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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-13
(45)【発行日】2024-03-22
(54)【発明の名称】毛細血管拡張抑制剤
(51)【国際特許分類】
A61K 36/30 20060101AFI20240314BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240314BHJP
A61P 9/14 20060101ALI20240314BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240314BHJP
【ＦＩ】
A61K36/30 ZNA
A61P43/00 111
A61P9/14
A61P17/00
A61P43/00 105
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2020000262
(22)【出願日】2020-01-06
(65)【公開番号】P2021109831
(43)【公開日】2021-08-02
【審査請求日】2022-11-30
(73)【特許権者】
【識別番号】592262543
【氏名又は名称】日本メナード化粧品株式会社
(72)【発明者】
【氏名】吉岡 寿
(72)【発明者】
【氏名】村上 祐子
(72)【発明者】
【氏名】宮地 克真
(72)【発明者】
【氏名】堀場 大生
(72)【発明者】
【氏名】山羽 宏行
【審査官】柴原 直司
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０２６７０８３７（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０５１６８０９１（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開２０１７－０８１８２９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開昭６０－１７４７２１（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０５９６３３３５（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開２０１１－０３７７３８（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３６／００－３６／９０６８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ルリジサの熱水抽出物を含有することを特徴とするエンドセリンＢ受容体発現抑制剤。
【請求項2】
血管内皮細胞におけるエンドセリンＢ受容体発現を抑制する請求項１記載のエンドセリンＢ受容体発現抑制剤。
【請求項3】
ルリジサの熱水抽出物を含有することを特徴とする毛細血管拡張抑制剤。
【請求項4】
ルリジサの熱水抽出物を含有することを特徴とする肌の赤み改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ルリジサ又はクズの抽出物を含有することを特徴とするエンドセリンＢ受容体発現抑制剤、毛細血管拡張抑制剤、肌の赤み改善剤に関するものである。
【背景技術】
【0002】
エンドセリンは、内皮細胞由来のペプチドホルモンで、受容体を通して種々の細胞や組織に作用する。例えば、血管平滑筋細胞等において細胞内カルシウム濃度上昇を引き起こし、血管収縮作用を有することが知られている（非特許文献１及び２、特許文献１）。各受容体がもつ生理作用は多彩ではあるが、基本的にエンドセリンＡ受容体は血管収縮作用、強心作用、中枢交感神経活性の亢進、副腎でのアルドステロン・カテコラミン分泌促進を介して血圧上昇と体液貯留を引き起こす。それに対し、エンドセリンＢ受容体は血管平滑筋と副腎皮質細胞を除くほとんどの部位でエンドセリンＡ受容体と拮抗する挙動を示し、全体として血圧低下と利尿促進作用を示す（非特許文献３）。
【0003】
動脈や静脈等の血管は通常、内腔を一層に覆う血管内皮細胞とその周囲を取り巻き血管構造の支持や血管の弛緩収縮等を司る壁細胞（平滑筋細胞及びペリサイト）から構成されている。それに対し、毛細血管は平滑筋細胞をもたず血管内皮細胞で構成されている（非特許文献４）。エンドセリンＢ受容体は平滑筋細胞においてはエンドセリンＡ受容体と同様に血管収縮作用を示すが、血管内皮細胞においては血管拡張作用を示す（非特許文献３及び５）。又、血管内皮細胞にはエンドセリンＡ受容体は存在しないため、エンドセリン／エンドセリン受容体経路を介した血管の収縮弛緩にはエンドセリンＢ受容体のみが関与している（非特許文献３）。そのため、血管内皮細胞しかもたない毛細血管においてはエンドセリン／エンドセリンＢ受容体経路を介して血管拡張が起こる。
【0004】
色むらはシミやソバカス、ニキビ等に代表され、日本人女性の肌悩みの上位を占め、化粧品や美容医療分野で重要な研究対象となっている。色むらには、シミやソバカスのようにメラニン色素を要因とする色むらと、ニキビの炎症に代表されるヘモグロビンを要因とする色むらが混在している（非特許文献６）。前者は肌のくすみ、後者は肌の赤みとされている。
【0005】
肌の赤みは、ウイルスやアレルゲンに対するバリア機能が低下することにより、免疫反応が起こりやすく、炎症が引き起こされて皮膚中の毛細血管が拡張することにより生じる。又、敏感肌の肌トラブルとして赤みを挙げた人は血流量が多く、いくつもの細い血管が確認されている。更に、赤ら顔と血管新生因子（ＶＥＧＦＡ）との関連が指摘されている。欧米人に見られる赤ら顔、特に酒さは皮脂分泌過剰による脂漏性皮膚炎、及びそれぞれが引き起こす毛細血管拡張が一因であるといわれている（非特許文献７）。エンドセリンＢ受容体に着目した先行研究として、ヒトケラチノサイトがエンドセリンを産生分泌し、ヒトメラノサイトへの強力な増殖促進効果を、エンドセリンＢ受容体を介して発揮してシミを引き起こすといった知見がある（非特許文献８）。しかし、肌の赤みに対する効果については研究されていない。
【0006】
ルリジサはムラサキ科ボラゴ属の植物でハーブの一種であり、学名：Ｂｏｒａｇｏ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓである。原産はヨーロッパ中部の地中海沿岸である。今までに、ルリジサの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする美白剤、抗シワ剤、抗老化剤及び皮膚化粧料（特許文献２）、保湿剤及び皮膚化粧料（特許文献３）等が知られている。しかしながら、ルリジサの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするエンドセリンＢ受容体発現抑制剤、毛細血管拡張抑制剤、肌の赤み改善剤については知られていない。
【0007】
クズはマメ科クズ属のつる性の多年草であり、学名：Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａであるが、今までに、クズの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする美白剤、抗酸化剤及び皮膚化粧料（特許文献４）、シワ改善組成物、老化防止組成物及び皮膚外用組成物（特許文献５）等が知られている。しかしながら、クズの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするエンドセリンＢ受容体発現抑制剤、毛細血管拡張抑制剤、肌の赤み改善剤については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】特開２０１４－８０３６９
【文献】特開２０１８－２０３６２８
【文献】特開平０９－２７８６４１
【文献】特開２０１２－０４６４５７
【文献】特開２０１２－５３２０９８
【非特許文献】
【0009】
【文献】Ｈｉｒａｔａ Ｙ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．，１５４（３），８６８－８７５（１９８８）
【文献】Ｙａｎａｇｉｓａｗａ Ｍ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３３２（６１６３），４１１－４１５（１９８８）
【文献】中山和彦，心臓，４５（１２），１５０３－１５１１（２０１３）
【文献】尾池雄一，「基礎から臨床応用までの血管研究がわかる」，２８－３６（２００４）
【文献】Ｄｏｎａｌｄ Ｅ． Ｋｏｈａｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，９１（１），１－７７（２０１１）
【文献】井上弥生，粧技誌，４５（３），２１８－２２４（２０１１）
【文献】飯田年以，香粧会誌，３７（４），２６３－２６７（２０１３）
【文献】芋川玄爾，フレグランスジャーナル，４５（９），５７－６４（２０１７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明が解決する課題は、エンドセリンＢ受容体発現を抑制する植物由来成分を見出し、これを有効成分とする、作用点が明確であり、且つ優れたエンドセリンＢ受容体発現抑制剤、毛細血管拡張抑制剤、肌の赤み改善剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、上記課題の解決に向け鋭意検討を行った結果、ルリジサ又はクズの抽出物に優れたエンドセリンＢ受容体発現抑制作用を有することを見出した。更に、本発明者らは、ルリジサ又はクズの抽出物を含有する組成物に、優れたエンドセリンＢ受容体発現抑制効果、毛細血管拡張抑制効果、及び肌の赤み改善効果を見出し、本発明を完成するに至った。
【0012】
即ち、本発明は、ルリジサ又はクズの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするエンドセリンＢ受容体発現抑制剤、毛細血管拡張抑制剤、及び肌の赤み改善剤に関する。
【0013】
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）ルリジサ及び／又はクズの抽出物を含有することを特徴とするエンドセリンＢ受容体発現抑制剤。
（２）血管内皮細胞におけるエンドセリンＢ受容体発現を抑制する請求項１記載のエンドセリンＢ受容体発現抑制剤。
（３）ルリジサ及び／又はクズの抽出物を含有することを特徴とする毛細血管拡張抑制剤。
（４）ルリジサ及び／又はクズの抽出物を含有することを特徴とする肌の赤み改善剤。
（１）ルリジサ及び／又はクズの抽出物を含有することを特徴とするエンドセリンＢ受容体発現抑制剤。
（２）血管内皮細胞におけるエンドセリンＢ受容体発現を抑制する請求項１記載のエンドセリンＢ受容体発現抑制剤。
（３）ルリジサ及び／又はクズの抽出物を含有することを特徴とする毛細血管拡張抑制剤。
（４）ルリジサ及び／又はクズの抽出物を含有することを特徴とする肌の赤み改善剤。
【発明の効果】
【0014】
本発明のルリジサ又はクズの抽出物は、エンドセリンＢ受容体発現抑制効果に優れていた。又、この抽出物を含有することを特徴とするエンドセリンＢ受容体発現抑制剤、毛細血管拡張抑制剤、肌の赤み改善剤は、安全で、毛細血管拡張予防又は肌の赤み改善効果に優れていた。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】実験例５でヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に蛍光色素を取り込ませた細胞の顕微鏡写真である。点線で囲んだ領域はＨＵＶＥＣが集積し造られた血管であり、管腔の外径としては血管の幅を測定した。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明におけるエンドセリンＢ受容体は、血管拡張因子であるエンドセリンと結合することで、毛細血管の拡張を引き起こす。別名でエンドセリン受容体Ｂ型、エンドセリン受容体Ｂ、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ Ｂ、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ Ｂ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＥＤＮＲＢ、ＥＴＢ、ＥＴ－Ｂ、ＥＴＢ１、ＥＴＢＲ、ＥＴＲＢ、ＨＳＣＲ、ＷＳ４Ａ、ＡＢＣＤＳ、ＥＴ－ＢＲ、ＨＳＣＲ２とも呼ばれる。
【0017】
本発明における血管内皮細胞は、血管の内腔を一層に覆う細胞である。
【0018】
本発明における肌の赤み改善は、紫外線や酸化ストレス等の敏感肌の肌トラブルにより起こるヘモグロビンを要因とする肌の赤みを改善することを示す。
【0019】
本発明に用いるルリジサは、植物で、ハーブの一種であり、原産はヨーロッパ中部の地中海沿岸である。高さは３０～６０センチくらいになり、淡い緑色の葉や茎は白い毛で覆われていて、夏季に青色や白色の星型の花を咲かせる。別名でボリジ・瑠璃苣・ルリヂサ、ボリヂ、ルリジシャ、ルリヂシャ、ボラゴとも呼ばれる。
【0020】
本発明におけるルリジサの抽出物には、シソ目ムラサキ科ボラゴ属のルリジサ（学名：Ｂｏｒａｇｏ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）が用いられ、部位としては、花、実、種子、葉、茎、根等の植物体の一部又は全草から抽出したものである。その抽出方法は特に限定されず、例えば、加熱抽出したものであっても良いし、常温抽出したものであっても良い。又、抽出には、植物体をそのまま使用しても良く、乾燥、粉砕、細切等の処理を行っても良い。
【0021】
本発明に用いるクズには、マメ科クズ属のつる性の多年草のうち、例えばクズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ、Ｐ．ｍｏｎｔａｎａ、Ｐ．ｔｈｕｎｂｅｒｇｉａｎａ）、タイワンクズ（Ｐ．ｏｍｅｉｅｎｓｉｓ、Ｐ．ｔｏｎｋｉｎｅｎｓｉｓ）、シナノクズ（Ｐ．ｔｈｏｍｓｏｎｉｉ、Ｐ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）を用いることができる。本発明に用いるクズの抽出物とは、クズの花、実、種子、葉、茎、根等の植物体の一部又は全草が用いられ、好ましくはクズの根茎の抽出物をいう。抽出には、これらの植物体をそのまま使用しても良く、乾燥、粉砕、細切等の処理を行っても良い。別名でウマノボタモチ・久須・葛根・くずね・カッコンとも呼ばれる。
【0022】
抽出方法は、特に限定されないが、水もしくは熱水、又は水と有機溶媒の混合溶媒を用い、撹拌又はカラム抽出する方法等により行うことができる。抽出溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール等）、液状多価アルコール類（１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール及び液状多価アルコール等の極性溶媒が良く、特に好ましくは、水、エタノール、１，３－ブチレングリコール及びプロピレングリコールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。特に好ましい抽出溶媒としては、水、又は水－エタノール系の混合極性溶媒が挙げられる。溶媒の使用量については、特に限定はなく、例えばルリジサの全草又はクズの根茎（乾燥重量）に対し、１０倍以上、好ましくは２０倍以上であれば良いが、抽出後に濃縮を行ったり、単離したりする場合の操作の便宜上１００倍以下であることが好ましい。又、抽出温度や時間は、用いる溶媒の種類や抽出時の圧力等によって適宜選択できる。
【0023】
上記抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良いが、必要に応じて、本発明の効果を奏する範囲で、濃縮（減圧濃縮、膜濃縮等による濃縮）、希釈、濾過、活性炭等による脱色、脱臭、エタノール沈殿等の処理を行ってから用いても良い。更には、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いても良い。
【0024】
本発明は、上記抽出物をそのまま使用しても良く、抽出物の効果を損なわない範囲内で、化粧品、医薬部外品、医薬品又は食品等に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、賦形剤、皮膜剤、甘味料、酸味料等の成分が含有されていても良い。
【0025】
本発明は、化粧品、医薬部外品、医薬品、食品のいずれにも用いることができ、その剤形としては、例えば、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、錠菓、カプセル剤、チョコレート、ガム、飴、飲料、散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤、坐剤、注射用溶液等が挙げられる。
【0026】
外用の場合、本発明に用いる上記抽出物の含有量は、固形物に換算して０．０００１重量％以上が好ましく、０．００１～１０重量％がより好ましい。更に、０．０１～５重量％が最も好ましい。０．０００１重量％未満では十分な効果は望みにくい。１０重量％を越えると、効果の増強は認められにくく不経済である。
【0027】
内用の場合、摂取量は年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なる。通常、成人１人当たりの１日の摂取量としては、５ｍｇ以上が好ましく、１０ｍｇ～５ｇがより好ましい。更に、２０ｍｇ～２ｇが最も好ましい。
【0028】
次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いる抽出物の製造例、実験例及び処方例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。製造例に示す％とは重量％を、処方例に示す含有量の部とは重量部を示す。
【実施例1】
【0029】
ルリジサ又はクズの抽出物を以下のとおり製造した。製造例１～４において抽出材料にはルリジサの全草を用い、製造例５～８において抽出材料にはクズの根茎を用いた。
【0030】
（製造例１）ルリジサの熱水抽出物の調製
ルリジサの乾燥物１０ｇに２００ｍＬの水を加え、９５～１００℃で２時間抽出した。得られた抽出液を濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してルリジサの熱水抽出物を１．４ｇ得た。
ルリジサの乾燥物１０ｇに２００ｍＬの水を加え、９５～１００℃で２時間抽出した。得られた抽出液を濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してルリジサの熱水抽出物を１．４ｇ得た。
【0031】
（製造例２）ルリジサの５０％エタノール抽出物の調製
ルリジサの乾燥物１０ｇを２００ｍＬの５０％エタノール水溶液に室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してルリジサの５０％エタノール抽出物を１．１ｇ得た。
ルリジサの乾燥物１０ｇを２００ｍＬの５０％エタノール水溶液に室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してルリジサの５０％エタノール抽出物を１．１ｇ得た。
【0032】
（製造例３）ルリジサのエタノール抽出物の調製
ルリジサの乾燥物１０ｇを２００ｍＬのエタノールに室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してルリジサのエタノール抽出物を０．４ｇ得た。
ルリジサの乾燥物１０ｇを２００ｍＬのエタノールに室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してルリジサのエタノール抽出物を０．４ｇ得た。
【0033】
（製造例４）ルリジサの１，３－ブチレングリコール抽出物の調製
ルリジサの乾燥物１０ｇを２００ｍＬの１，３－ブチレングリコールに室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過してルリジサの１，３－ブチレングリコール抽出物を１９２ｇ得た。
ルリジサの乾燥物１０ｇを２００ｍＬの１，３－ブチレングリコールに室温で７日間浸漬し抽出を行った。得られた抽出液を濾過してルリジサの１，３－ブチレングリコール抽出物を１９２ｇ得た。
【0034】
（製造例５）クズの根茎の熱水抽出物の調製
根皮を取り除いたクズの根茎の乾燥物１０ｇに１５０ｍＬの水を加え、９５～１００℃で２時間抽出した。得られた抽出液を濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してクズの根茎の熱水抽出物を１．２ｇ得た。
根皮を取り除いたクズの根茎の乾燥物１０ｇに１５０ｍＬの水を加え、９５～１００℃で２時間抽出した。得られた抽出液を濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してクズの根茎の熱水抽出物を１．２ｇ得た。
【0035】
（製造例６）クズの根茎の５０％エタノール抽出物の調製
根皮を取り除いたクズの根茎の乾燥物１０ｇを１５０ｍＬの５０％エタノール水溶液に室温で７日間浸漬し、１８０ｒｐｍの速度で振盪抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してクズの根茎の５０％エタノール抽出物を２．０ｇ得た。
根皮を取り除いたクズの根茎の乾燥物１０ｇを１５０ｍＬの５０％エタノール水溶液に室温で７日間浸漬し、１８０ｒｐｍの速度で振盪抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してクズの根茎の５０％エタノール抽出物を２．０ｇ得た。
【0036】
（製造例７）クズの根茎のエタノール抽出物の調製
根皮を取り除いたクズの根茎の乾燥物１０ｇを１００ｍＬのエタノールに室温で７日間浸漬し、１８０ｒｐｍの速度で振盪抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してクズの根茎のエタノール抽出物を０．４ｇ得た。
根皮を取り除いたクズの根茎の乾燥物１０ｇを１００ｍＬのエタノールに室温で７日間浸漬し、１８０ｒｐｍの速度で振盪抽出を行った。得られた抽出液を濾過した後、エバポレーターで濃縮乾固してクズの根茎のエタノール抽出物を０．４ｇ得た。
【0037】
（製造例８）クズの根茎の１，３－ブチレングリコール抽出物の調製
根皮を取り除いたクズの根茎の乾燥物１０ｇを２００ｍＬの１，３－ブチレングリコールに室温で７日間浸漬し、１８０ｒｐｍの速度で振盪抽出を行った。得られた抽出液を濾過してクズの根茎の１，３－ブチレングリコール抽出物を１９０ｇ得た。
根皮を取り除いたクズの根茎の乾燥物１０ｇを２００ｍＬの１，３－ブチレングリコールに室温で７日間浸漬し、１８０ｒｐｍの速度で振盪抽出を行った。得られた抽出液を濾過してクズの根茎の１，３－ブチレングリコール抽出物を１９０ｇ得た。
【実施例2】
【0038】
（処方例１） 化粧水
処方 含有量（部）
１．ルリジサの熱水抽出物（製造例１） ２．０
２．１，３－ブチレングリコール ８．０
３．グリセリン ２．０
４．キサンタンガム ０．０２
５．クエン酸 ０．０１
６．クエン酸ナトリウム ０．１
７．エタノール ５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１０．香料 適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～６及び１１と、成分７～１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。
処方 含有量（部）
１．ルリジサの熱水抽出物（製造例１） ２．０
２．１，３－ブチレングリコール ８．０
３．グリセリン ２．０
４．キサンタンガム ０．０２
５．クエン酸 ０．０１
６．クエン酸ナトリウム ０．１
７．エタノール ５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１０．香料 適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～６及び１１と、成分７～１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。
【0039】
（比較処方例１） 従来の化粧水
処方例１において、ルリジサの熱水抽出物を精製水に置き換えたものを、従来の化粧水とした。
処方例１において、ルリジサの熱水抽出物を精製水に置き換えたものを、従来の化粧水とした。
【0040】
（処方例２） クリーム
処方 含有量（部）
１．クズの根茎の５０％エタノール抽出物（製造例６） １．０
２．スクワラン ５．５
３．オリーブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコール １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１２．１，３－ブチレングリコール ８．５
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
処方 含有量（部）
１．クズの根茎の５０％エタノール抽出物（製造例６） １．０
２．スクワラン ５．５
３．オリーブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコール １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１２．１，３－ブチレングリコール ８．５
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【0041】
（比較処方例２） 従来のクリーム
処方例２において、クズの根茎の５０％エタノール抽出物を精製水に置き換えたものを、従来のクリームとした。
処方例２において、クズの根茎の５０％エタノール抽出物を精製水に置き換えたものを、従来のクリームとした。
【0042】
（処方例３） 乳液
処方 含有量（部）
１．ルリジサのエタノール抽出物（製造例３） ０．０１
２．スクワラン ５．０
３．オリーブ油 ５．０
４．ホホバ油 ５．０
５．セタノール １．５
６．モノステアリン酸グリセリン ２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
９．香料 ０．１
１０．プロピレングリコール １．０
１１．グリセリン ２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１０～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
処方 含有量（部）
１．ルリジサのエタノール抽出物（製造例３） ０．０１
２．スクワラン ５．０
３．オリーブ油 ５．０
４．ホホバ油 ５．０
５．セタノール １．５
６．モノステアリン酸グリセリン ２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
９．香料 ０．１
１０．プロピレングリコール １．０
１１．グリセリン ２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１０～１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【0043】
（処方例４） ゲル剤
処方 含有量（部）
１．ルリジサの１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４） １．０
２．エタノール ５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．） ０．１
５．香料 適量
６．１，３－ブチレングリコール ５．０
７．グリセリン ５．０
８．キサンタンガム ０．１
９．カルボキシビニルポリマー ０．２
１０．水酸化カリウム ０．２
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～５と、成分１及び６～１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。
処方 含有量（部）
１．ルリジサの１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例４） １．０
２．エタノール ５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．） ０．１
５．香料 適量
６．１，３－ブチレングリコール ５．０
７．グリセリン ５．０
８．キサンタンガム ０．１
９．カルボキシビニルポリマー ０．２
１０．水酸化カリウム ０．２
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～５と、成分１及び６～１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。
【0044】
（処方例５） パック
処方 含有量（部）
１．クズの根茎の熱水抽出物（製造例５） ５．０
２．ポリビニルアルコール １２．０
３．エタノール ５．０
４．１，３－ブチレングリコール ８．０
５．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
６．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．） ０．５
７．クエン酸 ０．１
８．クエン酸ナトリウム ０．３
９．香料 適量
１０．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～１０を均一に溶解し製品とする。
処方 含有量（部）
１．クズの根茎の熱水抽出物（製造例５） ５．０
２．ポリビニルアルコール １２．０
３．エタノール ５．０
４．１，３－ブチレングリコール ８．０
５．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
６．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（２０Ｅ．Ｏ．） ０．５
７．クエン酸 ０．１
８．クエン酸ナトリウム ０．３
９．香料 適量
１０．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１～１０を均一に溶解し製品とする。
【0045】
（処方例６） ファンデーション
処方 含有量（部）
１．ルリジサの５０％エタノール抽出物（製造例２） １．０
２．ステアリン酸 ２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（２０Ｅ．Ｏ．） １．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
５．セタノール １．０
６．液状ラノリン ２．０
７．流動パラフィン ３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル ６．５
９．カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．１
１０．ベントナイト ０．５
１１．プロピレングリコール ４．０
１２．トリエタノールアミン １．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１４．二酸化チタン ８．０
１５．タルク ４．０
１６．ベンガラ １．０
１７．黄酸化鉄 ２．０
１８．香料 適量
１９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～８を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分１９に成分９を良く膨潤させ、続いて、成分１及び１０～１３を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１４～１７を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。この油相に水相をかき混ぜながら加え、乳化する。その後、冷却し、４５℃で成分１８を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
処方 含有量（部）
１．ルリジサの５０％エタノール抽出物（製造例２） １．０
２．ステアリン酸 ２．４
３．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（２０Ｅ．Ｏ．） １．０
４．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
５．セタノール １．０
６．液状ラノリン ２．０
７．流動パラフィン ３．０
８．ミリスチン酸イソプロピル ６．５
９．カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．１
１０．ベントナイト ０．５
１１．プロピレングリコール ４．０
１２．トリエタノールアミン １．１
１３．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１４．二酸化チタン ８．０
１５．タルク ４．０
１６．ベンガラ １．０
１７．黄酸化鉄 ２．０
１８．香料 適量
１９．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～８を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分１９に成分９を良く膨潤させ、続いて、成分１及び１０～１３を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１４～１７を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。この油相に水相をかき混ぜながら加え、乳化する。その後、冷却し、４５℃で成分１８を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
【0046】
（処方例７） 浴用剤
処方 含有量（部）
１．クズの根茎のエタノール抽出物（製造例７） １．０
２．炭酸水素ナトリウム ５０．０
３．黄色２０２号（１） 適量
４．香料 適量
５．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１～５を均一に混合し製品とする。
処方 含有量（部）
１．クズの根茎のエタノール抽出物（製造例７） １．０
２．炭酸水素ナトリウム ５０．０
３．黄色２０２号（１） 適量
４．香料 適量
５．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１～５を均一に混合し製品とする。
【0047】
（処方例８） 軟膏
処方 含有量（部）
１．クズの根茎の１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例８） ５．０
２．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
３．モノステアリン酸グリセリン １０．０
４．流動パラフィン ５．０
５．セタノール ６．０
６．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
７．プロピレングリコール １０．０
８．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～５を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び６～８を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
処方 含有量（部）
１．クズの根茎の１，３－ブチレングリコール抽出物（製造例８） ５．０
２．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
３．モノステアリン酸グリセリン １０．０
４．流動パラフィン ５．０
５．セタノール ６．０
６．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
７．プロピレングリコール １０．０
８．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２～５を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び６～８を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
【0048】
（処方例９） 散剤
処方 含有量（部）
１．ルリジサの熱水抽出物（製造例１） ０．５
２．クズの根茎の熱水抽出物（製造例５） ０．５
３．乾燥コーンスターチ ３９．０
４．微結晶セルロース ６０．０
［製造方法］成分１～４を混合し、散剤とする。
処方 含有量（部）
１．ルリジサの熱水抽出物（製造例１） ０．５
２．クズの根茎の熱水抽出物（製造例５） ０．５
３．乾燥コーンスターチ ３９．０
４．微結晶セルロース ６０．０
［製造方法］成分１～４を混合し、散剤とする。
【0049】
（処方例１０） 錠剤
処方 含有量（部）
１．ルリジサのエタノール抽出物（製造例３） ２．５
２．クズの根茎のエタノール抽出物（製造例７） ２．５
３．乾燥コーンスターチ ２５．０
４．カルボキシメチルセルロースカルシウム ２０．０
５．微結晶セルロース ４０．０
６．ポリビニルピロリドン ７．０
７．タルク ３．０
［製造方法］成分１～５を混合し、次いで成分６の水溶液を結合剤として加えて顆粒成型する。成型した顆粒に成分７を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。
処方 含有量（部）
１．ルリジサのエタノール抽出物（製造例３） ２．５
２．クズの根茎のエタノール抽出物（製造例７） ２．５
３．乾燥コーンスターチ ２５．０
４．カルボキシメチルセルロースカルシウム ２０．０
５．微結晶セルロース ４０．０
６．ポリビニルピロリドン ７．０
７．タルク ３．０
［製造方法］成分１～５を混合し、次いで成分６の水溶液を結合剤として加えて顆粒成型する。成型した顆粒に成分７を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。
【0050】
（処方例１１） 錠菓
処方 含有量（部）
１．ルリジサのエタノール抽出物（製造例３） １．０
２．クズの根茎のエタノール抽出物（製造例７） １．０
３．乾燥コーンスターチ ４９．８
４．エリスリトール ４０．０
５．クエン酸 ５．０
６．ショ糖脂肪酸エステル ３．０
７．香料 ０．１
８．精製水 ０．１
［製造方法］成分１～５及び８を混合し、顆粒成型する。成型した顆粒に成分６及び７を加えて打錠する。１粒１．０ｇとする。
処方 含有量（部）
１．ルリジサのエタノール抽出物（製造例３） １．０
２．クズの根茎のエタノール抽出物（製造例７） １．０
３．乾燥コーンスターチ ４９．８
４．エリスリトール ４０．０
５．クエン酸 ５．０
６．ショ糖脂肪酸エステル ３．０
７．香料 ０．１
８．精製水 ０．１
［製造方法］成分１～５及び８を混合し、顆粒成型する。成型した顆粒に成分６及び７を加えて打錠する。１粒１．０ｇとする。
【0051】
（処方例１２） 飲料
処方 含有量（部）
１．ルリジサの熱水抽出物（製造例１） ０．０２５
２．クズの根茎の熱水抽出物（製造例５） ０．０２５
３．ステビア ０．０５
４．リンゴ酸 ５．０
５．香料 ０．１
６．精製水 ９４．８
［製造方法］成分３及び４を少量の水に溶解する。次いで、成分１、２、５及び６を加えて混合する。
処方 含有量（部）
１．ルリジサの熱水抽出物（製造例１） ０．０２５
２．クズの根茎の熱水抽出物（製造例５） ０．０２５
３．ステビア ０．０５
４．リンゴ酸 ５．０
５．香料 ０．１
６．精製水 ９４．８
［製造方法］成分３及び４を少量の水に溶解する。次いで、成分１、２、５及び６を加えて混合する。
【0052】
次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。
【0053】
実験例１ ヒト血管内皮細胞におけるエンドセリンＢ受容体タンパク質をコードする遺伝子発現に及ぼすルリジサ及びクズの抽出物の影響
エンドセリンＢ受容体ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、ＨｕＭｅｄｉａ－ＥＧ２（クラボウ）の培地にて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。コンフルエントな状態になったところで、最終濃度１０μｇ／ｍＬになるようにルリジサ抽出物（製造例１）又はクズ抽出物（製造例５）を溶解させたＨｕＭｅｄｉａ－ＥＧ２に置き換えた。添加から２４時間後に総ＲＮＡの抽出を行った。細胞からの総ＲＮＡの抽出はＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ）を用いて行い、総ＲＮＡ量は分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。ｍＲＮＡ発現量の測定は、細胞から抽出した総ＲＮＡを基にしてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法には、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。即ち、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写反応後、ＰＣＲ反応（９５℃：１５秒間、６０℃：６０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。その他の操作は定められた方法に従い、エンドセリンＢ受容体ｍＲＮＡの発現量を、内部標準であるβ―アクチンｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。エンドセリンＢ受容体発現抑制率は、コントロール（試料未添加）群のエンドセリンＢ受容体ｍＲＮＡの発現量に対する試料添加群のエンドセリンＢ受容体ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。
エンドセリンＢ受容体ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、ＨｕＭｅｄｉａ－ＥＧ２（クラボウ）の培地にて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。コンフルエントな状態になったところで、最終濃度１０μｇ／ｍＬになるようにルリジサ抽出物（製造例１）又はクズ抽出物（製造例５）を溶解させたＨｕＭｅｄｉａ－ＥＧ２に置き換えた。添加から２４時間後に総ＲＮＡの抽出を行った。細胞からの総ＲＮＡの抽出はＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ）を用いて行い、総ＲＮＡ量は分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。ｍＲＮＡ発現量の測定は、細胞から抽出した総ＲＮＡを基にしてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法には、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。即ち、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写反応後、ＰＣＲ反応（９５℃：１５秒間、６０℃：６０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。その他の操作は定められた方法に従い、エンドセリンＢ受容体ｍＲＮＡの発現量を、内部標準であるβ―アクチンｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。エンドセリンＢ受容体発現抑制率は、コントロール（試料未添加）群のエンドセリンＢ受容体ｍＲＮＡの発現量に対する試料添加群のエンドセリンＢ受容体ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。尚、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。
【0054】
エンドセリンＢ受容体用のプライマーセット
ＣＡＡＧＧＡＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号１）
ＣＧＡＡＣＡＣＡＡＧＧＣＡＧＧＡＣＡＣＡ（配列番号２）
β－アクチン用のプライマーセット
ＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣ（配列番号３）
ＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号４）
ＣＡＡＧＧＡＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＴＣＡＡＧ（配列番号１）
ＣＧＡＡＣＡＣＡＡＧＧＣＡＧＧＡＣＡＣＡ（配列番号２）
β－アクチン用のプライマーセット
ＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣ（配列番号３）
ＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧ（配列番号４）
【0055】
その結果を表１に示す。ヒト血管内皮細胞におけるエンドセリンＢ受容体ｍＲＮＡ発現量は、ルリジサ及びクズ抽出物により減少した。尚、ルリジサの抽出物（製造例２、３及び４）、クズの抽出物（製造例６、７及び８）にも同等の効果が認められた。
【0056】
【表1】
【0057】
実験例２ ヒト血管内皮細胞におけるＵＶＡ照射によるエンドセリンＢ受容体発現変化に及ぼすルリジサ及びクズの抽出物の影響
ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、ＨｕＭｅｄｉａ－ＥＧ２（クラボウ）の培地にて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。コンフルエントな状態になったところで、ＨＵＶＥＣをＰＢＳ（－）にて洗浄した後、ＰＢＳ（－）存在下、ＵＶＡ １０Ｊ／ｃｍ２を照射した。照射後は、最終濃度１０μｇ／ｍＬになるようにルリジサ抽出物（製造例１）又はクズ抽出物（製造例５）を溶解させたＨｕＭｅｄｉａ－ＥＧ２に置き換えた。この操作を３日間繰り返し、最終照射から２４時間培養した後、総ＲＮＡの抽出を行った。細胞からの総ＲＮＡの抽出はＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ）を用いて行い、総ＲＮＡ量は分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。ｍＲＮＡ発現量の測定は、細胞から抽出した総ＲＮＡを基にしてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法には、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。即ち、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写反応後、ＰＣＲ反応（９５℃：１５秒間、６０℃：６０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。その他の操作は定められた方法に従い、エンドセリンＢ受容体ｍＲＮＡの発現量を、内部標準であるβ―アクチンｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。エンドセリンＢ受容体発現抑制率は、コントロール（試料未添加）群のエンドセリンＢ受容体ｍＲＮＡの発現量に対する試料添加群のエンドセリンＢ受容体ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。
ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、ＨｕＭｅｄｉａ－ＥＧ２（クラボウ）の培地にて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。コンフルエントな状態になったところで、ＨＵＶＥＣをＰＢＳ（－）にて洗浄した後、ＰＢＳ（－）存在下、ＵＶＡ １０Ｊ／ｃｍ２を照射した。照射後は、最終濃度１０μｇ／ｍＬになるようにルリジサ抽出物（製造例１）又はクズ抽出物（製造例５）を溶解させたＨｕＭｅｄｉａ－ＥＧ２に置き換えた。この操作を３日間繰り返し、最終照射から２４時間培養した後、総ＲＮＡの抽出を行った。細胞からの総ＲＮＡの抽出はＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（タカラバイオ）を用いて行い、総ＲＮＡ量は分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて２６０ｎｍにおける吸光度により求めた。ｍＲＮＡ発現量の測定は、細胞から抽出した総ＲＮＡを基にしてリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法には、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。即ち、５００ｎｇの総ＲＮＡを逆転写反応後、ＰＣＲ反応（９５℃：１５秒間、６０℃：６０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。その他の操作は定められた方法に従い、エンドセリンＢ受容体ｍＲＮＡの発現量を、内部標準であるβ―アクチンｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。エンドセリンＢ受容体発現抑制率は、コントロール（試料未添加）群のエンドセリンＢ受容体ｍＲＮＡの発現量に対する試料添加群のエンドセリンＢ受容体ｍＲＮＡの発現量の比率として算出した。
【0058】
その結果を表２に示す。ルリジサ及びクズ抽出物にＵＶＡ照射により上昇したエンドセリンＢ受容体ｍＲＮＡ発現量を減少させる効果が認められた。尚、ルリジサの抽出物（製造例２、３及び４）、クズの抽出物（製造例６、７及び８）にも同等の効果が認められた。
【0059】
【表2】
【0060】
実験例３ ヒト血管内皮細胞におけるＵＶＡ照射による血管拡張とルリジサ及びクズの抽出物の影響
ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を６０ｍｍ ｄｉｓｈに播種し、ＨｕＭｅｄｉａ－ＥＧ２（クラボウ）の培地にて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。コンフルエントな状態になったところで、ＨＵＶＥＣをＰＢＳ（－）にて洗浄した後、ＰＢＳ（－）存在下、ＵＶＡ １０Ｊ／ｃｍ２を照射した。照射から２４時間培養した後、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＲＡ Ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を希釈したＨｕＭｅｄｉａ－ＥＧ２に置き換えた。３０分後にＰＢＳ（－）にて洗浄した後、トリプシン－ＥＤＴＡを用いて細胞を剥離し、ＴｈｉｎＣｅｒｔ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ ＩＮＳＥＲＴ ＦＯＲ ６ ＷＥＬＬ ＰＬＡＴＥＳ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のインサート内に、あらかじめＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ Ｔｙｐｅ １－Ａ（新田ゼラチン）を５００ｍＬ加えコラーゲンゲルを固形化させたものの上に、１×１０５個播種した。細胞が接着した後、その上からＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ Ｔｙｐｅ １－Ａを５００ｍＬ加えコラーゲンゲルを固形化させ、インサート内外を最終濃度１０μｇ／ｍＬになるようにルリジサ抽出物（製造例１）又はクズ抽出物（製造例５）を溶解させたＨｕＭｅｄｉａ－ＥＧ２で満たした。添加から２４時間後に、蛍光顕微鏡（キーエンス）にて観察した。
ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を６０ｍｍ ｄｉｓｈに播種し、ＨｕＭｅｄｉａ－ＥＧ２（クラボウ）の培地にて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。コンフルエントな状態になったところで、ＨＵＶＥＣをＰＢＳ（－）にて洗浄した後、ＰＢＳ（－）存在下、ＵＶＡ １０Ｊ／ｃｍ２を照射した。照射から２４時間培養した後、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ Ｏｒａｎｇｅ ＣＭＲＡ Ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を希釈したＨｕＭｅｄｉａ－ＥＧ２に置き換えた。３０分後にＰＢＳ（－）にて洗浄した後、トリプシン－ＥＤＴＡを用いて細胞を剥離し、ＴｈｉｎＣｅｒｔ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ ＩＮＳＥＲＴ ＦＯＲ ６ ＷＥＬＬ ＰＬＡＴＥＳ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のインサート内に、あらかじめＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ Ｔｙｐｅ １－Ａ（新田ゼラチン）を５００ｍＬ加えコラーゲンゲルを固形化させたものの上に、１×１０５個播種した。細胞が接着した後、その上からＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ Ｔｙｐｅ １－Ａを５００ｍＬ加えコラーゲンゲルを固形化させ、インサート内外を最終濃度１０μｇ／ｍＬになるようにルリジサ抽出物（製造例１）又はクズ抽出物（製造例５）を溶解させたＨｕＭｅｄｉａ－ＥＧ２で満たした。添加から２４時間後に、蛍光顕微鏡（キーエンス）にて観察した。
【0061】
ＨＵＶＥＣによる血管形成の結果を図１、外径の計測結果を表３に示す。ＵＶＡ照射により拡張するＨＵＶＥＣが形成する血管の外径が、ルリジサ及びクズ抽出物により減少したため、ルリジサ及びクズ抽出物に毛細血管拡張抑制効果が認められた。尚、ルリジサ抽出物（製造例２、３及び４）、クズ抽出物（製造例６、７及び８）にも同等の効果が認められた。
【0062】
【表3】
【産業上の利用可能性】
【0063】
本発明に関わる、ルリジサ又はクズの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするエンドセリンＢ受容体発現抑制剤、毛細血管拡張抑制剤、肌の赤み改善剤は、各剤の目的に対して優れた改善効果を発揮する。従って、肌の赤みの改善を目的とする化粧品、医薬品、医薬部外品及び食品を提供することができる。
【図1】
【配列表】