特許 7452829 アミロイドベータのエピトープおよびそれに対する抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-11

(45)【発行日】2024-03-19

(54)【発明の名称】アミロイドベータのエピトープおよびそれに対する抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/64 20060101AFI20240312BHJP

   A61K 38/12 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240312BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240312BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240312BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240312BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240312BHJP

【ＦＩ】

C07K7/64 ZNA

A61K38/12

A61K39/00 H

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61P25/28

C07K16/18

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/13

C12P21/08

G01N33/53 D

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2018522803

(86)(22)【出願日】2016-11-09

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-02-21

(86)【国際出願番号】 CA2016051305

(87)【国際公開番号】W WO2017079835

(87)【国際公開日】2017-05-18

【審査請求日】2019-11-08

【審判番号】

【審判請求日】2022-01-06

(31)【優先権主張番号】62/253,044

(32)【優先日】2015-11-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/289,893

(32)【優先日】2016-02-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/365,634

(32)【優先日】2016-07-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/393,615

(32)【優先日】2016-09-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】300066874

【氏名又は名称】ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】キャッシュマン，ニール アール．

(72)【発明者】

【氏名】プロトキン，スティーブン エス．

【合議体】

【審判長】長井 啓子

【審判官】中根 知大

【審判官】高堀 栄二

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１１－５２２８４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１１－５２２８４２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５３８７９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００７－５２７８６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１４／０８９１４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｕｌｙ １１， ２０１２， Ｖｏｌ．３２， Ｎｏ．２８， ｐ．９６７７－９６８９

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

C12N 15/00-15/90

C07K 1/00-19/00

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０／ＪＭＥＤＰｌｕｓ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＱＫＬＶ（配列番号１）からなるＡベータペプチドと、リンカーとからなる環状化合物であって、前記リンカーが、前記ＡベータペプチドのＮ末端残基および前記ＡベータのＣ末端残基と共有結合したアミノ酸ＧＣＧからなる、環状化合物。

【請求項2】

請求項１に記載の環状化合物を含む免疫原。

【請求項3】

前記環状化合物が、担体タンパク質または免疫原性増強物質と結合している、請求項２に記載の免疫原。

【請求項4】

前記担体タンパク質が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であるか、または前記免疫原性増強物質がキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である、請求項３に記載の免疫原。

【請求項5】

Ａベータモノマーおよび／またはＡベータ線維よりもＡベータオリゴマーのＱＫＬＶ（配列番号１）と特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、

【化1】

を含む、抗体。

【請求項6】

前記抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項５に記載の抗体。

【請求項7】

前記抗体は、ヒト化抗体またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディおよびその多量体から選択される抗体結合フラグメントである、請求項５または６に記載の抗体。

【請求項8】

前記抗体は、Ｉ）ｉ）配列番号１８で示されるアミノ酸配列；もしくはｉｉ）配列番号１８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲの配列が、配列番号１１、１２、および１３で示される配列である、アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつ
ｉ）配列番号２０で示されるアミノ酸配列；もしくはｉｉ）配列番号２０と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲの配列が、配列番号１４、１５、および１６で示される配列である、アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、または、
ＩＩ）ｉ）配列番号２８で示されるアミノ酸配列；もしくはｉｉ）配列番号２８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲの配列が、配列番号２１、２２、および２３で示される配列である、アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつ
ｉ）配列番号３０で示されるアミノ酸配列；もしくはｉｉ）配列番号３０と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ＣＤＲの配列が、配列番号２４、２５、および２６で示される配列である、アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
請求項５～７のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項9】

前記重鎖可変領域が、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含む、もしくはこれよりなり、かつ前記軽鎖可変領域が、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む、もしくはこれよりなり、または
前記重鎖可変領域が、配列番号２８で示されるアミノ酸配列を含む、もしくはこれよりなり、かつ前記軽鎖可変領域が、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を含む、もしくはこれよりなる、
請求項５～８のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項10】

請求項５～９のいずれか１項に記載の抗体と、検出可能な標識または細胞毒性物質とを含む、イムノコンジュゲート。

【請求項11】

請求項５～９のいずれか１項に記載の抗体、または請求項１０に記載のタンパク質性のイムノコンジュゲートをコードする、核酸分子か、または前記核酸分子はベクターに含まれる、核酸分子。

【請求項12】

請求項５～９のいずれか１項に記載の抗体を発現する細胞。

【請求項13】

請求項１に記載の環状化合物、請求項２～４のいずれか１項に記載の免疫原、請求項５～９のいずれか１項に記載の抗体、請求項１０に記載のイムノコンジュゲート、請求項１１に記載の核酸、または請求項１２に記載の細胞を含む、組成物。

【請求項14】

請求項１に記載の環状化合物、請求項２～４のいずれか１項に記載の免疫原、請求項１３に記載の組成物、請求項５～９のいずれか１項に記載の抗体、請求項１０に記載のイムノコンジュゲート、請求項１１に記載の核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、または請求項１２に記載の細胞を含む、キット。

【請求項15】

生体試料がＡベータを含むかどうかを判定する方法であって、
前記方法は、
ａ．前記生体試料と、請求項５～９のいずれか１項に記載の抗体または請求項１０に記載のイムノコンジュゲートとを接触させることと、及び
ｂ．何らかの抗体複合体の存在を検出すること、を含む、方法。

【請求項16】

Ａベータオリゴマーの伝播の阻害に使用するための、またはアルツハイマー病および／または他のＡベータアミロイド関連疾患を有する対象を治療するのに使用するための、
１）請求項５～９のいずれか１項に記載の抗体もしくは請求項１０に記載のイムノコンジュゲート、または前記抗体もしくはイムノコンジュゲートを含む医薬組成物、
２）請求項２～４のいずれか１項に記載の免疫原または前記免疫原を含む医薬組成物、または
３）１）の抗体をコードする核酸または前記核酸を含むベクター。

【請求項17】

請求項５～９のいずれか１項に記載の抗体を用いて、治療される対象由来の生体試料がＡベータの有無またはレベルについて評価されている、請求項１６に記載の抗体、イムノコンジュゲート、免疫原、医薬組成物、核酸またはベクター。

【請求項18】

前記抗体、前記イムノコンジュゲート、前記免疫原、前記医薬組成物、前記核酸、または前記ベクターを脳または中枢神経系の他の部分に直接投与する、請求項１６または１７に記載の抗体、イムノコンジュゲート、免疫原、医薬組成物、核酸またはベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願）
これは２０１５年１１月９日に出願された米国特許出願第６２／２５３０４４号、２０１６年２月１日に出願された米国特許出願第６２／２８９，８９３号、２０１６年７月２２日に出願された米国特許出願第６２／３６５，６３４号および２０１６年９月１２日に出願された米国特許出願第６２／３９３，６１５号の優先権の利益を主張するＰＣＴ出願であり、上記の出願はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

（分野）
本開示は、アミロイドベータ（ＡベータまたはＡβ）エピトープおよびそれに対する抗体、より具体的には、Ａベータオリゴマー内で選択的に接触可能であると予測されている立体配座Ａベータエピトープ、関連する抗体組成物、およびそれらの用途に関する。

【背景技術】

【0003】

（背景）
３６～４３アミノ酸のペプチドとして存在するアミロイドベータ（Ａベータ）は、酵素であるβセクレターゼおよびγセクレターゼによってアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から放出される産物である。ＡＤ患者では、Ａベータは可溶性モノマー、不溶性線維および可溶性オリゴマーの形で存在し得る。モノマー型のＡベータは、主として不定形のポリペプチド鎖として存在する。線維型のＡベータは、よく株と呼ばれる様々な形態に凝集することができる。これらの構造のうちのいくつかは固体ＮＭＲにより決定されている。

【0004】

例えば、原子分解三次元構造データの結晶学的データベースであるタンパク質データバンク（ＰＤＢ）では、３回対称性のＡβ構造（ＰＤＢエントリー２Ｍ４Ｊ）、Ａβ－４０モノマーの２回対称性構造（ＰＤＢエントリー２ＬＭＮ）およびＡβ－４２モノマーの一本鎖平行ｉｎ－ｒｅｇｉｓｔｅｒ構造（ＰＤＢエントリー２ＭＸＵ）を含めたいくつかの線維の株の構造が入手可能である。

【0005】

２Ｍ４Ｊの構造は、Ｊ．Ｘ． ＬＵ， Ｗ．ＱＩＡＮＧ， Ｗ．Ｍ．ＹＡＵ， Ｃ．Ｄ．ＳＣＨＷＩＥＴＥＲＳ， Ｓ．Ｃ． ＭＥＲＥＤＩＴＨ， Ｒ．ＴＹＣＫＯ， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＯＦ ＢＥＴＡ－ＡＭＹＬＯＩＤ ＦＩＢＲＩＬＳ ＩＮ ＡＬＺＨＥＩＭＥＲ’Ｓ ＤＩＳＥＡＳＥ ＢＲＡＩＮ ＴＩＳＳＵＥ． ＣＥＬＬ Ｖｏｌ． １５４ ｐ．１２５７ （２０１３）に報告されており、２ＭＸＵの構造は、Ｙ．ＸＩＡＯ， Ｂ．ＭＡ， Ｄ．ＭＣＥＬＨＥＮＹ， Ｓ．ＰＡＲＴＨＡＳＡＲＡＴＨＹ， Ｆ．ＬＯＮＧ， Ｍ．ＨＯＳＨＩ， Ｒ．ＮＵＳＳＩＮＯＶ， Ｙ．ＩＳＨＩＩ Ａ ＢＥＴＡ （１－４２） ＦＩＢＲＩＬ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＩＬＬＵＭＩＮＡＴＥＳ ＳＥＬＦ－ＲＥＣＯＧＮＩＴＩＯＮ ＡＮＤ ＲＥＰＬＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＡＭＹＬＯＩＤ ＩＮ ＡＬＺＨＥＩＭＥＲ’Ｓ ＤＩＳＥＡＳＥ． ＮＡＴ． ＳＴＲＵＣＴ． ＭＯＬ． ＢＩＯＬ． Ｖｏｌ． ２２ ｐ．４９９（２０１５）に報告されている。

【0006】

Ａベータオリゴマーは、培養した細胞系およびニューロンを死滅させ、脳スライス培養物および動物生体において記憶を促進し長期増強（ＬＴＰ）と呼ばれる極めて重要なシナプス活性を遮断することが示されている。

【0007】

これまでにオリゴマーの構造は決定されていない。さらに、ＮＭＲおよびその他の証拠から、オリゴマーが単一の明確に定められた構造ではなく、規則性に乏しく立体配座的に可塑性で順応性のある構造アンサンブルの形で存在することがわかっている。さらに、毒性オリゴマー種の濃度はモノマーまたは線維の濃度よりはるかに低い（推定値には幅があるが、約１０００分の１またはそれ以下である）ため、この標的は捉えどころのないものとなっている。

【0008】

米国特許第５，７６６，８４６号；同５，８３７，６７２号；および同５，５９３，８４６号（参照として本明細書中援用されている）は、Ａベータペプチドの中心的なドメインに対するマウスのモノクローナル抗体の生産を記載している。国際特許公開公報第０１／６２８０１号は、アミノ酸１３～２８の間でＡベータを結合する抗体を記載している。国際特許公開公報第２００４０７１４０８号は、ヒト化抗体を開示している。国際特許公開公報第２００８０８８９８３号は、アミロイドベータ（Ａベータ）ペプチドを結合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１つまたは複数と共有結合する抗体結合フラグメントを記載している。ここで抗体フラグメントは、アミノ酸１３～２８位の間でヒトのＡ－ベータペプチドを特異的に結合する。ソラネズマブおよびクレネズマブは、Ａベータのアミノ酸１６～２６を結合する。クレネズマブは、モノマー、オリゴマー、および線維と相互作用する。ソラネズマブ（ピコモル濃度の親和性）およびクレネズマブ（ナノモル濃度の親和性）を含む中間領域の抗体（Ｍｉｄｒｅｇｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、優先的にモノマーのＡベータと結合すると思われている［１］。

【0009】

Ａベータオリゴマーと優先的または選択的と結合する抗体が望ましい。

【発明の概要】

【0010】

本明細書には、残基ＱＫＬＶ（配列番号１）よりなるＡベータのエピトープ、任意に立体配座エピトープまたはその一部、ならびにそれらに対する抗体が記載される。エピトープは、モノマーのものと区別がつく立体配座のＡベータのオリゴマー種において選択的に露出されると同定されている。

【0011】

一態様は、ＱＫＬおよび最大８、７、または６個のＡベータの残基を含むＡベータペプチドと、リンカーとを含み、リンカーが、ＡベータペプチドのＮ末端残基およびＡベータのＣ末端残基と共有結合している、化合物、好ましくは環状化合物を含む。

【0012】

一実施形態では、Ａベータペプチドは、任意選択でＱＫＬＶ（配列番号１）、ＨＱＫＬＶ（配列番号２）、ＨＱＫＬＶＦ（配列番号９）、およびＱＫＬＶＦ（配列番号１０）から選択される、配列番号１～１０のいずれか１つの配列を有するペプチドから選択される。

【0013】

別の実施形態では、環状化合物は環状ペプチドである。

【0014】

別の実施形態では、環状化合物は、ｉ）少なくとも、対応する直鎖状化合物におけるＱと比較して別の立体配座のＱ；および／またはｉｉ）対応する直鎖状化合物と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％強く拘束された、エントロピーにより測定されたＱ、および／またはＫ、および／またはＬの立体配座を含む。

【0015】

別の実施形態では、Ａベータペプチドは、ＱＫＬＶ（配列番号１）である。

【0016】

別の実施形態では、化合物は、検出可能な標識をさらに含む。

【0017】

別の実施形態では、リンカーは、１～８個のアミノ酸および／またはこれと同等に機能する分子および／または１つもしくは複数の官能化可能な部分を含む、あるいはこれよりなる。

【0018】

別の実施形態では、リンカーのアミノ酸がＡおよびＧから選択され、かつ／または官能化可能な部分がＣである。

【0019】

別の実施形態では、リンカーは、アミノ酸ＧＣＧもしくはＣＧＣを含む、またはこれよりなる。

【0020】

別の実施形態では、リンカーはＰＥＧ分子を含む。

【0021】

別の実施形態では、環状化合物は、以下の構造

【化1】

【化2】

から選択される。

【0022】

一態様は、本明細書に記載される環状化合物を含む、免疫原を含む。

【0023】

一実施形態では、環状化合物は、担体タンパク質または免疫原性増強物質と結合している。

【0024】

一実施形態では、担体タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、または免疫原性増強物質がキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である。

【0025】

一態様は、本明細書に記載される化合物または本明細書に記載される免疫原を含む、組成物を含む。

【0026】

一実施形態では、本明細書に記載される組成物は、アジュバントをさらに含む。

【0027】

別の実施形態では、アジュバントはリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムである。

【0028】

一態様は、任意選択で配列番号１～１０のいずれか１つで示される配列ＱＫＬＶ（配列番号１）または関連エピトープ配列を有するＡベータペプチドに特異的と結合する、単離された抗体を含む。

【0029】

一実施形態では、抗体は、Ａベータ上のエピトープに特異的と結合し、エピトープは、抗体との結合に主として関与する少なくとも２個の連続するアミノ酸残基を含み、少なくとも２個の連続するアミノ酸は、ＱＫＬＶ（配列番号１）内に組み込まれたＱＫである。

【0030】

別の実施形態では、エピトープは、ＱＫＬＶ（配列番号１）、ＨＱＫＬＶ（配列番号２）、ＨＱＫＬＶＦ（配列番号９）、またはＱＫＬＶＦ（配列番号１０）を含む、またはこれよりなる。

【0031】

別の実施形態では、抗体は環状化合物内、任意選択で、本明細書に記載される環状化合物内、好ましくは配列番号３で示される配列を有する環状ペプチド内で提示されるＡＥＤＶまたは関連エピトープペプチドと特異的または選択的に結合する、立体配座に特異的かつ／または選択的な抗体である。

【0032】

別の実施形態では、抗体は、Ａベータモノマーおよび／またはＡベータ線維よりもＡベータオリゴマーに選択的と結合する。

【0033】

別の実施形態では、Ａベータオリゴマーに対する選択性は、Ａベータモノマーおよび／またはＡベータ線維の少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍選択的である。

【0034】

別の実施形態では、抗体は、配列ＱＫＬＶ（配列番号１）または関連エピトープを含む直鎖状ペプチドに特異的かつおよび／または選択的と結合することがなく、任意選択で、直鎖状ペプチドの配列は、抗体を生じさせるのに使用する環状化合物の直鎖型、任意選択で配列番号３で示される配列を有する直鎖状ペプチドである。

【0035】

別の実施形態では、抗体は、ｉｎ ｓｉｔｕでＡベータモノマー斑および／またはＡベータ線維斑と結合しない、またはほとんど結合しない。

【0036】

一実施形態では、抗体は、本明細書中記載される環状化合物、任意選択で本明細書中記載される環状ペプチドを使用して、産生されている。

【0037】

別の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。

【0038】

別の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。

【0039】

別の実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディおよびその多量体から選択される抗体結合フラグメントである。

【0040】

別の実施形態では、本明細書中記載される抗体は、任意選択で融合している軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は以下の配列を含む。

【化3】

【0041】

別の実施形態では、抗体は、ｉ）配列番号１８もしくは２８で示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号１８もしくは２８と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲの配列が配列番号１１、１２、１３、２１、２２および２３で示される、アミノ酸配列；またはｉｉｉ）保存的に置換されたアミノ酸配列ｉ）を含む重鎖可変領域を含む。

【0042】

別の実施形態では、抗体は、ｉ）配列番号２０もしくは３０で示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号２０もしくは３０と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲの配列が配列番号１４、１５、１６、２４、２５、および２６で示される、アミノ酸配列；またはｉｉｉ）保存的に置換されたｉ）のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。

【0043】

別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号１７または２７で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ；かつ／あるいは、抗体が、配列番号１９または２９で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。

【0044】

別の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号１８もしくは２８で示されるアミノ酸配列を含む、もしくはこれよりなり、かつ／または、軽鎖可変領域が、配列番号２０もしくは３０で示されるアミノ酸配列を含む、もしくはこれよりなる。

【0045】

別の実施形態では、抗体は、ヒトＡベータとの結合に関して、表６および／または８に記載されるＣＤＲ配列を含む抗体と競合する。

【0046】

一態様は、本明細書に記載される抗体と、検出可能な標識または細胞毒性物質とを含む、イムノコンジュゲートを含む。

【0047】

一実施形態では、検出可能な標識は、任意選択でＰＥＴ撮像などの対象の撮像に使用する、陽電子放出放射性核種を含む。

【0048】

一態様は、任意選択で希釈剤とともに、本明細書に記載される抗体を含む組成物または本明細書に記載されるイムノコンジュゲートを含む。

【0049】

一態様は、本明細書に記載される化合物もしくは免疫原のタンパク質性部分、本明細書に記載される抗体または本明細書に記載されるタンパク質性イムノコンジュゲートをコードする、核酸分子を含む。

【0050】

一態様は、本明細書に記載される核酸を含むベクターを含む。

【0051】

一態様は、本明細書に記載される抗体を発現する細胞を含み、任意選択で、細胞は、本明細書中記載されるベクターを含むハイブリドーマである。

【0052】

一態様は、本明細書に記載される化合物、本明細書に記載される免疫原、本明細書に記載される抗体、本明細書に記載されるイムノコンジュゲート、本明細書に記載される組成物、本明細書に記載される核酸分子、本明細書に記載されるベクターまたは本明細書に記載される細胞を含むキットを含む。

【0053】

一態様は、本明細書に記載される抗体を作製する方法であって、本明細書に記載される化合物もしくは免疫原または前記化合物もしくは免疫原を含む組成物を対象に投与することと、投与する化合物もしくは免疫原および／またはＡベータオリゴマーに特異的または選択的であり、任意選択で、Ａベータペプチドを含む直鎖状ペプチドと結合しない、もしくはほとんど結合せず、かつ／または斑と結合しない、もしくはほとんど結合しない、抗体および／または抗体を発現する細胞を単離することとを含む、方法を含む。

【0054】

一態様は、生体試料がＡベータを含むかどうかを判定する方法であって、
ａ．生体試料と、本明細書に記載される抗体または本明細書に記載されるイムノコンジュゲートとを接触させること；および
ｂ．何らかの抗体複合体の存在を検出すること
を含む、方法を含む。

【0055】

一実施形態では、生体試料がＡベータオリゴマーを含有し、上記方法が、
ａ．抗体：Ａベータオリゴマー複合体の形成が可能な条件下で、試料と、Ａベータオリゴマーに特異的かつ／または選択的な本明細書に記載される抗体または本明細書に記載されるイムノコンジュゲートとを接触させること；および
ｂ．何らかの複合体の存在を検出すること
を含み、
検出可能な複合体の存在により、試料がＡベータオリゴマーを含有し得ることが示される。

【0056】

別の実施形態では、複合体の量を測定する。

【0057】

別の実施形態では、試料は、脳組織もしくはその抽出物、全血、血漿、血清および／またはＣＳＦを含む。

【0058】

別の実施形態では、試料はヒト試料である。

【0059】

別の実施形態では、試料を対照、任意選択で以前の試料と比較する。

【0060】

別の実施形態では、ＳＰＲによりＡベータのレベルを検出する。

【0061】

一態様は、対象のＡベータのレベルを測定する方法であって、ＡＤを有するリスクもしくは疑いがある、またはＡＤを有する対象に、本明細書に記載される抗体を含み、抗体が検出可能な標識とコンジュゲートされているイムノコンジュゲートを投与すること；および標識を検出すること、任意選択で標識を定量的に検出することを含む、方法を含む。

【0062】

一実施形態では、標識は陽電子放出放射性核種である。

【0063】

一態様は、対象に免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に記載される化合物もしくは化合物の組合せ、任意選択で、ＱＫＬＶ（配列番号１）もしくは関連エピトープペプチド配列を含む環状化合物、免疫原および／または前記化合物もしくは前記免疫原を含む組成物を対象に投与すること；ならびに任意選択で、投与した化合物または免疫原中のＡベータペプチドと特異的または選択的に結合する細胞および／または抗体を単離することを含む、方法を含む。

【0064】

一態様は、Ａベータオリゴマー伝播を阻害する方法であって、有効量の本明細書に記載されるＡベータオリゴマーに特異的または選択的な抗体またはイムノコンジュゲートを、Ａベータを発現する細胞もしくは組織と接触させる、または必要とする対象に投与して、Ａベータの凝集および／またはオリゴマー伝播を阻害することを含む、方法を含む。

【0065】

一態様は、ＡＤおよび／またはその他のＡベータアミロイド関連疾患を治療する方法であって、必要とする対象にｉ）有効量の本明細書に記載される抗体またはイムノコンジュゲート、任意選択で、Ａベータオリゴマーに特異的もしくは選択的な抗体または前記抗体を含む医薬組成物を投与すること；２）ＱＫＬＶ（配列番号１）もしくは関連エピトープ配列を含む単離環状化合物または免疫原または前記環状化合物を含む医薬組成物あるいは３）１の抗体または２の免疫原をコードする核酸または核酸を含むベクターを、必要とする対象に投与することを含む、方法を含む。

【0066】

一実施形態では、本明細書に記載される抗体を用いて、治療する対象由来の生体試料をＡベータの有無またはレベルに関して評価する。

【0067】

別の実施形態では、２つ以上の抗体または免疫原を投与する。

【0068】

別の実施形態では、抗体、イムノコンジュゲート、免疫原、組成物または核酸もしくはベクターを脳またはＣＮＳの他の部分に直接投与する。

【0069】

別の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤または担体と混合した化合物または免疫原を含む、医薬組成物である。

【0070】

一態様は、配列番号１～１０で示される配列のいずれか１つの配列よりなるＡベータペプチドを含む、単離ペプチドを含む。

【0071】

一実施形態では、ペプチドは、リンカーを含み、リンカーがＡベータペプチドのＮ末端残基および／またはＡベータのＣ末端残基と共有結合している、環状ペプチドである。

【0072】

別の実施形態では、本明細書に記載される単離ペプチドは検出可能な標識を含む。

【0073】

一態様は、本明細書に記載される単離ペプチドをコードする核酸配列を含む。

【0074】

一態様は、本明細書に記載される抗体を発現するハイブリドーマを含む。

【0075】

以下の詳細な説明から本開示のその他の特徴と利点が明らかになるであろう。ただし、この詳細な説明から本開示の趣旨および範囲内に含まれる様々な変更および改変が当業者に明らかになることから、詳細な説明および具体例は、本開示の好ましい実施形態を示すと同時に、単に説明を目的として記載されるものであることが理解されるべきである。

【0076】

これより本開示の実施形態を図面と関連させて説明する。

【図面の簡単な説明】

【0077】

【図1】図１は、２Ｍ４Ｊの部分的なアンフォールディングを表す自由エネルギー地形のグラフである。

【図2】図２は、閾値が７ｋｃａｌ／ｍｏｌの、部分的にアンフォールディングしている２ＭＸＵの地形のグラフである。

【図3】図３は、残基インデックスの関数としての曲率を表す概略図である。長い矢印は、環状ペプチドを同定し、短い矢印は直鎖状ペプチドを同定している。

【図4】図４（ａ）は、残基Ｑ１５の側鎖の重原子を含むすべての二面角に関する二面角分布を示す一連のグラフであり、図４（ｂ）は、ＱＫＬＶ（配列番号１）を含む環状ペプチドの概略図である。

【図5】図５は、Ｋ１６の側鎖の重原子を含む角に関する二面角分布を示すグラフである。

【図6】図６は、Ｌ１７の側鎖の重原子を含む角に関する二面角分布を示すグラフである。

【図7】図７は、Ｖ１８の側鎖の重原子を含む角に関する二面角分布を示すグラフである。

【図8】図８は、集団座標の方法により決定された、配列の関数としての露出の可能性を示すグラフである。ピークは、中心の残基１７の周辺に現れている。

【図9】図９は、Ａベータ４２ペプチドに関する溶解度ｖｓ残基インデックスを示すグラフである。

【図10】図１０は、溶媒露出面積（ＳＡＳＡ）、重み付けＳＡＳＡ、

【数1】

の一連のプロットである。矢印は、各パネルで環状構造を同定している。

【図11】図１１は、残基ＱＫＬＶ（配列番号１）の側鎖に沿った重原子―水素部分のＳＡＳＡのプロットを示す。矢印は、各パネルで環状構造を同定している。

【図12-1】図１２は、ＱＫＬＶ（配列番号１）を含む一連の環状化合物を示す概略図である。

【図12-2】図１２は、ＱＫＬＶ（配列番号１）を含む一連の環状化合物を示す概略図である。

【図12-3】図１２は、ＱＫＬＶ（配列番号１）を含む一連の環状化合物を示す概略図である。

【図13】図１３は、線維における残基の対応するエントロピーと比較した、環状ペプチドのシクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）および直鎖状ペプチド（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）における各残基のエントロピーの変化を示すグラフである。

【図14】Ｑの側鎖におけるＣα―Ｃβ―Ｃγ―Ｃδの間の二面角が、環状ペプチドと直鎖状ペプチドとの間で異なることを示す概略図である。

【図15】組織培養上清のクローンのの表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）直接結合アッセイを示す図であり、パネルＡは環状ペプチドおよび直鎖状ペプチドに対するもの、パネルＢはＡベータオリゴマーおよびＡベータモノマーに対するものである。

【図16】組織培養上清のクローンの結合ををＳＰＲ直接結合アッセイとＥＬＩＳＡとで比較したプロット。

【図17】選択したクローンの環状ペプチド、直鎖状ペプチド、ＡベータモノマーおよびＡベータオリゴマーに対するＳＰＲ直接結合アッセイ。

【図18】６Ｅ１０陽性対照抗体（Ａ）およびシクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号２）に対して生じさせた選択かつ精製された抗体（３０５－６２，８Ｈ１０）（Ｂ）を用いた死体ＡＤ脳由来の斑の免疫組織化学染色を示す図である。

【図19】選択し精製した抗体に関するＳＰＲ間接（捕捉）結合アッセイを用いた二次スクリーニングを示す図である。Ａベータオリゴマーの捕捉抗体に対するＳＰＲ結合応答からＡベータモノマーの捕捉抗体に対する結合応答を差し引いたもの（丸）；ＡＤ患者からプールした可溶性脳抽出物（ＢＨ）の捕捉抗体に対するＳＰＲ結合応答から、非ＡＤ対照からプールした脳抽出物の捕捉抗体に対する結合応答を差し引いたもの（三角）；ＡＤ患者からプールした脳脊髄液（ＣＳＦ）の捕捉抗体に対するＳＰＲ結合応答から、非ＡＤ対照からプールしたＣＳＦの捕捉抗体に対する結合応答を差し引いたもの（四角）。

【図20-1】安定したＡベータオリゴマーに対する抗体結合の検証を示す図である。様々な濃度の市販の調製済みの安定なＡベータオリゴマーと固定化抗体との結合に関するＳＰＲセンサグラムおよび結合応答プロット。パネルＡは陽性対照ｍＡｂ６Ｅ１０での結果を示し、パネルＢは陰性アイソタイプ対照での結果を示し、パネルＣはシクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）に対して生じさせた抗体での結果を示している。パネルＤは、ＱＫＬＶ（配列番号１）を含む環状ペプチドに対して生じさせた選択された抗体クローンと、濃度１マイクロモルのＡベータオリゴマーとの結合をプロットしたものである。

【図20-2】安定したＡベータオリゴマーに対する抗体結合の検証を示す図である。様々な濃度の市販の調製済みの安定なＡベータオリゴマーと固定化抗体との結合に関するＳＰＲセンサグラムおよび結合応答プロット。パネルＡは陽性対照ｍＡｂ６Ｅ１０での結果を示し、パネルＢは陰性アイソタイプ対照での結果を示し、パネルＣはシクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）に対して生じさせた抗体での結果を示している。パネルＤは、ＱＫＬＶ（配列番号１）を含む環状ペプチドに対して生じさせた選択された抗体クローンと、濃度１マイクロモルのＡベータオリゴマーとの結合をプロットしたものである。

【図20-3】安定したＡベータオリゴマーに対する抗体結合の検証を示す図である。様々な濃度の市販の調製済みの安定なＡベータオリゴマーと固定化抗体との結合に関するＳＰＲセンサグラムおよび結合応答プロット。パネルＡは陽性対照ｍＡｂ６Ｅ１０での結果を示し、パネルＢは陰性アイソタイプ対照での結果を示し、パネルＣはシクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）に対して生じさせた抗体での結果を示している。パネルＤは、ＱＫＬＶ（配列番号１）を含む環状ペプチドに対して生じさせた選択された抗体クローンと、濃度１マイクロモルのＡベータオリゴマーとの結合をプロットしたものである。

【図20-4】安定したＡベータオリゴマーに対する抗体結合の検証を示す図である。様々な濃度の市販の調製済みの安定なＡベータオリゴマーと固定化抗体との結合に関するＳＰＲセンサグラムおよび結合応答プロット。パネルＡは陽性対照ｍＡｂ６Ｅ１０での結果を示し、パネルＢは陰性アイソタイプ対照での結果を示し、パネルＣはシクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）に対して生じさせた抗体での結果を示している。パネルＤは、ＱＫＬＶ（配列番号１）を含む環状ペプチドに対して生じさせた選択された抗体クローンと、濃度１マイクロモルのＡベータオリゴマーとの結合をプロットしたものである。

【図21-1】ＱＫＬＶ（配列番号１）を含む環状ペプチドを用いて生じさせた代表的な抗体の存在下（星）または不在下（四角）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡベータ凝集伝播のプロットである。

【図21-2】ＱＫＬＶ（配列番号１）を含む環状ペプチドを用いて生じさせた代表的な抗体の存在下（星）または不在下（四角）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡベータ凝集伝播のプロットである。

【図21-3】ＱＫＬＶ（配列番号１）を含む環状ペプチドを用いて生じさせた代表的な抗体の存在下（星）または不在下（四角）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡベータ凝集伝播のプロットである。

【図22-1】異なるモル比の陰性アイソタイプ対照（Ａ）またはシクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）に対して生じさせた抗体（Ｂ）の存在下または不存在下における、毒性Ａベータオリゴマー（ＡβＯ）に曝露したラットの初代皮質ニューロンの生存率を示すプロット。対照は、単独で培養したニューロン（ＣＴＲＬ）、オリゴマーを含まない抗体とインキュベートしたニューロン、およびＡベータオリゴマーを含むまたは含まずに神経保護ペプチドのヒューマニン（ＨＮＧ）と培養したニューロンを、含む。

【図22-2】異なるモル比の陰性アイソタイプ対照（Ａ）、またはシクロ（（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）に対して生じさせた抗体（Ｂ）の存在下または不存在下における、毒性Ａベータオリゴマー（ＡβＯ）に曝露したラットの初代皮質ニューロンの生存率を示すプロット。対照は、単独で培養したニューロン（ＣＴＲＬ）、オリゴマーを含まない抗体とインキュベートしたニューロン、およびＡベータオリゴマーを含むまたは含まずに神経保護ペプチドのヒューマニン（ＨＮＧ）と培養したニューロンを、含む。

【発明を実施するための形態】

【0078】

表１に、選択した組織培養上清のクローンの結合特性を示す。

【0079】

表２に、選択した精製済みの抗体の結合特性のまとめを示す。

【0080】

表３に、シクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）に対して生じさせた抗体のオリゴマー結合－モノマー結合を記載する。

【0081】

表４に、ホルマリン固定組織で試験した抗体の特性を記載する。

【0082】

表５は例示的毒性試験である。

【0083】

表６にクローン３０５－６１（７Ｅ９）のＣＤＲ配列を記載する。

【0084】

表７にクローン３０５－６１（７Ｅ９）の重鎖および軽鎖の可変配列を記載する。

【0085】

表８に、クローン３０５－６２（８Ｈ１０）のＣＤＲ配列を記載する。

【0086】

表９にクローン３０５－６２（８Ｈ１０）の重鎖および軽鎖の可変配列を記載する。

【0087】

表１０は、Ａベータエピトープ配列およびリンカーを有する選択Ａベータ配列の表である。

【0088】

表１１にＡベータ１～４２ヒトポリペプチド配列全体を記載する。

【0089】

（本開示の詳細な説明）
オリゴマー特異的抗体の作製のための必要条件は、モノマーまたは線維上に存在しない、または非常に少ない度合で存在するＡベータペプチド上の標的を特定することである。これらのオリゴマー特異的エピトープは、モノマーまたは線維の対応するセグメントと一次配列が異なっていなくてもよいが、オリゴマーにおいて立体配座的に際立ったものであり得る。つまり、これらは、オリゴマー内で、主鎖および／または側鎖立体配座の点でモノマーおよび／または線維にはみられないと考えられる際立った立体配座を示す。

【0090】

直鎖状ペプチド領域に対して生じさせた抗体は、オリゴマーに選択的でなく、したがって、モノマーにも結合する傾向がある。

【0091】

オリゴマー型のＡベータに選択的になり得る抗体を開発するため、本発明者らは、線維において破壊されやすく、オリゴマーの表面にも露出するであろう、線維における配列の領域を特定することを目指した。

【0092】

実施例に記載されるように、本発明者らは、線維において破壊されやすいことが予測される領域を特定した。本発明者らは、その特定されたエピトープを含む環状化合物がより高い曲率、より大きい露出表面積、および／または別の二面角分布といった上記の基準を満たすようこれを設計した。

【0093】

標的領域を含む環状ペプチドを用いて、同じ配列の直鎖状ペプチド（例えば、対応する直鎖状配列）と比較して環状ペプチドと優先的と結合する抗体を生じさせた。実験結果が記載されており、合成モノマーと比較して合成オリゴマーと選択的と結合し、対照ＣＳＦよりもＡＤ患者のＣＳＦと優先的と結合し、かつ／または対照の可溶性脳抽出物よりもＡＤ患者の可溶性脳抽出物と優先的と結合する、エピトープ特異的かつ立体配座選択的な抗体が特定される。さらに、ＡＤ脳組織の染色では、斑との結合を全くまたはほとんど示さない抗体が特定され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験では、抗体がＡβオリゴマーの伝播および凝集を阻害することがわかった。

【0094】

Ｉ．定義
本明細書で使用される「Ａベータ（Ａ－ｂｅｔａ）」という用語は、代替的に「アミロイドベータ」、「アミロイドβ」、Ａベータ（Ａｂｅｔａ）、Ａベータ（Ａ－ｂｅｔａ）または「Ａβ」と呼ばれ得る。アミロイドベータは、３６～４３個のアミノ酸よりなるペプチドであり、本明細書中使用されるように、あらゆる種のあらゆる野生型および変異型、特にヒトＡベータを包含する。Ａベータ４０は４０アミノ酸型を指し、Ａベータ４２は４２アミノ酸型を指すなど。ヒト野生型Ａベータ４２のアミノ酸配列は配列番号３１で示されるものである。

【0095】

本明細書で使用される「Ａベータモノマー」という用語は、本明細書中で、Ａベータ（例えば、１～４０、１～４１、１～４２、１～４３）ペプチドの個々のサブユニット型を指す。

【0096】

本明細書で使用される「Ａベータオリゴマー」という用語は、複数（例えば、少なくとも２つ）のＡベータモノマーが非共有結合によって、約１００個未満またはより通常には約５０個未満のモノマーからなり、立体配座に柔軟性があり、部分的に規則的である三次元の小球に凝集したＡベータサブユニットのいずれか複数のものを指す。例えば、オリゴマーは、３個、４個、５個またはそれ以上のモノマーを含み得る。本明細書で使用される「Ａベータオリゴマー」という用語は、合成Ａベータオリゴマーおよび／または天然Ａベータオリゴマーの両方を包含する。「天然Ａベータオリゴマー」は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えばＡＤを有する対象の脳およびＣＳＦ内で形成されるＡベータオリゴマーを指す。

【0097】

本明細書で使用される「Ａベータ線維」という用語は、電子顕微鏡下で線維構造を示す個々のＡベータペプチドが非共有結合により会合した集合体を含む分子構造を指す。線維構造は通常、「クロスベータ」構造であり、理論上、多量体の大きさに上限はなく、線維は数千個または何千個ものモノマーを含み得る。線維は数千個単位で凝集し、ＡＤに特徴的な主な病理学的形態の１つである老人斑を形成し得る。

【0098】

本明細書中使用される「直鎖状Ａベータペプチド、Ａベータモノマーおよび／または線維内でＱ、Ｋ、Ｌ、および／またはＶによって占められるものとは別の立体配座」という用語は、溶媒露出度、エントロピー、曲率（例えば、ペプチドＱＫＬＶ（配列番号１）の曲率）、および１つもしくは複数の二面角から選択される１つまたは複数の立体配座特性が、たとえばＰＤＢの２ＭＪ４に示されており、図１４に示されている直鎖状の不定形のＡベータペプチド、Ａベータモノマー、および／またはＡベータ線維におけるＱの特性と比較して異なることを意味する。図４Ａは、残基Ｑに関してモノマーまたは線維と比較して別の立体配座の分布を示す。図５および６は、それぞれ残基ＫおよびＬの別の類似の立体配座分布を示し、ＫおよびＬが線維およびモノマーの両方のものとは異なっていることを示す。別の立体配座はまた、比較立体配座より弱くまたは強く「拘束された」ものであり得る。たとえば図１３は、記載されている環状化合物中のＱ、Ｋ、およびＬが、Ａベータモノマーのものよりも強く拘束されていることを示す。

【0099】

「アミノ酸」という用語は、天然のアミノ酸および修飾されたＬ－アミノ酸をすべて包含する。アミノ酸の原子は、たとえば様々な同位体を含み得る。例えば、アミノ酸は、水素に代わるジュウテリウム、窒素１４に代わる窒素１５および炭素１２に代わる炭素１３ならびにその他の同様の変化を含み得る。

【0100】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体ならびに例えば一本鎖Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメントまたは一本鎖Ｆｖフラグメントを含めた上記の抗体のフラグメントを包含するものとする。「組織培養上清のクローン（Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｃｌｏｎｅ）」は、本明細書中で、収集および試験のためハイブリドーマにより上清に分泌されたモノクローナル抗体を表す。抗体は、組換え供給源由来のものおよび／またはウサギ、ラマ、サメなどの動物で産生されたものであり得る。また、トランスジェニック動物で産生され得る、もしくは生化学技術を用いて作製され得る、またはファージライブラリーなどのライブラリーから単離され得るヒト抗体も包含される。ヒト化抗体またはその他のキメラ抗体は、１種類または２種類以上のアイソタイプもしくはクラスまたは種由来の配列を含み得る。

【0101】

「単離された抗体」という語句は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで産生され、抗体を産生した供給源、例えば、動物、ハイブリドーマまたはその他の細胞系（抗体を産生する組換え昆虫、酵母または細菌細胞など）から取り出された抗体を指す。単離された抗体は任意選択で「精製」されており、これは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の純度であることを意味する。

【0102】

本明細書で使用される「結合フラグメント」という用語は、抗体または抗体鎖の一部または一部分であって、インタクトの抗体もしくは抗体鎖または完全な抗体もしくは抗体鎖より少ないアミノ酸残基を含み、抗原と結合する、またはインタクトの抗体と競合するものを指す。例示的結合フラグメントとしては、特に限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディおよびその多量体が挙げられる。フラグメントは、インタクトの抗体もしくは抗体鎖または完全な抗体もしくは抗体鎖の化学処理または酵素処理によって得ることができる。フラグメントは、組換え手段によっても得ることができる。例えば、抗体をペプシンで処理することによりＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製することができる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントにジスルフィド架橋を還元する処理を実施して、Ｆａｂ’フラグメントを作製することができる。パパイン消化によりＦａｂフラグメントの形成を引き起こすことができる。また、組換え発現技術によりＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメントならびにその他のフラグメントを構築することもできる。

【0103】

当該技術分野で認識されている「ＩＭＧＴ番号付け」または「ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース番号付け」という用語は、抗体またはその抗原結合部分の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の他のアミノ酸残基より可変性のある（すなわち、超可変性の）アミノ酸残基を番号付けするシステムを指す。

【0104】

ある抗体がＱＫＬＶ（配列番号１）などのエピトープに特異的と結合すると記載される場合、それは、その抗体が特定の残基またはその一部、例えばＱＫＬＶの少なくとも２つの残基を含むペプチドに最小限の親和性で特異的と結合し、例えばアイソタイプ対照抗体より大きい無関係な配列にも無関係な配列の空間定位にも結合しないことを意味する。このような抗体は必ずしもＱＫＬＶ（配列番号１）の各残基と接触するわけではなく、前記エピトープ内のあらゆるアミノ酸置換またはアミノ酸欠失が、必ずしも結合親和性に大きな影響を及ぼし、かつ／または同程度の影響を及ぼすというわけではない。

【0105】

ある抗体がエピトープ、例えばＱＫＬＶ（配列番号１）などの立体配座エピトープなどに選択的と結合すると記載される場合、それは、その抗体が特定の残基またはその一部を含む１つまたは複数の特定の立体配座に、別の立体配座の前記残基と結合する場合より大きい親和性で優先的と結合することを意味する。例えば、ある抗体が対応する直鎖状ペプチドよりもＱＫＬＶまたは関連エピトープを含むシクロペプチドに選択的と結合すると記載される場合、その抗体は、直鎖状ペプチドと結合する場合の少なくとも２倍の親和性でそのシクロペプチドと結合する。

【0106】

本明細書で使用される「立体配座エピトープ」という用語は、アミノ酸配列が特定の三次元構造を有し、対応する不定形の直鎖状エピトープの配列中に存在しない三次元構造の一態様がコグネイト抗体によって認識される、エピトープを指す。立体配座特異的エピトープと特異的に結合する抗体は、その立体配座特異的エピトープの１つまたは複数のアミノ酸の空間的配置を認識する。例えば、ＱＫＬＶ（配列番号１）の立体配座エピトープは、直鎖状のＱＫＬＶ（配列番号１）を使用して生じさせた抗体と比較して、選択的に抗体により認識されるエピトープを指す。立体配座エピトープを特異的かつ／または選択的に結合する抗体は、特異的かつ／または選択的にエピトープ配列のアミノ酸のうちの１つまたは複数の空間的配置を認識する。たとえば、ＱＫＬＶ（配列番号１）立体配座エピトープは、抗体によって特異的かつ／または選択的に、例えば対応する直鎖状ＱＫＬＶ（配列番号１）化合物と比較して少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍もしくは１０００倍またはそれ以上選択的に認識される、ＱＫＬＶ（配列番号１）のエピトープを指す。

【0107】

アミノ酸配列内のアミノ酸もしくはその側鎖、またはより大きいポリペプチド内のアミノ酸配列に関して、本明細書中で使用される「拘束された立体配座」という用語は、アミノ酸二面角の回転運動性が対応する直鎖状ペプチド配列または配列もしくはより大きいポリペプチドよりも低下し、それにより、許容される立体配座の数が少なくなっていることを意味する。このことは、例えば、二面角自由度のアンサンブルのエントロピー減少を見出すことによって定量化することが可能であり、ＱＫＬＶ（配列番号１）については図１３にプロットされている。例えば、配列内の側鎖の立体配座自由度が直鎖状ペプチドより低ければ、エントロピーが減少することになる。このような立体配座の制約があれば、この抗原に対して特異的に生じた抗体の立体配座選択性が増大するものと思われる。本明細書で使用される「より拘束された立体配座」という用語は、１つまたは複数の二面角の二面角分布（許容される二面角のアンサンブル）が、アミノ酸Ｑ、Ｋ、Ｌ、および／またはＶのエントロピーにより判定されるように、比較立体配座より少なくとも１０％強く拘束されていることを意味する。具体的には、より拘束された立体配座のアンサンブルのＱＫＬＶ（配列番号１）の線維におけるエントロピーに対する平均エントロピー変化、Ｓ（拘束されている）－Ｓ（線維）は、拘束されていない立体配座アンサンブルから、例えば直鎖状ペプチドに関して量Ｓ（直鎖状）－Ｓ（線維）が平均で１０％超、２０％超、３０％超または４０％超減少している。

【0108】

本明細書中使用される用語「関連エピトープ」は、抗原性のあるＱＫＬＶ（配列番号１）の少なくとも２つの残基、任意にＫＬ、ならびに／または、ＱＫＬＶ（配列番号１）（たとえばＱＫＬＶＦ（配列番号１０）の少なくとも２つの残基に対するＡベータのＮ末端側および／もしくはＣ末端側の最大１つもしくは最大２つのアミノ酸残基を含む配列を、意味する。

【0109】

本明細書で抗体に関して使用される「斑との結合が全くまたはほとんどみられない」または「斑と結合しない、またはほとんど結合しない」という用語は、抗体が（例えば、ｉｎ ｓｉｔｕの）免疫組織化学法で典型的な斑の染色形態を示さず、染色のレベルが、ＩｇＧ陰性の（例えば、無関係な）アイソタイプ対照でみられるレベルと同等である、またはその２倍以下であることを意味する。

【0110】

「単離ペプチド」という用語は、例えば組換え技術または合成技術によって作製され、ペプチドを作製した組換え細胞または残存ペプチド合成反応物などの供給源から取り出されたペプチドを指す。単離ペプチドは、任意選択で「精製」されており、これは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の純度および任意選択で医薬品等級の純度であることを意味する。

【0111】

本明細書で使用される「検出可能な標識」という用語は、本明細書に記載されるペプチドまたは化合物内に付加または導入することができるペプチド配列（ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｖ５タグまたはＮＥタグなど）、蛍光タンパク質などの部分であって、直接的または間接的に検出可能なシグナルを発生することが可能な部分を指す。例えば、標識は、（例えば、ＰＥＴ撮像に使用する）放射線不透性の陽電子放出放射性核種もしくは放射性同位元素、例えば^３Ｈ、^１３Ｎ、^１４Ｃ、^１８Ｆ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉなど；蛍光化合物（フルオロフォア）もしくは化学発光化合物（発色団）、例えばフルオレセインイソチオシアナート、ローダミンもしくはルシフェリンなど；酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなど；造影剤；または金属イオンであり得る。検出可能な標識はまた、例えば二次抗体を用いて間接的に検出可能なものであり得る。

【0112】

通常使用される「エピトープ」という用語は、抗体によって特異的に認識される抗原の抗体結合部位、通常、ポリペプチドセグメントを意味する。本明細書で使用される「エピトープ」はまた、エピトープ配列を含むペプチドを使用して抗体を生じさせることができる、記載される集団座標法を用いてＡベータ上で特定され得るアミノ酸配列またはその一部を指すこともある。例えば、特定された標的領域ＱＫＬＶ（配列番号１）を含む環状化合物に対応する単離ペプチドに対して作製した抗体は、前記エピトープ配列の一部または全部を認識する。エピトープが抗体による結合に接触可能な場合、それは本明細書において「接触可能な」ものである。

【0113】

本明細書で使用される「より高い親和性」という用語は、抗体Ｘが標的Ｚより強く（Ｋ_ｏｎ）かつ／または小さい解離定数（Ｋ_ｏｆｆ）で標的Ｙと結合する場合の相対的抗体結合度を指し、この文脈では、抗体Ｘは標的Ｙに対して標的Ｚより高い親和性を有する。これと同様に、本明細書の「より低い親和性」は、抗体Ｘが標的Ｚより弱くかつ／または大きい解離定数で標的Ｙと結合する場合の相対的抗体結合度を指し、この文脈では、抗体Ｘは標的Ｙに対して標的Ｚより低い親和性を有する。抗体とその標的抗原との間の結合の親和性はＫ_Ａ＝１／Ｋ_Ｄで表すことができ、式中、Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆである。ｋ_ｏｎおよびｋ_ｏｆｆの値は、表面プラズモン共鳴技術を用いて、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＳＳ－１）（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）を用いて測定することができる。環状化合物、例えば任意選択の環状ペプチド中に提示される立体配座に選択的な抗体は、環状化合物（例えば、環状ペプチド）に対する親和性が直鎖状形態の対応する配列（例えば、非環化配列）より大きい。

【0114】

同じく本明細書で使用される「免疫原性」という用語は、抗体の産生を誘発し、免疫原の免疫原性部分に対するＴ細胞およびその他の反応性免疫細胞を活性化する物質を指す。

【0115】

環状化合物に関する「対応する直鎖状化合物」という用語は、環状化合物と同じ配列もしくは化学的部分を含む、またはこれよりなるが、直鎖状（すなわち、非環状）形態であり、例えば溶液中でみられ得る直鎖状ペプチドの特性を有する、化合物、任意選択で直鎖状ペプチドを指す。例えば、対応する直鎖状化合物は、環化されていない合成ペプチドであり得る。

【0116】

ある抗体に関して本明細書で使用される「特異的に結合する」は、その抗体がエピトープ配列を認識し、最小限の親和性でその標的抗原と結合することを意味する。例えば、多価抗体は、その標的と少なくとも１ｅ－６、少なくとも１ｅ－７、少なくとも１ｅ－８、少なくとも１ｅ－９または少なくとも１ｅ－１０のＫ_Ｄで結合する。少なくとも１ｅ－８より高い親和性が好ましいものであり得る。可変ドメインを１つ含むＦａｂフラグメントなどの抗原結合フラグメントは、非フラグメント化抗体との多価相互作用の１０倍または１００倍低い親和性でその標的と結合する。

【0117】

ある形態のＡベータ（例えば、線維、モノマーまたはオリゴマー）または環状化合物と選択的に結合する抗体に関して本明細書で使用される「選択的に結合する」という用語は、その抗体が上記の形態と少なくとも２倍、少なくとも３倍または少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍もしくは少なくとも１０００倍またはそれ以上の親和性で結合することを意味する。したがって、特定の立体配座（例えば、オリゴマー）に対してより選択的な抗体は、別の形態のペプチドおよび／または直鎖状ペプチドの少なくとも２倍などの親和性で特定の形態のＡベータと優先的に結合する。

【0118】

本明細書で使用される「リンカー」という用語は、ＱＫＬＶ（配列番号１）エピトープペプチドを含むペプチドと共有結合して、任意選択でＱＫＬＶ（配列番号１）ペプチドのＮ末端およびＣ末端と結合して、環状化合物を生じさせることができる化学的部分を指す。リンカーは、スペーサーおよび／または１つもしくは複数の官能化可能な部分を含み得る。リンカーは、官能化可能な部分を介して担体タンパク質またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原強化物質と結合することができる。

【0119】

本明細書で使用される「スペーサー」という用語は、ペプチドのＮ末端およびＣ末端と直接的または間接的に共有結合して、長さがペプチド自体より長い環状化合物を生じさせることができる、非免疫原性または低免疫原性の任意の化学的部分を意味し、例えば、スペーサーは、ＱＫＬＶ（配列番号１）よりなるペプチドのＮ末端およびＣ末端と結合して、主鎖の長さがＱＫＬＶ（配列番号１）配列自体より長い環状化合物を生じさせることができる。つまり、（例えば、３アミノ酸残基の）スペーサーを有する環状ペプチドは、スペーサーのない環状ペプチドより大きい閉環を作製する。スペーサーとしては、特に限定されないが、Ｇリピート、ＡリピートまたはＰＥＧリピートなどの非免疫原性部分、例えばＧＱＫＬＶ（配列番号４）、ＧＱＫＬＶＧ（配列番号５）、ＧＧＱＫＬＶＧ（配列番号６）、ＧＱＫＬＶＧＧ（配列番号７）などが挙げられる（たとえば特定の実施形態については図１２を参照）。スペーサーは、１つもしくは複数のシステイン（Ｃ）残基などの１つもしくは複数の官能化部分を含む、またはこれと結合しているものであり得、官能化部分はスペーサー内に散在している、またはスペーサーの一端または両端と共有結合しているものであり得る。Ｃ残基などの官能化可能な部分がスペーサーの１つまたは複数の末端と共有結合している場合、スペーサーはペプチドと間接的に共有結合している。スペーサーはまた、ビオチン分子がアミノ酸残基内に導入されている場合のように、スペーサー残基内に官能化可能な部分を含み得る。

【0120】

本明細書で使用される「官能化可能な部分」という用語は、「官能基」を有する化学物質を指し、本明細書で使用される「官能基」は、別の原子団または単一原子（いわゆる「相補性官能基」）と反応して、２つの原子団または原子の間で化学的相互作用を形成する、原子団または単一原子を指す。システインの場合、官能基は、反応してジスルフィド結合を形成することができる－ＳＨであり得る。したがって、リンカーは、例えばＣＣＣであり得る。別の原子団との反応は、共有結合または例えば、Ｋｄが約１ｅ－１４になり得るビオチン－ストレプトアビジン結合の場合のような強い非共有結合であり得る。本明細書で使用される強い非共有結合は、Ｋ_ｄが少なくとも１ｅ－９、少なくとも１ｅ－１０、少なくとも１ｅ－１１、少なくとも１ｅ－１２、少なくとも１ｅ－１３または少なくとも１ｅ－１４の相互作用を意味する。

【0121】

タンパク質および／またはその他の物質を免疫原性に役立つ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ研究のプローブとして作用するよう環状ペプチドに機能化（例えば、結合）させ得る。この目的には、反応すること（例えば、共有結合または共有結合ではない強い結合を形成すること）が可能な任意の官能化可能な部分を使用し得る。ある特定の実施形態では、官能化可能な部分は、目的のタンパク質上にある対形成していないシステインと反応してジスルフィド結合を形成するシステイン残基であり、目的のタンパク質は、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性増強物質またはｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫ブロットもしくは免疫組織化学アッセイに使用するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体タンパク質であり得る。

【0122】

本明細書で使用される「～と反応する」という用語は一般に、電子の流れまたは静電荷の移動が起こることにより化学的相互作用が形成されることを意味する。

【0123】

本明細書で使用される「動物」または「対象」という用語は、任意選択でヒトを含む、または含まない哺乳動物を含めた動物界のあらゆるメンバーを包含する。

【0124】

本明細書で使用される「保存的アミノ酸置換」とは、タンパク質の所望の特性を打ち消すことなく、あるアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換わるアミノ酸置換のことである。適切な保存的アミノ酸置換は、疎水性、極性およびＲ鎖長が互いに類似したアミノ酸同士を置き換えることにより実施することができる。保存的アミノ酸置換の例としては以下のものが挙げられる。

【0125】

【表1】

【0126】

本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列または２つの核酸配列の間の配列同一性のパーセンテージを指す。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するには、配列を最適な比較目的で整列させる（例えば、第二のアミノ酸配列または核酸配列との最適アライメントのために第一のアミノ酸配列または核酸配列の配列内にギャップを導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列内のある位置が第二の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、その分子は上記の位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、その配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の重複位置の数／一の総数×１００％）。一実施形態では、２つの配列は同じ長さである。２つの配列間のパーセント同一性の決定はまた、数学的アルゴリズムを用いて実施することができる。２つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例には、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３－５８７７で改変されたＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２６４－２２６８のアルゴリズムがある。Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムにはそのようなアルゴリズムが組み込まれている。ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータを例えばスコア＝１００、ワード長＝１２に設定してＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施し、本願の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータを例えばスコア－５０、ワード長＝３に設定してＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施し、本明細書に記載されるタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ付きアライメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されているＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることができる。あるいは、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施することができる（同文献）。ＢＬＡＳＴプログラム、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムおよびＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期パラメータを用いることができる（例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトを参照されたい）。配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例には、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７のアルゴリズムがある。ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）には、そのようなアルゴリズムが組み込まれている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを用いる場合、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いることができる。ギャップを許容するかしないかを問わず、上記のものと類似した技術を用いて２つの配列間のパーセント同一性を決定することができる。パーセント同一性を算出する際には通常、完全一致のみをカウントする。

【0127】

抗体に関しては、抗体配列をＩＭＧＴまたはその他のもの（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けの慣例）により最大限に整列させたとき、パーセンテージ配列同一性を決定することができる。アライメント後、対象抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の全成熟可変領域）を参照抗体の同じ領域と比較している場合、対象抗体領域と参照抗体領域の間のパーセンテージ配列同一性は、ギャップをカウントせず、対象抗体領域および参照抗体領域の両方で同じアミノ酸によって占められている位置の数を、整列させた２つの領域の位置の総数で除したものに１００を乗じてパーセンテージに変換したものとする。

【0128】

本明細書で使用される「核酸配列」は、天然の塩基、糖および糖間（主鎖）結合よりなるヌクレオシドモノマーまたはヌクレオチドモノマーの配列を指す。この用語はまた、非天然のモノマーまたはその一部分を含む修飾または置換された配列を包含する。本願の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であり得、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含めた天然の塩基を包含し得る。配列はまた、修飾塩基を含み得る。このような修飾塩基の例としては、アザおよびデアザアデニン、グアニン、シトシン、ミジンおよびウラシル；ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。核酸は二本鎖または一本鎖であり得、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す。さらに、「核酸」という用語は、相補的核酸配列およびコドン最適化等価物または同義コドン等価物を包含する。本明細書で使用される「単離核酸配列」という用語は、組換えＤＮＡ技術により作製された場合は実質的に細胞物質も培地も含まない核酸、あるいは化学的に合成された場合は化学的前駆体またはその他の化学物質を指す。単離核酸はまた、その核酸が由来する核酸に天然の状態で隣接する配列（すなわち、核酸の５’側および３’側に位置する配列）を実質的に含まない。

【0129】

「作動可能に連結されている」は、核酸の発現が可能なようにその核酸が制御配列を連結されていることを意味するものとする。適切な制御配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物または昆虫の遺伝子を含めた様々な供給源に由来するものであり得る。適切な制御配列の選択は、選択する宿主細胞によって決まり、当業者により容易に達成され得る。このような制御配列の例としては、転写プロモーターおよび転写エンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含めたリボソーム結合配列が挙げられる。さらに、選択する宿主細胞および用いるベクターに応じてその他の配列、例えば複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサーおよび転写の誘導性を付与する配列などを発現ベクター内に組み込み得る。

【0130】

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、核酸分子を例えば、原核細胞および／または真核細胞内に導入し、かつ／あるいはゲノム内に組み込むことを可能にする前記核酸分子の任意の中間運搬体を含み、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスベクター、例えばレトロウイルス系ベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどがこれに包含される。本明細書で使用される「プラスミド」という用語は一般に、通常は環状ＤＮＡ二本鎖であり、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる、染色体外遺伝物質の構築物を指す。

【0131】

「少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、溶液中の２つの相補的核酸分子の間の選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件を選択することを意味する。ハイブリダイゼーションは核酸配列分子の全部または一部に起こり得る。ハイブリダイズする部分は通常、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０または５０）ヌクレオチドの長さである。当業者には、核酸の二本鎖またはハイブリッドの安定性が、ナトリウム含有緩衝液中でのナトリウムイオン濃度と温度の関数であるＴｍ（Ｔｍ＝８１．５℃－１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）－６００／ｌ）またはこれと類似した方程式）によって決まることが認識されよう。したがって、ハイブリッドの安定性を決定する洗浄条件のパラメータはナトリウムイオン濃度および温度である。既知の核酸分子に類似しているが同一ではない分子を特定するには、１％のミスマッチによりＴｍが約１℃低下するものと考えられ、例えば、同一性が９５％を上回る核酸分子を探索するのであれば、最終洗浄温度は約５℃低下することになる。当業者は、これらの考慮事項に基づき、適切なハイブリダイゼーション条件を容易に選択することが可能であろう。好ましい実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を選択する。例として、以下の条件を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーションを実施し得る：上の方程式に基づき、Ｔｍを－５℃とし、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳで、ハイブリダイゼーションを実施し、次いで、６０℃にて０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄する。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、４２℃、３×ＳＳＣでの洗浄段階が含まれる。ただし、上のものに代わる緩衝液、塩および温度を用いても同等のストリンジェンシーが達成され得ることが理解される。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなる指針については、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，２００２およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１にみることができる。

【0132】

本明細書で使用され、当該技術分野でも十分に理解されている「治療すること」または「治療」という用語は、臨床結果を含めた有益な結果または所望の結果を得る方法を意味する。有益な臨床結果または所望の臨床結果としては、特に限定されないが、検出可能なものであるか検出不可能なものであるかを問わず、１つまたは複数の症状または病態の軽減または改善、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患の拡散の予防、疾患進行の遅延または緩徐化、病状の改善または緩和、疾患再発の減少および寛解（部分寛解または完全寛解を問わない）が挙げられる。「治療すること」および「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間が長くなることを意味し得る。本明細書で使用される「治療すること」および「治療」はまた、予防的治療を包含する。例えば、初期段階のＡＤを有する対象を本明細書に記載される化合物、抗体、免疫原、核酸または組成物で治療して進行を予防することができる。

【0133】

本明細書で使用される「投与される」という用語は、細胞または対象への治療有効量の開示の化合物または組成物の投与を意味する。

【0134】

本明細書で使用される「有効量」という語句は、所望の結果を得るのに必要な投与回数および期間で効果が得られる量を意味する。対象に投与する場合、有効量は対象の病状、年齢、性別、体重などの因子に応じて異なり得る。最適な治療反応を得るために投与レジメンを調整し得る。

【0135】

「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤または補形剤が、製剤の他の成分と適合性があり、その被投与者に対して実質的に有害でないことを意味する。

【0136】

１つまたは複数の記載される要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇまたはｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に記載されていない他の要素を含み得る。例えば、抗体を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅまたはｉｎｃｌｕｄｅ）」組成物は、抗体を単独で、または他の成分とともに含有し得る。

【0137】

本開示の範囲を理解するにあたっては、本明細書で使用される「～よりなる」という用語またはその派生語は、記載される特徴、要素、成分、グループ、整数および／または段階の存在を明記し、また他の記載されていない特徴、要素、成分、グループ、整数および／または段階の存在を排除する、オープンエンドな用語であるものとする。

【0138】

本明細書で端点により数値範囲が記載されている場合、その範囲内に含まれる数および端数がいずれも含まれる（例えば、１～５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４および５が含まれる）。また、数およびその端数はすべて「約」という用語によって修飾されるものと考えられることを理解するべきである。さらに、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容からそうでないことが明らかでない限り、複数形の指示対象を包含することを理解するべきである。「約」という用語は、言及されている数のプラスまたはマイナス０．１～５０％、５～５０％または１０～４０％、好ましくは１０～２０％、より好ましくは１０％または１５％を意味する。

【0139】

さらに、当業者であれば理解するように、特定のセクションに記載される定義および実施形態は、本明細書に記載される他の実施形態のうちそれらが適しているものに適用可能であるものとする。例えば、以下の節では、本発明の様々な態様がさらに詳細に定義される。そのように定義された各態様は、そうでないことが明記されない限り、１つまたは複数の他の任意の態様と組み合わせ得る。特に、好ましいまたは有利であると示されている任意の特徴と、好ましいまたは有利であると示されている他の任意の特徴とを組み合わせ得る。

【0140】

冠詞の単数形である「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないことが明らかでない限り、複数の指示物を包含する。例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、複数の化合物をその混合物も含め包含し得る。

【0141】

ＩＩ．エピトープおよび結合タンパク質
本発明者らは、Ａベータのアミノ酸１５～１８でＡベータの「エピトープ」ＱＫＬＶ（配列番号１）を特定した。本発明者らはさらに、そのエピトープまたはその一部が立体配座エピトープであり得ることおよびＱＫＬＶ（配列番号１）がＡベータのオリゴマー種での抗体結合に選択的に接触可能であり得ることを明らかにした。

【0142】

理論に束縛されることを望むものではないが、線維は、オリゴマー化を触媒する傾向のある相互作用部位を示し得る。このことは、株に特異的であり得、正常な患者には存在しない選択的な線維表面が露出され、よってモノマーとの異常な相互作用を起こすことが可能である（すなわちモノマーに提示される）場合にのみ起こり得る。低ｐＨ、炎症時に存在するオスモライトまたは酸化的損傷などの環境変化が線維の破壊を誘発し、より安定性の低い領域の露出を引き起こし得ると考えられる。その結果、これらの低安定性領域を予測し、そのような予測を用いて、上記の領域を標的とする抗体を合理的に設計することに関心が持たれている。線維内で破壊される可能性のある領域はまた、オリゴマー種内で露出する領域の有力な候補となり得る。

【0143】

不規則になりやすい隣接するタンパク質領域を予測するためのコンピュータに基づくシステムおよび方法が、２０１５年１１月９日に出願された米国特許出願第６２／２５３０４４号「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｂｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｂｉａｓｉｎｇ」、および２００９年１０月６日に出願されている米国特許出願第１２／５７４，６３７号「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｍ ｉｓｆｏｌｄｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ」に記載されている。各文献の全体は、参照により本明細書に組み込まれている。実施例に記載されるように、この方法をＡベータに適用し、Ａベータオリゴマーにおいてより接触可能なエピトープを特定した。

【0144】

実施例に記載されるように、環状ペプチドであるシクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）は、モノマー種および／または線維種と比較したオリゴマーのエピトープの立体配座の差を捕捉し得る。例えば、環状７量体シクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）の溶媒接触表面積、曲率、ならびにいくつかの二面角の二面角分布の差は、Ａベータモノマーおよび線維と実質的に異なっていることが明らかになり、シクロペプチドが不定形の直線状エピトープとは異なる立体配座エピトープをもたらすことが示唆された。

【0145】

シクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号２）を含む免疫原を使用して生じさせた抗体は、直鎖状ＣＧＱＫＬＶＧ（配列番号２）よりも選択的にシクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号２）と結合し、単量体のＡベータ斑およびＡベータ線維斑と比較して合成および／または天然のオリゴマーＡベータ種と選択的に結合した。さらに、シクロ（ＧＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体によりＡベータ凝集のｉｎ ｖｉｔｒｏでの伝播を阻害でき、神経細胞モデルにおけるＡベータオリゴマーが誘導する毒性を阻害することができた。

【0146】

ｉ）ＱＫＬＶ（配列番号１）「エピトープ」化合物
したがって、本開示は、アミノ酸ＱＫＬＶ（配列番号１）またはその一部よりなるＡベータの立体配座エピトープを特定するものであり、これはＡベータのアミノ酸残基１５～１８に対応する。

【0147】

一態様は、ＱＫＬＶ（配列番号１）、関連エピトープの配列および／または上記のいずれかのものの一部を含む、あるいはこれよりなるＡベータペプチドを含む、化合物を含む。

【0148】

いくつかの実施形態では、ＱＫＬＶ（配列番号１）を含むＡベータペプチドは、ＱＫＬＶ（配列番号１）、たとえばＨＱＫＬＶ（配列番号２）の、ＡベータのＮ末端および／またはＣ末端に追加の残基を１個、２個または３個含んでよい。ＡベータのＱＫＬＶ（配列番号１）のＮ末端側の３個のアミノ酸はＶＨＨであり、ＱＫＬＶ（配列番号１）のＣ末端側の３個のアミノ酸はＦＦＡである。一実施形態では、Ａベータペプチドは、最大、７個のアミノ酸、６個のアミノ酸、または５個のアミノ酸である。

【0149】

一実施形態では、Ａベータペプチドは、ＱＫＬＶ（配列番号１）のＣ末端にある、Ａベータ中の１つまたは２つの追加的な残基を含む。

【0150】

一実施形態では、本化合物は、表１０に記載されている配列を含む。

【0151】

一実施形態では、化合物はリンカーをさらに含む。リンカーは、スペーサーおよび／または１つもしくは複数の官能化可能な部分を含む。リンカーは、例えば、３個、４個、５個、６個、７個もしくは８個のアミノ酸および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの同等に機能する分子ならびに／あるいはその組合せを含み得る。一実施形態では、スペーサーアミノ酸は、非免疫原性または低免疫原性のアミノ酸残基、例えばＧおよびＡなどから選択され、例えば、スペーサーは、ＧＧＧ、ＧＡＧ、Ｇ（ＰＥＧ）Ｇ、ＰＥＧ－ＰＥＧ－ＧＧなどであり得る。１つまたは複数の官能化可能な部分、例えば官能基を有するアミノ酸は、例えば、化合物と、作用物質もしくは検出可能なタグ、ＢＳＡなどの担体またはＫＬＨなどの免疫原性増強物質とを結合させるために含まれ得る。

【0152】

一実施形態では、リンカーは、ＧＣ－ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＧＣ、ＧＣＧまたはＰＥＧ－Ｃ－ＰＥＧを含む。

【0153】

一実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７個または８個のアミノ酸を含む。

【0154】

ＱＫＬＶ（配列番号１）を含むＡベータペプチドが、Ａベータにみられ、ＱＫＬＶ（配列番号１）（たとえばＨＱＫＬＶ（配列番号２）のＮ末端側および／またはＣ末端側にある追加の残基を１個、２個または３個含む実施形態では、環状化合物中のリンカーは、Ａベータ残基のＮ末端および／またはＣ末端と（例えば、残基ＨおよびＶに）共有結合している）。環状化合物は、環化の前に、ＱＫＬＶ（配列番号１）を含むペプチドのＮ末端またはＣ末端に共有結合したリンカーをを含む直鎖状分子として合成することができる。あるいは、環化前に、リンカーの一部をＮ末端と共有結合させ、一部をＣ末端と共有結合させる。いずれの場合も、直鎖状化合物を例えば頭－尾環化（例えば、アミド結合環化）で環化する。

【0155】

化合物のタンパク質性部分は、タンパク質化学でよく知られている固相合成または均質溶液中での合成などの技術を用いる化学合成により調製し得る。

【0156】

一実施形態では、化合物は、環状化合物である。一実施形態では、環状化合物は環状ペプチド（シクロペプチド）である。

【0157】

本明細書で「環状ペプチド」との記載は、（例えば、リンカーが１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個のアミノ酸である）完全にタンパク質性の化合物を指すことができる。実施例で決定された環状ペプチドについて記載される特性を、非アミノ酸リンカー分子を含む他の化合物（例えば環状化合物）に組み込み得ることが理解される。

【0158】

したがって、一態様では、ペプチドＱＫＬＶ（配列番号１）（たとえばベータペプチド）とリンカーとを含み、リンカーが、ＱＫＬＶ（配列番号１）を含むペプチド（任意に、ペプチドがＱＫＬＶ（配列番号１）からなる場合にはＱ残基およびＶ残基）に共有結合し、任意に、少なくともＱが、ＱＫＬＶ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチドのＱ、ならびに／またはモノマーおよび／もしくは線維のＱの立体配座とは別の立体配座にあり、かつ任意に、少なくともＱ、または少なくともＫ、または少なくともＬが、環状化合物において、ＱＫＬＶ（配列番号１）または関連エピトープの配列を含む直鎖状ペプチド中に占められている立体配座よりも拘束されている。

【0159】

Ａベータ配列を含む直鎖状ペプチドは直鎖状化合物に含まれ得る。ＱＫＬＶ（配列番号１）を含む直鎖状化合物または直鎖状ペプチドは、一実施形態では、対応する直鎖状ペプチドである。別の実施形態では、直鎖状ペプチドは、例えば、Ａベータ残基１～３５またはそれより小さいＡベータ残基１０～２０、１１～２０、１２～２０、１３～２０、１０～１９、１０～１８などの部分を含む直鎖状ペプチドを含めた、ＱＫＬＶ（配列番号１）を含む任意の長さのＡベータペプチドである。直鎖状ペプチドはまた、いくつかの実施形態では完全長のＡベータペプチドであり得る。

【0160】

一実施形態では、環状化合物は、ＱＫＬＶ（配列番号１）及びリンカーを含む、またはこれよりなりペプチドを含み、上記リンカーは、ペプチドのＮ末端およびＣ末端（たとえばペプチドがＱＫＬＶ（配列番号１）からなる場合Ｑ残基およびＶ残基）に結合している。一実施形態では、少なくともＱは、環状化合物において、ＱＫＬＶ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチドのＱにより占められているものとは別の立体配座にある。一実施形態では、
少なくともＱが、環状化合物内で、モノマーおよび／または線維内でＱによって占められるものとは別の立体配座にある。

【0161】

一実施形態では、別の立体配座は拘束された立体配座である。

【0162】

一実施形態では、少なくともＱは任意選択で、単独で、または少なくともＫまたはＬと組み合わさって、ＱＫＬＶ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチドにおいて占められる立体配座より拘束された立体配座にある。

【0163】

一実施形態では、Ｑならびに／あるいはＫ、Ｌ、および／またはＶのうちの１つまたは複数のものと組み合わさったＱの立体配座は、ＱＫＬＶを含む直鎖状ペプチドで占有されているもとは別の立体配座、任意選択でより拘束された立体配座の化合物に含まれている。

【0164】

例えば、別の立体配座は、残基Ｑに、ならびに任意選択で直鎖状ペプチドまたは線維におけるペプチドの二面角と異なるＱおよび／もしくはＫ、ならびに／またはＬおよび／もしくはＶに、１つあるいは複数の異なる二面角を含み得る。

【0165】

別の立体配座は、エピトープの１つまたは複数のアミノ酸側鎖、特にはＱ、同様にＫまたはＬに関して、直鎖状ペプチドおよび／またはＡベータ線維と比較した、側鎖の１つまたは複数の部分の溶媒露出面積（ＳＡＳＡ）の増加または減少を含むことができる。

【0166】

たとえば、図１０（上部のパネル）および図１１は、ＱおよびＬの側鎖が、側鎖を「広げる（ｓｐｌａｙ ｏｕｔ）」、主鎖の湾曲により、直鎖状ペプチドよりも環状化合物においてより溶媒に露出していることを示す。図１１は、側鎖上の特異的な部分を見ており、ＱのＳＡＳＡの増加が、Ｃ_γＨ_２基および／またはＮ_εＨ_２基に由来することを例証している。また、ＬのＳＡＳＡの増加がＣ_δ１Ｈ_３および／またはΟ_δ２Η_３に由来することが、観察できる。

【0167】

一実施形態では、化合物中のＱ、および任意選択でＫまたはＬのうちの１つまたは複数のＳＡＳＡは、直鎖状ペプチドＱＫＬＶ（配列番号１）と比較して増加している。

【0168】

別の立体配座はまた、直鎖状ペプチドおよび／またはＡベータ線維と比較して、アミノ酸を中心とする曲率または環状ペプチドＱＫＬＶ（配列番号１）の曲率の増大を含み得る。

【0169】

一実施形態では、別の立体配座ＱＫＬＶ（配列番号１）は、直鎖状ＱＫＬＶ（配列番号１）と比較して増大した曲率を有する。実施例に示されるように環状エピトープの主鎖における曲率は、同様に、実施例４に記載されるように直鎖状ペプチドまたは線維におけるペプチド（図３）の曲率と比較して増大している。

【0170】

シクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）、直鎖状ＧＣＧＱＫＬＶＧ（配列番号３）および線維におけるＱＫＬＶ（配列番号１）のＱ、Ｋ、Ｌ、Ｖの曲率の値が決定された。実施例４に記載されるように、これらは、
環状ペプチド：１．２４８ １．５６６ １．４２２ １．４６
直鎖状ペプチド：０．８７０ １．３５５ ０．９３１ １．３０３
線維：０．７４０ １．１５９ ０．７９６ １．１８８
であった。これらの平均は、
環状ペプチド：１．４２
直鎖状ペプチド：１．１１
線維：０．９７
である。

【0171】

したがって、別の立体配座のＱ、ならびに／または、Ｋ、Ｌ、および／もしくはＶのうちの１つまたは複数の曲率が、直鎖状ペプチドと比較して少なくとも０．１ラジアン、０．２ラジアン、０．３ラジアンまたはそれ以上増大している。

【0172】

一実施形態では、ＱＫ、ＱＫＬ、および／またはＱＫＬＶ（配列番号１）は、例えば非オリゴマー立体配座でこれら残基によって占められるものと比較して、別の立体配座にある。

【0173】

たとえばＱおよびＫでは、溶解度により重み付けされたＳＡＳＡは、直鎖状ペプチドまたは線維におけるペプチドと比較して、環状ペプチドにおいて増大する。

【0174】

さらに、環状ペプチドでは、側鎖のエントロピーが直鎖状ペプチドと比較して減少しており、側鎖が直鎖状ペプチドよりも構造化された立体配座になっている。

【0175】

環状化合物で好ましい立体配座は、直鎖状ペプチドまたは線維のいずれかで好ましい立体配座と異なっている。具体的には、Ｑの側鎖におけるＣα－Ｃβ－Ｃγ－Ｃδ原子の間の二面角が、環状ペプチドと直鎖状ペプチドとの間で異なるものである。これは、図１４、ならびに図４、５、および６に示されている。

【0176】

図１４では、実線の矢印は、概して環状ペプチドで占められている二面角を示し、破線の矢印は、概して直鎖状ペプチドで占められている二面角を示し、ここで側鎖の一部は半透明に示されている。

【0177】

本明細書で示されるように、環状エピトープの曲率は、直鎖状ペプチドのものまたは線維におけるペプチドと比較して増大している（図３）。また、残基Ｑならびに／またはＬおよび／もしくはＶの二面角のうち１つまたは複数は、直鎖状ペプチドまたは線維におけるペプチドの二面角と大幅に異なることが示されている。さらに、エピトープの１つまたは複数のアミノ酸、特にはＱおよびＫでは、側鎖の溶媒露出面積（ＳＡＳＡ）は、線維におけるペプチドと比較して環状ペプチドにおいて増大している。これらのアミノ酸では、溶解度により重み付けされたＳＡＳＡは、線維におけるペプチドと比較して環状ペプチドにおいて増大している。さらに、側鎖のエントロピーは、直鎖状ペプチドと比較して環状ペプチドにおいて減少しており、側鎖を、直鎖状ペプチドよりも構造化された立体配座にしている（図１３）。

【0178】

同様の変化を示す環状化合物も包含される。

【0179】

ＱＫＬＶ（配列番号１を含むペプチドを含む、いくつかの実施形態の環状化合物は、ＡベータのＱＫＬＶ（配列番号１）の上流および／または下流に１個、２個、３個またはそれ以上の残基を含み得る。このような場合、Ａベータの残基のＮ末端およびＣ末端にスペーサーが共有結合している。

【0180】

一実施形態では、環状化合物は図１２の化合物である。

【0181】

環化ペプチドを作製する方法は当該技術分野で公知であり、ＳＳ環化またはアミド環化（頭－尾環化または主鎖環化）がこれに含まれる。実施例５に方法をさらに記載する。例えば、Ｎ末端およびＣ末端に「Ｃ」残基を有するペプチド、例えばＣＧＱＫＬＶＧＣ（配列番号８）をＳＳ環化により反応させて、環状ペプチドを得ることができる。

【0182】

環状化合物は、環化の前に、Ａベータペプチドを含むペプチドのＮ末端またはＣ末端に共有結合しているリンカーを含む直鎖状分子として合成することができる。あるいは、環化前に、リンカーの一部をＮ末端と共有結合させ、一部をＣ末端と共有結合させる。いずれの場合も、直鎖状化合物を、例えば頭－尾環化（例えば、アミド結合環化）で環化する。

【0183】

一部の実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、ＡベータペプチドのＮ末端およびＣ末端に間接的に結合されている

【0184】

実施例４に記載されるように、図１２Ａの環状化合物について、特定された立体配座エピトープとの関連性を評価した。ＱＫＬＶ（配列番号１）ペプチドを含む環状化合物は、例えば、１つまたは複数の立体配座的特徴に選択的な抗体を生じさせるのに使用することができる。

【0185】

本明細書に記載されるエピトープＱＫＬＶ（配列番号１）および／またはその一部は、Ａベータに含まれるＡベータのミスフォールドされた伝播性の株における潜在的な標的となり得、その立体配座エピトープを認識する抗体は、例えば、そのような伝播性の株の検出に有用であり得る。

【0186】

別の態様では、直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドを含めた本明細書に記載されるＡベータペプチド配列を含む、単離ペプチドも提供される。直鎖状ペプチドは、例えば、それと結合しない抗体の選択に使用することができる。単離ペプチドは、本明細書に記載されるリンカー配列を含み得る。リンカーは、ＧＣＧＱＫＬＶＧ（配列番号３）直鎖状ペプチドでは、Ｎ末端またはＣ末端と共有結合していても、あるいは一部がＮ末端と結合し、一部がＣ末端と結合していてもよい。環状ペプチドでは、リンカーはＣ末端およびＮ末端と直接的または間接的に結合している。

【0187】

別の態様は、本明細書に記載される化合物、任意選択で本明細書中に記載される環状化合物（たとえばＱＫＬ、ＫＬＶ、またはＱＫＬＶ（配列番号１）を含む）を含む、免疫原を含む。

【0188】

免疫原は、対象への投与のために適切に調製または製剤化され、例えば、免疫原は無菌のものまたは精製されたものであり得る。一実施形態では、免疫原は、ＱＫＬＶ（配列番号１）または関連エピトープ配列を含む環状ペプチドである。

【0189】

一実施形態では、免疫原は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性増強物質を含む。免疫原性増強物質は、アミド結合などを介して直接、またはリンカーの官能化可能な部分を介して間接的に、化合物と結合していてよい。（例えば、環状化合物内のＡベータペプチドが６アミノ酸残基であり）リンカーが単一のアミノ酸残基である場合、リンカーは官能化可能な部分（例えば、システイン残基）であり得る。

【0190】

免疫原は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＬａｔｅｅｆら（２００７）に記載されている方法を用いて、拘束されたエピトープペプチドを含む環状化合物と、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性増強物質またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体とをコンジュゲートすることにより作製することができる。一実施形態では、実施例３または４に記載される方法を用いる。

【0191】

さらなる態様は、本明細書に記載される化合物または免疫原のタンパク質性部分をコードする単離核酸である。実施形態では、核酸分子は、配列番号１～１０で示されるアミノ酸配列のいずれか１つをコードする。

【0192】

一実施形態では、核酸分子は、ＱＫＬＶ（配列番号１）または関連エピトープおよび任意選択で、本明細書に記載されるリンカーをコードする。

【0193】

さらなる態様は、前記核酸を含むベクターである。適切なベクターについては本明細書の他の箇所に記載する。

【0194】

ｉｉ）抗体、細胞および核酸
上記の化合物および特に環状化合物を用いて、Ａベータ内のＱＫＬＶ（配列番号１）と特異的に結合する抗体および／またはＡベータのＱＫＬＶ（配列番号１）の特定の立体配座を認識する抗体を生じさせることができる。実施例で例証されているように、環状化合物（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）は免疫原性であり、対応する直鎖状ペプチドと比較して環状化合物を特異的かつ／または選択的に結合する多くの抗体を産生した。さらに、（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）に対して生じさせられた抗体は、Ａベータオリゴマーと特異的かつ／または選択的に結合し、斑と結合しない、もしくはほとんど結合せず、Ａベータ凝集伝播を阻害し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡベータオリゴマー誘導型の神経毒性を阻害した。

【0195】

よって、上述の化合物、特に環状化合物を使用して、本明細書中記載される１つまたは複数の差次的な特徴を含む、ＡベータにおいてＱＫＬＶ（配列番号１）を特異的に結合する抗体、および／またはＡベータにおけるこれら残基の特定の立体配座を認識する抗体を生じさせることができる。同様に、たとえば配列番号１、２、９、または１０などの本明細書中に記載される関連エピトープ配列を含む環状化合物を使用して、ＱＫＬＶ（配列番号１）の立体配座エピトープを特異的、選択的に結合する抗体を生じさせることができる。

【0196】

したがって、一態様は、例えば配列番号１、２、９、または１０のいずれか１つで示される配列ＱＫＬＶ（配列番号１）または関連エピトープ配列を有するＡベータペプチドと特異的に結合する、抗体（その結合フラグメントを含む）を含む。

【0197】

一実施形態では、Ａベータペプチドは環状化合物、任意に環状ペプチド内に含まれており、抗体は、環状化合物内で提示されるＡベータの一部に対して特異的または選択的なものである。

【0198】

一実施形態では、抗体は、任意に直鎖状（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）、たとえば対応する直鎖状配列においてＱＫＬＶ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチドと比較して、シクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）において環状化合物中のＡベータペプチドを選択的に結合する。たとえば、一実施形態では、抗体は、環状立体配座でＱＫＬＶ（配列番号１）を選択的に結合し、かつ、たとえばＥＬＩＳＡもしくは表面プラズモン共鳴により、または任意に本明細書中記載される方法を使用して測定される、直鎖状の不定形の化合物におけるＱＫＬＶ（配列番号１）と比較して環状の立体配座において、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍選択性が大きいＱＫＬＶ（配列番号１）を有する。

【0199】

一実施形態では、抗体は環状化合物のＡベータペプチドと特別かつ／または選択的に結合し、Ａベータは、配列番号１、２、４～１０のいずれか１つで示される配列を有する。

【0200】

一実施形態では、抗体は、直鎖状化合物と比較して、環状化合物において提示される配列番号１～１０のいずれかの配列であるＡベータの一部選択的に結合する。

【0201】

一実施形態では、環状化合物は環状ペプチドである。一実施形態では、環状ペプチド内のＡベータペプチドは配列番号１、２、９、または１０のいずれか１つである。一実施形態では、環状ペプチドは配列番号１～１０の配列のいずれか１つを含む

【0202】

実施例に記載されるように、実施例に記載されるアッセイを用いて、１つまたは複数の特性を有する抗体を選択することができる。

【0203】

一実施形態では、抗体は、配列ＱＫＬＶ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチドとは結合せず、任意選択で、直鎖状ペプチドの配列は、任意選択で配列番号３で示される本明細書中記載される抗体を生じさせるために使用される環状配列の直鎖状型である。

【0204】

一実施形態では、抗体は、立体配座に特異的かつ／または選択的なＡベータの抗体である。例えば、特定のエピトープ立体配座と結合する抗体は、立体配座特異的抗体と呼ぶことができる。このような抗体は、本明細書に記載される方法を用いて選択することができる。立体配座選択的抗体は、特定のＡベータ種または関連種（例えば、二量体、三量体およびその他のオリゴマー種）のグループを区別して認識することが可能であり、ある種または種のグループに対して別の種（例えば、Ａベータモノマー種または線維種）より高い親和性を有し得る。

【0205】

一実施形態では、抗体は単離されている。

【0206】

一実施形態では、抗体は外来抗体である。

【0207】

一実施形態では、抗体はＡベータ上のエピトープと特異的に結合し、エピトープは、ＱＫＬＶ（配列番号１）、その関連エピトープまたは一部を含む、またはこれよりなる。

【0208】

実施例に記載されるように、Ｑおよび／またはＱＫおよび／またはＱＬ残基は、モノマー型および／または線維型とは異なるＡベータの立体配座で主として接触可能である、または露出している。

【0209】

したがって、さらなる態様は、Ａベータ上のエピトープと特異的に結合する抗体であり、ここでは、エピトープは、抗体との結合に主として関与する少なくとも１個のアミノ酸残基を含む、またはこれよりなるものであり、その少なくとも１個のアミノ酸は、配列ＱＫＬＶ（配列番号１）内に組み込まれたＱ、Ｋ、またはＬである。

【0210】

一実施形態では、エピトープは、抗体との結合に主として関与する少なくとも２個の連続するアミノ酸残基を含む、またはこれよりなるものであり、その少なくとも２個の連続するアミノ酸は、ＱＫＬＶ（配列番号１）内に組み込まれたＱＫまたはＫＬである。

【0211】

別の実施形態では、エピトープはＱＫＬＶ（配列番号１）よりなる。

【0212】

一実施形態では、抗体は単量体Ａベータと特異的に結合しない。一実施形態では、抗体は、例えばＡＤの脳組織においてｉｎ ｓｉｔｕで、Ａベータ老人斑と特異的に結合しない。

【0213】

別の実施形態では、抗体は、天然または合成のオリゴマーＡベータより単量体Ａベータと選択的に結合することはない。

【0214】

一実施形態では、抗体は、選択的にＡベータオリゴマーなどのＡベータ種と特異的かつ／または選択的に結合する。一実施形態では、選択性は、ＱＫＬＶ（配列番号１）を含むＡベータモノマーおよび／またはＡベータ線維および／または直鎖状化合物から選択されるＡベータ種よりも、Ａベータオリゴマーに関して少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、高い選択性である。

【0215】

一実施形態では、Ａベータオリゴマーは、Ａベータの１～４２のサブユニットを含む。

【0216】

一実施形態では、抗体はＡベータ線維斑（老人斑とも呼ばれる）染色を示さない。斑染色がみられないことは、Ａベータ特異的抗体である６Ｅ１０および４Ｇ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）または２Ｃ８（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ファーミングデール、ニューヨーク州）、またはＡベータの線維形態に対して反応性のある他のいずれかの抗体などの陽性対照ならびにアイソタイプ対照と比較することにより評価することができる。本明細書に記載される抗体は、その抗体が典型的な斑形態染色を示さず、染色のレベルがＩｇＧ陰性アイソタイプ対照でみられるレベルの２倍と同等またはそれ以下である場合、Ａベータ線維斑染色を示さない、またはほとんど示さないことになる。尺度は、例えば、アイソタイプ対照での染色レベルを１に設定し、６Ｅ１０での染色レベルを１０に設定することができる。抗体は、そのような尺度で染色レベルが２以下である場合、Ａベータ線維斑染色を示さないことになる。実施形態では、抗体は、例えば上記の尺度で、最小限のＡベータ線維斑染色を示し、そのレベルのスコアは少なくとも３程度または３未満である。

【0217】

一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。

【0218】

モノクローナル抗体を作製するには、本明細書に記載される免疫原で免疫感作した対象から抗体産生細胞（リンパ球）を回収し、標準的な体細胞融合法によりミエローマ細胞と融合し、それにより上記の細胞を不死化してハイブリドーマ細胞を得ることができる。このような技術は当該技術分野で周知である（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより最初に開発されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７（１９７５））ならびにその他の技術、例えばヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３））、ヒトモノクローナル抗体を作製するＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１２１：１４０－６７（１９８６））およびコンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング（Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５（１９８９）など）。筋萎縮性側索硬化症に特異的なエピトープと特異的に反応する抗体の産生に関してハイブリドーマ細胞を免疫学的にスクリーニングし、モノクローナル抗体を単離することができる。

【0219】

特定の抗原または分子に対して反応性の特異的抗体または抗体フラグメントはまた、細胞表面成分とともに細菌内で発現する免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードする発現ライブラリーをスクリーニングすることにより作製し得る。例えば、ファージ発現ライブラリーを用いて、完全Ｆａｂフラグメント、ＶＨ領域およびＦＶ領域を細菌内で発現させることができる（例えば、Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ ４１：５４４－５４６（１９８９）；Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１（１９８９）；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）を参照されたい）。

【0220】

一実施形態では、抗体はヒト化抗体である。

【0221】

非ヒト種からの抗体のヒト化については文献に十分に記載されている。例えば、欧州特許第号第０２３９４００号（Ｂ１）ならびにＣａｒｔｅｒおよびＭｅｒｃｈａｎｔ １９９７（全体が参照により本明細書に組み込まれるＣｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ８，４４９－４５４，１９９７）を参照されたい。ヒト化抗体はまた、商業的に容易に入手できる（例えば、イギリス、ミドルセックス、トゥイッケナム、ホーリーロード２番のＳｃｏｔｇｅｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）。

【0222】

ヒト化型のげっ歯類抗体は、ＣＤＲ移植（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２７，１９８８）によって容易に作製される。この方法では、げっ歯類モノクローナル抗体の抗原結合部位を含む６つのＣＤＲループと、対応するヒトフレームワーク領域とを結合させる。ＣＤＲ移植では、フレームワーク領域のアミノ酸が抗原認識に影響を及ぼし得ることから、親和性が低下した抗体が得られることが多い（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２２４：４８７－４９９，１９９２）。抗体の親和性を維持するには多くの場合、部位特異的変異誘発またはその他の組換え技術により特定のフレームワーク残基を置き換える必要があり、コンピュータによる抗原結合部位のモデル化を援用することもある（Ｃｏら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：２９６８－２９７６，１９９４）。

【0223】

ヒト化型の抗体は任意選択で、リサーフィシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２３５：９５９－９７３，１９９４）によって得られる。この方法ではげっ歯類抗体の表面残基のみをヒト化する。

【0224】

特定の抗原に特異的なヒト抗体は、ファージディスプレイ戦略（Ｊｅｓｐｅｒｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：８９９－９０３，１９９４）によって特定され得る。１つの方法では、特異的抗原に対するげっ歯類抗体の重鎖をクローン化し、ヒト軽鎖のレパートリーと対にして、繊維状ファージ上にＦａｂフラグメントとして提示させる。抗原との結合によりファージを選択する。次いで、選択されたヒト軽鎖をヒト重鎖のレパートリーと対にしてファージ上に提示させ、再び抗原との結合によりファージを選択する。その結果は、特定の抗原に特異的なヒト抗体Ｆａｂフラグメントとなる。別の方法では、メンバーがその外表面に様々なヒト抗体フラグメント（ＦａｂまたはＦｖ）を提示するファージのライブラリーを作製する（Ｄｏｗｅｒら，国際公開第９１／１７２７１号およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，国際公開第９２／０１０４７号）。特異的抗原に対するアフィニティー濃縮により所望の特異性を有する抗体を提示するファージを選択する。いずれかの方法で特定されたヒトＦａｂフラグメントまたはヒトＦｖフラグメントをクローン化して、哺乳動物細胞でヒト抗体として発現させ得る。

【0225】

ヒト抗体は任意選択で、トランスジェニック動物から得られる（米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，１１４，５９８号；および同第５，７７０，４２９号）。この方法では、キメラマウスまたは生殖系列変異体マウスの重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子を欠失させる。次いで、そのような変異体マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを導入する。次いで、得られたトランスジェニックマウスは抗原曝露時にヒト抗体の全レパートリーを作製することが可能になる。

【0226】

ヒト化抗体またはヒトの抗体を含む抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＥを含めた任意のクラスの免疫グロブリン；ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択される。キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体は、１つまたは２つ以上のアイソタイプまたはクラスに由来する配列を含み得る。

【0227】

さらにこれらの抗体は通常、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖおよび単一ドメイン抗体フラグメントなどの抗原結合フラグメントまたは重鎖と軽鎖がスペーサーにより連結された一本鎖抗体として作製される。また、ヒト抗体またはヒト化抗体はモノマー型またはポリマー型で存在し得る。ヒト化抗体は任意選択で、１本の非ヒト鎖と１本のヒト化鎖（すなわち、１本のヒト化重鎖または軽鎖）とを含む。

【0228】

さらに、本明細書に記載されるエピトープに特異的な抗体は、抗体ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることにより容易に単離される。例えば、任意選択で本発明の疾患特異的エピトープを用いることにより抗体ファージライブラリーをスクリーニングして、疾患特異的なエピトープに特異的な抗体フラグメントを特定する。任意選択で、特定された抗体フラグメントを用いて、本発明の様々な実施形態に有用な様々な組換え抗体を作製する。抗体ファージディスプレイライブラリーは、例えばＸｏｍａ社（バークレー、カリフォルニア州）から市販されている。ファージライブラリーをスクリーニングする方法は当該技術分野で周知である。

【0229】

さらなる態様は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、重鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が、以下に記載する配列を含む、抗体および／またはその結合フラグメントである。

【0230】

【表2】

【0231】

一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗体はキメラ抗体、例えば表６および／または８に記載されるＣＤＲ配列を含むヒト化抗体などである。

【0232】

別の実施形態では、任意選択で一本鎖抗体において、表６および／または８のＣＤＲと軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む、抗体も提供される。

【0233】

さらに別の態様では、抗体は、ｉ）配列番号１８もしくは２８で示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号１８もしくは２８と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＣＤＲ配列が配列番号１１、１２、１３、２１、２２、および／もしくは２３で示される、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）保存的に置換されたアミノ酸配列ｉ）を含む、重鎖可変領域を含む。別の態様では、抗体は、ｉ）配列番号２０もしくは３０で示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号２０もしくは３０と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％ 少なくとも７０％の配列同一性を有し、ＣＤＲ配列が配列番号１４、１５、１６、２４、２５、および／もしくは２６で示される、アミノ酸配列、またはｉｉｉ）保存的に置換されたｉ）のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域アミノ酸配列が、配列番号１７または２７で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重最適化型によってコードされている。別の実施形態では、抗体は、配列番号１９または２９で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくコドン最適化型によってコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は配列番号１８または２８で示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号２０または３０で示されるアミノ酸配列を含む。

【0234】

別の態様は、表６および／または８に記載されるＣＤＲ配列を有する抗体と同じエピトープと特異的に結合する抗体である。

【0235】

別の態様は、ヒトＡベータとの結合に関して、表６および／または８に記載されるＣＤＲ配列を含む抗体と競合する、抗体を含む。

【0236】

抗体間の競合は、例えば、被験抗体が参照抗体と共通の抗原との特異的結合を阻害する能力を評価するアッセイを用いて判定することができる。競合結合アッセイで測定したとき、過剰の被験抗体（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍または２０倍）が参照抗体の結合を少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％阻害する場合、被験抗体は参照抗体と競合することになる。

【0237】

さらなる態様は、治療剤、検出可能な標識または細胞毒性物質とコンジュゲートした抗体である。一実施形態では、検出可能な標識は陽電子放出放射性核種である。陽電子放出放射性核種は、例えばＰＥＴ撮像で使用され得る。

【0238】

さらなる態様は、本明細書に記載される抗体および／またはその結合フラグメントとオリゴマーＡベータとを含む、抗体複合体に関する。

【0239】

さらなる態様は、本明細書に記載される抗体またはその一部をコードする、単離核酸である。

【0240】

また、重鎖または軽鎖をコードする、例えば、本明細書に記載されるＣＤＲ－Ｈ１領域、ＣＤＲ－Ｈ２領域および／またはＣＤＲ－Ｈ３領域を含む重鎖をコードする、あるいは本明細書に記載されるＣＤＲ－Ｌ１領域、ＣＤＲ－Ｌ２領域および／またはＣＤＲ－Ｌ３領域を含む軽鎖をコードする、核酸も提供される。

【0241】

本開示はまた、本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸配列のバリアントを提供する。例えば、バリアントとしては、本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸配列と少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列またはコドン縮重配列もしくはコドン最適化配列が挙げられる。別の実施形態では、バリアント核酸配列は、配列番号１８、２０、２８、および３０のうちのいずれか１つを含む本明細書中に記載されるタンパク質性配列をコードする核酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらに最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。

【0242】

一実施形態では、核酸は単離核酸である。

【0243】

別の態様は、本明細書に開示される核酸を含む発現カセットまたはベクターである。一実施形態では、ベクターは単離ベクターである。

【0244】

ベクターは、抗体および／またはその結合フラグメントの作製あるいは本明細書に記載されるエピトープペプチド配列の発現に適したベクターを含めた任意のベクターであり得る。

【0245】

既知の方法で、タンパク質を確実に発現させる適切な発現ベクター内に核酸分子を組み込み得る。考え得る発現ベクターとしては、特に限定されないが、コスミド、プラスミドまたは改変ウイルス（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。ベクターは使用する宿主細胞と適合性のあるものであるべきである。発現ベクターは「宿主細胞の形質転換に適した」ものであり、これは、その発現ベクターが、本明細書に記載されるエピトープまたは抗体に対応するペプチドをコードする核酸分子を含んでいることを意味する。

【0246】

一実施形態では、ベクターは、遺伝子治療により例えば一本鎖抗体を発現させるのに適したものである。ベクターは、例えば神経特異的プロモーターなどを用いて、神経組織での特異的発現に適合させることができる。一実施形態では、ベクターは、ＩＲＥＳを含み、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の発現を可能にする。このようなベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を送達するのに用いることができる。

【0247】

適切な制御配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物または昆虫の遺伝子を含めた様々な供給源に由来するものであり得る。

【0248】

このような制御配列の例としては、転写プロモーターおよび転写エンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含めたリボソーム結合配列が挙げられる。さらに、選択する宿主細胞および用いるベクターに応じてその他の配列、例えば複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサーおよび転写の誘導性を付与する配列などを発現ベクター内に組み込み得る。

【0249】

一実施形態では、制御配列は、神経組織および／または細胞での発現を指令する、または増大させる。

【0250】

一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。

【0251】

組換え発現ベクターはまた、本明細書に記載される抗体またはエピトープペプチドを発現させるためにベクターにより形質転換、感染または形質移入した宿主細胞の選択を容易にするマーカー遺伝子を含み得る。

【0252】

組換え発現ベクターはまた、組換えペプチドを発現または安定性を増大させる；組換えペプチドの溶解度を増大させる；ならびに例えば本明細書に記載されるタグおよび標識を含めたアフィニティー精製のリガンドとして作用することにより標的組換えペプチドの精製を補助する融合部分（すなわち、「融合タンパク質」）をコードする、発現遺伝子を含み得る。さらに、標的組換えタンパク質にタンパク質分解切断部位を付加して、融合タンパク質精製後に融合部分から組換えタンパク質を分離させ得る。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ社、メルボルン、オーストラリア）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、ビバリー、マサチューセッツ州）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）が挙げられ、これらは組換えタンパク質にそれぞれグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを融合させるものである。

【0253】

例えばニューロンおよび神経組織内にｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で遺伝子を導入するシステムとしては、ウイルス、中でもとりわけ単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレンチウイルスを含めたレトロウイルスに基づくベクターが挙げられる。これに代わる遺伝子送達の方法としては、裸のプラスミドＤＮＡおよびリポソーム－ＤＮＡ複合体の使用が挙げられる。別の方法には、ＤＮＡをポリカチオン濃縮して脂質に封入し、脳内遺伝子送達により脳内に導入する、ＡＡＶプラスミドの使用（Ｌｅｏｎｅら，米国特許出願公開第２００２０７６３９４号）がある。

【0254】

したがって、別の態様では、本明細書に記載される化合物、免疫原、核酸、ベクターおよび抗体をリポソーム、ナノ粒子およびウイルスタンパク質粒子などの小胞で製剤化し、例えば、本明細書に記載される抗体、化合物、免疫原および核酸を送達し得る。特に、ポリマーソームを含めた合成ポリマー小胞を用いて抗体を投与することができる。

【0255】

別の態様では、本明細書に記載される抗体を発現する、または本明細書に開示される発現カセットもしくはベクターを含む細胞、任意選択で単離細胞および／または組換え細胞も提供される。

【0256】

組換え細胞は、ポリペプチドの産生に適した、例えば抗体および／またはその結合フラグメントの産生に適した任意の細胞を用いて作製することができる。例えば、核酸（例えば、ベクター）を細胞内に導入するには、用いるベクターに応じて、細胞に形質移入し得る、細胞を形質転換し得る、または細胞に感染させ得る。

【0257】

適切な宿主細胞としては、多種多様な原核宿主細胞および真核宿主細胞が挙げられる。例えば、本明細書に記載されるペプチドおよび抗体を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルスを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞で発現させ得る。

【0258】

一実施形態では、細胞は、酵母細胞、植物細胞、蠕虫細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞および哺乳動物細胞から選択される真核細胞である。

【0259】

一実施形態では、細胞は、ハイブリドーマ細胞などの融合した細胞である。

【0260】

別の実施形態では、哺乳動物細胞は、ミエローマ細胞、脾臓細胞またはハイブリドーマ細胞である。

【0261】

一実施形態では、細胞は神経細胞である。

【0262】

抗体またはペプチドを発現させるのに適した酵母宿主細胞および真菌宿主細胞としては、特に限定されないが、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属またはクリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の様々な種が挙げられる。酵母（Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅ）で発現させるためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）が挙げられる。酵母および真菌を形質転換させるプロトコルは当業者に周知である。

【0263】

適切であり得る哺乳動物細胞としては、特にＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０または１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６２８１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）、２９３（ＡＴＣＣ番号１５７３）およびＮＳ－１細胞が挙げられる。哺乳動物細胞での発現を指令するのに適した発現ベクターは一般に、プロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０などのウイルス材料由来のもの）ならびにその他の転写制御配列および翻訳制御配列を含む。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８およびｐＭＴ２ＰＣが挙げられる。

【0264】

さらなる態様は、本明細書に記載されるエピトープに特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株である。

【0265】

組成物
さらなる態様は、本明細書に記載される化合物、免疫原、核酸、ベクターまたは抗体を含む組成物である。

【0266】

一実施形態では、組成物は希釈剤を含む。

【0267】

核酸に適した希釈剤としては、特に限定されないが、水、生理食塩水およびエタノールが挙げられる。

【0268】

抗体もしくはそのフラグメントを含めたポリペプチドおよび／または細胞に適した希釈剤としては、特に限定されないが、生理食塩水、ｐＨ緩衝溶液およびグリセロール溶液あるいはポリペプチドおよび／または細胞を凍結させるのに適した他の溶液が挙げられる。

【0269】

一実施形態では、組成物は、本明細書に開示されるペプチド、免疫原、抗体、核酸またはベクターのいずれかを含み、任意選択で薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物である。

【0270】

本明細書に記載される組成物は、対象に投与することができる薬学的に許容される組成物を調製する既知の方法それ自体により、任意選択でワクチンとして、有効量の活性物質が薬学的に許容される溶媒との混合物の形で組み合わさるように調製することができる。

【0271】

医薬組成物としては、特に限定されないが、凍結乾燥粉末剤または水性もしくは非水性の無菌注射用液剤もしくは無菌注射用懸濁剤が挙げられ、これらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および組成物を目的とする被投与者の組織または血液に実質的に適合させる溶質をさらに含有し得る。このような組成物中に記載の存在し得るその他の成分としては、例えば水、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎなど）、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油が挙げられる。無菌粉末剤、顆粒剤、錠剤または濃縮した液剤もしくは懸濁剤から即時注射液剤および即時注射懸濁剤を調製し得る。組成物は、例えば、特に限定されないが、患者に投与する前に滅菌水または生理食塩水で再構築する凍結乾燥粉末として供給され得る。

【0272】

医薬組成物は薬学的に許容される担体を含み得る。適切な薬学的に許容される担体としては、実質的に化学的に不活性で無毒性であり医薬組成物の生物活性の効果に干渉しない組成物を含む。適切な医薬担体の例としては、特に限定されないが、水、生理食塩水、グリセロール溶液、エタノール、Ｎ－（１（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレシルホスファチジル－エタノールアミン（ｄｉｏｌｅｓｙｌｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌ－ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＤＯＰＥ）およびリポソームが挙げられる。このような組成物は、患者に直接投与する形態になるように、治療有効量の化合物を適量の担体とともに含有するべきである。

【0273】

組成物は薬学的に許容される塩の形態であり得、このような塩としては、特に限定されないが、遊離アミノ基を用いて形成される塩、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するなどおよび遊離カルボキシル基を用いて形成される塩、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアルニノエタノール（２－ｅｔｈｙｌａｒｎｉｎｏ ｅｔｈａｎｏｌ）、ヒスチジン、プロカインなどに由来するなどが挙げられる。

【0274】

本明細書に記載される化合物または免疫原を含む実施形態では、組成物はアジュバントを含む。

【0275】

使用し得るアジュバントとしては例えば、通常、ワクチンとして使用される死菌または弱毒菌の成分である、内因性アジュバント（リポ多糖など）が挙げられる。外因性アジュバントには、通常、抗原と非共有結合し、宿主免疫応答を増強するよう製剤化される、免疫調節物質がある。水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（一般にミョウバンと総称される）はアジュバントとして日常的に使用される。様々なアジュバントが免疫原に対する強力な免疫応答を引き起こし得る。このようなものとしては、サポニン、例えばＳｔｉｍｕｌｏｎ（ＱＳ２１、Ａｑｕｉｌａ社、ウスター、マサチューセッツ州）またはそれから生成されるＩＳＣＯＭおよび（免疫刺激複合体）および膜タンパク質抗原と複合体を形成したＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（免疫刺激複合体）などの粒子など、プルロニックポリマーと鉱油、死滅マイコバクテリアと鉱油、フロイント完全アジュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖などの細菌生成物ならびにリピドＡおよびリポソームが挙げられる。

【0276】

一実施形態では、アジュバントは水酸化アルミニウムである。別の実施形態では、アジュバントはリン酸アルミニウムである。水中油型乳剤としては、スクアレン；ラッカセイ油；ＭＦ５９（国際公開第９０／１４３８７号）；ＳＡＦ（Ｓｙｎｔｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、パロアルト、カリフォルニア州）；およびＲｉｂｉ（商標）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ社、ハミルトン、モンタナ州）が挙げられる。水中油型乳剤は、免疫刺激物質、例えばムラミルペプチド（例えば、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－スレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ｎｏｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）、Ｎ－アセチルグルクサミニル－Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－Ａｌ－Ｄ－イソグル－Ｌ－Ａｌａ－ジパルミトキシプロピルアミド（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｓａｍｉｎｙｌ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ－Ｌ－Ａｌ－Ｄ－ｉｓｏｇｌｕ－Ｌ－Ａｌａ－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｘｙ ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄｅ）（ＤＴＰ－ＤＰＰ）、ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標））またはその他の細菌細胞壁成分とともに使用し得る。

【0277】

アジュバントを単一組成物として免疫原とともに投与し得る。あるいは、アジュバントを免疫原投与の前に、免疫原投与と同時に、かつ／または免疫原投与の後に投与し得る。

【0278】

アジュバントは一般に、リン酸緩衝生理食塩水に溶かした０．０５～１．０パーセント溶液として使用される。アジュバントは免疫原の免疫原性を増強するが、アジュバント自体は必ずしも免疫原性であるわけではない。アジュバントは、投与部位付近に免疫原を局所的に保持することよって作用し、免疫系細胞への免疫原の緩徐で持続的な放出を促進するデポとしての効果をもたらし得る。アジュバントはまた、免疫原デポに免疫系細胞を誘引し、そのような細胞を刺激して免疫応答を誘発し得る。したがって、諸実施形態は、アジュバントをさらに含む組成物を包含する。

【0279】

非経口免疫感作のためのアジュバントとしては、アルミニウム化合物（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびヒドロキシリン酸アルミニウム）が挙げられる。標準的プロトコルに従って、抗原をアルミニウム化合物とともに沈殿させる、またはアルミニウム化合物上に吸着させることができる。ＲＩＢＩ（ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ社、ハミルトン、モンタナ州）などのその他のアジュバントも非経口投与に使用することができる。

【0280】

粘膜免疫感作のためのアジュバントとしては、細菌毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）、ディフィシル菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび百日咳毒素（ＰＴ）またはその組合せ、サブユニット、トキソイドもしくは変異体）が挙げられる。例えば、天然のコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）の精製調製物が有用であり得る。上記のいずれかの毒素のフラグメント、ホモログ、誘導体および融合物も、アジュバント活性を保持している限り適切なものである。好ましくは、毒性が低下した変異体を使用する。適切な変異体については、（例えば、国際公開第９５／１７２１１号（Ａｒｇ－７－Ｌｙｓ ＣＴ変異体）、国際公開第９６／６６２７号（Ａｒｇ－１９２－Ｇｌｙ ＬＴ変異体）および国際公開第９５／３４３２３号（Ａｒｇ－９－ＬｙｓおよびＧｌｕ－１２９－Ｇｌｙ ＰＴ変異体）に）既に記載されている。方法および組成物に使用し得る追加のＬＴ変異体としては、例えば、Ｓｅｒ－６３－Ｌｙｓ変異体、Ａｌａ－６９－Ｇｌｙ変異体、Ｇｌｕ－１１０－Ａｓｐ変異体およびＧｌｕ－１１２－Ａｓｐ変異体が挙げられる。その他のアジュバント（様々な供給源（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍもしくはシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ））の細菌モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、サポニンまたはポリラクチドグリコリド（ＰＬＧＡ）マイクロスフェアなど）も粘膜投与に使用することができる。

【0281】

その他のアジュバントとしては、インターロイキンなどのサイトカイン、例えばＩＬ－１、ＩＬ－２およびＩＬ－１２、ケモカイン、例えばＣＸＣＬ１０およびＣＣＬ５、マクロファージ刺激因子ならびに／あるいは腫瘍壊死因子が挙げられる。使用し得るその他のアジュバントとしては、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｄａｖｉｓ．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４７：１７１－１８３，２０００）が挙げられる。

【0282】

水中油型乳剤としては、スクアレン；ラッカセイ油；ＭＦ５９（国際公開第９０／１４３８７号）；ＳＡＦ（Ｓｙｎｔｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、パロアルト、カリフォルニア州）；およびＲｉｂｉ（商標）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ社、ハミルトン、モンタナ州）が挙げられる。水中油型乳剤は、免疫刺激物質、例えばムラミルペプチド（例えば、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－スレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ｎｏｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）、Ｎ－アセチルグルクサミニル－Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－Ａｌ－Ｄ－イソグル－Ｌ－Ａｌａ－ジパルミトキシプロピルアミド（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｓａｍｉｎｙｌ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ－Ｌ－Ａｌ－Ｄ－ｉｓｏｇｌｕ－Ｌ－Ａｌａ－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｘｙ ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄｅ）（ＤＴＰ－ＤＰＰ）、ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標））またはその他の細菌細胞壁成分とともに使用され得る。

【0283】

粘膜免疫感作および非経口免疫感作の両方に有用なアジュバントとしては、ポリホスファゼン（例えば、国際公開第９５／２４１５号）、ＤＣ－ｃｈｏｌ（３ｂ－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノメタン）－カルバモイル）コレステロール（例えば、米国特許第５，２８３，１８５号および国際公開第９６／１４８３１）号およびＱＳ－２１（例えば、国際公開第８８／９３３６号）が挙げられる。

【0284】

アジュバントを免疫原と結合させて投与し得る。例えば、免疫原を含むペプチドの立体配座の変化が免疫原に対する免疫応答の性質に影響を及ぼさないように、パルミチン酸などの脂質を１つまたは複数のペプチドと直接結合させ得る。

【0285】

アジュバントは、単一の組成物として免疫原と共に投与してもよい。さらにアジュバントは、免疫原の投与の前、投与中、または投与後に投与されてもよい。

【0286】

一実施形態では、組成物は本明細書に記載される抗体を含む。別の実施形態では、組成物は、本明細書に記載される抗体と希釈剤とを含む。一実施形態では、組成物は無菌組成物である。

【0287】

キット
さらなる態様は、無菌バイアルなどのバイアルあるいはその他の筐体に入った本明細書に記載されるｉ）抗体および／またはその結合フラグメント、ｉｉ）核酸、ｉｉｉ）組成物あるいはｉｖ）組換え細胞と、任意選択で参照物質および／またはキットの使用のための説明書とを含む、キットに関する。

【0288】

一実施形態では、キットは、収集バイアル、標準緩衝液および検出試薬のうちの１つまたは複数のものをさらに含む。

【0289】

方法
本明細書に記載される化合物、免疫原および抗体を作製する方法が含まれる。

【0290】

特に、ＱＫＬＶ（配列番号１）または関連エピトープの立体配座エピトープに選択的な抗体を作製する方法であって、対象、任意選択で非ヒト対象に本明細書に記載されるエピトープ配列を含み立体配座的に制約のある化合物、任意選択でＱＫＬＶ（配列番号１）または関連エピトープを含む環状化合物を投与することと、環状化合物と特異的または選択的に結合し、任意選択で、ｉ）合成および／または天然のオリゴマーと特異的または選択的に結合し、かつ／あるいはｉｎ ｓｉｔｕ組織試料で老人斑との結合が全くもしくはほとんどみられない、または対応する直鎖状ペプチドとの結合が全くもしくはほとんどない、抗体産生細胞あるいは抗体を単離することとを含む、方法が提供される。環状化合物は、例えば、本明細書に記載される環状化合物を含む、本明細書に記載されるいずれかの「エピトープ」を含み得る。

【0291】

一実施形態では、この方法は、例えば本明細書に記載される方法を用いて、モノクローナル抗体を作製するためのものである。

【0292】

一実施形態では、この方法は、例えば本明細書に記載される方法を用いて、ヒト化抗体を作製するためのものである。

【0293】

環状化合物を用いて作製する抗体は、本明細書および実施例に記載される通りに選択される。一実施形態では、この方法は、任意選択で本明細書に記載される方法を用いて、直鎖状ペプチドよりも環状ペプチドと特異的または選択的に結合し、エピトープ配列に特異的であり、オリゴマーと特異的に結合し、かつ／あるいはｉｎ ｓｉｔｕの斑および／または対応する直鎖状ペプチドと結合しない、またはほとんど結合しない抗体を単離することを含む。

【0294】

さらなる態様では、生体試料がＡベータを含むかどうかを検出する方法であって、生体試料と本明細書に記載される抗体とを接触させることと、何らかの抗体複合体の存在を検出することとを含む、方法が提供される。一実施形態では、この方法は、生体試料がＡベータを含むかどうかを検出するための方法である。一実施形態では、この方法は、試料がＡベータを含むかどうかを検出するための方法であって、ここでは、ＱＫＬＶ（配列番号１）または関連するエピトープが別の立体配座にあり、たとえば少なくともＱ、Ｌ、またはＶが、非オリゴマーの立体配座にあるＱ、Ｌ、またはＶにより占められている立体配座と別の立体配座にある。

【0295】

一実施形態では、この方法は、
ａ．抗体：Ａベータオリゴマー複合体の形成が可能な条件下で、生体試料と、本明細書のＡベータオリゴマーに特異的かつ／または選択的な本明細書に記載される抗体とを接触させること；および
ｂ．何らかの複合体の存在を検出すること
を含み、
検出可能な複合体の存在により、試料がＡベータオリゴマーを含有し得ることが示される。

【0296】

一実施形態では、形成された複合体のレベルを、適切なＩｇ対照または無関係な抗体などの被験抗体と比較する。

【0297】

一実施形態では、検出を定量化し、生成した複合体の量を測定する。測定は、例えば標準物質に対して相対的なものであり得る。

【0298】

一実施形態では、測定された量を対照と比較する。

【0299】

別の実施形態では、この方法は、
（ａ）抗体－抗原複合体の生成が可能な条件下で、前記対象の生体試料と本明細書に記載される抗体とを接触させること；
（ｂ）被験試料中の抗体－抗原複合体の量を測定すること；および
（ｃ）被験試料中の抗体－抗原複合体の量と対照とを比較すること
を含み、
対照と比較して生体試料中に抗体－抗原複合体が検出されることにより、試料がＡベータを含むことが示される。

【0300】

対照は、試料対照（例えば、ＡＤを有さない対象または軽度、中等度もしくは進行型といった特定の型のＡＤを有する対象に由来するもの）または対象のＡベータオリゴマーレベルの変化をモニターするための同じ対象由来の以前の試料であり得る。

【0301】

一実施形態では、本明細書に記載される抗体を使用する。

【0302】

一実施形態では、ＱＫＬＶ（配列番号１）の立体配座エピトープを含むＡベータは、Ａベータオリゴマーであって、抗原：抗体複合体の存在を検出することが、試料がＡベータオリゴマーを含み得ることを示す。

【0303】

一実施形態では、抗体は、ＱＫＬＶ（配列番号１）または関連立体配座エピトープを含むＡベータの立体配座を特異的かつ／または選択的に認識し、生体試料中に抗体抗原複合体が検出されることにより、試料がＡベータオリゴマーを含むことが示される。

【0304】

一実施形態では、試料は生体試料である。一実施形態では、試料は、脳組織もしくはその抽出物および／またはＣＳＦを含む。一実施形態では、試料は、全血、血漿または血清を含む。一実施形態では、試料はヒト対象から採取されるものである。一実施形態では、対象は、ＡＤが疑われる、ＡＤのリスクがある、またはＡＤを有する。

【0305】

本明細書に記載される抗体を用いてＡベータ：抗体複合体を検出し、それにより生体試料中にＱＫＬＶ（配列番号１）もしくは関連立体配座エピトープを含むＡベータおよび／またはＡベータオリゴマーが存在するかどうかを判定するには、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡおよび免疫沈降とそれに続くＳＤＳ－ＰＡＧＥなどのイムノアッセイならびに免疫細胞化学を含めたいくつかの方法を用いることができる。

【0306】

実施例に記載されるように、表面プラズモン共鳴技術を用いて立体配座特異的結合を評価することができる。抗体を標識する、または複合体の抗体に特異的な検出可能に標識した二次抗体を用いる場合、その標識を検出することができる。一般に用いられる試薬としては、蛍光発光抗体およびＨＲＰ標識抗体が挙げられる。定量的方法では、発生したシグナルの量を標準物質または対照との比較により測定することができる。測定はまた、相対的なものであり得る。

【0307】

さらなる態様は、対象または組織中のＡベータのレベルを測定する、またはそのようなＡベータを撮像する方法であって、任意選択で、測定または撮像するＡベータがオリゴマーＡベータである、方法を含む。一実施形態では、この方法は、ＡＤを有するリスクがある、ＡＤを有することが疑われる、またはＡＤを有する対象に検出可能な標識とコンジュゲートした抗体を投与すること；および標識を検出すること、任意選択で標識を定量的に検出することを含む。標識は、一実施形態では、例えばＰＥＴ撮像に使用することができる陽電子放出放射性核種である。

【0308】

さらなる態様は、対象に免疫応答を誘導する方法であって、対象に本明細書に記載される化合物、任意選択で、ＱＫＬＶ（配列番号１）もしくは関連エピトープペプチド配列を含む環状化合物、免疫原および／または前記化合物もしくは前記免疫原を含む組成物を投与すること；ならびに任意選択で、投与した化合物または免疫原中のＡベータペプチドと特異的および／または選択的に結合する細胞および／または抗体を単離することを含む、方法を含む。一実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤または担体と混合した化合物または免疫原を含む、医薬組成物である。

【0309】

一実施形態では、対象はげっ歯類などの非ヒト対象である。作製された抗体産生細胞は、一実施形態ではハイブリドーマ細胞系を作製するために使用する。

【0310】

一実施形態では、投与する免疫原は、図１２に示される化合物を含む。

【0311】

本明細書では、シクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体が、Ａベータオリゴマーと特異的かつ／または選択的に結合し、Ａベータ斑染色を示さないことが示される。オリゴマーＡベータ種は、ＡＤにおいて毒性のある伝播性の種であると考えられる。さらに、図２１に示されるように、シクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）を用いて生じさせ、オリゴマーに特異的な抗体は、Ａベータの凝集およびＡベータオリゴマーの伝播を阻害した。さらに、このような抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイにおいて、神経細胞でＡベータオリゴマーの毒性を阻害した（図２２）。したがって、Ａベータオリゴマーの伝播を阻害する方法であって、有効量の本明細書に記載されるＡベータオリゴマーに特異的または選択的な抗体を、Ａベータを発現する細胞もしくは組織と接触させる、または必要とする対象に投与して、Ａベータの凝集および／またはオリゴマーの伝播を阻害することを含む、方法も提供される。実施例１０に記載されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイをモニターすることができる。

【0312】

抗体はまた、ＡＤおよび／またはその他のＡベータアミロイド関連疾患の治療に有用であり得る。例えば、レビー小体型認知症のバリアントおよび封入体筋炎（筋肉疾患の１つ）では、ＡＤと類似した斑がみられ、またＡベータは脳アミロイド血管症に関与する凝集体をも形成し得る。上記のように、シクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）に対して生じさせた抗体は、ＡＤの毒素原性のＡベータ種であると考えられるオリゴマーＡベータと結合し、毒素原性Ａベータオリゴマーの形成および伝搬を阻害する。

【0313】

したがって、さらなる態様は、ＡＤおよび／またはその他のＡベータアミロイド関連疾患を治療する方法であって、必要とする対象にｉ）有効量の本明細書に記載される抗体、任意選択で、前記抗体を含むＡベータオリゴマー特異的もしくはＡベータオリゴマー選択的組成物または医薬組成物を投与すること；あるいは２）必要とする対象にＱＫＬＶ（配列番号１）もしくは関連エピトープ配列を含む単離環状化合物、免疫原または前記環状化合物を含む医薬組成物を投与することを含む、方法である。

【0314】

一実施形態では、本明細書に記載される抗体を用いて、治療する対象由来の生体試料をＡベータの有無またはレベルに関して評価する。一実施形態では、検出可能なＡベータレベル（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定される、または撮像により測定されるＡベータ抗体複合体）を有する対象を抗体で治療する。

【0315】

抗体および免疫原を例えば、本明細書に記載される医薬組成物に含ませ、例えば小胞に製剤化して送達を改善することができる。

【0316】

シクロＣＧＱＫＬＶＧ（配列番号３）を標的とする１つまたは複数の抗体および／または関連抗体を組み合わせて投与することができる。さらに、本明細書に開示される抗体をベータセクレターゼ阻害剤またはコリンエステラーゼ阻害剤などの１つまたは複数の他の治療剤とともに投与することができる。

【0317】

一実施形態では、抗体は、任意選択でＡベータオリゴマーと特異的または選択的に結合する、立体配座特異的／選択的抗体である。

【0318】

また、ＡＤを標的とする組成物、抗体、単離ペプチド、免疫原および核酸の使用が提供される。

【0319】

本明細書に記載される組成物、化合物、抗体、単離ペプチド、免疫原および核酸、ベクターなどを、例えば、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、脳室内投与、髄腔内投与、眼窩内、点眼、脊髄内投与、槽内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、エアゾール投与または経口投与により投与することができる。

【0320】

ある特定の実施形態では、医薬組成物を全身投与する。

【0321】

他の実施形態では、医薬組成物を脳またはＣＮＳの他の部分に直接投与する。例えば、このような方法は、埋込み型カテーテルおよびポンプの使用を含み、これらはカテーテルを通して注入部位に所定用量を放出するものである。当業者であればさらに、理解されよう。カテーテルは、それを可視化して脳内の所望の投与部位または注入部位に隣接する位置に配置することが可能な外科技術により埋め込まれ得る。このような技術は、参照により本明細書に組み込まれるＥｌｓｂｅｒｒｙらの米国特許第５，８１４，０１４号「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｂｙ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ」に記載されている。また、米国特許出願公開第２００６０１２９１２６号（ＫａｐｌｉｔｔおよびＤｕｒｉｎｇ，「Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｆｕｓｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｏｆ ａ ｐａｔｉｅｎｔ」）に記載されているもの方法などの方法が企図される。脳およびＣＮＳの他の部分に薬物を送達する装置が市販されている（例えば、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ（登録商標）ＥＬ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ社、ミネアポリス、ミネソタ州）。

【0322】

別の実施形態では、血液脳関門を通過する受容体介在型輸送が可能になるよう投与する化合物を修飾するなどの方法を用いて、医薬組成物を脳に投与する。

【0323】

他の実施形態では、本明細書に記載される組成物、化合物、抗体、単離ペプチド、免疫原および核酸と、血液脳関門を通過する輸送を促進することが知られている生物学的に活性な分子との共投与が企図される。

【0324】

また、ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物、化合物、抗体、単離ペプチド、免疫原および核酸を血液脳関門を通過させて投与する方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７０１２０６１号「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ」に記載されている、血液脳関門の透過性を一時的に増大させることを目的とする方法などが企図される。

【0325】

当業者には、本明細書に記載される組成物、化合物、抗体、単離ペプチド、免疫原および核酸を脳に直接投与する、または血液脳関門を通過させて投与するのに適切な様々な方法が理解され、本明細書に記載される製品を安全に投与するためにこれらの方法を修正することが可能であろう。

【0326】

上の開示は本願を全体的に説明するものである。以下の具体例を参照することにより、さらに十全な理解することができる。これらの例は単に説明を目的として記載されるものであって、本願の範囲を限定することを意図するものではない。状況によって好都合であることが示唆される、または好都合である場合、形態の変更および均等物による置換が企図される。本明細書では特定の用語が使用されているが、このような用語は説明的な意味を意図するものであって、限定を目的とするものではない。

【0327】

以下の非限定的な例は本開示を例示するものである。

【0328】

（実施例）
実施例１
Ｉ．Ａベータオリゴマー特異的エピトープを予測するためのＧ^－ｏモデルの方法
１つのエピトープ予測モデルは、天然の状態からの部分的なタンパク質のアンフォールディングの自由エネルギー地形に基づくものである。この天然の状態は、実験に由来する線維構造に引き継がれている。タンパク質が、所定の量の一次配列だけ、天然の状態から部分的にアンフォールディングされている場合、エピトープ候補は、不規則に対する最小の自由エネルギーを消費する連続した配列のセグメントである。所定のタンパク質の立体配座の自由エネルギーは、立体配座のエントロピーおよび折りたたまれていない状態を好む極性官能基の溶媒和、ならびに天然の状態をエンタルピー的に安定させる、静電作用およびファンデルワールスのタンパク質内相互作用の損失を含む、いくつかの寄与から生じる。

【0329】

Ａ．部分的アンフォールドタンパク質の地形のＧ^－ｏ様モデル
アンフォールディング中に行われる自由エネルギーの変化を考慮する近似モデルは、固定したエネルギーを天然の状態におけるすべての接触に割り当て、ここでの接触は、固定したカットオフ距離ｒ_{ｃｕｔｏｆｆ}の中の１対の重（非水素）原子として定義されている。Ｇ^－ｏ様モデルは、以前のタンパク質のフォールディングの試験でうまく行われた。Ｇ^－ｏ様モデルは、天然のタンパク質の相互作用のトポロジーから生じる効果を分離しており、実際にアンフォールディングされている自由エネルギー地形は、単一の天然の状態の構造から容易に計算することができる。

【0330】

あるセグメントをアンフォールディングする総自由エネルギー消費は、アンフォールディングされた領域の立体配座のエントロピーの観点と合わせて、妨害される相互作用の数に依拠している。

【0331】

以下の式では、小文字の変数は原子を表し、大文字の変数は残基を表す。Ｔは、タンパク質中のすべての残基のセットとし、Ｕは、タンパク質中のアンフォールディングされている残基のセットとし、Ｆを、タンパク質中でフォールディングされている残基のサブセットとする（よって（Ｔ＝Ｕ∪Ｆ）。本来度合が高いアンフォールディングの機構は、複数の不規則な残基の連続した鎖からなる。ここで単一の連続したアンフォールディングされた鎖の近似値を採用し、この連続した鎖を不規則化するための自由エネルギー消費を計算した。

【0332】

残基Ｕのセットをアンフォールディングするための総自由エネルギーの変化

【数2】

は、

【数3】

である。

【0333】

アンフォールディングのエンタルピーの関数

【数4】

は、Ｕ残基のセットのアンフォールディングにより妨害される相互作用の数により得られる。

【数5】

【0334】

式２では、ｉ，ｊの合計は、アンフォールディングされた領域中の１つまたは両方の原子のいずれかを有するすべての固有の重原子対に関するものであり、ｒ_ｉおよびｒ_ｊは、原子ｉおよびｊの座標である。ｒ_{ｃｕｔｏｆｆ}（４．８Åとされる）は、相互作用の距離のカットオフである。

【数6】

は、ｘが正である場合、

【数7】

、その他の場合は０により定義されているヘヴィサイド関数である。接触あたりのエネルギーは、室温でタンパク質を完全にアンフォールディングする際の、全体の実験的な安定性

【数8】

をまとめるために選択されてもよい。

【数9】

【0335】

結果はこの値に依存するものではなく；単にこの問題の一般的なエネルギー尺度全体を設定している。このモデルでは、この自由エネルギーを、４．６ｋｃａｌ／ｍｏｌに相当する定数とした。この値は、エピトープ予測の方法で不規則であると考えられている同一のタンパク質の異なる領域に関する相対的な自由エネルギーの消費であるため、一番の関心ごとではない。

【0336】

アンフォールディングのエントロピー用語

【数10】

の計算が、以下のＢに論述されている。

【0337】

Ｂ．エントロピーの計算
アンフォールディングされた状態のタンパク質と接触可能なマイクロ状態の数は、天然の状態で接触可能な数よりもかなり多いため、アンフォールディングに関する立体配座のエントロピーの好都合な増分が存在する。アンフォールディングされた領域の残基Ｋすべてを合計することによりアンフォールディングセグメントＵの総エントロピーが計算される。

【数11】

式中、

【数12】

は、参照文献［３］に列挙されている残基Ｋの３つの立体配座のエントロピー構成要素であり、

【数13】

は、天然の状態からアンフォールディングされた状態までの主鎖のエントロピーの変化であり、

【数14】

は、タンパク質中に埋もれた側鎖からタンパク質の表面までのエントロピーの変化であり、

【数15】

は、表面から溶液までの側鎖に関して得られたエントロピーである。

【0338】

単一の配列の近似では、部分的にアンフォールディングされた鎖のエンドポイントは、天然の構造ではこれら位置で固定されているため、補正をアンフォールディングされた状態の立体配座のエントロピーに適用する。これは、完全にアンフォールディングされた状態には存在しない、部分的にアンフォールディングされた構造における末端を拘束するために対となっているループエントロピーのペナルティが存在することを意味する。

【数16】

【0339】

ここで、

【数17】

は、確率を計算することにより、理想的なランダムウォークが、ランダムウォークの間にタンパク質に浸透が戻ることなく、Ｎステップの後に位置Ｒを中心とした体積ΔＴのボックスに戻ることが見いだされる。約ｎ＝２０の残基より短い長さの鎖では、溶けた鎖の大きさは、タンパク質の直径よりもずっと小さく、タンパク質の立体上の排除された体積が、入り込めない面として良好に処理されている。溶けた鎖の重合状態の数は、タンパク質の表面上の起点から、溶けたポリマーが入り込めない面に接触または当該面を通ることなくタンパク質に再度戻る場所まで移動するランダムウォークの割合により乗算されなければならない。上記の状態の割合は、以下の形態

【数18】

によって書くことができる。式中、Ｒは、出口と入口の場所の間の末端から末端の距離であり、Ｎは溶けた領域の残基の数であり、ａ、Ｉ、Ｖｃは、アンフォールディングされたポリペプチドのシミュレーションに適合することにより決定されたパラメータである。パラメータＩは、２つのＣα原子の間の有効なアーク長であり、Ｖｃは、各残基に関する平均排除体積である。シミュレーションの結果に式６を適合することにより、パラメータの値、ａ＝０．０２１７、Ｉ＝４．８６７、Ｖｃ＝３．２９１を得る。エントロピーのペナルティは一般的なものであり、配列とは無関係である。

【0340】

ジスルフィド結合は、アンフォールディングされたセグメントの動きをさらに制限するため、ループエントロピーの観点でさらに考慮することが必要である。存在する場合、ジスルフィドは、ループが通過しなければならない追加的なノードとして処理され、実際には、完全なループを２つの小さなループに分割し、両方に上述の境界条件を課す。

【0341】

Ｃ．自由エネルギー地形からのエピトープの予測
タンパク質を部分的にアンフォールディングする自由エネルギー地形を得た後、可変エネルギーの閾値Ｅ_ｔｈを適用し、閾値より小さな自由エネルギーの消費を伴い、３つ未満のアミノ酸を含むセグメントを、エピトープの候補として予測する。この予測は、閾値Ｅ_ｔｈの変動に関して安定している。

【0342】

ＩＩ．Ａベータジスルフィド線維構造からのエピトープの予測
２Ｍ４Ｊの天然の構造から、ＩＡに記載されるＧ^－ｏ様モデルを使用して、アンフォールディングの自由エネルギー地形を計算した。この結果を図１に示す。エピトープＱＫＬＶ（配列番号１）は、この解析で候補エピトープとして浮上する。

【0343】

すべてのエピトープに関してｃａｌ／ｍｏｌでの自由エネルギーの消費が示されており、ここでの自由エネルギー消費は１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である。ｘ，ｙ，ｚの値を提供するボックスで印をつけられたエピトープは、残基ＩＤ１７で中心にあり（ｘ軸）、長さ４を有し（ｙ軸）、よって、残基１５～１８またはＱＫＬＶ（配列番号１）からなる。さらに番号付けされたエピトープで、「中心」は、単純に図面をプロットする目的のため、数字の中心の右に対する残基としての表現により定義されている。

【0344】

図１は、閾値Ｅ_ｔｈ＝１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の自由エネルギー地形の平面図である。ここではｘ軸はセグメントの中心であり、ｙ軸はセグメントの長さであり、色の濃さは、対応するセグメントが溶けるために必要とされる自由エネルギーを表す。図１から、１０ｋｃａｌ／ｍｏｌのエネルギー尺度で、残基１５～１８または配列ＱＫＬＶ（配列番号１）からなるエピトープは、構造ＰＤＢ ２Ｍ４Ｊの鎖Ａ、Ｂ、およびＣにおいて予測されるエピトープとして浮上する。

【0345】

この線維モデルは鎖「Ａ」～「Ｉ」を含む。たとえば、決定された線維の構造は、９個の鎖の反復単位からなり、これは鎖Ａ～Ｉと同定されている。同定されたエピトープは、鎖Ａ、Ｂ、およびＣに存在する。

【0346】

Ａベータの線維の構造２ＭＸＵと同様に、配列１４～１８のエピトープは鎖Ａ（配列ＨＱＫＬＶ；図２）で現れる。ＨＱＫＬＶ（配列番号２）は、モノマーまたは線維のＡベータと比較して別の立体配座のＱおよび／またはＱＫの溶媒への露出の増大と一致する。

【0347】

実施例２
集団座標予測
ミスフォールドされたエピトープを予測する第２の方法は、２０１５年１１月９日に出願され参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６２／２５３０４４号、「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｂｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｂｉａｓｉｎｇ」に記載されている「集団座標バイアス」によって得られる。そこに記載されているように、この方法は、あるタンパク質（またはペプチド凝集体）にグローバル座標のバイアスをかけて、そのタンパク質（またはペプチド凝集体）をミスフォールドさせた後、部分的に構造化されていないタンパク質（またはペプチド凝集体）のフォールドされない可能性が最も高いアンフォールド領域を予測する、分子動力学に基づくシミュレーションを用いるものである。バイアスシミュレーションを実施し、各残基インデックスに対応する（検討するタンパク質の初期構造のものと比較した）溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）。ＳＡＳＡはＨ_２Ｏが接触可能な表面積を表す。ＳＡＳＡの（検討するタンパク質の初期構造のものと比較した）正の変化は、関連する残基インデックスの領域における案フォールドを示すと考え得る。この方法をそれぞれが独自の形態を有する３種類のＡベータ株、すなわち、３回対称性構造（またはモノマー）（ＰＤＢエントリー２Ｍ４Ｊ）のＡβ－４０ペプチド、２回対称性構造（ＰＤＢエントリー２ＬＭＮ）のＡβ－４０モノマーおよび一本鎖平行ｉｎ－ｒｅｇｉｓｔｅｒ（例えば、一本の鎖の残基が近接する鎖の同じ残基と相互作用するベータシートが反復したもの）構造（ＰＤＢエントリー２ＭＸＵ）のＡβ－４２モノマーに適用した。

【0348】

米国特許出願第６２／２５３０４４号「ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＲＥＤＩＣＴＩＮＧ ＭＩＳＦＯＬＤＥＤ ＰＲＯＴＥＩＮ ＥＰＩＴＯＰＥＳ ＢＹ ＣＯＬＬＥＣＴＩＶＥ ＣＯＯＲＤＩＮＡＴＥ ＢＩＡＳＩＮＧ」に記載されている集団座標法ならびにＫ．Ｖａｎｏｍｍｅｓｌａｅｇｈｅ，Ｅ．Ｈａｔｃｈｅｒ，Ｃ．Ａｃｈａｒｙａ，Ｓ．Ｋｕｎｄｕ，Ｓ．Ｚｈｏｎｇ，Ｊ．Ｓｈｉｍ，Ｅ．Ｄａｒｉａｎ，Ｏ．Ｇｕｖｅｎｃｈ，Ｐ．Ｌｏｐｅｓ，Ｉ．ＶｏｒｏｂｙｏｖおよびＡ．Ｄ．Ｍａｃｋｅｒｅｌｌ．Ｃｈａｒｍｍ ｇｅｎｅｒａｌ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ：Ａ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ ｆｏｒ ｄｒｕｇ－ｌｉｋｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｈａｒｍｍ ａｌｌ－ａｔｏｍ ａｄｄｉｔｉｖｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１（４）：６７１－６９０，２０１０；ならびにＰ．Ｂｊｅｌｋｍａｒ，Ｐ．Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｍ．Ａ．Ｃｕｅｎｄｅｔ，Ｂ．ＨｅｓｓおよびＥ．Ｌｉｎｄａｈｌ．Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＨＡＲＭＭ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ ｉｎ ＧＲＯＭＡＣＳ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｅｆｅｃｔｓ ｆｒｏｍ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｍａｐｓ，ｖｉｒｔｕａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ，ａｎｄ ｗａｔｅｒ ｍｏｄｅｌｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｈｅｏ．Ｃｏｍｐ．，６：４５９－４６６，２０１０に記載されているＣＨＡＲＭＭ力場パラメータ（ともに参照により本明細書に組み込まれる）をＴＩＰ３Ｐ水とともに用いて、各初期構造に対するシミュレーションを実施した。

【0349】

最初の構造の８０％までバイアスをかけた後の、３回対称性のＡベータの抗体２Ｍ４Ｊの１つのモノマーに関する、残基インデックスの関数としてのアミノ酸側鎖のＳＡＳＡを解析した。確実に増加したＳＡＳＡを伴う１つの領域は残基１４～１７であり、残基ＨＱＫＬに対応し、図８に示されている。ＨＱＫＬは、モノマーＡベータまたは線維Ａベータと比較して別の立体配座のＱおよび／またはＱＫの溶媒への露出の増大と一致している。

【0350】

残基１４～１７からなるエピトープは、３倍のＡベータ４０（２Ｍ４Ｊ）および２倍のＡベータ（２ＬＭＮ）構造で予測された。

【0351】

残基１５～１９からなるエピトープは、Ａベータ４０（２ＭＸＵ）から予測され、残基１５～２０からなるエピトープは、Ａベータ４２の拘束された末端に対して予測された。

【0352】

異なるバイアスは、予測したエピトープの一般的な構造が、バイアスの度合いに有意に依存することを示す。

【0353】

図１３は、直鎖状ペプチド（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）および環状ペプチドシクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）の両方の、線維に関するエントロピーのプロットである。その中に示されるように、環状化合物に関して、側鎖のエントロピーは、直鎖状ペプチドと比較して減少しており、側鎖が直鎖状ペプチドにある場合、すなわち遊離したＡベータモノマーにある場合よりもより立体配座的に拘束されていることを示す。

【0354】

実施例３
ＱＫＬＶ（配列番号１）を含む拘束されたペプチド構造は、記載されている予測プログラムを使用して、同定された立体配座エピトープを模倣し得る。図１２に示される環状構造を含む環状構造を設計し、評価した。図１２に示される環状構造を、実施例４に記載されるように評価した。

【0355】

実施例４
Ａベータオリゴマーにおける予測された配向を近似する立体配座エピトープＱＫＬＶ（配列番号１）を含む構造の決定
ＱＫＬＶ（配列番号１）エピトープを含む環状構造（図５Ａに示される）を、Ａベータの線維およびモノマーにおけるエピトープの配向に対する立体配座の関連性または相違点をエピトープに提供するため、評価した。

【0356】

Ｉ．環状ペプチドの曲率
図１２（a）に示される環状化合物の主鎖の曲率は、線維またはモノマーの曲率と異なる大きなプロファイルを有し、環状ペプチドに対する抗体は、モノマーまたは線維のものと異なる立体配座のアンサンブルを提示する種に選択性を示し得ることが示唆される。曲率のプロファイルは図３に示されている。

【0357】

図３は、残基インデックスの関数としての曲率を示すプロットである。直鎖状ペプチド（短い矢印）に関する曲率、および線維における様々なモノマーの曲率（薄いペプチドの曲線長）、および線維に関する平均曲率（濃いペプチドの曲線長）と共に、環状ペプチド（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）の平衡アンサンブルにおける平均曲率が示されている（長い矢印）。

【0358】

本明細書中使用される曲率は、主鎖の曲率を指し、主鎖に沿って動く際の接ベクトルの変化の比率として定義されている。これは、連続したＣ＿アルファ原子間の単位接ベクトルを利用し、次いで１つの接線から次の接線まででどの程度変化するかに言及することにより、定量化することができる。本明細書中使用される精確な数学上の定義は、異なる微分幾何学における空間曲線の曲率の従来の定義の離散型である。

【数19】

（式中、ｔ_ｉは、Ｃ＿アルファ（ｉ）からＣ＿アルファ（ｉ＋１）までの単位接ベクトルである）
この曲率は、主鎖の構成に応じて、０（平行）からπ（逆平行）までの原則で変動し得る、単純なラジアン単位の角度である。

【0359】

シクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）、直鎖状（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）、および線維におけるＱＫＬＶ（配列番号１）のＱ、Ｋ、Ｌ、Ｖに関する曲率の値は、それぞれ
環状ペプチド：１．２４８ １．５６６ １．４２２ １．４６
直鎖状ペプチド：０．８７０ １．３５５ ０．９３１ １．３０３
線維：０．７４０ １．１５９ ０．７９６ １．１８８
と、決定された。

【0360】

これらの平均値は、
環状ペプチド：１．４２
直鎖状ペプチド：１．１１
線維：０．９７
である。

【0361】

以下の曲率のプロットおよび二面角分布に関しては、Ｃｈａｒｍｍ２７を用いる陽溶媒（ＳＰＣ）での平衡シミュレーションからデータを得る。環状ペプチドアンサンブル：シミュレーション時間１ナノ秒、５００のフレームを含む；直鎖状ペプチドアンサンブル：シミュレーション時間１０ナノ秒、１０００のフレームを含む；２ｍ４ｊアンサンブル：６８０ピコ秒、６８のフレームを含む。

【0362】

環状エピトープの曲率は大きくなるため、これらの残基を含むオリゴマーに関する仮説上の回転（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｔｕｒｎ）は、線維またはモノマーのものとは異なる主鎖配向を有したであろう。しかし、曲率の大きさは非物理学的なものであると思われ、環状ペプチドを特徴付ける曲率の数値は線維のいくつかの位置で得られる。

【0363】

ＩＩ．二面角分布
さらなるコンピュータ支援が、同定したエピトープが、Ａベータにおけるオリゴマー特異的エピトープを定義することができ、オリゴマーで露出したエピトープの代理であり得る図１２ａ）の環状ペプチドにおける二面角分布が、線維またはモノマーにおける対応する分布と実質的に異なることを、裏付けている。

【0364】

Ｑ１５の二面角の分布は、環状ペプチドにおいて、多くの側鎖の二面角に関してモノマーまたは線維の分布と実質的に異なっている（図４Ａ）。

【0365】

図４Ｂは、環状ペプチド（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）の画像；平衡分子動的シュミレーションから得られた画像を示す。この画像では、グルタミン（Ｑ）残基は、黒いビーズで示されているＣα、Ｃβ、Ｇχ、およびＣδ原子と作用する側鎖を有する。対応する二面角結合（ｄｉｈｅｄｒａｌ ｂｏｎｄ）は黒色で示されている。この二面角は、環状ペプチドにおいて、直鎖状ペプチド、または線維に関する残基により探索された対応する二面角分布と有意に異なる二面角分布を有する（図４参照、パネルＲｅｓ－Ｑ：ＣＡ－ＣＢ－ＣＧ－ＣＤ）。

【0366】

同様に、二面角分布は、Ｋ、Ｌ、Ｖで試験することができる。Ｋ１６に関する二面角分布は、図５に示されている。Ｋの差異は、Ｑの差異よりも明確ではない。

【0367】

Ｌ１７に関する二面角分布は図６に示されている。

【0368】

Ｖ１８に関する二面角分布は図７に示されている。

【0369】

Ｌ１７は、直鎖状ペプチドの分布、特に、環状の立体配座と直鎖状を区別する主鎖の原子を含む二面角に関した直鎖状ペプチドの分布とのいくつかの相違を示すにもかかわらず、直鎖状または線維の分布と最も有意差を示す残基はＱ１５である。

【0370】

たとえばＱＫＬまたはＱＫＬＶにおけるＱ１５－Ｋ１６は、エピトープにおいて鍵となる残基であり得る。これら残基の重要性に関するさらなる裏付けが、本明細書中に記載される表面積および溶解度の解析により提供されている。

【0371】

ＩＩＩ．エピトープの溶解度および抗原性
ＣａｍＳｏｌ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ［４］によるＡベータ４２の残基の溶解度が、図９に示されている。図９の残基ＱＫＬＶ（配列番号１）は、それぞれ－０．８９９、－０．９３６、－１．４６、および－１．５１の値を有する。溶解度は、Ｃ末端に向かい連続している場合減少する。

【0372】

残基がより可溶であると、Ａベータのいずれかの種の表面でより遭遇しやすくなり、特にオリゴマーの表面または表面近くでより遭遇しやすくなる。残基は、不定形のモノマーの表面で溶媒和されており、線維の表面では溶媒和されていなくてもよい（器質性構造のため）。オリゴマーは、任意に１つまたは複数の立体配座の特徴と組み合わせて、線維において溶媒に接触できない特定の残基の露出が線維とオリゴマーを区別し得るように、部分的かつ動的に構造化されている。

【0373】

残基ｉに関する相対的な溶解度の係数δｉは、

【数20】

（式中、Ｓｉは残基ｉの溶解度であり、ＳｍａｘおよびＳｍｉｎは、所定の範囲の残基の溶解度の最大値および最大値である）
として定義することができる。ここでは、単純にプロットする値の尺度を設定するために、残基の範囲は、ｓｍａｘ＝０．０３０２およびｓｍｉｎ＝－１．５１となるように、ＨＱＫＬＶＦ（配列番号９）と任意に選択されている。

【0374】

ＳＡＳＡが残基の溶解度により重み付けされる場合、グループＱＫＬＶ（配列番号１）のＮ末端残基がより強調される。図１０は、溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）、各残基の溶解度係数δiにより重み付けしたＳＡＳＡ、σ_ｉ・ＳＡＳＡ_ｉおよびσ_ｉ・ＳＡＳＡ_ｉから線維での値を減じたもの、すなわち、モノマーペプチドおよび環状ペプチドでのこの量の線維に対する増分、σ_ｉΔＳＡＳＡ_ｉをプロットする。

【0375】

溶解度による重み付けは、オリゴマーの表面での差次的な露出および抗原性の可能性が最も高いＱおよびＫの残基をもたらす。

【0376】

残りの側鎖部分の基づく溶媒接触表面積の検出
図１１に示されている様々な残基の側鎖の原子基への分離は、側鎖の末端に達すると、より大きな溶媒への露出に向かう一般的な傾向が存在することを示す。たとえばＱ１５は、

【化4】

に細分され、ここでＮ_ε－Ｈ_２は、線維またはモノマーと比較して、環状ペプチドにおいて最も大きなＳＡＳＡを有する。線維に関連する溶媒の露出における偏差はまた、側鎖の末端近くの分子で増加する傾向を有する。

【0377】

実施例５
立体配座拘束エピトープを含む環状化合物構築
シクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）などのＱＫＬＶ（配列番号１）を含むペプチドは頭－尾環化することができる。

【0378】

Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成などの既知の方法を単独で、または他の方法と組み合わせて用い、ＱＫＬＶ（配列番号１）と、好ましくは２個、３個もしくは４個のアミノ酸および／またはＰＥＧ単位を含むリンカーとを含む、直鎖状ペプチドを合成することができる。例えばＨａｍｌｅｙ（２０１４）［６］およびＲｏｂｅｒｔｓら（２０１２）［７］（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているカップリング化学を用いて、ＰＥＧ分子をＮ末端のアミン基に結合させることができる。直鎖状ペプチド化合物は、１）ペプチド＋リンカーのアミノ末端とカルボキシ末端を共有結合させてペプチド結合を形成させること（例えば、主鎖の環化）、２）ペプチド＋リンカー内のアミノ末端もしくはカルボキシ末端と側鎖を共有結合させること、または３）ペプチド＋リンカー内の２つの側鎖を共有結合させることにより環化され得る。

【0379】

環状化合物内の結合は、すべて通常のペプチド結合であっても（ホモデティック環状ペプチド）、あるいはエステル結合、エーテル結合、アミド結合もしくはジスルフィド結合などの他のタイプの結合を含んでも（ヘテロデティック環状ペプチド）よい。

【0380】

ペプチドをＮ末端もしくはＣ末端またはペプチドの内側にある、例えばシステインおよびホモシステインを含めたチオール含有残基またはメルカプタン含有残基の酸化により環化させ得る。例えば、ペプチドに隣接する２つのシステイン残基を酸化させてジスルフィド結合を形成させ得る。用い得る酸化試薬としては、例えば、酸素（空気）、ジメチルスルホキシド、酸化グルタチオン、シスチン、塩化銅（ＩＩ）、フェリシアン化カリウム、トリフルオロ酢酸タリウム（ＩＩＩ）またはその他の酸化試薬、例えば当業者に公知であり当業者に公知の方法とともに使用し得る酸化試薬などが挙げられる。

【0381】

米国特許出願公開第２００９／０２１５１７２号、米国特許出願公開第２０１０／０２４０８６５号、米国特許出願公開第２０１０／０１３７５５９号には環状ペプチド合成に関連する方法および組成物が記載されており、米国特許第７，５６９，５４１には環化の様々な方法が記載されている。国際公開第０１／９２４６６号およびＡｎｄｒｅｕら，１９９４．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３５：９１－１６９にはその他の例が記載されている。

【0382】

より具体的には、システイン残基が隣接し、かつ／または挿入されているスペーサーを含むリンカーを付加することにより、ＱＫＬＶ（配列番号１）エピトープを含む環状ペプチドを構築することができる。ペプチドのＮ末端およびＣ末端に付加した非天然システイン残基の間でジスルフィド結合を形成させることにより、ペプチドを環状立体配座に構築することができる。また、Ｎ末端とＣ末端のアミノ酸の間でペプチド結合を形成させること（例えば、頭－尾環化）により、それを環状化合物に合成することができる。

【0383】

ペプチド合成を標準的な製造方法に従いＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（サニーベール、カリフォルニア州、米国）で実施する。

【0384】

例えば、ＱＫＬＶ（配列番号１）を含むペプチドのＮ末端およびＣ末端に付加したシステイン残基間のジスルフィド結合を用いて、拘束された環状立体配座の立体配座エピトープＱＫＬＶ（配列番号１）を含むシクロ（ＣＧＱＫＬＶＣ）環状ペプチドを構築することができる。２つの非天然システイン残基にうち１つをＱＫＬＶ（配列番号４）のＣ末端に、１つをＮ末端に付加した。この２つのシステインを制御された条件下で酸化してジスルフィド架橋を形成させる、または頭部と尾部を反応させてペプチド結合を生じさせる。

【0385】

上記の通り、ＡベータオリゴマーのＱＫＬＶ（配列番号１）のアミノ酸側変化の立体配座および配向を模倣するように環状ペプチドの構造を設計した。

【0386】

シクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）
スペーサーＧＣＧおよびエピトープペプチドＱＫＬＶ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチドを、たとえばＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成を使用して合成する。この固相は、リンクアミド樹脂上または２－クロロトリチルクロリド樹脂上とすることができる。

【0387】

直鎖状ペプチドＣＧＱＫＬＶＧ（配列番号３）のアミド縮合によりシクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）を調製することができる。

【0388】

直鎖状化合物Ｃ－ＰＥＧ２－ＱＫＬＶＧのアミド縮合によりシクロ（Ｃ－ＰＥＧ２－ＱＫＬＶＧ）を調製することができる。

【0389】

免疫原構築
拘束したエピトープペプチドを含む環状化合物を、任意に、たとえば本明細書中参照として援用されているＬａｔｅｅｆ ｅｔ ａｌ ２００７に記載される方法を使用して、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性増強物質またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体とコンジュゲートさせる。

【0390】

実施例６
抗体の作製および選択
立体配座拘束化合物、任意選択で環状化合物、例えばシクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）ペプチドなどのＱＫＬＶ（配列番号１）を含む環状ペプチドなどとキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とを結合させる。カナダ動物管理協会により承認されたプロトコルに従ったマウスモノクローナル抗体作製（ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社（ビクトリア、ブリティッシュコロンビア州、カナダ））のためにシクロペプチドを送る。ＢＳＡと結合した、抗体の作製に使用する立体配座ペプチドまたは関連ペプチド、例えばシクロ（ＣＧＱＫＬＶ－ペプチド）（配列番号３）を用いて、マウス血清をスクリーニングする。陽性のＩｇＧ分泌クローンで、大きな尺度の産生を行わせる。

【0391】

実施例８にさらに記載するように、シクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）を含む免疫原を用いてハイブリドーマを作製した。ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲにより、本明細書に記載される直鎖状（未構造化）ペプチドよりもシクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）ペプチドと優先的に結合するハイブリドーマ上清をスクリーニングした。陽性ＩｇＧ分泌クローンを大規模生産およびプロテインＧを用いるさらなる精製に供する。

【0392】

実施例７
斑／線維との結合の有無の評価

【0393】

免疫染色には、本明細書に記載される抗体、陽性対照の６Ｅ１０（１μｇ／ｍｌ）およびアイソタイプ対照のＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａＩｇＧ２ｂ、またはＩｇＧ３（１μｇ／ｍｌ、Ａｂｃａｍ社）を一次抗体として用いる。切片を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳ－Ｔで３×５分間洗浄する。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ（１：１０００、ＥＣＬ社）を切片に添加し、４５分間インキュベートし、次いでＴＢＳ－Ｔで３×５分間洗浄する。ＤＡＢ発色試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）を加え、バックグランド染色に対して所望の標的レベルに達したとき、切片を蒸留水でリンスする。切片をマイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、カバーガラスをかけた。スライドを光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｃａｎａｄａ社、トロント、オンタリオ州、カナダ）下で検査し、Ｌｅｉｃａ社のＤＣ３００デジタルカメラおよびソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｎａｄａ社、リッチモンドヒル、オンタリオ州）を用いて代表的な画像を５０倍、２００倍および４００倍の倍率で記録する。

【0394】

実施例８
方法および材料
免疫原
米国カリフォルニア州サニーベールのＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社で環状ペプチドおよび直鎖状ペプチドを作製した。トリフルオロ酢酸対イオンプロトコルを用いてペプチドをＫＬＨ（免疫感作用）およびＢＳＡ（スクリーニング用）とコンジュゲートした。ペプチドを脱塩し、ＭＳおよびＨＰＬＣにより確認し、純度９５％であると判断された。ペプチドをＩＰＡ社に発送し、マウスを用いたモノクローナル抗体の作製に使用した。

【0395】

抗体
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合したシクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）に対するハイブリドーマおよびモノクローナル抗体をいくつか作製した。

【0396】

５０日齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ケベック州）を免疫感作した。抗原を含有するがアジュバントは含有しない一連の皮下水性注射剤を１９日間にわたって投与した。環状ペプチド－ＫＬＨの０．５ｍｇ／ｍＬ無菌生理食塩水溶液の注射によりマウスを１匹当たり１００μｇのペプチドで免疫感作した。マウスをＬａｂ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社の換気ラックシステムで飼育した。第１９日、マウス全４匹を安楽死させ、ハイブリドーマ細胞系の作製用にリンパ球を回収した。

【0397】

融合／ハイブリドーマの発育
リンパ球を単離し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００）の存在下でマウスＳＰ２／０ミエローマ細胞と融合させた。融合した細胞をＨＡＴ選択を用いて培養した。この方法では、半固形メチルセルロース系ＨＡＴ選択培地を用いてハイブリドーマ選択とクローン化とを１つの段階に組み合わせる。半固形培地上で単一細胞由来のハイブリドーマが増殖してモノクローナルコロニーを形成した。融合事象から１０日後、得られたハイブリドーマクローンを９６ウェル組織培養プレートに移し、中期対数増殖期に達するまで（５日）ＨＴ含有培地で増殖させた。

【0398】

ハイブリドーマの解析（スクリーニング）
ハイブリドーマの組織培養上清を間接ＥＬＩＳＡによりスクリーニング抗原（環状ペプチド－ＢＳＡ）（一次スクリーニング）で試験し、ヤギ抗ＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＆Ｌ）－ＨＲＰ二次抗体を用いてＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体の両方について探索し、ＴＭＢ基質で発色させた。このアッセイで０．２ＯＤ超であったクローンを次の試験ラウンドに進めた。陽性培養物をスクリーニング抗原で再試験して分泌を確認し、無関係の抗原（ヒトトランスフェリン）で再試験して非特異的ｍＡｂを除去し、偽陽性を除外した。抗体捕捉ＥＬＩＳＡにより目的とする全クローンにアイソタイピングを実施して、それらがＩｇＧアイソタイプであるのか、またはＩｇＭアイソタイプであるのかを判定した。また、目的とする全クローンを間接ＥＬＩＳＡにより他の環状ペプチド－ＢＳＡコンジュゲートおよび直鎖状ペプチド－ＢＳＡコンジュゲートで試験して、交差反応性を評価した。

【0399】

ＢＳＡとコンジュゲートしたシクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）を用いた間接ＥＬＩＳＡにより、マウスハイブリドーマ抗体をスクリーニングした。

【0400】

ＥＬＩＳＡ抗体スクリーニング
簡潔に述べれば、ＥＬＩＳＡプレートを４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルのシクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）コンジュゲートＢＳＡ １００ｕＬ／ウェルでコートし、脱脂粉乳の３％ＰＢＳ溶液を用いて室温で１時間ブロックした。一次抗体：３７℃で振盪しながら１時間インキュベートした１００ｕＬ／ウェルのハイブリドーマ上清。二次抗体：３７℃で１時間振盪したＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中１：１０，０００の１００ｕＬ／ウェルのヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ。全洗浄段階をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３０分間実施した。基質３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で発色させ、等体積の１Ｍ ＨＣｌで停止させた。

【0401】

さらなる試験のため陽性クローンを選択した。マウスハイブリドーマの陽性クローンを間接ＥＬＩＳＡにより、シクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）コンジュゲートＢＳＡおよびヒトトランスフェリン（ＨＴ）に対する反応性について試験した。プレートを１）４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルのシクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）コンジュゲートＢＳＡ（配列番号３）１００ｕＬ／ウェル；または２）３７℃のｄＨ２Ｏ Ｏ／Ｎ中０．２５ｕｇ／ウェルのＨＴ抗原５０ｕＬ／ウェルでコートした。一次抗体：３７℃で振盪しながら１時間インキュベートした１００ｕＬ／ウェルのハイブリドーマ上清。二次抗体：３７℃で１時間振盪したＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中１００ｕＬ／ウェルの１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ。全洗浄段階をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３０分間実施した。基質３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で発色させ、等体積の１Ｍ ＨＣｌで停止させた。

【0402】

ＥＬＩＳＡによるシクロと直鎖状ＣＧＱＫＬＶＧ（配列番号３）化合物の選択性
ＥＬＩＳＡプレートを１）４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルのシクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）コンジュゲートＢＳＡ（配列番号３）１００ｕＬ／ウェル；２））４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルの直鎖状ＣＧＱＫＬＶＧＧコンジュゲートＢＳＡ（配列番号３）１００ｕＬ／ウェル；または３）４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルの陰性ペプチド１００ｕＬ／ウェルでコートした。一次抗体：３７℃で振盪しながら１時間インキュベートした１００ｕＬ／ウェルのハイブリドーマ上清。二次抗体：３７℃で１時間振盪したＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中１００ｕＬ／ウェルの１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ。全洗浄段階をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３０分間実施した。基質ＴＭＢを５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で発色させ、等体積の１Ｍ ＨＣｌで停止させた。

【0403】

アイソタイピング
抗体捕捉実験を用いてハイブリドーマ抗体にアイソタイピングを実施した。捕捉プレートをｐＨ９．６の炭酸塩コーティング緩衝液中、４℃で一晩、１００ｕＬ／ウェルの１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＆Ｌ）抗体でコートした。ブロッキング段階は用いなかった。一次抗体（ハイブリドーマ上清）を加えた（１００ｕｇ／ｍＬ）。二次抗体：３７℃で１時間振盪したＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中１００ｕＬ／ウェルの１：５，０００ヤギ抗マウスＩｇＧγ－ＨＲＰまたは１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＭμ－ＨＲＰ。全洗浄段階をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３０分間実施した。基質ＴＭＢを５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で発色させ、等体積の１Ｍ ＨＣｌで停止させた。

【0404】

ＳＰＲ結合アッセイ－一次および二次スクリーニング
抗体とＡベータモノマーおよびＡベータオリゴマーとの結合に関するＳＰＲ解析
氷冷ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）にＡベータモノマーおよびＡベータオリゴマーの調製組換えＡベータ４０およびＡベータ４２ペプチド（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｅｐｔｉｄｅ社、ソルトレイクシティ、ユタ州、米国）を溶かした。一晩蒸発させることによりＨＦＩＰを除去し、ＳｐｅｅｄＶａｃ遠心機で乾燥させた。モノマーの調製には、ペプチド薄膜をＤＭＳＯで戻して５ｍＭとし、ｄＨ２Ｏでさらに１００μＭに希釈し、直ちに使用した。５ｍＭのＤＭＳＯペプチド溶液を無フェノールレッドＦ１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）で希釈して最終濃度１００μＭとすることによりオリゴマーを調製し、４℃で２４時間～７日間インキュベートした。

【0405】

ＳＰＲ解析高強度レーザー光および高速光学式走査を用いて結合相互作用をリアルタイムでモニターする分析用バイオセンサーであるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＳＳ－１）（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）を用いて、全ＳＰＲ測定を実施した。ＳＰＲ直接結合アッセイを用いて組織培養上清の一次スクリーニングを実施し、このアッセイでは、Ｈｉｇｈ Ａｍｉｎｅ Ｃａｐａｃｉｔｙ（ＨＡＣ）センサーチップ（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）の個々のフローセル上にＢＳＡコンジュゲートペプチド、Ａベータ４２モノマーおよびＡベータ４２オリゴマーを共有結合で固定化し、表面に抗体を流した。二次スクリーニングでは、プロテインＧで精製したｍＡｂをＳＰＲ間接（捕捉）結合アッセイを用いて解析し、このアッセイでは、プロテインＡ誘導体化センサーチップ（ＸａｎＴｅｃ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ社、デュッセルドルフ、ドイツデュッセルドルフ、ドイツ）上に抗体を捕捉し、表面にＡベータ４０モノマー、Ａベータ４２オリゴマー、可溶性脳抽出物および脳脊髄液を流した。ＳＰＲ直接結合アッセイで、ＨＡＣセンサーチップの個々のフローセル上にＡベータ４２モノマーおよびＡベータ４２オリゴマーを共有結合で固定化し、精製ｍＡｂを流すことにより抗体の特異性を検証した。

【0406】

可溶性脳抽出物およびＣＳＦ試料のＳＰＲ解析
可溶性脳抽出物およびＣＳＦの調製ＵＢＣ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ｃｌｉｎｉｃで評価した患者からヒトの脳組織およびＣＳＦを採取した。推定ＡＤの臨床診断はＮＩＮＣＤＳ－ＡＤＲＤＡ基準［５］に基づくものである。腰椎穿刺後１時間以内にＣＳＦをポリプロピレンチューブに収集し、処理し、１００μＬポリプロピレンバイアルに等分し、－８０℃で保管する。

【0407】

ホモジナイゼーション：ヒト脳組織試料の重量を測定し、次いで、脳組織の最終濃度が２０％（ｗ／ｖ）になるよう一定量の新鮮な氷冷ＴＢＳ（カナダケベック州ラヴァルのＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社の無ＥＤＴＡプロテアーゼインヒビターカクテルを添加したもの）に浸漬した。この緩衝液中で機械的プローブホモジナイザーを用いて組織をホノジナイズ（間に３０秒の停止を挟んで３×３０秒のパルス、いずれも氷上で実施）する。次いで、ＴＢＳ中でホモジナイズした試料を超遠心分離にかける（７０，０００×ｇで９０分）。上清を収集し、等分し、－８０℃で保管する。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ロックフォード、イリノイ州、米国）を用いてＴＢＳホモジネートのタンパク質濃度を求める。

【0408】

ＳＰＲ解析ＡＤ患者４例および同年齢の対照４例の脳抽出物ならびにＡＤ患者９例および同年齢の対照９例のＣＳＦ試料をプールし解析した。プロテインＡ誘導体化センサーチップの別個のフローセル上に精製ｍＡｂを捕捉し、表面に希釈試料を１８０秒間注入し、次いで、緩衝液で１２０秒間解離を実施し、表面を再生した。マウス対照ＩｇＧモノクローナル抗体参照の表面結合およびアッセイ緩衝液の減算により結合応答を二重参照し、異なる試料のグループを比較した。

【0409】

Ａベータモノマーとの結合の有無の評価
組織培養上清の一次スクリーニングでは、Ａベータ４２モノマーおよびＡベータ４２オリゴマーを直接結合アッセイに用いた。二次スクリーニングでは、Ａベータ４０モノマーおよびＡベータ４２オリゴマー、可溶性脳抽出物およびＣＳＦ試料を間接（捕捉）結合アッセイに用いた。

【0410】

一次スクリーニング
コグネイト環状ペプチドに対する抗体の結合の有無について組織培養上清をスクリーニングした。各試料を希釈し、固定化したペプチドおよびＢＳＡ参照の表面に１２０秒間、二重反復で注入し、次いで、３００秒間の解離相にのみランニング緩衝液を注入した。解析サイクル毎に、センサーチップ表面を再生した。ＢＳＡ参照表面およびブランクランニング緩衝液注入から結合を減算することによりセンサグラムを二重参照し、解離相の結合応答報告点を収集した。

【0411】

オリゴマー結合アッセイ
次の合成Ａベータ４２オリゴマーを上記の通りに作製および固定化し、抗体結合応答を解析した。Ａベータ４２オリゴマーに対する抗体結合応答を環状に対する結合応答と比較した。

【0412】

Ａベータオリゴマーとの結合の検証。
Ａベータ４２オリゴマー結合をさらに検証および確認するため、抗体を共有結合で固定化し、次いで、市販の調製済みの安定なＡベータ４２オリゴマー（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社、ヴァンドゥーヴル＝レ＝ナンシー、フランス）を表面に注入した。

【0413】

結果
ＥＬＩＳＡ試験では、ハイブリドーマクローンの大部分がシクロペプチドと結合することがわかった。

【0414】

次のクローンをシクロおよび直鎖状ＣＧＱＫＬＶＧ（配列番号３）化合物に対する選択性についてＥＬＩＳＡにより試験した。複数のクローンが、直鎖状ＣＧＱＫＬＶＧコンジュゲートＢＳＡ（配列番号３）よりも優先的にシクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）コンジュゲートＢＳＡ（配列番号３）と結合した。

【0415】

アイソタイピングでは、クローンの大部分がＩｇＧ１クローン、ＩｇＧ２ａクローンおよびＩｇＧ３クローンを含めたＩｇＧであることがわかった。ＩｇＭクローンおよびＩｇＡクローンも複数同定されたが、それ以上追究しなかった。

【0416】

表面プラズモン共鳴を用いた直接結合解析を実施して、配列番号３の環状ペプチドと結合する組織培養上清中の抗体についてスクリーニングした。

【0417】

図１６は、ＳＰＲ直接結合アッセイのデータ対ＥＬＩＳＡの結合性のデータをプロットしており、ＳＰＲ直接結合アッセイの結果とＥＬＩＳＡの結果との間に相関があることを示している。ＳＰＲでの強い結合は、ＥＬＳＡで強い結合がある場合にのみ起こる。

【0418】

上記の通りに調製した環状ペプチド、直鎖状ペプチド、Ａベータ１～４２モノマーおよびＡベータ１～４２オリゴマーとの結合能についてクローンを試験した。上記のＭＡＳＳ－１を用いて結合アッセイを実施した（直接結合アッセイ）。表１に示すように、実施した結合アッセイに基づきクローンをいくつか選択した。

【0419】

選択したクローンはＩｇＧ ｍＡｂであった。一次スクリーニングの負の数は結合がみられなかった（例えば、アイソタイプ対照未満であった）ことを示している。

【0420】

【表3】

【0421】

ＥＬＩＳＡプレスクリーニング
ハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡプレスクリーニングにより、直鎖状ペプチドと比較して環状ペプチドとの結合の増大を示すクローンを特定した。そのクローンの一部はＫＬＨ－エピトープリンカーペプチドに対して反応性であった。これらはさらなる検討から除外した。本明細書に記載されるアイソタイピング法を用いて、クローンの大部分がＩｇＧアイソタイプであることが明らかになった。

【0422】

表面プラズモン共鳴により測定する直接結合－一次スクリーニング
表面プラズモン共鳴を用いて組織培養上清を含む抗体のクローンを環状ペプチド、直鎖状ペプチド、ＡベータオリゴマーおよびＡベータモノマーとの直接結合について試験した。

【0423】

この結果を図１５に示す。パネルＡは、リンカー領域に反応性ではないＩｇＧクローンに関して、環状ペプチドおよび直鎖状ペプチド（不定形）との抗体の結合を示している。パネルＢはＡベータオリゴマーおよびＡベータモノマーとの抗体の結合を示している。環状ペプチドに対しては、いくつかのクローンが反応性の増大を示し、直鎖状ペプチドに対しては、１つを除きいずれのクローンも反応性が最小限であるか、または反応性を全く示さない。全体的にＡベータオリゴマー結合に対する選択性がみられる。

【0424】

図１７に、選択したクローンの結合プロファイルを比較して示す。表面プラズモン共鳴を用いて、環状ペプチド（丸）、直鎖状ペプチド（四角）、Ａベータ（Ａβ）モノマー（直立三角形）およびＡベータオリゴマー（逆三角形）における特定のエピトープに対する直接結合について各クローンを評価する。

【0425】

実施例９
二次スクリーニング
免疫組織化学
固定も抗原回復も実施していない凍結ヒト脳切片に免疫組織化学を実施した。加湿チャンバ内で無血清タンパク質ブロッキング試薬（Ｄａｋｏ Ｃａｎａｄａ社、ミシサガ、オンタリオ州、カナダ）と１時間インキュベートすることにより非特異的結合をブロックした。免疫染色には以下の一次抗体を使用した：マウスモノクローナルアイソタイプ対照ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂならびに抗アミロイドβ６Ｅ１０（以上、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社から購入）ならびにシクロペプチドに対して反応性を示す選択した精製クローン。いずれの抗体も１μｇ／ｍＬで使用した。切片を室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳ－Ｔで３×５分間洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ（１：１０００、ＥＣＬ社）を切片に添加し、４５分間インキュベートし、次いでＴＢＳ－Ｔで３×５分間洗浄した。ＤＡＢ発色試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）を加え、バックグランド染色に対して所望の標的レベルに達したとき、切片を蒸留水でリンスした。切片をマイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、カバーガラスをかけた。スライドを光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｃａｎａｄａ社、トロント、オンタリオ州、カナダ）下で検査し、Ｌｅｉｃａ社のＤＣ３００デジタルカメラおよびソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｎａｄａ社、リッチモンドヒル、オンタリオ州）を用いて代表的な画像を２０倍および４０倍の倍率で記録した。Ａｄｏｂｅ ＰｈｏｔｏｓｈｏｐでＬｅｖｅｌｓ Ａｕｔｏ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎを用いて画像を最適化した。

【0426】

ＣＳＦおよび脳抽出物
ＵＢＣのＣｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｂｏａｒｄ（Ｃ０４－０５９５）から承認を受け、メリーランド大学のＢｒａｉｎ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋからヒト脳組織を入手した。ＵＢＣ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｌｉｎｉｃ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓで評価した患者からＣＳＦを採取した。この試験はＵＢＣのＣｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｂｏａｒｄにより承認を受けたものであり、ＣＳＦ試料を収集する前に参加者または法律上の近親者から書面による同意を得た。推定ＡＤの臨床診断はＮＩＮＣＤＳ－ＡＤＲＤＡ基準に基づくものとした。腰椎穿刺後１時間以内にＣＳＦをポリプロピレンチューブに収集し、処理し、１００μＬポリプロピレンバイアルに等分し、－８０で保管した。

【0427】

ホモジナイゼーション：ヒト脳組織試料の重量を測定し、次いで、脳組織の最終濃度が２０％（ｗ／ｖ）になるよう一定量の新鮮な氷冷ＴＢＳおよびＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（ラヴェル、ケベック州、カナダ）の無ＥＤＴＡプロテアーゼインヒビターカクテルに浸漬した。この緩衝液中で機械的プローブホモジナイザーを用いて組織をホモジナイズ（間に３０秒の停止を挟んで３×３０秒のパルス、いずれも氷上で実施）した。次いで、ＴＢＳ中でホモジナイズした試料を超遠心分離にかけた（７０，０００×ｇで９０分）。上清を収集し、等分し、－８０℃で保管した。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ロックフォード、イリノイ州、米国）を用いてＴＢＳホモジネートのタンパク質濃度を求めた。

【0428】

ＣＳＦ：ＡＤを有するドナー９例およびＡＤを有さないドナー９例からＣＳＦをプールした。精製ＩｇＧを全抗体とも３０マイクログラム／ｍｌの濃度で用いて、試料をＳＰＲにより解析した。マウスＩｇＧを抗体対照として使用し、いずれの実験も少なくとも２回反復した。

【0429】

抗体６Ｅ１０を用いてＣＳＦおよび脳抽出物での陽性結合を確認した。

【0430】

ＳＰＲ解析：ＡＤ患者の脳抽出物４例および同年齢の対照の脳抽出物４例をプールし解析した。ＴＢＳ中でホモジナイズした脳試料には前頭皮質のブロードマン第９野が含まれていた。いずれの実験も、高強度レーザー光および高速光学式走査を用いて結合相互作用をリアルタイムでモニターする分析用バイオセンサーである、実施例６に記載のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＳＳ－１）（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）を用いて実施した。本明細書に記載されるシクロペプチドに対して作製した精製抗体をプロテインＡ誘導体化センサーチップの別個のフローセル上に捕捉し、表面に希釈試料を１８０秒間注入し、次いで、緩衝液で１２０秒間解離を実施し、表面を再生した。マウス対照ＩｇＧ参照の表面結合およびアッセイ緩衝液の減算により結合応答を二重参照し、異なる試料のグループを比較した。

【0431】

結果
ＣＳＦ脳抽出物および免疫組織化学
いくつかのクローンをＣＳＦ、可溶性脳抽出物中でのＡベータとの結合能について試験し、死体ＡＤ脳の組織試料を表２に示す。表２では陽性度がプラス印の数により示されている。

【0432】

表２および表３は、選択したクローンが本明細書に記載されるＳＰＲによる測定でモノマーよりもオリゴマーに対して結合選択性を有することのデータとなる。

【0433】

表２にはＩＨＣの結果もまとめてあり、ここでは、「＋／－」は、アイソタイプ対照と類似した染色またはアイソタイプ対照と異なる染色であるが明確な斑形態はみられないことを表す。

【0434】

６Ｅ１０抗体でみられる陽性斑染色と比較して、クローン８Ｈ１０（６２）では新鮮な凍結切片上に斑染色がみられない例を図１８に示す。

【0435】

ＱＫＬＶ（配列番号１）を含むシクロペプチドに対して生じさせた抗体が、モノマーよりもＡベータオリゴマーと優先的に結合し、ＡＤ患者の脳抽出物および／またはＣＳＦ中のＡベータとも優先的に結合することを図１９に示す。

【0436】

表２、３ならびに図１８および１９に示されるように、ＱＫＬＶ（配列番号１）を含むシクロペプチドに対して生じさせた抗体は、脳抽出物および／またはＣＳＦ中のＡベータと結合したクローンを含んだが、ＳＰＲではモノマーとあまり結合せず、ＩＨＣによる斑線維とあまり結合しなかった。

【0437】

【表4】

^＊スコアリングは同じ試料カテゴリーで他のクローンに対して相対的なものである。

【0438】

【表5】

【0439】

実施例１０
合成オリゴマー結合
共有結合で固定化した抗体との結合について市販の調製済み合成アミロイドベータオリゴマー（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社、ヴァンドゥーヴル＝レ＝ナンシー）の連続２倍希釈物（７．８ｎＭ～２０００ｎＭ）を試験した。対照抗体ｍＡｂ６Ｅ１０の結果を図２０Ａに示し、マウス対照ＩｇＧの対照の結果を図２０Ｂに示す。シクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）に対して生じさせた抗体を用いた結果を図２０Ｃに示す。

【0440】

実施例１１
ホルマリン固定組織での免疫組織化学
シクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）に対して生じさせた抗体を用いてヒト脳組織を評価した。患者はそれまでに、（ｉ）老人斑および神経原線維濃縮体を示すビルショウスキー銀法、（ｉｉ）アミロイドを示すコンゴーレッドならびに（ｉｉｉ）濃縮体を示し老人斑が「神経突起性」であることを確認するタウ免疫組織化学法の３部よりなる方法でアルツハイマー病であることが特徴付けられ診断されていた。この組織を用いて、選択したモノクローナル抗体クローンの斑反応性を試験した。脳組織を１０％緩衝ホルマリンで数日間固定し、Ｓａｋｕｒａ ＶＩＰ組織処理装置でパラフィン処理した。組織切片にマイクロ波による抗原回復（ＡＲ）を実施するか、または実施せずに、１μｇ／ｍｌの抗体で探索した。陽性対照として、汎アミロイドベータ反応性抗体６Ｅ１０を選択した抗体クローンと同時にインキュベートした。抗体を抗体希釈剤（Ｖｅｎｔａｎａ社）で希釈し、ＯｐｔｉＶｉｅｗ ＤＡＢ（Ｖｅｎｔａｎａ社）で発色させた。Ｖｅｎｔａｎａ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ＸＴ ＩＨＣ染色装置で染色を実施した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４５顕微鏡で画像を取得した。画像は神経病理学の専門知識を有する専門の病理学者が盲検的に解析した。

【0441】

下の表４に示されるように、固定組織を用いると、被験抗体は抗原回復の有無を問わず、老人斑アミロイドの特異的染色が陰性であった。陽性対照には６Ｅ１０を用いた。

【0442】

【表6】

【0443】

実施例１２
オリゴマー伝播の阻害
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）結合アッセイを用いてアミロイドベータ（Ａβ）凝集対する抗体の効果を検討することにより、その生物学的機能をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。Ａβ凝集は、予め形成された小さいＡβオリゴマーの核によって誘導され、この核を介して伝播し、単量体Ａβから可溶性オリゴマー、次いで不溶性線維への全過程には同時に、ベータシート形成の増大が伴う。このことはベンゾチアゾール塩のＴｈＴによってモニターすることができ、ＴｈＴがベータシートに富む構造に結合すると、その励起および発光の最大値がそれぞれ３８５ｎｍから４５０ｎｍおよび４４５ｎｍから４８２ｎｍに遷移し、それにより蛍光が増大する。簡潔に述べれば、Ａβ１～４２（Ｂａｃｈｅｍ Ａｍｅｒｉｃａｓ社、トーランス、カリフォルニア州）を可溶化し、超音波処理し、トリス－ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し、黒色の９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社、モンロー、ノースカロライナ州）のウェルに加え、これに等体積のシクロペプチドに対する抗体または無関係のマウスＩｇＧ抗体アイソタイプ対照を加え、Ａβ１～４２ペプチドと抗体のモル比を１：５とした。ＴｈＴを加え、プレートを室温で２４時間インキュベートし、１時間毎にＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ３ｖ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いてＴｈＴ蛍光を測定し記録した。全ウェルからバックグラウンド緩衝液の蛍光読取り値を減算し、さらに、対応するウェルから抗体単独のウェルの読取り値を減算した。図２１に示されるように、ＴｈＴ蛍光によりモニターしたＡβ４２凝集は、蛍光が最小である最初の遅滞期、蛍光が急激に増大する対数期および最後にＡβ分子種が平衡状態にあり蛍光の増大がみられないプラトー期を特徴とするＳ字形を示した。Ａβ４２と無関係のマウス抗体との共インキュベーションでは、凝集過程に対する有意な効果が全くみられなかった。これに対し、Ａβ４２と被験抗体との共インキュベーションでは、凝集過程のいずれの期も阻害された。図２１には抗体クローン６１、６２、および６４で得られた結果が示されている。ＴｈＴ凝集アッセイは、ＡＤの病理発生に極めて重要なＡβ伝播およびモノマー、オリゴマー、前原線維および線維からのＡβ凝集のｉｎ ｖｉｖｏの生物物理学的／生化学的段階を模倣するものであることから、シクロ（ＣＧＱＫＬＶＧ）（配列番号３）に対して生じさせた抗体はこの過程を完全に打ち消す可能性を秘めている。マウスのＩｇＧ２の対照を用いて実施したアイソタイプ対照では阻害はみられなかった。

【0444】

実施例１３
アルツハイマー病の免疫療法に最適なプロファイルの達成：毒性Ａベータオリゴマーに特異的な抗体の合理的作製
目的：毒性アミロイドβオリゴマー（ＡβＯ）に特異的な抗体を作製すること
背景：現時点での証拠から、ＡβＯの伝播性プリオン様株は、モノマーおよび線維とは対照的に、ニューロンに対して優先的に毒性を示し、アルツハイマー病（ＡＤ）のタウ病態を誘発することが示唆される。さらに、臨床試験では、用量制限有害作用がＡβ線維認識と関係があることがわかっている。これらの観察結果から、安全性および有効性のためには毒性ＡβＯの特異的中和が望ましいものであり得ることが示唆される。

【0445】

設計／方法：本明細書に記載されるように、標準力場による分子動力学を用いてＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｓｅに蓄積されているＡβ線維の原子レベルの構造を攪乱するコンピュータシミュレーションを用いた。新生前原線維またはオリゴマーではわずかに安定な領域が露出する可能性が高いという仮説を立てた。オリゴマーにおいて提示される場合とモノマーまたは線維において提示される場合の抗原性プロファイルの差を定量化するクラスタリング解析、曲率、溶媒への露出、溶解度、二面角分布およびラマチャンドラン角分布をすべて用いて予測エピトープの立体配座特性を特徴付けた。局所的なＡβＯ立体配座を模倣し得る環状フォーマットで候補ペプチドエピトープを合成し、担体タンパク質とコンジュゲートし、マウスでのモノクローナル抗体作製に用いた。精製した抗体をＳＰＲおよび免疫組織化学によりスクリーニングした。

【0446】

結果：
コグネイト構造化ペプチドおよび合成ＡβＯを認識することが可能であり、非構造化ペプチド、リンカーペプチドまたはＡβモノマーとはほとんどまたは全く結合しないことに基づき、５種類の予測エピトープに対するＩｇＧクローンを６６種類選択し精製した。さらなるスクリーニングにより、対照と比較してＡＤ患者のＣＳＦおよび脳抽出物中の天然の可溶性ＡβＯと優先的に結合する抗体を特定した。ＡＤ脳の免疫組織化学的解析により、斑と反応しない抗体クローンを選択することができた。

【0447】

結論：コンピュータにより特定したＡβＯエピトープにより、天然のＡＤ ＡβＯと選択的に結合しモノマーにも線維にも有意な交差反応性を示さないという所望の標的プロファイルを有する抗体を作製することができた。

【0448】

実施例１４
毒性阻害アッセイ
シクロペプチドに対して生じさせた抗体によるＡベータ４２オリゴマーの毒性の阻害をラット一次皮質ニューロンアッセイで試験することができる。

【0449】

抗体および対照ＩｇＧをそれぞれ２ｍｇ／ｍＬなどの濃度に調節する。様々なモル比のＡベータオリゴマーと抗体を溶媒対照、Ａベータオリゴマー単独および神経保護ペプチドのヒューマニン（ＨＮＧ）などの陽性対照とともに試験する。

【0450】

例示的設定を表５に示す。

【0451】

室温で１０分間プレインキュベートした後、体積を培地で８４０マイクロリットルに調節する。この溶液を３７℃で５分間インキュベートする。次いで、溶液を一次皮質ニューロンに直接添加し、細胞を２４時間インキュベートする。ＭＴＴ試験を用いて細胞生存率を求めることができる。

【0452】

【表7】

【0453】

この試験は、３０５抗体のクローン６２を使用して行った。この抗体単独では、毒性がないことが示された（図２２Ａ）。Ａベータオリゴマーの毒性の用量依存的な阻害が、抗体：オリゴマー：１：５、１：１および２：１のすべての濃度で観察された（図２２Ｂ）。

【0454】

実施例１５
ｉｎ ｖｉｖｏ毒性阻害アッセイ
シクロペプチドに対して生じさせた抗体によるＡベータ４２オリゴマーの毒性の阻害をマウス行動試験でｉｎ ｖｉｖｏで試験することができる。

【0455】

マウスの脳室内（ＩＣＶ）に注射する前に、抗体およびアイソタイプ対照をそれぞれＡベータ４２オリゴマーと２以上の様々なモル比で予め混合する。対照群には、溶媒単独を注射するマウス、オリゴマー単独を注射するマウス、抗体単独を注射するマウスおよび神経保護ペプチドのヒューマニンなどの陽性対照を注射するマウスを含める。あるいは、抗体をオリゴマーのＩＣＶ注射前、注射時および／または注射後に全身投与してもよい。オリゴマーのＩＣＶ注射から約４～７日後に開始して、マウス空間認識試験（ＳＲＴ）、Ｙ迷路試験、モーリス水迷路モデルおよび新奇物体認識モデル（ＮＯＲ）などの学習および記憶に関する行動試験で認知を評価する。

【0456】

マウス空間認識試験（ＳＲＴ）は、海馬機能の尺度である地理的記憶を評価するものである（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社）。このモデルでは２チャンバの装置を使用し、この装置のチャンバは形状、模様および色が異なっている（すなわち、地理的差）。チャンバは透明なＰｌｅｘｉｇｌａｓｓ製の廊下で繋がっている。最初に個々のマウスを探索期の５分間、一方のチャンバにのみアクセスできる装置の中に入れておく。次いで、マウスをホームケージに３０分間戻し、「選択」期の５分間、再び装置の中に入れ、その間、マウスは両方のチャンバにアクセスできる。正常な認知機能を有するマウスは前回探索したチャンバを記憶しており、新規なチャンバで費やす時間の方が長い。ＤＩ＝（ＴＮ－ＴＦ）／（ＴＮ＋ＴＦ）で識別指数（ＤＩ）を算出し、式中、ＴＮは新規なチャンバで費やした時間の量であり、ＴＦは馴染みのあるチャンバで費やす時間の量である。毒性ＡベータオリゴマーによりＤＩの低下が起こるが、ヒューマニン陽性対照により一部レスキューされ得る。ＩＣＶ注射後の様々な時間におけるこの試験の成績を用いて、シクロペプチドに対して生じさせた抗体がＡベータオリゴマー毒性をｉｎ ｖｉｖｏで阻害する可能性を評価することができる。

【0457】

Ｙ迷路試験（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社）は、主として前頭前皮質（作業記憶）および海馬（空間構成要素）が仲介する空間作業記憶の試験である。マウスが２本の腕を探索することができるＹ字形の迷路の中にマウスを置く。短期記憶が無傷なマウスは連続試行で交互に２本の腕に行く。毒性ＡベータオリゴマーをＩＣＶ注射したマウスは認知に障害がみられ、ランダム値５０％（これに対し正常個体は約７０％）付近の交互のランダム行動を示す。この障害は、コリンエステラーゼ阻害剤ドネペジル（Ａｒｉｃｅｐｔ）またはヒューマニンによりそれぞれ部分的または全面的に正常に戻る。この試験により、被験抗体のＡベータオリゴマー毒性に対する防御活性に関してまた別のｉｎ ｖｉｖｏ評価ができる。

【0458】

モーリス水迷路はまた別の広く認められている認知モデルであり、主として海馬機能に依存する空間学習および長期地理的記憶を検討するものである（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社）。マウスを複数回の試行で、不透明な水面の下に隠したプラットフォームを見つけるよう訓練する。プラットフォームの位置の想起に関するマウスの学習成績は、視覚的な手掛かりおよび記録したビデオに基づく。マウスを水に放ってからプラットフォームを見つけるまでの時間は着実に短縮され、これをマウスの学習速度とし、複数日にわたって測定する。認知が正常なマウスでは、プラットフォームを見つけるのに必要な時間が連日短縮される（学習）。長期記憶の解析には、訓練後に試験を複数日反復する。つまり、プラットフォームを取り去り、以前のプラットフォームの位置の上を横切る回数または最初に横切るまでの時間を長期記憶を評価する尺度として用いる。毒性ＡベータオリゴマーをＩＣＶ注射したマウスは、学習および長期記憶の両方に欠陥がみられ、被験抗体の防御活性を評価するためのモデルとなる。

【0459】

新奇物体認識（ＮＯＲ）モデルは、新奇な物体を既知の物体より有意に長い時間をかけて調べるというげっ歯類の正常な行動を利用するものであり、この行動は主として嗅周皮質機能に依存する（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社）。習得試行でマウスまたはラットに２つの同一の物体を探索させる。短時間の試行間間隔の後、一方の物体を新奇な物体に置き換える。動物を活動領域に戻し、各物体を能動的に探索して費やした時間を記録する。正常なげっ歯類は馴染みのある物体を思い出し、新奇な物体の方の探索に有意に長い時間を費やす。これに対し、Ａベータオリゴマー処置したげっ歯類は明確な認知障害を示し、「馴染みのある」物体と「新奇な」物体の両方の探索に同程度の時間を費やす。これは、既知の臨床認知機能改善薬（例えば、ドネペジル）により一時的に正常に戻すことができる。ＮＯＲ試験を縦断研究で複数回実施して、験抗体の認知に対する潜在的な有益性を評価することができる。

【0460】

行動試験に加え、脳組織を収集し、シナプスマーカー（ＰＳＤ９５、ＳＮＡＰ２５、シナプトフィジン）および炎症マーカー（ＩＬ－１ベータ）のレベルを解析することができる。オリゴマーのＩＣＶ注射から約１４日後にマウスを屠殺し、生理食塩水を灌流する。海馬を収集し、急速凍結し、解析まで－８０℃で保管する。ホモジナイズした試料のタンパク質濃度をＢＣＡにより求める。ＥＬＩＳＡキット（Ｃｌｏｕｄ－Ｃｌｏｎｅ社、米国）を用いてシナプスマーカーの濃度を求める。シナプスマーカーは通常、Ａベータオリゴマーを注射したマウスで２５～３０％減少し、ヒューマニン陽性対照により９０～１００％に回復する。ＩＬ－１ベータ炎症性マーカーの濃度は、Ａベータオリゴマーを注射したマウスで約３倍になり、この増大はヒューマニンによって大幅に抑えられる。これらのアッセイは、被験抗体の防御活性に関する分子レベルでのまた別の尺度となる。

【0461】

実施例１６
ｉｎ ｖｉｖｏ伝播阻害アッセイ
Ａベータ毒性オリゴマーのｉｎ ｖｉｖｏの伝播およびそれに関連する病態を様々なアルツハイマー病（ＡＤ）げっ歯類モデルで研究することができる。例えば、ヒトＡＰＰのトランスジェニックマウス（例えば、ＡＰＰ２３マウス）またはヒトＡＰＰとＰＳＥＮ１のトランスジェニックマウス（ＡＰＰＰＳ１マウス）は高レベルのＡベータを発現し、加齢とともに炎症および神経損傷を伴うアミロイド沈着が徐々にみられるようになる。オリゴマー含有脳抽出物の脳内接種によりこの過程を大幅に加速させることができる（過程１３、１４）。これらのモデルは、脳内または全身に投与した抗体によるＡベータオリゴマー伝播の阻害を研究するためのシステムとなる。

【0462】

実施例１７
ＣＤＲシーケンシング―３０５７Ｅ９．１
ＩｇＧ３重鎖とカッパ軽鎖とを有することが明らかになった３０５７Ｅ９．１を重鎖および軽鎖のＣＤＲおよび可変領域に選択した。

【0463】

５’ＲＡＣＥならびに適切なマウス免疫グロブリンの重鎖（ＩｇＧ１／ＩｇＧ３／ＩｇＧ２Ａ）および軽鎖（カッパ）の可変領域配列を増幅する遺伝子特異的逆方向プライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した。

【0464】

シーケンシング用に特異的バンドを切り取ってｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯベクターにクローン化し、構築物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。

【0465】

各鎖について少なくとも８種類のクローンを選定し、シーケンシングの前に増幅領域の有無についてＰＣＲでスクリーニングした。選択したＰＣＲ陽性クローンにシーケンシングを実施した。

【0466】

ＣＤＲ配列を表６に記載する。重鎖および軽鎖の可変部分のコンセンサスＤＮＡ配列およびタンパク質配列を表７に記載する。

【表8】

【表9】

【0467】

実施例９
ＣＤＲのシークエンシング－３０５－８Ｈ１０
ＩｇＧ１重鎖とカッパ軽鎖とを有することが明らかになった３０５－８Ｈ１０を、ＣＤＲならびに重鎖および軽鎖の可変領域のシークエンシングに選択した。

【0468】

５’ＲＡＣＥならびに適切なマウス免疫グロブリンの重鎖（ＩｇＧ１／ＩｇＧ３／ＩｇＧ２Ａ）および軽鎖（カッパ）の可変領域配列を増幅する遺伝子特異的逆方向プライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した。

【0469】

シーケンシング用に特異的バンドを切り取ってｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯベクターにクローン化し、構築物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。

【0470】

各鎖について少なくとも８種類のクローンを選定し、シーケンシングの前に増幅領域の有無についてＰＣＲでスクリーニングした。選択したＰＣＲ陽性クローンにシーケンシングを実施した。

【0471】

ＣＤＲ配列を表８に記載する。重鎖および軽鎖の可変部分のコンセンサスＤＮＡ配列およびタンパク質配列を表９に記載する。

【表10】

【0472】

【表11】

【0473】

表１０．Ａベータ配列およびリンカーを有するＡベータ配列
ＱＫＬＶ（配列番号１）
ＨＱＫＬＶ（配列番号２）
ＣＧＱＫＬＶＧ、シクロＣＧＱＫＬＶＧ（配列番号３）
ＧＱＫＬＶ（配列番号４）
ＧＱＫＬＶＧ（配列番号５）
ＧＧＱＫＬＶＧ（配列番号６）
ＧＱＫＬＶＧＧ（配列番号７）
ＣＧＱＫＬＶＧＣ（配列番号８）
ＨＱＫＬＶＦ（配列番号９）
ＱＫＬＶＦ（配列番号１０）

【0474】

表１１－完全なＡベータ１～４２
ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号３１）

【0475】

ここまで、現時点で好ましい例であると考えるものに関して本願を記載してきたが、本願は本開示の例に限定されないことを理解するべきである。これとは逆に、本願は、添付の請求項の趣旨および範囲に含まれる様々な改変および同等の構成を包含するものとする。

【0476】

刊行物、特許および特許出願はいずれも、個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別にその全体が参照により組み込まれることが明記された場合と同じように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に、例えば表またはその他の箇所に記載されるアクセッション番号および／またはバイオマーカー配列（例えば、タンパク質および／または核酸）を含めた本明細書に記載される各アクセッション番号に関連する配列は、その全体が参照により組み込まれる。

【0477】

請求項の範囲は、好ましい実施形態および実施例によって限定されるべきではなく、記載全体と一致する最も広い解釈がなされるべきである。

【0478】

（本明細書で参照される参考文献の引用）
［１］ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＲＥＰＯＲＴＳ｜５：９６４９，２０１５｜ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０９６４９
［２］Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｊ．Ｈｉｌｓｅｒ ａｎｄ Ｅｒｎｅｓｔｏ Ｆｒｅｉｒｅ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｆｏｌｄｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６２：７５６－７７２，１９９６．Ｔｈｅ ＣＯＲＥＸ ａｐｐｒｏａｃｈ．
［３］Ｓａｍｕｅｌ Ｉ．Ａ．Ｃｏｈｅｎ，Ｓａｒａ Ｌｉｎｓｅ，Ｌｅｉｌａ Ｍ．Ｌｕｈｅｓｈｉ，Ｅｒｉｋ Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ，Ｄｕｎｃａｎ Ａ．Ｗｈｉｔｅ，Ｌｕｋｅ Ｒａｊａｈ，Ｄａｎｉｅｌ Ｅ．Ｏｔｚｅｎ，Ｍｉｃｈｅｌｅ Ｖｅｎｄｒｕｓｃｏｌｏ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｍ．Ｄｏｂｓｏｎ，ａｎｄ Ｔｕｏｍａｓ Ｐ．Ｊ．Ｋｎｏｗｌｅｓ．Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ－β４２ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｏｃｃｕｒｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１１０（２４）：９７５８－９７６３，２０１３．
［４］Ｐｉｅｔｒｏ Ｓｏｒｍａｎｎｉ，Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ａ．Ａｐｒｉｌｅ，ａｎｄ Ｍｉｃｈｅｌｅ Ｖｅｎｄｒｕｓｃｏｌｏ．Ｔｈｅ ｃａｍｓｏｌ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２７（２）：４７８－４９０，２０１５．
［５］Ｄｅｂｏｒａｈ Ｂｌａｃｋｅｒ，ＭＤ，ＳｃＤ；Ｍａｒｉｌｙｎ Ｓ．Ａｌｂｅｒｔ，ＰｈＤ；Ｓｕｓａｎ Ｓ．Ｂａｓｓｅｔｔ，ＰｈＤ；Ｒｏｄｎｅｙ Ｃ．Ｐ．Ｇｏ，ＰｈＤ；Ｌｉｎｄｙ Ｅ．Ｈａｒｒｅｌｌ，ＭＤ，ＰｈＤ；Ｍａｒｓｈａｉ Ｆ．Ｆｏｌｓｔｅｉｎ，ＭＤ Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｖａｌｉｄｉｔｙ ｏｆ ＮＩＮＣＤＳ－ＡＤＲＤＡ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ．Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ．１９９４；５１（１２）：１１９８－１２０４．ｄｏｉ：１０．１００１／ａｒｃｈｎｅｕｒ．１９９４．００５４０２４００４２０１４．
［６］Ｈａｍｌｅｙ，Ｉ．Ｗ．ＰＥＧ－Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ２０１４；１５，１５４３－１５５９；ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｂｍ５００２４６ｗ
［７］Ｒｏｂｅｒｔｓ，ＭＪ ｅｔ ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ６４：１１６－１２７．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図4-1】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図12-3】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20-1】

【図20-2】

【図20-3】

【図20-4】

【図21-1】

【図21-2】

【図21-3】

【図22-1】

【図22-2】

【配列表】

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