特許 7452918 マクロファージの製造方法、分化誘導剤、分化誘導キット、マクロファージの分化誘導方法、マクロファージの増殖促進剤、マクロファージの増殖促進キット、マクロファージの増殖方法及びマクロファージ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-11

(45)【発行日】2024-03-19

(54)【発明の名称】マクロファージの製造方法、分化誘導剤、分化誘導キット、マクロファージの分化誘導方法、マクロファージの増殖促進剤、マクロファージの増殖促進キット、マクロファージの増殖方法及びマクロファージ

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0786 20100101AFI20240312BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALI20240312BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20240312BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0786

C12N5/0789

C12M3/00 Z

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2023569552

(86)(22)【出願日】2022-12-22

(86)【国際出願番号】 JP2022047472

(87)【国際公開番号】W WO2023120673

(87)【国際公開日】2023-06-29

【審査請求日】2023-11-16

(31)【優先権主張番号】P 2021208420

(32)【優先日】2021-12-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】504258527

【氏名又は名称】国立大学法人 鹿児島大学

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100168114

【弁理士】

【氏名又は名称】山中 生太

(74)【代理人】

【識別番号】100162259

【弁理士】

【氏名又は名称】末富 孝典

(74)【代理人】

【識別番号】100146916

【弁理士】

【氏名又は名称】廣石 雅紀

(72)【発明者】

【氏名】原 博満

(72)【発明者】

【氏名】松本 信英

(72)【発明者】

【氏名】豊永 憲司

【審査官】鳥居 敬司

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１７－５２３８１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０２１－５１３３２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－１３６０１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５２２５５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】Nature Communications，2021年04月，Vol.12, No.1，Article No.2299

【文献】The Journal of Immunology，2010年，Vol.184， pp.6522-6528

【文献】Diabetes，2015年，Vol.64，pp.117-127

【文献】BMC Immunology，2021年05月，22:30

【文献】Cell，2019年，Vol.178，pp.686-698

【文献】Cell，2017年，Vol.169，pp.1276-1290

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ５／００－５／２８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

マクロファージコロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の非存在下、かつリゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びミコール酸からなる群から選択されるＴＲＥＭ２シグナル活性化剤存在下で骨髄細胞を培養する培養ステップを含む、
マクロファージの製造方法。

【請求項2】

前記骨髄細胞を培養する細胞培養容器の表面が、
前記ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤でコートされている、
請求項１に記載のマクロファージの製造方法。

【請求項3】

リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びミコール酸からなる群から選択されるＴＲＥＭ２シグナル活性化剤を含み、かつマクロファージコロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のいずれも含まない、
骨髄細胞からマクロファージへの分化誘導剤。

【請求項4】

リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びミコール酸からなる群から選択されるＴＲＥＭ２シグナル活性化剤で表面がコートされた細胞培養容器を備え、
マクロファージコロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の非存在下での骨髄細胞の培養で使用される、
骨髄細胞からマクロファージへの分化誘導キット。

【請求項5】

マクロファージコロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の非存在下、かつリゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びミコール酸からなる群から選択されるＴＲＥＭ２シグナル活性化剤存在下で骨髄細胞を培養する培養ステップを含む、
マクロファージの分化誘導方法。

【請求項6】

リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びミコール酸からなる群から選択されるＴＲＥＭ２シグナル活性化剤を含み、かつマクロファージコロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のいずれも含まない、
マクロファージの増殖促進剤。

【請求項7】

リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びミコール酸からなる群から選択されるＴＲＥＭ２シグナル活性化剤で表面がコートされた細胞培養容器を備え、
マクロファージコロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の非存在下でのマクロファージの培養で使用される、
マクロファージの増殖促進キット。

【請求項8】

マクロファージコロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の非存在下、かつリゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びミコール酸からなる群から選択されるＴＲＥＭ２シグナル活性化剤存在下でマクロファージを培養する培養ステップを含む、
マクロファージの増殖方法。

【請求項9】

マクロファージコロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のいずれも含まず、かつリゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びミコール酸からなる群から選択されるＴＲＥＭ２シグナル活性化剤を含む培地で骨髄細胞を培養することで、ＴＲＥＭ２依存的に分化が誘導された、
マクロファージ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マクロファージの製造方法、分化誘導剤、分化誘導キット、マクロファージの分化誘導方法、マクロファージの増殖促進剤、マクロファージの増殖促進キット、マクロファージの増殖方法及びマクロファージに関する。

【背景技術】

【0002】

マクロファージは感染防御及び組織恒常性の維持に寄与する白血球細胞である。生体におけるマクロファージは、骨髄の造血幹細胞に由来し、その分化にはマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）の刺激が必要とされている。実際、マウスの骨髄細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＭ－ＣＳＦの存在下で培養することで、単球とマクロファージの性質を有する細胞（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ：ＢＭＤＭ）を分化誘導する手法が確立されている。ＢＭＤＭは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるマクロファージの研究ツールとして広く利用されている。

【0003】

ＢＭＤＭには、ｉ）誘導に使用するＭ－ＣＳＦが高価であるため、ＢＭＤＭを大量培養する際のコストが大きくなる、ｉｉ）一週間程度しか生存することができない、ｉｉｉ）分化後は増殖が止まるため、一回の培養で得られる細胞数が限定される、ｉｖ）上記ｉｉｉ）のために凍結保存後に融解して再培養ができない、等の問題がある。ＢＭＤＭ以外にも、げっ歯類及びヒト由来の様々なマクロファージ細胞株がｉｎ ｖｉｔｒｏ研究で頻繁に使用されている。これらの細胞には上記のｉ）～ｉｖ）の問題は存在しないが、腫瘍細胞であるため生体への投与等のｉｎ ｖｉｖｏ試験での使用が制限される。

【0004】

Ｍ－ＣＳＦを使用せずに単球からマクロファージを分化誘導する分化誘導剤として、特許文献１には、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗作用及びペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化作用を有する化合物を含有する分化誘導剤が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】特開２０１５－４７１２５号公報

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｈａｄａｓ Ｋｅｒｅｎ－Ｓｈａｕｌ，外１３名，「Ａ Ｕｎｉｑｕｅ Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ Ｔｙｐｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｎｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｃｅｌｌ，２０１７年，１６９，１２７６－１２９０

【文献】Ｄｉｅｇｏ Ａｄｈｅｍａｒ Ｊａｉｔｉｎ，外２２名，「Ｌｉｐｉｄ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ ａ Ｔｒｅｍ２－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍａｎｎｅｒ」，Ｃｅｌｌ，２０１９年，１７８，６８６－６９８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、特許文献１では、当該分化誘導剤によって得られるマクロファージの生存期間、分化後は増殖特性及び凍結保存の可否等は検討されていない。

【0008】

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、生存期間及び増殖期間が長く、凍結保存が可能で、研究ツールとして汎用性の高いマクロファージが得られるマクロファージの製造方法、分化誘導剤、分化誘導キット、マクロファージの分化誘導方法、マクロファージの増殖促進剤、マクロファージの増殖促進キット及びマクロファージの増殖方法を提供することを目的とする。また、本発明は、生存期間及び増殖期間が長く、凍結保存が可能で、研究ツールとして汎用性の高いマクロファージを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

疾患発症時には免疫細胞のリモデリングが生じて特殊な形質のマクロファージ集団が組織内に出現し、疾患の増悪又は抑制に重要な役割を担っていることが明らかになっている。例えば、アルツハイマー病のモデルマウスの脳には、特殊な性格を示す活性化ミクログリア（Ｄｉｓｅａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ：ＤＡＭ）が出現する（非特許文献１参照）。また、高脂肪食負荷により生活習慣病を発症したマウスの脂肪組織には定常時には存在しないマクロファージ集団（Ｌｉｐｉｄ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ：ＬＡＭ）が出現する（非特許文献２参照）。ＤＡＭ及びＬＡＭは脂質認識受容体であるＴＲＥＭ２（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ２）に特徴的に高発現する分子の１つである。非特許文献１及び２には、これらの疾患関連マクロファージの誘導にＴＲＥＭ２が深く関わることが示されている。

【0010】

本発明者は、骨髄細胞をＴＲＥＭ２シグナル活性化剤で刺激することでマクロファージ様の細胞が出現することを見出し、本発明を完成させた。

【0011】

（マクロファージの製造方法）
本明細書に記載されたマクロファージの製造方法は、
マクロファージコロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の非存在下、かつリゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びミコール酸からなる群から選択されるＴＲＥＭ２シグナル活性化剤存在下で骨髄細胞を培養する培養ステップを含む。

【0015】

前記骨髄細胞を培養する細胞培養容器の表面が、
前記ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤でコートされていることとしてもよい。

【0018】

（マクロファージへの分化誘導剤）
本明細書に記載された骨髄細胞からマクロファージへの分化誘導剤は、
リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びミコール酸からなる群から選択されるＴＲＥＭ２シグナル活性化剤を含み、かつマクロファージコロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のいずれも含まない。

【0019】

（マクロファージへの分化誘導キット）
本明細書に記載された骨髄細胞からマクロファージへの分化誘導キットは、
リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びミコール酸からなる群から選択されるＴＲＥＭ２シグナル活性化剤で表面がコートされた細胞培養容器を備え、
マクロファージコロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の非存在下での骨髄細胞の培養で使用される。

【0020】

（マクロファージの分化誘導方法）
本明細書に記載されたマクロファージの分化誘導方法は、
マクロファージコロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の非存在下、かつリゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びミコール酸からなる群から選択されるＴＲＥＭ２シグナル活性化剤存在下で骨髄細胞を培養する培養ステップを含む。

【0021】

（マクロファージの増殖促進剤）
本明細書に記載されたマクロファージの増殖促進剤は、
リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びミコール酸からなる群から選択されるＴＲＥＭ２シグナル活性化剤を含み、かつマクロファージコロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子のいずれも含まない。

【0022】

（マクロファージの増殖促進キット）
本明細書に記載されたマクロファージの増殖促進キットは、
リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びミコール酸からなる群から選択されるＴＲＥＭ２シグナル活性化剤で表面がコートされた細胞培養容器を備え、
マクロファージコロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の非存在下でのマクロファージの培養で使用される。

【0023】

（マクロファージの増殖方法）
本明細書に記載されたマクロファージの増殖方法は、
マクロファージコロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の非存在下、かつリゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びミコール酸からなる群から選択されるＴＲＥＭ２シグナル活性化剤存在下でマクロファージを培養する培養ステップを含む。

【0025】

本明細書に記載されたマクロファージは、
マクロファージコロニー刺激因子及び顆粒球マクロファージ刺激因子のいずれも含まず、かつリゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びミコール酸からなる群から選択されるＴＲＥＭ２シグナル活性化剤を含む培地で骨髄細胞を培養することで、ＴＲＥＭ２依存的に分化が誘導されたマクロファージである。

【発明の効果】

【0030】

本発明によれば、生存期間及び増殖期間が長く、凍結保存が可能で、研究ツールとして汎用性の高いマクロファージが得られる。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】マウス骨髄細胞から分化誘導したマクロファージの画像を示す図である。（Ａ）は、脳脂質で分化誘導したマクロファージの画像を示す。（Ｂ）はＭ－ＣＳＦで分化誘導したマクロファージの画像を示す。

【図2】試験例２に係るフローサイトメトリーによる解析で得られたドットプロットを示す図である。

【図3】試験例２に係るフローサイトメトリーによる解析で得られた表面抗原の単変量ヒストグラムを示す図である。

【図4】試験例３に係る単位培養面積当たりの脳脂質の質量に対する細胞数を示す図である。

【図5】試験例４に係る細胞数の経時変化を示す図である。（Ａ）の上段は培養０～２１日後の細胞数を示す。（Ａ）の下段は０日目の細胞数を１とした培養０～２１日後における細胞数の増加倍率を示す。（Ｂ）の上段は培養０～５４４日後の細胞数を示す。（Ｂ）の下段は０日目の細胞数を１とした培養０～５４４日後における細胞数の増加倍率を示す。（Ｃ）は脳脂質存在下又は非存在下で培養したマクロファージの細胞数を示す。

【図6】試験例５に係る凍結保存後に融解したマクロファージの細胞数の経時変化を示す図である。

【図7】試験例６に係る脳脂質での刺激後のマクロファージ数を示す図である。（Ａ）は混合培養されたＬｉｎ陽性細胞及びＬｉｎ陰性細胞から分化したマクロファージ数を示す。（Ｂ）はそれぞれ単独で培養されたＬｉｎ陽性細胞及びＬｉｎ陰性細胞から分化したマクロファージ数を示す。

【図8】試験例７に係る各マウス骨髄細胞を分化誘導後の生細胞数を示す図である。

【図9】試験例８に係るＴＲＥＭ２レポーター細胞を用いたリガンド活性を示す図である。

【図10】試験例８に係るマウス骨髄細胞を被験物質で分化誘導後の生細胞数を示す図である。

【図11】試験例９に係るマクロファージの貪食能を示す図である。

【図12】試験例１０に係るマクロファージのリポ多糖（ＬＰＳ）刺激に対するサイトカイン産生応答を示す図である。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）は、それぞれｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－１（ＭＣＰ－１）、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１０及び一酸化窒素（ＮＯ）の濃度を示す。

【発明を実施するための形態】

【0032】

本発明に係る実施の形態について図面を参照しながら説明する。なお、本発明は下記の実施の形態によって限定されるものではない。

【0033】

本実施の形態に係るマクロファージの製造方法は、ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤存在下で造血系前駆細胞を培養する培養ステップを含む。ＴＲＥＭ２はアダプター分子であるＤＡＰ１２（ＤＮＡＸ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ １２ｋＤａ）と会合するイムノグロブリンスーパーファミリー受容体である。ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤は、ＴＲＥＭ２に特異的に結合し、ＤＡＰ１２を介したシグナルを生成する物質であれば任意である。

【0034】

ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤は、例えば、ＴＲＥＭ２アゴニスト活性若しくはＤＡＰ１２アゴニスト活性を有する、抗体若しくはその抗原結合断片又は化合物、及びＴＲＥＭ２のリガンド等である。抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。また、抗体は、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体であってもよい。本明細書における抗体は抗体の抗原結合を含む。抗原結合断片は、抗体の一部分（部分断片）を含むタンパク質又はペプチドであって、抗体の抗原への作用結合性を保持し、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆａｂ３、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、（タンデム）バイスペシフィック一本鎖Ｆｖ（ｓｃ（Ｆｖ）２）、一本鎖トリプルボディ、ナノボディ、ダイバレントＶＨＨ、ペンタバレントＶＨＨ、ミニボディ、（二本鎖）ダイアボディ、タンデムダイアボディ、バイスペシフィックトリボディ、バイスペシフィックバイボディ、デュアルアフィニティリターゲティング分子（ＤＡＲＴ）、トリアボディ（又はトリボディ）、テトラボディ（又は［ｓｃ（Ｆｖ）２］２）、若しくはジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、又はそれらの重合体を挙げることができる（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２９（１）：５－６ （２０１１）；Ｍａｎｅｅｓｈ Ｊａｉｎ ｅｔ ａｌ．， ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２５（７）（２００７）：３０７－３１６、及びＣｈｒｉｓｔｏｐｈ ｓｔｅｉｎら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１）：８８－１２３（２０１２）参照）。

【0035】

ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤は、例えば、ＴＲＥＭ２のリガンド又は脂質である。脂質とは、水に不溶性で有機溶媒に易溶性の有機化合物である。脂質は特に制限がなく、常温で液体であっても、固体であってもよい。脂質としては、例えば、スフィンゴ糖脂質、リン脂質、硫酸化糖脂質及び脂肪酸等が挙げられる。好ましくは、脂質は２本の長鎖脂肪基を有する脂質である。長鎖脂肪酸基としては、炭素数６～６０又は１０～５０の脂肪酸基が挙げられ、各長鎖脂肪酸基の炭素鎖を構成する炭素の数は同じであっても異なっていてもよい。

【0036】

脂肪酸は、飽和脂肪酸であっても不飽和脂肪酸であってもよい。好ましくは、脂質として、２－テトラデシルヘキサデカノン酸（２－ｔｅｔｒａｄｅｃｙｌｈｅｘａｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）（ＴＨＡ）、β－グルコシルセラミド（β－ＧｌｕＣｅｒ）、α－ガラクトシルセラミド（α－ＧａｌＣｅｒ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、スルファチド（Ｓｕｌｆ）及びミコール酸（ＭＡ）等が例示される。ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤は、複数種の脂質の混合物であってもよく、例えば脳等の動物由来の組織、植物由来の組織、細菌等の微生物から有機溶媒を用いて抽出した全脂質又はＴＲＥＭ２に結合する合成脂質であってもよい。ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤の一態様として、細胞表面に脂質を有する細胞又は微生物が挙げられる。好適には、ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤は、脳由来の脂質又はＭＡである。

【0037】

ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤は、式（Ｉ）で示される化合物、そのエステル又はその塩であってもよい。当該化合物１分子の炭素数は例えば６０～９０個又は７０～８０個である。Ｒ^１は飽和又は不飽和脂肪族炭化水素基を表す。Ｒ^１の炭素数は、例えば６～６０個、１０～５０個、２０～４０個、２２～３０個又は２２～２６個である。Ｒ^２は環状構造又は置換基を有してもよい飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基を表す。Ｒ^２の炭素数は、例えば６～６０個、１０～５０個、２０～４０個、２２～３０個又は２２～２６個である。環状構造を構成する炭素数は例えば３～６個である。環状構造は、シクロアルキレン基としてＲ^２に含まれてもよいし、シクロアルキル基としてＲ^２に含まれてもよい。Ｒ^２に、環状構造が１～数個含まれていてもよい。置換基は、特に限定されず、メチル基、ヒドロキシ基、カルボニル基及びカルボキシル基等である。

【0038】

【化1】

【0039】

上記式（Ｉ）で示される化合物の塩は、薬理学的に許容される塩であれば特に限定されず、酸性塩及び塩基性塩のいずれであってもよい。塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩及びカルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素塩、硫酸塩、硝酸塩及びリン酸塩等の無機酸塩、並びにギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、プロピオン酸塩、ヘキサン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、グリコール酸塩、ピルビン酸塩、乳酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、ジベンゾイル酒石酸塩、ジトルオイル酒石酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、ｏ－（４－ヒドロキシベンゾイル）安息香酸塩、桂皮酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、１，２－エタンジスルホン酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－クロロベンゼンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、アスパラギン酸塩、カンファースルホン酸塩、グルコヘプタン酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、トリメチル酢酸塩、第三級ブチル酢酸塩、ラウリル硫酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩、マレイン酸塩、二マレイン酸塩及びムコン酸塩等の有機酸塩等が挙げられる。

【0040】

上記式（Ｉ）で示される化合物のエステルは、薬理学的に許容されるエステルであれば特に限定されず、例えば、炭酸エステル、リン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、ホウ酸エステル及びスルホン酸エステル等が挙げられる。なお、本実施の形態は、式（Ｉ）の化合物及びその塩の各種の水和物や溶媒和物、及び結晶多形の物質も包含する。

【0041】

ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤は、ＴＲＥＭ２及びＤＡＰ１２を発現させ、リガンドの結合によるＴＲＥＭ２のシグナルによってレポータータンパク質が発現する細胞を用いて選択してもよい。ＴＲＥＭ２及びＤＡＰ１２は、公知の方法、例えば遺伝子発現プラスミド等を細胞に導入することで細胞に発現させることができる。任意のレポータータンパク質が使用でき、レポータータンパク質としては、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び発光タンパク質ルシフェラーゼ等が挙げられる。ＴＲＥＭ２のシグナルによって、ＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ）型の転写因子に制御される遺伝子が発現することが知られている。よって、好ましくは、ＴＲＥＭ２及びＤＡＰ１２を発現させる細胞として、ＮＦＡＴ型の転写因子を有する細胞を使用すればよい。具体的には、ＮＦＡＴ型の転写因子で発現が制御される遺伝子としてレポータータンパク質をコードする遺伝子が導入された細胞にＴＲＥＭ２及びＤＡＰ１２を発現させた細胞を、リガンドの評価に使用すればよい。

【0042】

造血系前駆細胞は、骨髄又は臍帯血に含まれる細胞である。造血系前駆細胞は、例えば骨髄系前駆細胞である。造血系前駆細胞として、骨髄から採取した骨髄細胞又は臍帯血から採取した単核細胞を使用してもよい。造血系前駆細胞としては、特にマクロファージ－樹状細胞前駆細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｎｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ；ＭＤＰ）及び共通単球系前駆細胞（ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ；ｃＭｏＰ）が好ましい。

【0043】

培養ステップにおいて、造血系前駆細胞の濃度は、特に限定されないが、例えば、単位培養面積（ｃｍ^２）あたり１×１０^３～１×１０^７細胞又は１×１０^４～１×１０^６細胞が播種される。好ましくは、単位培養面積（ｃｍ^２）あたり１×１０^５個の造血系前駆細胞が播種される。

【0044】

培養ステップでは、ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤を保持する細胞培養容器中で造血系前駆細胞を培養すればよい。細胞培養容器としては、例えば細胞培養プレート、細胞培養フラスコ及び細胞培養皿等が挙げられる。ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤が水に不溶性で液体培地に不溶である場合は、表面がＴＲＥＭ２シグナル活性化剤でコートされている細胞培養容器で造血系前駆細胞を培養すればよい。ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤として脳由来の脂質を使用する場合、細胞培養容器の表面をコートする脂質の質量は、例えば、１×１０^４～１×１０^６個の造血系前駆細胞に対して、１．０μｇ／ｃｍ^２以上で、１．５～２０μｇ／ｃｍ^２、２～１８μｇ／ｃｍ^２、３～１６μｇ／ｃｍ^２、好ましくは３～１２μｇ／ｃｍ^２である。細胞培養容器の表面をＴＲＥＭ２シグナル活性化剤でコートするには、有機溶媒等にリガンドを溶解（懸濁）し、細胞培養容器に加え、有機溶媒を乾燥させればよい。

【0045】

培養ステップでは、公知の培地を用いて細胞培養方法で細胞を培養すればよい。培養条件は、例えば３７℃でＣＯ_２濃度が５％である。培養中、培地を例えば、３～４日ごとに交換するのが好ましい。培養開始７～１０日後頃からマクロファージ様の接着細胞が得られる。

【0046】

本実施の形態に係る製造方法で得られるマクロファージは、ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤で刺激する限り増殖性を維持し、培養可能な日数（生存期間）は少なくとも５４０日以上である。また、当該マクロファージを凍結保存後、融解して培養すると増殖性を維持しているため、当該マクロファージは凍結保存が可能である。さらに、当該マクロファージは、ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤非存在下で培養すると増殖が停止することから、腫瘍細胞ではなく、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用も限定されず、研究ツールとしての汎用性が高い。また、当該マクロファージは、がん等の疾患に対する細胞治療にも使用することができる。

【0047】

別の実施の形態では、マクロファージが提供され、当該マクロファージは、Ｍ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦのいずれも含まず、かつＴＲＥＭ２シグナル活性化剤を含む培地で造血系前駆細胞を培養することで、ＴＲＥＭ２依存的に分化が誘導される。

【0048】

また、下記試験例４に示すように、Ｍ－ＣＳＦで骨髄細胞から誘導したＢＭＤＭは、Ｍ－ＣＳＦを含まない培地で継代培養したところ５日以降は増殖能を喪失したのに対し、当該マクロファージは、ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤存在下では培地にＭ－ＣＳＦを含まなくても、継代培養１０日以降に増殖能を有していた。このため、別の実施の形態では、マクロファージが提供され、当該マクロファージは、誘導開始後又は凍結保存後に、Ｍ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦのいずれも含まず、かつＴＲＥＭ２シグナル活性化剤を含む培地での継代培養１０日以降、好ましくは１５日以降、２０日以降、５０日以降又は１００日以降、より好ましくは２００日以降、３００日以降又は４００日以降、さらに好ましくは５００日以降に増殖能を有する。

【0049】

下記試験例５に示すように、凍結保存後に融解したＢＭＤＭはＭ－ＣＳＦ存在下であっても増殖しなかったのに対し、融解した当該マクロファージはＴＲＥＭ２シグナル活性化剤の存在下で増殖した。このため、別の実施の形態では、凍結保存後に、Ｍ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦのいずれも含まず、かつＴＲＥＭ２シグナル活性化剤を含む培地で増殖能を有するマクロファージが提供される。凍結保存は、細胞の凍結保存で通常使用される温度であれば特に限定されず、例えば－８０℃である。凍結保存の期間は、特に限定されず、凍結確認直後でもよいし、凍結から５日間、１０日間、２０日間又は３０日間であってもよいし、数か月あるいは数年間であってもよい。

【0050】

さらに、下記試験例１０に示すように、当該マクロファージは、ＬＰＳ（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）を含む培地で２４時間培養後の培養上清中のＭＣＰ－１、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６及びＮＯの濃度が、ＬＰＳを含む培地で２４時間培養したＢＭＤＭと比較して低かった。そこで、別の実施の形態では、マクロファージが提供され、当該マクロファージは、ＬＰＳを含む培地で２４時間培養後の培養上清中のＴＮＦ－α、ＩＬ－６及び一酸化窒素の濃度が、Ｍ－ＣＳＦで骨髄細胞から誘導したＢＭＤＭと比較して３０％以下である。上記培養上清中のＴＮＦ－αの濃度は、ＢＭＤＭと比較して、２５％以下又は２０％以下であってもよい。上記培養上清中のＩＬ－６の濃度は、ＢＭＤＭと比較して、２５％以下、２０％以下又は１５％以下であってもよい。上記培養上清中のＮＯの濃度は、ＢＭＤＭと比較して、２５％以下であってもよい。

【0051】

また、本実施の形態に係るマクロファージは、表３に記載された遺伝子の内、１個若しくは１個以上、２個若しくは２個以上、３個若しくは３個以上、４個若しくは４個以上、５個若しくは５個以上、１０個若しくは１０個以上、２０個若しくは２０個以上、３０個若しくは３０個以上、４０個若しくは４０個以上、５０個若しくは５０個以上、６０個若しくは６０個以上、７０個若しくは７０個以上、８０個若しくは８０個以上、又は８８個の発現が、肺胞マクロファージ、ＢＭＤＭ、Ｍ１に誘導されたＢＭＤＭ、Ｍ２に誘導されたＢＭＤＭ、クッパー細胞、ミクログリア、破骨細胞及び腹腔滲出マクロファージから選択される少なくとも１種類、好ましくは、２種類若しくは２種類以上、３種類若しくは３種類以上、４種類若しくは４種類以上、５種類若しくは５種類以上、６種類若しくは６種類以上、７種類若しくは７種類以上、又はこれらの８種類すべてと比較して高くてもよい。

【0052】

【表1】

【0053】

上記表３の遺伝子の発現とは関係なく、あるいは、上記表３の遺伝子の高発現に加えて、上記マクロファージは、表４に記載された遺伝子の内、１個若しくは１個以上、２個若しくは２個以上、３個若しくは３個以上、４個若しくは４個以上、５個若しくは５個以上、１０個若しくは１０個以上、２０個若しくは２０個以上、３０個若しくは３０個以上、４０個若しくは４０個以上、５０個若しくは５０個以上、６０個若しくは６０個以上、７０個若しくは７０個以上、８０個若しくは８０個以上、又は８７個の発現が、肺胞マクロファージ、ＢＭＤＭ、Ｍ１に誘導されたＢＭＤＭ、Ｍ２に誘導されたＢＭＤＭ、クッパー細胞、ミクログリア、破骨細胞及び腹腔滲出マクロファージから選択される少なくとも１種類、好ましくは、２種類若しくは２種類以上、３種類若しくは３種類以上、４種類若しくは４種類以上、５種類若しくは５種類以上、６種類若しくは６種類以上、７種類若しくは７種類以上、又はこれらの８種類すべてと比較して低くてもよい。

【0054】

【表2】

【0055】

なお、好ましくは、上記遺伝子の発現はＲＮＡの発現レベルである。本明細書全体において、“レベル”とは、数値化された存在量に関する指標を意味し、例えば、濃度、量又はその代わりとして用いることができる指標である。よって、レベルは測定値であってもよいし、濃度に換算された値であってもよい。また、レベルは、存在量及び単位面積当たりの存在量等の絶対的な数値であってもよいし、必要に応じて設定された比較対照と比較した相対的な数値であってもよい。

【0056】

本実施の形態に係るマクロファージは、上述の特徴から任意に選択される１種類、２種類若しくはそれ以上、３種類若しくはそれ以上、４種類若しくはそれ以上、５種類若しくはそれ以上、又はすべての特徴を有していてもよい。

【0057】

別の実施の形態では、上記の培養ステップを含む、マクロファージの調製方法、マクロファージの作製方法、マクロファージの誘導方法、マクロファージの培養方法又はマクロファージの増殖方法が提供される。当該マクロファージの培養方法等によれば長期に渡って維持できる。また、当該マクロファージの増殖方法によって、マクロファージは増殖する。なお、好ましくは、上記マクロファージの製造方法、マクロファージの調製方法、マクロファージの作製方法、マクロファージの誘導方法、マクロファージの培養方法及びマクロファージの増殖方法は、Ｍ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦのいずれも使用しない。

【0058】

また、別の実施の形態では、ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤を含む分化誘導剤が提供される。当該分化誘導剤は、造血系前駆細胞からマクロファージへの分化を誘導する。分化誘導剤は、ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤の他に、溶媒、水、エタノール、多価アルコール、油分、界面活性剤、増粘剤、防腐剤及びｐＨ調整剤等を含んでもよい。分化誘導剤は、例えば、液状、ゲル状、クリーム状及び固形状であってもよい。好ましくは、分化誘導剤は細胞培養容器に加えられ、あるいは細胞培養容器の表面に塗布されて、その表面にコートされて用いられる。

【0059】

当該分化誘導剤によれば、造血系前駆細胞から生存期間が長く、凍結保存が可能なマクロファージを得ることができる。当該マクロファージは研究ツールとして汎用性が高く、各種実験に使用しやすい。

【0060】

また、別の実施の形態では、ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤を含むマクロファージの増殖促進剤が提供される。当該増殖促進剤は、マクロファージ、特には、上述の製造方法で得られるマクロファージの増殖を促進する。当該増殖促進剤は、上記分化誘導剤と同様に、ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤の他の成分を含んでもよい。

【0061】

他の実施の形態では、ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤で表面がコートされた細胞培養容器を備える、分化誘導キットが提供される。当該分化誘導キットは、造血系前駆細胞からマクロファージへの分化を誘導するのに使用される。分化誘導キットは、基本培地、血清低減培地及び無血清培地等の培地、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の細胞培養に必要な血清、その他培地に添加される公知の添加剤をさらに備えてもよい。

【0062】

当該細胞培養容器によれば、ＴＲＥＭ２シグナル活性化剤で表面があらかじめコートされた細胞培養容器を備えるため、当該細胞培養容器に造血系前駆細胞を播種して培養するだけで生存期間が長く、凍結保存が可能なマクロファージを簡便に得ることができる。なお、当該分化誘導キットは、マクロファージの増殖促進キットとしても使用できる。

【0063】

なお、好ましくは、上記分化誘導剤及びマクロファージの増殖促進剤は、Ｍ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦのいずれも含まない。また、上記マクロファージへの分化誘導キット及びマクロファージの増殖促進キットは、Ｍ－ＣＳＦ及びＧＭ－ＣＳＦのいずれも備えない。

【実施例】

【0064】

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

【0065】

実施例１：脂質誘導マクロファージ（Ｌｉｐｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ：ＬＩＭ）の調製
［マウス脳脂質の抽出］
マウスの脳（約４００ｍｇ／匹）をポリプロピレンチューブ中の１ｍｌのメタノールに沈め、ハサミで細断した。得られた試料全量をガラス試験管に移し、メタノール１ｍｌ及びクロロホルム４ｍｌを加え、クロロホルムとメタノール（ＭｅＯＨ）との体積比を２：１（Ｃ－Ｍ ２：１）とした。シェイカーを用いて室温で３時間、試料を混和した（２００ｒｐｍ）。試料を２０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離し、上清をろ過しガラス瓶に抽出液１として回収した。

【0066】

ガラス試験管に残った脳残渣に新たにメタノール２ｍｌ及びクロロホルム４ｍｌを加えた試料を、シェイカーを用いて室温で１６時間、混和した（２００ｒｐｍ）。ろ過した上清を抽出液１が入ったガラス瓶に回収しよく混和して抽出液２とした。抽出液２は使用時まで－３０℃で保存した。

【0067】

抽出液２のうち１．８ｍｌを秤量済みのガラス瓶に分注し、３７℃に加温しつつ窒素吹付により溶媒を乾燥させ、脂質の乾燥重量を測定した。５ｍｇ／ｍｌになるようにＣ－Ｍ ２：１に溶解し、脳脂質抽出液とした。

【0068】

［脳脂質による細胞培養プレートのコーティング］
脳脂質抽出液をメタノールで５０μｇ／ｍｌに希釈し、細胞培養プレートに３μｇ／ｃｍ^２になるように分注した。クリーンベンチ内で溶媒を乾燥させた。

【0069】

［脂質誘導マクロファージの誘導］
採取したマウス骨髄細胞を、４×１０^５細胞／ｍｌになるように１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩに懸濁した。脳脂質コーティングした細胞培養プレートに、骨髄細胞懸濁液を１×１０^５細胞／０．２５ｍｌ／ｃｍ^２になるように加えた。骨髄細胞を３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターにて培養した。培養３日後に培養プレートに新鮮培地を半量追加した。その後３～４日ごとに培地を交換した。

【0070】

（結果）
培養開始７～１０日後頃からマクロファージ様の接着細胞が出現し始めた。図１（Ａ）は、培養開始１４日後のＬＩＭの画像を示す。

【0071】

比較例１：ＢＭＤＭの調製
採取したマウス骨髄細胞を、４×１０^５細胞／ｍｌになるように１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩに懸濁した。細胞懸濁液に２５ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦを加えた。２４ウェル培養プレートの各ウェルに、骨髄細胞懸濁液を２×１０^５細胞／０．５ｍｌになるように加えた。骨髄細胞を３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターにて培養した。培養３日後に２５ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ／１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩを半量（０．２５ｍｌ／ウェル）追加した。培養５日後に上清を吸引し、０．５ｍｌ／ウェルの１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩを加えスクレーパーで細胞を剥離した。１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩで１／４希釈し、０．５ｍｌ／ウェルずつ分注し、２５ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦを加えた。その後３～４日ごとに２５ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ／１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩを半量培地交換した。

【0072】

（結果）
培養開始５日後には４．０～６．５×１０^５細胞／ウェルに増えた。図１（Ｂ）は、培養開５日後のＭ－ＣＳＦで誘導したＢＭＤＭの画像を示す。

【0073】

試験例１：細胞種の同定
［ＬＩＭからのＴｏｔａｌ ＲＮＡ抽出］
Ｓｅｐａｓｏｌ（商標）－ＲＮＡ Ｉ Ｓｕｐｅｒ Ｇ（ナカライテスク社製）の取扱説明書に準じて、ＬＩＭからＴｏｔａｌ ＲＮＡを次のように抽出した。培養開始１４日目のＬＩＭ（１．６×１０^６細胞）に対して１ｍｌのＳｅｐａｓｏｌ（商標）－ＲＮＡ Ｉ Ｓｕｐｅｒ Ｇを加え、ピペッティングによって均質化した。試料をボルテックスミキサーで撹拌し、室温で５分間静置した。試料にクロロホルム２００μｌを加え転倒混和し、室温で３分間静置した。試料を１２０００Ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上層の水相を１．５ｍｌチューブに移した。水相にイソプロパノールを５００μｌ加え混和した試料を室温で１０分間静置した。試料を１２０００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を除去した。沈殿に７５％エタノールを１ｍｌ加え、沈殿を洗浄した。さらに１２０００Ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去した。チューブの蓋を開け、室温で１０分間静置し、残った液を乾燥させ、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを得た。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡにＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを４０μｌ加え、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを溶解させた。

【0074】

［Ｔｏｔａｌ ＲＮＡのＤＮａｓｅ Ｉ処理］
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮａｓｅ Ｉ（タカラバイオ社製）の取扱説明書に準じて、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを次のようにＤＮａｓｅ Ｉで処理した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ３８μｌに対して１０×ＤＮａｓｅ ｂｕｆｆｅｒを５μｌ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮａｓｅ Ｉ（ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ）を２μｌ（１０Ｕ）、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを１μｌ（２０Ｕ）、ＤＥＰＣ処理水を４μｌ加えた。３７℃で２０分間反応させ、ＤＥＰＣ処理水１５０μｌを加え総量２００μｌの試料とした。試料にフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（体積比が２５：２４：１）２００μｌを加えて混合した。試料を１２０００Ｇ、室温で５分間遠心分離した。水相約２００μｌを１．５ｍｌチューブに回収し、チューブに３Ｍ酢酸ナトリウム２０μｌ及びエタノール５００μｌを加え混合した試料を室温で１５分間静置した。

【0075】

試料を２００００Ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清を除去した。７０％エタノール１ｍｌを加え沈殿を洗浄した。２００００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を除去した。チューブの蓋を開け室温で１０分間静置し残った液を乾燥させた。ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ ４０μｌを加え、ＲＮＡを溶解させ、ナノドロップを使用して濃度を測定した。ＲＮＡを１５０ｎｇ／μｌに調製し－８０℃で保存した。

【0076】

［ＲＮＡ－ｓｅｑ解析］
Ｖｅｒｉｔａｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社の次世代シーケンス解析受託サービスを利用し（サービス名：ｍＲＮＡ－ｓｅｑ（１５０ｂｐ ＰＥ）、データ量：３Ｇ、リード数：１０００万リード）、ｆａｓｔｑ形式のデータを取得した。

【0077】

［ＲＮＡ－ｓｅｑデータの解析］
取得したデータをｐｉｇｚコマンドによりｆａｓｔｑ．ｇｚ形式に圧縮した。ｆａｓｔｐコマンドによりアダプター配列をトリミングし、クオリティチェックを実行した。ｈｉｓａｔ２コマンドによりリファレンスゲノム（マウス：ＧＲＣｍ３８＿ｇｅｎｏｍｅ）へのマッピングを実行した。ｓａｍｔｏｏｌｓコマンドによりマッピング結果をソートし、ＢＡＭファイルに変換した。ｆｅａｔｕｒｅｃｏｕｎｔｓコマンドにより遺伝子ごとのリードをカウントし発現量を定量した。得られたリードカウントデータを、Ｓｉｎｇｌｅ Ｒパイプラインを用いてＩｍｍＧｅｎ ｄａｔａｂａｓｅ（https://www.immgen.org/）を参照することで細胞種を同定した。

【0078】

（結果）
ＲＮＡ－ｓｅｑデータ解析により、ＬＩＭの細胞種は“マクロファージ”と同定された。

【0079】

試験例２：ＢＭＤＭ及びＬＩＭの細胞表面マーカーの発現解析
実施例１における誘導開始１４日後のＬＩＭ及び比較例１における誘導開始５日後のＢＭＤＭを、それぞれセルスクレーパーを用いて培地ごと剥離して回収し、血球計算盤を用いて細胞を計数した。５００Ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去した。１×１０^７細胞／ｍｌになるように１％ＦＢＳ／ＨＢＳＳを加え、懸濁した。細胞懸濁液に１０μｇ／ｍｌになるように抗マウスＣＤ１６／３２抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を加え、氷上で１０分間静置し、Ｆｃγレセプターのブロッキングを行った。

【0080】

９６ウェルＶ底プレートにブロッキング済みの細胞懸濁液を１０μｌ／ウェルずつ分注し、取扱説明書に記載の推奨濃度になるように１％ＦＢＳ／ＨＢＳＳに希釈したＰＥ抗マウスＴＲＥＭ２抗体（Ｒ＆Ｄ社製）、ＰＥ 抗マウスＤｅｃｔｉｎ－１抗体、ＦＩＴＣ 抗マウスＣＤ９抗体、ＡＰＣ 抗マウスＣＤ１１ｃ抗体、ＰＥ 抗マウスＳｉｇｌｅｃ－Ｆ抗体、ＰＥ 抗マウスＣＤ２０６抗体、ＡＰＣ 抗マウスＰ２ＲＹ１２抗体、ＡＰＣ 抗マウスＣＸ３ＣＲ１抗体、ＡＰＣ 抗マウスＭＨＣクラスＩＩ抗体、ＡＰＣ／Ｃｙａｎｉｎｅ７ 抗マウスＣＤ１１５抗体、ＰＥ／Ｃｙａｎｉｎｅ７ 抗マウスＣＤ１１５抗体、ＦＩＴＣ 抗マウスＦ４／８０抗体、ＰＥ／Ｃｙａｎｉｎｅ７ 抗マウスＬｙ－６Ｃ抗体、ＦＩＴＣ 抗マウスＬｙ－６Ｇ抗体、ＡＰＣ 抗マウスＣＤ４５抗体、又はＰＥ 抗マウスＣＤ１１ｂ抗体（いずれもＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を加えて総量２０μｌ／ウェルとし、氷上で１５分間静置し反応させた。１％ＦＢＳ／ＨＢＳＳを１８０μｌ／ウェルずつ加え洗浄した。

【0081】

試料を５００Ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去した。１％ＦＢＳ／ＨＢＳＳを１８０μｌ／ウェルずつ加え、試料を洗浄した。試料を５００Ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去した。１０μｇ／ｍｌ ＰＩ／１％ＦＢＳ／ＨＢＳＳを５０μｌ／ウェルずつ加え試料を懸濁した。得られた試料についてフローサイトメトリーにより解析し、表面抗原の単変量ヒストグラム解析ではＬｙ６Ｇ陰性かつＣＤ１１ｂ陽性細胞をマクロファージ細胞として抽出して各表面抗原を解析した。なお、ＣＤ１１５の検出には、フローサイトメトリーによるドットプロット解析ではＡＰＣ／Ｃｙａｎｉｎｅ７ 抗マウスＣＤ１１５抗体を使用し、表面抗原の単変量ヒストグラム解析ではＰＥ／Ｃｙａｎｉｎｅ７ 抗マウスＣＤ１１５抗体を使用した。

【0082】

（結果）
ドットプロット解析の結果を図２に示す。細胞の大きさの指標である前方散乱光（ＦＳＣ）及び細胞の乱雑性（顆粒の多さ）の指標である側方散乱光（ＳＳＣ）のシグナルの分布は、ＬＩＭとＢＭＤＭとで類似していた。ＬＩＭは、Ｐａｎ白血球マーカーのＣＤ４５及び単球マーカーのＣＤ１１５の発現が高く、かつ、マクロファージマーカーのＦ４／８０並びに顆粒球及びマクロファージのマーカーであるＣＤ１１ｂの発現が高かった。

【0083】

表面抗原の単変量ヒストグラム解析の結果を図３に示す。腹腔マクロファージ（ＭΦ）、脾臓マクロファージ、クッパー細胞及びミクログリアといったマウス生体内のマクロファージと比較して、ＢＭＤＭ及びＬＩＭの各種表面抗原発現パターンはよく類似していた。ＴＲＥＭ２、ＣＤ２０６、Ｐ２ＲＹ１２及びＣＸ３ＣＲ１の発現量はＬＩＭにおいて特に高かった。試験例１及び試験例２の結果から、ＬＩＭはマクロファージであることが示された。

【0084】

試験例３：ＬＩＭ誘導のための脂質濃度の検討
［脳脂質のコーティング］
９６ウェル細胞培養プレートに４、２、１、０．５、０．２５又は０．１２５μｇ／ウェルになるように実施例１と同様に調製した脳脂質抽出液をコーティングした。採取したマウス骨髄細胞を４×１０^５細胞／ｍｌになるように１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩに懸濁した。骨髄細胞懸濁液を１００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターにて細胞を培養した。培養３日後に新鮮培地を半量追加した。その後３～４日ごとに培地を交換した。培養開始７日後及び１４日後にＷＳＴ－８アッセイによって生細胞数を測定した。

【0085】

［ＷＳＴ－８アッセイ］
新しい１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地に、１／１０容量のＷＳＴ－８（０７５５３－１５ 生細胞数測定試薬ＳＦ、ナカライテスク社製）を加え、生細胞数測定培地を調製した。培養プレートの古い培地を吸引除去し、生細胞数測定培地を１００μｌ／ウェルずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターにて１時間、細胞を培養した。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。

【0086】

（結果）
図４は単位培養面積当たりのコーティングした脳脂質の質量に対する細胞数を示す。脳脂質が１．５μｇ／ｃｍ^２以上がＬＩＭの誘導に適しており、特に３～１２μｇ／ｃｍ^２でＬＩＭの増殖が促進された。

【0087】

試験例４：ＬＩＭの継代培養
２４ウェルプレートを使用した場合、誘導開始１４日後頃に９０～１００％コンフルエントになる。そこで、次のように１４日ごとにＬＩＭ又はＢＭＤＭを継代した。培養上清を吸引し、０．５ｍｌ／ウェルの１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳを加え３７℃で５分間、インキュベートした。１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳを吸引除去し、０．５ｍｌ／ウェルの１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩを加えピペッティングにより剥離し細胞を懸濁した。血球計算盤によって細胞数を測定した。細胞懸濁液を１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩで１／４希釈し、新しい脳脂質コートプレートに０．５ｍｌ／ウェルずつ分注した。その後３～４日ごとに１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩを半量培地交換し、１４日後に再度継代した。

【0088】

また、５８６日間培養したＬＩＭを脳脂質コートあり（ＢＬ＋）又はなし（ＢＬ－）の２４ウェルプレート（コーティングした脳脂質３μｇ／ｃｍ^２）に２００００細胞／ウェルで播種し、培養した。

【0089】

（結果）
図５（Ａ）の上段は培養０～２１日後の細胞数を示し、図５（Ａ）の下段は０日目の細胞数を１とした培養０～２１日後における細胞数の増加倍率を示す。図５（Ｂ）の上段は培養０～５４４日後の細胞数を示し、図５（Ｂ）の下段は０日目の細胞数を１とした培養０～５４４日後における細胞数の増加倍率を示す。ＢＭＤＭは継代希釈した後はほとんど増えなかった。一方、ＬＩＭは少なくとも培養５４４日を超えても生存し増殖した。

【0090】

図５（Ｃ）はＢＬ＋及びＢＬ－で培養したＬＩＭの細胞数を示す。ＢＬ－ではＬＩＭは増殖及び生存しなかった。ＬＩＭは脳脂質による刺激がないと増殖及び生存しないため、腫瘍化した細胞ではないことが示された。

【0091】

試験例５：ＬＩＭ及びＢＭＤＭの凍結保存試験
８０～９０％コンフルエントのＬＩＭ及びＢＭＤＭを培養プレートより剥離し、それぞれ５００Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。５×１０^５～５×１０^６細胞に対し１ｍｌのセルバンカー１（日本全薬工業社製）に細胞を懸濁し、クライオチューブに移して－８０℃で保存した。３０日後に融解し、無刺激（Ｎｏｎｅ）、２５ｎｇ／ｍｌ Ｍ－ＣＳＦ添加（Ｍ－ＣＳＦ）又は脳脂質コーティングあり（ＢＬ）の２４ウェルプレートに播種した。播種から６日経過後又は１４日経過後の生細胞数を血球計算盤により測定した。

【0092】

（結果）
図６に示すように、凍結保存後に融解したＢＭＤＭはＭ－ＣＳＦ存在下であっても増殖しなかった。一方、融解したＬＩＭは脳脂質刺激の存在下で増殖した。ＬＩＭは凍結保存が可能であることが示された。

【0093】

試験例６：Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ及びセルソーターによる細胞の単離
ＣＤ４５．１陽性のマウス又はＣＤ４５．２陽性のマウスの骨髄細胞１×１０^７細胞あたり１００μｌの１０μｇ／ｍｌ抗Ｆｃγレセプター（ＣＤ１６／３２）抗体／０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳを加え、細胞を懸濁した。氷上に５分間静置してＦｃγレセプターをブロッキングした。各マウスの骨髄細胞懸濁液に下記の成熟細胞マーカー（Ｌｉｎｅａｇｅマーカー：Ｌｉｎ）に対する蛍光標識抗体を加え反応させた。
抗ＣＤ３－ＦＩＴＣ（２．５μｇ／ｍｌ）
抗ＣＤ１９－ＦＩＴＣ（２．５μｇ／ｍｌ）
抗ＮＫ１．１－ＦＩＴＣ（２．５μｇ／ｍｌ）
抗Ｌｙ６Ｇ－ＦＩＴＣ（２．５μｇ／ｍｌ）
抗ＴＥＲ－１１９－ＦＩＴＣ（２．５μｇ／ｍｌ）
抗ＣＤ１１ｂ－ＦＩＴＣ（２．５μｇ／ｍｌ）

【0094】

骨髄細胞懸濁液を氷上に１５分間静置し、以降はミルテニーバイオテク社のＡｎｔｉ－ＦＩＴＣ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ及びＡｎｔｉ－ＡＰＣ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓの使用説明書に準じて操作した。１×１０^７細胞試料あたりＭＡＣＳ（商標）バッファー（０．５％ ＢＳＡ／２ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ）１ｍｌを加え洗浄し、３００Ｇ、４℃で試料を１０分間遠心分離し、上清を除去した。沈殿をＭＡＣＳ（商標）バッファー８０μｌに懸濁し、抗ＦＩＴＣ抗体標識磁気ビーズを２０μｌ加えた。４℃で１５分間静置し、試料にＭＡＣＳ（商標）バッファー１ｍｌを加え洗浄した。試料を３００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を除去した。沈殿をＭＡＣＳ（商標）バッファー０．５ｍｌに懸濁した。ＭＡＣＳ（商標）セパレーターにセットし、あらかじめＭＡＣＳ（商標）バッファー３ｍｌで洗浄したＬＳカラムに試料を加え、素通り液をＬｉｎ陰性画分として回収した。

【0095】

ＭＡＣＳ（商標）バッファー３ｍｌによるＬＳカラムの洗浄を３回繰り返した。ＬＳカラムをＭＡＣＳ（商標）セパレーターから外し、１５ｍｌチューブにセットした。ＬＳカラムにＭＡＣＳ（商標）バッファーを５ｍｌ加え、プランジャで押し出し、Ｌｉｎ陽性画分として回収した。ＣＤ４５．２陽性マウス由来のＬｉｎ陰性画分及びＣＤ４５．１陽性マウス由来のＬｉｎ陽性画分を、それぞれ５００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を除去した。得られた細胞を、５×１０^６細胞／ｍｌになるように１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩに懸濁し、さらにセルソーターによって、Ｌｉｎ陰性画分及びＬｉｎ陽性画分を厳密に単離した。単離後の細胞を含む試料５００Ｇを、４℃で１０分間遠心分離し上清を除去した。得られた細胞を、４×１０^５細胞／ｍｌになるように１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩに懸濁し、ＣＤ４５．２陽性マウス由来Ｌｉｎ陰性画分とＣＤ４５．１陽性マウス由来Ｌｉｎ陽性画分の比率を、骨髄中の比率とほぼ同様になる１：９となるように混合して、脳脂質コーティング済みの培養プレートに播種した。また、各画分を単独で同様に播種した。Ｌｉｎ陽性の細胞又はＬｉｎ陰性の細胞が、脳脂質刺激によりＬＩＭへと分化誘導されるか否かを、培養開始５、９及び１４日後にフローサイトメトリーを用いてＣＤ１１ｂ陽性Ｆ４／８０陽性マクロファージの個数を計測することによって評価した。

【0096】

（結果）
混合培養中のＣＤ４５．１陽性マウス由来のＬｉｎ陽性細胞及びＣＤ４５．２陽性マウス由来のＬｉｎ陰性細胞から分化したマクロファージ数、並びに各画分を単独で培養した場合のマクロファージ数の変化をそれぞれ図７（Ａ）及び図７（Ｂ）に示す。培養開始時のＬｉｎ陰性細胞とＬｉｎ陽性細胞の比率が１：９であったにもかかわらず、ＬＩＭに分化誘導された細胞の大部分（６６～８３％）はＬｉｎ陰性細胞であった。さらにＬｉｎ陰性細胞を単独で培養した場合には、早期（５日目）に多数のＬＩＭの分化誘導が見られた。以上のことから、ＬＩＭは主に骨髄系前駆細胞から分化することが示唆された。また、Ｌｉｎ陽性細胞からもある程度の数のマクロファージが誘導されることから、おそらくＣＤ１１ｂ陽性の単球からも分化する可能性が示唆された。

【0097】

試験例７：各マウス由来骨髄細胞のＢＭＤＭ及びＬＩＭへの誘導
野生型（ＷＴ）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）、ＴＲＥＭ２ノックアウトマウス（ＫＯ）、ＴＲＥＭ２ Ｒ４７Ｈ変異導入マウス由来の骨髄細胞を用いて、実施例１及び比較例１と同様に、ＬＩＭ及びＢＭＤＭを誘導した。ＴＲＥＭ２ Ｒ４７Ｈ変異は、野生型と比較してリガンド結合能が低下する。ＬＩＭについては誘導開始１４日後にＷＳＴ－８アッセイを行った。

【0098】

（結果）
ＢＭＤＭについては誘導開始５日後に顕微鏡観察を行い、いずれのマウス由来でも誘導できることを確認した。図８は、ＷＳＴ－８アッセイで評価した生細胞数を示す。野生型マウス由来の骨髄細胞は脳脂質で刺激することでＬＩＭに分化誘導されたのに対し、ＴＲＥＭ２ ＫＯ及びＴＲＥＭ２ Ｒ４７Ｈ由来の骨髄細胞は脳脂質で刺激してもＬＩＭに分化誘導されなかった。

【0099】

試験例８：ＴＲＥＭ２レポーター細胞を用いたリガンド活性の評価
２Ｂ４－ＮＦＡＴ－ＧＦＰレポーター細胞（理化学研究所から取得）にレトロウイルスベクターを用いてＴＲＥＭ２及びＤＡＰ１２のｃＤＮＡを導入し、細胞表面に発現させたＴＲＥＭ２にリガンドが結合するとＧＦＰの発現が誘導されるレポーター細胞を作製した（Ｉｉｚａｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０２１，ｖｏｌ．１２（１），ｐ．２２９９－１６）。

【0100】

被験物質であるβ－ＧｌｕＣｅｒ、α－ＧａｌＣｅｒ、パルミチン酸、ステアリン酸、コレステロール、ＰＣ、ＬＰＣ、ＰＥ、Ｓｕｌｆ又はＭＡをメタノールで希釈して５０μｇ／ｍｌとした。被験物質を９６ウェル細胞培養プレートに２０μｌ（１μｇ）ずつ分注し、クリーンベンチ内に静置してメタノールを乾燥させた。

【0101】

被験物質でコートした培養プレートにレポーター細胞を５×１０^４細胞／１００μｌ／ウェルずつ播種した。ＣＯ_２インキュベーターにて細胞を１６時間培養した。培養液をよく懸濁し、Ｖ底９６ウェルプレートに移した。試料を５００Ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去した。１０μｇ／ｍｌ ＰＩ／１％ＦＢＳ／ＨＢＳＳを５０μｌ／ウェルずつ加え懸濁した。フローサイトメトリーにより試料におけるＧＦＰ陽性細胞を解析した。

【0102】

上記と同様の方法で各被験物質を９６ウェル細胞培養プレートにコートし、マウス骨髄細胞を４×１０^４細胞／１００μｌ／ウェルずつプレートに播種した。ＣＯ_２インキュベーターにて細胞を培養し、培養開始５、１０、１４及び２０日後にＷＳＴ－８アッセイを行い、生細胞数を測定した。

【0103】

（結果）
図９に示すように、β－ＧｌｕＣｅｒ、α－ＧａｌＣｅｒ、ＰＣ、ＬＰＣ、ＰＥ、Ｓｕｌｆ及びＭＡにＴＲＥＭ２に対するリガンド活性を認めた。β－ＧｌｕＣｅｒ、α－ガラクトシルセラミド、ＰＣ、ＬＰＣ、ＰＥ、Ｓｕｌｆ及びＭＡは、図１０に示すように骨髄細胞をＬＩＭへ分化誘導した。

【0104】

試験例９：貪食能の評価
ＢＭＤＭ又はＬＩＭを１×１０^５細胞／２００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、１×１０^６ｃｆｕのＦＩＴＣ標識ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）を加え４時間、３７℃でインキュベートした。４時間後、細胞を回収し、フローサイトメトリーによりＦＩＴＣの蛍光強度を測定することでＦＩＴＣ標識ＢＣＧ（ＢＣＧ－ＦＩＴＣ）の貪食能を比較した。

【0105】

（結果）
図１１にＦＩＴＣ標識ＢＣＧに係る平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。ＬＩＭはＢＭＤＭと比較して貪食能が高いことが示された。

【0106】

試験例１０：ＬＰＳ刺激に対するサイトカイン産生応答の検討
ＢＭＤＭ又はＬＩＭを１×１０^５細胞／２００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、１０ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳを加え２４時間、３７℃でインキュベートした。２４時間後の培養上清を回収し、上清中のＭＣＰ－１、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１０及びＮＯの濃度を測定した。

【0107】

（結果）
図１２（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）に、それぞれＭＣＰ－１、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１０及びＮＯの濃度を示す。ＬＩＭはＢＭＤＭと比較して、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αといった炎症性サイトカイン並びにＮＯの産生が低かった。

【0108】

試験例１１：ＬＩＭのマーカー分子の検討
各種細胞のＲＮＡ－ｓｅｑデータ（ＳＲＡファイル）は、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）データベース（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）より取得した。各種細胞の参照元（ＧＥＯ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）は以下の通りである。
肺胞マクロファージ：ＧＳＭ４４７６１０９、ＧＳＭ４４７６１１０、ＧＳＭ４４７６１１１
ＢＭＤＭ：ＧＳＭ４５５２５００、ＧＳＭ４５５２５０１、ＧＳＭ４５５２５０２
ＢＭＤＭ（Ｍ１）：ＧＳＭ４８４４１８０、 ＧＳＭ４８４４１８１、 ＧＳＭ４８４４１８２
ＢＭＤＭ（Ｍ２）：ＧＳＭ４８４４１８３、 ＧＳＭ４８４４１８４、 ＧＳＭ４８４４１８５
クッパー細胞：ＧＳＭ４１１９１４９、ＧＳＭ４１１９１５０、ＧＳＭ４１１９１５１
ミクログリア：ＧＳＭ４０６５８９４、ＧＳＭ４０６５８９５、ＧＳＭ４０６５８９６
破骨細胞：ＧＳＭ３１７９４４９、ＧＳＭ３１７９４５０、ＧＳＭ３１７９４５１
腹腔滲出マクロファージ：ＧＳＭ２８５９８０３、ＧＳＭ２８５９８０４、ＧＳＭ２８５９８０５

【0109】

なお、ＢＭＤＭ（Ｍ１）は、ＢＭＤＭに１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳと５０ｎｇ／ｍｌ ｍＩＦＮγとを加え２４時間培養した細胞である。ＢＭＤＭ（Ｍ２）は、ＢＭＤＭに２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４と２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１３とを加え２４時間培養した細胞である。

【0110】

各種細胞のＳＲＡファイルをｆａｓｔｅｒｑ－ｄｕｍｐコマンドによりｆａｓｔｑ形式のデータに変換した。上記試験例１のＲＮＡ－ｓｅｑデータの解析に記載の方法に準じてリードカウントデータを取得した。ＬＩＭとこれらの細胞のリードカウントデータを用いて、ＤＥＳｅｑ２により発現変動遺伝子（ＤＥＧ）を抽出した。さらにそれぞれのＤＥＧのリストから、ＬＩＭとその他のすべてのマクロファージとの比較において共通してＬＩＭにおける発現が高いＤＥＧ（８８個）及びＬＩＭにおける発現が低いＤＥＧ（８７個）をマーカー分子として抽出した。抽出にはＣａｌｃｕｌａｔｅ ａｎｄ ｄｒａｗ ｃｕｓｔｏｍ Ｖｅｎｎ ｄｉａｇｒａｍｓ（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）を用いた。

【0111】

（結果）
表５にＤＥＧの個数を示す。抽出されたＬＩＭにおける発現が高いＤＥＧ及びＬＩＭにおける発現が低いＤＥＧをそれぞれ表６及び表７に示す。

【0112】

【表3】

【0113】

【表4】

【0114】

【表5】

【0115】

上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

【0116】

本出願は、２０２１年１２月２２日に出願された、日本国特許出願２０２１－２０８４２０号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０２１－２０８４２０号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

【産業上の利用可能性】

【0117】

本発明は、マクロファージの取得に有用である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】