特許 7453334 核酸－リン酸カルシウムナノ粒子複合体及び生物鉱化におけるその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-11

(45)【発行日】2024-03-19

(54)【発明の名称】核酸－リン酸カルシウムナノ粒子複合体及び生物鉱化におけるその使用

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/24 20060101AFI20240312BHJP

   A61L 27/36 20060101ALI20240312BHJP

   A61L 27/12 20060101ALI20240312BHJP

   C07K 14/78 20060101ALN20240312BHJP

   C12N 15/87 20060101ALN20240312BHJP

【ＦＩ】

A61L27/24

A61L27/36 100

A61L27/12

C07K14/78

C12N15/87 Z

【請求項の数】 19

(21)【出願番号】P 2022505251

(86)(22)【出願日】2020-08-07

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-10-19

(86)【国際出願番号】 CN2020108009

(87)【国際公開番号】W WO2021196490

(87)【国際公開日】2021-10-07

【審査請求日】2022-01-24

(31)【優先権主張番号】202010246314.5

(32)【優先日】2020-03-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】520087527

【氏名又は名称】中国人民解放軍第四軍医大学

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】牛 ▲麗▼娜

(72)【発明者】

【氏名】▲陳▼ 吉▲華▼

(72)【発明者】

【氏名】焦 ▲凱▼

(72)【発明者】

【氏名】沈 敏娟

(72)【発明者】

【氏名】▲馬▼ 雨▲軒▼

(72)【発明者】

【氏名】▲ヤン▼ ▲艦▼▲飛▼

(72)【発明者】

【氏名】万 千千

(72)【発明者】

【氏名】李 ▲ジン▼

【審査官】西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】特表２００９－５１９０５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１９－０４３７９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００５－２３７６３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０３５３６９６５（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１１０６２８７６７（ＣＮ，Ａ）

【文献】長澤寛道，バイオミネラリゼーションの科学，化学と生物，2004年，Vol. 42，pp. 340-345

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ａ６１Ｌ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ハイドロキシアパタイト－コラーゲンの有機無機複合材料を調製するためのコラーゲン線維製品の鉱化のための鉱化剤の使用であって、
前記鉱化剤は、核酸と非晶質リン酸カルシウムナノ粒子の静電吸着により形成された複合体を含み、
前記複合体において、核酸と非晶質リン酸カルシウムナノ粒子は以下の順番：
核酸のリン酸基とナノ粒子のカルシウムイオンとの間の静電吸着、及び
遊離のリン酸イオンと核酸に吸着したカルシウムイオンのさらなる静電吸着、
で形成され、
前記鉱化剤において、カルシウムイオンの濃度は、２～５ｍＭであり、リン酸イオンの濃度は、１～５ｍＭであり、カルシウムイオンとリン酸イオンの濃度の比は、２：１～１：１であり、
前記核酸は、哺乳動物細胞の全ＤＮＡ又は全ＲＮＡから単離され、
ＤＮＡの出発濃度は、７０～２５０ｕｇ／ｍｌであり、又は、ＲＮＡの出発濃度は、１５０～２５０ｕｇ／ｍｌであり、
前記複合体の粒径は、４０～１００ｎｍである、使用。

【請求項2】

前記鉱化剤が、核酸溶液、塩化カルシウム溶液及びリン酸水素二カリウム溶液を混合して形成される、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

鉱化剤中のカルシウムイオンの濃度は、１．６７～３．５ｍＭであり、リン酸イオンの濃度は、１．０～２．１ｍＭである、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項4】

鉱化剤中のカルシウムイオンとリン酸イオンの濃度の比は、１．６７：１である、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項5】

前記複合体の粒径が、４０～６０ｎｍ又は６０～１００ｎｍである、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項6】

前記哺乳動物細胞は、骨細胞前駆細胞、前骨芽細胞、骨細胞、骨形成細胞、破骨細胞又は骨髄間葉系幹細胞である、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項7】

前記哺乳動物細胞は、破骨細胞である、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項8】

前記哺乳動物細胞は、骨細胞である、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項9】

鉱化剤のｐＨ値は、５．５～６．９である、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項10】

鉱化剤のｐＨ値は、６．０～６．５である、請求項９に記載の使用。

【請求項11】

鉱化剤が、液体形態、半固体形態、又は固体形態である、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項12】

鉱化剤が、溶液、コロイド液、ゲル、又は粉末である、請求項１１に記載の使用。

【請求項13】

鉱化剤が、凍結乾燥粉末である、請求項１１に記載の使用。

【請求項14】

コラーゲン線維製品が骨修復材料から選択される、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項15】

コラーゲン線維製品がコラーゲン足場から選択される、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項16】

コラーゲン線維製品がコラーゲン膜及びコラーゲン線維シートから選択される、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項17】

ハイドロキシアパタイト－コラーゲンの有機無機複合材料が、患者における骨関連疾患又は障害を治療し、又は骨の状態を改善するための医薬又は医療機器の製造に用いられる、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項18】

鉱化剤が以下の方法：
（１）、好ましくは哺乳動物細胞から全ＤＮＡ（各種のＤＮＡを含む）又は全ＲＮＡ（各種のＲＮＡを含む）を抽出して、核酸を得るステップと、
（２）、ステップ（１）で得られた核酸を塩化カルシウム溶液と混合するステップと、
（３）、ステップ（２）で得られた混合物にリン酸水素二カリウム溶液を添加することにより、核酸と非晶質リン酸カルシウムナノ粒子とで形成された複合体を得るステップとを含む、ことを特徴とする方法により製造される、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項19】

ステップ（１）で取得された核酸の出発濃度は、１５００～２５００ｎｇ／μｌであり,核酸分子量が４０ｋＤａよりも大きい、請求項１８に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、骨組織工学の分野及び生体材料の分野に関し、具体的には、鉱化コラーゲン複合材料の製造及び使用を含む核酸－リン酸カルシウムナノ粒子複合体の生体模倣型鉱化における使用、及び核酸－リン酸カルシウム複合材料によって介在される遺伝子の高効率トランスフェクション及び伝達に関する。

【背景技術】

【0002】

人体骨組織は、重要な器官として、身体を機械的に支持し保護するだけでなく、体内のミネラル及び酸塩基平衡を維持することができる。しかしながら、腫瘍、創傷、炎症、外科的創面切除などが頻繁に発生するため、患者の骨損失及び骨欠損を引き起こし、さらに、生活の質を劇的に低下させる。したがって、骨組織欠損の修復は、目前に迫っている。現在、従来の自家骨、移植骨、異種骨などの移植技術には、依然として、例えば、二次的な傷害、免疫拒絶などの多くの無視できない問題及び欠陥が存在する。そのため、優れた生物学的及び力学的性能を有し、構造的に天然骨組織のミクロ及びマクロ構造を再現する生体模倣型鉱化人工骨修復材料を求めることは、骨欠損の臨床治療、骨修復の促進に重要な役割を果たすことができる。

【0003】

天然骨組織の階層的構造に基づいて、Ｉ型コラーゲン線維、水及びアパタイトは、骨組織の最も初期の３つの主要成分であると分析する。しかしながら、アパタイト結晶が堆積したＩ型コラーゲン線維は、骨の第２段の階層構造である。したがって、鉱化されたコラーゲン線維をインビトロで再現及び製造すれば、構造的及び性能に天然骨組織を高度に模倣することができ、高度に模倣された骨欠損修復材料である。

【0004】

Ｉ型コラーゲンのインビトロ生体模倣型鉱化は、生物鉱化研究分野の重点の１つである。天然の象牙質基質タンパク質、象牙質シアロリンタンパク質などの非コラーゲン性タンパク質は、より多くの負電荷を有する。したがって、酸性アミノ酸の特性を有し、水相中でヒドロキシアパタイトの核形成を防ぎ、即ち、核形成阻害剤として作用することができ、したがって、水溶液中で非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）ナノ粒子を安定化することができる。その後に、ＡＣＰは、コラーゲン線維の孔領域にさらに浸透し、又は、コラーゲン線維の表面に堆積して、コラーゲン線維のの内外部の鉱化を実現する。しかしながら、天然の生体高分子タンパク質を取得しにくく、インビトロでの合成が複雑であり、価格が高いなどという欠陥は、その使用を制限する。したがって、非コラーゲン性タンパク質類似体、例えば、ポリアスパラギン酸、ポリアクリル酸などのポリアニオン性のポリマーは、生体模倣型鉱化分野において多くの注目を集めている。しかしながら、これらの高分子電解質は、非常に強いアニオン性又はカチオン性を有するため、その残留物は、細胞リン脂質の加水分解、細胞小器官の損傷、さらに、細胞死を引き起こしやすい。そのため、インビボの応用において、生体適合性の問題を考慮する必要がある。そのため、良好な生体適合性を有し、便利に取得可能で、骨組織における骨形成促進タンパク質の高効率発現を促進する非コラーゲン性タンパク質類似体を選択し、且つインビトロにおけるコラーゲン線維の迅速な生体模倣型鉱化に適用することができ、それにより骨組織欠損修復材料を製造し、極めて大きな応用の将来性及び発展可能性を有する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

バイオテクノロジーの発展に伴い、ＲＮＡ、ＤＮＡなどの遺伝情報を有する生体高分子は、沈殿法によって調製されたリン酸カルシウム粒子に付着することができる。しかしながら、該リン酸カルシウム複合体は、非晶質状態を呈するものではなく、生体模倣型鉱化の分野に適用することもできない。しかしながら、ＲＮＡ及びＤＮＡは、アニオン特性を有し、鉱物との間に天然の静電吸着力が存在し、且つ取得しやすい。製造方法を変えれば、コラーゲン線維の生体模倣型鉱化に応用し、新型骨材の開発に全く新しい考え方を提供することができる。

【0006】

従来技術の欠点又は不足に対して、本発明の目的は、核酸－ＡＣＰナノ粒子複合体を形成するために、核酸を利用してカルシウム及びリンを安定化させる、インビトロでの生体模倣型鉱化の概念をインビボでの骨再生誘導の探索に適用することを含む。本発明者らは、初めて、核酸－ＡＣＰナノ粒子でコラーゲンをを誘導して線維の内外部の鉱化を発生させると共に、ＲＮＡ及びＤＮＡの存在で、コラーゲン線維が迅速に鉱化される製造方法を提供する。したがって、ハイドロキシアパタイト－コラーゲンの有機無機複合材料を形成し、骨欠損を修復するための骨材料として使用される。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記目的を達成するために、本発明の採用する技術的解決手段は、以下を含む。

【0008】

本発明の第１の目的によれば、本発明は、それぞれＲＮＡ或ＤＮＡを利用してカルシウムリンを安定化し、それぞれ、ＲＮＡ－ＡＣＰ又はＤＮＡ－ＡＣＰナノ粒子複合体を形成する。主に、以下のステップを含む。

【0009】

（１）ＲＮＡ－ＡＣＰナノ粒子を合成する。

【0010】

まず、マウスＢＭＳＣに対して、細胞初期接種密度が５＊１０＾^４個／ｃｍ^２であり、骨形成誘導及び分化を７－２８日間行い、Ｔｒｉｚｏｌ法で細胞内の全ＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡの出発濃度をマイクロプレートリーダーで検出し、濃度が約１５００～２５００ｎｇ／μｌである。その後、鉱化溶液を調製し、高濃度及び低濃度の等体積の塩化カルシウム二水和物溶液及びリン酸水素二カリウム溶液をそれぞれ調製する。ＲＮＡ中のリン酸基は、負に帯電しているため、静電吸引力により正に帯電しているカルシウムイオンと吸着することができる。そのため、ＲＮＡがまずカルシウムイオンと混合することは、混合物の安定性、及び混合物の吸着効率の向上に有利である。次に、リン酸イオンをさらに添加することは、ＲＮＡに吸着されたカルシウムイオンとの結合に有利であり、それにより、安定な非晶質リン酸カルシウム複合体を形成する。そのため、１００μｌのＲＮＡと、４５０μｌの高濃度、低濃度の塩化カルシウム二水和物溶液とを均一に混合した後、４５０μｌの高濃度、低濃度のリン酸水素二カリウム溶液を、ＲＮＡ－塩化カルシウム二水和物の混合液にゆっくりと滴下する。最終的に、２群の安定で且つ透明な高低濃度のＲＮＡ－ＡＣＰナノ粒子鉱化溶液を合成する。

【0011】

（２）ＤＮＡ－ＡＣＰナノ粒子を合成する。

【0012】

ＤＮＡ－ＡＣＰナノ粒子の合成ステップは、ＲＮＡ－ＡＣＰナノ粒子の合成ステップと同じである。具体的には、Ｔｒｉｚｏｌ法及びキット法で得られたＤＮＡを抽出し、その濃度が７００ｎｇ／μｌよりも大きくしてもよい。その後に、鉱化溶液を調製し、１５０μｌのＤＮＡと、４２５μｌの高濃度、低濃度の塩化カルシウム二水和物溶液とを均一に混合した後、４２５μｌの高濃度、低濃度のリン酸水素二カリウム溶液を、ＤＮＡ－塩化カルシウム二水和物の混合液にゆっくりと滴下する。２群の安定で透明な高濃度、低濃度のＤＮＡ－ＡＣＰナノ粒子鉱化溶液を合成する。

【0013】

好ましくは、ステップ（１）及び（２）で、選択された細胞は、マウスＢＭＳＣ又はＭＣ３Ｔ３であってもよいが、他のタイプの細胞を排除しない。

【0014】

好ましくは、ステップ（１）及び（２）で、細胞の初期接種密度は、５＊１０＾^４から１＊１０＾^５個／ｃｍ^２であり、初期培地は、α－ＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、及び１％の二重抗体を用いて、プレーティング後に２日間培養し、ＢＭＳＣ細胞の状態が良好な場合に、骨形成誘導培地を交換し、２日毎に溶液を交換する。細胞の状態が良好で量が十分なである場合にのみ、抽出されたＲＮＡの出発濃度は、１５００ｎｇ／μｌよりも高い。

【0015】

好ましくは、ステップ（１）及び（２）で、使用される骨形成誘導培地において、配合物として、α－ＭＥＭ、１０％のＦＢＳ、１％の二重抗体、０．１ｕｍｏｌ／ｌのデキサメタゾン、５０ｍｇ／ｌのアスコルビン酸、１０ｍｍｏｌ／ｌのβ－グリセロ燐酸塩二ナトリウムを使用する。

【0016】

好ましくは、ステップ（１）及び（２）で、骨形成誘導及び分化の日数は、７日－１４日である。

【0017】

好ましくは、ステップ（１）及び（２）で、塩化カルシウム二水和物粉末の分子量は、１４７である。単一の高濃度塩化カルシウム二水和物溶液の濃度は、７ｍＭであり、単一の低濃度塩化カルシウム二水和物溶液の濃度は、３．５ｍＭである。リン酸水素二カリウム粉末の分子量は、１７４である。単一の高濃度リン酸水素二カリウム溶液の濃度は、４．２ｍＭであり、単一の低濃度リン酸水素二カリウム溶液の濃度は、２．１ｍＭである。

【0018】

好ましくは、ステップ（１）で、取得された核酸の出発濃度は、１００～５０００ｎｇ／μｌであり、好ましい出発濃度は、５００～５０００ｎｇ／μｌであり、より好ましい出発濃度は、１０００～３０００ｎｇ／μｌであり、例えば、１５００～２５００ｎｇ／μｌである。最終的に、ＲＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液では、ＲＮＡの作用濃度は、１５０ｕｇ／ｍｌよりも大きくしてもよい。

【0019】

好ましくは、ステップ（２）では、得られた核酸の出発濃度は、１００～５０００ｎｇ／μｌであり、好ましい出発濃度は、５００～５０００ｎｇ／μｌであり、より好ましい出発濃度は、７００～３０００ｎｇ／μｌであり、より好ましい出発濃度は、７００～１５００ｎｇ／μｌであり、例えば、１０００ｎｇ／μｌである。最終的に、ＤＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液では、ＤＮＡの作用濃度は、１５０ｕｇ／ｍｌよりも大きくしてもよい。

【0020】

好ましくは、ステップ（１）で、最終的な２群の高低濃度のＲＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液は、ｐＨ値が約６．０～６．５であり、比較的に良好な安定性を有し、透明であり、沈殿がなく、４℃で３日間保存することができ、ＲＮＡが分解されない。

【0021】

好ましくは、ステップ（２）で、最終的な２群の高低濃度のＤＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液は、ｐＨ値が約６．０～６．５であり、比較的に良好な安定性を有し、透明であり、沈殿がなく、４℃で長期間保存することができ、ＤＮＡが分解されない。

【0022】

好ましくは、ステップ（１）で、ＲＮＡ－ＡＣＰナノ粒子は、平均粒径の範囲が４０～６０ｎｍであり、非晶質状態の結晶形態で回折される。

【0023】

好ましくは、ステップ（２）で、ＤＮＡ－ＡＣＰナノ粒子は、平均粒径の範囲が６０～１００ｎｍであり、結晶が非晶質状態である。

【0024】

好ましくは、ステップ（１）及び（２）における高濃度のカルシウムリン鉱化溶液の最終濃度は、３．５：２．１ｍＭであり、低濃度のカルシウムリン鉱化溶液の最終濃度は、１．６７：１ｍＭである。

【0025】

本発明の第２の目的によれば、本発明は、ＲＮＡ－ＡＣＰナノ粒子及びＤＮＡ－ＡＣＰナノ粒子をそれぞれ利用してコラーゲン線維の内外部の鉱化を誘導する。主に、以下のステップを含む。

【0026】

（１）自己組織化コラーゲン線維を調製する。

【0027】

ラット尾腱に由来するコラーゲン／酢酸溶液（５ｍｇ／ｍｌ）に対して、正逆透析法で、３７℃の環境でコラーゲン自己組織化を完了し、炭素担持支持膜の金属網に置く。架橋技術により、自己組織化コラーゲン線維の調製を完了する。

【0028】

（２）鉱化溶液－コラーゲンの鉱化方法

【0029】

前記核酸－ＡＣＰナノ粒子鉱化溶液を、ＥＰチューブキャップ内に約４５０μｌ滴下し、均一な球形を形成する。その後、コラーゲン線維を担持したニッケル／金網の前面を鉱化溶液に接触させ、５日間鉱化する。

【0030】

好ましくは、ステップ（１）で、炭素担持支持膜の網に滴下し、該網は、ニッケル網及び金網であってもよい。銅網は、液滴の乾燥揮発過程において、不安定であり、実験結果に影響を与える可能性がある。

【0031】

好ましくは、ステップ（１）で、コラーゲンタンパク質溶液は、菌を生じやすいため、調製過程で、防菌に厳密に注意する。

【0032】

好ましくは、ステップ（１）で、選択された材料は、ラットのＩ型マウス尾腱由来のコラーゲン／酢酸溶液、自己組織化を完了したマウス尾腱、自己組織化を完了した３Ｄコラーゲン足場、コラーゲン膜、脱灰骨組織、脱灰象牙質シートなどであってもよい。

【0033】

好ましくは、ステップ（２）で、コラーゲン線維は、ニッケル／金網の正面に置く必要があり、鉱化過程で、コラーゲンが鉱化溶液に均一に接触する。

【0034】

本発明の第３の目的によれば、本発明の製造方法で得られるコラーゲン線維鉱化材料は、硬組織欠損修復材料とすることができ、且つそれを骨組織工学に応用することができる。

【発明の効果】

【0035】

本発明は、他の非コラーゲン性タンパク質／非コラーゲン性タンパク質類似体の安定したリン酸カルシウムナノ粒子がコラーゲン線維のインビトロ生体模倣型鉱化を誘導することに比べ、以下の利点を有する。

【0036】

第一に、インビトロ生体模倣型鉱化の分野において、非コラーゲン性タンパク質／非コラーゲン性タンパク質類似体は、いずれもＡＣＰを安定化させ、且つＡＣＰをコラーゲン線維の内部に入るように誘導し、コラーゲン線維の内部の鉱化を完了する。しかしながら、非コラーゲン性タンパク質は、一般的に、組織又は細胞から直接抽出されにくく、且つインビトロ合成過程で操作が極めて煩雑であり、高価であり、後続の研究に不利である。したがって、ポリアニオン化合物又はポリカチオン化合物などの多くの非コラーゲン性タンパク質類似体が注目され、コラーゲンの生体模倣型線維の内部の鉱化を研究するために使用されている。しかしながら、コラーゲン線維骨格修復材料は、一定の機械的強度及び硬度を有することに加えて、良好な生体適合性、非毒性、及び低い免疫原性を有する必要がある。しかしながら、非コラーゲン性タンパク質類似体、例えば、ポリカチオンは、リン脂質膜の穿孔を引き起こし、細胞小器官の損傷を引き起こし、最後に細胞の死を引き起こし、より大きな毒性を有する。同時に、ポリアニオン中に遊離した大量の高濃度のカルボキシル基も、細胞に傷害を与えることができるため、その使用が制限される。例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡのような遺伝情報を有する生体高分子は、細胞自体に由来し、免疫原性が低く、毒性が低く、生体適合性に優れるなどという特徴を有するだけでなく、細胞トランスフェクションに広く応用され、且つ天然のタンパク質に比べて取得しやすく、アニオン特性を有し、カルシウムイオンとの間に天然の静電吸引力を生じることができる。そのため、それは、リン酸カルシウムの安定化剤及び線維の内部鉱化誘導剤として、応用上、優れた利点を有する。

【0037】

第二に、核酸－ＡＣＰは、コラーゲン線維の内外部の鉱化を実現し、ハイドロキシアパタイトは、コラーゲン線維内に規則的な堆積を実現するだけでなく、コラーゲン線維の表面に付着し、コラーゲン線維の内外部の同期鉱化を実現する。これは、さらに、天然骨組織の表面形状、組成成分、階層的ミクロ構造、機械的性能等の方面を模倣し、上記生体材料の全ての要件を満たす。したがって、理想的で、生体模倣型の骨欠損再生修復材料である。

【0038】

第三に、核酸－ＡＣＰでコラーゲン線維の内部の鉱化を誘導する効率が高く、周期が短く、５－６時間に広範囲の線維の内部の鉱化を完了することができ、鉱化コラーゲン材料の製造に迅速で効率的な特徴を有し、後期に臨床的転換を満たすことができる。

【0039】

第四に、核酸とコラーゲン線維との間に吸引力が存在し、コラーゲン、非コラーゲン性タンパク質（核酸）、ミネラルという３者の間の相互作用関係を高程度に模倣し、そのため、鉱化モードの生体模倣、インビボに実際のインビボのコラーゲン線維の内部の鉱化メカニズムを究明するために重要な考え方を提供する。

【0040】

第五に、核酸－ＡＣＰナノ粒子複合体では、ＲＮＡ、ＤＮＡ構造が安定し、長期間分解されにくい。そのため、骨形成促進表現の関連遺伝子を添加することができ、コラーゲン線維の生体模倣型鉱化を完了すると共に、細胞トランスフェクションを実現し、トランスフェクション効率を向上させ、骨欠損における骨形成促進タンパク質の発現を制御及び維持し、さらに、骨形成分化及び骨再生を促進する。そのため、核酸－ＡＣＰナノ粒子複合体で製造されたトランスフェクション－鉱化で二重調整されたコラーゲン複合足場は、欠損空間で足場の支持作用を果たし、欠損領域に良好な機械的性能を付与し、良好な細胞微小環境を作り、細胞の成長に有利であると共に、骨形成を促進する関連遺伝子を細胞の内部に持続的に送達することができる。したがって、骨疾患、骨損傷、骨損失及び骨障害の治療又は予防に広く活用することができ、骨再生、骨分化を誘導又は増強し、骨欠損の修復を促進することもできる。

【0041】

一態様では、本発明は、核酸と非晶質リン酸カルシウムナノ粒子とで形成された複合体（「核酸－非晶質リン酸カルシウムナノ粒子複合体」、「ＲＮＡ又はＤＮＡ－ＡＣＰナノ粒子複合体」、「核酸－ＡＣＰナノ粒子複合体」、「ＲＮＡ／ＤＮＡ－ＡＣＰナノ粒子複合体」、「ＲＮＡ／ＤＮＡ－ＡＣＰナノ粒子」又は「核酸－ＡＣＰ」とも呼ばれ、これらは、互換的に使用されてもよい）に関する。一態様では、核酸は、静電吸着によって非晶質リン酸カルシウムナノ粒子と複合体を形成する。一態様では、本発明は、生体模倣型鉱化における生物鉱化剤とする前記複合体の使用に関する。例えば、前記複合体又は鉱化剤は、コラーゲン線維、例えば、骨、歯、又は象牙質のコラーゲン線維を鉱化するために使用される。前記骨又は歯は、患者の骨又は歯、又はインビトロの骨又は歯の材料であってもよい。一態様では、本発明の生物鉱化剤は、骨、歯、又は象牙質のコラーゲン線維を鉱化するための組成物などの組み合わせ形態であってもよい。

【0042】

一態様では、本発明は、核酸と非晶質リン酸カルシウムナノ粒子で形成された複合体を含む生物鉱化剤に関する。複合体において、前記核酸は、静電吸着によって非晶質リン酸カルシウムナノ粒子と共に複合体を形成する。例えば、核酸のリン酸基とナノ粒子のカルシウムイオンとの間の静電吸着、及び遊離のリン酸イオンと核酸に吸着したカルシウムイオンのさらなる静電吸着により複合体を形成する。

【0043】

一態様では、本発明の生物鉱化剤は、核酸溶液、塩化カルシウム溶液、及びリン酸水素二カリウムの溶液を混合することによって形成される。

【0044】

本発明の生物鉱化剤において、カルシウムイオンの濃度は、０．１～１００ｍＭであり、好ましくは、０．５～５０ｍＭであり、より好ましくは、１～１０ｍＭであり、より好ましくは、２～５ｍＭであり、より好ましくは、１．６７～３．５ｍＭである。例えば、カルシウムイオンの濃度は、１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、又は７ｍＭであってもよい。本発明の生物鉱化剤において、リン酸イオンの濃度は、０．１～１００ｍＭであり、好ましくは、０．２～５０ｍＭであり、好ましくは、０．５～１０ｍＭであり、より好ましくは、１～５ｍＭであり、より好ましくは、１．０～２．１ｍＭであってもよい。例えば、リン酸イオンの濃度は、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．８ｍＭ、１．０ｍＭ、１．２ｍＭ、１．５ｍＭ、２．１ｍＭ、又は、４．２ｍＭであってもよい。これらの特徴は、本発明の生物鉱化剤の製造方法に適用される。

【0045】

本発明の生物鉱化剤において、カルシウムイオンとリン酸イオンの比は、１０：１～１：５であり、好ましくは、５：１～１：３であり、好ましくは、３．５：１～１：１．２５であり、より好ましくは、２：１～１：１であり、例えば、１．６７：１である。例えば、カルシウムイオンとリン酸イオンの比は、１０：１、８：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１．９：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．２：１、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．９、１：２、１：３又は１：４である。これらの特徴は、本発明の生物鉱化剤の製造方法に適用される。

【0046】

本発明の生物鉱化剤において、核酸と非晶質リン酸カルシウムナノ粒子とで形成された複合体の粒径は、１～１００ｎｍ、好ましくは、１０～１００ｎｍ、より好ましくは、２０～１００ｎｍ、例えば、４０～６０ｎｍ又は６０～１００ｎｍである。例えば、粒径は、５ｎｍ、３０ｎｍ、５０ｎｍ、７０ｎｍ、又は８０ｎｍであってもよい。これらの粒径範囲は、ＤＮＡ又はＲＮＡで形成される複合体に適用される。

【0047】

一態様では、本発明の前記核酸は、ＲＮＡであってもよい。一態様では、本発明の前記核酸は、ＤＮＡであってもよい。別の態様では、核酸は、哺乳動物細胞から単離された全ＤＮＡ又は全ＲＮＡ又はプラスミドＤＮＡである。別の態様では、核酸は、骨形成分化を促進し及び／又は骨再生を促進する核酸を含む。一態様では、核酸は、ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－２６ａ又はｍｉＲ－１４８ｂ又はＢＭＰ２－プラスミドＤＮＡから選択される。この態様では、哺乳動物細胞は、骨細胞前駆細胞、前骨芽細胞（例えば、ＭＣ３Ｔ３）、骨髄間葉系幹細胞（例えば、ＢＭＳＣ）、骨細胞、骨形成細胞、骨芽細胞、破骨細胞から選択されてもよい。好ましくは、核酸は、前骨芽細胞系又は骨髄間葉系幹細胞系から単離された全ＤＮＡ又は全ＲＮＡである。この態様では、哺乳動物細胞は、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ、又はサルに由来する細胞であってもよい。一例では、哺乳動物細胞は、マウスの前骨芽細胞又はマウスの骨髄間葉系幹細胞である。プラスミドＤＮＡは、大腸菌などの菌種に由来してもよい。

【0048】

本発明の生物鉱化剤において、核酸の作用濃度は、２０～８００ｕｇ／ｍｌであり、より好ましくは、５０～７００ｕｇ／ｍｌであり、より好ましくは、８０～６００ｕｇ／ｍｌであり、好ましくは、１００～５００ｕｇ／ｍｌであり、より好ましくは、１５０～３００ｕｇ／ｍｌであり、例えば、１６０～２５０ｕｇ／ｍｌ、又は、１５０ｕｇ／ｍｌである。これらの核酸の濃度は、ＤＮＡ又はＲＮＡに適している。

【0049】

核酸の出発濃度は、１００～５０００ｎｇ／μｌであり、好ましい出発濃度は、５００～５０００ｎｇ／μｌであり、より好ましい出発濃度は、１０００～３０００ｎｇ／μｌである。これらの核酸の濃度は、ＤＮＡ又はＲＮＡに適している。例えば、核酸の作用濃度は、好ましくは、７０～１５０ｕｇ／ｍｌ（ＤＮＡに適する）であり、作業濃度は、好ましくは、１５０～２５０ｕｇ／ｍｌ（ＲＮＡに適している）である。本発明の生物鉱化剤において、生物鉱化剤のｐＨは、５．５～７であり、好ましくは、６．０～６．５である。ｐＨは、例えば、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、又は６．９である。

【0050】

一態様では、本発明の生物鉱化剤は、例えば、溶液又はコロイド液のような液体形態、ゲルなどの半固体形態、粉末又は凍結乾燥粉末のような固体形態であってもよい。本発明の生物鉱化剤は、好ましくは、液体形態であり、より好ましくは、溶液形態である。別の態様では、本発明の生物鉱化剤は、凍結乾燥粉末であってもよい。前記生物鉱化剤は、また、生理学的に許容される補助材料又は添加剤、好ましくは、コラーゲン線維の鉱化に寄与する補助材料又は添加剤を含んでもよい。液体形態では、前記生物鉱化剤は、水などの溶媒又は溶剤をさらに含んでもよい。これらの補助材料、添加剤又は溶媒は、当業者に周知である。

【0051】

一態様では、本発明は、本発明の生物鉱化剤を含み、又は本発明の生物鉱化剤で処理された鉱化されたコラーゲン線維製品に関する。鉱化されたコラーゲン線維製品は、例えば、患者へ埋め込むための医療機器であってもよい。一態様では、鉱化されたコラーゲン線維製品は、コラーゲン足場（又は３Ｄコラーゲン足場）、コラーゲン膜、コラーゲン線維シート（又は２Ｄコラーゲン足場）、脱灰骨組織、脱灰象牙質スライス、又はマウス尾部から選択されてもよいか、又はそれらを含んでもよい。一態様では、鉱化されたコラーゲン線維製品は、歯又は骨修復材料、歯又は骨足場材料、歯又は骨再生材料、又は歯又は骨埋め込み材料から選択される。

【0052】

一態様では、本発明の前記コラーゲン線維は、骨コラーゲン線維であり、好ましくは、Ｉ型コラーゲン線維である。一態様では、本発明の生物鉱化剤は、コラーゲン線維、例えば、コラーゲン線維を鉱化するために使用される。一態様では、本発明の生物鉱化剤は、コラーゲン線維製品を鉱化するために用いられる。鉱化プロセスは、患者のインビトロ又はインビボで行われてもよい。

【0053】

一態様では、患者は、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ、又はサルであってもよく、好ましくは、ヒトである。

【0054】

一態様では、本発明は、患者の骨関連疾患又は障害を治療し、又は骨の状態を改善するための医薬又は医療機器の製造における、生物鉱化剤又は鉱化されたコラーゲン線維製品の使用に関する。別の態様では、本発明は、患者の骨関連疾患又は障害を治療し、又は骨の状態を改善するための生物鉱化剤又は鉱化されたコラーゲン線維製品に関する。別の態様では、本発明は、それを必要とする患者の骨関連疾患又は障害を治療し、又は骨の状態を改善する方法に関し、前記方法は、患者に、治療有効量の本発明の鉱化剤又は鉱化されたコラーゲン線維製品を投与することを含む。治療有効量は、実際の状況に応じて当業者によって決定されてもよい。

【0055】

一態様では、本発明で製造された医薬は、骨欠損又は骨損失を治療し、又は骨修復、骨分化又は骨再生を促進するために用いられる。別の態様では、本発明の生物鉱化剤又は鉱化されたコラーゲン線維製品は、骨欠損又は骨損失を治療し、又は骨修復、骨分化又は骨再生を促進するために用いられる。別の態様では、本発明は、それを必要とする患者の骨欠損又は骨損失を治療し、又は骨修復、骨分化又は骨再生を促進する方法に関し、前記方法は、患者に、治療有効量の本発明の生物鉱化剤又は鉱化されたコラーゲン線維製品を投与することを含む。

【0056】

一態様では、本発明は、患者のコラーゲン線維を鉱化するための医薬の製造における生物鉱化剤の使用に関する。別の態様では、本発明は、患者のコラーゲン線維を鉱化するための生物鉱化剤に関する。一態様では、本発明は、患者のコラーゲン線維を鉱化する方法に関し、前記方法は、患者に、治療有効量の本発明の鉱化剤を投与することを含む。

【0057】

一態様では、本発明は、生物鉱化剤を製造するための方法に関し、前記方法は、（１）、核酸を得るステップと、（２）、ステップ（１）で得られた核酸を塩化カルシウム溶液と混合するステップと、（３）、ステップ（２）で得られた混合物にリン酸水素二カリウム溶液を添加することにより、核酸と非晶質リン酸カルシウムナノ粒子とで形成された複合体を得るステップとを含む。該方法のステップ（１）では、全ＤＮＡ又は全ＲＮＡ又はプラスミドＤＮＡを哺乳動物細胞から抽出することができる。一態様では、ステップ（１）で得られる核酸は、好ましい出発濃度が、７００～１０００ｎｇ／μｌ（ＤＮＡ）、１５００～２５００ｎｇ／μｌ（ＲＮＡ）である。例えば、核酸の出発濃度は、７００ｎｇ／μｌ、１０００ｎｇ／μｌ、１６００ｎｇ／μｌ、１７００ｎｇ／μｌ、１８００ｎｇ／μｌ、１９００ｎｇ／μｌ、２０００ｎｇ／μｌ又は２５００ｎｇ／μｌであってもよい。一態様では、ステップ（１）で得られるＲＮＡの出発濃度は、１４００～２５００ｎｇ／μｌであり、好ましい出発濃度は、１５００～２５００ｎｇ／μｌである。一態様では、ステップ（１）で得られるＤＮＡの出発濃度は、７００ｎｇ／μｌより大きくしてもよく、１０００ｎｇ／μｌが最適である。前記方法では、ステップ（３）におけるカルシウムイオンの濃度は、１～１０ｍＭであり、好ましくは、２～５ｍＭであり、より好ましくは、１．６７～３．５ｍＭである。前記方法では、ステップ（３）におけるリン酸イオンの濃度は、０．５～１０ｍＭであり、好ましくは、１～５ｍＭであり、より好ましくは、１．０～２．１ｍＭである。前記方法では、カルシウムイオンとリン酸イオンの比は、１０：１～１：５であり、好ましくは、５：１～１：３であり、好ましくは、３．５：１～１：１．２５であり、より好ましくは、２：１～１：１であり、好ましくは、５：３又は１．６７：１である。

【0058】

一態様では、本発明は、コラーゲン線維の生体模倣型鉱化を誘導する方法に関する。別の態様では、本発明は、鉱化されたコラーゲン線維製品を製造する方法に関する。前記方法は、本発明の生物鉱化剤を、コラーゲン線維又はコラーゲン線維を含む製品と、例えば溶液中で接触させることを含む。この態様では、本発明の生物鉱化剤は、コラーゲン線維と溶液中で混合される。接触時間又は鉱化時間は、０．５時間を超えてもよく、例えば、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２４時間、少なくとも３０時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、又は少なくとも７２時間であってもよい。接触時間又は鉱化時間は、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１５日間、少なくとも２０日間、少なくとも２５日間、少なくとも３０日間であってもよい。例えば、接触時間又は鉱化時間は、１～１０日間であってもよく、好ましくは、２～８日間であり、より好ましくは、３～７日間であり、より好ましくは、４～６日間、例えば５日間である。一態様では、５時間接触した後に、完全な鉱化を実現する。一態様では、本発明は、ＲＮＡと非晶質リン酸カルシウムナノ粒子とで形成された複合体を製造する方法に関する。本発明の方法は、（１）、ＲＮＡを抽出するステップと、（２）、得られたＲＮＡを塩化カルシウム溶液と混合するステップと、（３）、ＲＮＡ－塩化カルシウム混合液をリン酸水素二カリウム溶液と混合することにより、ＲＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液を得るステップとを含んでもよい。一態様では、Ｔｒｉｚｏｌ法でＲＮＡを抽出する。抽出されたＲＮＡの出発濃度は、１５００～２５００ｎｇ／μｌであってもよい。一態様では、カルシウムイオンは、静電吸引力によってＲＮＡの負に帯電したリン酸基に吸着される。一態様では、溶液中のリン酸は、ＲＮＡ上のカルシウムイオンとさらに静電吸着される。得られたＲＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液は、透明であってもよい。

【0059】

一態様では、ＲＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液中において、カルシウムイオン又はカルシウムの濃度は、１．６７～３．５ｍＭであり、リン酸イオン又はリン酸の濃度は、１．０～２．１ｍＭである。一態様では、カルシウムイオンとリン酸イオンの比は、５：３又は１．６７：１である。

【0060】

一態様では、抽出されたＲＮＡは、哺乳動物細胞の全ＲＮＡ、例えば、マウス前骨芽細胞系（ＭＣ３Ｔ３）又はマウス骨髄間葉系幹細胞系（ＢＭＳＣ）に由来する全ＲＮＡである。一態様では、ＲＮＡは、ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－１４８ｂなどの、骨形成分化を促進し、及び／又は骨再生を促進するＲＮＡを含む。

【0061】

一態様では、ＲＮＡの出発濃度は、１５００～２５００ｎｇ／μｌである。最終的なＲＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液では、ＲＮＡの作用濃度は、１５０～２５０ｕｇ／ｍｌであってもよい。

【0062】

本発明のＲＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液は、透明であり、沈殿がなく、４℃で三日間保存することができ、ＲＮＡは分解されず、比較的良好な安定性を有し、ｐＨ値は、約６．０～６．５である。

【0063】

一態様では、ＲＮＡ－ＡＣＰナノ粒子は、粒径が４０～６０ｎｍである。本発明のナノ粒子は、非晶質状態又は非晶形である。

【0064】

一態様では、本発明は、ＤＮＡと非晶質リン酸カルシウムナノ粒子とで形成された複合体を製造する方法に関する。本発明の方法は、（１）、ＤＮＡを抽出するステップと、（２）、得られたＤＮＡを塩化カルシウム溶液と混合するステップと、（３）、ＤＮＡ－塩化カルシウム混合液をリン酸水素二カリウム溶液と混合することにより、ＤＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液を得るステップとを含んでもよい。一態様では、Ｔｒｉｚｏｌ法又はキット法でＤＮＡを抽出する。抽出物のＤＮＡの出発濃度は、７００ｎｇ／μｌよりも大きくしてもよい。一態様では、カルシウムイオンは、静電吸引力によってＤＮＡの負に帯電したリン酸基に吸着される。一態様では、溶液中のリン酸は、ＤＮＡ上のカルシウムイオンとさらに静電吸着される。得られたＤＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液は、透明であってもよい。

【0065】

一態様では、ＤＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液では、カルシウムイオンの濃度は、１．６７～３．５ｍＭであり、リン酸イオンの濃度は、１．０～２．１ｍＭである。一態様では、カルシウムイオンとリン酸イオンの比は、５：３又は１．６７：１である。

【0066】

一態様では、抽出されたＤＮＡは、哺乳動物細胞の全ＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ、例えば、マウス前骨芽細胞系（ＭＣ３Ｔ３）又はマウス骨髄間葉系幹細胞系（ＢＭＳＣ）に由来する全ＤＮＡ又は大腸菌プラスミドＤＮＡである。一態様では、ＤＮＡは、骨形成分化を促進し、及び／又は骨再生を促進するＤＮＡを含む。

【0067】

一態様では、ＤＮＡの最適な出発濃度は、１０００ｎｇ／μｌである。最終的なＤＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液では、ＤＮＡの作用濃度は、１５０ｕｇ／ｍｌよりも大きくしてもよい。

【0068】

本発明のＤＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液は、透明であり、沈殿がなく、４℃で長期間保存することができ、ＤＮＡは分解されず、比較的良好な安定性を有し、ｐＨ値は、約６．０～６．５である。

【0069】

一態様では、ＤＮＡ－ＡＣＰナノ粒子は、粒径が６０～１００ｎｍである。本発明のナノ粒子は、非晶質状態又は非晶形で回折する。

【0070】

一態様では、本発明は、核酸－ＡＣＰナノ粒子を用いてコラーゲン線維の生体模倣型鉱化を誘導する方法に関する。前記方法は、コラーゲン線維を本発明の生物鉱化剤と接触させることを含んでもよい。一態様では、前記方法は、本発明の生物鉱化剤をコラーゲン線維と溶液中で混合することを含んでもよい。

【0071】

一態様では、鉱化可能なコラーゲン線維は、３Ｄコラーゲン足場、コラーゲン膜、２Ｄコラーゲン線維、脱灰骨組織、脱灰象牙質スライス、マウス尾部などを含む。

【0072】

一態様では、ＲＮＡ又はＤＮＡ－ＡＣＰナノ粒子は、コラーゲンを媒介して急速な線維の内部の鉱化を発生させる。コラーゲンを３時間浸漬すれば、線維の内部の鉱化を観察することができる。６時間浸漬すると、大面積のコラーゲン線維の内部の鉱化を観察することができ、線維内の結晶は、コラーゲンＣ軸に沿って規則的に配列される。

【0073】

一態様では、鉱物（例えば、ナノ粒子）は、コラーゲン線維の表面及び内部に堆積して、コラーゲン線維の内部の鉱化及び線維の外部の鉱化を完了することができる。鉱化モードは、核酸とコラーゲン線維表面が接着及び／又は吸引を発生させることであってもよい。

【0074】

一態様では、核酸－ＡＣＰナノ粒子コラーゲンによって媒介される線維の内部及び線維の外部のコラーゲンを鉱化する。ミクロ構造において、本発明の鉱化コラーゲンは、マウスの大腿骨においてインビボで鉱化されたコラーゲン線維に非常に類似している。

【0075】

一態様では、ＲＮＡ又はＤＮＡ－ＡＣＰナノ粒子は、コラーゲンを誘導して線維の内外部の鉱化を発生させる。鉱化コラーゲン複合材料は、骨欠損の修復、骨分化の促進及び骨再生の強化に用いることができる。

【0076】

一態様では、ＲＮＡ又はＤＮＡ－ＡＣＰナノ粒子は、コラーゲンを誘導して生体模倣型鉱化を発生させると共に、骨形成促進表現の関連遺伝子の細胞内部への持続送達を可能にする。本発明の核酸と非晶質リン酸カルシウムナノ粒子との複合体は、ＲＮＡ又はＤＮＡの送達システムとして機能してもよい。前記送達システムは、細胞トランスフェクションに用いることができ、骨欠損における骨形成促進タンパク質の発現を制御及び維持し、さらに、骨形成分化及び骨再生を促進する。

【0077】

一態様では、ＲＮＡ又はＤＮＡ－ＡＣＰナノ粒子複合体でトランスフェクション－鉱化で二重調整されたコラーゲン複合足場を製造する。本発明の製品、足場、又は複合体は、骨疾患、骨損傷、骨損失、及び骨障害を治療又は予防し、又は骨再生、骨分化を誘導又は強化し、骨欠損の修復を促進するために用いられる。

【図面の簡単な説明】

【0078】

【図1】低濃度でのＲＮＡ－ＡＣＰナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真である。ａ、右上隅には、ＲＮＡ－ＡＣＰナノ粒子の制限視野電子回折像がある。ｃ～ｆ、それぞれ、酸素元素、カルシウム元素、リン元素、及び窒素元素の元素分布画像である。ｂ、以上の４種類の元素の分布合成図である。

【図2】低濃度でのリン酸カルシウムの電位及び粒径分布である。ａ、ｂは、それぞれ安定化剤が添加されない単純カルシウムリン混合液の電位状況及び粒径分布である。ｃ、ｄは、ＲＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液の電位状況及び粒径分布である。ｅ、ｆは、ＤＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液の電位状況及び粒径分布である。

【図3】フーリエ変換赤外線分光図である。上から順に低濃度のハイドロキシアパタイト凍結乾燥粉末、低濃度のＤＮＡ－ＡＣＰ凍結乾燥粉末及び低濃度のＲＮＡ－ＡＣＰ凍結乾燥粉末の赤外線スペクトルである。

【図4】コラーゲン線維の透過型電子顕微鏡画像である。ａ、コラーゲン線維は、低濃度のＲＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液で５日間鉱化され、コラーゲン線維の内部及び外部の両方に鉱物が堆積する。ｂ、コラーゲン線維は、低濃度のＤＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液で５日間鉱化され、コラーゲン線維は、内外部の鉱化を完了する。

【図5】コラーゲン線維足場の走査型電子顕微鏡画像である。ａ、４ヶ月齢のマウスの大腿骨における鉱化されたコラーゲン線維の表面トポグラフィーである。ｂ、純粋なコラーゲン線維足場は、低濃度のＲＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液で５日間鉱化された表面トポグラフィーである。コラーゲン線維の内部及び表面の両方に鉱物が堆積する。

【図6】低濃度のＲＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液でコラーゲン線維を５時間鉱化した走査型電子顕微鏡画像である。ａ、暗視野で、コラーゲン線維の内部のリン酸カルシウムが規則的に堆積し、コラーゲン線維の内部の鉱化を完了する。ｂ、左下隅には、リン酸カルシウムがコラーゲンのＣ軸に沿って整列したヒドロキシアパタイト結晶に変換されたことを示す制限視野電子回折像がある。ｃ、ｄは、それぞれ、カルシウム元素及びリン元素の元素分布画像である。

【図7】ルテニウムレッドで染色したコラーゲン線維の透過型電子顕微鏡画像である。ａ、純粋なコラーゲン線維を純粋なＲＮＡ（２００ｕｇ／ｍｌ）と共に４８時間インキュベートした後、洗浄し、ルテニウムレッドで染色する。ｂ、純粋なコラーゲン線維を、酵素フリー水と共に４８時間インキュベートした後、洗浄し、ルテニウムレッドで染色する。

【発明を実施するための形態】

【0079】

本発明は、細胞におけるアニオン性を有するＲＮＡ及びＤＮＡ生体高分子を抽出し、且つ生体模倣型鉱化技術をインビトロに応用することにより、リン酸カルシウム鉱物を安定化し、それにより核酸－ＡＣＰナノ粒子複合体を製造する。また、核酸は、コラーゲン線維の鉱化誘導剤として、ＡＣＰをそれぞれコラーゲン線維の内部に入れ、コラーゲン線維の間に沈積させ、それにより、コラーゲン線維の内外部の生体模倣型鉱化を完了する。次に、生体適合性に優れ、免疫原性が低く、鉱化速度が速く、機械的強度が高いハイドロキシアパタイト－コラーゲン有機／無機複合材料を製造し、それにより骨組織欠損修復に独特で効率的な解決手段を提供する。

【0080】

以下、発明者が提供する具体的な実施例であり、本発明の技術的解決手段をさらに説明する。

【実施例】

【0081】

実施例１：

【0082】

（１）マウスＢＭＳＣ細胞をＴ７５に接種し、初期プレーティング密度を５＊１０＾^４個／ｃｍ^２とし、１０％のＦＢＳを含有するαＭＥＭ培地で２日間培養した。細胞状態が良好であり、且つ融合度が約７０－８０％であると、骨形成誘導培地に加え、２－３日ごとに液体を交換した。

【0083】

（２）骨形成誘導分化を７日間行った後、細胞の成長状態が良好である場合、Ｔｒｉｚｏｌ法で細胞内の全ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡが非常に分解されやすいため、低温で、氷上で行い、用いるツールに酵素処理が不要であるように注意する。最終的に得られたＲＮＡ沈殿を酵素フリー水で溶解した。

【0084】

（３）マイクロプレートリーダーを用いて各ＥＰチューブにおけるＲＮＡ溶液の濃度を検出し、出発濃度が１５００ｎｇ／μｌ以上であるＲＮＡ溶液を選択し、混合することにより、約１６００～２５００ｎｇ／μｌの１ｍｌの高濃度のＲＮＡ溶液を得た。

【0085】

（４）２本の１５ｍｌの遠心管に等量の酵素フリー水をそれぞれ添加し、塩化カルシウム二水和物粉末（分子量が１４７）でそれぞれ濃度が７ｍＭと３．５ｍＭのカルシウムイオン含有溶液を調製した。

【0086】

（５）２本の１５ｍｌの遠心管にそれぞれ等量の酵素フリー水を添加し、リン酸水素二カリウム粉末（分子量が１７４）でそれぞれ濃度が４．２ｍＭと２．１ｍＭのリン酸イオン含有溶液を調製した。本実験に用いられる試薬を調製するための溶液は、いずれも酵素フリー水であった。

【0087】

（６）１００μｌのＲＮＡを７ｍＭの塩化カルシウム二水和物（４５０μｌ）と混合し、次に、等体積の４．２ｍＭのリン酸水素二カリウム（４５０μｌ）をゆっくりと滴下した。最終的なカルシウムリン濃度が３．５：２．１である高濃度のＲＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液を調製した。同様に、１００μｌのＲＮＡを、３．５ｍＭの塩化カルシウム二水和物（４５０μｌ）と混合し、次に、等体積の２．１ｍＭのリン酸水素二カリウム溶液（４５０μｌ）をゆっくりと滴下した。最終的なカルシウムリン濃度が約１．６７：１である低濃度のＲＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液を調製した。

【0088】

（７）ラットの尾腱に由来するコラーゲン／酢酸（８ｍｇ／ｍＬ）溶液を透析バッグに入れ、透析バッグを締めた。

【0089】

（８）リン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を外部に置いた。３７℃の環境で、透析液を１２時間ごとに交換した。

【0090】

（９）７２ｈ後に、コラーゲン線維の自己組織化を完了した後、自己組織化完了後のコラーゲン線維に対するリン酸イオンの影響を低減するために、ＰＢＳ透析液を脱イオン水（ｐＨ７．４）に置き換え、逆透析を行った。

【0091】

（１０）４８ｈ後、透析バッグにおけるコラーゲンタンパク質溶液（８ｍｇ／ｍＬ）の適量を、ピペットで４００メッシュまで滴下して炭素支持膜のニッケル／金網に覆い、正面を上向きにし、室温で乾燥させた。

【0092】

（１１）コラーゲン線維を、０．３Ｍの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）／０．０６Ｍ及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）溶液で４時間架橋し、脱イオン水で３回洗浄した後、室温で乾燥させて使用に備えた。

【0093】

（１２）前記核酸－ＡＣＰナノ粒子鉱化溶液を、ＥＰチューブキャップ内に約４５０uｌ滴下し、均一な球形を形成した。

【0094】

（１３）コラーゲン線維を置いたニッケル／金網の前面を鉱化溶液に接触させ、５日間鉱化した。

【0095】

好ましい解決手段において、選択された鉱化基質は、ラットのＩ型マウス尾腱に由来するコラーゲン／酢酸溶液、自己組織化を完了したマウス尾腱、自己組織化を完了した３Ｄコラーゲン足場、コラーゲン膜、脱灰骨組織、脱灰象牙質シートなどであってもよい。

【0096】

実施例２：

【0097】

該実施例と実施例１との相違点は、以下のとおりである。

【0098】

（１）Ｔｒｉｚｏｌ法及びキット法を用いて細胞内の全ＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡの出発濃度をマイクロプレートリーダーで検出し、その濃度は、７００ｎｇ／μｌよりも大きくしてもよい。

【0099】

（２）１５０μｌのＤＮＡを、４２５μｌの高低濃度の塩化カルシウム二水和物溶液と均一に混合した後、４２５μｌの高低濃度のリン酸水素二カリウム溶液をＤＮＡ－塩化カルシウム二水和物混合液にゆっくりと滴下した。２群の安定で透明な高低濃度のＤＮＡ－ＡＣＰナノ粒子鉱化溶液を合成した。後期に鉱化に用いた。

【0100】

実施例１、２の記載によれば、本発明の構築する核酸－ＡＣＰナノ粒子が、コラーゲン線維の生体模倣型鉱化を誘導することは、以下の利点を有する。

【0101】

図１に示すように、透過型電子顕微鏡の検出結果は、実施例１で構築されたリン酸カルシウム複合体の粒径は、比較的均一な球形であり、約５０ｎｍであることを示した（図１のａ）。制限視野電子回折結果は、リン酸カルシウムが非晶性、非晶質であることを示した（図１のａの右上隅）。元素エネルギースペクトルの結果は、高電子密度粒子の主な組成成分が、酸素元素、カルシウム元素、リン元素、及び窒素元素であることを示した（図１のｃ～ｆ）。そのうち、元素複合図（図１のｂ）は、窒素元素が他の元素分布に一致することを示した。窒素元素は、有機核酸にのみ存在するので、この方法では、ＲＮＡがカルシウムリン粒子の安定化に関与し、粒径がより均一なＲＮＡ－ＡＣＰナノ粒子を最終的に形成することができることを示した。

【0102】

図２に示すように、Ｚｅｔａ電位の結果は、いずれの安定化剤を添加しない純粋なカルシウムリン溶液（図２のａ）では、電位は、実質的に０であるが、ＲＮＡ（１５０～２５０ｕｇ／ｍｌ）を安定化剤として添加するカルシウムリン溶液（図２のｃ）では、その電位は、負であり、約－１０ｍｖであり、ＤＮＡ（１５０ｕｇ／ｍｌ）を安定化剤として添加したカルシウムリン溶液（図２のｅ）では、その電位が約－２０ｍｖであることを示した。これは、核酸が負に帯電しているので、核酸の存在で安定化されたＡＣＰナノ粒子複合体も負に帯電していることを示した。粒径の結果は、いずれの安定化剤を添加しない純粋なカルシウムリン溶液（図２のｂ）では、カルシウムリン粒子の粒径が１ミクロンよりも大きいことを示し、これは、カルシウムリン粒子が沈殿した形態で溶液から直接分離されたことを示した。一方、ＤＮＡ－ＡＣＰナノ粒子の粒径は、約６０～１００ｎｍ（図２のｆ）であり、ＲＮＡ－ＡＣＰナノ粒子の粒径は、より小さく、より均一であり、約４０～６０ｎｍである（図２のｄ）。これは、ＲＮＡもＤＮＡもリン酸カルシウムの安定化に関与し、また、ＤＮＡが二本鎖構造であり、分子量も大きいため、空間的に示されたＤＮＡ－ＡＣＰナノ粒子の直径がＲＮＡ－ＡＣＰナノ粒子よりも僅かに大きいことを示した。

【0103】

図３に示すように、フーリエ変換赤外分光法による結果は、ＲＮＡ－ＡＣＰ及びＤＮＡ－ＡＣＰが、５００ｃｍ^－１、６００ｃｍ^－１、１０００ｃｍ^－１にあり、いずれもＯ－Ｐ－Ｏリン酸化結合、リン酸の振動ピークを有することを示した。これは、ＲＮＡ－ＡＣＰ及びＤＮＡ－ＡＣＰの複合体にリン酸カルシウムが含まれていることを示した。また、ＲＮＡとＤＮＡの特徴的な塩基、例えば、グアニン、アデニン、シトシンなどの振動ピークが変化せず、そのため、この２種類の複合体において、ＲＮＡとＤＮＡの構造が破壊されず、依然として安定的に維持されることを示した。

【0104】

図４に示すように、透過型電子顕微鏡による結果（図４のａ～ｂ）は、核酸－ＡＣＰが鉱化溶液として、ＡＣＰナノ粒子がコラーゲン線維の内部に入り、コラーゲン線維のＣ軸方向に沿ってさらに規則的に成長し、熱力学的に安定なハイドロキシアパタイトに最終的に変換され、コラーゲン線維の内部の鉱化を完了することを示した。また、カルシウムリンもコラーゲン線維間又はその表面に堆積することができ、各方向に沿って不規則的に成長して、最終的にコラーゲン線維の外部の鉱化を完了する。これは、核酸－ＡＣＰが、コラーゲン線維の内外部の鉱化を誘導する作用を有し、ミクロ構造で精巧な天然骨組織の鉱化コラーゲン特徴を模倣することができ、生体模倣骨修復材料の製造に確固たる基礎を定めることを示した。

【0105】

図５に示すように、走査型電子顕微鏡により、純粋なコラーゲン線維足場をＲＮＡ－ＡＣＰで５日間鉱化した場合（図５のｂ）、コラーゲン線維足場の複数の部分の体積が膨張すると共に、膨張箇所の表面が滑らかではなく、既存の特徴的な横縞構造が覆われることを示した。線維の内外部の空間がいずれも無機鉱物によって占められ、コラーゲン線維の内外部が鉱化されることを示した。注目すべきことに、走査型電子顕微鏡により、天然マウスの大腿骨における鉱化コラーゲンの表面トポグラフィーも同様に粗く、表面がハイドロキシアパタイトで覆われていることを示した（図５のａ）。これは、ＲＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液によって誘導される鉱化コラーゲン線維のトポグラフィーによく一致する。これは、該実施例１及び２で使用された安定化剤、製造方法、鉱化過程がインビボの実際のコラーゲン線維の鉱化状況と比較して類似性を有し、そのため、鉱化モードから言えば、該材料の製造も生体模倣によって行われるであることを示した。

【0107】

図６に示すように、走査型電子顕微鏡による結果は、コラーゲン線維がＲＮＡ－ＡＣＰ鉱化溶液だけに５時間接触すれば、大面積のコラーゲン線維の内部を鉱化することができることを示す（図６のａ）。元素分布結果は、カルシウムリンがコラーゲン線維内に規則的に堆積することを示していると共に、制限視野電子回折結果は、コラーゲン線維の内部に堆積した鉱物が規則的なハイドロキシアパタイト結晶であることを示した。これは、ＲＮＡがカルシウムリン安定化剤及びコラーゲン線維誘導剤として、コラーゲン線維の広範囲の線維の内部の鉱化を迅速に誘導することができ、鉱化時間が極めて短く、効率が極めて高いことを示した。これは、骨修復材料の効率的な製造及び臨床的転換のために強力な支持を提供する。

【0108】

図７に示すように、純粋なコラーゲン線維を純粋なＲＮＡと共に４８時間インキュベートした後、洗浄及びルテニウムレッド染色を行い、透過型電子顕微鏡による結果は、高電子密度のＲＮＡ－ルテニウムレッド染色液は、コラーゲン線維に均一で大面積に吸着され（図７のａ）、ＲＮＡとインキュベートしないコラーゲン線維群は、高電子密度の粒子がない（図７のｂ）ことを示した。これは、ＲＮＡとコラーゲンとの間に吸引力が存在することを示し、本特許に係る実験モデルの生体模倣をさらに検証し、実際のインビボのコラーゲン線維の内部の鉱化メカニズムを究明するために重要な考え方を提供する。

【0109】

以上の内容は、具体的な好ましい実施形態を参照しながら本発明をさらに詳細に説明したものであり、本発明の具体的な実施形態がこれに限定されると認定することができず、当業者にとって、本発明の概念から逸脱しない前提で、いくつかの簡単な推論又は置換を行うこともでき、いずれも本発明の特許請求の範囲によって決定された特許の保護範囲に属すると見なすべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】