▶ オスロ ユニヴェルジテットサイケフス ホーエフの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-14
(45)【発行日】2024-03-25
(54)【発明の名称】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および医薬におけるその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240315BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240315BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240315BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240315BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240315BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240315BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240315BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240315BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20240315BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20240315BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N15/12 ZNA
C12N15/13
C07K16/28
C07K19/00
C12N5/10
A61K35/17
A61P35/00
A61P19/08
A61P35/04
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2021535886
(86)(22)【出願日】2019-12-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-16
(86)【国際出願番号】 EP2019086309
(87)【国際公開番号】W WO2020127734
(87)【国際公開日】2020-06-25
【審査請求日】2022-11-16
(31)【優先権主張番号】20181636
(32)【優先日】2018-12-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】NO
(73)【特許権者】
【識別番号】515202863
【氏名又は名称】オスロ ユニヴェルジテットサイケフス ホーエフ
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】ヴァルヒリ、セバスチャン
(72)【発明者】
【氏名】ブルラン、エイヴィン エス
(72)【発明者】
【氏名】インダーベルグ、エルセ マリット
【審査官】白井 美香保
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／０３３６３０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Nucl. Med. Biol.，1995年，Vol.22, No.6，p.765-771
【文献】ERRATUM，Nuclea Medicine and Biology，1999年，Vol.26，p.599
【文献】Mus musculus mRNA for immunoglobulin light chain variable region, clone TP-1，GenBank，AJ131747，2016年07月26日，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AJ131747.1/，[令和５年１０月２５日検索]
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＣＡＰＬＵＳ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＦＳＴＡ／ＣＡＢＡ／ＡＧＲＩＣＯＬＡ／ＢＩＯＴＥＣＨＮＯ／ＳＣＩＳＥＡＲＣＨ／ＴＯＸＣＥＮＴＥＲ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗原結合ドメインと、ヒンジドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記抗原結合ドメインは、ペプチドリンカーによって連結された配列番号１および配列番号２を含み、前記ヒンジドメインはＣＤ８αヒンジドメインを含み、
前記細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、ＣＡＲ。
【請求項2】
前記ヒンジドメインは配列番号５で表される請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項3】
前記膜貫通ドメインは配列番号６で表される請求項１または２に記載のＣＡＲ。
【請求項4】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインからなる請求項１～３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項5】
前記抗原結合ドメインはペプチドリンカーによって連結された配列番号１および配列番号２を含み、前記ヒンジドメインは配列番号５で表され、前記膜貫通ドメインは配列番号６で表され、前記細胞内シグナル伝達ドメインは４－１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む請求項１～４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載のＣＡＲをコードする核酸。
【請求項7】
請求項６に記載の核酸で形質導入された免疫細胞。
【請求項8】
請求項１～５のいずれか１項に記載のＣＡＲを発現する免疫細胞。
【請求項9】
前記免疫細胞がＴ細胞またはＮＫ細胞である、請求項７または８に記載の免疫細胞を含む医薬組成物。
【請求項10】
骨肉腫の治療に使用するための請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
転移性骨肉腫の治療に使用するための請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項12】
微小転移性骨肉腫の治療に使用するための請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項13】
微小転移性骨肉腫または転移性骨肉腫の治療に使用するための請求項９に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物は前記治療が必要とされた患者に薬学的に有効量で静脈内投与されるものである、請求項９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞療法の分野に関連する。特に、キメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＣＡＲ）、ＣＡＲをコードする核酸、それら核酸を発現する免疫細胞、および骨肉腫の治療のための医薬におけるそれらの有用性に関連する。
【背景技術】
【0002】
骨肉腫（ＯＳ）は、最も一般的な原発性骨腫瘍であり、小児および青年で８番目に最も一般的な癌の形態である。ＯＳは、５年全生存率が６０％と低い侵攻性のタイプの癌である。この数字は７０年代に化学療法が導入されてから改善していない。革新的な解決策で臨床試験を実施するための多くの国際借款団が作られたが、今のところ乏しい結果しか報告されていない。これらのネガティブな結果の理由は、ＯＳの生物学に関連する。ほとんどの患者は、たいていの場合に化学療法に耐性のある肺転移による癌に屈服することになる。この分野には明らかに満たされていないニーズがある。
【0003】
ＣＡＲを発現する自己Ｔ細胞によるＨＥＲ２の標的化に基づく、骨肉腫患者を含む肉腫の患者に関する１臨床試験が報告されている（非特許文献１）。ＨＥＲ２は様々なタイプの癌で存在するが、健康な組織もＨＥＲ２を発現している。ＣＡＲ Ｔ細胞を静脈内投与されたある患者は、細胞注射後１５分以内に呼吸困難を経験し、集中的な医療行為にもかかわらず、その患者は治療の５日後に亡くなった（非特許文献２）。
【0004】
治療力のあるＣＡＲ Ｔ細胞を得るために、細胞はその細胞膜に十分な量のＣＡＲを発現する必要があり、抗原結合ドメインはＣＡＲコンストラクト中に十分な親和性および特異性を伝達する必要がある。ヒンジにおける微妙な差異でさえ、標的細胞上の標的エピトープに到達し、その後免疫細胞にシグナルを伝えるＣＡＲの能力に影響を与え得る。
【0005】
インビトロでのＣＡＲ Ｔ細胞の活性は、もちろんインビボでの活性の指標であり得る。しかしながら、以下のように非特許文献３によって開示されたように、インビトロでのＣＡＲ Ｔ細胞の活性は、必ずしもインビボでの、とりわけＯＳへの効力と解釈されるわけではない。すなわち、「しかしながら、インビボでは、ＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞は神経芽腫異種移植片に対する効力のある抗腫瘍活性を仲介したが、骨肉腫異種移植に対しては最小限の活性のみを仲介した。抗腫瘍活性の欠如は、ヒトＴ細胞を抑制するＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋マウスＭＤＳＣのかなりの拡大に関連する」。さらにまた非特許文献４によって開示されるように、同所性異種移植を有する大半のマウスにおいて許容されるＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞の投与により、深刻な副作用が生じ得る。抗腫瘍活性の急性期中の腫瘍周囲の神経炎症は、一部の動物で致命的な水頭症につながる。
【0006】
加えて、固形腫瘍のためのＣＡＲ Ｔ細胞療法は、血液悪性腫瘍と比べて異なるセットの克服すべき障害を提供する。非特許文献５において記載されるように、そのような障害は、乏しい輸送、免疫抑制分子および免疫抑制細胞の増強発現、および免疫チェックポイントを含む。例えば、腫瘍へのＣＡＲ Ｔ細胞の輸送は、腫瘍によって分泌されるケモカインの受容体の発現に依存する。抗原活性化ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｔ細胞機能不全につながり得る抑制性受容体の発現を上方制御することがさらに示されている。免疫抑制分子および免疫抑制細胞は、直接的におよび間接的に、腫瘍増殖を促進し、Ｔ細胞活性を阻害し得る。したがって、ＣＡＲ Ｔ細胞が固形腫瘍において効果的であるために様々な障害を克服する必要がある。
【0007】
別の問題は、標的部位におけるＣＡＲ Ｔ細胞の効率的なアクセスに関連する。血液悪性腫瘍とは対照的に、固形腫瘍の認識は血液から腫瘍部位へ出ることを必要とし、Ｔ細胞浸透が積極的に妨げられるように多くの悪性腫瘍は発達する。
【0008】
インビトロ活性のある一部のＣＡＲ Ｔ細胞のみがインビボで腫瘍転移にうまく移行し、ＯＳなどの固形腫瘍の厳しい条件の腫瘍微小環境に浸透することが予期され得る。さらにまた、ＣＡＲ Ｔ細胞は、インビボで治療効果を提供するために経時的にその活性を持続させる必要がおそらくあるであろう。以下のように非特許文献６によって開示されるように、ＣＡＲコンストラクトのシグナル伝達ドメインは重要である。すなわち、「それにもかかわらず、２つの異なる共刺激シグナル伝達ドメインを有するＩＩＩＣＡＲ．ＧＤ２Ｔ細胞を異種移植ＮＳＧマウスモデルにおいて試験したとき、我々はＣＡＲＧＤ２．２８．４－１ＢＢｚＴ細胞のみで、インビボで持続した抗腫瘍効果を仲介することを観察した（図２Ｄ～Ｆ）。…（中略）…ＧＤ２を標的にする第１１７，１８および第３（ＣＤ２８．ＯＸ４０）２１世代の両方のＣＡＲを使用したＮＢを有する小児において今までに行われた臨床試験は、限られた有効性しか実証していない」。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【文献】Ａｈｍｅｄら、２０１５、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２０１５ Ｍａｙ ２０；３３（１５）：１６８８－９６
【文献】Ｍｏｒｇａｎら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１０ Ａｐｒ；１８（４）：８４３－５１
【文献】Ｌｏｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ． ２０１６ Ｏｃｔ；４（１０）：８６９－８８０
【文献】Ｍｏｕｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｖｏｌｕｍｅ ２４、ページ５７２－５７９（２０１８）
【文献】ＳｒｉｖａｓｔａｖａおよびＲｉｄｄｌｅ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１８；２００：４５９－４６８
【文献】Ｑｕｉｎｔａｒｅｌｌｉら、ＯＮＣＯＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ ２０１８、ＶＯＬ．７、ＮＯ．６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
したがって、免疫細胞の細胞膜で発現されたとき、インビボでＯＳに治療効果を提供可能な新規なＣＡＲを得ることが些細なことではなく、非常に望まれる。
【課題を解決するための手段】
【0011】
新規なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。本明細書のＣＡＲを発現する免疫細胞は転移性ＯＳをシミュレートしたマウスモデル、すなわち肺においてＯＳ腫瘍が確立されたマウスにおいて治療効果を示す。図７、８および９参照されたい。ＯＳはしばしば肺に広がり致命的な結果をもたらす固形腫瘍である。本明細書に提示されるＣＡＲは、以前に非常に特異的であることが示された肺転移特異的マーカーを認識する。加えて、我々は健康な組織に対するそれらの反応性を試験することにより、ＣＡＲの安全性を評価した。健康な骨髄からの幹細胞は、任意のＣＡＲを発現するＴ細胞によってそれほど影響を受けなかったという発見と組み合わせると、本開示はヒト患者におけるＯＳ治療の魅力的な細胞治療力のある代替策を提供する。さらにまた、ＣＡＲを発現する免疫細胞はまた、微小転移性ＯＳをシミュレートしたモデルにおいて活性を実証した（図１０参照）。
【0012】
本明細書のＣＡＲが免疫細胞の表面に発現されるとき、そのような免疫細胞は我々のインビボのデータに実証されるように、ＯＳ細胞に方向づけられ得る。いくつかの異種移植ＯＳモデルにおける治療効果が実証されている。マウスの腹腔内モデルにおいて、腫瘍増殖は、配列番号１および配列番号２（ＴＰ１ ｓｃＦｖ－断片）を含む抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現するＴ細胞で有意に遅れた。同じモデルにおいて、配列番号３および配列番号４（ＴＰ３ ｓｃＦｖ－断片）を含む抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現するＴ細胞のため、腫瘍増殖が本質的に避けられる。さらにまた、全生存率はいずれかのＣＡＲを発現するＴ細胞を受けたマウスで大幅に改善した。ＯＳＣＡＲ１またはＯＳＣＡＲ３を発現するＴ細胞の静脈内投与は、非常に侵攻性のＯＳＡ肺腫瘍を有するマウスに治療効果および延長された長期生存を提供し、骨転移さえ防ぐようであった（図７および８参照）。ＯＳＣＡＲ１またはＯＳＣＡＲ３を発現するＴ細胞の静脈内投与はまた、ＬＭ－７肺腫瘍を有するマウスにおいて延長された治療効果を提供した（図９を参照）。
【0013】
第１の態様において、抗原結合ドメインと、ヒンジドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むＣＡＲが提供され、抗原結合ドメインはＴＰ１ ｓｃＦｖ－断片を含むか、または抗原結合ドメインはＴＰ３ ｓｃＦｖ－断片を含み、ヒンジドメインはＣＤ８αヒンジドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【0014】
前記ヒンジドメインは、配列番号５で表され得る。
前記膜貫通ドメインは、配列番号６で表され得る。
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインを含み得る。
前記膜貫通ドメインは、配列番号６で表され得る。
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインを含み得る。
【0015】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み得る。
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインからなり得る。
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインからなり得る。
【0016】
前記抗原結合ドメインは、ペプチドリンカーによって連結された配列番号１および配列番号２を含み得る。
前記抗原結合ドメインは、ペプチドリンカーによって連結された配列番号３および配列番号４を含み得る。
前記抗原結合ドメインは、ペプチドリンカーによって連結された配列番号３および配列番号４を含み得る。
【0017】
前記抗原結合ドメインは、ペプチドリンカーによって連結された配列番号１および配列番号２を含み得、ヒンジドメインは配列番号５で表され得、膜貫通ドメインは配列番号６で表され得、細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み得る。
【0018】
前記抗原結合ドメインは、ペプチドリンカーによって連結された配列番号３および配列番号４を含み得、ヒンジドメインは配列番号５で表されるＣＤ８αヒンジドメインであり得、膜貫通ドメインは配列番号６で表されるＣＤ８α膜貫通ドメインであり得、細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインを含み得る。
【0019】
第２の態様において、第１の態様によるＣＡＲをコードする核酸が提供される。
第３の態様において、第２の態様による核酸で形質導入された免疫細胞が提供される。
第４の態様において、第１の態様によるＣＡＲを発現する免疫細胞が提供される。
第３の態様において、第２の態様による核酸で形質導入された免疫細胞が提供される。
第４の態様において、第１の態様によるＣＡＲを発現する免疫細胞が提供される。
【0020】
第５の態様において、第３または第４の態様による免疫細胞を含む医薬組成物が提供される。
前記医薬組成物は、骨肉腫の治療に使用され得る。
前記医薬組成物は、骨肉腫の治療に使用され得る。
【0021】
前記医薬組成物は、転移性骨肉腫の治療に使用され得る。
前記医薬組成物は、微小転移性骨肉腫の治療に使用され得る。
転移性骨肉腫の治療に使用するための、その細胞膜にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞がまた提供され、前記ＣＡＲはＴＰ１ ｓｃＦｖ－断片またはＴＰ３ ｓｃＦｖ－断片を含む抗原結合ドメインと、ヒンジドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインと、任意選択的に１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。
前記医薬組成物は、微小転移性骨肉腫の治療に使用され得る。
転移性骨肉腫の治療に使用するための、その細胞膜にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する免疫細胞がまた提供され、前記ＣＡＲはＴＰ１ ｓｃＦｖ－断片またはＴＰ３ ｓｃＦｖ－断片を含む抗原結合ドメインと、ヒンジドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインと、任意選択的に１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。
【0022】
第５の態様による薬学的に有効量の医薬組成物を患者に静脈内投与するステップを含む、患者の骨肉腫の治療のための方法も提供される。
第５の態様による薬学的に有効量の医薬組成物を患者に静脈内投与するステップを含む、患者の転移性骨肉腫の治療のための方法も提供される。
第５の態様による薬学的に有効量の医薬組成物を患者に静脈内投与するステップを含む、患者の転移性骨肉腫の治療のための方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】両方のＣＡＲコンストラクト（ＯＳＣＡＲ１およびＯＳＣＡＲ３）は、レトロウイルス的に形質導入された初代Ｔ細胞において十分に発現され、抗マウスＦａｂ抗体で検出可能であったことを示す図。
【図2】ＢｉｏＰｌｅｘによって検出された細胞培地中のサイトカイン放出を示す図。より暗い色は、２４時間後の上清中のより高いサイトカインレベルを示す。示されるように、ＯＳＣＡＲリダイレクト細胞は、骨肉腫細胞株からの刺激時、ＴＮＦαおよびＩＦＮγの放出に対して強く活性化された。
【図3a】ＯＳＣＡＲ１またはＯＳＣＡＲ３のいずれかを発現する初代Ｔ細胞またはモックトランスフェクションによるＯＨＳ細胞のインビトロ殺傷（ＢＬＩアッセイ）を示す図。
【図3b】ＯＳＣＡＲ１またはＯＳＣＡＲ３のいずれかを発現する初代Ｔ細胞またはモックトランスフェクションによるＯＳＡ細胞のインビトロ殺傷（ＢＬＩアッセイ）を示す図。
【図3c】ＯＳＣＡＲ１またはＯＳＣＡＲ３のいずれかを発現する初代Ｔ細胞またはモックトランスフェクションによるＳＡＯＳ細胞のインビトロ殺傷（ＢＬＩアッセイ）を示す図。
【図4a】実施例４において記載されたように腹腔内マウスモデルの処理プロトコルを示す図。
【図4b】実施例４において記載されるように処理されたマウスの２０日目のＯＨＳ腫瘍負荷（ＩＶＩＳによって検出されたルシフェラーゼシグナル検出）および生存率を示す図。
【図4c】実施例４において記載されるように処理された各マウスのルシフェラーゼシグナルのスパイダープロットを示す図。ＯＳＣＡＲ１およびＯＳＣＡＲ３は、ほとんどの動物において腫瘍増殖を制御し得るが、ＯＳＣＡＲ３で処理された動物はモックＴ細胞で処理された動物（対照）と比較して腫瘍再発が観察された。
【図4d】実施例４において記載されたように処理されたマウスの生存曲線（カプラン・マイヤー）を示す図。ＯＳＣＡＲ１を発現するＴ細胞は、エンドポイントにおいて８０％のマウスを生存させ続けた。ＯＳＣＡＲ３を発現するＴ細胞は、モックまたは生理食塩水で処理された動物よりも良好に働いた。
【図5a】実施例５において記載されるように、肺転移腫瘍モデルのための処理プロトコルを示す図。
【図5b】実施例５において記載されるように処理されたマウスでの腫瘍進行を示す図。示されるように、モックまたは培地で処理された動物に比べて、ＯＳＣＡＲ１またはＯＳＣＡＲ３を発現するＴ細胞によってＯＳＡ腫瘍増殖はより長い時間制御された。
【図6a】ＯＳＣＡＲ１またはＯＳＣＡＲ３を一時的に発現するＴ細胞はいずれも血液前駆細胞のコロニー形成に有意な影響を及ぼさなかったことを実証する図。
【図6b】ＯＳＣＡＲ１またはＯＳＣＡＲ３を安定的に発現するＴ細胞はいずれも血液前駆細胞のコロニー形成に有意な影響を及ぼさなかったことを実証する図。コロニー形成単位（ＣＦＵ）－赤血球（Ｅ） 赤、ＣＦＵ－顆粒球マクロファージ（ＧＭ） 白コロニー、ＣＦＵ 顆粒球、赤血球、単球、巨核球（ＧＥＭＭ）混合コロニー。
【図7】肺転移をシミュレートするためにＯＳＡ細胞を使用した第２実験においてＯＳＣＡＲ１またはＯＳＣＡＲ３のいずれかを発現するＴ細胞の治療効果を実証する図。写真は３、１１、および２０日目に撮影された。ここで、対照動物において骨転移（＊）が検出可能であった。
【図8】実施例７からのカプラン・マイヤー曲線を示す図。
【図9】ＬＭ－７細胞株を使用した別の肺転移モデルのインビボ実験を示す図。写真は１３、２１、および２８日目に撮影された。
【図10】スフェロイドにおいてＯＳＣＡＲ１またはＯＳＣＡＲ３のいずれかを発現するＴ細胞の細胞傷害性効果を実証する図。中央の白い斑点は腫瘍細胞（ＯＨＳ細胞株）を表す。上段は、形質導入されていないＴ細胞（モック）の効果を表す。
【図11】ＯＳＣＡＲ１およびＯＳＣＡＲ３のＮ末端からＣ末端への概略的な構造を視覚化した図。両方のＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジに連結されたｓｃＦｖを含み、ＣＤ８αヒンジは、ひいてはＣＤ８α膜貫通ドメインに連結される。細胞内シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとを含む。
【発明を実施するための形態】
【0024】
本明細書に使用されるとき、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む受容体である。
本明細書に使用されるとき、抗原結合ドメインは、生理学的条件下、特に腫瘍環境内の生理学的条件下で細胞外標的エピトープと結合できるタンパク質部分である。抗原結合ドメインは２つの配列、抗体軽鎖（ＶＬ）からの１可変ドメインおよび抗体重鎖（ＶＨ）からの１可変ドメインを含む。理論に縛られることなしに、本明細書の抗原結合ドメインの標的はｐ８０であり得る。この抗原は、癌細胞および腫瘍に関連する毛細血管の出芽によって発現すると思われるので、ＯＳ治療の適切な標的であると考えられている。
本明細書に使用されるとき、抗原結合ドメインは、生理学的条件下、特に腫瘍環境内の生理学的条件下で細胞外標的エピトープと結合できるタンパク質部分である。抗原結合ドメインは２つの配列、抗体軽鎖（ＶＬ）からの１可変ドメインおよび抗体重鎖（ＶＨ）からの１可変ドメインを含む。理論に縛られることなしに、本明細書の抗原結合ドメインの標的はｐ８０であり得る。この抗原は、癌細胞および腫瘍に関連する毛細血管の出芽によって発現すると思われるので、ＯＳ治療の適切な標的であると考えられている。
【0025】
ＶＨおよびＶＬ配列は、ジスルフィド架橋またはペプチドリンカーによって連結され得る。あるいは、その２つの配列は抗体のＦａｂ－断片に埋め込まれ得る。一実施形態において、抗原結合ドメインは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含むか、またはそれらからなる。別の実施形態において、抗原結合ドメインはＶＨ－リンカー－ＶＬを含むか、またはそれらからなる。そのような抗原結合ドメインは、しばしば一本鎖Ｆｖ－断片（ｓｃＦｖ）と呼ばれる。リンカーは、ＶＨおよびＶＬが機能的な抗原結合ドメインを形成できるようにある特定の長さを有する必要がある。一実施形態において、リンカーは１０～３０のアミノ酸残基を含む。一実施形態において、リンカーは１５～２５のグリシン残基および／またはセリン残基を含む。一実施形態において、リンカーは配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９）によって表される。
【0026】
各ＶＬおよびＶＨは、フレームワーク配列によって挟まれた３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。フレームワーク配列は、標的抗原に対する特異性および親和性を滅することなくいくつかの変異を許容し得ることが予期され得る。例えば、アミノ酸残基の置換は、アミノ酸残基の欠失または追加より許容され得る。しかしながらＣＤＲは一般に、より感受性があるが、時折、特異性および親和性を滅することなく保存的置換が導入され得る。
【0027】
一実施形態において、抗原結合ドメインはＴＰ１ ｓｃＦｖ－断片を含む。ＴＰ１ ｓｃＦｖ－断片は、ペプチドリンカーによって連結されたＴＰ１ ＶＬおよびＴＰ１ ＶＨを含む。一実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号１または配列番号１と９０％を超える配列同一性のある配列と、配列番号２または配列番号２と９０％を超える配列同一性のある配列とを含む。
【0028】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号１または配列番号１と９０％を超える配列同一性のある配列と、配列番号２または配列番号２と９０％を超える配列同一性のある配列とを含む。ただし、前記配列の任意の差異がアミノ酸残基の保存的置換の形態である場合である。
【0029】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号１またはＣＤＲが改変されていない場合、配列番号１と９０％を超える配列同一性のある配列と、配列番号２またはＣＤＲが改変されていない場合、配列番号２と９０％を超える配列同一性のある配列とを含む。
【0030】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号１または配列番号１と９５％を超える配列同一性のある配列と、配列番号２または配列番号２と９５％を超える配列同一性のある配列２を含む。ただし、前記配列の任意の差異がアミノ酸残基の保存的置換の形態である場合である。
【0031】
一実施形態において、抗原結合ドメインはＴＰ３ ｓｃＦｖ－断片を含む。ＴＰ３ ｓｃＦｖ－断片はリンカーによって連結されたＴＰ３ ＶＬおよびＴＰ３ ＶＨを含む。一実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号３または配列番号３と９０％を超える配列同一性のある配列と、配列番号４または配列番号４と９０％を超える配列同一性のある配列とを含む。
【0032】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号３または配列番号３と９０％を超える配列同一性のある配列と、配列番号４または配列番号４と９０％を超える配列同一性のある配列とを含む。ただし、前記配列の任意の差異がアミノ酸残基の保存的置換の形態である場合である。
【0033】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号３またはＣＤＲが改変されていない場合、配列番号３と９０％を超える配列同一性のある配列と、配列番号４またはＣＤＲが改変されていない場合、配列番号４と９０％を超える配列同一性のある配列とを含む。
【0034】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、配列番号３または配列番号３と９５％を超える配列同一性のある配列３と、配列番号４または配列番号４と９５％を超える配列同一性のある配列とを含む。ただし、前記配列の任意の差異がアミノ酸残基の保存的置換の形態である場合である。
【0035】
用語「保存的アミノ酸置換」は、本明細書に使用されるとき、１のアミノ酸残基が同様の側鎖を有する他のアミノ酸残基と置換されたアミノ酸置換を表す。同様の側鎖を有するアミノ酸は、同様の特性を有する傾向があり、したがってポリペプチドの構造または機能に重要なアミノ酸の保存的置換は、同じ位置の非保存的アミノ酸置換よりあまりポリペプチド構造／機能に影響を与えないことが予期され得る。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義され、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、保存的アミノ酸置換は、特定のアミノ酸残基が同じファミリー内の異なるアミノ酸残基と置換される置換であると考えられ得る。
【0036】
新規なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。本明細書のＣＡＲが免疫細胞の表面に発現されるとき、そのような免疫細胞は医薬に使用され得る。特に、前記免疫細胞は骨肉腫の治療に使用され得る。一実施形態において、前記免疫細胞は転移性骨肉腫の治療に使用され得る。
【0037】
本開示におけるＣＡＲは上述のように任意の抗原結合ドメインを含み得る。特に、本開示におけるＣＡＲは上述のようにＣＤ８αヒンジに連結された任意の抗原結合ドメインを含み得る。特に、本開示におけるＣＡＲは上述のようにＣＤ８αヒンジに連結された任意の抗原結合ドメインを含み得、ＣＡＲはさらに膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインは４－１ＢＢとＯＸ４０とから選択される１つの共刺激ドメインと、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとを含むか、またはそれらからなる。
【0038】
特定の一実施形態において、ＣＡＲは、ＴＰ１ ｓｃＦｖ－断片またはＴＰ３ ｓｃＦｖ－断片を含む抗原結合ドメインと、抗原結合ドメインに連結されたＣＤ８αヒンジドメインと、ヒンジドメインに連結された膜貫通ドメインと、膜貫通ドメインに連結されたＣＤ３ζシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。
【0039】
２つのＣＡＲの有効性および安全性が実施例において実証された。ＯＳＣＡＲ１と呼ばれる１つのＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端へ配列番号１－配列番号９－配列番号２－配列番号５－配列番号６－配列番号７－配列番号８からなる。ＯＳＣＡＲ３と呼ばれる他のＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端へ配列番号３－配列番号９－配列番号４－配列番号５－配列番号６－配列番号７－配列番号８からなる。ＯＳＣＡＲ１およびＯＳＣＡＲ３の概略的な構造は、図１１に視覚化される。
【0040】
抗原結合ドメインは、直接的に膜貫通ドメインに付く場合がある。しかしながら、ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するヒンジドメインを含み得る。ヒンジドメインは、したがって、抗原結合ドメインの立体構造に影響を与え得る。これはひいては標的エピトープに結合してその後免疫細胞にシグナル伝達を引き起こすＣＡＲの能力に影響を与える。標的エピトープが標的細胞の細胞膜から遠すぎる位置にある場合または標的エピトープがその他隠されている場合、ＣＡＲを発現する免疫細胞は効率的ではない場合がある。したがって、標的エピトープがＣＡＲを発現する免疫細胞にとって十分にアクセス可能であることが好ましい。本明細書に開示されるＣＡＲにおいて配列番号５で表されるＣＤ８αヒンジドメインは、抗原結合ドメインが標的エピトープに結合することを可能にし、かつ、それを発現する免疫細胞の活性化を可能にすることが分かった。抗原結合ドメインの同様の立体配座が可能であれば、他のＣＤ８αヒンジもまた、機能する場合がある。特に、そのようなヒンジは配列番号５で表されるＣＤ８αヒンジとおおよそ同じ数のアミノ酸残基を含み得る。特に、ＣＤ８αヒンジは、配列番号５またはそれと９０％を超える配列同一性のある配列によって表され得る。一実施形態において、ヒンジドメインはＣＤ２８からではない。
【0041】
本明細書に使用されるとき、「Ｘ％配列同一性」は、ｂｌａｓｔｐアルゴリズムでのＢＬＡＳＴ（登録商標）によってアラインメントして比較したとき、２つの配列間でＸ％のアミノ酸残基が同一であることを意味する。
【0042】
膜貫通ドメインは、細胞外ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結する。抗原結合ドメインおよびヒンジドメインの両方は、細胞外ドメインであり、すなわち免疫細胞の細胞膜に発現されたとき、それらは一般に細胞外環境に面する。本明細書に使用されるとき、「膜貫通ドメイン」は、免疫エフェクター細胞によって発現されたとき、細胞膜に埋め込まれる傾向があるＣＡＲの部分を意味する。適切な膜貫通ドメインは当業者に良く知られている。特に、ＣＤ８α、ＣＤ２８またはＩＣＯＳからの膜貫通ドメインが使用され得る。一実施形態において、膜貫通ドメインはＣＤ２８からではない。膜貫通ドメインは、抗原結合ドメインによる標的結合時に免疫細胞内にシグナルを伝達すると考えられている。配列番号６で表されるＣＤ８α膜貫通ドメインは標的結合時に免疫細胞内へのシグナル伝達を可能にすることが分かった。
【0043】
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、ＣＡＲが細胞膜に発現されているとき、免疫細胞の内側に配置されるＣＡＲの部分を表す。これらのドメインは、標的結合時にシグナルを伝達することに関与する。様々なシグナル伝達ドメインが知られ、それらは免疫細胞内の内在性シグナル伝達機構に適合するように組み合わされ、適応され得る。
【0044】
一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζ、ＦｃＲ－γ、ＣＤ３εなどから入手可能なシグナル伝達ドメイン様の「シグナル１」ドメインを含む。一般に、「シグナル１」ドメイン（例えば、配列番号８で表されるＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）は、抗原結合時にシグナルを伝達すると考えられている。
【0045】
別の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激ドメインを含む。そのようなドメインは良く知られ、「シグナル２」ドメインとしばしば呼ばれ、それらは「シグナル１」ドメインに続いて共刺激分子を介してシグナルを伝達すると考えられている。「シグナル２」は、シグナルの維持および細胞の生存にとって重要である。第１世代のＣＡＲのように「シグナル２」がない場合、リダイレクトされた細胞は、殺傷や初期のサイトカイン放出に効果的であり得るが、時間の経過とともに使い果たされることがよくあるであろう。そのような一般に使用される「シグナル２」ドメインの例には、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、およびＩＣＯＳシグナル伝達ドメインが含まれる。
【0046】
特に、本明細書のＣＡＲを発現する細胞傷害性免疫細胞は、細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（配列番号８）および４－１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号７）を含むかまたはそれらからなるとき、ＯＳモデルにおいてインビボで効果を提供することが見出された。
【0047】
本明細書のＣＡＲを発現する免疫細胞は、白血球分離または他の適切な方法によって患者または互換性のあるドナーから単離され得る。そのような初代細胞は、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であり得る。特に、自己Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞の両方またはこれらの混合物）は、それらの細胞が含まれる医薬組成物が患者に戻されて投与される前にＣＡＲをコードする核酸で形質導入され得る。ＣＡＲを発現する免疫細胞はまた、ＮＫ－９２細胞のように臨床使用に適切な細胞株であり得る。もちろん、意図された患者がヒトであるとき、好ましい細胞はヒトである。しかしながら、ＯＳはまた犬も罹患するので、本明細書のＣＡＲを発現するイヌ細胞は、犬のＯＳの治療に使用され得る。
【0048】
本明細書の医薬組成物は、治療力のある細胞を患者に投与するために適切な任意の組成物であり得る。ＣＡＲ Ｔ細胞の最も一般的な投与ルートは、静脈内投与である。したがって、前記医薬組成物は例えば、中性ｐＨの滅菌水溶液であり得る。例えば、患者の末梢血単核細胞は標準的な白血球分離手順によって得られる場合がある。単核細胞は、ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターまたはｍＲＮＡで形質導入する前にＴ細胞で富化され得る。前記細胞は、その後、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズで活性化され得る。形質導入されたＴ細胞を細胞培養で拡大培養し、洗浄し、滅菌懸濁液中に製剤してよく、それは凍結保存することができる。そのようにした場合、製品は投与前に解凍される。
【0049】
骨肉腫の標的部位におけるＣＡＲ Ｔ細胞の効率的なアクセスに関連する１つの問題は、固形腫瘍からの防御を回避することである。血液悪性腫瘍とは対照的に、固形腫瘍の認識には血液から腫瘍部位へ出ることを必要とし、Ｔ細胞浸透が積極的に妨げられるように多くの悪性腫瘍は発達する。腫瘍が局在化している状況では、有効性を改善するために異なる投与方法が使用され得る。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞の全身投与ではなく局部的な投与は、有効性を促進する場合がある。
【0050】
医薬組成物は、本明細書の薬学的に有効量の免疫細胞を含み得る。薬学的な有効量は、例えば、１×１０６から１×１０９個の範囲のＣＡＲを発現する免疫細胞であり得る。薬学的な有効量は、例えば、１×１０７から５×１０８個の範囲のＣＡＲを発現するＴ細胞であり得る。
【0051】
免疫細胞におけるクレームされたＣＡＲの効率的な発現のために、細胞膜への局在化を容易にするため従来のリーダーペプチド（すなわちシグナルペプチドまたはＬ鎖）がＮ末端に導入され得る。リーダーペプチドはトリミングされて細胞膜の機能的なＣＡＲには存在していないであろうと考えられている。リーダーペプチドが配列番号１０で表されるとき、本明細書のＣＡＲをコードする核酸は正常に転写され、ＣＡＲは正常に細胞膜に移動することが見出された。これは図１に示されている。クレームされたＣＡＲをコードする核酸は、良く知られている例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ、または例えば、レトロウイルスベクターなどのＤＮＡ発現ベクターである。しかしながらＴＰ３ ｓｃＦｖを含むＣＡＲ（例えば、ＯＳＣＡＲ３）は、ＴＰ１ ｓｃＦｖを含む他は同一のＣＡＲ（例えば、ＯＳＣＡＲ１）より、それらをコードするｍＲＮＡで形質導入されたＴ細胞において良好に発現されることが分かった。したがって、ＴＰ３ ｓｃＦｖを含むＣＡＲはｍＲＮＡ形質導入で免疫細胞において一過的に発現させるために好ましいであろう。特に、ＯＳＣＡＲ３をコードするｍＲＮＡは、Ｔ細胞における一過的な発現に好ましい場合がある。ｍＲＮＡ形質導入によるＣＡＲの一過的な発現は、レトロウイルスのＣＡＲ発現系と比較して安全性の利点を有する。
【0052】
ＴＰ１ ｓｃＦｖ（例えば、ＯＳＣＡＲ１）を含むＣＡＲは、侵攻性の転移性ＯＳモデルにおいて改善された長期生存を提供することも分かった。したがって、ＴＰ１ ｓｃＦｖを含むＣＡＲは、免疫細胞におけるレトロウイルス発現に好ましい場合がある。特に、ＯＳＣＡＲ１をコードするレトロウイルスのベクターは、Ｔ細胞における長期的な発現に好ましい場合がある。
【0053】
一実施形態において、核酸は、Ｌ鎖－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＤ８αヒンジドメイン－ＣＤ８α膜貫通ドメイン－４－１ＢＢ共刺激ドメイン－ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインをコードする。一実施形態において、核酸はＬ鎖－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＤ８αヒンジドメイン－ＣＤ８α膜貫通ドメイン－４－１ＢＢ共刺激ドメイン－ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインをコードする。一実施形態において、骨肉腫の治療に使用するための、ＣＡＲを発現する薬学的に有効量のＴ細胞またはＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供され、本明細書に記載されるように抗原結合ドメインはＴＰ１ｓｃＦｖ－断片である。一実施形態において、ＴＰ１ ｓｃＦｖ－断片は、ペプチドリンカーによって連結されたＴＰ１ ＶＬおよびＴＰ１ ＶＨを含む。
【0054】
特定の一実施形態において、骨肉腫の治療に使用するための、ＣＡＲを発現する薬学的に有効量のＴ細胞またはＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供され、抗原結合ドメインは配列番号１および配列番号２を含み、前記ＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジドメインおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインは４－１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【0055】
一実施形態において、骨肉腫の治療に使用するための、ＣＡＲを発現する薬学的に有効量のＴ細胞またはＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供され、本明細書に記載されるように抗原結合ドメインはＴＰ３ ｓｃＦｖ－断片である。一実施形態において、ＴＰ３ ｓｃＦｖ－断片は、ペプチドリンカーによって連結されたＴＰ３ ＶＬおよびＴＰ３ ＶＨを含む。
【0056】
特定の一実施形態において、骨肉腫の治療に使用するための、ＣＡＲを発現する薬学的に有効量のＴ細胞またはＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供され、抗原結合ドメインは配列番号３および配列番号４を含むｓｃＦｖであり、前記ＣＡＲはＣＤ８αヒンジドメインおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインは４－１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【0057】
一実施形態において、転移性骨肉腫の治療に使用するための、ＣＡＲを発現する薬学的に有効量のＴ細胞またはＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供され、本明細書に記載されるように抗原結合ドメインはＴＰ１ ｓｃＦｖ－断片である。一実施形態において、ＴＰ１ ｓｃＦｖ－断片は、ペプチドリンカーによって連結されたＴＰ１ ＶＬおよびＴＰ１ ＶＨを含む。
【0058】
特定の一実施形態において、転移性骨肉腫の治療に使用されるＣＡＲを発現する薬学的に有効量のＴ細胞またはＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供され、抗原結合ドメインは配列番号１および配列番号２を含むｓｃＦｖであり、前記ＣＡＲはＣＤ８αヒンジドメインおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインは４－１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【0059】
一実施形態において、転移性骨肉腫の治療に使用するためのＣＡＲを発現する薬学的に有効量のＴ細胞またはＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供され、本明細書に記載されるように抗原結合ドメインはＴＰ３ ｓｃＦｖ－断片である。一実施形態において、ＴＰ３ ｓｃＦｖ－断片はペプチドリンカーによって連結されたＴＰ３ ＶＬおよびＴＰ３ ＶＨを含む。
【0060】
特定の一実施形態において、転移性骨肉腫の治療に使用するためのＣＡＲを発現する薬学的に有効量のＴ細胞またはＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供され、抗原結合ドメインは配列番号３および配列番号４を含むｓｃＦｖであり、前記ＣＡＲはＣＤ８αヒンジドメインおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインは４－１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【0061】
特定の一実施形態において、転移性骨肉腫の治療に使用するためのＣＡＲを発現する薬学的に有効量のＴ細胞またはＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供され、抗原結合ドメインは、配列番号３またはそれと８０％を超える配列同一性のある配列、および、配列番号４またはそれと８０％を超える配列同一性のある配列を含むｓｃＦｖであり、前記ＣＡＲはＣＤ８αヒンジドメインおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインは４－１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【0062】
一実施形態において、微小転移性骨肉腫の治療に使用するためのＣＡＲを発現する薬学的に有効量のＴ細胞またはＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供され、抗原結合ドメインは本明細書に記載されるようにＴＰ１ ｓｃＦｖ－断片を含む。一実施形態において、ＴＰ１ ｓｃＦｖ－断片は、ペプチドリンカーによって連結されたＴＰ１ ＶＬおよびＴＰ１ ＶＨを含む。
【0063】
特定の一実施形態において、微小転移性骨肉腫の治療に使用するためのＣＡＲを発現する薬学的に有効量のＴ細胞またはＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供され、抗原結合ドメインは配列番号１および配列番号２を含むｓｃＦｖであり、前記ＣＡＲはＣＤ８αヒンジドメインおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【0064】
一実施形態において、微小転移性骨肉腫の治療に使用するためのＣＡＲを発現する薬学的に有効量のＴ細胞またはＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供され、抗原結合ドメインは本明細書に記載されるようにＴＰ３ ｓｃＦｖ－断片を含む。一実施形態において、ＴＰ３ ｓｃＦｖ－断片は、ペプチドリンカーによって連結されたＴＰ３ ＶＬおよびＴＰ３ ＶＨを含む。
【0065】
特定の一実施形態において、微小転移性骨肉腫の治療に使用するためのＣＡＲを発現する薬学的に有効量のＴ細胞またはＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供され、抗原結合ドメインは配列番号３および配列番号４を含むｓｃＦｖであり、前記ＣＡＲはＣＤ８αヒンジドメインおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【0066】
特定の一実施形態において、ヒト患者において転移性骨肉腫の治療に使用するための、ＣＡＲを発現する薬学的に有効量のヒトＴ細胞またはＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供され、抗原結合ドメインは、配列番号１または、ＣＤＲが改変されていない場合、配列番号１と９０％を超える配列同一性のある配列と、配列番号２または、ＣＤＲが改変されていない場合、配列番号２と９０％を超える配列同一性のある配列２とを含み、前記ＣＡＲはＣＤ８αヒンジドメインおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインは４－１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【0067】
特定の一実施形態において、ヒト患者において転移性骨肉腫の治療に使用するための、ＣＡＲを発現する薬学的に有効量のヒトＴ細胞またはＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供され、抗原結合ドメインは配列番号３またはＣＤＲが改変されていない場合、配列番号３と９０％を超える配列同一性のある配列と、配列番号４またはＣＤＲが改変されていない場合、配列番号４と９０％を超える配列同一性のある配列とを含み、前記ＣＡＲはＣＤ８αヒンジドメインと、ＣＤ８α膜貫通ドメインとを含み、細胞内シグナル伝達ドメインは４－１ＢＢ共刺激ドメインとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとを含む。
【0068】
特定の一実施形態において、犬の骨肉腫の治療に使用するための、ＣＡＲを発現する薬学的に有効量のイヌＴ細胞またはＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供され、抗原結合ドメインは配列番号１またはＣＤＲが改変されていない場合、配列番号１と９０％を超える配列同一性のある配列と、配列番号２またはＣＤＲが改変されていない場合配列番号２と９０％を超える配列同一性のある配列とを含み、前記ＣＡＲはＣＤ８αヒンジドメインおよび膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインは４－１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【0069】
特定の一実施形態において、犬の骨肉腫の治療に使用するための、ＣＡＲを発現する薬学的に有効量のイヌＴ細胞またはＮＫ細胞を含む医薬組成物が提供され、抗原結合ドメインは配列番号３またはＣＤＲが改変されていない場合、配列番号３と９０％を超える配列同一性のある配列と、配列番号４またはＣＤＲが改変されていない場合、配列番号４と９０％を超える配列同一性のある配列とを含み、前記ＣＡＲはＣＤ８αヒンジドメインおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインは４－１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【0070】
局所ＯＳと診断された多くの患者はＯＳ転移を発症する。転移性ＯＳは、最初に罹患した骨から、起源の部位から離れている身体内の１つ以上の部位に広がった骨肉腫である。検出可能なＯＳ転移は一次診断時に大半の患者で存在する。そのような検出された肺転移の外科的切除にもかかわらず、任意の残っている微小転移は、その後の再発、および最終的には死を引き起こし得る。ＯＳ微小転移は、検出された肺転移の外科的切除後、大半の患者で存在すると考えられている。微小転移性腫瘍はその小さいサイズのために、現在の手順によってはほとんど検出できず、それゆえ名前が微小転移性ＯＳである。しかしながら、静脈内注射時に、本明細書のＣＡＲを発現する免疫細胞は肺に移動し、そのような微小転移性腫瘍に浸透し得る。特に、ＯＳ微小転移性腫瘍においてＣＡＲ Ｔ細胞が正常にその標的に結合したとき、Ｔ細胞は正常に活性化し、細胞傷害性効果が引き起こされ得る。本明細書に開示される医薬組成物は、したがって、転移性ＯＳおよび／または微小転移性ＯＳの代替療法を提供し得る。
【0071】
特定の一実施形態において、
ａ）ＴＰ１ ｓｃＦｖ－断片を含むＣＡＲをコードするウイルスベクターでＮＫ細胞および／またはＴ細胞の集団に形質導入するステップと、
ｂ）ステップａ）からの細胞を含む医薬組成物を骨肉腫と診断された患者に投与するステップ
とを含む骨肉腫の治療の方法が提供される。
ａ）ＴＰ１ ｓｃＦｖ－断片を含むＣＡＲをコードするウイルスベクターでＮＫ細胞および／またはＴ細胞の集団に形質導入するステップと、
ｂ）ステップａ）からの細胞を含む医薬組成物を骨肉腫と診断された患者に投与するステップ
とを含む骨肉腫の治療の方法が提供される。
【0072】
特定の一実施形態において、
ａ）ＯＳＣＡＲ１をコードするウイルスベクターでＮＫ細胞および／またはＴ細胞の集団に形質導入するステップと、
ｂ）ステップａ）からの細胞を含む医薬組成物を骨肉腫と診断された患者に静脈内投与するステップ
とを含む骨肉腫の治療の方法が提供される。
ａ）ＯＳＣＡＲ１をコードするウイルスベクターでＮＫ細胞および／またはＴ細胞の集団に形質導入するステップと、
ｂ）ステップａ）からの細胞を含む医薬組成物を骨肉腫と診断された患者に静脈内投与するステップ
とを含む骨肉腫の治療の方法が提供される。
【0073】
特定の一実施形態において、
ａ）ＯＳＣＡＲ１をコードするウイルスベクターでＮＫ細胞および／またはＴ細胞の集団に形質導入するステップと、
ｂ）ステップａ）からの細胞を含む医薬組成物を転移性骨肉腫と診断された患者に静脈内投与するステップ
とを含む転移性骨肉腫の治療の方法が提供される。
ａ）ＯＳＣＡＲ１をコードするウイルスベクターでＮＫ細胞および／またはＴ細胞の集団に形質導入するステップと、
ｂ）ステップａ）からの細胞を含む医薬組成物を転移性骨肉腫と診断された患者に静脈内投与するステップ
とを含む転移性骨肉腫の治療の方法が提供される。
【0074】
特定の一実施形態において、
ａ）ＯＳＣＡＲ１をコードするウイルスベクターでＮＫ細胞および／またはＴ細胞の集団に形質導入するステップと、
ｂ）ステップａ）からの細胞を含む医薬組成物を転移性骨肉腫と以前に診断された患者であって、現在、検出可能な転移は検出されていない患者に投与するステップ
とを含む微小転移性骨肉腫の治療の方法が提供される。
ａ）ＯＳＣＡＲ１をコードするウイルスベクターでＮＫ細胞および／またはＴ細胞の集団に形質導入するステップと、
ｂ）ステップａ）からの細胞を含む医薬組成物を転移性骨肉腫と以前に診断された患者であって、現在、検出可能な転移は検出されていない患者に投与するステップ
とを含む微小転移性骨肉腫の治療の方法が提供される。
【0075】
特定の一実施形態において、
ａ）ＴＰ３ ｓｃＦｖ－断片を含むＣＡＲをコードするｍＲＮＡでＮＫ細胞および／またはＴ細胞の集団に形質導入するステップと、
ｂ）ステップａ）からの細胞を含む医薬組成物を骨肉腫と診断された患者に投与するステップ
とを含む骨肉腫の治療の方法が提供される。
ａ）ＴＰ３ ｓｃＦｖ－断片を含むＣＡＲをコードするｍＲＮＡでＮＫ細胞および／またはＴ細胞の集団に形質導入するステップと、
ｂ）ステップａ）からの細胞を含む医薬組成物を骨肉腫と診断された患者に投与するステップ
とを含む骨肉腫の治療の方法が提供される。
【0076】
特定の一実施形態において、
ａ）ＯＳＣＡＲ３をコードするｍＲＮＡでＮＫ細胞および／またはＴ細胞の集団に形質導入するステップと、
ｂ）ステップａ）からの細胞を含む医薬組成物を骨肉腫と診断された患者に投与するステップ
とを含む骨肉腫の治療の方法が提供される。
ａ）ＯＳＣＡＲ３をコードするｍＲＮＡでＮＫ細胞および／またはＴ細胞の集団に形質導入するステップと、
ｂ）ステップａ）からの細胞を含む医薬組成物を骨肉腫と診断された患者に投与するステップ
とを含む骨肉腫の治療の方法が提供される。
【0077】
特定の一実施形態において、
ａ）ＯＳＣＡＲ３をコードするｍＲＮＡでＮＫ細胞および／またはＴ細胞の集団に形質導入するステップと、
ｂ）ステップａ）からの細胞を含む医薬組成物を転移性骨肉腫と診断された患者に投与するステップ
とを含む転移性骨肉腫の治療の方法が提供される。
ａ）ＯＳＣＡＲ３をコードするｍＲＮＡでＮＫ細胞および／またはＴ細胞の集団に形質導入するステップと、
ｂ）ステップａ）からの細胞を含む医薬組成物を転移性骨肉腫と診断された患者に投与するステップ
とを含む転移性骨肉腫の治療の方法が提供される。
【0078】
特定の一実施形態において、
ａ）ＯＳＣＡＲ３をコードするｍＲＮＡでＮＫ細胞および／またはＴ細胞の集団に形質導入するステップと、
ｂ）ステップａ）からの細胞を含む医薬組成物を以前に転移性骨肉腫と診断された患者であって、現在、検出可能な転移は検出されていない患者に投与するステップ
とを含む微小転移性骨肉腫の治療の方法が提供される。
ａ）ＯＳＣＡＲ３をコードするｍＲＮＡでＮＫ細胞および／またはＴ細胞の集団に形質導入するステップと、
ｂ）ステップａ）からの細胞を含む医薬組成物を以前に転移性骨肉腫と診断された患者であって、現在、検出可能な転移は検出されていない患者に投与するステップ
とを含む微小転移性骨肉腫の治療の方法が提供される。
【0079】
【表1】
実施例
実施例１
ＣＡＲ設計
２つの新規な第２世代のＣＡＲをｐＥＮＴＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、Ｇａｔｅｗａｙ系の互換性のある発現ベクター、レトロウイルスのコンストラクトｐＭＰ７１、およびｍＲＮＡ合成コンストラクトｐＣＩｐＡ１０２に、我々の以前の出版物（Ｗaｌｃｈｌｉら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１；６（１１）：ｅ２７９３０、および、Ｉｎｄｅｒｂｅｒｇ Ｅ．Ｍ．、Ｗaｌｃｈｌｉ Ｓ．（２０１９） Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｔｏ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｖｏｌｕｍｅ２、Ｉｓｓｕｅ２、Ａｐｒｉｌ ２０１９、ページ５６～６３）にしたがって、組換えによってさらにサブクローニングした。
【0080】
ベクターにコードされたＣＡＲ配列は、Ｌ鎖－ＶＬ鎖－リンカー－ＶＨ鎖－ＣＤ８αヒンジドメイン－ＣＤ８α膜貫通ドメイン－４－１ＢＢ共刺激ドメイン－ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインであった。
【0081】
したがって、ＯＳＣＡＲ１を発現するベクターは、配列番号１０－配列番号１－配列番号９－配列番号２－配列番号５－配列番号６－配列番号７－配列番号８をコードしていた。
【0082】
ＯＳＣＡＲ３を発現するベクターは、配列番号１０－配列番号３－配列番号９－配列番号４－配列番号５－配列番号６－配列番号７－配列番号８をコードしていた。
実施例２：
ＣＡＲ発現
実施例１からのＯＳＣＡＲ１およびＯＳＣＡＲ３のレトロウイルス粒子を調製し、良く知られている方法（Ｗaｌｃｈｌｉら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１；６（１１）：ｅ２７９３０）によって、健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離された初代Ｔ細胞に形質導入した。４８時間後、抗マウスＦａｂ抗体（抗ＣＡＲ）を使用したフローサイトメトリーでＣＡＲの存在を分析した。結果は図１に含まれる。
実施例２：
ＣＡＲ発現
実施例１からのＯＳＣＡＲ１およびＯＳＣＡＲ３のレトロウイルス粒子を調製し、良く知られている方法（Ｗaｌｃｈｌｉら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１；６（１１）：ｅ２７９３０）によって、健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離された初代Ｔ細胞に形質導入した。４８時間後、抗マウスＦａｂ抗体（抗ＣＡＲ）を使用したフローサイトメトリーでＣＡＲの存在を分析した。結果は図１に含まれる。
【0083】
以下の実施例において、ＯＳＣＡＲ１またはＯＳＣＡＲ３を発現するＴ細胞を形質導入していないＴ細胞（モック）と比較している。いくつかの図において、Ｔ細胞を省略してＴｃと書く。したがって「ＯＳＣＡＲ１ Ｔｃ」および「Ｔｃ ＯＳＣＡＲ－１」の両方は、ＯＳＣＡＲ１を発現するＴ細胞を表す。したがって「ＯＳＣＡＲ３ Ｔｃ」および「Ｔｃ ＯＳＣＡＲ－３」の両方は、ＯＳＣＡＲ３を発現するＴ細胞を表す。
【0084】
実施例３
インビトロでのＣＡＲ機能（殺傷およびサイトカイン放出）
Ｔ細胞単独（モック）、ＯＳＣＡＲ１を発現するＴ細胞、およびＯＳＣＡＲ３を発現するＴ細胞を示された標的細胞と２４時間インキュベートした。上清をその後採取し、ＢｉｏＰｌｅｘによってサイトカインの存在を検出した。示されるように、ＯＳＣＡＲリダイレクト細胞は、特定の刺激時にＴＮＦαおよびＩＦＮγの放出に対して強く活性化された。
インビトロでのＣＡＲ機能（殺傷およびサイトカイン放出）
Ｔ細胞単独（モック）、ＯＳＣＡＲ１を発現するＴ細胞、およびＯＳＣＡＲ３を発現するＴ細胞を示された標的細胞と２４時間インキュベートした。上清をその後採取し、ＢｉｏＰｌｅｘによってサイトカインの存在を検出した。示されるように、ＯＳＣＡＲリダイレクト細胞は、特定の刺激時にＴＮＦαおよびＩＦＮγの放出に対して強く活性化された。
【0085】
インビトロでの標的細胞株の殺傷：
ＯＳＣＡＲ１またはＯＳＣＡＲ３を発現するＴ細胞を骨肉腫細胞株（ＯＨＳ、ＳＡＯＳ－２、ＯＳＡ）と２０時間インキュベートすることによってインビトロでの標的細胞株の殺傷を実証した。全ての標的細胞はＧＦＰに融合されたルシフェラーゼ遺伝子を恒常的に発現し、公知の方法（Ｗａｌｓｅｎｇら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１７ Ｓｅｐ ６；７（１）：１０７１３）によってルシフェラーゼ基質を添加時のルシフェラーゼの存在を使用して細胞殺傷を検出した。標的細胞におけるルシフェラーゼシグナルの変動を測定することによって（ＢＬＩアッセイ）Ｔ細胞殺傷を監視した。結果を図３ａ、３ｂおよび３ｃに示す。
ＯＳＣＡＲ１またはＯＳＣＡＲ３を発現するＴ細胞を骨肉腫細胞株（ＯＨＳ、ＳＡＯＳ－２、ＯＳＡ）と２０時間インキュベートすることによってインビトロでの標的細胞株の殺傷を実証した。全ての標的細胞はＧＦＰに融合されたルシフェラーゼ遺伝子を恒常的に発現し、公知の方法（Ｗａｌｓｅｎｇら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１７ Ｓｅｐ ６；７（１）：１０７１３）によってルシフェラーゼ基質を添加時のルシフェラーゼの存在を使用して細胞殺傷を検出した。標的細胞におけるルシフェラーゼシグナルの変動を測定することによって（ＢＬＩアッセイ）Ｔ細胞殺傷を監視した。結果を図３ａ、３ｂおよび３ｃに示す。
【0086】
実施例４
インビボでのＣＡＲ機能（異種移植モデル）
ＣＡＲ有効性の評価のために、ヒト骨肉腫細胞株がマウスに移植された動物モデルを使用した。ルシフェラーゼ遺伝子を発現する１０６個のＯＨＳ細胞を腹腔内注射によって移植を行った。腫瘍が触知可能になったとき、マウスを無作為抽出し、ＯＳＣＡＲ１リダイレクトＴ細胞またはＯＳＣＡＲ３リダイレクトＴ細胞か、またはリダイレクトされていないＴ細胞で処理したか、またはしなかった。１０×１０６個のＴ細胞の３つの注射を行い、腫瘍増殖をＩＶＩＳ（ルシフェラーゼシグナル検出）によって監視した。加えて、マウスの生存率も研究した。条件：マウス５匹／群、Ｎ＝２。
インビボでのＣＡＲ機能（異種移植モデル）
ＣＡＲ有効性の評価のために、ヒト骨肉腫細胞株がマウスに移植された動物モデルを使用した。ルシフェラーゼ遺伝子を発現する１０６個のＯＨＳ細胞を腹腔内注射によって移植を行った。腫瘍が触知可能になったとき、マウスを無作為抽出し、ＯＳＣＡＲ１リダイレクトＴ細胞またはＯＳＣＡＲ３リダイレクトＴ細胞か、またはリダイレクトされていないＴ細胞で処理したか、またはしなかった。１０×１０６個のＴ細胞の３つの注射を行い、腫瘍増殖をＩＶＩＳ（ルシフェラーゼシグナル検出）によって監視した。加えて、マウスの生存率も研究した。条件：マウス５匹／群、Ｎ＝２。
【0087】
図４ａは、本処理のプロトコルおよびタイムラインを示す。図４ｂは、左に示されるように処理されたマウスの一例示的なＩＶＩＳ画像（これは２０日目）である。示されるように、ＯＳＣＡＲ１およびＯＳＣＡＲ３処理された動物は、２０日目において非常に低いか検出不可能な腫瘍負荷を示した。図４ｃは各動物のルシフェラーゼシグナルのスパイダープロットであり、ＯＳＣＡＲコンストラクトが腫瘍発症を制御し得ることが示された。これは、ＯＳＣＡＲ１で処理した動物の８０％がエンドポイントにおいて生存することを示す図４ｄの生存曲線（カプラン・マイヤー）と一致する。ＯＳＣＡＲ３で処理した動物は、モックおよび生理食塩水で処理した動物より良好に生存し、生存曲線に関してはＯＳＣＡＲ１動物と統計的に異ならなかった。
【0088】
実施例５
インビボでのＣＡＲ機能（異種移植モデル）
図５ａに示されるように、我々はまた、ＯＳＡ（ルシフェラーゼ＋）細胞株をｎｏｄ－ｓｃｉｄマウスに静脈内（ｉｖ）注射した肺転移腫瘍モデルを使用した。この細胞株は肺でコロニーを形成し、約２５～３０日後動物の死につながる侵攻性腫瘍を確立した。４日後、腫瘍負荷は肺で検出可能であり、マウスを無作為抽出し、ＯＳＣＡＲ Ｔ細胞で処理した。１０６個のＯＳＣＡＲリダイレクトＴ細胞でマウスを４回注射し、ＩＶＩＳによって腫瘍進行を分析した。示されるように、モックまたは培地で処理した動物と比べてＯＳＣＡＲ１およびＯＳＣＡＲ３によって、腫瘍増殖は、より長い期間制御されたが、動物は最終的には腫瘍を発症した。カプランマイヤー曲線によって、統計的にこの保護効果が確かめられたが、この侵攻性モデルにおいて動物をレスキューすることはできなかった。
インビボでのＣＡＲ機能（異種移植モデル）
図５ａに示されるように、我々はまた、ＯＳＡ（ルシフェラーゼ＋）細胞株をｎｏｄ－ｓｃｉｄマウスに静脈内（ｉｖ）注射した肺転移腫瘍モデルを使用した。この細胞株は肺でコロニーを形成し、約２５～３０日後動物の死につながる侵攻性腫瘍を確立した。４日後、腫瘍負荷は肺で検出可能であり、マウスを無作為抽出し、ＯＳＣＡＲ Ｔ細胞で処理した。１０６個のＯＳＣＡＲリダイレクトＴ細胞でマウスを４回注射し、ＩＶＩＳによって腫瘍進行を分析した。示されるように、モックまたは培地で処理した動物と比べてＯＳＣＡＲ１およびＯＳＣＡＲ３によって、腫瘍増殖は、より長い期間制御されたが、動物は最終的には腫瘍を発症した。カプランマイヤー曲線によって、統計的にこの保護効果が確かめられたが、この侵攻性モデルにおいて動物をレスキューすることはできなかった。
【0089】
実施例６
ＣＡＲ安全性
ＣＡＲ療法は危険な療法としてみなされ得る。これは主に、所与のコンストラクトが健康な組織に対して有し得る予測不可能な標的化のためである。ＯＳＣＡＲ１およびＯＳＣＡＲ３の特異性を試験するために、造血細胞に対する一連の試験を行った。アッセイは、肝細胞の源としての、ドナーからの骨髄の単離からなる。同じドナーからの血液を取り、Ｔ細胞を単離し、肝細胞と共にインキュベートする前に興味の対象であるＣＡＲで改変した。その後、各タイプの血液前駆体を拡大培養するためにコロニーを異なる培地で増殖させた。コロニーが視認可能になったとき、それらを数え、対照と比較した。
ＣＡＲ安全性
ＣＡＲ療法は危険な療法としてみなされ得る。これは主に、所与のコンストラクトが健康な組織に対して有し得る予測不可能な標的化のためである。ＯＳＣＡＲ１およびＯＳＣＡＲ３の特異性を試験するために、造血細胞に対する一連の試験を行った。アッセイは、肝細胞の源としての、ドナーからの骨髄の単離からなる。同じドナーからの血液を取り、Ｔ細胞を単離し、肝細胞と共にインキュベートする前に興味の対象であるＣＡＲで改変した。その後、各タイプの血液前駆体を拡大培養するためにコロニーを異なる培地で増殖させた。コロニーが視認可能になったとき、それらを数え、対照と比較した。
【0090】
２人のドナーからのＴ細胞を示されるＣＡＲコンストラクトでエレクトロポレーションまたはモックでエレクトロポレーションした。図６ａに示されるように、ＯＳＣＡＲ１またはＯＳＣＡＲ３のいずれもコロニー形成に影響を及ぼさず、それらの標的が血液前駆細胞に存在しないことを示唆している。我々は、安定的にＯＳＣＡＲ１またはＯＳＣＡＲ３を発現している自己Ｔ細胞を使用したとき、これらのデータを確かめ、この場合もまた、統計的な影響は検出されず（図６ｂ参照）、ＯＳＣＡＲが造血幹細胞を殺傷しないことが示唆された。
【0091】
実施例７
写真が示されている実施例５と同じ実験によって（図７参照）、対照動物（＊）において骨転移の存在が実証されたが、ＯＳＣＡＲ処理された動物では腫瘍発症の制御が実証された。
写真が示されている実施例５と同じ実験によって（図７参照）、対照動物（＊）において骨転移の存在が実証されたが、ＯＳＣＡＲ処理された動物では腫瘍発症の制御が実証された。
【0092】
実施例８
実施例７に基づくカプラン・マイヤー生存曲線は、ＯＳＣＡＲ１およびＯＳＣＡＲ３の両方は肺における腫瘍増殖を制御することができ、それゆえ動物の生存を延長することを実証する（図８参照）。ＯＳＡは非常に侵攻性である細胞株（Ｌａｕｖｒａｋら、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１３ Ｏｃｔ １５；１０９（８）：２２２８－２２３６）であり、この実験はそのようなモデルにおけるＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を最初に実証したものであり得ることに注意されたい。
実施例７に基づくカプラン・マイヤー生存曲線は、ＯＳＣＡＲ１およびＯＳＣＡＲ３の両方は肺における腫瘍増殖を制御することができ、それゆえ動物の生存を延長することを実証する（図８参照）。ＯＳＡは非常に侵攻性である細胞株（Ｌａｕｖｒａｋら、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１３ Ｏｃｔ １５；１０９（８）：２２２８－２２３６）であり、この実験はそのようなモデルにおけるＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を最初に実証したものであり得ることに注意されたい。
【0093】
実施例９
我々は代替的なあまり侵攻性でない肺転移腫瘍モデルを使用した。Ｎｏｄ－ｓｃｉｄマウスに、インビトロでＯＳＣＡＲ１およびＯＳＣＡＲ３によってまた認識されるＬＭ－７（ルシフェラーゼ＋）細胞株を静脈内（ｉｖ）注射し、ＯＳＡより遅く肺転移を形成させた。ｉｖ注射後、この細胞株は肺でコロニー形成し、約４０～５０日後に動物を死に至らせる侵攻性の腫瘍を確立する。処理５日後にマウスを無作為抽出し、ＯＳＣＡＲＴ細胞で処理した。マウスを１０６個のＯＳＣＡＲリダイレクトＴ細胞で４回ｉｖ注射し、腫瘍進行をＩＶＩＳで分析した。図９に示されるように、腫瘍増殖はモックと比較してＯＳＣＡＲによって制御され、形質導入された細胞の良好な有効性を支持している。
我々は代替的なあまり侵攻性でない肺転移腫瘍モデルを使用した。Ｎｏｄ－ｓｃｉｄマウスに、インビトロでＯＳＣＡＲ１およびＯＳＣＡＲ３によってまた認識されるＬＭ－７（ルシフェラーゼ＋）細胞株を静脈内（ｉｖ）注射し、ＯＳＡより遅く肺転移を形成させた。ｉｖ注射後、この細胞株は肺でコロニー形成し、約４０～５０日後に動物を死に至らせる侵攻性の腫瘍を確立する。処理５日後にマウスを無作為抽出し、ＯＳＣＡＲＴ細胞で処理した。マウスを１０６個のＯＳＣＡＲリダイレクトＴ細胞で４回ｉｖ注射し、腫瘍進行をＩＶＩＳで分析した。図９に示されるように、腫瘍増殖はモックと比較してＯＳＣＡＲによって制御され、形質導入された細胞の良好な有効性を支持している。
【0094】
実施例１０
５０００個の骨肉腫細胞（ＯＨＳ細胞株）由来の腫瘍スフェロイドを７日間成長させ、蛍光生細胞顕微鏡によって監視した（ＧＦＰ＝白）。Ｔ細胞（モックまたはＯＳＣＡＲ発現）を追加し、写真を定期的に撮影し、ＧＦＰシグナルを分析した。図１０に示されるように、ＯＳＣＡＲ１またはＯＳＣＡＲ３のいずれかを発現するＴ細胞は、スフェロイド内部の腫瘍を殺傷することができる。
５０００個の骨肉腫細胞（ＯＨＳ細胞株）由来の腫瘍スフェロイドを７日間成長させ、蛍光生細胞顕微鏡によって監視した（ＧＦＰ＝白）。Ｔ細胞（モックまたはＯＳＣＡＲ発現）を追加し、写真を定期的に撮影し、ＧＦＰシグナルを分析した。図１０に示されるように、ＯＳＣＡＲ１またはＯＳＣＡＲ３のいずれかを発現するＴ細胞は、スフェロイド内部の腫瘍を殺傷することができる。
【図1】
【図2】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図4d】
【図5a】
【図5b】
【図6a】
【図6b】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】