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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-12
(45)【発行日】2024-03-21
(54)【発明の名称】エキソソーム及びその調製プロセス及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20240313BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240313BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20240313BHJP
A61P 17/14 20060101ALI20240313BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240313BHJP
A61K 35/57 20150101ALI20240313BHJP
A61K 8/98 20060101ALI20240313BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20240313BHJP
A61Q 7/00 20060101ALI20240313BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
A61P17/00 ZNA
A61P17/02
A61P17/14
A61P29/00
A61K35/57
A61K8/98
A61Q19/00
A61Q7/00
【請求項の数】
13
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022114981
(22)【出願日】2022-07-19
(65)【公開番号】P2023118035
(43)【公開日】2023-08-24
【審査請求日】2023-02-21
(31)【優先権主張番号】111105325
(32)【優先日】2022-02-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】TW
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】522288762
【氏名又は名称】陞醫生物科技股▲分▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100176072
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 功
(74)【代理人】
【識別番号】100230156
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 心
(74)【代理人】
【識別番号】110000176
【氏名又は名称】弁理士法人一色国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】謝 儒生
(72)【発明者】
【氏名】金 玉堂
【審査官】藤澤 雅樹
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１１３６９９１０３（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１１２１９０５３６（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１１１２２８５６９（ＣＮ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１１／０３４１０６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０２２－０２０８１４（ＪＰ，Ａ）
【文献】Journal of Dental Sciences，2021年，Vol.16，pp.586-598
【文献】International Endodontic Journal，2018年，Vol.51，pp.1159-1170
【文献】BioMed Research International，Hindawi Publishing Corporation，2013年，Volume 2013, Article ID 626258，pp.1-8
【文献】Drug Delivery System，2021年，Vol.36-2，pp.90-99
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
２，３，４′，５－テトラヒドロキシスチルベン－２－Ｏ－β－Ｄ－グルコシド（ＴＨＳＧ）を含有する培養培地で鳥類の胚性間葉系幹細胞（ＡＭＳＣｓ）を培養してＡＭＳＣｓの細胞培養物を得ることと、該ＡＭＳＣｓの細胞培養物を分離処理にかけてエキソソームを得ることと、を含む、エキソソームを製造する方法。
【請求項2】
該培養培地は、０．１μＭ～５０μＭの範囲の濃度のＴＨＳＧを含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
該ＡＭＳＣｓの培養は、２４時間～９６時間の範囲の期間で実行する、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
該分離処理は、サイズ選択分離及び密度選択分離からなる群より選択された、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
該サイズ選択分離は、限外ろ過、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）、透析ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及びそれらの組み合わせからなる群より選択された、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
該サイズ選択分離は、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の組み合わせである、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
請求項１に記載の方法により製造されたエキソソーム。
【請求項8】
５０ｎｍ～２００ｎｍの範囲の粒度を有する、請求項７に記載のエキソソーム。
【請求項9】
５０ｎｍ～１００ｎｍの範囲の平均粒度を有する、請求項７に記載のエキソソーム。
【請求項10】
請求項７に記載のエキソソームを含む、皮膚状態を改善するための組成物。
【請求項11】
該皮膚状態は、傷、肌の老化、脱毛、皮膚の炎症及びそれらの組み合わせからなる群より選択された、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
医薬組成物または機能性化粧品組成物として配合される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項13】
経口投与または非経口投与で投与される、請求項１２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、エキソソームを製造する方法及び該方法で調製されたエキソソームに関する。本開示は、該エキソソームを使用して皮膚状態を改善することにも関する。
【背景技術】
【0002】
エキソソームは、細胞から分泌されるナノサイズのベシクルであり、且つ細胞外小胞（ＥＶｓ）に属する。エキソソームは、さまざまな生体液に存在し（例えば羊水、尿液、血液など）、且つタンパク質、脂質、ｍＲＮＡｓ及びｍｉＲＮＡｓを多く含む。
【0003】
エキソソームの生物学的活性を研究する場合、サイズ選択分離（例えば、ろ過、透析及びクロマトグラフィー）及び密度選択分離（例えば、遠心分離）が、幹細胞培養物からエキソソームを分離することによく用いられる。
【0004】
異なる種類の幹細胞により製造したエキソソームは、異なる生物学的活性を有することが先行研究で実証されている。例えば、Ｗａｎｇ Ｙ． ｅｔ ａｌ． （２０１７）， Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． Ｔｈｅｒ．， ８：１８９において、ヒトの胚性幹細胞誘導間葉系幹細胞（ＥＳＣ－ＭＳＣｓ）由来のエキソソームは、軟骨細胞の細胞外基質（ＥＣＭ）の合成及び分解のバランスを取ることにより、変形性関節症に有益な治療効果を発揮することが報告されている。更に、Ｋｉｍ Ｙ．Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２０１７）， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ４９３：１１０２－１１０８において、ヒト臍帯血からの間葉系幹細胞（ＵＣＢ－ＭＳＣｓ）由来のエキソソームは、人の皮膚に吸収されて皮膚でI型コラーゲン及びエラスチンの合成を促進することができ、故に肌の若返りに不可欠であることが開示されている。
【0005】
上記のような報告があるが、今はエクソソームに対する市場からの高い需要により、エキソソームの量産に役立つ新たな方策を立てる必要がまだある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
第１の態様において、本開示は、先行技術の欠点の少なくとも１つを緩和することができる、エキソソームを製造する方法を提供する。
【0007】
該方法は、２，３，４′，５－テトラヒドロキシスチルベン－２－Ｏ－β－Ｄ－グルコシド（ＴＨＳＧ）を含有する培養培地で鳥類の胚性間葉系幹細胞（ＡＭＳＣｓ）を培養してＡＭＳＣｓの細胞培養物を得ることと、該ＡＭＳＣｓの細胞培養物を分離処理にかけてエキソソームを得ることとを含む。
【0008】
第２の態様において、本開示は、先行技術の欠点の少なくとも１つを緩和することができ且つ上記の方法で製造されたエキソソームを提供する。
【0009】
第３の態様において、本開示は、皮膚状態を改善する方法を提供し、該方法は、先行技術の欠点の少なくとも１つを緩和することができ且つそれを必要とする対象に上記のエキソソームを含む組成物を投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0010】
本開示の他の特徴および利点は、添付の図面を参照して、以下の実施形態の詳細に説明することにより明白になる。
【図1】後述の実施例２の各グループにおけるエキソソーマルタンパク質含有量を示す図であり、記号“*”はｐ＜０．０５（対照群との比較）を表す。
【図2】後述の実施例２の各グループにおけるエキソソーマルＲＮＡ含有量を示す図であり、記号“***”はｐ＜０．００１（対照群との比較）を表す。
【図3】後述の実施例４の各グループにおけるＣＯＬ１Ａ１遺伝子の相対的な発現レベルを示す図であり、記号“***”はｐ＜０．００１（対照群との比較）を表す。
【図4】後述の実施例４の各グループにおけるＣＯＬ３Ａ１遺伝子の相対的な発現レベルを示す図であり、記号“***”はｐ＜０．００１（対照群との比較）を表す。
【図5】後述の実施例４の各グループにおけるＥＬＮ遺伝子の相対的な発現レベルを示す図であり、記号“***”はｐ＜０．００１（対照群との比較）を表す。
【図6】後述の実施例５の各グループにおける細胞生存比率を示す図であり、記号“***”はｐ＜０．００１（対照群との比較）を表す。
【図7】後述の実施例６の各グループにおける創傷治癒の観察から得られた結果を示す図である。
【図8】後述の実施例７の各グループにおける細胞生存比率を示す図であり、記号“***”はｐ＜０．００１（対照群との比較）を表す。
【図9】後述の実施例８の各グループにおけるＩＬ－６遺伝子の相対的な発現レベルを示す図であり、記号“***”はｐ＜０．００１（正常対照群との比較）を表し且つ記号“###”はｐ＜０．００１（病態対照群との比較）を表す。
【図10】後述の実施例８の各グループにおけるＩＬ－１β遺伝子の相対的な発現レベルを示す図であり、記号“***”はｐ＜０．００１（正常対照群との比較）を表し且つ記号“###”はｐ＜０．００１（病態対照群との比較）を表す。
【図11】後述の実施例８の各グループにおけるＴＮＦ－α遺伝子の相対的な発現レベルを示す図であり、記号“***”はｐ＜０．００１（正常対照群との比較）を表し且つ記号“###”はｐ＜０．００１（病態対照群との比較）を表す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
まず、何らかの先行技術文献が本明細書において引用されても、台湾またはいかなる国におい
【0012】
ても、該先行技術文献の内容が本発明の属する分野における一般知識であることを示すものではないことを理解されたい。
【0013】
また、「含む」という用語は「含むが、これに限定されない」ことを意味し、「含める」という用語もこれに対応する意味を有することも理解されたい。
【0014】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。当業者であれば、本開示の実施において、本明細書に記載のものと類似又は同等の多くの方法及び材料を認識し、利用することができる。実際、本開示は記載された方法及び材料に決して限定されない。
【0015】
本開示は、エキソソームを製造する方法を提供し、
該方法は、２，３，４′，５－テトラヒドロキシスチルベン－２－Ｏ－β－Ｄ－グルコシド（ＴＨＳＧ）を含有する培養培地で鳥類の胚性間葉系幹細胞（ＡＭＳＣｓ）を培養してＡＭＳＣｓの細胞培養物を得ることと、
該ＡＭＳＣｓの細胞培養物を分離処理にかけてエキソソームを得ることとを含む。
該方法は、２，３，４′，５－テトラヒドロキシスチルベン－２－Ｏ－β－Ｄ－グルコシド（ＴＨＳＧ）を含有する培養培地で鳥類の胚性間葉系幹細胞（ＡＭＳＣｓ）を培養してＡＭＳＣｓの細胞培養物を得ることと、
該ＡＭＳＣｓの細胞培養物を分離処理にかけてエキソソームを得ることとを含む。
【0016】
本開示によれば、該エキソソームは、１×１０８ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｇ以上の量で取得することができる。一部の実施形態において、該エキソソームは、１×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｇ～１×１０１０ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｇの範囲の量で取得できる。例示的な実施形態において、該エキソソームの量は、５．０８×１０９ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍｇである。
【0017】
本開示によれば、該ＡＭＳＣｓは、８．３×１０７細胞～８．３×１０９細胞の範囲の量で存在する。一部の実施形態において、該ＡＭＳＣｓの量は、１×１０８細胞である。
【0018】
本開示によれば、該培養培地は、０．１μＭ～５０μＭの範囲の濃度のＴＨＳＧを含有することができる。一部の実施形態において、該培養培地は、２５μＭのＴＨＳＧを含有する。
【0019】
本開示によれば、ＴＨＳＧは、当業者の周知技術を用いて植物性材料、例えばツルドクダミ、から分離されたものであることができる。この点について、当業者は、学術論文、例えば、Ｔｓａｉ Ｐ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２０１８），Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２３（３）：５７１を参照することができる。
【0020】
一部の実施形態において、本開示で使用することに適切なＴＨＳＧは、市販品として入手することができ、例えば成都バイオピュリファイファイトケミカルス社（Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｂｉｏｐｕｒｉｆｙ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．）から購入したスチルベン配糖体（カタログ番号ＢＰ００３９）であり得る。
【0021】
本明細書で使用される「培養する」という用語は、他の用語、例えば「培養」、「栽培」などと互換可能に使うことができる。
【0022】
該ＡＭＳＣｓを培養するための手順と作用条件は、実際の要求に応じて調整することができる。この点について、当業者は、学術論文、例えば、Ｇａｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．，ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１３／６２６２５８を参照することができる。
【0023】
本開示によれば、該ＡＭＳＣｓを培養することに適切な培養培地は、ＡＭＳＣｓの成長を促進するために様々な栄養素を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含むことができるが、それに限らない。更に、該培養培地は、添加物、例えばウマ、子ウシまたはウシ胎仔血清など、を添加することができる。
【0024】
本開示によれば、該ＡＭＳＣｓの培養は、３６℃～３７℃の範囲の温度で実行することができる。一部の実施形態において、該ＡＭＳＣｓの培養は、３７℃の温度で実行する。
【0025】
本開示によれば、該ＡＭＳＣｓの培養は、２４時間～９６時間の範囲の期間で実行することができる。一部の実施形態において、該ＡＭＳＣｓの培養は、３６時間の期間で実行する。
【0026】
本開示によれば、該分離処理の手順及び作動条件は、実際の要求に応じて調整することができる。この点について、当業者は、学術論文、例えば、上記のＷａｎｇ Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０１７）を参照することができる。
【0027】
本開示によれば、該分離処理は、サイズ選択分離及び密度選択分離からなる群から選択することができる。
【0028】
本開示によれば、該サイズ選択分離は、ろ過（例えば限外ろ過及びタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）など）、透析（例えば透析ろ過など）、クロマトグラフィー（例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）など）及びそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。一部の実施形態において、該サイズ選択分離は、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の組み合わせである。
【0029】
本開示によれば、ＴＦＦは、１００ｋＤａ～５００ｋＤａの範囲の分画分子量（ＭＷＣＯ）値を有するろ過膜を使用して実行することができる。一部の実施形態において、ＴＦＦは、５００ｋＤａの分画分子量（ＭＷＣＯ）値を有するろ過膜を使用して実行する。
【0030】
本開示によれば、ＴＦＦは、流量が５０ｍＬ/ｍｉｎ～２００ｍＬ/ｍｉｎの範囲で実行することができる。一部の実施形態において、ＴＦＦは、流量が８０ｍＬ/ｍｉｎ～１２０ｍＬ/ｍｉｎの範囲で実行する。
【0031】
本開示によれば、ＳＥＣは、１５℃～２５℃の範囲のカラム温度で実行することができる。一部の実施形態において、ＳＥＣは、２５℃のカラム温度で実行する。
【0032】
本開示によれば、該密度選択分離は、超遠心分離法及び密度勾配遠心分離法からなる群から選択される遠心分離処理であることができる。
【0033】
本開示は、上記の方法で調製されたエキソソームも提供する。
【0034】
本開示によれば、該エキソソームは、５０ｎｍ～２００ｎｍの範囲の粒度を有することができる。一部の実施形態において、該エキソソームは、５０ｎｍ～１５０ｎｍの範囲の粒度を有する。
【0035】
本開示によれば、該エキソソームは、５０ｎｍ～１００ｎｍの範囲の平均粒度を有することができる。一部の実施形態において、該エキソソームは、７２ｎｍの平均粒度を有する。
【0036】
本開示によれば、該エキソソームは、粉体状の製品を得るように、当業者の周知技術を用いて乾燥処理にかけることができる。乾燥処理の例は、凍結乾燥処理、噴霧乾燥処理、真空乾燥処理及び流動層乾燥を含むことができるが、それらに限らない。一部の実施形態において、該エキソソームは、凍結乾燥処理にかけられる。
【0037】
更に、本開示は、皮膚状態を改善する方法を提供し、該方法は、それを必要とする対象に上記のエキソソームを含む組成物を投与することを含む。
【0038】
本明細書で使用される「投与」または「投与する」という用語は、「意図された機能を果たすために、任意の適切な経路で予め決められた活性成分を対象に導入、提供または送達する」ことを意味する。
【0039】
本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラットなど、関心のあるあらゆる動物を指す。一部の実施形態において、該対象はヒトである。
【0040】
本開示によれば、該皮膚状態は、傷、肌の老化、脱毛、皮膚の炎症及びそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。
【0041】
本明細書で使用される「肌の老化」という用語は、自然に起こる内因性皮膚老化と、環境要因（紫外線など）に起因する外因性皮膚老化が含まれることを意図している。肌の老化の例は、毛細血管拡張症、表皮が薄くなること、皮膚萎縮、コラーゲン線維及び弾性線維の減少、弾性線維症、皮膚弾力性の低下、粗い肌のキメ、乾燥、シワの形成、色素変化（例えば黒子、そばかす、低色素沈着または高色素沈着など）を含むことができるが、それらに限らない。
【0042】
本開示によれば、該組成物は、機能性化粧品組成物として配合されることができる。該機能性化粧品組成物は、前記の薬学的に許容される担体や、美容的に許容されるアジュバントを更に含み、且つ、当業者の周知技術を用いてスキンケアまたは化粧品用に適切な外用剤にすることができる。
【0043】
該美容的に許容されるアジュバントの例は、溶剤、ゲル化剤、活性剤、酸化防止剤、スクリーニング剤、界面活性剤、着色剤、増粘剤、充填剤、香料及び臭気吸収剤を含むことができるが、それらに限らない。該美容的に許容されるアジュバントの選択及び量は、当業者の専門知識の範囲内である。
【0044】
スキンケアまたは化粧品用に適切な該外用剤の例は、水溶液、水－アルコール溶液または油性溶液、水中油型、油中水型または複合エマルション、ゲル、軟膏、クリーム、マスク、パッチ、パック、包帯、塗布剤、パウダー、エアゾール、スプレー、ローション、セラム、ペースト、フォーム、分散液、懸濁液、ドロップ、ムース、硬膏、日焼け止め、トニックウォーター、ファンデーション、アイシャドウなどを含むことができるが、それらに限らない。
【0045】
本開示によれば、組成物は、当業者の周知技術を用いて、例えば非経口または経口投与に適切な剤形の医薬組成物に調製することができる。
【0046】
非経口投与の場合、本開示の該医薬組成物は、注射液、例えば無菌水溶液または分散液に配合されることができる。
【0047】
本開示の該医薬組成物は、腹腔内注射、筋肉内注射、表皮内注射、皮下注射、皮内注射、病巣内注射の非経口経路の１つを介して投与することができる。
【0048】
本開示によれば、経口投与の適切な剤形は、無菌粉末、タブレット、トローチ、ロゼンジ、ペレット、カプセル、分散性粉末または顆粒、溶液、懸濁液、エマルション、シロップ、エリキシル剤、スラリーなどを含むことができるが、それらに限らない。
【0049】
本開示によれば、該医薬組成物は、製薬の技術に広く使用されている薬学的に許容される担体を更に含むことができる。例えば、該薬学的に許容される担体は、溶剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁化剤、分解剤、崩壊剤、分散剤、結合剤、賦形剤、安定化剤、キレート剤、希釈剤、ゲル化剤、保存剤、湿潤剤、潤滑剤、吸収遅延剤、リポソームなどの剤から１種又は複数種以上を含むことができる。上記の剤の選択及び量は、当業者の専門知識及び習慣的な技能の範囲内である。
【0050】
上記の医薬組成物の用量及び頻度は、治療する病気や疾患の深刻さ、投与経路、治療する対象の年齢、健康状態、反応などの要因によって変えることができる。一般的に、該医薬組成物は、単回投与又は数回に分けて投与することができる。
【0051】
以下、本発明の実施例について説明する。これらの実施例は、例示的かつ説明的なものであり、且つ、本発明を限定するものと解釈されるべきではないことを理解されたい。
【実施例】
【0052】
一般実験材料
１.以下の実験に使用した２，３，４′，５－テトラヒドロキシスチルベン－２－Ｏ－β－Ｄ－グルコシド（ＴＨＳＧ）は、上記のＴｓａｉ Ｐ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２０１８）に記載されている手順で調製した。
１.以下の実験に使用した２，３，４′，５－テトラヒドロキシスチルベン－２－Ｏ－β－Ｄ－グルコシド（ＴＨＳＧ）は、上記のＴｓａｉ Ｐ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２０１８）に記載されている手順で調製した。
【0053】
２.鳥類の胚性間葉系幹細胞（ＡＭＳＣｓ）及びヒト歯髄幹細胞（ＤＰＳＣｓ）のそれぞれは、上記のＧａｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）及びＬｉｎ Ｃ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｊ．Ｅｎｄｏｄ．，４５：４３５－４４１に記載されている手順で調製した。
【0054】
３. ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＳＦｓ）
以下の実験で使用した該ＨＳＦｓは、台湾の財団法人食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）のバイオソース収集・研究センター（ＢＣＲＣ）（Ｎｏ．３３１，Ｓｈｉｈ－Ｐｉｎ Ｒｄ．，Ｈｓｉｎｃｈｕ Ｃｉｔｙ ３００，Ｔａｉｗａｎ）から購入したものである。該ＨＳＦｓは、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ/ｍＬストレプトマイシンが添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）、カタログ番号１０－０１７－ＣＭ）を含有する７５Ｔフラスコで培養された。該ＨＳＦｓは、３７℃及び５％ＣＯ２に設定した培養条件で培養器で培養された。２～３日ごとに培地交換を実行した。培養された細胞がコンフルエントの８０％～９０％に達したときに細胞通過を実行した。
以下の実験で使用した該ＨＳＦｓは、台湾の財団法人食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）のバイオソース収集・研究センター（ＢＣＲＣ）（Ｎｏ．３３１，Ｓｈｉｈ－Ｐｉｎ Ｒｄ．，Ｈｓｉｎｃｈｕ Ｃｉｔｙ ３００，Ｔａｉｗａｎ）から購入したものである。該ＨＳＦｓは、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ/ｍＬストレプトマイシンが添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ（商標）、カタログ番号１０－０１７－ＣＭ）を含有する７５Ｔフラスコで培養された。該ＨＳＦｓは、３７℃及び５％ＣＯ２に設定した培養条件で培養器で培養された。２～３日ごとに培地交換を実行した。培養された細胞がコンフルエントの８０％～９０％に達したときに細胞通過を実行した。
【0055】
４. ヒト毛乳頭細胞（ＨＦＤＰＣｓ）
以下の実験で使用した該ＨＦＤＰＣｓは、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ社（ドイツ、ハイデルベルク市）（カタログ番号Ｃ－１２０７１）から購入したものである。該ＨＦＤＰＣｓは、１％の成長培地サプリメントミックス（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ社、カタログ番号Ｃ－３９６２５）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ/ｍＬストレプトマイシンが添加された毛乳頭細胞増殖培地（ＦＤＰＣＧＭ）（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ社、カタログ番号Ｃ－２６５０１）を含有する７５Ｔフラスコで培養された。該ＨＦＤＰＣｓは、３７℃及び５％ＣＯ２に設定した培養条件で培養器で培養された。２～３日ごとに培地交換を実行した。培養された細胞がコンフルエントの８０％～９０％に達したときに細胞通過を実行した。
以下の実験で使用した該ＨＦＤＰＣｓは、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ社（ドイツ、ハイデルベルク市）（カタログ番号Ｃ－１２０７１）から購入したものである。該ＨＦＤＰＣｓは、１％の成長培地サプリメントミックス（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ社、カタログ番号Ｃ－３９６２５）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ/ｍＬストレプトマイシンが添加された毛乳頭細胞増殖培地（ＦＤＰＣＧＭ）（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ社、カタログ番号Ｃ－２６５０１）を含有する７５Ｔフラスコで培養された。該ＨＦＤＰＣｓは、３７℃及び５％ＣＯ２に設定した培養条件で培養器で培養された。２～３日ごとに培地交換を実行した。培養された細胞がコンフルエントの８０％～９０％に達したときに細胞通過を実行した。
【0056】
基本手順
１. 統計分析
以下に説明する実験はすべて３回繰り返し行った。すべての試験グループの実験データは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）で表される。統計分析は、ＩＢＭ（商標） ＳＰＳＳ（商標） Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｖｅｒｓｉｏｎ １９．０（米ＳＰＳＳ Ｉｎｃ.社、米国イリノイ州）を用いて行った。すべてのデータは、グループ間の差異を評価するために、両側スチューデントのｔ検定を用いて分析された。統計的な有意性はｐ＜０．０５で示される。
１. 統計分析
以下に説明する実験はすべて３回繰り返し行った。すべての試験グループの実験データは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）で表される。統計分析は、ＩＢＭ（商標） ＳＰＳＳ（商標） Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｖｅｒｓｉｏｎ １９．０（米ＳＰＳＳ Ｉｎｃ.社、米国イリノイ州）を用いて行った。すべてのデータは、グループ間の差異を評価するために、両側スチューデントのｔ検定を用いて分析された。統計的な有意性はｐ＜０．０５で示される。
【0057】
［実施例１］ＡＭＳＣｓからのエキソソームの製造に対してＴＨＳＧの効果の評価
「一般実験材料」のセクション２に調製されたＡＭＳＣｓは、１つの対照群及び１つの実験群を含む２つのグループに分けられた。各グループのＡＭＳＣｓは、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、２．５％のＦＢＳが添加された５ｍＬのＤＭＥＭを含有する１０－ｃｍのペトリ皿で培養され、続いて培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で４８時間培養された。各グループの得られた細胞培養物は、１×１０８の細胞数を有する。次に、該実験群の細胞培養物は、２５μＭのＴＨＳＧを含有する新鮮なＤＭＥＭ培地に置き換えられ、該対照群の細胞培養物は、ＴＨＳＧを含有しない新鮮なＤＭＥＭ培地に置き換えられた。各グループは、培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で３６時間培養された。
「一般実験材料」のセクション２に調製されたＡＭＳＣｓは、１つの対照群及び１つの実験群を含む２つのグループに分けられた。各グループのＡＭＳＣｓは、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、２．５％のＦＢＳが添加された５ｍＬのＤＭＥＭを含有する１０－ｃｍのペトリ皿で培養され、続いて培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で４８時間培養された。各グループの得られた細胞培養物は、１×１０８の細胞数を有する。次に、該実験群の細胞培養物は、２５μＭのＴＨＳＧを含有する新鮮なＤＭＥＭ培地に置き換えられ、該対照群の細胞培養物は、ＴＨＳＧを含有しない新鮮なＤＭＥＭ培地に置き換えられた。各グループは、培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で３６時間培養された。
【0058】
その後、各グループの液体の細胞培養物を、１０００ｇで１０分間の遠心分離処理にかけて、沈殿物を除去した。該遠心分離処理を２回繰り返した。得られた上澄みを、収集し、そして、フィルター（メッシュ：０．２２μｍ）を使用してろ過することにより、第１のろ液を得た。
【0059】
各グループの該第１のろ液をタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）にかけることにより、第２のろ液を得た。ＴＦＦは、ポンプ（回転速度：８０－１２０ｍＬ／ｍｉｎ）と５００ｋＤａの変性ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）を用いる中空糸ろ過モジュールとを備えるミニタンジェンシャルフローろ過システムを使用することにより実行された。
【0060】
各グループの該第２のろ液を、フィルター（メッシュ：０．２２ μｍ）を使用してろ過することにより、第３のろ液を得た。各グループの該第３のろ液を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用してろ過することにより、エキソソーム含有の溶出液を得た。ＳＥＣ分析は、ＳＥＣ ｑＥＶカラム（カラム温度：２５℃)を使用し且つリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を溶離液として使用することにより実行された。
【0061】
各グループの溶出液を、凍結乾燥処理にかけることにより、実験群の乾燥エキソソーム粉末及び対照群の乾燥エキソソーム粉末を得た。
【0062】
［実施例２］エキソソーム成分の分析
Ａ. エキソソーマルタンパク質含有量の測定
実施例１で調製した２つの乾燥エキソソーム粉末のそれぞれの１つを１００ｍｇでＲＩＰＡ溶解バッファーと混合し、続いて、メーカーの指示に従ってＰｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質測定キット(米Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．社、カタログ番号２３２２５)を使用して、エキソソーマルタンパク質含有量を測定した。
Ａ. エキソソーマルタンパク質含有量の測定
実施例１で調製した２つの乾燥エキソソーム粉末のそれぞれの１つを１００ｍｇでＲＩＰＡ溶解バッファーと混合し、続いて、メーカーの指示に従ってＰｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質測定キット(米Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．社、カタログ番号２３２２５)を使用して、エキソソーマルタンパク質含有量を測定した。
【0063】
更に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をコントロールスタンダード（０、１．９５３、３．９０６２５、７．８１２５、１５．６２５、３１．２５、６２．５、１２５及び２５０μｇ／ｍＬの濃度で提供された）として使用し、且つ、同じ分析にかけた。
【0064】
図１を参照すると、実験群における測定されたエキソソーマルタンパク質含有量は、対照群における測定されたものより著しく高い。
【0065】
Ｂ. エキソソーマルＲＮＡ含有量の測定
実施例１で調製した２つの乾燥エキソソーム粉末のそれぞれの１つを１００ｍｇで、メーカーの指示に従ってｑＥＶ ＲＮＡ抽出キット（ＩＺＯＮ社、カタログ番号ＲＸＴ０１)を使用して、エキソソーマルＲＮＡ含有量を測定した。
実施例１で調製した２つの乾燥エキソソーム粉末のそれぞれの１つを１００ｍｇで、メーカーの指示に従ってｑＥＶ ＲＮＡ抽出キット（ＩＺＯＮ社、カタログ番号ＲＸＴ０１)を使用して、エキソソーマルＲＮＡ含有量を測定した。
【0066】
図２を参照すると、実験群で測定されたエキソソーマルＲＮＡ含有量は、対照群で測定されたものより著しく高い。
【0067】
［実施例３］異なる幹細胞からのエキソソームの製造に対してＴＨＳＧの効果の評価
「一般実験材料」のセクション２で調製されたＤＰＳＣｓを、同じ実施例１に記載されたＴＨＳＧ処理、エキソソーム分離及び凍結乾燥処理にかけることにより、(比較群として)ＤＰＳＣｓからの乾燥エキソソーム粉末を得た。
「一般実験材料」のセクション２で調製されたＤＰＳＣｓを、同じ実施例１に記載されたＴＨＳＧ処理、エキソソーム分離及び凍結乾燥処理にかけることにより、(比較群として)ＤＰＳＣｓからの乾燥エキソソーム粉末を得た。
【0068】
実施例１で調製した実験群の乾燥エキソソーム粉末及び比較群の乾燥エキソソーム粉末のそれぞれの１つを１８ｍｇで、蒸留水と混合し、続いて、含有量及び粒度の測定を、調整可能な抵抗脈波検出（ｔＲＰＳ）技術に基づいてｑＮａｎｏシステム（ニュージーランドＩｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．社)を使用して行った。
【0069】
下記の表１に示されるように、実験群で測定されたエキソソーム含有量は、比較群で測定されたものより著しく高い。更に、実験群のエキソソーム含有量は、５３ｎｍ～２４５ｎｍの範囲の粒度及び７２ｎｍの平均粒度を有する。
【0070】
【表1】
【0071】
これらの結果から、本開示の方法は、高含有量のエキソソームを製造でき、且つそれにより得られたエキソソームが比較的に小さい粒度を有することを示した。
【0072】
［実施例４］本開示によるエキソソームの抗しわ効果の評価
材料：
１．エキソソーム懸濁液の調製
実施例１で調製した実験群の乾燥エキソソーム粉末の適切な量を無菌超純水に懸濁させることにより、エキソソーム懸濁液を得た。
材料：
１．エキソソーム懸濁液の調製
実施例１で調製した実験群の乾燥エキソソーム粉末の適切な量を無菌超純水に懸濁させることにより、エキソソーム懸濁液を得た。
【0073】
方法：
「一般実験材料」のセクション３で調製されたＨＳＦｓは、１つの対照群及び３つの実験群（即ち、実験群１～３）を含む４つのグループに分けられた。各グループのＨＳＦｓは、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、１０％のＦＢＳが添加された２ｍＬのＤＭＥＭを含有する６ウェル培養プレートの各ウェルに培養され、続いて培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養された。
「一般実験材料」のセクション３で調製されたＨＳＦｓは、１つの対照群及び３つの実験群（即ち、実験群１～３）を含む４つのグループに分けられた。各グループのＨＳＦｓは、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、１０％のＦＢＳが添加された２ｍＬのＤＭＥＭを含有する６ウェル培養プレートの各ウェルに培養され、続いて培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養された。
【0074】
その後、３つの実験群及び対照群の各細胞培養物は、０．２５％のチャコール処理ウシ胎児血清（ＣＳ－ＦＢＳ）(カタログ番号１２６７６０２９、米Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．社)を含有する新鮮な２ｍＬのＤＭＥＭ培地に置き換えられた。次に、該３つの実験群の細胞培養物は、各細胞培養物が表２に示される最終濃度を有するように、この実施例の「材料」のセクション１で調製されたエキソソーム懸濁液の適切な量で処理された。更に、対照群の細胞培養物は、処理を受けていない。
【0075】
【表2】
【0076】
各グループは、培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で４８時間培養された。５分間５０００ｒｐｍの遠心分離の後、得られた細胞ペレットを収集し、そして、メーカーの指示に従ってＧＥＮＥｚｏｌ（商標）ＴｒｉＲＮＡ純粋キット (台湾Ｇｅｎｅａｉｄ社、カタログ番号ＧＺＸＤ２００)を使用してトータルＲＮＡ抽出にかけた。得られたそれぞれのグループのＲＮＡは、メーカーの指示に従ってＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット(米Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ.社、カタログ番号Ｋ１６３１)を使用して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によりｃＤＮＡを合成するためのテンプレートとした。
【0077】
そのように得られたｃＤＮＡを、ＤＮＡテンプレートとして、ＳＹＢＲ－Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅに基づいて定量的なリアルタイムＰＣＲにかけ、それは、表３に示されるＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子、ＥＬＮ遺伝子に対して特異的に設計されたプライマー対及び表４に示される反応条件を使用してＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ（商標）リアルタイムＰＣＲ解析システム（米Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｉｎｃ.社）で実行した。１８ＳｒＲＮＡ遺伝子は、リアルタイムＰＣＲの定量分析の内在性コントロールとして使用されて、遺伝子発現データを正常化する。
【0078】
【表3】
【0079】
【表4】
【0080】
得られたＰＣＲ産物を蛍光強度測定にかけ、続いて、各ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子及びＥＬＮ遺伝子のサイクル閾（Ｃｔ）値を計算した。定量リアルタイムＰＣＲデータは、比較Ｃｔ方法を使用して分析された。簡潔に言うと、各グループにおける各ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子及びＥＬＮ遺伝子のＣｔ値は、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のもので正常化され、且つ、各ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子及びＥＬＮ遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現レベルは、以下の式（Ｉ）を使用して更に計算された。
【0081】
Ａ＝Ｂ／Ｃ （Ｉ）
式中、Ａ＝ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子、またはＥＬＮ遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現レベル
Ｂ＝それぞれのグループにおけるＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子、またはＥＬＮ遺伝子の正常化されたＣｔ値
Ｃ＝対照群におけるＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子、またはＥＬＮ遺伝子の正常化されたＣｔ値
式中、Ａ＝ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子、またはＥＬＮ遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現レベル
Ｂ＝それぞれのグループにおけるＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子、またはＥＬＮ遺伝子の正常化されたＣｔ値
Ｃ＝対照群におけるＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子、またはＥＬＮ遺伝子の正常化されたＣｔ値
【0082】
こうして得られたデータは、「基本手順」のセクション１に記載された方法に従って解析された。
【0083】
結果：
図３～５を参照すると、実験群１～３における測定されたＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子及びＥＬＮ遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現レベルは、対照群における測定されたものより高い。更に、実験群３における測定されたＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子及びＥＬＮ遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現レベルは、実験群１における測定されたものより著しく高い。
図３～５を参照すると、実験群１～３における測定されたＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子及びＥＬＮ遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現レベルは、対照群における測定されたものより高い。更に、実験群３における測定されたＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ３Ａ１遺伝子及びＥＬＮ遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現レベルは、実験群１における測定されたものより著しく高い。
【0084】
これらの結果から、本開示の方法で製造されたエキソソームは、皮膚線維芽細胞からのコラーゲン及びエラスチンの分泌を用量依存的に促進でき、それにより抗しわ効果を達成することを示した。
【0085】
［実施例５］本開示によるエキソソームの皮膚再生促進効果の評価
方法：
「一般実験材料」のセクション３で調製されたＨＳＦｓは、１つの対照群及び１つの実験群を含む２つのグループに分けられた。各グループのＨＳＦｓは、それぞれが５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、１０％のＦＢＳが添加された１００μＬのＤＭＥＭを含有する９６ウェル培養プレートのウェルで培養され、続いて培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養された。
方法：
「一般実験材料」のセクション３で調製されたＨＳＦｓは、１つの対照群及び１つの実験群を含む２つのグループに分けられた。各グループのＨＳＦｓは、それぞれが５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、１０％のＦＢＳが添加された１００μＬのＤＭＥＭを含有する９６ウェル培養プレートのウェルで培養され、続いて培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養された。
【0086】
その後、実験群及び対照群の各細胞培養物は、０．２５％のＣＳ－ＦＢＳを含有する新鮮な１００μＬのＤＭＥＭ培地に置き換えられた。次に、実験群の細胞培養物は、各細胞培養物が７０μｇ／ｍＬの最終濃度を有するように、実施例４の「材料」のセクション１で調製されたエキソソーム懸濁液の適切な量で処理された。更に、対照群の細胞培養物は、処理を受けていない。
【0087】
各グループは、培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で７２時間培養された。次に、実験群及び対照群の各細胞培養物は、２０％ＭＴＳ溶液(ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（商標） ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ)(米Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、カタログ番号Ｇ３５８１)を含有する成長培地に置き換えられ、続いて、培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２時間培養された。
【0088】
得られた細胞培養物のそれぞれを、ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ（米Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）により４９０ｎｍ波長における吸収（ＯＤ４９０）の測定を行った。細胞生存比率（％）は、以下の式（ＩＩ）を使用して計算された。
【0089】
Ｄ＝（Ｅ／Ｆ）×１００ （ＩＩ）
式中、Ｄ＝細胞生存比率（％）
Ｅ＝それぞれのグループのＯＤ４９０値
Ｆ＝対照群のグループのＯＤ４９０値
式中、Ｄ＝細胞生存比率（％）
Ｅ＝それぞれのグループのＯＤ４９０値
Ｆ＝対照群のグループのＯＤ４９０値
【0090】
こうして得られたデータは、「基本手順」のセクション１に記載された方法に従って解析された。
【0091】
結果：
図６を参照すると、実験群における測定された細胞生存比率は、対照群における測定されたものより著しく高い。これらの結果から、本開示の方法により製造されたエキソソームは、皮膚線維芽細胞の増殖を促進することにより皮膚再生を改善することができることを示した。
図６を参照すると、実験群における測定された細胞生存比率は、対照群における測定されたものより著しく高い。これらの結果から、本開示の方法により製造されたエキソソームは、皮膚線維芽細胞の増殖を促進することにより皮膚再生を改善することができることを示した。
【0092】
実施例６．本開示によるエキソソームの傷の治癒の促進効果の評価
方法：
「一般実験材料」のセクション３で調製されたＨＳＦｓは、１つの対照群及び１つの実験群を含む２つのグループに分けられた。各グループのＨＳＦｓは、それぞれが２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、１０％のＦＢＳが添加された５００μＬのＤＭＥＭを含有する２４ウェル培養プレートのウェルで培養され、続いて培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養された。
方法：
「一般実験材料」のセクション３で調製されたＨＳＦｓは、１つの対照群及び１つの実験群を含む２つのグループに分けられた。各グループのＨＳＦｓは、それぞれが２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、１０％のＦＢＳが添加された５００μＬのＤＭＥＭを含有する２４ウェル培養プレートのウェルで培養され、続いて培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養された。
【0093】
その後、実験群及び対照群の各細胞培養物は、新鮮な１００μＬのＤＭＥＭ培地に置き換えられ、続いて、培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養された。次に、無菌鉗子を使用して約５００μｍの無細胞傷エリアを作り出すように、各グループの細胞培養物を対応のウェルの直径に沿ってこすり落とした。その後、実験群及び対照群の各細胞培養物は、０．２５％のＣＳ－ＦＢＳを含有する新鮮な５００μＬのＤＭＥＭ培地に置き換えられた。実験群の細胞培養物は、細胞培養物が７０μｇ／ｍＬの最終エキソソーム濃度を有するように、実施例４の「材料」のセクション３で調製されたエキソソーム懸濁液の適切な量で処理された。更に、対照群の細胞培養物は、処理を受けていない。
【0094】
その後、各グループの細胞培養物は、培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養された。培養を実行する前及び培養開始から第２４時間に、各グループの傷エリアを、４０×の倍率で倒立顕微鏡（メーカー：オリンパス、型番：ＣＫＸ５３）で観測し、そして、デジタルカメラ（メーカー：オリンパス、型番：ＥＰ５０）を使用して撮影した。
【0095】
結果：
図７を参照すると、対照群との比較において、傷の治癒は、培養開始から第２４時間の実験群で明瞭に観測された。この結果から、本開示の方法により製造されたエキソソームは、線維芽細胞媒介の傷の塞ぎを有効に改善することができることを示し、故に、傷の治癒の促進に優れた効果があることを示した。
図７を参照すると、対照群との比較において、傷の治癒は、培養開始から第２４時間の実験群で明瞭に観測された。この結果から、本開示の方法により製造されたエキソソームは、線維芽細胞媒介の傷の塞ぎを有効に改善することができることを示し、故に、傷の治癒の促進に優れた効果があることを示した。
【0096】
実施例７．本開示によるエキソソームの脱毛改善効果の評価
方法：
「一般実験材料」のセクション４で調製されたＨＦＤＰＣｓは、１つの対照群及び１つの実験群を含む２つのグループに分けられた。ＨＦＤＰＣｓの各グループは、それぞれが５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、１％の成長培地サプリメントミックスが添加された１００μＬのＦＤＰＣＧＭを含有する９６ウェル培養プレートのウェルで培養され、続いて培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養された。
方法：
「一般実験材料」のセクション４で調製されたＨＦＤＰＣｓは、１つの対照群及び１つの実験群を含む２つのグループに分けられた。ＨＦＤＰＣｓの各グループは、それぞれが５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、１％の成長培地サプリメントミックスが添加された１００μＬのＦＤＰＣＧＭを含有する９６ウェル培養プレートのウェルで培養され、続いて培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養された。
【0097】
その後、実験群及び対照群の各細胞培養物は、新鮮な１００μＬのＦＤＰＣＧＭに置き換えられた。その後、実験群の細胞培養物は、細胞培養物が７０μｇ／ｍＬの最終エキソソーム濃度を有するように、実施例４の「材料」のセクション１で調製されたエキソソーム懸濁液の適切な量で処理された。更に、対照群の細胞培養物は、処理を受けていない。
【0098】
各グループは、培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で９６時間培養された。次に、該実験群及び対照群の各細胞培養物は、２０％ＭＴＳ溶液(ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（商標） ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ)(米Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、カタログ番号Ｇ３５８１)を含有する成長培地に置き換えられ、続いて、培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２時間培養された。得られた細胞培養物のそれぞれに対し、ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ（米Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）により４９０ｎｍ波長における吸収（ＯＤ４９０）の測定を行った。細胞生存比率（％）は、上記の式（ＩＩ）を使用して計算された。
【0099】
こうして得られたデータは、「基本手順」のセクション１に記載された方法に従って解析された。
【0100】
結果：
図８を参照すると、実験群における測定された細胞生存比率は、対照群における測定されたものより著しく高い。これらの結果から、本開示の方法により製造されたエキソソームは、毛嚢の再生を有効的に促進し、故に、脱毛を改善することに優れた効果があることを示した。
図８を参照すると、実験群における測定された細胞生存比率は、対照群における測定されたものより著しく高い。これらの結果から、本開示の方法により製造されたエキソソームは、毛嚢の再生を有効的に促進し、故に、脱毛を改善することに優れた効果があることを示した。
【0101】
実施例８．本開示によるエキソソームの抗炎症効果の評価
方法：
「一般実験材料」のセクション３で調製されたＨＳＦｓは、１つの正常対照群、１つの実験群及び１つの病態対照群を含む３つのグループに分けられた。各グループのＨＳＦｓは、それぞれが１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、１０％のＦＢＳが添加された２ｍＬのＤＭＥＭを含有する６ウェル培養プレートのウェルで培養され、続いて培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養された。
方法：
「一般実験材料」のセクション３で調製されたＨＳＦｓは、１つの正常対照群、１つの実験群及び１つの病態対照群を含む３つのグループに分けられた。各グループのＨＳＦｓは、それぞれが１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで、１０％のＦＢＳが添加された２ｍＬのＤＭＥＭを含有する６ウェル培養プレートのウェルで培養され、続いて培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で２４時間培養された。
【0102】
その後、実験群の細胞培養物は、０．２５％のＣＳ－ＦＢＳ及び１μｇ／ｍＬのリポ多糖体（ＬＰＳ）(大腸菌血清型 Ｏ１１１：Ｂ４（Ｓｉｇｍａ）から得られた)が添加された新鮮な１ｍＬのＤＭＥＭ培地に置き換えられ、病態対照群の細胞培養物は、１μｇ／ｍＬのＬＰＳが添加された新鮮な１ｍＬのＤＭＥＭ培地に置き換えられ、且つ正常対照群の細胞培養物は、新鮮な１ｍＬのＤＭＥＭ培地に置き換えられた。その後、実験群の細胞培養物は、細胞培養物が０．０７μｇ／ｍＬの最終エキソソーム濃度を有するように、実施例４の「材料」のセクション１で調製されたエキソソーム懸濁液の適切な量で処理された。更に、正常対照群及び病態対照群の細胞培養物は、処理を受けていない。
【0103】
各グループは、培養器（３７℃、５％ＣＯ２）で６時間培養された。５分間５０００ｒｐｍの遠心分離の後、得られた細胞ペレットを収集し、そして、実施例４に記載されている手順に従ってトータルＲＮＡ抽出及びＲＴ－ＰＣＲを行った。
【0104】
そのように得られたｃＤＮＡを、ＤＮＡテンプレートとして、表５に示されるＩＬ－６遺伝子、ＩＬ－１β遺伝子、ＴＮＦ－α遺伝子に対して特異的に設計されたプライマー対及び表４に示される反応条件を使用して、実施例４に記載されている手順に従って定量的なリアルタイムＰＣＲにかけた。１８ＳｒＲＮＡ遺伝子は、リアルタイムＰＣＲの定量分析の内在性コントロールとして使用されて、遺伝子発現データを正常化する。
【0105】
【表5】
【0106】
得られたＰＣＲ産物を蛍光強度測定にかけ、続いて、各ＩＬ－６遺伝子、ＩＬ－１β遺伝子及びＴＮＦ－α遺伝子のサイクル閾（Ｃｔ）値を計算した。定量リアルタイムＰＣＲデータは、実施例４に記載されている比較Ｃｔ方法を使用して分析され、且つ、各ＩＬ－６遺伝子、ＩＬ－１β遺伝子及びＴＮＦ－α遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現レベルは、以下の式（ＩＩＩ）を使用して更に計算された。
【0107】
Ｇ＝Ｈ／Ｉ （ＩＩＩ）
式中、Ｇ＝ＩＬ－６遺伝子、ＩＬ－１β遺伝子、またはＴＮＦ－α遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現レベル
Ｈ＝それぞれのグループにおけるＩＬ－６遺伝子、ＩＬ－１β遺伝子、またはＴＮＦ－α遺伝子の正常化されたＣｔ値
Ｉ＝正常対照群におけるＩＬ－６遺伝子、ＩＬ－１β遺伝子、またはＴＮＦ－α遺伝子の正常化されたＣｔ値
式中、Ｇ＝ＩＬ－６遺伝子、ＩＬ－１β遺伝子、またはＴＮＦ－α遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現レベル
Ｈ＝それぞれのグループにおけるＩＬ－６遺伝子、ＩＬ－１β遺伝子、またはＴＮＦ－α遺伝子の正常化されたＣｔ値
Ｉ＝正常対照群におけるＩＬ－６遺伝子、ＩＬ－１β遺伝子、またはＴＮＦ－α遺伝子の正常化されたＣｔ値
【0108】
こうして得られたデータは、「基本手順」のセクション１に記載された方法に従って解析された。
【0109】
結果：
図９～１１を参照すると、病態対照群における測定されたＩＬ－６遺伝子、ＩＬ－１β遺伝子及びＴＮＦ－α遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現レベルは、正常対照群における測定されたものより著しく高く、ＨＳＦｓにおいてＬＰＳが炎症の誘発に成功したことを示した。更に、実験群における測定されたＩＬ－６遺伝子、ＩＬ－１β遺伝子及びＴＮＦ－α遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現レベルは、病態対照群における測定されたものより低い。
図９～１１を参照すると、病態対照群における測定されたＩＬ－６遺伝子、ＩＬ－１β遺伝子及びＴＮＦ－α遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現レベルは、正常対照群における測定されたものより著しく高く、ＨＳＦｓにおいてＬＰＳが炎症の誘発に成功したことを示した。更に、実験群における測定されたＩＬ－６遺伝子、ＩＬ－１β遺伝子及びＴＮＦ－α遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現レベルは、病態対照群における測定されたものより低い。
【0110】
これらの結果から、本開示の方法で製造されたエキソソームは、炎症誘発性のサイトカインの表現を有効的に抑止でき、故に優れた抗炎症効果を示した。
【0111】
上記試験結果をまとめと、本開示の方法は、ＡＭＳＣｓが大量のエキソソームを含有する高濃度のタンパク質及びＲＮＡを製造することを促進できる。更に、本開示の方法により製造されたエキソソームは、皮膚再生及び傷の治癒、しわの低減及び皮膚の炎症、脱毛の改善を促進する能力がある。その結果、本開示の方法により製造されたエキソソームは、皮膚状態及びスキンケア製品に関する医薬品として開発される可能性が高いと考えられる。
【0112】
以上、本開示の好ましい実施形態及び変化例を説明したが、本開示はこれらに限定されるものではなく、最も広い解釈の精神および範囲内に含まれる様々な構成として、全ての修飾および均等な構成を包含するものとする。
[配列表]
<110> ASCENSION MEDICAL BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.
<120> EXOSOME AND PREPARATION PROCESS AND USE THEREOF
<130> PE-66132-JA
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
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<223> Reverse primer TNF-α-R of TNF-α gene for quantitative real-time PCR
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】