特許 7452881 心血管疾患の処置に有用な新規化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-11

(45)【発行日】2024-03-19

(54)【発明の名称】心血管疾患の処置に有用な新規化合物

(51)【国際特許分類】

   C07D 493/04 20060101AFI20240312BHJP

   A61K 31/341 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 9/06 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20240312BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20240312BHJP

【ＦＩ】

C07D493/04 101C

A61K31/341

A61P9/00

A61P9/06

A61P9/10

A61P9/10 101

A61P9/12

C07D493/04 CSP

【請求項の数】 20

(21)【出願番号】P 2021518909

(86)(22)【出願日】2019-10-27

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-13

(86)【国際出願番号】 US2019058241

(87)【国際公開番号】W WO2020092180

(87)【国際公開日】2020-05-07

【審査請求日】2022-10-13

(31)【優先権主張番号】62/755,516

(32)【優先日】2018-11-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】16/429,015

(32)【優先日】2019-06-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】16/600,476

(32)【優先日】2019-10-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】521138648

【氏名又は名称】コユーラティブ，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】シュメッツェ，ジョン

【審査官】藤代 亮

(56)【参考文献】

【文献】特表平０７－５００８１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０５－２６８９７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開昭６２－２１５５９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表平０５－５０４３５３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｄ ４９３／０４

Ａ６１Ｋ ３１／３４１

Ａ６１Ｐ ９／００

Ａ６１Ｐ ９／０６

Ａ６１Ｐ ９／１０

Ａ６１Ｐ ９／１２

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、もしくはＶＩの化合物であって、

【化1】

式中、
Ｒ^１は、存在せず、
あるいは、Ｒ^１は、（ＣＨ_２）_２Ｏ、（ＣＨ_２）_２ＮＨ、（ＣＨ_２）_３Ｏ、（ＣＨ_２）_３ＮＨ、ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、およびＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨから選択され、
Ｒ^２は、（ＣＨ_２）_２Ｏ、（ＣＨ_２）_２ＮＨ、（ＣＨ_２）_３Ｏ、（ＣＨ_２）_３ＮＨ、ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、ＣＨ_２ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ、ＣＨ_２ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＣＨ_２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ、およびＣＨ_２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨから選択される、化合物、
またはその薬学的に許容される塩。

【請求項2】

前記化合物が、式ＩまたはＩＶの化合物である、請求項１に記載の化合物、

【化2】

またはその薬学的に許容される塩。

【請求項3】

Ｒ^１が、存在しない、請求項２に記載の化合物、
またはその薬学的に許容される塩。

【請求項4】

Ｒ^１が、（ＣＨ_２）_２Ｏ、（ＣＨ_２）_２ＮＨ、（ＣＨ_２）_３Ｏ、および（ＣＨ_２）_３ＮＨから選択される、請求項２に記載の化合物、
またはその薬学的に許容される塩。

【請求項5】

Ｒ^１が、（ＣＨ_２）_２Ｏである、請求項２に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【請求項6】

Ｒ^１が、（ＣＨ_２）_２ＮＨである、請求項２に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【請求項7】

Ｒ^１が、ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）Ｏである、請求項２に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【請求項8】

Ｒ^１が、ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨである、請求項２に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【請求項9】

前記化合物が、式ＩＩまたはＶの化合物である、請求項１に記載の化合物、

【化3】

またはその薬学的に許容される塩。

【請求項10】

Ｒ^２が、（ＣＨ_２）_２Ｏ、（ＣＨ_２）_２ＮＨ、（ＣＨ_２）_３Ｏ、（ＣＨ_２）_３ＮＨ、ＣＨ_２ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ、ＣＨ_２ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＣＨ_２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ、およびＣＨ_２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨから選択される、請求項９に記載の化合物、
またはその薬学的に許容される塩。

【請求項11】

Ｒ^２が、ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）Ｏである、請求項９に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【請求項12】

Ｒ^２が、ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨである、請求項９に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【請求項13】

前記化合物が、式ＩＩＩまたはＶＩの化合物である、請求項１に記載の化合物、

【化4】

またはその薬学的に許容される塩。

【請求項14】

Ｒ^１が、存在しない、請求項１３に記載の化合物、
またはその薬学的に許容される塩。

【請求項15】

Ｒ^１が、（ＣＨ_２）_２Ｏ、（ＣＨ_２）_２ＮＨ、（ＣＨ_２）_３Ｏ、および（ＣＨ_２）_３ＮＨから選択される、請求項１３に記載の化合物、
またはその薬学的に許容される塩。

【請求項16】

Ｒ^１が、ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）Ｏである、請求項１３に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【請求項17】

Ｒ^１が、ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨである、請求項１３に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【請求項18】

治療有効量の請求項１に記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項19】

疾患を処置する方法における使用のための、請求項１８に記載の医薬組成物であって、前記方法は、それを必要とする哺乳動物に、前記医薬組成物を投与することを含み、前記疾患が心血管疾患である、医薬組成物。

【請求項20】

前記心血管疾患が、冠状動脈疾患、心筋梗塞、心不全、心不整脈、電気生理学的心臓障害、先天性心血管異常、発達性心血管異常、炎症性心筋症、川崎病、感染性心筋症、突然死／心臓停止、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化性心血管疾患、心臓弁疾患、静脈不全、心臓血栓症、血管血栓症、血栓塞栓症、末梢動脈疾患、大動脈瘤、大動脈解離、血管動脈瘤、血管解離、脳卒中、全身性高血圧症、および肺高血圧症から選択される、請求項１９に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規化合物およびその医薬組成物、ならびにそれらを使用して心血管疾患を処置する方法を提供する。

【0002】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月１２日に出願された米国非仮特許出願第１６／６００，４７６号の利益を主張し、当該出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0003】

本出願は、２０１９年６月２日に出願された米国非仮特許出願第１６／４２９，０１５号の利益を主張し、当該出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0004】

本出願は、２０１８年１１月４日に出願された米国非仮特許出願第６２／７５５，５１６号の利益を主張し、当該出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0005】

２０１９ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｈｅａｒｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（Ｂｅｎｊａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９）によれば、心血管疾患は米国での死亡の殆どの原因である。これらの疾患は、２０歳超の１億２１００万人の米国民、すなわち、成人人口の４８％に見られる。これらの心血管疾患はすべて、細胞低酸素症に関連している。細胞低酸素症は、正常な生理学的状態と比較して、生細胞での酸素の利用可能性または利用の相対的欠乏として定義される。

【0006】

米国での心血管疾患の年間費用は、２０３５年に１．１兆ドルに達するであろう。心血管疾患の管理における大きな進歩にもかかわらず、これらの同疾患は依然として米国で最も頻繁に起こる死因であり、世界的な問題としても考慮される必要がある。２０１６年には、世界で約１，７６０万人の死亡が心血管疾患に起因しており、２００６年から１４．５％増加した。

【0007】

医療専門家は、ある程度の誇りを持って、近年の米国における心血管疾患による死亡率の大幅な減少を指摘している。しかしながら、以前はこれらの疾患で急死した患者は、今では長期的な管理を必要とする慢性患者となっている。社会としての我々の課題は、この増大する流行に対処する低費用の管理戦略を考案することである。

【0008】

酸素供給が不足した場合、細胞代謝、したがって、生命自体が危険に曝される。生細胞は、遺伝子発現経路を再プログラムする非常に感受性の高い作用機序を用いて、利用可能な周囲酸素量の変化に応答する。この応答特性は、各細胞の状況および環境に特有である。酸素の運搬が生物の生活において重要な変数である場合は常に、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）が原虫からヒトに至る生物に見出され、ＨＩＦ生理学の変化に注力している多くの現在の医薬品開発プログラムがある（Ｓｅｍｅｎｚａ，２０１９）。ＨＩＦは、低酸素症媒介性遺伝子発現のキーとなる要素の重要例を示しているが、酸素に対するヒト細胞応答の範囲はＨＩＦ発現の調節には限定されない。

【0009】

低酸素症は、血流低下と相関関係にあり、低酸素症は、心血管疾患および灌流される臓器への血流の減少に関連する他の状態において認められる。再灌流は、血流の回復に関連している。再灌流は通常望ましいが、長期の虚血およびその後の血流の回復は、酸化的代謝の有毒な副産物に起因して局所的炎症および細胞損傷を引き起こし得る。このプロセスを軽減する方法がある。短時間の血流低下および再灌流を繰り返すことによって、将来の虚血の結果に対する抵抗性が高めることができる。この現象は、プレコンディショニングとして既知である。酸素の運搬および灌流の非致死的かつ大幅な低下による有害事象に対する効果的な処置が非常に求められており、治療選択肢は現時点では限られている。

【0010】

低酸素関連遺伝子発現の管理のために現在臨床開発中である化合物の殆どは、プロリルヒドロキシラーゼを阻害する。プロリルヒドロキシラーゼによって低酸素誘導因子が分解の標的となり、したがって、プロリルヒドロキシラーゼ阻害剤はＨＩＦの分解を妨げ、事実上、低酸素媒介性事象が増強される。プロリルヒドロキシラーゼ阻害剤は、低酸素症に対する細胞の適応応答をＨＩＦを介して全身的に増強する化合物である。プロリルヒドロキシラーゼ阻害剤によって増強されたＨＩＦは、赤血球の発達を刺激して貧血状態における治療効果をもたらす内因性分子である追加のエリスロポエチンを腎臓に合成させることできる。ＨＩＦの増強はまた、血管新生を生じさせて、低酸素領域へのより大きな血管成長を引き起こし、これは、例えば冠状動脈疾患が心筋虚血および関連する心機能障害をもたらす場合には有益である。残念ながら、上記包括的アプローチは、同時に、休眠状態の悪性腫瘍の動脈供給を増加させ、および／または酸素がすでに利用可能である場合に酸素を節約するように細胞代謝を変化させ得る。低酸素関連病状の病態生理学の複雑性を過小評価するのは容易である。低酸素媒介事象を調節するための非常に選択的なアプローチが、安全で効果的な医薬品を開発するには必要になるであろう。これには、限られた臓器特異的空間内での送達または適切な病理学的状況での活性の誘発が含まれる。

【0011】

シクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）の発現は、転写活性化因子ＮＦ－κＢのｐ６５、ＨＭＧ Ｉ（Ｙ）、およびＳＰ１を介して、培養中のヒト臍帯静脈内皮細胞での低酸素症によって調節され、ＰＧＥ_２の生成の増加をもたらす（Ｓｃｈｍｅｄｔｊｅ，Ｊｒ．，Ｊｉ，Ｌｉｕ，ＤｕＢｏｉｓ，＆Ｒｕｎｇｅ，１９９７；Ｘｕ，Ｊｉ，＆Ｓｃｈｍｅｄｔｊｅ，Ｊｒ．，２０００；Ｊｉ，Ｘｕ，＆Ｓｃｈｍｅｄｔｊｅ，Ｊｒ．，１９９８）。これらの発見は、ＨＩＦが、低酸素症に対するヒト適応のすべてを駆動するのに不十分であり、ＮＦ－κＢが、血管内皮での遺伝子の低酸素駆動性転写活性化の別の重要なメディエーターであるという事実を反映している。

【0012】

虚血性心血管疾患は、血流不足に関連し、低酸素症にも関連している。虚血性プレコンディショニングは、本化合物に起因する治療効果の一部である。ＣＯＸ－２の血管内皮発現は、低酸素症によって増加する。ＣＯＸ－２は、一酸化窒素（ＮＯ）の合成の随伴物として虚血性プレコンディショニングに不可欠である（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）。虚血性プレコンディショニングの後期段階によって与えられる心臓の保護を達成するためには、両方が必要である（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0013】

尿素輸送体遺伝子のＳＬＣ１４（溶質キャリア１４）ファミリーは、細胞膜を通過する尿素輸送を調節する。ＵＴ－Ｂ（遺伝子ＳＬＣ１４Ａ１の産物である尿素輸送タンパク質Ｂ）は、細胞膜を通過する尿素、水、および尿素類似体の輸送を促進する（Ｓｈａｙａｋｕｌ，Ｃｌｅｍｅｎｃｏｎ，＆Ｈｅｄｉｇｅｒ，２０１３）。ＵＴ－Ｂは、心臓、血管内皮、および赤血球を含んで広く発現している。ＵＴ－Ｂヌル（ｎｕｌｌ）マウスは、心臓伝導異常、脳尿素濃度の増加、およびＮＯ産生の減少を有する（Ｌｉ，Ｃｈｅｎ，＆Ｙａｎｇ，２０１２）。尿素は、自由に透過可能であり、受動的に細胞に入るが、平衡は遅く、ＵＴ－Ｂは赤血球からの尿素の急速な排出を促進する（Ｓａｎｄｓ，１９９９）。尿素は、一般に廃棄物とみなされ、アミノ酸の分解から再生利用の機会まで窒素を保持する。腎不全は、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）活性の低下と関連している。しかしながら、正常な腎機能を有するラットは、ＢＵＮが尿毒症レベルへと上昇した場合には、低下したＮＯＳ活性を有さない（Ｘｉａｏ，Ｅｒｄｅｌｙ，Ｗａｇｎｅｒ，＆Ｂａｙｌｉｓ，２００１）。尿素は、いくつかの状況では心臓保護特性を有し得る（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。

【0014】

膜ＵＴ－Ｂは、様々な場所に由来する培養におけるヒト血管内皮に豊富に存在し、一酸化窒素（ＮＯ）合成の調節に関与しているようである。（Ｗａｇｎｅｒ，Ｋｌｅｉｎ，Ｓａｎｄｓ，＆Ｂａｙｌｉｓ，２００２）。血管内皮におけるＵＴ－Ｂは、一般に細胞膜を通過して尿素を排出するように作用する。血管内皮におけるＵＴ－Ｂの阻害は、尿素の細胞内蓄積を引き起こす。これは、アルギナーゼ（ｌ－アルギニンを尿素に変換する酵素）のフィードバック阻害をもたらし、該フィードバック阻害が、ｌ－アルギニンの代替経路の活性および発現を増加させ、この場合、内皮型ＮＯＳ（ｅＮＯＳ）がＮＯの生成を増加させることができる（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。これは、尿素の存在がＮＯの生成をどのように増強するかを示す点で興味深い。

【0015】

低酸素症は、低酸素血管内皮におけるＵＴ－Ｂの発現を増加させる。本発明者は、ＵＴ－Ｂの遺伝子（ＳＬＣ１４Ａ１）のメッセンジャーＲＮＡが、低酸素（１％酸素）細胞培養におけるヒト血管内皮細胞で有意にアップレギュレートされることを発見した。この状況でのＵＴ－Ｂの発現のアップレギュレーションは、尿素を内皮細胞から排出させ、ｅＮＯＳ活性の増加を引き起こすアルギナーゼのフィードバック阻害を排除し、ニトレート投与の正味の血管拡張効果を低下させる。尿素または尿素類似体の供給源は、効果的な細胞内尿素基質レベルを維持して、これによりＵＴ－Ｂのアップレギュレーションを克服し、かつ、ｌ－アルギニンをＮＯのｅＮＯＳ生成への経路に向かわせ、低酸素に応答して血管拡張を増強し、これにより隣接する血管平滑筋を拡張する。

【0016】

虚血性プレコンディショニングのプロセスを標的化（例えば局所）様式で可能にしつつ、低酸素症でのＮＯの血管拡張放出を増強することで、心血管疾患における主な心臓有害事象の処置および予防をもたらす化合物を発見することが有益であろう。

【発明の概要】

【0017】

したがって、一態様では、本発明は、細胞低酸素症の領域に応答する新規化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0018】

別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体、および治療有効量の本発明の化合物の少なくとも１つまたはその薬学的に許容される塩を含む、新規な医薬組成物を提供する。

【0019】

別の態様では、本発明は、細胞低酸素症によって媒介される疾患を処置するための新規な方法であって、それを必要とする哺乳動物に、治療有効量の本発明の化合物の少なくとも１つまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。

【0020】

別の態様では、本発明は、本発明の化合物の少なくとも１つを調製するためのプロセスを提供する。

【0021】

別の態様では、本発明は、治療に使用するための新規化合物または薬学的に許容される塩を提供する。

【0022】

別の態様では、本発明は、細胞低酸素症によって媒介される疾患の処置のための薬剤の製造のための新規化合物の使用を提供する。

【0023】

これらおよび他の目的は、以下の詳細な説明中で明らかになり、特許請求の範囲の化合物またはその薬学的に許容される塩が、細胞低酸素症の領域に焦点を絞った治療応答を提供すると予想されるという発明者の発見によって達成された。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本明細書で引用されるすべての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0025】

本化合物は、内皮表面で尿素または尿素類似体（例えば、アミドまたはグリコールアミド）に加えて硝酸塩を放出するように設計されている。それらは、尿素部分（式ＩおよびＩＶ）、アミド部分（式ＩＩおよびＶ）、またはグリコールアミド部分（式ＩＩＩおよびＶ）に結合された中央のイソソルビド部分、および対向する硝酸基（－ＮＯ_３）を有する小分子である。グリコールアミドは、ＵＴ－Ｂを介した比較的高い透過性および低い毒性の利点を有する。（Ｚｈａｏ，Ｓｏｎａｗａｎｅ，Ｌｅｖｉｎ，＆Ｙａｎｇ，２００７）。本化合物は、細胞膜を横切って血管内皮細胞への尿素および尿素類似体の受動的移動を利用することが期待される。血管内皮低酸素症の状態ではＵＴ－Ｂ遺伝子の発現が増加している。尿素および尿素類似体のＵＴ－Ｂ媒介性輸送（除去）は低酸素症で発生し、これにより、ｅＮＯＳ活性およびＮＯ合成が制限されるようである。したがって、細胞内尿素の置換は、血管内皮に提供される硝酸塩の効果を増強する。低酸素状態での尿素および／または尿素類似体ならびに硝酸塩の組み合わせは、血管拡張および虚血性プレコンディショニングを含む事象のカスケードを促進すると予想される。

【0026】

本化合物は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ－２によってＮＯに代謝されるか、または亜硝酸塩に変換され、続いて、キサンチンオキシダーゼを含む一連の酵素によって還元されてＮＯを形成することができる、硝酸基を特徴とする。あるいは、細胞内Ｌ－アルギニンが一酸化窒素合成酵素によって酸化されて、ＮＯを生成する。歴史上、内皮由来弛緩因子として既知であるＮＯは、ＮＯ受容体である可溶性グアニル酸シクラーゼの活性化により、サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の形成を誘導する。ｃＧＭＰは、プロテインキナーゼＧ活性に結合して増強し、平滑筋細胞からのカルシウムの移動を促進し、これにより、細胞内カルシウムが減少するとことによって平滑筋の収縮性が損なわれるために、血管緊張が低下する。

【0027】

この効果の正確な細胞内作用機序は血管拡張の作用機序ほどよく理解されていないが、ＮＯは、虚血性プレコンディショニングにも不可欠である。ＣＯＸ－２の発現は、虚血性プレコンディショニングの必要な部分であり、ＣＯＸ－２の発現は、ＮＦ－κＢ転写活性化システムに依存する作用機序を介して低酸素症によって誘導される。さらに、以前に発表されたように、低酸素症がＣＯＸ－２のアップレギュレーションを引き起こす場合、内皮型一酸化窒素合成酵素はわずかにダウンレギュレートされるようである。（Ｓｃｈｍｅｄｔｊｅ，Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，１９９７）。したがって、低酸素症の状況においてＣＯＸ－２の誘導を伴うＮＯ産生を増強する作用機序は、血管内皮において治療価値があるはずである。

【0028】

したがって、一態様では、本発明の化合物は、標的化された様式で虚血性プレコンディショニングのプロセスを可能にしながら、血管拡張物であるＮＯの形成および放出を増強する。

【0029】

別の態様では、本発明の化合物は、低酸素誘導性のＵＴ－Ｂの発現ならびに細胞外へのおよび細胞膜を通過する関連する尿素ならびに／または類似体輸送の結果を克服するためのより多くの基質を提供する。

【0030】

別の態様では、本化合物は、ＨＩＦ－（低酸素誘導因子）および下流の効果の包括的なモジュレーターではないので、その治療応答は、細胞低酸素の領域に焦点が絞られるものであろう。本化合物は、細胞低酸素症の結果を局所的に軽減することにより、低酸素症の下流の効果を非選択的に模擬する治療剤の焦点が絞られていない投与で見られる副作用を殆どまたは全く伴わずに、心血管疾患を処置することができる。

【0031】

別の態様では、本発明は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖおよび／またはＶＩの新規化合物であって、

【化1】

式中、
Ｒ^１は、存在せず、
あるいは、Ｒ^１は、（イソソルビド部分に結合しているＲ^１の右側部分）：（ＣＨ_２）_２Ｏ、（ＣＨ_２）_２ＮＨ、（ＣＨ_２）_３Ｏ、（ＣＨ_２）_３ＮＨ、ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、およびＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨから選択され、
Ｒ^２は、（イソソルビド部分に結合しているＲ^２の右側部分）：（ＣＨ_２）_２Ｏ、（ＣＨ_２）_２ＮＨ、（ＣＨ_２）_３Ｏ、（ＣＨ_２）_３ＮＨ、ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ、ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、ＣＨ_２ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ、ＣＨ_２ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＣＨ_２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ、およびＣＨ_２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨから選択される、化合物、
またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0032】

別の態様では、化合物は、式ＩもしくはＩＶの化合物、またはその薬学的に許容される塩である。

【0033】

別の態様では、化合物は、Ｒ^１が存在しない、式ＩもしくはＩＶの化合物、またはその薬学的に許容される塩である。

【0034】

別の態様では、化合物は、Ｒ^１が、（ＣＨ_２）_２Ｏ、（ＣＨ_２）_２ＮＨ、（ＣＨ_２）_３Ｏ、および（ＣＨ_２）_３ＮＨから選択される、式ＩもしくはＩＶの化合物、またはその薬学的に許容される塩である。

【0035】

別の態様では、化合物は、式ＩＩもしくはＶの化合物、またはその薬学的に許容される塩である。

【0036】

別の態様では、化合物は、Ｒ^２が、（ＣＨ_２）_２Ｏ、（ＣＨ_２）_２ＮＨ、（ＣＨ_２）_３Ｏ、（ＣＨ_２）_３ＮＨ、ＣＨ_２ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ、ＣＨ_２ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ、ＣＨ_２ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ、およびＣＨ_２ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨから選択される、式ＩＩもしくはＶの化合物、またはその薬学的に許容される塩である。

【0037】

別の態様では、化合物は、式ＩＩＩもしくはＶＩの化合物、またはその薬学的に許容される塩である。

【0038】

別の態様では、化合物は、Ｒ^１が存在しない、式ＩＩＩもしくはＶＩの化合物、またはその薬学的に許容される塩である。

【0039】

別の態様では、化合物は、Ｒ^１が、（ＣＨ_２）_２Ｏ、（ＣＨ_２）_２ＮＨ、（ＣＨ_２）_３Ｏ、および（ＣＨ_２）_３ＮＨから選択される、式ＩＩＩもしくはＶＩの化合物、またはその薬学的に許容される塩である。

【0040】

別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体および治療有効量の本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、新規な医薬組成物を提供する。

【0041】

別の態様では、本発明は、細胞低酸素症によって媒介される疾患を処置する新規の方法であって、それを必要とする患者に、治療有効量の本発明の少なくとも１つの化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。

【0042】

別の態様では、本発明は、心血管疾患を処置するための新規な方法を提供し、それを必要とする患者に、治療有効量の本発明の少なくとも１つの化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。

【0043】

別の態様では、心血管疾患は、冠状動脈疾患、心筋梗塞、心不全、心不整脈、電気生理学的心臓障害、先天性心血管異常、発達性心血管異常、炎症性心筋症、川崎病、感染性心筋症、突然死／心臓停止、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化性心血管疾患、心臓弁疾患、静脈不全、心臓血栓症、血管血栓症、血栓塞栓症、末梢動脈疾患、大動脈瘤、大動脈解離、血管動脈瘤、血管解離、脳卒中、全身性高血圧症、および肺高血圧症から選択される。

【0044】

別の態様では、本発明は、治療に使用するための本発明の化合物を提供する。

【0045】

別の態様では、本発明は、細胞低酸素症によって媒介される疾患の処置のための薬剤の製造のための本発明の使用を提供する。

【0046】

別の態様では、本発明は、心血管疾患の処置のための薬剤の製造のための本発明の使用を提供する。

【0047】

本発明は、その真意または本質的な属性から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化されてもよい。本発明は、本明細書に記載の本発明の態様のすべての組み合わせを包含する。本発明の任意およびすべての実施形態は、追加の実施形態を説明するために、他の任意の実施形態と合わせて解釈され得ると理解される。実施形態の個々の要素はそれぞれ、それ自体の独立した実施形態として個別に解釈されることを意図していることも理解されたい。さらに、実施形態の任意の要素は、追加の実施形態を説明するために、任意の実施形態からの任意およびすべての他の要素と組み合わされることを意味する。

【0048】

定義
本出願に提示される定義で提供される例は、特に明記されていない限り、非包括的である。それらには、記載された例が含まれるが、これらに限定されない。

【0049】

細胞低酸素症は、個々の細胞レベルでの酸素不足であり、生物全体のレベルまたは環境での酸素不足に必ずしも関連しているわけではない。

【0050】

本明細書に記載の化合物は、非対称中心、幾何学的中心（例えば、二重結合）、またはその両方を有し得る。特定の立体化学または異性体形態が具体的に示されていない限り、構造のすべてのキラル体、ジアステレオマー体、ラセミ体、およびすべての幾何異性体が意図されている。非対称に置換された原子を含む本発明の化合物は、光学活性体またはラセミ体で単離し得る。ラセミ体の分解、光学活性出発物質からの合成、またはキラル補助剤の使用などによる光学活性体を調製する方法は、当技術分野で周知である。オレフィンの幾何異性体、Ｃ＝Ｎ二重結合、または他の種類の二重結合が、本明細書に記載の化合物に存在してもよく、そのようなすべての安定な異性体が本発明に含まれる。具体的には、本発明の化合物のシスおよびトランス幾何異性体が存在してもよく、異性体の混合物もしくは分離された異性体として単離してもよい。本発明の化合物およびプロセスで作られる中間体を調製するために使用されるすべてのプロセスは、本発明の一部であるとみなされる。示されているまたは記載されている化合物のすべての互変異性体はまた、本発明の一部であるとみなされる。

【0051】

「哺乳動物」および「患者」は、典型的には医療を受けている温血哺乳動物（例えば、ヒトおよび家畜）を包含する。例には、ネコ、イヌ、ウマ、およびヒト、ならびにヒトのみが含まれる。

【0052】

「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」には、哺乳動物の病状の処置が含まれ、（ａ）哺乳動物における病状の発生を予防すること、特に、そのような哺乳動物が、病状にかかりやすいが、まだそれを有すると診断されていない場合、（ｂ）病状を阻害すること、例えば、進行を阻止すること、および／または（ｃ）病状を軽減すること、例えば、所望の評価項目に到達するまで病状の退行を引き起こすことが含まれる。処置にはまた、疾患の症状の改善（例えば、疼痛または不快感の軽減）が含まれ、そのような改善は、疾患に直接影響を与える場合もあるし、またはそうでない場合（例えば、原因、伝達、発現など）もある。

【0053】

「薬学的に許容される塩」は、親化合物がその酸または塩基塩を生成することによって改変された、本開示の化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例には、アミンなどの塩基性残基の無機酸塩または有機酸塩、およびカルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩が含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩には、例えば非毒性の無機酸または有機酸から形成された、親化合物の慣用的な非毒性塩または第四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、そのような慣用的な非毒性塩には、１，２－エタンジスルホン酸、２－アセトキシ安息香酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、酢酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、重炭酸、炭酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリコリルサニル酸、ヘキシルレゾルシン酸、ヒドラバミン酸、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸塩、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフトエ酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリルスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ナプシリン酸、硝酸、シュウ酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、ポリガラクツロン酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、亜酢酸、コハク酸、スバセチン酸、コハク酸、スルファミン酸、スルファニル酸、硫酸、タンニン酸．、酒石酸、およびトルエンスルホン酸から選択される無機酸および有機酸に由来する塩が含まれる。

【0054】

本発明の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、塩基性または酸性部分を含む親化合物から合成することができる。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、化学量論量の適切な塩基または酸と、水中もしくは有機溶媒中または２つの混合物中で反応させることによって調製することができ、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体が有用である。好適な塩の列挙は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄ．，ｐ １４４５（Ｇｅｎｎａｒｏ＆Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，１９９０）に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0055】

「治療有効量」は、本明細書に記載の適応症を処置するために単独でまたは組み合わせて投与された場合に有効である本発明の化合物の量を含む。「治療有効量」はまた、所望の適応症を処置するのに有効であると主張される化合物の組み合わせの量を含む。化合物の組み合わせは、相乗的な組み合わせであり得る。記載される相乗効果（Ｃｈｏｕ＆Ｔａｌａｌａｙ，１９８４）は、組み合わせて投与された場合の化合物の効果が、単剤として単独で投与された場合の化合物の相加効果よりも大きい場合に生ずる。一般に、相乗効果は、化合物の最適値以下（ｓｕｂ－ｏｐｔｉｍａｌ）の濃度において最も明確に示される。相乗効果は、細胞毒性の低下、効果の増加、または個々の成分と比較した組み合わせの他の有益な効果に関するものであり得る。

【0056】

本発明の化合物は、本明細書に記載されるように活性であることが期待される。

【0057】

製剤化および投与量
本発明では、本発明の化合物は、任意の好都合な方法で（例えば、経腸的または非経口的に）投与することができる。投与方法の例には、経口および経皮が含まれる。当業者は、本発明の化合物の投与経路が大きく変動し得ることを認識している。他の経口投与に加えて、持続放出組成物が好まれ得る。他の許容される経路には、注射（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内）、皮下インプラント、ならびに口腔、舌下、局所、直腸、膣、および鼻腔内投与が含まれ得る。経口製剤の例には、錠剤、コーティング錠剤、軟質および硬質ゼラチンカプセル剤、溶剤、乳剤、ならびに懸濁剤が含まれる。本発明の化合物を血管壁に直接送達し得るカテーテルによって配置されたステントなどの薬剤溶出構造を含む、生体侵食性（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）、非生体侵食性、生分解性、および非生分解性投与システムも使用し得る。

【0058】

錠剤の形態の固体組成物が調製される場合、主な活性成分は、例えば、シリカ、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、およびタルクを含む医薬ビヒクルと混合することができる。錠剤は、スクロースまたは他の適切な物質でコーティングすることができ、あるいは、持続的または遅延した活性を有し、所定量の活性成分を連続的に放出するように処理することができる。ゼラチンカプセルは、活性成分を希釈剤と混合し、得られた混合物を軟質または硬質ゼラチンカプセルに組み込むことによって得ることができる。シロップまたはエリキシルは、典型的にはカロリーゼロの甘味料、防腐剤（例えば、メチルパラベンおよび／またはプロピルパラベン）、香味料、および適切な着色剤と組み合わせて、活性成分を含むことができる。水分散性粉末または顆粒は、分散剤もしくは湿潤剤、またはポリビニルピロリドンなどの懸濁剤、および甘味料または味覚矯正剤（ｔａｓｔｅ ｃｏｒｒｅｃｔｏｒｓ）と混合された活性成分を含むことができる。直腸投与は、直腸温度で融解する結合剤（例えば、カカオバターおよび／またはポリエチレングリコール）で調製される坐剤を使用して行うことができる。非経口投与は、薬理学的に適合性のある分散剤および／または湿潤剤（例えば、プロピレングリコールおよび／またはポリエチレングリコール）を含む、水性懸濁液、等張食塩水、または注射可能な滅菌溶液を使用して行うことができる。活性成分はまた、任意選択で１つ以上の担体または添加剤とともに、マイクロカプセルまたはミクロスフェアとして製剤化することができる。活性成分はまた、シクロデキストリン、例えば、α－、β－、またはγ－シクロデキストリン、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、および／またはメチル－β－シクロデキストリンとの複合体の形態で提供することができる。

【0059】

毎日投与される本発明の化合物の用量は、個々ごとに変動し、処置される疾患の重症度によってある程度決定され得る。本発明の化合物の用量はまた、投与される化合物に応じて変動するであろう。本発明の化合物の投与量の例には、哺乳動物の体重１ｋｇあたり、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７６、８０、８５、９０、９５から１００ｍｇまで含まれる。化合物は、単回投与で、または多くのより少ない投与量で一定期間にわたって投与することができる。化合物が投与される時間の長さは、個人ごとに変動し、所望の結果（すなわち、体脂肪の減少、または体脂肪の増加の防止）が達成されるまで継続することができる。したがって、治療は、処置される対象、所望の結果、および対象が本発明による処置にどれだけ迅速に応答するかに応じて、１日～数週間、数ヶ月、または数年まで継続する可能性がある。

【0060】

本発明の錠剤の可能な例は、以下の通りである。
成分 ｍｇ／錠
活性成分 １００
粉末乳糖 ９５
ホワイトコーンスターチ ３５
ポリビニルピロリドン ８
Ｎａカルボキシメチルデンプン １０
ステアリン酸マグネシウム ２
錠剤重量 ２５０

【0061】

本発明のカプセルの可能な例は、以下の通りである。
成分 ｍｇ／カプセル
活性成分 ５０
結晶ラクトース ６０
微結晶性セルロース ３９
ステアリン酸マグネシウム １
カプセル充填重量 １５０

【0062】

上記のカプセルにおいて、活性成分は好適な粒子サイズを有する。結晶ラクトースおよび微結晶性セルロースを互いに均一に混合し、ふるいにかけた後、ステアリン酸マグネシウムを混合する。最終混合物は、好適なサイズの硬質ゼラチンカプセルに充填される。

【0063】

本発明の注射溶液の可能な例は以下の通りである。
成分 ｍｇ／溶液
活性成分 １．０ｍｇ
１ＮＨＣｌ ２０．０μｌ
酢酸 ０．５ｍｇ
ＮａＣｌ ８．０ｍｇ
フェノール １０．０ｍｇ
１Ｎ ＮａＯＨ ｐＨ５まで適量
Ｈ _２Ｏ １ｍＬまで適量

【0064】

本発明の他の特徴は、本発明の例示するために提供され、かつ、それを限定することを意図しない、例示的な実施形態の以下の説明過程で明らかになるであろう。

【0065】

合成例
本発明の化合物は、有機合成化学分野で既知である合成方法と一緒に、または当業者によって理解されるその変形によって、以下に記載される方法を使用して合成することができる。好ましい方法には、以下に記載されるものが含まれるが、これらに限定されない。反応は、使用される試薬および材料に適切であり、影響を受ける変換に好適な溶媒中で行われる。分子上に存在する官能基が提案された変換物と合致している必要があることが有機合成分野の当業者によって理解されるであろう。これは、所望の本発明の化合物を得るために、合成ステップの順序を変更するか、またはある特定のプロセススキームを別のものに対して選択するための判断を必要とする場合がある。この分野における任意の合成経路の計画における別の主要な考慮事項は、本発明に記載の化合物に存在する反応性官能基の保護に使用される保護基の賢明な選択であることも認識される。熟練した実施者に対して多くの選択肢を説明する信頼ある記述は、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．（Ｇｒｅｅｎｅ＆Ｗｕｔｓ，１９９１）に見出される。本明細書で引用されたすべての参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0066】

合成例１～３４は、本発明の化合物を調製するために使用することができる手順の代表である。合成例１～１７は、既知の化合物であるイソソルビド－２－モノニトレート（５－ヒドロキシ－１，４：３，６－ジアンヒドロ－Ｄ－グルシトール２－ニトレート）および５－アミノ－イソソルビド－２－モノニトレート（５－アミノ－１，４：３，６－ジアンヒドロ－Ｄ－グルシトール２－ニトレート）を使用し、合成例１８～３４は、イソソルビド－５－モノニトレート（２－ヒドロキシ－１，４：３，６－ジアンヒドロ－Ｄ－グルシトール５－ニトレート）および２－アミノ－イソソルビド－５－モノニトレート（２－アミノ－１，４：３，６－ジアンヒドロ－Ｄ－グルシトール５－ニトレート）を出発物質として使用する。本発明の詳細な説明において、合成例１～１７は、式Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩに関し、合成例１８～３４は、式ＩＶ、Ｖ、およびＶＩに関する。

【0067】

合成例１

【化2】

【0068】

５－アミノ－イソソルビド－２－モノニトレート（１）１Ｎ ＨＣｌ溶液を、室温で１０～１２時間撹拌しながらイソシアン酸カリウムで処理し、抽出による従来のワークアップを行って２－ウレイド誘導体（２）を得ることができる。

【0069】

合成例２

【化3】

【0070】

Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびジメチル－アミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下、５－アミノ－イソソルビド－２－モノニトレート（１）をジクロロメタン中のＮ－ｔ－ＢＯＣ－グリシン（ｔ－ＢＯＣ＝第三級ブチル－オキシカルボニル）で処理することができる。周囲温度で一晩撹拌した後、ｔ－ＢＯＣアミド（３）を従来の方法で単離することができる。続いて、（３）をトリフルオロ酢酸で処理して、脱保護されたアミノ酸付加物（４）を得ることができ、これを前述のようにイソシアン酸カリウムおよび希ＨＣｌ溶液で処理して、ウレイドグリシン付加物（５）を得ることができる。

【0071】

合成例３

【化4】

【0072】

ピロリジノピリミジンの存在下、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中のイソソルビド－２－モノニトレート（６）を１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリニル）カルボジイミド（ＣＭＣ）で処理して、保護されたアミノ酸付加物（７）を得ることができる。ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で保護基を除去して、アミノ化合物（８）を得ることができる。続いて、０℃から周囲温度でイソシアン酸カリウムおよび希塩酸溶液で処理して、尿素化合物（９）を得ることができる。

【0073】

合成例４

【化5】

【0074】

［Ｃｐ＊Ｉｒ（Ｐｒｏ）Ｃｌ］（Ｐｒｏ＝プロリナト）（Ｃｐ＝シクロペンタジエニル）の存在下、５－アミノ－イソソルビド－２－モノニトレート（１）をトルエンまたは水中のｔ－ＢＯＣ－アミノエタノールまたはｔ－ＢＯＣ－３－アミノプロパノールで処理して、保護されたジアミノ付加物（１０）を得ることができる。保護基をＴＦＡで除去して、第一級アミン（１１）を得ることができ、これを前述のように希塩酸溶液中のシアン酸カリウムを使用して尿素（１２ａ、１２ｂ）に変換することができる。

【0075】

合成例５

【化6】

【0076】

イソソルビド－２－モノニトレート（６）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の水素化ナトリウムまたはリチウムジイソプロピルアミドで脱プロトン化し、次いで、ｔ－ＢＯＣ－アミノエチルブロミドまたはｔ－ＢＯＣ－３－アミノプロピルブロミドで処理して、エーテル（１２）を得ることができる。ＴＦＡを使用してｔ－ＢＯＣ基を脱保護して、第一級アミン（１３）を得て、続いて、前述のようにイソシアン酸カリウムで処理して、尿素（１４）を得ることができる。

【0077】

合成例６

【化7】

【0078】

５－アミノ－イソソルビド－２－モノニトレート（１）をＴＨＦまたはＤＣＭ中のエチルシアナノアセテートで処理して、尿素（１５）を得ることができる。メタノール中の無水アンモニアとさらに反応させて、ウレイドカルボキサミド（１６）を生成することができる。

【0079】

合成例７

【化8】

【0080】

Ｎ－メチルイミダゾールの存在下、イソソルビド－２－モノニトレート（６）をアセトニトリル中のｔ－ブチルシアノアセテートで処理して、カルバメート（１７）を得ることができる。ｔ－ブチル基の除去をエーテル中のＨＣｌまたはＴＦＡを使用して達成し、カルボン酸（１８）を得ることができる。ＤＣＣの存在下、酸をアンモニアでアミド化して、カルボキサミド（１９）を得ることができる。

【0081】

合成例８

【化9】

【0082】

ＤＣＣ／ＤＭＡＰまたはＣＭＣ／ピロリジノピリミジンの存在下、５－アミノ－イソソルビド－２－モノニトレート（１）またはイソソルビド－２－モノニトレート（６）をＤＣＭ中のマロン酸モノアミドで処理して、マロンアミド（２０）またはマロノ－エステル－アミド（２１）をそれぞれ生成することができる。

【0083】

合成例９

【化10】

【0084】

５－アミノ－イソソルビド－２－モノニトレート（１）をホスゲンおよびピリジンで約０℃で処理して、塩化カルバモイル（２２ａ、Ｘ＝ＮＨ）を生成することができる。ＤＣＭ中のＤＭＡＰの存在下、この塩化カルバモイルをグリシンアミドと低温で反応させて、ウレイドカルボキサミド（２３）を得ることができる。あるいは、ＤＣＭ中のＤＭＡＰの存在下、塩化カルバモイル（２２）（Ｘ＝ＮＨ）をグリコールアミドで処理して、末端カルボキサミド基を有するカーボネート（２４）を得ることができる。この一連の出発物質としてイソソルビド－２－モノニトレート（６）を使用する場合、ホスゲン反応により、低温（２２、Ｘ＝Ｏ）で塩化カルボニルを生成することができ、この中間体を前述の条件下でグリシンアミドまたはグリコールアミドで処理する場合、カルバメート（２５）または炭酸塩（２６）をそれぞれ調製することができる。

【0085】

合成例１０

【化11】

【0086】

トルエン中のコバルト触媒およびモレキュラーシーブの存在下、５－アミノ－イソソルビド－２－モノニトレート（１）を３－ヒドロキシプロピオンアミドまたは４－ヒドロキシブタンアミドで高温で処理して、カルボキサミドアミン（２７）および（２８）をそれぞれ生成することができる。

【0087】

合成例１１

【化12】

【0088】

イソソルビド－２－モノニトレート（６）をＴＨＦ中の水素化ナトリウムまたはＴＨＦ中のリチウムジイソプロピルアミドで処理し、続いて、アルコキシドを３－ブロモプリオンアミドまたは４－ブロモブタンアミドでアルキル化して、カルボキサミドエーテル（２９）および（３０）をそれぞれ得ることができる。

【0089】

合成例１２

【化13】

【0090】

ＴＨＦ中のトリエチルアミンの存在下、２－アミノ－イソソルビド－５－モノニトレート（１）をアセトキシアセチルクロリドで処理して、アミド付加物（３１）を生成することができる。アセテートを水酸化ナトリウム溶液で加水分解して、ヒドロキシルアミド（３２）を生成することができる。

【0091】

合成例１３

【化14】

【0092】

ＴＨＦ中のトリエチルアミンの存在下、イソソルビド－２－モノニトレート（６）をアセトキシアセチルクロリドで処理して、エステル付加物（３３）を生成することができる。アセテートをジブチルスズオキシドで加水分解して、グリコール酸付加物（３４）を生成する。

【0093】

合成例１４

【化15】

【0094】

Ｎ－アセトキシアセチルグリシンは、トリエチルアミンの存在下、ベンジルグリシンをアセトキシアセチルクロリドで処理し、続いてパラジウム触媒の存在下、ベンジルエステルを水素化分解することによって調製することができる。ＤＣＣの存在下、５－アミノ－イソソルビド－２－モノニトレート（１）をＤＣＭ中のアセトキシアセチルグリシンで処理して、アセチル化アミド付加物（３５）を生成することができる。酢酸塩（３６）の除去は、メタノール溶液中のＫＯＨまたはトリメチルスズヒドロキシドとの反応によって達成することができる。

【0095】

合成例１５

【化16】

【0096】

ＤＣＣ／ＤＭＰの存在下、イソソルビド－２－モノニトレート（６）をＤＣＭ中のアセトキシアセチルグリシンで処理して、アセチル化エステル付加物（３７）を生成することができる。アセテート（３８）の除去は、トリメチルスズヒドロキシドとの反応によって達成することができる。

【0097】

合成例１６

【化17】

【0098】

トルエン中のコバルト触媒およびモレキュラーシーブの存在下、５－アミノ－イソソルビド－２－モノニトレート（１）をＮ－ｔ－ＢＯＣ－アミノエタノールまたはＮ－ｔ－ＢＯＣ－３－アミノプロパノールで高温で処理して、保護されたアミノ化合物（３９）を得ることができる。保護基の除去は、ＴＦＡを使用して達成することができ、これにより、保護されていない第一級アミン（４０）を得ることができる。トリメチルアミンの存在下、アミン（４０）をアセトキシアセチルクロリドと反応させてアミド（４１）を得ることができ、続いてメタノール中のＫＯＨで処理して、ヒドロキシアセトアミド（４２および４３）を得ることができる。

【0099】

合成例１７

【化18】

【0100】

イソソルビド－２－モノニトレート（６）をＴＨＦ中の水素化ナトリウムまたはＬＤＡで脱プロトン化し、続いて、Ｎ－ｔ－ＢＯＣ－アミノエチルブロミドまたはＮ－ｔ－ＢＯＣ－３－アミノプロピルブロミドを添加して、保護されたエーテル（４４）を得ることができる。ＴＦＡを使用してアミノ基を脱保護して、第一級アミン（４５）が得られ、これを塩化アクテオキシアセチルで処理して、アミド（４６）を得ることができる。ＭｅＯＨ中のＫＯＨを使用して酢酸塩を加水分解して、ヒドロキシアセトアミド（４７および４８）を得ることができる。

【0101】

合成例１８

【化19】

【0102】

２－アミノ－イソソルビド－５－モノニトレート（４９）１Ｎ ＨＣｌ溶液を、室温で１０～１２時間撹拌しながらイソシアン酸カリウムで処理して、抽出による従来のワークアップを行って２－ウレイド誘導体（５０）を得ることができる。

【0103】

合成例１９

【化20】

【0104】

Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびジメチル－アミノピリジンの存在下、２－アミノ－イソソルビド－５－モノニトレート（４９）をジクロロメタン中のＮ－ｔ－ＢＯＣ－グリシン（ｔ－ＢＯＣ＝第三級ブチル－オキシカルボニル）（ＤＭＡＰ）で処理することができる。周囲温度で一晩撹拌した後、ｔ－ＢＯＣアミド（５１）を従来の方法で単離することができる。続いて、（５１）をトリフルオロ酢酸で処理して、脱保護されたアミノ酸付加物（５２）を得ることができ、前述のようにイソシアン酸カリウムおよび希塩酸溶液で処理して、ウレイドグリシン付加物（５３）を得ることができる。

【0105】

合成例２０

【化21】

【0106】

ジクロロメタン（ＤＣＭ）中のイソソルビド－５－モノニトレート（５４）をピロリジノピリミジンの存在下で１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリニル）カルボジイミド（ＣＭＣ）で処理して、保護されたアミノ酸付加物（５５）を得ることができる。ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で保護基を除去して、アミノ化合物（５６）を得ることができる。続いて、０℃から周囲温度でイソシアン酸カリウムおよび希塩酸溶液で処理して、尿素化合物（５７）を得ることができる。

【0107】

合成例２１

【化22】

【0108】

［Ｃｐ＊Ｉｒ（Ｐｒｏ）Ｃｌ］（Ｐｒｏ＝プロリナト）（Ｃｐ＝シクロペンタジエニル）の存在下、２－アミノ－イソソルビド－５－モノニトレート（４９）をトルエンまたは水中のｔ－ＢＯＣ－アミノエタノールまたはｔ－ＢＯＣ－３－アミノプロパノールで処理して、保護されたジアミノ付加物（５８）を得ることができる。保護基をＴＦＡで除去して、第一級アミン（５９）を得ることができ、これを前述のように希塩酸溶液中のシアン酸カリウムを使用して尿素（６０ａ、６０ｂ）に変換することができる。

【0109】

合成例２２

【化23】

【0110】

イソソルビド－５－モノニトレート（５４）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の水素化ナトリウムまたはリチウムジイソプロピルアミドで脱プロトン化し、次いで、ｔ－ＢＯＣ－アミノエチルブロミドまたはｔ－ＢＯＣ－３－アミノプロピルブロミドで処理して、エーテル（６０）を得ることができる。ＴＦＡを使用してｔ－ＢＯＣ基を脱保護して、第一級アミン（６１）を得て、続いて、前述のようにイソシアン酸カリウムで処理して、尿素（６２）を得ることができる。

【0111】

合成例２３

【化24】

【0112】

２－アミノ－イソソルビド－５－モノニトレート（４９）をＴＨＦまたはＤＣＭ中のエチルシアナノアセテートで処理して、尿素（６３）を得ることができる。メタノール中の無水アンモニアとさらに反応させて、ウレイドカルボキサミド（６４）を生成することができる。

【0113】

合成例２４

【化25】

【0114】

Ｎ－メチルイミダゾールの存在下、イソソルビド－５－モノニトレート（５４）をアセトニトリル中のｔ－ブチルシアノアセテートで処理して、カルバメート（６５）を得ることができる。ｔ－ブチル基の除去をエーテル中のＨＣｌまたはＴＦＡを使用して達成し、カルボン酸（６６）を得ることができる。ＤＣＣの存在下、酸をアンモニアでアミド化して、カルボキサミド（６７）を得ることができる。

【0115】

合成例２５

【化26】

【0116】

ＤＣＣ／ＤＭＡＰまたはＣＭＣ／ピロリジノピリミジンの存在下、２－アミノ－イソソルビド－５－モノニトレート（４９）またはイソソルビド－５－モノニトレート（５４）をＤＣＭ中のマロン酸モノアミドで処理して、マロンアミド（６８）またはマロノ－エステル－アミド（６９）をそれぞれ生成することができる。

【0117】

合成例２６

【化27】

【0118】

２－アミノ－イソソルビド－５－モノニトレート（４９）をホスゲンおよびピリジンで約０℃で処理して、塩化カルバモイル（７０ａ、Ｘ＝ＮＨ）を生成することができる。ＤＣＭ中のＤＭＡＰの存在下、この塩化カルバモイルをグリシンアミドと低温で反応させて、ウレイドカルボキサミド（７１）を得ることができる。あるいは、ＤＣＭ中のＤＭＡＰの存在下、塩化カルバモイル（７０ａ、Ｘ＝ＮＨ）をグリコールアミドで処理し、末端カルボキサミド基を有するカーボネート（７２）を得ることができる。イソソルビド－５－モノニトレート（５４）をこの一連の出発物質として使用する場合、ホスゲン反応により、塩化カルボニルを低温（７０ｂ、Ｘ＝Ｏ）で生成することができ、この中間体を前述の条件下でグリシンアミドまたはグリコールアミドで処理する場合、カルバメート（７３）またはカーボネート（７４）をそれぞれ調製することができる。

【0119】

合成例２７

【化28】

【0120】

トルエン中のコバルト触媒およびモレキュラーシーブの存在下、２－アミノ－イソソルビド－５－モノニトレート（４９）を３－ヒドロキシプロピオンアミドまたは４－ヒドロキシブタンアミドで高温で処理して、カルボキサミドアミン（７５）および（７６）をそれぞれ生成することができる。

【0121】

合成例２８

【化29】

【0122】

イソソルビド－５－モノニトレート（６）をＴＨＦ中の水素化ナトリウムまたはＴＨＦ中のリチウムジイソプロピルアミドで処理し、続いて、アルコキシドを３－ブロモプリオンアミドまたは４－ブロモブタンアミドでアルキル化して、カルボキサミドエーテル（７７）および（７８）をそれぞれ得ることができる。

【0123】

合成例２９

【化30】

【0124】

ＴＨＦ中のトリエチルアミンの存在下、２－アミノ－イソソルビド－５－モノニトレート（４９）をアセトキシアセチルクロリドで処理して、アミド付加物（７９）を生成することができる。アセテートを水酸化ナトリウム溶液で加水分解して、ヒドロキシルアミド（８０）を生成することができる。

【0125】

合成例３０

【化31】

【0126】

ＴＨＦ中のトリエチルアミンの存在下、イソソルビド－５－モノニトレート（５４）をアセトキシアセチルクロリドで処理して、エステル付加物（８１）を生成することができる。アセテートをジブチルスズオキシドで加水分解して、グリコール酸付加物（８２）を生成する。

【0127】

合成例３１

【化32】

【0128】

Ｎ－アセトキシアセチルグリシンは、トリエチルアミンの存在下、ベンジルグリシンをアセトキシアセチルクロリドで処理し、続いてパラジウム触媒の存在下、ベンジルエステルを水素化分解することによって調製することができる。ＤＣＣの存在下、２－アミノ－イソソルビド－５－モノニトレート（４９）をＤＣＭ中のアセトキシアセチルグリシンで処理して、アセチル化アミド付加物（８３）を生成することができる。酢酸塩（８４）の除去は、メタノール溶液中のＫＯＨまたはトリメチルスズヒドロキシドとの反応によって達成することができる。

【0129】

合成例３２

【化33】

【0130】

ＤＣＣ／ＤＭＰの存在下、イソソルビド－５－モノニトレート（６）をＤＣＭ中のアセトキシアセチルグリシンで処理して、アセチル化エステル付加物（８５）を生成することができる。アセテート（８６）の除去は、トリメチルスズヒドロキシドとの反応によって達成することができる。

【0131】

合成例３３

【化34】

【0132】

トルエン中のコバルト触媒およびモレキュラーシーブの存在下、２－アミノ－イソソルビド－５－モノニトレート（４９）をＮ－ｔ－ＢＯＣ－アミノエタノールまたはＮ－ｔ－ＢＯＣ－３－アミノプロパノールで高温で処理して、保護されたアミノ化合物（８７）を得ることができる。保護基の除去は、ＴＦＡを使用して達成することができ、これにより、保護されていない第一級アミン（８８）を得ることができる。トリメチルアミンの存在下、アミン（８８）をアセトキシアセチルクロリドと反応させてアミド（８９）を得ることができ、続いてメタノール中のＫＯＨで処理して、ヒドロキシアセトアミド（９０および９１）を得ることができる。

【0133】

合成例３４

【化35】

【0134】

イソソルビド－５－モノニトレート（５４）をＴＨＦ中の水素化ナトリウムまたはＬＤＡで脱プロトン化し、続いて、Ｎ－ｔ－ＢＯＣ－アミノエチルブロミドまたはＮ－ｔ－ＢＯＣ－３－アミノプロピルブロミドを添加して、保護されたエーテル（９２）を得ることができる。ＴＦＡを使用してアミノ基を脱保護して、第一級アミン（９３）が得られ、これを塩化アクテオキシアセチルで処理して、アミド（９４）を得ることができる。ＭｅＯＨ中のＫＯＨを使用して酢酸塩を加水分解して、ヒドロキシアセトアミド（９５および９６）を得ることができる。

【0135】

生物学
本化合物については２つの主な適応症がある。第１の適応症は狭心症治療剤としてである。化合物は、冠状血管拡張剤として作用する薬剤とともに、冠状動脈疾患の状況における運動能力を改善することが期待される。第２の適応症は、心血管疾患の二次予防であり、この用途では、血管拡張は虚血性プレコンディショニングと同様に考えられる。

【0136】

本明細書に記載の実験は、本化合物が少なくとも２つの主な適応症に有用であるかどうかを試験するために使用される。実験は、ＲＯＳ（活性酸素種）の生成、ならびに炎症および虚血性プレコンディショニングのマーカー、ならびにエクスビボでヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）および末梢血単核細胞細胞（ＰＢＭＣ）を使用した、血管平滑筋弛緩のメディエーターに対する、本化合物の効果および低酸素症の影響を決定することである。正常かつ健康な成人から単離された初代ＨＡＥＣは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ニューヨーク州グランドアイランド）から購入し、Ｍｅｄｉｕｍ２００中で培養することができる。末梢血単核細胞は、以下に参照されるように、エクスビボで本化合物の効果の決定の一部として使用することができる。

【0137】

細胞培養物は、細胞操作のすべての態様を包含する、密閉環境で酸素および二酸化炭素がダイナミック制御されるＢｉｏｓｐｈｅｒｉｘ（ニューヨーク州ラコナ）加湿細胞培養インキュベーター中で維持することができる。培地は、ｐＨ７．３で調製することができる。インキュベーター条件は、３７℃の内部温度を有する加湿インキュベーター（ＣＯ_２／Ｏ_２モニタリングおよびＣＯ_２／Ｎ_２ガス供給源を有する、制御インキュベーターを使用する）中で、常酸素（２１％Ｏ_２、５％ＣＯ_２）または低酸素（１％ Ｏ_２、５％ ＣＯ_２、残りがＮ_２）のいずれかであり得る。培地は、細胞曝露前に一晩、環境ガス条件に平衡化される。できるだけ早く、かつ、いくつかの場合では初代培養において、細胞を実験用ガス混合物とともに様々な期間インキュベートする。再酸素化（ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ）は、グローブド細胞アクセスを有する密閉された環境チャンバーを使用して防止することができる。ｐＨ、ｐＣＯ_２、およびｐＯ_２電極を使用した細胞培地の定期的な分析により、制御された環境を保証することができる。

【0138】

ＨＡＥＣは、本発明の化合物の存在の有無に関わらず、正常酸素状態（２０％酸素）または低酸素状態（１％酸素）のいずれかに、１時間（ＲＯＳ測定の場合）、２時間（転写因子活性の測定の場合）、４時間（炎症メディエーター遺伝子の測定の場合）、また１６時間（炎症メディエータータンパク質の測定の場合）、曝露することができる。ジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）および２’，７’－ジクロロ－フルオレセイン（ＤＣＦ）蛍光アッセイを行って、スーパーオキシドアニオンおよび過酸化水素などのＲＯＳの細胞内レベルを測定することができる。ＨＡＥＣにおける炎症誘発性転写因子（ＮＦ－κＢおよびＡＰ－１）のＤＮＡ結合活性は、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によって分析することができる。炎症性メディエーターであるＩＬ－１βのｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルは、以前に示したように、リポ多糖（ＬＰＳ）刺激の状況において正常酸素対低酸素で培養されたＨＡＥＣで測定することができる。（Ｆｏｌｃｏ，Ｓｕｋｈｏｖａ，Ｑｕｉｌｌａｒｄ，＆Ｌｉｂｂｙ，２０１４）。他のマーカー（ＴＮＦ－α、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－γ、ＵＴ－Ｂ、ｅＮＯＳ、ＣＯＸ－２、およびＭＣＰ－１）は、刺激されたＨＡＥＣで調べることができる。ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルは、定量的リアルタイム逆転写酵素－ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）および酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定することができる。ＥＬＩＳＡは、初代培養中でＨＡＥＣを刺激した後、ＰＧＥ_２などの関連する内皮応答のメディエーターを選択するための分析に使用することができる。代謝は、高解像度呼吸測定法およびシーホース細胞外フラックス分析の組み合わせによる確立されたプロトコルを使用して包括的に評価し、患者細胞におけるミトコンドリア対解糖の寄与を示すことができる。

【0139】

関連する転写因子の活性化レベルは、ＨＡＥＣから分離された核抽出物のＤＮＡ結合活性をＥＭＳＡで測定することによって決定することができる。ＨＡＥＣを上記のように処理することができ、細胞を溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、６０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１ｍＭジチオスレイトール、１００μＭフッ化フェニルーメチルスルホニル、０．１％ＮＰ－４０）とともにインキュベートし、氷上で５分間溶解し、６００×ｇで４℃で４分間遠心分離して、核を回収することができる。次いで、核ペレットを、ＮＰ－４０なしで溶解バッファーで洗浄し、核抽出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０、４２０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、２５％グリセロール）に氷上で１０分間溶解し、１８，３００×ｇで４℃で１５分間遠心分離することができる。核抽出物を含む上清をドライアイス上で直ぐ凍結し、分析まで－８０℃に移行することができる。結合反応は、４μｇの核タンパク質抽出物、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ，ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭジチオスレイトール、１０％グリセロール、および２μｇのポリ［ｄＩ－ｄＣ］を使用して行うことができる。試薬を添加した後、混合物を室温で２５分間インキュベートすることができる。次いで、ビオチン標識した特異的オリゴヌクレオチドプローブを添加することができ、および／または非標識対照を添加することができ、結合混合物を室温で２５分間インキュベートすることができる。モル過剰の非標識オリゴヌクレオチドを結合反応に添加することにより、競合研究を行うことができる。得られたタンパク質－ＤＮＡ複合体は、０．２５×ＴＢＥバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、４５ｍＭホウ酸、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．４）を使用して、非変性５％ポリアクリルアミドゲル上で１５０Ｖで３時間電気泳動できる。これは、ＬｉｇｈｔＳｈｉｆｔ化学発光ＥＭＳＡキット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イリノイ州ロックフォード）の変型である。

【0140】

定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ－ＰＣＲ）アッセイを使用することができる。プローブおよびプライマーを使用した蛍光発生５’－ヌクレアーゼアッセイ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州フォスターシティー）を遺伝子発現分析に使用することができる。ＨＡＥＣを上記のように処理することができ、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，カリフォルニア州バレンシア）を使用して全ＲＮＡをＨＡＥＣから単離することができる。１μｇの全ＲＮＡを、２５℃で１５分間、４２℃で４５分間、および９９℃で５分間、２０μＬの５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ９．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１ｍＭ ｄＮＴＰ、１ユニット／μＬの組換えＲＮａｓｉｎ、１５ユニット／μｇのトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、および０．５μｇのランダムヘキサマー中で逆転写することができる。個々の遺伝子の増幅は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘおよび標準的なサーマルサイクラープロトコル（最初のサイクルの前に５０℃で２分間、９５℃で１５秒間、および６０℃で１分間、４５回繰り返する）を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７３００リアルタイムＰＣＲシステムで行うことができる。ヒトＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＦＮ－γ、ＵＴ－Ｂ、ＣＯＸ－２、ｅＮＯＳ、ＭＣＰ－１、およびグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の遺伝子発現アッセイ試薬は、ＰＣＲ増幅の特定のプローブおよびプライマーに使用することができる。増幅された標的遺伝子の量が一定の閾値に達する分数サイクル数を示す閾値サイクル（ＣＴ）は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｏｆｔｗａｒｅを使用して各ウェルから決定することができる。

【0141】

ＲＯＳの細胞内レベルは、蛍光顕微鏡を使用してＤＨＥおよびＤＣＦ蛍光染色によって測定することができる。ＨＡＥＣを上記に示したように処理することができ、細胞に、ＰＢＳ中５μＭの濃度のＤＨＥまたはカルボキシＨ_２ＤＣＦ－ＤＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，カリフォルニア州カールスバッド）のいずれかを５％ＣＯ_２／９５％空気の加湿細胞培養インキュベーター中で３７℃で３０分間充填することができる。ＨＡＥＣをＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡で調べることができる。取得したデジタル画像のＤＨＥまたはＤＣＦ蛍光強度を適宜定量化することができる。

【0142】

内皮細胞からの低酸素媒介性ＮＯ放出に対する本化合物の効果は、膜不透過性の細胞内ＤＡＦ－２の蓄積をもたらす、膜透過性の４，５－ジアミノフルオレセインジアセテート（ＤＡＦ－２ジアセテート）を使用して細胞を単離することによって測定することができる。ＤＡＦ－２はＮＯと反応して高蛍光性トリアゾロフルオレセイン（ＤＡＦ－２Ｔ）を形成し、上清を蛍光分光測定するによって、これを検出することができる（Ｌｅｉｋｅｒｔ，Ｒａｔｈｅｌ，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｖｏｌｌｍａｒ，＆Ｄｉｒｓｃｈ，２００１）。

【0143】

細胞ＲＯＳホメオスタシスおよび代謝に対する本化合物の効果を細胞代謝アッセイで試験するために、並行研究を使用することができる。異なる実験群からのプレーティング細胞は、シーホース細胞外フラックス分析装置で研究することができる。酸素消費率（ミトコンドリア機能）および細胞外酸性化率（解糖）は、基礎条件下、最大呼吸条件下、および確立された方法を使用してミトコンドリア生体エネルギー発生（ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ）を阻害した後に測定することができる（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。確立されたプロトコルを使用して、細胞のＲＯＳおよび代謝を同時に測定するために、細胞の並列サブセットをＯｒｏｂｏｒｏｓ高解像度呼吸計チャンバーに配置することができる（Ａｌｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

【0144】

末梢血単核細胞および血清は、ヒトボランティアから入手することができる。虚血性心筋症（心筋梗塞の病歴を含む）および二次予防の適応症の患者に対する本化合物の効果を試験するように設計された臨床試験において、患者を自身の対照として使用することができる。研究は、１吸引あたり５ｘ８ｍＬの血液チューブに限定することができ、当該血液チューブから、ヘパリンナトリウムを含むＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴ（ニュージャージー州フランクリンレイクス）を使用して、１チューブあたり２ｍＬの血漿由来血清および８ｘ１０^６個のＰＢＭＣを抽出することが期待できる。これには、ＦＩＣＯＬＬ Ｈｙｐａｑｕｅ密度液体および２つの液体を分離するポリエステルゲルバリアとともにヘパリンナトリウム抗凝固剤が含まれている。チューブを１５００ｇで室温で１５分間遠心分離することができる。血漿は、密度溶液上の単核細胞および血小板の層上の上清として得ることができる。血清は、ＣａＣｌ_２を２０ｍＭの最終濃度まで添加し、室温で４時間凝固させ、続いて、凝固した血漿を－２０℃で凍結し、融解し、少なくとも５分間５０００ｇを維持して血清を遠心分離することにより、血漿上清から得ることができる。血清をろ過し、あるコートとし、－２０℃で凍結することができる。ＰＢＭＣは、１８～２０℃、４００ｇで１０～１５分間遠心分離することにより分離した後にリン酸緩衝生理食塩水中で２回洗浄し、次いで、８ｘ１０６個の細胞／２ｍＬのＡＩＭＶ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁し、次いで、１ｘ１０６個の細胞のアリコートに分けることができる。培養物は、細胞操作のすべての態様を包含する、密閉環境で酸素および二酸化炭素がダイナミック制御されるＢｉｏｓｐｈｅｒｉｘ（ニューヨーク州ラコナ）加湿細胞培養インキュベーター中で維持することができる。

【0145】

ＤＨＥ／ＤＣＦ蛍光アッセイ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ＥＭＳＡ、およびレポーター遺伝子アッセイは、内皮型一酸化窒素合成酵素およびシクロオキシゲナーゼ発現の下流産物を含む、ＲＯＳ生成、ｍＲＮＡ、および虚血性プレコンディショニングのメディエーターのタンパク質発現を決定するために行うことができる。ｅＮＯＳおよびＣＯＸ－２の生成物は、対照と比較した本化合物の治療価値を確認することができる。毒性は、シーホース技術を使用して、本化合物の代謝効果によって評価することができる。

【0146】

表１～６は、上記のようにして合成することができる本発明の化合物の構造を示す。

【0147】

【表1】

【0148】

【表2】

【0149】

【表3】

【0150】

【表4】

【0151】

【表5】

【0152】

【表6】

【0153】

上記の教示に照らして、本発明の多くの修正および変形が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内で、本発明は、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で実施され得ることが理解されるべきである。

【0154】

参考文献
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【0155】

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Ｊｉ，Ｙ．－Ｓ．，Ｘｕ，Ｑ．，＆Ｓｃｈｍｅｄｔｊｅ，Ｊ．Ｆ．，Ｊｒ．（１９９８）．Ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎｄｕｃｅｓ ｈｉｇｈ－ｍｏｂｉｌｉｔｙ－ｇｒｏｕｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉ（Ｙ）ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２ ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８３，２９５－３０４．

【0163】

Ｌｅｉｋｅｒｔ，Ｊ．Ｆ．，Ｒａｔｈｅｌ，Ｔ．Ｒ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｃ．，Ｖｏｌｌｍａｒ，Ａ．Ｍ．，＆Ｄｉｒｓｃｈ，Ｖ．Ｍ．（２００１）．Ｒｅｌｉａｂｌｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅ ４，５－ｄｉａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５０６，１３１－１３４．

【0164】

Ｌｉ，Ｑ．，Ｇｕｏ，Ｙ．，Ｔａｎ，Ｗ．，Ｏｕ，Ｑ．，Ｗｕ，Ｗ．Ｊ．，Ｓｔｕｒｚａ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｆｆｏｒｄｅｄ ｂｙ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｉｓ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２ ｖｉａ ａ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ－κＢ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐａｔｈｗａｙ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１６，１５７７－１５８４．

【0165】

Ｌｉ，Ｘ．，Ｃｈｅｎ，Ｇ，Ｙａｎｇ，Ｂ．（２０１２）Ｕｒｅａ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｓｔｕｄｉｅｄ ｉｎ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，３：２１７．

【0166】

Ｓａｎｄｓ，Ｊ．Ｍ．（１９９９）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｎａｌ Ｕｒｅａ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，１０，６３５－６４６．

【0167】

Ｓｃｈｍｅｄｔｊｅ，Ｊ．Ｆ．，Ｊｒ．，Ｊｉ，Ｙ．－Ｓ．，Ｌｉｕ，Ｗ．－Ｌ．，ＤｕＢｏｉｓ，Ｒ．Ｎ．，＆Ｒｕｎｇｅ，Ｍ．Ｓ．（１９９７）．Ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２ ｖｉａ ｔｈｅ ＮＦ－κＢ ｐ６５ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７２，６０１－６０８．

【0168】

Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｇ．Ｌ．（２０１９）．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｈｙｐｏｘｉａ－Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｆａｃｔｏｒｓ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，５９，３７９－４０３．

【0169】

Ｓｈａｙａｋｕｌ，Ｃ．，Ｃｌｅｍｅｎｃｏｎ，Ｂ．，＆Ｈｅｄｉｇｅｒ，Ｍ．Ａ．（２０１３）．Ｔｈｅ ｕｒｅａ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｆａｍｉｌｙ （ＳＬＣ１４）：ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｓｐｅｃｔｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３４，３１３－３２２．

【0170】

Ｓｕｎ，Ｙ．，Ｌａｕ，Ｃ．Ｗ．，Ｊｉａ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ｒａｎ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｆ．，Ｈｕａｎｇ，Ｙ．，Ｚｈｏｕ，Ｈ．，Ｙａｎｇ，Ｂ．（２０１６）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒｅａ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＵＴ－Ｂ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｖａｓｏｄｉｌａｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｗｅｒｓ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｖｉａ Ｌ－ａｒｇｉｎｉｎｅ－ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ－ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｐａｔｈｗａｙ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ６，１８６９７．

【0171】

Ｗａｇｎｅｒ，Ｌ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｓａｎｄｓ，Ｊ．Ｍ．，＆Ｂａｙｌｉｓ，Ｃ．（２００２）．Ｕｒｅａ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ａｒｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ－ａｒｇｉｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２８３，Ｆ５７８－Ｆ５８２．

【0172】

Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｗｕ，Ｌ．，Ａｏｕｆｆｅｎ，Ｍ．，Ｍａｔｅｅｓｃｕ，Ｍ．，Ｎａｄｅａｕ，Ｒ．，＆Ｗａｎｇ，Ｒ．（１９９９）．Ｎｏｖｅｌ ｃａｒｄｉａｃ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｕｒｅａ：ｆｒｏｍ ｓｈａｒｋ ｔｏ ｒａｔ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１２８，１４７７－１４８４．

【0173】

Ｘｉａｏ，Ｓ．；Ｅｒｄｅｌｙ，Ａ．；Ｗａｇｎｅｒ，Ｌ．；Ｂａｙｌｉｓ，Ｃ．（２００１）Ｕｒｅｍｉｃ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＢＵＮ ｄｏ ｎｏｔ ｃａｕｓｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｎｏｒｍａｌ ｒｅｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ－Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２８０，Ｆ９９６－Ｆ１０００．

【0174】

Ｘｕ，Ｑ．，Ｊｉ，Ｙ．Ｓ．，＆Ｓｃｈｍｅｄｔｊｅ，Ｊ．Ｆ．，Ｊｒ．（２０００）．Ｓｐ１ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２ ｉｎ ｈｙｐｏｘｉｃ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ－Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｏｒｔｉｃ ａｎｅｕｒｙｓｍ ａｎｄ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７５，２４５８３－２４５８９．

【0175】

Ｚｈａｏ，Ｄ．，Ｓｏｎａｗａｎｅ，Ｎ．Ｄ．，Ｌｅｖｉｎ，Ｍ．Ｈ．，＆Ｙａｎｇ，Ｂ．（２００７）．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ ｏｆ ｕｒｅａ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｕｒｅａ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＵＴ－Ｂ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）－Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，１７６８，１８１５－１８２１．