もある）は、埋め込み注射剤、経皮パッチ及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出配合物のように作用物質（複数の場合もある）を急速な放出及び／又は分解から保護する担体を用いて調製することができる。ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル及びポリ乳酸等の生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。概して、各活性物質は、適切な医療行為と適合し、関連作用物質（複数の場合もある）（例えば、抗体等の作用物質）に適切な医薬組成物及び投与計画を用いて治療有効量で配合、投薬及び投与される。活性物質を含有する医薬組成物は、限定されるものではないが、経口投与、粘膜投与、吸入投与、局所投与、バッカル投与、経鼻投与、直腸投与又は非経口投与（例えば、静脈内、点滴、腫瘍内、節内（intranodal）、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、経皮、又は被験体の組織の物理的切開（physical breaching）及びかかる切開部を介した医薬組成物の投与を伴う他の種類の投与）を含む当該技術分野で既知の任意の適切な方法によって投与することができる。
【0110】
幾つかの実施形態では、特定の活性物質の投与計画は、例えば被験体の対象の１つ以上の組織又は体液において特定の所望の薬物動態プロファイル又は他の曝露パターンを達成するための間欠又は持続（例えば、灌流又は徐放システムによる）投与を含み得る。幾つかの実施形態では、組み合わせて投与される異なる作用物質を、異なる送達経路により及び／又は異なるスケジュールに従って投与することができる。代替的又は付加的には、幾つかの実施形態では、１つ以上の用量の第１の活性物質を１つ以上の他の活性物質と実質的に同時に、幾つかの実施形態では共通の経路により及び／又は単一の組成物の一部として投与する。
【0111】
経路及び／又は投与スケジュールを所与の治療計画に最適化する場合に考慮すべき因子は、例えば治療される特定の癌（例えば、タイプ、ステージ、位置等）、被験体の臨床状態（例えば、年齢、健康全般、体重等）、作用物質の送達部位、作用物質（例えば、抗体又は他のタンパク質ベースの化合物）の性質、作用物質の投与方法及び／又は投与経路、併用療法の有無、並びに医師に知られている他の因子を含み得る。
【0112】
当業者には、例えば特定の送達経路が用量に影響する可能性があり、及び／又は必要とされる用量が送達経路に影響する可能性があることが理解される。例えば、特定の部位又は位置（例えば、組織又は器官内）において特に高濃度の作用物質を目的とする場合、集中的な送達（例えば、腫瘍内送達）が所望される及び／又は有用である可能性がある。幾つかの実施形態では、特定の医薬組成物及び／又は利用される投与計画の１つ以上の特徴は、例えば所望の治療効果又は応答（例えば、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体剤の機能的特徴に関連する治療的又は生物学的応答）を最適化するために、時間と共に修正することができる（例えば、任意の個々の投与における活性物質量の増減、投与間の時間間隔の増減等）。概して、本発明に従う活性物質の投薬のタイプ、量及び頻度は、関連作用物質（複数の場合もある）を哺乳動物、好ましくはヒトに投与する場合に適用される安全性及び有効性の要件に左右される。概して、かかる投薬の特徴は、療法がない場合に観察されるものと比較して特定の通例検出可能な治療応答をもたらすように選択される。本発明の状況下で、例示的な望ましい治療応答は、腫瘍成長、腫瘍サイズ、転移、腫瘍と関連する症状及び副作用の１つ以上の阻害及び／又は減少、並びに癌細胞のアポトーシスの増加、１つ以上の細胞マーカー又は循環マーカーの治療的に関連する減少又は増加等を含み得るが、これらに限定されない。かかる基準は、文献に開示される様々な免疫学的方法、細胞学的方法及び他の方法のいずれかによって容易に評定することができる。例えば、単独での又は更なる作用物質と組み合わせた抗ＣＤ２５抗体剤の治療有効量は、実施例に記載されるように癌細胞の殺傷を増強するのに十分であるとして決定され得る。
【0113】
活性物質又はかかる作用物質を含む組成物としての抗ＣＤ２５抗体剤の治療有効量は、例えば治療される疾患又は病態、疾患のステージ、治療される哺乳動物の年齢及び健康及び体調、疾患の重症度、投与される特定の化合物等の１つ以上の因子を考慮することを含む、当該技術分野で利用可能な技法を用いて容易に決定することができる。
【0114】
幾つかの実施形態では、治療有効量は、活性物質の効果的な用量（及び／又は単位用量）であり、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも約０．０５ｍｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ（体重）、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）又はそれ以上（例えば０．０１ｍｇ／ｋｇ（体重）、０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）、０．３ｍｇ／ｋｇ（体重）、０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）、１ｍｇ／ｋｇ（体重）、２ｍｇ／ｋｇ（体重）、３ｍｇ／ｋｇ（体重）、４ｍｇ／ｋｇ（体重）、５ｍｇ／ｋｇ（体重）、６ｍｇ／ｋｇ（体重）、７ｍｇ／ｋｇ（体重）、８ｍｇ／ｋｇ（体重）、９ｍｇ／ｋｇ（体重）、１０ｍｇ／ｋｇ（体重）、２０ｍｇ／ｋｇ（体重）、３０ｍｇ／ｋｇ（体重）、４０ｍｇ／ｋｇ（体重）又は５０ｍｇ／ｋｇ（体重））であり得る。幾つかの実施形態では、かかる指針が活性物質の分子量に応じて調整され得ることが当業者には理解される。投与量は投与経路、治療サイクル、又は結果として、漸増用量でのａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む単離抗体又はその抗原結合フラグメントの投与と関連した最大耐量及び用量制限毒性（もしあれば）の決定に用いることができる用量漸増プロトコルに応じて変更することもできる。
【0115】
治療用組成物は通例、滅菌であり、製造及び貯蔵の条件下で安定したものとする。組成物は溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、又は高い薬物濃度に適した他の規則構造として配合することができる。滅菌注射溶液は、必要量の抗体を上記に列挙した成分の１つ又は組合せと共に適切な溶媒に組み入れ、続いて濾過減菌（filtered sterilization）を行うことによって調製することができる。概して、分散液は、基本的な分散媒及び上記に列挙したものからの他の必要とされる成分を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を組み入れることによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過した溶液から有効成分及び任意の付加的な所望の成分の粉末を生じる真空乾燥及び凍結乾燥である。溶液の適当な流動性は、例えばコーティング剤の使用、分散液の場合の必要とされる粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。注射用組成物の持続的吸収は、組成物に吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを加えることによってもたらすことができる。
【0116】
各作用物質の配合物は、望ましくは滅菌濾過膜を通した濾過によって達成され得るように滅菌であり、その後ボーラス投与又は持続投与に適した形態でパッケージング又は販売されるものとする。注射用配合物は、単位剤形、例えば保存料の入ったアンプル又は複数回投与用容器内で調製、パッケージング又は販売することができる。非経口投与用の配合物としては、懸濁液、溶液、油性又は水性ビヒクル中のエマルション、ペースト、及び本明細書で論考されるような埋め込み可能な徐放性又は生分解性配合物が挙げられるが、これらに限定されない。滅菌注射製剤は、水又は１，３－ブタンジオール等の非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒を用いて調製することができる。他の有用な非経口投与可能な配合物としては、微結晶形態で、リポソーム製剤中で、又は生分解性ポリマー系の構成成分として有効成分を含むものが挙げられる。持続放出又は移植のための組成物は、エマルション、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー又は塩等の薬学的に許容可能なポリマー材料又は疎水性材料を含み得る。
【0117】
本発明に従って使用される各医薬組成物は、用いられる投与量及び濃度で被験体に対して非毒性である薬学的に許容可能な分散剤、湿潤剤、懸濁化剤、等張剤、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、担体、賦形剤、塩又は安定化剤を含み得る。かかる付加的な薬学的に許容可能な化合物の包括的でないリストには、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；薬理学的に許容可能なアニオンを含有する塩（酢酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド及び吉草酸塩等）；保存料（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；塩化ナトリウム；フェノール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール；メチルパラベン又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖、二糖及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；及び／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含まれる。
【0118】
２つ以上の活性物質を本発明に従って利用する幾つかの実施形態では、かかる作用物質は、同時又は順次に投与することができる。幾つかの実施形態では、或る作用物質の投与を、別の作用物質の投与に対して特別にタイミングを合わせる。幾つかの実施形態では、幾つかの実施形態では、組合せで投与される作用物質の所望の相対的投与計画を、例えばｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを用いて評定するか又は経験的に決定することができる。幾つかの実施形態では、かかる評定又は経験的決定は、ｉｎ ｖｉｖｏで特定の患者又は患者集団（例えば、相関が得られるように）において行われる。
【0119】
幾つかの実施形態では、本発明の実施に際して利用される１つ以上の活性物質を、少なくとも２回のサイクルを含む間欠投与計画に従って投与する。２つ以上の作用物質を組み合わせて、各々かかる間欠サイクル計画によって投与する場合、個々の用量の異なる作用物質を互いに組み合わせることができる。幾つかの実施形態では、１つ以上の用量の第２の作用物質を本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体剤の投与の一定時間後に投与する。幾つかの実施形態では、各用量の第２の作用物質を本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体剤の投与の一定時間後に投与する。幾つかの実施形態では、１つ以上の用量の第２の作用物質を抗ＣＤ２５抗体剤の投与の一定時間前に投与する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体剤は、１週間、２週間、４週間又はそれ以上にわたる１回以上の治療サイクルにおいて同じ経路による後続の投与だけでなく、皮下（又は筋肉内）投与及び腫瘍内投与等の代替（alternating）投与経路による後続の投与を含む計画で投与し、かかるサイクルを患者応答に応じて同じ計画で（又は投与間の間隔を長くして）繰り返すこともできる。また、幾つかの実施形態では、従う正確な計画（例えば、投与回数、投与間隔（例えば、互いに対する又は別の療法の実施等の別の事象）、投与量等は、１回以上のサイクルで１つ以上の他のサイクルと比較して異なっていてもよい。
【0120】
本明細書に記載される投与経路、投与量及び／又は計画のいずれかを用いることで、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体剤を、例えば患者において生検、血液サンプルを用いて測定される１つ以上の基準、及び／又は他の臨床基準を考慮に入れて特定、特性評価及び／又は検証することができる。幾つかの実施形態では、腫瘍サイズ及び／又は転移の直接評価の代わりに又はそれに加えて、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体剤の治療有効性を、以下の１つ以上の異なる一般基準を評価する方法において決定することができる：循環、腫瘍及び／又はリンパ器官中の制御性Ｔ細胞の減少、癌細胞に対する直接細胞傷害（癌細胞のアポトーシス及びネクローシス）、腫瘍浸潤免疫細胞（ＣＤ４陽性及び／又はＣＤ８陽性腫瘍浸潤Ｔ細胞等）の増加、血中を循環する免疫細胞（リンパ球、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞等の全集団又は特定の亜集団）の増加、及び／又は応答患者又は非応答患者のいずれかのみにおける治療前対治療後の幾らかの差次的発現の提示（ＲＮＡシークエンシング、マスフローサイトメトリー及び／又は他のマスシークエンシングアプローチによって決定される）。代替的又は付加的に、幾つかの実施形態では、かかる特定、特性評価及び／又は検証は、ｍＲＮＡ及び／又は１つ以上の特定のタンパク質又はタンパク質のセットのタンパク質発現をスクリーニングすることによる分子レベルでの追跡を含み得る。幾つかの実施形態では、１つ以上のかかる技法により、例えば腫瘍内の（又は近くの）及び／又は血中を循環する特定の細胞集団についての組織分布及び／又はマーカーと関連し得る、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体剤に対する応答を評価するための関連情報の特定が可能となり得る。
【0121】
かかるアプローチ及び免疫生物学的データは、１つ以上の有効性及び／又は安全性パラメーター又は特性の決定を可能とし得るだけでなく、幾つかの実施形態では、例えば単独で及び／又は更なる治療効果をもたらし得る他の薬物、標準治療プロトコル又は免疫療法と組み合わせて、所与の適応症についての１つ以上の臨床試験において利用することができる特定の用量、経路又は投与計画を選ぶ論理的根拠をもたらし得る。このため、本発明の一連の更なる実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体剤は、かかる配合物での治療後又は治療前にＲＮＡ及び／又はタンパク質レベルで患者の細胞又は組織（腫瘍、血液サンプル又は血液画分等）における１つ以上の遺伝子の発現の存在（及び／又は非存在）の組合せを決定した後に、疾患（癌等）を患う患者を治療するか又は疾患（癌等）を予防する方法に使用される。したがって、かかる方法は、望ましい抗ＣＤ２５抗体剤の治療有効量に関連した１つ以上のバイオマーカー若しくはより複雑な遺伝子発現シグネチャー（又は細胞集団分布）、被験体が本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体剤での治療後に抗腫瘍若しくは抗感染応答を有し得ることを予測する治療的に関連するバイオマーカー（複数の場合もある）、又は被験体が抗ＣＤ２５抗体剤での治療後に化合物での治療に応答し得ることを予測する治療的に関連するバイオマーカー（複数の場合もある）の既定を可能にし得る。
【0122】
代替的又は付加的に、幾つかの実施形態では、本明細書で開示される特定の抗ＣＤ２５抗体剤の投薬及び投与は、ヒト癌及び／又は他のヒト組織におけるＣＤ２５発現を考慮して、例えば間質サブセット、及び／又は様々な癌、組織及び／又は患者の免疫サブセットにおけるＣＤ２５分布に関するデータを集めることによって事前に確立し、及び／又は後に評価することができる。かかるデータは、様々な免疫及び非免疫亜集団におけるＣＤ２５発現の関係、及び／又は癌細胞又は免疫細胞のサブセットと関連する細胞浸潤の尺度及び／又は癌関連マーカー（Ｆｏｘｐ３及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１等）との関係を特定するために、一般的な癌型及び／又は組織（中枢神経系、食道、胃、肝臓、結腸、直腸、肺、膀胱、心臓、腎臓、甲状腺、膵臓、子宮、皮膚、乳房、卵巣、前立腺及び精巣）にわたって一般的な技術（フローサイトメトリー、マスサイトメトリー、免疫組織化学又はｍＲＮＡ発現ライブラリー等）を用いて生成することができる。ＣＤ２５発現は、腫瘍組織（例えばＮＫ細胞、及び他のエフェクター又は制御性免疫細胞）の免疫サブセットに限定することができ（又は限定しない）、ＣＤ２５発現と免疫チェックポイント阻害剤との相関を、陽性である場合に決定することができ、これにより、かかる免疫チェックポイント阻害剤、例えば抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体等のＰＤ－１アンタゴニストを標的とする化合物と組み合わせた抗ＣＤ２５抗体剤の適切な用途が示唆される。
【0123】
製品及びキット：本発明の幾つかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体剤は、別個の製品で提供される。本発明の幾つかの実施形態では、抗ＣＤ２５抗体剤を含む製品は、ラベルの付いた容器内で又はそれと共に提供される。好適な容器としては、例えばボトル、バイアル、シリンジ及び試験管を挙げることができる。幾つかの実施形態では、容器は、ガラス又はプラスチック等の任意の又は様々な材料から形成することができる。幾つかの実施形態では、容器は、特定の疾患、障害若しくは病態、又はそのステージ若しくはタイプの治療に効果的な組成物を収容する。幾つかの実施形態では、容器は、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針を突き刺すことができるストッパーを有する静注用溶液バッグ又はバイアルであり得る）。例えば、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体剤を含む組成物は、ゴム栓及びアルミニウムシールを有する透明ガラスバイアルにパッケージングされる。容器上の又は付随するラベルは、組成物が選択される病態の治療に使用されることを示す。
【0124】
幾つかの実施形態では、製品は、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液等の薬学的に許容可能なバッファーの入った別個の容器を更に含んでいてもよく、及び／又は他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明を含む添付文書を含む、商業的観点及びユーザーの観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。例えば、幾つかの実施形態では、製品は、適切な希釈剤及びバッファーを用いて０．１ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度又はより高濃度で配合された合計２ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、５０ｍｇ又はそれ以上を含有する滅菌水溶液として静注用配合物中で作用物質の各々を提供することを可能にし得る。
【0125】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＤ２５抗体剤は、キットと共に提供される若しくは提供されない任意の適切な水溶液を用いて再構成される凍結乾燥形態、又は任意の適合する医薬担体を用いた他のタイプの投薬単位にてパーツキット（kits－of－parts）内で提供することができる。抗ＣＤ２５抗体剤の１つ以上の単位剤形をパック又はディスペンサーデバイス内で提供してもよい。かかるパック又はデバイスは、例えばブリスターパック等の金属又はプラスチック箔を含み得る。かかるパーツキットを正確に使用するために、バッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び癌の治療における使用説明を含む添付文書が更に含まれ得る。
【0126】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される製品又はキットに付随する説明書は、製品及び／又はキット内の作用物質、配合物及び他の材料の正しい使用及び／又は考え得る影響のモニタリングについての情報を与えるために使用することができるラベル、リーフレット、文書、記録、図表の形態又は任意の他の手段であり得る。説明書は、製品と共に及び／又はキット内に提供することができる。
[項１]
可変重鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４）を含む抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項２]
ａ）可変重鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号２）と、
ｂ）可変重鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号３）と、
を更に含む、項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項３]
ａ）可変軽鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号６）と、
ｂ）可変軽鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号７）と、
ｃ）可変軽鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号８）と、
を更に含む、項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項４]
ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号５）を含む可変重鎖を含む、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項５]
ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖を含む、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項６]
モノクローナル抗体、ドメイン抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）又は単一ドメイン抗体である、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項７]
ウサギ、マウス、キメラ、ヒト化又は完全ヒト抗原結合抗体である、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項８]
前記抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４アイソタイプ抗体からなる群から選択される、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項９]
二重特異性抗体、多重特異性抗体、又は治療剤若しくは診断剤を更に含む免疫複合体に含まれる、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項１０]
ヒトＣＤ２５の細胞外ドメインに結合する、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項１１]
ヒトＣＤ２５を表面上に発現する細胞に結合し、抗ＣＤ２５抗体剤である、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項１２]
ＣＤ２５へのインターロイキン－２（ＩＬ－２）の結合を阻害しない、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項１３]
ＣＤ２５を介したインターロイキン－２（ＩＬ－２）のシグナル伝達を阻害しない、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項１４]
脱フコシル化された、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項１５]
ヒトＣＤ２５のエピトープに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、配列番号１のアミノ酸４２～５６に含まれる１つ以上のアミノ酸残基を含む、抗体又は抗原結合フラグメント。
[項１６]
前記エピトープが、配列番号１のアミノ酸４２～５６を含む、項１５に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[項１７]
項１～１６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの親和性成熟変異体。
[項１８]
ＦＴＦＡＳＹＧＭＨ（配列番号１０）及びＦＴＦＰＳＹＧＭＨ（配列番号１１）からなる群から選択されるＨＣＤＲ３領域を含む、項１７に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[項１９]
ＶＩＷＹＤＡＳＴＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２）、ＶＩＷＹＤＡＩＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３）、ＶＩＷＹＤＡＶＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１４）、ＶＩＷＹＤＡＳＴＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２）、及びＶＩＷＹＤＡＬＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１５）からなる群から選択されるＨＣＤＲ２を含む、項１７又は１８に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[項２０]
ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１６）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１７）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１８）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１９）、及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号２０）から選択される配列を含む可変重鎖を含む、項１７～１９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[項２１]
ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）、及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）から選択される配列を含む可変軽鎖を含む、項１７～２０のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[項２２]
ａ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１６）を含む可変重鎖及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖；
ｂ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１７）を含む可変重鎖及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖；
ｃ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１８）を含む可変重鎖及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖；
ｄ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１９）を含む可変重鎖及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖；又は、
ｅ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号２０）を含む可変重鎖及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖；
を含む、項１７～２１のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[項２３]
項１～２２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子。
[項２４]
項２３に記載の核酸分子を含む核酸ベクター。
[項２５]
項２４に記載の核酸ベクターを含む宿主細胞。
[項２６]
項１～２２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを作製する方法であって、項２５に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
[項２７]
項１～２２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物。
[項２８]
薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を更に含む、項２７に記載の組成物。
[項２９]
癌の治療に使用される、項２７又は項２８に記載の医薬組成物。
[項３０]
癌の治療のための薬剤の製造における項１～１６のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は項２７若しくは２８に記載の組成物の使用。
[項３１]
癌の治療のための薬剤の製造における、ＣＤ２５の結合について項１～２２のいずれか一項に記載の抗体と競合する抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
[項３２]
被験体において癌を治療する方法であって、該被験体に項２７又は項２８に記載の組成物を有効量投与することを含む、方法。
[項３３]
被験体において癌を治療する方法であって、該被験体にＣＤ２５の結合について項１～２２のいずれか一項に記載の抗体と競合する抗体又はその抗原結合フラグメントを有効量投与することを含む、方法。
[項３４]
前記被験体に第２の作用物質を同時に又は任意の順序で順次に投与することを更に含む、項３２又は３３に記載の方法。
[項３５]
前記第２の作用物質が免疫チェックポイント阻害剤又は癌ワクチンである、項３４に記載の方法。
[項３６]
前記第２の作用物質が免疫チェックポイント阻害剤であり、該免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ－１アンタゴニストである、項３５に記載の方法。
[項３７]
前記ＰＤ－１アンタゴニストが抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、項３６に記載の方法。
[項３８]
前記被験体が固形腫瘍を有する、項３２～３７のいずれか一項に記載の方法。
[項３９]
前記被験体が血液癌腫瘍を有する、項３２～３７のいずれか一項に記載の方法。
[項４０]
被験体において腫瘍中の制御性Ｔ細胞を枯渇させる方法であって、項２７若しくは項２８に記載の組成物、又はＣＤ２５の結合について項１～２２のいずれか一項に記載の抗体と競合する抗体若しくは抗原結合フラグメントを有効量投与する工程を含む、方法。
[項４１]
前記被験体が固形腫瘍を有する、項４０に記載の方法。
[項４２]
前記被験体が血液癌腫瘍を有する、項４０に記載の方法。
[項４３]
癌の治療に使用されるＣＤ２５の結合について項１～２２のいずれか一項に記載の抗体と競合する抗体又は抗原結合フラグメント。
[項４４]
容器内に項２７又は項２８に記載の組成物を含むキット。
[項４５]
抗ＣＤ２５抗体を作製する方法であって、項１～２２のいずれか一項に記載の抗体を準備することと、該抗体を親和性成熟に供することとを含み、作製される抗ＣＤ２５抗体がＣＤ２５に対して親抗体よりも大きな親和性を有する、方法。
[項４６]
医薬組成物を作製する方法であって、項４５に記載の方法に従って作製された抗体を準備することと、該抗体と少なくとも１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤とを同時配合することとを含む、方法。
[項１]
可変重鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号４）を含む抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項２]
ａ）可変重鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号２）と、
ｂ）可変重鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号３）と、
を更に含む、項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項３]
ａ）可変軽鎖相補性決定領域１としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ１アミノ酸配列（配列番号６）と、
ｂ）可変軽鎖相補性決定領域２としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ２アミノ酸配列（配列番号７）と、
ｃ）可変軽鎖相補性決定領域３としてａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列（配列番号８）と、
を更に含む、項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項４]
ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号５）を含む可変重鎖を含む、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項５]
ａＣＤ２５－ａ－６４６－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖を含む、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項６]
モノクローナル抗体、ドメイン抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＡｂ）又は単一ドメイン抗体である、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項７]
ウサギ、マウス、キメラ、ヒト化又は完全ヒト抗原結合抗体である、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項８]
前記抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４アイソタイプ抗体からなる群から選択される、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項９]
二重特異性抗体、多重特異性抗体、又は治療剤若しくは診断剤を更に含む免疫複合体に含まれる、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項１０]
ヒトＣＤ２５の細胞外ドメインに結合する、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項１１]
ヒトＣＤ２５を表面上に発現する細胞に結合し、抗ＣＤ２５抗体剤である、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項１２]
ＣＤ２５へのインターロイキン－２（ＩＬ－２）の結合を阻害しない、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項１３]
ＣＤ２５を介したインターロイキン－２（ＩＬ－２）のシグナル伝達を阻害しない、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項１４]
脱フコシル化された、先行項のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
[項１５]
ヒトＣＤ２５のエピトープに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントであって、前記エピトープは、配列番号１のアミノ酸４２～５６に含まれる１つ以上のアミノ酸残基を含む、抗体又は抗原結合フラグメント。
[項１６]
前記エピトープが、配列番号１のアミノ酸４２～５６を含む、項１５に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[項１７]
項１～１６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの親和性成熟変異体。
[項１８]
ＦＴＦＡＳＹＧＭＨ（配列番号１０）及びＦＴＦＰＳＹＧＭＨ（配列番号１１）からなる群から選択されるＨＣＤＲ３領域を含む、項１７に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[項１９]
ＶＩＷＹＤＡＳＴＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２）、ＶＩＷＹＤＡＩＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１３）、ＶＩＷＹＤＡＶＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１４）、ＶＩＷＹＤＡＳＴＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２）、及びＶＩＷＹＤＡＬＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１５）からなる群から選択されるＨＣＤＲ２を含む、項１７又は１８に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[項２０]
ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１６）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１７）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１８）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１９）、及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号２０）から選択される配列を含む可変重鎖を含む、項１７～１９のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[項２１]
ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）、及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）から選択される配列を含む可変軽鎖を含む、項１７～２０のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[項２２]
ａ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１６）を含む可変重鎖及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖；
ｂ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１７）を含む可変重鎖及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖；
ｃ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１８）を含む可変重鎖及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖；
ｄ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号１９）を含む可変重鎖及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖；又は、
ｅ）ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＨＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号２０）を含む可変重鎖及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５－ＬＣＤＲ１２３アミノ酸配列（配列番号９）を含む可変軽鎖；
を含む、項１７～２１のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[項２３]
項１～２２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子。
[項２４]
項２３に記載の核酸分子を含む核酸ベクター。
[項２５]
項２４に記載の核酸ベクターを含む宿主細胞。
[項２６]
項１～２２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを作製する方法であって、項２５に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
[項２７]
項１～２２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物。
[項２８]
薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を更に含む、項２７に記載の組成物。
[項２９]
癌の治療に使用される、項２７又は項２８に記載の医薬組成物。
[項３０]
癌の治療のための薬剤の製造における項１～１６のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は項２７若しくは２８に記載の組成物の使用。
[項３１]
癌の治療のための薬剤の製造における、ＣＤ２５の結合について項１～２２のいずれか一項に記載の抗体と競合する抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
[項３２]
被験体において癌を治療する方法であって、該被験体に項２７又は項２８に記載の組成物を有効量投与することを含む、方法。
[項３３]
被験体において癌を治療する方法であって、該被験体にＣＤ２５の結合について項１～２２のいずれか一項に記載の抗体と競合する抗体又はその抗原結合フラグメントを有効量投与することを含む、方法。
[項３４]
前記被験体に第２の作用物質を同時に又は任意の順序で順次に投与することを更に含む、項３２又は３３に記載の方法。
[項３５]
前記第２の作用物質が免疫チェックポイント阻害剤又は癌ワクチンである、項３４に記載の方法。
[項３６]
前記第２の作用物質が免疫チェックポイント阻害剤であり、該免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ－１アンタゴニストである、項３５に記載の方法。
[項３７]
前記ＰＤ－１アンタゴニストが抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体である、項３６に記載の方法。
[項３８]
前記被験体が固形腫瘍を有する、項３２～３７のいずれか一項に記載の方法。
[項３９]
前記被験体が血液癌腫瘍を有する、項３２～３７のいずれか一項に記載の方法。
[項４０]
被験体において腫瘍中の制御性Ｔ細胞を枯渇させる方法であって、項２７若しくは項２８に記載の組成物、又はＣＤ２５の結合について項１～２２のいずれか一項に記載の抗体と競合する抗体若しくは抗原結合フラグメントを有効量投与する工程を含む、方法。
[項４１]
前記被験体が固形腫瘍を有する、項４０に記載の方法。
[項４２]
前記被験体が血液癌腫瘍を有する、項４０に記載の方法。
[項４３]
癌の治療に使用されるＣＤ２５の結合について項１～２２のいずれか一項に記載の抗体と競合する抗体又は抗原結合フラグメント。
[項４４]
容器内に項２７又は項２８に記載の組成物を含むキット。
[項４５]
抗ＣＤ２５抗体を作製する方法であって、項１～２２のいずれか一項に記載の抗体を準備することと、該抗体を親和性成熟に供することとを含み、作製される抗ＣＤ２５抗体がＣＤ２５に対して親抗体よりも大きな親和性を有する、方法。
[項４６]
医薬組成物を作製する方法であって、項４５に記載の方法に従って作製された抗体を準備することと、該抗体と少なくとも１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤とを同時配合することとを含む、方法。
【実施例】
【0127】
実施例１：ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ２５に結合する抗体の生成
材料及び方法
ＣＤ２５抗原調製物
マウスＣＤ２５－ＨＩＳ、ヒトＣＤ２５－Ｆｃ及び非タグ付き組換えタンパク質は、R&D Systems Biotechneから購入した。カニクイザルＣＤ２５－Ｆｃ及びＣＤ２５－ＨＩＳ組換えタンパク質は、Sino Biologicalから購入した。タンパク質試薬ビオチン化は、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Thermo Scientific、カタログ番号２１４２５）を用いて行った。ＣＤ２５抗原を約１ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、ＰＢＳにバッファー交換した後、１：７．５のモル比のビオチン化試薬（ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Thermo Scientific、カタログ番号２１４２５）を添加した。混合物を一晩４℃に維持した後、更なるバッファー交換を行い、溶液中の遊離ビオチンを除去した。ビオチン化を、ForteBioでの標識タンパク質のストレプトアビジンセンサー結合によって確認した。
材料及び方法
ＣＤ２５抗原調製物
マウスＣＤ２５－ＨＩＳ、ヒトＣＤ２５－Ｆｃ及び非タグ付き組換えタンパク質は、R&D Systems Biotechneから購入した。カニクイザルＣＤ２５－Ｆｃ及びＣＤ２５－ＨＩＳ組換えタンパク質は、Sino Biologicalから購入した。タンパク質試薬ビオチン化は、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Thermo Scientific、カタログ番号２１４２５）を用いて行った。ＣＤ２５抗原を約１ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、ＰＢＳにバッファー交換した後、１：７．５のモル比のビオチン化試薬（ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Thermo Scientific、カタログ番号２１４２５）を添加した。混合物を一晩４℃に維持した後、更なるバッファー交換を行い、溶液中の遊離ビオチンを除去した。ビオチン化を、ForteBioでの標識タンパク質のストレプトアビジンセンサー結合によって確認した。
【0128】
抗ＣＤ２５抗体の単離のためのライブラリー問合せ及び選択の方法論：
各々多様性が約１０９の８つのナイーブヒト合成酵母ライブラリーを以前に記載されているように設計し、生成し、増殖させた（例えば、Xu et al, 2013、国際公開第２００９０３６３７９号、国際公開第２０１０１０５２５６号、国際公開第２０１２００９５６８号を参照されたい）。８回の並行選択を、単量体ヒトＣＤ２５選択のために８つのナイーブライブラリーを用いて行った。
各々多様性が約１０９の８つのナイーブヒト合成酵母ライブラリーを以前に記載されているように設計し、生成し、増殖させた（例えば、Xu et al, 2013、国際公開第２００９０３６３７９号、国際公開第２０１０１０５２５６号、国際公開第２０１２００９５６８号を参照されたい）。８回の並行選択を、単量体ヒトＣＤ２５選択のために８つのナイーブライブラリーを用いて行った。
【0129】
最初の２回の選択については、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣｓシステムを利用する磁性ビーズ選別法を基本的には記載のように行った（Siegel et al. 2004）。簡潔に述べると、酵母細胞（約１０１０細胞／ライブラリー）を、３ｍｌの１０ｎＭビオチン化二量体ヒトＣＤ２５抗原と共にＦＡＣＳ洗浄バッファー(０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中、３０℃で１５分間インキュベートした。５０ｍｌの氷冷洗浄バッファーで一度洗浄した後、細胞ペレットを４０ｍＬの洗浄バッファーに再懸濁し、５００μｌのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany；カタログ番号１３０－０４８－１０１）を酵母に添加し、４℃で１５分間インキュベートした。次に、酵母をペレット化し、５ｍＬの洗浄バッファーに再懸濁し、ＭＡＣＳ ＬＳカラム（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany；カタログ番号１３０－０４２－４０１）にロードした。５ｍＬをロードした後、カラムを３ｍｌのＦＡＣＳ洗浄バッファーで３回洗浄した。次いで、カラムを磁場から取り出し、酵母を５ｍＬの増殖培地で溶出させた後、一晩成長させた。
【0130】
２回のＭＡＣＳの後に、以下の３段落に記載されるフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いて４回の選別を行った。
【0131】
１回目のＦＡＣＳ選択については、およそ４×１０７個の酵母をペレット化し、洗浄バッファーで３回洗浄し、１０ｎＭの各ビオチン化二量体ヒトＣＤ２５抗原又は２００ｎＭのビオチン化単量体マウスＣＤ２５抗原と共に３０℃で１５分間インキュベートした。次いで、酵母を２回洗浄し、二次試薬である１００倍希釈したヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２κ－ＦＩＴＣ（Southern Biotech，Birmingham，Alabama；カタログ番号２０６２－０２）及び５００倍希釈したストレプトアビジン－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３（Life Technologies，Grand Island，NY；カタログ番号Ｓ２１３７５）又は５０倍希釈したＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ－フィコエリトリン（Sigma－Aldrich，St Louis；カタログ番号Ｅ４０１１）を用いて４℃で１５分間染色した。氷冷洗浄バッファーで２回洗浄した後、細胞ペレットを０．４ｍＬの洗浄バッファーに再懸濁し、濾過器付きの選別チューブに移した。ＦＡＣＳ ＡＲＩＡソーター（BD Biosciences）を用いて選別を行い、選別ゲートを決定してＣＤ２５結合のみを選択した。１回目のＦＡＣＳにより選択されたマウス集団を合わせてプールにした。次いで、このプールをヒトＣＤ２５結合について選別し、３回目のＦＡＣＳにおいて交差反応性結合剤を増大又は特定した（下記）。
【0132】
選択ヒト集団に対する２回目及び３回目のＦＡＣＳは、試薬の多特異性結合剤を減少させるＣＤ２５結合剤のポジティブ選別又はネガティブ選別を伴うものであった（Xu et al., 2013）。特定の選択アウトプットの多特異的結合又は標的結合の量に応じて、ポジティブ選別をネガティブ選別に続いて行うか又はその逆とし、限定量の多特異的結合を有する完全結合集団を富化した。３回目の選択によるアウトプットのサンプルをプレーティングし、シークエンシングした。
【0133】
４回目のＦＡＣＳは、主に１０ｎＭビオチン化二量体ｃｙｎｏ ＣＤ２５を抗原として用いるポジティブ選択からなるものであった。次いで、これらの選択のサンプルを、３回目の選択アウトプットを用いて行う場合と同様にプレーティング及びシークエンシングした。
【0134】
ナイーブ選択において特定されたクローンの親和性成熟
多特異性結合剤ネガティブ選別アウトプットからの重鎖を使用して、４回の付加的な選択に用いられる軽鎖多様性ライブラリーを作成した。これらの選択の１回目には、抗原としての１０ｎＭビオチン化二量体ヒトＣＤ２５又は抗原としての１００ｎＭビオチン化単量体マウスＣＤ２５のいずれかとコンジュゲートしたＭｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣｓビーズを利用した。
多特異性結合剤ネガティブ選別アウトプットからの重鎖を使用して、４回の付加的な選択に用いられる軽鎖多様性ライブラリーを作成した。これらの選択の１回目には、抗原としての１０ｎＭビオチン化二量体ヒトＣＤ２５又は抗原としての１００ｎＭビオチン化単量体マウスＣＤ２５のいずれかとコンジュゲートしたＭｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣｓビーズを利用した。
【0135】
ＭＡＣｓビーズ選択の後に、３回のＦＡＣＳ選別を行った。これらの選別の１回目には、１００ｎＭの単量体ヒトＣＤ２５、１０ｎＭの二量体ｃｙｎｏ ＣＤ２５又は２００ｎＭの単量体マウスＣＤ２５のいずれかを使用した。２回目のＦＡＣＳは、限定量の多特異的結合を有する完全結合集団を富化する多特異性試薬を用いたネガティブ選択とした。3回目のＦＡＣＳは、１ｎＭまでのヒトＣＤ２５抗原の力価決定、及び１００ｎＭ又は１０ｎＭのマウスＣＤ２５を用いた並行選択を含むものであった。
【0136】
直前の段落に記載される３回目のＦＡＣＳと並行して、競合選択を行った。競合選択については、２００ｎＭの競合ＩｇＧ（ヒトＣＤ２５上の既知のビン（bins）を用いる、そのビンと競合した又は競合しなかった抗体を選択するナイーブ選択（上記）によるAdimab製のＩｇＧ）を１０ｎＭビオチン化二量体ヒトＣＤ２５と共に３０分間インキュベートした後、酵母と共に３０分間インキュベートした。
【0137】
上記の各回のＦＡＣＳ選択からの個々のコロニーをプレーティングし、シークエンシング特性評価のためにピッキングした。
【0138】
ＩｇＧ及びＦａｂの作製及び精製：
酵母クローンを飽和状態まで成長させた後、振盪しながら３０℃で４８時間誘導した。誘導後に酵母細胞をペレット化し、上清を精製のために採取した。ＩｇＧを、プロテインＡカラムを用いて精製し、酢酸（ｐＨ２．０）で溶出させた。Ｆａｂフラグメントをパパイン消化によって生成し、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＩｇＧ－ＣＨ１アフィニティーマトリックス（LifeTechnologies；カタログ番号１９４３２００２５０）で精製した。
酵母クローンを飽和状態まで成長させた後、振盪しながら３０℃で４８時間誘導した。誘導後に酵母細胞をペレット化し、上清を精製のために採取した。ＩｇＧを、プロテインＡカラムを用いて精製し、酢酸（ｐＨ２．０）で溶出させた。Ｆａｂフラグメントをパパイン消化によって生成し、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＩｇＧ－ＣＨ１アフィニティーマトリックス（LifeTechnologies；カタログ番号１９４３２００２５０）で精製した。
【0139】
哺乳動物細胞において発現される脱フコシル化ａＣＤ２５－ａ－６４６ヒトＩｇＧ１の産生：
抗体のコドン最適化ＶＨ及びＶＬコード配列の合成を行い、従来の（非ＰＣＲベース）クローニング法を用いて可変領域のｃＤＮＡを抗体発現ベクター（Evitria，Switzerland）にクローニングした。酸化還元酵素であるＧＤＰ－６－デオキシ－ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）酵素のｃＤＮＡを発現ベクター（Evitria，Switzerland）にクローニングした。プラスミドＤＮＡを陰イオン交換クロマトグラフィーに基づいて低エンドトキシン条件下で作製した。Evitriaは、懸濁適合ＣＨＯ Ｋ１細胞（最初にＡＴＣＣから入手し、Evitriaにて懸濁培養での無血清成長に適合させた）を産生に用いる。シードを既知組成の動物由来成分を含まない無血清培地であるｅｖｉＧｒｏｗ培地中で成長させた。細胞にEvitriaの特注の専用トランスフェクション試薬であるｅｖｉＦｅｃｔを用いてＩｇＧ１及びＲＭＤ酵素の発現ベクターをトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション後に動物由来成分を含まない無血清培地であるｅｖｉＭａｋｅ２中で成長させた。上清を遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）によって採取した。抗体を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標） ＳｕＲｅ（商標）を用いて精製した。ＬＣ／ＭＳを用いて抗体のグリコシル化パターンを特性評価し、９９％超の脱フコシル化が示された。
抗体のコドン最適化ＶＨ及びＶＬコード配列の合成を行い、従来の（非ＰＣＲベース）クローニング法を用いて可変領域のｃＤＮＡを抗体発現ベクター（Evitria，Switzerland）にクローニングした。酸化還元酵素であるＧＤＰ－６－デオキシ－ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）酵素のｃＤＮＡを発現ベクター（Evitria，Switzerland）にクローニングした。プラスミドＤＮＡを陰イオン交換クロマトグラフィーに基づいて低エンドトキシン条件下で作製した。Evitriaは、懸濁適合ＣＨＯ Ｋ１細胞（最初にＡＴＣＣから入手し、Evitriaにて懸濁培養での無血清成長に適合させた）を産生に用いる。シードを既知組成の動物由来成分を含まない無血清培地であるｅｖｉＧｒｏｗ培地中で成長させた。細胞にEvitriaの特注の専用トランスフェクション試薬であるｅｖｉＦｅｃｔを用いてＩｇＧ１及びＲＭＤ酵素の発現ベクターをトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション後に動物由来成分を含まない無血清培地であるｅｖｉＭａｋｅ２中で成長させた。上清を遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）によって採取した。抗体を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標） ＳｕＲｅ（商標）を用いて精製した。ＬＣ／ＭＳを用いて抗体のグリコシル化パターンを特性評価し、９９％超の脱フコシル化が示された。
【0140】
抗ＣＤ２５抗体の親和性測定：
ForteBioの親和性測定は、これまでに記載されたように、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６でのＫＤの測定により行った（例えば、Estep et a,（2013)を参照されたい）。センサーをアッセイバッファー中、オフラインで１０分間平衡化した後、ベースライン確立のためにオンラインで６０秒間モニタリングした。３２ｎＭのＩｇＧをＡＨＣセンサーにオンラインで５分間ロードした。次いで、１：３段階希釈（１μＭから４ｎＭまで）のＨＩＳタグ付き組換えヒトＣＤ２５をロードしたＩｇＧに１０分間会合した。その後、それらをオフレート（off-rate）測定のために６．６分間、アッセイバッファーに移した。参照を減算することで（with reference subtraction）ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析ソフトウェア９.０においてグローバル１：１結合モデルを用いて、動態データをフィッティングした（図５Ａを参照されたい）。
ForteBioの親和性測定は、これまでに記載されたように、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６でのＫＤの測定により行った（例えば、Estep et a,（2013)を参照されたい）。センサーをアッセイバッファー中、オフラインで１０分間平衡化した後、ベースライン確立のためにオンラインで６０秒間モニタリングした。３２ｎＭのＩｇＧをＡＨＣセンサーにオンラインで５分間ロードした。次いで、１：３段階希釈（１μＭから４ｎＭまで）のＨＩＳタグ付き組換えヒトＣＤ２５をロードしたＩｇＧに１０分間会合した。その後、それらをオフレート（off-rate）測定のために６．６分間、アッセイバッファーに移した。参照を減算することで（with reference subtraction）ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析ソフトウェア９.０においてグローバル１：１結合モデルを用いて、動態データをフィッティングした（図５Ａを参照されたい）。
【0141】
抗ヒトＣＤ２５抗体に対する親和性は、２５℃の周囲実験温度にてＣＭ－５センサーチップを用いてＢｉａｃｏｒｅ ２０００（図５Ｂを参照されたい）においてＳＰＲによりそれらのＫＤを測定することによっても決定した。抗ヒト抗体を初めに、分析バッファー（ｐＨ ７．４、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）中の全てのフローセルを通して１０分間に亘って１２０００～１４０００のＲＵにて固定化した。続いて、リガンド（抗体試験物）を１４５ＲＵ～１９０ＲＵの捕捉レベルにてロードした。次いで、分析物（ｈｉｓタグ付き組換えヒトＣＤ２５）を、４００ｎＭから始めて２倍希釈で３．１３ｎＭの最低濃度にて６分間、分析バッファー中で会合した。解離を１０分間に亘って分析バッファー中で行った。サンプル濃縮間の再生工程は、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．７）中で１０分間行った。プロセスの間は、２５μｌ／分の流量を維持した。参照を減算することでBiacoreにより提供されるグローバルな２つの状態の反応の立体配座変化分析ソフトウェアを用いて、動態データを適合させた。
【0142】
リガンド結合：
抗体のリガンド結合を、標準サンドイッチビニングアッセイを用いてＦｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４システム（Pall Forte Bio Corp.，USA）で行った。抗ヒトＣＤ２５抗体（ａＣＤ２５－ａ－６４６）をＡＨＱセンサー上にロードし、センサー上の非占有Ｆｃ結合部位を非関連ヒトＩｇＧ１抗体でブロッキングした。センサーを１００ｎＭヒトＣＤ２５、続いて１００ｎＭヒトＩＬ－２に曝露した。Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ７．０を用いてデータを処理した。抗原会合後のヒトＩＬ２による追加の結合は、非占有エピトープを示し（非競合物質（non－competitor））、結合がなければエピトープ遮断が示される（競合物質）。
抗体のリガンド結合を、標準サンドイッチビニングアッセイを用いてＦｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４システム（Pall Forte Bio Corp.，USA）で行った。抗ヒトＣＤ２５抗体（ａＣＤ２５－ａ－６４６）をＡＨＱセンサー上にロードし、センサー上の非占有Ｆｃ結合部位を非関連ヒトＩｇＧ１抗体でブロッキングした。センサーを１００ｎＭヒトＣＤ２５、続いて１００ｎＭヒトＩＬ－２に曝露した。Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ７．０を用いてデータを処理した。抗原会合後のヒトＩＬ２による追加の結合は、非占有エピトープを示し（非競合物質（non－competitor））、結合がなければエピトープ遮断が示される（競合物質）。
【0143】
エピトープビニング：
抗体のエピトープビニングを、標準サンドイッチフォーマットビニングアッセイを用いてＦｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４システム（Pall Forte Bio Corporation，Menlo Park，CA）で行った。抗ヒトＣＤ２５抗体ＩｇＧをＡＨＱセンサー上にロードし、センサー上の非占有Ｆｃ結合部位を非関連ヒトＩｇＧ１抗体でブロッキングした。次いで、センサーを１００ｎＭ標的抗原、続いてダクリズマブ又はバシリキシマブに曝露した。ForteBioのＤａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ７．０を用いてデータを処理した。抗原会合後の第２の抗体による追加の結合は、非占有エピトープを示し（非競合物質）、結合がなければエピトープ遮断が示される（競合物質）。
抗体のエピトープビニングを、標準サンドイッチフォーマットビニングアッセイを用いてＦｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４システム（Pall Forte Bio Corporation，Menlo Park，CA）で行った。抗ヒトＣＤ２５抗体ＩｇＧをＡＨＱセンサー上にロードし、センサー上の非占有Ｆｃ結合部位を非関連ヒトＩｇＧ１抗体でブロッキングした。次いで、センサーを１００ｎＭ標的抗原、続いてダクリズマブ又はバシリキシマブに曝露した。ForteBioのＤａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ７．０を用いてデータを処理した。抗原会合後の第２の抗体による追加の結合は、非占有エピトープを示し（非競合物質）、結合がなければエピトープ遮断が示される（競合物質）。
【0144】
ＣＤ２５発現細胞への抗ＣＤ２５抗体の結合：
候補ヒットをリンパ腫ヒト細胞株、ＳＵ－ＤＨＬ－１及びＳＲ－７８６、Ｋａｒｐａｓ２９９、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇ細胞及びＨＳＣ－ＦカニクイザルＴ細胞株への結合によって評価する。ＣＤ２５発現ヒト細胞株（ＳＵ－ＤＨＬ－１及びＳＲ－７８６）への結合を、最初に細胞をＴｒｕｓｔａｉｎ（Biolegend）で遮断し、次に２０μｇ／ｍｌの最高濃度からの片対数希釈系列で力価決定した抗ＣＤ２５抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした後、洗浄し、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Biolegend）と共にインキュベートすることによって試験した。細胞を再度洗浄し、ＤＡＰＩを含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅで取得した。生細胞をサンプル取得時にフローサイトメトリーによってＦＳＣ対ＳＳＣのパラメーターを用いてゲーティングした。染色細胞の幾何平均強度をＸＹチャート上にプロットし、幾何平均強度を濃度の対数に対してグラフ化し、データを非線形回帰曲線にフィッティングし、それによりＥＣ５０を算出した。
候補ヒットをリンパ腫ヒト細胞株、ＳＵ－ＤＨＬ－１及びＳＲ－７８６、Ｋａｒｐａｓ２９９、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇ細胞及びＨＳＣ－ＦカニクイザルＴ細胞株への結合によって評価する。ＣＤ２５発現ヒト細胞株（ＳＵ－ＤＨＬ－１及びＳＲ－７８６）への結合を、最初に細胞をＴｒｕｓｔａｉｎ（Biolegend）で遮断し、次に２０μｇ／ｍｌの最高濃度からの片対数希釈系列で力価決定した抗ＣＤ２５抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした後、洗浄し、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Biolegend）と共にインキュベートすることによって試験した。細胞を再度洗浄し、ＤＡＰＩを含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅで取得した。生細胞をサンプル取得時にフローサイトメトリーによってＦＳＣ対ＳＳＣのパラメーターを用いてゲーティングした。染色細胞の幾何平均強度をＸＹチャート上にプロットし、幾何平均強度を濃度の対数に対してグラフ化し、データを非線形回帰曲線にフィッティングし、それによりＥＣ５０を算出した。
【0145】
ＣＤ２５発現ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇへの結合を、試験物（抗ＣＤ２５一次抗体）を３０μｇ／ｍｌ抗体、続いて片対数希釈系列（７点）を用いて氷上で３０分間染色することによって試験した。これに続いて、濃度１μｇ／ｍｌの二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆａｂ Ｆｒａｇｍｅｎｔヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Jackson ImmunoResearch））を用いて氷上で３０分間染色した。全てのサンプルを二連で染色した。生細胞をサンプル取得時にフローサイトメトリーによってＦＳＣ対ＳＳＣのパラメーターを用いてゲーティングした。染色細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＸＹチャート上にプロットし、ＭＦＩを濃度の対数に対してグラフ化し、データを非線形回帰曲線にフィッティングし、それによりＥＣ５０を算出した。
【0146】
ＣＤ２５発現活性化ヒト及びカニクイザルＰＭＢＣへの結合を、試験物（抗ＣＤ２５一次抗体）を２０μｇ／ｍｌ抗体、続いて片対数希釈系列（７点）を用いて氷上で３０分間染色することによって試験した。これに続いて、濃度５μｇ／ｍｌの二次抗体（ウサギ抗ヒトＦｃｇ Ｆ（ａｂ’）２（Jackson ImmunoResearch））を用いて氷上で３０分間染色した。全てのサンプルを三連で染色した。二次抗体の結合によって媒介される架橋誘導細胞死を最小限に抑えるために、細胞株を４つの試験物の染色コホートで一度に試験した。生リンパ球をサンプル取得時にフローサイトメトリーによってＦＳＣ対ＳＳＣのパラメーターを用いてゲーティングした。ゲーティングＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＸＹチャート上にプロットし、ＭＦＩを濃度の対数に対してグラフ化し、データを非線形回帰曲線にフィッティングし、それによりＥＣ５０を算出した。
【0147】
ＣＤ２５発現Ｋａｒｐａｓ ２９９細胞への結合を、試験物（抗ＣＤ２５一次抗体）を２０μｇ／ｍｌ抗体、続いて片対数希釈系列（７点）を用いて氷上で３０分間染色することによって試験した。これに続いて、濃度１μｇ／ｍｌの二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔウサギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγフラグメント（Jackson ImmunoResearch））を用いて氷上で３０分間染色した。全てのサンプルを二連で染色した。生細胞をサンプル取得時にフローサイトメトリーによってＦＳＣ対ＳＳＣのパラメーターを用いてゲーティングした。染色細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＸＹチャート上にプロットし、ＭＦＩを濃度の対数に対してグラフ化し、データを非線形回帰曲線にフィッティングし、それによりＥＣ５０を算出する。
【0148】
哺乳動物細胞において発現されるヒトＩｇＧ１としてのａＣＤ２５－ａ－６４６のリクローニング、産生及び特性評価：
抗体のコドン最適化ＶＨ及びＶＬコード配列の合成は、Genewizによって行われた。可変領域のｃＤＮＡを、ヒトＩｇＧ１重鎖及びκ軽鎖定常領域（それぞれＰ０１８５７及びＰ０１８３４）を有する抗体発現ベクター（Icosagen，EST）にクローニングした。完全長重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡを、最終ベクター中でシークエンシングすることによって検証した後、ＣＨＯ系細胞（ＣＨＯＥＢＮＡＬＴ８５）、及び組換えタンパク質、抗体の産生に適切なベクターを用いる安定なエピソーム発現系であるＱＭＣＦ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Icosagen）を用いてそれらを発現させるためにリクローニングし、ＣＨＯＥＢＮＡＬＴ８５細胞に抗体産生のために１μｇの発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、７００μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加し、プラスミドを含有する細胞集団を選択した。産生のために温度を３０℃に変化させ、培養物を更に供給した。産生の終了時に、培養上清を遠心分離（１０００ｇ、３０分間及び１５℃）によって清澄化し、ＰＭＳＦを添加し、上清を処理するか又は精製まで凍結した。ｈＩｇＧ１抗体をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティークロマトグラフィー、続いてＰＢＳ又はＰＢＳ １００ｍＭ Ｌ－ＡｒｇのいずれかへのＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲル濾過によって精製した。ＣＨＯＥＢＮＡＬＴ８５細胞において産生されたヒトＩｇＧ１抗体を組換えヒトＣＤ２５に対する親和性、マウス及びｃｙｎｏ ＣＤ２５に対する交差反応性、並びに選択ＣＤ２５結合抗体に対するエピトープビニングについて特性評価した。
抗体のコドン最適化ＶＨ及びＶＬコード配列の合成は、Genewizによって行われた。可変領域のｃＤＮＡを、ヒトＩｇＧ１重鎖及びκ軽鎖定常領域（それぞれＰ０１８５７及びＰ０１８３４）を有する抗体発現ベクター（Icosagen，EST）にクローニングした。完全長重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡを、最終ベクター中でシークエンシングすることによって検証した後、ＣＨＯ系細胞（ＣＨＯＥＢＮＡＬＴ８５）、及び組換えタンパク質、抗体の産生に適切なベクターを用いる安定なエピソーム発現系であるＱＭＣＦ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Icosagen）を用いてそれらを発現させるためにリクローニングし、ＣＨＯＥＢＮＡＬＴ８５細胞に抗体産生のために１μｇの発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、７００μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加し、プラスミドを含有する細胞集団を選択した。産生のために温度を３０℃に変化させ、培養物を更に供給した。産生の終了時に、培養上清を遠心分離（１０００ｇ、３０分間及び１５℃）によって清澄化し、ＰＭＳＦを添加し、上清を処理するか又は精製まで凍結した。ｈＩｇＧ１抗体をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティークロマトグラフィー、続いてＰＢＳ又はＰＢＳ １００ｍＭ Ｌ－ＡｒｇのいずれかへのＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲル濾過によって精製した。ＣＨＯＥＢＮＡＬＴ８５細胞において産生されたヒトＩｇＧ１抗体を組換えヒトＣＤ２５に対する親和性、マウス及びｃｙｎｏ ＣＤ２５に対する交差反応性、並びに選択ＣＤ２５結合抗体に対するエピトープビニングについて特性評価した。
【0149】
ａＣＤ２５－ａ－６４６エピトープマッピング：
ヒトＣＤ２５配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ記録番号Ｐ０１５８９）を示す様々な直鎖、単一ループ、βターン模倣体、ジスルフィド架橋模倣体、不連続ジスルフィド架橋体、不連続エピトープ模倣体のペプチドのセットを、固相Ｆｍｏｃ合成を用いて合成した（Pepscan BV, The Netherlands；Timmermann P et al., 2007、Langedijk JP et al., 2011）。合成ペプチドの各々へのａ－６４６抗体の結合を、ＥＬＩＳＡ（Pepscan，The Netherlands）において試験した。ペプチドアレイを一次抗体溶液と共にインキュベートした（４℃で一晩）。洗浄後に、ペプチドアレイを１０００倍希釈の適切な抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（２０１０－０５；Southern Biotech）と共に２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後に、ペルオキシダーゼ基質２，２’－アジノ－ジ－３－エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）及び２０μｌ／ｍｌの３％Ｈ２Ｏ２を添加した。１時間後に発色を測定した。発色を電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ及び画像処理システムで定量化した。ＣＣＤカメラにより得られた値は、標準９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダーと同様、０ｍＡＵ～３０００ｍＡＵの範囲である。合成ペプチドの品質を検証するために、別個の陽性及び陰性対照ペプチドのセットを並行して合成し、非関連対照抗体を用いてスクリーニングした。
ヒトＣＤ２５配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ記録番号Ｐ０１５８９）を示す様々な直鎖、単一ループ、βターン模倣体、ジスルフィド架橋模倣体、不連続ジスルフィド架橋体、不連続エピトープ模倣体のペプチドのセットを、固相Ｆｍｏｃ合成を用いて合成した（Pepscan BV, The Netherlands；Timmermann P et al., 2007、Langedijk JP et al., 2011）。合成ペプチドの各々へのａ－６４６抗体の結合を、ＥＬＩＳＡ（Pepscan，The Netherlands）において試験した。ペプチドアレイを一次抗体溶液と共にインキュベートした（４℃で一晩）。洗浄後に、ペプチドアレイを１０００倍希釈の適切な抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（２０１０－０５；Southern Biotech）と共に２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後に、ペルオキシダーゼ基質２，２’－アジノ－ジ－３－エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）及び２０μｌ／ｍｌの３％Ｈ２Ｏ２を添加した。１時間後に発色を測定した。発色を電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ及び画像処理システムで定量化した。ＣＣＤカメラにより得られた値は、標準９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダーと同様、０ｍＡＵ～３０００ｍＡＵの範囲である。合成ペプチドの品質を検証するために、別個の陽性及び陰性対照ペプチドのセットを並行して合成し、非関連対照抗体を用いてスクリーニングした。
【0150】
抗ヒトＣＤ２５ Ａｂ競合アッセイ：
抗体競合を、標準逐次結合アッセイを用いてＦｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６システム（Pall Forte Bio Corp.，USA）で行った。２６．８ｎＭ ｈｉｓタグ付き組換えヒトＣＤ２５をＮｉ－ＮＴＡバイオセンサー上に２００秒間ロードした。動態バッファーに対するベースライン工程後に、センサーを６６．６ｎＭの第１の抗体に６００秒間、続いて第２の抗ＣＤ２５抗体（同様に６６．６ｎＭで６００秒間）に曝露した。Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ９．０を用いてデータを処理した。第２の抗体による追加の結合は、非占有エピトープを示し（エピトープについての競合なし）、結合がなければエピトープ遮断が示される（エピトープについての競合）。
抗体競合を、標準逐次結合アッセイを用いてＦｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６システム（Pall Forte Bio Corp.，USA）で行った。２６．８ｎＭ ｈｉｓタグ付き組換えヒトＣＤ２５をＮｉ－ＮＴＡバイオセンサー上に２００秒間ロードした。動態バッファーに対するベースライン工程後に、センサーを６６．６ｎＭの第１の抗体に６００秒間、続いて第２の抗ＣＤ２５抗体（同様に６６．６ｎＭで６００秒間）に曝露した。Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ９．０を用いてデータを処理した。第２の抗体による追加の結合は、非占有エピトープを示し（エピトープについての競合なし）、結合がなければエピトープ遮断が示される（エピトープについての競合）。
【0151】
結果
組換えヒトＣＤ２５細胞外タンパク質配列（ｒｈＣＤ２５）に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、材料及び方法に記載される酵母ベースの抗体提示ライブラリーを用いて単離した。これらの抗体をシークエンシングし、独自のクローンを酵母細胞において産生させた（Barnard GC et al., 2010）。独自の抗体配列を発現する各酵母クローンの細胞培養上清をｒｈＣＤ２５結合についてスクリーニングした。
組換えヒトＣＤ２５細胞外タンパク質配列（ｒｈＣＤ２５）に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、材料及び方法に記載される酵母ベースの抗体提示ライブラリーを用いて単離した。これらの抗体をシークエンシングし、独自のクローンを酵母細胞において産生させた（Barnard GC et al., 2010）。独自の抗体配列を発現する各酵母クローンの細胞培養上清をｒｈＣＤ２５結合についてスクリーニングした。
【0152】
ｒｈＣＤ２５への結合、配列独自性及び発現レベルに基づいて、ｍＡｂのパネルを特定した。これらの抗体を組換えカニクイザル及びマウスＣＤ２５細胞外ドメインタンパク質配列への結合について更に特性評価した。クローンを特性評価し、１０－８Ｍ～１０－１０Ｍに含まれる一価ｒｈＣＤ２５及び／又は組換えｃｙｎｏ ＣＤ２５細胞外タンパク質配列へのＩｇＧ結合値が示された。加えて、各抗体をＩＬ－２リガンド又は参照抗ＣＤ２５抗体ダクリズマブと競合する又は競合しないとして特性評価した。抗体クローンをフローサイトメトリーによってリンパ腫細胞株、ＳＵ－ＤＨＬ－１及びｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇ細胞等の異なるレベルのＣＤ２５を発現するヒト細胞への結合のレベルでも評価した。
【0153】
【0154】
【0155】
最後に、凝集及び非特異的相互作用の傾向がある抗体配列を除去するために、抗体を多特異性試薬（Poly Specific Reagent；ＰＳＲ）アッセイ、及び早期抗体開発のためのハイスループットスクリーニングを可能にするアプローチである親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法（Affinity－Capture Self－Interaction Nanoparticle Spectroscopy；ＡＣ－ＳＩＮＳ）においてスクリーニングした（Liu Y et al., 2014）。選択抗体は、いずれも後者のアッセイにおいて陽性とスコアリングされなかったため、パネルから除去されなかった。
【0156】
上記のようにシークエンシング及び特性評価した選択ヒットのうち、クローンａＣＤ２５－ａ－６４６は、ヒトＣＤ２５結合について、ダクリズマブともバシリキシマブとも競合しないが（図１３Ａ及び図１３Ｂ）、結合について非遮断抗体７Ｇ７Ｂ６及び参照非ブロッカーａＣＤ２５－ａ－６８６と競合する（図１３Ｃ及び図１３Ｄ）新規の相補性決定領域（ＣＤＲ；図１）を提示する抗体である。Ｐｅｐｓｃａｎ技術を用いて行われたエピトープマッピング研究により、ａＣＤ２５－ａ－６４６が、アミノ酸４２～５６の領域（図２）においてヒトＣＤ２５に結合し、１０－８Ｍ～１０－１０Ｍの範囲のＫｄ値にてヒトＣＤ２５細胞外タンパク質配列に結合することが示される。
【0157】
ＣＤ２５動態測定－親和性及び／又はアビディティを用いた結合強度
親和性及びアビディティに関する下記の更なる研究を行った。ヒトＣＤ２５抗原へのＣＤ２５抗体の結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ２００機器（GE Healthcare）を使用した表面プラズモン共鳴により調べた。およそ８０００ＲＵ（共鳴単位（resonance units)）の捕捉システム（２０μｇ／ｍｌの抗ヒトＦａｂ；ヒトＦａｂ捕捉キットの注文コード：２８－９５８３－２５；GE Healthcare）を、GE Healthcareから供給されるアミンカップリングキット（ＢＲ－１０００－５０）を用いて、ｐＨ ５．０でＣＭ５チップ（GE Healthcare、ＢＲ－１００５－３０）に連結した。
親和性及びアビディティに関する下記の更なる研究を行った。ヒトＣＤ２５抗原へのＣＤ２５抗体の結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ２００機器（GE Healthcare）を使用した表面プラズモン共鳴により調べた。およそ８０００ＲＵ（共鳴単位（resonance units)）の捕捉システム（２０μｇ／ｍｌの抗ヒトＦａｂ；ヒトＦａｂ捕捉キットの注文コード：２８－９５８３－２５；GE Healthcare）を、GE Healthcareから供給されるアミンカップリングキット（ＢＲ－１０００－５０）を用いて、ｐＨ ５．０でＣＭ５チップ（GE Healthcare、ＢＲ－１００５－３０）に連結した。
【0158】
泳動及び希釈バッファーは、ＰＢＳ－Ｐ（ｐＨ７．４）（２０ｍＭのリン酸バッファー、２．７ｍＭのＫＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０；GE Healthcare、注文コード２８－９９５０－８４）とした。フローセルは２５℃に、サンプル区画は１２℃に設定した。１０μｌ／分の流量で６０秒間、３μｇ／ｍｌの溶液を注入することにより、ＣＤ２５抗体を捕捉した。３０μｌ／分の流量で１８０秒間、１０００ｎＭの濃度から開始して１０倍希釈刻みで１ｎＭまでのヒトＣＤ２５溶液を注入することにより、ＣＤ２５抗原の結合を測定した。解離相は、サンプル溶液の注入を泳動バッファーに切り替えることで誘発され、最大６００秒間、モニタリングした。１０μｌ／分の流量で１０ｍＭのグリシン（ｐＨ ２．１）の２回の連続した１分間注入（キットにより与えられる）にて洗浄することにより、表面を再生した。抗ヒトＦａｂ参照表面から得られた応答を差し引くことにより、バルク屈折率の差を補正し、更にブランク注入も差し引いた（＝二重参照（double referencing））。
【0159】
様々なＣＤ２５抗原変異体、すなわち社内で製造したモノマー抗原（Ｐ１ＡＡ５８７２）及び２つの市販ＣＤ２５抗原（Sino Biologicals、カタログ番号１０１６５－Ｈ０８Ｈ；R&D Systems、カタログ番号２２３－２Ａ／ＣＦ）を用いて、ＣＤ２５抗体の結合特性を評価した。
【0160】
ＫＤ及び動態パラメーターの算出のために、Ｂｉａｃｏｒｅで与えられたフィッティングモデルを用いて、最適な曲線フィッティング結果を得た。１：１ ＬａｎｇｍｕｉｒフィッティングをＰ１ＡＡ５８７２に、またＴｗｏ Ｓｔａｔｅ Ｋｉｎｅｔｉｃ適合をSino Biologicals及びR&D Systems製のＣＤ２５に用いた。
【0161】
【0162】
このため、ａＣＤ２５－ａ－６４６配列（図１）により、ＣＤ２５に特異的に結合する抗体が特定され、その抗ＣＤ２５抗体剤を規定する機能的特徴に関連する活性は、その用語が本明細書で使用される場合に、セルベースアッセイ又は動物モデルによって機能的に評価することができる。
【0163】
実施例２：ＣＤ２５調節抗体剤を検証するセルベースモデル
材料及び方法
ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイによるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＬ－２シグナル伝達：
ＩＬ－２遮断を、ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイを用いて特性評価し、ＩＬ－２シグナル伝達を試験した。予め凍結したＰＢＭＣ（Stemcell Technologies）をＵ字底９６ウェルプレートにおいて１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２５抗体の存在下で３０分間培養した後、１０％ＦＢＳ（Sigma）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Life Technologies）及び１００００Ｕ／ｍｌ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Sigma）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Life Technologies）中で１０Ｕ／ｍｌ、又は０．２５Ｕ／ｍｌ、０．７４Ｕ／ｍｌ、２．２２Ｕ／ｍｌ、６．６６Ｕ／ｍｌ若しくは２０Ｕ／ｍｌと様々な濃度のＩＬ－２（Peprotech）を１０分間添加した。細胞をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標） Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Invitrogen）で固定及び透過処理し、ＢＤ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（BD Biosciences）で処理することでＩＬ－２誘導ＳＴＡＴ５リン酸化を停止した。次いで、細胞を表面及び細胞内蛍光色素標識抗体（ＳＴＡＴ５－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７クローン４７／ｓｔａｔ５／ｐＹ６９４（BD Bioscience）、ＣＤ３－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５クローンＵＣＨＴ１（Biolegend）、ＣＤ４－ＢＶ５１０クローンＳＫ３（BD Bioscience）、ＣＤ８－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００クローンＲＰＡ－Ｔ８（Invitrogen）、ＣＤ４５ＲＡ－ＰＥ－Ｃｙ７クローンＨＩ１００（Invitrogen）、ＦｏｘＰ３－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８クローン２３６Ａ／Ｅ７（Invitrogen））で同時に染色し、サンプルをＦｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ Ｘ２０フローサイトメーター（BD Bioscience）で取得し、ＢＤ ＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェアを用いて分析した。ＦＣＳ－Ｈ対ＦＣＳ－Ａを用いてダブレットを除外し、ＳＳＣ－Ａ対ＦＣＳ－Ａパラメーターを用いてリンパ球を規定した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＣＤ３ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５－Ａ対ＦＣＳ－Ａのプロットを用いて規定し、ゲートをカウント対ＳＴＡＴ５ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－Ａを示すヒストグラム上に描画して、ＳＴＡＴ５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の集団を決定した。ＩＬ－２シグナル伝達の遮断率は、以下のように算出した：遮断（％）＝１００×［（Ｓｔａｔ５＋細胞無Ａｂ群（％）－Ｓｔａｔ５＋細胞１０μｇ／ｍｌ Ａｂ群（％））／（Ｓｔａｔ５＋細胞無Ａｂ群（％））］。異なるＴ細胞サブセット（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋、ナイーブ及びメモリーＴ細胞）によるＳＴＡＴ５リン酸化の更なる分析も、それぞれのサブセットについてゲーティングすることによって評定し、上記のように分析した。グラフ化及び統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７を用いて行った。
材料及び方法
ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイによるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＬ－２シグナル伝達：
ＩＬ－２遮断を、ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイを用いて特性評価し、ＩＬ－２シグナル伝達を試験した。予め凍結したＰＢＭＣ（Stemcell Technologies）をＵ字底９６ウェルプレートにおいて１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２５抗体の存在下で３０分間培養した後、１０％ＦＢＳ（Sigma）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Life Technologies）及び１００００Ｕ／ｍｌ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Sigma）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Life Technologies）中で１０Ｕ／ｍｌ、又は０．２５Ｕ／ｍｌ、０．７４Ｕ／ｍｌ、２．２２Ｕ／ｍｌ、６．６６Ｕ／ｍｌ若しくは２０Ｕ／ｍｌと様々な濃度のＩＬ－２（Peprotech）を１０分間添加した。細胞をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標） Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Invitrogen）で固定及び透過処理し、ＢＤ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（BD Biosciences）で処理することでＩＬ－２誘導ＳＴＡＴ５リン酸化を停止した。次いで、細胞を表面及び細胞内蛍光色素標識抗体（ＳＴＡＴ５－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７クローン４７／ｓｔａｔ５／ｐＹ６９４（BD Bioscience）、ＣＤ３－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５クローンＵＣＨＴ１（Biolegend）、ＣＤ４－ＢＶ５１０クローンＳＫ３（BD Bioscience）、ＣＤ８－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００クローンＲＰＡ－Ｔ８（Invitrogen）、ＣＤ４５ＲＡ－ＰＥ－Ｃｙ７クローンＨＩ１００（Invitrogen）、ＦｏｘＰ３－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８クローン２３６Ａ／Ｅ７（Invitrogen））で同時に染色し、サンプルをＦｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ Ｘ２０フローサイトメーター（BD Bioscience）で取得し、ＢＤ ＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェアを用いて分析した。ＦＣＳ－Ｈ対ＦＣＳ－Ａを用いてダブレットを除外し、ＳＳＣ－Ａ対ＦＣＳ－Ａパラメーターを用いてリンパ球を規定した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＣＤ３ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５－Ａ対ＦＣＳ－Ａのプロットを用いて規定し、ゲートをカウント対ＳＴＡＴ５ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－Ａを示すヒストグラム上に描画して、ＳＴＡＴ５＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の集団を決定した。ＩＬ－２シグナル伝達の遮断率は、以下のように算出した：遮断（％）＝１００×［（Ｓｔａｔ５＋細胞無Ａｂ群（％）－Ｓｔａｔ５＋細胞１０μｇ／ｍｌ Ａｂ群（％））／（Ｓｔａｔ５＋細胞無Ａｂ群（％））］。異なるＴ細胞サブセット（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋、ナイーブ及びメモリーＴ細胞）によるＳＴＡＴ５リン酸化の更なる分析も、それぞれのサブセットについてゲーティングすることによって評定し、上記のように分析した。グラフ化及び統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７を用いて行った。
【0164】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞活性化アッセイ：
Ｔｅｆｆ応答へのＩＬ－２シグナル伝達の影響を、細胞内グランザイムＢ（ＧｒＢ）の上方調節及び増殖を試験する、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて特性評価した。予め凍結した初代ヒト汎Ｔ細胞（Stemcell Technologies）を、ｅＦｌｕｏｒ４５０細胞増殖色素（Invitrogen）で製造業者の推奨に従って標識し、１０％ＦＢＳ（Sigma）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Life Technologies）及び１００００Ｕ／ｍｌ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Sigma）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Life Technologies）の入ったＵ字底９６ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルで添加した。次いで、細胞を１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２５抗体又は対照抗体、続いてＨｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（２０：１の細胞対ビーズ比；Gibco）で処理し、３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で７２時間インキュベートした。Ｔ細胞活性化を評定するために、細胞をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅｆｌｕｏｒ７８０（Invitrogen）、続いて表面Ｔ細胞マーカーに対する蛍光色素標識抗体（ＣＤ３－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５クローンＵＣＨＴ１（Biolegend）、ＣＤ４－ＢＶ５１０クローンＳＫ３（BD Bioscience）、ＣＤ８－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００クローンＲＰＡ－Ｔ８（Invitrogen）、ＣＤ４５ＲＡ－ＰＥ－Ｃｙ７クローンＨＩ１００（Invitrogen）、ＣＤ２５－ＢＵＶ７３７クローン２Ａ３（BD Bioscience））で染色した後、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標） Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Invitrogen）で固定及び透過処理し、その後、細胞内ＧｒＢ及び核内ＦｏｘＰ３について染色した（グランザイムＢ－ＰＥクローンＧＢ１１（BD Bioscience）、ＦｏｘＰ３－ＡＰＣクローン２３６Ａ／Ｅ７）。サンプルをＦｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ Ｘ２０フローサイトメーター（BD Bioscience）で取得し、ＢＤ ＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェアを用いて分析した。ＦＣＳ－Ｈ対ＦＣＳ－Ａを用いてダブレットを除外し、ＳＳＣ－Ａ対ＦＣＳ－Ａパラメーターを用いてリンパ球を規定した。生ＣＤ３＋リンパ球からゲーティングしたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットを、ＧｒＢ－ＰＥ－Ａ対増殖ｅＦｌｕｏｒ４５０－Ａのプロットを用いて評定した。結果を全ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞集団からの増殖性ＧｒＢ陽性細胞のパーセンテージとして提示した。グラフ化及び統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７を用いて行った。
Ｔｅｆｆ応答へのＩＬ－２シグナル伝達の影響を、細胞内グランザイムＢ（ＧｒＢ）の上方調節及び増殖を試験する、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて特性評価した。予め凍結した初代ヒト汎Ｔ細胞（Stemcell Technologies）を、ｅＦｌｕｏｒ４５０細胞増殖色素（Invitrogen）で製造業者の推奨に従って標識し、１０％ＦＢＳ（Sigma）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Life Technologies）及び１００００Ｕ／ｍｌ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Sigma）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Life Technologies）の入ったＵ字底９６ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルで添加した。次いで、細胞を１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２５抗体又は対照抗体、続いてＨｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（２０：１の細胞対ビーズ比；Gibco）で処理し、３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で７２時間インキュベートした。Ｔ細胞活性化を評定するために、細胞をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅｆｌｕｏｒ７８０（Invitrogen）、続いて表面Ｔ細胞マーカーに対する蛍光色素標識抗体（ＣＤ３－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５クローンＵＣＨＴ１（Biolegend）、ＣＤ４－ＢＶ５１０クローンＳＫ３（BD Bioscience）、ＣＤ８－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００クローンＲＰＡ－Ｔ８（Invitrogen）、ＣＤ４５ＲＡ－ＰＥ－Ｃｙ７クローンＨＩ１００（Invitrogen）、ＣＤ２５－ＢＵＶ７３７クローン２Ａ３（BD Bioscience））で染色した後、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標） Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Invitrogen）で固定及び透過処理し、その後、細胞内ＧｒＢ及び核内ＦｏｘＰ３について染色した（グランザイムＢ－ＰＥクローンＧＢ１１（BD Bioscience）、ＦｏｘＰ３－ＡＰＣクローン２３６Ａ／Ｅ７）。サンプルをＦｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ Ｘ２０フローサイトメーター（BD Bioscience）で取得し、ＢＤ ＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェアを用いて分析した。ＦＣＳ－Ｈ対ＦＣＳ－Ａを用いてダブレットを除外し、ＳＳＣ－Ａ対ＦＣＳ－Ａパラメーターを用いてリンパ球を規定した。生ＣＤ３＋リンパ球からゲーティングしたＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットを、ＧｒＢ－ＰＥ－Ａ対増殖ｅＦｌｕｏｒ４５０－Ａのプロットを用いて評定した。結果を全ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞集団からの増殖性ＧｒＢ陽性細胞のパーセンテージとして提示した。グラフ化及び統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７を用いて行った。
【0165】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイ：
抗体依存性細胞介在性細胞傷害アッセイ（ＡＤＣＣアッセイ）を、抗ヒトＣＤ２５抗体の特性評価のためにＳＵ－ＤＨＬ－１又はＳＲ－７８６（ＣＤ２５陽性）ヒト細胞株を標的細胞として用い、ヒトＮＫ細胞をエフェクター細胞の供給源として用いて行った。ＮＫ細胞を健常ドナーのＰＢＭＣからＮＫ細胞陰性単離キット（Stemcell Technologies）を用いて単離した。ＮＫ細胞を２ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２（Peprotech）の存在下で一晩培養した。ＳＵ－ＤＨＬ－１又はＳＲ－７８６標的細胞にカルセインＡＭ（Thermofisher）をロードし、１条件当たり４つの反復試験区で抗ＣＤ２５又はアイソタイプ抗体の存在下、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間プレーティングした。インキュベーション後に、ＮＫ細胞を１：１０の標的：エフェクター（Ｔ：Ｅ）比（１００００個の標的細胞及び１０００００個のエフェクター細胞）でウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。上清におけるカルセイン蛍光の読出しをBMGのＦｌｕｏｓｔａｒプレートリーダーで行った。特異的溶解率を標的細胞単独（０％溶解）及び０．１％サポニンで処理した標的細胞（１００％溶解）に対して算出した。生データのグラフを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７を用いて作成し、用量応答曲線を生成した。標的細胞溶解率をＸＹチャート上にプロットし、正規化カルセインＡＭ放出率を濃度の対数に対してグラフ化し、データを非線形回帰曲線にフィッティングし、それによりＥＣ５０を算出した。
抗体依存性細胞介在性細胞傷害アッセイ（ＡＤＣＣアッセイ）を、抗ヒトＣＤ２５抗体の特性評価のためにＳＵ－ＤＨＬ－１又はＳＲ－７８６（ＣＤ２５陽性）ヒト細胞株を標的細胞として用い、ヒトＮＫ細胞をエフェクター細胞の供給源として用いて行った。ＮＫ細胞を健常ドナーのＰＢＭＣからＮＫ細胞陰性単離キット（Stemcell Technologies）を用いて単離した。ＮＫ細胞を２ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２（Peprotech）の存在下で一晩培養した。ＳＵ－ＤＨＬ－１又はＳＲ－７８６標的細胞にカルセインＡＭ（Thermofisher）をロードし、１条件当たり４つの反復試験区で抗ＣＤ２５又はアイソタイプ抗体の存在下、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間プレーティングした。インキュベーション後に、ＮＫ細胞を１：１０の標的：エフェクター（Ｔ：Ｅ）比（１００００個の標的細胞及び１０００００個のエフェクター細胞）でウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。上清におけるカルセイン蛍光の読出しをBMGのＦｌｕｏｓｔａｒプレートリーダーで行った。特異的溶解率を標的細胞単独（０％溶解）及び０．１％サポニンで処理した標的細胞（１００％溶解）に対して算出した。生データのグラフを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７を用いて作成し、用量応答曲線を生成した。標的細胞溶解率をＸＹチャート上にプロットし、正規化カルセインＡＭ放出率を濃度の対数に対してグラフ化し、データを非線形回帰曲線にフィッティングし、それによりＥＣ５０を算出した。
【0166】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＰアッセイ：
抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）アッセイを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇを標的細胞として用い、単球由来マクロファージをエフェクター細胞として用いて行った。ＰＢＭＣを、フィコール勾配遠心分離によって白血球コーンから単離した。単球（ＣＤ１４＋細胞）を、ＣＤ１４マイクロビーズ（Miltenyi Biotec）を用いて単離した。単球を１０％ＦＢＳ（Sigma）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Life Technologies）及び１００００Ｕ／ｍｌ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Sigma）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Life Technologies）中、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦの存在下で５日間培養し、Ｍ－ＣＳＦを含有する新鮮培地を３日後に添加した。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を、Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（R&D Systems）を用いて単離した。これらの細胞を３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で５日間インキュベートし、ｅＦｌｕｏｒ４５０色素（Invitrogen）で製造業者の推奨に従って標識した。５日目に、マクロファージ及びｅＦｌｕｏｒ４５０色素標識Ｔｒｅｇを、下記のように抗ＣＤ２５抗体又は対照の存在下にて１０対１のエフェクター対標的比で４時間同時培養する。１０対１のエフェクター対標的比のために、標的細胞（Ｔｒｅｇ）を１×１０４細胞／ウェルで添加し、エフェクター細胞（マクロファージ）を１×１０５細胞／ウェルで添加した。次いで、抗ＣＤ２５抗体を１μｇ／ｍｌの最高濃度、続いて対数系列（７点）にて二連で添加した。細胞及び抗体を３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。ＡＤＣＰを評定するために、細胞を氷上に置き、細胞表面マーカーＣＤ１４（ＣＤ１４－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５クローンＭｆＰ９（BD Biosciences））で染色し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ固定バッファーで固定した。二色フローサイトメトリー分析を、Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ Ｘ２０を用いて行った。残留標的細胞は、ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４－である細胞と規定した。マクロファージは、ＣＤ１４＋として規定した。二重標識細胞（ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４＋）は、マクロファージによる標的の食作用を表すとみなした。標的細胞の食作用は、以下の式を用いて算出した：食作用（％）＝１００×［（二重陽性率）／（二重陽性率＋残留標的率）］。
抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）アッセイを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化Ｔｒｅｇを標的細胞として用い、単球由来マクロファージをエフェクター細胞として用いて行った。ＰＢＭＣを、フィコール勾配遠心分離によって白血球コーンから単離した。単球（ＣＤ１４＋細胞）を、ＣＤ１４マイクロビーズ（Miltenyi Biotec）を用いて単離した。単球を１０％ＦＢＳ（Sigma）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Life Technologies）及び１００００Ｕ／ｍｌ Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Sigma）を含有するＲＰＭＩ １６４０（Life Technologies）中、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦの存在下で５日間培養し、Ｍ－ＣＳＦを含有する新鮮培地を３日後に添加した。制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を、Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（R&D Systems）を用いて単離した。これらの細胞を３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーター内で５日間インキュベートし、ｅＦｌｕｏｒ４５０色素（Invitrogen）で製造業者の推奨に従って標識した。５日目に、マクロファージ及びｅＦｌｕｏｒ４５０色素標識Ｔｒｅｇを、下記のように抗ＣＤ２５抗体又は対照の存在下にて１０対１のエフェクター対標的比で４時間同時培養する。１０対１のエフェクター対標的比のために、標的細胞（Ｔｒｅｇ）を１×１０４細胞／ウェルで添加し、エフェクター細胞（マクロファージ）を１×１０５細胞／ウェルで添加した。次いで、抗ＣＤ２５抗体を１μｇ／ｍｌの最高濃度、続いて対数系列（７点）にて二連で添加した。細胞及び抗体を３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。ＡＤＣＰを評定するために、細胞を氷上に置き、細胞表面マーカーＣＤ１４（ＣＤ１４－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５クローンＭｆＰ９（BD Biosciences））で染色し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ固定バッファーで固定した。二色フローサイトメトリー分析を、Ｆｏｒｔｅｓｓａ ＬＳＲ Ｘ２０を用いて行った。残留標的細胞は、ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４－である細胞と規定した。マクロファージは、ＣＤ１４＋として規定した。二重標識細胞（ｅＦｌｕｏｒ４５０色素＋／ＣＤ１４＋）は、マクロファージによる標的の食作用を表すとみなした。標的細胞の食作用は、以下の式を用いて算出した：食作用（％）＝１００×［（二重陽性率）／（二重陽性率＋残留標的率）］。
【0167】
統計：
Ｐｒｉｓｍソフトウェア（GraphPad）を用いて曲線フィッティングを行い、ＥＣ５０値及び最大活性を決定した。
Ｐｒｉｓｍソフトウェア（GraphPad）を用いて曲線フィッティングを行い、ＥＣ５０値及び最大活性を決定した。
【0168】
結果
ａＣＤ２５－ａ－６４６抗体を、実施例１において特定及び特性評価された他のＣＤ２５抗体と同様に、ＩＬ－２シグナル伝達を妨げない能力及びＣＤ２５発現標的細胞を殺傷する能力に関して更に評価した。Ｏｃｔｅｔを用いたリガンド結合アッセイにより、ａＣＤ２５－ａ－６４６がＣＤ２５へのＩＬ－２結合に影響を及ぼさないことが示された（図６）。これをＳＴＡＴ５アッセイにおいて確認したが、ａＣＤ２５－ａ－６４６は、試験したＩＬ－２濃度に関わらずにＩＬ－２シグナル伝達を遮断せず、参照抗体ダクリズマブによってＩＬ－２シグナル伝達が完全に遮断された（図８）。いわゆる「Ｔａｃ」エピトープを介したＣＤ２５とＩＬ－２との相互作用を遮断することが示されているダクリズマブ（非特許文献１７及び非特許文献１８）は、ａＣＤ２５－ａ－６４６とは異なるエピトープに結合し（図７）、これにより、ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおいてダクリズマブがＩＬ－２シグナル伝達を遮断し、ａＣＤ２５－ａ－６４６がＩＬ－２シグナル伝達を遮断しない理由を説明することができる（図８）。さらに、ダクリズマブは、おそらくそのＩＬ－２シグナル伝達の遮断により、活性化Ｔ細胞のエフェクター応答を低減し、ＩＬ－２シグナル伝達を遮断しないａＣＤ２５－ａ－６４６は、たとえあったとしても抗体なし又はアイソタイプ対照の条件と比較してＴ細胞応答に対する影響は最小限しかない（図９）。最後に、ａＣＤ２５－ａ－６４６は、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体と比較した場合にＡＤＣＣ（図１０）及びＡＤＣＰ（図１２）によってＣＤ２５発現細胞、腫瘍細胞又は制御性Ｔ細胞を殺傷する。脱フコシル化ａＣＤ２５－ａ－６４６抗体は、非改変ＣＤ２５抗体に比べて、ＡＤＣＣを介したＣＤ２５陽性細胞の死滅を更に増大させる（図１１）。
ａＣＤ２５－ａ－６４６抗体を、実施例１において特定及び特性評価された他のＣＤ２５抗体と同様に、ＩＬ－２シグナル伝達を妨げない能力及びＣＤ２５発現標的細胞を殺傷する能力に関して更に評価した。Ｏｃｔｅｔを用いたリガンド結合アッセイにより、ａＣＤ２５－ａ－６４６がＣＤ２５へのＩＬ－２結合に影響を及ぼさないことが示された（図６）。これをＳＴＡＴ５アッセイにおいて確認したが、ａＣＤ２５－ａ－６４６は、試験したＩＬ－２濃度に関わらずにＩＬ－２シグナル伝達を遮断せず、参照抗体ダクリズマブによってＩＬ－２シグナル伝達が完全に遮断された（図８）。いわゆる「Ｔａｃ」エピトープを介したＣＤ２５とＩＬ－２との相互作用を遮断することが示されているダクリズマブ（非特許文献１７及び非特許文献１８）は、ａＣＤ２５－ａ－６４６とは異なるエピトープに結合し（図７）、これにより、ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおいてダクリズマブがＩＬ－２シグナル伝達を遮断し、ａＣＤ２５－ａ－６４６がＩＬ－２シグナル伝達を遮断しない理由を説明することができる（図８）。さらに、ダクリズマブは、おそらくそのＩＬ－２シグナル伝達の遮断により、活性化Ｔ細胞のエフェクター応答を低減し、ＩＬ－２シグナル伝達を遮断しないａＣＤ２５－ａ－６４６は、たとえあったとしても抗体なし又はアイソタイプ対照の条件と比較してＴ細胞応答に対する影響は最小限しかない（図９）。最後に、ａＣＤ２５－ａ－６４６は、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体と比較した場合にＡＤＣＣ（図１０）及びＡＤＣＰ（図１２）によってＣＤ２５発現細胞、腫瘍細胞又は制御性Ｔ細胞を殺傷する。脱フコシル化ａＣＤ２５－ａ－６４６抗体は、非改変ＣＤ２５抗体に比べて、ＡＤＣＣを介したＣＤ２５陽性細胞の死滅を更に増大させる（図１１）。
【0169】
結論として、ａＣＤ２５－ａ－６４６を特性評価したが、ａＣＤ２５－ａ－６４６は、ＣＤ２５陽性細胞（Ｔｒｅｇ又は癌細胞株）の強力な殺傷を示し、ＩＬ－２シグナル伝達を妨げず、結果としてＴエフェクター応答を阻害しない。このため、ａＣＤ２５－ａ－６４６は、単独療法として又は組合せで癌の治療に適用し得るＴｒｅｇ枯渇抗体である。
【0170】
実施例３：ＣＤ２５調節抗体剤の変異体の作製
ａＣＤ２５－ａ－６４６を更なる親和性成熟に供した。最適化は、多様性を重鎖可変領域に導入することによって行った。抗体のＣＤＲＨ３を、多様性が１×１０８のＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２変異体を有する予め作成したライブラリーに組み換え、選択をナイーブ開発に記載されるように１回のＭＡＣＳ及び４回のＦＡＣＳによって行った。ＦＡＣＳ回では、ライブラリーをＰＳＲ結合、種交差反応性、抗原交差反応性及び親和性圧力（affinity pressure）について調べ、選別を行って、所望の特性を有する集団を得た。これらの選択については、親和性圧力を、ビオチン化単量体抗原を力価決定するか、又はビオチン化抗原を親Ｆａｂ又はＩｇＧと共に３０分間プレインキュベートした後、その予め合わせた混合物を選択が平衡に達するまでの時間にわたって酵母ライブラリーに適用することによって適用した。次いで、より高親和性の抗体を選別することが可能であった。
ａＣＤ２５－ａ－６４６を更なる親和性成熟に供した。最適化は、多様性を重鎖可変領域に導入することによって行った。抗体のＣＤＲＨ３を、多様性が１×１０８のＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２変異体を有する予め作成したライブラリーに組み換え、選択をナイーブ開発に記載されるように１回のＭＡＣＳ及び４回のＦＡＣＳによって行った。ＦＡＣＳ回では、ライブラリーをＰＳＲ結合、種交差反応性、抗原交差反応性及び親和性圧力（affinity pressure）について調べ、選別を行って、所望の特性を有する集団を得た。これらの選択については、親和性圧力を、ビオチン化単量体抗原を力価決定するか、又はビオチン化抗原を親Ｆａｂ又はＩｇＧと共に３０分間プレインキュベートした後、その予め合わせた混合物を選択が平衡に達するまでの時間にわたって酵母ライブラリーに適用することによって適用した。次いで、より高親和性の抗体を選別することが可能であった。
【0171】
次いで、最良の親和性を示す変異体を哺乳動物産生のために選択し、上記実施例１及び実施例２に記載のアッセイを用いて更に特性評価した。
【0172】
【0173】
【0174】
【0175】
Ｋａｒｐａｓ ２９９細胞結合実験により、ＣＤ２５への変異抗体の結合が親クローンと同程度であったことが確認された（図２１）。変異抗体は、１０－８Ｍ～１０－１０Ｍの範囲のＫｄ値でヒトＣＤ２５細胞外タンパク質配列と結合し、親クローンと比較しておよそ２倍～１０倍改善した（図１９）。
【0176】
競合アッセイにより、変異抗体ａＣＤ２５－ａ－６４６ｍ１がヒトＣＤ２５結合についてダクリズマブ又はバシリキシマブと競合しないが、結合について非遮断抗体７Ｇ７Ｂ６及び参照非ブロッカーａＣＤ２５－ａ－１１０と競合することが示された（図２０）。
【0177】
ＳＴＡＴ５アッセイにより、変異抗体ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ１、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ２、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ３、ａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ４及びａＣＤ２５－ａ－６４６－ｍ５が親クローンａＣＤ２５－ａ－６４６と同程度にＩＬ－２シグナル伝達を遮断せず、参照抗体ダクリズマブによりＩＬ－２シグナル伝達が完全に遮断されることが示された（図２２）。いわゆる「Ｔａｃ」エピトープを介したＣＤ２５のＩＬ－２との相互作用を遮断することが示されているダクリズマブは、ａＣＤ２５－ａ－６４６及びその変異体とは異なるエピトープに結合し、このことにより、ダクリズマブがＩＬ－２シグナル伝達を遮断し、ａＣＤ２５－ａ－６４６及びその変異体がＳＴＡＴ５リン酸化アッセイにおいてＩＬ－２シグナル伝達を遮断しない理由を説明することができる（図２２）。
【0178】
結論として、ａＣＤ２５－ａ－６４６変異抗体は、ＩＬ－２シグナル伝達に干渉することなく、その親クローンと同じようなものであることが示されている。
【0179】
実施例４：マウスモデル実験
材料及び方法
非ＩＬ－２遮断抗体の治療活性：Charles Riverから入手した雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０％マトリゲル中３×１０５個のＣＴ２６腫瘍細胞を脇腹に皮下注射した（１群当たりｎ＝１５）。動物を１日目の体重に基づいて処理群に無作為化した。処理を６日目に開始し、マウスを２００μｇ／動物の各抗体（マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ、ＩＬ－２中和抗体、マウスＩｇＧ１アイソタイプのＩＬ－２シグナル伝達を遮断する抗マウスＣＤ２５であるＰＣ６１ ｍＩｇＧ１、及びマウスＩｇＧ２ａアイソタイプのＩＬ－２シグナル伝達を遮断しない抗マウスＣＤ２５である７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａ）の１回の注射で処理した。動物に抗体１つ当たり１群での単独療法処理、又は７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａとＩＬ－２中和抗体、若しくは７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａとＰＣ６１ ｍＩｇＧ１抗体との併用処理を行った。マウスを、腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達した時点又は５０日間のいずれか早い方で屠殺した。
材料及び方法
非ＩＬ－２遮断抗体の治療活性：Charles Riverから入手した雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０％マトリゲル中３×１０５個のＣＴ２６腫瘍細胞を脇腹に皮下注射した（１群当たりｎ＝１５）。動物を１日目の体重に基づいて処理群に無作為化した。処理を６日目に開始し、マウスを２００μｇ／動物の各抗体（マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ、ＩＬ－２中和抗体、マウスＩｇＧ１アイソタイプのＩＬ－２シグナル伝達を遮断する抗マウスＣＤ２５であるＰＣ６１ ｍＩｇＧ１、及びマウスＩｇＧ２ａアイソタイプのＩＬ－２シグナル伝達を遮断しない抗マウスＣＤ２５である７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａ）の１回の注射で処理した。動物に抗体１つ当たり１群での単独療法処理、又は７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａとＩＬ－２中和抗体、若しくは７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａとＰＣ６１ ｍＩｇＧ１抗体との併用処理を行った。マウスを、腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達した時点又は５０日間のいずれか早い方で屠殺した。
【0180】
結果
抗ＣＤ２５枯渇非ＩＬ－２遮断抗体７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａは、処理マウスにおいて腫瘍拒絶を誘導し、他の抗体は、アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａと比較した場合に単独療法として効果を示さなかった。ＰＣ６１ ｍＩｇＧ１又はＩＬ２ ｎＡｂのいずれかのＩＬ２遮断抗体との組合せは、非ＩＬ－２遮断抗体７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａの治療活性を抑止する（図２３）。これにより、７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａの非ＩＬ－２遮断特徴が治療活性に重要であることが実証される。この抗体の治療活性が、最適活性についてＩＬ－２シグナル伝達に依存するＴエフェクター細胞によって媒介される抗腫瘍免疫応答に依拠することも示唆される。これらの結果から、ＩＬ－２／ＣＤ２５遮断活性の欠如がＣＤ２５標的抗体の最適治療活性に必要とされ、癌療法における本明細書に記載の抗ＣＤ２５非ＩＬ－２遮断抗体の使用を支持することが示される。
抗ＣＤ２５枯渇非ＩＬ－２遮断抗体７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａは、処理マウスにおいて腫瘍拒絶を誘導し、他の抗体は、アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２ａと比較した場合に単独療法として効果を示さなかった。ＰＣ６１ ｍＩｇＧ１又はＩＬ２ ｎＡｂのいずれかのＩＬ２遮断抗体との組合せは、非ＩＬ－２遮断抗体７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａの治療活性を抑止する（図２３）。これにより、７Ｄ４ ｍＩｇＧ２ａの非ＩＬ－２遮断特徴が治療活性に重要であることが実証される。この抗体の治療活性が、最適活性についてＩＬ－２シグナル伝達に依存するＴエフェクター細胞によって媒介される抗腫瘍免疫応答に依拠することも示唆される。これらの結果から、ＩＬ－２／ＣＤ２５遮断活性の欠如がＣＤ２５標的抗体の最適治療活性に必要とされ、癌療法における本明細書に記載の抗ＣＤ２５非ＩＬ－２遮断抗体の使用を支持することが示される。
【0181】
配列
本願に含まれる配列の概要を下記に提示する。
本願に含まれる配列の概要を下記に提示する。
【0182】
【0183】
均等物及び範囲
当業者には、本発明が実施例又は本明細書に含まれる或る特定の実施形態の他の記載ではなく、添付の特許請求の範囲によって定義されることが理解される。
当業者には、本発明が実施例又は本明細書に含まれる或る特定の実施形態の他の記載ではなく、添付の特許請求の範囲によって定義されることが理解される。
【0184】
同様に、本明細書で使用される場合、文脈上他に明らかに指示されない限り、数量を特定していない単数形（the singular forms "a", "an", and "the"）は概して、複数の指示対象を含む。
【0185】
上記で他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することもできる。概して、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸化学に関連して用いられる命名法及びその技法は、当該技術分野で既知であり、一般に使用されるか、又は製造業者の仕様書に従うものである。
【0186】
本明細書で言及される全ての刊行物は、それによって引用される刊行物と関連して上記方法及び／又は材料を開示及び説明するため引用することにより本明細書の一部をなす。
参考文献
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19-1】
【図19-2】
【図20-1】
【図20-2】
【図21-1】
【図21-2】
【図22】
【図23】
【配列表】