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特許7454882抗ヒトインターロイキン－４受容体α抗体及びその調製方法並びに使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-14
(45)【発行日】2024-03-25
(54)【発明の名称】抗ヒトインターロイキン－４受容体α抗体及びその調製方法並びに使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20240315BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240315BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240315BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240315BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240315BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240315BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240315BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240315BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240315BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240315BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240315BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240315BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20240315BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20240315BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240315BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20240315BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20240315BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240315BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240315BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240315BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240315BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
C12P21/08
A61P43/00 105
A61P37/02
A61P29/00
A61P11/06
A61P37/08
A61P17/00
A61P11/02
A61P17/06
A61P19/02
A61P25/00
A61P27/02
A61K39/395 D
A61K39/395 N
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2022563020
(86)(22)【出願日】2021-04-13
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-12
(86)【国際出願番号】 CN2021086806
(87)【国際公開番号】W WO2021208881
(87)【国際公開日】2021-10-21
【審査請求日】2022-12-08
(31)【優先権主張番号】202010309238.8
(32)【優先日】2020-04-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】522404465
【氏名又は名称】シャンハイマブギークバイオテック．カンパニー，リミティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100108903
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 和広
(74)【代理人】
【識別番号】100123593
【弁理士】
【氏名又は名称】関根 宣夫
(74)【代理人】
【識別番号】100208225
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 修二郎
(74)【代理人】
【識別番号】100217179
【弁理士】
【氏名又は名称】村上 智史
(74)【代理人】
【識別番号】100227592
【弁理士】
【氏名又は名称】孔 詩麒
(72)【発明者】
【氏名】チャン チョンハイ
(72)【発明者】
【氏名】クオ チンリン
(72)【発明者】
【氏名】ユアン ユイチン
【審査官】松井 一泰
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５０６１４６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５２７５６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５１４５０１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５２０１７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０００－５１５０１６（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－ １９／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－ １５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
インターロイキン－４受容体αに特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分であって、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、ＨＣＤＲ３配列、ＨＣＤＲ１配列及びＨＣＤＲ２配列を含み、前記軽鎖可変領域が、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列及びＬＣＤＲ３配列を含み、
前記ＨＣＤＲ１配列、前記ＨＣＤＲ２配列、前記ＨＣＤＲ３配列、前記ＬＣＤＲ１配列、前記ＬＣＤＲ２配列及び前記ＬＣＤＲ３配列が、それぞれ配列番号１２３～１２８のアミノ酸配列を含み、又は
前記ＨＣＤＲ１配列、前記ＨＣＤＲ２配列、前記ＨＣＤＲ３配列、前記ＬＣＤＲ１配列、前記ＬＣＤＲ２配列及び前記ＬＣＤＲ３配列が、それぞれ配列番号：１２９～１３４のアミノ酸配列を含み、又は
前記ＨＣＤＲ１配列、前記ＨＣＤＲ２配列、前記ＨＣＤＲ３配列、前記ＬＣＤＲ１配列、前記ＬＣＤＲ２配列及び前記ＬＣＤＲ３配列が、それぞれ配列番号：２０１～２０６のアミノ酸配列を含む、
抗体又はその抗原結合部分。
【請求項2】
前記重鎖可変領域は、配列番号：１４のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が、配列番号：１６のアミノ酸配列を含み、又は前記重鎖可変領域は、配列番号：８２のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が、配列番号：８５のアミノ酸配列を含み、又は
前記重鎖可変領域は、配列番号：１８のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が、配列番号：２０のアミノ酸配列を含み、又は
前記重鎖可変領域は、配列番号：８８のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が、配列番号：９１のアミノ酸配列を含み、又は
前記重鎖可変領域は、配列番号：６６のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が、配列番号：６８のアミノ酸配列を含み、又は
前記重鎖可変領域は、配列番号：１００のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖可変領域が、配列番号：１０３のアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項3】
前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号：８３に示される重鎖配列、及び配列番号：８６に示される軽鎖配列を有し、又は前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号：８９に示される重鎖配列、及び配列番号：９２に示される軽鎖配列を有し、又は
前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号：１０１に示される重鎖配列、及び配列番号：１０４に示される軽鎖配列を有する、
請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項4】
前記抗原結合部分は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、及びＦｖフラグメントから選ばれる、請求項１～３の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項5】
前記Ｆｖフラグメントが、ｓｃＦｖフラグメントである、請求項４に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項6】
前記抗体又はその抗原結合部分は６００ｐＭ未満のＫＤでインターロイキン－４受容体αに結合する、請求項１～５の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項7】
前記抗体又はその抗原結合部分は、３５０ｐＭ未満のＫＤでインターロイキン－４受容体αに結合する、請求項６に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項8】
前記抗体又はその抗原結合部分は、ヒトインターロイキン－４受容体α又はマウスインターロイキン－４受容体αに特異的に結合される、請求項１～７の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項9】
前記抗体又はその抗原結合部分は、ＩＬ－４によって誘導されるＴＦ－１細胞の増殖を阻害し及び／又はＢ細胞のＩｇＥ分泌を阻害することができる、請求項８に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項10】
請求項１～９の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分及び薬学的に許容されるベクターを含む、薬物組成物。
【請求項11】
請求項１～９の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分をコードする、ヌクレオチド分子。
【請求項12】
請求項１１に記載のヌクレオチド分子を含む、発現ベクター。
【請求項13】
請求項１１に記載のヌクレオチド分子又は請求項１２に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項14】
請求項１～９の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分の生成方法であって、ａ）請求項１３に記載の宿主細胞が前記抗体又はその抗原結合部分の生成を可能にさせる発現条件下で、前記宿主細胞を培養することによって、抗体又はその抗原結合部分を発現するステップと、
ｂ）ステップａ）で発現される前記抗体又はその抗原結合部分を分離及び精製するステップと、を含む、方法。
【請求項15】
ＩＬ－４Ｒα関連疾患を予防又は治療する薬物の調製における、請求項１～９の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分、又は請求項１０に記載の組成物の使用。
【請求項16】
前記ＩＬ－４Ｒα関連疾患は、喘息、アレルギー、アトピー性皮膚炎、慢性副鼻腔炎、好酸球性食道炎、鼻ポリープ、乾癬、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、ブドウ膜炎、ベーチェットブドウ膜炎、ドライアイ及び慢性自発性蕁麻疹から選ばれる、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０２０年４月１７日に提出された中国特許出願第２０２０１０３０９２３８．８号の優先権を主張する。
本願は、２０２０年４月１７日に提出された中国特許出願第２０２０１０３０９２３８．８号の優先権を主張する。
【0002】
本発明は、抗体分野に関し、より具体的には、本発明は、抗インターロイキン受容体の抗体及びその調製方法並びに使用に関する。
【背景技術】
【0003】
体が抗原に刺激される時、体内の抗原特異的リンパ球が抗原を認識し、活性化、増殖、分化などの応答が起こり、最後に侵入した抗原を除去する。Ｔ細胞とＢ細胞は主なエフェクター細胞である。異なるタイプの抗原に対して、Ｔ細胞は標的細胞を直接殺傷し、異なるタイプのサイトカインを分泌することによって、免疫応答を強化及び増強して免疫効果を発揮することができる。研究により、アレルギー性喘息などのアレルギー性疾患において、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｕｋｉｎ、ＩＬ）－４、ＩＬ－５、ＩＬ－９及びＩＬ－１３などのＴｈ２型サイトカインは、主な病理学的進行を介在することが示された。
【0004】
喘息は、一般的な呼吸器疾患であり、通常、呼吸器炎症、気管支過敏症及び気管支壁の構造変化（呼吸器リモデリング）で表される。遺伝的背景やアレルゲン及び呼吸器系ウイルスなどの環境要因の刺激などが喘息の発作を誘発し、主な病理学的症状は、再発性喘息、息切れ、胸部圧迫感及び咳である。喘息の患者数は世界で２３０万人であり、罹患率は今後の数十年で増加すると予想されている。喘息は現在、プログレッシブ治療で症状を軽減し、リスクをコントロールする。吸入コルチコステロイドは中等度喘息の標準治療方法であるが、重症患者には長時間作用型β拮抗薬を併用し、最も重症の場合は追加のコントローラー薬を必要とする可能性がある。これらの治療は、他の深刻な副作用とともに、免疫系の障害を引き起こす可能性がある。それにもかかわらず、５％～１０％の患者は現在、治療薬がない。
【0005】
アレルギー性喘息において、気管支でのＴｈ２型サイトカインの異常な高発現が発見されると同時に、Ｔｈ２サイトカインが炎症反応の発作と進行を介在し、呼吸器の病理学的変化を促進するなどが確認されている。これらのサイトカインは、好酸球や肥満細胞などを含む炎症細胞の活性化及び炎症部位への走化性を促進する。ＩＬ－４とＩＬ－１３はＢ細胞を標的とし、分泌された抗体をＩｇＭからＩｇＥに変換し、同時に杯細胞の過形成、気管支線維芽細胞の筋線維芽細胞への変換、コラーゲン沈着や呼吸器平滑筋細胞の増殖などを誘導することによって、気管支リモデリングを誘導する。
【0006】
ＩＬ－４とＩＬ－１３の両方とも、インターロイキン－４受容体α（ＩＬ－４Ｒα）に結合することで、対応するシグナル伝達経路を活性化できるため、ＩＬ－４Ｒα標的抗体の開発によりＩＬ－４とＩＬ－１３の両方の病理学的反応を同時に遮断でき、喘息などのＩＬ－４Ｒα関連疾患の治療への使用が期待されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の発明者らは、大量の試験により、細胞表面ＩＬ－４受容体α（ＩＬ－４Ｒα）へのＩＬ－４及びＩＬ－１３の結合を特異的に遮断することによって、ＩＬ－４及びＩＬ－１３シグナル伝達を遮断するモノクローナル抗体を得、それはＩＬ－４／ＩＬ－１３により介在される生物活性を遮断することができる。
【課題を解決するための手段】
【0008】
第１態様によれば、本出願は、ＨＣＤＲ３配列を含み、任意選択にＨＣＤＲ１及び／又はＨＣＤＲ２配列をさらに含む重鎖可変領域を含む、ＩＬ－４受容体αに特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分を提供する。いくつかの実施形態において、上記ＨＣＤＲ３配列は配列番号：１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、１６７、１７３、１７９、１８５、１９１、１９７及び２０３から選ばれるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ＨＣＤＲ１配列は配列番号：１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、１６５、１７１、１７７、１８３、１８９、１９５及び２０１から選ばれるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ＨＣＤＲ２配列は配列番号：１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６及び２０２から選ばれるアミノ酸配列を含む。選択可能な実施形態において、上記抗原結合部分はＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｄフラグメント及び単一ドメイン抗体から選ばれる。
【0009】
いくつかの実施形態において、上記重鎖可変領域は、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７６、８２、８８、９４及び１００から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、又は前記重鎖可変領域は、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７６、８２、８８、９４及び１００から選ばれるアミノ酸配列を含む。
【0010】
いくつかの実施形態において、ＩＬ－４受容体αに特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及び／又はＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む。特定の実施形態において、前記ＬＣＤＲ１配列は配列番号：１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、１９８及び２０４から選ばれるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、前記ＬＣＤＲ２配列は配列番号：１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、１６３、１６９、１７５、１８１、１８７、１９３、１９９及び２０５から選ばれるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、前記ＬＣＤＲ３配列は配列番号：１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、１６４、１７０、１７６、１８２、１８８、１９４、２００及び２０６から選ばれるアミノ酸配列を含む。
【0011】
いくつかの実施形態において、上記軽鎖可変領域は、配列番号：４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７３、７９、８５、９１、９７及び１０３から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、又は前記軽鎖可変領域は、配列番号：４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７３、７９、８５、９１、９７及び１０３から選ばれるアミノ酸配列を含む。
【0012】
いくつかの実施形態において、ＩＬ－４受容体αに特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分の重鎖は、配列番号：７１、７７、８３、８９、９５及び１０１から選ばれるアミノ酸配列又は上記配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。任意選択で、前記抗体又はその抗原結合部分の軽鎖は、配列番号：７４、８０、８６、９２、９８及び１０４から選ばれるアミノ酸配列又は上記配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【0013】
いくつかの実施形態において、第１態様に記載のＩＬ－４受容体αに特異的に結合する抗体はモノクローナル抗体である。
【0014】
いくつかの実施形態において、第１態様に記載のＩＬ－４受容体αに特異的に結合する抗体はヒト化抗体である。
【0015】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるＩＬ－４受容体α抗体又はその抗原結合部分は、抗体１３１－Ｈｕ、１３６－Ｈｕ又は２３６－ＨｕとＩＬ－４受容体αにおける同じエピトープに結合するか、又は１３１－Ｈｕ、１３６－Ｈｕ又は２３６－ＨｕとＩＬ－４受容体αに競合的に結合し、ここで、前記抗体１３１－Ｈｕの重鎖配列は配列番号：８３に示され、軽鎖配列は配列番号：８６に示され、前記抗体１３６－Ｈｕの重鎖配列は配列番号：８９に示され、軽鎖配列は配列番号：９２に示され、及び前記抗体２３６－Ｈｕの重鎖配列は配列番号：１０１に示され、軽鎖配列は配列番号：１０４に示される。
【0016】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される抗体又はその抗原結合部分は、Ｂ細胞のＩｇＥ分泌を阻害することができる。いくつかの実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、６００ｐＭ未満、好ましくは３５０ｐＭ未満のＫＤでＩＬ－４Ｒαに結合する。別のいくつかの実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、ＩＬ－４によって誘導されるＴＦ－１細胞の増殖を阻害することができる。
【0017】
第２態様によれば、本願は、前述のＩＬ－４受容体αに特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド分子を提供する。
【0018】
第３態様によれば、本願は、前述のヌクレオチド分子を含む発現ベクターを提供する。
【0019】
いくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、ｐＴＴ５、ｐＵＣ５７、ｐＤＲ１、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐＤＨＦＦ又はｐＣＨＯ１．０などである。
【0020】
第４態様によれば、本出願は、前述の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、前記宿主細胞は、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＳ０、ｓｆ９、ｓｆ２１、ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＴＧ１などである。
【0021】
第５態様によれば、本願は、第１態様に記載のＩＬ－４受容体αに特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分を調製する方法を提供する。上記方法は、下記のステップ：
ａ）第４態様に記載の宿主細胞が前記抗体又はその抗原結合部分の生成を可能にする発現条件下で、前記宿主細胞を培養することによって、前記抗体又はその抗原結合部分を発現するステップと、
ｂ）ａ）で発現される前記抗体又はその抗原結合部分を分離及び精製するステップと、を含む。
ａ）第４態様に記載の宿主細胞が前記抗体又はその抗原結合部分の生成を可能にする発現条件下で、前記宿主細胞を培養することによって、前記抗体又はその抗原結合部分を発現するステップと、
ｂ）ａ）で発現される前記抗体又はその抗原結合部分を分離及び精製するステップと、を含む。
【0022】
第６態様によれば、本出願は、第１態様に記載の抗ＩＬ－４受容体α抗体又はその抗原結合部分及び薬学的に許容されるベクターを含む薬物組成物を提供する。
【0023】
いくつかの実施形態において、前記組成物は、ＩＬ－４Ｒα関連疾患の治療に用いられる。
【0024】
第７態様によれば、本出願は、免疫介在性炎症反応又は炎症性疾患など、ＩＬ－４Ｒα関連疾患を予防又は治療する薬物の調製における、第１態様に記載の抗ＩＬ－４受容体α抗体又はその抗原結合部分、又は第６態様に記載の組成物の使用を提供する。
【0025】
いくつかの実施形態において、前記免疫介在性炎症反応又は炎症性疾患は、喘息、アレルギー、アトピー性皮膚炎、慢性副鼻腔炎、好酸球性食道炎、鼻ポリープ、乾癬、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、ブドウ膜炎、ベーチェットブドウ膜炎、ドライアイ及び慢性自発性蕁麻疹などを含む。
【0026】
その他の態様によれば、本出願は、第１態様に記載の抗体又はその抗原結合部分、或いは第６態様に記載の薬物組成物を必要のある個体に投与することを含む、ＩＬ－４Ｒα関連疾患を予防又は治療する方法を提供する。
【発明の効果】
【0027】
本発明の抗ＩＬ－４Ｒα抗体又はその抗原結合部分は、ＩＬ－４Ｒαに特異的に結合することができ、以下の１つ又は複数の効果を有する。ＩＬ－４ＲαへのＩＬ－４又はＩＬ－１３の結合を遮断する。ＴＦ－１細胞など、ＩＬ－４又はＩＬ－１３によって誘導される細胞株の増殖を阻害する。及び／又は、Ｂ細胞のＩｇＥ分泌を阻害する。インビボ薬効学試験は、本発明の抗体が、ＩＬ－４、ＩＬ－１３シグナル伝達経路を阻害することによって下流のＴｈ２型応答の発生を拮抗することができ、喘息を抑える強力な機能を有し、且つ発効が速い。本発明の抗ＩＬ－４Ｒα抗体又はその抗原結合部分は、免疫介在性炎症性疾患など、ＩＬ－４Ｒα関連疾患の予防又は治療に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】構築されたマウス抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体のヒトＩＬ－４Ｒαに対する親和力の測定結果である。
【図2】構築されたマウス抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体のヒトＩＬ－４によって誘導されるＴＦ－１細胞増殖を阻害する結果である。
【図3】ヒト化抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体のヒトＩＬ－４によって誘導されるＴＦ－１細胞増殖を阻害する実験結果である。
【図4】ヒト化抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体の新鮮な末梢血由来のＢ細胞ＩｇＥ分泌を阻害する実験結果である。
【図5】ヒト化抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体の薬物動態実験結果である。
【図6】モデルマウス血清ＩｇＥに対する３０５－Ｂの阻害である。
【図7】各モデル群動物の肺胞洗浄液における白血球に対する好酸球の割合である。
【図8】各モデル群動物の肺組織における好酸球の浸潤である。
【図9】各モデル群動物の肺組織における粘液分泌である。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本願は、ＩＬ－４Ｒαに特異的に結合する新しい抗ＩＬ－４Ｒα抗体又はその抗原結合部分を提供する。好ましい実施形態において、本出願の抗体又はその抗原結合部分は高親和力でヒトＩＬ－４Ｒαに結合し、且つＩＬ－４Ｒαの活性を阻害する。本出願は、当該抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞、当該抗体を調製及び精製する方法、及びＩＬ－４Ｒα関連疾患又は病状の予防又は治療など、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの医学的及び生物学的使用をさらに提供する。本出願は、前記抗体又はその抗原結合フラグメントを使用してＩＬ－４Ｒαを検出し、ＩＬ－４Ｒα活性の調節する方法をさらに含む。
【0030】
本出願を容易に理解するために、まず、本明細書で使用されるいくつかの用語を定義する。
【0031】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖、即ちジスルフィド結合を介して相互結合された２つの重鎖（Ｈ）鎖及び２つの軽鎖（Ｌ）を含む免疫グロブリン分子、及びその多量体（例えばＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと略記）及び重鎖定常領域（ＣＨと略記）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、即ちＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと略記）及び軽鎖定常領域（ＣＬと略記）を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分化できる。
【0032】
本明細書で使用されるように、抗体の「抗原結合部分」という用語は、抗原との結合に関与する完全な抗体分子の一部又はセグメントを指す。抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）又は上記の両方を含んでもよい。抗体の抗原結合フラグメントは、任意の適切な標準技術を使用して、完全な抗体分子から調製することができ、前記標準技術はタンパク質分解消化又は組換え遺伝子工学技術などを含む。抗原結合部分の非限定的な例は、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、単一ドメイン抗体、ｄＡｂフラグメント及び抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基で構成された最小認識ユニット（例えば、分離したＣＤＲ）を含む。「抗原結合部分」という用語は、二重抗体、三重抗体、四重抗体及び小型抗体など、他の工学的分子をさらに含む。
【0033】
本明細書で使用されるように、「重鎖可変領域（ＶＨ）」及び「軽鎖可変領域（ＶＬ）」という用語はそれぞれ、ＦＲ１、２、３、４及びＣＤＲ１、２、３を含む単一抗体の可変重鎖と軽鎖領域を指す。
【0034】
当業者によく知られているように、相補性決定領域（ＣＤＲ、通常ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がある）は、抗体の親和力及び特異性に最大の影響を与える可変領域内の領域である。ＶＨ又はＶＬのＣＤＲ配列は、ｋａｂａｔ定義及びＣｈｏｔｈｉａ定義という２つの一般的な定義方法があり、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）；Ａ１－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８（１９９７）；及びＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：９２６８－９２７２（１９８９）を参照する。抗体が特定された可変領域配列に関しては、Ｋａｂａｔ定義又はＣｈｏｔｈｉａ定義に基づいてＶＨとＶＬ配列内のＣＤＲ領域の配列を決定することができる。本出願の実施形態では、Ｋａｂａｔを使用してＣＤＲ配列を定義する。本明細書において、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はそれぞれ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と略称され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はそれぞれ、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及ＬＣＤＲ３と略称される。
【0035】
抗体が特定された可変領域配列に関しては、様々な方法によって可変領域配列内のＣＤＲ領域の配列を分析することができ、例えば、オンラインソフトウェアＡｂｙｓｉｓによって決定することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ／）。
【0036】
本明細書で使用される「特異的に結合」という用語は、２つの分子間の非ランダム結合反応を指し、例えば抗原エピトープへの抗体の結合であり、例えば非特異的抗原に対する親和性の少なくとも２倍の親和性で特異的抗原に結合する抗体の能力である。しかし、抗体は、その配列に関連する２つ以上の抗原に特異的に結合することができることを理解すべきである。例えば、本発明の抗体は、ヒト及び非ヒト（例えばマウス又は非ヒト霊長類動物）のＩＬ－４Ｒαに特異的に結合することができる。
【0037】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、集団を構成した各抗体は、少数の個体に天然に存在する突然変異を除いて同一である。本明細書に記載されているモノクローナル抗体は特に「キメラ」抗体を含み、ここで、重鎖及び／又は軽鎖の一部は特定の種に由来するか、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であり、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分は別の種に由来するか、又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であり、また所望の生物活性を示すことができる抗体のフラグメントを含む（米国特許番号４，８１６，５６７；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５（１９８４）を参照）。
【0038】
本明細書で使用されるように、「相同性」という用語は、配列アラインメント及びギャップ導入後、アミノ酸又はヌクレオチド配列変異体内の同一残基のパーセンテージが、必要に応じて最大パーセンテージに達する相同性を指す。アラインメントに使用される方法及びコンピュータプログラムは当該分野で周知である。本明細書に記載の「少なくとも８０％の相同性」とは、相同性が８０％～１００％の間の任意の値であることを指し、例えば８５％、９０％、９５％、９９％などである。
【0039】
本明細書で使用されるように、「ＩＬ－４Ｒα関連疾患」という用語は、ＩＬ－４Ｒαシグナル伝達経路の活性化に関連する疾患及び／又は病状を含む。例示的なＩＬ－４Ｒα関連疾患又は病状は、アレルギー性疾患、喘息など、免疫介在性炎症反応を含む。
【0040】
本明細書で使用されるように、「半減期」及び「血清半減期」という用語は、本開示による抗原結合タンパク質の血清濃度が体内で５０％減少するのにかかる時間を指す。
【0041】
一態様によれば、本出願は、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含むＩＬ－４Ｒαに特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分を提供する。下記の表１～５は、本出願の開示に適した抗体のＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、重鎖と軽鎖アミノ酸配列及び対応するヌクレオチド配列を例示的に示す。特定の実施形態において、抗ＩＬ－４Ｒα抗体又はその抗原結合部分は、ＨＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２及び／又はＨＣＤＲ１配列を含み、それは表１に示されるＨＣＤＲ３、ＨＣＤＲ２又はＨＣＤＲ１配列のうちのいずれか１つから独立して選ばれる。特定の実施形態において、本出願の抗ＩＬ－４Ｒα抗体は、軽鎖ＣＤＲをさらに含むことができ、それは表２に示される軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３配列のうちのいずれか１つから独立して選ばれる。例えば、本出願の抗ＩＬ－４Ｒα抗体は、表３と表４に示される重鎖可変領域のうちのいずれか１つを含むことができ、任意選択に表３と表４に示される軽鎖可変領域のいずれかと組み合わせることができる。
【0042】
【表1】
【0043】
【表2】
【0044】
【表3】
【0045】
【表4】
【0046】
【表5】
【0047】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される抗体又はその抗原結合部分のＨＣＤＲ３は、配列番号：１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、１６７、１７３、１７９、１８５、１９１、１９７及び２０３に示されるアミノ酸配列から選ばれる。いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ２は、配列番号：１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６及び２０２に示されるアミノ酸配列から選ばれ、及び／又は前記ＨＣＤＲ１は、配列番号：１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、１６５、１７１、１７７、１８３、１８９、１９５及び２０１に示されるアミノ酸配列から選ばれる。
【0048】
具体的な実施形態において、ＨＣＤＲ３は、配列番号：１０７、１１３、１１９、１２５及び１３１に示されるアミノ酸配列から選ばれる。別の具体的な実施形態において、ＨＣＤＲ３は、配列番号：１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、１６７、１７３、１７９、１８５、１９１、１９７及び２０３に示されるアミノ酸配列から選ばれる。好ましい実施形態において、ＨＣＤＲ３は、１２５、１３１及び２０３に示されるアミノ酸配列から選ばれる。
【0049】
具体的な実施形態において、ＨＣＤＲ２は、配列番号：１０６、１１２、１１８、１２４及び１３０に示されるアミノ酸配列から選ばれる。別の具体的な実施形態において、ＨＣＤＲ２は、配列番号：１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６及び２０２に示されるアミノ酸配列から選ばれる。好ましい実施形態において、ＨＣＤＲ２は、１２４、１３０及び２０２に示されるアミノ酸配列から選ばれる。
【0050】
具体的な実施形態において、ＨＣＤＲ１は、配列番号：１０５、１１１、１１７、１２３及び１２９に示されるアミノ酸配列から選ばれる。別の具体的な実施形態において、ＨＣＤＲ１は、配列番号：１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、１６５、１７１、１７７、１８３、１８９、１９５及び２０１に示されるアミノ酸配列から選ばれる。好ましい実施形態において、ＨＣＤＲ１は、１２３、１２９及び２０１に示されるアミノ酸配列から選ばれる。
【0051】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される抗体重鎖可変領域は、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７６、８２、８８、９４及び１００から選ばれるアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態において、前記重鎖可変領域は、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７６、８２、８８、９４及び１００から選ばれるアミノ酸配列で構成される。
【0052】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７６、８２、８８、９４又は１００に示される配列と少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の相同性を有する。好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域は、配列番号：８２、８８又は１００に示されるアミノ酸配列と９９％以上の相同性を有する。
【0053】
本明細書で開示される抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域を含むことに加えて、軽鎖可変領域をさらに含むことができる。
【0054】
いくつかの実施形態において、前記軽鎖可変領域のＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）は、配列番号：１１０、１１６、１２２、１２８及び１３４に示されるアミノ酸配列から選ばれ、又は配列番号：１４０、１４６、１５２、１５８、１６４、１７０、１７６、１８２、１８８、１９４、２００及び２０６で示されるアミノ酸配列から選ばれる。好ましい実施形態において、ＬＣＤＲ３は、配列番号：１２８、１３４及び２０６で示されるアミノ酸配列から選ばれる。
【0055】
いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ２は、配列番号：１０９、１１５、１２１、１２７及び１３３に示されるアミノ酸配列から選ばれ、又は配列番号：１３９、１４５、１５１、１５７、１６３、１６９、１７５、１８１、１８７、１９３、１９９及び２０５に示されるアミノ酸配列から選ばれる。好ましい実施形態において、ＬＣＤＲ２は、配列番号：１２７、１３３及び２０５に示されるアミノ酸配列から選ばれる。
【0056】
いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号：１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、１９８及び２０４に示されるアミノ酸配列から選ばれ、又は配列番号：１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、１９８及び２０４に示されるアミノ酸配列から選ばれる。好ましい実施形態において、ＬＣＤＲ１は配列番号：１２６、１３２及び２０４に示されるアミノ酸配列から選ばれる。
【0057】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される抗体軽鎖可変領域は、配列番号：４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７３、７９、８５、９１、９７及び１０３から選ばれるアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態において、前記軽鎖可変領域は、配列番号：４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７３、７９、８５、９１、９７及び１０３から選ばれるアミノ酸配列で構成される。
【0058】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号：４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７３、７９、８５、９１、９７又は１０３に示される配列と少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の相同性を有する。好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域は、配列番号：８５、９１又は１０３に示される配列と９９％以上の相同性を有する。
【0059】
具体的な実施形態において、本明細書で開示される抗体又はその抗原結合部分の重鎖は、配列番号：７１、７７、８３、８９、９５及び１０１から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有し、例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する。より具体的な実施形態において、上記抗体重鎖は、配列番号：７１、７７、８３、８９、９５及び１０１から選ばれるアミノ酸配列で構成される。好ましい実施形態において、上記抗体重鎖のアミノ酸配列は配列番号：８３、８９又は１０１に示される通りである。
【0060】
具体的な実施形態において、本明細書で開示される抗体の軽鎖は、配列番号：７４、８０、８６、９２、９８及び１０４から選ばれる配列と少なくとも８０％の相同性を有し、例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する。より具体的な実施形態において、前記抗体軽鎖は、配列番号：７４、８０、８６、９２、９８及び１０４から選ばれるアミノ酸配列で構成される。好ましい実施形態において、上記抗体軽鎖のアミノ酸配列は配列番号：８６、９２又は１０４に示される通りである。
【0061】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される抗体の重鎖又は重鎖可変領域、軽鎖又は軽鎖可変領域は、上記に列挙されたそれぞれの対応する具体的なアミノ酸配列に基づいて少なくとも１つのアミノ酸を置換、欠失又は付加して得ることができ、且つ得られた変異体は依然としてＩＬ－４Ｒαに結合する活性を維持する。
【0062】
特定の実施形態において、上記アミノ酸の置換、欠失又は付加の数は１～３０個であり、好ましくは１～２０個であり、より好ましくは１～１０個である。好ましい実施形態において、配列の変異体は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸の置換、欠失及び／又は添加によって元のアミノ酸配列と異なる。より好ましい実施形態において、配列の変異体は、約１、２、３、４又は５個のアミノ酸の置換、欠失又は付加によって元のアミノ酸配列と異なる。具体的な実施形態において、前記アミノ酸置換は保存的置換である。
【0063】
好ましい実施形態において、本明細書で開示された抗体は抗体１３１－Ｈｕ、１３６－Ｈｕ又は２３６－Ｈｕであり、ここで、抗体１３１－Ｈｕの重鎖配列は配列番号：８３で示される通りであり、軽鎖配列は配列番号：８６で示される通りであり、ここで、ＣＤＲ配列は抗体１３１と同じであり；抗体１３６－Ｈｕの重鎖配列は配列番号：８９で示される通りであり、軽鎖配列は配列番号：９２で示される通りであり、ここで、ＣＤＲ配列は抗体１３６と同じであり；前記抗体２３６－Ｈｕの重鎖配列は配列番号：１０１で示される通りであり、軽鎖配列は配列番号：１０４で示される通りであり、ＣＤＲ配列は抗体２３６と同じである。
【0064】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される抗体又はその抗原結合部分は、抗体１３１－Ｈｕ、１３６－Ｈｕ又は２３６－Ｈｕとインターロイキン－４受容体αにおける同じエピトープに結合し、又は１３１－Ｈｕ、１３６－Ｈｕ又は２３６－Ｈｕとインターロイキン－４受容体αに競合的に結合する。
【0065】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される抗体はモノクローナル抗体である。具体的な実施形態において、本明細書で開示される抗体はヒト化抗体である。
【0066】
本明細書で開示される抗体又はその抗原結合部分は、ＩＬ－４Ｒαに特異的に結合することができる。具体的な実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＩＬ－４Ｒα又はマウスＩＬ－４Ｒαに特異的に結合する。好ましい実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＩＬ－４Ｒαに特異的に結合する。
【0067】
いくつかの実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、６００ｐＭ未満のＫＤでＩＬ－４Ｒαに結合する。好ましい実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、３５０ｐＭ未満のＫＤでヒトＩＬ－４ＲαなどのＩＬ－４Ｒαに結合する。
【0068】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される抗体又はその抗原結合部分は、ＩＬ－４によって誘導されるＴＦ－１細胞の増殖を阻害することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される抗体又はその抗原結合部分は、Ｂ細胞のＩｇＥ分泌を阻害することができる。
【0069】
例えば、本出願の発明者らは、本明細書で開示される抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体のインビトロ、インビボ生物学的実験を行い、結果により当該抗体はＩＬ－４Ｒαによく結合できることが示された。
【0070】
具体的には、本願の発明者らは、抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体に対して親和力の検出、ＩＬ－４／ＩＬ－１３とＩＬ－４Ｒαとの結合を遮断する実験の分析、インビトロ細胞機能の検出などの実験を行った。実験の結果により、本明細書で開示される抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体は細胞表面のＩＬ－４Ｒαに結合することができ、ＩＬ－４／ＩＬ－１３とＩＬ－４Ｒαとの間のシグナル伝達を遮断し、炎症反応の発生を阻害することが示された。
【0071】
本願は、本明細書で開示される抗体又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド分子、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞、及び当該抗体を調製及び精製する方法をさらに提供する。
【0072】
いくつかの実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド分子は、前記ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識されることができる調節配列に作動可能に結合する。
【0073】
いくつかの実施形態において、任意の適切な発現ベクターは本願に使用できる。例えば、前記発現ベクターは、ｐＴＴ５、ｐＵＣ５７、ｐＤＲ１、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐＤＨＦＦ及びｐＣＨＯ１．０のうちの１種であってもよい。発現ベクターには、適切な転写及び翻訳調節配列に結合する融合ＤＮＡ配列を含んでもよい。
【0074】
いくつかの実施形態において、使用可能な宿主細胞は上記発現ベクターを含む細胞であり、真核細胞であってもよく、例えば、哺乳動物又は昆虫宿主細胞系はすべて、本出願の抗体又はその抗原結合部分の発現に使用できる。例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＳ０、ｓｆ９及びｓｆ２１などはすべて、本発明に適用できる。前記宿主細胞は、ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＴＧ１など、上記発現ベクターを含む原核細胞であってもよい。
【0075】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体の調製方法は：発現条件下で、宿主細胞を培養することによって、抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体を発現するステップと、発現した抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体を分離及び精製するステップと、を含む。上記方法を使用して、組換えタンパク質を、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動でのシングルバンドなど、基本的に均一な物質に精製することができる。
【0076】
いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィ法により本明細書に開示される抗ＩＬ－４Ｒα抗体を分離及び精製することができ、使用するアフィニティーカラムの特性に応じて、高塩緩衝液、ＰＨ変更など、従来の方法を使用して、アフィニティーカラムに結合した抗ＩＬ－４Ｒα抗体を溶出することができる。
【0077】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるヒト化抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体は以下の方法によって得られる：実験室で調製したＩＬ－４Ｒα抗原でＢａｌｂ／ｃマウスを免疫し、高力価のマウスを複数回免疫した後、マウス脾細胞をハイブリドーマ細胞と融合させ、ＩＬ－４機能的活性を抑制するハイブリドーマ細胞株をスクリーニングする。より具体的には、本願の発明者らは大量の実験により、まずＩＬ－４Ｒα細胞外領域抗原、ＩＬ－４及びＩＬ－１３をそれぞれ発現し、これに基づいて、異なるアジュバントをＩＬ－４Ｒα抗原と混合してマウスを免疫し、次に上記マウスの脾細胞をハイブリドーマ細胞株ｓｐ２／０とさらに融合させ、融合後のハイブリドーマをＩＬ－４Ｒα細胞外領域抗原で陽性細胞株をスクリーニングし、ＩＬ－４／ＩＬ－１３のＩＬ－４Ｒαへの結合を遮断し、ＩＬ－４／ＩＬ－１３の機能を確実に阻害することを確認した後、標的細胞株を得る。標的分子がヒト化改変された後、軽鎖と重鎖遺伝子を真核細胞発現ベクターｐＣＨＯ１．０に同時にクローニングする。上記発現ベクターをリポソーム法によりＣＨＯ細胞へトランスフェクションし、次にピュロマイシンとメトトレキサートを使用して陽性細胞クローンをスクリーニングし、スクリーニングした高発現クローンを無血清培地で拡大培養し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティーカラムでヒト化抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体を分離又は精製する。
【0078】
別のいくつかの実施形態において、ＰＣＲ誘発変異などの当該分野の従来の技術を使用してマウス由来の親抗体を改変して、抗体のキメラ又はヒト化形式又は他の変異形式を生成することができる。本出願の親抗体は、例えば抗原相補性決定領域（ＣＤＲ）構造ドメイン内で誘発変異されて変異抗体を生成することができ、結合親和力（より低いＫＤ）、ＩＣ５０、特異性、優先的結合など、その標的性質の存在をスクリーニングすることができる。好ましくは、変異抗体の標的性質は親抗体の性質に対する改善である。好ましくは、アミノ酸で変異抗体を置き換え、親抗体分子の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸残基は除去され、且つその位置に異なる残基が挿入されている。誘発変異を代替するための最も関心のある部位は１つ以上のＣＤＲ領域であるが、フレームワーク領域（ＦＲ）の改変も考える。好ましくは、保存アミノ酸の置換であり、非保存アミノ酸改変を導入でき、得られた変異抗体を用いて標的性質をスクリーニングすることができる。
【0079】
いくつかの実施形態において、抗体の血清半減期を増加させるために、抗体のＦｃ領域を改変する。すでに確認されたヒトＦｃＲｎの抗体への結合能力を向上できる突然変異部位は主にＴ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｖ３０８Ｐ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｓがあり、本実施形態において、これらの位置のアミノ酸の突然変異によって抗体の血清半減期の延長を実現することができる。
【0080】
本出願は、本明細書で開示される抗体又はその抗原結合部分及び薬学的に許容されるベクターを含む薬物組成物を提供する。抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体など、本明細書で開示される上記抗ＩＬ－４Ｒα抗体は、薬学的に許容されるベクターと共に薬物製剤を調製することで、治療効果をより安定的に発揮することができる。いくつかの実施形態において、これらの製剤は、抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体など、本明細書で開示される抗ＩＬ－４Ｒα抗体のアミノ酸コア配列の配座完全性を保証できると同時に、タンパク質の多官能基を分解（凝縮、脱アミド化、又は酸化を含むが、これらに限定されない）から保護する。いくつかの実施形態において、液体製剤の場合は通常、２℃～８℃の条件下で少なくとも１年間安定的に保存できる。いくつかの実施形態において、凍結乾燥製剤の場合は、３０℃下で少なくとも６ヶ月間安定的に保持できる。
【0081】
いくつかの実施形態において、抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体製剤など、前記抗ＩＬ－４Ｒα抗体は、懸濁液、水針、凍結乾燥製剤などの製薬分野で一般的に使用されるものであってもよく、好ましくは、水針又は凍結乾燥製剤であり、抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体など、本明細書で開示される抗ＩＬ－４Ｒα抗体の水針又は凍結乾燥製剤に対して、薬学的に許容される補助材料には、界面活性剤、溶液安定剤、等張性調節剤及び緩衝液又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ツイン２０又は８０）、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、テトラデシル、リノレイル又はオクタデシルサルコシン、プルロニクス（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）、ＭＯＮＡＱＵＡＴＴＭなど、非イオン性界面活性剤が含まれるが、これらに限定されず、抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体が顆粒化する傾向を最小限にするような量で添加する必要がある。いくつかの実施形態において、溶液安定剤には、還元糖及び非還元糖などの糖、グルタミン酸ナトリウム又はヒスチジンなどのアミノ酸、トリオール、高級糖アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのアルコールのうちの１種又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。溶液安定剤は、最後に形成された製剤が当業者によって安定であると考えられる期間に安定するような量で添加する必要がある。等張性調節剤には、塩化ナトリウム、マンニトール又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。緩衝液には、Ｔｒｉｓ、ヒスチジン緩衝液、リン酸塩緩衝液又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【0082】
本出願は、抗ＩＬ－４Ｒα抗体、又は抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体などの抗ＩＬ－４Ｒα抗体を含む組成物を個体へ投与することを含む、ＩＬ－４Ｒα関連疾患を予防又は治療する方法さらに提供する。いくつかの実施形態において、ヒトを含む動物へ投与した後、抗免疫介在性炎症反応の効果は明らかである。具体的に、本明細書で開示される抗ＩＬ－４Ｒα抗体は、免疫介在性炎症反応を効果的に予防及び／又は治療することができ、抗炎症薬物として使用することができる。
【0083】
本出願は、ＩＬ－４Ｒα関連疾患又は病状を予防又は治療するための薬物の調製における、抗ＩＬ－４Ｒα抗体、又は抗ＩＬ－４Ｒα抗体を含む組成物の使用をさらに提供する。いくつかの実施形態において、前記ＩＬ－４Ｒα関連疾患又は病状は、免疫介在性炎症反応又は免疫介在性炎症性疾患である。
【0084】
いくつかの実施形態において、上記免疫介在性炎症反応又は免疫介在性炎症性疾患には、喘息、アレルギー、アトピー性皮膚炎、慢性副鼻腔炎、好酸球性食道炎、鼻ポリープ、乾癬、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、ブドウ膜炎、ベーチェットブドウ膜炎、ドライアイ及び慢性自発性蕁麻疹などが含まれるが、これらに限定されない。上記炎症関連疾患を除いて、本明細書で開示される抗ＩＬ－４Ｒα抗体は、多発性硬化症、クローン病、結腸炎、潰瘍性結腸炎、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病などの予防又は治療にも使用される。
【0085】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される抗ＩＬ－４Ｒα抗体は、抗免疫介在性炎症反応薬物として使用することができる。本出願で言及される抗免疫介在性炎症反応薬物は、免疫介在性炎症反応を阻害及び／又は治療する薬物を指し、例えば、免疫介在性炎症反応関連病状の進行を遅らせること及び／又はこれらの病状の重症度を軽減することができる。いくつかの実施形態において、前記薬物は、既存の炎症反応に伴う病状を軽減し、他の病状の出現を防止することができる。いくつかの実施形態において、前記薬物は、炎症反応の転移を軽減又は防止することができる。
【0086】
本明細書で開示される抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体及びその組成物を、人を含む動物へ投与する場合、投与量は、患者の年齢や体重、疾患の性質及び重症度、並びに投与経路に応じて異なり、動物実験の結果と全体的な状況を参照でき、総投与量は一定の範囲を超えてはならない。具体的な実施形態において、静脈内注射の用量は１～１８００ｍｇ／日である。
【0087】
抗体又はその組成物の投与量及び投与頻度は、疾患の予防又は治療に応じて変化することができる。予防的使用では、本出願の抗体又はその混合物を含む組成物を、患者の抵抗性を高めるために、まだ病状になっていない患者に投与する場合、当該量を「予防の有効量」と定義する。この使用では、具体的な投与量はまた患者の健康及び全身免疫性に依存する。通常、比較的頻繁ではない間隔で比較的低用量を長期間投与する。治療的使用では、疾患の進行が遅くなるか終了するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的又は完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量を投与する必要がある。その後、予防的方案を患者に投与することができる。当業者は、実際の必要に応じて具体的な投与量及び投与頻度を容易に把握することができる。
【0088】
本明細書及び特許請求の範囲において、「含む」、「含み」及び「含有」という用語は、「含むがこれらに限定されない」を意味し、且つ他の部分、添加物、構成又はステップを除外することを意図しない。
【0089】
本出願の特定の態様、実施形態又は実施例に記載されている特徴、特性、構成又はステップは、それと矛盾しない限り、本明細書に記載されている他の任意の態様、実施形態又は実施例に適用可能であることを理解されたい。
【0090】
上記の開示は、全体的に本発明を説明している。以下の具体的な実施例は、本発明をさらに説明するものであり、本発明を限定するものとして理解されるべきではない。実施例は、当業者によく知られており、分子クローニングマニュアル、コールドスプリングハーバーが出版しているプロトコール集（抗体技術）などの多くの出版物に記載されている従来の方法の詳細な説明を含まない。試薬の出所が示されていない場合は、従来の試薬である。
実施例
実施例
【0091】
実施例１ 可溶性ＩＬ－４Ｒα細胞外領域Ｆｃタグ及びＦｌａｇタグ抗原、参照抗体Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ及びＩＬ－４の調製
ヒトＩＬ－４Ｒα細胞外領域抗原配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２４３９４）に由来し、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓのコドン使用バイアスに従って、コドン最適化を行い、Ｎ末端第２６～２３２位アミノ酸フラグメントの遺伝子合成を行い、配列をｐＵＣ５７ベクターにサブクローニングし、ｐＵＣ５７－ｈＩＬ４Ｒα－ＥＣＤを得た。ヒトＩｇＧ１の定常領域配列は、Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂの配列（ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｖｏｌ．２３、Ｎｏ．４、２００９．Ｐ３４２を参照）に従って合成された。配列をｐＵＣ５７ベクターにサブクローニングし、ｐＵＣ５７－ＩｇＧ１－ＣＨを得た。ＰＣＲ法によりｈＦｃフラグメントとＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）をｈＩＬ４Ｒα－ＥＣＤフラグメントのＣ末端に挿入し、ｐＴＴ５発現ベクター（実験室で保存）に構築し、ｐＴＴ５（ｈＩＬ４Ｒα－ＥＣＤ－ｈＦｃ）とｐＴＴ５（ｈＩＬ４Ｒα－ＥＣＤ－Ｆｌａｇ）を得、次に配列決定を行い、完全に正しい配列を有するクローンを選択してトランスフェクションした。
ヒトＩＬ－４Ｒα細胞外領域抗原配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ２４３９４）に由来し、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓのコドン使用バイアスに従って、コドン最適化を行い、Ｎ末端第２６～２３２位アミノ酸フラグメントの遺伝子合成を行い、配列をｐＵＣ５７ベクターにサブクローニングし、ｐＵＣ５７－ｈＩＬ４Ｒα－ＥＣＤを得た。ヒトＩｇＧ１の定常領域配列は、Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂの配列（ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｖｏｌ．２３、Ｎｏ．４、２００９．Ｐ３４２を参照）に従って合成された。配列をｐＵＣ５７ベクターにサブクローニングし、ｐＵＣ５７－ＩｇＧ１－ＣＨを得た。ＰＣＲ法によりｈＦｃフラグメントとＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）をｈＩＬ４Ｒα－ＥＣＤフラグメントのＣ末端に挿入し、ｐＴＴ５発現ベクター（実験室で保存）に構築し、ｐＴＴ５（ｈＩＬ４Ｒα－ＥＣＤ－ｈＦｃ）とｐＴＴ５（ｈＩＬ４Ｒα－ＥＣＤ－Ｆｌａｇ）を得、次に配列決定を行い、完全に正しい配列を有するクローンを選択してトランスフェクションした。
【0092】
Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ（ＩｇＧ４、κ）のアミノ酸配列は、ｗｈｏ．ｉｎｔ（ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｖｏｌ．２６、Ｎｏ．４、２０１２．Ｐ４１２を参照）に由来し、コドン最適化後にヌクレオチド配列を全ゲノム合成し、ｐＴＴ５発現ベクターにクローニングし、配列決定の検証により、ｐＴＴ５（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ）と標識された正しいクローンベクターを得たことが確認された。ｐＴＴ５（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ）ベクターをＨＥＫ２９３Ｅ細胞株に一過性にトランスフェクションし、３ｍＭのバルプロ酸を含むＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地で５日培養した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社から購入）を使用して細胞培養上清からＤｕｐｉｌｕｍａｂ抗体タンパク質を精製した。
【0093】
ヒトＩＬ－４配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０５１１２）に由来し、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓのコドン使用バイアスに従って、コドン最適化を行い、Ｎ末端第２５～１５３位アミノ酸フラグメントの合成を行い、配列をｐＵＣ５７ベクターにサブクローニングした。ＰＣＲ法によりＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）をｈＩＬ４フラグメントのＣ末端に挿入し、ｐＴＴ５発現ベクターに構築し、ｐＴＴ５（ｈＩＬ４－Ｆｌａｇ）を得、次に配列決定を行い、完全に正しい配列を有するクローンを選択してトランスフェクションした。
【0094】
ＰＥＩ法によりプラスミドをＨＥＫ２９３Ｅ細胞株（実験室で保存）にトランスフェクションした。３ｍＭを含むバルプロ酸のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地（Ｇｉｂｃｏ社から購入）で５日培養した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社から購入）又はＦｌａｇアフィニティークロマトグラフィー（Ｓｉｇｍａ社から購入）を使用して細胞培養上清から標的タンパク質を精製した。タンパク質の定量は、ビスキノリンカルボン酸（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ、ＢＣＡ）方法により行われ、精製されたタンパク質は、次の更なる分析と研究に使用された。精製されたタンパク質は、次のマウス免疫及び更なる分析と研究に使用された。
【0095】
実施例２ ｈＩＬ－４Ｒα－ＥＣＤ－Ｆｃの免疫
１００μｇ／マウスのｈＩＬ－４Ｒα－ＥＣＤ－Ｆｃ抗原用生理食塩水を７５μｌに希釈した後、等体積の完全なフロイントアジュバントと混合し、超音波乳化の完了後に４～５週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（上海霊暢生物科技有限社から購入し、動物製造販売業の
）を複数の箇所に皮下注射した。３週間後、５０μｇ／マウスのタンパク質も７５μｌに希釈した後、等体積の不完全なフロイントアジュバントと混合し、超音波乳化の完了後にマウスを複数の箇所に皮下注射し、２週間後、この免疫を繰り返した。すべてのマウスは、３回目の免疫の１週間後に、テールカットで血液を採取し、血清を分離し、ｈＩＬ－４Ｒα－Ｆｃ抗原でコーティングされたＥＬＩＳＡによって血清学的力価を検出した。血清抗体価が１００００を超えるマウスの場合、採血の１週間後に免疫パルス療法を行い、尾静脈に１０μｇ抗原／１００μｌの生理食塩水／マウスを注射した。
１００μｇ／マウスのｈＩＬ－４Ｒα－ＥＣＤ－Ｆｃ抗原用生理食塩水を７５μｌに希釈した後、等体積の完全なフロイントアジュバントと混合し、超音波乳化の完了後に４～５週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（上海霊暢生物科技有限社から購入し、動物製造販売業の
【数1】
【0096】
力価はＥＬＩＳＡ法により検出された。１μｇ／ｍｌの濃度及び１ウェル当たり１００μｌのｈＩＬ－４ＲαＥＣＤ－Ｆｃ抗原でＥＬＩＳＡプレートをコーディングし、４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳＴ（０．５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０を含むＰＢＳ）でプレートを２回洗浄し、軽く叩いて乾燥させた。１％のＢＳＡを含むコーティング溶液２００μｌを各ウェルに添加して密閉し、常温下で４時間密閉した後に叩いて乾燥させ、－２０℃の冷蔵庫に保存して使用に備えた。検出時にＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに様々な濃度のマウス血清１００μｌを添加し、２つの２ウェルを設定し、室温で１．５時間培養した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後に叩いて乾燥させた。ＰＢＳＴ１：１００００倍で希釈したＨＲＰに標識されたウサギ抗マウスＩｇ抗体（Ｓｉｇｍａ社から購入）１００μｌを添加し、室温で１時間培養した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後に叩いて乾燥させた。各ウェルに１００μｌの発色液（使用直前にＥＬＩＳＡ発色Ａ液と発色Ｂ液を１：１の体積比で均一に混合）を加えて発色させ、次に各ウェルに１００μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４停止液をそれぞれ添加して、反応を終了させた。直ちに、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して４５０ｎｍの波長で各ウェルのＯＤ値を測定した。
【0097】
実施例３ ハイブリドーマの融合及びスクリーニング
ハイブリドーマｓｐ２／０細胞（中国科学院典型培養物保蔵委員会の細胞バンクから入手し、保蔵番号はＴＣＭ－１８）を３７℃、５％のＣＯ２インキュベータで培養し、融合の前日に培地を交換した。マウスの免疫パルス療法の３日後にマウス脾細胞を採取して融合させた。融合とスクリーニングの方法は次のとおりであった。マウス脾臓を採取し、粉砕及び洗浄後に脾細胞をカウントした。脾細胞をｓｐ２／０細胞と１０：１の比率で混合し、１５００ｒｐｍで７分間遠心分離した。上清を洗浄して除去した。１分間以内に１ｍｌのＰＥＧ（１４５０）を加え、９０秒間軽く振とうし、２．５分間以内に無血清ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社から購入）５ｍｌを加え、次に無血清培地５ｍｌを一度に加えて反応を停止させ、５分間放置し、１２８０ｒｐｍで８分間遠心分離した。９６ウェルプレートに２００万個のｓｐ２／０細胞の数に応じて、細胞を９６ウェルプレートに均一に接種し、各ウェルに２００μｌであった。まず、ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ、Ｈ）、メトトレキサート（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ、Ａ）及びチミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ、Ｔ）を含むＨＡＴ培地でスクリーニングし、３～４日ごとに半分量の培地を交換し、１０日目にＨＴ培地に交換した。１０日後、ハイブリドーマ細胞が９６ウェルプレートの底部の１０％以上を覆った時、ｈＩＬ－４Ｒα－ＥＣＤ－Ｆｃ抗原でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートでＥＬＩＳＡ検出を行うために上清を採取した。ＥＬＩＳＡ検出方法は実施例２に記載されている方法と同じであった。陽性ハイブリドーマを選択し、２４ウェルプレートにクローニングして拡大培養し、限界希釈法でサブクローニングし、標的抗体を安定的に発現したハイブリドーマ株を得た後に種保存及びバンク構築を行った。
ハイブリドーマｓｐ２／０細胞（中国科学院典型培養物保蔵委員会の細胞バンクから入手し、保蔵番号はＴＣＭ－１８）を３７℃、５％のＣＯ２インキュベータで培養し、融合の前日に培地を交換した。マウスの免疫パルス療法の３日後にマウス脾細胞を採取して融合させた。融合とスクリーニングの方法は次のとおりであった。マウス脾臓を採取し、粉砕及び洗浄後に脾細胞をカウントした。脾細胞をｓｐ２／０細胞と１０：１の比率で混合し、１５００ｒｐｍで７分間遠心分離した。上清を洗浄して除去した。１分間以内に１ｍｌのＰＥＧ（１４５０）を加え、９０秒間軽く振とうし、２．５分間以内に無血清ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社から購入）５ｍｌを加え、次に無血清培地５ｍｌを一度に加えて反応を停止させ、５分間放置し、１２８０ｒｐｍで８分間遠心分離した。９６ウェルプレートに２００万個のｓｐ２／０細胞の数に応じて、細胞を９６ウェルプレートに均一に接種し、各ウェルに２００μｌであった。まず、ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ、Ｈ）、メトトレキサート（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ、Ａ）及びチミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ、Ｔ）を含むＨＡＴ培地でスクリーニングし、３～４日ごとに半分量の培地を交換し、１０日目にＨＴ培地に交換した。１０日後、ハイブリドーマ細胞が９６ウェルプレートの底部の１０％以上を覆った時、ｈＩＬ－４Ｒα－ＥＣＤ－Ｆｃ抗原でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートでＥＬＩＳＡ検出を行うために上清を採取した。ＥＬＩＳＡ検出方法は実施例２に記載されている方法と同じであった。陽性ハイブリドーマを選択し、２４ウェルプレートにクローニングして拡大培養し、限界希釈法でサブクローニングし、標的抗体を安定的に発現したハイブリドーマ株を得た後に種保存及びバンク構築を行った。
【0098】
実施例４ マウス抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体によるｈＩＬ－４ＲαＥＣＤ－ＦｃへのＩＬ－４結合の遮断
ＥＬＩＳＡ法によってマウス抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体によるｈＩＬ－４Ｒα－ＥＣＤ－ＦｃへのＩＬ－４結合の遮断を研究した。ｈＩＬ－４抗原でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、密閉後にｈＩＬ－４Ｒα－ＥＣＤ－Ｆｃ及び３００μｌのサブクローニングにおけるマウス抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体のハイブリドーマ細胞を同時に加えて上清を培養し、最後にＨＲＰ－ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を加えて発色させて検出した。ＩＬ－４及びＩＬ－４Ｒα－ＥＣＤ－Ｆｃへの結合を遮断できる細胞株を、次のサブクローニングのために保持した。
ＥＬＩＳＡ法によってマウス抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体によるｈＩＬ－４Ｒα－ＥＣＤ－ＦｃへのＩＬ－４結合の遮断を研究した。ｈＩＬ－４抗原でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、密閉後にｈＩＬ－４Ｒα－ＥＣＤ－Ｆｃ及び３００μｌのサブクローニングにおけるマウス抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体のハイブリドーマ細胞を同時に加えて上清を培養し、最後にＨＲＰ－ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を加えて発色させて検出した。ＩＬ－４及びＩＬ－４Ｒα－ＥＣＤ－Ｆｃへの結合を遮断できる細胞株を、次のサブクローニングのために保持した。
【0099】
実施例５ マウス抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体のヒトＩＬ－４Ｒαに結合するＥＣ５０
好ましいマウス抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティークロマトグラフィーカラムによりアフィニティー精製した後、ＢＣＡ法により定量を実施した。抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体のｈＩＬ－４Ｒαに結合するＥＣ５０はＥＬＩＳＡにより検出された。検出方法は実施例３に示された通りである。１μｇ／ｍｌのｈＩＬ－４Ｒα－ＥＣＤ－Ｆｃ抗原でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、様々な濃度のマウス抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体を加えて検出した。
好ましいマウス抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティークロマトグラフィーカラムによりアフィニティー精製した後、ＢＣＡ法により定量を実施した。抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体のｈＩＬ－４Ｒαに結合するＥＣ５０はＥＬＩＳＡにより検出された。検出方法は実施例３に示された通りである。１μｇ／ｍｌのｈＩＬ－４Ｒα－ＥＣＤ－Ｆｃ抗原でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、様々な濃度のマウス抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体を加えて検出した。
【0100】
２６６個の構築された抗体を分析し、図１は代表的な実験結果であった。表６には一部の好ましい抗体のＥＣ５０データがリストされ、これらの抗体のヒトＩＬ－４Ｒαに対する親和力が比較的高く、ＥＣ５０はいずれも約１０ｎｇ／ｍｌであった。
【0101】
【表6】
【0102】
実施例６ マウス抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体の、ｈＩＬ－４又はｈＩＬ－１３によって誘導されるＴＦ－１細胞増殖に対する阻害
３回目のサブクローニング後のハイブリドーマ細胞株を拡大して無血清培養し、次に細胞の上清を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（ＧＥ社から購入）アフィニティーカラムを使用して抗体を精製した。精製後の抗体の定量を実施し、その機能的活性を検証した。
３回目のサブクローニング後のハイブリドーマ細胞株を拡大して無血清培養し、次に細胞の上清を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ（ＧＥ社から購入）アフィニティーカラムを使用して抗体を精製した。精製後の抗体の定量を実施し、その機能的活性を検証した。
【0103】
ＴＦ－１細胞は、ヒト赤血球系の白血病患者の骨髄から分離及び培養されたサイトカイン依存性細胞株であった。研究によると、ＴＦ－１細胞はｈＩＬ－４又はｈＩＬ－１３の刺激下でよく成長するため、優れたＩＬ－４シグナル伝達経路の機能を検証するモデルにすることが可能であった。
【0104】
成長状態が良好なＴＦ－１細胞（ＡＴＣＣから入手し、保蔵番号はＣＲＬ－２００３である）を採取し、カウント後に最終濃度２０ｎｇ／ｍｌの組換えｈＩＬ－４又はｈＩＬ－１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入）と共に２×１０５／１００μｌの細胞懸濁液に再懸濁した。培地は、１０％のウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ社から購入）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ社から購入）及び１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社から購入）を含み、ＲＰＭＩ－１６４０完全培地と呼ばれるＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社から購入）であった。培地溶液で様々な濃度のマウス抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体（２０μｇ／ｍｌ～３ｎｇ／ｍｌ、３倍で希釈、９個の異なる濃度）を希釈し、各ウェルに１００μｌで、９６ウェル平底細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社から購入）に加え、次に各ウェルに１００μｌの細胞懸濁液を加えた。各群に２つの複製ウェルを設定し、３７℃、５％のＣＯ２で７２時間培養した。各ウェルに２０μｌのＣＣＫ－８溶液（Ｄｏｊｉｎｄｏ社から購入）を加え、８時間培養を続け、均一に混合した後にマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して４５０ｎｍの波長で各ウェルのＯＤ値を測定し、細胞増殖の比率を計算した。
【0105】
上記２６６個のマウス抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体の、ＩＬ－４によって誘導されるＴＦ－１細胞増殖に対する阻害機能活性を分析すると（図２）、好ましい１７個の抗体のデータは表７に示される通りであった。
【0106】
【表7】
【0107】
実施例７ マウス抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体配列の測定
Ｔｒｉｚｏｌ（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を使用して各ハイブリドーマ細胞株の総ＲＮＡを抽出し、逆転写キット（Ｔａｋａｒａ社から購入）でｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。マウス抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の遺伝子を、文献で報告されたプライマーを用いてＰＣＲによって増幅し、次にＰＣＲ産物をｐＧＥＭ－Ｔベクターにクローニングし、配列決定し、可変領域の遺伝子配列を分析した。様々な機能実験と初期ドラッガビリティ分析の結果に基づいて、最終的に表２に記載されている１７個の抗体をリード抗体として選択し、配列決定によってその軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のヌクレオチド配列を得た。形質転換されたアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋでアラインメント分析され、すべての配列はマウスＩｇＧ可変領域の遺伝子特性と一致した。更なる配列分析の結果により、５４、５５、５７、６４、７５、８１、８３、８４、８８、１００、２２８、２３６号抗体の軽鎖と重鎖ＣＤＲ配列はいずれも非常に類似し、わずかなアミノ酸の違いがあり、２９、５９、１２０、１３１、１３６号抗体の軽鎖と重鎖ＣＤＲ配列は非常に類似していることが示された。２９号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：１に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：２に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：３に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：４に示された。５９号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：５に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：６に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：７に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：８に示される通りであった。１２０号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：９に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：１０に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：１１に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：１２に示される通りであった。１３１号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：１３に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：１４に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：１５に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：１６に示される通りであった。１３６号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：１７に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：１８に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：１９に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：２０に示される通りであった。５４号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：２１に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：２２に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：２３に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：２４に示される通りであった。５５号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：２５に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：２６に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：２７に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：２８に示される通りであった。５７号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：２９に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：３０に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：３１に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：３２に示される通りであった。６４号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：３３に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：３４に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：３５に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：３６に示される通りであった。７５号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：３７に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：３８に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：３９に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：４０に示される通りであった。８１号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：４１に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：４２に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：４３に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：４４に示される通りであった。８３号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：４５に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：４６に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：４７に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：４８に示される通りであった。８４号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：４９に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：５０に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：５１に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：５２に示される通りであった。８８号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：５３に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：５４に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：５５に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：５６に示される通りであった。１００号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：５７に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：５８に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：５９に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：６０に示される通りであった。２２８号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：６１に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：６２に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：６３に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：６４に示される通りであった。２３６号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：６５に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：６６に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：６７に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：６８に示される通りであった。
Ｔｒｉｚｏｌ（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を使用して各ハイブリドーマ細胞株の総ＲＮＡを抽出し、逆転写キット（Ｔａｋａｒａ社から購入）でｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。マウス抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の遺伝子を、文献で報告されたプライマーを用いてＰＣＲによって増幅し、次にＰＣＲ産物をｐＧＥＭ－Ｔベクターにクローニングし、配列決定し、可変領域の遺伝子配列を分析した。様々な機能実験と初期ドラッガビリティ分析の結果に基づいて、最終的に表２に記載されている１７個の抗体をリード抗体として選択し、配列決定によってその軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のヌクレオチド配列を得た。形質転換されたアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋでアラインメント分析され、すべての配列はマウスＩｇＧ可変領域の遺伝子特性と一致した。更なる配列分析の結果により、５４、５５、５７、６４、７５、８１、８３、８４、８８、１００、２２８、２３６号抗体の軽鎖と重鎖ＣＤＲ配列はいずれも非常に類似し、わずかなアミノ酸の違いがあり、２９、５９、１２０、１３１、１３６号抗体の軽鎖と重鎖ＣＤＲ配列は非常に類似していることが示された。２９号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：１に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：２に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：３に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：４に示された。５９号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：５に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：６に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：７に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：８に示される通りであった。１２０号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：９に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：１０に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：１１に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：１２に示される通りであった。１３１号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：１３に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：１４に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：１５に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：１６に示される通りであった。１３６号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：１７に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：１８に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：１９に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：２０に示される通りであった。５４号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：２１に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：２２に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：２３に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：２４に示される通りであった。５５号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：２５に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：２６に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：２７に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：２８に示される通りであった。５７号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：２９に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：３０に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：３１に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：３２に示される通りであった。６４号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：３３に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：３４に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：３５に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：３６に示される通りであった。７５号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：３７に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：３８に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：３９に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：４０に示される通りであった。８１号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：４１に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：４２に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：４３に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：４４に示される通りであった。８３号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：４５に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：４６に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：４７に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：４８に示される通りであった。８４号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：４９に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：５０に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：５１に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：５２に示される通りであった。８８号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：５３に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：５４に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：５５に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：５６に示される通りであった。１００号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：５７に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：５８に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：５９に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：６０に示される通りであった。２２８号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：６１に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：６２に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：６３に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：６４に示される通りであった。２３６号抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：６５に示され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：６６に示され、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号：６７に示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号：６８に示される通りであった。
【0108】
実施例８ 抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体のヒト化
配列分析の結果により、２９、５９、１３１、１３６、２２８及び２３６号抗体を選択し、キメラ抗体とヒト化抗体を構築した。キメラ抗体の構築はマウス抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を採取し、ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲを使用してヒトＩｇＧ４の軽鎖と重鎖の定常領域（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ抗体に由来）にそれぞれ結合して形成された。
配列分析の結果により、２９、５９、１３１、１３６、２２８及び２３６号抗体を選択し、キメラ抗体とヒト化抗体を構築した。キメラ抗体の構築はマウス抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を採取し、ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲを使用してヒトＩｇＧ４の軽鎖と重鎖の定常領域（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ抗体に由来）にそれぞれ結合して形成された。
【0109】
Ｋａｂａｔ法則に従ってマウス抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を分析し、３つのＣＤＲと４つのＦＲを決定した。１３６号抗体を例として、その重鎖相補性決定領域のアミノ酸配列は、ＨＣＤＲ１：ＤＹＧＭＨ（配列番号：１２９）、ＨＣＤＲ２：ＹＩＳＳＧＳＴＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧ（配列番号：１３０）及びＨＣＤＲ３：ＩＳＴＶＶＡＫＲＹＡＭＤＹ（配列番号：１３１）であり、軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列は、ＬＣＤＲ１：ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号：１３２）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号：１３３）及びＬＣＤＲ３：ＱＱＩＮＡＬＰＬＴ（配列番号：１３４）であった。
【0110】
ＮＣＢＩ ＩｇＢｌａｓｔとヒトＩｇＧ生殖系配列（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ）の相同性比較により、ＩＧＨＶ３－４８＊０１を重鎖ＣＤＲ移植テンプレートとして選択し、マウス抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体１３６の重鎖ＣＤＲ領域をＩＧＨＶ３－４８＊０１骨格領域に移植して、重鎖のＣＤＲ移植抗体を構築した。同様に、ヒトＩｇＧ生殖系配列との相同性比較により、ＩＧＫＶ１－３３＊０１を軽鎖ＣＤＲ移植テンプレートとして選択し、マウス抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体１３６の軽鎖ＣＤＲ領域をＩＧＫＶ１－３３＊０１骨格領域に移植して、軽鎖のＣＤＲ移植抗体を構築し、得られた抗体は１３６－Ｇｒ（１３６－Ｇｒａｆｔｉｎｇ）として定義された。同時に、これに基づいて、いくつかのフレームワーク領域のアミノ酸部位に復帰突然変異が行われた。復帰突然変異時、アミノ酸配列はＫａｂａｔによってコーディングされ、部位の位置はＫａｂａｔコードで示された。好ましくは、軽鎖可変領域配列の場合、Ｋａｂａｔによってコーディングされた第７３位のＦ復帰がマウスＬであり、同時にＣＤＲ３の第９６位のＬをＦに突然変異させた。重鎖可変領域には復帰突然変異がなかった。上記可変領域の遺伝子配列は生工生物のＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓコドン使用バイアスに従ってコドン最適化が行われ、合成された。合成されたヒト化可変領域配列をヒトＩｇＧ４定常領域に結合し、当該抗体は１３６号抗体のヒト化抗体（１３６－Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ、１３６－Ｈｕ）として定義された。
【0111】
上記と同じ原理を使用して、残りの５つの抗体も同様にヒト化させた。ｐＴＴ５ベクター（ＮＲＣ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入）を使用してヒト化重鎖、軽鎖の一過性発現ベクターをそれぞれ構築し、上記の軽鎖と重鎖の組み合わせをＨＥＫ２９３システム（ＮＲＣ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから購入）により一過性にトランスフェクションし、抗体を発現させた。ＨＥＫ２９３細胞はＦｒｅｅ Ｓｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ社から購入）培地で培養され、ＰＥＩトランスフェクション法によりプラスミドを５日間細胞に移し、細胞上清を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａにより精製した後に抗体を得た。
【0112】
最終的に、２９号抗体のヒト化後の重鎖可変領域の遺伝子配列は、全長３６６ｂｐであり、１２２個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号：６９に示され、アミノ酸配列は配列番号：７０に示され、ヒト化後の軽鎖可変領域の遺伝子配列は、全長３２１ｂｐであり、１０７個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号：７２に示され、アミノ酸配列は配列番号：７３に示される通りであった。ヒトＩｇＧ４定常領域に結合された後、最終的に４４８個のアミノ酸の２９－Ｈｕヒト化重鎖（配列は配列番号：７１に示される通りである）及び２１４個のアミノ酸の２９－Ｈｕヒト化軽鎖（配列は配列番号：７４に示される通りである）を得た。
【0113】
５９号抗体のヒト化後の重鎖可変領域の遺伝子配列は、全長３５４ｂｐであり、１１８個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号：７５に示され、アミノ酸配列は配列番号：７６に示され、ヒト化後の軽鎖可変領域の遺伝子配列は、全長３１８ｂｐであり、１０６個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号：７８に示され、アミノ酸配列は配列番号：７９に示される通りであった。ヒトＩｇＧ４定常領域に結合された後、最終的に４４４個のアミノ酸の５９－Ｈｕヒト化重鎖（配列は配列番号：７７に示される通りである）及び２１３個のアミノ酸の５９－Ｈｕヒト化軽鎖（配列は配列番号：８０に示される通りである）を得た。
【0114】
１３１号抗体のヒト化後の重鎖可変領域の遺伝子配列は、全長３６６ｂｐであり、１２２個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号：８１に示され、アミノ酸配列は配列番号：８２に示され、ヒト化後の軽鎖可変領域の遺伝子配列は、全長３２１ｂｐであり、１０７個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号：８４に示され、アミノ酸配列は配列番号：８５に示された。ヒトＩｇＧ４定常領域に結合された後、最終的に４４８個のアミノ酸の１３１－Ｈｕヒト化重鎖（配列は配列番号：８３に示される）及び２１４個のアミノ酸の１３１－Ｈｕヒト化軽鎖（配列は配列番号：８６に示される）を得た。
【0115】
１３６号抗体のヒト化後の重鎖可変領域の遺伝子配列は、全長３６６ｂｐであり、１２２個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号：８７に示され、アミノ酸配列は配列番号：８８に示され、ヒト化後の軽鎖可変領域の遺伝子配列は、全長３２１ｂｐであり、１０７個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号：９０に示され、アミノ酸配列は配列番号：９１に示された。ヒトＩｇＧ４定常領域に結合された後、最終的に４４８個のアミノ酸の１３６－Ｈｕヒト化重鎖（配列は配列番号：８９に示される）及び２１４個のアミノ酸の１３６－Ｈｕヒト化軽鎖（配列は配列番号：９２に示される）を得た。
【0116】
２２８号抗体のヒト化後の重鎖可変領域の遺伝子配列は、全長３６０ｂｐであり、１２０個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号：９３に示され、アミノ酸配列は配列番号：９４に示され、ヒト化後の軽鎖可変領域の遺伝子配列は、全長３１８ｂｐであり、１０６個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号：９６に示され、アミノ酸配列は配列番号：９７に示された。ヒトＩｇＧ４定常領域に結合された後、最終的に４４６個のアミノ酸の２２８－Ｈｕヒト化重鎖（配列は配列番号：９５に示される）及び２１３個のアミノ酸の２２８－Ｈｕヒト化軽鎖（配列は配列番号：９８に示される）を得た。
【0117】
２３６号抗体のヒト化後の重鎖可変領域の遺伝子配列は、全長３６０ｂｐであり、１２０個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号：９９に示され、アミノ酸配列は配列番号：１００に示され、ヒト化後の軽鎖可変領域の遺伝子配列は、全長３１８ｂｐであり、１０６個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列は配列番号：１０２に示され、アミノ酸配列は配列番号：１０３に示された。ヒトＩｇＧ４定常領域に結合された後、最終的に４４６個のアミノ酸の２３６－Ｈｕヒト化重鎖（配列は配列番号：１０１に示される）及び２１３個のアミノ酸の２３６－Ｈｕヒト化軽鎖（配列は配列番号：１０４に示される）を得た。
【0118】
実施例９ ＩＬ－４Ｒαに対するヒト化抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体の親和力
発現及び精製された６個のヒト化抗体の親和力は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により検出され、参照抗体Ｄｕｐｉｌｕｍａｂをコントロールとした。具体的な実験方法は次の通りであった。Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ａ ＣＭ５センサチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、ＦＣ１（Ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ １）を参照チャネルとし、ＦＣ２（Ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ ２）をサンプルチャネルとした。ＦＣ２チャネルからヒト抗体又はコントロール抗体をそれぞれ捕捉し、次に様々な濃度のｈＩＬ－４Ｒα－ＥＣＤ－Ｆｌａｇを注射した。循環条件は、ＦＣｓのすべてのチャネルにおいて、５０μｌ／ｍｉｎで分析物を４分間注射し、解離時間は２０分であり、１０μｌ／ｍｉｎの速度で６Ｍの塩酸グアニジン（国薬グループ化学試薬有限社）を３０秒間注射して表面再生を行い、次にＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ１．０を使用して捕捉抗体のシグナルと捕捉抗体を含まないシグナルとの差及び相互作用の親和力を計算した。表８に示されるように、ｈＩＬ－４Ｒα－ＥＣＤ－Ｆｌａｇに対するヒト化後の抗体１３６－Ｈｕ及び２３６－Ｈｕの親和力は、参照抗体Ｄｕｐｉｌｕｍａｂよりも有意に高かった。
発現及び精製された６個のヒト化抗体の親和力は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により検出され、参照抗体Ｄｕｐｉｌｕｍａｂをコントロールとした。具体的な実験方法は次の通りであった。Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ａ ＣＭ５センサチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、ＦＣ１（Ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ １）を参照チャネルとし、ＦＣ２（Ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ ２）をサンプルチャネルとした。ＦＣ２チャネルからヒト抗体又はコントロール抗体をそれぞれ捕捉し、次に様々な濃度のｈＩＬ－４Ｒα－ＥＣＤ－Ｆｌａｇを注射した。循環条件は、ＦＣｓのすべてのチャネルにおいて、５０μｌ／ｍｉｎで分析物を４分間注射し、解離時間は２０分であり、１０μｌ／ｍｉｎの速度で６Ｍの塩酸グアニジン（国薬グループ化学試薬有限社）を３０秒間注射して表面再生を行い、次にＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ１．０を使用して捕捉抗体のシグナルと捕捉抗体を含まないシグナルとの差及び相互作用の親和力を計算した。表８に示されるように、ｈＩＬ－４Ｒα－ＥＣＤ－Ｆｌａｇに対するヒト化後の抗体１３６－Ｈｕ及び２３６－Ｈｕの親和力は、参照抗体Ｄｕｐｉｌｕｍａｂよりも有意に高かった。
【0119】
【表8】
【0120】
実施例１０ ＴＦ－１細胞増殖に対するヒト化抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体の阻害
ＴＦ－１細胞増殖に対するヒト化抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体の阻害実験は、実施例６を参照して行われた。その結果は図３に示される通りである。表９に示されるように、ＩＬ－４によって介在されるＴＦ－１細胞増殖に対するヒト化抗体１３１－Ｈｕ、１３６－Ｈｕ及び２３６－Ｈｕの阻害機能は、参照抗体Ｄｕｐｉｌｕｍａｂよりも有意に高かった。
ＴＦ－１細胞増殖に対するヒト化抗ヒトｈＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体の阻害実験は、実施例６を参照して行われた。その結果は図３に示される通りである。表９に示されるように、ＩＬ－４によって介在されるＴＦ－１細胞増殖に対するヒト化抗体１３１－Ｈｕ、１３６－Ｈｕ及び２３６－Ｈｕの阻害機能は、参照抗体Ｄｕｐｉｌｕｍａｂよりも有意に高かった。
【0121】
【表9】
【0122】
実施例１１ 末梢血由来Ｂ細胞のＩｇＥ分泌に対するヒト化抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体の阻害
喘息の発症中、ＩＬ－４及びＩＬ－１３は、Ｂ細胞のＩｇＭからＩｇＥへの変換を誘発し、大量のＩｇＥを分泌し、ＩｇＥは好中球、リンパ球及び肥満細胞表面の受容体に結合された後、免疫応答を活性化して、気道を狭め、炎症反応を引き起こし、それにより喘息の病状を悪化させる。従って、抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体の機能的活性の１つは、Ｂ細胞のＩｇＥ分泌を阻害することである。ヒト化抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体のこの活性を検証した。
喘息の発症中、ＩＬ－４及びＩＬ－１３は、Ｂ細胞のＩｇＭからＩｇＥへの変換を誘発し、大量のＩｇＥを分泌し、ＩｇＥは好中球、リンパ球及び肥満細胞表面の受容体に結合された後、免疫応答を活性化して、気道を狭め、炎症反応を引き起こし、それにより喘息の病状を悪化させる。従って、抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体の機能的活性の１つは、Ｂ細胞のＩｇＥ分泌を阻害することである。ヒト化抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体のこの活性を検証した。
【0123】
Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Ｓｉｇｍａ社から購入）を使用して、新鮮なヒト末梢血（長海医院から提供される）から単一の核細胞を分離した。ＲＰＭＩ－１６４０完全培地を使用して細胞を５×１０５／ｍｌの細胞懸濁液に再懸濁し、９６ウェルの細胞培養プレートに１００μｌの細胞懸濁液を加えると同時に、１００μｌの２０ｎｇ／ｍｌの組換えｈＩＬ－４及び様々な濃度の抗ヒトｈＩＬ－４Ｒα抗体（２０μｇ／ｍｌ～３ｎｇ／ｍｌ）を加え、３７℃、５％のＣＯ２条件下で１４日間培養した。次に１００μｌの細胞液上清を採取し、ＥＬＩＳＡでＩｇＥの含有量を検出した。
【0124】
ＥＬＩＳＡ分析法は次の通りであった。２．５μｇ／ｍｌの濃度及び１ウェル当たり１００μｌのマウス抗ヒトＩｇＥでＥＬＩＳＡプレート（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入）をコーティングし、４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳＴでプレートを２回洗浄し、叩いて乾燥させた。１％のＢＳＡを含むコーティング溶液２００μｌを各ウェルに添加して密閉し、常温下で４時間密閉した後に叩いて乾燥させ、－２０℃の冷蔵庫に保存して使用に備えた。検出時に、最終濃度がそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌ、３３ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、３．７ｎｇ／ｍｌ、１．２ｎｇ／ｍｌ、４１０ｐｇ／ｍｌ、１３０ｐｇ／ｍｌ及び４６ｐｇ／ｍｌになるように、培地でｈＩｇＥ標準品（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入）を調製し、コーティングされたＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１００μｌを添加し、各濃度で２つの複製ウェルを設定し、コーティングされたＥＬＩＳＡプレートに１００μｌの細胞上清を加え、室温で１．５時間培養した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後に叩いて乾燥させた。各ウェルに１００μｌのビオチン化されたラット抗ヒトＩｇＥ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで１０００倍に希釈させる）を加え、室温で１時間培養した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後に叩いて乾燥させた。各ウェルに１００μｌのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入し、１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで１０００倍に希釈させる）を加え、室温で１時間培養した。各ウェルに１００μｌの発色液（使用直前にＥＬＩＳＡ発色Ａ液と発色Ｂ液を１：１の体積比で均一に混合する）を加えて発色させ、次に各ウェルに１００μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４停止液をそれぞれ加えて反応を終了させた。直ちに、マイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍの波長で各ウェルのＯＤ値を測定した。結果により、Ｄｕｐｉｌｕｍａｂに比べて、１３１－Ｈｕ、１３６－Ｈｕ及び２３６－Ｈｕは、末梢血Ｂ細胞のＩｇＥ分泌に対する阻害効果はより強く、Ｄｕｐｉｌｕｍａｂよりも優れた機能的活性を有する（図４）ことが示された。
【0125】
実施例１２ カニクイザル体内におけるヒト化抗ヒトＩＬ－４Ｒαモノクローナル抗体の薬物動態研究
ヒト化抗体に基づいて、抗体のＦｃ領域が改変され、Ｆｃ領域の突然変異の部位は主にＴ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｖ３０８Ｐ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｓであった。Ｆｃの変化は抗体の半減期を変えるために使用され、より長い半減期は投与の頻度を減らすことができる。
ヒト化抗体に基づいて、抗体のＦｃ領域が改変され、Ｆｃ領域の突然変異の部位は主にＴ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｖ３０８Ｐ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｓであった。Ｆｃの変化は抗体の半減期を変えるために使用され、より長い半減期は投与の頻度を減らすことができる。
【0126】
カニクイザルの単回投与後の０ｈ、１ｈ、４ｈ、１０ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、１２０ｈ、１６８ｈ、２４０ｈ、３３６ｈ、４０８ｈ、５０４ｈ、６７２ｈ、８４０ｈ、１００８ｈ、１１７６ｈ、１３４４ｈ、１５１２ｈ、１６８０ｈ及び１８４８ｈで血液サンプルを採取し、薬物動態分析を行った。検証済みのＥＬＩＳＡ法を使用して検出抗体の血中薬物濃度を測定した。本研究の分析方法の定量範囲は１５．６３～１０００．００ｎｇ／ｍＬであり、すべての濃度ポイントの標準サンプルは１００％のカニクイザル血清から調製された。ｓｃ投与後のＦｃ非突然変異コントロール群抗体とＦｃ領域改変後の抗体の薬物動態パラメータは表１０、表１１に示される通りである。各群の動物数は、メスとオスがそれぞれ１匹で、合計２匹であり、投与経路は皮下注射（ｓｃ）あり、投与量は５ｍｇ／ｋｇであった。
【0127】
【表10】
【0128】
【表11】
【0129】
コントロール群と比較して、Ｆｃ領域改変後の抗体はｓｃ投与後、薬物クリアランスは比較的滑らかであり、抗体の血清半減期は有意に延長され（図５）、ここで、３０５－Ａ－ｓｃはコントロール群であり、３０５－Ｂ－ｓｃはＦｃ領域改変後の抗体であった。本実験は、「軍科正源（北京）薬物研究株式会社」から委託されて完了した。
【0130】
実施例１３ Ｂ－ｈＩＬ－４／ｈＩＬ－４ＲＡ二重ヒト化マウス喘息様肺炎に基づいたモデリング及び薬物薬効学実験
標的分子をパイロットスケールで作製及び開発し、得られた１５０ｍｇ／ｍｌの安定製剤を３０５－Ｂと名付けた。インビボ薬効学研究のために、ＩＬ－４／ＩＬ－４Ｒα二重ヒト化マウス（Ｂ－ｈＩＬ－４／ｈＩＬ－４ＲＡ又はＢ－ｈＩＬ－４／ＩＬ４ＲＡマウス）を使用した。これらのＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドマウスでは、マウスＩＬ－４及びＩＬ－４Ｒαはノックアウトされ、ヒトＩＬ－４及びＩＬ－４Ｒα遺伝子に置換された。ヒト化マウスは正常マウスと同じ表現を示し、異常は見つからなかった。ヒト化マウスの構築及びマウス喘息モデルにおける３０５－Ｂの薬効学研究は、北京百奥賽図遺伝子生物技術株式会社から委託されて完了した。
標的分子をパイロットスケールで作製及び開発し、得られた１５０ｍｇ／ｍｌの安定製剤を３０５－Ｂと名付けた。インビボ薬効学研究のために、ＩＬ－４／ＩＬ－４Ｒα二重ヒト化マウス（Ｂ－ｈＩＬ－４／ｈＩＬ－４ＲＡ又はＢ－ｈＩＬ－４／ＩＬ４ＲＡマウス）を使用した。これらのＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドマウスでは、マウスＩＬ－４及びＩＬ－４Ｒαはノックアウトされ、ヒトＩＬ－４及びＩＬ－４Ｒα遺伝子に置換された。ヒト化マウスは正常マウスと同じ表現を示し、異常は見つからなかった。ヒト化マウスの構築及びマウス喘息モデルにおける３０５－Ｂの薬効学研究は、北京百奥賽図遺伝子生物技術株式会社から委託されて完了した。
【0131】
試験では、オボアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、ＯＶＡ）で感作された喘息様肺炎のマウスモデルを使用した。マウスは、ＯＶＡで感作された後にＯＶＡのエアロゾル吸入によってＴｈ２型免疫応答を誘発し、肺内の好酸球浸潤の増加が観察され、同時に血清中のＩｇＥ濃度は有意に増加した。このモデルを使用して抗体の抗アレルギー性喘息機能を評価した。Ｄｕｐｉｌｕｍａｂを陽性コントロールとした。３０５－Ｂは被験物質であり、その主な成分は抗ヒトＩＬ－４Ｒαヒト化モノクローナル抗体であった。
【0132】
４９匹の動物を体重に応じて無作為に７群に分け、各群７匹であり、Ｇ１はＰＢＳモデル群、Ｇ２はＤｕｐｉｌｕｍａｂ陽性コントロール（５０ｍｇ／ｋｇ）群、Ｇ３は試験品３０５－Ｂ（０．５ｍｇ／ｋｇ）群、Ｇ４は試験品３０５－Ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）群、Ｇ５は試験品３０５－Ｂ（２５ｍｇ／ｋｇ）群、Ｇ６は試験品３０５－Ｂ（５０ｍｇ／ｋｇ）群、Ｇ７はモデル化されていないナイーブ群であった。Ｇ１～Ｇ６群の動物はすべてＯＶＡによって感作され、マウスは、０、７、１４日目にＯＶＡの腹腔内注射によって感作され、２１～２５日目にＯＶＡのエアロゾル吸入によって刺激された。各群の動物は、２０日目と２３日目に薬物投与により介入を受けた。
【0133】
ナイーブ群と比較して、ＰＢＳモデル群の血清中のＩｇＥは有意に増加し、肺胞洗浄液中の白血球における好酸球の割合は有意に増加した。組織病理学的結果は、肺組織における混合炎症細胞浸潤及び好酸球浸潤が有意に増強され、且つ粘液の分泌が有意に増加したことが示され、モデリングに成功したことが示された。
【0134】
ＰＢＳモデル群と比較して、試験品３０５－Ｂ（０．５ｍｇ／ｋｇ）群の血清ＩｇＥは有意に低下し（ｐ＜０．０５）、陽性コントロールＤｕｐｉｌｕｍａｂ（５０ｍｇ／ｋｇ）群及び試験品３０５－Ｂ（５ｍｇ／ｋｇ）、（２５ｍｇ／ｋｇ）、（５０ｍｇ／ｋｇ）群の血清ＩｇＥはいずれも、有意に低下し（ｐ＜０．０００１）、詳しくは図６を参照できる；３０５－Ｂ（０．５ｍｇ／ｋｇ）群を除いて、各投与群の白血球における好酸球の割合（Ｅｏｓ／ＷＢＣ％）はいずれも、有意に低下し（ｐ＜０．０００１）、詳しくは図７を参照できる；３０５－Ｂ（０．５ｍｇ／ｋｇ）群を除いて、各投与群の肺組織ではいずれも、有意な好酸球浸潤がなく、好酸球の得点は有意に低下し（ｐ＜０．０５）、詳しくは図８を参照できる；３０５－Ｂ（２５ｍｇ／ｋｇ）、（５０ｍｇ／ｋｇ）群は肺部粘液の形成を有意に改善し（ｐ＜０．０５）、詳しくは図９を参照できる；上記の各指標に関しては、同じ投与量（５０ｍｇ／ｋｇ）の３０５－ＢとＤｕｐｉｌｕｍａｂは有意差がなかった。
【0135】
以上から分かるように、Ｔｈ２型免疫応答を特徴とする喘息様肺部炎症では、２５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇの３０５－Ｂの２回治療的投与は、血清中のＩｇＥレベル及び肺胞洗浄液中のＥｏｓ／ＷＢＣ％を有意に低下させ、肺への好酸球浸潤を減らし、粘液の分泌を減らすことができる。３０５－ＢはＩＬ－４、ＩＬ－１３シグナル伝達経路を阻害することにより、下流Ｔｈ２型応答の発生に拮抗し、喘息を抑える強力な機能を有し、且つ発効が速いことが十分に実証された。当該阻害作用は一定の用量相関性を有した。同じ用量の３０５－ＢとＤｕｐｉｌｕｍａｂは、各評価指標に有意差がなかった。
【0136】
結論：親和力測定及び様々なインビトロ機能的活性分析において、本発明の抗体はいずれも、コントロール抗体Ｄｕｐｉｌｕｍａｂよりも一貫して強い生物活性を示した。インビボ薬効学研究の結果は、本発明に示される抗体とコントロール抗体Ｄｕｐｉｌｕｍａｂとの間に有意差がないことを示した。
【0137】
本出願は何らかの形で説明されているが、本出願は、本明細書に示され、説明されているものに限定されないことを理解されたい。当業者にとって、本出願の範囲から逸脱することなく、記載された実施形態及び／又は特定の特徴又はパラメータを様々に変更できることは、明らかである。これらの変更はすべて、本出願の請求範囲内に含まれる。
本発明は、下記の形態を含む：
〈態様１〉
インターロイキン－４受容体αに特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分であって、
ＨＣＤＲ３配列を含み、任意選択にＨＣＤＲ１及び／又はＨＣＤＲ２配列をさらに含む重鎖可変領域を含み、前記ＨＣＤＲ３配列は配列番号：１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、１６７、１７３、１７９、１８５、１９１、１９７及び２０３から選ばれるアミノ酸配列を含み、及び／又は前記ＨＣＤＲ１配列は配列番号：１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、１６５、１７１、１７７、１８３、１８９、１９５及び２０１から選ばれるアミノ酸配列を含み、及び／又は前記ＨＣＤＲ２配列は配列番号：１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６及び２０２から選ばれるアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記抗原結合部分はＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｄフラグメント及び単一ドメイン抗体から選ばれる、
抗体又はその抗原結合部分。
〈態様２〉
前記重鎖可変領域は、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７６、８２、８８、９４及び１００から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、又は前記重鎖可変領域は、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７６、８２、８８、９４及び１００から選ばれるアミノ酸配列を含む、
態様１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
〈態様３〉
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及び／又はＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域をさらに含み、前記ＬＣＤＲ１配列は配列番号：１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、１９８及び２０４から選ばれるアミノ酸配列を含み、及び／又は前記ＬＣＤＲ２配列は配列番号：１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、１６３、１６９、１７５、１８１、１８７、１９３、１９９及び２０５から選ばれるアミノ酸配列を含み、及び／又は前記ＬＣＤＲ３配列は配列番号：１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、１６４、１７０、１７６、１８２、１８８、１９４、２００及び２０６から選ばれるアミノ酸配列を含む、
態様１又は２に記載の抗体又はその抗原結合部分。
〈態様４〉
前記軽鎖可変領域は、配列番号：４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７３、７９、８５、９１、９７及び１０３から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、又は前記軽鎖可変領域は、配列番号：４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７３、７９、８５、９１、９７及び１０３から選ばれるアミノ酸配列を含む、
態様３に記載の抗体又はその抗原結合部分。
〈態様５〉
前記重鎖は、配列番号：７１、７７、８３、８９、９５及び１０１から選ばれるアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は前記軽鎖は、配列番号：７４、８０、８６、９２、９８及び１０４から選ばれるアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、
上記の態様の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
〈態様６〉
前記抗体又はその抗原結合部分は、抗体１３１－Ｈｕ、１３６－Ｈｕ又は２３６－Ｈｕとインターロイキン－４受容体αにおける同じエピトープに結合するか、又は抗体１３１－Ｈｕ、１３６－Ｈｕ又は２３６－Ｈｕとインターロイキン－４受容体αに競合的に結合し、ここで、前記抗体１３１－Ｈｕの重鎖配列は配列番号：８３に示され、軽鎖配列は配列番号：８６に示され、前記抗体１３６－Ｈｕの重鎖配列は配列番号：８９に示され、軽鎖配列は配列番号：９２に示され、及び前記抗体２３６－Ｈｕの重鎖配列は配列番号：１０１に示され、軽鎖配列は配列番号：１０４に示される、
上記の態様の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
〈態様７〉
前記抗体又はその抗原結合部分は６００ｐＭ未満で、好ましくは３５０ｐＭ未満のＫＤでインターロイキン－４受容体αに結合する、
上記の態様の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
〈態様８〉
前記抗体又はその抗原結合部分は、ヒトインターロイキン－４受容体α又はマウスインターロイキン－４受容体αに特異的に結合され、ここで、好ましくは、前記抗体又はその抗原結合部分は、ＩＬ－４によって誘導されるＴＦ－１細胞の増殖を阻害し及び／又はＢ細胞のＩｇＥ分泌を阻害することができる、
上記の態様の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
〈態様９〉
態様１～８の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分及び薬学的に許容されるベクターを含む、
薬物組成物。
〈態様１０〉
態様１～８の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分をコードする、
ヌクレオチド分子。
〈態様１１〉
態様１０に記載のヌクレオチド分子を含む、
発現ベクター。
〈態様１２〉
態様１０に記載のヌクレオチド分子又は態様１１に記載の発現ベクターを含む、
宿主細胞。
〈態様１３〉
態様１～８の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分の生成方法であって、
ａ）態様１２に記載の宿主細胞が前記抗体又はその抗原結合部分の生成を可能にさせる発現条件下で、前記宿主細胞を培養することによって、抗体又はその抗原結合部分を発現するステップと、
ｂ）ステップａ）で発現される前記抗体又はその抗原結合部分を分離及び精製するステップと、を含む、方法。
〈態様１４〉
ＩＬ－４Ｒα関連疾患を予防又は治療する薬物の調製における、態様１～８の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分、又は態様９に記載の組成物の使用であって、
好ましくは、前記ＩＬ－４Ｒα関連疾患は免疫介在性炎症性疾患である、使用。
〈態様１５〉
前記免疫介在性炎症性疾患は、喘息、アレルギー、アトピー性皮膚炎、慢性副鼻腔炎、好酸球性食道炎、鼻ポリープ、乾癬、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、ブドウ膜炎、ベーチェットブドウ膜炎、ドライアイ及び慢性自発性蕁麻疹から選ばれる、
態様１４に記載の使用。
本発明は、下記の形態を含む：
〈態様１〉
インターロイキン－４受容体αに特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分であって、
ＨＣＤＲ３配列を含み、任意選択にＨＣＤＲ１及び／又はＨＣＤＲ２配列をさらに含む重鎖可変領域を含み、前記ＨＣＤＲ３配列は配列番号：１０７、１１３、１１９、１２５、１３１、１３７、１４３、１４９、１５５、１６１、１６７、１７３、１７９、１８５、１９１、１９７及び２０３から選ばれるアミノ酸配列を含み、及び／又は前記ＨＣＤＲ１配列は配列番号：１０５、１１１、１１７、１２３、１２９、１３５、１４１、１４７、１５３、１５９、１６５、１７１、１７７、１８３、１８９、１９５及び２０１から選ばれるアミノ酸配列を含み、及び／又は前記ＨＣＤＲ２配列は配列番号：１０６、１１２、１１８、１２４、１３０、１３６、１４２、１４８、１５４、１６０、１６６、１７２、１７８、１８４、１９０、１９６及び２０２から選ばれるアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記抗原結合部分はＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｄフラグメント及び単一ドメイン抗体から選ばれる、
抗体又はその抗原結合部分。
〈態様２〉
前記重鎖可変領域は、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７６、８２、８８、９４及び１００から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、又は前記重鎖可変領域は、配列番号：２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、６６、７０、７６、８２、８８、９４及び１００から選ばれるアミノ酸配列を含む、
態様１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
〈態様３〉
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及び／又はＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域をさらに含み、前記ＬＣＤＲ１配列は配列番号：１０８、１１４、１２０、１２６、１３２、１３８、１４４、１５０、１５６、１６２、１６８、１７４、１８０、１８６、１９２、１９８及び２０４から選ばれるアミノ酸配列を含み、及び／又は前記ＬＣＤＲ２配列は配列番号：１０９、１１５、１２１、１２７、１３３、１３９、１４５、１５１、１５７、１６３、１６９、１７５、１８１、１８７、１９３、１９９及び２０５から選ばれるアミノ酸配列を含み、及び／又は前記ＬＣＤＲ３配列は配列番号：１１０、１１６、１２２、１２８、１３４、１４０、１４６、１５２、１５８、１６４、１７０、１７６、１８２、１８８、１９４、２００及び２０６から選ばれるアミノ酸配列を含む、
態様１又は２に記載の抗体又はその抗原結合部分。
〈態様４〉
前記軽鎖可変領域は、配列番号：４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７３、７９、８５、９１、９７及び１０３から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、又は前記軽鎖可変領域は、配列番号：４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７３、７９、８５、９１、９７及び１０３から選ばれるアミノ酸配列を含む、
態様３に記載の抗体又はその抗原結合部分。
〈態様５〉
前記重鎖は、配列番号：７１、７７、８３、８９、９５及び１０１から選ばれるアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、及び／又は前記軽鎖は、配列番号：７４、８０、８６、９２、９８及び１０４から選ばれるアミノ酸配列又は前記配列と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、
上記の態様の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
〈態様６〉
前記抗体又はその抗原結合部分は、抗体１３１－Ｈｕ、１３６－Ｈｕ又は２３６－Ｈｕとインターロイキン－４受容体αにおける同じエピトープに結合するか、又は抗体１３１－Ｈｕ、１３６－Ｈｕ又は２３６－Ｈｕとインターロイキン－４受容体αに競合的に結合し、ここで、前記抗体１３１－Ｈｕの重鎖配列は配列番号：８３に示され、軽鎖配列は配列番号：８６に示され、前記抗体１３６－Ｈｕの重鎖配列は配列番号：８９に示され、軽鎖配列は配列番号：９２に示され、及び前記抗体２３６－Ｈｕの重鎖配列は配列番号：１０１に示され、軽鎖配列は配列番号：１０４に示される、
上記の態様の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
〈態様７〉
前記抗体又はその抗原結合部分は６００ｐＭ未満で、好ましくは３５０ｐＭ未満のＫＤでインターロイキン－４受容体αに結合する、
上記の態様の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
〈態様８〉
前記抗体又はその抗原結合部分は、ヒトインターロイキン－４受容体α又はマウスインターロイキン－４受容体αに特異的に結合され、ここで、好ましくは、前記抗体又はその抗原結合部分は、ＩＬ－４によって誘導されるＴＦ－１細胞の増殖を阻害し及び／又はＢ細胞のＩｇＥ分泌を阻害することができる、
上記の態様の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分。
〈態様９〉
態様１～８の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分及び薬学的に許容されるベクターを含む、
薬物組成物。
〈態様１０〉
態様１～８の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分をコードする、
ヌクレオチド分子。
〈態様１１〉
態様１０に記載のヌクレオチド分子を含む、
発現ベクター。
〈態様１２〉
態様１０に記載のヌクレオチド分子又は態様１１に記載の発現ベクターを含む、
宿主細胞。
〈態様１３〉
態様１～８の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分の生成方法であって、
ａ）態様１２に記載の宿主細胞が前記抗体又はその抗原結合部分の生成を可能にさせる発現条件下で、前記宿主細胞を培養することによって、抗体又はその抗原結合部分を発現するステップと、
ｂ）ステップａ）で発現される前記抗体又はその抗原結合部分を分離及び精製するステップと、を含む、方法。
〈態様１４〉
ＩＬ－４Ｒα関連疾患を予防又は治療する薬物の調製における、態様１～８の何れか１項に記載の抗体又はその抗原結合部分、又は態様９に記載の組成物の使用であって、
好ましくは、前記ＩＬ－４Ｒα関連疾患は免疫介在性炎症性疾患である、使用。
〈態様１５〉
前記免疫介在性炎症性疾患は、喘息、アレルギー、アトピー性皮膚炎、慢性副鼻腔炎、好酸球性食道炎、鼻ポリープ、乾癬、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、ブドウ膜炎、ベーチェットブドウ膜炎、ドライアイ及び慢性自発性蕁麻疹から選ばれる、
態様１４に記載の使用。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】