特許 7453709 キトサンを基にした多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリア及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-12

(45)【発行日】2024-03-21

(54)【発明の名称】キトサンを基にした多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリア及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/36 20060101AFI20240313BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20240313BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20240313BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240313BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240313BHJP

【ＦＩ】

A61K47/36

A61K9/51

A61K31/704

A61K48/00

A61P35/00

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2022162857

(22)【出願日】2022-10-10

(65)【公開番号】P2024002868

(43)【公開日】2024-01-11

【審査請求日】2022-10-11

(31)【優先権主張番号】202210731610.3

(32)【優先日】2022-06-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】515223167

【氏名又は名称】中国海洋大学

(74)【代理人】

【識別番号】100178434

【弁理士】

【氏名又は名称】李 じゅん

(72)【発明者】

【氏名】常 菁

(72)【発明者】

【氏名】韓 宝芹

(72)【発明者】

【氏名】孫 楽

(72)【発明者】

【氏名】谷 志洋

(72)【発明者】

【氏名】王 立▲とう▼

(72)【発明者】

【氏名】郭 麗々

(72)【発明者】

【氏名】李 文雅

【審査官】愛清 哲

(56)【参考文献】

【文献】中国特許第１１０１２４０４４（ＣＮ，Ｂ）

【文献】米国特許出願公開第２０１９／０３２１４７７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１０４７５８９４０（ＣＮ，Ａ）

【文献】Redox-responsive nanocarriers for drug and gene co-delivery basedon chitosan derivatives modified mesoporous silica nanoparticles，Colloids and Surfaces B: Biointerfaces，2017年，155，pp.41-50，http://dx.doi.org/10.1016/j.colsurfb.2017.04.002

【文献】Cationic nanoparticles self-assembled from amphiphilic chitosan derivatives containing poly(amidoamine) dendrons and deoxycholic acid as a vector for co-delivery of doxorubicin and gene，Carbohydrate Polymers，2021年，258，pp.1-9，https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2021.117706

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９

Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｐ ３５／００－３５／０４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

キトサンを基にした多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリアであって、
前記ナノキャリアはキトサンを主体とし、キトサンのアミノ基はそれぞれビタミンＥコハク酸エステル（ＶＥＳ）、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（ｍＰＥＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）と結合され、
上記両親媒性は、親水性と疎水性を含み、
前記のキトサンを基にした多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリア（ＶＣＰＨ）は、疎水性薬物と負に帯電する遺伝子とを共担持し、前記疎水性薬物は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）であり、前記負に帯電する遺伝子は、ｐＧＰＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ ＳＴＡＴ３－ｓｈＲＮＡ（ｐＤＮＡ）であり、
ＤＯＸ／ＶＣＰＨの質量比は３：５であり、ＤＯＸ／ＶＣＰＨの封入率は８４．２１±７．７７％であり、薬物担持量は最高３１．５８±２．９１％であり、
前記ナノキャリアの表面ゼータ電位は＋３２．８±７．３ｍＶであり、ＤＯＸとｐＤＮＡとを共担持した後のＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡの表面ゼータ電位は＋１５．１±０．２１ｍＶである
ことを特徴とするキトサンを基にした多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリア。

【請求項2】

前記ナノキャリアは球状又は楕円球状であり、平均粒径は１４７．６±４０．４ｎｍで、ＰＤＩ＝０．３８±０．０２９であり、その中、ビタミンＥコハク酸エステルの置換度は４．１３％で、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルの置換度は２２．６％で、ヒスチジンの置換度は１７．３９％である、
ことを特徴とする請求項１に記載の多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリア。

【請求項3】

前記ナノキャリアは、形態が球状又は楕円球状であり、粒径サイズが比較的に均一であり、分散性がよく、ナノ粒子の間には比較的に強い静電作用があり、良好な生物学的安全性を有する、
ことを特徴とする請求項１に記載の多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリア。

【請求項4】

キトサンを基にした多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリアの製造方法であって、
前記ナノキャリアはキトサンを主体とし、キトサンのアミノ基はそれぞれビタミンＥコハク酸エステル（ＶＥＳ）、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（ｍＰＥＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）と結合され、
上記両親媒性は、親水性と疎水性を含み、
前記のキトサンを基にした多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリア（ＶＣＰＨ）は、疎水性薬物と負に帯電する遺伝子とを共担持し、前記疎水性薬物は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）であり、前記負に帯電する電子遺伝子は、ｐＧＰＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ ＳＴＡＴ３－ｓｈＲＮＡ（ｐＤＮＡ）であり、
ＤＯＸ／ＶＣＰＨの質量比は３：５であり、ＤＯＸ／ＶＣＰＨの封入率は８４．２１±７．７７％であり、薬物担持量は最高３１．５８±２．９１％であり、
前記ナノキャリアの表面ゼータ電位は＋３２．８±７．３ｍＶであり、ＤＯＸとｐＤＮＡとを共担持した後のＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡの表面ゼータ電位は＋１５．１±０．２１ｍＶであり、
前記製造方法は、
（１）キトサン（ＣＳ）を希酸溶液に溶解するステップと、
（２）ビタミンＥコハク酸エステル（ＶＥＳ）溶液を製造し、活性化剤を添加するステップと、
（３）ステップ（１）で得られたキトサン液をステップ（２）ＶＥＳ溶液に滴下し、反応させるステップと、
（４）ステップ（３）で反応の完了した混合液に対してエタノール沈殿、透析及び凍結乾燥を行って、スポンジ状のビタミンＥコハク酸エステル－キトサン（ＶＣ）を得るステップと、
（５）ステップ（４）で得られたＶＣを酸性溶液に溶解し、次に、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（ｍＰＥＧ）溶液を製造して活性化し、続いて、ＶＣ溶液をｍＰＥＧ溶液に滴下して反応させるステップと、
（６）ステップ（５）の反応が完了した後、透析及び凍結乾燥を行って、ビタミンＥコハク酸エステル－キトサン－ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＶＣＰ）を得るステップと、
（７）ステップ（６）で得られたＶＣＰを酸性溶液に溶解し、次に、ヒスチジン（Ｈｉｓ）溶液を製造して活性化し、続いて、ＶＣＰ溶液をＨｉｓ溶液に滴下して反応させるステップと、
（８）ステップ（７）の反応が完了した後、透析及び凍結乾燥を行って、最終の生成物であるビタミンＥコハク酸エステル－キトサン－ポリエチレングリコールモノメチルエーテル－ヒスチジン（ＶＣＰＨ）を得るステップとを含む、
ことを特徴とする多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリアの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）が改質されたナノ材料に関する。具体的には、キトサンを基にした多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリア及びその製造方法に関し、海洋生物材料を製造する技術分野に属する。

【背景技術】

【0002】

キトサンは、Ｄ－グルコサミンとＮ－アセチルグルコサミンユニットにより構成される。キトサンの脱アセチル化度が約５０％に達すると、酸性水溶液に溶解し、キトサンが酸性環境において溶解すると、アミノ基が陽イオンに変化し、キトサンが唯一の陽イオン海洋多糖になる。キトサンは無毒で副作用がなく、良好な保湿や吸着性を持つ。しかしながら、水やほとんどの有機溶媒に溶解しないデメリットを持つため、さまざまな分野における応用が限られている。キトサンのより大きな役割を果たすために、キトサンの活性を有する官能基に対して化学修飾を行うことにより、キトサンの誘導体を得ることができる。化学改質は、キトサンの独自の特性を保留することができるだけではなく、キトサンの物理的及び化学的特性を改善して、キトサン誘導体の応用の範囲を拡大することができる。

【0003】

キトサンを薬物／遺伝子キャリアとして使用することは、現在の研究の焦点であり、幅広い応用の見込みがある。

【発明の概要】

【0004】

本発明の目的は、キトサンを基にした多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリアを提供することである。本発明の他の目的は、このナノキャリアの製造方法を提供することであり、また、このナノキャリアが腫瘍の薬物／遺伝子共同治療における応用について研究する。

【0005】

上記の目的を達成するために、本発明が採用する具体的な技術的な解決手段は次の通りである。

【0006】

キトサンを基にした多機能及び両親媒性の自己組織化ナノキャリア（ＶＣＰＨ）であって、前記ナノキャリアはキトサンを主体とし、キトサンのアミノ基はそれぞれビタミンＥコハク酸エステル（ＶＥＳ）、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（ｍＰＥＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）と結合される。

【0007】

さらに、前記ＶＣＰＨは球状又は楕円球状であり、平均粒径は１４７．６±４０．４ｎｍで、ＰＤＩ＝０．３８±０．０２９であり、その中、ＶＥＳの置換度は４．１３％で、ｍＰＥＧの置換度は２２．６％で、Ｈｉｓの置換度は１７．３９％である。

【0008】

さらに、前記ＶＣＰＨの表面ゼータ電位は＋３２．８±７．３ｍＶである。

【0009】

前記ＶＣＰＨは、形態が球状又は楕円球状であり、粒径サイズは比較的に均一であり、分散性は良好であり、ナノ粒子の間には比較的に強い静電相互作用があり、ナノミセルの安定性を維持することに有利であり、良好な生物学的安全性を有する。

【0010】

上記ナノキャリアの製造方法は、
（１）キトサンを希酸溶液に溶解するステップと、
（２）ＶＥＳ溶液を製造し、活性化剤を添加するステップと、
（３）ステップ（１）で得られたキトサン液をステップ（２）ＶＥＳ溶液に滴下し、反応させるステップと、
（４）ステップ（３）で反応完了した混合液をエタノール沈殿、透析及び凍結乾燥を行って、スポンジ状のビタミンＥコハク酸エステル－キトサン（ＶＣ）を得るステップと、
（５）ステップ（４）で得られたＶＣを酸性溶液に溶解し、ｍＰＥＧ溶液を製造して活性化し、続いて、ＶＣ溶液をｍＰＥＧ溶液に滴下して反応させるステップと、
（６）ステップ（５）の反応が完了した後、透析及び凍結乾燥を行って、生成物であるビタミンＥコハク酸エステル－キトサン－ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＶＣＰ）（Ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ－Ｃｈｉｔｏｓａｎ－Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ Ｅｔｈｅｒ）を得るステップと、
（７）前記ＶＣＰを酸性溶液に溶解し、Ｈｉｓ溶液を製造して活性化してから、ＶＣＰ溶液をＨｉｓ溶液に滴下して反応させるステップと、
（８）ステップ（７）の反応が完了した後、透析及び凍結乾燥を行って、最終の生成物であるビタミンＥコハク酸エステル－キトサン－ポリエチレングリコールモノメチルエーテル－ヒスチジン（ＶＣＰＨ）を得るステップとを含む。

【0011】

また、本発明は、前記ＶＣＰＨの共担持疎水性薬物と負に帯電する電子遺伝子キャリアの製造における応用を提供する。

【0012】

さらに、疎水性薬物をジメチルスルホキシドに分散させ、前記ＶＣＰＨを水に溶解し、両者を均一に混合し、透析処理を行い、次に、封入されなかった疎水性薬物を除去し、凍結乾燥を行う。

【0013】

さらに、負電荷電子遺伝子を水に溶解し、疎水性薬物が封入されたナノ粒子溶液を遺伝子水溶液に滴下し、両者を均一に混合し、静置する。

【0014】

さらに、前記疎水性薬物は疎水性ドキソルビシンであり、負電荷電子遺伝子はすでに構築されたｐＧＰＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ ＳＴＡＴ３－ｓｈＲＮＡ（ｐＤＮＡ）である。

【0015】

ＶＣＰＨを基にして製造されたＤＯＸ／ＶＣＰＨの封入率は８４．２１％であり、薬物担持量は最高３１．５８％であり、表面ゼータ電位は＋２８．１±１．３ｍＶである。また、前記ＤＯＸ／ＶＣＰＨナノ粒子はπ－π共役作用を有し、一定のｐＨ感度を持つ。

【0016】

ＶＣＰＨを基にして製造されたＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡの平均粒径は２６７．９±８．９ｎｍで、ＰＤＩ＝０．２１９±０．００７であり、表面ゼータ（Ｚｅｔａ）電位は＋１５．１±０．２１ｍＶである。その形態は球状又は楕円球状であり、分散は均一で安定である。体内及び体外機能実験で良好な抗腫瘍効果を示しており、体外腫瘍抑制率は６２．４０％で、体内腫瘍抑制率は４０．１２％である。

【0017】

本発明のメリット及び技術的な効果は以下の通りである。
本発明により製造されたＶＣＰＨは、分散性が良く、安定性が高く、良好な生物学的安全性を有する。製造された薬物担持ナノ粒子は、安定性が強く、封入率及び薬物担持量が高い。ＶＣＰＨが薬物キャリアとして効果的に使用できることを実際に検証した。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】ＣＳ、ＶＣ、ＶＣＰ及びＶＣＰＨの赤外線スペクトル画像である。

【図2】ＶＣＰＨの^１ＨＮＲＭ図である。

【図3】ＶＣＰＨナノ粒子の粒径分布図である。

【図4】ＶＣＰＨナノ粒子の表面ゼータ電位図である。

【図5】ＶＣＰＨナノ粒子の走査型電子顕微鏡像である。

【図6】異なる濃度のＶＣＰＨナノ粒子でＬ９２９細胞を処理時、２４時間及び４８時間における増殖状態の観察図である。

【図7】異なる濃度のＶＣＰＨナノ粒子で処理後、Ｌ９２９細胞の相対増殖率の結果図である。

【図8】ＤＯＸ／ＶＣＰＨの粒径分布図である。

【図9】ＤＯＸ／ＶＣＰＨの表面ゼータ電位図である。

【図10】ＤＯＸ／ＶＣＰＨの走査型電子顕微鏡像である。

【図11】ＤＯＸ・ＨＣｌ及びＤＯＸ／ＶＣＰＨのＵＶ吸収スペクトル画像である。

【図12】ＤＯＸ／ＶＣＰＨのｐＨ＝５．７及びｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液における放出曲線である。

【図13】ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡの粒径分布図である。

【図14】ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡの表面ゼータ電位図である。

【図15】ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡナノ粒子の走査型電子顕微鏡像である。

【図16】ＤＯＸ・ＨＣｌ、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ及びＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡのＩＣ_５０結果図である。

【図17】異なるナノ粒子でＡ５４９細胞トランスフェクション後の細胞の相対抑制率の結果図である。

【図18】異なるナノコンポジット粒子でＡ５４９細胞トランスフェクション後のレーザー共焦点走査型顕微鏡の観察図である。

【図19】異なるナノコンポジット粒子でＡ５４９細胞トランスフェクション後のＧＦＰ陽性率をフローサイトメトリーで検出した結果図である。

【図20】異なるナノ粒子群におけるヌードマウスの相対体重の変化図である（生理食塩水群と比較して、＊Ｐ＜０．０５）。

【図21】異なるナノ粒子群におけるヌードマウスの相対腫瘍直径の変化図である。（生理食塩水群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。

【図22】異なる群におけるヌードマウスの主要臓器の臓器指数である。（生理食塩水群と比較して、＊Ｐ＜０．０５）。

【図23】異なる群におけるヌードマウスの腫瘍切除後の固形腫瘍図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、具体的な実施例を基づき、添付の図面と結合して、本発明を更に解釈及び説明する。

【実施例1】

【0020】

０．２４ｇのキトサンを秤量し、６０ｍＬの０．５％酢酸溶液に溶解し、１．５９ｇのＶＥＳを４０ｍＬのＤＭＦに溶解し、三口フラスコに入れる。次に、１．１５ｇのＥＤＣと０．６８ｇのＮＨＳを秤量し、上記の溶液に添加し、２時間磁気撹拌し、キトサン溶液を定圧滴定漏斗により三口フラスコに滴下し、室温で４８時間撹拌する。反応後の混合液を５倍体積の無水エタノールに注ぎ入れて沈殿させ、８時間撹拌した後、１２０００ｒｐｍで室温で２０分間遠心分離する。次に、無水エタノールで４～５回洗浄して沈殿させ、２００ｍＬの蒸留水で溶解して沈殿させ、透析バッグ（阻止率８０００－１４０００ｋ）に入れ、３日間透析し、凍結乾燥を行って、スポンジ状のビタミンＥコハク酸エステル－キトサン（ＶＣ）を得る。

【0021】

０．２４ｇのＶＣを秤量し、６０ｍＬの０．５％酢酸溶液に溶解し、後で使用する。０．２ｇのポリエチレングリコールモノメチルエーテル（ｍＰＥＧ）を秤量し、６０ｍＬの０．５％酢酸溶液に溶解し、０．５７ｇのＥＤＣと０．３４ｇのＮＨＳを添加し、２時間磁気攪拌した後、上記ＶＣ溶液をゆっくりと混合液に滴下し、室温で３６時間機械撹拌する。反応が完了した後、混合液を透析バッグ（阻止率３５００ｋ）に入れ、３日間透析し、凍結乾燥の方法によりビタミンＥコハク酸エステル－キトサン－ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＶＣＰ）を得る。

【0022】

０．４ｇのＶＣＰを秤量し、８０ｍＬの０．５％酢酸溶液に溶解し、後で使用する。０．１９３ｇのヒスチジン（Ｈｉｓ）を秤量し、脱イオン水に溶解し、０．２８６ｇのＥＤＣと０．４７６ｇのＮＨＳを添加し、２時間磁気攪拌した後、上記ＶＣＰ溶液をゆっくりと混合液に滴下し、室温で２４時間機械撹拌する。反応が完了した後、混合液を透析バッグ（阻止率８０００～１４０００ｋ）に入れ、３日間透析し、凍結乾燥を行って、最終生成物であるビタミンＥコハク酸エステル－キトサン－ポリエチレングリコールモノメチルエーテル－ヒスチジン（ＶＣＰＨ）を得る。

【0023】

赤外線分光スペクトルとＮＭＲ（核磁気共鳴）水素スペクトル特性付けを採用して合成された最終生成物であるＶＣＰＨの結果を図１と図２に示す。赤外線及びＮＭＲの結果を組み合わせると、ビタミンＥコハク酸エステル、ｍＰＥＧ及びＨｉｓがキトサンへのグラフトに成功したことを判断できる。レーザー粒径電位アナライザーを採用してＶＣＰＨナノ粒子の粒径、表面ゼータ電位及び多分散指数（ＰＤＩ）を測定し、その結果を図３及び図４に示す。ＶＣＰＨナノ粒子の平均粒径は１４７．６±４０．４ｎｍで、ＰＤＩ＝０．３８±０．０２９で、表面ゼータ電位は＋３２．８±７．３ｍＶである。

【0024】

上記の結果は、ＶＣＰＨナノ粒子の粒径サイズが分散して均一であり、ナノ粒子の間に比較的に強い静電相互作用があり、ナノミセルの安定性を維持するために有利であることを示す。走査型電子顕微鏡でＶＣＰＨナノ粒子の形態を観察し、その結果を図５に示す。この図から、ＶＣＰＨナノ粒子は球状又は楕円球状であり、粒径サイズは約１００～２００ｎｍであり、均一に分散され、明らかな凝集現象がないことが観察できる。

【実施例2】

【0025】

Ｌ９２９細胞が対数増殖期にある時、パンクレアチンを添加して消化した後、培地で消化を停止し、遠心分離し、細胞ペレットを収集し、細胞を再懸濁した後、細胞懸濁液の濃度を２×１０^４個／ｍＬに調整し、１ウェルあたり２００μＬで９６ウェルプレートに播種する。２４時間培養した後、ウェルプレート内の古い培地を吸引して廃棄し、２００μＬの異なる濃度のＶＣＰＨ溶液を含む培地を添加し、濃度勾配を１０、５０、１００及び２００μｇ／ｍＬに設定し、通常の培地で培養された細胞播種ウェル及び通常の培地のみを含むが細胞が播種されていないウェルをそれぞれ対照群及びブランク対照群として設定し、各群に６セットの重複ウェルを設定する。穏やかに混ぜた後、ウェルプレートを２４時間及び４８時間インキュベートした後、それぞれ異なる時点で取り出し、倒立顕微鏡下で細胞の形態を観察し、写真を撮る。次に、各ウェルに２０μＬの製造されたＭＴＴ溶液を添加し、３７℃のインキュベーターで４時間インキュベートし、上清液を吸引して廃棄し、１５０μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加し、マイクロプレートリーダーで３７°Ｃで１０分間振とうしながらインキュベートした後、４９２ｎｍの波長で各ウェルの吸光度値（ＯＤ値）を測定する。次の公式に従って、細胞の相対増殖率（ＲＧＲ）は算出する。

【0026】

細胞の相対増殖率（ＲＧＲ％）＝（実験群の平均吸光度値－ブランク群の平均吸光度値）／（対照群の平均吸光度値－ブランク群の平均吸光度値）×１００％

【0027】

細胞毒性の評価基準は表１の通りである。

【表1】

表１は細胞毒性の評価表である。
備考：グレード０又は１は適格と見なされ、グレード２は細胞の形態と組み合わせて評価する必要があり、グレード３～５は不適格と見なされる。

【0028】

図６は、異なる濃度のＶＣＰＨナノ粒子とＬ９２９細胞を２４時間及び４８時間共培養した細胞の形態図である。この図から、Ｌ９２９細胞は２４時間及び４８時間の培養後にいずれも正常に成長及び増殖でき、細胞の形態が良好で、正常な紡錘形又は扁平状の細胞の形態を呈し、対照群の細胞と比較して細胞数に明らかな差はなく、細胞の変形、収縮、又は細胞間のお互いの分離等の明らかなアポトーシスが見られないことがわかる。

【0029】

図７は、異なる濃度のＶＣＰＨナノ粒子がＬ９２９細胞に対する細胞の相対増殖率をＭＴＴ法（ＭＴＴアッセイプロトコル）で検出した図である。この図から、ＶＣＰＨとＬ９２９を２４時間共培養したか又は４８時間共培養したかにかかわらず、その細胞の相対増殖率はいずれも８０％を超えていることがわかる。細胞毒性の評価によると、各ナノ粒子群の細胞毒性はグレード０又は１であることがわかる。これは、ＶＣＰＨナノ粒子は細胞毒性がなく、良好な細胞適合性を持つことを示す。

【実施例3】

【0030】

１ｍｇ／ｍＬのＶＣＰＨ水溶液を製造し、一定量のドキソルビシン（ＤＯＸ）を１ｍＬのＤＭＳＯに溶解し、ＶＣＰＨ水溶液に滴下し、この溶液を透析バッグ（分子量カットオフは８０００～１４０００ｋである）に移し、４^ｏＣで光を避けて１２時間透析し、２時間ごとに水を交換し、有機溶媒とナノ粒子に未封入されたドキソルビシンを取り除き、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ溶液を得る。

【0031】

上記により、異なる薬物質量比（ＤＯＸ：ＶＣＰＨ薬物質量比はそれぞれ２：５、３：５、４：５である）のＤＯＸ／ＶＣＰＨナノ粒子溶液を製造する。２５ｍＬの茶色のメスフラスコに１ｍＬのＤＯＸ／ＶＣＰＨ溶液を添加し、ジメチルスルホキシドで目盛線まで補足添加する。超音波処理後、蛍光マイクロプレートリーダーでＤＯＸの相対蛍光強度を測定する。公式に従って、薬物質量比が異なるＤＯＸ／ＶＣＰＨの封入率と薬物担持量を算出する。
封入率（ＥＥ％）＝（ナノ粒子に封入された薬物の質量）／（投与質量）×１００％
薬物担持量（ＬＣ％）＝（ナノ粒子に封入された薬物の質量）／（薬物担持ナノ粒子の総質量）×１００％
封入率と薬物担持量に対するＤＯＸ／ＶＣＰＨ薬物質量比の影響を表２に示す。

【0032】

【表2】

表２は封入率と薬物担持量に対する異なる薬物質量比の影響を示したものである。

【0033】

表２から、ＤＯＸ／ＶＣＰＨの薬物担持量は薬物質量比と正の関係であり、封入率は薬物質量比と負の関係があることがわかる。薬物質量比を上げると、ＶＣＰＨナノ粒子の疎水性層に封入される薬物の量が増加されるが、より多くの比率のＤＯＸが未封入され、損失が発生されるため、３：５の薬物質量比を選択してＤＯＸ／ＶＣＰＨを製造する。

【0034】

レーザー粒径電位アナライザーでＤＯＸ／ＶＣＰＨナノ粒子の粒径、表面ゼータ電位及びＰＤＩを測定し、その結果を図８及び９に示す。ＤＯＸ／ＶＣＰＨの平均粒径は２８３．２±３１．７ｎｍで、ＰＤＩ＝０．２７±０．０１１で、表面ゼータ電位は＋２８．１±１．３ｍＶである。これは、ＤＯＸ／ＶＣＰＨの粒径サイズが比較的均一で、分散性が良好であることを示す。走査型電子顕微鏡でＤＯＸ／ＶＣＰＨの形態を観察し、その結果を図１０に示す。ＤＯＸ／ＶＣＰＨの粒径は約２００～３００ｎｍで、球状又は楕円球状であり、ＶＣＰＨナノ粒子と比較してよりふっくらし、明らかな凝集現象がない。

【実施例4】

【0035】

１ｍｇ／ｍＬのＤＯＸ・ＨＣｌ水溶液とＤＯＸ／ＶＣＰＨ溶液をそれぞれ製造し、一定の倍数に希釈した後、それぞれ紫外線分光光度計に入れて２５０～６５０ｎｍの全波長吸収スペクトルを測定し、紫外線吸収スペクトル曲線を描く。

【0036】

ＤＯＸ／ＶＣＰＨ溶液を製造し、ｐＨ＝７．４及び５．７のＰＢＳ緩衝液にそれぞれ１ｍＬのＤＯＸ／ＶＣＰＨ溶液を含む透析バッグ（阻止率は８０００～１４０００ｋである）を浸し、３７°Ｃで１００ｒｐｍで４８時間インキュベートする。設定した時点で、それぞれ２００μＬのＰＢＳを吸引してＤＯＸの蛍光強度を測定し、同時に、２００μＬの新しいＰＢＳを補足添加する。ＤＯＸの標準曲線によってＤＯＸの累積放出量を算出し、ＤＯＸ／ＶＣＰＨの薬物放出曲線を描く。

【0037】

ＤＯＸ・ＨＣｌ及びＤＯＸ／ＶＣＰＨのＵＶ吸収スペクトルの結果を図１１に示す。ＤＯＸ・ＨＣｌの最大吸収ピークは４８５ｎｍであるが、ＤＯＸ／ＶＣＰＨの最大吸収ピークは４９６ｎｍである。ＤＯＸ／ＶＣＰＨはＤＯＸ・ＨＣｌと比較して転移が発生される。これは、ＶＣＰＨによるＤＯＸの封入過程中にπ‐π共役力が発生され、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ共役体系がより安定することを示す。ＤＯＸ／ＶＣＰＨのｐＨ＝７．４及びｐＨ＝５．７条件下における薬物放出行為の結果を図１２に示す。０～０．５時間でＤＯＸの放出は比較的に速いが、０．５～４８時間でＤＯＸ／ＶＣＰＨの放出は遅い。４８時間で、ＤＯＸ／ＶＣＰＨのｐＨ＝７．４及び５．７の環境下におけるＤＯＸの累積放出はそれぞれ１５．５３％及び２８．７２％である。これは、ＤＯＸ／ＶＣＰＨナノ粒子が一定のｐＨ感度を持つことを示す。

【実施例5】

【0038】

ＤＯＸ／ＶＣＰＨ溶液を製造し、５５のＮ／Ｐで４μｇの希釈後のＳＴＡＴ３－ｓｈＲＮＡ組換えプラスミド（ｐＤＮＡ）を含む溶液に等体積のＤＯＸ／ＶＣＰＨ溶液を入れ、完全に混合し、３７°Ｃで３０分間静置し、静電相互作用を利用してｓｈＲＮＡを安定して担持したＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡナノコンポジット粒子を製造する。上記の方法に従って、樹枝状の水溶性ポリマーポリエチレンイミン（ＰＥＩ、１ｍｇ／ｍＬ）と組換えプラスミドとを１０：１のＮ／Ｐ比で配合し、ＰＥＩ／ｐＤＮＡ複合粒子を製造する。

【0039】

ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡナノコンポジット粒子の粒径、表面ゼータ電位及びＰＤＩの結果を図１３及び図１４に示す。ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡナノ粒子の平均粒径は２６７．９±８．９ｎｍで、ＰＤＩ＝０．２１９±０．００７で、表面ゼータ電位＋１５．１±０．２１ｍＶである。粒径サイズは比較的均一で、分散性が良好である。ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡナノコンポジット粒子の走査型電子顕微鏡下における観察結果を図１５に示す。サイズは約２００～３００ｎｍで、球状又は楕円球状であり、均一に分散され、凝集現象がない。

【実施例6】

【0040】

対数増殖期にあるＡ５４９細胞をパンクレアチンで消化し、Ｆ－１２ｋ培地で消化を終了させ、遠心分離して再懸濁し、２×１０^４個／ｍＬの密度で９６ウェルプレートに播種し、２４時間培養した後、元の培地を吸引して廃棄する。次に、ＤＯＸ・ＨＣｌ、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ及びＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡを含む培地を添加する（培地におけるＤＯＸの最終濃度は０．１～１００μｇ／ｍＬの範囲に設定する）。Ｆ－１２ｋ培地で正常培養した細胞を対照群とし、細胞を含まない正常培地をブランク群とする。２４時間培養した後、倒立顕微鏡で細胞の形態を観察し、各ウェルに２０μＬのＭＴＴ溶液を添加し、３７°Ｃで４時間インキュベートし、上清液を吸引して廃棄し、１５０μＬのジメチルスルホキシドを添加し、マイクロプレートリーダーで３７°Ｃで１０分間振とうしながらインキュベートした後、４９２ｎｍの波長で各ウェルの吸光度値を測定し、各群の細胞の相対増殖率を算出する。

【0041】

図１６から、Ａ５４９細胞に対するＤＯＸ・ＨＣｌ、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ及びＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡの２４時間におけるＩＣ_５０は、それぞれ１．３９μｇ／ｍＬ、１２．５０μｇ／ｍＬ及び６．９５μｇ／ｍＬであることがわかる。

【実施例7】

【0042】

対数増殖期にあるＡ５４９細胞をパンクレアチンで消化し、遠心分離して再懸濁し、細胞密度を２×１０^４細胞／ｍＬに調整して９６ウェルプレートに播種し、２４時間培養した後、製造されたＤＯＸ・ＨＣｌ、ＰＥＩ／ｐＤＮＡ、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ、ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ及びＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡを添加する。ここで、ＤＯＸの最終濃度はそれぞれ１、５、１０、１５及び２０μｇ／ｍＬである。Ｆ－１２ｋ培地で正常培養した細胞を対照群とし、細胞を含まない正常培地をブランク群とする。２４時間培養した後、倒立顕微鏡で細胞の形態を観察し、各ウェルに２０μＬのＭＴＴ溶液を添加し、３７°Ｃで４時間インキュベートし、上清液を廃棄し、１５０μＬのジメチルスルホキシドを添加し、マイクロプレートリーダーで各ウェルの吸光度値を測定し、各群の細胞の相対抑制率を算出する。

【0043】

図１７から、ＤＯＸ薬物濃度の増加に伴い、Ａ５４９細胞の増殖に対するＤＯＸ・ＨＣｌ、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ、ＰＥＩ／ｐＤＮＡ及びＶＣＰＨ／ｐＤＮＡの抑制は有意に向上され、ＤＯＸ濃度が２０μｇ／ｍＬの場合、ＤＯＸ・ＨＣｌの細胞増殖抑制率は７１．８１％で、ＤＯＸ／ＶＣＰＨの細胞増殖抑制率は５７．９３％で、ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡの細胞増殖抑制率は４１．８５％で、ＰＥＩ／ｐＤＮＡの細胞増殖抑制率は６８．５６％で、二重負荷ナノ粒子ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡの細胞増殖抑制率は６２．４０％であることがわかる。

【実施例8】

【0044】

対数増殖期にあるＡ５４９細胞をパンクレアチンで消化し、遠心分離して再懸濁し、細胞密度を１０^５個／ｍＬに調整して６ウェルプレートに播種し、２４時間培養した後、製造された裸のｐＤＮＡ（ｎａｋｅｄ ｐＤＮＡ）、ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ及びＰＥＩ／ｐＤＮＡを添加する。培地中のＤＯＸの最終濃度は２０μｇ／ｍＬである。４８時間培養した後、ウェルプレート内の培地を吸引して廃棄し、光を避けてＰＢＳで洗浄した後、レーザー共焦点顕微鏡で蛍光観察を行う。トランスフェクションに成功した細胞は、ＧＦＰ緑色蛍光タンパク質（励起波長４８８ｎｍで、発光波長５０７ｎｍである）を発現できる。実験では、裸のｐＤＮＡ群とＰＥＩ／ｐＤＮＡ群をそれぞれ陰性対照群と陽性対照群として使用する。

【0045】

上記のように、裸のｐＤＮＡ、ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ及びＰＥＩ／ｐＤＮＡをＡ５４９細胞にトランスフェクトし、４８時間培養した後、光を避けた条件下で、ＰＢＳで洗浄した後、パンクレアチンを添加して消化し、新鮮な培地で消化を終了させた後、遠心分離し、ウェルプレート内の細胞をＰＢＳで再懸濁し、細胞濾過器でフローサイトメトリー検出を行う。

【0046】

図１８から、陰性対照の裸のｐＤＮＡ群では蛍光シグナル発現はないが、異なるナノ粒子を含む群が示されるトランスフェクション効率は不一致であり、ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ群、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ群及びＰＥＩ／ｐＤＮＡ群はいずれも比較的に強い蛍光発現強度と数量を示しており、その中、ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ群は陽性対照のＰＥＩ／ｐＤＮＡ群と比較して発現数量と強度がいずれも比較的に弱いが、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ群の緑色蛍光の発現量と強度が最高であることがわかる。図１９から、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ群のトランスフェクション率は９８．２％で、ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ群のトランスフェクション率は１５．１％で、ＰＥＩ／ｐＤＮＡ群のトランスフェクション効率は２１％であることがわかる。

【実施例9】

【0047】

フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（励起波長４９０ｎｍ）は、イソチオシアネートによって炭素－窒素二重結合を開き、ＶＣＰＨのアミノ基と反応してＶＣＰＨを標識する。０．１ｇのＶＣＰＨを秤量し、１０ｍＬの０．５％酢酸に溶解し、０．１ＭのＮａＯＨ溶液でｐＨを９．０に調整し、１０ｍＬのメタノールを添加し、攪拌して均一に混合させ、１２ｍＬの濃度が２ｍｇ／ｍＬであるＦＩＴＣメタノール溶液を滴下し、４℃で光を避けて２４時間反応させ、反応溶液を９５％エタノールで繰り返し洗浄した後、透析バッグ（阻止率は３５００ｋである）に入れ、３日間透析し、凍結乾燥後、ＦＩＴＣ－ＶＣＰＨを得る。２ｍｇのＣｙ５を秤量し、８００μＬのジメチルスルホキシドに溶解し、１ｍＬの等体積のジメチルスルホキシドに溶解した濃度が０．５μｇ／μＬであるｐＤＮＡを添加し、光を避けて攪拌しながら１２時間反応させた後、遠心分離し、得られた上清がＣｙ５－ｐＤＮＡである。

【0048】

対数増殖期にあるＡ５４９細胞をパンクレアチンで消化し、遠心分離して再懸濁し、８×１０^４個／ｍＬに希釈して６ウェルプレートに播種し、２４時間培養し、元の培地を吸引して廃棄し、製造されたＤＯＸ・ＨＣｌ、ＤＯＸ／ＦＩＴＣ－ＶＣＰＨ、ＤＯＸ／ＦＩＴＣ－ＶＣＰＨ／Ｃｙ５－ｐＤＮＡ、ＦＩＴＣ－ＶＣＰＨ／Ｃｙ５－ｐＤＮＡを添加する。培地中のＤＯＸの最終濃度は２０μｇ／ｍＬである。異なるナノ粒子を添加してから１時間、３時間及び５時間後に、それぞれ１ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色液を添加し、３７°Ｃで１５分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、１ｍＬのＰＢＳを添加して細胞を浸漬し、レーザー共焦点顕微鏡で細胞内における標識材料の分布を観察する。
細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色された後青色を呈し、ＶＣＰＨはＦＩＴＣで標識された後緑色を呈し、Ｃｙ５で標識されたｐＤＮＡとＤＯＸは赤色を呈す。トランスフェクションの１時間後、すべての群の青色蛍光、赤色蛍光及び緑色蛍光の強度はいずれも明らかではなく、この時点で複合粒子は既に細胞に入っている。トランスフェクションの３時間後、ＤＯＸ・ＨＣｌ群は細胞核で比較的に強い赤色蛍光を示したが、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ群は細胞質で赤色蛍光が比較的に強く、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ群とＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ群は細胞質と細胞核ですべて赤色蛍光を示した。トランスフェクションの５時間後、各群の青色蛍光、赤色蛍光及び緑色蛍光は基本的に重複する。これは、ＶＣＰＨに封入されたＤＯＸとｐＤＮＡがいずれも細胞核に送達されたことを示す。

【実施例10】

【0049】

Ｆ－１２ｋ培地でＡ５４９細胞を培養し、３回継代した後、パンクレアチンで消化し、遠心分離して再懸濁し、０．９％生理食塩水で細胞密度を１×１０^７個／ｍＬに調整する。Ａ５４９細胞を１匹あたり０．１ｍＬの接種量でＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ雌マウスの右側の脇下に接種する。正常に１週間給餌した後、ヌードマウスの接種部位から約８０～１００ｍｍ^３の腫瘍が成長したら、ヌードマウス腫瘍モデルが成功に確立される。

【0050】

腫瘍状態の良好な３０匹の担癌マウスをランダムに６つの群に分ける。即ち、生理食塩水群、ＤＯＸ・ＨＣｌ群、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ群、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ群、ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ群及びＰＥＩ／ｐＤＮＡ群である。ヌードマウスの体重に従い、１回の注射あたり５ｍｇ／ｋｇの用量で、３日に１回、４回連続してヌードマウスの尾静脈に注射し、３日ごとにヌードマウスの体重、腫瘍の長さ（Ｌ）及び短径（Ｗ）を記録する。ヌードマウスの治療が完了した後、それらの首を切断して殺し、ヌードマウスの脇下の腫瘍体及び心臓、肝臓、脾臓、肺及び腎臓の臓器組織を剥がして収集し、各群の腫瘍体と臓器組織の重量を正確に計量して記録し、各群の腫瘍抑制率と臓器指数を算出する。次の公式に従って、腫瘍体積のサイズを算出する。

【数1】

【0051】

投与の初日を０日目として標記する。図２０から、生理食塩水群のヌードマウスの体重は常に増加しており、ＤＯＸ・ＨＣｌ群の体重は投与２回目以降明らかな下降傾向があり、投与１２日目以降体重が上昇の変化を呈しており、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ群でも投与後に体重減少の状況があったが、減少の程度は比較的に低く、その後徐々に上昇しており、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ群、ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ群及びＰＥＩ／ｐＤＮＡ群の体重は常に上昇傾向を呈していることがわかる。投与２４日後、ＤＯＸ・ＨＣｌ群は生理食塩水群と比較して顕著な差があり、他の４つの群には顕著な差がなく、ＶＣＰＨは薬物／遺伝子キャリアとして化学療法薬物の毒性と副作用を効果的に減少できることを示す。治療の２４日後、図２１から、治療開始以来、生理食塩水群のヌードマウスの腫瘍体積は常に上昇傾向を呈し、治療２４日後、生理食塩水群の腫瘍体積は初期体積の６．３６倍に増加し、ＤＯＸ・ＨＣｌ群は初期体積の３．８９倍に増加し、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ群は５．１８倍に増加し、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ群は初期体積の４．３７倍に増加し、ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ群は初期体積の４．６９倍に増加し、ＰＥＩ／ｐＤＮＡ群は初期体積の４．０６倍に増加していることがわかる。治療の２４日後、ＤＯＸ・ＨＣｌ群は生理食塩水群と比較して非常に顕著な差があり、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ群及びＰＥＩ／ｐＤＮＡ群は生理食塩水群と比較して顕著な差があるが、他の２つの群は顕著な差がない。ヌードマウスの腫瘍体積の相対的な変化から、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ群の腫瘍体積変化はＤＯＸ／ＶＣＰＨ群及びＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ群よりも明らかな利点があることがわかる。これは、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡは比較的に良好な腫瘍抑制効果を持つことを示す。

【0052】

臓器指数は、臓器に対する薬物又は材料の影響を初歩的に反映することができる。図２２から、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ群、ＶＣＰＨ／ＤＮＡ群及びＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ＤＮＡ群の各組織の臓器指数は生理食塩水群と比較して顕著な差がないが、ＤＯＸ・ＨＣｌ群の脾臓及びＰＥＩ／ｐＤＮＡ群の肝臓は生理食塩水群と比較して顕著な差があることがわかる。これは、ＤＯＸとＰＥＩはヌードマウスの正常な臓器組織に一定の毒性作用を有することを示す。

【0053】

治療完了後、ヌードマウスを殺した後、各群の腫瘍体を剥がし、写真を撮って記録する。図２３から、固形腫瘍の写真は治療期間中のヌードマウスの相対腫瘍体積の変化傾向と比較的に一致することがわかる。ヌードマウス体内の腫瘍抑制率の公式に従って計算すると、ＤＯＸ・ＨＣｌ群の腫瘍抑制率は５０．６０％で、ＰＥＩ／ｐＤＮＡ群の腫瘍抑制率は４３．７１％で、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ群の腫瘍抑制率は３６．７２％で、ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ群の腫瘍抑制率は２９．４９％で、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡ群の腫瘍抑制率は４０．１２％である（表３を参照）。これから、ＤＯＸ／ＶＣＰＨ／ｐＤＮＡはＤＯＸ／ＶＣＰＨ及びＶＣＰＨ／ｐＤＮＡと比較して比較的に優れた体内抗腫瘍効果を示すことがわかる。

【0054】

【表3】

表３はヌードマウス体内における異なる群の腫瘍抑制率を示したものである。

【0055】

本発明の親水性及び疎水性のブロックの改質で自己組織化して製造された多機能の新型ナノミセルＶＣＰＨは、両親媒性、受動的ターゲティング、ｐＨ感度及び遺伝子トランスフェクション効率の向上などの特徴を有し、多機能のインテリジェント薬物キャリア及び遺伝子キャリアである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】