特許 7451424 マイクロフローサイトメトリーを使用して疾患を診断する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-08

(45)【発行日】2024-03-18

(54)【発明の名称】マイクロフローサイトメトリーを使用して疾患を診断する方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/574 20060101AFI20240311BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240311BHJP

   G01N 33/573 20060101ALI20240311BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20240311BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20240311BHJP

   G16H 50/00 20180101ALI20240311BHJP

【ＦＩ】

G01N33/574 A

G01N33/53 D

G01N33/53 P

G01N33/573 A

G01N33/483 C

G01N21/64 F

G16H50/00

【請求項の数】 20

(21)【出願番号】P 2020560403

(86)(22)【出願日】2019-04-26

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-08-30

(86)【国際出願番号】 CA2019050541

(87)【国際公開番号】W WO2019204940

(87)【国際公開日】2019-10-31

【審査請求日】2022-04-19

(31)【優先権主張番号】3,003,032

(32)【優先日】2018-04-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CA

(73)【特許権者】

【識別番号】520413014

【氏名又は名称】ナノスティックス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ルイス、ジョン

(72)【発明者】

【氏名】パプロスキー、ロバート

(72)【発明者】

【氏名】ピンク、デズモンド

(72)【発明者】

【氏名】バスケス、カタリーナ

【審査官】三木 隆

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／０７５８２５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／００１６９７８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許第０９９３４３６４（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１３／００９５５７５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／０５３５９２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Abstract Book: ISEV2017，JOURNAL OF EXTRACELLULAR VESICLES，2017年05月15日，Vol.6 No.Sup.1，Page.1310414

【文献】Isev 2018 abstract book，JOURNAL OF EXTRACELLULAR VESICLES，2018年04月30日，Vol.7 No.sup.1，Page.1461450

【文献】Desmond Pink，Technical validation of a micro-flow cytometry platform for prostate cancer biomarker discovery，Cancer Res，2017年06月30日，Vol.77 No.13 Supplement，Page.3799

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／５７４

Ｇ０１Ｎ ３３／５３

Ｇ０１Ｎ ３３／５７３

Ｇ０１Ｎ ３３／４８３

Ｇ０１Ｎ ２１／６４

Ｇ１６Ｈ ５０／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞外小胞を含む患者由来の試料を処理して、目的の疾患の疾患シグネチャーを識別する方法であって、
前記患者由来の試料を、前記細胞外小胞を前記目的の前記疾患についてのバイオマーカーに結合する１つ又は複数のプローブとインキュベートするステップと、
前記試料をマイクロフローサイトメトリーに供して、前記細胞外小胞を識別するステップと、
前記１つ又は複数のバイオマーカーについてのシグナル強度を得るステップ、及び前記試料に関連する１つ又は複数の光学特性を得るステップと、
前記シグナル強度、及び得られる場合、前記１つ又は複数の光学特性を処理して、前記試料中の異なる粒子表現型の濃度を計算するステップであって、前記シグナル強度を対数変換して変換したシグナル強度を生成する処理と、前記変換したシグナル強度が類似する粒子を、各関心領域は異なる粒子表現型である各光学特性について関心領域にビニングする処理とを含む、前記計算するステップと、
機械学習アルゴリズムのための入力として前記粒子表現型の前記濃度を使用して、臨床的に有意な前立腺がんを有する患者の確率を決定するステップと
を含む、方法。

【請求項2】

前記目的の疾患についての前記疾患シグネチャーに含まれる追加のバイオマーカーを識別するステップと、
前記１つ又は複数のバイオマーカーからの前記シグナル強度、及び存在する場合、前記１つ又は複数の光学特性を対数変換して、変換したシグナル強度を生成するステップと、
同様の変換したシグナル強度を有する粒子を、各バイオマーカーシグナルについての多くの異なる閾値を使用して関心領域内にビニングするステップと、
健康な対象由来の試料と、既知の疾患を有する対象由来の試料との間の各関心領域における前記粒子の濃度データを比較するステップと、
マーカーの各組合せから各関心領域についての受信者操作特性曲線下面積値を決定するステップと、
最も高い曲線下面積値を提供するバイオマーカーの組合せを選択して、前記疾患についての前記疾患シグネチャーを得るステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

患者における臨床的に有意な前立腺癌の前記疾患シグネチャーを識別するために、患者サンプルを処理するステップと、
前記シグナル強度、及び得られる場合、前記１つ又は複数の光学特性を処理して、前記試料中の異なる粒子表現型の濃度を計算するステップであって、当該計算するステップは、シグナル強度を対数変換して変換したシグナル強度を生成することと、同様の変換したシグナル強度を有する粒子を各関心領域が異なる粒子表現型である各光学特性ついての関心領域内にビニングすることとを含む、前記計算するステップと、
機械学習アルゴリズムのための特徴または入力として前記粒子表現型の前記濃度を使用して、臨床的に有意な前立腺がんを有する患者の確率を決定するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記対数変換するステップ及びビニングするステップが同時に行われる、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記対数変換するステップ及びビニングするステップが別々に行われる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記粒子をビニングするステップが、光学特性当たりのセット数のビンを使用してビニングするステップを含む、請求項４または５に記載の方法。

【請求項7】

粒子表現型の前記決定が、
Ｘ軸に蛍光強度、Ｙ軸に粒子密度をとり、すべてのバイオマーカー陽性粒子と陰性粒子の信号強度をプロットするカーネル密度推定の曲線を作成するステップと、
前記バイオマーカーの陰性粒子集団に対するカーネル密度推定のプロットにおけるＹ軸上の最も高い領域と交差するＸ軸上の蛍光値Ｆ１を識別するステップと、
Ｆ１から多くの異なるより高い蛍光シグナル強度について前記カーネル密度推定の曲線上の勾配を計算して、前記勾配がほとんど負である第２の蛍光値Ｆ２を識別するステップと、
Ｆ１＋（２^＊（Ｆ２－Ｆ１））＋Ｆ３（式中、Ｆ３は、バイオマーカー陰性粒子がバイオマーカー陽性粒子として分類されないようにするために加えられる小さな任意の蛍光強度値である）に等しいバイオマーカー陽性粒子及びバイオマーカー陰性粒子を分離する蛍光強度の値（Ｆｓ）を計算するステップと、
前記粒子が前記蛍光強度の値（Ｆｓ）を上回るバイオマーカー陽性又は下回るバイオマーカー陰性であるバイオマーカーシグナルを有するかどうかに基づいて全ての粒子のバイオマーカー陽性状態を決定するステップと、
前記粒子を、当該粒子の光散乱強度に基づいて異なる推定サイズグループにビニングするステップと、
前記バイオマーカー陽性状態及び前記光散乱強度のグループの全ての可能の組合せによって粒子表現型を決定するステップと
によって、各患者における各粒子について前記バイオマーカー陽性状態を識別する動的蛍光閾値化アルゴリズムを使用して実施される、請求項１又は３に記載の方法。

【請求項8】

前記機械学習アルゴリズムが、個別／バギング／ブースト決定木アルゴリズム、線形／二次／三次／ガウスサポートベクターマシンアルゴリズム、ロジスティック回帰、線形／二次／部分空間判別分析、又はｋ近傍法アルゴリズムである、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記機械学習アルゴリズムが、ブースト決定木アルゴリズムである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ブースト決定木アルゴリズムが、エクストリーム勾配ブースト決定木アルゴリズムである、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記エクストリーム勾配ブースト決定木アルゴリズムが、平均化された出力確率を有する少なくとも１００個のモデルのアンサンブルを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記方法は、標準治療スコアを含む予測スコアを生成する、請求項３に記載の方法。

【請求項13】

前記１つ又は複数のバイオマーカーがＳＬＣ４５Ａ３、ＦＯＬＨ１、ＧＨＳＲ、ＪＡＧ１、ＣＤＨ１１、ＳＥＬＥ、ＭＥＲＴＫ、ＧＡＢＲＡ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＡＢＣＣ５、ＬＥＴＭＤ１、ＣＡＤＭ１、ＥＭＰ２、ＥＮＴＰＤ２、ＡＢＣＢ１１、ＩＬ１７ＲＡ、ＲＮＦ１２２、ＳＴ１４、ＳＹＰＬ１、ＬＤＬＲＡＤ３、ＨＴＲ１Ｆ、ＥＭＰ１、ＴＲＰＶ６、ＫＣＮＮ２、ＣＬＣＮ６、ＳＬＣ１７Ａ３、ＳＬＣ４４Ａ４、ＳＬＣ２２Ａ２３、Ｃ９ｏｒｆ９１、ＲＤＨ１０、ＰＮＫＤ、ＴＭＥＭ２２９からなるグループから選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記試料が血清試料である、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記試料が血漿試料である、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記試料が尿試料である、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記試料が精液試料である、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

組織特異的バイオマーカーに結合するプローブの混合物が使用される、請求項１又は３に記載の方法。

【請求項19】

前記組織特異的バイオマーカーが、前立腺特異的バイオマーカー、がん特異的バイオマーカー、転帰特異的バイオマーカー、またはそれらの組み合わせである、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記がん特異的バイオマーカーがグレリンである、または前記転帰特異的バイオマーカーがポリシアル酸である、請求項１９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

概して、本発明は、診断方法及びその診断方法において試験されるバイオマーカーに関する。より具体的には、本発明は、臨床的に有意な前立腺がん診断のための細胞外小胞及びその臨床的に有意な前立腺がんを予測するためのバイオマーカーの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞外小胞（ＥＶ：Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）は、免疫学、神経学、心臓病学、及び腫瘍学などの様々な分野における診断及び予後に大きな可能性を秘めている。ＥＶには、エキソソーム（３０～１００ｎｍ）、微小胞（５０～２，０００ｎｍ）、アポトーシス小体（５００～４，０００ｎｍ）、及び非常に大きなオンコソーム（ｏｎｃｏｓｏｍｅ）（１，０００～１０，０００ｎｍ）が含まれる。正常細胞及び異常細胞は、それらの起源の細胞からｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びタンパク質マーカーの多くを含有するＥＶを継続的に放出する。ＥＶは、血液、尿、精液、及び脳脊髄液を含むほぼ全ての生体液中に見出されており、低侵襲性診断アッセイの有望な標的となっている。

【0003】

ＥＶ特性付けのための複数の方法が存在する（Ｓｚａｔｅｎｅｋ Ｒら、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １８（６）、２０１７年）。電子顕微鏡法はＥＶの最高解像度の画像を提供するが、ハイスループットデータ収集を欠き、多くのマーカーを同時に容易に測定することができず、生データが画像であるため、時間がかかり、複雑なデータ分析を必要とし得る（Ｈａｒｒｉｓ ＪＲ、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ５８１：３～１８頁、２０１５年）。ナノ粒子追跡分析及び調整可能な抵抗パルス感知は、粒子の迅速な計数及びサイジングを可能にするが、ＥＶマーカーを特性付けるためには理想的ではない（Ｇａｒｄｉｎｅｒ Ｃら、Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ２、２０１３年；Ｖｏｇｅｌ Ｒら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８３（９）：３４９９－３５－６、２０１１年）。ナノスケール又は高感度フローサイトメトリーとも称されるマイクロフローサイトメトリー（μＦＣＭ：Ｍｉｃｒｏｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）は、粒子の光学特性のハイスループット特性付けを可能にし、数百万のＥＶについての粒径、濃度、及びマーカー存在量の定量を数分で可能にする（Ｓｚａｔｅｎｅｋ、上記）。これらの望ましい特性は、μＦＣＭを高感度ＥＶベースの臨床アッセイに非常に適したものにする。

【0004】

μＦＣＭは、分析を複雑にする大量のデータを生成する。１００倍に希釈された典型的な１０μＬの血漿試料は、１分の分析において、数十を超える光学特性を伴う各々５，０００，０００を超える事象を生じ得る。換言すれば、１μＬの血漿は１０９を超える事象を有し得る。他の液体生検の種類は同様の濃度を有し得る。μＦＣＭによるＥＶの分析は、試料分析当たり、ナノ粒子（ＮＴＡ：Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）又は電子顕微鏡法と比較して少なくとも５００～５０，０００倍多い試料の事象を検査することができ、試料全体のより大きな代表的な分析を提供する。従来の細胞ベースのフローサイトメトリー分析は、典型的に、多くの細胞が同様のサイズを有し、マーカー陽性又は陰性として特性付けられるため、二変量散布図を生成し、４象限にわたってユーザが定義した関心領域（ＲＯＩ：ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）内の事象濃度を定量することを含む。このような方法は、ＥＶがサイズ、それ故、マーカー存在量に幅があるため、μＦＣＭでは単純すぎ、それにより、非常に大きな複雑なデータセットを迅速に処理することができるμＦＣＭ分析ツールの開発を必要とする。

【0005】

ＥＶベースの診断／予後アッセイを開発する場合、ＥＶは、生体試料内で特性付けされるだけでなく、患者の幸福及び／又は医療経済を改善することができる臨床的に意味のある状態を予測するそれらの能力についても分析されなければならない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｓｚａｔｅｎｅｋ Ｒら、Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １８（６）、２０１７年

【文献】Ｈａｒｒｉｓ ＪＲ、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ５８１：３～１８頁、２０１５年

【文献】Ｇａｒｄｉｎｅｒ Ｃら、Ｊ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ２、２０１３年

【文献】Ｖｏｇｅｌ Ｒら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ８３（９）：３４９９－３５－６、２０１１年

【文献】Ｃｈｕｒｍ Ｒら、Ｏｂｅｓ Ｒｅｖ １８（２）：１４０～１４８頁、２０１７年

【文献】Ｋａｓｐｅｒｚｙｋ ＪＬら、Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ２２（１２）：２３５４～６３頁、２０１３年

【文献】Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ａ及びＬａｉｏ Ａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４４（６１９１）：１４９２～６頁、２０１４年

【文献】Ｂｒｕｇｇｎｅｒ ＲＶら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１（２６）：Ｅ２７７０～７頁、２０１４年

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の一態様によれば、患者における疾患を診断する方法が提供される。この方法は、患者由来の血漿、血清、尿又は他の体液試料などの液体生検を、目的の疾患についてのバイオマーカーに結合する１つ又は複数のプローブとインキュベートするステップと、試料をマイクロフローサイトメトリーに供するステップと、１つ又は複数のバイオマーカーについてのシグナル強度を得るステップ、及び任意選択により、試料に関連する１つ又は複数の光学特性を得るステップと、シグナル強度、及び得られる場合、カスタムアルゴリズムを用いて処理した１つ又は複数の光学特性を処理して、試料中の異なる粒子表現型の濃度を計算するステップとを含む。これらの粒子表現型の濃度は、臨床的に有意な前立腺がんを有する患者の確率を決定するための機械学習アルゴリズムのための特徴（すなわち、入力）として使用される。

【0008】

本発明の別の態様によれば、疾患についての疾患シグネチャーを識別する方法が提供される。この方法は、健康な対象由来の試料及び既知の疾患を有する対象由来の試料を、バイオマーカーについての１つ又は複数のプローブとインキュベートするステップと、試料をマイクロフローサイトメトリーに供するステップと、１つ又は複数のバイオマーカーについてのシグナル強度を得るステップ、及び任意選択により、各試料に関連する１つ又は複数の光学特性を得るステップと、１つ又は複数のバイオマーカーからのシグナル強度、及び存在する場合、１つ又は複数の光学特性を対数変換して、変換したシグナル強度を生成するステップと、同様の変換したシグナル強度を有する粒子を関心領域（ＲＯＩ）内にビニングするステップと、各ＲＯＩについて粒子の濃度を決定するステップと、健康な対象由来の試料と、既知の疾患を有する対象由来の試料との間の各ＲＯＩにおける粒子の濃度データを比較するステップと、マーカーの各組合せから各ＲＯＩについての受信者操作特性（ＲＯＣ：ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線下面積（ＡＵＣ：ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）値を決定するステップと、最も高いＡＵＣ値を提供するバイオマーカーの組合せを選択して、疾患についての疾患シグネチャーを得るステップとを含む。

【0009】

本発明の更なる態様によれば、患者における臨床的に有意な前立腺がんを診断する方法が提供される。この方法は、患者由来の試料を、臨床的に有意な前立腺がんについての１つ又は複数のバイオマーカーに結合する１つ又は複数のプローブとインキュベートするステップと、試料をマイクロフローサイトメトリーに供するステップと、１つ又は複数のバイオマーカーについてのシグナル強度を得るステップ、及び任意選択により、試料に関連する１つ又は複数の光学特性を得るステップと、シグナル強度、及び得られる場合、異なる粒子表現型の濃度を決定するカスタムアルゴリズムを使用して１つ又は複数の光学特性を処理するステップと、機械学習アルゴリズムのための特徴（すなわち、入力）として粒子表現型の濃度を使用して、臨床的に有意な前立腺がんを有する患者の確率を決定するステップと、特定の確率閾値の使用に基づいて疾患を有する患者を診断するステップとを含む。

【0010】

一実施例では、処理するステップは、シグナル強度を対数変換して、変換したシグナル強度を生成するステップと、同様の変換したシグナル強度を有する粒子を、各関心領域（ＲＯＩ）が異なる粒子表現型であるとみなされる、各光学特性についてのＲＯＩ内にビニングするステップとを含む。他の実施例では、対数変換するステップ及びビニングするステップは同時又は別々に行われる。

【0011】

別の実施例では、粒子をビニングするステップは、光学特性当たりのセット数のビンを使用してビニングするステップを含む。

【0012】

更なる実施例では、この方法は複数のＲＯＩを含む。

【0013】

別の実施例では、粒子は、バイオマーカーに結合するプローブについてのそれらの陽性状態及びそれらの光散乱強度に基づいてビニングされる。粒子がバイオマーカーについて陽性であるかどうかを決定するために、カーネル密度推定（ＫＤＥ：ｋｅｒｎｅｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ）関数が、特定の患者についての特定のバイオマーカーについてのシグナルヒストグラムに適用される。蛍光値Ｆ１は、バイオマーカーの陰性粒子集団に対するＫＤＥプロットにおける最も高い領域から識別される。次に、ＫＤＥ曲線の勾配が、多くの異なるより高いシグナル強度について計算される。第２の蛍光値Ｆ２は、勾配が最も負である場所から識別され、これは陰性粒子集団の右側の下半分である。バイオマーカー陽性粒子及びバイオマーカー陰性粒子を分離する蛍光強度の値（Ｆｓ）は、Ｆ１＋（２^＊（Ｆ２－Ｆ１））＋Ｆ３（式中、Ｆ３は、バイオマーカー陰性粒子がバイオマーカー陽性粒子として分類されないことを保証するのに役立つように加えられる小さな任意の蛍光強度値である）に等しい。Ｆｓを上回る又は下回る蛍光強度を有する粒子は、それぞれ、バイオマーカーについて陽性又は陰性である。動的シグナル閾値化のこの方法は、時間の経過に伴う、及び異なる患者に対するシグナルシフトに耐性がある。各患者についての全ての粒子が各バイオマーカーについて陽性／陰性として分類されると、粒径を推定するために使用される対数変換光散乱シグナルは、任意の数のグループにビニングされる。例えば、０～１の範囲のシグナル強度及び１０のビンが存在する場合、０から０．１の間のシグナルはグループ１にあり、一方、０．９～１はグループ１０にある。最後に、粒子表現型は、バイオマーカー状態（陰性／陽性）及び光散乱ビンの全ての可能な組合せに基づいて作成される。例えば、バイオマーカーＡ＋及び光散乱ビン１／１０粒子は、バイオマーカーＡ－及び光散乱ビン１／１０粒子とは異なる。全ての粒子表現型の濃度が決定され、機械学習アルゴリズムのための入力特徴として使用される。

【0014】

なお更なる実施例では、機械学習アルゴリズムは、個別／バギング／ブースト決定木アルゴリズム、線形／二次／三次／ガウスサポートベクターマシンアルゴリズム、ロジスティック回帰、線形／二次／部分空間判別分析、又はｋ近傍法アルゴリズムである。一実施例では、機械学習アルゴリズムは、ブーストされ、アンサンブルされた決定木アルゴリズム、例えば、ＸＧＢｏｏｓｔアルゴリズムである。

【0015】

一実施例では、エクストリーム勾配ブースト決定木アルゴリズムは少なくとも１００個のモデルのアンサンブルを含み、各モデルの確率は臨床的に有意な前立腺がんの単一の確率値を生じるように平均化される。

【0016】

別の実施例では、予測スコアは標準治療スコアを含む。

【0017】

更なる実施例では、１つ又は複数のバイオマーカーは表１又は表２から選択される。

【0018】

なお更なる実施例では、試料は血清試料である。

【0019】

これら及び他の実施例及び特徴は、以下の説明及び図面を参照することにより、より良く理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】本発明の一実施例による方法の概略図を表す図である。

【図2】μＦＣＭデータを使用した臨床的特徴の予測／関連付けを示す図である。Ａ）ＬＡＬＳ－ＰＳＭＡ、ＬＡＬＳ－グレリン、及びＰＳＭＡ－グレリンデータセットを使用して種々の臨床的特徴を予測するための受信者操作特性曲線下面積（ＲＯＣ ＡＵＣ：ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）マップ。各マップにおける最大の１０％ＡＵＣを平均化し、比較した；Ｂ）ＬＡＬＳ－ＰＳＭＡデータセットを使用してＰＣａグレードグループ１＋、２＋、３＋、４＋及び５を予測するためのＲＯＣ ＡＵＣマップ；Ｃ）ＬＡＬＳ－グレリンデータセットを使用して糖尿病を予測するためのＲＯＣ ＡＵＣマップ；並びにＤ）ＬＡＬＳ－ＰＳＭＡデータセットを使用したＰＳＡ（右）、腫瘍ステージ（中央）、及び体重（右）についての相関係数マップ。

【図3】血漿試料からの粒子に対するＰＳＭＡ／グレリンプローブ染色の変動性が従来の手動ゲーティング分析を複雑にすることを示す図である。Ａ）、Ｂ）及びＣ）は、非臨床的に有意及び臨床的に有意なＰＣａ患者についての大角度光散乱（ＬＡＬＳ：ｌａｒｇｅ ａｎｇｌｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒ）及びＰＳＭＡ（ａ）、ＬＡＬＳ及びグレリン（ｂ）、並びにＰＳＭＡ及びグレリン（ｃ）の代表的な散布図及びＲＯＣ ＡＵＣマップである；Ｄ）手動ゲーティングによる患者の血漿中のＰＳＭＡ／グレリンプローブ陽性粒子の定量；Ｅ）手動ＲＯＩデータを使用して臨床的に有意なＰＣａ（グレードグループ３＋）を予測するためのＲＯＣ曲線。

【図4】μＦＣＭデータのｖｉＳＮＥ分析を示す図である。Ａ）臨床的に有意及び非臨床的に有意なＰＣａ患者からの同数の粒子（３０，０００）をｖｉＳＮＥにより分析した；Ｂ）高速検索／密度ピークアルゴリズムを使用して粒子をクラスター化した；Ｃ）臨床的に有意なＰＣａ粒子についてのｖｉＳＮＥクラスター純度。いくつかのクラスターは臨床的に有意なＰＣａ患者に由来する粒子に対してエンリッチメントを示す（矢印）。

【図5】ＰＳＭＡ－グレリンデータセットを使用して臨床的に有意なＰＣａを予測するためのμＦＣＭデータの機械学習の最適化を示す図である；Ａ）、Ｂ）、Ｃ）最適な機械学習アルゴリズム（ａ）、光学パラメーター当たりのビンの数（ｂ）及びアンサンブルにおけるＸＧ Ｂｏｏｓｔモデルの数（ｃ）；Ｄ）モデル性能に対するグリッドサーチＸＧＢｏｏｓｔパラメーター、特徴選択、及びアンサンブルの効果；Ｅ）臨床的に有意なＰＣａを予測するための手動ゲーティング、ＣＩＴＲＵＳ、及びカスタムビニング－ＸＧＢｏｏｓｔアルゴリズムについてのＲＯＣ曲線。プロットした値は、５倍交差検証の少なくとも１０回の反復による±ＳＥＭを表す。

【図6】臨床的に有意なＰＣａを予測するための臨床及びμＦＣＭデータの統合を示す図である。Ａ）μＦＣＭベースのＸＧＢｏｏｓｔ予測並びにＰＳＡ、年齢、人種、ＤＲＥ、以前の陰性生検、及びＰＣａの家族歴を含むＳＯＣ臨床的特徴を使用したロジスティック回帰モデルからの臨床的に有意なＰＣａの予測のウォーターフォールプロット；Ｂ）μＦＣＭデータを伴う又は伴わないＳＯＣのロジスティック回帰モデルの受信者操作特性曲線；Ｃ）がんと診断され、且つ異常ＤＲＥを伴う前立腺肥大（≧４０ｃｍ^３（４０ｃｃ））を有する又は有さない患者の割合；Ｄ）、Ｅ）前立腺肥大を有する及び有さない男性におけるＰＳＡ（ｄ）及びＰＳＡ密度（ｅ）。プロットした値は平均±ＳＥＭである；Ｆ）μＦＣＭ＋ＳＯＣロジスティック回帰モデルを使用した前立腺肥大を有する男性における臨床的に有意なＰＣａの予測；並びにＧ）前立腺肥大を有する男性が、μＦＣＭ＋ＳＯＣモデルを使用した生検を受けるべきかどうかの推奨。

【図7】ＬＡＬＳ－ＰＳＭＡ－グレリンデータセットのｖｉＳＮＥプロットのクラスタリングアルゴリズムの比較を示す図である。Ａ）、Ｂ）、及びＣ）クラスタリングアルゴリズムは、Ｋ平均（ａ）、期待値最大化ガウス混合モデル（ｂ）、及び高速検索／密度ピーク（ｃ）を含む。

【図8】ＰＳＭＡ－グレリンデータセット変換後のＸＧＢｏｏｓｔモデル性能のグラフ表示である。

【図9】臨床的に有意なＰＣａを予測するためにＰＳＭＡ－グレリンデータセットを使用したＸＧＢｏｏｓｔモデルからの可変ゲインマップ（ａ）、並びにＡＵＣ（カラースケール）及び可変ゲイン（グレースケール）マップのオーバーレイ（ｂ）を示す図である。

【図10】マイクロフローサイトメトリー及び超音波を使用した単一のがん細胞の高感度検出からの方法及び結果を表す図である。

【図11】シフトしたマイクロフローサイトメトリーデータに対する臨床的予測の向上した精度を示す方法及び結果を表す図である。

【図12】Ｊａｇｇｅｄ １についてのバイオマーカー結果を示す図である。

【図13】カドヘリン１１、２型、ＯＢカドヘリンについてのバイオマーカー結果を示す図である。

【図14】ポリシアル酸についてのバイオマーカー結果を示す図である。

【図15】ＭＥＲＴＫについてのバイオマーカー結果を示す図である。

【図16】プロステインについてのバイオマーカー結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

臨床的に有意な前立腺がんを含む、疾患を診断するためのバイオマーカーを例示する実施例；臨床的に有意な前立腺がんを含む、疾患を診断する方法；並びに疾患予測モデル及びそれを使用する診断検査を開発する方法が本明細書に記載される。本明細書に記載される実施例及び実例は、当業者のために意図された例示目的のためであり、決して限定することを意味しないことが理解される。開示全体にわたる実施例又は実例に対する全ての言及は、例示的で非限定的な実施例又は例示的で非限定的な実例に対する言及とみなされるべきである。

【0022】

別段に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。また、本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に別様を指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されなければならない。例えば、「抗原」又は「抗体」に対する言及は、複数の抗原分子又は抗体を含むことが意図される。

【0023】

患者における、臨床的に有意な前立腺がんなどの疾患を診断する方法が提供される。本論述の目的のために、「臨床的に有意な前立腺がん」は、グリーソングループ３又はそれ以上を有する前立腺がんを意味する。この方法は、患者由来の試料を、目的の疾患についての１つ又は複数のバイオマーカーに結合する１つ又は複数のプローブ及び／又は抗体とインキュベートするステップと、試料をマイクロフローサイトメトリーに供するステップと、１つ又は複数のバイオマーカーについてのシグナル強度を得るステップ、及び任意選択により、試料に関連する１つ又は複数の光学特性を得るステップと、シグナル強度、及び得られる場合、１つ又は複数の光学特性を、カスタムアルゴリズムを使用して処理して、患者試料中の異なる粒子表現型の濃度を決定するステップと、機械学習のための入力として患者試料からの粒子表現型の濃度データを使用して機械学習アルゴリズムの出力に基づいて疾患を有する患者を診断するステップとを含む。一実施例では、疾患は、がん、特に臨床的に有意な前立腺がんであり得、バイオマーカーは、がんバイオマーカー、特に臨床的に有意な前立腺がんバイオマーカーと相関する。

【0024】

疾患シグネチャーを識別する方法も提供される。この方法は、健康な対象由来の試料及び既知の疾患を有する対象由来の試料を、疾患についての１つ又は複数のバイオマーカーに結合する１つ又は複数のプローブとインキュベートするステップと、試料をマイクロフローサイトメトリーに供するステップと、１つ又は複数のバイオマーカーについてのシグナル強度を得るステップ、及び任意選択により、各試料に関連する１つ又は複数の光学特性を得るステップと、１つ又は複数のバイオマーカーからのシグナル強度、及び存在する場合、１つ又は複数の光学特性を対数変換して、変換したシグナル強度を生成するステップと、同様の変換したシグナル強度を有する粒子を関心領域（ＲＯＩ）内にビニングするステップと、各ＲＯＩにおける粒子の濃度（各ＲＯＩにおける全粒子数を、データ収集の間に分析される試料体積で除算することによって計算される）を決定するステップと、健康な対象由来の試料と、既知の疾患を有する対象由来の試料との間の各ＲＯＩにおける粒子の濃度データを比較するステップと、マーカーの各組合せから各ＲＯＩについての受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）値を決定するステップと、最も高いＡＵＣ値を提供するバイオマーカーの組合せを選択して、疾患についての疾患シグネチャーを得るステップとを含む。

【0025】

本発明において有用な試料には、血液（又はその成分）、精液、乳などの生体試料が含まれるが、これらに限定されない。本発明において、細胞外小胞は、他の方法において要求されるように、単離及び精製される必要はない。代わりに、血清又は血漿は、標準的な臨床診断手順に従って血液から単離され得、更なる精製及び処理を必要とすることなく、本明細書に記載される方法において使用され得る。

【0026】

試料は、目的の疾患若しくは診断される疾患についてのバイオマーカー、又はこの場合、ＥＶのような特定の種類の小粒子に関連するプローブとインキュベートされる。プローブには、特異的抗原に対する、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）_２若しくはＦ（ａｂ’）断片、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）などのような全抗体若しくは抗体成分、又は特異的標的に対するペプチドが含まれ得るが、これらに限定されない。プローブはまた、試料中の特定の成分の識別を可能にする種々の色素を含んでもよい。例えば、膜結合小粒子を染色する親油性色素とのインキュベーションは、試料中の脂質結合粒子からのタンパク質凝集体の分離に役立ち得る。典型的に、プローブは、プローブ結合標的の検出に役立つ、蛍光コンジュゲートなどの直接的にコンジュゲートした二次成分を有する。

【0027】

ＰＳＭＡ陽性ＥＶを検出するために、試料は、ＤｙＬｉｇｈｔ４０５などの色素と直接コンジュゲートしたＰＳＭＡ特異的モノクローナル抗体Ｊ５９１（ＢＺＬ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＬＬＣから入手可能）とインキュベートされ得る。或いは、非コンジュゲートプローブ（例えば、ＰＳＭＡ特異的モノクローナル抗体Ｊ５９１）は、試料とのインキュベーション後、アッセイに使用される一次プローブを識別するために二次薬剤と更にインキュベートされ得る。例えば、Ｑｄｏｔ５６５コンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ抗体とのインキュベーションは、その後のμＦＣＭアッセイにおける検出を可能にする。典型的に、バイオマーカープローブは、目的の疾患によって影響される細胞又は組織においてのみ発現されるか、又は主に発現される生体分子に特異的である。しかしながら、バイオマーカーは特定の細胞型に対して特異的であってもよい。更に、１つより多いバイオマーカーを使用して、目的の疾患及び／又は細胞型の１つより多い特徴を識別することができる。

【0028】

バイオマーカープローブとの試料のインキュベーションは、単一試料＋単一プローブフォーマットとして、又は単一試料＋複数プローブフォーマットとして行われ得る。インキュベーションのフォーマットは、各バイオマーカープローブが試料中のＥＶ集団に関する異なる情報を提供することができるので、異なる解決策を提供することができる。例えば、プローブは、脂質結合事象対非脂質結合事象、又は上皮粒子起源対非上皮粒子起源を示してもよい。他の場合には、プローブは、疾患の存在、疾患の存在及び侵襲性を示してもよい。インキュベーションにおける複数のプローブは、粒子起源、疾患の存在、及び疾患の侵襲性の同様の徴候を有し得る。したがって、プローブの組合せは疾患表現型の検出について有意な意味を有し得る。

【0029】

粒径及び計数は光散乱によって推定することができる。上記の蛍光強度と組み合わせた光散乱特性は、各粒子について固有の表現型を提供することができる。これらの粒子表現型は、単独で、又は複数のバイオマーカーと組み合わせて使用することができ、目的の疾患についての固有の疾患シグネチャーを提供することができる。

【0030】

試料は、これらに限定されないが、Ａｐｏｇｅｅ Ａ５０マイクロフローサイトメーター又はＣｙｔｏＦＬＥＸ又はＤｘＦｌｅｘフローサイトメーターなどの市販の機械を使用してμＦＣＭに供される。μＦＣＭ分析から得られた生データは、ＭＡＴＬＡＢ、Ｒ、又はＰｙｔｈｏｎで書かれたアルゴリズムを使用して抽出することができ、行として個々の粒子として、並びに列として光散乱及び蛍光強度として編成することができる。各粒子が記録された時間は別個の列に表すことができる。

【0031】

各粒子表現型についての光散乱／蛍光強度についての最小及び最大カットオフは、異なる光散乱／蛍光強度の範囲についての異なるカットオフの範囲を使用すること、及び以前に取得された患者データからの曲線下で最も高い受信者操作特性を提供するカットオフを識別することを含む、最適化実験によって決定することができる。

【0032】

各粒子表現型における粒子の数は、同様の光散乱及びマーカー強度を有する粒子をグループ化するカスタム処理スクリプトを使用して決定することができる。粒子表現型濃度は、粒子表現型数、試料を実施した時間の長さ、μＦＣＭの試料流速、及び試料の希釈係数に基づいて計算される。患者が１つより多いμＦＣＭデータファイル（すなわち、複数の複製）を有する場合、粒子表現型濃度は、全ての複製μＦＣＭの日付のファイルにわたって平均化され得る。

【0033】

また、各患者における各粒子についてのバイオマーカー陽性状態を識別することによって動的蛍光閾値化アルゴリズム（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して試料中の粒子表現型濃度を計算することも可能である。各患者試料についての粒子がバイオマーカーについて陽性であるかどうかを決定するために、カーネル密度推定（ＫＤＥ）関数が、単一の患者試料からの単一のプローブシグナルのヒストグラムプロットに適用される。蛍光値Ｆ１は、ＫＤＥプロットの左側付近の最大ピークである、バイオマーカー陰性粒子集団についてのＫＤＥプロットにおけるＹ軸上の最も高い領域（粒子密度）と交差するヒストグラムプロットのＸ軸上の領域（蛍光強度）として識別される。次に、ＫＤＥ曲線の勾配が、Ｆ１からの多くの異なるより高いシグナル強度について計算される。第２の蛍光値Ｆ２は、勾配が最も負である場所から識別され、これは陰性粒子集団の右側の下半分である。バイオマーカー陽性粒子及びバイオマーカー陰性粒子を分離する蛍光強度値（Ｆｓ）は、Ｆ１＋（２^＊（Ｆ２－Ｆ１））＋Ｆ３（式中、Ｆ３は、バイオマーカー陰性粒子がバイオマーカー陽性粒子として分類されないことを保証するのに役立つように加えられる小さな任意の蛍光強度値である）に等しい。Ｆｓを上回る又は下回る蛍光強度を有する粒子は、それぞれ、バイオマーカーについて陽性又は陰性である。各患者についての全ての粒子が各バイオマーカーについて陽性／陰性として分類されると、粒径を推定するために使用される対数変換光散乱シグナルは、任意の数のグループにビニングされる。最後に、粒子表現型は、バイオマーカー状態（陰性／陽性）及び光散乱ビンの全ての可能な組合せに基づいて作成される。

【0034】

上記で収集されたデータから、機械学習のためのデータセットが構築される。表は、全ての患者についての粒子表現型濃度を用いて作成することができる。１回の反復において、行は患者を表すことができ、列は粒子表現型濃度を表す。しかしながら、データは逆の様式で、又は何らかの他の表形式で表すことができることは当業者には明らかであろう。

【0035】

臨床的に関連するデータは、データセットが作成される方法に応じて、追加の列又は行として表に追加することができる。このデータは、機械学習についての付加的な特徴として使用することができるか（例えば、μＦＣＭデータを用いたＰＳＡは臨床的に有意な前立腺がんを有する人のより良い予測を提供するか？）、又は機械学習アルゴリズムが予測する必要があるラベルとして使用することができる（例えば、どの患者が臨床的に有意な前立腺がんを有するかの識別）。

【0036】

データセットが作成されると、臨床データを用いて又は用いずにμＦＣＭから臨床状態を予測することができる最適化された機械学習モデルが生成される。機械学習のために使用されるソフトウェアには、Ｒ、ＭＡＴＬＡＢ、ＫＮＩＭＥ、及びｐｙｔｈｏｎが含まれ得るが、これらに限定されない。機械学習モデルには、単一決定木、サポートベクターマシン、ｋ近傍法、線形回帰、ロジスティック回帰、判別分析、ランダムフォレスト、ニューラルネットワーク、及びＸＧＢｏｏｓｔが含まれ得る。臨床状態を予測するために最も高いＲＯＣ ＡＵＣを提供するアルゴリズムは、更に最適化することができる。全ての機械学習アルゴリズムは、データを５つの別個のグループに分割することを含む５倍交差検証を使用して分析される。モデルは５つのグループのうちの４つを使用して作成することができ、モデル精度はホールドアウトされたグループに対して決定することができる。グループはシャッフルされ、このプロセスは、全ての患者がホールドアウトされたグループで１回使用されるように更に４回反復される。これにより、モデルを作成するために使用されなかったデータに対してモデル精度が決定されることが保証される。

【0037】

機械学習アルゴリズム最適化は、再帰的特徴量削減を使用してモデル作成前にどのμＦＣＭ／臨床的特徴を保持／除去すべきかを識別することを含む。このアルゴリズムは全てのデータを使用してモデルから最も重要な特徴を識別する（例えば、Ｒにおけるｘｇｂ．重要度機能を使用したＸＧＢｏｏｓｔ特徴重要度）。上位１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％の最も重要な特徴を含む複数のデータセットが作成され、５倍交差検証を使用して最も高いＲＯＣ ＡＵＣを提供するデータセットは、最終的な機械学習モデルのために保持される特徴を含む。遺伝的アルゴリズム及び焼きなまし法を含む他の特徴選択アルゴリズムもまた、このステップで使用することができる。

【0038】

特徴選択の後、機械学習アルゴリズムの調整可能なパラメーターは、グリッドサーチによって最適化することができる。これは、各々の調整可能なアルゴリズムパラメーター（例えば、「ｎｒｏｕｎｄｓ」：１００、２００、及び３００、並びに「ｍａｘ＿ｄｅｐｔｈ」：３、４、及び５などのＸＧＢｏｏｓｔパラメーター）についての複数の値を提供し、可能なパラメーター値のあらゆる組合せを試験することを含む。５倍交差検証を使用して最も高いＲＯＣ ＡＵＣを提供するパラメーター値のセットが、最終的な機械学習モデルのために使用される。

【0039】

最終的な機械学習モデル最適化は、全てのモデルからの予測を平均化することによって、多く（典型的には１００以上）のモデルを一緒にアンサンブルすることを含む。全てのモデルは上記の最適化された特徴及びパラメーターを使用するが、各モデルは、モデル作成のために、患者のわずかに異なるコホート（例えば、患者の無作為に選択した８０％）を使用する。これにより、各モデルが固有になり、全てのモデルの予測の平均が、次いで完全なデータセットを有する単一のモデルを使用して、臨床状態のより正確且つ安定した予測を提供する。最終的に最適化されたアンサンブルモデルは将来の使用のためにコンピュータ上に保存される。

【0040】

最終的な機械学習モデルは、新しい患者の臨床状態を予測するために使用することができる。臨床データを伴う又は伴わない粒子表現型濃度を含む新しい患者データは、患者が特定の臨床状態を有する確率を予測するための最終的な機械学習モデルについての入力として使用することができる。

【0041】

上記の方法を使用して、以前に臨床的に有意な前立腺がんと診断された患者が、疾患と最も一般的に関連する粒子表現型／バイオマーカーを決定するために研究された。これらの粒子表現型／バイオマーカーを、図１２、１３、１４、１５及び１６における概念の更なる証拠と共に表１に示す。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0042】

「実例」
種々のサイズの異なるＥＶに起因して、目的はμＦＣＭデータを多くの異なるＲＯＩ（ここで各ＲＯＩは異なるＥＶの濃度を表す）に分離すること、及び臨床状態を予測するためにＲＯＩデータに関する機械学習を使用することであった（図１）。このようなモデルを作成する前に、まず、どの臨床状態をμＦＣＭデータが最適に予測することができるかを識別することが重要であった。自動分析スクリプトを使用して、ＰＳＭＡ及びグレリンプローブに関連する１０の異なる臨床状態を予測するためのμＦＣＭデータのＡＵＣマップを作成した。

【0043】

ＬＡＬＳ－ＰＳＭＡ、ＬＡＬＳ－グレリン、及びＰＳＭＡ－グレリンＡＵＣマップ内のＡＵＣのうちの最も高い１０％を平均すると、ＰＣａグレードグループ５及び４＋の予測が、最も高い平均ＡＵＣを生じた（図２ａ）。興味深いことに、３つ全ての二変量ＡＵＣマップは、グレードグループ５ＰＣａの予測に関して０．８を超えるＡＵＣを有するＬＡＬＳ－ＰＳＭＡと共にこれらの高グレードＰＣａの予測に関して０．７を上回る上位１０％のＡＵＣを提供した。ＬＡＬＳ－ＰＳＭＡ ＡＵＣマップは、異なるＰＣａグレードグループを比較した場合に興味深いパターンシフトを示した（図２ｂ）。ＬＡＬＳを使用して粒径を推定すると、グレードグループ１＋の予測は、０．５を超えるＡＵＣを有する比較的小さなＰＳＭＡ陽性粒子を示し、全体的にこれらのＲＯＩにおける粒子濃度が、グレードグループ１＋ＰＣａを有する患者において、より高いことを意味し、一方、より大きなＰＳＭＡ陽性粒子は主に０．５を下回るＡＵＣを示し、全体的にこれらのＲＯＩにおける粒子濃度が、グレードグループ１＋ＰＣａを有する患者において、より低いことを意味する。より高いグレードグループについてのＡＵＣマップは、より大きなＰＳＭＡ陽性粒子に対して０．８超のＡＵＣ及び多くのより小さなＰＳＭＡ陽性粒子に対して約０．３のＡＵＣを有するグレードグループ５ＰＣａでこの表現型の漸進的逆転を実証した。この表現型逆転はグレードグループ３＋ＡＵＣマップでかなり目立つようになった。以前の臨床試験では、前立腺全摘出術を受けたグレードグループ３のＰＣａ患者は、０．５以下の１０年の無再発進行であり、グレードグループ２のＰＣａを有するこれらの患者についての０．７５超より有意に低かった（２８）。このことにより、グレードグループ３のＰＣａを有する男性のほとんどは、原発腫瘍の外科的切除によってＰＣａの患者が治癒しないため、診断時に転移性疾患を有することが示唆される。理論によって制限されないが、より高いグレードのＰＣａ患者におけるより大きなＰＳＭＡ陽性粒子のより多くの存在量は、局所腫瘍細胞からのより大きなＥＶ（＞３００ｎｍ）が血管内への侵入を困難にするので、循環転移細胞に部分的に起因する可能性がある。

【0044】

エネルギー及びグルコース代謝におけるグレリンの役割（Ｃｈｕｒｍ Ｒら、Ｏｂｅｓ Ｒｅｖ １８（２）：１４０～１４８頁、２０１７年）に起因して、糖尿病を予測するためのＡＵＣマップを作成した。様々な異なるサイズのグレリン陽性粒子は０．７付近のＡＵＣを示したことから、糖尿病男性はグレリン受容体のレベルの上昇を伴うＥＶを有することが示唆される（図２ｃ）。

【0045】

ＬＡＬＳ－ＰＳＭＡデータを使用して、ＰＳＡ、腫瘍ステージ、及び体重についての相関マップを作成した（図２ｄ）。ＰＳＭＡに対してわずかに陽性の比較的大きな粒子はＰＳＡと最も高い正の相関を実証したが、強いＰＳＭＡ陽性である大きな粒子は腫瘍ステージと最もよく相関した。このような相関は驚くことではない。なぜなら、１）前立腺ＰＳＭＡ発現が、診断時にＰＳＡと相関すると示されており（Ｋａｓｐｅｒｚｙｋ ＪＬら、Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ２２（１２）：２３５４～６３頁、２０１３年）、２）より高いグレードの腫瘍ほど、より広がる可能性が高く、より高いグレードのＡＵＣマップと腫瘍ステージ相関マップとの間の類似性が説明されるからである。

【0046】

ＡＵＣ／相関マップの結果を考慮して、μＦＣＭデータを使用して、グレードグループ３＋と定義された臨床的に有意なＰＣａを予測した。なぜなら、これらの患者はグレードグループ２及びより低いＰＣａ患者よりも顕著に悪化した転帰を実証するからである。

【0047】

従来の分析のベンチマークを提供するために手動ゲーティングによってμＦＣＭデータを分析した。特定の粒子集団の周囲に手動ゲートを作成することは重要なタスクである。なぜなら、異なる粒子集団が異なる患者散布図上に存在し、集団位置においていくらかのわずかなシフトを伴うからである（図３ａ、ｂ、ｃ）。簡略化のために、全てのマーカー陽性粒子をグループ化したゲートを作成した。非臨床的に有意なＰＣａと比較した場合、臨床的に有意なＰＣａではグレリン陽性粒子の濃度のみが２．１倍有意に高かった（ｐ＜０．０５、図３ｄ）。臨床的に有意なＰＣａを予測するためのＰＳＭＡ－、グレリン－、及びＰＳＭＡ／グレリン陽性粒子濃度のＡＵＣは全て０．６を下回った（図３ｅ）。これらの低いＡＵＣは、０．５を上回る及び下回るＡＵＣを有する粒子を取り囲むゲートを示すＡＵＣマップによって説明することができる（図３ａ、ｂ、ｃ）。

【0048】

臨床的に有意及び非臨床的に有意な粒子の両方のｖｉＳＮＥプロットは、従来の散布図で見られたよりも多くの粒子集団を一緒に見出した（図４ａ）。Ｋ平均、期待値最大化ガウス混合モデル、及び高速探索／密度ピークアルゴリズムを使用して粒子をクラスター化し、最後のアルゴリズムは不規則な形状を有する大きなクラスターを維持することができる唯一のものであった（図４ｂ及び図８）。２つのクラスターは、臨床的に有意なＰＣａについて０．８超のクラスター純度を達成したことから、これらの粒子集団は臨床的に有意なＰＣａ患者内でより高いレベルにあることが示唆される（図４ｃ）。これらの結果は臨床的に利用するのに有望であるように見えるが、ｖｉＳＮＥの再現性のない性質は全てのデータを同時に分析することを必要とする。ｖｉＳＮＥは１００，０００個までの事象しか扱うことができないため、２１５人の患者コホートにおける粒子の９９．９９％超は分析から除外される。

【0049】

μＦＣＭデータからの臨床的に有意なＰＣａの予測を最適化するために、ＲＯＩからの粒子濃度を、２４の異なる機械学習アルゴリズムのための訓練データとして使用した。ＬＡＬＳ－ＰＳＭＡ、ＬＡＬＳ－グレリン、及びＰＳＭＡ－グレリンデータセットでは、ＸＧＢｏｏｓｔが０．６１、０．６２、及び０．６６において最も高いＡＵＣを提供した（図５ａ）。その後の全ての分析は、ＸＧＢｏｏｓｔと共にＰＳＭＡ－グレリンデータセットを使用した。

【0050】

決定木ベースのモデルについて予想されるように、μＦＣＭデータの単調変換はＸＧＢｏｏｓｔモデル性能を改善しなかった（図９）。ＸＧＢｏｏｓｔモデルの精度に対して最も重要なＲＯＩを示すＸＧＢｏｏｓｔ可変ゲインマップは、多くの異なる粒子集団がＸＧＢｏｏｓｔモデルにとって重要であることを示した（図１０ａ）。比較的高い可変ゲインを有するＲＯＩは、０．５を大きく上回る及び下回るＡＵＣマップ上の領域とほとんど重なったことにより、臨床的に有意なＰＣａ患者において、より高い及びより低い濃度を有する粒子集団がこのモデルにとって重要であることが示唆される（図１０ｂ）。

【0051】

ビニングストラテジーを、３２を上回る又は下回るように変化させると、ＡＵＣが減少したことにより、この解像度のレベルが臨床的に有意なＰＣａを予測するのに好ましいことが示唆される。ますます大きなＸＧＢｏｏｓｔモデルのアンサンブルを作成することにより、モデルの性能が向上した（図５ｃ）。単一のＸＧＢｏｏｓｔモデルと比較して、１００個のモデルのアンサンブルはＡＵＣにおいて５％の改善をもたらし、モデル変動性を９５％低下させた。より大きなＸＧＢｏｏｓｔアンサンブルはより大きなモデル性能のために作られ得るが、精度におけるこのような小さな利点はより大きな処理／メモリの要件も有する。グリッドサーチＸＧＢｏｏｓｔパラメーター及び再帰的特徴量削減は、ＸＧＢｏｏｓｔ ＡＵＣをそれぞれ３％及び５％増加させた（図５ｄ）。グリッドサーチ、特徴選択、アンサンブルを組み合わせると、ＸＧＢｏｏｓｔ ＡＵＣが１２％有意に増加したことから（ｐ＜０．０５）、モデル最適化技法の間の相加的相互作用が示唆される。ＰＳＭＡ－グレリンデータセットのＣｉｔｒｕｓ及び手動ゲーティング分析により、本発明者らの０．７５において最適化したＸＧＢｏｏｓｔモデルと比較して、それぞれ０．５２及び０．５９の有意に低いＡＵＣが生じた（ｐ＜０．０５）。この最適化したＸＧＢｏｏｓｔモデルはまた、臨床的に有意なＰＣａ患者と非臨床的に有意なＰＣａ患者との間で有意に異なる唯一の臨床的特徴であるＰＳＡより性能が優れていた（ｐ＝０．００１５、表１）。

【0052】

この最適化したモデルを臨床的に有意なＰＣａを予測するためのＳＯＣと比較するために、本発明者らのμＦＣＭベースのＸＧＢｏｏｓｔモデル予測を伴って又は伴わずにＳＯＣを使用してロジスティック回帰モデルを作成した。ＳＯＣ及びμＦＣＭモデルからの患者予測のウォーターフォールプロットは、０．０７３３２のカットオフ確率を使用した場合、８９％の感度及び４９％の特異性をもたらした（図６ａ及び表１）。μＦＣＭ予測にＳＯＣを加えると、ＡＵＣは０．７６にわずかに増加し、これはＳＯＣ単独からの０．６８のＡＵＣよりも有意に大きく（ｐ＜０．０５）、μＦＣＭベースのＸＧＢｏｏｓｔモデルの臨床的価値が実証された（図６ｂ）。

【表2】

【0053】

ＤＲＥ、直腸指診；ＳＯＣ、標準治療；ＣＩ、９５％信頼区間；ＲＯＣ ＡＵＣ、受信者操作特性曲線下面積；ＰＰＶ、陽性予測値；ＮＰＶ、陰性予測値；

【0054】

２１５人の患者コホートを更に分析すると、前立腺肥大（＞４０ｃｍ^３（４０ｃｃ））を有する男性はＰＣａを有する確率が有意に低いことが観察され、このことは、正常な大きさの前立腺を有する男性と比較して、前立腺肥大を有する、より多くのパーセンテージの男性が不必要な生検を受けていることを意味する。現在の臨床診療に基づくと、男性は主に高いＰＳＡレベル及び／又は異常ＤＲＥのために前立腺生検を受ける。異常ＤＲＥを有する患者の割合は、正常な前立腺を有する男性と前立腺肥大を有する男性との間で同様であったが（図６ｃ）、ＰＳＡレベルは前立腺肥大を有する男性において有意に高く（ｐ＜０．０５、図６ｄ）、ＰＳＡの上昇が不必要な生検の数の増加の原因であることが示唆される。ＰＳＡ密度（前立腺体積で除算したＰＳＡ）を使用してＰＳＡレベルを正規化することは理想的でないことがある。なぜなら、ＰＳＡ密度は前立腺肥大を有する男性において有意に低かったからである（図６ｅ）。前立腺肥大を有する男性に関して、臨床的に有意なＰＣａについてのＳＯＣ＋μＦＣＭ確率スコアは、非臨床的に有意なＰＣａ患者と臨床的に有意なＰＣａ患者との間で有意に異なり（ｐ＜０．０００５、図６ｆ）、表２における以前に定義された確率カットオフ閾値を使用すると、臨床的に有意なＰＣａ及び非臨床的に有意なＰＣａを有する患者のそれぞれ１００％及び４９％が生検を推奨され、不必要な生検の約半分が排除される一方で、臨床的に有意なＰＣａを検出するための感度は依然として１００％を維持する（図６ｇ）。

【0055】

Ａ．患者特性及び試料取得
生検前の血漿試料は、Ａｌｂｅｒｔａ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＡＰＣａＲＩ）バイオレポジトリーから取得した。組み入れ基準は、（１）前立腺の懸念のためにアルバータ州の泌尿器科クリニックを紹介され、前立腺生検を受ける予定であり、且つ（２）前立腺異常の診断又は処置のために経尿道的前立腺手術を受けたことがある、以前に前立腺がんと診断されていない成人男性であった。全ての患者には書面によるインフォームドコンセントが提供され、この研究は、Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｃａｌｇａｒｙ、Ａｌｂｅｒｔａ、カナダ）及びＮｏｒｔｈｅｒｎ Ａｌｂｅｒｔａ Ｕｒｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、Ａｌｂｅｒｔａ、カナダ）における科学倫理委員会によって承認された。患者は２０１４年６月から２０１５年９月の間に登録された。経直腸的超音波ガイド下の前立腺生検を、患者当たり１２コアの中央値で実施し、各病院のＳＯＰに従って評価した。患者ケアのために臨床現場に検査結果を提供しなかった。患者試料を取得し、それらを用いて試験を実施した検査技師は、患者特性について盲検化された。血液を採取し、施設のＳＯＰに従って血漿を採取するために処理し、治療群から－８０℃の冷凍庫までの時間は２時間以下であった。特に、血液試料は臨床グレードのバキュテナーで採取した。血漿調製のために、試料を２段階遠心分離プロセスにかけた。最初に、他の血液成分から血漿の分離をもたらすために、標準的な１３００×ｇを１０分間、続いて、血小板をペレット化するために２回目の１３００×ｇ×１０分間の遠心分離を行う。血清チューブに採取した血液を、最初に１５～３０分間凝固させ、次いで単一の１３００×ｇ×１０分間の遠心分離ステップを実施する。

【0056】

Ｂ．μＦＣＭアッセイ
凍結血漿試料を解凍し、１６，０００×ｇで３０分間遠心分離して大きな残屑及び血小板粒子を除去し、４００μｇ／ｍＬのＪ５９１抗体及び１／５０最終希釈の二次Ｑｄｏｔ５６５コンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ抗体とインキュベートした。また、試料を、グレリンの最初の１８アミノ酸を含有する０．０２５ｍＭのグレリンＣｙ５プローブとインキュベートした。プローブインキュベーションの３０分後、試料を二重濾過（０．２２μｍ）したリン酸緩衝生理食塩水中で１００倍希釈し、３．０１μＬ／分の流速を使用してＡｐｏｇｅｅ Ａ５０マイクロフローサイトメーターで分析した。試料は、２分間まで、又は５，０００，０００の事象が記録されるまでのいずれか早い方まで実施した。各患者からの血漿は３連で実施した。μＦＣＭデータの従来の手動ゲーティング分析は、Ｈｉｓｔｏｇｒａｍバージョン２５５．０．０．８０ソフトウェア（Ａｐｏｇｅｅ Ｆｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。

【0057】

Ｃ．μＦＣＭデータの処理
患者μＦＣＭ ｆｃｓファイルを、カスタムＭＡＴＬＡＢ（バージョンＲ２０１７ａ）スクリプトを使用して分析した。各ｆｃｓファイル内で、全てのチャネルについてのシグナル強度を対数変換し、同様の光学特性を有する粒子を、別段に記載されない限り、光学特性当たり３２ビンを使用してビニングした。粒子濃度の３つの異なる二変量ヒストグラムを作成した：１）大角度光散乱（ＬＡＬＳ）及びＰＳＭＡ染色強度、２）ＬＡＬＳ及びグレリンプローブ染色強度、並びに３）ＰＳＭＡ及びグレリンプローブ染色強度。各二変量ヒストグラムは１０２４のＲＯＩ（３２×３２ビン）を含んだ。各ＲＯＩにおける粒子濃度を患者当たり３回の反復にわたって平均した。

【0058】

Ｄ．μＦＣＭデータを用いた臨床的特徴の予測及び関連付け
μＦＣＭデータを使用して、バイナリ臨床的特徴（例えば、糖尿病を有する又は有さない患者、正常又は異常な直腸指診）を予測し、カスタムＭＡＴＬＡＢスクリプトを使用して順序又は区間の臨床的特徴（例えば、それぞれ腫瘍ステージ又はＰＳＡ）と関連付けた。自動分析に必要なコードを最小限にするために、μＦＣＭデータが各臨床的特徴についてどのように分析されるべきかを記述するエクセル命令ファイルを作成した。命令ファイル内では、各臨床的特徴は別個の列であり、各行は特定の情報又は命令を含んだ。特定の情報には、データベース内の臨床的特徴の位置、各臨床的特徴に関するデータの種類（バイナリ又は順序／区間）、及びその臨床的特徴に関する欠測データを表す値が含まれた。命令は主に、特徴をバイナリ化する場合の値の閾値化、グリーソンスコアからのＰＣａグレードグループの導出、及び出生日からの年齢の決定を含む、臨床的特徴がどのように変換されるべきかを含んだ。臨床的特徴についてデータが欠落している患者は、その臨床的特徴について分析から除外した。

【0059】

臨床的特徴データを、全ての患者についてのデータベースから取り出し、変換してから、各ＲＯＩについてのμＦＣＭ粒子濃度データを使用して臨床的特徴を予測し又は関連付けた。バイナリ臨床的特徴について、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）値を各ＲＯＩについて決定し、ＡＵＣマップを、ＬＡＬＳ－ＰＳＭＡ、ＬＡＬＳ－グレリン、及びＰＳＭＡ－グレリンを含む各二変量データセットについて作成した。順序／区間の臨床的特徴について、ピアソン相関係数を各ＲＯＩについて決定し、相関マップを各二変量データセットについて作成した。各ＡＵＣマップにおけるＡＵＣ値の最も高い１０％を平均化し、これらの値を臨床的特徴にわたって比較した。

【0060】

Ｅ．μＦＣＭデータのｖｉＳＮＥ分析
ＭＡＴＬＡＢ（２５）上で実行されるＣｙｔバージョン２．０ソフトウェアを使用してｖｉＳＮＥプロットを作成した。各患者の３連のｆｃｓファイルを１つのｆｃｓファイルに連結させた。２つの新たなｆｃｓファイルを作成した：１つはグレードグループ２及びより低いＰＣａ（非臨床的に有意なＰＣａ）を有する患者からの事象を使用し、もう１つはグレードグループ３及びより高いＰＣａ（臨床的に有意なＰＣａ）を有する患者からの事象を使用した。これらの２つのｆｃｓファイルは合計約１００，０００の事象を有し、それらのグループ内の各患者からの事象の数は等しかった。Ｃｙｔソフトウェアを用いて、これらの２つのｆｃｓファイルの両方からの３０，０００の事象を無作為にサブサンプリングし、マージして、ＬＡＬＳ、ＰＳＭＡ、及びグレリンチャネルを使用したｂｈ－ＳＮＥ変換を使用してｖｉＳＮＥで可視化し、ｋ平均及び期待値最大化ガウス混合モデルアルゴリズムでクラスター化した６０，０００の事象を作成した。ｖｉＳＮＥの結果をＣｙｔからエクスポートし、また、ＭａｔｌａｂについてのＤｅｎｓｉｔｙＣｌｕｓｔ関数（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ａ及びＬａｉｏ Ａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４４（６１９１）：１４９２～６頁、２０１４年）を使用した高速検索／密度ピークアルゴリズムを使用してクラスター化した。事象と対になったユークリッド距離は、ｐｄｉｓｔ２関数を使用して決定した。ｐａｒａＳｅｔ関数を使用してデルタ及びローパラメーターを設定するために、近傍変数パーセントを２％に設定し、ガウスカーネルを使用した。１．５から５の間のデルタ値及び２００から１９００の間のロー値を使用してクラスター中心を選択した。全てのクラスタリングアルゴリズムについて、６０，０００の事象にわたって２４８のクラスターを作成した。臨床的に有意なＰＣａについてのクラスター純度を、各クラスター内の事象の総数で除算した臨床的に有意なＰＣａ事象の数と定義した。少なくとも６０個の粒子（全粒子の０．１％）を有するクラスターのみを分析した。

【0061】

Ｆ．臨床的に重要なＰＣａを予測するための機械学習モデルの最適化
ＭＡＴＬＡＢの分類学習アプリを使用して、２３の異なる機械学習アルゴリズムを試験し、粒子濃度のμＦＣＭデータを使用して臨床的に有意なＰＣａを予測した。これらのアルゴリズムには、個別／バギング／ブースト決定木、線形／二次／三次／ガウスサポートベクターマシン、ロジスティック回帰、線形／二次／部分空間判別分析、及びｋ近傍法が含まれた。ＸＧＢｏｏｓｔもまた、Ｒ（バージョン３．３．３）における「ｘｇｂｏｏｓｔ」パッケージを使用して試験した。全ての機械学習アルゴリズムはデフォルト設定を使用し、５倍交差検証を少なくとも１０回反復し、反復の間に患者を無作為化した。

【0062】

次いで最も高いＡＵＣを有する機械学習アルゴリズムを、１）μＦＣＭデータを処理するときに２、４、８、１６、３２、６４、及び１２８ビンを比較すること、２）同じ機械学習アルゴリズムを使用するが、訓練データとして患者の異なるサブセットを無作為に選択して、３、６、１２、２５、５０、及び１００個のモデルのアンサンブルを作成し、モデル予測を平均化すること、３）Ｒ「ｃａｒｅｔ」パッケージと共に再帰的特徴量削減を使用してμＦＣＭ ＲＯＩの最適なサブセットを選択すること、並びに４）グリッドサーチアルゴリズムパラメーター（ＸＧＢｏｏｓｔ：ｎｒｏｕｎｄｓ＝５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００；ｍａｘ＿ｄｅｐｔｈ＝３、４、５、６；イータ＝０．０１、０．１；ガンマ＝０；ｃｏｌｓａｍｐｌｅ＿ｂｙｔｒｅｅ＝１；ｍｉｎ＿ｃｈｉｌｄ＿ｗｅｉｇｈｔ＝１；ｓｕｂｓａｍｐｌｅ＝１）によって最適化した。最も高いＡＵＣを提供したビニング／アンサンブル／特徴／パラメーターを一緒に使用して、臨床的に有意なＰＣａを予測するための最終モデルを作成した。このモデルを、Ｈｉｓｔｏｇｒａｍソフトウェアを使用して手動ゲーティング分析と比較し、Ｒ．Ｃｉｔｒｕｓを使用するデフォルト設定を用いたＣｉｔｒｕｓが、階層的クラスタリング及びｌａｓｓｏ正規化ロジスティック回帰及び最短収縮重心法（ｎｅａｒｅｓｔ ｓｈｒｕｎｋｅｎ ｃｅｎｔｒｏｉｄ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｂｒｕｇｇｎｅｒ ＲＶら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１（２６）：Ｅ２７７０～７頁、２０１４年）を使用することによってフローサイトメトリーデータから臨床状態を予測する。

【0063】

ＰＳＡ、年齢、ＤＲＥ、ＰＣａの家族歴、以前の陰性生検、及び人種（黒人＝１、その他の人種＝０）を含む、標準治療（ＳＯＣ）の臨床的特徴を最終的なμＦＣＭモデル確率予測に組み込むために、これらの特徴の全てを使用してロジスティック回帰モデルを作成した。このモデルを、μＦＣＭデータを使用していない同様のロジスティック回帰モデルと比較した。

【0064】

Ｇ．統計解析
別段に記載されない限り、エラーバーを有するバー／ドットプロットは平均±標準誤差を表す。２つのグループを比較する場合、対応のない両側ｔ検定を区間データのために使用し、フィッシャーの正確確率検定を分割表のために使用した。テューキーの多重比較検定を使用して３以上のグループを比較するためにｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを使用した。Ｒにおける「ｐＲＯＣ」パッケージを使用してＤｅＬｏｎｇ法によってＲＯＣ曲線を比較した。可能な場合、ＲＯＣカットオフ値を、約９０％の感度を使用して決定し、得られた特異性及び陽性／陰性予測値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．０１ソフトウェアを使用して決定した。

【0065】

マイクロフローサイトメトリーを使用して超音波処理した試料からＥＶを分析することによる循環腫瘍細胞検出のためのアッセイの開発
図１０に示すように、アッセイ最適化のために、培地中の１００，０００個のＨｅＬａ－ＧＦＰ細胞をインキュベートし、様々な量のマイクロバブル及び超音波に曝露した。超音波処理の前後に培地を蛍光Ｅｖについて分析した。アッセイ感度を試験するために、パルミトイル化したＧＦＰを発現する０、１、５、１０、１００、及び１，０００個のＰＣ３前立腺がん細胞を、１，０００，０００個のＨＴ１０８０細胞（バックグラウンド）と混合し、マイクロバブルにより超音波処理した。超音波処理前／後にマイクロフローサイトメトリーによって培地を分析した。

【0066】

このアッセイは、従来のフローサイトメトリーより高い理論的ＳＮＲを有する単一のがん細胞を検出する。１５Ｍｐａ以上の圧力の超音波は最大ＥＶを生成する。超音波媒介ＥＶ放出は超音波サイクル及びマイクロバブル濃度と共に直線的に増加する。

【0067】

光散乱シグナル及び蛍光シグナルを標準化するためのアルゴリズムの開発
図１１に示すように、異なる電圧（＋１０Ｖで３００～４００Ｖ）下で較正ビーズから光散乱シグナルを記録した。光散乱ヒストグラムを作成し、３５０Ｖで実施したビーズに適合するように直線的にシフトした。各ビーズのヒストグラムピークを、３５０Ｖで実施したビーズの同じピークと適合するようにシフトした（非線形シフト）。

【0068】

２８１人の患者からの血漿試料を前立腺特異的膜抗原で染色した。データを、固定した１６×１６ビニング（ＬＡＬＳ対ＰＳＭＡ）を用いて、又は動的蛍光閾値化を使用してＰＳＭＡについて陽性若しくは陰性の粒子を識別し、更にＰＳＭＡ陽性の程度に基づいてグループを分離するアルゴリズムを使用して処理した。ＸＧＢｏｏｓｔモデルを作成して侵襲性前立腺がん（グリーソン４＋３及びそれ以上）を有する患者を予測した。モデルを、修正した蛍光（×０．１２５～２５６）と共に同じデータ上で使用し、ＡＵＣを計算した。

【0069】

非線形光散乱較正アルゴリズムは試料中の光散乱変動を補正するのに役立ち得る。動的蛍光閾値を用いてデータを処理することは、シフトしたデータに対するモデルの信頼性を保証するのに役立つ。これらの標準化アルゴリズムは、多くの診療所において使用される場合、経時的に臨床アッセイ予測を改善する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9a】

【図9b】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】