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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-11
(45)【発行日】2024-03-19
(54)【発明の名称】固相混合物、充填剤及びカラム
(51)【国際特許分類】
B01J 20/281 20060101AFI20240312BHJP
B01J 20/283 20060101ALI20240312BHJP
B01J 20/285 20060101ALI20240312BHJP
G01N 30/88 20060101ALI20240312BHJP
G01N 30/06 20060101ALI20240312BHJP
G01N 30/08 20060101ALI20240312BHJP
G01N 1/10 20060101ALI20240312BHJP
B01J 20/02 20060101ALI20240312BHJP
B01D 15/00 20060101ALI20240312BHJP
B01D 15/08 20060101ALI20240312BHJP
B01D 15/38 20060101ALI20240312BHJP
【ＦＩ】
B01J20/281 X
B01J20/283
B01J20/285 N
B01J20/285 S
B01J20/285 M
G01N30/88 E
G01N30/06 E
G01N30/08 L
G01N1/10 C
B01J20/22 D
B01J20/02 A
B01D15/00 101
B01D15/08
B01D15/38
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2021037510
(22)【出願日】2021-03-09
(65)【公開番号】P2022137827
(43)【公開日】2022-09-22
【審査請求日】2022-06-22
(73)【特許権者】
【識別番号】000004271
【氏名又は名称】日本電子株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100112874
【弁理士】
【氏名又は名称】渡邊 薫
(72)【発明者】
【氏名】福沢 世傑
(72)【発明者】
【氏名】高橋 康司
【審査官】高田 亜希
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００７／１０５７７３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】実開昭５４－１７７９９６（ＪＰ，Ｕ）
【文献】特表２０１２－５２２０７４（ＪＰ，Ａ）
【文献】Oxidaction Reactions using Sodium Metaperiodate Supported on Silica Gel，Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1，2015年07月26日，P2970-2973
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３０／００ －３０／９６
Ｂ０１Ｊ ２０／００ －２０／２９２
Ｇ０１Ｎ ３３／４８ －３３／９８
Ｂ０１Ｄ １５／００ －１５／４２
Ｇ０１Ｎ １／１０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
酸化剤及び／又は該酸化剤の塩と、固相粒子とを含む、固相混合物であって、前記酸化剤及び／又は前記酸化剤の塩は固相状態にあり、
前記酸化剤は、過ヨウ素酸又は四酢酸鉛であり、且つ、
前記酸化剤の塩は、過ヨウ素酸の塩であり、
前記固相混合物は、前記固相粒子に、前記固相状態にある酸化剤及び／又は前記酸化剤の塩が混合されて形成された混合物であり、且つ
１,２－ジオール構造を有するビタミンＤを選択的に結合・酸化することによって１,２－ジオール構造以外のジオール構造を有するビタミンＤを抽出する、
前記固相混合物。
【請求項2】
前記酸化剤が、１,２－ジオール化合物に対して選択的な酸化能力を有する化合物である、請求項１に記載の固相混合物。
【請求項3】
前記固相粒子が、珪藻土、シリカゲル、デキストラン及びポリマーから選ばれる少なくとも１種の粒子である、請求項１又は２に記載の固相混合物。
【請求項4】
前記ポリマーが、ポリスチレン、ポリメタクリレート及びポリビニルアルコールから選ばれる少なくとも１種である、請求項３に記載の固相混合物。
【請求項5】
前記固相粒子の質量に対する前記酸化剤及び又は前記酸化剤の塩の質量が、４％～２０％である、請求項１～４のいずれか一項に記載の固相混合物。
【請求項6】
前記固相粒子は、親水性官能基を有する固相粒子である、請求項１～５のいずれか一項に記載の固相混合物。
【請求項7】
前記固相混合物は、１,２－ジオール構造を有するビタミンＤを選択的に結合・酸化することによって１,２－ジオール構造以外のジオール構造を有するビタミンＤを抽出するために用いられる、請求項１～６のいずれか一項に記載の固相混合物。
【請求項8】
１,２－ジオール化合物を選択的に結合・酸化することによって１,３－ジオール化合物を抽出する、請求項１～７のいずれか一項に記載の固相混合物。
【請求項9】
前記１,２－ジオール化合物が、１,２－ジオール構造を有するビタミンＤであり、前記１,３－ジオール化合物が、１,３－ジオール構造を有するビタミンＤである、請求項８に記載の固相混合物。
【請求項10】
前記固相混合物は、１,２－ジオール構造を有するビタミンＤを選択的に結合・酸化することによって１,３－ジオール構造を有するビタミンＤを抽出するために用いられる、請求項１～９のいずれか一項に記載の固相混合物。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の固相混合物を含む、充填剤。
【請求項12】
請求項１１に記載の充填剤を充填してなる、カラム。
【請求項13】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の固相混合物、請求項１１に記載の充填剤、又は、請求項１２に記載のカラムを用いる、１,３－ジオール構造を有するビタミンＤの抽出方法。
【請求項14】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の固相混合物、請求項１１に記載の充填剤、又は、請求項１２に記載のカラムを用いて、１,３－ジオール構造を有するビタミンＤを抽出すること、及び、抽出された前記ビタミンＤを検出又は定量すること、
を含む質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、固相混合物、充填剤及びカラムに関する。
【背景技術】
【0002】
生体中のビタミンＤ代謝物の検出・定量は臨床検査、食品栄養、公衆衛生の分野で需要が多い。なかでも、生理活性作用を持つ最も重要な代謝物は活性型ビタミンＤと呼ばれている１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３であり、その選択的な抽出は極めて重要である。
【0003】
例えば、非特許文献１では、抗１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ抗体カラムによる１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の免疫抽出に関する技術が提案されている。また、非特許文献２では、血漿抽出物の過ヨウ素酸処理に関する技術が提案されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｅｒｕｍ／ｐｌａｓｍａ １α,２５－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ＤＡＰＴＡＤ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ. Ｉｓｈｉｇｅ, Ｔ.; Ｓａｔｏｈ, Ｍ.; Ｏｇａｗａ, Ｓ.; Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ, Ｎ.; Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ, Ｋ.; Ｈｉｇａｓｈｉ, Ｔ.; Ｎｏｍｕｒａ, Ｆ. Ｃｌｉｎ. Ｃｈｅｍ. Ａｃｔａ ２０１７, ４７３, １７３-１７９.
【文献】Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ, ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ４β,２５－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３, ｕｓｉｎｇ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ. Ｗａｎｇ, Ｚ.; Ｓｅｎｎ, Ｔ.; Ｋａｌｈｏｒｎ, Ｔ.; Ｚｈｅｎｇ, Ｘ. Ｅ.; Ｚｈｅｎｇ, Ｓ.; Ｄａｖｉｓ, Ｃ. Ｌ.; Ｈｅｂｅｒｔ, Ｍ. Ｆ.; Ｌｉｎ, Ｙ. Ｓ.; Ｔｈｕｍｍｅｌ, Ｋ. Ｅ. Ａｎａｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. ２０１１, ４１８, １２６-１３３.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、非特許文献１及び２で提案された技術では、生体中のビタミンＤ代謝物（特には、１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３）の検出・定量において、更なる迅速化の実現や、更なる簡便化の実現や、更なる低コスト化の実現が図れないおそれがある。
【0006】
そこで、本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、生体中のビタミンＤ代謝物（特には、１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３）の検出・定量において、更なる迅速化や、更なる簡便化や、更なる低コスト化を実現できる固相混合物、その固相混合物を含む充填剤、及びその充填剤を充填してなるカラムを提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上述の主目的を解決するために鋭意研究を行った結果、驚くべきことに、生体中のビタミンＤ代謝物（特には、１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３）の検出・定量において、更なる迅速化や、更なる簡便化や、更なる低コスト化を実現できる固相混合物、その固相混合物を含む充填剤、及びその充填剤を充填してなるカラムの開発に成功し、本発明を完成するに至った。
【0008】
すなわち、本発明では、第１の側面として、
酸化剤及び／又は該酸化剤の塩と、固相粒子とを含む、固相混合物を提供する。
酸化剤及び／又は該酸化剤の塩と、固相粒子とを含む、固相混合物を提供する。
【0009】
本発明に係る第１の側面において、
前記酸化剤が、１,２－ジオール化合物に対して選択的な酸化能力を有する化合物であってもよい。
前記酸化剤が、１,２－ジオール化合物に対して選択的な酸化能力を有する化合物であってもよい。
【0010】
本発明に係る第１の側面において、
前記酸化剤が、過ヨウ素酸又は四酢酸鉛であってもよい。
前記酸化剤が、過ヨウ素酸又は四酢酸鉛であってもよい。
【0011】
本発明に係る第１の側面において、
前記酸化剤の塩が、過ヨウ素酸の塩であってもよい。
前記酸化剤の塩が、過ヨウ素酸の塩であってもよい。
【0012】
本発明に係る第１の側面において、
前記固相粒子が、珪藻土、シリカゲル、デキストラン及びポリマーから選ばれる少なくとも１種の粒子であってもよい。
前記固相粒子が、珪藻土、シリカゲル、デキストラン及びポリマーから選ばれる少なくとも１種の粒子であってもよい。
【0013】
本発明に係る第１の側面において、
前記ポリマーが、ポリスチレン、ポリメタクリレート及びポリビニルアルコールから選ばれる少なくとも１種であってもよい。
前記ポリマーが、ポリスチレン、ポリメタクリレート及びポリビニルアルコールから選ばれる少なくとも１種であってもよい。
【0014】
本発明に係る第１の側面において、
前記固相粒子の質量に対する前記酸化剤及び又は前記酸化剤の塩の質量が、４％～２０％であってもよい。
前記固相粒子の質量に対する前記酸化剤及び又は前記酸化剤の塩の質量が、４％～２０％であってもよい。
【0015】
本発明に係る第１の側面において、
１,２－ジオール化合物を選択的に結合・酸化することによって１,２－ジオール化合物以外のジオール化合物を抽出してもよい。
１,２－ジオール化合物を選択的に結合・酸化することによって１,２－ジオール化合物以外のジオール化合物を抽出してもよい。
【0016】
本発明に係る第１の側面において、
前記１,２－ジオール化合物が、１,２－ジオール構造を有するビタミンＤであってもよく、
前記１,２－ジオール化合物以外のジオール化合物が、１,２－ジオール構造以外のジオール構造を有するビタミンＤであってもよい。
前記１,２－ジオール化合物が、１,２－ジオール構造を有するビタミンＤであってもよく、
前記１,２－ジオール化合物以外のジオール化合物が、１,２－ジオール構造以外のジオール構造を有するビタミンＤであってもよい。
【0017】
本発明に係る第１の側面において、
１,２－ジオール化合物を選択的に結合・酸化することによって１,３－ジオール化合物を抽出してもよい。
１,２－ジオール化合物を選択的に結合・酸化することによって１,３－ジオール化合物を抽出してもよい。
【0018】
本発明に係る第１の側面において、
前記１,２－ジオール化合物が、１,２－ジオール構造を有するビタミンＤであってもよく、
前記１,３－ジオール化合物が、１,３－ジオール構造を有するビタミンＤであってもよい。
前記１,２－ジオール化合物が、１,２－ジオール構造を有するビタミンＤであってもよく、
前記１,３－ジオール化合物が、１,３－ジオール構造を有するビタミンＤであってもよい。
【0019】
本発明に係る第１の側面において、
前記酸化剤及び／又は前記酸化剤の塩が固相状態であってもよい。
前記酸化剤及び／又は前記酸化剤の塩が固相状態であってもよい。
【0020】
また、本発明では、第２の側面として、
本発明に係る第１の側面の固相混合物を含む、充填剤を提供する。
本発明に係る第１の側面の固相混合物を含む、充填剤を提供する。
【0021】
さらに、本発明では、第３の側面として、
本発明に係る第２の側面の充填剤を充填してなる、カラムを提供する。
また、本発明は、
酸化剤及び／又は該酸化剤の塩と、固相粒子とを含む、固相混合物であって、
前記酸化剤及び／又は前記酸化剤の塩は固相状態にあり、
前記酸化剤は、過ヨウ素酸又は四酢酸鉛であり、且つ、
前記酸化剤の塩は、過ヨウ素酸の塩であり、
前記固相混合物は、前記固相粒子に、前記固相状態にある酸化剤及び／又は前記酸化剤の塩が混合されて形成された混合物であり、且つ
１,２－ジオール構造を有するビタミンＤを選択的に結合・酸化することによって１,２－ジオール構造以外のジオール構造を有するビタミンＤを抽出する、
前記固相混合物も提供する。
前記酸化剤が、１,２－ジオール化合物に対して選択的な酸化能力を有する化合物であってよい。
前記固相粒子が、珪藻土、シリカゲル、デキストラン及びポリマーから選ばれる少なくとも１種の粒子であってよい。
前記ポリマーが、ポリスチレン、ポリメタクリレート及びポリビニルアルコールから選ばれる少なくとも１種であってよい。
前記固相粒子の質量に対する前記酸化剤及び又は前記酸化剤の塩の質量が、４％～２０％であってよい。
前記固相粒子は、親水性官能基を有する固相粒子であってよい。
前記固相混合物は、１,２－ジオール構造を有するビタミンＤを選択的に結合・酸化することによって１,２－ジオール構造以外のジオール構造を有するビタミンＤを抽出するために用いられてよい。
前記固相混合物は、１,２－ジオール化合物を選択的に結合・酸化することによって１,３－ジオール化合物を抽出するものであってよい。
前記１,２－ジオール化合物が、１,２－ジオール構造を有するビタミンＤであり、
前記１,３－ジオール化合物が、１,３－ジオール構造を有するビタミンＤであってよい。
前記固相混合物は、１,２－ジオール構造を有するビタミンＤを選択的に結合・酸化することによって１,３－ジオール構造を有するビタミンＤを抽出するために用いられてよい。
また、本発明は、前記固相混合物を含む充填剤も提供する。
また、本発明は、前記充填剤を充填してなるカラムも提供する。
また、本発明は、前記固相混合物、前記充填剤、又は、前記カラムを用いる、１,３－ジオール構造を有するビタミンＤの抽出方法も提供する。
また、本発明は、前記固相混合物、前記充填剤、又は、前記カラムを用いて、１,３－ジオール構造を有するビタミンＤを抽出すること、及び、
抽出された前記ビタミンＤを検出又は定量すること、
を含む質量分析方法も提供する。
本発明に係る第２の側面の充填剤を充填してなる、カラムを提供する。
また、本発明は、
酸化剤及び／又は該酸化剤の塩と、固相粒子とを含む、固相混合物であって、
前記酸化剤及び／又は前記酸化剤の塩は固相状態にあり、
前記酸化剤は、過ヨウ素酸又は四酢酸鉛であり、且つ、
前記酸化剤の塩は、過ヨウ素酸の塩であり、
前記固相混合物は、前記固相粒子に、前記固相状態にある酸化剤及び／又は前記酸化剤の塩が混合されて形成された混合物であり、且つ
１,２－ジオール構造を有するビタミンＤを選択的に結合・酸化することによって１,２－ジオール構造以外のジオール構造を有するビタミンＤを抽出する、
前記固相混合物も提供する。
前記酸化剤が、１,２－ジオール化合物に対して選択的な酸化能力を有する化合物であってよい。
前記固相粒子が、珪藻土、シリカゲル、デキストラン及びポリマーから選ばれる少なくとも１種の粒子であってよい。
前記ポリマーが、ポリスチレン、ポリメタクリレート及びポリビニルアルコールから選ばれる少なくとも１種であってよい。
前記固相粒子の質量に対する前記酸化剤及び又は前記酸化剤の塩の質量が、４％～２０％であってよい。
前記固相粒子は、親水性官能基を有する固相粒子であってよい。
前記固相混合物は、１,２－ジオール構造を有するビタミンＤを選択的に結合・酸化することによって１,２－ジオール構造以外のジオール構造を有するビタミンＤを抽出するために用いられてよい。
前記固相混合物は、１,２－ジオール化合物を選択的に結合・酸化することによって１,３－ジオール化合物を抽出するものであってよい。
前記１,２－ジオール化合物が、１,２－ジオール構造を有するビタミンＤであり、
前記１,３－ジオール化合物が、１,３－ジオール構造を有するビタミンＤであってよい。
前記固相混合物は、１,２－ジオール構造を有するビタミンＤを選択的に結合・酸化することによって１,３－ジオール構造を有するビタミンＤを抽出するために用いられてよい。
また、本発明は、前記固相混合物を含む充填剤も提供する。
また、本発明は、前記充填剤を充填してなるカラムも提供する。
また、本発明は、前記固相混合物、前記充填剤、又は、前記カラムを用いる、１,３－ジオール構造を有するビタミンＤの抽出方法も提供する。
また、本発明は、前記固相混合物、前記充填剤、又は、前記カラムを用いて、１,３－ジオール構造を有するビタミンＤを抽出すること、及び、
抽出された前記ビタミンＤを検出又は定量すること、
を含む質量分析方法も提供する。
【発明の効果】
【0022】
本発明によれば、生体中のビタミンＤ代謝物（特には、１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３）の検出・定量において、更なる迅速化や、更なる簡便化や、更なる低コスト化が実現され得る。なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本明細書中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【発明を実施するための形態】
【0024】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【0025】
なお、説明は以下の順序で行う。
１．本発明の概要
２．第１の実施形態（固相混合物の例）
３．第２の実施形態（充填剤の例）
４．第３の実施形態（カラムの例）
５．実施例
５－１．実施例１
５－２．実施例２
５－３．実施例３
１．本発明の概要
２．第１の実施形態（固相混合物の例）
３．第２の実施形態（充填剤の例）
４．第３の実施形態（カラムの例）
５．実施例
５－１．実施例１
５－２．実施例２
５－３．実施例３
【0026】
＜１．本発明の概要＞
まず、本発明の概要について説明をする。本発明は、固相混合物、その固相混合物を含む充填剤及びその充填剤を充填してなるカラムに関する。
まず、本発明の概要について説明をする。本発明は、固相混合物、その固相混合物を含む充填剤及びその充填剤を充填してなるカラムに関する。
【0027】
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、クロマト分離とフラグメントイオンのｍ／ｚ（質量電荷比）との組み合わせで高い分離能を持ち、２４Ｒ,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３についてはフラグメントイオンのｍ／ｚによって分離可能であるのに対し、４β,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３については、フラグメントイオンのｍ／ｚによって分離することができない。
【0028】
１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（１α,２５（ＯＨ）２Ｄ３）、２４Ｒ,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（２４Ｒ,２５（ＯＨ）２Ｄ３）、４β,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（４β，２５（ＯＨ）２Ｄ３）の誘導体化試薬ＤＡＰ－ＰＡ（１）による誘導体化反応の反応式は、以下のとおりである。誘導体化反応により、１α,２５（ＯＨ）２Ｄ３－ＤＡＰＴＡＤ誘導体（７）、２４Ｒ,２５（ＯＨ）２Ｄ３－ＤＡＰＴＡＤ誘導体（８）及び４β，２５（ＯＨ）２Ｄ３－ＤＡＰＴＡＤ誘導体（９）が形成されて、この３つの誘導体を用いてＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析が行われる。
【0029】
【化1】
【0030】
図１を用いて説明をする。図１は、１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（１α,２５（ＯＨ）２Ｄ３）及び４β,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（４β,２５（ＯＨ）２Ｄ３）のＳＲＭクロマトグラムを示す。なお、１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（１α,２５（ＯＨ）２Ｄ３）は、１３Ｃ３標識体である。分析条件を、下記の表１に示す。
【0031】
【表1】
【0032】
図１から明らかなように、１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３と、４β,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３とにおいては、クロマト分離が困難である。
【0033】
従って、現状では、抗１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ抗体カラムによる免疫抽出でのみ、それらの単離・抽出が可能となっている。
【0034】
次に、従来の技術例１（抗１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ抗体カラムによる１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の免疫抽出）及び技術例２（血漿抽出物の過ヨウ素酸処理）について説明する。従来の技術例１は以下のとおりである。
【0035】
遠心で抗体カラム中の緩衝液を遠心で除去する。血清０．２ｍＬに内部標準物質を含むリン酸緩衝液０．３ｍＬをカラムに展開し、ゆっくり回転させながら１時間インキュベーションする。遠心で検体希釈液を除去した後、洗浄液を添加して遠心除去する（２回繰り返す）。溶出液を添加し、遠心で溶出して回収する。溶出液を濃縮後、誘導体化試薬ＤＡＰＴＡＤ又はＰＴＡＤ（０．２ｍｇ／ｍＬ、５０μＬ）を添加し、室温１時間静置することで誘導体化する。濃縮後、再溶解溶媒（３０％アセトニトリル溶液）３３μＬに溶解し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析をする。
【0036】
技術例１のスキームをスキーム１として以下に示す。
【0037】
（スキーム１）
(1)遠心で抗体カラム中の緩衝液を遠心で除去。
↓
(2)血清０．２ｍＬを含む検体希釈液０．５ｍＬをカラムに展開。
↓
(3)ゆっくり回転させながら１時間インキュベーション。
↓
(4)遠心で検体希釈液を除去。
↓
(5)洗浄液を添加し、遠心除去（２回繰り返す。）。
↓
(6)溶出液を添加し、遠心で溶出。
↓
(7)誘導体化試薬ＤＡＰＴＡＤ又はＰＴＡＤ（０．２ｍｇ／ｍＬ、５０μＬ）を添加し、室温１時間静置することで誘導体化する。
↓
(8)再溶解溶媒（３０％アセトニトリル溶液）３３μＬに溶解。
↓
(9)ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析。
(1)遠心で抗体カラム中の緩衝液を遠心で除去。
↓
(2)血清０．２ｍＬを含む検体希釈液０．５ｍＬをカラムに展開。
↓
(3)ゆっくり回転させながら１時間インキュベーション。
↓
(4)遠心で検体希釈液を除去。
↓
(5)洗浄液を添加し、遠心除去（２回繰り返す。）。
↓
(6)溶出液を添加し、遠心で溶出。
↓
(7)誘導体化試薬ＤＡＰＴＡＤ又はＰＴＡＤ（０．２ｍｇ／ｍＬ、５０μＬ）を添加し、室温１時間静置することで誘導体化する。
↓
(8)再溶解溶媒（３０％アセトニトリル溶液）３３μＬに溶解。
↓
(9)ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析。
【0038】
従来の技術例２は以下のとおりである。
【0039】
誘導体化後の試料を再溶解溶媒（５０％メタノール溶液）０．３ｍＬに溶解する。５％過ヨウ素酸ナトリウム水溶液３０μＬを添加し、１時間インキュベーションする。０．５ｍＬの水を加えて酢酸エチル２ｍＬで抽出する。濃縮後、再溶解溶媒（４０％アセトニトリル溶液）４０μＬに溶解し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析する。
【0040】
技術例２のスキームをスキーム２として以下に示す。
【0041】
（スキーム２）
(1)誘導体化後の試料を再溶解溶媒（５０％メタノール溶液）０．３ｍＬに溶解。
↓
(2)５％過ヨウ素酸ナトリウム水溶液３０μＬを添加し、１時間インキュベーション。
↓
(3)０．５ｍＬの水を加えて酢酸エチル２ｍＬで抽出。
↓
(4)濃縮後、再溶解溶媒（４０％アセトニトリル溶液）４０μＬに溶解。
↓
(5)ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析。
(1)誘導体化後の試料を再溶解溶媒（５０％メタノール溶液）０．３ｍＬに溶解。
↓
(2)５％過ヨウ素酸ナトリウム水溶液３０μＬを添加し、１時間インキュベーション。
↓
(3)０．５ｍＬの水を加えて酢酸エチル２ｍＬで抽出。
↓
(4)濃縮後、再溶解溶媒（４０％アセトニトリル溶液）４０μＬに溶解。
↓
(5)ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析。
【0042】
技術例１は、高価な抗体を用いること、そして１時間インキュベーションをする必要があり、処理に要する時間が長いといった短所がある。本発明は抗原－抗体反応を用いた従来の１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の選択的抽出法に対し、生体試料中の夾雑物である４β,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３が１，２－ジオール構造を有することに着目し、過ヨウ素酸による１，２－ジオール構造を有する化合物（例えば、４β,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３）に対して、選択的な反応・分解による除去によって、結果として、１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の選択的抽出を行うものである。
【0043】
また、技術例２は、過ヨウ素酸で、４β,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３を分解しているが、血漿中のビタミンＤを除蛋白に続いて誘導体化した後に、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を添加して１時間インキュベーションして、酢酸エチル抽出を行うという手間と時間とを要する。本発明はカラムに、例えば、過ヨウ素酸ナトリウムを固体で添加するのみで（過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を用いていないことが好ましい。）、簡便に製作でき、カラムを用いた通常の除蛋白処理と同様にカラムを通液するだけで４β,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３を除去でき、迅速・簡便・安価に、１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３を抽出する発明である。
【0044】
本発明は、例えば、質量分析を用いた、１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３を精確に検出するために供する抽出カラムであり、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー―タンデム質量分析計）を検出手段と考えている．そして本発明は、質量分析計の製造メーカに限定されないで用いられるものである。臨床検査分野における１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の測定需要は非常に大きく、本発明は抗体を用いた免疫抽出法に比べて、低価格であり、処理時間が格段に短く、検査速度を飛躍的に高めることができる。
【0045】
以下、本発明を実施するための好適な形態について詳細に説明する。以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【0046】
＜２．第１の実施形態（固相混合物の例）＞
本発明に係る第１の実施形態（固相混合物の例）の固相混合物は、酸化剤及び／又は酸化剤の塩と、固相粒子とを含む、固相混合物である。
本発明に係る第１の実施形態（固相混合物の例）の固相混合物は、酸化剤及び／又は酸化剤の塩と、固相粒子とを含む、固相混合物である。
【0047】
酸化剤は、１,２－ジオール化合物に対して選択的な酸化能力を有する化合物であり、酸化剤は、特に限定されることはないが、過ヨウ素酸又は四酢酸鉛が好適である。酸化剤の塩も、特に限定されることはないが、過ヨウ素酸の塩が好適である。酸化剤及び／又は酸化剤の塩は、固相状態であることが好適である。
【0048】
固相粒子は、親水性官能基を有してよく、例えば、珪藻土、シリカゲル、デキストラン及びヒドロキシル化された合成ポリマーから選ばれる少なくとも１種の粒子が挙げられる。ヒドロキシル化された合成ポリマーは、例えば、ポリスチレン、ポリメタクリレート及びポリビニルアルコールから選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
【0049】
本発明に係る第１の実施形態の固相混合物においては、固相粒子の質量に対する酸化剤及び又は前記酸化剤の塩の質量は、随意の割合でよいが、４％～２０％であることが好適である。
【0050】
酸化剤は、１,２－ジオール化合物に選択的に結合し、酸化することで１,２－ジオール化合物を除去し、１,２－ジオール構造を有さない化合物（すなわち、１,２－ジオール化合物以外のジオール化合物）を抽出する。１,２－ジオール化合物以外のジオール化合物は、例えば、１,３－ジオール化合物が挙げられる。
【0051】
以下の反応式のように、工程Ｓ１００において、１,２－ジオール化合物（１）は、過ヨウ素酸ナトリウム／水（ＮａＩＯ４／Ｈ２Ｏ）と反応して、１,２－ジオール化合物と過ヨウ素酸との複合体化合物（３）が形成されるが、１,３－ジオール化合物（２）は、過ヨウ素酸ナトリウム／水（ＮａＩＯ４／Ｈ２Ｏ）と反応しない。
【0052】
【化2】
【0053】
本発明に係る第１の実施形態の固相混合物は、ビタミンＤのうち、１,２－ジオール構造を有する（４β,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（５）、２４Ｒ,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（６）等）ものと選択的に結合・酸化することによって、４β,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３と過ヨウ素酸との複合体化合物（５－１）が形成され、２４Ｒ,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３と過ヨウ素酸との複合体化合物（６－１）が形成される。１,２－ジオール構造を有さないビタミンＤが抽出され得る。
【0054】
１,２－ジオール構造を有さない化合物の代表例として１,３－ジオール構造を有する１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（４）（又は（７））があり、また、１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ２（８）、（２３Ｓ,２５Ｒ）－１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３ ２６,２３－ラクトン（９）等も、１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（４）（及び（７））と同様に抽出され得る。
【0055】
【化3】
【0056】
【化4】
【0057】
【化5】
【0058】
本発明に係る第１の実施形態の固相混合物の使用形態としては、例えば、後述する本発明に係る第２の実施形態の充填剤に当該固相混合物を含ませて、その充填剤を、後述する本発明に係る第３の実施形態のカラムに充填して使用する（カラム法）ことが挙げられる。また、本発明に係る第１の実施形態の固相混合物の使用形態としては、例えば、固相混合物そのものを抽出対象溶液に混ぜる（バッチ法）ことが挙げられる。
【0059】
本発明に係る固相混合物は、カラム法又はバッチ法で生体試料（血液、血清、血漿、尿、唾液、髄液等）から１,２－ジオール構造を有するジヒドロキシビタミンＤ３類を選択的に除去し、１,２－ジオール構造を有さない１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３類等を抽出する。抽出された１α,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３類は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法で検出・定量する。
【0060】
＜３．第２の実施形態（充填剤の例）＞
本発明に係る第２の実施形態（充填剤の例）の充填剤は、本発明に係る固相混合物（例えば、本発明に係る第１の実施形態の固相混合物）を含む、充填剤である。
本発明に係る第２の実施形態（充填剤の例）の充填剤は、本発明に係る固相混合物（例えば、本発明に係る第１の実施形態の固相混合物）を含む、充填剤である。
【0061】
＜４．第３の実施形態（カラムの例）＞
本発明に係る第３の実施形態（カラムの例）のカラムは、本発明に係る充填剤（例えば、本発明に係る第２の実施形態の充填剤）を充填してなる、カラムである。
本発明に係る第３の実施形態（カラムの例）のカラムは、本発明に係る充填剤（例えば、本発明に係る第２の実施形態の充填剤）を充填してなる、カラムである。
【0062】
＜５．実施例＞
以下に、実施例を挙げて、本発明の効果等について具体的に説明をする。なお、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。
以下に、実施例を挙げて、本発明の効果等について具体的に説明をする。なお、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。
【0063】
＜５－１．実施例１＞
［過ヨウ素酸添加の珪藻土カラムの製作］
珪藻土１ｇに過ヨウ素酸ナトリウム（０ｇ、０．０４ｇ、０．０６ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ）のそれぞれを添加し、機械的によく混ぜて、５つの固相混合物を作製し、その５つの固相混合物のそれぞれを３ｍＬのシリンジ型カラムに充填した。
［過ヨウ素酸添加の珪藻土カラムの製作］
珪藻土１ｇに過ヨウ素酸ナトリウム（０ｇ、０．０４ｇ、０．０６ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ）のそれぞれを添加し、機械的によく混ぜて、５つの固相混合物を作製し、その５つの固相混合物のそれぞれを３ｍＬのシリンジ型カラムに充填した。
【0064】
＜５－２．実施例２＞
［過ヨウ素酸添加カラム（珪藻土１ｇに、０．１５ｇの過ヨウ素酸ナトリウムを添加する。）を用いた４β，２５-ジヒドロキシビタミンＤ３の除去］
４β,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３標品（１．８ｐｇ、１８ｐｇ、１８０ｐｇ、１８００ｐｇ）及び内部標準物質（１α,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３-１３Ｃ３）のそれぞれを含む希釈液（３０％アセトニトリル溶液）１ｍＬをカラムに展開した。１分間静置し、ヘキサン０．６ｍＬを添加して加圧溶出、溶出液は廃棄した。ヘキサン/酢酸エチル（１：１）０．６ｍＬを添加して加圧溶出（２回繰り返す）した。溶出液を濃縮後、誘導体化試薬ＤＡＰ－ＰＡ（０．５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍＬ）を添加し、８０℃１５分間加熱し誘導体化した。濃縮後、再溶解溶媒（５０％アセトニトリル溶液）５０μＬに溶解し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
［過ヨウ素酸添加カラム（珪藻土１ｇに、０．１５ｇの過ヨウ素酸ナトリウムを添加する。）を用いた４β，２５-ジヒドロキシビタミンＤ３の除去］
４β,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３標品（１．８ｐｇ、１８ｐｇ、１８０ｐｇ、１８００ｐｇ）及び内部標準物質（１α,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３-１３Ｃ３）のそれぞれを含む希釈液（３０％アセトニトリル溶液）１ｍＬをカラムに展開した。１分間静置し、ヘキサン０．６ｍＬを添加して加圧溶出、溶出液は廃棄した。ヘキサン/酢酸エチル（１：１）０．６ｍＬを添加して加圧溶出（２回繰り返す）した。溶出液を濃縮後、誘導体化試薬ＤＡＰ－ＰＡ（０．５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍＬ）を添加し、８０℃１５分間加熱し誘導体化した。濃縮後、再溶解溶媒（５０％アセトニトリル溶液）５０μＬに溶解し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
【0065】
実施例２のスキームをスキーム３として以下に示す。
【0066】
（スキーム３）
(1)４β,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３標品（１．８ｐｇ、１８ｐｇ、１８０ｐｇ、１８００ｐｇ）及び内部標準物質（１α,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３-１３Ｃ３）のそれぞれを含む検体希釈液（３０％アセトニトリル溶液）１ｍＬをカラムに展開。
↓
(2)１分間静置。
↓
(3)ヘキサン０．６ｍＬを添加して加圧溶出、溶出液は廃棄。
↓
ヘキサン/酢酸エチル（１：１）０．６ｍＬを添加して加圧溶出（２回繰り返す）。
↓
(4)溶出液を濃縮後、誘導体化試薬ＤＡＰ－ＰＡ（０．５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍＬ）を添加し、８０℃１５分間加熱することで誘導体化。
↓
(5)濃縮後、再溶解溶媒（５０％アセトニトリル溶液）５０μＬに溶解。
↓
(6)ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析。
(1)４β,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３標品（１．８ｐｇ、１８ｐｇ、１８０ｐｇ、１８００ｐｇ）及び内部標準物質（１α,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３-１３Ｃ３）のそれぞれを含む検体希釈液（３０％アセトニトリル溶液）１ｍＬをカラムに展開。
↓
(2)１分間静置。
↓
(3)ヘキサン０．６ｍＬを添加して加圧溶出、溶出液は廃棄。
↓
ヘキサン/酢酸エチル（１：１）０．６ｍＬを添加して加圧溶出（２回繰り返す）。
↓
(4)溶出液を濃縮後、誘導体化試薬ＤＡＰ－ＰＡ（０．５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍＬ）を添加し、８０℃１５分間加熱することで誘導体化。
↓
(5)濃縮後、再溶解溶媒（５０％アセトニトリル溶液）５０μＬに溶解。
↓
(6)ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析。
【0067】
実施例２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の分析結果を図２及び図３に示す。図２に示されるＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の分析結果を導き出すためのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の分析条件を下記の表２に示す。また、図３に示されるＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の分析結果を導き出すためのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の分析条件を下記の表３に示す。
【0068】
【表2】
【0069】
【表3】
【0070】
図２は、過ヨウ素酸（過ヨウ素酸ナトリウム）の添加により４β,２５（ＯＨ）２Ｄ３が除去できることについてのＳＲＭクロマトグラムを示す。
【0071】
より詳しくは、図２の左側の図は、珪藻土のみのカラムでのＳＲＭクロマトグラムを示す。そして、図２の左側の図において、上側の図から順に、４β,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３の添加量を、１．８ｐｇ（４４ｐｇ／ｍＬ）、１８ｐｇ（４４０ｐｇ／ｍＬ）、１８０ｐｇ（４．４ｎｇ／ｍＬ）、１．８ｎｇ（４４ｎｇ／ｍＬ）としたときのＳＲＭクロマトグラムを示す。また、図２の右側の図は、珪藻土１ｇ当たり、０．１５ｇの過ヨウ素酸ナトリウムを添加したカラムでのＳＲＭクロマトグラムを示す。そして、図２の右側の図において、上側の図から順に、４β,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３の添加量を、１．８ｐｇ（４４ｐｇ／ｍＬ）、１８ｐｇ（４４０ｐｇ／ｍＬ）、１８０ｐｇ（４．４ｎｇ／ｍＬ）、１．８ｎｇ（４４ｎｇ／ｍＬ）としたときのＳＲＭクロマトグラムを示す。
【0072】
図２の左側の図の参照符号Ｐ１－１に示される領域を参照すれば、明らかなように、過ヨウ素酸（過ヨウ素酸ナトリウム）を添加しないと、４β,２５（ＯＨ）２Ｄ３は、除去されないで抽出されていることを確認した。一方、図２の右側の図の参照符号Ｐ１－２に示される領域を参照すれば、明らかなように、過ヨウ素酸（過ヨウ素酸ナトリウム）を添加すると、過ヨウ素酸（過ヨウ素酸ナトリウム）が、１,２－ジオール構造を有する４β,２５（ＯＨ）２Ｄ３に結合・酸化することで、４β,２５（ＯＨ）２Ｄ３が除去されて、抽出されていないことを確認した。
【0073】
図３は、過ヨウ素酸（過ヨウ素酸ナトリウム）の添加により４β,２５（ＯＨ）２Ｄ３が除去できることについてのＳＲＭクロマトグラムを示す。
【0074】
より詳しくは、図３の左側の図は、珪藻土のみのカラムでのＳＲＭクロマトグラムを示す。そして、図３の左側の図において、上側の図（ｍ／ｚ：６３５．３＞３５７．０）が、４β,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３を添加したとき（添加量は、１８０ｐｇ（４．４ｎｇ／ｍＬ）である。）のＳＲＭクロマトグラムを示し、下側の図（ｍ／ｚ：６３８．３＞３５７．０）が、１α,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３-１３Ｃ３を添加したとき（添加量は、１８０ｐｇ（４．４ｎｇ／ｍＬ）である。）のＳＲＭクロマトグラムを示す。また、図３の右側の図は、珪藻土に過ヨウ素酸ナトリウムを添加した（１５質量％）カラムでのＳＲＭクロマトグラムを示す。そして、図３の右側の図において、上側の図（ｍ／ｚ：６３５．３＞３５７．０）が、４β,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３を添加したとき（添加量は、１８０ｐｇ（４．４ｎｇ／ｍＬ）である。）のＳＲＭクロマトグラムを示し、下側の図（ｍ／ｚ：６３８．３＞３５７．０）が、１α,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３-１３Ｃ３を添加したとき（添加量は、１８０ｐｇ（４．４ｎｇ／ｍＬ）である。）のＳＲＭクロマトグラムを示す。
【0075】
図３の左側の図の参照符号Ｐ２－１に示される領域を参照すれば、明らかなように、過ヨウ素酸（過ヨウ素酸ナトリウム）を添加しないと、４β,２５（ＯＨ）２Ｄ３と、１α,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３-１３Ｃ３と除去されないで抽出されていることを確認した。一方、図３の右側の図の参照符号Ｐ２－２に示される領域を参照すれば、明らかなように、過ヨウ素酸（過ヨウ素酸ナトリウム）を添加すると、過ヨウ素酸（過ヨウ素酸ナトリウム）が、１,２－ジオール構造を有する４β,２５（ＯＨ）２Ｄ３に結合・酸化することで、４β,２５（ＯＨ）２Ｄ３が除去されて、抽出されないが、過ヨウ素酸（過ヨウ素酸ナトリウム）は、１,３－ジオール構造を有する１α,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３-１３Ｃ３には、結合・酸化することはないので、１α,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３-１３Ｃ３は除去されずに抽出されることを確認した。すなわち、１α,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３（１α,２５（ＯＨ）２Ｄ３）と、４β,２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（４β,２５（ＯＨ）２Ｄ３）とが識別され得る。
【0076】
＜５－３．実施例３＞
［過ヨウ素酸の添加カラム（珪藻土１ｇに、０．０４ｇの過ヨウ素酸ナトリウム、０．０６ｇの過ヨウ素酸ナトリウム、０．１ｇの過ヨウ素酸ナトリウム、０．１５ｇの過ヨウ素酸ナトリウム及び０．２ｇの過ヨウ素酸ナトリウムのそれぞれを添加する。）を用いた１α，２５-ジヒドロキシビタミンＤ３の固液抽出］
血清０．２ｍL及び内部標準物質（１α,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３-１３Ｃ３）を含む検体希釈液（３０％アセトニトリル溶液）１ｍＬをカラムに展開した。１分間静置し、ヘキサン０．６ｍＬを添加して加圧溶出、溶出液は廃棄した。ヘキサン／酢酸エチル（１：１）０．６ｍＬを添加して加圧溶出（２回繰り返す）した。溶出液を濃縮後、誘導体化試薬ＤＡＰ－ＰＡ（０．５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍＬ）を添加し、８０℃１５分間加熱し誘導体化した。濃縮後、再溶解溶媒（５０％アセトニトリル溶液）５０μＬに溶解し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
［過ヨウ素酸の添加カラム（珪藻土１ｇに、０．０４ｇの過ヨウ素酸ナトリウム、０．０６ｇの過ヨウ素酸ナトリウム、０．１ｇの過ヨウ素酸ナトリウム、０．１５ｇの過ヨウ素酸ナトリウム及び０．２ｇの過ヨウ素酸ナトリウムのそれぞれを添加する。）を用いた１α，２５-ジヒドロキシビタミンＤ３の固液抽出］
血清０．２ｍL及び内部標準物質（１α,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３-１３Ｃ３）を含む検体希釈液（３０％アセトニトリル溶液）１ｍＬをカラムに展開した。１分間静置し、ヘキサン０．６ｍＬを添加して加圧溶出、溶出液は廃棄した。ヘキサン／酢酸エチル（１：１）０．６ｍＬを添加して加圧溶出（２回繰り返す）した。溶出液を濃縮後、誘導体化試薬ＤＡＰ－ＰＡ（０．５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍＬ）を添加し、８０℃１５分間加熱し誘導体化した。濃縮後、再溶解溶媒（５０％アセトニトリル溶液）５０μＬに溶解し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
【0077】
実施例３のスキームをスキーム４として以下に示す。
【0078】
（スキーム４）
(1)血清０．２ｍＬ及び内部標準物質（１α,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３-１３Ｃ３）を含む検体希釈液（３０％アセトニトリル溶液）１ｍＬをカラムに展開。
↓
(2)１分間静置。
↓
(3)ヘキサン０．６ｍＬを添加して加圧溶出、溶出液は廃棄。
↓
(4)ヘキサン/酢酸エチル（１：１）０．６ｍＬを添加して加圧溶出（２回繰り返す）
↓
(5)溶出液を濃縮後、誘導体化試薬ＤＡＰ－ＰＡ（０．５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍＬ）を添加し、８０℃１５分間加熱することで誘導体化。
↓
(6)濃縮後、再溶解溶媒（５０％アセトニトリル溶液）５０μＬに溶解。
↓
(7)ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析。
(1)血清０．２ｍＬ及び内部標準物質（１α,２５-ジヒドロキシビタミンＤ３-１３Ｃ３）を含む検体希釈液（３０％アセトニトリル溶液）１ｍＬをカラムに展開。
↓
(2)１分間静置。
↓
(3)ヘキサン０．６ｍＬを添加して加圧溶出、溶出液は廃棄。
↓
(4)ヘキサン/酢酸エチル（１：１）０．６ｍＬを添加して加圧溶出（２回繰り返す）
↓
(5)溶出液を濃縮後、誘導体化試薬ＤＡＰ－ＰＡ（０．５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍＬ）を添加し、８０℃１５分間加熱することで誘導体化。
↓
(6)濃縮後、再溶解溶媒（５０％アセトニトリル溶液）５０μＬに溶解。
↓
(7)ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析。
【0079】
【0080】
【表4】
【0081】
図４は、プール血清において、過ヨウ素酸の添加により４β,２５（ＯＨ）２Ｄ３が除去できることについてのＳＲＭクロマトグラムを示す。
【0082】
より詳しくは、図４において、上側の図から順に、珪藻土１ｇに過ヨウ素酸ナトリウムを添加していないカラムのＳＲＭクロマトグラムを示し、珪藻土１ｇに０．０４ｇの過ヨウ素酸ナトリウムを添加したカラムでのＳＲＭクロマトグラムを示し、珪藻土１ｇに０．０６ｇの過ヨウ素酸ナトリウムを添加したカラムでのＳＲＭクロマトグラムを示し、珪藻土１ｇに０．１ｇの過ヨウ素酸ナトリウムを添加したカラムでのＳＲＭクロマトグラムを示し、珪藻土１ｇに０．１５ｇの過ヨウ素酸ナトリウムを添加したカラムでのＳＲＭクロマトグラムを示し、珪藻土１ｇに０．２ｇの過ヨウ素酸ナトリウムを添加したカラムでのＳＲＭクロマトグラムを示す。
【0083】
図４の参照符号Ｐ３に示される領域を参照すれば、明らかなように、過ヨウ素酸ナトリウムを添加しないと、４β,２５（ＯＨ）２Ｄ３は、除去されないで抽出されていることを確認した（図４の一番上側の図）。一方、過ヨウ素酸（過ヨウ素酸ナトリウム）を添加すると（珪藻土１ｇに対して０．０４ｇ～０．２ｇの過ヨウ素酸ナトリウムの添加）、過ヨウ素酸（過ヨウ素酸ナトリウム）が、１,２－ジオール構造を有する４β,２５（ＯＨ）２Ｄ３に結合・酸化することで、４β,２５（ＯＨ）２Ｄ３が除去されて、抽出されていないことを確認した。
【0084】
ところで、本発明は、上記各実施形態及び上記各実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更することが可能である。
【0085】
また、本明細書に記載された効果はあくまでも例示であって限定されるものではなく、また他の効果があってもよい。
【0086】
また、本発明は、以下のような構成を取ることもできる。
［１］
酸化剤及び／又は該酸化剤の塩と、固相粒子とを含む、固相混合物。
［２］
前記酸化剤が、１,２－ジオール化合物に対して選択的な酸化能力を有する化合物である、［１］に記載の固相混合物。
［３］
前記酸化剤が、過ヨウ素酸又は四酢酸鉛である、［１］又は［２］に記載の固相混合物。
［４］
前記酸化剤の塩が、過ヨウ素酸の塩である、［１］～［３］のいずれか一つに記載の固相混合物。
［５］
前記固相粒子が、珪藻土、シリカゲル、デキストラン及びポリマーから選ばれる少なくとも１種の粒子である、請求項１～４のいずれか一項に記載の固相混合物。
［６］
前記ポリマーが、ポリスチレン、ポリメタクリレート及びポリビニルアルコールから選ばれる少なくとも１種である、［５］に記載の固相混合物。
［７］
前記固相粒子の質量に対する前記酸化剤及び又は前記酸化剤の塩の質量が、４％～２０％である、［１］～［６］のいずれか一つに記載の固相混合物。
［８］
１,２－ジオール化合物を選択的に結合・酸化することによって１,２－ジオール化合物以外のジオール化合物を抽出する、［１］～［７］のいずれか一つに記載の固相混合物。
［９］
前記１,２－ジオール化合物が、１,２－ジオール構造を有するビタミンＤであり、
前記１,２－ジオール化合物以外のジオール化合物が、１,２－ジオール構造以外のジオール構造を有するビタミンＤである、［８］に記載の固相混合物。
［１０］
１,２－ジオール化合物を選択的に結合・酸化することによって１,３－ジオール化合物を抽出する、［１］～［７］のいずれか一つに記載の固相混合物。
［１１］
前記１,２－ジオール化合物が、１,２－ジオール構造を有するビタミンＤであり、
前記１,３－ジオール化合物が、１,３－ジオール構造を有するビタミンＤである、［１０］に記載の固相混合物。
［１２］
前記酸化剤及び／又は前記酸化剤の塩が固相状態である、［１］～［１１］のいずれか一つに記載の固相混合物。
［１３］
［１］～［１２］のいずれか一つに記載の固相混合物を含む、充填剤。
［１４］
［１３］に記載の充填剤を充填してなる、カラム。
［１］
酸化剤及び／又は該酸化剤の塩と、固相粒子とを含む、固相混合物。
［２］
前記酸化剤が、１,２－ジオール化合物に対して選択的な酸化能力を有する化合物である、［１］に記載の固相混合物。
［３］
前記酸化剤が、過ヨウ素酸又は四酢酸鉛である、［１］又は［２］に記載の固相混合物。
［４］
前記酸化剤の塩が、過ヨウ素酸の塩である、［１］～［３］のいずれか一つに記載の固相混合物。
［５］
前記固相粒子が、珪藻土、シリカゲル、デキストラン及びポリマーから選ばれる少なくとも１種の粒子である、請求項１～４のいずれか一項に記載の固相混合物。
［６］
前記ポリマーが、ポリスチレン、ポリメタクリレート及びポリビニルアルコールから選ばれる少なくとも１種である、［５］に記載の固相混合物。
［７］
前記固相粒子の質量に対する前記酸化剤及び又は前記酸化剤の塩の質量が、４％～２０％である、［１］～［６］のいずれか一つに記載の固相混合物。
［８］
１,２－ジオール化合物を選択的に結合・酸化することによって１,２－ジオール化合物以外のジオール化合物を抽出する、［１］～［７］のいずれか一つに記載の固相混合物。
［９］
前記１,２－ジオール化合物が、１,２－ジオール構造を有するビタミンＤであり、
前記１,２－ジオール化合物以外のジオール化合物が、１,２－ジオール構造以外のジオール構造を有するビタミンＤである、［８］に記載の固相混合物。
［１０］
１,２－ジオール化合物を選択的に結合・酸化することによって１,３－ジオール化合物を抽出する、［１］～［７］のいずれか一つに記載の固相混合物。
［１１］
前記１,２－ジオール化合物が、１,２－ジオール構造を有するビタミンＤであり、
前記１,３－ジオール化合物が、１,３－ジオール構造を有するビタミンＤである、［１０］に記載の固相混合物。
［１２］
前記酸化剤及び／又は前記酸化剤の塩が固相状態である、［１］～［１１］のいずれか一つに記載の固相混合物。
［１３］
［１］～［１２］のいずれか一つに記載の固相混合物を含む、充填剤。
［１４］
［１３］に記載の充填剤を充填してなる、カラム。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
