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特許7454861インフルエンザウイルス検出のための方法及びキット、並びにインフルエンザイウイルス感染の診断方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-14
(45)【発行日】2024-03-25
(54)【発明の名称】インフルエンザウイルス検出のための方法及びキット、並びにインフルエンザイウイルス感染の診断方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/483 20060101AFI20240315BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240315BHJP
C12Q 1/34 20060101ALI20240315BHJP
【ＦＩ】
G01N33/483 C
G01N33/50 Z
C12Q1/34
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2021503642
(86)(22)【出願日】2020-03-05
(86)【国際出願番号】 JP2020009355
(87)【国際公開番号】W WO2020179858
(87)【国際公開日】2020-09-10
【審査請求日】2023-01-06
(31)【優先権主張番号】P 2019039299
(32)【優先日】2019-03-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】503360115
【氏名又は名称】国立研究開発法人科学技術振興機構
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(72)【発明者】
【氏名】田端 和仁
(72)【発明者】
【氏名】野地 博行
(72)【発明者】
【氏名】浦野 泰照
(72)【発明者】
【氏名】神谷 真子
【審査官】大瀧 真理
(56)【参考文献】
【文献】特表２００３－５１１３８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００２－５４１８５８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０００－５０１７４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第１８／０４３７３３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】OBAYASHI,Y. et al.，A single-molecule digital enzyme assay using alkaline phosphatase with a cumarin-based fluorogenic substrate，Analyst，2015年，vol.140，pp.5065-5073
【文献】MIURA, K. et al.，Discovery of human Golgi b-galactosidase with no identified glycosidase using a QMC substrate design platform for exo-glycosidase，Bioorganic & Medicinal Chemistry，2016年，vol.24，pp.1369-1375
【文献】RIVAS, C. et al.，A novel sialidase-activatable fluorescence probe with improved stability for the sensitive detection of sialidase，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2020年，vol.30, no.126860，pp.1-4
【文献】LIU, D. et al.，Fluorescent sialic derivatives for the specific detection of influenza viruses，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，vol.29,no.126773，2019年08月11日，pp.1-5
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８ － ３３／９８
Ｃ１２Ｑ １／３４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
生物試料中のインフルエンザウイルスを検出する方法であって、（１）前記生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順１、
ここで、前記第一のプローブは、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成するものであり、
前記第二のプローブは、バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されないものであり、
前記第一のプローブから生成する信号と前記第二のプローブから生成する信号は光学的に区別して検出可能である、と、
（２）前記第一のプローブ及び前記第二のプローブから生成する信号を検出する手順２と、を含み、
前記第二のプローブから生成する信号の強度に対する前記第一のプローブから生成する信号の強度の比が所定値以上である場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスの存在を検出し、
前記比が前記所定値未満である場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスの不存在を検出する、検出方法。
【請求項2】
前記第二のプローブが以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩である、請求項１記載の検出方法。
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
【請求項3】
前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（4MU-NANA）である、請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項4】
前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスの存在を検出し、前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスの不存在を検出する、請求項１－３のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項5】
デジタル法に基づく、請求項１－４のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項6】
インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料中のインフルエンザウイルスを検出するためのキットであって、
インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成する第一のプローブと、
バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されない第二のプローブと、を含み、
前記第二のプローブが以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩である、キット。
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
【請求項7】
前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（4MU-NANA）である、請求項６記載のキット。
【請求項8】
以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩の、インフルエンザウイルスをバクテリアと識別検出するための使用。
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
【請求項9】
対象のインフルエンザウイルスへの感染の有無の診断を補助するための方法であって、（１）インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順１、
ここで、前記第一のプローブは、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成するものであり、
前記第二のプローブは、バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されないものであり、
前記第一のプローブから生成する信号と前記第二のプローブから生成する信号は光学的に区別して検出可能である、と、
（２）前記第一のプローブ及び前記第二のプローブから生成する信号を検出する手順２と、を含み、
前記第二のプローブから生成する信号の強度に対する前記第一のプローブから生成する信号の強度の比が所定値以上である場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの感染が示され、
前記比が前記所定値未満である場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの非感染が示される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、インフルエンザウイルス検出のための方法及びキット、並びにインフルエンザイウイルス感染の診断方法に関する。より詳しくは、インフルエンザ由来のノイラミニダーゼとバクテリア由来のノイラミニダーゼとに対して異なる反応性を示す基質を用いた、インフルエンザウイルスの検出方法等に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、イムノクロマトグラフィを用いた簡易なインフルエンザウイルス検査キットが開発されている（特許文献１参照）。イムノクロマトグラフィを用いる方法は、数分から数十分の間にインフルエンザウイルスを検出できるので、感染の診断や治療等に活用されている。
【0003】
また、従来、インフルエンザウイルスが有する酵素であるノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）と発色基質との反応に基づいて光学的にインフルエンザウイルスを検出する技術が知られている（特許文献２、３参照）。ノイラミニダーゼは、糖鎖の非還元末端からシアル酸を遊離するエキソ型糖分解酵素である。ノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルスの表面に存在し、ウイルスの増殖に関与している。発色基質としては、例えば、４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ノイラミン酸（４－Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－α－Ｄ－ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ：４ＭＵ－ＮＡＮＡ、特許文献２参照）や、４－アルコキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸又は４，７－ジアルコキシ－Ｎ－アセチルノイラミン酸の化学発光誘導体（特許文献３参照）などが用いられている。例えば、発色基質として４ＭＵ－ＮＡＮＡを用いた方法では、ノイラミニダーゼによる４ＭＵ－ＮＡＮＡの分解によって蛍光物質である４－メチルウンベリフェロンが生成する。生成した４－メチルウンベリフェロンの蛍光強度に基づいてノイラミニダーゼの酵素活性値を算出することができ、さらに酵素活性値に基づいてインフルエンザウイルスの粒子数を定量することができる。
【0004】
特許文献４には、ヒトにおいてインフルエンザがヒトインフルエンザであるかヒト病原性トリインフルエンザであるかを検出するためのキットが開示されている（実施例７参照）。このキットは、ガラクトースに結合したN-グリコリルノイラミン（NeuGcα2-3Gal）酸を含む基質と、ガラクトースに結合したN-アセチルノイラミン酸（NeuAcα2-3Gal）を含む基質とを含んでなる。これら２種類の基質と臨床検体とを接触させ、NeuAcα 2-3Galに基づいた基質のみが切断されればヒトインフルエンザウイルス陽性と判定され、NeuAcα 2-3Galに基づいた基質及びNeuGcα 2-3Galに基づいた基質の双方が切断されればヒト病原性トリインフルエンザウイルス陽性と判断される。
【0005】
特許文献５には、デジタル法によるインフルエンザウイルスの検出方法が記載されている。デジタル法では、多数の極小空間（例えば微小液滴）中に検出対象物を最大で１分子ずつ存在するように導入する。そして、各極小空間内の検出対象物を検出し、その存在を０又は１で数値化する。これによって、デジタル法では、検出対象物を高感度かつ定量的に検出することが可能である。特許文献６，７には、物質を極小空間中に封入（Enclose）するための方法であって、デジタル法に適用可能な技術が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特開２００８－２７５５１１号
【文献】特開２０１１－１３９６５６号
【文献】特表２００２－５４１８５８号
【文献】特表２００９－５１６５０２号
【文献】特開２０１８－０３８３８４号
【文献】再表２０１２－１２１３１０号
【文献】再表２０１６－００６２０８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
上部気道粘膜に常在するバクテリアには、ノイラミニダーゼを有するものがある。このため、鼻腔ぬぐい液等を試料に用いた、イラミニダーゼと基質との反応に基づくインフルエンザウイルスの検出方法では、バクテリア由来のノイラミニダーゼに起因する信号が擬陽性として検出される可能性がある。
【0008】
そこで、本発明は、インフルエンザ由来のノイラミニダーゼとバクテリア由来のノイラミニダーゼに対して異なる反応性を示す基質を用い、インフルエンザウイルスを改善された確度で検出するための技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記の課題を解決するために、本発明は、以下の［１］～［１８］を提供する。
［１］ 生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼを検出する方法であって、
（１）前記生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順１、
ここで、前記第一のプローブは、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成するものであり、
前記第二のプローブは、バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されないものであり、
前記第一のプローブから生成する信号と前記第二のプローブから生成する信号は光学的に区別して検出可能である、と、
（２）前記第一のプローブ及び前記第二のプローブから生成する信号を検出する手順２と、を含み、
（Ａ）前記第二のプローブから生成する信号の強度に対する前記第一のプローブから生成する信号の強度の比が所定値以上である場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの存在を検出し、
前記比が前記所定値未満である場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの不存在を検出する、又は、
（Ｂ）前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの存在を検出し、
前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの不存在を検出する、
検出方法。
［２］ 前記第二のプローブが以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩である、［１］の検出方法。
（式中、
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［３］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［２］の検出方法。
［４］ 前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（4MU-NANA）である、［１］－［３］のいずれかの検出方法。
［５］ 前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの存在を検出し、
前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの不存在を検出する、［１］－［４］のいずれかの検出方法。
［６］ デジタル法に基づく、［１］－［５］のいずれかの検出方法。
［１］ 生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼを検出する方法であって、
（１）前記生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順１、
ここで、前記第一のプローブは、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成するものであり、
前記第二のプローブは、バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されないものであり、
前記第一のプローブから生成する信号と前記第二のプローブから生成する信号は光学的に区別して検出可能である、と、
（２）前記第一のプローブ及び前記第二のプローブから生成する信号を検出する手順２と、を含み、
（Ａ）前記第二のプローブから生成する信号の強度に対する前記第一のプローブから生成する信号の強度の比が所定値以上である場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの存在を検出し、
前記比が前記所定値未満である場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの不存在を検出する、又は、
（Ｂ）前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの存在を検出し、
前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの不存在を検出する、
検出方法。
［２］ 前記第二のプローブが以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩である、［１］の検出方法。
【化1】
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［３］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［２］の検出方法。
［４］ 前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（4MU-NANA）である、［１］－［３］のいずれかの検出方法。
［５］ 前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの存在を検出し、
前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼの不存在を検出する、［１］－［４］のいずれかの検出方法。
［６］ デジタル法に基づく、［１］－［５］のいずれかの検出方法。
【0010】
［７］ インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料中のインフルエンザウイルスあるいはインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼを検出するためのキットであって、
インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成する第一のプローブと、
バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されない第二のプローブと、を含み、
前記第二のプローブが以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩である、キット。
（式中、
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［８］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［７］のキット。
［９］ 前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（4MU-NANA）である、［７］又は［８］のキット。
インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成する第一のプローブと、
バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されない第二のプローブと、を含み、
前記第二のプローブが以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩である、キット。
【化2】
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［８］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［７］のキット。
［９］ 前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（4MU-NANA）である、［７］又は［８］のキット。
【0011】
［１０］ 以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩の、インフルエンザウイルスあるいはインフルエンザ由来ノイラミニダーゼをバクテリアあるいはバクテリア由来ノイラミニダーゼと識別検出するための使用。
（式中、
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［１１］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［１０］の使用。
【化3】
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［１１］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［１０］の使用。
【0012】
［１２］ インフルエンザウイルスあるいはインフルエンザ由来ノイラミニダーゼをバクテリアあるいはバクテリア由来ノイラミニダーゼと識別検出するための試薬であって、以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩を含む試薬。
（式中、
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［１３］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［１２］の試薬。
【化4】
Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示し；
Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在せず；
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され；
Ｒ10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し；
ｍは、０～４の整数であり；
ｎは、１～３の整数であり；
ｓは、１の整数であり；
ｔは、０～４の整数である。）
［１３］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［１２］の試薬。
【0013】
［１４］ 対象のインフルエンザウイルスへの感染の有無を診断する方法であって、
（１）インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順１、
ここで、前記第一のプローブは、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成するものであり、
前記第二のプローブは、バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されないものであり、
前記第一のプローブから生成する信号と前記第二のプローブから生成する信号は光学的に区別して検出可能である、と、
（２）前記第一のプローブ及び前記第二のプローブから生成する信号を検出する手順２と、を含み、
（Ａ）前記第二のプローブから生成する信号の強度に対する前記第一のプローブから生成する信号の強度の比が所定値以上である場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの感染を決定すし、
前記比が前記所定値未満である場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの非感染を決定する、又は、
（Ｂ）前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの感染を決定し、
前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの非感染を決定する、
診断方法。
［１５］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［１４］の診断方法。
［１６］ 前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（4MU-NANA）である、［１４］又は［１５］の診断方法。
［１７］ 前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの感染を決定し、前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの非感染を決定する、［１４］－［１６］のいずれかの診断方法。
［１８］ デジタル法に基づく、［１４］－［１７］のいずれかの診断方法。
（１）インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順１、
ここで、前記第一のプローブは、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成するものであり、
前記第二のプローブは、バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されないものであり、
前記第一のプローブから生成する信号と前記第二のプローブから生成する信号は光学的に区別して検出可能である、と、
（２）前記第一のプローブ及び前記第二のプローブから生成する信号を検出する手順２と、を含み、
（Ａ）前記第二のプローブから生成する信号の強度に対する前記第一のプローブから生成する信号の強度の比が所定値以上である場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの感染を決定すし、
前記比が前記所定値未満である場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの非感染を決定する、又は、
（Ｂ）前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの感染を決定し、
前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの非感染を決定する、
診断方法。
［１５］ 式（１）中、Ｒ6が－ＣＨ2－ＣＦ3である、［１４］の診断方法。
［１６］ 前記第一のプローブが、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（4MU-NANA）である、［１４］又は［１５］の診断方法。
［１７］ 前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの感染を決定し、前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの非感染を決定する、［１４］－［１６］のいずれかの診断方法。
［１８］ デジタル法に基づく、［１４］－［１７］のいずれかの診断方法。
【0014】
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１～６個、好ましくは炭素数１～４個、更に好ましくは炭素数１～３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基などを挙げることができる。
【0015】
本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
【発明の効果】
【0016】
本発明により、インフルエンザウイルスを改善された確度で検出するための技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】式（１）で表される化合物の一例である「ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃ」と、４ＭＵ－ＮＡＮＡのインフルエンザウイルス又はバクテリアのノイラミニダーゼによる酵素加水分解のスキームを示す。
【図2】本発明に係るインフルエンザウイルス検出方法の手順２の一実施形態を説明するための図である。
【図3-1】本発明に係るインフルエンザウイルス検出方法の手順２の他の実施形態を説明するための図である。
【図3-2】本発明に係るインフルエンザウイルス検出方法の手順２の他の実施形態を説明するための図である。
【図3-3】本発明に係るインフルエンザウイルス検出方法の手順２の他の実施形態を説明するための図である。
【図4】アルスロバクター・ウレアファシエンス由来のノイラミニダーゼとの酵素反応に伴うＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃの蛍光強度の経時変化を示すグラフである（試験例１）。
【図5】インフルエンザイウルス由来のノイラミニダーゼとの酵素反応に伴うＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃ及び４ＭＵ－ＮＡＮＡの蛍光強度の経時変化を示すグラフである（試験例２）。
【発明を実施するための形態】
【0018】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【0019】
１．インフルエンザウイルスの検出方法及びインフルエンザ感染の診断方法
本発明に係るインフルエンザウイルス検出方法は、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼによるプローブの加水分解の有無に基づいてインフルエンザウイルスを検出するものである。したがって、本発明において、「インフルエンザウイルスの検出」と「インフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼ」の検出とは同義に用いられる。
本発明に係るインフルエンザウイルス検出方法は、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼによるプローブの加水分解の有無に基づいてインフルエンザウイルスを検出するものである。したがって、本発明において、「インフルエンザウイルスの検出」と「インフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼ」の検出とは同義に用いられる。
【0020】
本発明に係るインフルエンザウイルス検出方法は、以下の手順（ステップ）１，２を含む。
手順１：生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順。
手順２：第一のプローブ及び第二のプローブから生成する信号を検出する手順。
手順１：生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順。
手順２：第一のプローブ及び第二のプローブから生成する信号を検出する手順。
【0021】
１－１．手順１（生物試料とプローブとの混合手順）
［生物試料］
本発明において、生物試料は、インフルエンザウイルスが含まれ得る、生体由来の材料であれば特に限定されない。
生物試料としては、例えば、鼻腔吸引液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、気管ぬぐい液、唾液、喀痰、血液（全血、血清及び血漿を含む）、尿、細胞や組織、臓器の抽出液等が挙げられる。
本発明に係るインフルエンザ感染の診断方法においては、生物試料は、インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離される。
対象は、ヒトに限定されず、サル及びブタを含む哺乳類や、アヒル及びニワトリを含む鳥類であってよい。
［生物試料］
本発明において、生物試料は、インフルエンザウイルスが含まれ得る、生体由来の材料であれば特に限定されない。
生物試料としては、例えば、鼻腔吸引液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、気管ぬぐい液、唾液、喀痰、血液（全血、血清及び血漿を含む）、尿、細胞や組織、臓器の抽出液等が挙げられる。
本発明に係るインフルエンザ感染の診断方法においては、生物試料は、インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離される。
対象は、ヒトに限定されず、サル及びブタを含む哺乳類や、アヒル及びニワトリを含む鳥類であってよい。
【0022】
［プローブ１］
第一のプローブ（以下「プローブ１」と称する）は、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により加水分解されて光学的に検出可能な信号を生成する。
第一のプローブ（以下「プローブ１」と称する）は、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により加水分解されて光学的に検出可能な信号を生成する。
【0023】
本発明において、「バクテリア」（細菌）との用語は、古細菌を含む原核生物全般を指す最も広義な意味で使用されるが、特には生物試料中に常在しえる真性細菌を意味する。
鼻腔、咽喉頭、口腔及び泌尿器等には、Actinomyces, Bacteroides, Clostridium, Corynebacterium, Enterobacteriaceae, Eubacterium, Fusobacterium, Haemophilus, Lactobacillus, Micrococcus, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Peptostreptococcus,
Porphyromonas, Prevotella, Propinibacterium, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Spirohaetaceae及びVeillonella等の各属に属する多種のバクテリアが常在しており、これらのバクテリアはノイラミニダーゼを有する場合がある。
鼻腔、咽喉頭、口腔及び泌尿器等には、Actinomyces, Bacteroides, Clostridium, Corynebacterium, Enterobacteriaceae, Eubacterium, Fusobacterium, Haemophilus, Lactobacillus, Micrococcus, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Peptostreptococcus,
Porphyromonas, Prevotella, Propinibacterium, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Spirohaetaceae及びVeillonella等の各属に属する多種のバクテリアが常在しており、これらのバクテリアはノイラミニダーゼを有する場合がある。
【0024】
プローブ１は、シアル酸を含む化合物であって、インフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼ及びバクテリア由来ノイラミニダーゼの双方によりシアル酸のグリコシド結合が加水分解されて分解前の化合物とは異なる光学特性を示す反応生成物を生成するものであればよい。加水分解前のプローブ１の光学特性から、加水分解後に生成する反応生成物の光学特性への変化が、「光学的に検出可能な信号」として検出される。
ここで、光学特性への変化とは、吸光度、旋光度及び屈折率の変化や、蛍光の有無あるいは強度の変化などを意味する。
ここで、光学特性への変化とは、吸光度、旋光度及び屈折率の変化や、蛍光の有無あるいは強度の変化などを意味する。
【0025】
プローブ１として、ノイラミン酸又はその誘導体に発色団を結合した化合物が好適に用いられる。
発色団は、蛍光物質又は化学発光物質であってよいが、蛍光物質とされること好ましい。蛍光物質には、例えば４－メチルウンベリフェロン（４－Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、レゾルフィン（Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）及びローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）などの公知の物質を用いることができる。
このようなプローブ１としては、例えば、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（４ＭＵ－ＮＡＮＡ）が汎用されている。４ＭＵ－ＮＡＮＡは、インフルエンザウイルス及びバクテリアに由来するノイラミニダーゼと接触して反応すると、蛍光物質である４－メチルウンベリフェロンを遊離させる。
発色団は、蛍光物質又は化学発光物質であってよいが、蛍光物質とされること好ましい。蛍光物質には、例えば４－メチルウンベリフェロン（４－Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、レゾルフィン（Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）及びローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）などの公知の物質を用いることができる。
このようなプローブ１としては、例えば、２´－（４－メチルウンベリフェリル）－α－Ｄ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（４ＭＵ－ＮＡＮＡ）が汎用されている。４ＭＵ－ＮＡＮＡは、インフルエンザウイルス及びバクテリアに由来するノイラミニダーゼと接触して反応すると、蛍光物質である４－メチルウンベリフェロンを遊離させる。
【0026】
［プローブ２］
第二のプローブ（以下「プローブ２」と称する）は、インフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されず、バクテリア由来のノイラミニダーゼによってのみ分解されて光学的に検出可能な信号を生成する。
第二のプローブ（以下「プローブ２」と称する）は、インフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されず、バクテリア由来のノイラミニダーゼによってのみ分解されて光学的に検出可能な信号を生成する。
【0027】
プローブ２は、シアル酸を含む化合物であって、インフルエンザ由来ノイラミニダーゼにより分解されず、バクテリア由来ノイラミニダーゼによってシアル酸のグリコシド結合が加水分解されて分解前の化合物とは異なる光学特性を示す反応生成物を生成するものであればよい。加水分解前のプローブ２の光学特性から、加水分解後に生成する反応生成物の光学特性への変化が、「光学的に検出可能な信号」として検出される。
【0028】
プローブ２が生成する「光学的に検出可能な信号」は、プローブ１が生成する「光学的に検出可能な信号」とは異なるものとされる。すなわち、プローブ２が生成する信号と、プローブ１が生成する信号とは、光学的に区別して検出可能なものとされる。
具体的には、例えばプローブ１が生成する信号が、吸光度、旋光度及び屈折率の変化である場合、プローブ２が生成する信号は、蛍光の有無あるいは強度の変化であってよい。あるいは、この場合、プローブ２が生成する信号は、プローブ１が生成する信号とは異なる波長域での吸光度旋光度及び屈折率の変化であってよい。
また、例えばプローブ１が生成する信号が、蛍光の有無あるいは強度の変化である場合、プローブ２が生成する信号は、吸光度、旋光度及び屈折率の変化であってよい。あるいは、この場合、プローブ２が生成する信号は、プローブ１が生成する信号とは異なる波長域での蛍光の有無あるいは強度の変化であってよい。
具体的には、例えばプローブ１が生成する信号が、吸光度、旋光度及び屈折率の変化である場合、プローブ２が生成する信号は、蛍光の有無あるいは強度の変化であってよい。あるいは、この場合、プローブ２が生成する信号は、プローブ１が生成する信号とは異なる波長域での吸光度旋光度及び屈折率の変化であってよい。
また、例えばプローブ１が生成する信号が、蛍光の有無あるいは強度の変化である場合、プローブ２が生成する信号は、吸光度、旋光度及び屈折率の変化であってよい。あるいは、この場合、プローブ２が生成する信号は、プローブ１が生成する信号とは異なる波長域での蛍光の有無あるいは強度の変化であってよい。
【0029】
プローブ２としては、以下の式（１）で表わされる化合物又はその塩（以下、単に「化合物（１）」とも称する）が好適に用いられる。
【0030】
【化5】
【0031】
式（１）において、Ｒ1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示す。一価の置換基としては、ハロゲン、置換されていてもよいアルキル基等が挙げられる。
【0032】
ｍは、０～４の整数である。
本発明の１つの好ましい側面においては、ｍが０であり、Ｒ1存在せずに無置換のベンゼン環である。
本発明の１つの好ましい側面においては、ｍが０であり、Ｒ1存在せずに無置換のベンゼン環である。
【0033】
式（１）において、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。
Ｒ2及びＲ3がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ2又はＲ3が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ2及びＲ3がそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ2及びＲ3がともにフッ素原子であるか、塩素原子である場合がより好ましい。
Ｒ2及びＲ3がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ2又はＲ3が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ2及びＲ3がそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ2及びＲ3がともにフッ素原子であるか、塩素原子である場合がより好ましい。
【0034】
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示し、Ｒ2及びＲ3について説明したものと同様である。Ｒ4及びＲ5が共に水素原子であることが好ましい。
【0035】
Ｒ6は、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、又は炭素数１～５個のフッ化アルキル基を示す。Ｒ6のアルキル基としては、メチル基、エチル基が好ましい。Ｒ6のフッ化アルキル基としては、－ＣＨ2－ＣＦ3、－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＦ3が好ましい。
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｒ6は、－ＣＨ2－ＣＦ3である。
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｒ6は、－ＣＨ2－ＣＦ3である。
【0036】
式（１）において、Ｒ7及びＲ8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示すが、Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立に、炭素数１～３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒ7及びＲ8がともにメチル基であることがより好ましい。Ｒ7及びＲ8が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ7又はＲ8が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒ7又はＲ8がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
Ｒ7又はＲ8がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
【0037】
また、後述するＸが酸素原子の場合は、Ｒ7及びＲ8は存在しない。
【0038】
Ｒ9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数１～５個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され、好ましくは、水素原子である。
【0039】
ｓは、１の整数である。
【0040】
Ｒ10は、存在する場合、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示す。
一価の置換基としては、ハロゲン、置換されていてもよいアルキル基等が挙げられる。
一価の置換基としては、ハロゲン、置換されていてもよいアルキル基等が挙げられる。
【0041】
ｔは、０～４の整数である。
本発明の１つの好ましい側面においては、ｔが０であり、Ｒ10は存在せずに無置換のベンゼン環である。
本発明の１つの好ましい側面においては、ｔが０であり、Ｒ10は存在せずに無置換のベンゼン環である。
【0042】
Ｘは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示す。
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｘは酸素原子である。
本発明の１つの好ましい側面においては、Ｘは酸素原子である。
【0043】
ｎは、１～３の整数であり、好ましくは、ｎは１である。
【0044】
式（１）で表される化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。
酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができる。
塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。
式（１）で表される化合物は、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。
化合物（１）は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もある。
酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができる。
塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。
式（１）で表される化合物は、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。
化合物（１）は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もある。
【0045】
化合物（１）は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。
【0046】
化合物（１）の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、化合物（１）を製造することができる。
【0047】
化合物（１）は、インフルエンザ由来ノイラミニダーゼにより分解されず、バクテリア由来ノイラミニダーゼによってのみ分解されて蛍光増強を示すことが明らかとなっている（試験例１、試験例２参照）。化合物（１）の一例である「ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃ」（合成例１参照）のノイラミニダーゼによる酵素加水分解のスキームを図１に示す。
したがって、化合物（１）は、インフルエンザウイルスあるいはインフルエンザ由来ノイラミニダーゼを、バクテリアあるいはバクテリア由来ノイラミニダーゼと識別検出するための蛍光プローブとして利用できる。
本発明は、化合物（１）を含む、インフルエンザウイルスあるいはインフルエンザ由来ノイラミニダーゼをバクテリアあるいはバクテリア由来ノイラミニダーゼと識別検出するための試薬をも提供するものである。この試薬は、乾燥された化合物（１）あるいは適当な緩衝液に溶解された化合物（１）であってよい。なお、緩衝液には後述のものを適宜用いることができる。
したがって、化合物（１）は、インフルエンザウイルスあるいはインフルエンザ由来ノイラミニダーゼを、バクテリアあるいはバクテリア由来ノイラミニダーゼと識別検出するための蛍光プローブとして利用できる。
本発明は、化合物（１）を含む、インフルエンザウイルスあるいはインフルエンザ由来ノイラミニダーゼをバクテリアあるいはバクテリア由来ノイラミニダーゼと識別検出するための試薬をも提供するものである。この試薬は、乾燥された化合物（１）あるいは適当な緩衝液に溶解された化合物（１）であってよい。なお、緩衝液には後述のものを適宜用いることができる。
【0048】
生物試料、プローブ１及びプローブ２の混合は、同一又は異なる水溶性溶媒に溶解され生物試料、プローブ１及びプローブ２のそれぞれの溶液を混合することによって行うことができる。あるいは、同一の水溶性溶媒に生物試料、プローブ１及びプローブ２を溶解することにより混合してもよい。
［親水性溶媒］
親水性溶媒には、酵素の反応溶液として従来用いられているものであれば特に限定されず、例えば、水、あるいは、水に酵素反応の最適化のために必要な濃度で緩衝物質を添加したバッファー溶液が用いられる。
［親水性溶媒］
親水性溶媒には、酵素の反応溶液として従来用いられているものであれば特に限定されず、例えば、水、あるいは、水に酵素反応の最適化のために必要な濃度で緩衝物質を添加したバッファー溶液が用いられる。
【0049】
緩衝物質としては、特に限定されないが、ＭＥＳ（2-Morpholinoethanesulfonic acid）、ＡＤＡ（N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid）、ＰＩＰＥＳ（Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)）、ＡＣＥＳ（N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＢＥＳ（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＴＥＳ（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid）ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）等のいわゆるグッドバッファー（Good's Buffer）や、Ｔｒｉｓ（Tris(hydroxymethyl)aminomethane）、ＤＥＡ（Diethanolamine）等が用いられ得る。
【0050】
生物試料、プローブ１及びプローブ２の混合液は、酵素反応のために必要に応じてインキュベートされる。インキュベーションは、例えば、室温－３７℃で、数分－数十分程度である。
【0051】
１－２．手順２（信号の検出手順）
プローブ１及びプローブ２から生成する信号は、イメージセンサ、分光光度計、旋光計、分光蛍光光度計及び蛍光顕微鏡等の従来公知の機器を用いて検出し、数値化することができる。生物試料、プローブ１及びプローブ２の混合液（以下、「サンプル液」とも称する）を機器にロードし、機器の操作手順書に従って測定を行えばよい。
プローブ１及びプローブ２から生成する信号は、イメージセンサ、分光光度計、旋光計、分光蛍光光度計及び蛍光顕微鏡等の従来公知の機器を用いて検出し、数値化することができる。生物試料、プローブ１及びプローブ２の混合液（以下、「サンプル液」とも称する）を機器にロードし、機器の操作手順書に従って測定を行えばよい。
【0052】
プローブ１は、インフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼ及びバクテリア由来ノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成する。プローブ１からの信号強度をＳ１とする。
一方、プローブ２は、バクテリア由来ノイラミニダーゼによってのみ加水分解されて光学的に検出可能な信号を生成する。プローブ２からの信号強度をＳ２とする。
一方、プローブ２は、バクテリア由来ノイラミニダーゼによってのみ加水分解されて光学的に検出可能な信号を生成する。プローブ２からの信号強度をＳ２とする。
【0053】
サンプル液中に存在するノイラミニダーゼがバクテリア由来である場合（対象が非感染の場合）、プローブ１及びプローブ２の双方から信号が生成する。
一方、サンプル液中に存在するノイラミニダーゼがインフルエンザウイルス由来である場合（対象が感染の場合）、プローブ１からは信号が生成するが、プローブ２から生成する信号は理論的には０であり、プローブ２の自然分解（ノイラミニダーゼの酵素活性によらない分解）により生成する信号を考慮しても十分に小さい。
したがって、Ｓ２に対するＳ１の比（Ｓ１／Ｓ２）は、サンプル液中にバクテリア由来ノイラミニダーゼが存在する場合（対象が非感染の場合）に比べて、サンプル液中にインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼが存在する場合（対象が感染の場合）では、より大きくなる。
すなわち、プローブ１から生成する信号の強度Ｓ１に対するプローブ２から生成する信号の強度Ｓ２の比（Ｓ１／Ｓ２）が所定値（閾値）以上であれば、サンプル液中にインフルエンザウイルスが存在する（対象がインフルエンザウイルスに感染している）と検出できる。
一方、比（Ｓ１／Ｓ２）が閾値未満であれば、サンプル液中にインフルエンザウイルスが存在しない（対象がインフルエンザウイルスに感染していない）と検出できる。
これにより、生物試料中に存在するノイラミニダーゼがインフルエンザウイルス由来のものであるかバクテリア由来のものであるかを明確に区別して、バクテリア由来ノイラミニダーゼに起因する信号を擬陽性として検出することなく、インフルエンザウイルスを高確度に検出することができる。
一方、サンプル液中に存在するノイラミニダーゼがインフルエンザウイルス由来である場合（対象が感染の場合）、プローブ１からは信号が生成するが、プローブ２から生成する信号は理論的には０であり、プローブ２の自然分解（ノイラミニダーゼの酵素活性によらない分解）により生成する信号を考慮しても十分に小さい。
したがって、Ｓ２に対するＳ１の比（Ｓ１／Ｓ２）は、サンプル液中にバクテリア由来ノイラミニダーゼが存在する場合（対象が非感染の場合）に比べて、サンプル液中にインフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼが存在する場合（対象が感染の場合）では、より大きくなる。
すなわち、プローブ１から生成する信号の強度Ｓ１に対するプローブ２から生成する信号の強度Ｓ２の比（Ｓ１／Ｓ２）が所定値（閾値）以上であれば、サンプル液中にインフルエンザウイルスが存在する（対象がインフルエンザウイルスに感染している）と検出できる。
一方、比（Ｓ１／Ｓ２）が閾値未満であれば、サンプル液中にインフルエンザウイルスが存在しない（対象がインフルエンザウイルスに感染していない）と検出できる。
これにより、生物試料中に存在するノイラミニダーゼがインフルエンザウイルス由来のものであるかバクテリア由来のものであるかを明確に区別して、バクテリア由来ノイラミニダーゼに起因する信号を擬陽性として検出することなく、インフルエンザウイルスを高確度に検出することができる。
【0054】
閾値は、プローブ１及びプローブ２として用いられる化合物、それらの光学特性、及び生物試料中に存在しえるバクテリアの種類などに応じて適宜設定されえる。例えば、閾値は、サンプル液中にバクテリア由来ノイラミニダーゼが存在する場合の比（Ｓ１／Ｓ２）の1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍以上に設定できる。
【0055】
プローブ２の自然分解（ノイラミニダーゼの酵素活性によらない分解）が生じないあるいは無視可能な程度である場合、サンプル液中に存在するノイラミニダーゼがインフルエンザウイルス由来である場合（対象が感染の場合）に、プローブ２から生成する信号は０である。この場合には、プローブ１から生成する信号の強度Ｓ１に対するプローブ２から生成する信号の強度Ｓ２の比（Ｓ１／Ｓ２）によらずに、インフルエンザウイルスの検出を行うこともできる。
すなわち、プローブ１から生成する信号が検出され、プローブ２から生成する信号が検出されない場合に、サンプル液中のインフルエンザウイルスの存在（対象のインフルエンザ感染）を検出し、プローブ１から生成する信号及びプローブ２から生成する信号が検出された場合には、サンプル液中のインフルエンザウイルスの不存在（対象のインフルエンザウイルス非感染）を検出することができる。
すなわち、プローブ１から生成する信号が検出され、プローブ２から生成する信号が検出されない場合に、サンプル液中のインフルエンザウイルスの存在（対象のインフルエンザ感染）を検出し、プローブ１から生成する信号及びプローブ２から生成する信号が検出された場合には、サンプル液中のインフルエンザウイルスの不存在（対象のインフルエンザウイルス非感染）を検出することができる。
【0056】
１－２－１．デジタル法に基づく検出１
手順２にデジタル法を適用した実施形態を説明する。
デジタル法では、多数の極小空間（例えば微小液滴）中に検出対象物を最大で１分子ずつ存在するように導入する。そして、各極小空間内の検出対象物を検出し、その存在を０又は１で数値化する。これによって、デジタル法では、検出対象物を高感度かつ定量的に検出することが可能である。
手順２にデジタル法を適用した実施形態を説明する。
デジタル法では、多数の極小空間（例えば微小液滴）中に検出対象物を最大で１分子ずつ存在するように導入する。そして、各極小空間内の検出対象物を検出し、その存在を０又は１で数値化する。これによって、デジタル法では、検出対象物を高感度かつ定量的に検出することが可能である。
【0057】
本実施形態に係る手順２は、以下の手順２Ａ１～２Ａ３を含む。
手順２Ａ１：インフルエンザウイルス及びバクテリアを収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する隔壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、当該下層部における当該収容部が形成されている面に対向している上層部との間の空間に、サンプル液を導入する手順。
手順２Ａ２：前記空間に疎水性溶媒を導入して、前記収容部内に、疎水性溶媒で被覆されかつインフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを包含する、サンプル液の液滴を形成する手順と、
手順２Ａ３：前記液滴中でプローブ１及びプローブ２から生成する信号を検出する手順。
手順２Ａ１：インフルエンザウイルス及びバクテリアを収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する隔壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、当該下層部における当該収容部が形成されている面に対向している上層部との間の空間に、サンプル液を導入する手順。
手順２Ａ２：前記空間に疎水性溶媒を導入して、前記収容部内に、疎水性溶媒で被覆されかつインフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを包含する、サンプル液の液滴を形成する手順と、
手順２Ａ３：前記液滴中でプローブ１及びプローブ２から生成する信号を検出する手順。
【0058】
１－２－１－１．導入手順２Ａ１
図２Ａを参照して導入手順２Ａ１を説明する。
アレイ１０１は、下層部１１１と上層部１２１が空間１３１を隔てて対向して配置されており、空間１３１を流体流路とするフローセル構造を有している。
下層部１１１には、インフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを収容可能な収容部１１４が複数形成されている。収容部１１４は、疎水性の上面を有する隔壁１１３によって互いに隔てられている。
また、上層部１２１は、空間１３１を隔てて、下層部１１１における収容部１１４が形成されている面に対向している。
図２Ａを参照して導入手順２Ａ１を説明する。
アレイ１０１は、下層部１１１と上層部１２１が空間１３１を隔てて対向して配置されており、空間１３１を流体流路とするフローセル構造を有している。
下層部１１１には、インフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを収容可能な収容部１１４が複数形成されている。収容部１１４は、疎水性の上面を有する隔壁１１３によって互いに隔てられている。
また、上層部１２１は、空間１３１を隔てて、下層部１１１における収容部１１４が形成されている面に対向している。
【0059】
本手順では、空間１３１にサンプル液４を導入する。サンプル液４には、プローブ１とプローブ２が含まれる。また、サンプル液４には、インフルエンザウイルス又はバクテリア３が含まれえる。サンプル液４は、例えば上層部１２１及び下層部１１１の少なくとも一方に形成されている貫通孔（図示せず）から空間１３１内に導入することができる。空間１３１内に導入されたサンプル液４は、毛細管現象に従って空間１３１を通流し、空間１３１内に充填される。
【0060】
［界面活性剤］
サンプル液４には、界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤を添加することで、サンプル液４が、空間１３１内及び収容部１１４内へ導入され易くなる傾向がある。
サンプル液４には、界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤を添加することで、サンプル液４が、空間１３１内及び収容部１１４内へ導入され易くなる傾向がある。
【0061】
界面活性剤としては、特に限定されないが、例えばＴＷＥＥＮ２０（ＣＡＳ番号：9005-64-5、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＣＡＳ番号：9002-93-1、一般名ポリエチレングリコールモノ－４－オクチルフェニルエーテル（n≒10））などが挙げられる。サンプル液４への界面活性剤の添加濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．０１～１％である。
【0062】
さらに、界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性イオン界面活性剤、天然由来の界面活性剤などを広く用いることができる。
【0063】
陰イオン性界面活性剤としては、例えば、カルボン酸型、硫酸エステル型、スルホン酸型、リン酸エステル型に分類される。このうち、具体的には、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、α-スルホ脂肪酸メチルエステルナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルエトキシレート硫酸ナトリウムなどが挙げられ、中でも、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを用いることが好ましい。
【0064】
陽イオン性界面活性剤としては、例えば、第四級アンモニウム塩型、アルキルアミン型、複素環アミン型に分類される。具体的には、例えば、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、ジステアリルジメチルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、セチルトリピリジニウムクロライド、ドデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライドなどが挙げられる。
【0065】
非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレンモノ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、アルキルポリグリコシド、N-メチルアルキルグルカミドなどが挙げられる。中でも、ドデシルアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、ラウロイルジエタノールアマイドの他、Triton X（Triton X-100など）、Pluronic（登録商標）（Pluronic F-123、F-68など）、Tween (Tween 20、40、60、65、80、85など)、Brij（登録商標）（Brij 35、58、98など）、Span (Span 20、40、60、80、83、85)の名前で市販されているものが好ましい。
【0066】
両性界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ドデシルアミノメチルジメチルスルホプロピルベタイン、3-(テトラデシルジメチルアミニオ)プロパン-1-スルホナートなどがあるが、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート（CHAPS）、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホナート（CHAPSO）などを用いることが好ましい。
【0067】
天然由来の界面活性剤としては、例えば、レシチン、サポニンが好ましく、レシチンとして称される化合物のうち、具体的には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロールなどが好ましい。また、サポニンとしてはキラヤサポニンが好ましい。
【0068】
本手順により、プローブ１、プローブ２、及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３が収容部１１４に導入される。サンプル液４においてインフルエンザウイルス又はバクテリアが十分に低い濃度に希釈されている場合、１つの収容部１１４に入るインフルエンザウイルス又はバクテリア３の数は０又は最大で１となり得る。サンプル液４においてインフルエンザウイルス又はバクテリアの濃度がより高い場合には、１つの収容部１１４には２以上のウイルス２が導入されえる。
【0069】
１－２－１－２．封入手順２Ａ２
図２Ｂを参照して封入手順２Ａ２を説明する。本手順では、下層部１１１と上層部１２１との間の空間１３１に疎水性溶媒５を導入する。
図２Ｂを参照して封入手順２Ａ２を説明する。本手順では、下層部１１１と上層部１２１との間の空間１３１に疎水性溶媒５を導入する。
【0070】
疎水性溶媒５は、サンプル液４と混ざり合いにくい溶媒（非混和性の溶媒）であればよく、親水性溶媒であるサンプル液４に対して疎水性溶媒が好適に用いられる。
疎水性溶媒５として、例えば飽和炭化水素、不飽和炭化水素、芳香族炭化水素、シリコーンオイル、パーフルオロカーボン、ハロゲン系溶媒、及び疎水性イオン液体からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物等を好適に用いることができる。飽和炭化水素としては、例えばアルカン、シクロアルカンなどが挙げられる。アルカンとしては、例えばデカン、ヘキサデカン等が挙げられる。不飽和炭化水素としては、例えばスクアレン等が挙げられる。芳香族炭化水素としては、例えばベンゼン、トルエン等が挙げられる。パーフルオロカーボンとしては、例えばフロリナート（登録商標）ＦＣ４０（SIGMA社製）等が挙げられる。ハロゲン系溶媒としては、例えばクロロホルム、塩化メチレン、クロロベンゼン等が挙げられる。疎水性イオン液体とは少なくとも水中では解離しないイオン液体をさし、例えば１―Ｂｕｔｙｌ―３―ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ
Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ等が挙げられる。イオン液体とは、室温において液体で存在する塩をさす。
疎水性溶媒５として、例えば飽和炭化水素、不飽和炭化水素、芳香族炭化水素、シリコーンオイル、パーフルオロカーボン、ハロゲン系溶媒、及び疎水性イオン液体からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物等を好適に用いることができる。飽和炭化水素としては、例えばアルカン、シクロアルカンなどが挙げられる。アルカンとしては、例えばデカン、ヘキサデカン等が挙げられる。不飽和炭化水素としては、例えばスクアレン等が挙げられる。芳香族炭化水素としては、例えばベンゼン、トルエン等が挙げられる。パーフルオロカーボンとしては、例えばフロリナート（登録商標）ＦＣ４０（SIGMA社製）等が挙げられる。ハロゲン系溶媒としては、例えばクロロホルム、塩化メチレン、クロロベンゼン等が挙げられる。疎水性イオン液体とは少なくとも水中では解離しないイオン液体をさし、例えば１―Ｂｕｔｙｌ―３―ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ
Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ等が挙げられる。イオン液体とは、室温において液体で存在する塩をさす。
【0071】
疎水性溶媒５も、サンプル液４と同様に、上層部１２１及び下層部１１１の少なくとも一方に形成されている貫通孔（図示せず）から空間１３１内に導入すればよい。空間１３１内に導入された疎水性溶媒５は、毛細管現象に従って空間１３１を通流し、空間１３１内のサンプル液４と置換する。置換されたサンプル液４は、空間１３１外に排出される。これにより、収容部１１４内に、疎水性溶媒５で被覆されかつプローブ１、プローブ２、及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３を包含する、サンプル液４の液滴が形成される。
【0072】
この液滴の容積（収容部１１４の容積にほぼ等しい）は、極小であってよく、例えば１０ａＬ～１００ｎＬ、好ましくは１ｆＬ～１ｐＬとされる。
サンプル液４の液滴の極小容積中で、インフルエンザウイルス又はバクテリアのノイラミニダーゼとプローブ１及びプローブ２との反応が進行する。
サンプル液４の液滴の極小容積中で、インフルエンザウイルス又はバクテリアのノイラミニダーゼとプローブ１及びプローブ２との反応が進行する。
【0073】
［脱気］
導入手順２Ａ１と封入手順２Ａ２との間に、空間１３１内の脱気を行ってもよい。脱気方法としては、例えば、アレイ１０１を減圧環境下において放置する方法、あるいはアレイ１０１を冷却する方法等を好適に用いることができる。具体的には、約０．１気圧の減圧デシケータ内にアレイ１０１を約３０秒放置する方法などである。
導入手順２Ａ１と封入手順２Ａ２との間に、空間１３１内の脱気を行ってもよい。脱気方法としては、例えば、アレイ１０１を減圧環境下において放置する方法、あるいはアレイ１０１を冷却する方法等を好適に用いることができる。具体的には、約０．１気圧の減圧デシケータ内にアレイ１０１を約３０秒放置する方法などである。
【0074】
本発明において、脱気手順は必須ではないが、脱気を行なうことにより、収容部１１４内の空気が除去され、プローブ１、プローブ２、及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３を収容部１１４内に効率よく導入できる。
【0075】
１－２－１－３．検出手順２Ａ３
本手順では、サンプル液４の液滴中で生成したプローブ１及びプローブ２からの信号が検出される。
本手順では、サンプル液４の液滴中で生成したプローブ１及びプローブ２からの信号が検出される。
【0076】
上述の通り、サンプル液４において、インフルエンザウイルス又はバクテリアが十分に低い濃度に希釈されている場合、１つの収容部１１４に入るインフルエンザウイルス又はバクテリア３の数は０又は最大で１となるので、収容部１１４にはインフルエンザウイルス及びバクテリアのどちらか一方が封入された液滴が形成される。
各液滴においてプローブ１から生成する信号が検出され、プローブ２から生成する信号が検出されない場合（図２Ｃ左図参照）に、当該液滴中にインフルエンザウイルスを検出できる。一方、プローブ１から生成する信号及びプローブ２から生成する信号が検出された場合（図２Ｃ右図参照）には、当該液滴中にバクテリアの存在（インフルエンザウイルスの不存在）を検出できる。
プローブ１に４ＭＵ－ＮＡＮＡを、プローブ２に化合物（１）としてＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃを用いたデジタル法において、インフルエンザウイルスが封入された液滴から生じた４－メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の蛍光をCCDカメラにより検出したイメージの一例を図２Ｄ左図に示す。検出領域に信号陽性の液滴が２つ確認できる。インフルエンザウイルスが存在する液滴から４ＭＵが発する青色蛍光（波長443 nm）が検出されている。液滴にバクリテリアが存在する場合には、４ＭＵが発する青色蛍光（波長443 nm）とＨＭＲｅｆが発する緑色蛍光（波長：518ｎｍ）が検出される。図２Ｄ右図は、信号陽性の液滴が存在しない領域を撮像したイメージの一例である。
各液滴においてプローブ１から生成する信号が検出され、プローブ２から生成する信号が検出されない場合（図２Ｃ左図参照）に、当該液滴中にインフルエンザウイルスを検出できる。一方、プローブ１から生成する信号及びプローブ２から生成する信号が検出された場合（図２Ｃ右図参照）には、当該液滴中にバクテリアの存在（インフルエンザウイルスの不存在）を検出できる。
プローブ１に４ＭＵ－ＮＡＮＡを、プローブ２に化合物（１）としてＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃを用いたデジタル法において、インフルエンザウイルスが封入された液滴から生じた４－メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の蛍光をCCDカメラにより検出したイメージの一例を図２Ｄ左図に示す。検出領域に信号陽性の液滴が２つ確認できる。インフルエンザウイルスが存在する液滴から４ＭＵが発する青色蛍光（波長443 nm）が検出されている。液滴にバクリテリアが存在する場合には、４ＭＵが発する青色蛍光（波長443 nm）とＨＭＲｅｆが発する緑色蛍光（波長：518ｎｍ）が検出される。図２Ｄ右図は、信号陽性の液滴が存在しない領域を撮像したイメージの一例である。
【0077】
インフルエンザウイルスが検出された収容部１１４の数と、インフルエンザウイルスが検出されない収容部１１４の数との比率を用いて、予め作成した当該比率とウイルス粒子数との関係を規定した標準曲線に基づいて、インフルエンザウイルス量を定量的に決定することもできる（デジタル定量）。
なお、インフルエンザウイルスが検出された収容部１１４が１つでも存在すれば、被検試料についてインフルエンザ陽性と判定してよい。このような判定方法は、検体中のインフルエンザウイルスの数が極めて少ない感染初期の場合にインフルエンザの罹患の有無を判定するため有用である。
なお、インフルエンザウイルスが検出された収容部１１４が１つでも存在すれば、被検試料についてインフルエンザ陽性と判定してよい。このような判定方法は、検体中のインフルエンザウイルスの数が極めて少ない感染初期の場合にインフルエンザの罹患の有無を判定するため有用である。
【0078】
１－２－２．デジタル法に基づく検出２
手順２にデジタル法を適用した他の実施形態を説明する。
本実施形態に係る手順２は、以下の手順２Ｂ１～２Ｂ３を含む。
手順２Ｂ１：インフルエンザウイルス及びバクテリアを収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する隔壁によって互いに隔てられて形成されている基板上に、サンプル液を導入する手順。
手順２Ｂ２：サンプル液よりも比重が大きい疎水性溶媒をサンプル液層の上に積層するようにして導入し、サンプル液層と疎水性溶媒層との層置換を生じさせることにより、前記収容部内に、疎水性溶媒で被覆されかつインフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを包含する、サンプル液の液滴を形成する手順。
手順２Ｂ３：前記液滴中でプローブ１及びプローブ２から生成する信号を検出する検出手順。
手順２にデジタル法を適用した他の実施形態を説明する。
本実施形態に係る手順２は、以下の手順２Ｂ１～２Ｂ３を含む。
手順２Ｂ１：インフルエンザウイルス及びバクテリアを収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する隔壁によって互いに隔てられて形成されている基板上に、サンプル液を導入する手順。
手順２Ｂ２：サンプル液よりも比重が大きい疎水性溶媒をサンプル液層の上に積層するようにして導入し、サンプル液層と疎水性溶媒層との層置換を生じさせることにより、前記収容部内に、疎水性溶媒で被覆されかつインフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを包含する、サンプル液の液滴を形成する手順。
手順２Ｂ３：前記液滴中でプローブ１及びプローブ２から生成する信号を検出する検出手順。
【0079】
１－２－２－１．導入手順２Ｂ１
図３－１～図３－３を参照して導入手順２Ｂ１を説明する。図は、アレイ２０１の側方断面図である。
アレイ２０１は、下層部２１１を含んでなる。アレイ２０１は、下層部２１１と側壁２２１，２２１によって下方及び両側方を区画されておりかつ上方が開放されている領域２１を有する。すなわち、下層部２１１と側壁２２１，２２１は、上方に開口を有する開口ウェルを形成している。当該開口ウェル内の空間を、図中、領域２１として示す。
下層部２１１には、インフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを収容可能な収容部２１４が複数形成されている。収容部２１４は、疎水性の上面を有する隔壁２１３によって互いに隔てられている。下層部２１１は、それに対向する面を有さない。
図３－１～図３－３を参照して導入手順２Ｂ１を説明する。図は、アレイ２０１の側方断面図である。
アレイ２０１は、下層部２１１を含んでなる。アレイ２０１は、下層部２１１と側壁２２１，２２１によって下方及び両側方を区画されておりかつ上方が開放されている領域２１を有する。すなわち、下層部２１１と側壁２２１，２２１は、上方に開口を有する開口ウェルを形成している。当該開口ウェル内の空間を、図中、領域２１として示す。
下層部２１１には、インフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを収容可能な収容部２１４が複数形成されている。収容部２１４は、疎水性の上面を有する隔壁２１３によって互いに隔てられている。下層部２１１は、それに対向する面を有さない。
【0080】
本手順では、下層部２１１上にサンプル液４を導入する。サンプル液４には、プローブ１とプローブ２が含まれる。また、サンプル液４には、インフルエンザウイルス又はバクテリア３が含まれえる。サンプル液は、例えば、開口ウェルの開口から領域２１内に導入することができる。
【0081】
サンプル液４には、界面活性剤を添加してもよい。界面活性剤を添加することで、次に説明する封入手順における、サンプル液４と疎水性溶媒との置換を促進できる。界面活性剤には、上述のものを用いることができる。
【0082】
１－２－２－２．封入手順２Ｂ２
図３－１～図３－３Ｂ－Ｈを参照して封入手順２Ｂ２を説明する。本手順では、疎水性溶媒５をサンプル液４の層の上に積層するようにして導入する。
疎水性溶媒５の導入方法としては、特に限定されないが、例えば、開口ウェルの開口から領域２１内に導入することができる。この際、疎水性溶媒５は、図３－１Ｂに示すように、サンプル液４の層上に疎水性溶媒５の層が積層されるようにして導入することが好ましい。
図３－１～図３－３Ｂ－Ｈを参照して封入手順２Ｂ２を説明する。本手順では、疎水性溶媒５をサンプル液４の層の上に積層するようにして導入する。
疎水性溶媒５の導入方法としては、特に限定されないが、例えば、開口ウェルの開口から領域２１内に導入することができる。この際、疎水性溶媒５は、図３－１Ｂに示すように、サンプル液４の層上に疎水性溶媒５の層が積層されるようにして導入することが好ましい。
【0083】
疎水性溶媒５には、サンプル液４よりも比重が大きい溶媒が用いられる。また、疎水性溶媒５には、サンプル液４と層置換をしえる程度に相互に親媒性を有するものであることが好ましいが、互いに相溶しないことが必要である。サンプル液４と疎水性溶媒５との間の親媒性が低すぎると、サンプル液４と疎水性溶媒５との層置換が生じない。また、サンプル液４と疎水性溶媒５とが互いに相溶する場合には、サンプル液４と疎水性溶媒５とが層分離せず、積層状態が生じない。このような疎水性溶媒として、上述のものを用いることができる。「表１」に例示的な疎水性溶媒５の比重を挙げる。
疎水性溶媒５は、サンプル液４と同様に、層置換を促進するために界面活性剤を含んでいてもよい。
疎水性溶媒５は、サンプル液４と同様に、層置換を促進するために界面活性剤を含んでいてもよい。
【0084】
【表1】
【0085】
サンプル液４上に導入され積層された疎水性溶媒５は、サンプル液４よりも比重が大きいため、サンプル液４の下方に移動する。すなわち、サンプル液４の層と疎水性溶媒５の層とが置換されて、上層が疎水性溶媒５で下層がサンプル液４となった状態（図３－１Ｂ参照）から上層がサンプル液４で下層が疎水性溶媒５となった状態（図３－３Ｈ参照）となる。層置換を生じる様子を図３－１Ｃ～図３－３Ｇに模式的に示す。この層置換において、プローブ１、プローブ２、及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３が、サンプル液４の下方へ移動していく疎水性溶媒５によって押し込まれるようにして収容部２１４の各々に収容されていく（図３－２Ｄ～Ｆ参照）。その結果、収容部２１４内に、疎水性溶媒５で被覆されかつプローブ１、プローブ２及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３を包含する、サンプル液４の液滴が形成される。
【0086】
この液滴の容積（収容部２１４の容積にほぼ等しい）は、極小であってよく、例えば１０ａＬ～１００ｎＬ、好ましくは１ｆＬ～１ｐＬとされる。
サンプル液４の液滴の極小容積中で、インフルエンザウイルス又はバクテリアのノイラミニダーゼとプローブ１及びプローブ２との反応が進行する。
サンプル液４の液滴の極小容積中で、インフルエンザウイルス又はバクテリアのノイラミニダーゼとプローブ１及びプローブ２との反応が進行する。
【0087】
１－２－２－３．検出手順２Ｂ３
本手順では、サンプル液４の液滴中で生成したプローブ１及びプローブ２からの信号が検出される。
本手順では、サンプル液４の液滴中で生成したプローブ１及びプローブ２からの信号が検出される。
【0088】
上述の通り、サンプル液４において、インフルエンザウイルス又はバクテリアが十分に低い濃度に希釈されている場合、１つの収容部２１４に入るインフルエンザウイルス又はバクテリア３の数は０又は最大で１となるので、収容部２１４にはインフルエンザウイルス及びバクテリアのどちらか一方が封入された液滴が形成される。
各液滴においてプローブ１から生成する信号が検出され、プローブ２から生成する信号が検出されない場合に、当該液滴中にインフルエンザウイルスを検出できる。一方、プローブ１から生成する信号及びプローブ２から生成する信号が検出された場合には、当該液滴中にバクテリアの存在（インフルエンザウイルスの不存在）を検出できる。
各液滴においてプローブ１から生成する信号が検出され、プローブ２から生成する信号が検出されない場合に、当該液滴中にインフルエンザウイルスを検出できる。一方、プローブ１から生成する信号及びプローブ２から生成する信号が検出された場合には、当該液滴中にバクテリアの存在（インフルエンザウイルスの不存在）を検出できる。
【0089】
インフルエンザウイルスが検出された収容部２１４の数と、インフルエンザウイルスが検出されない収容部２１４の数との比率を用いて、予め作成した当該比率とウイルス粒子数との関係を規定した標準曲線に基づいて、インフルエンザウイルス量を定量的に決定することもできる（デジタル定量）。
【0090】
２．インフルエンザウイルスの検出キット及びインフルエンザ感染の診断キット
本発明に係るインフルエンザウイルスの検出キットは、インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料中のインフルエンザウイルスを検出するためのキットである。本発明に係るインフルエンザウイルスの検出キットは、対象におけるインフルエンザ感染の有無の診断に用いられる。本発明に係るインフルエンザウイルスの検出キットは、上述のプローブ１及びプローブ２を含んでなるものであり、これらに加えて任意に上述した疎水性溶媒、及び、アレイ１０１又はアレイ２０１を含んでいてよい。これらのキット構成要素（コンポーネント）は、ひとまとまりで販売されるものであってよく、それぞれ単独で販売されるものであってもよい。
本発明に係るインフルエンザウイルスの検出キットは、インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料中のインフルエンザウイルスを検出するためのキットである。本発明に係るインフルエンザウイルスの検出キットは、対象におけるインフルエンザ感染の有無の診断に用いられる。本発明に係るインフルエンザウイルスの検出キットは、上述のプローブ１及びプローブ２を含んでなるものであり、これらに加えて任意に上述した疎水性溶媒、及び、アレイ１０１又はアレイ２０１を含んでいてよい。これらのキット構成要素（コンポーネント）は、ひとまとまりで販売されるものであってよく、それぞれ単独で販売されるものであってもよい。
【0091】
プローブ１、プローブ２及び疎水性溶媒については上述のとおりである。アレイ１０１及びアレイ２０１について、以下により詳しい構造を説明する。
アレイ１０１及びアレイ２０１の作製のためのフォトリソグラフィー、エッチング、基板積層などの技術は、汎用のマイクロチップやアレイを作成するための技術を適用できる。
アレイ１０１及びアレイ２０１の作製のためのフォトリソグラフィー、エッチング、基板積層などの技術は、汎用のマイクロチップやアレイを作成するための技術を適用できる。
【0092】
［アレイ１０１］
上層部１２１の材質は、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等とできる。
上層部１２１の厚みは、特に限定されない。
上層部１２１の下面（空間１３１に臨む面）は、疎水性であることが好ましい。「疎水性」とは、ここでは「親油性」と同じ意味で用いられ、疎水性溶媒との親和性が親水性溶媒との親和性よりも高いことをいう。
上層部１２１の材質は、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等とできる。
上層部１２１の厚みは、特に限定されない。
上層部１２１の下面（空間１３１に臨む面）は、疎水性であることが好ましい。「疎水性」とは、ここでは「親油性」と同じ意味で用いられ、疎水性溶媒との親和性が親水性溶媒との親和性よりも高いことをいう。
【0093】
下層部１１１において、収容部１１４は、板状部材１１２上に形成された隔壁１１３によって互いに隔てられている。収容部１１４の底面は、板状部材１１２の表面であってよい。
板状部材１１２の材質は、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等とできる。
板状部材１１２の厚みは、特に限定されない。
板状部材１１２の材質は、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等とできる。
板状部材１１２の厚みは、特に限定されない。
【0094】
隔壁１１３は、板状部材１１２の表面に形成した樹脂層により形成でき、例えば撥水性の樹脂又はフッ素系高分子樹脂等のエッチングにより形成できる。フッ素系高分子樹脂としては、例えばアモルファスフッ素樹脂等が挙げられる。アモルファスフッ素樹脂は、高い疎水性を有し、かつ、生体試料に対する毒性が低いという理由で、好ましく用いられる。
上記アモルファスフッ素樹脂としては、例えば、ＣＹＴＯＰ（登録商標）、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ２４００、およびＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ１６００から選択した少なくとも１つを好適に用いることができる。中でも、微細加工が容易であるという理由で、ＣＹＴＯＰ（登録商標）が最も好ましい。
上記アモルファスフッ素樹脂としては、例えば、ＣＹＴＯＰ（登録商標）、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ２４００、およびＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ１６００から選択した少なくとも１つを好適に用いることができる。中でも、微細加工が容易であるという理由で、ＣＹＴＯＰ（登録商標）が最も好ましい。
【0095】
収容部１１４の形状は、特に限定されず、例えば円柱形状及び角柱形状等であってよい。
収容部１１４の大きさは、インフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを収容可能であれば特に限定されないが、水平方向の幅及び垂直方向の高さ（隔壁１１３の高さ）は、それぞれ、例えば１００ｎｍ－１００μｍ、２００ｎｍ－９０μｍ、３００ｎｍ－８０μｍ、４００ｎｍ－７０μｍ、５００ｎｍ－６０μｍ、６００ｎｍ－５０μｍ、７００ｎｍ－４０μｍ、８００ｎｍ－３０μｍ、９００ｎｍ－２０μｍ、１０００ｎｍ－１０μｍ、２μｍ－９μｍ、３μｍ－８μｍの範囲である。
収容部１１４は、例えば１００万個以上が高密度に配置されていてよい。このような超高密度アレイであっても、先に説明した封入手順によれば、疎水性溶媒５で被覆されかつプローブ１、プローブ２、及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３を包含する、サンプル液４の液滴を各収容部１１４に効率よく形成できる。
収容部１１４の大きさは、インフルエンザウイルス及び／又はバクテリアを収容可能であれば特に限定されないが、水平方向の幅及び垂直方向の高さ（隔壁１１３の高さ）は、それぞれ、例えば１００ｎｍ－１００μｍ、２００ｎｍ－９０μｍ、３００ｎｍ－８０μｍ、４００ｎｍ－７０μｍ、５００ｎｍ－６０μｍ、６００ｎｍ－５０μｍ、７００ｎｍ－４０μｍ、８００ｎｍ－３０μｍ、９００ｎｍ－２０μｍ、１０００ｎｍ－１０μｍ、２μｍ－９μｍ、３μｍ－８μｍの範囲である。
収容部１１４は、例えば１００万個以上が高密度に配置されていてよい。このような超高密度アレイであっても、先に説明した封入手順によれば、疎水性溶媒５で被覆されかつプローブ１、プローブ２、及びインフルエンザウイルス又はバクテリア３を包含する、サンプル液４の液滴を各収容部１１４に効率よく形成できる。
【0096】
隔壁１１３の上面（上層部１２１と対向する面）は、疎水性とされることが好ましい。また、収容部１１４の底面を形成する板状部材１１２の表面は親水性であることが好ましい。「親水性」とは、親水性溶媒との親和性が疎水性溶媒との親和性よりも高い表面を指す。
収容部１１４の底面が親水性であり、かつ隔壁１１３の上面及び上層部１２１の下面が疎水性であることにより、導入手順２Ａ１において、サンプル液４を円滑に収容部１１４内に導入することができる。また、収容部１１４の底面が親水性であり、かつ隔壁１１３の上面が疎水性であることにより、封入手順２Ａ２において疎水性溶媒５が収容部１１４内に入り込むことを防止できる。
なお、隔壁１１３は、その上面が疎水性であればよく、その側面（収容部１１４に臨む面）は、疎水性であっても親水性であってもよい。
収容部１１４の底面が親水性であり、かつ隔壁１１３の上面及び上層部１２１の下面が疎水性であることにより、導入手順２Ａ１において、サンプル液４を円滑に収容部１１４内に導入することができる。また、収容部１１４の底面が親水性であり、かつ隔壁１１３の上面が疎水性であることにより、封入手順２Ａ２において疎水性溶媒５が収容部１１４内に入り込むことを防止できる。
なお、隔壁１１３は、その上面が疎水性であればよく、その側面（収容部１１４に臨む面）は、疎水性であっても親水性であってもよい。
【0097】
上層部１２１の下面（空間１３１に臨む面）と隔壁１１３の上面（上層部１２１と対向する面）との間の距離（空間１３１の高さ）は、毛細管現象に従って液体を空間１３１内に通流させえる程度に小さくされる。空間１３１の高さは、例えば０．１μｍ－５ｍｍ、０．５μｍ－４ｍｍ、１μｍ－３ｍｍ、２μｍ－２ｍｍ、５μｍ－１ｍｍ、１０μｍ－５００μｍ、２０μｍ－４００μｍ、３０μｍ－３００μｍ、４０μｍ－２００μｍ、５０μｍ－１００μｍの範囲である。高さが０．１μｍ未満では、空間１３１内に液体を通流させるのに要する送液圧が高くなりすぎる可能性がある。
【0098】
［アレイ２０１］
アレイ２０１の下層部２１１は、アレイ１０１の下層部１１１と同様の構成であってよく、下層部２１１を構成する板状部材２１２及び隔壁２１３も、アレイ１０１の板状部材１１２及び隔壁１１３と同様の構成であってよい。
また、収容部２１４も、アレイ１０１の収容部１１４と同様の構成であってよい。
アレイ２０１の下層部２１１は、アレイ１０１の下層部１１１と同様の構成であってよく、下層部２１１を構成する板状部材２１２及び隔壁２１３も、アレイ１０１の板状部材１１２及び隔壁１１３と同様の構成であってよい。
また、収容部２１４も、アレイ１０１の収容部１１４と同様の構成であってよい。
【0099】
側壁２２１は、板状部材２１２と同様の材質であって、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等からなる部材の表面であってよい。
側壁２２１の高さは、任意であるが、サンプル液４の層と疎水性溶媒５の層とが積層された状態での合計の厚みを上回る必要がある。
側壁２２１の高さは、任意であるが、サンプル液４の層と疎水性溶媒５の層とが積層された状態での合計の厚みを上回る必要がある。
【0100】
収容部２１４の底面が親水性であり、かつ隔壁２１３の上面が疎水性であることにより、封入手順２Ｂ２において疎水性溶媒５が収容部２１４内に入り込むことを防止できる。
【実施例】
【0101】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0102】
［合成例１：ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃの合成］
以下の反応スキームの手順に従って化合物３を合成した。次に、化合物３を用いてＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃを合成した。
以下の反応スキームの手順に従って化合物３を合成した。次に、化合物３を用いてＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃを合成した。
【0103】
【化6】
【0104】
［原料］
合成に使用した全ての化学物質は、東京化成工業（株）、和光純薬工業（株）、シグマアルドリッチ（株）から購入し、追加的な精製を行うことなく使用した。
合成に使用した全ての化学物質は、東京化成工業（株）、和光純薬工業（株）、シグマアルドリッチ（株）から購入し、追加的な精製を行うことなく使用した。
【0105】
［測定機器］
ＮＭＲスペクトルは、重水素化溶媒中を用い、Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ４００分光計［１Ｈ（４００ＭＨｚ）、１３Ｃ（１０１ＭＨｚ）］で得た。
高分解能ＥＳＩ質量スペクトルは、ｍｉｃｒｏＯＴＯＦ ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ）で得た。
ＨＰＬＣ精製は、Ｉｎｅｒｔｓｔｉｌ－ＯＤＳ－３カラム（Φ１０×２５０ｍｍ（セミ分取）およびΦ２０×２５０ｍｍ（分取））を備えたＪＡＳＣＯ ＰＵ－２０８７ Ｐｌｕｓポンプ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）およびＵＶＩＤＥＣ－１００－Ｖ検出器（ＪＡＳＣＯ）で行った。
ＨＰＬＣに使用した溶媒は、和光（株）より入手した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル６０Ｎ（球状、中性、６３～２１０μｍ；関東化学株式会社製）を用いて行った。
ＴＬＣは、シリカゲルプレートＦ２５４（０．２５ｍｍ（分析）；Ｍｅｒｃｋ、ＡＫＧ）で行った。
ＵＶ－ｖｉｓスペクトルは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－２４５０分光光度計で得た。
ＮＭＲスペクトルは、重水素化溶媒中を用い、Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ４００分光計［１Ｈ（４００ＭＨｚ）、１３Ｃ（１０１ＭＨｚ）］で得た。
高分解能ＥＳＩ質量スペクトルは、ｍｉｃｒｏＯＴＯＦ ＩＩ（Ｂｒｕｋｅｒ）で得た。
ＨＰＬＣ精製は、Ｉｎｅｒｔｓｔｉｌ－ＯＤＳ－３カラム（Φ１０×２５０ｍｍ（セミ分取）およびΦ２０×２５０ｍｍ（分取））を備えたＪＡＳＣＯ ＰＵ－２０８７ Ｐｌｕｓポンプ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）およびＵＶＩＤＥＣ－１００－Ｖ検出器（ＪＡＳＣＯ）で行った。
ＨＰＬＣに使用した溶媒は、和光（株）より入手した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル６０Ｎ（球状、中性、６３～２１０μｍ；関東化学株式会社製）を用いて行った。
ＴＬＣは、シリカゲルプレートＦ２５４（０．２５ｍｍ（分析）；Ｍｅｒｃｋ、ＡＫＧ）で行った。
ＵＶ－ｖｉｓスペクトルは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－２４５０分光光度計で得た。
【0106】
（１）化合物１の合成
４－ヒドロキシベンズアルデヒド（Ｓ、４７９ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（５ｍＬ）の溶液に、Ｎ－アセチル－２－クロロ－２－デオイズノイラミン酸メチルエステル４，７，８，９－テトラアセテート３（０．５ｍＬ、３．１ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ溶液に加え、反応混合物を室温で３時間撹拌した。この後、すべての溶媒を除去し、トルエン（×３）で希釈した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ、１：１～ＥｔＯＡｃ）を用いて精製して、化合物１を白色泡状物として得た（１４５ｍｇ、６２％）。
４－ヒドロキシベンズアルデヒド（Ｓ、４７９ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（５ｍＬ）の溶液に、Ｎ－アセチル－２－クロロ－２－デオイズノイラミン酸メチルエステル４，７，８，９－テトラアセテート３（０．５ｍＬ、３．１ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ溶液に加え、反応混合物を室温で３時間撹拌した。この後、すべての溶媒を除去し、トルエン（×３）で希釈した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ、１：１～ＥｔＯＡｃ）を用いて精製して、化合物１を白色泡状物として得た（１４５ｍｇ、６２％）。
【0107】
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ1.93 (s, 3H, NHOAc), 2.05 (s, 3H, OAc), 2.06 (s, 3H, OAc), 2.12 (s, 3H, OAc), 2.19 (s, 3H, OAc), 2.30 (t, 1H, 3JHH = 12.5 Hz, H3ax), 2.74 (dd, 1H, 3JHH = 13, 4.7 Hz, H3eq), 3.65 (s, 3H, COOMe), 4.11 (m, 1H, H9), 4.13 (m, 1H, H5), 4.25 (dd, 1H, 3JHH = 12.4, 2.4 Hz, H9'), 4.60 (dd, 1H, 3JHH = 10.8, 1.6 Hz, H6), 4.98 (td, 1H, 3JHH = 10.4, 4.6, 1.8 HZ, H4), 5.23 (d, 1H, 3JHH = 10 Hz, H7), 5.35 (m, 1H, NH), 5.37 (m, 1H, H8), 7.18 (d, 2H, 3JHH = 8.7 Hz, Ar), 7.83 (d, 2H, 3JHH = 8.8 Hz, Ar), 9.93 (s, 1H, CHO). 13C NMR (101 MHz, CDCl3):δ 20.7, 20.7, 20.8, 21.0, 23.2, 38.7, 49.5, 53.2, 62.0, 67.1, 68.4, 68.7, 73.6,
99.5, 118.9, 131.7, 132.0, 158.9, 168.2, 169.9, 170.1, 170.2, 170.6, 170.9, 190.9. HRMS (ESI+): calcd for [M+Na+] 618.17933, found 618.18094 (-1.6 mDa) for C27H34NaNO14.
99.5, 118.9, 131.7, 132.0, 158.9, 168.2, 169.9, 170.1, 170.2, 170.6, 170.9, 190.9. HRMS (ESI+): calcd for [M+Na+] 618.17933, found 618.18094 (-1.6 mDa) for C27H34NaNO14.
【0108】
（２）化合物２の合成
化合物１（２４７ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解し、０℃でＬｉＡｌＨ（ＯｔＢｕ）3（０．８３ｍＬの１．０Ｍ ＴＨＦ溶液）を加えた。０℃で１時間撹拌した後、飽和ＮＨ4Ｃｌ（ａｑ）（５ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）を混合物に加え、室温でさらに１時間撹拌した。これにロッシェル塩（水性）（１０ｍＬ）の飽和溶液を加え、粗生成物をＣＨＣｌ3（×３）で抽出したのち、有機層を減圧残去した。次いで残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ １：９９から５：９５）を用いて精製して、化合物２を白色泡状物として得た（１５６ｍｇ、６３％）。
化合物１（２４７ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解し、０℃でＬｉＡｌＨ（ＯｔＢｕ）3（０．８３ｍＬの１．０Ｍ ＴＨＦ溶液）を加えた。０℃で１時間撹拌した後、飽和ＮＨ4Ｃｌ（ａｑ）（５ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）を混合物に加え、室温でさらに１時間撹拌した。これにロッシェル塩（水性）（１０ｍＬ）の飽和溶液を加え、粗生成物をＣＨＣｌ3（×３）で抽出したのち、有機層を減圧残去した。次いで残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ １：９９から５：９５）を用いて精製して、化合物２を白色泡状物として得た（１５６ｍｇ、６３％）。
【0109】
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ1.90 (s, 3H, NHOAc), 2.04 (s, 3H, OAc), 2.04 (s, 3H, OAc), 2.12 (s, 3H, OAc), 2.13 (s, 3H, OAc), 2.21 (t, 1H, 3JHH = 12.6 Hz, H3ax), 2.72 (dd, 1H, 3JHH = 12.9, 4.6 Hz, H3eq), 3.68 (s, 3H, COOMe), 4.10 (m, 1H, H5),
4.14 (d, 1H, 3JHH = 5 Hz, H9), 4.28 (dd, 1H, 3JHH = 12.6, 2.6 Hz, H9'), 4.38 (dd, 1H, 3JHH = 10.8, 1.6 Hz, H6), 4.63 (s, 2H, CH2OH), 4.95 (td, 1H, 3JHH = 10.4,
4.6, 1.8 HZ, H4), 5.27 (m, 1H, NH), 5.35 (m, 2H, H7, H8), 7.03 (d, 2H, 3JHH = 8.6 Hz, Ar), 7.27 (d, 2H, 3JHH = 8.6 Hz, Ar). 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 20.7, 20.8, 20.8, 21.0, 23.2, 38.2, 49.5, 52.9, 62.1, 64.9, 67.4, 68.8, 69.4, 73.4, 99.9, 120.3, 128.3, 136.7, 153.1, 168.1, 170.0, 170.1, 170.3, 170.7, 170.9. HRMS (ESI+): calcd for [M+Na+] 620.19498, found 620.19672 (-1.7 mDa) C27H36NaNO14.
4.14 (d, 1H, 3JHH = 5 Hz, H9), 4.28 (dd, 1H, 3JHH = 12.6, 2.6 Hz, H9'), 4.38 (dd, 1H, 3JHH = 10.8, 1.6 Hz, H6), 4.63 (s, 2H, CH2OH), 4.95 (td, 1H, 3JHH = 10.4,
4.6, 1.8 HZ, H4), 5.27 (m, 1H, NH), 5.35 (m, 2H, H7, H8), 7.03 (d, 2H, 3JHH = 8.6 Hz, Ar), 7.27 (d, 2H, 3JHH = 8.6 Hz, Ar). 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 20.7, 20.8, 20.8, 21.0, 23.2, 38.2, 49.5, 52.9, 62.1, 64.9, 67.4, 68.8, 69.4, 73.4, 99.9, 120.3, 128.3, 136.7, 153.1, 168.1, 170.0, 170.1, 170.3, 170.7, 170.9. HRMS (ESI+): calcd for [M+Na+] 620.19498, found 620.19672 (-1.7 mDa) C27H36NaNO14.
【0110】
（３）化合物３の合成
化合物２（１５０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解し、三臭化リン（１２μＬ、０．１３ｍｍｏｌ）を０℃で溶液に添加した。０℃で２時間撹拌後、溶液を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（×３）および飽和食塩水（×１）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧残去して化合物３を白色泡状物（１３６ｍｇ、８２％）として得た。
化合物２（１５０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３ｍＬ）に溶解し、三臭化リン（１２μＬ、０．１３ｍｍｏｌ）を０℃で溶液に添加した。０℃で２時間撹拌後、溶液を飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（×３）および飽和食塩水（×１）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧残去して化合物３を白色泡状物（１３６ｍｇ、８２％）として得た。
【0111】
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.84 (s, 3H, NHOAc), 1.97 (s, 3H, OAc), 1.98 (s, 3H,
OAc), 2.05 (s, 3H, OAc), 2.09 (s, 3H, OAc), 2.15 (t, 1H, 3JHH = 12.6 Hz, H3ax),
2.63 (dd, 1H, 3JHH = 13, 4.7 Hz, H3eq), 3.58 (s, 3H, COOMe), 4.03 (m, 1H, H9), 4.10 (m, 1H, H5), 4.23 (m, 1H, H9'), 4.37 (m, 1H, H6), 4.40 (s, 2H, CH2Br), 4.89
(td, 1H, 3JHH = 10.4, 4.6, 1.8 Hz, H4), 5.29 (m, 3H, H7, H8, NH), 6.95 (d, 2H, 3JHH = 8.7 Hz, Ar), 7.23 (d, 2H, 3JHH = 8.7 Hz, Ar). 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 19.7, 19.8, 19.8, 20, 22.2, 32.3, 37.2, 48.4, 52.0, 70.0, 66.3, 67.7, 68.1, 72.4, 98.8, 118.7, 129.2, 132.1, 152.8, 167.1, 169.0, 169.1, 169.2, 169.6, 169.9.
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na+] 682.11057, found 682.10666 (3.9 mDa) C27H34BrNNaO13.
OAc), 2.05 (s, 3H, OAc), 2.09 (s, 3H, OAc), 2.15 (t, 1H, 3JHH = 12.6 Hz, H3ax),
2.63 (dd, 1H, 3JHH = 13, 4.7 Hz, H3eq), 3.58 (s, 3H, COOMe), 4.03 (m, 1H, H9), 4.10 (m, 1H, H5), 4.23 (m, 1H, H9'), 4.37 (m, 1H, H6), 4.40 (s, 2H, CH2Br), 4.89
(td, 1H, 3JHH = 10.4, 4.6, 1.8 Hz, H4), 5.29 (m, 3H, H7, H8, NH), 6.95 (d, 2H, 3JHH = 8.7 Hz, Ar), 7.23 (d, 2H, 3JHH = 8.7 Hz, Ar). 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 19.7, 19.8, 19.8, 20, 22.2, 32.3, 37.2, 48.4, 52.0, 70.0, 66.3, 67.7, 68.1, 72.4, 98.8, 118.7, 129.2, 132.1, 152.8, 167.1, 169.0, 169.1, 169.2, 169.6, 169.9.
HRMS (ESI+): calcd for [M+Na+] 682.11057, found 682.10666 (3.9 mDa) C27H34BrNNaO13.
【0112】
（４）ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃの合成
以下の反応スキームの手順に従って、ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃを合成した。
以下の反応スキームの手順に従って、ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃを合成した。
【0113】
【化7】
【0114】
ＨＭＲｅｆ（７９ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）およびＮａＨ（６ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）に乾燥ＴＨＦ（３ｍＬ）および乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）を添加し、この混合物をアルゴン気下で０℃で撹拌した。化合物３（１３０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（３ｍＬ）溶液を加え、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。この後、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）を加え、この混合物を飽和ＮＨ4Ｃｌ溶液（×２）および飽和食塩水（×１）で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧留去した。残渣をＭｅＯＨ（６ｍＬ）に溶解し、１Ｍ ＮａＯＨ（水溶液）を加えた（３ｍＬ）。混合物を室温で５時間撹拌し、その後、有機溶媒を蒸発させた。残留水溶液を２ＭのＨＣｌで中和し、次いで凍結乾燥させた。次いで、残留物をＭｅＯＨ：ＤＣＭ、１：４溶液に溶解し、濾過して不溶性塩を除去した。この溶液を減圧留去させ、残渣をＨＰＬＣ（Ａ液：１００ｍＭ ＴＥＡＡ緩衝液、Ｂ液：ＣＨ3ＣＮ ９９％、Ｈ2Ｏ １％。Ａ／Ｂ＝９０／１０で５分間、その後１５分で１０／９０に勾配をかけ、次いで１０／９０で１５分間）で精製し、凍結乾燥後に橙色の粉末（２ステップで３６％）を得た。
【0115】
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ1.04 (t, 26H, TEAA), 1.84 (1H, t, 3JHH = 11.9 Hz, H3ax), 1.90 (s, 3H, TEAA), 2.02 (s, 3H, NHCOCH3), 2.55 (q, 17 H, TEAA), 2.94 (dd, 1H, 3JHH = 12.2, 4.0 Hz, H3eq), 3.54 (dd, 1H, 3JHH = 9.0, 1.6 Hz, H7), 3.66 (dd, 1H, 3JHH = 11.3, 5.4 Hz, H9), 3.74 (m, 1H, H5), 3.77 (m, 1H, H4), 3.81 (m, 1H, H9'), 3.85 (m, 2H, NHCH2CF3), 3.86 (m, 1H, H8), 3.91 (m, 1H, H6), 5.01 (s, 2H, ArCH2O), 5.23 (s, 2H, ArCH2O), 6.45 (dd, 1H, 3JHH = 8.6, 4JHH = 2.4 Hz, Ar), 6.50 (d, 1H, 4JHH = 2.3 Hz, Ar), 6.65 (dd, 1H, 3JHH = 8.7, 4JHH = 2.6 Hz, Ar), 6.67 (d, 1H, 3JHH = 8.6, Ar), 6.78 (m, 1H, Ar), 6.79 (m, 1H, Ar), 6.82 (m, 1H, Ar), 7.24 (d, 2H, 3JHH = 8.7 Hz, Ar), 7.30 (m, 1H, Ar), 7.31 (d, 2H, 3JHH = 8.7 Hz, Ar),
7.39 (m, 1H, Ar), 7.43 (m, 1H, Ar). 13C NMR (101 MHz, CD3OD): δ 11.2 (TEAA) 22.9, 24.4 (TEAA), 43.1, 45.8, 46.9 (TEAA), 54.3, 64.0, 69.3, 70.2, 72.6, 72.7, 73.1, 75.3, 85.5, 99.3, 104.0, 104.1, 109.7, 110.8, 114.7, 117.8, 118.1, 120.8, 121.9, 124.7, 124.8, 126.9 (q, CF3), 129.3, 129.4, 130.2, 130.2, 130.9, 140.3, 146.0, 150.3, 152.1, 153.0, 157.0, 173.6, 175.6, 180.7 (TEAA). HRMS (ESI+) L calcd for [M+Na]+ 797.75163; found 797.75043 (-1.2 mDa).
直線勾配（０ｍｉｎ、２０％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡａｑ． Ｔｏ １５ｍｉｎ，１００％ＣＨ3ＣＮ ０．１％ＴＦＡ ａｑ；ｆｌｏｗ ｒａｔｅ＝１．０ｍＬ／ｍｉｎ）を用いてＨＰＬＣ分析を行った。５２０ｎｍでの蛍光を調べた。
7.39 (m, 1H, Ar), 7.43 (m, 1H, Ar). 13C NMR (101 MHz, CD3OD): δ 11.2 (TEAA) 22.9, 24.4 (TEAA), 43.1, 45.8, 46.9 (TEAA), 54.3, 64.0, 69.3, 70.2, 72.6, 72.7, 73.1, 75.3, 85.5, 99.3, 104.0, 104.1, 109.7, 110.8, 114.7, 117.8, 118.1, 120.8, 121.9, 124.7, 124.8, 126.9 (q, CF3), 129.3, 129.4, 130.2, 130.2, 130.9, 140.3, 146.0, 150.3, 152.1, 153.0, 157.0, 173.6, 175.6, 180.7 (TEAA). HRMS (ESI+) L calcd for [M+Na]+ 797.75163; found 797.75043 (-1.2 mDa).
直線勾配（０ｍｉｎ、２０％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡａｑ． Ｔｏ １５ｍｉｎ，１００％ＣＨ3ＣＮ ０．１％ＴＦＡ ａｑ；ｆｌｏｗ ｒａｔｅ＝１．０ｍＬ／ｍｉｎ）を用いてＨＰＬＣ分析を行った。５２０ｎｍでの蛍光を調べた。
【0116】
【化8】
【0117】
［試験例１：ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃのバクテリア由来ノイラミニダーゼとの反応性］
合成例１で得られたＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃについて、アルスロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）由来のノイラミニダーゼとの酵素反応に伴う蛍光強度の経時変化を調べた。
合成例１で得られたＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃについて、アルスロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）由来のノイラミニダーゼとの酵素反応に伴う蛍光強度の経時変化を調べた。
【0118】
プローブ（ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、蛍光測定グレード、同仁化学研究所）に溶解してストック溶液を得た。さらに、ストック溶液を、プローブの最終濃度が１μＭになるように緩衝液（１００ｍＭ ＮａＯＡｃ、２ｍＭ
ＣａＣｌ2、ｐＨ７．４）で希釈して測定溶液を得た。
測定溶液の蛍光スペクトルを、日立Ｆ－７０００を用いて１秒ごとに測定した（励起波長４９０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ）。測定開始後６０秒後にアルスロバクター・ウレアファシエンス由来のノイラミニダーゼ０．０１Ｕを、単独であるいは酵素阻害剤との組み合わせで添加した。測定時の温度は３７℃、酵素阻害剤（ＤＡＮＡ）の濃度は１００μＭとした。
ＣａＣｌ2、ｐＨ７．４）で希釈して測定溶液を得た。
測定溶液の蛍光スペクトルを、日立Ｆ－７０００を用いて１秒ごとに測定した（励起波長４９０ｎｍ、発光波長５２０ｎｍ）。測定開始後６０秒後にアルスロバクター・ウレアファシエンス由来のノイラミニダーゼ０．０１Ｕを、単独であるいは酵素阻害剤との組み合わせで添加した。測定時の温度は３７℃、酵素阻害剤（ＤＡＮＡ）の濃度は１００μＭとした。
【0119】
結果を図４に示す。ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃは、バクテリア由来のノイラミニダーゼとの反応で１３０倍の蛍光増強を示した。
ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）由来のノイラミニダーゼを用いた場合にも同様の結果を得た。ウェルシュ菌は、ヒトに常在する菌であり、口腔を含む上部気道粘膜にも常在している。
ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）由来のノイラミニダーゼを用いた場合にも同様の結果を得た。ウェルシュ菌は、ヒトに常在する菌であり、口腔を含む上部気道粘膜にも常在している。
【0120】
［試験例２：ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃのインフルエンザ由来ノイラミニダーゼとの反応性］
ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃについて、試験例１と同様にしてインフルエンザイウルス由来のノイラミニダーゼとの酵素反応に伴う蛍光強度の経時変化を調べた。
ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃについて、試験例１と同様にしてインフルエンザイウルス由来のノイラミニダーゼとの酵素反応に伴う蛍光強度の経時変化を調べた。
【0121】
本試験例ではプローブにＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃに加えて４ＭＵ－ＮＡＮＡ（陽性コントロール）に用いた。プローブの測定溶液中の終濃度はＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃ １００μＭ、４ＭＵ－ＮＡＮＡ １ｍＭとした。
測定溶液にインフルエンザウイルス（A/PR8 医科研II株）を５×１０7ＰＦＵ／ｍＬを添加し、蛍光スペクトルの測定を開始した（励起波長３６０ｎｍ、発光波長４４８ｎｍ）。測定時の温度は２５℃とした。
測定溶液にインフルエンザウイルス（A/PR8 医科研II株）を５×１０7ＰＦＵ／ｍＬを添加し、蛍光スペクトルの測定を開始した（励起波長３６０ｎｍ、発光波長４４８ｎｍ）。測定時の温度は２５℃とした。
【0122】
結果を図５に示す。陽性コントロールの４ＭＵ－ＮＡＮＡは経時的な蛍光増強を示したが、ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃでは蛍光強度の変化は全くみられなかった。本試験例及び試験例１の結果から、ＨＭＲｅｆ－Ｓ－Ｎｅｕ５Ａｃは、バクテリア由来のノイラミニダーゼに対しては反応性を有するが、インフルエンザ由来ノイラミニダーゼに対しては反応性を有さないことが明らかとなった。
【符号の説明】
【0123】
１：プローブ１、２：プローブ２、３：インフルエンザウイルス又はバクテリア、４：サンプル液、５：疎水性溶媒、１０１，２０１：アレイ、１１１，２１１：下層部、１１２，２１２：板状部材、１１３，２１３：隔壁、１１４，２１４：収容部、１２１：上層部、１３１：空間、２１：領域、２２１：側壁
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4】
【図5】