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▶ シャンハイ フダン－チャンジャン バイオ－ファーマシューティカル カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-12
(45)【発行日】2024-03-21
(54)【発明の名称】抗体薬物複合体、その中間体、製造方法及び使用
(51)【国際特許分類】
A61K 47/68 20170101AFI20240313BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240313BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20240313BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240313BHJP
【ＦＩ】
A61K47/68
A61P35/00
C07K16/28 ZNA
C12N15/09 Z
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2023534207
(86)(22)【出願日】2020-12-04
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-11-10
(86)【国際出願番号】 CN2020133872
(87)【国際公開番号】W WO2022116141
(87)【国際公開日】2022-06-09
【審査請求日】2023-08-03
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】510157476
【氏名又は名称】シャンハイ フダン－チャンジャン バイオ－ファーマシューティカル カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】クオ、チンソン
(72)【発明者】
【氏名】シェン、イーチュン
(72)【発明者】
【氏名】ヤン、トン
(72)【発明者】
【氏名】パオ、ピン
(72)【発明者】
【氏名】カオ、ペイ
(72)【発明者】
【氏名】ウー、ファン
(72)【発明者】
【氏名】シュイ、チュン
【審査官】三上 晶子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５０３７８４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５３７８９３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／０３４１７６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１７－５１０５４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５１５１３７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５２６８９５（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ９／００－ ９／７２
Ａ６１Ｋ ４７／００－ ４７／６９
Ａ６１Ｐ １／００－ ４３／００
Ｃ０７Ｋ １６／２８
Ｃ１２Ｎ １５／０９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
構造が式Ｉで表される通りである、抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。【化1】
（ただし、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体又はＨＥＲ３抗体の変異体であり、
前記ＨＥＲ３抗体の変異体はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示される通りであり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ又はＰ３３１Ｓの１つ又は複数の部位突然変異を有するアミノ酸配列であり、
ｍは２～８であり、
Ｄは、細胞毒性薬トポイソメラーゼ阻害剤であり、前記細胞毒性薬トポイソメラーゼ阻害剤は、
【化2】
であり、Ｒ ２ 及びＲ ５ は、それぞれ独立してＨ、Ｃ １ ～Ｃ ６ アルキル又はハロゲンであり
、Ｒ ３ 及びＲ ６ は、それぞれ独立してＨ、Ｃ １ ～Ｃ ６ アルキル又はハロゲンであり、Ｒ ４ 及びＲ ７ は、それぞれ独立してＣ １ ～Ｃ ６ アルキルであり、
Ｒ１は、１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、又は１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルであり、前記Ｒ１－１、Ｒ１－２及びＲ１－３は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｌ１は、フェニルアラニン残基、アラニン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、プロリン残基、及びバリン残基の１つ又は複数であり、ｐは、２であり、
Ｌ２は、
【化3】
であり、ここで、ｎは、独立して１～１２であり、ｃ末端はカルボニルを介してＬ１に連結され、ｆ末端はＬ３のｄ末端に連結され、
前記Ｌ３は、
【化4】
であり、ここで、ｂ末端は前記Ａｂに連結され、ｄ末端は前記Ｌ２のｆ末端に連結される。）
【請求項2】
Ａｂが、ＨＥＲ３抗体である場合、前記ＨＥＲ３抗体はＨＥＲ３抗体Ａであり、前記ＨＥＲ３抗体Ａにおける軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号１に示される通りであり、重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号２に示される通りである、請求項１に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物
【請求項3】
前記Ｌ３のｂ末端と前記抗体上のスルフヒドリルとは、チオエーテル結合の形態で連結され、及び／又は、前記Ｒ２及びＲ５が、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、Ｃ１～Ｃ４アルキルであり、
及び／又は、前記Ｒ２及びＲ５が、それぞれ独立してハロゲンである場合、前記ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素であり、
及び／又は、前記Ｒ３及びＲ６が、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、Ｃ１～Ｃ４アルキルであり、
及び／又は、前記Ｒ３及びＲ６が、それぞれ独立してハロゲンである場合、前記ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素であり、
及び／又は、前記Ｒ４及びＲ７が、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、Ｃ１～Ｃ４アルキルであり、
及び／又は、前記Ｒ１が、１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、
及び／又は、前記Ｒ１が複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記複数は、２つ又は３つであり、
及び／又は、前記Ｒ１－１及びＲ１－２がそれぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、
及び／又は、前記Ｒ１が、１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、
及び／又は、前記Ｒ１が、複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記複数は、２つ又は３つであり、
及び／又は、前記Ｒ１－３が、Ｃ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、
及び／又は、前記Ｒ１が、Ｃ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、
及び／又は、前記ｍは、４～８の整数又は非整数であり、
及び／又は、前記ｐは、２であり、
及び／又は、前記ｎは、８～１２であり、
及び／又は、前記Ｒ１－１、Ｒ１－２及びＲ１－３が、独立してＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、Ｃ１～Ｃ４アルキルであることを特徴とする、請求項２に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。
【請求項4】
前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ及びＬ２３５Ａの部位突然変異又はＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓの部位突然変異を有するアミノ酸配列であり、
及び／又は、前記Ｒ２及びＲ５が、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、
及び／又は、前記Ｒ２及びＲ５が、それぞれ独立してハロゲンである場合、前記ハロゲンは、フッ素であり、
及び／又は、前記Ｒ３及びＲ６が、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、
及び／又は、前記Ｒ３及びＲ６が、それぞれ独立してハロゲンである場合、前記ハロゲンは、フッ素であり、
及び／又は、前記Ｒ４及びＲ７が、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、
及び／又は、前記Ｒ１が、１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記－ＮＲ１－１Ｒ１－２は、－Ｎ（ＣＨ３）２であり、
及び／又は、前記Ｒ１が、１つの－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記１つの－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルは、
【化5】
であり、
及び／又は、前記Ｒ１が、１つのＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記１つのＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルは、
【化6】
であり、
及び／又は、ｍは、７．４９、７．５６、７．５９、７．６０、７．６３、７．６５、７．６７、７．７２、７．７８、７．８１、７．８２又は７．８３であり、
及び／又は、前記（Ｌ１）ｐは、
【化7】
であり、ここで、ｇ末端はカルボニルを通じて前記Ｌ２のｃ末端に連結され、
及び／又は、前記ｎは、８、９、１０、１１又は１２であり、
及び／又は、前記Ｒ１－１、Ｒ１－２及びＲ１－３が、独立してＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、メチルであることを特徴とする、請求項３に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。
【請求項5】
Ｒ２及びＲ５は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルはメチルであり、及び／又は、Ｒ３及びＲ６は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルはメチルであり、
及び／又は、Ｒ４及びＲ７は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルはエチルである、
請求項４に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。
【請求項6】
Ｒ２及びＲ５は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルであり、及び／又は、Ｒ３及びＲ６は、それぞれ独立してハロゲンであり、
及び／又は、Ｒ４及びＲ７は、エチルであり、
及び／又は、前記Ｒ１は、１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキル又はＣ３～Ｃ１０シクロアルキルである、請求項２に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。
【請求項7】
前記Ｄは、【化8】
であることを特徴とする、請求項６に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。
【請求項8】
前記抗体薬物複合体は、下記のいずれか１つのスキームであることを特徴とする、請求項２～７のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。（スキーム１：
前記Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示される通りであり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ又はＰ３３１Ｓの１つ又は複数の部位突然変異を有するアミノ酸配列であり、
スキーム２：
前記Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示される通りであり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ又はＰ３３１Ｓの１つ又は複数の部位突然変異を有するアミノ酸配列であり、
Ｄは、
【化9】
であり、前記Ｒ２及びＲ５は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルであり、前記Ｒ３及びＲ６は、それぞれ独立してハロゲンであり、
スキーム３：
前記Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示される通りであり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ又はＰ３３１Ｓの１つ又は複数の部位突然変異を有するアミノ酸配列であり、
Ｄは、
【化10】
であり、前記Ｒ２及びＲ５は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルであり、前記Ｒ３及びＲ６は、それぞれ独立してハロゲンであり、
前記ｍは、７～８であり、
前記Ｌ１は、独立してバリン残基及び／又はアラニン残基であり、
スキーム４：
前記Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示される通りであり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ又はＰ３３１Ｓの１つ又は複数の部位突然変異を有するアミノ酸配列であり、 前記Ｄは、
【化11】
であり、
スキーム５：
前記Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示される通りであり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ又はＰ３３１Ｓの１つ又は複数の部位突然変異を有するアミノ酸配列であり、
前記Ｄは、
【化12】
であり、
前記ｍは、７～８であり、
前記Ｌ１は、独立してバリン残基及び／又はアラニン残基である。）
【請求項9】
前記抗体薬物複合体は、下記のいずれか１つのスキームであることを特徴とする、請求項２～７のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。（スキーム１－１：
前記Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示される通りであり、前
記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ及びＬ２３５Ａの部位突然変異、又はＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓの部位突然変異を有するアミノ酸配列であり、
Ｄは、
【化13】
であり、
スキーム２－１：
前記Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示される通りであり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ及びＬ２３５Ａの部位突然変異、又はＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓの部位突然変異を有するアミノ酸配列であり、
Ｄは、
【化14】
であり、
スキーム３－１：
前記Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示される通りであり、前
記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ及びＬ２３５Ａの部位突然変異、又はＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓの部位突然変異を有するアミノ酸配列であり
Ｄは、
【化15】
であり、
前記ｍは、７～８であり、
前記Ｌ１は、独立してバリン残基及び／又はアラニン残基である。）
【請求項10】
前記抗体薬物複合体は、下記の式で表されるいずれか１つの化合物であることを特徴とする、請求項２に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。
【化16】
【化17】
【化18】
又は
【化19】
（ただし、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、ｍは、７．４９、７．５６、７．５９、７．６０、７．６３、７．６５、７．６７、７．７２、７．７８、７．８１又は７．８３である。）
【請求項11】
前記抗体薬物複合体は、下記のいずれか１つのスキームであることを特徴とする、請求項１０に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。（スキームＡ：
【化20】
【化21】
【化22】
【化23】
又は
【化24】
ただし、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗
体Ａの変異体において軽鎖は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列であり、重鎖は、配列表の配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列から選択され、
スキームＢ：
【化25】
又は
【化26】
ただし、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、ｍは、７．５６、７．５９、７．６３、７．６７、７．７２、７．８１又は７．８３であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体において軽鎖は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列であり、重鎖は、配列表の配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列から選択され、
スキームＣ：
【化27】
【化28】
又は
【化29】
ただし、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体において軽鎖は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列であり、重鎖は、配列表の配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列から選択される。）
【請求項12】
前記抗体薬物複合体は、下記の式で表されるいずれか１つの化合物であって、
【化30】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、７．６３であり、
【化31】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖は
、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の軽鎖であり、重鎖は、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列の重鎖であり、ｍは、７．５９であり、
【化32】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の軽鎖であり、重鎖は、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列の重鎖であり、ｍは、７．６７であり、
【化33】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、７．８１であり、
【化34】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の軽鎖であり、重鎖は、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列の重鎖であり、ｍは、７．６３であり、
【化35】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の軽鎖であり、重鎖は、配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列の重鎖であり、ｍは、７．８２であり、
【化36】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、７．５６であり、
【化37】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、７．８３であり、
【化38】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、７．４９であり、
【化39】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、７．６０であり、
【化40】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、７．７８であり、
【化41】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、７．６５であり、
【化42】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、７．８３であり、又は
【化43】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、７．８２であることを特徴とする、請求項２に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物。
【請求項13】
式ＩＩで表される化合物とＡｂ－水素とを下記に示されるカップリング反応を実行させるステップを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体の製造方法。【化44】
【請求項14】
物質Ｘ及び医薬補助剤を含む、医薬組成物であって、前記物質Ｘは、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物である、医薬組成物。
【請求項15】
ＨＥＲ３タンパク質阻害剤の製造における、物質Ｘ又は請求項１４に記載の医薬組成物の使用であって、前記物質Ｘは、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物である、使用。
【請求項16】
腫瘍を治療及び／又は予防するための医薬の製造における、物質Ｘ又は請求項１４に記載の医薬組成物の使用であって、前記物質Ｘは、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物である、使用。
【請求項17】
前記腫瘍は、ＨＥＲ３陽性腫瘍であり、前記ＨＥＲ３陽性腫瘍は、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌及び胃癌の１つ又は複数である、請求項１６に記載の使用。
【請求項18】
前立腺癌細胞は、２２Ｒｖ１細胞及び／又はＬＮＣａＰ細胞であり、及び／又は、結腸直腸癌細胞は、ＳＷ６２０細胞であり、
及び／又は、肺癌細胞は、ＮＣＩ－Ｈ８２０細胞及び／又はＨＣＣ８２７細胞であり、
及び／又は、卵巣癌細胞は、ＯＶＣＡＲ－８細胞であり、
及び／又は、乳癌細胞は、ＳＫ－ＢＲ－３細胞である、
請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はバイオ医学の分野に関し、特に抗体薬物複合体、その中間体、製造方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ＨＥＲファミリーは、構造的に類似し、機能的に関連する４つのＲＴＫｓから構成され、それぞれＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４であり、受容体間の二量体化は、ＨＥＲファミリーがその機能とシグナル伝達活性を発揮するための基本条件である。受容体の二量体化後、細胞内で高度に保存されたキナーゼ残基の架橋とリン酸化を誘導し、その後下流のタンパク質を動員して活性化し、シグナル伝達カスケードを引き起こし、細胞増殖、生存、遊走、発生、転移などの過程を調節する。ＨＥＲ３はニューレグリン（Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ、ＮＲＧ）に結合できるが、固有のチロシンキナーゼ活性が欠如しているため、他の受容体とヘテロ二量体を形成することによってのみその機能を発揮することができる。一方、ＨＥＲ２はチロシンキナーゼ活性を持っているが、それに結合する対応するリガンドがない。ＨＥＲ２の細胞外領域の構造は天然の開いた構造になっており、これによりＨＥＲ２はリガンド活性化なしに他の受容体と二量体化することができるため、ＨＥＲ２はＨＥＲ３の好ましい二量体化パートナーである。
【0003】
ＨＥＲ２とＨＥＲ３はヘテロ二量体を形成し、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を直接に活性化することができ、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路は、腫瘍細胞の増殖を促進する最も重要なシグナル伝達経路であり、遺伝子発現、細胞代謝、細胞骨格の再構成等を調節する過程に関与するため、ＨＥＲ２－ＨＥＲ３ヘテロ二量体は、ＨＥＲファミリーの中で最も強いシグナル伝達能力を持つ二量体であると考えられている。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を直接的に又は間接的に阻害する薬物は、ＨＥＲ３転写を増加させ、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴの負のフィードバック調節を通じてＨＥＲ３発現を上方調節及び活性化させ、下流経路が再活性化され、その結果、抗ＨＥＲ２及び抗ＥＧＦＲ標的治療に対する薬剤耐性に関連する薬剤耐性が生じることが研究により表明された。更に、ＨＥＲ３の主要なリガンドであるＮＲＧ１は、パラクリン経路及びオートクリン経路を介してＨＥＲ３のシグナル伝達などに関与し、それによってＨＥＲ３経路の活性化を誘導し、ＨＥＲファミリー標的治療に対する薬剤耐性にも関与している可能性がある。また、ＨＥＲ３は、ＥＧＦＲなどのＨＥＲファミリーの他のメンバー、及びＭＥＴ、ＩＧＦ－１Ｒなどの非ＨＥＲファミリーのメンバーと二量体を形成し、腫瘍の発生、発達に関与することもできる。ＨＥＲ３が他の標的とヘテロ二量体を形成して最も強力なＰＩ３Ｋ／ＡＫＴを送達できること、チロシンキナーゼ活性の欠如により、ＨＥＲ３の治療薬物には主にＨＥＲ３の３つの細胞外ドメインを標的として抗体薬を開発している。現在、複数のモノクローナル抗体医薬品又は二重特異性抗体医薬品が臨床研究段階にあるが、既存のデータでは、臨床有効性データが十分に有意ではなく、今後の開発の可能性は小さいことを示している。
【0004】
抗体－小分子薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）は、新世代の抗体標的治療薬であり、主に癌腫瘍の治療に使用される。ＡＤＣ医薬品は、低分子細胞傷害性薬剤（Ｄｒｕｇ）、抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ）、及び抗体と細胞傷害性薬剤をつなぐリンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）の３つの部分で構成されており、低分子細胞傷害性薬剤は化学結合により抗体タンパク質に結合している。ＡＤＣ薬物は抗体を使用して小分子薬を特異的に認識し、癌特異抗原を発現する癌細胞標的に誘導し、エンドサイトーシスを通じて癌細胞に侵入する。リンカー部分は、細胞内の低ｐＨ値環境又はリソソームプロテアーゼの作用下で破壊され、小分子の細胞毒性薬物を放出し、正常組織細胞に損傷を与えることなく癌細胞を特異的に殺傷する効果を達成できる。従って、ＡＤＣ薬物は抗体の標的特異性及び癌細胞に対する小分子毒素の高い毒性の特徴を組み合わせ、薬物の有効な治療用量範囲（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）を大幅に拡大する。臨床研究では、ＡＤＣ薬物は有効性が高く、血液中で比較的安定し、循環系及び健康な組織に対する低分子細胞傷害性薬剤（化学薬品）の毒性を効果的に軽減できることが証明されており、現在、抗癌薬物の国際研究開発における研究ホットスポットとなっている。
【0005】
抗体薬物のＦｃ末端には、主にＦｃγ受容体即ちＦｃγＲ、Ｆｃ新生児受容体即ちＦｃＲｎ及びＣ型レクチン受容体などの様々な受容体が含まれている。ＦｃγＲ受容体には多くのサブタイプがあり、異なるＦｃγＲは主に細胞性免疫と体液性免疫を連結する重要な因子である、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣなどの異なるエフェクター機能を媒介する。モノクローナル抗体医薬品では、ＦｃγＲによって媒介されるエフェクター機能が一部の治療用抗体の有効性において重要な役割を果たしているが、ＡＤＣ薬物では、ＦｃγＲがＡＤＣ薬物のＦｃに結合することで、関連する細胞の内在化、輸送及び活性分子の放出を媒介し、深刻な毒性事象を引き起こす可能性がある。例えば、ＦｃγＲＩＩａ（即ち、ＣＤ３２ａ）は、ＤＭ１系ＡＤＣ薬物を媒介し、血小板減少症などの毒性事象の発生を引き起こす可能性があるため、ＡＤＣ薬物のＦｃγＲＩＩａへの結合を減少させることで、ＡＤＣ薬物によるＦｃγＲＩＩａ細胞の死滅を減少させ、それによってＦｃγＲＩＩａによって媒介される毒性事象の発生が減少させることができる。
【0006】
ＨＥＲ３を標的としたモノクローナル抗体医薬品開発の臨床効果は不十分であるため、当該標的に基づいてより有効性の高い抗体薬物複合体の研究開発又はＦｃγＲＩＩａへの結合を減少させることができる抗体薬物複合体を開発することは、臨床的に大きな価値があると考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明が解決しようとする技術的課題は、既存の抗体薬物複合体の種類が単一である欠点を克服するために、抗体薬物複合体、その中間体、製造方法及び使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明により提供される抗体薬物複合体は、良好なターゲティングを有し、ＨＥＲ３を陽性発現する腫瘍細胞に対して良好な阻害効果を有し、更に良好な創薬可能性、高い安全性を有する。当該抗体薬物複合体は、ＨＥＲ３に対して阻害効果を有し、またＳＫ－ＢＲ－３及びＳＷ６２０細胞に対して阻害効果を有し、且つ２２Ｒｖ１、ＬＮＣａＰ、ＮＣＩ－Ｈ８２０、ＯＶＣＡＲ－８及びＨＣＣ８２７細胞の少なくとも１つに対して良好な阻害効果を有する。
【0009】
本発明は、以下の技術的解決手段を通じて上記の技術的問題を解決する。
【0010】
本発明は、構造が式Ｉで表される通りである、抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物を提供する。
【0011】
【化1】
【0012】
ただし、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体又はＨＥＲ３抗体の変異体であり、
ｍは２～８であり、
Ｄは、細胞毒性薬トポイソメラーゼ阻害剤であり、
Ｒ１は、１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１４アリール又は５～１４員ヘテロアリールであり、前記５～１４員ヘテロアリールのヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１つ又は複数であり、ヘテロ原子の数は、１、２、３又は４であり、前記Ｒ１－１、Ｒ１－２及びＲ１－３は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｌ１は、独立してフェニルアラニン残基、アラニン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、システイン残基、グルタミン酸残基、ヒスチジン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、リジン残基、メチオニン残基、プロリン残基、セリン残基、スレオニン残基、トリプトファン残基、チロシン残基及びバリン残基の１つ又は複数であり、ｐは、２～４であり、
ｍは２～８であり、
Ｄは、細胞毒性薬トポイソメラーゼ阻害剤であり、
Ｒ１は、１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ６～Ｃ１４アリール又は５～１４員ヘテロアリールであり、前記５～１４員ヘテロアリールのヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１つ又は複数であり、ヘテロ原子の数は、１、２、３又は４であり、前記Ｒ１－１、Ｒ１－２及びＲ１－３は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｌ１は、独立してフェニルアラニン残基、アラニン残基、グリシン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、システイン残基、グルタミン酸残基、ヒスチジン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、リジン残基、メチオニン残基、プロリン残基、セリン残基、スレオニン残基、トリプトファン残基、チロシン残基及びバリン残基の１つ又は複数であり、ｐは、２～４であり、
【0013】
Ｌ２は、
であり、ここで、ｎは、独立して１～１２であり、ｃ末端はカルボニルを介してＬ１に連結され、ｆ末端は前記Ｌ３のｄ末端に連結され、
【化2】
であり、ここで、ｎは、独立して１～１２であり、ｃ末端はカルボニルを介してＬ１に連結され、ｆ末端は前記Ｌ３のｄ末端に連結され、
【0014】
Ｌ３は、
であり、ここで、ｂ末端は前記Ａｂに連結され、ｄ末端は前記Ｌ２のｆ末端に連結される。
【化3】
であり、ここで、ｂ末端は前記Ａｂに連結され、ｄ末端は前記Ｌ２のｆ末端に連結される。
【0015】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体薬物複合体において、特定の基は以下の定義を有し、言及されていない群の定義は、上記の方案のいずれかに記載される通りである（以下、本段落の内容を「本発明の好ましい実施形態において」と言う）。
【0016】
前記ＨＥＲ３抗体はＨＥＲ３抗体Ａであり、前記ＨＥＲ３抗体Ａにおける軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号１に示される通りであり、重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号２に示される通りである。
【0017】
本発明の好ましい実施形態において、前記ＨＥＲ３抗体の変異体はＨＥＲ３抗体Ａの変異体である。
【0018】
本発明の好ましい実施形態において、前記ＨＥＲ３抗体の変異体はＨＥＲ３抗体と比べて、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％以上の相同性を有している。
【0019】
本発明の好ましい実施形態において、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、好ましくは配列表の配列番号１に示される通りである。
【0020】
本発明の好ましい実施形態において、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ又はＰ３３１Ｓの１つ又は複数の部位突然変異を有するアミノ酸配列である。例えば、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ及びＬ２３５Ａの部位突然変異（即ち配列表の配列番号３）を有し、又は、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓの部位突然変異（即ち配列表の配列番号４）を有し、前記の複数は好ましくは２つ又は３つである。
【0021】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｌ３のｂ末端は、好ましくは前記抗体のスルフヒドリルと、チオエーテル結合の形態で連結されている。
【0022】
【化4】
を例として、
【化5】
と前記抗体のシステイン残基との連結形態は
【化6】
である。
【0023】
本発明の好ましい実施形態において、Ｄが細胞毒性薬トポイソメラーゼ阻害剤である場合、前記細胞毒性薬トポイソメラーゼ阻害剤は
【化7】
【0024】
であり、Ｒ２及びＲ５は、それぞれ独立してＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル又はハロゲンであり、Ｒ３及びＲ６は、それぞれ独立してＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル又はハロゲンであり、Ｒ４及びＲ７は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルである。
【0025】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ２及びＲ５が、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、好ましくはＣ１～Ｃ４アルキルであり、より好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、最も好ましくはメチルである。
【0026】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ２及びＲ５が、それぞれ独立してハロゲンである場合、前記ハロゲンは、好ましくはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素であり、より好ましくはフッ素である。
【0027】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ３及びＲ６が、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、好ましくはＣ１～Ｃ４アルキルであり、より好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、最も好ましくはメチルである。
【0028】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ３及びＲ６が、それぞれ独立してハロゲンである場合、前記ハロゲンは、好ましくはフッ素、塩素、臭素又はヨウ素であり、より好ましくはフッ素である。
【0029】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ４及びＲ７が、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、好ましくはＣ１～Ｃ４アルキルであり、より好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、最も好ましくはエチルである。
【0030】
本発明の好ましい実施形態において、Ｒ２及びＲ５は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルである。
【0031】
本発明の好ましい実施形態において、Ｒ３及びＲ６は、それぞれ独立してハロゲンである。
【0032】
本発明の好ましい実施形態において、Ｒ４及びＲ７は、エチルである。
【0033】
本発明の好ましい実施形態において、Ｄは、
である。
【化8】
である。
【0034】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｄが、
である場合、前記抗体薬物複合体は、
又は
であってもよい。
【化9】
である場合、前記抗体薬物複合体は、
【化10】
又は
【化11】
であってもよい。
【0035】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ１が、１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、より好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、最も好ましくはエチルである。
【0036】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ１が複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記複数は、２つ又は３つである。
【0037】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ１－１及びＲ１－２が、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、最も好ましくはメチルである。
【0038】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ１が、１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記－ＮＲ１－１Ｒ１－２は、好ましくは－Ｎ（ＣＨ３）２である。
【0039】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ１が、１つの－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記１つの－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルは、
である。
【化12】
である。
【0040】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ１が、１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、好ましくはＣ１～Ｃ４アルキルであり、より好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、最も好ましくはエチルである。
【0041】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ１が、複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記複数は、２つ又は３つである。
【0042】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ１－３が、Ｃ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、最も好ましくはメチルである。
【0043】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ１が、１つのＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記１つのＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルは、
である。
【化13】
である。
【0044】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ１がＣ１～Ｃ６アルキルである場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、最も好ましくはメチルである。
【0045】
本発明の好ましい実施形態において、前記ｍは、整数（例えば、２、３、４、５、６、７又は８）又は非整数であり、好ましくは４～８であり、より好ましくは６～８であり、更に好ましくは７～８であり、また、更に好ましくは７．４～７．８５であり、例えば、７．４９、７．５６、７．５９、７．６０、７．６３、７．６５、７．６７、７．７２、７．７８、７．８１、７．８２又は７．８３である。
【0046】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｌ１好ましくはフェニルアラニン残基、アラニン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、プロリン残基及びバリン残基の１つ又は複数であり、より好ましくはフェニルアラニン残基、アラニン残基、グリシン残基及びバリン残基の１つ又は複数であり、より好ましくはバリン残基及び／又はアラニン残基であり、前記複数は、好ましくは２つ又は３つであり、前記ｐは、好ましくは２である。
【0047】
本発明の好ましい実施形態において、前記（Ｌ１）ｐは、より好ましくは
であり、ここで、ｇ末端はカルボニルを通じて前記Ｌ２のｃ末端に連結される。
【化14】
であり、ここで、ｇ末端はカルボニルを通じて前記Ｌ２のｃ末端に連結される。
【0048】
本発明の好ましい実施形態において、前記ｎは、好ましくは８～１２であり、例えば、８、９、１０、１１及び１２であり、また例えば、８又は１２である。
【0049】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ１－１、Ｒ１－２及びＲ１－３が、独立してＣ１～Ｃ６アルキルであることが好ましい場合、前記Ｃ１～Ｃ６アルキルは、好ましくはＣ１～Ｃ４アルキルであり、より好ましくはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル又はｔｅｒｔ－ブチルであり、最も好ましくはメチルである。
【0050】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｒ１は、好ましくは１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキル又はＣ３～Ｃ１０シクロアルキルであり、Ｒ１は、更に好ましくは１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、又は、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり、より好ましくは１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、又は、１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルであり、最も好ましくは、１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルである。
【0051】
本発明の好ましい実施形態において、前記式Ｉで表される化合物は、下記のいずれか１つのスキームに記載された通りである。
【0052】
スキーム１：
前記Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、好ましくは配列表の配列番号１に示される通りであり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ又はＰ３３１Ｓの１つ又は複数の部位突然変異を有するアミノ酸配列であり、例えば、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ及びＬ２３５Ａの部位突然変異（即ち配列表の配列番号３）を有し、又は、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓの部位突然変異（即ち配列表の配列番号４）を有し、
前記Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、好ましくは配列表の配列番号１に示される通りであり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ又はＰ３３１Ｓの１つ又は複数の部位突然変異を有するアミノ酸配列であり、例えば、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ及びＬ２３５Ａの部位突然変異（即ち配列表の配列番号３）を有し、又は、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓの部位突然変異（即ち配列表の配列番号４）を有し、
【0053】
Ｄは、
であり、Ｒ２及びＲ５は、それぞれ独立してＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル又はハロゲンであり、Ｒ３及びＲ６は、それぞれ独立してＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル又はハロゲンであり、Ｒ４及びＲ７は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｄは、好ましくは
であり、
【化15】
であり、Ｒ２及びＲ５は、それぞれ独立してＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル又はハロゲンであり、Ｒ３及びＲ６は、それぞれ独立してＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル又はハロゲンであり、Ｒ４及びＲ７は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｄは、好ましくは
【化16】
であり、
【0054】
Ｒ１は、１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキル又はＣ３～Ｃ１０シクロアルキルであり、前記Ｒ１－１、Ｒ１－２及びＲ１－３は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルであり、
【0055】
Ｌ１は、独立してフェニルアラニン残基、アラニン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、プロリン残基及びバリン残基の１つ又は複数であり、
【0056】
スキーム２：
前記Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、好ましくは配列表の配列番号１に示される通りであり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ又はＰ３３１Ｓの１つ又は複数の部位突然変異を有するアミノ酸配列であり、例えば、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ及びＬ２３５Ａの部位突然変異（即ち配列表の配列番号３）を有し、又は、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓの部位突然変異（即ち配列表の配列番号４）を有し、
前記Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、好ましくは配列表の配列番号１に示される通りであり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ又はＰ３３１Ｓの１つ又は複数の部位突然変異を有するアミノ酸配列であり、例えば、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ及びＬ２３５Ａの部位突然変異（即ち配列表の配列番号３）を有し、又は、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓの部位突然変異（即ち配列表の配列番号４）を有し、
【0057】
Ｄは、
であり、前記Ｒ２及びＲ５は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルであり、前記Ｒ３及びＲ６は、それぞれ独立してハロゲンであり、Ｄは、好ましくは
であり、
【化17】
であり、前記Ｒ２及びＲ５は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルであり、前記Ｒ３及びＲ６は、それぞれ独立してハロゲンであり、Ｄは、好ましくは
【化18】
であり、
【0058】
前記Ｒ１は、１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、又は、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり、
【0059】
スキーム３：
前記Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、好ましくは配列表の配列番号１に示される通りであり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ又はＰ３３１Ｓの１つ又は複数の部位突然変異を有するアミノ酸配列であり、例えば、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ及びＬ２３５Ａの部位突然変異（即ち配列表の配列番号３）を有し、又は、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓの部位突然変異（即ち配列表の配列番号４）を有し、
前記Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、好ましくは配列表の配列番号１に示される通りであり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ又はＰ３３１Ｓの１つ又は複数の部位突然変異を有するアミノ酸配列であり、例えば、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ及びＬ２３５Ａの部位突然変異（即ち配列表の配列番号３）を有し、又は、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓの部位突然変異（即ち配列表の配列番号４）を有し、
【0060】
Ｄは、
であり、前記Ｒ２及びＲ５は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルであり、前記Ｒ３及びＲ６は、それぞれ独立してハロゲンであり、Ｄは、好ましくは
であり、
【化19】
であり、前記Ｒ２及びＲ５は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ６アルキルであり、前記Ｒ３及びＲ６は、それぞれ独立してハロゲンであり、Ｄは、好ましくは
【化20】
であり、
【0061】
前記ｍは、７～８であり、
前記Ｒ１は、１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、又は、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり、
前記Ｌ１は、独立してバリン残基及び／又はアラニン残基であり、
前記Ｒ１は、１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、又は、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり、
前記Ｌ１は、独立してバリン残基及び／又はアラニン残基であり、
【0062】
スキーム４：
前記Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、好ましくは配列表の配列番号１に示される通りであり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ又はＰ３３１Ｓの１つ又は複数の部位突然変異を有するアミノ酸配列であり、例えば、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ及びＬ２３５Ａの部位突然変異（即ち配列表の配列番号３）を有し、又は、具有Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓの部位突然変異（即ち配列表の配列番号４）を有し、
前記Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、好ましくは配列表の配列番号１に示される通りであり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ又はＰ３３１Ｓの１つ又は複数の部位突然変異を有するアミノ酸配列であり、例えば、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ及びＬ２３５Ａの部位突然変異（即ち配列表の配列番号３）を有し、又は、具有Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓの部位突然変異（即ち配列表の配列番号４）を有し、
【0063】
前記Ｄは、
であり、
【化21】
であり、
【0064】
前記Ｒ１は、１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、又は、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり、
【0065】
スキーム５：
前記Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、好ましくは配列表の配列番号１に示される通りであり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ又はＰ３３１Ｓの１つ又は複数の部位突然変異を有するアミノ酸配列であり、例えば、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ及びＬ２３５Ａの部位突然変異（即ち配列表の配列番号３）を有し、又は、具有Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓの部位突然変異（即ち配列表の配列番号４）を有し、
前記Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、好ましくは配列表の配列番号１に示される通りであり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列にＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ又はＰ３３１Ｓの１つ又は複数の部位突然変異を有するアミノ酸配列であり、例えば、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ及びＬ２３５Ａの部位突然変異（即ち配列表の配列番号３）を有し、又は、具有Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓの部位突然変異（即ち配列表の配列番号４）を有し、
【0066】
前記Ｄは、
であり、
【化22】
であり、
【0067】
前記ｍは、７～８であり、
前記Ｒ１は、１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、又は、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり、
前記Ｌ１は、独立してバリン残基及び／又はアラニン残基である。
前記Ｒ１は、１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、又は、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり、
前記Ｌ１は、独立してバリン残基及び／又はアラニン残基である。
【0068】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体薬物複合体は、好ましくは
又は
である。
【化23】
【化24】
又は
【化25】
である。
【0069】
本発明の好ましい実施形態において、前記Ｌ２は、好ましくは
である。
【化26】
である。
【0070】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体薬物複合体における抗体は、好ましくはＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示される通りであり、重鎖は、配列表の配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列から選択され、Ｄは、
【化27】
【0071】
であり、Ｌ１は、バリン残基及び／又はアラニン残基であり、ｐは、２であり、（Ｌ１）ｐは、好ましくは
【化28】
【0072】
であり、Ｒ１は、１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル又はＣ１～Ｃ６アルキルであり、好ましくは、１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキル、又は、１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルであり、より好ましくは、１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルであり、前記Ｒ１－１、Ｒ１－２及びＲ１－３は、独立してＣ１～Ｃ４アルキルであり、好ましくはメチルであり、前記１つ又は複数の－ＮＲ１－１Ｒ１－２により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルは、好ましくは
【化29】
【0073】
であり、前記１つ又は複数のＲ１－３Ｓ（Ｏ）２－により置換されたＣ１～Ｃ６アルキルは、好ましくは
【化30】
【0074】
であり、Ｌ２は、
【化31】
【0075】
であり、Ｌ３は、
である。
【化32】
である。
【0076】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体薬物複合体は、好ましくは下記の式で表されるいずれか１つの化合物である。
【0077】
【化33】
【0078】
【化34】
【0079】
【化35】
であり、
【0080】
ただし、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、ｍは、７．４９、７．５６、７．５９、７．６０、７．６３、７．６５、７．６７、７．７２、７．７８、７．８１又は７．８３であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖は、好ましくは配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列であり、重鎖は、好ましくは配列表の配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列から選択される。
【0081】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体薬物複合体は、好ましくは下記の式で表されるいずれか１つの化合物である。
【0082】
【化36】
【0083】
【化37】
【0084】
【化38】
【0085】
【化39】
【0086】
又は
であり、
【化40】
であり、
【0087】
ただし、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖は、好ましくは配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列であり、重鎖は、好ましくは配列表の配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列から選択される。
【0088】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体薬物複合体は、好ましくは下記の式で表されるいずれか１つの化合物である。
【0089】
【化41】
【0090】
【化42】
【0091】
又は
であり、
【化43】
であり、
【0092】
ただし、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、ｍは、７．５６、７．５９、７．６３、７．６７、７．７２、７．８１又は７．８３であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖は、好ましくは配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列であり、重鎖は、好ましくは配列表の配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列から選択される。
【0093】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体薬物複合体は、好ましくは下記の式で表されるいずれか１つの化合物である。
【0094】
【化44】
【0095】
【化45】
【0096】
【化46】
【0097】
【化47】
又は
【0098】
【化48】
であり、
【0099】
ただし、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａ又はＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖は、好ましくは配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列であり、重鎖は、好ましくは配列表の配列番号３又は配列番号４に示されるアミノ酸配列から選択される。
【0100】
本発明の好ましい実施形態において、前記抗体薬物複合体は、好ましくは下記の式で表されるいずれか１つの化合物である。
【0101】
【化49】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、好ましくは７．５６であり、
【0102】
【化50】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖は、好ましくは配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の軽鎖であり、重鎖は、好ましくは配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列の重鎖であり、ｍは、好ましくは７．６７であり、
【0103】
【化51】
【0104】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖は、好ましくは配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の軽鎖であり、重鎖は、好ましくは配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列の重鎖であり、ｍは、好ましくは７．７２であり、
【0105】
【化52】
【0106】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、好ましくは７．６３であり、
【0107】
【化53】
【0108】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖は、好ましくは配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の軽鎖であり、重鎖は、好ましくは配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列の重鎖であり、ｍは、好ましくは７．５９であり、
【0109】
【化54】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖は、好ましくは配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の軽鎖であり、重鎖は、好ましくは配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列の重鎖であり、ｍは、好ましくは７．６７であり、
【0110】
【化55】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、好ましくは７．８１であり、
【0111】
【化56】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖は、好ましくは配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の軽鎖であり、重鎖は、好ましくは配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列の重鎖であり、ｍは、好ましくは７．６３であり、
【0112】
【化57】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａの変異体であり、前記ＨＥＲ３抗体Ａの変異体における軽鎖は、好ましくは配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列の軽鎖であり、重鎖は、好ましくは配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列の重鎖であり、ｍは、好ましくは７．８２であり、
【0113】
【化58】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、好ましくは７．５６であり、
【0114】
【化59】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、好ましくは７．８３であり、
【0115】
【化60】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、好ましくは７．４９であり、
【0116】
【化61】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、好ましくは７．６０であり、
【0117】
【化62】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、好ましくは７．７８であり、
【0118】
【化63】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、好ましくは７．６５であり、
【0119】
【化64】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、好ましくは７．８３であり、又は
【0120】
【化65】
、Ａｂは、ＨＥＲ３抗体Ａであり、ｍは、好ましくは７．８２である。
【0121】
本発明はまた、抗体を提供し、前記抗体における軽鎖のアミノ酸配列は、好ましくは配列表の配列番号１に示される通りであり、前記抗体における重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３又は配列番号４に示される通りである。
【0122】
本発明はまた、式ＩＩで表される化合物とＡｂ－水素を下記に示されるカップリング反応を実行させるステップを含む、抗体薬物複合体の製造方法を提供する。
【0123】
【化66】
【0124】
ただし、前記Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｒ１、ｐ及びＡｂの定義は上記で記載された通りである。
【0125】
本発明において、前記カップリング反応の条件及び操作は、当技術分野におけるカップリング反応の通常の条件及び操作であってもよい。
【0126】
本発明はまた、上記の物質Ｘ及び医薬補助剤を含む、医薬組成物を提供し、前記物質Ｘは、上記抗体薬物複合体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物又はその薬学的に許容される塩の溶媒和物である。
【0127】
前記医薬組成物において、前記物質Ｘの使用量は、治療有効量であってもよい。
【0128】
本発明はまた、ＨＥＲ３タンパク質阻害剤の製造における上記の物質Ｘ又は上記の医薬組成物の使用を提供する。
【0129】
本発明はまた、腫瘍を治療及び／又は予防するための医薬の製造における、上記の物質Ｘ又は上記の医薬組成物の使用を提供し、前記腫瘍は、好ましくはＨＥＲ３陽性腫瘍である。
【0130】
前記使用において、前記ＨＥＲ３陽性腫瘍は、好ましくはＨＥＲ３陽性肺癌、卵巣癌、結直腸癌、乳癌、前立腺癌及び胃癌の１つ又は複数である。
【0131】
本発明のいくつかの実施形態において、前記前立腺癌において、前立腺癌細胞は２２Ｒｖ１細胞である。
【0132】
本発明のいくつかの実施形態において、前記前立腺癌において、前立腺癌細胞はＬＮＣａＰ細胞である。
【0133】
本発明のいくつかの実施形態において、前記結腸直腸癌において、結腸直腸癌細胞はＳＷ６２０細胞である。
【0134】
本発明のいくつかの実施形態において、前記肺癌において、肺癌細胞はＮＣＩ－Ｈ８２０細胞である。
【0135】
本発明のいくつかの実施形態において、前記卵巣癌において、卵巣癌細胞はＯＶＣＡＲ－８細胞である。
【0136】
本発明のいくつかの実施形態において、前記肺癌において、肺癌細胞はＨＣＣ８２７細胞である。
【0137】
本発明のいくつかの実施形態において、前記乳癌において、乳癌細胞はＳＫ－ＢＲ－３細胞である。
【0138】
別途に説明しない限り、本発明の明細書及び請求の範囲で使用される用語は、以下の意味を有する。
【0139】
前記の医薬賦形剤は、医薬製造分野で広く使用されている賦形剤であってもよい。賦形剤は主に、安全、安定及び機能的な医薬組成物を提供するために使用され、更に対象に投与後に有効成分が所望の速度で溶解できるようにさせる方法、又は対象が組成物の投与を受けた後、有効成分の効果的な吸収が促進されるようにする方法を提供することができる。前記医薬賦形剤は、不活性充填剤であってもよく、又は特定の機能、例えば、当該組成物の全体的なｐＨを安定化させるか又は組成物の有効成分の分解を防ぐ機能を提供する。前記医薬賦形剤には、緩衝剤、キレート剤、防腐剤、可溶化剤、安定剤、賦形剤及び界面活性剤、着色剤、矯味剤及び甘味料の１つ又は複数が含まれる。
【0140】
用語「薬学的に許容される」とは、一般に無毒で、安全で、また患者への使用に適した塩、溶媒、助剤などを指す。前記「患者」は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
【0141】
用語「薬学に許容される塩」とは、本発明の化合物と比較的に無毒の、薬学的に許容される酸又は塩基で製造された塩を指す。本発明の化合物に比較的に酸性の官能基が含まれる場合、単独の溶液又は適切な不活性溶媒において十分な量の薬学的に許容される塩基とこれらの化合物の中性形態とを接触させることで塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩は、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、ビスマス塩、アンモニウム塩、ジエタノールアミン塩などが含まれるが、これらに限定されない。本発明の化合物に比較的塩基性の官能基が含まれる場合、単独の溶液又は、適切な不活性溶媒において十分な量の薬学的に許容される酸とこれらの化合物の中性形態とを接触させることで酸付加塩を得ることができる。前記薬学的に許容される酸は、無機酸を含み、前記無機酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、リン酸、亜リン酸、硫酸などが含まれるが、これらに限定されない。前記薬学的に許容される酸は、有機酸を含み、前記有機酸は、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、クエン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、イソニコチン酸、酸性クエン酸、オレイン酸、タンニン酸、パントテン酸、酒石酸水素、アスコルビン酸、ゲンチジン酸、フマル酸、グルコン酸、糖酸、ギ酸、エタンスルホン酸、パモ酸（即ち、４，４’－メチレンビス（３－ヒドロキシ－２－ナフトエ酸）、アミノ酸（グルタミン酸、アルギニンなど）などが含まれるが、これらに限定されない。本発明の化合物に比較的酸性及び比較的塩基性の官能基が含まれる場合、塩基付加塩又は酸付加塩に転換させることができる。具体的には、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．， “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６６： １－１９ （１９７７）、又は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ： Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｕｓｅ （Ｐ． Ｈｅｉｎｒｉｃｈ Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃａｍｉｌｌｅ Ｇ． Ｗｅｒｍｕｔｈ， ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ， ２００２）を参照することができる。
【0142】
用語「溶媒和物」とは、本発明の化合物を化学量論的又は非化学量論的量の溶媒と結合させることによって形成される物質を指す。溶媒和物中の溶媒分子は、規則的又は非規則的配置で存在することができる。前記溶媒は、水、メタノール、エタノールなどを含むが、これらに限定されない。
【0143】
天然又は天然配列のＨＥＲ３は、自然から分離されることができるか、或いは組換えＤＮＡ技術、化学合成、又は上記及び同様の技術の組み合わせによって製造することができる。
【0144】
ここで、抗体は最も広い意味で解釈され、それは当該免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識領域を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂肪、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合することができる。具体的には、所望の生物学的活性を有する限り、完全なのモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体及び抗体フラグメントが含まれる。本発明の抗体の変異体とは、天然ポリペプチドと同等の生物学的活性が保持されているという条件で、アミノ酸配列の突然変異体、及び天然ポリペプチドの共有結合誘導体を指す。アミノ酸配列突然変異体と天然アミノ酸配列との違いは、一般に、天然アミノ酸配列中の１つ又は複数のアミノ酸が置換されるか、又はポリペプチド配列での１つ又は複数のアミノ酸が欠失及び／又は挿入されることである。欠失突然変異体には、天然ポリペプチドフラグメントと、Ｎ末端及び／又はＣ末端切断型突然変異体が含まれる。一般に、アミノ酸配列突然変異体は、天然の配列と比較して、少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％）の相同性を有する。
【0145】
モノクローナル抗体又は単一の抗体とは、当該抗体が実質的に均質な抗体の群に由来することを指し、即ち、存在する可能性のある少量の天然突然変異又は抗体の発現及び製造中に生成される異性体を除いて、当該群を構成する各抗体は完全に同様である。モノクローナル抗体は、単一の抗原に対して高い特異性を持つ。一方、ポリクローナル抗体には異なる决定基を標的とする異なる抗体が含まれており、各モノクローナル抗体は抗原の１つの决定基のみを標的とする。
【0146】
本発明において、モノクローナル抗体には、特にキメラ抗体及びそのフラグメントも含まれ、即ち、抗体の重鎖及び／又は軽鎖の一部は特定の種類、特定のタイプ又は特定のサブタイプに由来し、残りの部分は別の種類、別のタイプ又は別のサブタイプに由来する。
【0147】
本発明の抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、又はこれらの技術の組み合わせ、或いはこの分野で既知の他の技術など、当該分野で既知の技術を用いて製造することができる。
【0148】
用語「抗体薬物複合体比」（ｄｒｕｇ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ、即ちＤＡＲ）についての説明する。Ｌ－Ｄは抗体上の結合点との反応性基であり、Ｌはリンカーであり、ＤはＬに連結された抗体に更に結合する細胞傷害性薬剤であり、本発明においてＤはＤｘｄであり、各抗体がＤに最終的に結合するＤＡＲの数をｍで表され、又はｍはＤと結合した単一の抗体の数を表すこともできる。いくつかの実施形態において、ｍは、実際には、２～８、４～８又は６～８の間に位置する平均値であり、又はｍは、２、３、４、５、６、７又は８のいずれか１つの整数であり、１つの実施形態において、ｍは、２、４、６、又は８の平均値であり、他の実施形態において、ｍは、２、３、４、５、６、７又は８の平均値である。
【0149】
リンカーとは、抗体と薬物との間を直接的又は間接的連結する部分を指す。リンカーのｍＡｂへの結合は、表面リジン、酸化炭水化物への還元カップリング、及び鎖間ジスルフィド結合によって放出されるシステイン残基の還元など、様々な方法で実現できる。様々なＡＤＣ結合系は当技術分野で周知であり、ヒドラゾン、ジスルフィド及びペプチドベースの結合を含む。
【0150】
用語「治療」又はほかの類似の同義語が、例え癌等に適用される場合、患者の体内の癌細胞の数を減らすか、又は除去すること、又は癌の症状を軽減するための過程またはプロセスを指す。癌又は他の増殖性障害における「治療」は、必ずしも癌細胞又は他の障害が実際に解消されること、細胞又は障害の数が実際に減少すること、又は、癌又は他の障害の症状が実際に減少することを意味するわけではない。通常、成功の可能性が低くても、がんの治療法が実行されるが、患者の病歴と推定生存期間を考慮すると、全体的に有益な行動方針をもたらすと考えられる。
【0151】
用語「予防」とは、疾患又は障害を獲得又は発症するリスクを低減することを指す。
【0152】
用語「シクロアルキル」とは、単環式シクロアルキル及び多環式シクロアルキルを含む、３～２０個の炭素原子を有する飽和環式炭化水素原子団（例えば、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル）を指す。シクロアルキルは３～２０個の炭素原子を含み、好ましくは３～１０個の炭素原子を含み、より好ましくは３～６個の炭素原子を含む。シクロアルキルの実例にはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル及びシクロデシルなどが含まれが、これらに限定されない。
【0153】
用語「アルキル」とは、特定の数の炭素原子数を含む直鎖又は分岐鎖アルキルを指す。アルキルの実例には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル及び類似したアルキルが含まれる。
【0154】
用語「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を指す。
【0155】
用語「ヘテロアリール」とは、１、２、３又は４つの独立してＮ、Ｏ及びＳから選択される、ヘテロ原子を含むアリール（又は芳香環）を指し、フリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、ジアゾリル、イミダゾリル、ピロリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、インダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイソオキサゾリル、キノリニル、イソキノリルなどの単環式、二環式又は三環式芳香族系であってもよい。
【0156】
用語「アリール」とは、任意の安定な単環式又は二環式炭素環を指し、その中ではのすべての環はいずれも芳香族である。上記アリール単位の実例はフェニル、又はナフチルを含む。
【0157】
前記好ましい条件は、当技術分野の通常の知識を違反しない限り、任意に組み合わせて、本発明の各々の好ましい実施例を得ることができる。
【0158】
特に説明しない限り、本発明における室温は２０～３０℃を指す。
【0159】
本発明で使用される試薬及び原料は市販品として入手できる。
【発明の効果】
【0160】
本発明の積極的な進歩効果は：
１．本発明により提供されるＨＥＲ３抗体を含む抗体薬物複合体は、良好なターゲティングを有し、ＨＥＲ３などを発現する各種腫瘍細胞に対して良好な阻害効果を有する。
１．本発明により提供されるＨＥＲ３抗体を含む抗体薬物複合体は、良好なターゲティングを有し、ＨＥＲ３などを発現する各種腫瘍細胞に対して良好な阻害効果を有する。
【0161】
２．体内研究は、本発明の抗体薬物複合体は、より優れた体外細胞毒性、体内抗腫瘍活性を有することを示している。
【0162】
３．本発明の抗体薬物複合体は良好な溶解性、良好な創薬可能性を有し、カップリング製造過程において沈殿などの異常現象がなく、抗体薬物複合体の製造に非常に適している。
【図面の簡単な説明】
【0163】
【図1】抗体の軽鎖、重鎖の発現ベクターの構築を示し、その中でＡｂ－Ｌは、抗体の軽鎖であり、Ａｂ－Ｈは抗体の重鎖である。
【発明を実施するための形態】
【0164】
以下、実施例の形態によって更に本発明を説明するが、これによって本発明を前記実施例の範囲内に限定するわけではない。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常の方法及び条件、或いは商品の説明書に従って選ばれる。
【0165】
略語の説明：
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＣＨＯ チャイニーズハムスター卵巣細胞
ＨＴＲＦ 均質時間分解蛍光法
ＰＢ リン酸緩衝液
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ＴＥＣＰ トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＨＡＴＵ ２－（７－アザベンゾトリアゾールオキシド）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ｖ／ｖ Ｖ／Ｖ、体積比
ＵＶ 紫外線可視光
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着測定法
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
ｒｐｍ 回／分（一分間に回転する回転数）
ＦＢＳ ウシ胎児血清
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＣＨＯ チャイニーズハムスター卵巣細胞
ＨＴＲＦ 均質時間分解蛍光法
ＰＢ リン酸緩衝液
ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸
ＴＥＣＰ トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＨＡＴＵ ２－（７－アザベンゾトリアゾールオキシド）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ｖ／ｖ Ｖ／Ｖ、体積比
ＵＶ 紫外線可視光
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着測定法
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
ｒｐｍ 回／分（一分間に回転する回転数）
ＦＢＳ ウシ胎児血清
【0166】
実施例１：ＨＥＲ３抗体の製造
本発明では、親和性が高く、ＨＥＲ３を特異的に標的とするモノクローナル抗体ＦＤＡ０２６を選択し、その軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１に示される通りであり、その重鎖のアミノ酸配列は配列番号２に示される通りであった。ＦＤＡ０２６の軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列は、全遺伝子合成（Ｓｕｚｈｏｕ Ｇｅｎｅｗｉｚ）によって取得した。ＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ（ＴＡＫＡＲＡから購入）の二重酵素切断によってそれぞれｐＶ８１担体にそれぞれ構築し（図１）、ライゲーションによってＴｒａｎｓ１－Ｔ１コンピテントセルに形質転換させ（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入、商品番号：ＣＤ５０１－０３）、ＰＣＲ同定のためにクローンを選択して検査し、配列確認し、培養・増幅した陽性クローンを血漿から抽出して、抗体軽鎖の真核生物発現血漿ＦＤＡ０２６－Ｌ／ｐＶ８１及び抗体重鎖の真核生物発現血漿ＦＤＡ０２６－Ｈ／ｐＶ８１を得、これら２つの血漿をＸｂａＩ（Ｔａｋａｒａから購入、商品番号：１０９３Ｓ）で酵素切断して線状化させ、軽鎖、重鎖の真核生物発現血漿の比は１．５／１であり、電気ショックにより懸濁増殖適応のＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣから購入）に形質転換し、電気ショック後の細胞を２０００～５０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに連結し、３週間培養した後、ＨＴＲＦ法（均質時間分解蛍光法）によって発現量を測定し、その中から発現量が上位１０位の細胞プールを選択して増幅した後、凍結保存した。細胞を１２５ｍｌの振盪フラスコ（３０ｍｌの培養体積）で復蘇させ、３７℃、５．０％のＣＯ２、１３０ｒｐｍで振盪培養し、３日後に１０００ｍｌの振盪フラスコ（３００ｍｌの培養体積）に拡張し、３７℃、５．０％のＣＯ２、１３０ｒｐｍで振盪培養し、４日目から１日おきに初期培養体積の５～８％のフィード培地の追加を開始し、１０～１２日間培養した後に培養を終了し、回収液を９５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、細胞沈殿を除去し、上清を収集し、更に０．２２μｍ濾膜で濾過し、処理された試料をＭａｂＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥから購入）で精製して抗体ＦＤＡ０２６を得た。
本発明では、親和性が高く、ＨＥＲ３を特異的に標的とするモノクローナル抗体ＦＤＡ０２６を選択し、その軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１に示される通りであり、その重鎖のアミノ酸配列は配列番号２に示される通りであった。ＦＤＡ０２６の軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列は、全遺伝子合成（Ｓｕｚｈｏｕ Ｇｅｎｅｗｉｚ）によって取得した。ＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ（ＴＡＫＡＲＡから購入）の二重酵素切断によってそれぞれｐＶ８１担体にそれぞれ構築し（図１）、ライゲーションによってＴｒａｎｓ１－Ｔ１コンピテントセルに形質転換させ（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入、商品番号：ＣＤ５０１－０３）、ＰＣＲ同定のためにクローンを選択して検査し、配列確認し、培養・増幅した陽性クローンを血漿から抽出して、抗体軽鎖の真核生物発現血漿ＦＤＡ０２６－Ｌ／ｐＶ８１及び抗体重鎖の真核生物発現血漿ＦＤＡ０２６－Ｈ／ｐＶ８１を得、これら２つの血漿をＸｂａＩ（Ｔａｋａｒａから購入、商品番号：１０９３Ｓ）で酵素切断して線状化させ、軽鎖、重鎖の真核生物発現血漿の比は１．５／１であり、電気ショックにより懸濁増殖適応のＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣから購入）に形質転換し、電気ショック後の細胞を２０００～５０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに連結し、３週間培養した後、ＨＴＲＦ法（均質時間分解蛍光法）によって発現量を測定し、その中から発現量が上位１０位の細胞プールを選択して増幅した後、凍結保存した。細胞を１２５ｍｌの振盪フラスコ（３０ｍｌの培養体積）で復蘇させ、３７℃、５．０％のＣＯ２、１３０ｒｐｍで振盪培養し、３日後に１０００ｍｌの振盪フラスコ（３００ｍｌの培養体積）に拡張し、３７℃、５．０％のＣＯ２、１３０ｒｐｍで振盪培養し、４日目から１日おきに初期培養体積の５～８％のフィード培地の追加を開始し、１０～１２日間培養した後に培養を終了し、回収液を９５００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、細胞沈殿を除去し、上清を収集し、更に０．２２μｍ濾膜で濾過し、処理された試料をＭａｂＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥから購入）で精製して抗体ＦＤＡ０２６を得た。
【0167】
上記と同様な製造方法でＦｃ突然変異（即ちＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ）を有するＨＥＲ３抗体ＦＤＡ０２８を製造し、その軽鎖のアミノ酸は配列番号１に示される通りである、その重鎖の配列は配列番号３に示される通りであり；Ｆｃ突然変異（即ちＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３３１Ｓ）を有するＨＥＲ３抗体ＦＤＡ０２９を製造し、その軽鎖アミノ酸は配列番号１に示される通りであり、その重鎖の配列は配列番号４に示される通りである。
【0168】
ＦＤＡ０２６、ＦＤＡ０２８及びＦＤＡ０２９の軽鎖の配列は下記の通りである：
【0169】
配列番号１：
ＤＩＥＭＴＱＳＰＤＳ ＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴ ＩＮＣＲＳＳＱＳＶＬ ＹＳＳＳＮＲＮＹＬＡ ＷＹＱＱＮＰＧＱＰＰ ５０
ＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲ ＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧ ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴ ＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡ ＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴ １００
ＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶ ＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳ ＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱ ＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣ ＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡ １５０
ＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬ ＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴ ＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳ ＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡ ＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣ ２００
ＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰ ＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ ２２０
ＤＩＥＭＴＱＳＰＤＳ ＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴ ＩＮＣＲＳＳＱＳＶＬ ＹＳＳＳＮＲＮＹＬＡ ＷＹＱＱＮＰＧＱＰＰ ５０
ＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲ ＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧ ＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴ ＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡ ＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴ １００
ＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶ ＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳ ＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱ ＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣ ＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡ １５０
ＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬ ＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴ ＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳ ＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡ ＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣ ２００
ＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰ ＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ ２２０
【0170】
ＦＤＡ０２６の重鎖の配列は下記の通りである：
【0171】
配列番号２：
ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧ ＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬ ＴＣＡＶＹＧＧＳＦＳ ＧＹＹＷＳＷＩＲＱＰ ＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥ ５０
ＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮ ＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳ ＶＥＴＳＫＮＱＦＳＬ ＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴ ＡＶＹＹＣＡＲＤＫＷ １００
ＴＷＹＦＤＬＷＧＲＧ ＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴ ＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ ＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡ ＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦ １５０
ＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳ ＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦ ＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹ ＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳ ＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣ ２００
ＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫ ＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣ ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ ２５０
ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ ＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤ ＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤ ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ ＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹ ３００
ＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ ＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡ ＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ ３５０
ＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫ ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ ４００
ＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬ ＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧ ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ ＬＳＬＳＰＧＫ ４４７
ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧ ＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬ ＴＣＡＶＹＧＧＳＦＳ ＧＹＹＷＳＷＩＲＱＰ ＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥ ５０
ＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮ ＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳ ＶＥＴＳＫＮＱＦＳＬ ＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴ ＡＶＹＹＣＡＲＤＫＷ １００
ＴＷＹＦＤＬＷＧＲＧ ＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴ ＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ ＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡ ＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦ １５０
ＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳ ＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦ ＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹ ＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳ ＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣ ２００
ＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫ ＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣ ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ ２５０
ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ ＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤ ＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤ ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ ＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹ ３００
ＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ ＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡ ＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ ３５０
ＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫ ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ ４００
ＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬ ＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧ ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ ＬＳＬＳＰＧＫ ４４７
【0172】
ＦＤＡ０２８の重鎖の配列は下記の通りである：
【0173】
配列番号３ ＦＤＡ０２８の重鎖
ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＹＧＧＳＦＳＧＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＥＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＫＷＴＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＹＧＧＳＦＳＧＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＥＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＫＷＴＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0174】
ＦＤＡ０２９の重鎖の配列は下記の通りである：
【0175】
配列番号４ ＦＤＡ０２９の重鎖
ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＹＧＧＳＦＳＧＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＥＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＫＷＴＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＹＧＧＳＦＳＧＹＹＷＳＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＨＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＶＥＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＫＷＴＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0176】
ｈ：リンカー－薬物複合体の合成
実施例２－１：ＬＥ１２の合成
実施例２－１：ＬＥ１２の合成
【化67】
【0177】
中間体２の合成：
（Ｓ）－２－アジドプロピオン酸（１０ｇ、８６．９ｍｍｏｌ）及び４－アミノベンジルアルコール（２１．４０ｇ、１７３．８ｍｍｏｌ）を３００ｍＬのジクロロメタン及びメタノールの混合溶媒（体積比２：１）に溶解させ、２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン（２１．４９ｇ、８６．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間反応させた後、溶媒を減圧蒸発させ、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：酢酸エチル＝１：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体２（１６．３ｇ、収率：８５％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ ／ ｚ：２２１（Ｍ ＋ Ｈ）であった。
（Ｓ）－２－アジドプロピオン酸（１０ｇ、８６．９ｍｍｏｌ）及び４－アミノベンジルアルコール（２１．４０ｇ、１７３．８ｍｍｏｌ）を３００ｍＬのジクロロメタン及びメタノールの混合溶媒（体積比２：１）に溶解させ、２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン（２１．４９ｇ、８６．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間反応させた後、溶媒を減圧蒸発させ、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：酢酸エチル＝１：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体２（１６．３ｇ、収率：８５％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ ／ ｚ：２２１（Ｍ ＋ Ｈ）であった。
【0178】
中間体３の合成：
中間体２（１５ｇ、６８．２ｍｍｏｌ）及びビス（ｐ－ニトロフェニル）カーボネート（２２．８２ｇ、７５．０２ｍｍｏｌ）を混合して２００ｍＬの無水Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解させ、２５ｍＬのトリエチルアミンを加え、室温で２時間反応させた。液体クロマトグラフィー－質量分析で原料の反応完了をモニターした後、メチルアミン塩酸塩（６．９１ｇ、１０２．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間反応を続けた。反応終了後、減圧蒸留して溶媒の大部分を除去し、２００ｍＬの水、２００ｍＬの酢酸エチルを加え、溶液を分離した後有機相を収集し、有機相を乾燥させた後に濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：酢酸エチル＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体３（１８．９ｇ、収率：１００％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ ／ ｚ：２７８（ Ｍ ＋ Ｈ）であった。
中間体２（１５ｇ、６８．２ｍｍｏｌ）及びビス（ｐ－ニトロフェニル）カーボネート（２２．８２ｇ、７５．０２ｍｍｏｌ）を混合して２００ｍＬの無水Ｎ、Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解させ、２５ｍＬのトリエチルアミンを加え、室温で２時間反応させた。液体クロマトグラフィー－質量分析で原料の反応完了をモニターした後、メチルアミン塩酸塩（６．９１ｇ、１０２．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間反応を続けた。反応終了後、減圧蒸留して溶媒の大部分を除去し、２００ｍＬの水、２００ｍＬの酢酸エチルを加え、溶液を分離した後有機相を収集し、有機相を乾燥させた後に濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：酢酸エチル＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体３（１８．９ｇ、収率：１００％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ ／ ｚ：２７８（ Ｍ ＋ Ｈ）であった。
【0179】
中間体５の合成：
中間体３（１０ｇ、３６．１ｍｍｏｌ）及びパラホルムアルデヒド（１．６３ｇ、５４．２ｍｍｏｌ）を混合して１５０ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解させ、トリメチルクロロシラン（６．２８ｇ、５７．７６ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、室温で２時間反応させ中間体４の粗溶液を得、サンプリングしてメタノールを加えてクエンチングさせた後、液体質量分析法で反応をモニタリングし、反応終了後、反応液を濾過し、濾液にヒドロキシ酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（９．５４ｇ、７２．２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１０ｍＬ、７２．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間反応を続けた。反応終了後、減圧蒸留して溶媒の大部分を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［石油エーテル：酢酸エチル＝３：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体５（１１．２ｇ、収率：７４％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ ／ ｚ：４２２（ Ｍ ＋ Ｈ）であった。
中間体３（１０ｇ、３６．１ｍｍｏｌ）及びパラホルムアルデヒド（１．６３ｇ、５４．２ｍｍｏｌ）を混合して１５０ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解させ、トリメチルクロロシラン（６．２８ｇ、５７．７６ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、室温で２時間反応させ中間体４の粗溶液を得、サンプリングしてメタノールを加えてクエンチングさせた後、液体質量分析法で反応をモニタリングし、反応終了後、反応液を濾過し、濾液にヒドロキシ酢酸ｔｅｒｔ－ブチル（９．５４ｇ、７２．２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１０ｍＬ、７２．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間反応を続けた。反応終了後、減圧蒸留して溶媒の大部分を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［石油エーテル：酢酸エチル＝３：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体５（１１．２ｇ、収率：７４％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ ／ ｚ：４２２（ Ｍ ＋ Ｈ）であった。
【0180】
中間体６の合成：
中間体５（１０ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）を８０ｍＬの無水テトラヒドロフランに溶解させ、８０ｍＬの水を加えた後、トリス（２－カルボキシエチルホスフィン）塩酸塩（１３．６ｇ、４７．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間反応させた。反応終了後、減圧蒸留してテトラヒドロフランを除去し、酢酸エチルを加えて抽出した後、得られた有機相を乾燥させ、減圧蒸発して溶媒を除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体６（８．１ｇ、収率：８６％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：３９６（Ｍ＋Ｈ）であった。
中間体５（１０ｇ、２３．８ｍｍｏｌ）を８０ｍＬの無水テトラヒドロフランに溶解させ、８０ｍＬの水を加えた後、トリス（２－カルボキシエチルホスフィン）塩酸塩（１３．６ｇ、４７．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間反応させた。反応終了後、減圧蒸留してテトラヒドロフランを除去し、酢酸エチルを加えて抽出した後、得られた有機相を乾燥させ、減圧蒸発して溶媒を除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体６（８．１ｇ、収率：８６％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：３９６（Ｍ＋Ｈ）であった。
【0181】
中間体８の合成：
中間体６（５ｇ、１２．７ｍｍｏｌ）を６０ｍＬのジクロロメタン及びメタノールの混合溶媒（ｖ／ｖ＝２：１）に溶解させ、３ｍＬのトリフルオロ酢酸をゆっくりと加え、室温で３０分間反応させた。反応終了後、同じ体積の水及び酢酸エチルを加え、有機相を乾燥させた後、濃縮し、得られた粗生成物を直接に次のステップに使用した。
中間体６（５ｇ、１２．７ｍｍｏｌ）を６０ｍＬのジクロロメタン及びメタノールの混合溶媒（ｖ／ｖ＝２：１）に溶解させ、３ｍＬのトリフルオロ酢酸をゆっくりと加え、室温で３０分間反応させた。反応終了後、同じ体積の水及び酢酸エチルを加え、有機相を乾燥させた後、濃縮し、得られた粗生成物を直接に次のステップに使用した。
【0182】
上記のステップで得られた粗生成物を５０ｍＬの無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解させ、Ｆｍｏｃ－バリンヒドロキシスクシンイミドエステル（８．３ｇ、１９．１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（５ｍＬ）を加え、室温で２時間反応させた。反応終了後、減圧蒸留して溶媒の大部分を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体８（５．４ｇ、収率：６４％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ ｚ：６６１（Ｍ＋Ｈ）であった。
【0183】
中間体９の合成：
中間体８（１ｇ、１．５ｍｍｏｌ）及びＥｘａｔｅｃａｎメシル酸塩（０．５６８ｇ、１ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに混合し、２－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１．１４ｇ、３．０ｍｍｏｌ）、２ｍＬのトリエチルアミンを加え、室温で２時間反応させた。反応終了後、減圧蒸留して溶媒のを除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体９（０．９４ｇ、収率：８７％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ ｚ：１０７８（Ｍ＋Ｈ）であった。
中間体８（１ｇ、１．５ｍｍｏｌ）及びＥｘａｔｅｃａｎメシル酸塩（０．５６８ｇ、１ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに混合し、２－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１．１４ｇ、３．０ｍｍｏｌ）、２ｍＬのトリエチルアミンを加え、室温で２時間反応させた。反応終了後、減圧蒸留して溶媒のを除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体９（０．９４ｇ、収率：８７％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ ｚ：１０７８（Ｍ＋Ｈ）であった。
【0184】
化合物ＬＥ１２の合成：
中間体９（１ｇ、０．９２９ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの無水ＤＭＦに溶解させ、０．５ｍＬの１，８－ジアザビシクロウンデカ－７－エンを加え、室温で１時間反応させた。反応終了後、６－（マレイミド）ヘキサン酸スクシンイミジルエステル（４２８．５ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）を直接に加え、室温で１時間撹拌した。減圧蒸留して溶媒を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝８：１（ｖ／ｖ）］で精製して表題化合物（０．７ｇ、収率：７３％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１０３５（Ｍ＋Ｈ）であった。
中間体９（１ｇ、０．９２９ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの無水ＤＭＦに溶解させ、０．５ｍＬの１，８－ジアザビシクロウンデカ－７－エンを加え、室温で１時間反応させた。反応終了後、６－（マレイミド）ヘキサン酸スクシンイミジルエステル（４２８．５ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）を直接に加え、室温で１時間撹拌した。減圧蒸留して溶媒を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝８：１（ｖ／ｖ）］で精製して表題化合物（０．７ｇ、収率：７３％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１０３５（Ｍ＋Ｈ）であった。
【0185】
実施例２－２：化合物ＬＥ１３の合成
【化68】
【0186】
中間体１４の合成
市販の中間体１２（２６７ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）及びパラホルムアルデヒド（５０ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を混合して２０ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解させ、トリメチルクロロシラン（０．３ｍｌ、３．４ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、添加完了後室温で２時間反応させた。その後、サンプリングし、メタノールを加えてクエンチングさせた後、液体質量分析法で反応をモニタリングし、反応終了後に反応溶液を濾過し、濾液にグリコール酸ｔｅｒｔ－ブチル（２１１ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）及び０．５ｍｌのペンピジン（Ｐｅｍｐｉｄｉｎｅ）を加え、室温で約２時間反応を続け、反応終了後、減圧下で蒸留して溶媒の大部分を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝２０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体１４（２６０ｍｇ、収率：６８％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：４７９（Ｍ＋Ｈ）であった。
市販の中間体１２（２６７ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）及びパラホルムアルデヒド（５０ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を混合して２０ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解させ、トリメチルクロロシラン（０．３ｍｌ、３．４ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、添加完了後室温で２時間反応させた。その後、サンプリングし、メタノールを加えてクエンチングさせた後、液体質量分析法で反応をモニタリングし、反応終了後に反応溶液を濾過し、濾液にグリコール酸ｔｅｒｔ－ブチル（２１１ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）及び０．５ｍｌのペンピジン（Ｐｅｍｐｉｄｉｎｅ）を加え、室温で約２時間反応を続け、反応終了後、減圧下で蒸留して溶媒の大部分を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝２０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体１４（２６０ｍｇ、収率：６８％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：４７９（Ｍ＋Ｈ）であった。
【0187】
中間体１５の合成
中間体１４（２３８ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を６ｍＬのジクロロメタン及びメタノールの混合溶媒（ｖ／ｖ＝２：１）に溶解させ、０．３ｍＬのトリフルオロ酢酸をゆっくりと加え、室温で３０分間反応させた。反応終了後、同じ体積の水及び酢酸エチルを加え、有機相を乾燥させた後、濃縮し、得られた粗生成物を直接に次のステップに使用した。
中間体１４（２３８ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を６ｍＬのジクロロメタン及びメタノールの混合溶媒（ｖ／ｖ＝２：１）に溶解させ、０．３ｍＬのトリフルオロ酢酸をゆっくりと加え、室温で３０分間反応させた。反応終了後、同じ体積の水及び酢酸エチルを加え、有機相を乾燥させた後、濃縮し、得られた粗生成物を直接に次のステップに使用した。
【0188】
中間体１６の合成
上記のステップで得られた粗生成物及びＥｘａｔｅｃａｎメシル酸塩（１７０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を５ｍＬの無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに混合し、２－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（３４１ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）、０．６０ｍＬのトリエチルアミンを加え、室温で２時間反応させた。反応終了後、減圧蒸留して溶媒を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体１６（２１０ｍｇ、収率：８３％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ ｚ：８４０（Ｍ＋Ｈ）であった。
上記のステップで得られた粗生成物及びＥｘａｔｅｃａｎメシル酸塩（１７０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を５ｍＬの無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに混合し、２－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（３４１ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）、０．６０ｍＬのトリエチルアミンを加え、室温で２時間反応させた。反応終了後、減圧蒸留して溶媒を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体１６（２１０ｍｇ、収率：８３％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ ｚ：８４０（Ｍ＋Ｈ）であった。
【0189】
中間体１７の合成
中間体１６（１００ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を１５ｍＬの無水テトラヒドロフランに溶解させ、３ｍＬの水を加えた後、１ｍｏｌ／Ｌのトリエチルホスフィン水溶液０．３ｍＬを加え、室温で４時間反応させた。反応の終了をモニタリングした後、反応溶液を減圧蒸留してテトラヒドロフランを除去し、残りの水溶液に炭酸水素ナトリウムを加えて、ｐＨを中性に調節し、ジクロロメタンを加えて抽出し、得られた有機相を乾燥させ、減圧蒸留して溶媒を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体１７（６９ｍｇ、収率：７１％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：８１４（Ｍ＋Ｈ）であった。
中間体１６（１００ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を１５ｍＬの無水テトラヒドロフランに溶解させ、３ｍＬの水を加えた後、１ｍｏｌ／Ｌのトリエチルホスフィン水溶液０．３ｍＬを加え、室温で４時間反応させた。反応の終了をモニタリングした後、反応溶液を減圧蒸留してテトラヒドロフランを除去し、残りの水溶液に炭酸水素ナトリウムを加えて、ｐＨを中性に調節し、ジクロロメタンを加えて抽出し、得られた有機相を乾燥させ、減圧蒸留して溶媒を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体１７（６９ｍｇ、収率：７１％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：８１４（Ｍ＋Ｈ）であった。
【0190】
化合物ＬＥ１３の合成
前ステップの合成法で得られた中間体１７（１２０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）及び市販の原料ＭＣ－Ｖ（１０２ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を４０ｍＬのジクロロメタンに混合し、縮合剤２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン（８２ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させ、反応終了後、溶媒を減圧蒸留し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して化合物ＬＥ１３（１１６ｍｇ、収率：７０％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１１０６．５（Ｍ＋Ｈ）であった。
前ステップの合成法で得られた中間体１７（１２０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）及び市販の原料ＭＣ－Ｖ（１０２ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を４０ｍＬのジクロロメタンに混合し、縮合剤２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン（８２ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させ、反応終了後、溶媒を減圧蒸留し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して化合物ＬＥ１３（１１６ｍｇ、収率：７０％）を得、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１１０６．５（Ｍ＋Ｈ）であった。
【0191】
実施例２－３：化合物ＬＥ１４の合成
【化69】
【0192】
中間体１９の合成
市販の中間体１８（３００ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）とパラホルムアルデヒド（５０ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を混合して２０ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解させ、トリメチルクロロシラン（０．３ｍｌ、３．４ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、室温で２時間反応させ、サンプリングし、メタノールを加えてクエンチングさせた後、液体質量分析法で反応をモニタリングした。反応終了後、反応溶液を濾過し、濾液にグリコール酸ｔｅｒｔ－ブチル（２１１ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．２２ｍ、１．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で約２時間反応を続け、反応終了後、減圧蒸留して溶媒の大部分を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝２０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体１９（３４９ｍｇ、収率：８５％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：５１４（Ｍ＋Ｈ），１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．１３ （ｓ， １Ｈ）， ７．５６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３５ （ｓ， ２Ｈ）， ５．１４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．９１ （ｓ， ２Ｈ）， ４．２５ （ｑ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９９ （ｄ， Ｊ ＝ ４２．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｄｄ， Ｊ ＝ １８．５， ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．８９ （ｄ， Ｊ ＝ ４８．６ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．６５ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．４６ （ｓ， ９Ｈ）。
市販の中間体１８（３００ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）とパラホルムアルデヒド（５０ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を混合して２０ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解させ、トリメチルクロロシラン（０．３ｍｌ、３．４ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、室温で２時間反応させ、サンプリングし、メタノールを加えてクエンチングさせた後、液体質量分析法で反応をモニタリングした。反応終了後、反応溶液を濾過し、濾液にグリコール酸ｔｅｒｔ－ブチル（２１１ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．２２ｍ、１．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で約２時間反応を続け、反応終了後、減圧蒸留して溶媒の大部分を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝２０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体１９（３４９ｍｇ、収率：８５％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：５１４（Ｍ＋Ｈ），１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．１３ （ｓ， １Ｈ）， ７．５６ （ｄ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．３５ （ｓ， ２Ｈ）， ５．１４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．９１ （ｓ， ２Ｈ）， ４．２５ （ｑ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９９ （ｄ， Ｊ ＝ ４２．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｄｄ， Ｊ ＝ １８．５， ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．８９ （ｄ， Ｊ ＝ ４８．６ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．６５ （ｄ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．４６ （ｓ， ９Ｈ）。
【0193】
中間体２０の合成
中間体１９（２５７ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を６ｍＬのジクロロメタン及びメタノールの混合溶媒（ｖ／ｖ＝２：１）に溶解させ、０．３ｍＬのトリフルオロ酢酸をゆっくりと加え、室温で３０分間反応させた。反応終了後、同じ体積の水及び酢酸エチルを加え、有機相を乾燥させた後、濃縮し、得られた粗生成物を直接に次のステップに使用した。
中間体１９（２５７ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を６ｍＬのジクロロメタン及びメタノールの混合溶媒（ｖ／ｖ＝２：１）に溶解させ、０．３ｍＬのトリフルオロ酢酸をゆっくりと加え、室温で３０分間反応させた。反応終了後、同じ体積の水及び酢酸エチルを加え、有機相を乾燥させた後、濃縮し、得られた粗生成物を直接に次のステップに使用した。
【0194】
得られた粗生成物及びＥｘａｔｅｃａｎメシル酸塩（１７０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を５ｍＬの無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに混合し、２－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（３４１ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）、０．０６ｍＬのトリエチルアミンを加え、室温で２時間反応させた。反応終了後、減圧蒸留して溶媒を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝２０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体２０（２１２ｍｇ、収率：８１％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ ｚ：８７５（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．２７ （ｄ， Ｊ ＝ ３４．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６３－７．３５ （ｍ， ５Ｈ）， ７．２１－７．１０ （ｍ， １Ｈ）， ５．７１－５．４８ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２４－４．９５ （ｍ， ３Ｈ）， ４．９５－４．７２ （ｍ， ４Ｈ）， ４．４５ （ｓ， １Ｈ）， ４．３３－３．９７ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７５ （ｓ， ２Ｈ）， ３．３９－２．９９ （ｍ， ４Ｈ）， ２．７６ （ｄ， Ｊ ＝ １５．３ Ｈｚ， ３Ｈ）， ２．４３－２．１５ （ｍ， ５Ｈ）， ２．０４ （ｓ， １Ｈ）， １．９４－１．７５ （ｍ， ２Ｈ）， １．６２ （ｄ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．１１－０．８９ （ｍ， ３Ｈ）。
【0195】
中間体２１の合成
中間体２０（７７ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を１２ｍＬの無水テトラヒドロフランに溶解させ、３ｍＬの水を加えた後、１ｍｏｌ／Ｌのトリエチルホスフィン水溶液を０．３ｍＬ加え、室温で４時間反応させた。反応終了後、減圧蒸留してテトラヒドロフランを除去し、残りの水溶液に炭酸水素ナトリウムを加えて、ｐＨを中性に調節し、ジクロロメタンを加えて抽出し、得られた有機相を乾燥させ、減圧蒸留して溶媒を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体２１（５３ｍｇ、収率：６９％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：８４９（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ８．５２ （ｓ， １Ｈ）， ７．７９ （ｄ， Ｊ ＝ １０．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６７－７．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４７－７．２１ （ｍ， ３Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ５．６０ （ｓ， １Ｈ）， ５．５２－５．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．３０－５．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ５．１１－４．９４ （ｍ， ２Ｈ）， ４．９４－４．７４ （ｍ， ２Ｈ）， ４．０２ （ｓ， ２Ｈ）， ３．８１－３．６６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６０－３．３５ （ｍ， ４Ｈ）， ３．２４－３．０８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．９４ （ｄ， Ｊ ＝ ３０．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， ２．３９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２８－２．０４ （ｍ，２Ｈ）， ２．００－１．７３ （ｍ， ２Ｈ）， １．２２ （ｄ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９６－０．７０ （ｍ， ３Ｈ）。
中間体２０（７７ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を１２ｍＬの無水テトラヒドロフランに溶解させ、３ｍＬの水を加えた後、１ｍｏｌ／Ｌのトリエチルホスフィン水溶液を０．３ｍＬ加え、室温で４時間反応させた。反応終了後、減圧蒸留してテトラヒドロフランを除去し、残りの水溶液に炭酸水素ナトリウムを加えて、ｐＨを中性に調節し、ジクロロメタンを加えて抽出し、得られた有機相を乾燥させ、減圧蒸留して溶媒を除去し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して中間体２１（５３ｍｇ、収率：６９％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：８４９（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ８．５２ （ｓ， １Ｈ）， ７．７９ （ｄ， Ｊ ＝ １０．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６７－７．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４７－７．２１ （ｍ， ３Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ５．６０ （ｓ， １Ｈ）， ５．５２－５．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．３０－５．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ５．１１－４．９４ （ｍ， ２Ｈ）， ４．９４－４．７４ （ｍ， ２Ｈ）， ４．０２ （ｓ， ２Ｈ）， ３．８１－３．６６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．６０－３．３５ （ｍ， ４Ｈ）， ３．２４－３．０８ （ｍ， ２Ｈ）， ２．９４ （ｄ， Ｊ ＝ ３０．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， ２．３９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２８－２．０４ （ｍ，２Ｈ）， ２．００－１．７３ （ｍ， ２Ｈ）， １．２２ （ｄ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．９６－０．７０ （ｍ， ３Ｈ）。
【0196】
化合物ＬＥ１４の合成
中間体２１（１３４ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）及び市販の原料ＭＣ－Ｖ（１０２ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を４０ｍＬのジクロロメタンに混合し、縮合剤２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン（８２ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させ、反応終了後、溶媒を減圧蒸留し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して化合物ＬＥ１４（１３７ｍｇ、収率：７５％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１１４１．４（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ９．９７ （ｓ， １Ｈ）， ８．５２ （ｓ， １Ｈ）， ８．２７－８．０９ （ｍ， １Ｈ）， ７．８８－７．７０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．６３－７．５１ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２８ （ｓ， ３Ｈ）， ６．９９ （ｓ， ２Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ５．５９ （ｓ， １Ｈ）， ５．５０－５．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．１７ （ｓ， ２Ｈ）， ４．９８ （ｓ， ２Ｈ）， ４．８５ （ｄ， Ｊ ＝ １７．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．４３－４．３３ （ｍ， １Ｈ）， ４．２１－４．１２ （ｍ， １Ｈ）， ４．０３ （ｓ， ２Ｈ）， ３．７４－３．６４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２０－３．０３ （ｍ， ３Ｈ）， ３．０２－２．８４ （ｍ， ４Ｈ）， ２．３６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２３－２．０９ （ｍ， ４Ｈ）， ２．０１－１．９０ （ｍ， １Ｈ）， １．９０－１．７８ （ｍ， ２Ｈ）， １．５５－１．３９ （ｍ， ４Ｈ）， １．３０ （ｄ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．２３－１．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ０．９３－０．７７ （ｍ， ９Ｈ）。
中間体２１（１３４ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）及び市販の原料ＭＣ－Ｖ（１０２ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を４０ｍＬのジクロロメタンに混合し、縮合剤２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン（８２ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させ、反応終了後、溶媒を減圧蒸留し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝１０：１（ｖ／ｖ）］で精製して化合物ＬＥ１４（１３７ｍｇ、収率：７５％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１１４１．４（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ９．９７ （ｓ， １Ｈ）， ８．５２ （ｓ， １Ｈ）， ８．２７－８．０９ （ｍ， １Ｈ）， ７．８８－７．７０ （ｍ， ２Ｈ）， ７．６３－７．５１ （ｍ， ２Ｈ）， ７．２８ （ｓ， ３Ｈ）， ６．９９ （ｓ， ２Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ５．５９ （ｓ， １Ｈ）， ５．５０－５．３２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．１７ （ｓ， ２Ｈ）， ４．９８ （ｓ， ２Ｈ）， ４．８５ （ｄ， Ｊ ＝ １７．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．４３－４．３３ （ｍ， １Ｈ）， ４．２１－４．１２ （ｍ， １Ｈ）， ４．０３ （ｓ， ２Ｈ）， ３．７４－３．６４ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２０－３．０３ （ｍ， ３Ｈ）， ３．０２－２．８４ （ｍ， ４Ｈ）， ２．３６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２３－２．０９ （ｍ， ４Ｈ）， ２．０１－１．９０ （ｍ， １Ｈ）， １．９０－１．７８ （ｍ， ２Ｈ）， １．５５－１．３９ （ｍ， ４Ｈ）， １．３０ （ｄ， Ｊ ＝ ６．７ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．２３－１．１１ （ｍ， ２Ｈ）， ０．９３－０．７７ （ｍ， ９Ｈ）。
【0197】
実施例２－４：化合物ＬＥ１５－ＬＥ２０の合成
【化70】
【0198】
中間体ＶＩは、Ｆｍｏｃ－Ｌ－バリン－Ｌ－アラニンを出発原料として、実施例２－１の中間体３の合成方法のステップａ及びｂを参照し、ステップｂのメチルアミン塩酸塩を対応する市販のアミノ化合物に置き換えることにより製造された。後続のステップは中間体ＶＩから出発し、実施例２－１のステップｃ、ｄ、ｆ及びｈと同様な方法に従って、中間体９と似ている中間体ＩＸを得、次に実施例６のステップｉ及びｊと同様な方法に従って処理し、アミノ保護基を除去し、その後、異なる市販のマレイミドと縮合することにより最終生成物を得た。使用したアミノ化合物及びマレイミドの構造は表１に示された通りである。化合物ＬＥ１５：灰白色の固体、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１１２１．２（Ｍ＋Ｈ）；化合物ＬＥ１６：淡黄色固体、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１１６７．１（Ｍ＋Ｈ）；化合物ＬＥ１７：黄色固体、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１１３２．３（Ｍ＋Ｈ）；化合物ＬＥ１８：淡黄色固体、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１３０５．４（Ｍ＋Ｈ）；化合物ＬＥ１９：淡黄色固体、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１３０７．４（Ｍ＋Ｈ）；化合物ＬＥ２０：淡黄色固体、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１３３７．６（Ｍ＋Ｈ）。
【0199】
【表1】
【0200】
【化71】
【0201】
【化72】
【0202】
【化73】
【0203】
【化74】
【0204】
【化75】
【0205】
実施例２－５：化合物ＬＥ２１与ＬＥ２２の合成
【化76】
【0206】
化合物ＤＸＤ－１の合成
市販のＥｘａｔｅｃａｎメシル酸塩（０．５６８ｇ、１ｍｍｏｌ）及び市販の２－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ）酢酸（ＣＡＳ：１０５４５９－０５－０、０．３８ｇ、２ｍｍｏｌ）を混合して２０ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解させ、縮合剤ＨＡＴＵ（０．７６ｇ、２ｍｍｏｌ）及び１ｍＬのピリジンを加えて、室温で２時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧蒸発させ、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝５０：１（ｖ／ｖ）］で精製して表題化合物ＤＸＤ－１（０．５５ｇ、収率：９０％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：６０８．１（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ７．７３ （ｄ， Ｊ ＝ １０．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６４ （ｓ， １Ｈ）， ７．０５ （ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．８０－５．６２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．４１－５．１４ （ｍ， ４Ｈ）， ４．２９－４．１５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．０８－４．０３ （ｍ， １Ｈ）， ３．２７－３．０７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４５ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３８－２．２８ （ｍ， ２Ｈ）， １．９６－１．８１ （ｍ， ２Ｈ）， １．０４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．８０ （ｓ， ９Ｈ）， ０．１１ （ｓ， ３Ｈ）， ０．０３ （ｓ， ３Ｈ）．
市販のＥｘａｔｅｃａｎメシル酸塩（０．５６８ｇ、１ｍｍｏｌ）及び市販の２－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルオキシ）酢酸（ＣＡＳ：１０５４５９－０５－０、０．３８ｇ、２ｍｍｏｌ）を混合して２０ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解させ、縮合剤ＨＡＴＵ（０．７６ｇ、２ｍｍｏｌ）及び１ｍＬのピリジンを加えて、室温で２時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧蒸発させ、得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー［ジクロロメタン：メタノール＝５０：１（ｖ／ｖ）］で精製して表題化合物ＤＸＤ－１（０．５５ｇ、収率：９０％）を得た。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：６０８．１（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ７．７３ （ｄ， Ｊ ＝ １０．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６４ （ｓ， １Ｈ）， ７．０５ （ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．８０－５．６２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．４１－５．１４ （ｍ， ４Ｈ）， ４．２９－４．１５ （ｍ， ２Ｈ）， ４．０８－４．０３ （ｍ， １Ｈ）， ３．２７－３．０７ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４５ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３８－２．２８ （ｍ， ２Ｈ）， １．９６－１．８１ （ｍ， ２Ｈ）， １．０４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ０．８０ （ｓ， ９Ｈ）， ０．１１ （ｓ， ３Ｈ）， ０．０３ （ｓ， ３Ｈ）．
【0207】
中間体Ｖの製造
中間体Ｖは、実施例２－１の化合物４の製造方法を参照し、ステップｂのメチルアミン塩酸塩を、対応する市販のアミノ化合物で置き換えることにより得られた。
中間体Ｖは、実施例２－１の化合物４の製造方法を参照し、ステップｂのメチルアミン塩酸塩を、対応する市販のアミノ化合物で置き換えることにより得られた。
【0208】
ＬＥ２１－ＬＥ２２の合成
中間体ＶとＤＸＤ－１を反応させ、１０％のトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン溶液処理により中間体Ｘを得、次に、中間体Ｘを実施例２－１の化合物５の後続ステップｅ、ｇ、ｉ及びｊを参照して反応させ：中間体Ｘを還元してアミノ化合物を得、得られたアミノ化合物とＦｍｏｃ－バリンヒドロキシスクシンイミドエステルを縮合させ、得られた生成物のＦｍｏｃ保護基を除去し、得られたアミノ生成物を更に６－（マレイミド）ヘキサン酸スクシンイミジルエステルと反応させて最終生成物を得た。化合物ＬＥ２１：黄色固体、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ ／ ｚ：１１４１．２（Ｍ ＋ Ｈ）；化合物ＬＥ２２：黄色固体、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ ／ ｚ：１１０６．６（Ｍ ＋ Ｈ）。
中間体ＶとＤＸＤ－１を反応させ、１０％のトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン溶液処理により中間体Ｘを得、次に、中間体Ｘを実施例２－１の化合物５の後続ステップｅ、ｇ、ｉ及びｊを参照して反応させ：中間体Ｘを還元してアミノ化合物を得、得られたアミノ化合物とＦｍｏｃ－バリンヒドロキシスクシンイミドエステルを縮合させ、得られた生成物のＦｍｏｃ保護基を除去し、得られたアミノ生成物を更に６－（マレイミド）ヘキサン酸スクシンイミジルエステルと反応させて最終生成物を得た。化合物ＬＥ２１：黄色固体、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ ／ ｚ：１１４１．２（Ｍ ＋ Ｈ）；化合物ＬＥ２２：黄色固体、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ ／ ｚ：１１０６．６（Ｍ ＋ Ｈ）。
【0209】
【化77】
【0210】
実施例２－６：化合物ＬＳ１３の合成
実施例２－４のＬＥ１５の合成方法を参照して、ＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）を中間体ＶＩＩ（Ｒ１はメチルスルホニルエチルである）と反応させた後、脱保護し、縮合などのステップで、化合物ＬＳ１３を得た：１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ９．９２ （ｄ， Ｊ ＝ ２２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．１４ （ｓ， １Ｈ）， ８．０８ （ｄ， Ｊ ＝ ９．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．８１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７０－７．５０ （ｍ， ３Ｈ）， ７．４７ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３４ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２７ （ｓ， １Ｈ）， ７．２０ （ｓ， １Ｈ）， ６．９８ （ｓ， ２Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ５．６１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．４８－５．３５ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２７ （ｓ， ２Ｈ）， ５．１０ （ｄ， Ｊ ＝ ２０．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．３６ （ｓ， １Ｈ）， ４．２１－４．０７ （ｍ， １Ｈ）， ３．８４ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４８ （ｓ， ２Ｈ）， ３．２１－２．９２ （ｍ， ６Ｈ）， ２．２５－２．０４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０４－１．７８ （ｍ， ３Ｈ）， １．５５－１．３６ （ｍ， ４Ｈ）， １．３６－１．１０ （ｍ， ９Ｈ）， ０．９５－０．７１ （ｍ， １０Ｈ）。
実施例２－４のＬＥ１５の合成方法を参照して、ＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）を中間体ＶＩＩ（Ｒ１はメチルスルホニルエチルである）と反応させた後、脱保護し、縮合などのステップで、化合物ＬＳ１３を得た：１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ９．９２ （ｄ， Ｊ ＝ ２２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．１４ （ｓ， １Ｈ）， ８．０８ （ｄ， Ｊ ＝ ９．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．８１ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７０－７．５０ （ｍ， ３Ｈ）， ７．４７ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３４ （ｄ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２７ （ｓ， １Ｈ）， ７．２０ （ｓ， １Ｈ）， ６．９８ （ｓ， ２Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ５．６１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．４８－５．３５ （ｍ， ２Ｈ）， ５．２７ （ｓ， ２Ｈ）， ５．１０ （ｄ， Ｊ ＝ ２０．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．３６ （ｓ， １Ｈ）， ４．２１－４．０７ （ｍ， １Ｈ）， ３．８４ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４８ （ｓ， ２Ｈ）， ３．２１－２．９２ （ｍ， ６Ｈ）， ２．２５－２．０４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０４－１．７８ （ｍ， ３Ｈ）， １．５５－１．３６ （ｍ， ４Ｈ）， １．３６－１．１０ （ｍ， ９Ｈ）， ０．９５－０．７１ （ｍ， １０Ｈ）。
【0211】
【化78】
【0212】
実施例２－７：化合物ＧＧＦＧ－Ｄｘｄの合成
化合物ＧＧＦＧ－Ｄｘｄは、ＷＯ２０１５１４６１３２Ａ１で報告された既知の合成方法を参照して製造された。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１０３４．５（Ｍ＋Ｈ），１Ｈ－ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．５０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．２８ （ｔ， Ｊ ＝ ５．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．１１ （ｄ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７７ （ｄ， Ｊ ＝ １１．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３１ （ｓ， １Ｈ）， ７．２５－７．１６ （ｍ， ５Ｈ）， ６．９８ （ｓ， ２Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ５．５９ （ｄｔ， Ｊ ＝ ７．４， ４．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．２０ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６４ （ｄ， Ｊ ＝ ６．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．５３－４．４０ （ｍ， １Ｈ）， ４．０２ （ｓ， ２Ｈ）， ３．７４－３．３７ （ｍ， ８Ｈ）， ３．１８－３．００ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０４－２．９７ （ｍ， １Ｈ）， ２．７７ （ｄｄ， Ｊ ＝ １３．５， ９．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．３８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１９ （ｄｄ， Ｊ ＝ １４．９， ８．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１１－２．０５ （ｍ， ２Ｈ）， １．８６ （ｄｄ， Ｊ ＝ １４．０， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．４５ （ｓ， ４Ｈ）， １．２０－１．１４ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）。
化合物ＧＧＦＧ－Ｄｘｄは、ＷＯ２０１５１４６１３２Ａ１で報告された既知の合成方法を参照して製造された。ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：１０３４．５（Ｍ＋Ｈ），１Ｈ－ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．５０ （ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．２８ （ｔ， Ｊ ＝ ５．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．１１ （ｄ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．０５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．９９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７７ （ｄ， Ｊ ＝ １１．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３１ （ｓ， １Ｈ）， ７．２５－７．１６ （ｍ， ５Ｈ）， ６．９８ （ｓ， ２Ｈ）， ６．５１ （ｓ， １Ｈ）， ５．５９ （ｄｔ， Ｊ ＝ ７．４， ４．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ５．２０ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６４ （ｄ， Ｊ ＝ ６．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．５３－４．４０ （ｍ， １Ｈ）， ４．０２ （ｓ， ２Ｈ）， ３．７４－３．３７ （ｍ， ８Ｈ）， ３．１８－３．００ （ｍ， ２Ｈ）， ３．０４－２．９７ （ｍ， １Ｈ）， ２．７７ （ｄｄ， Ｊ ＝ １３．５， ９．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．３８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１９ （ｄｄ， Ｊ ＝ １４．９， ８．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．１１－２．０５ （ｍ， ２Ｈ）， １．８６ （ｄｄ， Ｊ ＝ １４．０， ６．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．４５ （ｓ， ４Ｈ）， １．２０－１．１４ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８７ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）。
【0213】
【化79】
【0214】
実施例３：抗体薬物複合体の製造
実施例１の方法に従って製造したＨＥＲ３の抗体ＦＤＡ０２６及びＦＤＡ０２８及びＦＤＡ０２９をそれぞれＧ２５脱塩カラムを用いて、５０ｍＭのＰＢ／１．０ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．０）に置換し、１２当量のＴＥＣＰを加え、３７℃で２時間撹拌し、抗体鎖間のジスルフィド結合を完全に開き、リン酸を用いて還元された抗体溶液のｐＨを６．０に調節し、水浴温度を２５℃に下げ、カップリング反応を準備した。上記の実施例２の方法に従って製造したリンカー－薬物複合体ＬＥ１２－ＬＥ２２、ＬＳ１３及びＧＧＦＧ－ＤｘｄをそれぞれＤＭＳＯに溶解させ、中から１２当量のリンカー－薬物複合体を吸引し、還元後の抗体溶液に一滴ずつ滴下し、ＤＭＳＯを補充して、その最終濃度を１０％（ｖ／ｖ）にし、２５℃で０．５時間攪拌して反応させ、反応の終了後、０．２２ｕｍメンブレンで試料を濾過した。タンジェンシャルフロー限外濾過システムで精製し、非結合小分子を除去し、緩衝液は５０ｍＭのＰＢ／１．０ｍＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６．０）であり、精製後、最終濃度６％のショ糖を加え、－２０℃の冷蔵庫で保存した。ＵＶ法で２８０ｎｍ及び３７０ｎｍでの吸光度値をそれぞれ測定し、ＤＡＲ値を計算し、結果を下記の表２に示される通りである。
実施例１の方法に従って製造したＨＥＲ３の抗体ＦＤＡ０２６及びＦＤＡ０２８及びＦＤＡ０２９をそれぞれＧ２５脱塩カラムを用いて、５０ｍＭのＰＢ／１．０ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．０）に置換し、１２当量のＴＥＣＰを加え、３７℃で２時間撹拌し、抗体鎖間のジスルフィド結合を完全に開き、リン酸を用いて還元された抗体溶液のｐＨを６．０に調節し、水浴温度を２５℃に下げ、カップリング反応を準備した。上記の実施例２の方法に従って製造したリンカー－薬物複合体ＬＥ１２－ＬＥ２２、ＬＳ１３及びＧＧＦＧ－ＤｘｄをそれぞれＤＭＳＯに溶解させ、中から１２当量のリンカー－薬物複合体を吸引し、還元後の抗体溶液に一滴ずつ滴下し、ＤＭＳＯを補充して、その最終濃度を１０％（ｖ／ｖ）にし、２５℃で０．５時間攪拌して反応させ、反応の終了後、０．２２ｕｍメンブレンで試料を濾過した。タンジェンシャルフロー限外濾過システムで精製し、非結合小分子を除去し、緩衝液は５０ｍＭのＰＢ／１．０ｍＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６．０）であり、精製後、最終濃度６％のショ糖を加え、－２０℃の冷蔵庫で保存した。ＵＶ法で２８０ｎｍ及び３７０ｎｍでの吸光度値をそれぞれ測定し、ＤＡＲ値を計算し、結果を下記の表２に示される通りである。
【0215】
本実施例と同様な操作ステップでカップリング反応を実行し、試料はいずれも最も高いＤＡＲ（即ちオーバーカップリング）で製造し、各カップリング反応が発生する時の沈殿生成状況を観察し、各カップリング反応完了後のポリマー比率及び回収率を算出し、得られた結果は表２に示される通りである。
【0216】
【表2】
【0217】
実際の研究では、リンカー－薬物複合体のＧＧＦＧ－Ｄｘｄが他の抗体とカップリングする場合に沈殿が生じ、ポリマー比率が高く、普遍性がないことを発見した。一方、本技術的解決策におけるリンカー－薬物複合体を異なる抗体とカップリングを試し、沈殿は生じず、且つポリマー比率も正常な範囲にあったことから、本発明で提供されたリンカー－薬物複合体は、より良好な理化学的性質を有していることを表した。
【0218】
効果例１：抗体薬物複合体と抗原との結合能力評価
競合ＥＬＩＳＡ法を使用してＦＤＡ０２６抗体とリンカー－薬物複合体ＬＥ１２－ＬＥ２２とのカップリング前後のＨｅｒ３抗原に対する結合能力に変化があるか否かを評価し、具体的方法は下記の通りである。１００ｎｇ／ｍｌのＨＥＲ３抗原（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入し、商品番号：１０２０１－Ｈ８Ｈ）を親水性ＥＬＩＳＡプレートストリップに１００μＬ／ウェルでコーティングし、３％のＢＳＡで室温で２時間静置してブロックした。３３ｎｇ／ｍｌのビオチンで標識されたＦＤＡ０２６抗体（ＤＡＲ－２．８２）をそれぞれ一連の最終濃度（１０００００、１００００、１０００、４００、１６０、６４、３．２及び０．１６ｎｇ／ｍｌ）のＦＤＡ０２６抗体及び実施例３で製造された抗体薬物複合体と１：１で事前混合し、次にＨｅｒ３抗原でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに加え、室温条件で２００ｒｐｍで１時間水平に振とうし、Ｐｉｅｒｃｅ（商標） Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ、Ｐｒｅ－Ｄｉｌｕｔｅｄ酵素結合抗体（Ｔｈｅｒｍｏ、商品番号：２１１３４）（希釈比１：５００）を１００μｌ／ウェルで加え、Ｓｉｇｍａ社のＴＭＢ発色液（Ｓｉｇｍａ、商品番号：Ｔ０４４０）で２５分間発色させた後１ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４で停止させた。マイクロプレートリーダーの参照波長は６５０ｎｍで、４５０ｎｍで吸光度の読み取り値を測定した結果は（表３に示される通りである）：ＦＤＡ０２６抗体とリンカー－薬物複合体とのカップリング前後の、ＨＥＲ３抗原に対する結合活性に差異がないことを示した。同じ方法を使用して、それぞれ抗体ＦＤＡ０２８及びＦＤＡ０２９とリンカー－薬物複合体とのカップリング前後のＨｅｒ３抗原に対する結合能力に変化があるか否かを評価した結果は（表３に示される通りである）：抗体ＦＤＡ０２８とＦＤＡ０２９とリンカー－薬物複合体とのカップリング前後の、ＨＥＲ３抗原に対する結合活性に差異がないことを示した。
競合ＥＬＩＳＡ法を使用してＦＤＡ０２６抗体とリンカー－薬物複合体ＬＥ１２－ＬＥ２２とのカップリング前後のＨｅｒ３抗原に対する結合能力に変化があるか否かを評価し、具体的方法は下記の通りである。１００ｎｇ／ｍｌのＨＥＲ３抗原（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入し、商品番号：１０２０１－Ｈ８Ｈ）を親水性ＥＬＩＳＡプレートストリップに１００μＬ／ウェルでコーティングし、３％のＢＳＡで室温で２時間静置してブロックした。３３ｎｇ／ｍｌのビオチンで標識されたＦＤＡ０２６抗体（ＤＡＲ－２．８２）をそれぞれ一連の最終濃度（１０００００、１００００、１０００、４００、１６０、６４、３．２及び０．１６ｎｇ／ｍｌ）のＦＤＡ０２６抗体及び実施例３で製造された抗体薬物複合体と１：１で事前混合し、次にＨｅｒ３抗原でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに加え、室温条件で２００ｒｐｍで１時間水平に振とうし、Ｐｉｅｒｃｅ（商標） Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ、Ｐｒｅ－Ｄｉｌｕｔｅｄ酵素結合抗体（Ｔｈｅｒｍｏ、商品番号：２１１３４）（希釈比１：５００）を１００μｌ／ウェルで加え、Ｓｉｇｍａ社のＴＭＢ発色液（Ｓｉｇｍａ、商品番号：Ｔ０４４０）で２５分間発色させた後１ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４で停止させた。マイクロプレートリーダーの参照波長は６５０ｎｍで、４５０ｎｍで吸光度の読み取り値を測定した結果は（表３に示される通りである）：ＦＤＡ０２６抗体とリンカー－薬物複合体とのカップリング前後の、ＨＥＲ３抗原に対する結合活性に差異がないことを示した。同じ方法を使用して、それぞれ抗体ＦＤＡ０２８及びＦＤＡ０２９とリンカー－薬物複合体とのカップリング前後のＨｅｒ３抗原に対する結合能力に変化があるか否かを評価した結果は（表３に示される通りである）：抗体ＦＤＡ０２８とＦＤＡ０２９とリンカー－薬物複合体とのカップリング前後の、ＨＥＲ３抗原に対する結合活性に差異がないことを示した。
【0219】
【表3】
【0220】
効果実施例２：抗体薬物複合体の体外殺傷活性評価
ＳＫ－ＢＲ－３（ＡＴＣＣ）細胞を体外活性検出に使用する細胞株として選択し、９６ウェル細胞培養プレートに２０００細胞／ウェルで播種し、２０～２４時間培養した。実施例３の方法に従って製造した抗体薬物複合体を１０％のＦＢＳを含むＬ１５細胞培地で１０００、１６６．７、５５．６、１８．６、６．１７、２．０６、０．６９、０．２３、０．０８、０．００８及び０ｎＭの１１個の濃度勾配の試験品溶液に調製し、希釈した試験品溶液１００μｌ／ウェルを取り、細胞を接種した培養プレートに加え、３７℃、５％のＣＯ２インキュベータに入れて１４４時間培養した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（５０μｌ／ウェル）を加え、５００ｒｐｍで室温で１０分間振とうして均一に混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＬマイクロプレートリーダーで（ＯＤ５７０ｎｍ、２ｓ間隔で読み取る）データを読み取り、ＩＣ５０結果を算出し、結果は表４に示される通りである。
ＳＫ－ＢＲ－３（ＡＴＣＣ）細胞を体外活性検出に使用する細胞株として選択し、９６ウェル細胞培養プレートに２０００細胞／ウェルで播種し、２０～２４時間培養した。実施例３の方法に従って製造した抗体薬物複合体を１０％のＦＢＳを含むＬ１５細胞培地で１０００、１６６．７、５５．６、１８．６、６．１７、２．０６、０．６９、０．２３、０．０８、０．００８及び０ｎＭの１１個の濃度勾配の試験品溶液に調製し、希釈した試験品溶液１００μｌ／ウェルを取り、細胞を接種した培養プレートに加え、３７℃、５％のＣＯ２インキュベータに入れて１４４時間培養した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（５０μｌ／ウェル）を加え、５００ｒｐｍで室温で１０分間振とうして均一に混合し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＬマイクロプレートリーダーで（ＯＤ５７０ｎｍ、２ｓ間隔で読み取る）データを読み取り、ＩＣ５０結果を算出し、結果は表４に示される通りである。
【0221】
上記と同様の方法を使用して、ＡＴＣＣから購入した２２Ｒｖ１、ＬＮＣａＰ、ＳＷ６２０、ＮＣＩ－Ｈ８２０、ＯＶＣＡＲ－８及びＨＣＣ８２７の複数の腫瘍細胞に対する各抗体薬物複合体の細胞毒死滅活性を測定し、結果は表４に示される通りである。表４の結果により、本発明で提供される抗体薬物複合体はＳＫ－ＢＲ－３、２２Ｒｖ１、ＬＮＣａＰ、ＳＷ６２０、ＮＣＩ－Ｈ８２０、ＯＶＣＡＲ－８及びＨＣＣ８２７などの細胞のいずれに対しても優れた体外死滅活性を有していることが分かる。
【0222】
【表4】
【0223】
効果実施例３：抗体薬物複合体における抗体Ｆｃ末端突然変異がＣＤ３２ａ受容体を発現する細胞の結合活性及び細胞毒性に及ぼす影響
効果実施例３－１：抗体薬物複合体における抗体Ｆｃ末端突然変異がＣＤ３２ａ受容体を発現する細胞の結合活性に及ぼす影響
ＨＴＲＦ法で製造したＡＤＣのＣＤ３２ａ発現細胞への結合能力を分析し、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）を３７℃の水浴中に入れて素早く振とうして細胞を蘇生させ、遠心分離して上清を除去し、更に１．１ｍＬの１× Ｔａｇ－ｌｉｔｅ ｂｕｆｆｅｒを加えて再懸濁し、１０μＬ／ウェルの細胞で３８４ウェルプレートに播種し、次に、細胞のウェルに加え、事前に製造したＦＤＡ０２６－ＬＥ１４、ＦＤＡ０２８－ＬＥ１４及びＦＤＡ０２９－ＬＥ１４などの抗体薬物複合体試料を勾配希釈濃度（１０００００、３３３３．３３、１１１１．１１、３７０．３７、１２３．４６、４１．１５、１３．７２、４．５７及び１．５２ｎＭ）で５μＬ／ウェルで３８４ウェルプレートに加え、最後に上記ウェルプレートにそれぞれ５μＬのｄ２標識免疫グロブリンＩｇＧ－ｄ２ ｃｏｎｊｕｇａｔｅを加え、当該ＩｇＧ－ｄ２ ｃｏｎｊｕｇａｔｅはＣＤ３２ａと結合することができ、室温で暗所で３時間培養すると、ＦＲＥＴシグナルが生成する。上記ＡＤＣ試料をウェルプレートに加えた後、ＡＤＣ試料は標識されたＩｇＧと競合してＣＤ３２ａに結合し、そのＦＲＥＴシグナルを低下させる。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐａｒａｄｉｇｍマイクロプレートリーダーでデータを読み取り、３４０ｎｍを励起波長とし、６１６ｎｍを参照波長とし、６６５ｎｍを特性発光波長として吸光度を測定し、そのＩＣ５０値を計算し、その結果は表５に示される通りである。各抗体薬物複合体とＣＤ３２の結合能力は表５に示される通りであり、Ｆｃ末端アミノ酸により修飾されたＦＤＡ０２８－ＬＥ１４及びＦＤＡ０２９－ＬＥ１４とＣＤ３２の結合能力は、未修飾のＦＤＡ０２６－ＬＥ１４の結合能力（～１０％）と比較して弱いことから、Ｆｃ末端アミノ酸により修飾された抗体薬物複合体とＣＤ３２ａの結合が弱いことを示している。
効果実施例３－１：抗体薬物複合体における抗体Ｆｃ末端突然変異がＣＤ３２ａ受容体を発現する細胞の結合活性に及ぼす影響
ＨＴＲＦ法で製造したＡＤＣのＣＤ３２ａ発現細胞への結合能力を分析し、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）を３７℃の水浴中に入れて素早く振とうして細胞を蘇生させ、遠心分離して上清を除去し、更に１．１ｍＬの１× Ｔａｇ－ｌｉｔｅ ｂｕｆｆｅｒを加えて再懸濁し、１０μＬ／ウェルの細胞で３８４ウェルプレートに播種し、次に、細胞のウェルに加え、事前に製造したＦＤＡ０２６－ＬＥ１４、ＦＤＡ０２８－ＬＥ１４及びＦＤＡ０２９－ＬＥ１４などの抗体薬物複合体試料を勾配希釈濃度（１０００００、３３３３．３３、１１１１．１１、３７０．３７、１２３．４６、４１．１５、１３．７２、４．５７及び１．５２ｎＭ）で５μＬ／ウェルで３８４ウェルプレートに加え、最後に上記ウェルプレートにそれぞれ５μＬのｄ２標識免疫グロブリンＩｇＧ－ｄ２ ｃｏｎｊｕｇａｔｅを加え、当該ＩｇＧ－ｄ２ ｃｏｎｊｕｇａｔｅはＣＤ３２ａと結合することができ、室温で暗所で３時間培養すると、ＦＲＥＴシグナルが生成する。上記ＡＤＣ試料をウェルプレートに加えた後、ＡＤＣ試料は標識されたＩｇＧと競合してＣＤ３２ａに結合し、そのＦＲＥＴシグナルを低下させる。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐａｒａｄｉｇｍマイクロプレートリーダーでデータを読み取り、３４０ｎｍを励起波長とし、６１６ｎｍを参照波長とし、６６５ｎｍを特性発光波長として吸光度を測定し、そのＩＣ５０値を計算し、その結果は表５に示される通りである。各抗体薬物複合体とＣＤ３２の結合能力は表５に示される通りであり、Ｆｃ末端アミノ酸により修飾されたＦＤＡ０２８－ＬＥ１４及びＦＤＡ０２９－ＬＥ１４とＣＤ３２の結合能力は、未修飾のＦＤＡ０２６－ＬＥ１４の結合能力（～１０％）と比較して弱いことから、Ｆｃ末端アミノ酸により修飾された抗体薬物複合体とＣＤ３２ａの結合が弱いことを示している。
【0224】
【表5】
【0225】
効果実施例３－２：抗体薬物複合体における抗体Ｆｃ末端突然変異がＣＤ３２ａ受容体を発現する細胞の細胞毒性に及ぼす影響
ＦｃγＲＩＩａを陽性発現するＫ５６２（ＡＴＣＣ）細胞（注：当該細胞はＨｅｒ３抗原を発現しない）をｉｎ ｖｉｔｒｏ活性検出用の細胞株として選択し、９６ウェル細胞培養プレートに５０００細胞／ウェルで播種し、１６～２０時間培養した。上記で製造した抗体薬物複合体ＦＤＡ０２６－ＬＥ１４、ＦＤＡ０２８－ＬＥ１４及びＦＤＡ０２９－ＬＥ１４を、１０％のＦＢＳを含むＬ１５細胞培地で１０００、１６６．７、５５．６、１８．６、６．１７、２．０６、０．６９、０．２３、０．０８、０．００８及び０ｎＭの合計１１個の濃度勾配の試験品溶液に製造し、希釈した試験溶液１００μｌ／ウェルを取り、細胞を接種した培養プレートに加え、３７℃、５％のＣＯ２インキュベータで１４４時間培養した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（５０μｌ／ウェル）を加え、５００ｒｐｍで、室温で１０分間振とうして、１０分間均一に混合させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＬマイクロプレートリーダー（ＯＤ５７０ｎｍ、２ｓ間隔で読み取る）でデータを読み取り、ＩＣ５０の算出結果は表５に示される通りであり、結果は：Ｆｃにより修飾されていないＦＤＡ０２６－ＬＥ１４薬物複合体はＫ５６２細胞に対していずれも所定の死滅効果を有しているが、Ｆｃにより修飾されたＡＤＣ薬物ＦＤＡ０２８－ＬＥ１４及びＦＤＡ０２９－ＬＥ１４はＫ５６２細胞に対する死滅効果は有意に低下することを示している。
ＦｃγＲＩＩａを陽性発現するＫ５６２（ＡＴＣＣ）細胞（注：当該細胞はＨｅｒ３抗原を発現しない）をｉｎ ｖｉｔｒｏ活性検出用の細胞株として選択し、９６ウェル細胞培養プレートに５０００細胞／ウェルで播種し、１６～２０時間培養した。上記で製造した抗体薬物複合体ＦＤＡ０２６－ＬＥ１４、ＦＤＡ０２８－ＬＥ１４及びＦＤＡ０２９－ＬＥ１４を、１０％のＦＢＳを含むＬ１５細胞培地で１０００、１６６．７、５５．６、１８．６、６．１７、２．０６、０．６９、０．２３、０．０８、０．００８及び０ｎＭの合計１１個の濃度勾配の試験品溶液に製造し、希釈した試験溶液１００μｌ／ウェルを取り、細胞を接種した培養プレートに加え、３７℃、５％のＣＯ２インキュベータで１４４時間培養した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（５０μｌ／ウェル）を加え、５００ｒｐｍで、室温で１０分間振とうして、１０分間均一に混合させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＬマイクロプレートリーダー（ＯＤ５７０ｎｍ、２ｓ間隔で読み取る）でデータを読み取り、ＩＣ５０の算出結果は表５に示される通りであり、結果は：Ｆｃにより修飾されていないＦＤＡ０２６－ＬＥ１４薬物複合体はＫ５６２細胞に対していずれも所定の死滅効果を有しているが、Ｆｃにより修飾されたＡＤＣ薬物ＦＤＡ０２８－ＬＥ１４及びＦＤＡ０２９－ＬＥ１４はＫ５６２細胞に対する死滅効果は有意に低下することを示している。
【0226】
上記Ｋ５６２細胞株と同様の実験方法を使用して、４日間分化させたＨＳＣ細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ社から購入し、商品番号：７０００８．１）を選択し、６日間投与して細胞毒性活性検出を実行し、抗体薬物複合体で６日間処理した後、ＨＳＣ細胞の表面抗原の存在量（即ちｂｉｎｄｉｎｇ ｒａｔｉｏ、ＣＤ３２ａ ７．４；Ｈｅｒ３抗原０．８；ＣＤ３４ ６９．０）をフロー分析して、そのＣＤ３２の発現が高く、Ｈｅｒ３抗原がほとんど発現しないことが示され、その活性結果は表６に示される通りであり、Ｆｃにより修飾されていないＦＤＡ０２６－ＬＥ１４薬物複合体はＨＳＣ細胞に対していずれも所定の死滅効果を有しているが、Ｆｃにより修飾されたＡＤＣ薬物ＦＤＡ０２８－ＬＥ１４及びＦＤＡ０２９－ＬＥ１４はＨＳＣ細胞に対する死滅効果は有意に低下することを示している。
【0227】
【表6】
【0228】
効果実施例４：ｉｎ ｖｉｔｒｏ血漿安定性試験
本実施例では、ヒト血漿における実施例３の方法に従って製造された抗体薬物複合体の安定性を評価した。具体的には、本実施例では、実施例３の抗体薬物複合体の一部をヒト血漿に加え、３７℃の水浴に１、３、７、１４、２１、２８日間置き、内部標準（イキシノテカンを内部標準物質とする）を入れて抽出し、高速液体クロマトグラフィーにより遊離薬物の放出量を検出し、結果は表７に示される通りである。
本実施例では、ヒト血漿における実施例３の方法に従って製造された抗体薬物複合体の安定性を評価した。具体的には、本実施例では、実施例３の抗体薬物複合体の一部をヒト血漿に加え、３７℃の水浴に１、３、７、１４、２１、２８日間置き、内部標準（イキシノテカンを内部標準物質とする）を入れて抽出し、高速液体クロマトグラフィーにより遊離薬物の放出量を検出し、結果は表７に示される通りである。
【0229】
【表7】
【0230】
血漿安定性の結果は、新しい技術を用いて得られたＡＤＣの安定性がＦＤＡ０２６－１４０２に劣らず、一部はより優れていることを示し、同時に上記の活性試験の結果も、一部の新たに得られたＡＤＣの活性がＦＤＡ０２６－１４０２より優れていることを証明している。
【0231】
効果実施例５：リンカー－薬物複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素切断実験
リンカー－薬物複合体（ＬＥ１４及びＧＧＦＧ－Ｄｘｄ）及びカテプシンＢを３つの異なるｐＨ（５．０、６．０、７．０）緩衝液で共培養し、異なる時点でサンプリングして高速液体クロマトグラフィー－質量分析計に入れ、外部標準法（ＤＸＤを外部標準とする）により薬物の放出率を確定した。試験結果（表８に示される通りである）は、ＧＧＦＧ－Ｄｘｄが使用されるｐＨ範囲においてより遅い消化速度を有する一方で、本発明のＬＥ１４は、ｐＨ５．０～ｐＨ７．０の範囲において迅速に酵素切断できることを示した。
リンカー－薬物複合体（ＬＥ１４及びＧＧＦＧ－Ｄｘｄ）及びカテプシンＢを３つの異なるｐＨ（５．０、６．０、７．０）緩衝液で共培養し、異なる時点でサンプリングして高速液体クロマトグラフィー－質量分析計に入れ、外部標準法（ＤＸＤを外部標準とする）により薬物の放出率を確定した。試験結果（表８に示される通りである）は、ＧＧＦＧ－Ｄｘｄが使用されるｐＨ範囲においてより遅い消化速度を有する一方で、本発明のＬＥ１４は、ｐＨ５．０～ｐＨ７．０の範囲において迅速に酵素切断できることを示した。
【0232】
【表8】
【0233】
効果実施例６：ＦＤＡ０２６－ＬＳ１３のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素切断実験
実験細胞株としてＳＫ－ＢＲ－３細胞株を選択し、試料をカテプシンＢ系（１００ｍＭの酢酸ナトリウム－酢酸緩衝液、４ｍＭのジチオスレイトール、ｐＨ５．０）で、３７℃で４時間培養後、得られた試料を培地で異なる濃度に希釈して、ＳＮ－３８濃度７０ｎＭ～０．００３ｎＭで８個の濃度（１．５～１０倍希釈）に設定し、細胞株の殺傷（阻害）能力の変化を１４４時間観察し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙ化学発光染色を使用して、蛍光データを読み取り、ＩＣ５０数値を計算した。
実験細胞株としてＳＫ－ＢＲ－３細胞株を選択し、試料をカテプシンＢ系（１００ｍＭの酢酸ナトリウム－酢酸緩衝液、４ｍＭのジチオスレイトール、ｐＨ５．０）で、３７℃で４時間培養後、得られた試料を培地で異なる濃度に希釈して、ＳＮ－３８濃度７０ｎＭ～０．００３ｎＭで８個の濃度（１．５～１０倍希釈）に設定し、細胞株の殺傷（阻害）能力の変化を１４４時間観察し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標） ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙ化学発光染色を使用して、蛍光データを読み取り、ＩＣ５０数値を計算した。
【0234】
以上のカテプシンＢ反応系で３７℃で４時間培養した酵素切断試料を適量のエタノールで沈殿させて、タンパク質を除去し、高速液体クロマトグラフィーで放出された小分子化合物を検出し、同量のＳＮ－３８を基準として、４時間の放出率を測定した結果、９９％の放出率を達した。
【0235】
試験結果（表９に示される通りである）は、酵素切断後のＦＤＡ０２６－ＬＳ１３の細胞毒性活性は等量のＳＮ－３８とほぼ同じであることを示し、また、ＦＤＡ０２６－ＬＳ１３がカテプシンＢの作用下でＳＮ－３８をほぼ完全に放出して効果的に機能したが、ＦＤＡ０２６－ＬＳ１３のリソソームへのエンドサイトーシスにより予測できない変化を引き起こし、ＳＮ－３８が効果的に機能できない可能性があることを示した。
【0236】
【表9】
【0237】
効果実施例７：ＳＷ６２０ヒト結腸直腸癌モデルにおけるＦＤＡ０２６－ＬＥ１４の抗腫瘍活性試験
６～８週齢のメスＢａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅマウスを選択し、１００ｕｌのＰＢＳ溶液に溶解させた５×１０６ヒト結腸直腸癌細胞（ＳＷ６２０）を首の右側と背中に皮下注射し、腫瘍が平均体積１５０～２００ｍｍ３に成長した後、腫瘍の大きさ及びマウスの体重に応じて無作為に８つの群に分け、各群に６匹の動物とし、それぞれブランク対照群、１００ｍｇ／ｋｇのイリノテカン塩酸塩群、及び抗体薬物複合体ＦＤＡ０２６－１４０２、ＦＤＡ０２８－ＬＥ１４及びＦＤＡ０２６－ＬＥ１４をそれぞれ５．０ｍｇ／ｋｇ及び１０．０ｍｇ／ｋｇの２つの投与量に分けた群であり、週に１回腹腔内投与した。週２回実験動物の体重と腫瘍の体積を測量し、実験中の動物の生存状態を観察した。結果は表９に示される通りであり、イリノテカン塩酸塩（１００ｍｇ／ｋｇ）治療群は投与終了後の第１４日（即ち観察してから４６日目、以下同様である）の平均腫瘍体積は１１２０．０９ｍｍ３であり、ブランク対照群マウスは投与終了後の平均腫瘍体は２０７４．５ｍｍ３であった。試験薬物５．０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０２６－１４０２治療群は投与終了後の第１４日の平均腫瘍体積は２６０．８７ｍｍ３であり、１０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０２６－１４０２治療群は投与終了後の第１４日の平均腫瘍体積は０．００ｍｍ３であった。試験薬物５．０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０２６－ＬＥ１４治療群は投与終了後の第１４日の平均腫瘍体積は１３．７９ｍｍ３であり、１０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０２６－ＬＥ１４治療群は投与終了後の第１４日の平均腫瘍体積は０．００ｍｍ３であった。試験薬物５．０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０２８－ＬＥ１４治療群は投与終了後の第１４日の平均腫瘍体積は９．８６ｍｍ３であり、１０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０２８－ＬＥ１４治療群は投与終了後の第１４日の平均腫瘍体積は０．００ｍｍ３であった。実験結果は、ＦＤＡ０２６－ＬＥ１４及びＡ０２８－ＬＥ１４がいずれも比較的良好な体内抗腫瘍活性を持っていることを示し、同時にすべての実験マウスは死亡状況がなく、体重減少がなく、ＦＤＡ０２６－ＬＥ１４が非常に良い安全性を持っていることを示した。
６～８週齢のメスＢａｌｂ／ｃ ｎｕｄｅマウスを選択し、１００ｕｌのＰＢＳ溶液に溶解させた５×１０６ヒト結腸直腸癌細胞（ＳＷ６２０）を首の右側と背中に皮下注射し、腫瘍が平均体積１５０～２００ｍｍ３に成長した後、腫瘍の大きさ及びマウスの体重に応じて無作為に８つの群に分け、各群に６匹の動物とし、それぞれブランク対照群、１００ｍｇ／ｋｇのイリノテカン塩酸塩群、及び抗体薬物複合体ＦＤＡ０２６－１４０２、ＦＤＡ０２８－ＬＥ１４及びＦＤＡ０２６－ＬＥ１４をそれぞれ５．０ｍｇ／ｋｇ及び１０．０ｍｇ／ｋｇの２つの投与量に分けた群であり、週に１回腹腔内投与した。週２回実験動物の体重と腫瘍の体積を測量し、実験中の動物の生存状態を観察した。結果は表９に示される通りであり、イリノテカン塩酸塩（１００ｍｇ／ｋｇ）治療群は投与終了後の第１４日（即ち観察してから４６日目、以下同様である）の平均腫瘍体積は１１２０．０９ｍｍ３であり、ブランク対照群マウスは投与終了後の平均腫瘍体は２０７４．５ｍｍ３であった。試験薬物５．０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０２６－１４０２治療群は投与終了後の第１４日の平均腫瘍体積は２６０．８７ｍｍ３であり、１０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０２６－１４０２治療群は投与終了後の第１４日の平均腫瘍体積は０．００ｍｍ３であった。試験薬物５．０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０２６－ＬＥ１４治療群は投与終了後の第１４日の平均腫瘍体積は１３．７９ｍｍ３であり、１０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０２６－ＬＥ１４治療群は投与終了後の第１４日の平均腫瘍体積は０．００ｍｍ３であった。試験薬物５．０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０２８－ＬＥ１４治療群は投与終了後の第１４日の平均腫瘍体積は９．８６ｍｍ３であり、１０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０２８－ＬＥ１４治療群は投与終了後の第１４日の平均腫瘍体積は０．００ｍｍ３であった。実験結果は、ＦＤＡ０２６－ＬＥ１４及びＡ０２８－ＬＥ１４がいずれも比較的良好な体内抗腫瘍活性を持っていることを示し、同時にすべての実験マウスは死亡状況がなく、体重減少がなく、ＦＤＡ０２６－ＬＥ１４が非常に良い安全性を持っていることを示した。
【0238】
【表10】
【0239】
注：０ｈ群は、ブランク対照群であり；０２群は、５ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０２６－ＬＥ１４群であり；０３群は、１０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０２６－ＬＥ１４群であり；０４群は、５ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０２６－１４０２群であり；０５群は、１０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０２６－１４０２群であり；０６群は、５ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０２８－ＬＥ１４群であり；０７群は、１０ｍｇ／ｋｇのＦＤＡ０２８－ＬＥ１４群であり；０８群は、１００ｍｇ／ｋｇのイリノテカン塩酸塩群である。
【図1】
【配列表】