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特許7455181ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８を阻害するペプチド
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-14
(45)【発行日】2024-03-25
(54)【発明の名称】ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８を阻害するペプチド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240315BHJP
C07K 14/81 20060101ALI20240315BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240315BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240315BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240315BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240315BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240315BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240315BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240315BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240315BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240315BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240315BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240315BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240315BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240315BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240315BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C07K14/81
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
A61P43/00 111
A61K38/16
A61K31/7088
A61K48/00
A61K35/76
A61K35/12
A61K47/64
C07K19/00
C12N15/62 Z
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2022195853
(22)【出願日】2022-12-07
(62)【分割の表示】P 2019540996の分割
【原出願日】2018-09-06
(65)【公開番号】P2023025223
(43)【公開日】2023-02-21
【審査請求日】2022-12-07
(31)【優先権主張番号】P 2017171776
(32)【優先日】2017-09-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】307010166
【氏名又は名称】第一三共株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100146581
【弁理士】
【氏名又は名称】石橋 公樹
(74)【代理人】
【識別番号】100113583
【弁理士】
【氏名又は名称】北野 範子
(74)【代理人】
【識別番号】100161160
【弁理士】
【氏名又は名称】竹元 利泰
(74)【代理人】
【識別番号】100167678
【弁理士】
【氏名又は名称】西田 直浩
(72)【発明者】
【氏名】西宮 大祐
(72)【発明者】
【氏名】田村 正和
【審査官】松田 芳子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１４／０２４９１４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１０／０１７５８７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】J. Invest. Dermatol.，2009年，vol.129, p.1656-1665
【文献】EMBO Molecular Medicine，2017年05月29日，vol.9, no.8，p.1132-1149
【文献】フナコシ，抗ＳＰＩＮＫ２抗体(Anti-SPINK2 Antibody)｜ヒト組織免疫染色用抗体 [online]，Ｗｅｂページ番号：１５６５４，2018年06月28日，[検索日:2018.11.21]，https://www.funakoshi.co.jp/contents/15654
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／０９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記（ｉ）で示されるアミノ酸配列を含み、且つ、ＫＬＫ４の有するプロテアーゼ活性を特異的に阻害する、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド：
（ｉ）配列番号９乃至１２（図１５乃至１８）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列。
【請求項2】
該アミノ酸配列のアミノ末端側に、１乃至３個のアミノ酸残基が付加してなるアミノ酸配列、又は、配列番号２６（図３２）で示されるアミノ酸配列が付加してなるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のペプチド。
【請求項3】
該アミノ酸配列のカルボキシル末端側に、１乃至６個のアミノ酸からなるアミノ酸配列が付加してなるアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項4】
３つのジスルフィド結合を有し、ループ構造、αへリックス及びβシートを含むことで特徴付けられる立体構造を有する、請求項１乃至３のいずれか一つに記載のペプチド。
【請求項5】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項6】
請求項５記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項7】
請求項５記載のポリヌクレオチド若しくは請求項６記載のベクターを含むか又は請求項１乃至４のいずれか一つに記載のペプチドを産生する細胞。
【請求項8】
下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの製造方法：（ｉ）請求項７記載の細胞を培養する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた培養物からＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドを回収する工程。
【請求項9】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載のペプチドを化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該ペプチドの製造方法。
【請求項10】
請求項８又は９記載の方法により得られるＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド。
【請求項11】
請求項１乃至４及び１０のいずれか一つに記載のペプチドに他の部分が結合してなるコンジュゲート。
【請求項12】
ペプチドである、請求項１１記載のコンジュゲート。
【請求項13】
免疫グロブリンのＦｃ領域を含む、請求項１１又は１２記載のコンジュゲート。
【請求項14】
下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、請求項１２又は１３記載のＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲートの製造方法：（ｉ）該コンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドが挿入されたベクターを含む細胞を培養する工程：
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた培養物からＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を回収する工程。
【請求項15】
請求項１１乃至１３のいずれか一つに記載のＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該コンジュゲートの製造方法。
【請求項16】
請求項１４又は１５記載の方法により得られるＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲート。
【請求項17】
請求項１乃至４及び１０のいずれか一つに記載のペプチド、請求項５記載のポリヌクレオチド、請求項６記載のベクター、請求項７記載の細胞、及び／又は、請求項１１乃至１３及び１６のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む組成物。
【請求項18】
請求項１乃至４及び１０のいずれか一つに記載のペプチド、請求項５記載のポリヌクレオチド、請求項６記載のベクター、請求項７記載の細胞、及び／又は、請求項１１乃至１３及び１６のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項19】
請求項１乃至４及び１０のいずれか一つに記載のペプチド、請求項５記載のポリヌクレオチド、請求項６記載のベクター、請求項７記載の細胞、及び／又は、請求項１１乃至１３及び１６のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む、ＫＬＫ４の検出用又は測定用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、ペプチドの製造方法、かかる方法により得られるペプチド、ペプチドに他の部分が結合してなるコンジュゲート、ペプチド又はコンジュゲートを含む組成物、ペプチド又はコンジュゲートを含む医薬組成物、ペプチド又はコンジュゲートを含む各種疾患の治療又は予防のための該医薬組成物、各種疾患の治療又は予防のためのペプチド又はコンジュゲートの使用、ペプチド又はコンジュゲートを投与する工程を含む各種疾患の治療方法、ペプチド又はコンジュゲートを含む各種疾患の診断又は検査のための組成物等に関する。
【背景技術】
【0002】
ＫＬＫ１はＮ末プロペプチドとプロテアーゼ活性ドメインからなり、３箇所のＮ型糖鎖付加が知られている（非特許文献１）。ＫＬＫ１はトリプシン様およびキモトリプシン様のプロテアーゼ活性を示し、カリクレインファミリーの中でも高いキニノーゲン分解活性を有している。その切断によって血中では血圧の調整に関与し、腎臓や心疾患系ではＨ＋－ＡＴＰａｓｅやＫ＋－ＡＴＰａｓｅなどの様々なトランスポーターに影響する（非特許文献２）。気道においては、ＫＬＫ１によるキニノーゲンの分解により生じたキニンがＢｒａｄｙｋｉｎｉｎ Ｂ２受容体を活性化し、気管の平滑筋収縮や粘液の過剰分泌を誘導する。さらに、ＫＬＫ１活性の増大とＩＬ－８およびｆｒｅｅ ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎの上昇の関連が報告されていることから、ＫＬＫ１は喘息の治療標的として示唆されている。これまでに、急性膵炎や気管支炎などのモデルにおいて低分子のＫＬＫ１阻害剤の効果が検証されていたが、その薬効または特異性は充分ではなかった。近年ではヒトモノクローナル抗体によるＫＬＫ１阻害薬が報告されており、ヒツジ喘息モデルで薬効を示すことが明らかとなっている（非特許文献３）。しかし、特異的にＫＬＫ１阻害活性を示す、抗体又はその断片以外の低分子量蛋白質（例えば、免疫グロブリン可変領域を含まない蛋白質）は知られていない。
【0003】
ＫＬＫ４はＮ末プロペプチドとプロテアーゼ活性を有するトリプシン様ドメインからなり、Ｎ型糖鎖が付加することが知られている。ＫＬＫ４は歯のエナメル形成時に分泌され、ＭＭＰ２０（Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ２０）によりＮ末のプロペプチドが切断されることで活性化ＫＬＫ４となる（非特許文献１）。活性化ＫＬＫ４はａｍｅｌｏｇｅｎｉｎやｅｎａｍｅｌｉｎなどのエナメルマトリックス成分を分解することで、ハイドロキシアパタイト結晶を主成分とするエナメル層の成熟促進に関与している（非特許文献２）。また、ＫＬＫ４に対するｓｉＲＮＡを前立腺がん移植マウスに投与した場合、腫瘍の増殖抑制が観察されており、前立腺がんとの関連も示唆されている。これまでに、ＫＬＫ４阻害剤としてＳｕｎｆｌｏｗｅｒ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＦＴＩ）由来の改変ペプチドなどが報告されており、がん細胞株においてＰａｃｌｉｔａｘｅｌとの併用で薬効を示しているが、その効果は充分とは言い難い（特許文献１，特許文献２，非特許文献４）。また、天然界においてはヒトｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｏｆ Ｋａｚａｌ－ｔｙｐｅ ６（ＳＰＩＮＫ６）がＫＬＫ４阻害活性を有しており、２７ｎＭのＫｉを示す一方、ＫＬＫ１２やＫＬＫ１３に対しては１ｎＭのＫｉを示すことから、特異性は高くない（非特許文献５）。そのため、抗体又はその断片以外の低分子量蛋白質（例えば、免疫グロブリン可変領域を含まない蛋白質）に代表されるＫＬＫ４特異的な阻害分子が望まれる。
【0004】
ＫＬＫ８はニューロプシンともよばれ、Ｎ末プロペプチドとプロテアーゼ活性を有するトリプシン様ドメインからなり、Ｎ型糖鎖が付加することが知られている（非特許文献１）。ＫＬＫ８はプロペプチドを有するプロ体として海馬や扁桃体、大脳辺縁系等で発現し、プロテアーゼによってプロペプチドが切断されることで活性化ＫＬＫ８となる。活性化ＫＬＫ８は海馬プレシナプスに存在する細胞接着分子Ｌ１ＣＡＭ（ｔｈｅ ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｌ１）や統合失調症脆弱因子ＮＲＧ１（Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ １）などを切断することで、長期記憶の増強や統合失調症などへの関与が報告されている（非特許文献２）。また、ＫＬＫ８はその高い発現が認められている大腸がんや卵巣がんとの関連が示唆されている（非特許文献６）。天然界において、ヒトｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｏｆ Ｋａｚａｌ－ｔｙｐｅ ９（ＳＰＩＮＫ９）がＫＬＫ８阻害活性を有していることが報告されたが、その活性は非常に弱い（非特許文献７）。ＫＬＫ８阻害活性を特異的に示す、抗体又はその断片以外の低分子量蛋白質（例えば、免疫グロブリン可変領域を含まない蛋白質）は知られていない。
【0005】
また、ＫＬＫ４関連疾患およびＫＬＫ８関連疾患を一剤で治療しうることを目的とした、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８に対する阻害活性を特異的に示す、抗体又はその断片以外の低分子量蛋白質（例えば、免疫グロブリン可変領域を含まない蛋白質）は知られていない。
【0006】
ＳＰＩＮＫ２（Ｓｅｒｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｋａｚａｌ－ｔｙｐｅ ２）は、３つのｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄを有するＫａｚａｌ－ｔｙｐｅ
ｄｏｍａｉｎから成る７ｋＤａのタンパク質である。ヒト生体内では精巣や精嚢で発現しており、ｔｒｙｐｓｉｎ／ａｃｒｏｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとして機能する（非特許文献８）。ＳＰＩＮＫ２自身がＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８二重阻害剤になりうることを示唆する知見はない。
ｄｏｍａｉｎから成る７ｋＤａのタンパク質である。ヒト生体内では精巣や精嚢で発現しており、ｔｒｙｐｓｉｎ／ａｃｒｏｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとして機能する（非特許文献８）。ＳＰＩＮＫ２自身がＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８二重阻害剤になりうることを示唆する知見はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】ＷＯ２０１０／０１７５８７
【文献】ＷＯ２０１５／１４４９３３
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ｇｕｏ Ｓ， Ｓｋａｌａ Ｗ， Ｍａｇｄｏｌｅｎ Ｖ， Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ Ｈ， Ｇｏｅｔｔｉｇ Ｐ． （２０１４） Ｓｗｅｅｔｅｎｅｄ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ （ＫＬＫｓ）： ｇｌｙｃａｎ ｔｒｅｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ３９５（９）：９５９－７６．
【文献】Ｐｒａｓｓａｓ Ｉ， Ｅｉｓｓａ Ａ， Ｐｏｄａ Ｇ， Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ． （２０１５） Ｕｎｌｅａｓｈｉｎｇ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． １４（３）：１８３－２０２．
【文献】Ｓｅｘｔｏｎ ＤＪ， Ｃｈｅｎ Ｔ， Ｍａｒｔｉｋ Ｄ， Ｋｕｚｍｉｃ Ｐ， Ｋｕａｎｇ Ｇ， Ｃｈｅｎ Ｊ， Ｎｉｘｏｎ ＡＥ， Ｚｕｒａｗ ＢＬ， Ｆｏｒｔｅｚａ ＲＭ， Ａｂｒａｈａｍ ＷＭ， Ｗｏｏｄ ＣＲ．（２００９） Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ １ ｗｉｔｈ ａ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ａｉｒｗａｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ４２２（２）：３８３－９２．
【文献】Ｄｏｎｇ Ｙ， Ｓｔｅｐｈｅｎｓ Ｃ， Ｗａｌｐｏｌｅ Ｃ， Ｓｗｅｄｂｅｒｇ ＪＥ， Ｂｏｙｌｅ ＧＭ， Ｐａｒｓｏｎｓ ＰＧ， ＭｃＧｕｃｋｉｎ ＭＡ， Ｈａｒｒｉｓ ＪＭ， Ｃｌｅｍｅｎｔｓ ＪＡ． （２０１３） Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐｈｅｒｏｉｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ４ ｉｎ ｓｅｒｏｕｓ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｎ ａｓｃｉｔｅｓ ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ８（２）：ｅ５７０５６．
【文献】Ｋａｎｔｙｋａ Ｔ１， Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｊ， Ｗｕ Ｚ， Ｄｅｃｌｅｒｃｑ Ｗ， Ｒｅｉｓｓ Ｋ， Ｓｃｈｒoｄｅｒ ＪＭ， Ｍｅｙｅｒ－Ｈｏｆｆｅｒｔ Ｕ． （２０１１） Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｋａｚａｌ－ｔｙｐｅ ６． Ｐｅｐｔｉｄｅｓ． ３２（６）：１１８７－９２．
【文献】Ｂｏｒｇｏnｏ ＣＡ１， Ｄｉａｍａｎｄｉｓ ＥＰ． （２００４） Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ． ４（１１）：８７６－９０．
【文献】Ｂｒａｔｔｓａｎｄ Ｍ１， Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ Ｋ， Ｈｕｂｉｃｈｅ Ｔ， Ｎｉｌｓｓｏｎ ＳＫ， Ｅｇｅｌｒｕｄ Ｔ．（２００９） ＳＰＩＮＫ９： ａ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ， ｓｋｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｋａｚａｌ－ｔｙｐｅ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ． Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １２９（７）：１６５６－６５．
【文献】Ｃｈｅｎ Ｔ， Ｌｅｅ ＴＲ， Ｌｉａｎｇ ＷＧ， Ｃｈａｎｇ ＷＳ， Ｌｙｕ Ｐ Ｃ． （２００９） Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｙｐｓｉｎ－ｉｎｈｉｂ ｉｔｏｒｙ ｓｉｔｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏ ｆ ｈｕｍａｎ ＳＰＩＮＫ２ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔ ｏｒ． Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． ７７（１）：２０９－１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
新規なＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８二重阻害（以下、単に「ＫＬＫ４及びＫＬＫ８阻害」又は「ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害」という）ペプチドを提供すること。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は
（１）
配列番号２３（図２９）で示されるアミノ酸配列を含み、且つ、ＫＬＫ１の有するプロテアーゼ活性を特異的に阻害するＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド、
（２）
１乃至１３番目のＸａａ（Ｘ１乃至Ｘ１３）がＣｙｓ及びＰｒｏ以外のアミノ酸である、（１）記載のペプチド、
（３）
１番目のＸａａ（Ｘ１）がＡｓｐ又はＧｌｙである、（１）又は（２）記載のペプチド、
（４）
２番目のＸａａ（Ｘ２）はＡｌａ、Ａｓｐ又はＳｅｒ、３番目のＸａａ（Ｘ３）はＩｌｅ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＶａｌ、４番目のＸａａ（Ｘ４）はＡｌａ、Ａｓｎ又はＴｙｒ、５番目のＸａａ（Ｘ５）はＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ又はＧｌｎ、６番目のＸａａ（Ｘ６）はＩｌｅ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ又はＶａｌ、７番目のＸａａ（Ｘ７）はＡｓｐ、Ａｒｇ又はＶａｌ、８番目のＸａａ（Ｘ８）はＡｓｐ、Ｉｌｅ又はＡｒｇ、９番目のＸａａ（Ｘ９）は
Ｐｈｅ、Ｈｉｓ又はＴｒｐ、１０番目のＸａａ（Ｘ１０）はＴｙｒ又はＴｒｐ、１１番目のＸａａ（Ｘ１１）はＡｌａ、Ｔｈｒ又はＴｙｒ、１２番目のＸａａ（Ｘ１２）はＳｅｒ又はＴｙｒ、並びに、１３番目のＸａａ（Ｘ１３）はＧｌｕ、Ｌｙｓ又はＧｌｎである、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載のペプチド、
（５）
配列番号５乃至８（図１１乃至１４）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、（１）乃至（４）のいずれか一つに記載のペプチド、
（６）
配列番号２３（図２９）で示されるアミノ酸配列を含み、且つ、ＫＬＫ４の有するプロテアーゼ活性を特異的に阻害するＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド、
（７）
１乃至１３番目のＸａａ（Ｘ１乃至Ｘ１３）がＣｙｓ及びＰｒｏ以外のアミノ酸である、（６）記載のペプチド、
（８）
１番目のＸａａ（Ｘ１）がＡｓｐ又はＧｌｙである、（６）又（７）記載のペプチド、（９）
２番目のＸａａ（Ｘ２）はＧｌｕ、Ａｒｇ又はＳｅｒ、３番目のＸａａ（Ｘ３）はＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ又はＧｌｎ、４番目のＸａａ（Ｘ４）はＡｌａ、Ｇｌｎ又はＴｙｒ、５番目のＸａａ（Ｘ５）はＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ又はＶａｌ、６番目のＸａａ（Ｘ６）はＧｌｕ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ又はＴｙｒ、７番目のＸａａ（Ｘ７）はＡｓｐ又はＧｌｙ、８番目のＸａａ（Ｘ８）はＡｌａ又はＶａｌ、９番目のＸａａ（Ｘ９）はＧｌｎ、１０番目のＸａａ（Ｘ１０）はＬｙｓ又はＡｒｇ、１１番目のＸａａ（Ｘ１１）はＩｌｅ、Ｌｅｕ又はＴｈｒ、１２番目のＸａａ（Ｘ１２）はＰｈｅ又はＴｙｒ、並びに、Ｘ１３）はＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＧｌｎである、（６）乃至（８）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１０）
配列番号９乃至１２（図１５乃至１８）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、（６）乃至（９）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１１）
配列番号２３（図２９）で示されるアミノ酸配列を含み、且つ、ＫＬＫ４の有するプロテアーゼ活性及びＫＬＫ８の有するプロテアーゼ活性を特異的に阻害するＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド、
（１２）
１乃至１３番目のＸａａ（Ｘ１乃至Ｘ１３）がＣｙｓ及びＰｒｏ以外のアミノ酸である、（１１）記載のペプチド、
（１３）
１番目のＸａａ（Ｘ１）がＡｓｐ又はＧｌｙである、（１１）又（１２）記載のペプチド、
（１４）
２番目のＸａａ（Ｘ２）はＧｌｙ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ、３番目のＸａａ（Ｘ３）はＬｙｓ又はＡｒｇ、４番目のＸａａ（Ｘ４）はＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ又はＴｙｒ、５番目のＸａａ（Ｘ５）はＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ又はＴｙｒ、６番目のＸａａ（Ｘ６）はＩｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ又はＴｒｐ、７番目のＸａａ（Ｘ７）はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｖａｌ又はＴｒｐ、８番目のＸａａ（Ｘ８）はＧｌｙ又はＴｒｐ、９番目のＸａａ（Ｘ９）はＡｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ、１０番目のＸａａ（Ｘ１０）はＬｙｓ又はＡｒｇ、１１番目のＸａａ（Ｘ１１）はＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ又はＶａｌ、１２番目のＸａａ（Ｘ１２）はＰｈｅ、Ｌｅｕ又はＴｙｒ、並びに、１３番目のＸａａ（Ｘ１３）はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＡｓｎである、（１１）乃至（１３）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１５）
配列番号１３乃至２２（図１９乃至２８）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１６）
配列番号２３（図２９）で示されるアミノ酸配列のアミノ末端側に、１乃至３個のアミノ酸残基が付加してなるアミノ酸配列、又は、配列番号２６（図３２）で示されるアミノ酸配列が付加してなるアミノ酸配列を含む、（１）乃至（１５）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１７）
配列番号２３（図２９）で示されるアミノ酸配列のカルボキシル末端側に、１乃至６個のアミノ酸からなるアミノ酸配列が付加してなるアミノ酸配列を含む、（１）乃至（１６）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１８）
３つのジスルフィド結合を有し、ループ構造、αへリックス及びβシートを含むことで特徴付けられる立体構造を有する、（１）乃至（１７）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１９）
（１）乃至（１８）のいずれか一つに記載のペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（２０）
（１９）記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
（２１）
（１９）記載のポリヌクレオチド若しくは（２０）記載のベクターを含むか又は（１）乃至（１８）のいずれか一つに記載のペプチドを産生する細胞、
（２２）
下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの製造方法：
（ｉ）（２１）記載の細胞を培養する工程；
（ｉｉ）該培養物からＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドを回収する工程、
（２３）
（１）乃至（１８）のいずれか一つに記載のペプチドを化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該ペプチドの製造方法、
（２４）
（２２）又は（２３）記載の方法により得られるＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド、
（２５）
（１）乃至（１８）及び（２４）のいずれか一つに記載のペプチドに他の部分が結合してなるコンジュゲート、
（２６）
ペプチドである、（２５）記載のコンジュゲート、
（２７）
免疫グロブリンのＦｃ領域又はその機能断片を含む、（２５）又は（２６）記載のコンジュゲート、
（２８）
下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、（２５）乃至（２７）のいずれか一つに記載のＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲートの製造方法：
（ｉ）該コンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドが挿入されたベクターを含む細胞を培養する工程：
（ｉｉ）該培養物からＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を回収する工程、
（２９）
（２５）乃至（２７）のいずれか一つに記載のＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲ
ート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該コンジュゲートの製造方法、
（３０）
（２８）又は（２９）記載の方法により得られるＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲート、
（３１）
（１）乃至（１８）及び（２４）のいずれか一つに記載のペプチドに結合する抗体又はその結合断片、
（３２）
（１）乃至（１８）及び（２４）のいずれか一つに記載のペプチド、（１９）記載のポリヌクレオチド、（２０）記載のベクター、（２１）記載の細胞、（２５）乃至（２７）及び（３０）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、及び／又は、（３１）記載の抗体もしくはその結合断片を含む組成物、
（３３）
（１）乃至（１８）及び（２４）のいずれか一つに記載のペプチド、（１９）記載のポリヌクレオチド、（２０）記載のベクター、（２１）記載の細胞、及び／又は、（２５）乃至（２７）及び（３０）のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む医薬組成物、
（３４）
ＫＬＫ１関連疾患、ＫＬＫ４関連疾患及び／又はＫＬＫ８関連疾患の治療用又は予防用である、（３３）記載の医薬組成物、
（３５）
（１）乃至（１８）及び（２４）のいずれか一つに記載のペプチド、（１９）記載のポリヌクレオチド、（２０）記載のベクター、（２１）記載の細胞、（２５）乃至（２７）及び（３０）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、及び／又は、（３１）記載の抗体もしくはその結合断片を含む、検査用又は診断用組成物、及び、
（３６）
（３１）記載の抗体又はその結合断片を用いたアフィニティー精製工程を含む、（２２）、（２３）、（２８）又は（２９）に記載の製造方法、
等に関する。
（１）
配列番号２３（図２９）で示されるアミノ酸配列を含み、且つ、ＫＬＫ１の有するプロテアーゼ活性を特異的に阻害するＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド、
（２）
１乃至１３番目のＸａａ（Ｘ１乃至Ｘ１３）がＣｙｓ及びＰｒｏ以外のアミノ酸である、（１）記載のペプチド、
（３）
１番目のＸａａ（Ｘ１）がＡｓｐ又はＧｌｙである、（１）又は（２）記載のペプチド、
（４）
２番目のＸａａ（Ｘ２）はＡｌａ、Ａｓｐ又はＳｅｒ、３番目のＸａａ（Ｘ３）はＩｌｅ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＶａｌ、４番目のＸａａ（Ｘ４）はＡｌａ、Ａｓｎ又はＴｙｒ、５番目のＸａａ（Ｘ５）はＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ又はＧｌｎ、６番目のＸａａ（Ｘ６）はＩｌｅ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ又はＶａｌ、７番目のＸａａ（Ｘ７）はＡｓｐ、Ａｒｇ又はＶａｌ、８番目のＸａａ（Ｘ８）はＡｓｐ、Ｉｌｅ又はＡｒｇ、９番目のＸａａ（Ｘ９）は
Ｐｈｅ、Ｈｉｓ又はＴｒｐ、１０番目のＸａａ（Ｘ１０）はＴｙｒ又はＴｒｐ、１１番目のＸａａ（Ｘ１１）はＡｌａ、Ｔｈｒ又はＴｙｒ、１２番目のＸａａ（Ｘ１２）はＳｅｒ又はＴｙｒ、並びに、１３番目のＸａａ（Ｘ１３）はＧｌｕ、Ｌｙｓ又はＧｌｎである、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載のペプチド、
（５）
配列番号５乃至８（図１１乃至１４）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、（１）乃至（４）のいずれか一つに記載のペプチド、
（６）
配列番号２３（図２９）で示されるアミノ酸配列を含み、且つ、ＫＬＫ４の有するプロテアーゼ活性を特異的に阻害するＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド、
（７）
１乃至１３番目のＸａａ（Ｘ１乃至Ｘ１３）がＣｙｓ及びＰｒｏ以外のアミノ酸である、（６）記載のペプチド、
（８）
１番目のＸａａ（Ｘ１）がＡｓｐ又はＧｌｙである、（６）又（７）記載のペプチド、（９）
２番目のＸａａ（Ｘ２）はＧｌｕ、Ａｒｇ又はＳｅｒ、３番目のＸａａ（Ｘ３）はＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ又はＧｌｎ、４番目のＸａａ（Ｘ４）はＡｌａ、Ｇｌｎ又はＴｙｒ、５番目のＸａａ（Ｘ５）はＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ又はＶａｌ、６番目のＸａａ（Ｘ６）はＧｌｕ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ又はＴｙｒ、７番目のＸａａ（Ｘ７）はＡｓｐ又はＧｌｙ、８番目のＸａａ（Ｘ８）はＡｌａ又はＶａｌ、９番目のＸａａ（Ｘ９）はＧｌｎ、１０番目のＸａａ（Ｘ１０）はＬｙｓ又はＡｒｇ、１１番目のＸａａ（Ｘ１１）はＩｌｅ、Ｌｅｕ又はＴｈｒ、１２番目のＸａａ（Ｘ１２）はＰｈｅ又はＴｙｒ、並びに、Ｘ１３）はＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＧｌｎである、（６）乃至（８）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１０）
配列番号９乃至１２（図１５乃至１８）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、（６）乃至（９）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１１）
配列番号２３（図２９）で示されるアミノ酸配列を含み、且つ、ＫＬＫ４の有するプロテアーゼ活性及びＫＬＫ８の有するプロテアーゼ活性を特異的に阻害するＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド、
（１２）
１乃至１３番目のＸａａ（Ｘ１乃至Ｘ１３）がＣｙｓ及びＰｒｏ以外のアミノ酸である、（１１）記載のペプチド、
（１３）
１番目のＸａａ（Ｘ１）がＡｓｐ又はＧｌｙである、（１１）又（１２）記載のペプチド、
（１４）
２番目のＸａａ（Ｘ２）はＧｌｙ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ、３番目のＸａａ（Ｘ３）はＬｙｓ又はＡｒｇ、４番目のＸａａ（Ｘ４）はＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ又はＴｙｒ、５番目のＸａａ（Ｘ５）はＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ又はＴｙｒ、６番目のＸａａ（Ｘ６）はＩｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ又はＴｒｐ、７番目のＸａａ（Ｘ７）はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｖａｌ又はＴｒｐ、８番目のＸａａ（Ｘ８）はＧｌｙ又はＴｒｐ、９番目のＸａａ（Ｘ９）はＡｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ、１０番目のＸａａ（Ｘ１０）はＬｙｓ又はＡｒｇ、１１番目のＸａａ（Ｘ１１）はＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ又はＶａｌ、１２番目のＸａａ（Ｘ１２）はＰｈｅ、Ｌｅｕ又はＴｙｒ、並びに、１３番目のＸａａ（Ｘ１３）はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＡｓｎである、（１１）乃至（１３）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１５）
配列番号１３乃至２２（図１９乃至２８）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、（１１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１６）
配列番号２３（図２９）で示されるアミノ酸配列のアミノ末端側に、１乃至３個のアミノ酸残基が付加してなるアミノ酸配列、又は、配列番号２６（図３２）で示されるアミノ酸配列が付加してなるアミノ酸配列を含む、（１）乃至（１５）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１７）
配列番号２３（図２９）で示されるアミノ酸配列のカルボキシル末端側に、１乃至６個のアミノ酸からなるアミノ酸配列が付加してなるアミノ酸配列を含む、（１）乃至（１６）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１８）
３つのジスルフィド結合を有し、ループ構造、αへリックス及びβシートを含むことで特徴付けられる立体構造を有する、（１）乃至（１７）のいずれか一つに記載のペプチド、
（１９）
（１）乃至（１８）のいずれか一つに記載のペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
（２０）
（１９）記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
（２１）
（１９）記載のポリヌクレオチド若しくは（２０）記載のベクターを含むか又は（１）乃至（１８）のいずれか一つに記載のペプチドを産生する細胞、
（２２）
下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの製造方法：
（ｉ）（２１）記載の細胞を培養する工程；
（ｉｉ）該培養物からＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドを回収する工程、
（２３）
（１）乃至（１８）のいずれか一つに記載のペプチドを化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該ペプチドの製造方法、
（２４）
（２２）又は（２３）記載の方法により得られるＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド、
（２５）
（１）乃至（１８）及び（２４）のいずれか一つに記載のペプチドに他の部分が結合してなるコンジュゲート、
（２６）
ペプチドである、（２５）記載のコンジュゲート、
（２７）
免疫グロブリンのＦｃ領域又はその機能断片を含む、（２５）又は（２６）記載のコンジュゲート、
（２８）
下記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、（２５）乃至（２７）のいずれか一つに記載のＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲートの製造方法：
（ｉ）該コンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドが挿入されたベクターを含む細胞を培養する工程：
（ｉｉ）該培養物からＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を回収する工程、
（２９）
（２５）乃至（２７）のいずれか一つに記載のＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲ
ート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該コンジュゲートの製造方法、
（３０）
（２８）又は（２９）記載の方法により得られるＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドコンジュゲート、
（３１）
（１）乃至（１８）及び（２４）のいずれか一つに記載のペプチドに結合する抗体又はその結合断片、
（３２）
（１）乃至（１８）及び（２４）のいずれか一つに記載のペプチド、（１９）記載のポリヌクレオチド、（２０）記載のベクター、（２１）記載の細胞、（２５）乃至（２７）及び（３０）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、及び／又は、（３１）記載の抗体もしくはその結合断片を含む組成物、
（３３）
（１）乃至（１８）及び（２４）のいずれか一つに記載のペプチド、（１９）記載のポリヌクレオチド、（２０）記載のベクター、（２１）記載の細胞、及び／又は、（２５）乃至（２７）及び（３０）のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む医薬組成物、
（３４）
ＫＬＫ１関連疾患、ＫＬＫ４関連疾患及び／又はＫＬＫ８関連疾患の治療用又は予防用である、（３３）記載の医薬組成物、
（３５）
（１）乃至（１８）及び（２４）のいずれか一つに記載のペプチド、（１９）記載のポリヌクレオチド、（２０）記載のベクター、（２１）記載の細胞、（２５）乃至（２７）及び（３０）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、及び／又は、（３１）記載の抗体もしくはその結合断片を含む、検査用又は診断用組成物、及び、
（３６）
（３１）記載の抗体又はその結合断片を用いたアフィニティー精製工程を含む、（２２）、（２３）、（２８）又は（２９）に記載の製造方法、
等に関する。
【発明の効果】
【0011】
本発明の提供するペプチド又はそれを含む医薬組成物は、ＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有し、ＫＬＫ１関連疾患、ＫＬＫ４関連疾患、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８関連疾患（いずれも後述）の治療又は予防等にそれぞれ有用である。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】ヒトＫＬＫ１、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８のアミノ酸配列類似性を比較した図。
【図2】ペプチド基質の分解速度を指標として、各阻害ペプチドのＫＬＫ１、ＫＬＫ４、ＫＬＫ８阻害活性を評価した図。ＫＬＫ１阻害活性は終濃度１ｎＭのＫＬＫ１および終濃度１００μＭのＰＦＲ－ＡＭＣ（ＢＡＣＨＥＭ）、ＫＬＫ４阻害活性評価は終濃度１０ｎＭのＫＬＫ４および終濃度１００μＭのＢｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＫＬＫ８阻害活性評価は終濃度２０ｎＭのＫＬＫ８および終濃度１００μＭのＢｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣを用いて実施した。
【図3】ペプチド基質の分解速度を指標として、ＫＬＫ４阻害ペプチドのＫＬＫ４阻害活性（Ｋｉ）を示した図。ＫＬＫ４阻害活性評価には終濃度１０ｎＭのＫＬＫ４および終濃度１００μＭのＢｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
【図4(1)】ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドの交差性を評価した図。α－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ阻害活性には、終濃度１０ｎＭ ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＬＳ００１４３４）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＳｕｃ－ＬＬＶＴ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１２０－ｖ）を用いた。Ｈｕｍａｎ ｔｒｙｐｔａｓｅ阻害活性には、終濃度１ｎＭ ｔｒｙｐｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ７０６３）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１０７－ｖ）を用いた。Ｈｕｍａｎ ｃｈｙｍａｓｅ阻害活性には、終濃度１００ｎＭ ｃｈｙｍａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃ８１１８）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＳｕｃ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１２０－ｖ）を用いた。
【図4(2)】ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドの交差性を評価した図。Ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍｉｎ阻害活性には、終濃度５０ｎＭ Ｐｌａｓｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｐ１８６７）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１０４－ｖ）を用いた。Ｈｕｍａｎ ｔｈｒｏｍｂｉｎ阻害活性には、終濃度１ｎＭ ｔｈｒｏｍｂｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ６８８４）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣ Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）を用いた。Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ阻害活性には、終濃度０．０２Ｕ／μＬ Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＳｕｃ（ＯＭｅ）－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１５３－ｖ）を用いた。
【図4(3)】ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドの交差性を評価した図。Ｈｕｍａｎ ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ阻害活性には、終濃度１ｎＭ ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｅ３９４６－ＳＥ）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－ＱＡＲ－ＡＭＣ Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＥＳ０１４）を用いた。Ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ阻害活性には、終濃度１００ｎＭ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｐ２２００）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１１２－ｖ）を用いた。Ｈｕｍａｎ ｔＰＡ阻害活性には、終濃度１０ｎＭ ｔＰＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ０８３１）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＰｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１４５－ｖ）を用いた。
【図4(4)】ペプチド基質の分解を指標として、各プロテアーゼに対する各阻害ペプチドの交差性を評価した図。Ｈｕｍａｎ ｕＰＡ阻害活性には、終濃度１０ｎＭ ｕＰＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ０８３１）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＰｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１４５－ｖ）を用いた。Ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ阻害活性には、終濃度０．１２５μｇ／ｍｌ ｐｌａｓｍａ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ０８３１）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＺ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３０９５－ｖ）を用いた。
【図5】ビオチン化ＫＬＫ４を用いて、ＫＬＫ４阻害ペプチドの結合親和性をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で測定した図。
【図6】Ｘ線結晶構造解析により得られたＫＬＫ４／ＫＬＫ４阻害ペプチド複合体を示した図。該阻害ペプチドはＫＬＫ４活性中心を含む領域に結合していた。
【図7】ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列（配列番号１）
【図8】ヒトＫＬＫ１のアミノ酸配列（配列番号２）
【図9】ヒトＫＬＫ４のアミノ酸配列（配列番号３）
【図10】ヒトＫＬＫ８のアミノ酸配列（配列番号４）
【図11】ＫＬＫ１阻害ペプチドＫ１００６１のアミノ酸配列（配列番号５）
【図12】ＫＬＫ１阻害ペプチドＫ１００６２のアミノ酸配列（配列番号６）
【図13】ＫＬＫ１阻害ペプチドＫ１００６６のアミノ酸配列（配列番号７）
【図14】ＫＬＫ１阻害ペプチドＫ１００７１のアミノ酸配列（配列番号８）
【図15】ＫＬＫ４阻害ペプチドＫ４０００１のアミノ酸配列（配列番号９）
【図16】ＫＬＫ４阻害ペプチドＫ４０００３のアミノ酸配列（配列番号１０）
【図17】ＫＬＫ４阻害ペプチドＫ４０００４のアミノ酸配列（配列番号１１）
【図18】ＫＬＫ４阻害ペプチドＫ４０００５のアミノ酸配列（配列番号１２）
【図19】ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０２１のアミノ酸配列（配列番号１３）
【図20】ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０２４のアミノ酸配列（配列番号１４）
【図21】ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０２５のアミノ酸配列（配列番号１５）
【図22】ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０２６のアミノ酸配列（配列番号１６）
【図23】ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０４１のアミノ酸配列（配列番号１７）
【図24】ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０４２のアミノ酸配列（配列番号１８）
【図25】ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０４３のアミノ酸配列（配列番号１９）
【図26】ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０４５のアミノ酸配列（配列番号２０）
【図27】ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０４６のアミノ酸配列（配列番号２１）
【図28】ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０４７のアミノ酸配列（配列番号２２）
【図29】ＫＬＫ１阻害結合ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド又はＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの一般式（配列番号２３）
【図30】プライマー１のヌクレオチド配列（配列番号２４）
【図31】プライマー２のヌクレオチド配列（配列番号２５）
【図32】Ｓｔａｇ＋リンカー１のアミノ酸配列（配列番号２６）
【図33】Ｃ末６マーのアミノ酸配列（配列番号２７）
【図34】ヒトＩｇＧ１ Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号２８）
【発明を実施するための形態】
【0013】
１．定義
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子又はその相補鎖を意味し、一本鎖、二本鎖又は三本鎖以上からなり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本の鎖上にリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドが混在するもの及びそのよう鎖を含む二本鎖又は三本鎖以上の核酸分子も「遺伝子」の意味に含まれる。
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子又はその相補鎖を意味し、一本鎖、二本鎖又は三本鎖以上からなり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本の鎖上にリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドが混在するもの及びそのよう鎖を含む二本鎖又は三本鎖以上の核酸分子も「遺伝子」の意味に含まれる。
【0014】
本発明において、「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」は同義であり、それらの構成単位であるリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド等の個数によっては何ら限定されず、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、プライマー等もその範囲に含まれる。「核酸分子」は略して「核酸」と呼ばれる場合がある。
【0015】
本発明において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「蛋白質」は同義である。
【0016】
本発明において、標的分子Ｘを認識する、又は標的分子Ｘに結合する（以下、その認識
又は結合作用をまとめて「Ｘ結合活性」という。）ペプチドを、「Ｘ結合ペプチド」と呼ぶことができる。さらに、標的分子Ｘを認識し、又は標的分子Ｘに結合し、かつ標的分子Ｘの有する１つ又は２つ以上の活性又は機能を阻害又は抑制する（以下、それらの阻害又は抑制作用をまとめて「Ｘ阻害活性」という。）ペプチドを、「Ｘ阻害ペプチド」と呼ぶことができる。
又は結合作用をまとめて「Ｘ結合活性」という。）ペプチドを、「Ｘ結合ペプチド」と呼ぶことができる。さらに、標的分子Ｘを認識し、又は標的分子Ｘに結合し、かつ標的分子Ｘの有する１つ又は２つ以上の活性又は機能を阻害又は抑制する（以下、それらの阻害又は抑制作用をまとめて「Ｘ阻害活性」という。）ペプチドを、「Ｘ阻害ペプチド」と呼ぶことができる。
【0017】
本発明において、「ＳＰＩＮＫ２」は、Ｓｅｒｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｋａｚａｌ－ｔｙｐｅ ２を意味し、３つのジスルフィド結合を有するＫａｚａｌ様ドメインから成る７ｋＤａの蛋白質である。好適なＳＰＩＮＫ２はヒト由来である。本発明においては、別段記載された場合を除き、ヒトＳＰＩＮＫ２を単に「ＳＰＩＮＫ２」という。
【0018】
本発明において、「ＫＬＫ１」はＮ末プロペプチドとプロテアーゼ活性ドメインからなり、３箇所のＮ型糖鎖が付加したトリプシン様およびキモトリプシン様のプロテアーゼ活性を示す蛋白質である。好適なＫＬＫ１はヒト由来である。本発明においては、別段記載された場合を除き、ヒトＫＬＫ１を単に「ＫＬＫ１」ということがある。
【0019】
本発明において、「ＫＬＫ４」はＮ末プロペプチドとプロテアーゼ活性を有するトリプシン様ドメインからなり、Ｎ型糖鎖が付加した蛋白質である。好適なＫＬＫ４はヒト由来である。本発明においては、別段記載された場合を除き、ヒトＫＬＫ４を単に「ＫＬＫ４」ということがある。
【0020】
本発明において、「ＫＬＫ８」はニューロプシンともよばれ、Ｎ末プロペプチドとプロテアーゼ活性を有するトリプシン様ドメインからなり、Ｎ型糖鎖が付加した蛋白質である。好適なＫＬＫ８はヒト由来である。本発明においては、別段記載された場合を除き、ヒトＫＬＫ８を単に「ＫＬＫ８」ということがある。
【0021】
本発明において、「前駆型ＫＬＫ１」はｐｒｏ－ＫＬＫ１を意味し、プロペプチドおよびプロテアーゼ活性を有するドメインから構成される。「活性型ＫＬＫ１」はａｃｔｉｖｅ ＫＬＫ１を意味し、プロテアーゼ活性を有するドメインで構成される。好適な活性型ＫＬＫ１はヒト由来である。
【0022】
本発明において、「前駆型ＫＬＫ４」はｐｒｏ－ＫＬＫ４を意味し、プロペプチドおよびプロテアーゼ活性を有するドメインから構成される。「活性型ＫＬＫ４」はａｃｔｉｖｅ ＫＬＫ４を意味し、プロテアーゼ活性を有するドメインで構成される。好適な活性型ＫＬＫ４はヒト由来である。
【0023】
本発明において、「前駆型ＫＬＫ８」はｐｒｏ－ＫＬＫ８を意味し、プロペプチドおよびプロテアーゼ活性を有するドメインから構成される。「活性型ＫＬＫ８」はａｃｔｉｖｅ ＫＬＫ８を意味し、プロテアーゼ活性を有するドメインで構成される。好適な活性型ＫＬＫ８はヒト由来である。
【0024】
本発明において、「ＫＬＫ１阻害ペプチド」、「ＫＬＫ４阻害ペプチド」又は「ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド」は、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８の有する１つ又は２つ以上の活性又は機能を阻害又は抑制するペプチドをそれぞれ意味する。
「ＫＬＫ１阻害ペプチド」、「ＫＬＫ４阻害ペプチド」及び「ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド」の範囲には、当該ペプチドの断片、他の部分（ｍｏｉｅｔｙ）が当該ペプチド又はその断片に付加又は結合してなるコンジュゲートのうち、ＫＬＫ１阻害（結合）活性、ＫＬＫ４阻害（結合）活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害（結合）活性を維持しているものがそれぞれ含まれる。すなわち、ＫＬＫ１阻害（結合）活性、ＫＬＫ４阻害（結合）活性、又は、ＫＬＫ４阻害（結合）活性及びＫＬＫ８阻害（結合）活性を維持する当該ペプチドの断片、付加体及び修飾体（コンジュゲート）も「ＫＬＫ１阻害ペプチド」、「ＫＬＫ４阻害ペプチド」又は「ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド」にそれぞれ含まれる。
「ＫＬＫ１阻害ペプチド」、「ＫＬＫ４阻害ペプチド」及び「ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド」の範囲には、当該ペプチドの断片、他の部分（ｍｏｉｅｔｙ）が当該ペプチド又はその断片に付加又は結合してなるコンジュゲートのうち、ＫＬＫ１阻害（結合）活性、ＫＬＫ４阻害（結合）活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害（結合）活性を維持しているものがそれぞれ含まれる。すなわち、ＫＬＫ１阻害（結合）活性、ＫＬＫ４阻害（結合）活性、又は、ＫＬＫ４阻害（結合）活性及びＫＬＫ８阻害（結合）活性を維持する当該ペプチドの断片、付加体及び修飾体（コンジュゲート）も「ＫＬＫ１阻害ペプチド」、「ＫＬＫ４阻害ペプチド」又は「ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド」にそれぞれ含まれる。
【0025】
本発明において、ペプチドが結合する「部位」、すなわちペプチドが認識する「部位」とは、ペプチドが結合又は認識する標的分子上の連続的もしくは断続的な部分アミノ酸配列又は部分高次構造を意味する。本発明においては、かかる部位のことを標的分子上のエピトープ又は結合部位と呼ぶことができる。
【0026】
本発明において、「細胞」には、動物個体に由来する各種細胞、継代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、組換え細胞、酵母、微生物等も含まれる。
【0027】
本発明において、「ＳＰＩＮＫ２変異体」とは、野生型ＳＰＩＮＫ２の有するアミノ酸配列において、１個又は２個以上のアミノ酸が野生型とは異なるアミノ酸で置換され、１個又は２個以上の野生型のアミノ酸が欠失し、１個又は２個以上の野生型には無いアミノ酸が挿入され、及び／又は、野生型には無いアミノ酸が野生型のアミノ末端（Ｎ末）及び／又はカルボキシル末端（Ｃ末）に付加されて（以下、「変異」と総称する）なるアミノ酸配列を含むペプチドを意味する。「ＳＰＩＮＫ２変異体」のうち、ＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、又は、ＫＬＫ４阻害活性及びＫＬＫ８阻害活性（ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性）を有するものは、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドに包含される。なお、本発明においては「挿入」も「付加」の範囲に含まれ得る。
【0028】
本発明において、「１乃至数個」における「数個」とは、３乃至１０個を指す。
【0029】
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、５×ＳＳＣを含む溶液中で６５℃にてハイブリダイゼーションを行い、ついで２×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、０．５×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、並びに、０．２×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、それぞれ洗浄する条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることを意味する。ＳＳＣとは１５０ｍＭ ＮａＣｌ－１５ｍＭクエン酸ナトリウムの水溶液であり、ｎ×ＳＳＣはｎ倍濃度のＳＳＣを意味する。
【0030】
本発明において「特異的」及び「特異性」なる語は「選択的」及び「選択性」とそれぞれ同義であり、互換性がある。例えば、ＫＬＫ１特異的な阻害ペプチドは、ＫＬＫ１選択的な阻害ペプチドと同義である。
【0031】
２．ペプチド
２－１．アミノ酸
「アミノ酸」は、アミノ基及びカルボキシル基を含む有機化合物であり、好適には蛋白質に、より好適には天然の蛋白質に、構成単位として含まれるα－アミノ酸を意味する。本発明において、より好適なアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌであり、特に明記しない限り「アミノ酸」はこれらの計２０アミノ酸を意味する。それらの計２０アミノ酸を「天然アミノ酸」と呼ぶことができる。本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、好適には天然アミノ酸を含有する。
２－１．アミノ酸
「アミノ酸」は、アミノ基及びカルボキシル基を含む有機化合物であり、好適には蛋白質に、より好適には天然の蛋白質に、構成単位として含まれるα－アミノ酸を意味する。本発明において、より好適なアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌであり、特に明記しない限り「アミノ酸」はこれらの計２０アミノ酸を意味する。それらの計２０アミノ酸を「天然アミノ酸」と呼ぶことができる。本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、好適には天然アミノ酸を含有する。
【0032】
本発明においては「アミノ酸残基」は「アミノ酸」と略記される場合がある。
【0033】
また、本発明において、アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、又はその混合物（ＤＬ－アミノ酸）であるが、特に明記しない限りＬ－アミノ酸を意味する。
【0034】
天然アミノ酸は、その共通する側鎖の性質に基づいて、例えば、次のグループに分けることができる。
（１）疎水性アミノ酸グループ：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性アミノ酸グループ：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性アミノ酸グループ：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性アミノ酸グループ：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグループ：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族アミノ酸グループ：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
ただし、天然アミノ酸の分類はこれらに限定されるものではない。
（１）疎水性アミノ酸グループ：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性アミノ酸グループ：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性アミノ酸グループ：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性アミノ酸グループ：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグループ：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族アミノ酸グループ：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
ただし、天然アミノ酸の分類はこれらに限定されるものではない。
【0035】
本発明においては、天然アミノ酸は保存的アミノ酸置換を受け得る。
【0036】
「保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、機能的に等価又は類似のアミノ酸との置換を意味する。ペプチドにおける保存的アミノ酸置換は、該ペプチドのアミノ酸配列に静的変化をもたらす。例えば、同様の極性を有する一つ又は二つ以上のアミノ酸は機能的に等価に作用し、かかるペプチドのアミノ酸配列に静的変化をもたらす。一般に、あるグループ内の置換は構造及び機能について保存的であると考えることができる。しかしながら、当業者には自明であるように、特定のアミノ酸残基が果たす役割は当該アミノ酸を含む分子の三次元構造における意味合いにおいて決定され得る。例えば、システイン残基は、還元型の（チオール）フォームと比較してより極性の低い、酸化型の（ジスルフィド）フォームをとることができる。アルギニン側鎖の長い脂肪族の部分は構造的及び機能的に重要な特徴を構成し得る。また、芳香環を含む側鎖（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン）はイオン－芳香族相互作用又は陽イオン－パイ相互作用に寄与し得る。かかる場合において、これらの側鎖を有するアミノ酸を、酸性又は非極性グループに属するアミノ酸と置換しても、構造的及び機能的には保存的であり得る。プロリン、グリシン、システイン（ジスルフィド・フォーム）等の残基は主鎖の立体構造に直接的な効果を与える可能性があり、しばしば構造的ゆがみなしに置換することはできない。
【0037】
保存的アミノ酸置換は、以下に示すとおり、側鎖の類似性に基づく特異的置換（レーニンジャ、生化学、改訂第２版、１９７５年刊行、７３乃至７５頁：Ｌ． Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐｐ７３－７５， Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７５））及び典型的置換を含む。
（１）非極性アミノ酸グループ：アラニン（以下、「Ａｌａ」又は単に「Ａ」と記す）、バリン（以下、「Ｖａｌ」又は単に「Ｖ」と記す）、ロイシン（以下、「Ｌｅｕ」又は単に「Ｌ」と記す）、イソロイシン（以下、「Ｉｌｅ」又は単に「Ｉ」と記す）、プロリン（以下、「Ｐｒｏ」又は単に「Ｐ」と記す）、フェニルアラニン（「Ｐｈｅ」又は単に「Ｆ」と記す）、トリプトファン（以下、「Ｔｒｐ」又は単に「Ｗ」と記す）、メチオニン（以下、「Ｍｅｔ」又は単に「Ｍ」と記す）
（２）非荷電極性アミノ酸グループ：グリシン（以下、「Ｇｌｙ」又は単に「Ｇ」と記す）、セリン（以下、「Ｓｅｒ」又は単に「Ｓ」と記す）、スレオニン（以下、「Ｔｈｒ」又は単に「Ｔ」と記す）、システイン（以下、「Ｃｙｓ」又は単に「Ｃ」と記す）、チロシン（以下、「Ｔｙｒ」又は単に「Ｙ」と記す）、アスパラギン（以下、「Ａｓｎ」又は単に「Ｎ」と記す）、グルタミン（以下、「Ｇｌｎ」又は単に「Ｑ」と記す）
（３）酸性アミノ酸グループ：アスパラギン酸（以下、「Ａｓｐ」又は単に「Ｄ」と記す）、グルタミン酸（以下、「Ｇｌｕ」又は単に「Ｅ」と記す）
（４）塩基性アミノ酸グループ：リジン（以下、「Ｌｙｓ」又は単に「Ｋ」と記す）、アルギニン（以下、「Ａｒｇ」又は単に「Ｒ」と記す）、ヒスチジン（以下、「Ｈｉｓ」又は単に「Ｈ」と記す）
本発明において、アミノ酸は、天然アミノ酸以外のアミノ酸であってもよい。例えば、天然のペプチドや蛋白質において見出されるセレノシステイン、Ｎ－ホルミルメチオニン、ピロリジン、ピログルタミン酸、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、チロキシン、Ｏ－ホスホセリン、デスモシン、β－アラニン、サルコシン、オルニチン、クレアチン、γアミノ酪酸、オパイン、テアニン、トリコロミン酸、カイニン酸、ドウモイ酸、アクロメリン酸等をあげることができ、ノルロイシン、Ａｃ－アミノ酸、Ｂｏｃ－アミノ酸、Ｆｍｏｃ－アミノ酸、Ｔｒｔ－アミノ酸、Ｚ－アミノ酸等のＮ末端保護アミノ酸、アミノ酸ｔ－ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、フルオレニルエステル等のＣ末端保護アミノ酸、ジアミン、ωアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸、アミノ酸のＴｉｃ誘導体、アミノフォスフォン酸を含むその他の天然界には見出されないアミノ酸等をあげることができるが、それらに限らず上記２０の「天然アミノ酸」以外のアミノ酸を、本発明では便宜的に「非天然アミノ酸」と総称する。
（１）非極性アミノ酸グループ：アラニン（以下、「Ａｌａ」又は単に「Ａ」と記す）、バリン（以下、「Ｖａｌ」又は単に「Ｖ」と記す）、ロイシン（以下、「Ｌｅｕ」又は単に「Ｌ」と記す）、イソロイシン（以下、「Ｉｌｅ」又は単に「Ｉ」と記す）、プロリン（以下、「Ｐｒｏ」又は単に「Ｐ」と記す）、フェニルアラニン（「Ｐｈｅ」又は単に「Ｆ」と記す）、トリプトファン（以下、「Ｔｒｐ」又は単に「Ｗ」と記す）、メチオニン（以下、「Ｍｅｔ」又は単に「Ｍ」と記す）
（２）非荷電極性アミノ酸グループ：グリシン（以下、「Ｇｌｙ」又は単に「Ｇ」と記す）、セリン（以下、「Ｓｅｒ」又は単に「Ｓ」と記す）、スレオニン（以下、「Ｔｈｒ」又は単に「Ｔ」と記す）、システイン（以下、「Ｃｙｓ」又は単に「Ｃ」と記す）、チロシン（以下、「Ｔｙｒ」又は単に「Ｙ」と記す）、アスパラギン（以下、「Ａｓｎ」又は単に「Ｎ」と記す）、グルタミン（以下、「Ｇｌｎ」又は単に「Ｑ」と記す）
（３）酸性アミノ酸グループ：アスパラギン酸（以下、「Ａｓｐ」又は単に「Ｄ」と記す）、グルタミン酸（以下、「Ｇｌｕ」又は単に「Ｅ」と記す）
（４）塩基性アミノ酸グループ：リジン（以下、「Ｌｙｓ」又は単に「Ｋ」と記す）、アルギニン（以下、「Ａｒｇ」又は単に「Ｒ」と記す）、ヒスチジン（以下、「Ｈｉｓ」又は単に「Ｈ」と記す）
本発明において、アミノ酸は、天然アミノ酸以外のアミノ酸であってもよい。例えば、天然のペプチドや蛋白質において見出されるセレノシステイン、Ｎ－ホルミルメチオニン、ピロリジン、ピログルタミン酸、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、チロキシン、Ｏ－ホスホセリン、デスモシン、β－アラニン、サルコシン、オルニチン、クレアチン、γアミノ酪酸、オパイン、テアニン、トリコロミン酸、カイニン酸、ドウモイ酸、アクロメリン酸等をあげることができ、ノルロイシン、Ａｃ－アミノ酸、Ｂｏｃ－アミノ酸、Ｆｍｏｃ－アミノ酸、Ｔｒｔ－アミノ酸、Ｚ－アミノ酸等のＮ末端保護アミノ酸、アミノ酸ｔ－ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、フルオレニルエステル等のＣ末端保護アミノ酸、ジアミン、ωアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸、アミノ酸のＴｉｃ誘導体、アミノフォスフォン酸を含むその他の天然界には見出されないアミノ酸等をあげることができるが、それらに限らず上記２０の「天然アミノ酸」以外のアミノ酸を、本発明では便宜的に「非天然アミノ酸」と総称する。
【0038】
２－２．ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、及び、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド
本発明のペプチドは、ＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有する。
本発明のペプチドは、ＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有する。
【0039】
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチドの標的であるＫＬＫ１、ＫＬＫ４阻害ペプチドの標的であるＫＬＫ４、並びに、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの標的であるＫＬＫ４及びＫＬＫ８は、好適には脊椎動物、より好適には哺乳類、より一層好適には霊長類、最適にはヒトに由来する。ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、及び、ＫＬＫ８は組織や細胞から精製するか、又は、遺伝子組換え、イン・ビトロ翻訳、ペプチド合成等の蛋白質の調製方法として当業者に公知の方法により、調製することができる。ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、及び、ＫＬＫ８には、シグナル配列、免疫グロブリンのＦｃ領域、タグ、標識等が連結されてもよい。 ＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、及び、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性は、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、並びに、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８の有するプロテアーゼ活性を指標として評価することができる。例えば、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４若しくはＫＬＫ４及びＫＬＫ８、又はそれらの機能断片、基質及び本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド若しくはＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド、又はその候補を共存させた場合に、対照の存在下又は該阻害剤又はその候補の非存在下と比較して、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８のプロテアーゼ活性が７０％以下、５０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下又は０％である場合、ＫＬＫ１阻害、ＫＬＫ４阻害又はＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害が生じており、その阻害活性はそれぞれ３０％以上、５０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上又は１００％である。ＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、及び、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性は、反応条件、基質の種類や濃度等により異なり得る。反応条件については、実施例に記載のものを例示することができるが、それに限定されない。一定濃度のＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８に基質ペプチド又は基質蛋白質を添加し、一定時間反応させた後、基質ペプチドの蛍光を検出する、又は基質蛋白質をＳＤＳ－ＰＡＧＥやＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法、液体クロマトグラフィー等により検出することで、酵素活性は評価できる。緩衝液としては、例えば、ホスフェート・バッファー・セイライン(ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓａｌｉｎｅ：以下「ＰＢＳ」という)、トリスバッファー（５０ｍＭ トリス，ｐＨ７乃至８．５、例えばｐＨ７．５）等を用いることができ、ＮａＣｌ（０乃至２００ｍＭ、例えば２００ｍＭ）、ＣａＣｌ２（０乃至１０ｍＭ、例えば２ｍＭ）、ＺｎＣｌ２、Ｂｒｉｊ－３５等の塩を添加することもできるが、それらに限定されない。
【0040】
ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８の有するプロテアーゼの基質は、内
在性の基質、外因性の基質、合成基質等、特に限定されるものではない。ＫＬＫ１のヒトの内在性の基質としては、低分子キニノーゲンやカリスタチン、コラーゲン等を例示することができる。ＫＬＫ４のヒトの内在性の基質としては、Ｐｒｏ－ＫＬＫ３やフィブロネクチン、コラーゲン等を例示することが出来る。ＫＬＫ８のヒトの内在性の基質としては、ｔＰＡやフィブロネクチン、コラーゲン等を例示することが出来る。コラーゲンを熱変性して得られるゼラチンも基質として用いることができる。合成基質としては、特に限定されないが、ＰＦＲ－ＡＭＣやＢｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣ等を例示することができる。本発明のＫＬＫ１阻害ペプチドのＫＬＫ１阻害活性（ＩＣ５０又はＫｉ）、ＫＬＫ４阻害ペプチドのＫＬＫ４阻害活性、及び、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性は、それぞれ１μＭ以下、好適には１００ｎＭ以下、より好適には１０ｎＭ以下、より一層好適には１ｎＭ以下である。また、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、ＫＬＫ４阻害活性とＫＬＫ８阻害活性（いずれもＩＣ５０又はＫｉ）の相対的な大小により分類することができ、好適には、（ｉ）ＫＬＫ４阻害活性がＫＬＫ８阻害活性の０．５倍未満、（ｉｉ）ＫＬＫ４阻害活性がＫＬＫ８阻害活性の差の０．５倍以上２倍未満、（ｉｉｉ）ＫＬＫ４阻害活性がＫＬＫ８阻害活性の２倍以上、の３群に分類され、治療等の用途に応じてそれらの群から所望のペプチドが選択され得る。例えば、ＫＬＫ４関連疾患治療効果に比して相対的に強いＫＬＫ８関連疾患治療効果が望まれる場合、上記（ｉ）に属するペプチドが治療のために好適に選択され得る。
在性の基質、外因性の基質、合成基質等、特に限定されるものではない。ＫＬＫ１のヒトの内在性の基質としては、低分子キニノーゲンやカリスタチン、コラーゲン等を例示することができる。ＫＬＫ４のヒトの内在性の基質としては、Ｐｒｏ－ＫＬＫ３やフィブロネクチン、コラーゲン等を例示することが出来る。ＫＬＫ８のヒトの内在性の基質としては、ｔＰＡやフィブロネクチン、コラーゲン等を例示することが出来る。コラーゲンを熱変性して得られるゼラチンも基質として用いることができる。合成基質としては、特に限定されないが、ＰＦＲ－ＡＭＣやＢｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣ等を例示することができる。本発明のＫＬＫ１阻害ペプチドのＫＬＫ１阻害活性（ＩＣ５０又はＫｉ）、ＫＬＫ４阻害ペプチドのＫＬＫ４阻害活性、及び、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性は、それぞれ１μＭ以下、好適には１００ｎＭ以下、より好適には１０ｎＭ以下、より一層好適には１ｎＭ以下である。また、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、ＫＬＫ４阻害活性とＫＬＫ８阻害活性（いずれもＩＣ５０又はＫｉ）の相対的な大小により分類することができ、好適には、（ｉ）ＫＬＫ４阻害活性がＫＬＫ８阻害活性の０．５倍未満、（ｉｉ）ＫＬＫ４阻害活性がＫＬＫ８阻害活性の差の０．５倍以上２倍未満、（ｉｉｉ）ＫＬＫ４阻害活性がＫＬＫ８阻害活性の２倍以上、の３群に分類され、治療等の用途に応じてそれらの群から所望のペプチドが選択され得る。例えば、ＫＬＫ４関連疾患治療効果に比して相対的に強いＫＬＫ８関連疾患治療効果が望まれる場合、上記（ｉ）に属するペプチドが治療のために好適に選択され得る。
【0041】
また、本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、それぞれＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８以外のプロテアーゼ活性を阻害若しくは抑制しないか、又はそれらに対する阻害若しくは抑制の程度が相対的に弱いことが好ましい。言い換えれば、本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドのプロテアーゼ阻害活性は、好適には、ＫＬＫ１特異性、ＫＬＫ４特異性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８特異性が高い。好適な本発明のペプチドは、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ９乃至ＫＬＫ１５、キモトリプシン、トリプターゼ、キマーゼ、プラスミン、トロンビン、エラスターゼ、マトリプターゼ、プロテインＣ、組織（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、血漿カリクレイ等のプロテアーゼ活性を阻害若しくは抑制しないか、又はそれらに対する阻害若しくは抑制の程度が相対的に弱い。そのような本発明の好適なペプチドは、他のプロテアーゼ活性を阻害若しくは抑制することに起因する副作用を示さず、ＫＬＫ１に関わる疾患、ＫＬＫ４に関わる疾患、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８に関わる疾患（いずれも後述）の治療薬又は予防薬として好適に使用され得る。さらに、本発明のＫＬＫ１阻害ペプチドは、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８のプロテアーゼ活性を阻害若しくは抑制しないか、又はそれらに対する阻害若しくは抑制の程度が相対的に弱い；本発明のＫＬＫ４阻害ぺプチドは、ＫＬＫ１及びＫＬＫ８のプロテアーゼ活性を阻害若しくは抑制しないか、又はそれらに対する阻害若しくは抑制の程度が相対的に弱い；本発明のＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、ＫＬＫ１のプロテアーゼ活性を阻害若しくは抑制しないか、又はそれに対する阻害若しくは抑制の程度が相対的に弱い。
【0042】
ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８に対する特異性が低く、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８に加えて、他のＫＬＫが有するプロテアーゼ活性も阻害するような阻害剤、すなわち非選択的阻害剤は、ヒトに投与した場合に副作用を生じ得る（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ，ＬＭ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９５巻（５５６４号）、２３８７－９２頁（２００２年）：Ｂｉｓｓｅｔｔ，Ｄ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２３巻（４号）、８４２－９頁（２００５年））。一方、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８に対する特異性が高い阻害剤、すなわちＫＬＫ１特異的阻害ペプチド、ＫＬＫ４特異的阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８特異的阻害ペプチドは、前述のような副作用を回避し得るため、ＫＬＫ１に関わる疾患、ＫＬＫ４に関わる疾患、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８に関わる疾患の治療又は予防のためにそれぞれ好適に使用することができ
る。
る。
【0043】
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及び／若しくはＫＬＫ８へのプロテアーゼ基質の結合において、競合的であってもよい。
【0044】
前述の通り、本発明のペプチドの標的であるＫＬＫ１、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８は、脊椎動物、好適には哺乳動物、より好適には霊長類、より一層好適にはヒトに由来するが、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス等のげっ歯類、カニクイザル、コモンマーモセット、アカゲザル等の霊長類に由来してもよい。非ヒト動物由来のＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８に対して阻害活性を有するペプチドは、かかる非ヒト動物におけるＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８に関わる疾患の診断、検査、治療又は予防等に使用することができる。また、そのようなペプチドが、ヒトＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８も阻害する場合、ヒトＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８に関わる疾患の治療薬又は予防薬としての該ペプチドの非臨床研究開発において、かかる非ヒト動物を動物病態モデルとして使用した薬効薬理試験や薬物動態試験、健常動物として使用した安全性試験や毒性試験等を行うことができる。
【0045】
また、本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、及びＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、医薬及び診断薬として当該分野で使用される抗体等の他の生体高分子と比較して分子量が小さく、その製造（後述）が比較的容易であり、保存安定性や熱安定性等の物性の面で優れており、医薬組成物（後述）として使用される場合の投与経路、投与方法、製剤等の選択の幅が広い等の長所を有する。また、生体高分子やポリマーの付加等、公知の方法を適用して本発明のペプチドの分子量を大きくすることにより、医薬組成物として使用された場合の血中半減期をより長く調節することもできる。そのような本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、及びＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの分子量は１０，０００未満、好適には８，０００未満、より好適には約７，０００～７，２００である。また、配列番号２３（図２９）の１５番Ｃｙｓ～３１番Ｃｙｓからなる可変ループ部分又は１５番Ｃｙｓ～６３番Ｃｙｓからなる部分（以下「６つのＣｙｓを含む部分」という）のうち、ＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有するものも、本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドにそれぞれ包含され、可変ループ部分の分子量は２，５００未満、好適には約１，８００～２，０００であり、６つのＣｙｓを含む部分の分子量は６，０００未満、好適には約５，３００～５，５００である。
【0046】
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、ＳＰＩＮＫ２の有する骨格が少なくとも部分的に維持されたＳＰＩＮＫ２変異体（以下、「ＳＰＩＮＫ２変異体」と略記する）であり、好適には、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８の部分ペプチド、部分高次構造等を認識する、又はそれらに結合する（以下、かかる認識又は結合作用をまとめて「標的結合活性」という）。
【0047】
本発明におけるＳＰＩＮＫ２変異体とＫＬＫ１、ＫＬＫ４又はＫＬＫ８の結合は、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：以下、「ＳＰＲ」という）解析法、バイオレイヤー干渉（ＢｉｏＬａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ:以下、「ＢＬＩ」という）法、等温滴定熱量測定（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ：以下、「ＩＴＣ」という）、フローサイトメトリー、免疫沈降法等により、当業者に公知の方法を用いて、測定又は判定することができる。
【0048】
ＥＬＩＳＡ法としては、プレート上に固相化されたＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ
４／ＫＬＫ８を認識して結合したＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドを検出する方法が挙げられる。ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８の固相化には、ビオチン－ストレプトアビジンの他、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、もしくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８、又は、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、もしくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８に融合したタグを認識する固相用抗体等を利用することができる。ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの検出には、標識されたストレプトアビジンの他、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、もしくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、もしくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドに融合したタグを認識する標識された検出用抗体等を利用することができる。標識には、ビオチンの他、ＨＲＰ、アルカリフォスファターゼ、ＦＩＴＣ等生化学的解析に実施可能な方法を利用することができる。酵素標識を利用した検出にはＴＭＢ（３，３'，５，５'－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＢＣＩＰ（５－ｂｒｏｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ－３－ｉｎｄｏｌｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｐ－ＮＰＰ（ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＯＰＤ（ｏ－Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（３－Ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等の発色基質やＱｕａｎｔａＢｌｕ（登録商標）Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等の蛍光基質、及び化学発光基質を用いることができる。検出シグナルの測定には、吸光プレートリーダー、蛍光プレートリーダー、発光プレートリーダー、ＲＩ液体シンチレーションカウンター等を利用することができる。
４／ＫＬＫ８を認識して結合したＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドを検出する方法が挙げられる。ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８の固相化には、ビオチン－ストレプトアビジンの他、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、もしくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８、又は、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、もしくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８に融合したタグを認識する固相用抗体等を利用することができる。ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの検出には、標識されたストレプトアビジンの他、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、もしくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、もしくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドに融合したタグを認識する標識された検出用抗体等を利用することができる。標識には、ビオチンの他、ＨＲＰ、アルカリフォスファターゼ、ＦＩＴＣ等生化学的解析に実施可能な方法を利用することができる。酵素標識を利用した検出にはＴＭＢ（３，３'，５，５'－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＢＣＩＰ（５－ｂｒｏｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ－３－ｉｎｄｏｌｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｐ－ＮＰＰ（ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＯＰＤ（ｏ－Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（３－Ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等の発色基質やＱｕａｎｔａＢｌｕ（登録商標）Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等の蛍光基質、及び化学発光基質を用いることができる。検出シグナルの測定には、吸光プレートリーダー、蛍光プレートリーダー、発光プレートリーダー、ＲＩ液体シンチレーションカウンター等を利用することができる。
【0049】
ＳＰＲ解析に用いる機器としては、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＰｒｏｔｅＯｎ（登録商標）（ＢｉｏＲａｄ）、ＳＰＲ－Ｎａｖｉ（登録商標）（ＢｉｏＮａｖｉｓＯｙ）、Ｓｐｒｅｅｔａ（登録商標）（Ｔｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ＳＰＲｉ－ＰｌｅｘＩＩ（登録商標）（ホリバ）、Ａｕｔｏｌａｂ ＳＰＲ（登録商標）（Ｍｅｔｒｏｈｍ）等を例示することができる。ＢＬＩ法に用いる機器としては、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）（Ｐａｌｌ）を例示することができる。
【0050】
免疫沈降法としては、ビーズ上に固相化されたＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドによって認識され、結合したＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８を検出する方法が挙げられる。ビーズには磁気ビーズやアガロースビーズ等を利用することができる。ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの固相化には、ビオチン－ストレプトアビジンの他、該ペプチド又は該ペプチドに融合したタグを認識する抗体、プロテインＡ又はプロテインＧ等を利用することができる。磁石や遠心分離等によってビーズを分離し、ビーズと共に沈殿したＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８をＳＤＳ－ＰＡＧＥやＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法で検出する。ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８の検出には、標識されたストレプトアビジンの他、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４若しくはＫＬＫ８，又は、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４若しくはＫＬＫ８に融合したタグを認識する標識された検出用抗体等を利用することができる。標識には、ビオチンの他、ＨＲＰ、アルカリフォスファターゼ、ＦＩＴＣ等生化学的解析に実施可能な方法を利用することができる。酵素標識を利用した検出にはＥＬＩＳＡ法と同様の基質を利用することができる。検出シグナルの測定にはＣｈｅｍｉＤｏｃ（登録商標）（ＢｉｏＲａｄ）やＬｕｍｉｎｏＧｒａｐｈ（ＡＴＴＯ）等を利用することができる。
【0051】
本発明において「特異的な認識」、すなわち「特異的な結合」とは、非特異的な吸着ではない結合を意味する。結合が特異的であるか否かの判定基準としては、例えば、ＥＬＩ
ＳＡ法における結合活性ＥＣ５０をあげることができる。他の判定基準としては、例えば、解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ：以下、「ＫＤ」という）をあげることができる。本発明におけるＫＬＫ１阻害ペプチドのＫＬＫ１に対するＫＤ値、ＫＬＫ４阻害ペプチドのＫＬＫ４に対するＫＤ値、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドのＫＬＫ４及びＫＬＫ８に対するＫＤ値は１×１０－５Ｍ以下、５×１０－６Ｍ以下、２×１０－６Ｍ以下又は１×１０－６Ｍ以下、より好適には５×１０－７Ｍ以下、２×１０－７Ｍ以下又は１×１０－７Ｍ以下、より一層好適には５×１０－８Ｍ以下、２×１０－８Ｍ以下又は１×１０－８Ｍ以下、さらにより一層好適には５×１０－９Ｍ以下、２×１０－９Ｍ以下又は１×１０－９Ｍ以下である。他の判定基準としては、例えば、免疫沈降法での解析結果をあげることができる。本発明における好適なＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドをビーズに固相化し、それぞれＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８を添加した後にビーズを分離し、ビーズと共に沈殿したＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８を検出した場合、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８のシグナルが検出される。
ＳＡ法における結合活性ＥＣ５０をあげることができる。他の判定基準としては、例えば、解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ：以下、「ＫＤ」という）をあげることができる。本発明におけるＫＬＫ１阻害ペプチドのＫＬＫ１に対するＫＤ値、ＫＬＫ４阻害ペプチドのＫＬＫ４に対するＫＤ値、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドのＫＬＫ４及びＫＬＫ８に対するＫＤ値は１×１０－５Ｍ以下、５×１０－６Ｍ以下、２×１０－６Ｍ以下又は１×１０－６Ｍ以下、より好適には５×１０－７Ｍ以下、２×１０－７Ｍ以下又は１×１０－７Ｍ以下、より一層好適には５×１０－８Ｍ以下、２×１０－８Ｍ以下又は１×１０－８Ｍ以下、さらにより一層好適には５×１０－９Ｍ以下、２×１０－９Ｍ以下又は１×１０－９Ｍ以下である。他の判定基準としては、例えば、免疫沈降法での解析結果をあげることができる。本発明における好適なＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドをビーズに固相化し、それぞれＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８を添加した後にビーズを分離し、ビーズと共に沈殿したＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８を検出した場合、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８のシグナルが検出される。
【0052】
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又はＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドとしてのＳＰＩＮＫ２変異体は、上記のようなプロテアーゼ阻害活性、標的結合活性、その他の性質、機能、特徴等を有し得る一方で、その全長アミノ酸配列はヒト野生型ＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列に対して高い配列同一性を有する。本発明のＳＰＩＮＫ２変異体は、ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列（配列番号１：図７）と６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する。
【0053】
「同一性」とは、２つの配列の間の、類似性又は関係の程度を示す性質を意味する。アミノ酸配列の同一性（％）は、同一であるアミノ酸もしくはアミノ酸残基の数をアミノ酸もしくはアミノ酸残基の総数で割って得られる数値に、１００を掛けることにより、算出される。
【0054】
「ギャップ」とは、２つ以上の配列のうち少なくとも１つにおける欠失及び／又は付加の結果である、当該配列間のアライメントにおける隙間を意味する。
【0055】
完全に同一なアミノ酸配列を有する２つのアミノ酸配列の間の同一性は１００％であるが、一方のアミノ酸配列を他方と比較して１つ又は２つ以上のアミノ酸又はアミノ酸残基の置換、欠失又は付加があれば、両者の同一性は１００％未満となる。ギャップをも考慮して２つの配列間の同一性を決定するためのアルゴリズムやプログラムとしては、標準的なパラメータを用いるＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻、３３８９－３４０２頁、１９９７年）、ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻、４０３－４１０頁、１９９０年）、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７巻、１９５－１９７頁、１９８１年）等の当業者に公知のものを例示することができる。
【0056】
本発明において、「変異した」とは、天然に存在する核酸分子又はペプチドと比較のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列において、１つ又は２つ以上のヌクレオチドもしくはヌクレオチド残基又はアミノ酸もしくはアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入がなされていることを意味する。本発明のＳＰＩＮＫ２変異体のアミノ酸配列は、ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列と比較して、１つ又は２つ以上のアミノ酸又はアミノ酸残基が変異されている。
【0057】
本発明のある態様において、ＳＰＩＮＫ２変異体のアミノ酸配列は、ヒトＳＰＩＮＫ２
のアミノ酸配列（配列番号１：図７）の：
１６番Ｓｅｒ～２２番Ｇｌｙのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は７つのアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸残基に置換されており；
２４番Ｐｒｏ～２８番Ａｓｎのうち１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸残基に置換されており；
１５番Ｃｙｓ、２３番Ｃｙｓ、３１番Ｃｙｓ、４２番Ｃｙｓ、４５番Ｃｙｓ及び６３番Ｃｙｓは、天然型のジスルフィド結合を維持するためには野生型と同じくＣｙｓであることが好ましく、天然型のジスルフィド結合を消失させたり、非天然型のジスルフィド結合を生じさせたりするためには、それらのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つを他のアミノ酸に置換してもよい。本発明のＳＰＩＮＫ２変異体うち一部の好適なＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドにおいては、天然型と同じ当該６箇所にＣｙｓが維持され、ジスルフィド結合が保持されている。かかるペプチドのうちより好適な一部の態様においては、１５番Ｃｙｓ－４５番Ｃｙｓ、２３番Ｃｙｓ－４２番Ｃｙｓ、及び、３１番Ｃｙｓ－６３番Ｃｙｓが、それぞれジスルフィド結合を形成している。
のアミノ酸配列（配列番号１：図７）の：
１６番Ｓｅｒ～２２番Ｇｌｙのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は７つのアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸残基に置換されており；
２４番Ｐｒｏ～２８番Ａｓｎのうち１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸残基に置換されており；
１５番Ｃｙｓ、２３番Ｃｙｓ、３１番Ｃｙｓ、４２番Ｃｙｓ、４５番Ｃｙｓ及び６３番Ｃｙｓは、天然型のジスルフィド結合を維持するためには野生型と同じくＣｙｓであることが好ましく、天然型のジスルフィド結合を消失させたり、非天然型のジスルフィド結合を生じさせたりするためには、それらのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つを他のアミノ酸に置換してもよい。本発明のＳＰＩＮＫ２変異体うち一部の好適なＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドにおいては、天然型と同じ当該６箇所にＣｙｓが維持され、ジスルフィド結合が保持されている。かかるペプチドのうちより好適な一部の態様においては、１５番Ｃｙｓ－４５番Ｃｙｓ、２３番Ｃｙｓ－４２番Ｃｙｓ、及び、３１番Ｃｙｓ－６３番Ｃｙｓが、それぞれジスルフィド結合を形成している。
【0058】
そのようなＳＰＩＮＫ２変異体の有するアミノ酸配列がＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドに含まれる場合、野生型ＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列に含まれる１６番Ｓｅｒ乃至３０番Ｖａｌからなるループ構造、３１番Ｃｙｓ及び３２番Ｇｌｙからなるβストランド（１）並びに５７番Ｉｌｅ乃至５９番Ａｒｇからなるβストランド（２）から構成されるβシート、４１番Ｇｌｕ乃至５１番Ｇｌｙからなるαへリックス、又は、それらに類似しているか若しくはそれら（の位置）に少なくとも部分的に対応するループ構造、βシート、αへリックス等から構成される立体構造が、ＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を発揮し得る程度に、維持されていることが好ましい。
【0059】
本発明のＳＰＩＮＫ２変異体のうち、一部のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの有するアミノ酸配列について以下に述べる。上述の通り、本発明において「アミノ酸残基」は単に「アミノ酸」と表記されることがある。
【0060】
配列番号２３（図２９）で示されるアミノ酸配列（一般式）において、Ｘ１乃至Ｘ１３は、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８を阻害する限りに置いてそれぞれ任意のアミノ酸であれば特に限定されない。以下、Ｘ１乃至Ｘ１３の好適なアミノ酸について記載するが、それらのアミノ酸の中には天然型、すなわち野生型ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列中と同一のアミノ酸が含まれている場合がある。
【0061】
ＫＬＫ１阻害ペプチドに含まれる配列番号２３（図２９）で示されるアミノ酸配列において、好適には：
１番Ｘａａ（Ｘ１）はＡｓｐ又はＧｌｙ；
１６番Ｘａａ（Ｘ２）はＡｌａ、Ａｓｐ又はＳｅｒ；
１７番Ｘａａ（Ｘ３）はＩｌｅ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＶａｌ；
１８番Ｘａａ（Ｘ４）はＡｌａ、Ａｓｎ又はＴｙｒ；
１９番Ｘａａ（Ｘ５）はＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ又はＧｌｎ；
２０番Ｘａａ（Ｘ６）はＩｌｅ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ又はＶａｌ；
２１番Ｘａａ（Ｘ７）はＡｓｐ、Ａｒｇ又はＶａｌ；
２２番Ｘａａ（Ｘ８）はＡｓｐ、Ｉｌｅ又はＡｒｇ；
２４番Ｘａａ（Ｘ９）はＰｈｅ、Ｈｉｓ又はＴｒｐ；
２５番Ｘａａ（Ｘ１０）はＴｙｒ又はＴｒｐ；
２６番Ｘａａ（Ｘ１１）はＡｌａ、Ｔｈｒ又はＴｙｒ；
２７番Ｘａａ（Ｘ１２）はＳｅｒ又はＴｙｒ；及び
２８番Ｘａａ（Ｘ１３）はＧｌｕ、Ｌｙｓ又はＧｌｎ
である。
１番Ｘａａ（Ｘ１）はＡｓｐ又はＧｌｙ；
１６番Ｘａａ（Ｘ２）はＡｌａ、Ａｓｐ又はＳｅｒ；
１７番Ｘａａ（Ｘ３）はＩｌｅ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＶａｌ；
１８番Ｘａａ（Ｘ４）はＡｌａ、Ａｓｎ又はＴｙｒ；
１９番Ｘａａ（Ｘ５）はＬｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ又はＧｌｎ；
２０番Ｘａａ（Ｘ６）はＩｌｅ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ又はＶａｌ；
２１番Ｘａａ（Ｘ７）はＡｓｐ、Ａｒｇ又はＶａｌ；
２２番Ｘａａ（Ｘ８）はＡｓｐ、Ｉｌｅ又はＡｒｇ；
２４番Ｘａａ（Ｘ９）はＰｈｅ、Ｈｉｓ又はＴｒｐ；
２５番Ｘａａ（Ｘ１０）はＴｙｒ又はＴｒｐ；
２６番Ｘａａ（Ｘ１１）はＡｌａ、Ｔｈｒ又はＴｙｒ；
２７番Ｘａａ（Ｘ１２）はＳｅｒ又はＴｙｒ；及び
２８番Ｘａａ（Ｘ１３）はＧｌｕ、Ｌｙｓ又はＧｌｎ
である。
【0062】
ＫＬＫ４阻害ペプチドに含まれる配列番号２３（図２９）で示されるアミノ酸配列において、好適には：
１番Ｘａａ（Ｘ１）はＡｓｐ又はＧｌｙ；
１６番Ｘａａ（Ｘ２）はＧｌｕ、Ａｒｇ又はＳｅｒ；
１７番Ｘａａ（Ｘ３）はＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ又はＧｌｎ；
１８番Ｘａａ（Ｘ４）はＡｌａ、Ｇｌｎ又はＴｙｒ；
１９番Ｘａａ（Ｘ５）はＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ又はＶａｌ；
２０番Ｘａａ（Ｘ６）はＧｌｕ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ又はＴｙｒ；
２１番Ｘａａ（Ｘ７）はＡｓｐ又はＧｌｙ；
２２番Ｘａａ（Ｘ８）はＡｌａ又はＶａｌ；
２４番Ｘａａ（Ｘ９）はＧｌｎ；
２５番Ｘａａ（Ｘ１０）はＬｙｓ又はＡｒｇ；
２６番Ｘａａ（Ｘ１１）はＩｌｅ；
２７番Ｘａａ（Ｘ１２）はＰｈｅ又はＴｙｒ；及び
２８番Ｘａａ（Ｘ１３はＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＧｌｎ
である。
１番Ｘａａ（Ｘ１）はＡｓｐ又はＧｌｙ；
１６番Ｘａａ（Ｘ２）はＧｌｕ、Ａｒｇ又はＳｅｒ；
１７番Ｘａａ（Ｘ３）はＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ又はＧｌｎ；
１８番Ｘａａ（Ｘ４）はＡｌａ、Ｇｌｎ又はＴｙｒ；
１９番Ｘａａ（Ｘ５）はＡｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ又はＶａｌ；
２０番Ｘａａ（Ｘ６）はＧｌｕ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ又はＴｙｒ；
２１番Ｘａａ（Ｘ７）はＡｓｐ又はＧｌｙ；
２２番Ｘａａ（Ｘ８）はＡｌａ又はＶａｌ；
２４番Ｘａａ（Ｘ９）はＧｌｎ；
２５番Ｘａａ（Ｘ１０）はＬｙｓ又はＡｒｇ；
２６番Ｘａａ（Ｘ１１）はＩｌｅ；
２７番Ｘａａ（Ｘ１２）はＰｈｅ又はＴｙｒ；及び
２８番Ｘａａ（Ｘ１３はＬｙｓ、Ｌｅｕ又はＧｌｎ
である。
【0063】
ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドに含まれる配列番号２３（図２９）で示されるアミノ酸配列において、好適には：
１番Ｘａａ（Ｘ１）はＡｓｐ又はＧｌｙ；
１６番Ｘａａ（Ｘ２）はＧｌｙ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ；
１７番Ｘａａ（Ｘ３）はＬｙｓ又はＡｒｇ、Ｘ４はＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ又はＴｙｒ；
１８番Ｘａａ（Ｘ４）はＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ又はＴｙｒ；
１９番Ｘａａ（Ｘ５）はＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ又はＴｙｒ；
２０番Ｘａａ（Ｘ６）はＩｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ又はＴｒｐ；
２１番Ｘａａ（Ｘ７）はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｖａｌ又はＴｒｐ；
２２番Ｘａａ（Ｘ８）はＧｌｙ又はＴｒｐ；
２４番Ｘａａ（Ｘ９）はＡｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ；
２５番Ｘａａ（Ｘ１０）はＬｙｓ又はＡｒｇ；
２６番Ｘａａ（Ｘ１１）はＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ又はＶａｌ；
２７番Ｘａａ（Ｘ１２）はＰｈｅ、Ｌｅｒ又はＴｙｒ；及び
２８番Ｘａａ（Ｘ１３）はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＡｓｎ
である。
１番Ｘａａ（Ｘ１）はＡｓｐ又はＧｌｙ；
１６番Ｘａａ（Ｘ２）はＧｌｙ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ；
１７番Ｘａａ（Ｘ３）はＬｙｓ又はＡｒｇ、Ｘ４はＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ又はＴｙｒ；
１８番Ｘａａ（Ｘ４）はＰｈｅ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ又はＴｙｒ；
１９番Ｘａａ（Ｘ５）はＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ又はＴｙｒ；
２０番Ｘａａ（Ｘ６）はＩｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ又はＴｒｐ；
２１番Ｘａａ（Ｘ７）はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｖａｌ又はＴｒｐ；
２２番Ｘａａ（Ｘ８）はＧｌｙ又はＴｒｐ；
２４番Ｘａａ（Ｘ９）はＡｌａ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ又はＴｈｒ；
２５番Ｘａａ（Ｘ１０）はＬｙｓ又はＡｒｇ；
２６番Ｘａａ（Ｘ１１）はＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ又はＶａｌ；
２７番Ｘａａ（Ｘ１２）はＰｈｅ、Ｌｅｒ又はＴｙｒ；及び
２８番Ｘａａ（Ｘ１３）はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＡｓｎ
である。
【0064】
なお、野生型の１番、１６乃至２２番及び２４乃至２８番Ｘａａ（Ｘ１乃至Ｘ１３）は、それぞれＡｓｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ及びＡｓｎである。
【0065】
本発明においては、１番アミノ酸のＮ末側に、さらに１つ乃至数個又はそれ以上のアミノ酸が付加していてもよく、そのような付加されるアミノ酸としては、例えば、Ｓｔａｇ＋リンカーからなるアミノ酸配列（配列番号２６：図３２）等をあげることができる。
【0066】
さらに、Ｃ末に位置する６３番Ｃｙｓに１乃至数個のアミノ酸が付加していてもよく、例えば、Ｇｌｙ－Ｇｌｙを加えＣ末が６５番Ｇｌｙであるアミノ酸配列等をあげることができる。そのような付加されるアミノ酸としては、例えば、Ｃ末６マー（配列番号２７：図３３）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ等をあげることができる。
【0067】
本発明においては、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド又はＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドのＮ末及び／又はＣ末付加体（以下、「親ペプチド」と呼ぶ）において、１つ又は２つ以上のアミノ酸が置換、付加及び／又は欠失されてなるペプチドを「親ペプチドの誘導体」又は「親ペプチド誘導体」と呼ぶことがある。かかる「誘導体」も本発明の「ペプチド」の範囲に含まれる。
【0068】
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの範囲に含まれるＳＰＩＮＫ２変異体の有するアミノ酸配列においては、Ｘ１乃至Ｘ１３以外の部分、すなわち、野生型ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列（配列番号１：図７）中の、２番Ｐｒｏ～１５番Ｃｙｓ、２３番Ｃｙｓ及び２９番Ｐｒｏ～６３番Ｃｙｓの位置において、天然型のアミノ酸もしくは変異したアミノ酸又はアミノ酸配列を含むことができる。例えば、ＳＰＩＮＫ２変異体は、ＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性又はフォールディングを少なくとも部分的に妨げないか又は干渉をしない限りにおいて、１つ又は２つ以上の位置において変異してよい。そのような変異は、当業者に公知の標準的な方法を使用することによりなし得る。アミノ酸配列中の典型的な変異としては、１つ又は２つ以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加をあげることができ、置換としては、保存的置換を例示することができる。保存的置換により、あるアミノ酸残基は、嵩高さのみならず、極性の面についても化学的特徴が類似しているアミノ酸残基により置換される。保存的置換の例は、本明細書の他の部分に記載されている。一方で、Ｘ１乃至Ｘ１３以外の部分は、ＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性又はフォールディングを少なくとも部分的に妨げないか又は干渉をしない限りにおいて、１つ又は２つ以上のアミノ酸の非保存的置換も許容し得る。
【0069】
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドとしてのＳＰＩＮＫ２変異体の有するアミノ酸配列は、Ｘ１乃至Ｘ１３が、好適には、配列番号５乃至８（図１１乃至１４）、配列番号９乃至１２（図１５乃至１８）、又は、配列番号１３乃至２２（図１９乃至２８）のいずれか一つにおけるＸ１乃至Ｘ１３の各アミノ酸であり、且つ、Ｘ１乃至Ｘ１３以外の部分がＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性又はフォールディングを少なくとも部分的に妨げないか又は干渉をしないアミノ酸又はアミノ酸配列を有することができる。
【0070】
また、本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドとしてのＳＰＩＮＫ２変異体のアミノ酸配列の例として、次の（ａ１）乃至（ａ３）、（ｂ１）乃至（ｂ３）又は（ｃ１）乃至（ｃ３）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列をそれぞれあげることができる：
（ａ１）配列番号５乃至８（図１１乃至１４）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列；（ａ２）（ａ１）に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ１阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；
（ａ３）（ａ１）に記載のアミノ酸配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ１阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列；及び、
（ａ４）（ａ１）に記載のアミノ酸配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ１阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列、
（ｂ１）配列番号９乃至１２（図１５乃至１８）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列；
（ｂ２）（ｂ１）に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；
（ｂ３）（ｂ１）に記載のアミノ酸配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列；及び、
（ｂ４）（ｂ１）に記載のアミノ酸配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列、又は、
（ｃ１）配列番号１３乃至２２（図１９乃至２８）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列；
（ｃ２）（ｃ１）に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ３）（ｃ１）に記載のアミノ酸配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列；及び、
（ｃ４）（ｃ１）に記載のアミノ酸配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列、
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドに、そのフォールディング安定性、熱安定性、保存安定性、血中半減期、水溶性、生物活性、薬理活性、副次的作用等を改善する目的で、変異を導入することができる。例えば、ポリエチレングルコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ビオチン、ペプチド又は蛋白質等の他の物質にコンジュゲートさせるため、Ｃｙｓのような新たな反応性基を変異により導入することができる。
（ａ１）配列番号５乃至８（図１１乃至１４）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列；（ａ２）（ａ１）に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ１阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；
（ａ３）（ａ１）に記載のアミノ酸配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ１阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列；及び、
（ａ４）（ａ１）に記載のアミノ酸配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ１阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列、
（ｂ１）配列番号９乃至１２（図１５乃至１８）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列；
（ｂ２）（ｂ１）に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；
（ｂ３）（ｂ１）に記載のアミノ酸配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列；及び、
（ｂ４）（ｂ１）に記載のアミノ酸配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列、又は、
（ｃ１）配列番号１３乃至２２（図１９乃至２８）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列；
（ｃ２）（ｃ１）に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；
（ｃ３）（ｃ１）に記載のアミノ酸配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列；及び、
（ｃ４）（ｃ１）に記載のアミノ酸配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列、
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドに、そのフォールディング安定性、熱安定性、保存安定性、血中半減期、水溶性、生物活性、薬理活性、副次的作用等を改善する目的で、変異を導入することができる。例えば、ポリエチレングルコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ビオチン、ペプチド又は蛋白質等の他の物質にコンジュゲートさせるため、Ｃｙｓのような新たな反応性基を変異により導入することができる。
【0071】
本発明において、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは他の部分に連結又は付加していてもよく、そのようなコンジュゲート体を「ＫＬＫ１阻害ペプチドのコンジュゲート」、「ＫＬＫ４阻害ペプチドのコンジュゲート」又は「ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドのコンジュゲート」とそれぞれ総称する。本発明において「コンジュゲート」とは、本発明のペプチド又はその断片に他の部分が結合してなる分子を意味する。「コンジュゲート」又は「コンジュゲーション」には、ある部分が架橋剤等の化学物質を介して、ある部分をアミノ酸の側鎖に連結するのに適した作用物質等を介して、本発明のペプチドのＮ末及び／又はＣ末に合成化学的手法や遺伝子工学的手法等により、本発明のペプチドに連結又は結合される形態が含まれる。そのような「部分」には、血中半減期を改善するものとして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、パルミチン酸等の脂肪酸分子、免疫グロブリンのＦｃ領域（例えば、ヒト免疫グロブリンＧ１：そのアミノ酸配列を配列番号２８、図３４に示す）、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン又はその断片、アルブミン結合ペプチド、連鎖球菌プロテインＧ等のアルブミン結合蛋白質、トランスフェリンを、例示することができる。その他の「部分」としては、かかる「部分」はペプチドリンカー等のリンカーを介して本発明のペプチドが連結され得る。
【0072】
また、本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドには、薬理活性を発揮するか又は増強するために、他の薬物がコンジュゲートされていてもよい。抗体分野において抗体－薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）として当業者に公知の技術や態様は、抗体を本発明のペプチドに置き換えることにより、本発明の一部の態様となり得る。
【0073】
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、それぞれＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８以外の標的分子に対する結合親和性、阻害活性、拮抗活性、作動活性等を発揮する１つ又は２つ以上の部分をさらに含むか、そのような部分にコンジュゲートされていてもよい。かかる「部分」としては、抗体又はその断片、ＳＰＩＮＫ２変異体のような抗体以外の骨格を有する蛋白質又はその断片を例示することができる。抗体分野において多重特異的抗体及び二重特異的抗体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）として当業者に公知の技術や態様は、それらに含まれる２つ以上の「抗体」のうち少なくとも１つを本発明のペプチドに置き換えることにより、本発明のコンジュゲートの一部の態様となる。
【0074】
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド又はその前駆体は、シグナル配列を含み得る。あるポリペプチドもしくはその前駆体のＮ末に存在するか又は付加されたシグナル配列は、当該ポリペプチドを細胞の特定の区画、例えば、大腸菌であれば周辺質、真核細胞であれば小胞体に送達するために有用であり、多くのシグナル配列が当業者に公知であり、宿主細胞に応じて選択され得る。大腸菌の周辺質中に所望のペプチドを分泌させるためのシグナル配列としては、ＯｍｐＡを例示することができる、シグナル配列を含む形態も、本発明のコンジュゲートに、その一部の態様として含まれ得る。
【0075】
また、本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドに予めタグを付加させることにより、アフィニティークロマトグラフィーによって該ペプチドを精製することができることができる。
本発明のペプチドは、例えば、そのＣ末に、ビオチン、Ｓｔｒｅｐタグ（登録商標）、ＳｔｒｅｐタグＩＩ（登録商標）、Ｈｉｓ６等のオリゴヒスチジン、ポリヒスチジン、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合蛋白質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ジゴキシゲニンやジニトロフェノール等のハプテン、ＦＬＡＧ（登録商標）等のエピトープタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ等（以下まとめて「アフィ二ティー・タグ」と呼ぶ）を含むことができる。タグ付加体も、本発明のコンジュゲートに、その一部の態様として含まれ得る。本発明のコンジュゲートは、全体としてペプチド（ポリペプチド）であってもよい。
本発明のペプチドは、例えば、そのＣ末に、ビオチン、Ｓｔｒｅｐタグ（登録商標）、ＳｔｒｅｐタグＩＩ（登録商標）、Ｈｉｓ６等のオリゴヒスチジン、ポリヒスチジン、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合蛋白質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ジゴキシゲニンやジニトロフェノール等のハプテン、ＦＬＡＧ（登録商標）等のエピトープタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ等（以下まとめて「アフィ二ティー・タグ」と呼ぶ）を含むことができる。タグ付加体も、本発明のコンジュゲートに、その一部の態様として含まれ得る。本発明のコンジュゲートは、全体としてペプチド（ポリペプチド）であってもよい。
【0076】
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、標識のための部分を含むことができ、具体的には、酵素標識、放射性標識、着色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属複合体、金属、コロイド金等の標識部分がコンジュゲートされ得る。標識のための部分を含む態様も、本発明のコンジュゲートに、その一部の態様として含まれ得る。
【0077】
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ
８阻害ペプチド（のアミノ酸配列）には、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸のいずれをも含むことができ、天然アミノ酸としてはＬ－アミノ酸及びＤ－アミノ酸のいずれをも含むことができる。
８阻害ペプチド（のアミノ酸配列）には、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸のいずれをも含むことができ、天然アミノ酸としてはＬ－アミノ酸及びＤ－アミノ酸のいずれをも含むことができる。
【0078】
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、単量体、２量体、３量体以上のオリゴマー又は多量体として存在し得る。２量体、３量体以上のオリゴマー及び多量体は、単一の単量体から構成されるホモ、及び、２つ以上の異なる単量体から構成されるヘテロ、のいずれでもよい。単量体は、例えば、速やかに拡散し組織への浸透に優れている場合がある。２量体、オリゴマー及び多量体は、例えば、局所において標的分子に対して高い親和性もしくは結合活性を有するか、遅い解離速度を有するか、又は、高いＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性若しくはＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を示す等の優れた側面を有し得る。自発的な２量体化、オリゴマー化及び多量体化に加え、意図した２量体化、オリゴマー化及び多量体化も、ｊｕｎ－ｆｏｓドメイン、ロイシンジッパー等を本発明のペプチドに導入することにより、なし得る。
【0079】
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、単量体、２量体、３量体以上のオリゴマー又は多量体で、１つ又は２つ以上の標的分子に結合するか又は標的分子の活性を阻害することができる。
【0080】
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドがとり得る形態としては、単離された形態（凍結乾燥標品、溶液等）、上述のコンジュゲート体、他の分子に結合した形態（固相化された形態、異分子との会合体、標的分子と結合した形態等）等をあげることができるが、それらに限定されるものではなく、発現、精製、使用、保存等に適合した形態を任意に選択することができる。
【0081】
３．ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、及び、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの同定
ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、及び、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、ＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列又は本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、及び、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの有するアミノ酸配列（例えば、配列番号５乃至８：図１１乃至１４からなる群、配列番号９乃至１２：図１５乃至１８からなる群、又は、配列番号１３乃至２２：図１９乃至２８からなる群から選択されるアミノ酸配列）、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列を含む核酸分子等を出発材料として、当業者に周知の方法により、同定することができる。好適な一例として、ヒトＳＰＩＮＫ２変異体ライブラリーより、ＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を指標としてそれぞれ同定することができ、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８に対する結合活性もそれぞれ指標として組み合わせてもよい。
ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、及び、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、ＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列又は本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、及び、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの有するアミノ酸配列（例えば、配列番号５乃至８：図１１乃至１４からなる群、配列番号９乃至１２：図１５乃至１８からなる群、又は、配列番号１３乃至２２：図１９乃至２８からなる群から選択されるアミノ酸配列）、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列を含む核酸分子等を出発材料として、当業者に周知の方法により、同定することができる。好適な一例として、ヒトＳＰＩＮＫ２変異体ライブラリーより、ＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を指標としてそれぞれ同定することができ、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８に対する結合活性もそれぞれ指標として組み合わせてもよい。
【0082】
例えば、出発材料としての核酸分子は、変異誘発に供され、組換えＤＮＡ技術を用いて適切な細菌宿主又は真核性宿主中に導入され得る。ＳＰＩＮＫ２変異体ライブラリーは、標的分子のバインダーや阻害剤を同定するための技術として公知であり、例えば、ＷＯ２０１２／１０５６１６公報における開示も、その全体を参照することにより本発明の開示に含まれる。適切な宿主において変異誘発に供されたヌクレオチド配列を発現させた後、所望の性質、活性、機能等を有するＳＰＩＮＫ２変異体がその遺伝形質とリンクしてなるクローンを、前記のライブラリーから濃縮及び／又は選抜し、同定することができる。クローンの濃縮及び／又は選抜には、細菌ディスプレイ法（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０巻，１０４４４－１０４４８頁）、酵母ディスプレイ法（Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５巻，５５３－５５７頁）、哺乳動物細胞ディスプレイ法（Ｈｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２００９年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．５２５巻：３３７－５２頁）、ファージディスプレイ法（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２２８巻，１３１５－１３１７頁）、リボソームディスプレイ法（（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ ＬＣ， ｅｔ ａｌ． （１９９４年） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９1巻１９号，９０２２－９０２９頁））、ｍＲＮＡディスプレイ等の核酸ディスプレイ法（Ｎｅｍｏｔｏ Ｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４１４巻２号，４０５－４０８頁）、コロニースクリーニング法（Ｐｉｎｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００２年）Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ． ５巻，５０３－５１０頁）等、当業者に公知の方法を使用することにより、選抜され同定されたクローンに含まれるＳＰＩＮＫ２変異体のヌクレオチド配列を決定することにより、該ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を、当該クローンに含まれるＳＰＩＮＫ２変異体すなわちＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの有するアミノ酸配列として決定することができる。
【0083】
本発明のＳＰＩＮＫ２変異体は、例えば、天然型のＳＰＩＮＫ２に変異を誘発することにより得ることができる。「変異の誘発」とは、あるアミノ酸配列の各位置に存在する１つ又は２つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換するかもしくは欠失させるか、又は当該アミノ酸配列中には存在しないアミノ酸を付加もしくは挿入することができるようにすることを意味する。かかる欠失又は付加もしくは挿入により、配列長が変わり得る。本発明のＳＰＩＮＫ２変異体において、変異の誘発は、好適には、配列番号２３（図２９）で示されるアミノ酸配列中の、Ｘ１乃至Ｘ１３の１つ又は２つ以上の位置において生じ得る。
【0084】
但し、そのような好適な変異の誘発の後に、Ｘ１乃至Ｘ１３の１つ又は２つ以上の位置において、天然型のアミノ酸、すなわち天然型のアミノ酸配列中の特定の位置に存在するのと同じアミノ酸が維持されたものも、全体として少なくとも１つのアミノ酸が変異されていれば、変異体の範囲に含まれる。同様に、本発明のある態様において、Ｘ１乃至Ｘ１３以外の部分の１つ以上の位置に変異を誘発した後に、当該位置に天然型のアミノ酸、すなわち天然型のアミノ酸配列中の特定の位置に存在するのと同じアミノ酸が維持されたものも、全体として少なくとも１つのアミノ酸が変異されていれば、変異体の範囲に含まれる。
【0085】
「ランダム変異の誘発」とは、配列上の特定の位置について、１つ又は２つ以上の異なるアミノ酸が、変異の誘発により、当該位置に一定の確率で導入させることを意味するが、少なくとも２つの異なるアミノ酸の導入される確率が全て同じではなくてもよい。また、本発明においては、少なくとも２つの異なるアミノ酸に、天然型のアミノ酸（１種）が含まれることを妨げるものではなく、そのような場合も「ランダム変異の誘発」の範囲に含まれる。
【0086】
特定の位置にランダム変異を誘発する方法としては、当業者に公知の標準的方法を使用することができる。例えば、配列中の特定の位置に、縮重ヌクレオチド組成物を含む合成オリゴヌクレオチドの混合物を用いたＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により変異を誘発することができる。例えば、コドンＮＮＫ又はＮＮＳ（Ｎ＝アデニン、グアニン、シトシン又はチミン；Ｋ＝グアニン又はチミン；Ｓ＝アデニン又はシトシン）を使用すれば、天然アミノ酸２０種全てに加え、停止コドンが導入される変異の誘発されるのに対し、コドンＶＶＳ（Ｖ＝アデニン、グアニン又はシトシン）を使用すれば、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌが導入される可能性が無く、残る１２の天然アミノ酸の導入が変異誘発される。また、例えば、コドンＮＭＳ（Ｍ＝アデニン又はシトシン）を使用すれば、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ及びＶａｌが導入される可能性が無く、残る１１の天然アミノ酸の導入が変異誘発される。非天然アミノ酸の導入を変異誘発するために、特殊なコドン、人工的なコドン等を用いることができる。
【0087】
部位特異的な変異誘発は、高次構造を含む標的及び／又は該標的に対するペプチドもしくはペプチドが由来する野生型ペプチドの構造情報を利用しても行うことができる。本発明においては、標的であるＫＬＫ１、ＫＬＫ４、若しくは、ＫＬＫ８、及び／又は、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、若しくは、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８に対するＳＰＩＮＫ２変異体もしくは野生型ＳＰＩＮＫ２の、又は両者の複合体の、高次情報を含む構造情報を利用して、部位特異的な変異を導入することができる。例えば、ＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有するＳＰＩＮＫ２変異体を同定し、次いでＫＬＫ１、ＫＬＫ４又はＫＬＫ８及び当該ＳＰＩＮＫ２変異体の複合体の結晶を取得してＸ線結晶構造解析を行い、その解析結果に基づいて該ＳＰＩＮＫ２変異体が結合するＫＬＫ１、ＫＬＫ４又はＫＬＫ８分子上のエピトープ及び該エピトープに対応する該ＳＰＩＮＫ２変異体上のパラトープを特定すること等を通じて得られる構造情報と、ＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性との相関を見出すことができる場合がある。そのような構造活性相関に基づいて、特定の位置において特定のアミノ酸への置換、特定の位置におけるアミノ酸の挿入又は欠失等をデザインし、実際にＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を確認することができる。
【0088】
また、例えば、イノシン等の塩基対の特異性が改変されたヌクレオチド構成単位を用いて、変異を誘発することができる。
【0089】
さらに、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ等の、校正機能を欠き、エラー率の高いＤＮＡポリメラーゼを用いたエラー・プローンＰＣＲ法、化学変異誘発等により、ランダムな位置への変異誘発が可能である。
【0090】
ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳細胞ディスプレイ、ファージディスプレイ、リボゾームディスプレイ、核酸ディスプレイ、コロニースクリーニング等を利用して、ファージライブラリー、コロニーライブラリー等それぞれのスクリーニング方法に適した当業者に公知のライブラリーより濃縮及び／又は選抜することができる。それらのライブラリーのうち、ファージライブラリーにはファージミド、コロニースクリーニングにはコスミド等、それぞれのライブラリーに適した当業者に公知のベクター及び方法により構築することができる。そのかかるベクターは、原核細胞又は真核細胞に感染するウイルス又はウイルス性ベクターであってもよい。それらの組換えベクターは、遺伝子操作等当業者に公知の方法により調製することができる。
【0091】
細菌ディスプレイは、例えば、大腸菌の外膜リポ蛋白質（Ｌｐｐ）の一部及び外膜蛋白質ＯｍｐＡと所望の蛋白質を融合させ、大腸菌表面上に所望の蛋白質を提示させる技術である。ある蛋白質の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にランダム変異を誘発して得られるＤＮＡ群を細菌ディスプレイに適したベクターに導入し、当該ベクターで細菌細胞を形質転換すれば、形質転換細菌細胞表面上に、ランダム変異誘発された蛋白質群を提示するライブラリーを得ることができる（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ
ａｌ．（１９９３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．
９０巻，１０４４４－１０４４８頁）。
ａｌ．（１９９３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．
９０巻，１０４４４－１０４４８頁）。
【0092】
酵母ディスプレイは、酵母の細胞表面の外殻にあるα－アグルチニン等の蛋白質に所望の蛋白質を融合させ、酵母表面上に提示させる技術である。α－アグルチニンには、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ)アンカー付着シグナルと推定されるＣ末疎
水性領域、シグナル配列、活性ドメイン、細胞壁ドメイン等が含まれ、それらを操作する
ことにより、酵母の細胞表面上に所望の蛋白質をディスプレイすることができる。ある蛋白質の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にランダム変異を誘発して得られるＤＮＡ群を酵母ディスプレイに適したベクターに導入し、当該ベクターで酵母細胞を形質転換すれば、形質転換酵母細胞表面上に、ランダム変異誘発された蛋白質群を提示するライブラリーを得ることができる（Ｕｅｄａ，Ｍ．＆ Ｔａｎａｋａ，Ａ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．、１８巻、１２１頁～、２０００年刊：Ｕｅｄａ，Ｍ．＆ Ｔａｎａｋａ，Ａ．、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９０巻、１２５頁～、２０００年刊等）。
水性領域、シグナル配列、活性ドメイン、細胞壁ドメイン等が含まれ、それらを操作する
ことにより、酵母の細胞表面上に所望の蛋白質をディスプレイすることができる。ある蛋白質の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にランダム変異を誘発して得られるＤＮＡ群を酵母ディスプレイに適したベクターに導入し、当該ベクターで酵母細胞を形質転換すれば、形質転換酵母細胞表面上に、ランダム変異誘発された蛋白質群を提示するライブラリーを得ることができる（Ｕｅｄａ，Ｍ．＆ Ｔａｎａｋａ，Ａ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．、１８巻、１２１頁～、２０００年刊：Ｕｅｄａ，Ｍ．＆ Ｔａｎａｋａ，Ａ．、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９０巻、１２５頁～、２０００年刊等）。
【0093】
動物細胞ディスプレイは、例えば、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）に代表される膜蛋白質の膜貫通領域と所望の蛋白質を融合させ、ＨＥＫ２９３やチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞表面上に所望の蛋白質を提示させる技術である。ある蛋白質の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にランダム変異を誘発して得られるＤＮＡ群を動物細胞ディスプレイに適したベクターに導入し、当該ベクターで動物細胞を形質転換すれば、形質転換動物細胞表面上に、ランダム変異誘発された蛋白質群を提示するライブラリーを得ることができる（Ｈｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２００９年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．５２５巻：３３７－５２頁）。
【0094】
酵母、細菌、動物細胞等の細胞上に提示された所望のライブラリーは、標的分子の存在下で保温するか、又は、標的分子と接触させることができる。例えば、ビオチン等で修飾されたＫＬＫ１、ＫＬＫ４又はＫＬＫ８とライブラリーを含む細胞を一定時間保温した後、磁性ビーズ等の担体を添加し、細胞を担体から分離し、次いで担体を洗浄することにより非特異的な吸着物及び結合物を除去し、担体（に結合したＫＬＫ１、ＫＬＫ４又はＫＬＫ８）に結合したペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物が提示された細胞群を回収することができる。同様に、磁性ビーズ添加後に磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）をする、又は、抗ＫＬＫ１抗体、抗ＫＬＫ４抗体又は抗ＫＬＫ８抗体を用いた細胞染色後にＦＡＣＳを実施することで、担体（に結合したＫＬＫ１、ＫＬＫ４若しくはＫＬＫ８）又はＫＬＫ１、ＫＬＫ４又はＫＬＫ８と結合したペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物が提示された細胞群を回収することができる。非特異的な吸着物部位及び／又は結合部位は、例えば、ブロッキング処理することも可能であり、ブロッキング工程も適切な方法であれば組み入れられ得る。そのようにして得られたペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物を発現しているベクターを回収し、ベクターに挿入されたポリヌクレオチドの有するヌクレオチド配列を決定し、該ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を決定することができる。また、ベクターを再度宿主細胞に導入し、上述の操作をサイクルとして１回乃至数回繰り返すことにより、標的分子に結合するペプチド集合物をより高度に濃縮することができる。
【0095】
ファージディスプレイの場合、例えば、ファージミドは、プラスミド複製起点の他に、一本鎖バクテリオファージから誘導された第二の複製起点を含む細菌プラスミドである。ファージミドを有する細胞は、Ｍ１３又はそれに類似のヘルパーバクテリオファージによる重感染において、一本鎖複製モードを介してファージミドを複製することができる。すなわち、バクテリオファージ被覆蛋白質により被覆された感染性粒子の中に、一本鎖ファージミドＤＮＡがパッケージされる。このようにして、ファージミドＤＮＡを、感染細菌中にクローン二本鎖ＤＮＡプラスミドとして、ファージミドを、重感染した細胞の培養上清からバクテリオファージ状の粒子として、それぞれ形成することができる。バクテリオファージ状の該粒子を、Ｆ性線毛を有する細菌にかかるＤＮＡを感染させるために該細菌中に注入することにより、粒子自体をプラスミドとして再形成することができる。
【0096】
被検ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド及びバクテリオファージ被覆蛋白質（ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を含んで構成さ
れる融合遺伝子を該ファージミドに挿入して細菌に感染させ、該細胞を培養すれば、かかるペプチドを、該細菌上又はファージ様粒子上に発現もしくは提示（ディスプレイと同義）させるか、又は、該被覆蛋白質との融合蛋白質としてファージ粒子中もしくは該細菌の培養上清中に産生することができる。
れる融合遺伝子を該ファージミドに挿入して細菌に感染させ、該細胞を培養すれば、かかるペプチドを、該細菌上又はファージ様粒子上に発現もしくは提示（ディスプレイと同義）させるか、又は、該被覆蛋白質との融合蛋白質としてファージ粒子中もしくは該細菌の培養上清中に産生することができる。
【0097】
例えば、該ポリヌクレオチド及びバクテリオファージ被覆蛋白質遺伝子ｇｐＩＩＩを含んで構成される融合遺伝子をファージミドに挿入し、Ｍ１３又はそれに類似のヘルパーファージとともに大腸菌に重感染させれば、該ペプチド及び該被覆蛋白質を含んで構成される融合蛋白質として、該大腸菌の培養上清中に産生させることができる。
【0098】
ファージミドの代わりに、環状又は非環状の各種ベクター、例えば、ウイルスベクターを用いる場合、当業者に公知の方法に従って、該ベクターに挿入された該ポリヌクレオチドの有するヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を有するペプチドを、該ベクターが導入された細胞もしくはウイルス様粒子上に発現又は提示させるか、又は該細胞の培養上清中に産生することができる。
【0099】
そのようにして得られる、ペプチドを発現しているライブラリーを、標的分子の存在下で保温するか、又は、標的分子と接触させることができる。例えば、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ８及び／若しくはＫＬＫ８が固相化された担体を、ライブラリーを含む移動相と一定時間保温した後、移動相を担体から分離し、次いで担体を洗浄することにより非特異的な吸着物及び結合物を除去し、担体（に結合したＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及び／若しくはＫＬＫ８）に結合したペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物を、溶出により回収することができる。溶出は、相対的に高いイオン強度、低いｐＨ、中程度の変性条件、カオトロピック塩の存在下等で、非選択的に行うか、又は、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、ＫＬＫ８等の可溶性の標的分子、標的分子に結合する抗体、天然のリガンド、基質等を添加して固相化された標的分子と競合させることにより選択的に行うことができる。非特異的な吸着物部位及び／又は結合部位は、例えば、ブロッキング処理することも可能であり、ブロッキング工程も適切な方法であれば組み入れられ得る。
【0100】
そのようにして得られたペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物を発現しているベクターを回収し、ベクターに挿入されたポリヌクレオチドの有するヌクレオチド配列を決定し、該ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を決定することができる。また、ベクターを再度宿主細胞に導入し、上述の操作をサイクルとして１回乃至数回繰り返すことにより、標的分子に結合するペプチド集合物をより高度に濃縮することができる。
【0101】
リボゾームディスプレイは、例えば、終始コドンを持たない所望の蛋白質をコードするｍＲＮＡと無細胞蛋白質合成系を用いることで、試験管内で所望の蛋白質とそれに対応するｍＲＮＡ、及びリボゾームが連結した分子を合成する技術である。ある蛋白質の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にランダム変異を誘発して得られるｍＲＮＡ群と無細胞蛋白質合成系を利用することで、ランダム変異誘発された蛋白質群がリボゾーム上に提示されたライブラリーを得ることができる（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ ＬＣ， ｅｔ ａｌ． （１９９４年） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９1巻１９号，９０２２－９０２９頁）。
【0102】
核酸ディスプレイは、ｍＲＮＡディスプレイともよばれ、例えば、チロシルｔＲＮＡの３’末端に類似の構造をもつピューロマイシン等のリンカーを用いることで、所望の蛋白質、それをコードするｍＲＮＡ及びリボゾームが連結した分子を合成する技術である。当該技術は生細胞ではなく、無細胞蛋白質合成系を利用するため、試験管内で合成することが可能である。ある蛋白質の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にランダ
ム変異を誘発して得られるｍＲＮＡ群とピューロマイシン等のリンカー、及び、無細胞蛋白質合成系を利用することで、ランダム変異誘発された蛋白質群がリボゾーム上に提示されたライブラリーを得ることができる（Ｎｅｍｏｔｏ Ｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４１４巻２号，４０５－４０８頁）。
ム変異を誘発して得られるｍＲＮＡ群とピューロマイシン等のリンカー、及び、無細胞蛋白質合成系を利用することで、ランダム変異誘発された蛋白質群がリボゾーム上に提示されたライブラリーを得ることができる（Ｎｅｍｏｔｏ Ｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９７年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４１４巻２号，４０５－４０８頁）。
【0103】
リボゾームディスプレイや核酸ディスプレイ等の無細胞合成系を介して得られる、ペプチドを発現しているライブラリーは、標的分子の存在下で保温するか、又は、標的分子と接触させることができる。例えば、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及び／若しくはＫＬＫ８が固相化された担体を、ライブラリーを含む移動相と一定時間保温した後、移動相を担体から分離し、次いで担体を洗浄することにより非特異的な吸着物及び結合物を除去し、担体（に結合したＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及び／若しくはＫＬＫ８）に結合したペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物を、溶出により回収することができる。溶出は、相対的に高いイオン強度、低いｐＨ、中程度の変性条件、カオトロピック塩の存在下等で、非選択的に行うか、又は、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、ＫＬＫ８等の可溶性の標的分子、標的分子に結合する抗体、天然のリガンド、基質等を添加して固相化された標的分子と競合させることにより選択的に行うことができる。非特異的な吸着物部位及び／又は結合部位は、例えば、ブロッキング処理することも可能であり、ブロッキング工程も適切な方法であれば組み入れられ得る。
【0104】
そのようにして得られたペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物を発現している核酸を回収し、ｍＲＮＡの場合はｃＤＮＡに逆転写反応後にヌクレオチド配列を決定し、該ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列を決定することができる。また、回収した核酸からｍＲＮＡを転写し、上述の操作をサイクルとして１回乃至数回繰り返すことにより、標的分子に結合するペプチド集合物をより高度に濃縮することができる。
【0105】
ペプチド、ペプチドの集合物又は濃縮されたペプチド集合物に予めアフィ二ティー・タグをコンジュゲートさせておけば、効率的に当該ペプチド又はそれらの集合物を精製することができる。例えば、プロテアーゼの基質をタグとして予めペプチド集合物にコンジュゲートさせておけば、該プロテアーゼ活性により切断することにより、ペプチドを溶出することができる。
【0106】
得られた配列情報及びペプチドの機能等に基づき、得られたクローン又はライブラリーにさらなる変異を誘発させ、変異が導入されたライブラリーから、その機能（例えば、ＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性）、物性（熱安定性、保存安定性等）、体内動態（分布、血中半減期）等が改善されたペプチドを取得することも可能である。
【0107】
得られたペプチドが、ＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有しているか否かを決定することにより、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドをそれぞれ同定することができる。
【0108】
また、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、好適には、野生型ＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列に含まれる１６番Ｓｅｒ乃至３０番Ｖａｌからなるループ構造、３１番Ｃｙｓ及び３２番Ｇｌｙからなるβストランド（１）並びに５７番Ｉｌｅ乃至５９番Ａｒｇからなるβストランド（２）から構成されるβシート、並びに、４１Ｇｌｕ番アミノ酸乃至５１番Ｇｌｙからなるαへリックス、又は、それらに類似するか若しくはそれら（の位置）に少なくとも部分的に対応するループ構造、βシート、αへリックス等から構成される立体構造が、ＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性をそれぞれ発揮し得る程度に、維持され得る。かかる立体構造（全体の構造又は部分構造）を指標の一部として、より好適なＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドを同定することも可能である。
【0109】
４．ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドをコードする核酸分子、それを含むベクター、それらを含む細胞、並びに、組換え型ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの製造方法
【0110】
本発明は、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（以下、それぞれ「ＫＬＫ１阻害ペプチドをコードする核酸分子」、「ＫＬＫ４阻害ペプチドをコードする核酸分子」又は「ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドをコードする核酸分子」という）、該遺伝子が挿入された組換えベクター、該遺伝子もしくはベクターが導入された細胞（以下、「ＫＬＫ１阻害ペプチドをコードする核酸分子含有細胞」、「ＫＬＫ４阻害ペプチドをコードする核酸分子含有細胞」又は「ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドをコードする核酸分子含有細胞」という）、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドを産生する細胞（以下、それぞれ「ＫＬＫ１阻害ペプチド産生細胞」、「ＫＬＫ４ペプチド阻害ペプチド産生細胞」又は「ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド産生細胞」という）をも提供する。
【0111】
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチドをコードする核酸分子、ＫＬＫ４阻害ペプチドをコードする核酸分子、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドをコードする核酸分子の好適な例として、それぞれ次の（ａ１）乃至（ａ４）、（ｂ１）乃至（ｂ４）又は（ｃ１）乃至（ｃ４）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列（以下、それぞれ「ＫＬＫ１阻害ペプチドのヌクレオチド配列」、「ＫＬＫ４阻害ペプチドのヌクレオチド配列」若しくは「ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドのヌクレオチド配列」という）を含んでなるか、ＫＬＫ１阻害ペプチドのヌクレオチド配列、ＫＬＫ４阻害ペプチドのヌクレオチド配列若しくはＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドのヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列からなるか、又は、ＫＬＫ１阻害ペプチドのヌクレオチド配列、ＫＬＫ４阻害ペプチドのヌクレオチド配列若しくはＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドのヌクレオチド配列からなるものをあげることができる：
（ａ１）配列番号５乃至８（図１１乃至１４）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ａ２）（ａ１）に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ１阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ａ３）（ａ１）に記載のヌクレオチド配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ１阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；及び、
（ａ４）（ａ１）に記載のヌクレオチド配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ１阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列：
（ｂ１）配列番号５乃至８（図１１乃至１４）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ２）（ｂ１）に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ３）（ｂ１）に記載のヌクレオチド配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃
至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；及び、
（ｂ４）（ｂ１）に記載のヌクレオチド配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列：
（ｃ１）配列番号１３乃至２２（図１９乃至２８）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ２）（ｃ１）に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ３）（ｃ１）に記載のヌクレオチド配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；及び、
（ｃ４）（ｃ１）に記載のヌクレオチド配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
（ａ１）配列番号５乃至８（図１１乃至１４）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ａ２）（ａ１）に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ１阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ａ３）（ａ１）に記載のヌクレオチド配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ１阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；及び、
（ａ４）（ａ１）に記載のヌクレオチド配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ１阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列：
（ｂ１）配列番号５乃至８（図１１乃至１４）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ２）（ｂ１）に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ３）（ｂ１）に記載のヌクレオチド配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃
至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；及び、
（ｂ４）（ｂ１）に記載のヌクレオチド配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ４阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列：
（ｃ１）配列番号１３乃至２２（図１９乃至２８）のいずれか一つで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ２）（ｃ１）に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ３）（ｃ１）に記載のヌクレオチド配列において１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、又は１個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり、且つＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；及び、
（ｃ４）（ｃ１）に記載のヌクレオチド配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり、且つＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【0112】
上記（ａ１）乃至（ａ４）、（ｂ１）乃至（ｂ４）又は（ｃ１）乃至（ｃ４）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列からなるか又は該アミノ酸配列を含むＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドは、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８の有するプロテアーゼ活性を阻害し、好適には該プロテアーゼ活性を特異的に阻害する。
【0113】
しかしながら、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドをコードする核酸分子は（ａ１）乃至乃至（ａ４）、（ｂ１）乃至（ｂ４）又は（ｃ１）乃至（ｃ４）（ｄ）に限定されるものではなく、ＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有するＳＰＩＮＫ２変異体に含まれるアミノ酸配列、好適には配列番号２３（図２９）で示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子は遍くＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドをコードする核酸分子の範囲に包含される。
【0114】
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を設計するには、各アミノ酸に対応するコドンを１種又は２種以上使用することができる。そのため、あるペプチドが有する単一のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、複数のバリエーションを有し得る。かかるコドンの選択に際しては、該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入される、発現用の宿主細胞のコドン使用（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）に応じて適宜コドンを選択したり、複数のコドンの使用の頻度もしくは割合を適宜調節したりすることができる。例えば、大腸菌を宿主細胞として用いる場合は、大腸菌において使用頻度が高いコドンを使用してヌクレオチド配列を設計してもよい。
【0115】
ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドをコードする核酸分子は、１つ又は２つ以上の調節配列に機能的に連結されていてもよい。「機能的に連結される」とは、連結された核酸分子を発現させることができる、又は、該分子に含まれるヌクレオチド配列の発現を可能にする、ことを意味する。調節配列は、転写調節及び／又は翻訳調節に関する情報を含む配列エレメントを含む。調節配列は、種により様々であるが、一般に、プロモーターを含み、原核生物の－３５／－１０ボックス及びシャイン・ダルガノ配列、真核生物のＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴ配列、及び５’キャッピング配列等で例示される、転写及び翻訳の開始に関与する５’非コード配列を含む。かかる配列は、エンハンサーエレメント及び／又はリプレッサーエレメント、並びに宿主細胞内外の特定の区画へと天然型又は成熟型のペプチドを送達するための、翻訳され得るシグナル配列、リーダー配列等を含んでもよい。さらに、調節配列は３’非コード配列を含んでよく、かかる配列には、転写終結又はポリアデニル化等に関与するエレメントを含み得る。ただし、転写終結に関する配列が、特定の宿主細胞において充分に機能しない場合は、当該細胞に適した配列で置換され得る。
【0116】
プロモーター配列としては、原核生物ではｔｅｔプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、Ｔ７プロモーター等を、真核細胞ではＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等を例示することができる。
【0117】
ＫＬＫ１阻害ペプチドをコードする核酸分子、ＫＬＫ４阻害ペプチドをコードする核酸分子、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドをコードする核酸分子は、単離された形態、ベクターもしくは他のクローニングビヒクル（以下、単に「ベクター」という：プラスミド、ファージミド、ファージ、バキュロウイルス、コスミド等）中又は染色体中に含まれる形態であってよいが、それらの形態に限定されない。ベクターは、上記調節配列に加え、発現に使用される宿主細胞に適した複製配列及び制御配列、並びに形質転換等により核酸分子が導入された細胞を選択可能な表現型を与える選択マーカーを含んでいてもよい。
【0118】
ＫＬＫ１阻害ペプチドをコードする核酸分子、ＫＬＫ４阻害ペプチドをコードする核酸分子、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドをコードする核酸分子、及び、ＫＬＫ１阻害ペプチドのヌクレオチド配列を含むベクター、ＫＬＫ４阻害ペプチドのヌクレオチド配列を含むベクター、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドのヌクレオチド配列を含むベクターは、当該ペプチド又はヌクレオチド配列を発現可能な宿主細胞に形質転換等の当業者に公知の方法により導入することができる。該核酸分子又はベクターを導入された宿主細胞は、当該ペプチド又はヌクレオチド配列の発現に適した条件下で培養され得る。宿主細胞は、原核及び真核のいずれでもよく、原核では大腸菌、枯草菌等、真核ではサッカロミセス・セレヴィシエ、ピキア・パストリス等の酵母、ＳＦ９、Ｈｉｇｈ５等の昆虫細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０等の動物細胞を例示することができる。真核細胞等を宿主細胞として用いることにより、発現した本発明のペプチドに所望の翻訳後修飾を施すことができる。翻訳後修飾としては、糖鎖等の官能基付加、ペプチド又は蛋白質の付加、アミノ酸の化学的性質の変換等を例示することができる。また、本発明のペプチドへの所望の修飾を人工的に施すことも可能である。そのようなペプチドの修飾体も、本発明の「ペプチド」の範囲に包含される。
【0119】
本発明はＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの製造方法をも提供する。当該方法には、ＫＬＫ１阻害ペプチドをコードする核酸分子含有細胞若しくはＫＬＫ１阻害ペプチド産生細胞、ＫＬＫ４阻害ペプチドをコードする核酸分子含有細胞もしくはＫＬＫ４阻害ペプチド産生細胞、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドをコードする核酸分子含有細胞もしくはＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド産生細胞を培養する工程１、及び／又は、工程１で得られた培養物からＳＰＩＮＫ２変異体を回収する工程２が含まれる。工程２には、当業者に公知の分画、クロマトグラフィー、精製等の操作を適用することができ、例えば、後述する本発明の抗体を利用したアフィニティー・クロマトグラフィーによる精製が適用可能である。
【0120】
本発明の一部の態様において、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、
ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、分子内ジスルフィド結合を有する。分子内ジスルフィド結合を有するペプチドは、シグナル配列等を用いて、酸化性の酸化還元環境を有する細胞区間に送達させることが好ましい場合がある。酸化性環境は、大腸菌等のグラム陰性細菌の周辺質、グラム陽性細菌の細胞外環境、真核細胞の小胞体内腔等により提供することが可能であり、かかる環境下では、構造的なジスルフィド結合の形成が促進され得る。また、大腸菌等の宿主細胞の細胞質において分子内ジスルフィド結合を有するペプチドを作製することも可能であり、その場合ペプチドは、可溶性の折り畳まれた状態で直接的に獲得されるか、又は封入体の形態で回収され、次いでイン・ビトロで復元され得る。さらに、酸化性の細胞内環境を有する宿主細胞を選択し、その細胞質において分子内ジスルフィド結合を有するペプチドを作製することもできる。一方、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドが分子内ジスルフィド結合を有さない場合は、還元性の酸化還元環境を有する細胞区間、例えば、グラム陰性細菌の細胞質において作製され得る。
ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、分子内ジスルフィド結合を有する。分子内ジスルフィド結合を有するペプチドは、シグナル配列等を用いて、酸化性の酸化還元環境を有する細胞区間に送達させることが好ましい場合がある。酸化性環境は、大腸菌等のグラム陰性細菌の周辺質、グラム陽性細菌の細胞外環境、真核細胞の小胞体内腔等により提供することが可能であり、かかる環境下では、構造的なジスルフィド結合の形成が促進され得る。また、大腸菌等の宿主細胞の細胞質において分子内ジスルフィド結合を有するペプチドを作製することも可能であり、その場合ペプチドは、可溶性の折り畳まれた状態で直接的に獲得されるか、又は封入体の形態で回収され、次いでイン・ビトロで復元され得る。さらに、酸化性の細胞内環境を有する宿主細胞を選択し、その細胞質において分子内ジスルフィド結合を有するペプチドを作製することもできる。一方、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドが分子内ジスルフィド結合を有さない場合は、還元性の酸化還元環境を有する細胞区間、例えば、グラム陰性細菌の細胞質において作製され得る。
【0121】
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは、メリフィールド他のペプチド固相合成法、並びに、ｔ－ブトキシカルボニル（ｔ－Ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ：Ｂｏｃ）や９－フルオレニルメトキシカルボニル（９－Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ：Ｆｍｏｃ）等を利用した有機合成化学的ペプチド合成法により例示される化学合成、イン・ビトロ翻訳等の、他の当業者に公知の方法によっても製造することができる。
【0122】
本発明は、その一部の態様として、ＫＬＫ１阻害活性、ＫＬＫ４阻害活性、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性を有するＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに結合する抗体及びその結合断片を提供する。抗体は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれでもよく、モノクローナル抗体としては、免疫グロブリン又はそれに由来するものであれば特に限定されない。抗体の機能断片は、抗原結合活性すなわち該ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドへの結合活性を有している範囲において限定はなく、重鎖及び軽鎖の両方もしくは一方又はその断片、定常領域やＦｃ領域を欠くもの、他の蛋白質や標識用物質とのコンジュゲート体等も含まれる。かかる抗体及びその機能断片は、当業者に公知の方法により調製することができ、該ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドのアフィニティー・クロマトグラフィーによる精製、該ペプチドを含む医薬組成物又はその使用に関連した臨床検査、診断等における該ペプチドの検出、イムノアッセイ等に有用である。本発明の抗体は、該抗体が結合する本発明のペプチドを用いたアフィニティー・クロマトグラフィーにより精製することができる。
【0123】
５．医薬組成物
本発明はＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド、又は、そのコンジュゲートを含む医薬組成物をも提供する。
本発明はＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド、又は、そのコンジュゲートを含む医薬組成物をも提供する。
【0124】
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド又はそのコンジュゲートを含む医薬組成物は、ＫＬＫ１により惹起されるか又は増悪化され、ＫＬＫ１の発現又は機能を阻害又は抑制することにより、かかる惹起又は増悪化の抑制、治癒、症状の維持もしくは改善、二次性疾患の回避等し得る各種疾患（以下、「ＫＬＫ１に関わる疾患」又は「ＫＬＫ１関連疾患」という）の治療及び／又は予防に有用である。ＫＬＫ１に関わる疾患としては、例えば、低血圧等の心血管疾患、腎疾患、急性膵炎、気管支炎、喘息等をあげることができる。
【0125】
本発明のＫＬＫ４阻害ペプチド又はそのコンジュゲートを含む医薬組成物は、ＫＬＫ４により惹起されるか又は増悪化され、ＫＬＫ４の発現又は機能を阻害又は抑制することにより、かかる惹起又は増悪化の抑制、治癒、症状の維持もしくは改善、二次性疾患の回避等し得る各種疾患（以下、「ＫＬＫ４に関わる疾患」又は「ＫＬＫ４関連疾患」という）の治療及び／又は予防に有用である。ＫＬＫ４に関わる疾患としては、例えば、遺伝性エ
ナメル質形成不全症、前立腺がん等をあげることができる。
ナメル質形成不全症、前立腺がん等をあげることができる。
【0126】
本発明のＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド又はそのコンジュゲートを含む医薬組成物は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８により惹起されるか又は増悪化され、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８の発現又は機能を阻害又は抑制することにより、かかる惹起又は増悪化の抑制、治癒、症状の維持もしくは改善、二次性疾患の回避等し得る各種疾患（以下、「ＫＬＫ４／ＫＬＫ８に関わる疾患」又は「ＫＬＫ４／ＫＬＫ８関連疾患」という）の治療及び／又は予防に有用である。ＫＬＫ４／ＫＬＫ８に関わる疾患としては、例えば、遺伝性エナメル質形成不全症、前立腺がん、長期記憶の阻害、統合失調症、大腸がん、卵巣がん等をあげることができる。
【0127】
本発明において、ＫＬＫ８関連疾患（「ＫＬＫ８に関わる疾患」ともいう）とは、ＫＬＫ８により惹起されるか又は増悪化され、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８の発現又は機能を阻害又は抑制することにより、かかる惹起又は増悪化の抑制、治癒、症状の維持もしくは改善、二次性疾患の回避等し得る各種疾患を意味し、例えば、長期記憶の阻害、統合失調症、大腸がん、卵巣がん等をあげることができる。
【0128】
但し、ＫＬＫ１に関わる疾患、ＫＬＫ４に関わる疾患、及び、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８に関わる疾患は、ここに例示された疾患に限定されるものではない。
【0129】
本発明の医薬組成物には、治療又は予防に有効な量のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドと薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含有せしめることができる。
【0130】
「治療又は予防に有効な量」とは、特定の疾患、投与形態及び投与経路につき治療又は予防効果を奏する量を意味し、「薬理学的に有効な量」と同義である。
【0131】
本発明の医薬組成物には、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、該組成物又はそれに含まれるペプチド、コンジュゲート等の安定性、溶解性、徐放性、吸収性、浸透性、剤型、強度、性状、形状等を変化させたり、維持したり、保持したりするための物質（以下、「製剤用の物質」という）を含有せしめることができる。製剤用の物質としては、薬理学的に許容される物質であれば特に限定されるものではない。例えば、非毒性又は低毒性であることは、製剤用の物質が好適に具備する性質である。
【0132】
製剤用の物質として、例えば、以下のものをあげることができるが、これらに限定されるものではない；グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素ナトリウム、トリス－塩酸（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β－シクロデキストリンやヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノース又はデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類やグルコース、マンノースやデキストリン等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール等の溶媒、マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール、懸濁剤、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルビテート２０やポリソルビテート８０等のポリソルビテート、トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン（ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、レシチン又はコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトールやソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、希釈剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤。
【0133】
これらの製剤用の物質の添加量は、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの重量に対して０．００１乃至１０００倍、好適には０．０１乃至１００倍、より好適には０．１乃至１０倍である。
【0134】
ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドをリポソーム中に含有せしめたもの、該ペプチドとリポソームとが結合してなる修飾体を含有する医薬組成物も、本発明の医薬組成物に含まれる。
【0135】
賦形剤や担体は、通常液体又は固体であり、注射用の水、生理食塩水、人工脳脊髄液、その他の、経口投与又は非経口投与用の製剤に用いられる物質であれば特に限定されない。生理食塩水としては、中性のもの、血清アルブミンを含むもの等をあげることができる。
【0136】
緩衝剤としては、医薬組成物の最終ｐＨが７．０乃至８．５になるように調製されたＴｒｉｓバッファー、同じく４．０乃至５．５になるように調製された酢酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたクエン酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたヒスチジンバッファー等を例示することができる。
【0137】
本発明の医薬組成物は、固体、液体、懸濁液等である。本発明の別の医薬組成物の例として、凍結乾燥製剤をあげることができる。凍結乾燥製剤を成型するには、スクロース等の賦形剤を用いることができる。
【0138】
本発明の医薬組成物の投与経路としては、点眼、経腸投与、局所投与及び非経口投与のいずれでもよく、例えば、結膜上への点眼、硝子体内投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与、骨内投与、関節内投与等をあげることができる。
【0139】
かかる医薬組成物の組成は、投与方法、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドのＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８に対する阻害活性、結合親和性等に応じて決定することができる。本発明の阻害ペプチドの標的に阻害活性が強い（ＩＣ５０値が小さい）か又は親和性が高い（ＫＤ値が小さい）ほど、少ない投与量でその薬効を発揮し得る。
【0140】
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの投与量は、薬理学的に有効な量であれば限定されず、個体の種、疾患の種類、症状、性別、年齢、持病、該ペプチドの標的に対する阻害活性、結合親和性、その他の要素に応じて適宜決定することができるが、通常、０．０１乃至１０００ｍｇ／ｋｇ、好適には０．１乃至１００ｍｇ／ｋｇを、１乃至１８０日間に１回、又は１日２回若しくは３回以上投与することができる。
【0141】
医薬組成物の形態としては、注射剤（凍結乾燥製剤、点滴剤を含む）、坐剤、経鼻型吸収製剤、経皮型吸収製剤、舌下剤、カプセル、錠剤、軟膏剤、顆粒剤、エアーゾル剤、丸剤、散剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、生体埋め込み型製剤等を例示することができる。
【0142】
ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドを有効成分として含む医薬組成物は、他の医薬と同時に又は別個に投与することができ
る。例えば、他の医薬を投与した後にＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドを有効成分として含む医薬組成物を投与するか、かかる医薬組成物を投与した後に、他の医薬を投与するか、又は、当該医薬組成物と他の医薬とを同時に投与してもよい。同時に投与する場合、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドと他の医薬とは、単一の製剤、及び、別々の製剤（複数の製剤）、のいずれに含有されてもよい。
る。例えば、他の医薬を投与した後にＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドを有効成分として含む医薬組成物を投与するか、かかる医薬組成物を投与した後に、他の医薬を投与するか、又は、当該医薬組成物と他の医薬とを同時に投与してもよい。同時に投与する場合、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドと他の医薬とは、単一の製剤、及び、別々の製剤（複数の製剤）、のいずれに含有されてもよい。
【0143】
それらの他の医薬は、１つの場合もあり、２つ、３つあるいはそれ以上を投与するか又は受けることもできる。それらをまとめて本発明の医薬組成物と「他の医薬との併用」又は「他の医薬との組み合わせ」と呼び、本発明のペプチド又はそのコンジュゲートに加えて他の医薬を含むか又は他の療法と組み合わせて使用される本発明の医薬組成物も「他の医薬との併用」又は「他の医薬との組み合わせ」の態様として本発明に含まれる。
【0144】
本発明は、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドを投与する工程を含む、ＫＬＫ１に関わる疾患、ＫＬＫ４に関わる疾患、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８に関わる疾患の治療方法又は予防方法、該疾患の治療用又は予防用医薬組成物を調製するための本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの使用、該疾患の治療又は予防のための該ペプチドの使用、をも提供する。該ペプチドを含む治療用又は予防用キットも本発明に含まれる。
【0145】
さらに、本発明は、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド又はそのコンジュゲートの有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、又は、該ポリヌクレオチドもしくは該ベクターを含むか又は本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド又はそのコンジュゲートを発現する細胞を含む医薬組成物をも提供する。例えば、かかるポリヌクレオチド及びベクターはＫＬＫ１に関わる疾患、ＫＬＫ４に関わる疾患、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８に関わる疾患の遺伝子治療に、かかる細胞はＫＬＫ１に関わる疾患、ＫＬＫ４に関わる疾患、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８に関わる疾患の細胞治療に、それぞれ公知の手法を用いて適用することができる。また、例えば、かかるポリヌクレオチド又はベクターを、自家細胞又は他家細胞（同種細胞）に導入することにより、細胞治療用の細胞を調製することができる。そのようなポリヌクレオチド及びベクターは、細胞治療薬調製用の組成物としても、本発明に包含される。しかしながら、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、細胞等を含む医薬組成物の態様は上記のものに限定されない。
【0146】
６．診断用組成物
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド、又はそのコンジュゲートを含む検査用又は診断用組成物（以下、まとめて「診断用組成物」という）を提供する。
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド、又はそのコンジュゲートを含む検査用又は診断用組成物（以下、まとめて「診断用組成物」という）を提供する。
【0147】
本発明の診断用組成物は、ＫＬＫ１に関わる疾患、ＫＬＫ４に関わる疾患、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８に関わる疾患、ＫＬＫ１発現、ＫＬＫ４発現、ＫＬＫ８発現等の検査又は診断に有用である。本発明において検査又は診断には、例えば、罹患リスクの判定又は測定、罹患の有無の判定、進行や増悪化の程度の測定、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドを含む医薬組成物による薬物治療の効果の測定又は判定、薬物治療以外の治療の効果の測定又は判定、再発リスクの測定、再発の有無の判定等が含まれるが、検査又は診断であればそれらに限定されるものではない。
【0148】
本発明の診断用組成物は、本発明のペプチド又はそのコンジュゲート、それらを含む組
成物、それらを含む医薬組成物を投与する個体の同定に有用である。
成物、それらを含む医薬組成物を投与する個体の同定に有用である。
【0149】
かかる診断用組成物には、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調節剤、塩類、安定化剤、防腐剤、顕色剤、増感剤、凝集防止剤等を含有せしめることができる。
【0150】
本発明はＫＬＫ１に関わる疾患、ＫＬＫ４に関わる疾患、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８に関わる疾患の検査方法又は診断方法、該疾患の診断用組成物を調製するための本発明のペプチドの使用、該疾患の検査又は診断のための本発明のペプチドの使用、をも提供する。本発明のペプチドを含む検査又は診断用キットも本発明に含まれる。
【0151】
本発明のペプチドを含む検査又は診断の方法としてはサンドウィッチＥＬＩＳＡが望ましいが、通常のＥＬＩＳＡ法やＲＩＡ法、ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ
ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ）法、ドットブロット法、オクタロニー法、ＣＩＥ（Ｃｏｕｎｔｅｒｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法、ＣＬＩＡ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）、ＦＣＭ（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）等の検出方法が利用可能である。検出には抗体や本発明のペプチドもしくはそのコンジュゲート等を標識したものが利用される。標識法としてはビオチンのほか、ＨＲＰ、アルカリフォスファターゼ、ＦＩＴＣ等の発蛍光団、放射性同位元素等のラベル等生化学的解析に実施可能な標識法が利用できる。酵素標識を利用した検出にはＴＭＢ（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＢＣＩＰ（５－ｂｒｏｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ－３－ｉｎｄｏｌｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｐ－ＮＰＰ（ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＯＰＤ（ｏ－Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（３－Ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等の発色基質やＱｕａｎｔａＢｌｕ（登録商標） Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）蛍光基質のほか、化学発光基質を用いることができる。本測定には、ヒト又は非ヒト動物由来の試料に加え、組換え蛋白質等の人工的な処理を加えた試料をも供することができる。生物個体由来の被検試料としては、例えば、血液、関節液、腹水、リンパ液、脳脊髄液、肺胞洗浄液、唾液、痰、組織ホモジネート上清、組織切片等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。
ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ）法、ドットブロット法、オクタロニー法、ＣＩＥ（Ｃｏｕｎｔｅｒｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法、ＣＬＩＡ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏ ａｓｓａｙ）、ＦＣＭ（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）等の検出方法が利用可能である。検出には抗体や本発明のペプチドもしくはそのコンジュゲート等を標識したものが利用される。標識法としてはビオチンのほか、ＨＲＰ、アルカリフォスファターゼ、ＦＩＴＣ等の発蛍光団、放射性同位元素等のラベル等生化学的解析に実施可能な標識法が利用できる。酵素標識を利用した検出にはＴＭＢ（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＢＣＩＰ（５－ｂｒｏｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ－３－ｉｎｄｏｌｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｐ－ＮＰＰ（ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＯＰＤ（ｏ－Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（３－Ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ－６－ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等の発色基質やＱｕａｎｔａＢｌｕ（登録商標） Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）蛍光基質のほか、化学発光基質を用いることができる。本測定には、ヒト又は非ヒト動物由来の試料に加え、組換え蛋白質等の人工的な処理を加えた試料をも供することができる。生物個体由来の被検試料としては、例えば、血液、関節液、腹水、リンパ液、脳脊髄液、肺胞洗浄液、唾液、痰、組織ホモジネート上清、組織切片等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。
【0152】
本発明のペプチドを含む検査又は診断用のサンドウィッチＥＬＩＳＡキットには、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの蛋白質標準液、発色試薬、希釈用緩衝液、固相用蛋白質、検出用蛋白質、並びに洗浄液等が含まれてよい。抗原に結合した蛋白質量を測定する方法としては、吸光法、蛍光法、発光法、ＲＩ（Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ）法等が好適に適用され、測定には、吸光プレートリーダー、蛍光プレートリーダー、発光プレートリーダー、ＲＩ液体シンチレーションカウンター等が好適に使用される。
【0153】
また、免疫沈降法を利用した方法でも検査又は診断が可能である。
【0154】
また、本発明は被検サンプル中のＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８を検出又は測定する方法を提供する。これらの検出又は測定方法には、本発明の診断用組成物を使用することができる。ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド、又は、そのコンジュゲートを被検試料と接触させ（工程１）、次いで該ペプチドに結合したＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８の量又は測定を測定する（工程２）ことにより、該試料中のＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８を検出することができる。工程１としては、例えば、ＫＬＫ１阻害
ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドに免疫グロブリンのＦｃ領域をコンジュゲートしたものをプロテインＧを介して磁気ビーズに固相化し、そこに被検試料を添加する等、工程２としては、例えば、磁気ビーズを分離し、ビーズと共に沈殿した可溶性蛋白質をＳＤＳ－ＰＡＧＥやＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法で解析し、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８を検出する等をあげることができる。本測定には、ヒト又は非ヒト動物由来の試料に加え、組換え蛋白質等の人工的な処理を加えた試料をも供することができる。生物個体由来の被検試料としては、例えば、血液、関節液、腹水、リンパ液、脳脊髄液、肺胞洗浄液、唾液、痰、組織ホモジネート上清、組織切片等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。
ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドに免疫グロブリンのＦｃ領域をコンジュゲートしたものをプロテインＧを介して磁気ビーズに固相化し、そこに被検試料を添加する等、工程２としては、例えば、磁気ビーズを分離し、ビーズと共に沈殿した可溶性蛋白質をＳＤＳ－ＰＡＧＥやＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法で解析し、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８を検出する等をあげることができる。本測定には、ヒト又は非ヒト動物由来の試料に加え、組換え蛋白質等の人工的な処理を加えた試料をも供することができる。生物個体由来の被検試料としては、例えば、血液、関節液、腹水、リンパ液、脳脊髄液、肺胞洗浄液、唾液、痰、組織ホモジネート上清、組織切片等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。
【0155】
前記のＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８の検出は、イン・ビトロのみならず、イン・ビボでも実施することができる。画像診断の場合は、薬学的に許容可能な放射性核種や発光体で標識されたＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、もしくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド、又は、そのコンジュゲートを利用することができる。工程１としては、例えば、被験者に、標識された該ペプチドもしくはそのコンジュゲートを投与する、工程２としては、例えば、ＰＥＴ／ＣＴ等の画像診断技術を使用して画像を取り、活性型ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８の存在を判定又は検査する等をあげることができる。
【0156】
本発明の診断用組成物に含まれるペプチド又はそのコンジュゲートはＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８結合し、好適にはＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８特異的結合活性を有する。
【0157】
本発明の医薬組成物が投与される個体を同定する方法も本発明に包含される。かかる同定方法においては、該個体由来サンプル中のＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８を測定し、該サンプル中に、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８が検出されたか、又は、健常個体由来サンプル中に検出されたＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８の量と比較してより多くのＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８が検出された場合に、該個体を陽性と判定することができる。
当該方法には、本発明の診断用組成物を使用することができる。
当該方法には、本発明の診断用組成物を使用することができる。
【0158】
また、かかる同定方法の好適な一態様において、該個体はＫＬＫ１関連疾患、ＫＬＫ４関連疾患、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８関連疾患に罹患しているか又はそのリスクがある。
【0159】
さらに、本発明の医薬組成物は、その一態様において、かかる同定方法において陽性と判定された個体に投与され得る。
【0160】
７．ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８の分離法
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドペプチドは、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８に特異的な結合活性を有する。したがって、本発明の好適なＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド又はそのコンジュゲートを用いて、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８と他のＫＬＫが混在した試料中から、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８を特異的に分離することができる。ペプチドからのＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８の遊離は、相対的に高いイオン強度、低いｐＨ、中程度の変性条件、カオトロピック塩の存在下等で、非選択的に行うことができるが、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８のプロテアーゼ活性を減弱させない範囲で行うことが好ましい。
本発明のＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドペプチドは、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８に特異的な結合活性を有する。したがって、本発明の好適なＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、若しくは、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド又はそのコンジュゲートを用いて、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８と他のＫＬＫが混在した試料中から、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８を特異的に分離することができる。ペプチドからのＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８の遊離は、相対的に高いイオン強度、低いｐＨ、中程度の変性条件、カオトロピック塩の存在下等で、非選択的に行うことができるが、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又は、ＫＬＫ４及びＫＬＫ８のプロテアーゼ活性を減弱させない範囲で行うことが好ましい。
【実施例】
【0161】
[実施例１]
ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、ＫＬＫ８の調製
（１－１）ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、ＫＬＫ８発現ベクターの構築
ｐｒｏ－ＫＬＫ１（配列番号２：図８，ＵｎｉＰｒｏｔ；Ｐ０６８７０）をコードするヌクレオチド配列、ｐｒｏ－ＫＬＫ４（配列番号３：図９，ＵｎｉＰｒｏｔ；Ｑ９Ｙ５Ｋ２）をコードするヌクレオチド配列、ｐｒｏ－ＫＬＫ８（配列番号４：図１０、ＵｎｉＰｒｏｔ；Ｏ６０２５９）をコードするヌクレオチド配列を鋳型として、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたオーバーラップＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ３０秒）×３０サイクル）により各断片をそれぞれ増幅し、各遺伝子のＣ末端にＨｉｓ ｔａｇを付加した哺乳細胞発現ベクターｐＣＭＡ＿ｐｒｏ－ＫＬＫ１、ｐＣＭＡ＿ｐｒｏ－ＫＬＫ４、ｐＣＭＡ＿ｐｒｏ－ＫＬＫ８を構築した。
ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、ＫＬＫ８の調製
（１－１）ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、ＫＬＫ８発現ベクターの構築
ｐｒｏ－ＫＬＫ１（配列番号２：図８，ＵｎｉＰｒｏｔ；Ｐ０６８７０）をコードするヌクレオチド配列、ｐｒｏ－ＫＬＫ４（配列番号３：図９，ＵｎｉＰｒｏｔ；Ｑ９Ｙ５Ｋ２）をコードするヌクレオチド配列、ｐｒｏ－ＫＬＫ８（配列番号４：図１０、ＵｎｉＰｒｏｔ；Ｏ６０２５９）をコードするヌクレオチド配列を鋳型として、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたオーバーラップＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ３０秒）×３０サイクル）により各断片をそれぞれ増幅し、各遺伝子のＣ末端にＨｉｓ ｔａｇを付加した哺乳細胞発現ベクターｐＣＭＡ＿ｐｒｏ－ＫＬＫ１、ｐＣＭＡ＿ｐｒｏ－ＫＬＫ４、ｐＣＭＡ＿ｐｒｏ－ＫＬＫ８を構築した。
【0162】
（１－２）ｐｒｏ－ＫＬＫ１、ｐｒｏ－ＫＬＫ４、ｐｒｏ－ＫＬＫ８の発現精製
（１－１）で構築した発現ベクターは、ＰＥＩ ＭＡＸ ４００００（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にトランスフェクションし、培養３日後に培養上清を回収した。ＨｉｓＴｒａｐ ｅｘｃｅｌ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて培養上精から所望のＨｉｓ ｔａｇ融合タンパク質を回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ＮＭＷＬ １０，０００（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳにバッファー交換することで、ｐｒｏ－ＫＬＫ１、ｐｒｏ－ＫＬＫ４、ｐｒｏ－ＫＬＫ８をそれぞれ精製した。
（１－１）で構築した発現ベクターは、ＰＥＩ ＭＡＸ ４００００（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にトランスフェクションし、培養３日後に培養上清を回収した。ＨｉｓＴｒａｐ ｅｘｃｅｌ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて培養上精から所望のＨｉｓ ｔａｇ融合タンパク質を回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ＮＭＷＬ １０，０００（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳにバッファー交換することで、ｐｒｏ－ＫＬＫ１、ｐｒｏ－ＫＬＫ４、ｐｒｏ－ＫＬＫ８をそれぞれ精製した。
【0163】
（１－３）ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、ＫＬＫ８の調製
ＫＬＫ活性化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，ｐＨ７．５）で調製した２００μｇ／ｍＬのｐｒｏ－ＫＬＫ１に等量の２μｇ／ｍＬのｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎを添加し、３７℃で一定時間反応後、２０ｍＭ
１，１０－ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅを等量混合することで活性化ＫＬＫ１を調製した。同様に、ＫＬＫ活性化バッファーで調製した２００μｇ／ｍＬのｐｒｏ－ＫＬＫ４またはｐｒｏ－ＫＬＫ８に等量の８μｇ／ｍＬ Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎを添加し、３７°Ｃで一定時間反応させた後、２０ｍＭ １，１０－ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅを等量混合することで活性化ＫＬＫ４またはＫＬＫ８を調製した。
ＫＬＫ活性化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ２，ｐＨ７．５）で調製した２００μｇ／ｍＬのｐｒｏ－ＫＬＫ１に等量の２μｇ／ｍＬのｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎを添加し、３７℃で一定時間反応後、２０ｍＭ
１，１０－ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅを等量混合することで活性化ＫＬＫ１を調製した。同様に、ＫＬＫ活性化バッファーで調製した２００μｇ／ｍＬのｐｒｏ－ＫＬＫ４またはｐｒｏ－ＫＬＫ８に等量の８μｇ／ｍＬ Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎを添加し、３７°Ｃで一定時間反応させた後、２０ｍＭ １，１０－ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅを等量混合することで活性化ＫＬＫ４またはＫＬＫ８を調製した。
【0164】
[実施例２]
ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの調製
（２－１）ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド発現ベクターの構築
ＳＰＩＮＫ２ ｓｃａｆｆｏｌｄを骨格としたＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド及びＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの発現ベクターを構築した。各阻害ペプチドのアミノ酸配列（配列番号５乃至２２：図１１乃至２８））をコードするヌクレオチド配列とヒトＳＰＩＮＫ２（配列番号１：図７）をコードするヌクレオチド配列を鋳型として、下記プライマーおよびＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ３０秒）×３０サイクル）により阻害ペプチド断片を増幅した。
プライマー１：５’－ＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＣＣＧＣＡＧＴＴＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＡＧ－３’（配列番号２４：図３０）
プライマー２：５’－ＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＧＧＡＣＣ－３’（配列番号２５：図３１）
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡ断片およびｐＥＴ ３２ａ（改変）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）およびＸｈｏＩ（ＮＥＢ）を用いて、３７℃で１時間以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により精製した。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）を用いて、精製した断片を１６℃で一晩反応させることでｌｉｇａｔｉｏｎ反応を実施した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ溶液は、大腸菌ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ）に添加し、氷上で３０分間静置した後、４２℃で４５秒の熱処理、さらに氷上で５分間静置し、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含む２ＹＴプレートに播種後、３７℃で一晩静置培養することで、大腸菌を形質転換した。翌日、形質転換した大腸菌を、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に植菌し、３７℃で一晩培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ ９６ Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを回収し、配列解析を実施することで「ｐＥＴ ３２ａ（改変）＿ＫＬＫ１阻害ペプチド」「ｐＥＴ ３２ａ（改変）＿ＫＬＫ４阻害ペプチド」「ｐＥＴ ３２ａ（改変）＿ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド」を構築した。
ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの調製
（２－１）ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド発現ベクターの構築
ＳＰＩＮＫ２ ｓｃａｆｆｏｌｄを骨格としたＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド及びＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの発現ベクターを構築した。各阻害ペプチドのアミノ酸配列（配列番号５乃至２２：図１１乃至２８））をコードするヌクレオチド配列とヒトＳＰＩＮＫ２（配列番号１：図７）をコードするヌクレオチド配列を鋳型として、下記プライマーおよびＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ３０秒）×３０サイクル）により阻害ペプチド断片を増幅した。
プライマー１：５’－ＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＣＣＧＣＡＧＴＴＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＡＧ－３’（配列番号２４：図３０）
プライマー２：５’－ＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＣＧＣＧＣＣＧＣＡＣＧＧＡＣＣ－３’（配列番号２５：図３１）
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡ断片およびｐＥＴ ３２ａ（改変）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）およびＸｈｏＩ（ＮＥＢ）を用いて、３７℃で１時間以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により精製した。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＮＥＢ）を用いて、精製した断片を１６℃で一晩反応させることでｌｉｇａｔｉｏｎ反応を実施した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ溶液は、大腸菌ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ）に添加し、氷上で３０分間静置した後、４２℃で４５秒の熱処理、さらに氷上で５分間静置し、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含む２ＹＴプレートに播種後、３７℃で一晩静置培養することで、大腸菌を形質転換した。翌日、形質転換した大腸菌を、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に植菌し、３７℃で一晩培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ ９６ Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを回収し、配列解析を実施することで「ｐＥＴ ３２ａ（改変）＿ＫＬＫ１阻害ペプチド」「ｐＥＴ ３２ａ（改変）＿ＫＬＫ４阻害ペプチド」「ｐＥＴ ３２ａ（改変）＿ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチド」を構築した。
【0165】
（２－２）ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、ＫＬＫ８阻害ペプチドの発現精製
（２－１）で構築したベクターでそれぞれ大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ （ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含む２ＹＴ培地を用いて３７℃で培養後、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加し、１６℃で一晩培養した。翌日、遠心分離（３，０００ｇ、２０分、４℃）により集菌後、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いてｌｙｓａｔｅを調製し、ＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＨｉｓ ｔａｇ融合目的蛋白質を精製した。次に、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いてｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｔａｇと所望の蛋白質とを切断し、ＴＡＬＯＮを用いて精製した。さらに、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ ＧＬ）に供することで、Ｎ末にＳ ｔａｇおよびリンカー（配列番号２６：図３２）、Ｃ末に６残基（配列番号２７：図３３）を含むＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドを精製した。
（２－１）で構築したベクターでそれぞれ大腸菌Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ （ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換し、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含む２ＹＴ培地を用いて３７℃で培養後、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加し、１６℃で一晩培養した。翌日、遠心分離（３，０００ｇ、２０分、４℃）により集菌後、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いてｌｙｓａｔｅを調製し、ＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＨｉｓ ｔａｇ融合目的蛋白質を精製した。次に、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いてｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ｔａｇと所望の蛋白質とを切断し、ＴＡＬＯＮを用いて精製した。さらに、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ ＧＬ）に供することで、Ｎ末にＳ ｔａｇおよびリンカー（配列番号２６：図３２）、Ｃ末に６残基（配列番号２７：図３３）を含むＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドを精製した。
【0166】
[実施例３]
各阻害ペプチドの評価
（３－１）ペプチド基質を用いた各阻害ペプチドのＫＬＫ１、ＫＬＫ４、及び、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性評価
基質ペプチドを１０ｍＭになるようＤＭＳＯで溶解し、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で希釈して終濃度１００μＭで使用した。Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈したＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又はＫＬＫ８と阻害ペプチドをそれぞれ２５μＬずつ混ぜ、３７℃で２０分反応させた後にＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈した基質を５０μＬ加えて、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光シグナル（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ）を測定した。各酵素と基質の組み合わせは以下の通り使用した。ＫＬＫ１阻害活性評価では終濃度１ｎＭのＫＬＫ１および終濃度１００μＭのＰＦＲ－ＡＭＣ（ＢＡＣＨＥＭ）を使用した。ＫＬＫ４阻害活性評価では終濃度１０ｎＭのＫＬＫ４および終濃度１００μＭのＢｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＫＬＫ８阻害活性評価では終濃度２０ｎＭのＫＬＫ８および終濃度１００μＭのＢｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。なお、各阻害ペプチドは終濃度１．８７５～１，０００ｎＭ、反応および測定にはプロテオセーブ（登録商標）ＳＳ９６Ｆ黒プレート（住友ベークライト株式会社）を使用した。
各阻害ペプチドの評価
（３－１）ペプチド基質を用いた各阻害ペプチドのＫＬＫ１、ＫＬＫ４、及び、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害活性評価
基質ペプチドを１０ｍＭになるようＤＭＳＯで溶解し、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で希釈して終濃度１００μＭで使用した。Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈したＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又はＫＬＫ８と阻害ペプチドをそれぞれ２５μＬずつ混ぜ、３７℃で２０分反応させた後にＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈した基質を５０μＬ加えて、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光シグナル（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ）を測定した。各酵素と基質の組み合わせは以下の通り使用した。ＫＬＫ１阻害活性評価では終濃度１ｎＭのＫＬＫ１および終濃度１００μＭのＰＦＲ－ＡＭＣ（ＢＡＣＨＥＭ）を使用した。ＫＬＫ４阻害活性評価では終濃度１０ｎＭのＫＬＫ４および終濃度１００μＭのＢｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。ＫＬＫ８阻害活性評価では終濃度２０ｎＭのＫＬＫ８および終濃度１００μＭのＢｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。なお、各阻害ペプチドは終濃度１．８７５～１，０００ｎＭ、反応および測定にはプロテオセーブ（登録商標）ＳＳ９６Ｆ黒プレート（住友ベークライト株式会社）を使用した。
【0167】
各濃度における各阻害ペプチドの基質ペプチド分解速度を算出し、阻害剤濃度０ｎＭの分解速度を１００％としてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ （ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した結果、いずれの阻害ペプチドも低濃度でＫＬＫ１、ＫＬＫ４、またはＫＬＫ８酵素活性を阻害することが明らかとなった（図２）。さらに、ＫＬＫ４阻害ペプチドについては、測定結果を非線形カーブフィッティングし、Ｍｏｒｒｉｓｏｎの式に従うことでＫｉ値を算出した（図３）。多くのＫＬＫ４阻害ペプチドおよびＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドは１ｎＭを下回るＫｉ値であり、強力な阻害剤であることが示された。尚、ＩＣ
５０およびＫｉ値を算出には、独立した３回の実験の平均値を使用した。
５０およびＫｉ値を算出には、独立した３回の実験の平均値を使用した。
【0168】
（３－２）各阻害ペプチドの特異性評価
基質ペプチドの切断を指標に、他のプロテアーゼに対する特異性を評価した。（３－１）に記載の方法と同様、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈したプロテアーゼとサンプル（終濃度１μＭ）をそれぞれ２５μＬずつ混ぜ、３７℃で２０分反応させた後にＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈した基質を５０μＬ加えて、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光シグナル（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ）を測定した。尚、プロテアーゼ活性評価にはＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）を用い、反応および測定にはプロテオセーブ（登録商標）ＳＳ９６Ｆ黒プレート（住友ベークライト株式会社）を使用した。特異性評価に用いたプロテアーゼおよび基質の組み合わせは以下の通り。
基質ペプチドの切断を指標に、他のプロテアーゼに対する特異性を評価した。（３－１）に記載の方法と同様、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈したプロテアーゼとサンプル（終濃度１μＭ）をそれぞれ２５μＬずつ混ぜ、３７℃で２０分反応させた後にＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈した基質を５０μＬ加えて、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光シグナル（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ）を測定した。尚、プロテアーゼ活性評価にはＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）を用い、反応および測定にはプロテオセーブ（登録商標）ＳＳ９６Ｆ黒プレート（住友ベークライト株式会社）を使用した。特異性評価に用いたプロテアーゼおよび基質の組み合わせは以下の通り。
【0169】
Ｂｏｖｉｎｅ α－ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ阻害活性評価；終濃度１０ｎＭ ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＬＳ００１４３４）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＳｕｃ－ＬＬＶＴ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１２０－ｖ）
【0170】
Ｈｕｍａｎ ｔｒｙｐｔａｓｅ阻害活性評価；終濃度１ｎＭ ｔｒｙｐｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ７０６３）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１０７－ｖ）
【0171】
Ｈｕｍａｎ ｃｈｙｍａｓｅ阻害活性評価；終濃度１００ｎＭ ｃｈｙｍａｓｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｃ８１１８）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＳｕｃ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１２０－ｖ）
【0172】
Ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍｉｎ阻害活性評価；終濃度５０ｎＭ Ｐｌａｓｍｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｐ１８６７）、終濃度１００μＭ基質 ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１０４－ｖ）
【0173】
Ｈｕｍａｎ ｔｈｒｏｍｂｉｎ阻害活性評価；終濃度１ｎＭ ｔｈｒｏｍｂｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ６８８４）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－ＶＰＲ－ＡＭＣ Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）
【0174】
Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ阻害活性；終濃度０．０２Ｕ／μＬ Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｌａｓｔａｓｅ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＳｕｃ（ＯＭｅ）－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－ＭＣＡ株式会社ペプチド研究所；３１５３－ｖ）
【0175】
Ｈｕｍａｎ ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ阻害活性評価；終濃度１ｎＭ ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｅ３９４６－ＳＥ）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－ＱＡＲ－ＡＭＣ Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＥＳ０１４）
【0176】
Ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ阻害活性評価；終濃度１００ｎＭ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｐ２２００）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１１２－ｖ）
【0177】
Ｈｕｍａｎ ｔＰＡ阻害活性評価；終濃度１０ｎＭ ｔＰＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ０８３１）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＰｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１４５－ｖ）
【0178】
Ｈｕｍａｎ ｕＰＡ阻害活性評価；終濃度１０ｎＭ ｕＰＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ０８３１）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＰｙｒ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３１４５－ｖ）
【0179】
Ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ阻害活性評価；終濃度０．１２５μｇ／ｍｌ ｐｌａｓｍａ ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｔ０８３１）、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＺ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＭＣＡ（株式会社ペプチド研究所；３０９５－ｖ）
【0180】
Ｈｕｍａｎ ＨＴＲＡ２阻害活性評価；終濃度２００ｎＭ ＨＴＲＡ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ；１４５８－ＨＴ）、終濃度５０μＭ 基質ペプチドＨ２－Ｏｐｔ（株式会社ペプチド研究所）
ｔｅｍｓ；１４５８－ＨＴ）、終濃度５０μＭ 基質ペプチドＨ２－Ｏｐｔ（株式会社ペプチド研究所）
【0181】
（３－１）と同様、ペプチド基質の分解を指標にＫＬＫ１、ＫＬＫ４、またはＫＬＫ８以外のプロテアーゼへの交差性を評価した。一部の阻害剤はＣｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎやＰｌａｓｍｉｎなどに対して阻害剤の終濃度１ｕＭで弱く交差性を示したが、多くの阻害剤はいずれのプロテアーゼに対しても各阻害ペプチドはプロテアーゼ活性を抑制せず、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、又はＫＬＫ４及びＫＬＫ８に対して特異的な阻害作用を有することが示された（図４）。
【0182】
[実施例４]
ＫＬＫ４阻害ペプチドの結合親和性
Ｓｉｎｇｌｅ ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓによるＫＬＫ４阻害ペプチドの結合親和性を測定するため、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ ２００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて表面プラズモン共鳴分析を実施した。一本鎖ＤＮＡが固定化されたＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＡＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、ストレプトアビジンコンジュゲートの相補鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションでキャプチャーさせた。次に、ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてビオチン化したＫＬＫ４を流速１０μＬ／ｍｉｎでキャプチャーさせることで、約５ＲＵを固定化した。その後、ＨＢＳ－ＥＰで３倍段階希釈したＫＬＫ４阻害ペプチド（０．０８～２０ｎＭ）をアナライトとして流速１０μＬ／ｍｉｎで添加した。ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）を用いて解析し、ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ－ｔｏ－ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌを用いてｋｏｎおよびｋｏｆｆを算出した。尚、平衡定数ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率として算出した。さらに、Ｂｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）付属のＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒでＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＡＰを再生し、ビオチン化ＫＬＫ４を繰り返しキャプチャーさせることで、複数のＫＬＫ４阻害ペプチドを測定した。測定した３つのＫＬＫ４阻害ペプチドはいずれも１ｎＭを下回るＫＤ値を示しており、非常に強い結合力であることが明らかとなった（図５）。
ＫＬＫ４阻害ペプチドの結合親和性
Ｓｉｎｇｌｅ ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓによるＫＬＫ４阻害ペプチドの結合親和性を測定するため、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ ２００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて表面プラズモン共鳴分析を実施した。一本鎖ＤＮＡが固定化されたＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＡＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、ストレプトアビジンコンジュゲートの相補鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションでキャプチャーさせた。次に、ＥＺ－Ｌｉｎｋ ＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてビオチン化したＫＬＫ４を流速１０μＬ／ｍｉｎでキャプチャーさせることで、約５ＲＵを固定化した。その後、ＨＢＳ－ＥＰで３倍段階希釈したＫＬＫ４阻害ペプチド（０．０８～２０ｎＭ）をアナライトとして流速１０μＬ／ｍｉｎで添加した。ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）を用いて解析し、ｓｉｍｐｌｅ ｏｎｅ－ｔｏ－ｏｎｅ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌを用いてｋｏｎおよびｋｏｆｆを算出した。尚、平衡定数ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率として算出した。さらに、Ｂｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）付属のＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒでＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＡＰを再生し、ビオチン化ＫＬＫ４を繰り返しキャプチャーさせることで、複数のＫＬＫ４阻害ペプチドを測定した。測定した３つのＫＬＫ４阻害ペプチドはいずれも１ｎＭを下回るＫＤ値を示しており、非常に強い結合力であることが明らかとなった（図５）。
【0183】
[実施例５]
ＫＬＫ４／ＫＬＫ４阻害ペプチド複合体のＸ線結晶構造解析
（５－１）ＫＬＫ４／ＫＬＫ４阻害ペプチド複合体の調製
（１－３）および（２－２）に記載した方法に従って、ＫＬＫ４およびＫ４１０４３（配列番号１９：図２５）で示されるアミノ酸配列を有するＫＬＫ４阻害ペプチドをそれぞれ調製した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０の条件下で両者を混合後、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ）により複合体を単離精製した。
ＫＬＫ４／ＫＬＫ４阻害ペプチド複合体のＸ線結晶構造解析
（５－１）ＫＬＫ４／ＫＬＫ４阻害ペプチド複合体の調製
（１－３）および（２－２）に記載した方法に従って、ＫＬＫ４およびＫ４１０４３（配列番号１９：図２５）で示されるアミノ酸配列を有するＫＬＫ４阻害ペプチドをそれぞれ調製した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０の条件下で両者を混合後、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ）により複合体を単離精製した。
【0184】
（５－２）Ｘ線結晶構造解析
（５－１）で調製した複合体溶液を３０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、終濃度１６．７Ｕ／ｕＬとなるようにＥＫＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加後、リザーバー溶液（ＬｉＣｌ ０．２Ｍ，２０％ＰＥＧ３３５０）と１対１で混合し、蒸気拡散法により結晶化した。得られた単結晶をクライオ溶液（２０％グリセロール、ＰＢＳ、リザーバー溶液）に浸漬した後、液体窒素にて凍結した。凍結結晶をクライオ気流下でＸ線照射し、回折イメージを得た（ｐｈｏｔｏｎ ｆａｃｔｏｒｙ ＮＥ３Ａ：高エネルギー加速器研究機構）。ｉｍｏｓｆｌｍを使用した解析により、最大分解能１．９Å（オングストローム）のスケーリングデータを取得した。ＫＬＫ４単体（ＰＤＢ ＩＤ：４Ｋ１Ｅ）、およびＳＰＩＮＫ２単体（ＰＤＢ ＩＤ：２ＪＸＤ）を鋳型とした分子置換法により位相を決定し、構造精密化後、分解能２．０ＡでＫＬＫ４／該ペプチドの複合体結晶を決定した。当該ＫＬＫ４阻害ペプチドはＫＬＫ４酵素活性中心を含む領域へ結合していることが認められた（図６）。
（５－１）で調製した複合体溶液を３０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、終濃度１６．７Ｕ／ｕＬとなるようにＥＫＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加後、リザーバー溶液（ＬｉＣｌ ０．２Ｍ，２０％ＰＥＧ３３５０）と１対１で混合し、蒸気拡散法により結晶化した。得られた単結晶をクライオ溶液（２０％グリセロール、ＰＢＳ、リザーバー溶液）に浸漬した後、液体窒素にて凍結した。凍結結晶をクライオ気流下でＸ線照射し、回折イメージを得た（ｐｈｏｔｏｎ ｆａｃｔｏｒｙ ＮＥ３Ａ：高エネルギー加速器研究機構）。ｉｍｏｓｆｌｍを使用した解析により、最大分解能１．９Å（オングストローム）のスケーリングデータを取得した。ＫＬＫ４単体（ＰＤＢ ＩＤ：４Ｋ１Ｅ）、およびＳＰＩＮＫ２単体（ＰＤＢ ＩＤ：２ＪＸＤ）を鋳型とした分子置換法により位相を決定し、構造精密化後、分解能２．０ＡでＫＬＫ４／該ペプチドの複合体結晶を決定した。当該ＫＬＫ４阻害ペプチドはＫＬＫ４酵素活性中心を含む領域へ結合していることが認められた（図６）。
【産業上の利用可能性】
【0185】
本発明の提供するペプチド、並びに、それを含む医薬組成物及び診断用組成物は、ＫＬＫ１に関わる疾患、ＫＬＫ４に関わる疾患、又は、ＫＬＫ４／ＫＬＫ８に関わる疾患の治療、予防、検査又は診断等に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【0186】
配列番号１：ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列（図７）
配列番号２：ヒトＫＬＫ１のアミノ酸配列（図８）
配列番号３：ヒトＫＬＫ４のアミノ酸配列（図９）
配列番号４：ヒトＫＬＫ８のアミノ酸配列（図１０）
配列番号５：ＫＬＫ１阻害ペプチドＫ１００６１のアミノ酸配列（図１１）
配列番号６：ＫＬＫ１阻害ペプチドＫ１００６２のアミノ酸配列（図１２）
配列番号７：ＫＬＫ１阻害ペプチドＫ１００６６のアミノ酸配列（図１３）
配列番号８：ＫＬＫ１阻害ペプチドＫ１００７１のアミノ酸配列（図１４）
配列番号９：ＫＬＫ４阻害ペプチドＫ４０００１のアミノ酸配列（図１５）
配列番号１０：ＫＬＫ４阻害ペプチドＫ４０００３のアミノ酸配列（図１６）
配列番号１１：ＫＬＫ４阻害ペプチドＫ４０００４のアミノ酸配列（図１７）
配列番号１２：ＫＬＫ４阻害ペプチドＫ４０００５のアミノ酸配列（図１８）
配列番号１３：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０２１のアミノ酸配列（図１９）配列番号１４：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０２４のアミノ酸配列（図２０）配列番号１５：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０２５のアミノ酸配列（図２１）配列番号１６：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０２６のアミノ酸配列（図２２）配列番号１７：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０４１のアミノ酸配列（図２３）配列番号１８：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０４２のアミノ酸配列（図２４）配列番号１９：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０４３のアミノ酸配列（図２５）配列番号２０：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０４５のアミノ酸配列（図２６）配列番号２１：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０４６のアミノ酸配列（図２７）配列番号２２：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０４７のアミノ酸配列（図２８）配列番号２３：ＫＬＫ１阻害結合ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド又はＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの一般式（図２９）
配列番号２４：プライマー１のヌクレオチド配列（図３０）
配列番号２５：プライマー２のヌクレオチド配列（図３１）
配列番号２６：Ｓｔａｇ＋リンカー１のアミノ酸配列（図３２）
配列番号２７：Ｃ末６マーのアミノ酸配列（図３３）
配列番号２８：ヒトＩｇＧ１ Ｆｃのアミノ酸配列（図３４）
配列番号２：ヒトＫＬＫ１のアミノ酸配列（図８）
配列番号３：ヒトＫＬＫ４のアミノ酸配列（図９）
配列番号４：ヒトＫＬＫ８のアミノ酸配列（図１０）
配列番号５：ＫＬＫ１阻害ペプチドＫ１００６１のアミノ酸配列（図１１）
配列番号６：ＫＬＫ１阻害ペプチドＫ１００６２のアミノ酸配列（図１２）
配列番号７：ＫＬＫ１阻害ペプチドＫ１００６６のアミノ酸配列（図１３）
配列番号８：ＫＬＫ１阻害ペプチドＫ１００７１のアミノ酸配列（図１４）
配列番号９：ＫＬＫ４阻害ペプチドＫ４０００１のアミノ酸配列（図１５）
配列番号１０：ＫＬＫ４阻害ペプチドＫ４０００３のアミノ酸配列（図１６）
配列番号１１：ＫＬＫ４阻害ペプチドＫ４０００４のアミノ酸配列（図１７）
配列番号１２：ＫＬＫ４阻害ペプチドＫ４０００５のアミノ酸配列（図１８）
配列番号１３：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０２１のアミノ酸配列（図１９）配列番号１４：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０２４のアミノ酸配列（図２０）配列番号１５：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０２５のアミノ酸配列（図２１）配列番号１６：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０２６のアミノ酸配列（図２２）配列番号１７：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０４１のアミノ酸配列（図２３）配列番号１８：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０４２のアミノ酸配列（図２４）配列番号１９：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０４３のアミノ酸配列（図２５）配列番号２０：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０４５のアミノ酸配列（図２６）配列番号２１：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０４６のアミノ酸配列（図２７）配列番号２２：ＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドＫ４１０４７のアミノ酸配列（図２８）配列番号２３：ＫＬＫ１阻害結合ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド又はＫＬＫ４／ＫＬＫ８阻害ペプチドの一般式（図２９）
配列番号２４：プライマー１のヌクレオチド配列（図３０）
配列番号２５：プライマー２のヌクレオチド配列（図３１）
配列番号２６：Ｓｔａｇ＋リンカー１のアミノ酸配列（図３２）
配列番号２７：Ｃ末６マーのアミノ酸配列（図３３）
配列番号２８：ヒトＩｇＧ１ Ｆｃのアミノ酸配列（図３４）
【図1】
【図2】
【図3】
【図4(1)】
【図4(2)】
【図4(3)】
【図4(4)】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【配列表】