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▶ ムスク・ファウンデイション・フォー・リサーチ・ディベロップメントの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-08
(45)【発行日】2024-03-18
(54)【発明の名称】がんの治療用の薬学的組合せ
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20240311BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240311BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240311BHJP
A61K 45/06 20060101ALN20240311BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 N
A61K39/395 U
A61P35/00
A61P43/00 121
A61K45/06
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021517299
(86)(22)【出願日】2019-09-27
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-11
(86)【国際出願番号】 US2019053651
(87)【国際公開番号】W WO2020069439
(87)【国際公開日】2020-04-02
【審査請求日】2022-09-26
(31)【優先権主張番号】62/737,155
(32)【優先日】2018-09-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】507208277
【氏名又は名称】ムスク・ファウンデイション・フォー・リサーチ・ディベロップメント
【氏名又は名称原語表記】ＭＵＳＣ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ ＦＯＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】ナンシー・ディモア
【審査官】池上 文緒
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５２７２９９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／１５０３１２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Mol. Cancer Ther.，2013年，vol.12, issue 5，p.685-695
【文献】J. Clin. Oncol.，2018年05月，vol.15, suppl.，Abstract 3530，https://ascopubs.org/doi/10.1200/JCO.2018.36.15_suppl.3530
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４５／０６
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｐ ３５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
がんを治療する方法における使用のための、ヒト化ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体を含む医薬組成物であって、前記方法が治療有効量のＰＤ－１抗体と組み合わせて治療有効量の前記ヒト化ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体をヒト患者に投与することを含む、医薬組成物。
【請求項2】
ＰＤ－１抗体が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、またはアテゾリズマブである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
がんが、乳がん、血管肉腫、肺がん、骨肉腫、黒色腫、非小細胞肺がん、または腎臓がんである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
ヒト化ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体の前記投与が、ＰＤ－１抗体の前記投与に先行する；ＰＤ－１抗体の前記投与が、ヒト化ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体の前記投与に先行する；ヒト化ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体が、ＰＤ－１抗体に付随して投与される；またはＰＤ－１抗体が、ヒト化ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体に付随して投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項5】
ヒト化ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体が、３日毎に１回、週毎に１回、２週毎に１回、３週毎に１回または４週毎に１回投与される；および／またはＰＤ－１抗体が、３日毎に１回、週毎に１回、２週毎に１回、３週毎に１回または４週毎に１回投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記ＰＤ－１抗体がニボルマブであり、かつ前記対象に投与されるニボルマブの量が３週毎の３ｍｇ／ｋｇ体重、２週毎の２４０ｍｇまたは４週毎の４８０ｍｇである；前記ＰＤ－１抗体がペムブロリズマブであり、かつ前記対象に投与されるペムブロリズマブの量が、３週毎の２００ｍｇである；前記ＰＤ－１抗体がアベルマブであり、かつ前記対象に投与されるアベルマブの量が２週毎の８００ｍｇである；前記ＰＤ－１抗体がデュルバルマブであり、かつ前記対象に投与されるデュルバルマブの量が２週毎の１０ｍｇ／ｋｇ体重である；前記ＰＤ－１抗体がセミプリマブであり、かつ前記対象に投与されるセミプリマブの量が３週毎の２５０ｍｇである；前記ＰＤ－１抗体がアテゾリズマブであり、かつ前記対象に投与されるアテゾリズマブの量が２週毎の８４０ｍｇ、３週毎の１２００ｍｇまたは４週毎の１６８０ｍｇである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記対象がヒト化ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体療法を開始する前にＰＤ－１抗体療法を与えられている、または前記対象がＰＤ－１抗体療法を開始する前にヒト化ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体療法を与えられている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記対象が、第２の療法を開始する前に第１の療法を少なくとも８週間、少なくとも１０週間、少なくとも２４週間、少なくとも２８週間、少なくとも４８週間または少なくとも５２週間与えられている、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項9】
ヒト化ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体ならびに／またはＰＤ－１抗体の周期投与が少なくとも３日間、少なくとも３０日間、少なくとも４２日間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、少なくとも２４週間または少なくとも６か月間継続される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記患者が、前記併用療法を与えられる前にＰＤ－１抗体療法を以前に与えられ、かつＰＤ－１抗体療法を与えることを中止された患者である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記患者が以前にＰＤ－１抗体療法に応答しなかったか、または前記ＰＤ－１抗体が前記患者の治療に失敗した、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
ある量のＰＤ－１抗体およびある量のヒト化ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体を含む、請求項１－１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月２７日に出願された米国仮出願第６２／７３７，１５５号の優先権を主張し、該仮出願の全内容はこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１８年９月２７日に出願された米国仮出願第６２／７３７，１５５号の優先権を主張し、該仮出願の全内容はこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、それを必要とする患者への単剤療法としてのまたは同時もしくは逐次的にＰＤ－１アンタゴニストと組み合わせたＳＦＲＰ２アンタゴニストの投与を含むがんの治療のための療法を対象とする。
【0003】
本出願において参照される全ての刊行物、特許、特許出願、および他の参考文献は、各個々の刊行物、特許、特許出願または他の参考文献が、全ての目的のために参照により全体が組み込まれることを特に個別的に指し示されたのと同じ程度まで全ての目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる。本明細書における参考文献の参照は、そのようなものが本発明の先行技術であることの承認として解釈されるべきではない。
【背景技術】
【0004】
Ｗｎｔリガンドは、ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体として公知の細胞表面Ｇタンパク質共役膜貫通型受容体への結合を通じて下流のエフェクターを活性化させる分泌性糖タンパク質である。Ｗｎｔシグナル伝達の活性化は正常な胚発生に関与するが、この経路の調節異常は様々ながんについて腫瘍進行に関連付けられている（１、２）。分泌性ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＳＦＲＰ）は以前に、カノニカルなＷｎｔ－ベータ（β）－カテニン経路の阻害因子と認識されており（１）、ＳＦＲＰ２は腫瘍抑制因子である可能性を示唆する。しかしながら、いくつかの追加の研究は、ＳＦＲＰ２はアンタゴニストではなくβ－カテニンアゴニストとして作用できることを示しており（３～７）、腫瘍促進における役割を示唆する。
【0005】
実質的な証拠は現在、乳がん（５、８～１１）、血管肉腫（９、１０）、骨肉腫（１２）、横紋筋肉腫（１３）、肺胞軟部肉腫（１４）、悪性神経膠腫（１５）、多発性骨髄腫（１６）、腎細胞癌（２）、前立腺がん（１７）、肺がん（１８）、および黒色腫（１９）において腫瘍成長を促進するＳＦＲＰ２の寄与を強く支持する。追加的に、インビボ（ｉｎ ｖｉｖо）ＳＦＲＰ２分子イメージングは、ＳＦＲＰ２発現が腫瘍サイズと比例して増加することを示しており（２０）、本発明者らは、マウスＳＦＲＰ２モノクローナル抗体はインビボで血管肉腫および乳がんの成長を阻害することを示した（２１）。さらには、Techavichit et alは、ＳＦＲＰ２が転移性骨肉腫において高度に過剰発現され、低転移性骨肉腫細胞における過剰発現はインビボで転移を増加させる一方、高転移性骨肉腫におけるＳＦＲＰ２のノックダウンはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒо）で細胞遊走および浸潤を減少させることを示した（１２）。腫瘍細胞に対するＳＦＲＰ２の直接的な効果に加えて、ＳＦＲＰ２は腫瘍血管新生に関与する（９、１０、１９、２２～２４）。したがって、ＳＦＲＰ２は、腫瘍成長の直接的な活性化および血管新生の活性化に対する二次的な効果において二重の役割を果たす。
【0006】
内皮細胞において、ＳＦＲＰ２は、カノニカルなβ－カテニン経路ではなく非カノニカルなＷｎｔ／Ｃａ２経路を活性化させて血管新生を刺激する（２２、２４）。Ｗｎｔ／Ｃａ２＋経路は、Ｇタンパク質およびホスホリパーゼの活性化を通じて媒介される。これは、細胞質の遊離カルシウムの一過性の増加、および活性化Ｔ細胞核因子（ＮＦＡＴ）を脱リン酸化するホスファターゼ、カルシニューリンの活性化に繋がり、ＮＦＡＴは次に細胞質から核に移動する。増加しつつあるデータは、細胞成長、生存、浸潤および血管新生を含む腫瘍成長の媒介におけるＮＦＡＴの不可欠な役割を支持する（２５）。ＮＦＡＴタンパク質はまた、Ｔ細胞の活性化を含む、免疫系の発生および機能において決定的な役割を有する。特に核内ＮＦＡＴは他の転写因子と協同して、ＩＬ２およびシクロオキシゲナーゼ２（２７）を含む免疫系の機能に関与する色々な遺伝子を調節する（２６）。
【0007】
併用療法
がんなどの所与の状態を治療するための２つの薬物の投与は多数の潜在的な問題を生じさせる。２つの薬物の間のインビボ相互作用は複雑である。任意の単一の薬物の効果はその吸収、分布、および排除と関係する。２つの薬物が身体に導入された場合、各薬物は他方の吸収、分布、および排除に影響し、それゆえ他方の効果を変更させることがある。例えば、１つの薬物は、他の薬物の排除の代謝経路に関与する酵素の産生を阻害し、活性化させまたは誘導し得る（４４）。一例では、グラチラマー酢酸塩（ＧＡ）およびインターフェロン（ＩＦＮ）の併用投与は、いずれかの療法の臨床的有効性を妨げることが実験的に示されている（４９）。別の実験において、ＩＦＮ－βとの併用療法におけるプレドニゾンの添加はその上方調節因子効果をアンタゴナイズすることが報告された（４８）。そのため、同じ状態を治療するために２つの薬物が投与される場合、それぞれが対象において他方の治療活性を補うのか、それに対して効果を有しないのか、それともそれに干渉するのかは予測することができない。
がんなどの所与の状態を治療するための２つの薬物の投与は多数の潜在的な問題を生じさせる。２つの薬物の間のインビボ相互作用は複雑である。任意の単一の薬物の効果はその吸収、分布、および排除と関係する。２つの薬物が身体に導入された場合、各薬物は他方の吸収、分布、および排除に影響し、それゆえ他方の効果を変更させることがある。例えば、１つの薬物は、他の薬物の排除の代謝経路に関与する酵素の産生を阻害し、活性化させまたは誘導し得る（４４）。一例では、グラチラマー酢酸塩（ＧＡ）およびインターフェロン（ＩＦＮ）の併用投与は、いずれかの療法の臨床的有効性を妨げることが実験的に示されている（４９）。別の実験において、ＩＦＮ－βとの併用療法におけるプレドニゾンの添加はその上方調節因子効果をアンタゴナイズすることが報告された（４８）。そのため、同じ状態を治療するために２つの薬物が投与される場合、それぞれが対象において他方の治療活性を補うのか、それに対して効果を有しないのか、それともそれに干渉するのかは予測することができない。
【0008】
２つの薬物の間の相互作用は各薬物の意図される治療活性に影響し得るだけでなく、相互作用は毒性代謝物のレベルを増加させ得る（４４）。相互作用はまた、各薬物の副作用を上昇または低下させることがある。それゆえ、疾患を治療するための２つの薬物の投与において、どのような変化が各薬物の負の側面のプロファイルにおいて起こるのかは予測することができない。一例では、ナタリズマブおよびインターフェロンβ－１ａの組合せは、予期されない副作用のリスクを増加させることが観察された（４７、４５、４６）。
【0009】
追加的に、２つの薬物の間の相互作用の効果がいつ現れるのかを正確に予測することは困難である。例えば、薬物間の代謝相互作用は、第２の薬物の初期投与時、２つの薬物が安定状態濃度に達した後または薬物のうちの１つの中止時に明らかとなり得る（４４）。
【0010】
したがって、出願時の当該技術分野の状態は、２つの薬物、特にＰＤ－１アンタゴニストと共にＳＦＲＰ２アンタゴニストのアドオン（ａｄｄ－ｏｎ）または併用療法の効果は、併用研究の結果が利用可能となるまで何らかの合理的な確実性を以って予測することはできないというものである。
【発明の概要】
【0011】
本発明は、治療有効量のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストならびに治療有効量のＰＤ－１アンタゴニストを含む、薬学的組合せを対象とする。本発明はまた、それを必要とする患者への治療有効量のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストならびに治療有効量のＰＤ－１アンタゴニストの同時のまたは逐次的な投与を含む、がんの治療方法を対象とする。本発明はまた、それを必要とする患者への治療有効量のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストの投与を含む、ある特定のがんの治療方法を対象とする。
【0012】
以下に説明される図面は、実例的な目的のものに過ぎず、本発明の範囲を限定することは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】Ｇｐ１００反応性マウス脾臓Ｔ細胞を単独で、またはＨｓ５７８Ｔ（上行）もしくはＲＦ４２０細胞（下行）の存在下で３日間培養し、３日間処理した。強度をＦＡＣＳ分析により各条件について測定した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（ＴＣＲ刺激）を陽性対照としてこの実験のために使用した。抑制パーセントを分裂指数（ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）法に基づいて算出した。分裂指数は、増殖指数に分裂細胞のパーセンテージを掛けることにより算出され、そのため集団全体の分裂状態を表す。実験を３回繰り返した。代表的なオーバーレイを左に表し、全ての反復からの累積データを棒グラフに提示する（＊ｐ＜０．０１）。
【図2】Ａ）ＦＺＤ５タンパク質はＴ細胞中に存在する。Ｂ～Ｃ）Ｔ細胞をＳＦＲＰ２（３０ｎＭ）を用いて１ｈ処理し、（Ｂ）核および（Ｃ）細胞質画分を単離した。指し示されるタンパク質マーカーに対する抗体を用いて試料をプロービングした。Ｄ）Ｔ細胞を単独または組合せで抗原ｇｐ１００（０．８７μＭ）またはｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（１０μＭ）を用いて６０分間処理し、核画分を単離した。ＳＦＲＰ２処理細胞中のＮＦＡＴｃ３のタンパク質レベルを非処理細胞におけるものと比較した。Ａ～Ｃ）アクチン：細胞質画分用のローディングコントロール；ヒストンＨ３およびＴＡＴＡ：核画分用のローディングコントロール。Ｂ～Ｄ）ＩｍａｇｅＪを使用してデンシトメトリーを行い、平均強度に各バンドの表面を掛けることにより密度を算出した。ローディングコントロールを使用して試料内のばらつきを排除した。各値を非処理対照（Ｂ～Ｄ）または抗原処理試料（Ｄ）に対して正規化することにより最終結果を得た。
【図3】Ａ）脾臓Ｔ細胞をＩＬ２、ＩＬ２＋ＴＣＲ抗原、ＩＬ２＋ＴＣＲ抗原＋ＴＧＦｂ、またはＩＬ２＋ＴＣＲ抗原＋ＴＧＦｂおよびｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂのいずれかを用いて処理した。タンパク質溶解液を抽出し、ＳＦＲＰ２のためのウエスタンブロットプロービングに供した。これは、ＳＦＲＰ２は、ＴＣＲおよびＴＧＦｂと共に増加し、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂと共に減少することを示す。Ｂ）ＮＡＤ＋濃度 マウス脾臓細胞を、ＴＣＲ／ＴＧＦβ（５ｎｇ／ｍｌ）有りまたは無し、およびｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（１０ｎＭ）有りまたは無しで３日間ＩＬ－２（６，０００ｕ／ウェル）を用いて処理した（ｎ＝３／群）。ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂは、非処理対照と比較してＮＡＤ＋濃度を増加させた（＊ｐ＝０．０２）。Ｃ）ＣＤ３８＋細胞の数（Ｚ軸）。３６時間であることを除いて上記のように細胞を処理した。ＴＣＲ／ＴＧＦβの添加と共にＣＤ３８＋細胞が増加し、それはｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂにより有意に阻害された（ｎ＝３、＊＊ ｐ＜０．００１）。
【図4】ＳＦＲＰ２ ｍＡｂはＴ細胞においてＰＤ－１を阻害する。脾臓（Ｓｐｌｅｅｎｉｃ）Ｔ細胞をＩＬ２単独、またはＴＣＲ抗原およびＴＧＦＢと共にＩＬ２、またはＴＣＲ抗原およびＴＧＦＢおよびｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂと共にＩＬ２を用いて処理する。細胞をＦＡＣＳにより分析した。ＴＣＲおよびＴＧＦＢはＰＤ－１を増加させ棒グラフ、それはｈｓＦＲＰ２ ｍＡｂを用いて逆転される。
【図5】Ａ）骨肉腫ＲＦ４２０細胞をＣ５７ＢＬ６マウスの静脈内に注射した。ＩｇＧ１対照またはｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂを用いる処置（３日毎の４ｍｇ／ｋｇ）を腫瘍細胞の注射の１０日後に開始した。３週後に動物を安楽死させ、肺を切除し、表面小結節をカウントした＊：ｐ≦０．０００１；ｎ＝１２）。Ｂ）腫瘍転移を伴う代表的な肺。Ｃ）ＲＦ４２０細胞を注射され、ＩｇＧ１対照またはｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂを用いて処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓から単離されたＴ細胞。細胞をＣＤ３８、蛍光色素を用いて染色し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳにより分析した。各処置についての４つの異なる脾臓から単離されたＴ細胞から得られた蛍光の測定値を示す棒グラフ（ｎ＝４）。ＣＤ３８は、脾臓細胞およびＴＩＬの両方においてｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂと共に統計的に異なっていた＊ ｐ≦０．００１。
【図6】ＲＦ４２０マウス骨肉腫細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に注射した。７日目に開始してマウスをＩｇＧ１対照、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ、マウスＰＤ－１ ｍＡｂ、または両方の抗体の組合せのいずれかを用いて２１日間処置した。マウスを安楽死させ、肺を回収した。Ｈ＆Ｅによる表面転移および微小転移の数を各群においてカウントした。ＰＤ－１ ｍＡｂ処置に伴う転移（ｍｅｔｓ）の数の減少は無かった。単剤療法としてのｈＳＦＲＰ２と共に転移数の有意な減少があり（ｐ＜０．００１）、それは組合せを用いてさらに増加した（ｐ＜０．００１）。
【図7】ヒト化ＳＦＲＰ２ ｍＡｂインビトロ活性。（Ａ）濃度応答曲線ＥＣ５０：半数最大有効濃度；Ｋｄ：平衡解離定数；Ｈｉｌｌ：ヒル係数。（Ｂ）棒グラフ（Ｃ～Ｈ）Ｈｓ５７８Ｔ乳がん細胞（Ｃ～Ｅ）、およびＳＶＲ血管肉腫細胞（Ｆ～Ｈ）におけるアポトーシス（Ｃ、Ｆ；ｎ＝８）、および壊死（Ｄ、Ｇ；ｎ＝８）増殖（Ｅ、Ｈ；ｎ＝１２）に対する増加性濃度のｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（０～１０μＭ）の効果を示す棒グラフ。＊：ｐ≦０．０５；＊＊：ｐ≦０．００１。増殖はＣｙｑｕａｎｔ（登録商標）を使用して測定し、アポトーシスおよび壊死はアネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムを使用して測定した。アポトーシスおよび壊死についての結果は、それぞれ４つのウェルを含有する２つの独立した実験の集計である、ｎ＝８）。増殖について提示される結果は、それぞれ４つの反復を含有する３つの実験の集計である（ｎ＝１２）。
【図8】血管肉腫および乳がんにおける腫瘍成長におけるヒト化ＳＦＲＰ２ ｍＡｂの効果。Ａ）ＡＵＣ：曲線下面積；Ｔ１／２：半減期；ＣＬ：クリアランス；Ｖｄ：分布容積；Ｃｍａｘ：最大血清濃度。各データ点は、少なくとも３つの独立した試料の測定値の平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３／時点）。Ａ～Ｃ）日は、腫瘍接種から３０日であるベースライン日からカウントされる。
【図9】ヒト化ＳＦＲＰ２ ｍＡｂ処置は腫瘍においてアポトーシスを促進する。上の棒グラフは、ＩｇＧ１対照処置腫瘍（黒棒）と比較してｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂを用いて処置された腫瘍（白棒）におけるアポトーシス細胞の数の増加を示す。＊：ｐ≦０．０５。下の画像：パラフィン包埋ＳＶＲ（上パネル）およびＨｓ５７８Ｔ（下パネル）腫瘍を切片化し、ＴＵＮＥＬ染色のために処理した。各腫瘍について、計５つの視野を写真撮影し、アポトーシス細胞（褐色）の数を各視野においてカウントし、各腫瘍について平均化した。処置（ｎ＝１０）当たり計１０の腫瘍を分析のために使用した。
【図10】ヒト化ＳＦＲＰ２ ｍＡｂは転移性骨肉腫成長を低減する。Ａ）処置後の肺表面小結節の数。Ｂ）脾臓細胞およびＴＩＬをＩｇＧ１対照およびｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂを用いて処置されたマウスから回収し、フローサイトメトリーに供した。
【図11】ヒト化ＳＦＲＰ２ ｍＡｂおよびニボルマブの組合せは転移性骨肉腫成長を阻害する。Ａ）様々な処置後の肺表面小結節の数。Ｂ）各処置について４つの異なる脾臓から単離されたＴ細胞から得られた蛍光の測定値を示すグラフ（ｎ＝４）、＊＊＊ ｐ≦０．００１。平均蛍光強度（ＭＦＩ）。
【図12】変異型抗体を使用したＳＦＲＰ２競合ＥＬＩＳＡ。
【図13】ＳＤＳ Ｐａｇｅ。４～１２％のＮｕＰＡＧＥ－ＳＤＳゲル上の１μｇの精製されたリードｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ。
【図14】試験抗体に対する健常ドナーＴ細胞増殖応答。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本明細書において用いられる学術用語は、特定の実施形態を記載する目的のために過ぎず、限定的であることは意図されないことが理解されるべきである。さらに、本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法、デバイスおよび材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、ある特定の方法、デバイスおよび材料がこれより記載される。
【0015】
本発明は、がんを治療する方法であって、それを必要とする対象にある量のＳＦＲＰ２アンタゴニストおよびある量のＰＤ－１アンタゴニストを投与することを含み、量が、合わさった場合に、対象を治療するために有効なものである、方法を提供する。本発明はまた、ある量のＳＦＲＰ２アンタゴニスト、例えばＳＦＲＰ２ ｍＡｂ、およびある量のＰＤ－１アンタゴニスト、例えば抗ＰＤ－１抗体を含む、薬学的組合せを提供する。一実施形態では、インビボで脾臓細胞および腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）におけるＣＤ３８を低減し、かつインビボでの腫瘍成長の阻害においてＰＤ－１抗体と優れた随伴性効果を有する、新規のヒト化ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体（ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ）が提供される。別の実施形態では、ヒト化ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体はインビトロでリンパ球におけるＰＤ－１を低減する。そのため、本発明のｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂは、複数の細胞種において非カノニカルなＷＮＴ経路を阻害することにより細胞機能に影響する。
【0016】
別の実施形態では、本発明は、がんの治療方法であって、治療有効量のＳＦＲＰ２アンタゴニスト、ＣＤ３８アンタゴニスト、および／またはＰＤ－１アンタゴニストならびに治療有効量のＰＤ－１アンタゴニストをそれを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0017】
別の実施形態では、本発明は、がんの治療方法であって、治療有効量のＳＦＲＰ２アンタゴニスト、ＣＤ３８アンタゴニスト、およびＰＤ－１アンタゴニストならびに治療有効量のＰＤ－１アンタゴニストをそれを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0018】
別の実施形態では、本発明は、がんの治療方法であって、治療有効量のＳＦＲＰ２アンタゴニストおよび／またはＣＤ３８アンタゴニストならびに治療有効量のＰＤ－１アンタゴニストをそれを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0019】
別の実施形態では、本発明は、がんの治療方法であって、治療有効量のＳＦＲＰ２アンタゴニストおよびＣＤ３８アンタゴニストならびに治療有効量のＰＤ－１アンタゴニストをそれを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0020】
別の実施形態では、本発明は、がんの治療方法であって、治療有効量のＳＦＲＰ２アンタゴニストまたはＣＤ３８アンタゴニストおよび治療有効量のＰＤ－１アンタゴニストをそれを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0021】
別の実施形態では、本発明は、がんの治療方法であって、治療有効量のＳＦＲＰ２アンタゴニストおよび治療有効量のＰＤ－１アンタゴニストをそれを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
【0022】
一実施形態では、ＳＦＲＰ２アンタゴニストは、（ａ）特異的にＳＦＲＰ２受容体に結合してその活性化を阻害する抗体、もしくは抗体の抗原結合断片、または（ｂ）特異的にＳＦＲＰ２リガンドに結合してＳＦＲＰ２リガンドのＳＦＲＰ２受容体への結合を阻害する可溶性形態のＳＦＲＰ２受容体である。
【0023】
一実施形態では、ＰＤ－１アンタゴニストは、（ａ）特異的にＰＤ－１受容体に結合してその活性化を阻害する抗体、もしくは抗体の抗原結合断片、または（ｂ）特異的にＰＤ－１リガンドに結合してＰＤ－１リガンドのＰＤ－１受容体への結合を阻害する可溶性形態のＰＤ－１受容体である。
【0024】
肉腫は、それぞれが独特の臨床的および病理学的な質を有する５０より多くの異なるサブタイプを含む悪性腫瘍の不均質群である。一般に、５０％の死亡率であり、ほとんどの治癒は、放射線療法有りまたは無しでの完全な外科的切除を用いて達成される。切除不能性または転移性疾患に対する化学療法剤からの結果は、最小の長期利益および転移性疾患を有する患者についてのわずか１５％の５年生存との失望的なものであった（３４）。ドキソルビシンは、２０％～２５％の奏効率を生じさせている。ＰＤ－１阻害剤が最近、肉腫に対して研究されている。ニボルマブを用いて処置された転移性軟組織肉腫を有する２８人の患者のレトロスペクティブ研究において、５０％の患者は部分的な応答または安定した疾患を有した（３５）。肉腫において標的化剤の何らかの活性があるが、応答および転帰を向上させるために、向上した治療剤、および治療法の新規の組合せが必須である。この研究において本発明者らは、免疫原性でなくかつ高い親和性でＳＦＲＰ２に結合するヒト化ＳＦＲＰ２ ｍＡｂの開発を報告する。ｈＳＦＰＲ２ ｍＡｂは３つの腫瘍細胞系（血管肉腫、骨肉腫、および乳癌－肉腫）において単剤として腫瘍成長を抑制するだけでなく、骨肉腫においてこの効果はＰＤ－１阻害剤単独よりはるかに優れていた。
【0025】
ＰＤ－１受容体またはそのリガンドＰＤ－Ｌ１のいずれかの遮断は、黒色腫、非小細胞肺がん、および腎臓がんを有する患者におけるフェーズＩＩＩ試験において全生存を向上させた。早期研究は、ＰＤ－１経路遮断は多くの他の種類のがんにおいて患者のサブセットに利益を与え得ることを示唆する。それにもかかわらず、患者の大部分はＰＤ－１経路遮断に応答せず、奏効率の向上への洞察が不可欠に必要とされる（３６）。
【0026】
本発明者らおよび他の者らは以前に、血管新生および腫瘍細胞に対するＳＦＲＰ２の役割を示したが（９、１０、１９、２０、２２、２４）、本発明者らの本研究は、新たな機序：ＳＦＲＰ２は内皮細胞および腫瘍細胞においてだけでなく、Ｔ細胞においてもＮＦＡＴを刺激することを明らかにする。カルシニューリン／ＮＦＡＴ経路阻害剤サイクロスポリンＡはＰＤ－１を遮断できるので、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞のＴＣＲ刺激後のＰＤ－１誘導はＮＦＡＴを要求する（３７、３８）ことを考慮して、本発明者らは、ＳＦＲＰ２の遮断はエフェクターＴ細胞の疲弊を低減し、より良好な腫瘍制御に繋がるという仮説を立てた。本発明者らのデータは、疲弊マーカー、ＣＤ５、およびＣＤ１０３発現は変更されなかったが、Ｔ細胞上でのその発現が腫瘍制御と逆相関することが最近示された非カノニカルなエクトヌクレオチダーゼＣＤ３８（３９）の発現における低減があったことを示す。ＣＤ３８は抗腫瘍Ｔ細胞応答を調節し、Ｔ細胞上のＣＤ３８の遺伝子アブレーションまたは抗体媒介性標的化は腫瘍制御を向上させる。追加的に、ＣＤ３８の発現が低減したＴ細胞はまた、高いエフェクターサイトカイン分泌能力を維持することが示され、ＰＤ－１を発現するにもかかわらず機能不全でなかった。ＣＤ３８発現はまた、固定されたクロマチン状態を有する初期化不可能なＰＤ１ｈｉ機能不全Ｔ細胞上に高発現されることが示された（４０）。追加的に、組み合わせたＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４遮断は、マウスにおいてＣＤ３８欠損腫瘍を根絶し、組み合わせたＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４遮断抗体を用いて処置された腫瘍保有マウスは、ＣＤ３８の上方調節を通じて抵抗性を発生させる（４１）。そのため、ＣＤ３８発現の低下は、腫瘍誘導性疲弊からＴ細胞をレスキューし得る。
【0027】
カルシウムおよびＮＦＡＴシグナル伝達は様々な細胞種においてＣＤ３８発現を調節することが示されているので（４２）、ＳＦＲＰ２のその阻害はＴ細胞においてＣａ２＋／ＮＦＡＴシグナル伝達の減少に繋がってＣＤ３８発現の低減を結果としてもたらした可能性がある。Ｂ細胞において、ＮＦＡＴｃ１はＣＤ３８発現のために不可欠であることが報告されており（４３）、それにより本発明者らは、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂはＴ細胞においてＮＦＡＴｃ３に対するその阻害効果を介してＣＤ３８を低減し得るという仮説を立てた。しかしながら、本発明者らのデータは、ＰＤ－１と共にＳＦＲＰ２の阻害はより良好な腫瘍制御に繋がることを支持し、これはＴ細胞におけるＣＤ３８に起因する免疫抑制の低減および腫瘍におけるＷｎｔシグナル伝達経路の両方を標的化することに起因する可能性がある。本発明者のデータが無ければ、そのような組合せがより良好な腫瘍制御を有することを予期する理由は無かった。
【0028】
一実施形態では、対象は、対象の身体中の任意の細胞、例えば、Ｔ細胞が、そのような増加した発現を有しない対応する健常対象またはがん対象よりも高いＣＤ３８および／またはＰＤ－１の発現を有する場合に、ＣＤ３８および／またはＰＤ－１の増加した発現を有する。
【0029】
定義
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法的対象の１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本開示において使用される。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法的対象の１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本開示において使用される。
【0030】
「対象」はヒトであり、「対象」および「患者」という用語は本明細書において交換可能に使用される。
【0031】
対象に関する「治療する」という用語は、例えば、疾患もしくは障害の阻害、退縮、もしくは静止を誘導すること、または障害を治癒し、改善させ、もしくは少なくとも部分的に寛解させること、または疾患もしくは障害の重症度を和らげ、減少させ、抑制し、阻害し、低減し、その症状を排除もしくは実質的に排除し、もしくは寛解させることを包含する。対象における疾患進行または疾患合併症の「阻害」は、対象において疾患進行および／または疾患合併症を予防または低減することを意味する。
【0032】
がんと関連付けられる「症状」は、がんと関連付けられる任意の臨床的または実験所見を含み、対象が感知または観察できるものに限定されない。
【0033】
「対象への投与」または「（ヒト）患者への投与」は、状態、例えば、病理学的状態と関連付けられる症状を緩和、治癒、または低減するために対象／患者に薬剤、薬物、または治療薬を与え、分注し、または塗布することを意味する。投与は周期投与であることができる。
【0034】
本明細書において使用される場合、「周期投与」は、期間により分離された繰返し／反復投与を意味する。投与間の期間は、好ましくは、回毎に一貫している。周期投与は、例えば、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、週毎、週２回、週３回、および週４回などの投与を含むことができる。
【0035】
本明細書において使用される場合、「単位用量」（ｕｎｉｔ ｄｏｓｅ）、「単位用量」（ｕｎｉｔ ｄｏｓｅｓ）および「単位投薬形態」は、単一の薬物投与実体を意味する。
【0036】
本明細書において使用される場合、ＰＤ－１アンタゴニストおよび／またはＳＦＲＰ２アンタゴニストの量を指す場合の「有効な」または「治療的に有効な」は、所望の治療奏功をもたらすために十分なＰＤ－１アンタゴニストおよび／またはＳＦＲＰ２アンタゴニストの量を指す。ある特定の実施形態では、有効量は、所望の治療的または予防的な結果を達成するための、必要な投薬量および期間での、有効な量を指す。本発明のＳＦＲＰ２アンタゴニストおよび／またはＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１アンタゴニストもしくは阻害剤の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する１つまたは複数の抗体の能力などの要因にしたがって変動し得る。治療有効量は、１つまたは複数の抗体の任意の毒性または有害効果を治療的に有益な効果が凌ぐ量を包含する。一実施形態では、ＳＦＲＰ２アンタゴニストの量およびＰＤ－１アンタゴニストの量は、組合せで投与される場合に、対象を治療するために有効なものである。ある特定の実施形態によれば、本発明の抗体は、０．ｌｍｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与される。他の実施形態によれば、本発明の抗体は、０．５ｍｇ／ｋｇ体重～２０ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与される。追加の実施形態によれば、本発明の抗体は、１．０ｍｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与される。
【0037】
本明細書において使用される一般用語の以下の略語は、問題とする用語が単独で現れるのか、それとも他の群と組み合わせて現れるのかにかかわらず適用される：
曲線下面積（ＡＵＣ）；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；カルシウム（Ｃａ２＋）；カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）；クリアランス（ＣＬ）；解離定数（Ｋｄ）；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；ウシ胎仔系（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ；ＦＢＳ）；蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）；Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ５（ＦＺＤ５）；ヒト化ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体（ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ）；ヒト組換え分泌性ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ｈｒＳＦＲＰ２）；ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）；半数最大有効濃度（ＥＣ５０）；静脈内（ｉ．ｖ．）；腹腔内（ｉ．ｐ．）；改変基礎イーグル培地（ＤＭＥＭ）；平均蛍光強度（ＭＩＦ）；ノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）；活性化Ｔ細胞核因子（ＮＦＡＴ）；薬物動態（ＰＫ）；プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）；分泌性ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；消失半減期（Ｔ１／２）；および分布容積（Ｖｄ）。
曲線下面積（ＡＵＣ）；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；カルシウム（Ｃａ２＋）；カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）；クリアランス（ＣＬ）；解離定数（Ｋｄ）；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；ウシ胎仔系（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ；ＦＢＳ）；蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）；Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ５（ＦＺＤ５）；ヒト化ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体（ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ）；ヒト組換え分泌性ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ｈｒＳＦＲＰ２）；ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）；半数最大有効濃度（ＥＣ５０）；静脈内（ｉ．ｖ．）；腹腔内（ｉ．ｐ．）；改変基礎イーグル培地（ＤＭＥＭ）；平均蛍光強度（ＭＩＦ）；ノンコンパートメント解析（ＮＣＡ）；活性化Ｔ細胞核因子（ＮＦＡＴ）；薬物動態（ＰＫ）；プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）；分泌性ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２）；Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；消失半減期（Ｔ１／２）；および分布容積（Ｖｄ）。
【0038】
本発明の組合せは、少なくとも本明細書に記載されるような薬学的に許容される担体、添加剤、佐剤または媒体と共に、その同時、別々または逐次の投与のために製剤化されてもよい。そのため、２つの活性化合物の組合せは、
・同じ医薬製剤の部分である組合せ（２つの活性化合物は同時に投与される）として、または
・それぞれが活性物質のうちの１つを有する２つの単位の組合せ（同時、逐次もしくは別々の投与の可能性を生じさせる）
として投与されてもよい。
・同じ医薬製剤の部分である組合せ（２つの活性化合物は同時に投与される）として、または
・それぞれが活性物質のうちの１つを有する２つの単位の組合せ（同時、逐次もしくは別々の投与の可能性を生じさせる）
として投与されてもよい。
【0039】
本明細書において使用される場合、「組合せ」（併用）は、同時投与または同期間投与のいずれかによる療法において使用するための試薬の集合体を意味する。同時投与は、ＰＤ－１アンタゴニストならびにＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストの混合物（真の混合物、懸濁液、エマルションまたは他の物理的組合せのいずれであれ）の投与を指す。この場合、組合せは、混合物または投与の直前に組み合わせられるＰＤ－１アンタゴニスト ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１アンタゴニストの別々の容器であってもよい。同期間投与、または随伴的な投与は、ＰＤ－１アンタゴニストならびにＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストの同時での、またはＰＤ－１アンタゴニスト単独 ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１アンタゴニスト単独のいずれかの活性と比べて相乗的な活性が観察される十分に近い時点における、または各剤の個々の治療効果が重なり合うことを可能とする十分な時間的近接性での別々の投与を指す。
【0040】
本明細書において使用される場合、「アドオン」または「アドオン療法」は、療法を与えられる対象が、１つまたは複数の試薬の第１の治療レジメンを始めた後に第１の治療レジメンに加えて１つまたは複数の異なる試薬の第２の治療レジメンを始めることにより、療法において使用される試薬の全てが同時に開始されない療法において使用するための試薬の集合体を意味する。例えば、ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニスト療法を既に与えられている患者に対してＰＤ－１アンタゴニスト療法が加えられる。
【0041】
任意の公知のＰＤ－１アンタゴニストが本発明の実施において利用されてもよく、広範なＰＤ－１アンタゴニストが当該技術分野において公知かつ開示されている。ＰＤ－１アンタゴニストは、好ましくは、結合後に生物学的機能を中和する。ＰＤ－１アンタゴニストは、好ましくは、ヒトＰＤ－１アンタゴニストである。適宜、ＰＤ－１アンタゴニストは、抗体、例えば、モノクローナル抗体またはその断片；キメラモノクローナル抗体（ヒト－マウスキメラモノクローナル抗体など）；完全ヒトモノクローナル抗体；組換えヒトモノクローナル抗体；ヒト化抗体断片；小分子ＰＤ－１遮断剤を含む可溶性ＰＤ－１アンタゴニストであってもよい。適宜、ＰＤ－１アンタゴニストは、機能性断片またはモノクローナル抗体の機能性断片を含む融合タンパク質、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび好ましくはＦａｂである。好ましくは、断片はペグ化または被包されている（例えば、安定性および／または持続放出のため）。ＰＤ－１アンタゴニストはまた、ラクダ科動物抗体であってもよい。本明細書において使用される場合、ＰＤ－１アンタゴニストとしては、ＰＤ－１受容体阻害剤が挙げられるがそれに限定されない。
【0042】
ＰＤ－１アンタゴニストは、例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、もしくはアテゾリズマブ、またはその機能性断片のうちの１つまたは組合せから選択されてもよい。
【0043】
任意の公知のＳＦＲＰ２および／またはＣＤ３８アンタゴニストが本発明の実施において利用されてもよく、広範なＳＦＲＰ２および／またはＣＤ３８アンタゴニストが当該技術分野において公知かつ開示されている。ＳＦＲＰ２および／またはＣＤ３８アンタゴニストは、好ましくは、結合後に生物学的機能を中和する。ＳＦＲＰ２および／またはＣＤ３８アンタゴニストは、好ましくは、ヒトＳＦＲＰ２および／またはＣＤ３８アンタゴニストである。適宜、ＳＦＲＰ２および／またはＣＤ３８アンタゴニストは、抗体、例えば、モノクローナル抗体またはその断片；キメラモノクローナル抗体（ヒト－マウスキメラモノクローナル抗体など）；完全ヒトモノクローナル抗体；組換えヒトモノクローナル抗体；ヒト化抗体断片；小分子ＳＦＲＰ２および／またはＣＤ３８遮断剤を含む可溶性ＳＦＲＰ２および／またはＣＤ３８アンタゴニストであってもよい。適宜、ＳＦＲＰ２および／またはＣＤ３８アンタゴニストは、機能性断片またはモノクローナル抗体の機能性断片を含む融合タンパク質、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよび好ましくはＦａｂである。好ましくは、断片はペグ化または被包されている（例えば、安定性および／または持続放出のため）。ＳＦＲＰ２および／またはＣＤ３８アンタゴニストはまた、ラクダ科動物抗体であってもよい。本明細書において使用される場合、ＳＦＲＰ２および／またはＣＤ３８アンタゴニストとしては、ＳＦＲＰ２および／またはＣＤ３８受容体阻害剤が挙げられるがそれに限定されない。例えば、ＳＦＲＰ２アンタゴニストは、米国特許第８，７３４，７８９号明細書、および同第９，０７３，９８２号明細書に開示されており、これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0044】
本発明をこれより以下の実施例においてさらに記載し、該実施例は、実例としてのみ意図され、本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【0045】
本開示を以下の実施例によりさらに実例を示し、実施例は、本明細書に記載の特有の手順に本開示の範囲または精神を限定するものとして解釈されるべきではない。実施例は、ある特定の実施形態の実例を示すために提供されることおよび本開示の範囲に対する限定はそれにより意図されないことが理解されるべきである。本開示の精神および／または添付の請求項の範囲から離れることなく当業者に示唆され得るその様々な他の実施形態、改変、および均等物に頼ることができることがさらに理解されるべきである。
【実施例1】
【0046】
ヒト化ＳＦＲＰ２ ｍＡｂはＴ細胞増殖の腫瘍細胞阻害をレスキューする。ＳＦＲＰ２はＮＦＡＴｃ３を活性化させ、ＮＦＡＴタンパク質はＴ細胞増殖を調節する（２８）ので、本発明者らは、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂはＴＣＲ刺激（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体）を用いた活性化後にＴ細胞増殖に影響するのかどうかを調べた（図１）。Ｔ細胞を単独で、ＴＣＲ刺激と共に、ＴＣＲ刺激＋腫瘍細胞と共に、ＴＣＲ刺激＋腫瘍細胞＋ＩｇＧ１対照と共に、またはＴＣＲ刺激＋腫瘍細胞＋ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂと共にインキュベートした。Ｔ細胞単独の集団において観察された増殖と比較して、ＴＣＲ抗原（陽性対照）は増殖を増加させた。増殖は、ヒト化生性乳がん細胞系であるＨｓ５７８Ｔの存在下で低減された（図１）。共培養物へのＩｇＧ１対照の添加は効果を有しなかった。比較的に、共培養物へのｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂの添加はＴ細胞増殖を部分的にレスキューした。この効果はまた、Ｔ細胞をＲＦ４２０マウス骨肉腫細胞の存在下で共培養した場合に見られ、その場合にｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂの存在は、腫瘍細胞により媒介される増殖の抑制を実質的にレスキューした（図１）。再び、ＩｇＧ１対照の添加は、ＲＦ４２０細胞の存在下でＴＣＲを用いて処理されたＴ細胞と比較して増殖に影響しなかった。
【0047】
ＳＦＲＰ２はＴ細胞においてＷｎｔシグナル伝達を誘導する。ＦＺＤ５受容体は内皮細胞中のＳＦＲＰ２に結合してＮＦＡＴｃ３活性化および血管新生を刺激する（２３）。しかしながら、Ｔ細胞活性化およびＷｎｔシグナル伝達におけるＳＦＲＰ２の役割は以前に評価されていない。Ｔ細胞溶解液のウエスタンブロット解析は、ＦＺＤ５タンパク質がＴ細胞中に存在することを示した（図２Ａ）。マウス脾臓Ｔ細胞をＳＦＲＰ２（３０ｎＭ）を用いて１時間刺激し、核および細胞質画分を単離した。細胞質画分において、ＳＦＲＰ２処理と共にＣＤ３８における増加があった（図２Ｂ）。核画分において、ＳＦＲＰ２処理と共にＮＦＡＴｃ３における増加があった（図２Ｃ）。次にＴ細胞をｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ有りまたは無しでコグネイト抗原を用いて３日間処理し、核画分を収集した。コグネイト抗原を用いて刺激された場合に核画分においてＮＦＡＴｃ３における増加があり、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ処理と共に核画分においてＮＦＡＴｃ３が減少した（図２Ｄ）。
【0048】
ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂはＴ細胞においてＰＤ－１およびＣＤ３８を阻害し、ＮＡＤを回復させる。次に、インビトロでのＴ細胞のｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ処理がＴＧＦβ曝露Ｔ細胞においてＣＤ３８を阻害し、ＮＡＤ＋レベルを回復させるのかどうかを評価した。ＴＧＦβは、Ｔ細胞からのＣＤ３８を増加させる腫瘍微小環境中に存在するサイトカインである。図３Ａは、ＩＬ２、ＴＣＲ抗原、およびＴＧＦβを用いる脾臓Ｔ細胞の処理はウエスタンブロットによりＳＦＲＰ２の増加を結果としてもたらすことを示す。ＦＡＣＳ分析は、ＴＣＲ／ＴＧＦβの添加と共にＣＤ３８＋細胞の統計的に有意な増加を示し、それはｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂにより有意に阻害された（図３ｃ、ｎ＝３、ｐ＜０．００１）。これと共に、ｈＳＦＲＰ２処理と共にＮＡＤ＋濃度の逆性の増加があった（図３ｂ、ｎ＝３、ｐ＝０．０２）。さらに、ＳＦＲＰ２ ｍＡｂは脾臓Ｔ細胞においてＰＤ－１を直接的に阻害するのかどうかを検討した。ＰＤ－１を増加させるＩＬ２、ＴＣＲ抗原およびＴＧＦβを用いてＣＤ８＋およびＣＤ４＋ 脾臓Ｔ細胞を処理した。これはＳＦＲＰ２ ｍＡｂの添加と共に逆転された（図４）。
【実施例2】
【0049】
骨肉腫の予後および治療オプション。骨肉腫（ＯＳ）は、通常青少年および若年成人に影響する、骨の最も一般的な原発性悪性腫瘍である。実行可能な場合、原発性腫瘍は、ネオアジュバント化学療法およびアジュバント化学療法の両方のデリバリーと共に、外科的に切除される。しかしながら、化学療法を用いた場合であっても、初期に切除可能な疾患を有する患者の３分の２のみが治癒し、長期生存は転移性または再発性腫瘍を有する患者の３０％未満においてのみ起こる。肺は、転移性疾患を有する症例の約８０％に関与し、その後の呼吸窮迫は致死のほとんどの原因となる（２９）。免疫療法は一部の腫瘍種において有効性を示しているが、ペムブロリズマブの投与はフェーズＩＩ試験（ＳＡＲＣ０２８）において骨肉腫の治療における有効性の欠如を結果としてもたらしており、該試験において転移性骨肉腫を有する患者の５％のみがペムブロリズマブに対して客観的な応答を有した（３０）。新たな活性剤の欠如は、３０年にわたり骨肉腫患者の生存の増加のいかなる進歩も遮断しており、新規の治療アプローチが強く必要とされる（３１）。
【0050】
増加しつつある証拠は、骨肉腫転移に対する分泌性ＳＦＲＰ２の寄与を強く支持する。ＳＦＲＰ２は、非転移性骨肉腫と比較して転移性骨肉腫において過剰発現される（３２）。ＯＳ患者試料におけるＳＦＲＰ２の高い発現は不良な生存と相関し、ＳＦＲＰ２過剰発現は正常な骨芽細胞分化を抑制し、ＯＳの特徴を促進し、血管新生を促す（３３）。機能研究は、局在化したヒトおよびマウスＯＳ細胞内のＳＦＲＰ２の安定な過剰発現は、インビトロで細胞遊走および浸潤能力を有意に増加させ、インビボで転移潜在能力を増強することを明らかにした。転移性ＯＳ細胞内のＳＦＲＰ２をノックダウンする追加の研究は、インビトロで細胞遊走および浸潤能力の減少を示し、そのため、ＳＦＲＰ２により実行される不可欠な生物学的表現型を裏付けた（１２）。そのため、ＳＦＲＰ２は骨肉腫に対する潜在的な治療標的として現れた。ＳＦＲＰ２はまた、乳がん（５、８～１１）、血管肉腫（９、１０）、横紋筋肉腫（１３）、肺胞軟部肉腫（１４）、悪性神経膠腫（１５）、多発性骨髄腫（１６）、腎細胞癌（２）、前立腺がん（１７）、肺がん（１８）、および黒色腫（１９）において腫瘍成長に寄与することが示されている。骨肉腫における免疫療法の有効性の欠如および本出願の他の箇所において詳述される本発明者のデータを考慮して、本発明者らは、ヒト化ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体（ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ）の組合せがＰＤ－１阻害剤の活性を増強するのかどうかを調べた。
【0051】
ヒト化ＳＦＲＰ２ ｍＡｂはインビボで転移を阻害する。免疫適格マウスにおいてｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂの抗腫瘍活性を評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、腫瘍転移のモデル、ＲＦ４２０マウス骨肉腫においてｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂを試験した。ＲＦ４２０細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に注射した。肺における転移の存在を腫瘍細胞の初期注射の７日後に検証した。第１の実験において、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂを用いる処置（４ｍｇ／ｋｇをｉ．ｖ．で３日毎に注射）を腫瘍注射後１０日目に開始し、ＩＧｇ１対照を用いる処置と比較した。エンドポイントにおいて、対照と比較してｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ処置と共に肺表面小結節の数における有意な減少があった（ｎ＝７、ｐ＜０．０１、図５）。疲弊に関する細胞表面マーカーの評価の際に、ＰＤ－１と緊密に共発現されることが示されているＣＤ３８（４１）は、ＩｇＧ１対照を用いて処置されたものと比較した場合に、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂを用いて処置されたマウスからの脾臓細胞において有意に低減していること（ｎ＝４、ｐ＜０．０１）に気付いた（図５）。
【0052】
マウスＰＤ－１阻害剤を伴うｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂの投与はインビボで転移性骨肉腫成長の阻害において有効である。ＲＦ４２０マウス骨肉腫細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に注射した。７日後に、マウスを週毎のＩｇＧ１対照４ｍｇ／ｋｇ ｉｖ、３日毎のｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ ４ｍｇ／ｋｇ ｉｖ、３日毎のマウスＰＤ－１ ｍＡｂ（２００ｕｇ／マウス）、または両方の抗体の組合せのいずれかを用いて処置した。処置の２１日後にマウスを安楽死させ、肺を回収した。表面転移の数を各群においてカウントした。ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂの組合せは、ＩｇＧ１対照と比較して表面小結節の数を７５％低減した（図６）。
【0053】
実施例１～２の方法
抗体およびタンパク質。対照ＩｇＧ１、オマリズマブはＮｏｖａｒｔｉｓ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。ヒトＳＦＲＰ２組換えタンパク質（ＳＦＲＰ２）は以前に記載されたように（２３）調製され、ノースカロライナ大学チャペルヒル校のｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｒｅ Ｌａｂにより提供された。ヒト化ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体（ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ）は、以前に記載され、実施例４に記載されるように製造し、エンドトキシンから精製した。
抗体およびタンパク質。対照ＩｇＧ１、オマリズマブはＮｏｖａｒｔｉｓ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。ヒトＳＦＲＰ２組換えタンパク質（ＳＦＲＰ２）は以前に記載されたように（２３）調製され、ノースカロライナ大学チャペルヒル校のｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｒｅ Ｌａｂにより提供された。ヒト化ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体（ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ）は、以前に記載され、実施例４に記載されるように製造し、エンドトキシンから精製した。
【0054】
以下の一次抗体をウエスタンブロットにおいて使用した：ウサギ抗ＣＤ３８（＃１４６３７ｓ）およびウサギ抗ヒストンＨ３抗体（＃２６５０ｓ）はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）からのものであり、ウサギ抗ＦＺＤ５（＃Ｈ００００７８５５－Ｄ０１Ｐ、Ａｂｎｏｖａ、Ｔａｉｐｅｉ ｃｉｔｙ、Ｔａｉｗａｎ）、マウス抗ＰＤ１（＃６６２２０－１、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、Ｒｏｓｅｍｏｎｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ＮＦＡＴｃ３（＃ＳＡＢ２１０１５７８）およびウサギ抗アクチン（＃Ａ２１０３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）。二次抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役抗マウス（＃７０７６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）；ＨＲＰ共役抗ウサギ（＃４０３００５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）であった。ＦＡＣＳ分析のために、ラット抗ＣＤ３８－ＰＥ抗体（＃１０２７０７）はＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）からのものであった。抗マウスＣＤ３（＃ＢＥ０００１１）および抗マウスＣＤ２８（＃ＢＥ００１５－１）はＢｉｏＸＣｅｌｌ（Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ、ＵＳＡ）からのものであった。以下の抗体をＢｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから購入し、フローサイトメトリーのために使用した：抗ＣＤ１０３（クローン２Ｅ７、カタログ番号１２１４３５）、抗ＣＤ５：ｇｐ１００抗原断片はＡｎａＳｐｅｃ（＃ＡＳ－６２５８９）からのものであった。
【0055】
細胞培養。遺伝子操作された骨肉腫マウスモデルから確立されたＲＦ４２０およびマウス骨肉腫細胞（３２）を得た。加湿された５％のＣＯ２－９５％の室内空気雰囲気中３７℃で細胞を培養した。細胞系はＡＴＣＣ（登録商標）により認証されたものであり、マウス細胞は、インビボで使用される場合は常にマイコプラズマを含む齧歯動物病原体についてＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｉｍａｌ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）により試験されたものであった。
【0056】
カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）シグナル強度の測定による細胞増殖の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析。ＣＦＳＥシグナルの希釈は細胞増殖の増加と緊密に相関する。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標） ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）の指示にしたがってＣＦＳＥ色素を用いて脾臓Ｔ細胞を事前標識した。細胞を次に未処理のままとしたか、または単独で、もしくは２：１の比の腫瘍細胞（ＲＦ４２０もしくはＨｓ５７８Ｔ乳癌－肉腫）の存在下で３日間、可溶性抗ＣＤ３（＃ＢＥ０００１－１、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ、ＵＳＡ；２μｇ／ｍｌ）／抗ＣＤ２８抗体（＃ＢＥ００１５－１、ＢｉｏＸＣｅｌｌ；２μｇ／ｍｌ）を用いて活性化させた。追加的に、一部の共培養物を対照ＩｇＧ１（１０μＭ）、またはｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（１０μＭ）を用いて処理した。３日後に、共培養物からのＴ細胞を使用してＣＦＳＥ強度を測定した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳにより測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析を行った。
【0057】
ウエスタンブロット。脾臓Ｔ細胞をＳＦＲＰ２（３０ｎＭ）またはｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（１０μＭ）の有りまたは無しで１時間処理した。ＳＦＲＰ２用の対照細胞には単独で培地を与え、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ実験用のものにはＩｇＧ１ １０μＭを与えた。細胞を次に１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。培地を除去し、細胞を処理前に－８０℃で凍結貯蔵した。製造者のマニュアル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に記載されるようにＮＥ－ＰＥＲ核および細胞質抽出試薬を使用して核抽出物を調製した。トランスジェニックＰｍｅｌ１マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から得られた脾臓Ｔ細胞をｒｈＳＦＲＰ２（３０ｎＭ）またはｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（１０μＭ）の有りまたは無しで１時間処理した。ｒｈＳＦＲＰ２用の対照細胞には単独で培地を与え、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ実験用のものにはＩｇＧ１ １０μＭを与えた。細胞を次に１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。培地を除去し、細胞を処理前に－８０℃で凍結貯蔵した。製造者のマニュアル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に記載されるようにＮＥ－ＰＥＲ核および細胞質抽出試薬を使用して核抽出物を調製した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してタンパク質濃度を測定した。等量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードした。タンパク質をポリビニリデンジフルオリド膜に転写し、以下の一次抗体を使用してウエスタンブロッティングを実行した：ウサギ抗ＣＤ３８およびウサギ抗ヒストンＨ３抗体、ウサギ抗ＦＺＤ５、マウス抗ＰＤ１、ウサギ抗ＮＦＡＴｃ３およびウサギ抗アクチン。以下の二次抗体を使用した：ＨＲＰ共役抗マウス、およびＨＲＰ共役抗ウサギ。ＥＣＬ Ａｄｖａｎｃｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅを視覚化のために使用した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）。
【0058】
次に、インビトロでのｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ処理がＴＧＦβ曝露Ｔ細胞においてＣＤ３８を阻害し、ＮＡＤ＋レベルを回復させるのかどうかを評価した。脾臓をＣ５７／ＢＬ６マウスから獲得し、単一細胞懸濁液を作製し、ＰＢＳと共にＡＣＫ溶解緩衝液に１分間再懸濁した。１％のＦＣＳを加えて反応を停止させた。単一細胞懸濁液中で、以下の抗体：ＴＣＲ１１９、ＣＤ２５、ＧＲ１、ＮＫ１．１、ＣＤ１１Ｃ、ＣＤ１１Ｂ、ＣＤ１９のミックスを使用することによる陰性サブトラクションによりＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を単離し、氷上で１５分間インキュベートした。細胞を２００μＬのストレプトアビジン結合ビーズ溶液と共にインキュベートした。単離後に、細胞をカウントし、４００，０００個の細胞を抗ＣＤ３（２μｇ／ｍＬ）および抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍＬ）プレコーティングプレートにプレーティングした。陰性対照は、ＩＬ－２富化培地中の単離された細胞のみを含有し、抗ＣＤ３／Ｃｄ２８（ＴＣＲ）コーティングを含有しなかった。細胞を含む各実験ウェルはＴＣＲおよびＩＬ－２（（６，０００Ｕ／ｍＬ）ならびに以下の実験条件：ＴＧＦβ（５ｎｇ／ｍｌ）の有りまたは無しでのｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（１０ｕＭ）のうちの１つを含有した。全ての条件を３連で行い、３日間培養した。実験後に細胞をカウントし、ＦＡＣＳについて染色したか、またはＮＡＤ／ＮＡＤＨ細胞ベースのアッセイキットを用いてＮＡＤ分析のために処理した。ＮＡＤ分析のために、少なくとも２５０，０００個の細胞が要求され、それをＮＡＤプロトコールにしたがって直ちに処理した。細胞を遠心分離し、撹拌下で透過処理緩衝液と共にインキュベートした。追加の遠心分離後に、試料および標準品を反応緩衝液と共に撹拌下で１ｈ３０分インキュベートした。プレートリーダーを使用して光学密度を最後に４５０ｎｍで読み取った。ＦＡＣｓ分析のために、３００，０００個の細胞をＰＢＳに再懸濁し、製造者のプロトコールの通りにＬｉｖｅ ｄｅａｄ ｓｔａｉｎ中でインキュベートし、次にＰＢＳを用いて洗浄し、遠心沈降させ、上清を除去した。細胞を次に抗ＣＤ３８ ＰＥ／Ｃｙ５（１／２００）、抗ＣＤ４ ＦＩＴＣ（１／１００）、抗ＣＤ８ ＡＰＣ（１／２００）、抗ＰＤ１ ＰＥ（１／２００）、緩衝液を含有する抗体および染色緩衝液（５０μＬ／試料）のマスターミックスに室温で２０分間懸濁し、光から保護した。細胞を最後に４％のパラホルムアルデヒド中で１０～１５分固定した後に２５０μｌの染色緩衝液に再懸濁した。
【0059】
インビボでの転移性骨肉腫成長。第１の実験において、無菌ＰＢＳに懸濁したＲＦ４２０骨肉腫細胞（５×１０５）を６～８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０匹の雌および１３匹の雄）の尾静脈を介してｉ．ｖ．で注射した。７日目に、２匹のマウスを屠殺し、肺を除去し、１０％のホルマリンに固定し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。切片を転移の存在について顕微鏡下でスクリーニングした。転移の存在が確認されたら、１０日目に、マウスをＩｇＧ１対照４ｍｇ／ｋｇまたはｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ ４ｍｇ／ｋｇを用いて処置した（ｎ＝１０）。３週の処置後に、動物を屠殺し、肺および脾臓を除去した。肺表面小結節を次にカウントし、処置群の間で比較した。脾臓をフローサイトメトリー用のＴ細胞単離のために新鮮な状態で収集した。
【0060】
次に、無菌ＰＢＳに再懸濁したＲＦ４２０細胞（５×１０５）をＥｎｖｉｇｏ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）から購入した６～８週齢Ｃ５７Ｂｌ／６雄および雌マウス（系統コード０４４）の尾静脈にｉ．ｖ．で注射した。マウスを無作為に４つの群に分けた：対照（オマリズマブ、ｎ＝１３）；ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（ｎ＝１１）；マウスＰＤ－１ ＭＡｂ（ｎ＝１２）；ＰＤ－１ｍ Ａｂ＋ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（ｎ＝１２）。処置を腫瘍細胞接種の１０日後に開始した。投薬量、デリバリー経路および頻度は以下であった：対照（オマリズマブ）４ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ． 週毎に１回；ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ ４ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ． ３日毎；ｐｄ－１ ｍａｂ ８ｍｇ／ｋｇ 腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｙ）（ｉ．ｐ．）３日毎。２３日の処置後に、動物を屠殺し、肺を切除し、表面小結節をカウントした。切除の直後に得られた全肺の画像から表面小結節をカウントした。肺をホルマリンに固定し、パラフィンに包埋した。それらを切片化し、Ｈ＆Ｅを用いて染色した。
【0061】
フローサイトメトリー。ＣＤ３８についての染色は、尾静脈中のＲＦ４２０骨肉腫注射を伴う実験からの脾臓細胞をＣＤ３８に対する一次抗体と共にＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））中４℃で３０分間インキュベートすることにより行った。試料を平均蛍光強度（ＭＦＩ）レベルについてＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａでスクリーニングし、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、ＯＲ）を用いて解析した。
【0062】
統計。全ての検定力および試料サイズの算出はＰＡＳＳバージョン０８．０．１３を使用して行った。インビトロ実験は３連で行い、３回繰り返した。定量的な測定は、潜在的なバイアスを軽減するために技師を実験条件に対して盲検として収集した。連続的な測定の群比較は、２または多群比較のためにそれぞれ２サンプルｔ検定またはＡＮＯＶＡを使用して行った。
【実施例3】
【0063】
ＳＦＲＰ２ ｍＡｂのヒト化。キメラ抗体ならびに複合物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）重鎖および軽鎖の組合せ（計１６の抗体）を競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＳＦＲＰ２への結合について試験した。特に、希釈系列の精製された完全ヒト複合物ＩｇＧ変異型をＳＦＲＰ２ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂへの結合について固定濃度のビオチン化マウス抗体に対して競合させた。次に、結合したビオチン化ｍＡｂ ８０．８．６（マウスＳＦＲＰ２ ｍＡｂ）をストレプトアビジンＨＲＰおよびＴＭＢ基質を使用して検出した。これは、ＳＦＲＰ２に対する全ての複合物抗体の結合効率はキメラ抗体のそれと大まかに同等であり、全てのバリアントはマウス抗体と比較して向上を示すことを実証した（図１２）。抗ＳＦＲＰ２のキメラ抗体および複合物変異型をプロテインＡセファロースカラム上で細胞培養上清から精製し、ＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換し、予測されるアミノ酸配列に基づいて消散係数（Ｅｃ（０．１％）＝１．７６）を使用してＯＤ２８０ｎｍにより定量化した。リードｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂのエンドトキシン試験はエンドトキシン＜０．５ＥＵ／ｍを示した。リードｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂのＳＤＳ－ＰＡＧＥは、重鎖および軽鎖に対応する２つのバンドを示した（図１３）。図１３において、ＳＤＳ Ｐａｇｅ。１μｇの精製されたリードｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂを４～１２％のＮｕＰＡＧＥ－ＳＤＳゲルにロードした。ＰａｇｅＲｕｌｅｒ Ｐｌｕｓ事前染色ラダーをロードしてバンドのサイズ決定を可能とした。レーン１はβ－メルカプトエタノールを用いて還元されており、試料について重鎖および軽鎖に対応する２つのバンドが存在する。レーン２は非還元であった。
【0064】
ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂの免疫原性試験。免疫原性の相対リスクを決定するためにＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標） ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｓｓａｙを使用してリード完全ヒト化およびキメラ抗ＳＦＲＰ２抗体を２２人の健常ドナーのコホートに対して試験した。完全ヒト化抗ＳＦＲＰ２抗体は、増殖アッセイにおいていずれのドナーにおいてもＳＩ≧２．０、ｐ＜０．０５の閾値を使用して陽性の応答を誘導しなかった一方、キメラ抗ＳＦＲＰ２抗体はドナーの２３％において陽性のＴ細胞増殖応答を誘導した。対照抗原ＫＬＨを用いた結果は、反復研究における陽性および陰性の結果の間に良好な相関（＜１０％のアッセイ内ばらつき）があったことを示し、これはアッセイにおける高いレベルの再現性を指し示す（図１４）。図１４において、バルク培養物からのＰＢＭＣをサンプリングし、３つの試験試料とのインキュベーション後５、６、７および８日目に増殖について評価した。対応のない２サンプルスチューデントｔ検定を使用して有意（ｐ＜０．０５）である点線により指し示されるＳＩ≧２．０（ｐ＜０．０５）の増殖応答をこの図において陽性であると考えた。
【0065】
ヒト化ＳＦＲＰ２ ｍＡｂは高い親和性でＳＦＲＰ２に結合する。ＳＦＲＰ２に対するリードｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂの結合親和性を決定するために、ｒｈＳＦＲＰ２（１μＭ）をマイクロプレート固相タンパク質結合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて増加性濃度のｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂと共にインキュベートした。ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂは８．７２ｎＭのＥＣ５０および７４．１ｎＭのＫｄでｒｈＳＦＲＰ２に結合した。ヒト化ＳＦＲＰ２ ｍＡｂはＥＬＩＳＡアッセイ（ｎ＝１６）において高い親和性でｒｈＳＦＲＰ２に結合し、予め設定された濃度の１μＭ ｒｈＳＲＰ２への増加性濃度のｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂの結合後に測定された４８０ｎｍの吸光度を示す濃度応答曲線を生じることを図１Ａは示す。
【0066】
ヒト化ＳＦＲＰ２ ｍＡｂは内皮管形成、腫瘍細胞増殖を阻害し、腫瘍アポトーシスを促進する。先行する報告と合致して、ｒｈＳＦＲＰ２は対照細胞と比較して分岐点の数における増加を誘導した（ｎ＝４、ｐ≦０．０５）。図７Ｂは、２Ｈ１１内皮管形成に対するｒｈＳＦＲＰ２およびｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂの効果を示す棒グラフである。このデータを得るために、２Ｈ１１細胞をインキュベートし、ＩｇＧ１対照のみ（５μＭ）、またはＩｇＧ１（５μＭ）＋ｒｈＳＦＲＰ２タンパク質（３０ｎＭ）、またはｒｈＳＦＲＰ２（３０ｎＭ）およびｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（０．５～１０μＭ）の組合せを用いて処理した。ｎ＝４ ＊：ｐ≦０．０５；＊＊：ｐ≦０．００１。反対に、増加性濃度のｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂは管形成に対するｒｈＳＦＲＰ２の効果を有意に相殺した（ｎ＝４、ｐ≦０．０５）。ＳＦＲＰ２刺激性管形成のｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ阻害についてのＩＣ５０は４．９±２μＭであった。
【0067】
Ｈｓ５７８Ｔヒト癌腫／肉腫乳がんおよびマウスＳＶＲ血管肉腫細胞における腫瘍細胞増殖、アポトーシスおよび壊死に対するｒｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂの効果をインビトロで評価した。ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂを用いた処理は、Ｈｓ５７８Ｔ乳がん（図７Ｃ；５μＭおよび１０μＭのｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂについてそれぞれｐ≦０．０５およびｐ≦０．００１）ならびにＳＶＲ血管肉腫細胞（図７Ｆ；５μＭおよび１０μＭのｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂの両方についてｐ≦０．００１）の両方において腫瘍アポトーシスを有意に増加させ、壊死における変化は無かった。ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂを用いた処理はＳＶＲ増殖に対する効果を有しなかったが（図７Ｈ）、Ｈｓ５７８Ｔ乳がん細胞の腫瘍細胞増殖を有意に低減した（図７Ｅ、５μＭ ｐ≦０．０５、１０μＭ ｐ≦０．００１）。
【0068】
インビボでのｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂの有効性および毒性の決定。ＳＶＲ血管肉腫細胞を接種されたマウスを３日毎のｉ．ｖ．での２、４、１０および２０ｍｇ／ｋｇのｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ用量、またはＩｇＧ１対照を用いて２１日間処置した。抗体処置マウスのいずれにおいても体重損失も嗜眠も無かった。２０ｍｇ／ｋｇの用量においても、肝臓または肺における病理学的変化は無かった。実験の終了時に体重は群の間で類似したままであった（対照について３２．２±１．４ｇ；２ｍｇ／ｋｇについて３１．３±１．１ｇ；４ｍｇ／ｋｇについて３２．１±０．５ｇ；１０ｍｇ／ｋｇについて３１．８±０．９ｇおよび２０ｍｇ／ｋｇについて３２．７±１．０ｇ。最大効果を有する用量は４ｍｇ／ｋｇであり、腫瘍体積の６９％の低減があった（ｎ＝５／群、ｐ＝０．０５）。
【0069】
抗体の薬物動態特性を研究するために、尾静脈を介してｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ ４ｍｇ／ｋｇの単回用量をヌードマウスに注射し、血液試料を異なる時点において収集した（図８）。組換えｈＳＦＲＰ２処置は膜ＣＤ３８および核ＮＦＡＴｃ３タンパク質の増加に繋がった一方、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂはＴ細胞において核ＮＦＡＴｃ３の蓄積を阻害する。図８Ａにおけるデータは、ＦＺＤ５タンパク質がＴ細胞中に存在することを実証する。図８Ａは、４ｍｇ／ｋｇの単回ｉ．ｖ．注射後の経時的なマウスの血清中のｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂの濃度の減少を示す薬物動態プロットである。動物の血清中の抗体の半減期は４．１±０．５日であり、７．８±１．０ｍｇ／Ｌの最大血清濃度（Ｃｍａｘ）および１３．０±０．６ｍＬ／時間のクリアランス（ＣＬ）であった。
【0070】
ＭＴＤ実験において同定された用量の有効性を確認するために、本発明者らは、より多数の動物（ｎ＝１０の動物／群）でのＳＶＲ血管肉腫腫瘍を用いる実験を繰り返し、４ｍｇ／ｋｇのｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂを用いるそれらの処置を開始した。Ｔ細胞をｒｈＳＦＲＰ２（３０ｎＭ）を用いて１ｈ処理し、細胞質および核画分を分離するためにＮＥ－ＰＥＲキットを使用して処理した（図８Ｂ）。指し示されるタンパク質マーカーに対する抗体を用いて試料をプロービングし、処理された細胞におけるタンパク質のレベルを非処理細胞におけるものと比較した。３週後に、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂを用いて処置された腫瘍は、ＩｇＧ１対照を用いて処置された腫瘍よりも４３％小さかった（対照について１，６３１．３±２８３ｍｍ３、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂについて９２８．５±１４８ｍｍ３；ｐ≦０．０５）。
【0071】
次に、本発明者らは、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂは他の腫瘍種の成長に影響し得るのかどうかを検討した。Ｈｓ５７８Ｔ乳癌－肉腫異種移植片を有するマウスをｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂまたはＩＧｇ１対照を用いて処置した。抗原ｇｐ１００（０．８７μＭ）またはｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（１０μＭ）を単独または組合せで用いてＴ細胞を６０分間処理し、核画分を単離した（図８Ｃ）。ｒｈＳＦＲＰ２処理細胞中のＮＦＡＴｃ３のタンパク質レベルを非処理細胞におけるものと比較した。各時点における対照および各処置群の間の比較は、ベースラインからの処置２２日目、２５日目、および３１日目からの全ての時点が統計的に有意であることを示した（ｐ＝０．０５）。実際に、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ処置マウスにおける腫瘍体積において６１％の低減があった、ｎ＝１１、＊Ｐ＜０．０５）。追加的に、処置マウスのいずれにおいても体重損失も嗜眠も無かった。
【0072】
ヒト化ＳＦＲＰ２ ｍＡｂはインビボで腫瘍においてアポトーシスを誘導する。ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂはインビトロでアポトーシスを誘導し、乳がん細胞において増殖を阻害し、本発明者らは、これらの表現型がインビボで保持されるのかどうかを調べた。増殖性（Ｋｉ６７陽性）細胞の割合は、ＩｇＧ１対照腫瘍と比較してｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ処置により影響されなかったが（ＳＶＲ腫瘍について２３±１．６％対２９±４．２％；Ｈｓ５７８Ｔ腫瘍について１８±２．７％対１８±２．８％、ｐ＝ＮＳ）、アポトーシス細胞の割合はＳＶＲ腫瘍において１８８％（ＩｇＧ１対照において８．４±０．９、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ腫瘍において２４．２±３．５；ｎ＝１０、ｐ≦０．０５）、Ｈｓ５７８Ｔ腫瘍において１８１％（ＩｇＧ１対照において１５．１±４．９、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ腫瘍において４２．４±３．９；ｎ＝１０、ｐ≦０．０５）増加した（図９）。
【0073】
免疫適格マウスにおいてｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂの抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは、腫瘍転移のモデルにおいてＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてＲＦ４２０マウス骨肉腫におけるｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂを試験した。ＲＦ４２０骨肉腫細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に注射した。１０日目にＩｇＧ１対照またはｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂを用いる処置を始めた。マウスを処置の２１日目に安楽死させ、表面小結節をカウントした。対照と比較してｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂを用いて処置されたマウスにおいて表面小結節の数における有意な低減があった（ｎ＝７、ｐ＜０．０１、図１０Ａ）。疲弊についての細胞表面マーカーの評価の際に本発明者らは、ＰＤ－１と緊密に共発現することが示されているＣＤ３８は、ＩｇＧ対照からのものと比較した場合にｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂを用いて処置されたマウスにおいて脾臓細胞（ｎ＝４、ｐ＜０．０１）およびＴＩＬ（ｎ＝４、ｐ＜０．０１）上で有意に低減したが、ＰＤ－１、ＣＤ１０３、およびＣＤ５（ｎ＝３）においては有意差が無かったことに気付いた（図６Ｂ）。ＰＤ－１、ＣＤ１０３、ＴＮＦα、またはＣＤ５などの他の疲弊マーカーの発現は、脾臓細胞でもＴＩＬでも有意でなかった（ｎ＝４、ｐ＝ＮＳ）。
【0074】
第２の骨肉腫実験において、骨肉腫ＲＦ４２０細胞を免疫適格マウスの静脈内に注射した。研究を４つの群に分けた。第１の群は３日毎のｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ ４ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．を用いて処置した。ＩＧｇ１対照群、３日毎８ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．でのニボルマブ、抗ＰＤ－１抗体を投与される群、ならびにｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂおよび抗ＰＤ－１抗体の両方を与えられる群もあった。処置を注射後１０日目に開始し、３週後に動物を安楽死させ、肺を切除し、表面小結節をカウントした＊：ｐ≦０．０００１；＊＊：ｐ≦０．０１、ｎ＝１２）。これらの群を比較して肺転移の発生を測定した。各個々の処置は、ＩｇＧ１対照と比較して表面小結節の数を低減した（ＩｇＧ１対照について４３．６±６．８、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂについて１８．３±３．４、ニボルマブについて１６．３±１．１；ｐ≦０．０００１、図１１Ａ）。ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂおよびニボルマブの組合せを用いて処置されたマウスをＩｇＧ１対照を用いて処置されたマウスと比較して転移性病変の発生における８０％の低減があった（ＩＲＲ＝０．２０、９５％ ＣＩ＝０．１３～０．３２；ｐ＜０．０００１）。ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂおよびニボルマブの組合せを用いて処置されたマウスを単剤ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂを用いて処置されたマウスと比較して転移性病変の発生において５１％の低減がある（ＩＲＲ＝０．４９、９５％ ＣＩ＝０．３１～０．７７；ｐ＝０．００２１）。ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂおよびニボルマブの組合せを用いて処置されたマウスを単剤ニボルマブを用いて処置されたマウスと比較して転移性病変の発生において４５％の低減がある（ＩＲＲ＝０．５５、９５％ ＣＩ＝０．３５～０．８６；ｐ＝０．００８４）（図１１Ａ）。
【0075】
本発明者らは、マウスＴ細胞におけるＣＤ３８レベルに対する、個々の処置としてまたは組合せで与えられたニボルマブおよびｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂの影響力を測定した。特に、ＲＦ４２０細胞を注射され、ＩｇＧ１対照、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ、ニボルマブ、またはｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂおよびニボルマブの組合せを用いて処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓からＴ細胞を単離した。細胞を次に、蛍光色素を用いて標識されたＣＤ３８を用いて染色し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳにより分析した。ニボルマブ処置は単独ではＣＤ３８レベルに対して効果を有しなかった。しかしながら、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂは、対照ＩｇＧ抗体を用いて処置された群から得られたＴ細胞と比較した場合にＴ細胞においてＣＤ３８表面発現を低減し（ｐ＜０．００１、図１１Ｂ）、ＳＦＲＰ２の標的化はＴ細胞上のＣＤ３８の発現を低減するために十分であることを指し示した。これらの結果は、ｈＳＦＰＲ２ ｍＡｂ投与はＴ細胞免疫応答を回復させ、腫瘍成長を予防し得るという提案を支持する。ニボルマブはヒト抗体であるので、マウスモデルにおける処置のために最適なものではないことが留意されるべきである。
【0076】
ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体のヒト化。マウスＳＦＲＰ２モノクローナル抗体８０．８．６をコードするＶ領域遺伝子（２１）を最初にクローニングし、それを使用して、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域、およびκ軽鎖定常領域と組み合わせたマウスＶ領域を含むキメラ抗体を構築した。キメラ抗体および複合物重鎖および軽鎖の組合せ（計１６の抗体）をＮＳ０またはＨＥＫ２９３細胞中で発現させ、精製し、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＳＦＲＰ２ペプチドへの結合について試験した。
【0077】
免疫原性試験。ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標） ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｓｓａｙを使用してリード完全ヒト化抗ＳＦＲＰ２抗体（ＶＨ２／ＶＫ５）および参照キメラ抗ＳＦＲＰ２抗体を免疫原性潜在能力について評価し、それにおいてＣＤ８＋枯渇ＰＢＭＣを使用してバルク培養物を確立し、試料の添加後の［３Ｈ］－チミジンの組込みにより様々な時点においてＴ細胞増殖を測定した。非特異的免疫原性の相対リスクを決定するためにＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標） ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｓｓａｙを使用してリード完全ヒト化およびキメラ抗ＳＦＲＰ２抗体を２２人の健常ドナーのコホートに対して試験した。検出可能な抗体特異的Ｔ細胞応答を刺激するために５０μｇ／ｍｌの飽和濃度は十分であることを示すＡｎｔｉｔｏｐｅの先行する研究に基づいて試料を５０μｇ／ｍｌの最終濃度において試験した。各試料の免疫原性潜在能力を評価するために、Ｔ細胞活性化を測定するための増殖の分析と共にＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標） ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ａｓｓａｙを使用した。試料はＰＢＭＣベースのアッセイにおいて以前に評価されていないので、ＰＢＭＣ生存能に対する試料の任意の全体的な毒性効果の初期評価が決定された。試験試料との培養の７日後に、ＰＢＭＣのトリパンブルー色素除外を使用して細胞生存能を算出した。
【0078】
抗体およびタンパク質。以下の一次抗体をウエスタンブロットにおいて使用した：ウサギ抗ＣＤ３８（＃１４６３７ｓ）およびウサギ抗ヒストンＨ３抗体（＃２６５０ｓ）はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入、ウサギ抗ＦＺＤ５（＃Ｈ００００７８５５－Ｄ０１Ｐ、Ａｂｎｏｖａ、Ｔａｉｐｅｉ ｃｉｔｙ、Ｔａｉｗａｎ）、マウス抗ＰＤ１（＃６６２２０－１、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、Ｒｏｓｅｍｏｎｔ、ＩＬ、ＵＳＡ）、ウサギ抗ＮＦＡＴｃ３（＃ＳＡＢ２１０１５７８）およびウサギ抗アクチン（＃Ａ２１０３、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）。二次抗体は、ＨＲＰ共役抗マウス（＃７０７６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）；ＨＲＰ共役抗ウサギ（＃４０３００５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）であった。ＥＬＩＳＡのために、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡからのＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ。ＦＡＣＳ分析のために、ラット抗ＣＤ３８－ＰＥ抗体（＃１０２７０７）はＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）からのものであった。抗マウスＣＤ３（＃ＢＥ０００１１）および抗マウスＣＤ２８（＃ＢＥ００１５－１）はＢｉｏＸＣｅｌｌ（Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ、ＵＳＡ）からのものであった。対照ＩｇＧ１、オマリズマブはＮｏｖａｒｔｉｓ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。ヒトＳＦＲＰ２タンパク質（ｒｈＳＦＲＰ２）は、以前に記載されたように調製した。ｇｐ１００抗原断片はＡｎａＳｐｅｃ（＃ＡＳ－６２５８９）からのものであった。
【0079】
ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂに対するｒｈＳＦＲＰ２の結合親和性を決定するためのマイクロプレート固相タンパク質結合（ＥＬＩＳＡ）アッセイ。マイクロプレート固相タンパク質結合アッセイを使用してｒｈＳＦＲＰ２およびｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂについてのＥＣ５０を決定した。平底Ｎｉ２＋コーティング９６ウェルマイクロプレート（＃１５４４２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、＃ＢＰ３９９－１、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）中の０．０５％のウシ血清アルブミン（ａｌｂｕｍｅｎ）（ＢＳＡ、＃００１－０００－１６２、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ ）を用いて４℃で終夜ブロッキングした。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に希釈された１μＭのｈｉｓタグ付加ｒｈＳＦＲＰ２を、ブロッキングされたプレート上で３７℃で終夜インキュベートした。２５０μｌ／ウェルのＰＢＳを用いてプレートを３回洗浄した。ＰＢＳ中の増加性用量のｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（０ｐＭ、１００ｐＭ、２００ｐＭ、４００ｐＭ、８００ｐＭ、１．６ｎＭ、３．１５ｎＭ、６．３ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ）をプレート上でｒｈＳＦＲＰ２と共に３７℃で終夜インキュベートした。プレートを３回洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％のＢＳＡ中室温で１時間ブロッキングした後に、ＰＢＳ中に１：４０，０００で希釈した１００μｌ／ウェルの二次抗体（ＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。プレートを５回洗浄した後に、各ウェルを１００μｌのＫ－Ｂｌｕｅ ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（＃３０８１７６、Ｎｅｏｇｅｎ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ、ＵＳＡ）と共に暗所で５分間インキュベートした。１００ｕｌの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させた。４５０ｎｍにおいて吸光度を読み取った。正規化された応答に対するＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（トップを１００％に制限した可変傾斜関数）を使用して可変傾斜を用いる非線形回帰分析を介してＥＣ５０算出を決定した。アゴニスト濃度およびＥＣ５０が等しいチェン－プロソフ式（４０）を使用してＥＣ５０をＫｄに変換した。結果を平均±平均の標準誤差として表す。各データ点は８つの独立した測定の結果である（ｎ＝８）。
【0080】
細胞培養。５％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、＃ＦＢ－１２、Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｉｅｌ／Ｂｉｅｎｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ｖ／ｖ）を含むＯｐｔｉ－ＭＥＭ（＃２２６００１３４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）中で２Ｈ１１マウス内皮細胞（＃ＣＲＬ－２１６３、ＡＴＣＣ（登録商標）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）を培養した。１０％のＦＢＳ、０．０１ｍｇ／ｍｌのウシインスリン（＃Ｉ０５１６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（＃ＭＴ３０００９Ｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ（登録商標））中でＨｓ５７８Ｔヒト乳癌－肉腫トリプルネガティブ細胞（＃３０－２０２、ＡＴＣＣ（登録商標）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）を培養した。ＳＶＲ血管肉腫細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（＃ＣＲＬ－２２８０、ＡＴＣＣ（登録商標））から得、８％のＦＢＳおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ｖ／ｖ）を含むＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養した。遺伝子操作された骨肉腫マウスモデルから確立されたＲＦ４２０マウス骨肉腫細胞（４１）をＤｒ． Ｊａｓｏｎ Ｔ． Ｙｕｓｔｅｉｎ（Ｔｅｘａｓ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）から得、１０％の熱不活化ＦＢＳおよび１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ｖ／ｖ）を含むＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ（登録商標））中で培養した。加湿された５％のＣＯ２－９５％の室内空気雰囲気中３７℃で全ての細胞系を培養した。全ての細胞系はＡＴＣＣ（登録商標）により認証されたものであり、マウス細胞は、インビボで使用される場合は常にマイコプラズマを含む齧歯動物病原体についてＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｉｍａｌ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）により試験されたものであった。Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から得られたＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドのｇｐ１００反応性ＴＣＲ保有ＰｍｅｌトランスジェニックマウスからマウスＴ細胞を単離した。
【0081】
内皮管形成アッセイ。５％のＦＢＳを含むＯｐｔｉ－ＭＥＭに２Ｈ１１内皮細胞をプレーティングし、２４時間静置した。２．５％のＦＢＳを含むＯｐｔｉ－ＭＥＭ中に細胞を終夜維持することにより静止状態を誘導した。インビトロ血管新生アッセイプロトコールにしたがって９６ウェルプレートのウェル中でＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（＃ＥＣＭ６２５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を重合させた。このアッセイにおいて、９つの処理条件を調製した：ＩｇＧ１単独（５μＭ；オマリズマブ）；ＩｇＧ１（５μＭ）と共にｒｈＳＦＲＰ２タンパク質（３０ｎＭ）；または増加性濃度のｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（０．５、１、５、１０もしくは２０μＭ）と組み合わせたｒｈＳＦＲＰ２（３０ｎＭ）。２．５％のＦＢＳを含むＯｐｔｉ－ＭＥＭに再懸濁された処理を、ロッカー上３７℃、５％のＣＯ２で９０分間プレインキュベートした後にそれらを細胞に加えた。１５０μｌのプレインキュベートされた処理物に１．９×１０４個の細胞を再懸濁し、次にロッカー上、３７℃、５％のＣＯ２でさらに３０分間インキュベートした。最後に、重合したＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を用いて既にコーティングされた各ウェルに細胞懸濁液を加えた。各実験をｎ＝４／条件で４つの独立した回数繰り返した。２．５％のＦＢＳおよび５μＭのＩｇＧ１を含む新鮮なＯｐｔｉ－ＭＥＭを対照細胞に与えた。各処理条件について、３７℃、５％のＣＯ２での４ｈのインキュベーション後に、ＥＶＯＳ ＦＬ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）の４Ｘ対物レンズを使用して画像を獲得した。ＩｍａｇｅＪ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して分岐点をカウントした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおいて、非線形回帰およびＤｏｓｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ－Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎファミリーの式を使用してデータを解析してＩＣ５０を決定した。
【0082】
増殖アッセイ。Ｈｓ５７８Ｔ乳癌－肉腫およびＳＶＲ血管肉腫細胞を９６ウェルプレートに３，０００細胞／ウェルでプレーティングした。４時間後に、指し示される濃度においてｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（１、５、または１０μＭ）を増殖培地に加えた。細胞を３７℃、５％のＣＯ２で７２時間インキュベートした。Ｃｙｑｕａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（＃Ｃ３５０１１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して増殖を評価した。ＥＶＯＳ ＦＬｃ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して画像を獲得した。ＦＩＪＩ細胞カウンティングソフトウェアを使用して細胞をカウントした。
【0083】
アポトーシス／壊死。Ｈｓ５７８Ｔ乳癌－肉腫乳房およびＳＶＲ血管肉腫細胞を１６ウェルチャンバースライド（＃１７８５９９、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）にそれぞれ２×１０４、３×１０４、および７．５×１０３細胞／ウェルでプレーティングした。翌日、増殖培地を含む懸濁液中で１、５もしくは１０μＭのｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂまたは５μＭのＩｇＧ１対照と共に３７℃、５％のＣＯ２で細胞を２時間インキュベートした。Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ／Ｎｅｃｒｏｔｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（＃ＰＫ－ＣＡ７０７－３００１７、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のプロトコールにしたがって壊死およびアポトーシスを決定した。ＥＶＯＳ ＦＬｃ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して画像を獲得した。ＩｍａｇｅＪ細胞カウンティングソフトウェアを使用して細胞をカウントした。各データ点は、それぞれが４つの別々のウェルを含有する２つの独立した実験的反復の結果であった（計ｎ＝８）。
【0084】
ウエスタンブロット。トランスジェニックＰｍｅｌ１マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から得られた脾臓Ｔ細胞をｒｈＳＦＲＰ２（３０ｎＭ）またはｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（１０μＭ）の有りまたは無しで１時間処理した。ｒｈＳＦＲＰ２用の対照細胞には単独で培地を与え、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ実験用のものにはＩｇＧ１ １０μＭを与えた。細胞を次に１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。培地を除去し、細胞を処理前に－８０℃で凍結貯蔵した。製造者のマニュアル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に記載されるようにＮＥ－ＰＥＲ核および細胞質抽出試薬を使用して核抽出物を調製した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してタンパク質濃度を測定した。等量のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードした。タンパク質をポリビニリデンジフルオリド膜に転写し、以下の一次抗体を使用してウエスタンブロッティングを実行した：ウサギ抗ＣＤ３８およびウサギ抗ヒストンＨ３抗体、ウサギ抗ＦＺＤ５、マウス抗ＰＤ１、ウサギ抗ＮＦＡＴｃ３およびウサギ抗アクチン。以下の二次抗体を使用した：ＨＲＰ共役抗マウス、およびＨＲＰ共役抗ウサギ。ＥＣＬ Ａｄｖａｎｃｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅを視覚化のために使用した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）。
【0085】
ＣＦＳＥシグナル強度の測定による細胞増殖のＦＡＣＳ分析。ＣＦＳＥシグナルの希釈は細胞増殖における増加と緊密に相関する。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標） ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）の指示にしたがってＣＦＳＥ色素を用いてＰｍｅｌ１トランスジェニックマウスからの脾臓Ｔ細胞を事前標識した。細胞を次に未処理のままとしたか、または単独で、もしくは２：１の比の腫瘍細胞（ＳＶＲ血管肉腫もしくはＨｓ５７８Ｔ乳癌－肉腫）の存在下で３日間、可溶性抗ＣＤ３（＃ＢＥ０００１－１、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ、ＵＳＡ；２μｇ／ｍｌ）／抗ＣＤ２８抗体（＃ＢＥ００１５－１、ＢｉｏＸＣｅｌｌ；２μｇ／ｍｌ）を用いて活性化させた。追加的に、一部の共培養物を対照ＩｇＧ１（１０μＭ）、またはｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（１０μＭ）を用いて処理した。３日後に、共培養物からのＴ細胞を使用してＣＦＳＥ強度を測定した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳにより測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析を行った。
【0086】
インビボでのｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂの最大耐用量（ＭＴＤ）。動物実験プロトコールは、実験動物の管理および使用についてのＮＩＨガイドラインと合致するものであった。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）から得られた６週齢ヌード雄および雌マウスの右脇腹の皮下に１０６個のＳＶＲ血管肉腫細胞を注射した。翌日、３日毎に尾静脈を介して注射される様々な濃度の精製されたｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（２、４、１０、および２０ｍｇ／ｋｇ）を用いてＰＢＳ対照と共にｉ．ｖ．でマウス（ｎ＝５／群）を処置した。動物を処置し、終点として定義された２ｃｍの平均直径に対照腫瘍が達するまで３日毎に腫瘍体積を測定した。安楽死後に、腫瘍、肺および肝臓を回収し、１０％のホルマリンに固定した。
【0087】
薬物動態研究。雄および雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに異なる時点（０、５分、１、２、７、１４、２１、２８、３５、および４２日）において４ｍｇ／ｋｇのｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂを注射した。３匹のマウスを各時点のために使用した（ｎ＝３）。エンドポイントにおいて、血液試料を門脈を通じて採取し、セパレーターチューブ（＃３６７９８１、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に入れた。試料を１３００×ｇで１５分間遠心分離した。
【0088】
ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂの薬物動態（ＰＫ）のためのマイクロプレート固相タンパク質結合（ＥＬＩＳＡ）アッセイ。ＰＢＳ中の０．０５％のＢＳＡを用いて４℃で終夜、平底Ｎｉ２＋コーティング９６ウェルマイクロプレートをブロッキングした。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に希釈された１μＭのｈｉｓタグ付加ｒｈＳＦＲＰ２を３７℃で終夜インキュベートした。２５０μｌ／ウェルのＰＢＳを用いてプレートを３回洗浄した。次に、１：５０の希釈のマウス血清をプレートに加え、穏やかに振盪しながら３７℃で終夜インキュベートした。プレートを３回洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％のＢＳＡ中室温で１時間ブロッキングした後、ＰＢＳ中に１：４０，０００で希釈された１００μｌ／ウェルの二次抗体（ＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。プレートを５回洗浄した後に、各ウェルを１００μｌのＫ－Ｂｌｕｅ ＴＭＢ基質と共に暗所で５分間インキュベートした。１００μｌの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させた。４５０ｎｍにおいて吸光度を読み取った。ＡＵＣのＰＫ推定のために、ＥＸＣＥＬおよび（４２）において非コンパートメント解析（ＮＣＡ）を使用してｔ１／２、ＣＬ、Ｖｄ、ＴｍａｘおよびＣｍａｘを決定した。ＮＣＡは、血漿濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）を決定するために線形台形公式を使用する。Ｔ１／２は消失半減期を表す。ＡＵＣ算出のために、ＥＬＩＳＡからのｎＭの濃度をｍｇ／Ｌに変換した。
【0089】
インビボでの血管肉腫同種移植片。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）から得られた６週齢ヌード雄および雌マウスの右脇腹の皮下に１０６個のＳＶＲ血管肉腫細胞を注射した。翌日、マウス（ｎ＝１０の動物／群）に尾静脈を介してｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（４ｍｇ／ｋｇ）またはＩｇＧ１対照（オマリズマブ４ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｖ．で注射し、３日毎に処置した。週に２回行われる垂直直径の連続的なキャリパー測定を使用し、以下の式：［（Ｌ（ｍｍ）×Ｗ（ｍｍ）×Ｈ（ｍｍ））×０．５］を使用して腫瘍体積を算出した。身体コンディショニングスコアおよび体重についてマウスを１日毎にモニターした。対照が２ｃｍの直径に達した時にマウスを屠殺し、腫瘍を切除し、ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋した。
【0090】
インビボでのＨｓ５７８Ｔ乳癌－肉腫異種移植片。Ｈｓ５７８Ｔ異種移植片をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）からの５～６週齢ヌード雌マウス中に確立した。マウスの乳房脂肪パッド中に１０６個の細胞を接種し、平均腫瘍サイズが約１００ｍｍ３となった時（３０日目）に処置を始めた。対照腫瘍が２ｃｍの直径に達する終点まで、３日毎にｉ．ｖ．で注射される４ｍｇ／ｋｇのｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（ｎ＝１１）または４ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ１対照（ｎ＝１１）を用いて動物を処置した。キャリパーを使用して腫瘍を週に２回測定し、腫瘍体積を次に上記のように算出した。腫瘍を切除し、ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋した。
【0091】
インビボでのＲＦ４２０転移性骨肉腫。第１の実験において、無菌ＰＢＳ中に懸濁されたＲＦ４２０骨肉腫細胞（５×１０５）を６～８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０匹の雌および１３匹の雄）の尾静脈を介してｉ．ｖ．で注射した。７日目に、２匹のマウスを屠殺し、肺を除去し、１０％のホルマリンに固定し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。切片を転移の存在について顕微鏡下でスクリーニングした。転移の存在が確認されたら（１０日目、ＩｇＧ１対照４ｍｇ／ｋｇまたはｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ ４ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１０）を用いてマウスを処置した。３週の処置後に、動物を屠殺し、肺を除去した。表面小結節をカウントした。第２の実験において、無菌ＰＢＳに再懸濁したＲＦ４２０細胞（５×１０５）をＥｎｖｉｇｏ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）から購入した６～８週齢Ｃ５７Ｂｌ／６雄および雌マウス（系統コード０４４）の尾静脈にｉ．ｖ．で注射した。マウスを無作為に４つの群に分けた：対照（オマリズマブ、ｎ＝１３）；ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（ｎ＝１１）；ニボルマブ（ＮＤＣ＃ ０００３－３７７２－１１、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）（ｎ＝１２）；ニボルマブ＋ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ（ｎ＝１２）。処置を腫瘍細胞接種の１０日後に開始した。投薬量、デリバリー経路および頻度は以下であった：対照（オマリズマブ）４ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ． 週毎に１回；ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ ４ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ． ３日毎；ニボルマブ ８ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ． ３日毎。２３日の処置後に、動物を屠殺し、肺を切除し、表面小結節をカウントした。切除の直後に得られた全肺の画像から表面小結節をカウントした。Ｔ細胞単離、免疫組織化学およびｔｕｎｎｅｌアッセイのために脾臓を新鮮な状態で収集した。
【0092】
免疫組織化学。ホルマリン固定されたパラフィン包埋腫瘍切片をキシレン中で２回、１０分間脱パラフィンし、無水エタノール中で２回、９５％のエタノール中で２回、次に水道水中で水和させた。スライドを３％の過酸化水素中で室温で１０分間インキュベートした後、ＰＢＳ １Ｘ中で２回洗浄した。１０分の冷却と共に４０分間キットＶｅｃｔｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｃｉｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ６（Ｈ－３３００）を使用して野菜スチーマー中でクエン酸緩衝液抗原賦活化ステップを行った。加湿されたスライドチャンバー中室温で１時間、Ｖｅｃｔｏｒ Ｒａｂｂｉｔ ＩＭＰＲＥＳＳ ＨＲＰ Ｋｉｔ（ＭＰ－４１００）において提供されるブロッキング血清中でスライドをインキュベートした。ブロッキング血清を次に排出し、スライドを１：４０希釈のＫｉ６７抗体（ＰＡ１－２１５２０）と共に４℃で終夜インキュベートした。翌日、スライドをＰＢＳ中で３回、洗浄当たり５分間リンスした。Ｖｅｃｔｏｒ Ｒａｂｂｉｔ ＩＭＰＲＥＳＳ ＨＲＰ Ｋｉｔからの二次抗体を加え、スライドをＲＴで３０分間インキュベートし、次にＰＢＳ中で３回、洗浄当たり５分間リンスした。ＤＡＢ溶液を調製し、Ｖｅｃｔｏｒ ＤＡＢ ｋｉｔ（ＳＫ－４１００）において指示されるようにスライドに５分間加え、ＰＢＳ中でリンスし、ヘマトキシリンを用いて３０秒間対比染色した。スライドを次に蒸留水、続いてアンモニアアルコール中で洗浄し、９５％のエタノール中で２回、１００％のエタノール中で２回、キシレン中で２回脱水し、次にカバーガラスをのせた。スライス当たり３つの視野の平均を使用して、単位面積当たりの陽性染色細胞の数として腫瘍増殖を定量化した。
【0093】
ＴＵＮＥＬアッセイ。Ａｐｏｐｔａｇ（登録商標） Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（＃Ｓ７１００）用の製造者のプロトコールにしたがってＨｓ５７８ＴおよびＳＶＲ腫瘍からの切片をアポトーシス細胞について染色した。Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ（＃ＨＳ－２００、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ、ＵＳＡ）を用いて全ての切片を脱パラフィンした。以下の材料はＴＵＮＥＬキットには供給されておらず、別々に購入した：３０％の過酸化水素（＃５１５５－０１、Ｊ． Ｔ． Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ、ＵＳＡ）、プロテイナーゼＫ（＃２１６２７、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）、金属増強性ＤＡＢ基質キット（＃３４０６５、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）、安定ペルオキシダーゼ基質緩衝液１Ｘ（＃１８５５９１０、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）および１－ブタノール（＃Ｂ７９０８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）。各試料中で５つの視野を無作為に選択し、ＥＶＯＳ ＦＬｃ顕微鏡（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して写真撮影した。各視野において、アポトーシス核／ＨＰＦの数として腫瘍アポトーシスを定量化した。
【0094】
フローサイトメトリー。ＣＤ３８表面発現についての染色は、尾静脈中のＲＦ４２０骨肉腫注射を伴う実験からの脾臓細胞をラット抗ＣＤ３８－ＰＥ抗体（１：２００；＃１０２７０７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）と共にＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中０．１％のＢＳＡ）中４℃で３０分間インキュベートすることにより行った。ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａでＣＤ３８平均蛍光強度（ＭＦＩ）レベルについて試料をスクリーニングし、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、ＯＲ）を用いて解析した。
【0095】
統計。インビトロアッセイのために、両側スチューデントｔ検定を使用してＩｇＧ１およびｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂ処理の間の統計的差異を算出し、ｐ≦０．０５を有意であると考えた。血管肉腫におけるインビボ腫瘍研究（処置を腫瘍接種の後の日に開始した）のために、両側スチューデントｔ検定を使用した。腫瘍が触知可能である３０日目に処置を開始したＨｓ５７８Ｔについて、３４～８２日目からの腫瘍体積を各群のベースライン（３０日目）腫瘍体積で割ることにより、データを正規化してベースライン腫瘍体積における差異について調整した。各時点のために２サンプルｔ検定を使用し、処置および対照動物の間で腫瘍体積を比較した。ｔ検定についての正規性仮定を満たすために、正規化された腫瘍体積をｌｏｇ変換する。骨肉腫研究における多重比較のために、本発明者らは、負二項一般化線形モデル（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｉｎｏｍｉａｌ ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌ；ＮＢＧＬＭ）を使用して処置群の関数としてマクロ転移性病変の数をモデル化した。処置群比較は、モデルベースの線形コントラストを使用して行った。全ての解析はＲバージョン３．２．３を使用して行った。本発明者らは、ＩｇＧ１、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂおよびニボルマブをｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂおよびニボルマブの組合せに対して比較する発生率比（ＩＲＲ）および対応する９５％信頼区画（ＣＩ）を要約した。本発明者らは、併用療法は単剤療法と比べてマクロ転移性病変の発生を低減することを想定し、したがって、処置（ＩｇＧ１、ｈＳＦＲＰ２ ｍＡｂまたはニボルマブ）が分母に現れるＩＲＲを構築して、単剤と比べた併用療法の影響力の解釈を促した。
【0096】
（参考文献）
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【表5】
【0097】
本発明は、上記の本発明の特定の実施形態に限定されず、特定の実施形態の変形を行うことができ、それは依然として添付の請求項の範囲内に入ることが理解されるべきである。
【0098】
本発明は、以下の番号付けられたパラグラフにより、限定されることなく、さらに記載される：
１．治療有効量のＳＦＲＰ２アンタゴニスト、ＣＤ３８アンタゴニスト、および／またはＰＤ－１アンタゴニストならびに治療有効量のＰＤ－１アンタゴニストを含む、薬学的組合せ。
２．前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストが、
ａ．特異的にＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１受容体に結合してその活性化を阻害する抗体、もしくは抗体の抗原結合断片、または
ｂ．特異的にＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１リガンドに結合して前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１リガンドの前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１受容体への結合を阻害する可溶性形態のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１受容体
である、パラグラフ１に記載の薬学的組合せ。
３．前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストがＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、パラグラフ１～２のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
４．前記ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体がヒトまたはヒト化抗体である、パラグラフ３に記載の薬学的組合せ。
５．前記ＰＤ－１アンタゴニストが、
ａ．特異的にＰＤ－１受容体に結合してその活性化を阻害する抗体、もしくは抗体の抗原結合断片、または
ｂ．特異的にＰＤ－１リガンドに結合して前記ＰＤ－１リガンドの前記ＰＤ－１受容体への結合を阻害する可溶性形態のＰＤ－１受容体
である、パラグラフ１～４のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
６．前記ＰＤ－１アンタゴニストが前記可溶性形態のＰＤ－１受容体であり、かつ前記ＰＤ－１リガンドがＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２である、パラグラフ５に記載の薬学的組合せ。
７．前記ＰＤ－１アンタゴニストがＰＤ－１モノクローナル抗体である、パラグラフ１～５のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
８．前記ＰＤ－１アンタゴニストがニボルマブである、パラグラフ１～５のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
９．前記ＰＤ－１アンタゴニストがペムブロリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、またはアテゾリズマブである、パラグラフ１～５のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
１０．ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストの前記治療有効量が０．１ｍｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重である、パラグラフ１～９のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
１１．ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストの前記治療有効量が０．２～３、０．２７～２．７０、０．２７、０．５４、１．３５、または２．７０ｍｇ／ｋｇ体重である、パラグラフ１～９のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
１２．ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストの前記治療有効量が１０ｍｇ～２００ｍｇ、１７ｍｇ、３３ｍｇ、８４ｍｇ、または１６７ｍｇである、パラグラフ１～１１のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
１３．ＰＤ－１アンタゴニストの前記治療有効量が０．１ｍｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重である、パラグラフ１～１２のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
１４．ＰＤ－１アンタゴニストの前記治療有効量が０．０２～１．２、０．０２７～１．０８、０．０２７または１．０８ｍｇ／ｋｇ体重である、パラグラフ１～１２のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
１５．ＰＤ－１アンタゴニストの前記治療有効量が１～８０、１．６～６７、１．６または６７ｍｇ／ｋｇ体重である、パラグラフ１～１４のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
１６．がんの治療方法であって、治療有効量のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストならびに治療有効量のＰＤ－１アンタゴニストをそれを必要とする対象に投与することを含む、方法。
１７．前記投与が同時または逐次的なものである、パラグラフ１６に記載の方法。
１８．前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストが、
ａ．特異的にＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１受容体に結合してその活性化を阻害する抗体、もしくは抗体の抗原結合断片、または
ｂ．特異的にＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１リガンドに結合して前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１リガンドの前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１受容体への結合を阻害する可溶性形態のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１受容体
である、パラグラフ１６または１７に記載の方法。
１９．前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストがＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、パラグラフ１６～１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．前記ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体がヒトまたはヒト化抗体である、パラグラフ１９に記載の方法。
２１．前記ＰＤ－１アンタゴニストが、
ａ．特異的にＰＤ－１受容体に結合してその活性化を阻害する抗体、もしくは抗体の抗原結合断片、または
ｂ．特異的にＰＤ－１リガンドに結合して前記ＰＤ－１リガンドの前記ＰＤ－１受容体への結合を阻害する可溶性形態のＰＤ－１受容体
である、パラグラフ１６～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．前記ＰＤ－１アンタゴニストが前記可溶性形態の前記ＰＤ－１受容体であり、かつ前記ＰＤ－１リガンドがＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２である、パラグラフ２１に記載の方法。
２３．前記ＰＤ－１アンタゴニストがＰＤ－１モノクローナル抗体である、パラグラフ１６～２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．前記ＰＤ－１アンタゴニストがニボルマブである、パラグラフ１６～２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．前記ＰＤ－１アンタゴニストがペムブロリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、またはアテゾリズマブである、パラグラフ１６～２３のいずれか１つに記載の方法。
２６．前記がんが乳がんである、パラグラフ１６～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．前記がんが血管肉腫、肺がん、骨肉腫、黒色腫、非小細胞肺がん、または腎臓がんである、パラグラフ１６～２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストの前記投与が前記ＰＤ－１アンタゴニストの前記投与に先行する、パラグラフ１６～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．前記ＰＤ－１アンタゴニストの前記投与がＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストの前記投与に先行する、パラグラフ１６～２７のいずれか１つに記載の方法。
３０．前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストが前記ＰＤ－１アンタゴニストに付随して投与される、パラグラフ１６～２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．前記ＰＤ－１アンタゴニストが前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストに付随して投与される、パラグラフ１６～２９のいずれか１つに記載の方法。
３２．前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストが１日毎、１日１回より高い頻度または１日１回より低い頻度で投与される、パラグラフ１６～３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストが３日毎に１回、週毎に１回、２週毎に１回、３週毎に１回または４週毎に１回投与される、パラグラフ１６～３１のいずれか１つに記載の方法。
３４．前記ＰＤ－１アンタゴニストが１日毎、１日１回より高い頻度または１日１回より低い頻度で投与される、パラグラフ１６～３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．前記ＰＤ－１アンタゴニストが３日毎に１回、週毎に１回、２週毎に１回、３週毎に１回または４週毎に１回投与される、パラグラフ１６～３３のいずれか１つに記載の方法。
３６．前記ＰＤ－１アンタゴニストがニボルマブであり、かつ前記対象に投与される前記ニボルマブの量が３週毎の３ｍｇ／ｋｇ体重、２週毎の２４０ｍｇまたは４週毎の４８０ｍｇである、パラグラフ１６～３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．前記ＰＤ－１アンタゴニストがペムブロリズマブであり、かつ前記対象に投与される前記ペムブロリズマブの量が３週毎の２００ｍｇである、パラグラフ１６～３５のいずれか１つに記載の方法。
３８．前記ＰＤ－１アンタゴニストがアベルマブであり、かつ前記対象に投与される前記アベルマブの量が２週毎の８００ｍｇである、パラグラフ１６～３５のいずれか１つに記載の方法。
３９．前記ＰＤ－１アンタゴニストがデュルバルマブであり、かつ前記対象に投与される前記デュルバルマブの量が２週毎の１０ｍｇ／ｋｇ体重である、パラグラフ１６～３５のいずれか１つに記載の方法。
４０．前記ＰＤ－１アンタゴニストがセミプリマブであり、かつ前記対象に投与される前記セミプリマブの量が３週毎の２５０ｍｇである、パラグラフ１６～３５のいずれか１つに記載の方法。
４１．前記ＰＤ－１アンタゴニストがアテゾリズマブであり、かつ前記対象に投与される前記アテゾリズマブの量が２週毎の８４０ｍｇ、３週毎の１２００ｍｇまたは４週毎の１６８０ｍｇである、パラグラフ１６～３５のいずれか１つに記載の方法。
４２．前記対象が、ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニスト療法を開始する前にＰＤ－１アンタゴニスト療法を与えられている、パラグラフ１６～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．前記対象が、ＰＤ－１アンタゴニスト療法を開始する前にＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニスト療法を与えられている、パラグラフ１６～４１のいずれか１つに記載の方法。
４４．前記対象が、第２の療法を開始する前に第１の療法を少なくとも８週間、少なくとも１０週間、少なくとも２４週間、少なくとも２８週間、少なくとも４８週間または少なくとも５２週間与えられている、パラグラフ４２または４３に記載の方法。
４５．前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１アンタゴニストならびに／または前記ＰＤ－１アンタゴニストの周期投与が少なくとも３日間、少なくとも３０日間、少なくとも４２日間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、少なくとも２４週間または少なくとも６か月間継続される、パラグラフ１６～４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．単独で摂取される場合のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストの量のそれぞれ、ならびに単独で摂取される場合のＰＤ－１アンタゴニストの量が、前記対象を治療するために有効なものである、パラグラフ１６～４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．単独で摂取される場合のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１アンタゴニストの量、単独で摂取される場合のＰＤ－１アンタゴニストの量、または単独で摂取される場合の各そのような量のいずれかが、前記対象を治療するために有効なものではない、パラグラフ１６～４５のいずれか１つに記載の方法。
４８．単独で摂取される場合のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１アンタゴニストの量、単独で摂取される場合のＰＤ－１アンタゴニストの量、または単独で摂取される場合の各そのような量のいずれかが、前記対象を治療するのに有効性が低い、パラグラフ１６～４５のいずれか１つに記載の方法。
４９．前記対象がヒト患者である、パラグラフ１６～４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．前記患者が、前記併用療法を与えられる前にＰＤ－１アンタゴニスト療法を以前に与えられ、かつＰＤ－１アンタゴニスト療法を与えることを中止された患者である、パラグラフ１６～４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．前記患者が以前にＰＤ－１アンタゴニスト療法に応答しなかったか、またはＰＤ－１アンタゴニスト単剤療法の前記投与が前記対象の治療に失敗した、パラグラフ１６～５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．がんを患う患者を治療するためのキットであって、治療有効量のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニスト、治療有効量のＰＤ－１アンタゴニスト、ならびに前記キットの使用のための指示を含む挿入物を含む、キット。
５３．ある量のＰＤ－１アンタゴニスト、ならびにある量のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストを含む、医薬組成物。
５４．ある量のＰＤ－１アンタゴニスト、ならびにある量のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストを本質的に含む、パラグラフ５３に記載の医薬組成物。
５５．がんに罹患した対象の治療において使用するための、前記量の前記ＰＤ－１アンタゴニスト、ならびにある量（ａｎ ａｍｏｕｎｔ）の前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストが同時に、同期間にまたは随伴的に投与される、パラグラフ５３または５４に記載の医薬組成物。
５６．がんに罹患した対象への分注のため、または前記分注における使用のための、治療用パッケージであって、ａ）１つまたは複数の単位用量であって、各そのような単位用量が、ｉ）ある量のＰＤ－１アンタゴニストおよびｉｉ）ある量のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストを含み、前記単位用量中の前記ＰＤ－１アンタゴニストおよび前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストの前記各々の量が、前記対象への随伴的な投与において、前記対象を治療するために有効なものである、前記単位用量、ならびにｂ）そのための仕上げられた薬学的容器であって、前記容器が、前記１つまたは複数の単位用量を含有し、前記容器が、前記対象の前記治療における前記パッケージの使用を指示するラベリングをさらに含有するかまたは含む、前記容器を含む、前記パッケージ。
５７．がんに罹患した対象の治療においてＰＤ－１アンタゴニストとのアドオン療法としてまたはそれと組み合わせて使用するための、ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニスト。
５８．がんに罹患した対象の治療においてＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストとのアドオン療法としてまたはそれと組み合わせて使用するための、ＰＤ－１アンタゴニスト。
５９．がんに罹患した対象を治療するための組合せの調製におけるある量のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニスト、ならびにある量のＰＤ－１アンタゴニストの使用であって、前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストならびに前記ＰＤ－１アンタゴニストが、同時に、同期間にまたは随伴的に投与されるために調製される、使用。
６０．医薬の製造において使用するための、ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストならびにＰＤ－１アンタゴニストの組合せ。
６１．前記医薬ががんの治療、予防、またはその症状の緩和のためのものである、パラグラフ６０に記載の組合せ。
６２．がんの治療方法であって、治療有効量のＳＦＲＰ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）をそれを必要とする対象に投与することを含み、前記対象がＣＤ３８および／またはＰＤ－１の増加した発現を有する、方法。
６３．前記対象のＴ細胞がＣＤ３８および／またはＰＤ－１の増加した発現を有する、パラグラフ６２に記載の方法。
６４．前記ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体がヒトまたはヒト化抗体である、パラグラフ６２または６３に記載の方法。
６５．前記がんが乳がんである、パラグラフ６２～６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．前記がんが血管肉腫、肺がん、骨肉腫、黒色腫、非小細胞肺がん、または腎臓がんである、パラグラフ６２～６４のいずれか１つに記載の方法。
６７．前記ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体が１日毎、１日１回より高い頻度または１日１回より低い頻度で投与される、パラグラフ６２～６６のいずれか１つに記載の方法。
６８．前記ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体が３日毎に１回、週毎に１回、２週毎に１回、３週毎に１回または４週毎に１回投与される、パラグラフ６２～６７のいずれか１つに記載の方法。
６９．前記ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体の周期投与が少なくとも３日間、少なくとも３０日間、少なくとも４２日間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、少なくとも２４週間または少なくとも６か月間継続される、パラグラフ６２～６７のいずれか１つに記載の方法。
７０．前記対象がヒト患者である、パラグラフ６２～６９のいずれか１つに記載の方法。
１．治療有効量のＳＦＲＰ２アンタゴニスト、ＣＤ３８アンタゴニスト、および／またはＰＤ－１アンタゴニストならびに治療有効量のＰＤ－１アンタゴニストを含む、薬学的組合せ。
２．前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストが、
ａ．特異的にＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１受容体に結合してその活性化を阻害する抗体、もしくは抗体の抗原結合断片、または
ｂ．特異的にＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１リガンドに結合して前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１リガンドの前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１受容体への結合を阻害する可溶性形態のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１受容体
である、パラグラフ１に記載の薬学的組合せ。
３．前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストがＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、パラグラフ１～２のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
４．前記ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体がヒトまたはヒト化抗体である、パラグラフ３に記載の薬学的組合せ。
５．前記ＰＤ－１アンタゴニストが、
ａ．特異的にＰＤ－１受容体に結合してその活性化を阻害する抗体、もしくは抗体の抗原結合断片、または
ｂ．特異的にＰＤ－１リガンドに結合して前記ＰＤ－１リガンドの前記ＰＤ－１受容体への結合を阻害する可溶性形態のＰＤ－１受容体
である、パラグラフ１～４のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
６．前記ＰＤ－１アンタゴニストが前記可溶性形態のＰＤ－１受容体であり、かつ前記ＰＤ－１リガンドがＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２である、パラグラフ５に記載の薬学的組合せ。
７．前記ＰＤ－１アンタゴニストがＰＤ－１モノクローナル抗体である、パラグラフ１～５のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
８．前記ＰＤ－１アンタゴニストがニボルマブである、パラグラフ１～５のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
９．前記ＰＤ－１アンタゴニストがペムブロリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、またはアテゾリズマブである、パラグラフ１～５のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
１０．ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストの前記治療有効量が０．１ｍｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重である、パラグラフ１～９のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
１１．ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストの前記治療有効量が０．２～３、０．２７～２．７０、０．２７、０．５４、１．３５、または２．７０ｍｇ／ｋｇ体重である、パラグラフ１～９のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
１２．ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストの前記治療有効量が１０ｍｇ～２００ｍｇ、１７ｍｇ、３３ｍｇ、８４ｍｇ、または１６７ｍｇである、パラグラフ１～１１のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
１３．ＰＤ－１アンタゴニストの前記治療有効量が０．１ｍｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重である、パラグラフ１～１２のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
１４．ＰＤ－１アンタゴニストの前記治療有効量が０．０２～１．２、０．０２７～１．０８、０．０２７または１．０８ｍｇ／ｋｇ体重である、パラグラフ１～１２のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
１５．ＰＤ－１アンタゴニストの前記治療有効量が１～８０、１．６～６７、１．６または６７ｍｇ／ｋｇ体重である、パラグラフ１～１４のいずれか１つに記載の薬学的組合せ。
１６．がんの治療方法であって、治療有効量のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストならびに治療有効量のＰＤ－１アンタゴニストをそれを必要とする対象に投与することを含む、方法。
１７．前記投与が同時または逐次的なものである、パラグラフ１６に記載の方法。
１８．前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストが、
ａ．特異的にＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１受容体に結合してその活性化を阻害する抗体、もしくは抗体の抗原結合断片、または
ｂ．特異的にＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１リガンドに結合して前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１リガンドの前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１受容体への結合を阻害する可溶性形態のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１受容体
である、パラグラフ１６または１７に記載の方法。
１９．前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストがＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、パラグラフ１６～１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．前記ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体がヒトまたはヒト化抗体である、パラグラフ１９に記載の方法。
２１．前記ＰＤ－１アンタゴニストが、
ａ．特異的にＰＤ－１受容体に結合してその活性化を阻害する抗体、もしくは抗体の抗原結合断片、または
ｂ．特異的にＰＤ－１リガンドに結合して前記ＰＤ－１リガンドの前記ＰＤ－１受容体への結合を阻害する可溶性形態のＰＤ－１受容体
である、パラグラフ１６～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．前記ＰＤ－１アンタゴニストが前記可溶性形態の前記ＰＤ－１受容体であり、かつ前記ＰＤ－１リガンドがＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２である、パラグラフ２１に記載の方法。
２３．前記ＰＤ－１アンタゴニストがＰＤ－１モノクローナル抗体である、パラグラフ１６～２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．前記ＰＤ－１アンタゴニストがニボルマブである、パラグラフ１６～２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．前記ＰＤ－１アンタゴニストがペムブロリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、またはアテゾリズマブである、パラグラフ１６～２３のいずれか１つに記載の方法。
２６．前記がんが乳がんである、パラグラフ１６～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．前記がんが血管肉腫、肺がん、骨肉腫、黒色腫、非小細胞肺がん、または腎臓がんである、パラグラフ１６～２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストの前記投与が前記ＰＤ－１アンタゴニストの前記投与に先行する、パラグラフ１６～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．前記ＰＤ－１アンタゴニストの前記投与がＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストの前記投与に先行する、パラグラフ１６～２７のいずれか１つに記載の方法。
３０．前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストが前記ＰＤ－１アンタゴニストに付随して投与される、パラグラフ１６～２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．前記ＰＤ－１アンタゴニストが前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストに付随して投与される、パラグラフ１６～２９のいずれか１つに記載の方法。
３２．前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストが１日毎、１日１回より高い頻度または１日１回より低い頻度で投与される、パラグラフ１６～３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストが３日毎に１回、週毎に１回、２週毎に１回、３週毎に１回または４週毎に１回投与される、パラグラフ１６～３１のいずれか１つに記載の方法。
３４．前記ＰＤ－１アンタゴニストが１日毎、１日１回より高い頻度または１日１回より低い頻度で投与される、パラグラフ１６～３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．前記ＰＤ－１アンタゴニストが３日毎に１回、週毎に１回、２週毎に１回、３週毎に１回または４週毎に１回投与される、パラグラフ１６～３３のいずれか１つに記載の方法。
３６．前記ＰＤ－１アンタゴニストがニボルマブであり、かつ前記対象に投与される前記ニボルマブの量が３週毎の３ｍｇ／ｋｇ体重、２週毎の２４０ｍｇまたは４週毎の４８０ｍｇである、パラグラフ１６～３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．前記ＰＤ－１アンタゴニストがペムブロリズマブであり、かつ前記対象に投与される前記ペムブロリズマブの量が３週毎の２００ｍｇである、パラグラフ１６～３５のいずれか１つに記載の方法。
３８．前記ＰＤ－１アンタゴニストがアベルマブであり、かつ前記対象に投与される前記アベルマブの量が２週毎の８００ｍｇである、パラグラフ１６～３５のいずれか１つに記載の方法。
３９．前記ＰＤ－１アンタゴニストがデュルバルマブであり、かつ前記対象に投与される前記デュルバルマブの量が２週毎の１０ｍｇ／ｋｇ体重である、パラグラフ１６～３５のいずれか１つに記載の方法。
４０．前記ＰＤ－１アンタゴニストがセミプリマブであり、かつ前記対象に投与される前記セミプリマブの量が３週毎の２５０ｍｇである、パラグラフ１６～３５のいずれか１つに記載の方法。
４１．前記ＰＤ－１アンタゴニストがアテゾリズマブであり、かつ前記対象に投与される前記アテゾリズマブの量が２週毎の８４０ｍｇ、３週毎の１２００ｍｇまたは４週毎の１６８０ｍｇである、パラグラフ１６～３５のいずれか１つに記載の方法。
４２．前記対象が、ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニスト療法を開始する前にＰＤ－１アンタゴニスト療法を与えられている、パラグラフ１６～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．前記対象が、ＰＤ－１アンタゴニスト療法を開始する前にＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニスト療法を与えられている、パラグラフ１６～４１のいずれか１つに記載の方法。
４４．前記対象が、第２の療法を開始する前に第１の療法を少なくとも８週間、少なくとも１０週間、少なくとも２４週間、少なくとも２８週間、少なくとも４８週間または少なくとも５２週間与えられている、パラグラフ４２または４３に記載の方法。
４５．前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１アンタゴニストならびに／または前記ＰＤ－１アンタゴニストの周期投与が少なくとも３日間、少なくとも３０日間、少なくとも４２日間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、少なくとも２４週間または少なくとも６か月間継続される、パラグラフ１６～４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．単独で摂取される場合のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストの量のそれぞれ、ならびに単独で摂取される場合のＰＤ－１アンタゴニストの量が、前記対象を治療するために有効なものである、パラグラフ１６～４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．単独で摂取される場合のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１アンタゴニストの量、単独で摂取される場合のＰＤ－１アンタゴニストの量、または単独で摂取される場合の各そのような量のいずれかが、前記対象を治療するために有効なものではない、パラグラフ１６～４５のいずれか１つに記載の方法。
４８．単独で摂取される場合のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／もしくはＰＤ－１アンタゴニストの量、単独で摂取される場合のＰＤ－１アンタゴニストの量、または単独で摂取される場合の各そのような量のいずれかが、前記対象を治療するのに有効性が低い、パラグラフ１６～４５のいずれか１つに記載の方法。
４９．前記対象がヒト患者である、パラグラフ１６～４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．前記患者が、前記併用療法を与えられる前にＰＤ－１アンタゴニスト療法を以前に与えられ、かつＰＤ－１アンタゴニスト療法を与えることを中止された患者である、パラグラフ１６～４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．前記患者が以前にＰＤ－１アンタゴニスト療法に応答しなかったか、またはＰＤ－１アンタゴニスト単剤療法の前記投与が前記対象の治療に失敗した、パラグラフ１６～５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．がんを患う患者を治療するためのキットであって、治療有効量のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニスト、治療有効量のＰＤ－１アンタゴニスト、ならびに前記キットの使用のための指示を含む挿入物を含む、キット。
５３．ある量のＰＤ－１アンタゴニスト、ならびにある量のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストを含む、医薬組成物。
５４．ある量のＰＤ－１アンタゴニスト、ならびにある量のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストを本質的に含む、パラグラフ５３に記載の医薬組成物。
５５．がんに罹患した対象の治療において使用するための、前記量の前記ＰＤ－１アンタゴニスト、ならびにある量（ａｎ ａｍｏｕｎｔ）の前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストが同時に、同期間にまたは随伴的に投与される、パラグラフ５３または５４に記載の医薬組成物。
５６．がんに罹患した対象への分注のため、または前記分注における使用のための、治療用パッケージであって、ａ）１つまたは複数の単位用量であって、各そのような単位用量が、ｉ）ある量のＰＤ－１アンタゴニストおよびｉｉ）ある量のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストを含み、前記単位用量中の前記ＰＤ－１アンタゴニストおよび前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストの前記各々の量が、前記対象への随伴的な投与において、前記対象を治療するために有効なものである、前記単位用量、ならびにｂ）そのための仕上げられた薬学的容器であって、前記容器が、前記１つまたは複数の単位用量を含有し、前記容器が、前記対象の前記治療における前記パッケージの使用を指示するラベリングをさらに含有するかまたは含む、前記容器を含む、前記パッケージ。
５７．がんに罹患した対象の治療においてＰＤ－１アンタゴニストとのアドオン療法としてまたはそれと組み合わせて使用するための、ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニスト。
５８．がんに罹患した対象の治療においてＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストとのアドオン療法としてまたはそれと組み合わせて使用するための、ＰＤ－１アンタゴニスト。
５９．がんに罹患した対象を治療するための組合せの調製におけるある量のＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニスト、ならびにある量のＰＤ－１アンタゴニストの使用であって、前記ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストならびに前記ＰＤ－１アンタゴニストが、同時に、同期間にまたは随伴的に投与されるために調製される、使用。
６０．医薬の製造において使用するための、ＳＦＲＰ２、ＣＤ３８、および／またはＰＤ－１アンタゴニストならびにＰＤ－１アンタゴニストの組合せ。
６１．前記医薬ががんの治療、予防、またはその症状の緩和のためのものである、パラグラフ６０に記載の組合せ。
６２．がんの治療方法であって、治療有効量のＳＦＲＰ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）をそれを必要とする対象に投与することを含み、前記対象がＣＤ３８および／またはＰＤ－１の増加した発現を有する、方法。
６３．前記対象のＴ細胞がＣＤ３８および／またはＰＤ－１の増加した発現を有する、パラグラフ６２に記載の方法。
６４．前記ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体がヒトまたはヒト化抗体である、パラグラフ６２または６３に記載の方法。
６５．前記がんが乳がんである、パラグラフ６２～６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．前記がんが血管肉腫、肺がん、骨肉腫、黒色腫、非小細胞肺がん、または腎臓がんである、パラグラフ６２～６４のいずれか１つに記載の方法。
６７．前記ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体が１日毎、１日１回より高い頻度または１日１回より低い頻度で投与される、パラグラフ６２～６６のいずれか１つに記載の方法。
６８．前記ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体が３日毎に１回、週毎に１回、２週毎に１回、３週毎に１回または４週毎に１回投与される、パラグラフ６２～６７のいずれか１つに記載の方法。
６９．前記ＳＦＲＰ２モノクローナル抗体の周期投与が少なくとも３日間、少なくとも３０日間、少なくとも４２日間、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、少なくとも２４週間または少なくとも６か月間継続される、パラグラフ６２～６７のいずれか１つに記載の方法。
７０．前記対象がヒト患者である、パラグラフ６２～６９のいずれか１つに記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
