特許 7454497 新規なＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１阻害剤による眼疾患のターゲティング

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-13

(45)【発行日】2024-03-22

(54)【発明の名称】新規なＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１阻害剤による眼疾患のターゲティング

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/165 20060101AFI20240314BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240314BHJP

   A61P 27/10 20060101ALI20240314BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20240314BHJP

   A61K 33/00 20060101ALI20240314BHJP

【ＦＩ】

A61K31/165

A61P27/02

A61P27/10

A61P27/06

A61K33/00

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2020542289

(86)(22)【出願日】2019-02-07

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-05-20

(86)【国際出願番号】 US2019017023

(87)【国際公開番号】W WO2019157163

(87)【国際公開日】2019-08-15

【審査請求日】2022-01-31

(31)【優先権主張番号】62/628,093

(32)【優先日】2018-02-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】507277642

【氏名又は名称】インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＩＡＮＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100106002

【弁理士】

【氏名又は名称】正林 真之

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(72)【発明者】

【氏名】ケリー マーク アール．

(72)【発明者】

【氏名】コーソン ティモシー ダブリュー．

【審査官】大島 彰公

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１０－５４０５４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／００４５４６１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】FENIL SHAH，EXPLOITING THE REF-1-APE1 NODE IN CANCER SIGNALING AND OTHER DISEASES: FROM BENCH TO CLINIC，NPJ PRECISION ONCOLOGY，2017年06月08日，V1，P1-19，http://doi.org/10.1038/s41698-017-0023-0

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ、Ａ６１Ｐ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

［（２Ｅ）－２－［（３－メトキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチリデン］－Ｎ，Ｎ－ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）、及び、（２Ｅ）－２－［（３－メトキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチリデン］－Ｎ－メトキシペンタンアミド］（ＡＰＸ２０１４）よりなる群より選択される脱プリン塩基／脱ピリミジン塩基エンドヌクレアーゼ１酸化還元因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１）阻害剤、その薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を含む、眼の血管新生を阻害するための剤。

【請求項2】

［（２Ｅ）－２－［（３－メトキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチリデン］－Ｎ，Ｎ－ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）、及び、（２Ｅ）－２－［（３－メトキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチリデン］－Ｎ－メトキシペンタンアミド］（ＡＰＸ２０１４）よりなる群より選択される脱プリン塩基／脱ピリミジン塩基エンドヌクレアーゼ１酸化還元因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１）阻害剤、その薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を含む、未熟児網膜症（ＲＯＰ）を処置するための剤。

【請求項3】

［（２Ｅ）－２－［（３－メトキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチリデン］－Ｎ，Ｎ－ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）、及び、（２Ｅ）－２－［（３－メトキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチリデン］－Ｎ－メトキシペンタンアミド］（ＡＰＸ２０１４）よりなる群より選択される有効量の脱プリン塩基／脱ピリミジン塩基エンドヌクレアーゼ１酸化還元因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１）阻害剤、その薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を含む、湿式加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）を処置するための剤。

【請求項4】

前記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１阻害剤がＡＰＸ２００９であり、請求項１～３のいずれか一項に記載の前記剤が１日当たり１２．５ｍｇ／ｋｇ～３５ｍｇ／ｋｇのＡＰＸ２００９を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の剤。

【請求項5】

前記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１阻害剤がＡＰＸ２０１４であり、請求項１～３のいずれか一項に記載の前記剤が１日当たり１２．５ｍｇ／ｋｇ～３５ｍｇ／ｋｇのＡＰＸ２０１４を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の剤。

【請求項6】

抗ＶＥＧＦ剤、ビタミン、ミネラルおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの追加の治療剤をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本開示は、２０１８年２月８日に出願した米国暫定出願第６２／６２８，０９３号の優先権を主張し、その開示は、その全体を参考として本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、一般に、眼疾患を阻害するための３－［（５－（２，３－ジメトキシ－６－メチル１，４－ベンゾキノイル）］－２－ノニル－２－プロピオン酸（ＡＰＸ３３３０）および／またはその誘導体（例えば、［（２Ｅ）－２－［（３－メトキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチリデン］－Ｎ，Ｎ－ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）、および（２Ｅ）－２－［（３－メトキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチリデン］－Ｎ－メトキシペンタンアミド］（ＡＰＸ２０１４）の使用に関する。

【背景技術】

【0003】

眼の血管新生は、増殖性糖尿病網膜症（ＰＤＲ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、湿式加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）のような疾患の主要な病理生物学的特徴であり、これらは一緒に失明の主要な原因である（非特許文献１）。ＰＤＲおよびＲＯＰでは、異常な血管は網膜内および網膜上で成長し、一方、湿式ＡＭＤでは、血管新生は、色素沈着した網膜下脈絡膜層から網膜内に成長する。すべての場合において、血管新生は網膜構造を乱し、出血を起こし、失明に至ることがある。血管新生を促進する正確な刺激は必ずしも十分に特徴づけられていないが、低酸素と炎症は共に決定的な役割を果たしている。現在使用されているＦＤＡ承認のこれらの疾患に対する薬理学的処置はすべて、ラニビズマブおよびアフリベルセプトなど、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達経路を標的とした生物学的製剤である（非特許文献２）。これらの治療剤は非常に成功しているが、かなりの割合の患者が抵抗性かつ難治性である（非特許文献３；非特許文献４）。さらに、出血および眼内炎を含む重篤な副作用も起こりうる。したがって、他のシグナル伝達経路を標的とした新規な治療的アプローチの開発は、極めて重要である。

【0004】

炎症および低酸素症は、血管新生において極めて重要な役割を果たす。炎症誘発性シグナル伝達および低酸素シグナル伝達の両方に影響する処置は、ユニークな治療的戦略を提供する。そのような潜在的標的の１つは、還元酸化因子１－脱プリン塩基／脱ピリミジン塩基エンドヌクレアーゼ（Ｒｅｆ－１／ＡＰＥ１）、血管新生促進刺激の形質導入において重要な役割を持つ細胞内シグナル伝達ネクサスである。この二官能性タンパク質は塩基除去修復（ＡＰＥ１）に必須のエンドヌクレアーゼ役割を有し、一方Ｒｅｆ－１活性は酸化還元感受性転写活性化因子である（非特許文献５）。Ｒｅｆ－１酸化還元シグナル伝達は、それらの転写活性化の一部として特定の転写因子中の酸化されたシステイン残基を低減する高度に調節されたプロセスである（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９）。この酸化還元シグナル伝達は、ＨＩＦ－１α、ＮＦ－κＢ、およびその他を含む多数の転写因子に影響を及ぼす。ＨＩＦ－１αおよびＮＦ－κＢの調節は、特に血管新生および眼疾患に関連している（非特許文献８；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１８；非特許文献１９）。

【0005】

興味深いことに、Ｒｅｆ－１活性は、薬理学的に標的とすることができる。３－［（５－（２，３－ジメトキシ－６－メチル１，４－ベンゾキノイル）］－２－ノニル－２－プロピオン酸、（ＡＰＸ３３３０；以前はＥ３３３０と呼ばれていた）は、特異的なＲｅｆ－１／ＡＰＥ１酸化還元阻害剤である。ＡＰＸ３３３０は、タンパク質のエンドヌクレアーゼ活性に影響を与えないＲｅｆ－１酸化還元活性の直接的で高度に選択的な阻害剤として広く特徴付けられている（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献１４；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）。Ｒｅｆ－１／ＡＰＥ１は、網膜の発達中に、および網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、周皮細胞、脈絡膜内皮細胞および網膜内皮細胞で高度に発現し（非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５）、より一般的には、Ｒｅｆ－１は、炎症が存在する組織の領域で高頻度にアップレギュレートされる（非特許文献２６；非特許文献２７）。ＡＰＸ３３３０は、網膜および脈絡膜内皮細胞の増殖、移動、および管形成によって証明されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ血管新生を遮断することが以前に示された（非特許文献２４；非特許文献２８）。実際、ＡＰＸ３３３０を硝子体内（眼内に直接）に送達したところ、網膜血管新生の超低密度リポタンパク受容体（ＶＬＤＬＲ）ノックアウトマウスモデルにおける（非特許文献２４）、またレーザー誘発脈絡膜血管新生（Ｌ－ＣＮＶ）における（非特許文献２８）血管新生が減少し、湿式ＡＭＤの特徴を再現する最も広く使用されている動物モデル（非特許文献２９）であった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ，２０１３

【文献】Ｐｒａｓａｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０

【文献】Ｌｕｘ ｅｔ ａｌ．，２００７

【文献】Ｆａｌａｖａｒｊａｎｉ ａｎｄ Ｎｇｕｙｅｎ，２０１３

【文献】Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７

【文献】Ｘａｎｔｈｏｕｄａｋｉｓ ａｎｄ Ｃｕｒｒａｎ，１９９２

【文献】Ｘａｎｔｈｏｕｄａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２

【文献】Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０００

【文献】Ｌａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０００

【文献】Ｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００２

【文献】Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ．，２００２

【文献】Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０

【文献】Ｆｉｓｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１

【文献】Ｃａｒｄｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２

【文献】Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１２

【文献】Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２

【文献】Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３

【文献】Ｆｉｓｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５

【文献】Ｌｏｇｓｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６

【文献】Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，２００８

【文献】Ｆｉｓｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０

【文献】Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１１

【文献】Ｃｈｉａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０００

【文献】Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１

【文献】Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４ａ

【文献】Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００９

【文献】Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０

【文献】Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４ｂ

【文献】Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

先導する臨床的な候補は、前臨床がん研究では有効である一方、抗血管新生および抗炎症性転写因子（ＮＦ－κＢ、ＨＩＦ－１α）阻害の有効性の増加、ならびに新しい化学的性質を有する第２世代のＲｅｆ－１阻害剤が、望まれている。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本開示は、眼の血管新生を阻害するための、３－［（５－（２，３－ジメトキシ－６－メチル１，４－ベンゾキノイル）］－２－ノニル－２－プロピオン酸（ＡＰＸ３３３０）ならびに／またはその誘導体、例えば［（２Ｅ）－２－［（３－メトキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチリデン］－Ｎ，Ｎ－ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）および（２Ｅ）－２－［（３－メトキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチリデン］－Ｎ－メトキシペンタンアミド］（ＡＰＸ２０１４）の使用に関する。特に、ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４は、ＡＰＸ３３３０と比較して、ＤＮＡ結合アッセイにおいてＲｅｆ－１機能の強化された阻害を提供することが見出された。両化合物は、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＥＣ；ＧＩ５０ ＡＰＸ２００９：１．１μＭ、ＡＰＸ２０１４：１１０ｎＭ）およびマカク脈絡膜内皮細胞（Ｒｆ／６ａ ＧＩ５０ ＡＰＸ２００９：２６μＭ、ＡＰＸ２０１４：５．０μＭ）に対して抗増殖性であった。両化合物は、対照と比較して、中ナノモル濃度でＨＲＥＣおよびＲｆ／６ａ細胞が管を形成する能力を有意に低下させ、両者は、引っかき傷アッセイにおいてＨＲＥＣおよびＲｆ／６ａ細胞移動を有意に阻害した。

【0009】

ｅｘ ｖｉｖｏでは、ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４は共に、それぞれ低マイクロモル濃度および高ナノモル濃度で脈絡膜発芽を阻害した。レーザー誘発脈絡膜血管新生マウスモデルにおいて、腹腔内ＡＰＸ２００９処置は、明らかな眼内または全身毒性なしに、病変体積をビヒクルと比較して４倍に有意に減少させた（ｐ＜０．０００１、Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定によるＡＮＯＶＡ）。このように、ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４によるＲｅｆ－１阻害は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでの眼血管新生を遮断し、ＡＰＸ２００９は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＮＶに対する有効な全身療法であり、Ｒｅｆ－１阻害を眼血管新生に対する有望な治療的アプローチとして確立する。

【0010】

従って、一態様では、本開示は、それを必要とする対象における眼の血管新生を阻害する方法に関する。当該方法は、有効量の脱プリン塩基／脱ピリミジン塩基エンドヌクレアーゼ１酸化還元因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１）阻害剤、その薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を対象に投与するステップを含む。

【0011】

別の態様では、本開示は、それを必要とする対象における眼の血管新生を阻害する方法に関し、当該方法は、有効量の脱プリン塩基／脱ピリミジン塩基エンドヌクレアーゼ１酸化還元因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１）阻害剤、その薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を対象に投与するステップを含む。

【0012】

別の態様では、本開示は、それを必要とする対象における未熟児網膜症（ＲＯＰ）を処置する方法に関し、当該方法は、有効量の脱プリン塩基／脱ピリミジン塩基エンドヌクレアーゼ１酸化還元因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１）阻害剤、その薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を対象に投与するステップを含む。

【0013】

さらに別の態様では、本開示は、それを必要とする対象における湿式加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を処置する方法に関し、当該方法は、有効量の脱プリン塩基／脱ピリミジン塩基エンドヌクレアーゼ１酸化還元因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１）阻害剤、その薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物を対象に投与するステップを含む。

【0014】

本開示はよりよく理解され、上記以外の特徴、態様および利点は、以下の詳細な記載を考慮すると明らかになるであろう。このような詳細な説明は、以下の図面を参照する。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1A】図１Ａは、Ｒｅｆ－１阻害剤の合成および活性を示す。図１Ａは、ＡＰＸ２００９（６ａ）およびＡＰＸ２０１４（６ｂ）の合成スキームを示す。ＡＰＸ３３３０（７）の構造を、参考に含めた。試薬および条件：ａ、２－ヨード－３－ヒドロキシ－１，４－ナフトキノン（ヨードラウソン、１）、２－プロピルアクリル酸（２）、Ｋ_２ＣＯ_３、Ｐｄ（ＯＡｃ）_２、アルゴン、１００℃、１時間、７４％；ｂ、（ＣＯＣｌ）_２、ＤＭＦ、ＤＣＭ、ＲＴ一晩、１００％；ｃ、ＤＥＡ・ＨＣｌ（ＡＰＸ２００９）またはＣＨ_３ＯＮＨ_２・ＨＣｌ（ＡＰＸ２０１４）、ＤＩＰＡ・ＨＣｌ、ＲＴ、４５分、それぞれ６２％および７１％；ｄ、ＮａＯＣＨ_３／ＣＨ_３ＯＨ、アルゴン、３０分、ＲＴ、それぞれ９６％および８６％。

【図1B】図１Ｂは、Ｒｅｆ－１阻害剤の合成および活性を示す。図１Ｂは、ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がＥＭＳＡにおいてＡＰＸ３３３０よりもＲｅｆ－１誘発ＡＰ－１ ＤＮＡ結合のより有効な阻害剤であることを示す。同じ実験からの２つの別々のゲルを示す。酸化還元ＥＭＳＡ阻害のＩＣ５０は、それぞれ、ＡＰＸ３３３０、ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４で２５、０．４５および０．２μＭであった。これらのアッセイは複数回実施され、同様の結果が得られた。

【図2A】図２Ａは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＲＥＣおよびＲｆ／６ａ細胞における内皮細胞増殖を阻害することを示す。ヒト網膜内皮細胞（ＨＲＥＣ）におけるＡＰＸ２００９（図２Ａ）およびＡＰＸ２０１４（図２Ｂ）の用量依存性作用、ならびにＲｆ／６ａ脈絡膜内皮細胞におけるＡＰＸ２００９（図２Ｃ）およびＡＰＸ２０１４（図２Ｄ）の用量依存性作用。ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖は、ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを用いて測定した。平均成長阻害（ＧＩ_５０）値を示す。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、１回投与あたりｎ＝３。

【図2B】図２Ｂは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＲＥＣおよびＲｆ／６ａ細胞における内皮細胞増殖を阻害することを示す。ヒト網膜内皮細胞（ＨＲＥＣ）におけるＡＰＸ２００９（図２Ａ）およびＡＰＸ２０１４（図２Ｂ）の用量依存性作用、ならびにＲｆ／６ａ脈絡膜内皮細胞におけるＡＰＸ２００９（図２Ｃ）およびＡＰＸ２０１４（図２Ｄ）の用量依存性作用。ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖は、ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを用いて測定した。平均成長阻害（ＧＩ_５０）値を示す。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、１回投与あたりｎ＝３。

【図2C】図２Ｃは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＲＥＣおよびＲｆ／６ａ細胞における内皮細胞増殖を阻害することを示す。ヒト網膜内皮細胞（ＨＲＥＣ）におけるＡＰＸ２００９（図２Ａ）およびＡＰＸ２０１４（図２Ｂ）の用量依存性作用、ならびにＲｆ／６ａ脈絡膜内皮細胞におけるＡＰＸ２００９（図２Ｃ）およびＡＰＸ２０１４（図２Ｄ）の用量依存性作用。ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖は、ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを用いて測定した。平均成長阻害（ＧＩ_５０）値を示す。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、１回投与あたりｎ＝３。

【図2D】図２Ｄは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＲＥＣおよびＲｆ／６ａ細胞における内皮細胞増殖を阻害することを示す。ヒト網膜内皮細胞（ＨＲＥＣ）におけるＡＰＸ２００９（図２Ａ）およびＡＰＸ２０１４（図２Ｂ）の用量依存性作用、ならびにＲｆ／６ａ脈絡膜内皮細胞におけるＡＰＸ２００９（図２Ｃ）およびＡＰＸ２０１４（図２Ｄ）の用量依存性作用。ｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖は、ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを用いて測定した。平均成長阻害（ＧＩ_５０）値を示す。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、１回投与あたりｎ＝３。

【図3A】図３Ａは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がＨＲＥＣにおけるＳ相を阻害することを示す。ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４の示された濃度でＨＲＥＣを処理した後、（図３Ａ）ＥｄＵ（赤色）および（図３Ｃ）Ｋｉ－６７（緑色）が検出され、核（青色）がＤＡＰＩで染色された；スケールバー＝１００μｍ。図３ＢはＥｄＵの定量を示し、図３ＤはＨＲＥＣにおけるＫｉ－６７の定量を示す。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、１回あたりｎ＝３フィールド。ＤＭＳＯ対照と比較して＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１（Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定による一元配置分散分析）。３つの独立した実験からの代表的なデータ。図４Ａおよび５参照。

【図3B】図３Ｂは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がＨＲＥＣにおけるＳ相を阻害することを示す。ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４の示された濃度でＨＲＥＣを処理した後、（図３Ａ）ＥｄＵ（赤色）および（図３Ｃ）Ｋｉ－６７（緑色）が検出され、核（青色）がＤＡＰＩで染色された；スケールバー＝１００μｍ。図３ＢはＥｄＵの定量を示し、図３ＤはＨＲＥＣにおけるＫｉ－６７の定量を示す。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、１回あたりｎ＝３フィールド。ＤＭＳＯ対照と比較して＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１（Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定による一元配置分散分析）。３つの独立した実験からの代表的なデータ。図４Ａおよび５参照。

【図3C】図３Ｃは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がＨＲＥＣにおけるＳ相を阻害することを示す。ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４の示された濃度でＨＲＥＣを処理した後、（図３Ａ）ＥｄＵ（赤色）および（図３Ｃ）Ｋｉ－６７（緑色）が検出され、核（青色）がＤＡＰＩで染色された；スケールバー＝１００μｍ。図３ＢはＥｄＵの定量を示し、図３ＤはＨＲＥＣにおけるＫｉ－６７の定量を示す。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、１回あたりｎ＝３フィールド。ＤＭＳＯ対照と比較して＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１（Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定による一元配置分散分析）。３つの独立した実験からの代表的なデータ。図４Ａおよび５参照。

【図3D】図３Ｄは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がＨＲＥＣにおけるＳ相を阻害することを示す。ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４の示された濃度でＨＲＥＣを処理した後、（図３Ａ）ＥｄＵ（赤色）および（図３Ｃ）Ｋｉ－６７（緑色）が検出され、核（青色）がＤＡＰＩで染色された；スケールバー＝１００μｍ。図３ＢはＥｄＵの定量を示し、図３ＤはＨＲＥＣにおけるＫｉ－６７の定量を示す。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、１回あたりｎ＝３フィールド。ＤＭＳＯ対照と比較して＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１（Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定による一元配置分散分析）。３つの独立した実験からの代表的なデータ。図４Ａおよび５参照。

【図4A】図４Ａは、すべての用量（図３Ａ～３Ｄと同じ実験）についてのＥｄＵ染色の全視野を示しており、ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４は、ＨＲＥＣにおいて用量依存的にＤＮＡ合成を減少させたことを示す。スケールバー＝１００μｍ。

【図4B】図４Ｂは、示した処置のためのヨウ化プロピジウム細胞周期プロファイルを示す。

【図4C】図４Ｃは、細胞周期局面の定量化を示す。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝３の独立した実験。

【図5】図５は、すべての用量に対するＫｉ－６７染色の別々のチャネル画像を示しており（図３Ａ～３Ｄと同じ実験）、ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がＨＲＥＣにおいて用量依存的に増殖を減少させたことを示す。スケールバー＝１００μｍ。

【図6A】図６Ａは、ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がＨＲＥＣにおいて細胞死を誘発しなかったことを示す。図６Ａは、細胞死についてのＴＵＮＥＬ染色（赤色）および核染色についてのＤＡＰＩ（青色）を示す。これらの画像ではＴＵＮＥＬ陽性細胞は認められない。スタウロスポリンは、陽性対照として作用する。スケールバー＝１００μｍ。

【図6B】図６Ｂは、ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がＨＲＥＣにおいて細胞死を誘発しなかったことを示す。図６Ｂは、種々の処理でのＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合を示す定量化データを示す。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝３。ｎｓ、有意でない（Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定による一元配置分散分析）。２つの独立した実験からの代表的なデータ。

【図7A】図７Ａは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＲＥＣおよびＲｆ／６ａ細胞における内皮細胞遊走を阻害することを示す。図７Ａは、ＨＲＥＣにおける細胞移動に対するＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４の効果を示す。様々な処置（示された最高用量）を施したＨＲＥＣの融合単層を創傷し、創傷閉鎖を８時間モニタリングした。

【図7B】図７Ｂは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＲＥＣおよびＲｆ／６ａ細胞における内皮細胞遊走を阻害することを示す。図７Ｂは、細胞移動の定量分析を示し、ＡＰＸ化合物がＨＲＥＣの移動を有意に遮断することを示す。

【図7C】図７Ｃは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＲＥＣおよびＲｆ／６ａ細胞における内皮細胞遊走を阻害することを示す。図７Ｃは、Ｒｆ／６ａ細胞における細胞移動に対するＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４の効果を示す。種々の処置（示された最高用量）によるＲｆ／６ａの融合単層を創傷し、創傷閉鎖を１６時間モニターした。

【図7D】図７Ｄは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＲＥＣおよびＲｆ／６ａ細胞における内皮細胞遊走を阻害することを示す。図７Ｄは、細胞遊走の定量分析を示し、ＡＰＸ化合物がＲｆ／６ａ細胞の遊走を有意に遮断することを示す。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、１回投与あたりｎ＝３。ＤＭＳＯ対照と比較して＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１（Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定による一元配置分散分析）。スケールバー＝５００μｍ。

【図8】図８Ａ～８Ｄは、ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＲＥＣおよびＲｆ／６ａ細胞の移動を阻害したことを示す。ＨＲＥＣにおける細胞移動に対する（図８Ａ）ＡＰＸ２００９および（図８Ｂ）ＡＰＸ２０１４の効果を示す。種々の濃度の各化合物で処理したＨＲＥＣのコンフルエントな単層を創傷し、創傷閉鎖を８時間モニターした。（図８Ｃ）ＡＰＸ２００９および（図８Ｄ）ＡＰＸ２０１４がＲｆ／６ａ細胞における細胞移動に及ぼす影響を示す。種々の濃度の各化合物で処理したＲｆ／６ａ細胞のコンフルエントな単層を創傷し、創傷閉鎖を１６時間モニターした。スケールバー＝５００μｍ。

【図9A】図９Ａは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＲＥＣおよびＲｆ／６ａ細胞における内皮管形成を阻害したことを示す。図９Ａは、指示された濃度のＡＰＸ化合物の存在下でのＨＲＥＣによるマトリゲル上の管形成を示す。

【図9B】図９Ｂは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＲＥＣおよびＲｆ／６ａ細胞における内皮管形成を阻害したことを示す。図９Ｂは、ＨＲＥＣ管形成に対するＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４化合物の定量分析を示す。管長さを測定し、ＤＭＳＯ対照との相対値として表した。

【図9C】図９Ｃは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＲＥＣおよびＲｆ／６ａ細胞における内皮管形成を阻害したことを示す。図９Ｃは、指示された濃度のＡＰＸ化合物の存在下でのＲｆ／６ａによるマトリゲル上の管形成を示す。

【図9D】図９Ｄは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＲＥＣおよびＲｆ／６ａ細胞における内皮管形成を阻害したことを示す。図９Ｄは、Ｒｆ／６ａ管形成に対するＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４化合物の定量分析を示す。管長さを測定し、ＤＭＳＯ対照との相対値として表した。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝３ウェル。ＤＭＳＯ対照と比較して＊＊、＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１（Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定による一元配置分散分析）。３つの独立した実験からの代表的なデータ。スケールバー＝５００μｍ。

【図10A】図１０Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＲＥＣにおける内皮管形成をＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４が阻害したことを示す。ＡＰＸ２００９の示された濃度（図１０Ａ）およびＡＰＸ２０１４の示された濃度（図１０Ｂ）の存在下でのＨＲＥＣによるマトリゲル上の管形成を示す。さらに、ＡＰＸ２００９の示された濃度の存在下（図１０Ｃ）およびＡＰＸ２０１４の示された濃度の存在下（図１０Ｄ）でのＲｆ／６ａ細胞によるマトリゲル上の管形成を示す。スケールバー＝５００μｍ。

【図10B】図１０Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＲＥＣにおける内皮管形成をＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４が阻害したことを示す。ＡＰＸ２００９の示された濃度（図１０Ａ）およびＡＰＸ２０１４の示された濃度（図１０Ｂ）の存在下でのＨＲＥＣによるマトリゲル上の管形成を示す。さらに、ＡＰＸ２００９の示された濃度の存在下（図１０Ｃ）およびＡＰＸ２０１４の示された濃度の存在下（図１０Ｄ）でのＲｆ／６ａ細胞によるマトリゲル上の管形成を示す。スケールバー＝５００μｍ。

【図10C】図１０Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＲＥＣにおける内皮管形成をＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４が阻害したことを示す。ＡＰＸ２００９の示された濃度（図１０Ａ）およびＡＰＸ２０１４の示された濃度（図１０Ｂ）の存在下でのＨＲＥＣによるマトリゲル上の管形成を示す。さらに、ＡＰＸ２００９の示された濃度の存在下（図１０Ｃ）およびＡＰＸ２０１４の示された濃度の存在下（図１０Ｄ）でのＲｆ／６ａ細胞によるマトリゲル上の管形成を示す。スケールバー＝５００μｍ。

【図10D】図１０Ｄは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＲＥＣにおける内皮管形成をＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４が阻害したことを示す。ＡＰＸ２００９の示された濃度（図１０Ａ）およびＡＰＸ２０１４の示された濃度（図１０Ｂ）の存在下でのＨＲＥＣによるマトリゲル上の管形成を示す。さらに、ＡＰＸ２００９の示された濃度の存在下（図１０Ｃ）およびＡＰＸ２０１４の示された濃度の存在下（図１０Ｄ）でのＲｆ／６ａ細胞によるマトリゲル上の管形成を示す。スケールバー＝５００μｍ。

【図11A】図１１Ａは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がＴＮＦ－α媒介ＮＦ－κＢシグナル伝達および血管新生促進標的遺伝子ｍＲＮＡ発現を阻害することを示す。ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４の示された濃度でＨＲＥＣを処理した後、ｐ６５（赤色）は免疫蛍光により検出され、核（青色）はＤＡＰＩで染色された；化合物は赤色と青色シグナルとの間の重複の減少により証明されるように、ｐ６５核移行を用量依存的に減少させた。ＢＡＹ １１－７０８２は、陽性対照ＮＦ－κＢ阻害剤である。スケールバー＝１００μｍ。（図１１Ｂ）ＶＥＧＦＡ、（図１１Ｃ）ＶＣＡＭ１、および（図１１Ｄ）ＨＲＥＣにおけるＣＣＬ２０ ｍＲＮＡ発現レベル。ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４は、各転写物のレベルを用量依存的に阻害した。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝３の技術的反復。ＤＭＳＯ対照と比較して＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１（Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定による一元配置分散分析）。３つの独立した実験からの代表的なデータ。

【図11B】図１１Ｂは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がＴＮＦ－α媒介ＮＦ－κＢシグナル伝達および血管新生促進標的遺伝子ｍＲＮＡ発現を阻害することを示す。ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４の示された濃度でＨＲＥＣを処理した後、ｐ６５（赤色）は免疫蛍光により検出され、核（青色）はＤＡＰＩで染色された；化合物は赤色と青色シグナルとの間の重複の減少により証明されるように、ｐ６５核移行を用量依存的に減少させた。ＢＡＹ １１－７０８２は、陽性対照ＮＦ－κＢ阻害剤である。スケールバー＝１００μｍ。（図１１Ｂ）ＶＥＧＦＡ、（図１１Ｃ）ＶＣＡＭ１、および（図１１Ｄ）ＨＲＥＣにおけるＣＣＬ２０ ｍＲＮＡ発現レベル。ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４は、各転写物のレベルを用量依存的に阻害した。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝３の技術的反復。ＤＭＳＯ対照と比較して＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１（Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定による一元配置分散分析）。３つの独立した実験からの代表的なデータ。

【図11C】図１１Ｃは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がＴＮＦ－α媒介ＮＦ－κＢシグナル伝達および血管新生促進標的遺伝子ｍＲＮＡ発現を阻害することを示す。ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４の示された濃度でＨＲＥＣを処理した後、ｐ６５（赤色）は免疫蛍光により検出され、核（青色）はＤＡＰＩで染色された；化合物は赤色と青色シグナルとの間の重複の減少により証明されるように、ｐ６５核移行を用量依存的に減少させた。ＢＡＹ １１－７０８２は、陽性対照ＮＦ－κＢ阻害剤である。スケールバー＝１００μｍ。（図１１Ｂ）ＶＥＧＦＡ、（図１１Ｃ）ＶＣＡＭ１、および（図１１Ｄ）ＨＲＥＣにおけるＣＣＬ２０ ｍＲＮＡ発現レベル。ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４は、各転写物のレベルを用量依存的に阻害した。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝３の技術的反復。ＤＭＳＯ対照と比較して＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１（Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定による一元配置分散分析）。３つの独立した実験からの代表的なデータ。

【図11D】図１１Ｄは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４がＴＮＦ－α媒介ＮＦ－κＢシグナル伝達および血管新生促進標的遺伝子ｍＲＮＡ発現を阻害することを示す。ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４の示された濃度でＨＲＥＣを処理した後、ｐ６５（赤色）は免疫蛍光により検出され、核（青色）はＤＡＰＩで染色された；化合物は赤色と青色シグナルとの間の重複の減少により証明されるように、ｐ６５核移行を用量依存的に減少させた。ＢＡＹ １１－７０８２は、陽性対照ＮＦ－κＢ阻害剤である。スケールバー＝１００μｍ。（図１１Ｂ）ＶＥＧＦＡ、（図１１Ｃ）ＶＣＡＭ１、および（図１１Ｄ）ＨＲＥＣにおけるＣＣＬ２０ ｍＲＮＡ発現レベル。ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４は、各転写物のレベルを用量依存的に阻害した。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝３の技術的反復。ＤＭＳＯ対照と比較して＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１（Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定による一元配置分散分析）。３つの独立した実験からの代表的なデータ。

【図12A】図１２Ａは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４が濃度依存的に脈絡膜発芽を阻害したことを示す。図１２Ａは、示されたＡＰＸ２００９濃度またはビヒクル（０．５％ＤＭＳＯ）対照での処理の４８時間後に形成された脈絡膜芽の代表的な相コントラスト画像である。

【図12B】図１２Ｂは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４が濃度依存的に脈絡膜発芽を阻害したことを示す。図１２Ｂは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、ＡＰＸ２００９処理した脈絡膜組織片の端から、４つの垂直方向から平均化した芽の端までの発芽距離の定量化を示す。

【図12C】図１２Ｃは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４が濃度依存的に脈絡膜発芽を阻害したことを示す。図１２Ｃは、示されたＡＰＸ２０１４濃度またはビヒクル（０．２％ＤＭＳＯ）対照での処理から４８時間後に形成された脈絡膜芽の代表的な画像である。

【図12D】図１２Ｄは、化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４が濃度依存的に脈絡膜発芽を阻害したことを示す。図１２Ｄは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、４つの垂直方向から平均化した脈絡膜組織片の端から芽の端までの発芽距離の定量化を示す。平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝４～５脈絡膜／処理あたり；Ｎ＝３～４眼。＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１（Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定による分散分析）。スケールバー＝５００μｍ。

【図13A】図１３Ａは、ＡＰＸ３３３０による全身性Ｒｅｆ－１阻害がレーザー誘発脈絡膜血管新生（Ｌ－ＣＮＶ）マウスモデルにおける血管新生を遮断したことを示す。図１３Ａは、レーザー７日後に得られた代表的な光干渉断層撮影（ＯＣＴ）画像を示し、ビヒクル（左）および５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与のＡＰＸ３３３０（右）処置動物の眼におけるＣＮＶ病変を示す。

【図13B】図１３Ｂは、ＡＰＸ３３３０による全身性Ｒｅｆ－１阻害がレーザー誘発脈絡膜血管新生（Ｌ－ＣＮＶ）マウスモデルにおける血管新生を遮断したことを示す。図１３Ｂは、アグルチニンで染色されたＣＮＶ病変のための共焦点顕微鏡検査からの代表的な画像を、レーザー処置１４日後に示す。

【図13C】図１３Ｃは、ＡＰＸ３３３０による全身性Ｒｅｆ－１阻害がレーザー誘発脈絡膜血管新生（Ｌ－ＣＮＶ）マウスモデルにおける血管新生を遮断したことを示す。図１３Ｃは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いた１４日目のＺ－スタック画像からのＣＮＶ病変血管容積の定量化を示す。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝７～９眼／処理。＊ ｐ＜０．０５（対応のないスチューデントのｔ検定）。スケールバー＝１００μｍ。

【図14(1)】図１４Ａ～Ｃは、Ｌ－ＣＮＶマウスモデルにおいて、腹腔内ＡＰＸ２００９が脈絡膜血管新生を阻害したことを示す。図１４Ａは、レーザー後７日および１４日に得られた代表的なＯＣＴ画像を示し、レーザー処置後１４日まで１日２回腹腔内注射された非触知制御装置、ビヒクル、１２．５ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇのＡＰＸ２００９化合物のＣＮＶ病変を示す。図１４Ｂは、ＡＰＸ２００９による血管漏出抑制を示すＣＮＶのフルオレセイン血管造影（ＦＡ）を示す。図１４Ｃは、レーザー処置１４日後のアグルチニン染色ＣＮＶ病変に対する共焦点顕微鏡検査からの代表的な画像である。

【図14(2)】図１４Ｄは、Ｌ－ＣＮＶマウスモデルにおいて、腹腔内ＡＰＸ２００９が脈絡膜血管新生を阻害したことを示す。図１４Ｄは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いた１４日目のＺ－スタック画像からのＣＮＶ病変血管容積の定量化を示す。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝８～１０眼／処置。ｎｓ：有意でない、ＤＭＳＯ対照と比較して＊＊＊、ｐ＜０．００１（Ｔｕｋｅｙの事後検定による一元配置分散分析）。スケールバー＝１００μｍ。

【図15A】図１５Ａは、Ｌ－ＣＮＶマウスモデルにおいて、ＡＰＸ２００９が脈絡膜血管新生を阻害したことを示す。図１５Ａは、レーザー処置１４日後のＬ－ＣＮＶ病変におけるＤｏｕｂｌｅ－ｓｔａｉｎｅｄ ＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎおよびＧｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４（ＧＳＩＢ４）共焦点画像を示す。

【図15B】図１５Ｂは、Ｌ－ＣＮＶマウスモデルにおいて、ＡＰＸ２００９が脈絡膜血管新生を阻害したことを示す。図１５Ｂは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、１４日目のＧＳ－ＩＢ４染色画像のＺ－スタックからのＣＮＶ病変血管容積の定量化を示す。ｎｓ：有意でない、＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１（Ｔｕｋｅｙの事後検定による一元配置分散分析）。

【図15C】図１５Ｃは、Ｌ－ＣＮＶマウスモデルにおいて、ＡＰＸ２００９が脈絡膜血管新生を阻害したことを示す。図１５Ｃは、１４日間にわたるビヒクルおよびＡＰＸ２００９注射群のマウス体重の定量化を示す。いずれの時点においても処置間の体重に有意差は認められなかった（反復測定二元配置分散分析）。平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、ｎ＝８～１０眼／処置。スケールバー＝１００μｍ。

【図16】図１６は、ＨＲＥＣにおけるＡＰＸ２００９の示された濃度によってダウンレギュレートされる既知のＨＩＦ調節遺伝子のサンプルデータを示す。ＲＮＡ－Ｓｅｑデータを主成分（ＰＣ）回帰法により分析し、有意な遺伝子はＡＰＸ２００９処置法のＰＣとの関連性に関してｒ＞０．４２であった。経路濃縮分析は、ＨＩＦ１Ａにより調節されるこれらの遺伝子の濃縮を明らかにした（ｐ＝０．０２）。

【図17】図１７は、湿式ＡＭＤにおいてアップレギュレートされているＲｅｆ－１を示す。Ｒｅｆ－１（茶色）で染色したヒト眼の断面では、内核層（ＩＮＬ）、外核層（ＯＮＬ）、および脈絡膜の核に、特に湿式ＡＭＤに発現が認められたが、年齢を整合させた対照では認められなかった。スケールバー＝５０μｍ。ＧＣＬ：神経節細胞層。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本開示は、一般に、眼の血管新生を阻害するための、３－［（５－（２，３－ジメトキシ－６－メチル１，４－ベンゾキノイル）］－２－ノニル－２－プロピオン酸（ＡＰＸ３３３０）および／またはその誘導体（例えば、［（２Ｅ）－２－［（３－メトキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチリデン］－Ｎ，Ｎ－ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）および（２Ｅ）－２－［（３－メトキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチリデン］－Ｎ－メトキシペンタンアミド］（ＡＰＸ２０１４））などのＡＰＥ１阻害剤に関する。さらに、本開示は、増殖性糖尿病網膜症（ＰＤＲ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、および湿式加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）のような疾患を処置するためのＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４の使用に向けられる。

【0017】

適当な実施形態では、本開示は、ＡＰＥ１阻害剤の有効量、ＡＰＥ１タンパク質と相互作用することが可能なＡＰＥ１阻害剤を、ＡＰＥ１のアミノ末端部分におけるＡＰＥ１タンパク質のアンフォールディングを引き起こし、ＡＰＥ１がニューロン内の他のタンパク質と相互作用する能力を阻害し、またはその酸化還元シグナル伝達機能を遂行する能力を必要とする対象に投与することを含む。より詳細には、本開示で使用されるＡＰＥ１阻害剤は、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１がＮＦ－κＢおよびＡＰ－１を酸化状態から還元状態に変換する能力を遮断し、それによってそれらの転写活性を変化させる。

【0018】

従って、特に好適な実施形態では、ＡＰＥ１阻害剤は、式：

【化1】

式中、Ｒ_１は、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシル、および水素からなる群から選択され；Ｒ_２は、アルキルであり；Ｒ_３およびＲ_６は、アルコキシおよびアリールからなる群から独立に選択され；Ｒ_４およびＲ_５は、アルコキシおよびアリールからなる群から独立に選択されるか、またはＲ_４およびＲ_５の両方は、一緒に置換または非置換ナプトキノンを形成し；
Ｘは、ＣＨ＝ＣＲ_２およびＮＣＨからなる群から選択され、Ｒ_２は、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキルおよびＣＦ_３ＣＨ_２ＣＨ_２からなる群から選択され；ならびに
Ｙは、Ｎ（Ｒｚ）Ｒ２またはＮＲ＾ＯＲ＾からなる群から選択され、各Ｒｚは、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルおよびシクロヘテロアルキル、直鎖もしくは分岐鎖もしくは任意に置換されたものからなる群から独立して選択され、またはＲｚとＲ２の両方が、結合した窒素と一緒になって、任意に置換された複素環を形成し；各Ｒ＾は、水素、アルキル、ヘテロアルキル、シクロヘキシル、およびシクロヘテロアルキルからなる群から独立して選択され、それぞれは任意に置換されており、または両方のＲ＾は、結合した窒素および酸素と一緒になって、任意に置換された複素環を形成する、
を有する。

【0019】

特に適切なＡＰＥ１阻害剤には、３－［（５－（２，３－ジメトキシ－６－メチル１，４－ベンゾキノイル）］－２－ノニル－２－プロピオン酸（以下、「Ｅ３３００」もしくは「３３３０」もしくは「ＡＰＸ３３３０」）、および／またはその類似体（例えば［（２Ｅ）－２－［（３－メトキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチリデン］－Ｎ、Ｎ－ジエチルペンタンアミド）］（以下「ＡＰＸ２００９」）、（２Ｅ）－２－［（３－メトキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチリデン］－Ｎ、Ｎ－ジメチルペンタンアミド］（以下「ＡＰＸ２００７」）、（２Ｅ）－２－［（３－メトキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチリデン］－Ｎ－メトキシペンタンアミド］（以下「ＡＰＸ２０１４」）、（２Ｅ）－２－（３－メトキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）－Ｎ、Ｎ、２－トリメチルプロパ－２－エンアミド（以下「ＡＰＸ２０３２」））が含まれる。追加の適当な類似体を、以下および表１に示す。ＡＰＸ３３３０に関するさらなる情報は、Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２１０，２３９号に見ることができ、ＡＰＸ２００９に関する情報は、Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２０１６ Ｎｏｖ，３５９（２）：３００－３０９に見出すことができ、各々は、本明細書と整合する範囲で参照によって本明細書に組み込まれる。

【化2】

【化3】

【0020】

【表1(1)】

【表1(2)】

【表1(3)】

【表1(4)】

【0021】

ここでは、ＡＰＥ１阻害剤、特にＡＰＸ２００９および／またはＡＰＸ２０１４の投与が、ＡＰＥ１タンパク質がニューロン内の他のタンパク質と相互作用するのを阻害することが見出されている。特に、ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４は、共にＶＥＧＦを調節できるＮＦ－κＢおよびＨＩＦ－１αを含む可能性のある候補であるＲｅｆ－１によって誘発される転写因子の活性化を遮断することによって、それらの抗血管新生作用を発揮する。

【0022】

本開示の方法で使用するためのＡＰＥ１阻害剤、その薬学的に許容可能な塩または薬学的に許容可能な溶媒和物の適当な用量は、例えば、個体の年齢および体重、処置される眼血管新生関連障害または疾患の重症度、組成物の性質、投与経路およびそれらの組み合わせを含む多くの因子に依存する。最終的に、適当な用量は、例えば医師、獣医師、科学者、および他の医療および研究専門家のような当業者によって容易に決定することができる。例えば、当業者は、低用量から始めることができ、それを、所望の処置転帰または結果に達するまで増量することができる。あるいはまた、当業者は、高用量から始めることができ、それを、所望の処置転帰または結果を達成するために必要な最小用量に達するまで減少させることができる。

【0023】

１つの特に適切な実施形態において、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１阻害剤はＡＰＸ２００９であり、対象は、１日当たり約１２．５ｍｇ／ｋｇ～約３５ｍｇ／ｋｇのＡＰＸ２００９を投与される。

【0024】

１つの特に適切な実施形態において、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１阻害剤はＡＰＸ２０１４であり、対象は、１日当たり約１２．５ｍｇ／ｋｇ～約３５ｍｇ／ｋｇのＡＰＸ２０１４を投与される。

【0025】

ある実施形態において、ＡＰＥ１阻害剤は、ＡＰＥ１阻害剤および薬学的に許容される担体を含む組成物を介して投与される。薬学的に許容される担体は、例えば、賦形剤、ビヒクル、希釈剤、およびそれらの組み合わせであってもよい。例えば、組成物を経口投与する場合には、それらを錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤、もしくはシロップ剤として処方することができ；または非経口投与の場合には、それらを注射剤（筋肉内、皮下、髄内、くも膜下腔内、脳室内、静脈内、硝子体内）、滴下注入製剤、もしくは坐剤として処方することができる。これらの組成物は、従来の手段によって調製することができ、所望であれば、活性化合物（例えば、ＡＰＸ２００９、ＡＰＸ２０１４）を、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、矯味薬、可溶化剤、懸濁助剤、乳化剤、コーティング剤、またはそれらの組み合わせなどの任意の従来の添加剤と混合することができる。

【0026】

本開示の医薬組成物は、さらに、本明細書に記載される疾患、障害、および状態を軽減、媒介、予防、および処置するための追加の既知の治療剤、薬物、合成化合物のプロドラッグへの修飾などを含むことができることを理解すべきである。例えば、１つの実施形態において、ＡＰＥ１阻害剤は、１つ以上の現在の治療剤および眼血管新生を処置するための薬物（例えば、抗ＶＥＧＦ療法、例えば、ラニビズマブ、ベバシズマブ、アフリベルセプトなどの抗ＶＥＧＦ生物製剤；ＶＥＧＦ発現を標的とするリボザイムを含む血管新生因子のアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡサイレンシングまたはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）；ＳＲＰＫファミリーのキナーゼの阻害剤、ＦＯＶＩＳＴＡ（登録商標）、および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）を標的とするその他の剤；スクアラミン（（１Ｓ，２Ｓ，５Ｓ，７Ｒ，９Ｒ，１０Ｒ，１１Ｓ，１４Ｒ，１５Ｒ）－Ｎ－｛３－［（４－アミノブチル）アミノ］プロピル｝－９－ヒドロキシ－２，１．５－ジメチル－１４－［（２Ｒ，５Ｒ）－６－メチル－５－（スルホオキシ）ヘプタン－２－イル］テトラシクロ［８．７．０．０＾｛２，７｝．０＾｛１１，１５｝］ヘプタデカン－５－アミニウム）；Ｘ－８２（Ｔｙｒｏｇｅｎｉｘ，Ｎｅｅｄｈａｍ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）；ＰＡＮ－９０８０６（ＰａｎＯｐｔｉｃａ，Ｂｅｒｎａｒｄｓｖｉｌｌｅ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）；ＴＮＰ４７０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）およびフマギリン（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）－１０－｛［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）－５－メトキシ－４－［（２Ｒ）－２－メチル－３－（３－メチルブタ－２－エニル）オキシラン－２－イル］－１－オキサスピロ［２．５］オクタン－６－イル］オキシ｝－１０－オキソデカ－２，４，６，８－テトラエン酸）；プロテインキナーゼＣ阻害剤；ＶＥＧＦ受容体キナーゼの阻害剤；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）；エンドスタチン；アンジオスタチン；アネコルタブアセテート；トリアムシノロン（（１１β、１６α）－９－フルオロ－１１，１６，１７，２１－テトラヒドロキシプレグナ－１，４－ジエン－３，２０－ジオン）；ベルテポルフィン（３－［（２３Ｓ，２４Ｒ）－１４－エテニル－５－（３－メトキシ－３－オキソプロピル）－２２，２３－ビス（メトキシカルボニル）－４，１０，１５，２４－テトラメチル－２５，２６，２７，２８－テトラアザヘキサシクロ［１６．６．１．１３，６．１８，１１．１１３，１６．０１９，２４］オクタコサ－１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，１６，１８（２５），１９，２１－ドデカセン－９－イル］プロパン酸）、ポルフィマーナトリウム（フォトフリン））、ビタミンおよびミネラル（ビタミンＣおよびＥ、ベータカロチン、亜鉛、銅、ルテイン、ゼアキサンチン、オメガ－３脂肪酸）など）とともに投与することができる。

【0027】

本開示の方法で使用されるＡＰＥ１阻害剤および／または薬学的担体を含む医薬組成物は、必要な個体／対象のサブセットに投与することができる。本明細書で使用される「必要な対象」とは、眼疾患および／もしくは眼血管新生のリスクにあるかもしくはそれを有する個体、あるいは眼疾患および／または眼血管新生に関連する疾患もしくは障害（例えば、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、増殖性糖尿病網膜症（ＰＤＲ）、糖尿病網膜症、湿式加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、病的近視、高血圧性網膜症、閉塞性脈絡膜血管炎、ポリープ状脈絡膜血管症、糖尿病黄斑浮腫、ブドウ膜炎黄斑浮腫、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、角膜血管新生、網膜血管新生、眼のヒストプラスマ症、血管新生緑内障、網膜芽細胞腫など、およびこれらの組合せ）のリスクにあるかもしくはそれを有する個体を指す。さらに、「必要な対象」はまた、本明細書では、眼の血管新生、または眼の血管新生に関連する疾患もしくは障害を有するリスクにあるかまたは医学専門家によってそれを有すると診断される個体を指すために使用される。そのため、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、一般集団のサブセットに向けられ、したがって、これらの実施形態では、一般集団の全てが方法から利益を得られるわけではない。前述に基づいて、本開示の方法実施形態のいくつかは、特定された個体の特定のサブセットまたはサブクラス（すなわち、ここに記した１つ以上の特定の条件に対処する際に援助「を必要とする」対象のサブセットまたはサブクラス）に向けられているため、全ての個体が本明細書に記載されるような個体のサブセットまたはサブクラスに収まるわけではない。特に、必要がある個体はヒトである。必要がある個体は、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、および当業者に公知の他のタイプの研究動物のような研究動物でもよい。

【0028】

別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、開示が属する通常の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

【0029】

本開示のこれらの実施形態および他の実施形態の様々な機能および利点は、以下に示す実施例からより完全に理解されるであろう。実施例は、本開示の利益を例示することを意図しているが、開示の全範囲を例示するものではない。

【実施例】

【0030】

実施例１
本実施例では、ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４について、ＡＰ－１ ＤＮＡ結合ならびに細胞増殖および移動に対するそれらの機能を分析した。

【0031】

材料および方法
合成法。化合物はＣａｓｃａｄｅ Ｃｕｓｔｏｍ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）により合成され、Ａｐｅｘｉａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより提供された。要約すると（図１Ａ）、ヨードラウソン（２－ヨード－３－ヒドロキシ－１，４ナフトキノン）がＣａｓｃａｄｅ Ｃｕｓｔｏｍ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙから入手可能となった。ＨＰＬＣは、４０℃でＡｌｌｔｅｃｈ ＡｌｌｔｉｍａカラムＣ１８ ５ｕ、２５０×５．６ｍｍ、流量１ｍｌ／分を用いて実施した。溶出は、１５：１０：７５水：Ａ１：メタノールの移動相で行い、Ａ１は、水７００ｍＬ、メタノール３００ｍＬおよびトリメチルアミン３ｍＬを用いて作成し、これにリン酸を加えてｐＨを３．４にした。

【0032】

（Ｅ）－２－（（３－ヒドロキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチレン）ペンタン酸（３）。機械的撹拌器とガス分散フリット管を備えた２Ｌの３つ首フラスコに、２－ヨード－３－ヒドロキシ－１，４ナフトキノン、（ヨードラウソン、１）（１８ｇ、０．０６ｍｏｌ）および２－プロピルアクリル酸２（１７．１ｇ、０．１５ｍｏｌ）を、炭酸カリウム（４１．４ｇ、０．３ｍｏｌ）の水（６００ｍＬ）溶液において入れた。反応混合物を、３０分間アルゴンで撹拌しスパージングした。酢酸パラジウム（ＩＩ）（０．６７ｇ、０．００３ｍｏｌ）を添加し、さらに３０分間スパージングを継続した。得られた混合物を、１００℃で油浴中で加熱した。ＨＰＬＣ分析は、反応が１時間後に完了することを示した。反応混合物を室温まで冷却し、黒色Ｐｄ金属をろ過した。ろ液は、機械的撹拌器を備えた２Ｌの３つ首フラスコに入れ、氷－メタノール浴中で冷却し、５０％Ｈ_３ＰＯ_４（１６０ｍＬ）でｐＨ２に酸性化した。１時間撹拌した後、固体を採取し、水（１Ｌ）、２０％アセトンの水混液（５００ｍＬ）で洗浄し、風乾して、（３）の１２．３ｇ（７２％）をマスタード色固体として得た。ＨＰＬＣ分析は、９８％の純度を示した。ＮＭＲ（ｄ_６－ＤＭＳＯ）δ １２．６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），１１．６５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．０（ｍ，２Ｈ），７．８（ｍ，２Ｈ），７．１５（ｓ，１Ｈ），２．１（ｍ，２Ｈ），１．４（ｍ，２Ｈ），０．８（ｍ，３Ｈ）。

【0033】

（Ｅ）－２－（（３－ヒドロキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチレン）ペンタノイルクロリド（４）。（３）（４．０ｇ、０．０１４ｍｏｌ）およびＤＭＦ（０．１ｍＬ）のジクロロメタン（７５ｍＬ）中の懸濁液に、塩化オキサリル（２ＭをＣＨ_２ Ｃｌ_２中１７．５ｍＬ、０．０３５ｍｏｌ）を室温で２０分間かけて加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した後、減圧下で濃縮して、４．５ｇ（１００％）（４）を褐色固体として得た。この固体を、次のステップで直接使用した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３） δ ７．８－８．２（ｍ，２Ｈ），７．７－７．８（ｍ，２Ｈ），７．４（ｓ，１Ｈ），２．１－２．４（ｍ，２Ｈ），１．２－１．７（ｍ，２Ｈ），０．６－１．０（ｍ，３Ｈ）。

【0034】

（Ｅ）－Ｎ，Ｎ－ジエチル－２－（（３－クロロ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチレン）ペンタンアミド（５ａ）。粗製の（４）（９．７ｇ、０．０３ｍｏｌ）のジクロロメタン（５０ｍＬ）溶液に、ジエチルアミン塩酸塩（４．９７ｇ、０．０４５ｍｏｌ）およびジイソプロピルアミン（１１．６ｇ、０．０９ｍｏｌ）のジクロロメタン（５０ｍＬ）溶液を４５分間かけて室温であった。１５分後のＨＰＬＣ分析は、反応が完全であることを示した。反応混合物を、水（１００ｍｌ）、１ＭのＨＣＬ（２ｘ１００ｍｌ）、ブライン（１００ｍｌ）で洗浄した。有機相を１ＰＳ紙で乾燥し、濃縮して濃赤色固体とした。この固体を、ヘキサンを充填した上に無水硫酸ナトリウム（２０ｇ）を有するシリカゲル（１５０ｇ）上でフラッシュクロマトグラフィーにかけた。カラムを、画分１～４についてはヘキサン中の１５％酢酸エチル、画分５～８についてはヘキサン中の２５％酢酸エチル、画分９～１６についてはヘキサン中の３５％酢酸エチル、画分１７～３２についてはヘキサン中の５０％酢酸エチルで１２５ｍＬずつ溶出した。すべての画分をＴＬＣ（酢酸エチル：ヘキサン；１：１）で、一部の画分をＨＰＬＣでチェックした。生成物は、画分２１～３０で溶出した。それらを組み合わせ、減圧下で濃縮して、オレンジ色の固体を得た。この固体を、１５％酢酸エチル上にヘキサン（５０ｍＬ）に懸濁し、１５分間撹拌した。固体を回収し、風乾して、（５ａ）６．７ｇ（６２％）を橙色固体として得た。ＨＰＬＣ分析は、９９％の純度を示した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３） δ ８．１－８．３（ｍ，２Ｈ），７．７－７．８（ｍ，２Ｈ），６．１（ｓ，１Ｈ），３．６（ｂｒ ｄ，４Ｈ），２．２（ｔ，２Ｈ），１．４５（ｍ，２Ｈ），１．２５（ｂｒ ｓ，（６Ｈ），０．９（ｔ，３Ｈ）。

【0035】

（Ｅ）－Ｎ－メトキシ－２－（（３－クロロ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチレン）ペンタンアミド（５ｂ）。ＤＣＭ（３００ｍＬ）中のＤＭＦ（０．５ｍＬ）および塩化オキサリル（ＤＣＭ中２Ｍ、８７．５ｍＬ、０．０１７５ｍｏｌ）を含む（３）（２０．０ｇ、０．７ｍｏｌ）から調製された粗（４）の１００ｍＬのＤＣＭ中溶液に、メトキシアミン塩酸塩（７．０ｇ、０．０８４ｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２７．１ｇ、０．２１ｍｏｌ）のＤＣＭ（１００ｍＬ）中溶液に、アルゴン下で加え、室温の水浴中で１時間にわたって冷却した。３０分後、ＨＰＬＣは、反応が完全であることを示した。混合物を、水（１００ｍＬ）、１ＭのＨＣｌ（１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を１ＰＳ紙で乾燥し、オレンジ油に濃縮した。粗油状物を、ヘキサン／ＥｔＯＡｃを用いたシリカゲル（３５０ｇ）上のクロマトグラフィーに付した。生成物は、６０％のＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した。純粋な画分を合わせて、油１９ｇを得、それは固化した。固体をヘキサン（１００ｍＬ）で粉砕し、ろ過して、（５ｂ）１６．６ｇを９８％純度で黄色固体（７１％）として得た。

【0036】

（Ｅ）－Ｎ，Ｎ－ジエチル－２－（（３－メトキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチレン）ペンタンアミド（６ａ）。（５ａ）（５．０ｇ、０．０１４ｍｏｌ）のメタノール（１００ｍＬ）溶液に、ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（ＭｅＯＨ中５Ｍ４．２ｍＬ）を、一部でアルゴンをスパージして加えた。３０分後、ＨＰＬＣは、反応が完全であることを示した。反応混合物を、３ＭのＨＣｌ（３．５ｍＬ）を用いてｐＨ３に酸性化した後、減圧下で濃縮した。その結果得られた残留物は、酢酸エチル（１５０ｍｌ）で溶解し、水（２×７５ｍｌ）およびブライン（１×１００ｍｌ）で洗浄し、１ＰＳ濾紙でろ過し、減圧下で濃縮して、油を得、それは固化した。この固体を、ヘキサン（５０ｍＬ）で３０分間粉砕し、固体を採集し、風乾して、（６ａ）、ＡＰＸ２００９の４．８ｇ（９６％）を淡橙色の固体として得た。ＨＰＬＣ分析は、９９％の純度を示した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ ８．１５（ｍ，２Ｈ），７．７５（ｍ，２Ｈ），６．２（ｓ，１Ｈ），４．１（ｓ，３Ｈ），３．６（ｂｒ ｄ，４Ｈ），２．２（ｔ，２Ｈ），１．４（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｂｒ ｄ，４Ｈ），０．８５（ｔ，３Ｈ）。

【0037】

（Ｅ）－Ｎ－メトキシ－２－（（３－メトキシ－１，４－ジオキソ－１，４－ジヒドロナフタレン－２－イル）メチレン）ペンタンアミド（６ｂ）。（５ｂ）（１０．０ｇ、０．０３ｍｏｌ）のメタノール（１００ｍＬ）溶液に、ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（ＭｅＯＨ中５Ｍ９．０ｍＬ）を、一部でアルゴンをスパージして加えた。３０分後、ＨＰＬＣは、反応が完全であることを示した。混合物を、３ＭのＨＣｌでｐＨ２～３に酸性化した。混合物を、残留物まで減圧下で濃縮した。残留物を酢酸エチル（１５０ｍＬ）に溶解し、水（１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を１ＰＳ紙上で乾燥し、減圧下で油に濃縮し、それは固化した。固体を、ヘキサン（１５０ｍＬ）で３０分間粉砕し、ろ過して、（６ｂ）、ＡＰＸ２０１４の８．７ｇ（８３％）を黄色固体として得た。ＨＰＬＣ分析は、９９％の純度を示した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ ８．８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），８．１（ｍ，２Ｈ），７．７５（ｍ，２Ｈ），６．７（ｓ，１Ｈ），４．１５（ｓ，３Ｈ），３．９（ｓ，３Ｈ），２．２（ｍ，２Ｈ），１．４（ｍ，２Ｈ），０．８５（ｔ，３Ｈ）。

【0038】

ＡＰＸ３３３０は、Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ １０：１８５３１８６７（２００８）に記載されているように合成された。

【0039】

電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）。これらのアッセイは、前述のように実施した（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ １０：１８５３１８６７（２００８）；Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ １４：１３８７－１４０１（２０１１）；Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５０：８２－９２（２０１１）；Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１：６９５－７０５（２０１２）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５２：２９５５－２９６６（２０１３））。簡単に説明すると、増加する量のＡＰＸ３３３０、ＡＰＸ２００９またはＡＰＸ２０１４を、ＥＭＳＡ反応緩衝液中の精製したＲｅｆ－１タンパク質と３０分間プレインキュベートした。ＥＭＳＡアッセイは、ＡＰ－１標的ＤＮＡ配列およびＡＰ－１タンパク質を用いて行った。

【0040】

細胞。初代ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＥＣ）は、Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ＷＡ）から得、一方Ｒｆ／６ａマカクク脈絡膜内皮細胞株は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。細胞は記載されているように維持され（Ｂａｓａｖａｒａｊａｐｐａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ９：７８６－８０１（２０１７））、少なくとも年１回は再指示され、マイコプラズマ汚染について定期的に評価された。

【0041】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイ。．内皮細胞増殖は、既に記載されているように測定した（Ｂａｓａｖａｒａｊａｐｐａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ９５６９４（２０１４）；Ｂａｓａｖａｒａｊａｐｐａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ９：７８６－８０１（２０１７））。簡単に説明すると、２．５×１０個の^３細胞を、１００μＬの成長培地に播種し、９６ウェル透明底黒色プレートの各ウェルに平板培養し、２４時間インキュベートした。ＡＰＸ２００９，ＡＰＸ２０１４、またはＤＭＳＯビヒクル（ＤＭＳＯ最終濃度＝１％）を添加し、プレートを３７℃および５％ＣＯ_２で１００μＬ完全培地で２４～４８時間インキュベートした。アラマーブルー試薬（１１．１μＬ）を、プレートの各ウェルに添加し、４時間後に、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて、それぞれ５６０ｎｍおよび５９０ｎｍの励起波長および発光波長で蛍光読み取りを行った。ＧＩ５０はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．７．０を用いて算出した。

【0042】

ＥｄＵの取り込み、Ｋｉ－６７染色およびＴＵＮＥＬ。これらのアッセイは、既に記載されているように実施した（Ｂａｓａｖａｒａｊａｐｐａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ９５６９４（２０１４）；Ｂａｓａｖａｒａｊａｐｐａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ９：７８６－８０１（２０１７））。ただし、カバースリップではなくチャンバースライドを使用した。簡単に言うと、細胞（ウェルあたり３０，０００）を、付着因子でコーティングした８ウェルのチャンバースライド上に播種し、一晩付着させた。細胞を、指示された化合物濃度で１７時間（一晩）処理した。増殖をアッセイするために、細胞を、３７℃で８時間完全培地中でＥｄＵと共にインキュベートした。次に細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、ＰＢＳで調製した０．２５％トリトンＸ－１００を用いて透過処理した。細胞を、Ｋｉ－６７（Ｄ３Ｂ５）（＃９１２９；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）（１：４００）に対するウサギ特異的モノクローナル抗体と、４℃で一晩インキュベートした。二次抗体は、核染色用のＤＡＰＩ対比染色を有するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒヤギ抗ウサギ４８８（Ａ１１０３４；Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）であった。ＥｄＵを取り込んだ増殖細胞を、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵ Ｉｍａｇｉｎｇキット（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて検出した。代わりに、アポトーシス細胞を、核染色のためのＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２対比染色、および陽性対照としての１μＭスタウロスポリンによる１７時間処理を用いて、製造業者の指示に従って、Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＴＵＮＥＬアッセイキット（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて可視化した。Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ Ｄ２顕微鏡またはＬＳＭ ７００共焦点顕微鏡を用いて細胞を撮像し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてウェル当たり３つの低出力（ＴＵＮＥＬ用）または高出力（Ｋｉ－６７およびＥｄＵ用）照射野で陽性細胞の割合を計数した。

【0043】

細胞周期解析。ＨＲＥＣ（２ｘ１０^６）を、ＥＧＭ－２培地で成長させた。細胞を一晩ＥＢＭ－２媒体で血清飢餓状態にし、次に示した濃度のＡＰＸ２００９またはＡＰＸ２０１４をＤＭＳＯ対照とともに完全媒体中で２４時間処理した。細胞を氷冷したＰＢＳで２回洗浄した後、６６％エタノール溶液中で４℃で一晩固定した。固定した細胞を、氷冷したＰＢＳで再び２回洗浄し、ペレットをヨウ化プロピジウム染色溶液に３７℃で３０分間再懸濁した（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および１００μｇ／ｍＬのＲＮＡ分解酵素Ａを含む１×ＰＢＳで調製した２０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム）。インキュベーション後、細胞を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて分析した。パルス形状解析を用いて、ダブレットおよびデブリを除外した。その後、ＭｏｄＦｉｔソフトウェア（ｖ．５．０）を用いてＦＬ２領域ヒストグラムプロットにより単一細胞集団を評価し、細胞周期プロファイルを生成した。

【0044】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞遊走アッセイ。内皮細胞移動は、前述のようにモニターした（Ｂａｓａｖａｒａｊａｐｐａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ９５６９４（２０１４）；Ｂａｓａｖａｒａｊａｐｐａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ９：７８６－８０１（２０１７））。簡単に述べると、ＨＲＥＣおよびＲｆ／６ａは、１２ウェルプレートでコンフルエントになるまで成長させた。滅菌した１０μＬマイクロピペットチップを用いて、各ウェルの中心を横断して引っかき傷を作り、ＤＭＳＯまたは種々の濃度のＡＰＸ２００９もしくはＡＰＸ２０１４化合物を含む新鮮な完全培地をウェルに加えた（ＤＭＳＯ最終濃度＝１％）。ウェルを、種々の時点でデジタル明視野顕微鏡を介して撮像し、引っかき傷領域への移動した細胞の数を手動で計数した。

【0045】

ｉｎ ｖｉｔｒｏマトリゲル管形成アッセイ。ＨＲＥＣおよびＲｆ／６ａ細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで管を形成する能力を、前述のようにモニターした（Ｂａｓａｖａｒａｊａｐｐａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ９５６９４（２０１４）；Ｂａｓａｖａｒａｊａｐｐａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ９：７８６－８０１（２０１７））。簡単に説明すると、細胞を、示された濃度のＡＰＸ２００９もしくはＡＰＸ２０１４化合物またはＤＭＳＯで４８時間処理し、次いで、ＤＭＳＯまたはＡＰＸ化合物を含む１００μＬの成長培地中の１．５×１０^４細胞を、マトリゲル基底膜５０μＬ（ＤＭＳＯ最終濃度＝１％）で前被覆した９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。ＩｍａｇｅＪソフトウェアのＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｎａｌｙｚｅｒプラグイン（ｖ．１．４８；ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅ．ｂｉｏ．ｍｅｔｈｏｄｓ．ｆｒｅｅ．ｆｒ／ＩｍａｇｅＪ／？Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ－Ａｎａｌｙｚｅｒ－ｆｏｒ－ＩｍａｇｅＪ．ｈｔｍｌ））を用いて、各ウェルの異なる時点のデジタル写真を撮影して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの管形成を測定した。

【0046】

ＮＦ－κＢ ｐ６５核移行アッセイ。ＮＦ－κＢ核転座アッセイは、付着因子でコーティングされた８ウェルチャンバースライド上に３０，０００ＨＲＥＣｓ／ウェルを播種することにより実施した。細胞をＥＧＭ－２培地中で一晩成長させた後、指示した濃度のＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４、または陽性対照ＮＦ－κＢ阻害剤として１０μＭのＢＡＹ １１－７０８２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理した。１７時間のインキュベーション後、培地を、指示した濃度の化合物またはＤＭＳＯで１時間ＥＢＭ－２（最小培地）と交換した。次いで、細胞を、ＥＢＭ－２中の１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ－αで３７℃で２０分間刺激して、ＮＦ－κＢを活性化した。次に、細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中に調製した０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液を用いて透過処理した。細胞を、ＮＦ－κＢ ｐ６５に対するモノクローナル抗体（ｓｃ－８００８；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）（１：５０）と４℃で一晩、続いてＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ ５５５ヤギ抗マウス二次抗体（１：２０００）と１時間インキュベートした。細胞を、核染色のためにＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で対比染色し、次いでＥｖｅｒｂｒｉｔｅ ハードセットマウンティング媒体を用いてマウントした。Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ Ｄ２顕微鏡を用いて細胞を撮像した。

【0047】

ｑＲＴ－ＰＣＲ。本アッセイは、以前記載されているように実施した（Ｂａｓａｖａｒａｊａｐｐａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ９５６９４（２０１４）；Ｂａｓａｖａｒａｊａｐｐａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ９：７８６－８０１（２０１７））。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて指示されているように処理した細胞からＲＮＡを抽出した。ランダムプライマーおよびｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、１μｇのＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ｑＰＣＲは、ＶｉｉＡ７サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上のＦａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘおよびＴａｑＭａｎプローブを用いて、３８４ウェルプレート中で１０μＬ体積で実施した。使用したプライマー／プローブセットは、以下の通りであった：ＶＥＧＦＡ（Ｈｓ００９０００５５＿ｍ１）、ＶＣＡＭ１（Ｈｓ０１００３３７２＿ｍ１）、およびＣＣＬ２０（Ｈｓ０１０１１３６８＿ｍ１）、およびハウスキーピング対照ＨＰＲＴ（Ｈｓ０２８００６９５＿ｍ１）およびＴＢＰ（Ｈｓ００４２７６２０＿ｍ１）。データは、ΔΔＣｔ法を用いて解析した。遺伝子の発現レベルを２つのハウスキーピング遺伝子に正常化し、ＤＭＳＯ処理試料に対して較正した。

【0048】

動物。すべての動物実験は、Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を受け、ｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｕａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈに準拠した。６～８週齢の野生型雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｅｎｖｉｇｏ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ；脈絡膜発芽実験について）またはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ；Ｌ－ＣＮＶについて）から購入し、標準条件下で飼育した（Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｖｉｓ ２１：５１５－５２２（２０１５））。９０ｍｇ／ｋｇの塩酸ケタミンおよび５ｍｇ／ｋｇのキシラジンを腹腔内注射し、アチパメゾール反転（１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与することによって、マウスを、すべての手順について麻酔した。処置は、ケージにより無作為に割り付けた。

【0049】

脈絡膜発芽アッセイ。ｅｘ ｖｉｖｏの脈絡膜発芽は、以前記載されているように（Ｓｕｌａｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：２５５０９（２０１６）；Ｂａｓａｖａｒａｊａｐｐａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ９：７８６－８０１（２０１７））評価した。簡単に述べると、７～８週齢のマウスの眼から脈絡膜強膜を切開し、片をマトリゲルに包埋し（成長因子減少）、抗生物質を含むＥＧＭ－２媒体中で７２時間成長させて、発芽を開始させた。示した濃度のＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４化合物（ＤＭＳＯ中、それぞれ最終ＤＭＳＯ濃度０．５および０．２％）を添加し、４８時間成長させて進行させた。画像を撮影し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて試料あたり４方向に脈絡膜片の端から成長前面までの距離を測定することにより、成長を定量化した。

【0050】

レーザー誘発脈絡膜血管新生。Ｌ－ＣＮＶは、以前記載されているように誘発された（Ｓｕｌａｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｏｃｕｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ３１：４４７－４５４（２０１５）；Ｓｕｌａｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：２５５０９（２０１６）；Ｂａｓａｖａｒａｊａｐｐａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ９：７８６－８０１（２０１７））。研究は、３０％のばらつき、α＝０．０５を仮定して、５０％の効果サイズの差を検出する確率が８０％であることを検出力とした。簡単に述べると、麻酔したマウスの瞳孔を１％トロピカミド（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｆｏｒｔｈ Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）で拡張し、ヒプロメロース眼粘膜粘滑液（Ｇｏｎａｋ）（Ａｋｏｒｎ，Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ，ＩＬ）で潤滑した。カバースリップを用いて、眼の後磁極を見ることが可能になった。細隙灯（５０μｍのスポットサイズ、５０ｍｓの持続時間、および２５０ｍＷのパルス）と結合した５３２ｎｍ眼用アルゴングリーンレーザーの３回の焼損を、各３、９、および１２時位置、光学ディスクから２枚のディスク直径に送達した。レーザー光凝固後に感知されたバブリングまたはポップは、ブルック膜の破裂の成功と考えられた。気泡が観察されなかった病変は、本例から除外した。ＡＰＸ３３３０の抗血管新生活性を評価するために、以前にｉｎ ｖｉｖｏで使用されたように、化合物（５０ｍｇ／ｋｇ体重）、１日２回、５日／２日の休薬をマウスに腹腔内注射した（Ｆｉｓｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １０：１６９８－１７０８（２０１１）；Ｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ Ｌｅｔｔ ７：１０７８－１０８２（２０１４）；Ｂｉｓｗａｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３０９：Ｃ２９６－３０７（２０１５））。ビヒクルは、ＰＢＳ中の４２％のＣｒｅｍｏｐｈｏｒ：２％エタノールであった。ＡＰＸ２００９については、用量は、特に指定のない限り、１２．５ｍｇ／ｋｇまたは２５ｍｇ／ｋｇ体重、レーザー処置の１４日間まで１日２回であった。ビヒクルは、プロピレングリコール、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ ＨＳ１５、Ｔｗｅｅｎ ８０（ＰＫＴ）であった（ＭｃＩｌｗａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２３４９３．（２０１７））。マウスは、毎日秤量した。

【0051】

ｉｎ ｖｉｖｏ画像化。光干渉断層撮影（ＯＣＴ）は、以前記載されているように（Ｓｕｌａｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：２５５０９（２０１６））Ｌ－ＣＮＶマウスにおいて、Ｍｉｃｒｏｎ ＩＩＩ眼内画像化システム（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）を用いて示した時点で実施した。簡単に言うと、手順の前に、麻酔したマウスの眼を１％トロピカミド溶液（Ａｌｃｏｎ，Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）で拡張し、ヒプロメロース眼粘液（Ｇｏｎａｋ）（Ａｋｏｒｎ，Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ，ＩＬ，ＵＳＡ）で潤滑した。次に、マウスを、画像化のためにマウス眼を位置決めするために自由に動く、カスタム加熱ステージ上に置いた。病変ごとにいくつかの水平および垂直ＯＣＴ画像を撮影した。２５％フルオレセインナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）５０μＬを腹腔内注射することによって、レーザー１４日後に蛍光眼底造影を行った。Ｍｉｃｒｏｎ ＩＩＩシステムおよびＳｔｒｅａｍｐｉｘソフトウェアを用いて、眼底画像を撮影した。

【0052】

脈絡膜平面免疫蛍光法。Ｌ－ＣＮＶ誘発１４日後にマウス眼を採取した。眼球を摘出し、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで一晩固定した。前眼部、水晶体、および網膜を摘出し、脈絡膜平坦マウント用に後眼カップを準備した。後眼カップをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む遮断緩衝液中で４℃で２時間透過処理した。遮断後、アイカップは、ローダミン標識されたＲｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ Ｉ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）およびＧｒｉｆｆｏｎｉａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ（ＧＳ－ＩＢ４）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からのＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ４８８共役Ｉｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４で、０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ＰＢＳ中０．５％のＢＳＡを含む緩衝液中の濃度１：２５０で、４℃で１６～２０時間、血管系について二重染色した。抗体インキュベーション後、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で４℃で各ステップ１５分間、全マウントをＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、脈絡膜フラットマウントを、水溶液マウンティング媒体（ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に装着し、共焦点Ｚ－ｓｔａｃｋ画像化（ＬＳＭ ７００，Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）による観察のためにカバースリップして、病変体積を推定した。各光学切片の染色面積の合計に切片間の距離（３μｍ）を乗じた値をＣＮＶ病変体積とし、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて病変体積を定量した。公表されているように品質管理基準を満たしている場合にのみ、病変を分析のために含めた（Ｐｏｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ５５：６５２５－６５３４（２０１４））。眼の病変はすべて平均して、単一のｎを表した。

【0053】

統計解析。統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェアを用いて行った。一元配置分散分析を、移動、管形成、および脈絡膜発芽実験のためにＤｕｎｎｅｔｔの事後検定と共に用いた。一元配置分散分析を、ＡＰＸ２００９のｉｎ ｖｉｖｏ実験のためにＴｕｋｅｙの事後検定と共に使用した。ＡＰＸ３３３０のｉｎ ｖｉｖｏ実験には対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いた。両側ｐ値＜０．０５を、統計学的に有意とみなした。

【0054】

結果
Ｒｅｆ－１阻害剤ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４は、ＡＰＸ３３３０よりも強力であった。ＡＰＸ２００９（６ａ）およびＡＰＸ２０１４（６ｂ）（図１Ａ）を合成し、両化合物はＡＰＸ３３３０（７）と比較して、Ｒｅｆ－１誘発性転写因子結合のＤＮＡへの阻害を増強し（図１Ｂ）、一方実質的に異なる生理化学的特性を有することを実証した。新規化合物は分子量がより低く、ＡＰＸ３３３０のカルボキシレート基および長いアルキル鎖を欠いている。また、新規化合物は、それらのｃｌｏｇＰ値、ＡＰＸ３３３０＝４．５、ＡＰＸ２００９＝２．７、およびＡＰＸ２０１４＝１．９の計算に基づいてコンピュータによって決定されるように、親油性を有意に低下させた。

【0055】

ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４は、内皮細胞増殖を遮断した。生存率の上昇に伴う内皮細胞の増殖は、新たな血管を構成する細胞を支持し、血管新生をもたらす。増殖アッセイを行って、血管新生または抗血管新生活性を測定した。これら２つの新たなＲｅｆ－１阻害剤の抗血管新生能の初期試験として、ＨＲＥＣおよびＲｆ／６ａ脈絡膜内皮細胞の増殖を阻害するそれらの能力（図２Ａ～２Ｄ）を評価した。両方の化合物は、ａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイにおいて、両方の細胞タイプの増殖を用量依存的に遮断し、ＡＰＸ２０１４はＡＰＸ２００９よりも高い効果を有する。一次ＨＲＥＣは、他の抗血管新生化合物で見られるように、Ｒｆ／６ａ脈絡膜細胞系よりも両化合物に対する感受性が高かった。

【0056】

ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４は、アポトーシスを誘発することなくＳ期を遮断した。化合物の活性は、ＨＲＥＣでより詳細に評価した。両化合物は、Ｋｉ－６７染色の減少およびＥｄＵの取り込みの減少によって証明されるように、Ｓ期を通る細胞の数を減少させた（図３Ａ～３Ｄ；図４Ａおよび５）。これは、高用量の化合物でＧ０／Ｇ１期の細胞が適度に増加し、同時にＧ２／Ｍ期細胞が減少することからも明らかであった（図４Ｂおよび４Ｃ）。しかしながら、いずれの化合物も、ＴＵＮＥＬにより評価されるような抗増殖性用量でアポトーシスを誘発しなかった（図６Ａおよび６Ｂ）。

【0057】

ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４は、内皮細胞遊走を遮断した。血管新生には、細胞外マトリックス分解、細胞移動、細胞増殖、および内皮細胞の形態形成を含む一連の協調した事象が関与している。内皮細胞遊走に対するＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４化合物の効果を知るために、スクラッチ－創傷アッセイを行った。（図７Ａ～７Ｄ；図８Ａ～８Ｄ）。両化合物は、再びここで用量依存的に有効であり、これらのアッセイの短時間経過にわたって明らかな細胞毒性を引き起こすことはなかった。

【0058】

ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４は、内皮細胞管形成を遮断した。内皮細胞は、マトリゲルのような細胞外マトリックス上にプレートすると毛細血管様構造を組織化し、形成する。内皮細胞が管の三次元ネットワークに組織化されることは、血管新生に不可欠である。このように、マトリゲル管形成アッセイは、ｉｎ ｖｉｖｏでの血管新生能の良好なｉｎ ｖｉｔｒｏ予測因子である。このアッセイでは、ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４の両方が、遊走のみを阻害するのに必要な濃度よりも低い濃度で、顕著に尿細管形成を阻害し、抗血管新生活性を強く示した（図９Ａ～９Ｄ；図１０Ａ～１０Ｄ）。

【0059】

ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４は、ＮＦ－κＢ活性を阻害した。Ｒｅｆ－１阻害は以前にＮＦ－κＢ活性の低下と関連していることから（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４が予想される機序を介して作用しているかどうかを決定するために、この経路の活性をＨＲＥＣ中の化合物に応答して評価した。まず、ＮＦ－κＢのｐ６５サブユニットの核内への転座を、経路活性の重要な指標であるＴＮＦ－αに応答して評価した。ｐ６５の転座は、ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４で処理したＨＲＥＣにおいて用量依存的に減弱した（図１１Ａ）。さらに、すべてＮＦ－κＢの下流にあるＶＥＧＦＡ、ＶＣＡＭ１、およびＣＣＬ２０のｍＲＮＡの産生は、これらの化合物によって３～１０倍減少した（図１１Ｂ、１１Ｃおよび１１Ｄ）。

【0060】

ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４は、ｅｘ ｖｉｖｏで血管新生を遮断した。活性のさらなる試験として、マウス脈絡膜外植片を用いた脈絡膜発芽試験を用いて、組織中の複雑な微小血管床におけるＡＰＸ化合物の有効性を試験した（図１２Ａ～１２Ｄ）。このアッセイでは、脈絡膜細胞は、脈絡膜組織片から周囲のマトリゲルマトリックスに成長する。両化合物は、発芽を有意に減少させ、ＡＰＸ２０１４はより強力なままであった。１０μＭでは、ＡＰＸ２００９は対照と比較して発芽を約７０％減少させ（図１２Ａおよび１２Ｂ）、一方１μＭ（試験した最高濃度）では、ＡＰＸ２０１４は対照と比較して発芽を約６０％減少させた（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。

【0061】

親化合物ＡＰＸ３３３０による全身性Ｒｅｆ－１阻害はＬ－ＣＮＶを予防できる。ＡＰＸ３３３０を用いたＲｅｆ－１阻害による眼血管新生を減弱する以前の努力は、化合物の硝子体内送達に依存していた。これは標準治療の抗ＶＥＧＦ生物学的製剤の送達経路であり、薬物がヒトで正しい位置に到達することを保証するが、それは労働集約的であり、患者に不快感を与え、潜在的に視力を脅かす眼内炎のリスクを負う。このように、全身的（腹腔内）Ｒｅｆ－１阻害がＬ－ＣＮＶの療法に対する代替の経路となりうるかどうかを探索した。概念実証として、第一世代Ｒｅｆ－１阻害剤ＡＰＸ３３３０（７）の腹腔内注射は、５０ｍｇ／ｋｇを１日２回、５日投薬／２日休薬、２週間の送達を用いた。この投与計画は、前臨床腫瘍研究では以前に成功しており、毒性が認められなかったことから選択した。ＡＰＸ３３３０で処理した動物は、有意に減少したＬ－ＣＮＶ体積を示した（図１３Ａ～１３Ｃ）。

【0062】

より強力な誘導体ＡＰＸ２００９の全身投与は、Ｌ－ＣＮＶを有意に減少させた。ＡＰＸ３３３０がＬ－ＣＮＶの有効な全身作用剤であることから、新たな第２世代のＲｅｆ－１阻害剤の効果を分析した。

【0063】

ＡＰＸ２００９は、以前に動物で安全に投与されていたため、この実験に選択された。以前に採用された２種の投与量計画、１２．５または２５ｍｇ／ｋｇを、１日２回、２週間使用した。より低用量ではＬ－ＣＮＶは低下しなかったが、２５ｍｇ／ｋｇ投与では著明な効果が認められた（図１４Ａ～１４Ｄ）。これは、７日目のＯＣＴ画像によって定性的に明らかであり、１４日目ではさらに実質的であった（図１４Ａ）。さらに、１４日目のフルオレセイン血管造影による病変では、定性的にフルオレセイン漏出が少なかった（図１４Ｂ）。最後に、アグルチニン（図１４Ｃ）およびイソレクチンＢ４（図１５Ａ～１５Ｃ）でのｅｘ ｖｉｖｏ染色により評価したＬ－ＣＮＶ病変体積は、ビヒクルと比較してＡＰＸ２００９の２５ｍｇ／ｋｇにより約４倍減少した（図１４Ｄ）。

【0064】

観察された効果は、化合物が酸化還元シグナル伝達阻害に特異的であることから、ＤＮＡ修復阻害よりもむしろ酸化還元シグナル伝達阻害に起因する可能性が高い。Ｒｅｆ－１、酸化還元およびＤＮＡ修復の分子的に異なる機能部分は、完全に独立している。例えば、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ－１の６５位におけるシステインの突然変異（Ｃ６５Ａ）は、酸化還元機能を阻害するが、ＤＮＡ修復機能には影響せず、逆もまた同様である。さらに、ＡＰＸ３３３０のようなＲｅｆ－１阻害剤は、ＡＰＥ１活性を阻害しない。実際、ＡＰＸ３３３０およびＡＰＸ２００９は、ニューロンにおけるＡＰＥ１修復活性を増強することができ、これらの剤の神経保護作用に寄与する可能性があり、血管新生性眼疾患における光受容体細胞死との関連において付加的な利益が提供され得る。

【0065】

抗Ｒｅｆ－１酸化還元シグナル伝達活性を考慮すると、ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４は、Ｒｅｆ－１によって引き起こされる転写因子の活性化を遮断することによって、その抗血管形成効果を発揮する可能性が高い。可能性のある候補には、ＮＦ－κＢおよびＨＩＦ－１αが含まれ、その両方は、ＶＥＧＦを調節することができる。網膜色素上皮細胞において、ＡＰＸ３３３０は、ＮＦ－κＢおよびＨＩＦ－１α活性の両方を低下させ、同時にＶＥＧＦ発現の低下を伴った。さらに、１型糖尿病ラットにおける発作のＡＰＸ３３３０処置は、総血管密度およびＶＥＧＦ発現を有意に減少させた。しかしながら、眼の血管新生との関連においてＲｅｆ－１阻害により調節される正確な転写因子は、未だ決定されていない。

【0066】

ｉｎ ｖｉｖｏで試験された２つの化合物（ＡＰＸ３３３０およびＡＰＸ２００９）の明らかな眼内または全身の有害性は観察されず、移動、管形成、および脈絡膜発芽アッセイに見られた実質的な細胞死も観察されなかった。これらの発見は、ヒトにおけるＡＰＸ３３３０の優れた安全性プロファイルと一致している。それにもかかわらず、新規化合物の眼毒性および眼内薬物動態は、十分に試験されていないままである。

【0067】

良好に耐容される全身性の薬物療法は、血管新生性眼疾患の処置に顕著な可能性がある。既存の承認された薬物はすべて、眼科医の診療所の関連において硝子体内注射が必要な生物学的製剤である。経口的に生体利用可能な薬物（ＡＰＸ３３３０と同様）は、潜在的には１日１回の丸剤として、自宅で投与され得る。このような療法のトレードオフは、硝子体内注射に必要な投与量（月１回以下）よりもはるかに頻繁に投与され、硝子体内療法でみられるよりも実質的な全身曝露であろう。しかし、Ｒｅｆ－１阻害剤の強力な安全性プロファイルを考慮すると、これは管理可能であると考えられる。また、診療所の受診および注射手順を減らすことができれば、このような療法では、患者および健康管理システムの費用が大幅に低くなる可能性がある。

【0068】

要約すると、Ｒｅｆ－１阻害剤（ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４）の全身投与がＬ－ＣＮＶを減弱できることがここで初めて示された。Ｌ－ＣＮＶは湿式ＡＭＤの基礎となる脈絡膜血管新生の広く使用されているモデルであるため、Ｒｅｆ－１阻害がこの適応症の治療的有用性を見出すことができることを示唆している。ｉｎ ｖｉｔｒｏデータは、Ｒｅｆ－１阻害が網膜内皮細胞が関与する血管新生も効果的に遮断することを示唆する。したがって、これらの阻害剤は、ＲＯＰおよびＰＤＲのような網膜血管新生疾患にも有用であり得る。

【0069】

実施例２
本実施例では、ＮＦ－κＢシグナル伝達関連遺伝子に対するＲｅｆ－１ノックダウンの効果を解析した。

【0070】

ヒト網膜内皮細胞（ＨＲＥＣ）（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ＷＡ）を、６ウェルプレートに平板培養し、０．１μＭのＡＰＸ２００９，１μＭのＡＰＸ２００９またはＤＭＳＯで６時間および２４時間処理した。ＰＢＳで処理した後、細胞を１回洗浄し、採取し、凍結した。このプロセスを繰り返して、４種類の異なる経過で処理した細胞を採取した。ＲＮＡを３００μＬのＴｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で抽出し、－８０℃でフラッシュ凍結した。ＳＭＡＲＴｅｒシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて、細胞からｃＤＮＡを発生させた。ｄｓｃＤＮＡ量および質は、高感度ＤＮＡチップを有するＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて評価した。合計４８個のＳＣＲおよび４８個のｓｉＡＰＥ１細胞を、配列決定のために選択した。ＩＵＳＭ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙは、Ｎｅｘｔｅｒａキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてライブラリーを調製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００を用いてＤＮＡの配列を決定した。

【0071】

Ｒｅｆ－１はＮＦ－κＢおよびＨＩＦ－１αシグナル伝達を活性化する：ＨＩＦ－１の活性化にはＨＩＦ－１αタンパク質の酸化還元依存性安定化が必要であり、Ｒｅｆ－１を介する酸化還元シグナル伝達は、ＨＩＦ－１のＤＮＡ結合活性を調節する。低酸素により駆動される遺伝子発現は、単にＨＩＦを介するものではなく、低酸素に応答する他のＴＦには、ＮＦ－κＢ、ＡＰ－１および他のものが含まれる。低酸素によって誘発される分子変化は、眼および癌の両方において、血管新生に影響し得る。新規な化合物ＡＰＸ２００９およびＡＰＸ２０１４は、ＨＲＥＣにおけるＮＦ－κＢ活性化を阻害し、標的遺伝子発現を減少させる。これはこのＲＮＡ－Ｓｅｑ実験で確認され、ＡＰＸ２００９がＨＩＦで制御された遺伝子を濃度依存的方式で遮断していることが実証された（図１６）。

【0072】

実施例３
本実施例では、眼血管新生に対するＲｅｆ－１の役割を解析する。

【0073】

Ｒｅｆ－１の発現データについて、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓをマイニングした。さらに、湿式ＡＭＤ患者および年齢を整合させた対照からの脱特定された剖検眼組織において、Ｒｅｆ－１の免疫組織化学検査を実施した。組織切片を、脱パラフィンした。ＤＡＢを検出に用い、ＤＡＰＩで対比染色した。網膜および脈絡膜の画像を、ＥＶＯＳ ｆｌデジタル顕微鏡で撮影した。

【0074】

Ｒｅｆ－１は、発生中のマウス網膜、ならびに網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、網膜周皮細胞、脈絡膜内皮細胞（ＣＥＣ）および網膜内皮細胞（ＲＥＣ）において高度に発現される。ＲＮＡレベルでは、３６種類の他の組織型のうち３分の１を除くすべての組織よりも網膜で高度に発現している（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ＥＮＳＧ０００００１００８２３－ＡＰＥＸ１／ｔｉｓｓｕｅ）。予備的な証拠でも、年齢を整合させた対照群と比較して、ヒト湿式ＡＭＤ患者眼の網膜および脈絡膜でアップレギュレートされていることが示唆されており（図１７）、疾患の関連性が示唆されている。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14(1)】

【図14(2)】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図16】

【図17】