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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B1)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-15
(45)【発行日】2024-03-26
(54)【発明の名称】ＮＦ－κＢ／ＪＡＫデュアル阻害剤
(51)【国際特許分類】
A61K 36/38 20060101AFI20240318BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240318BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240318BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240318BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240318BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240318BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240318BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240318BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240318BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240318BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20240318BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20240318BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20240318BHJP
A61P 17/14 20060101ALI20240318BHJP
A23L 33/105 20160101ALI20240318BHJP
A21D 13/80 20170101ALN20240318BHJP
A23L 21/10 20160101ALN20240318BHJP
A61K 127/00 20060101ALN20240318BHJP
A61K 133/00 20060101ALN20240318BHJP
A61K 135/00 20060101ALN20240318BHJP
【ＦＩ】
A61K36/38
A61P43/00 111
A61P19/02
A61P29/00 101
A61P37/06
A61P9/10 101
A61P9/10
A61P1/16
A61P35/00
A61P3/10
A61P17/00
A61P37/08
A61P7/00
A61P17/06
A61P17/14
A23L33/105
A21D13/80
A23L21/10
A61K127:00
A61K133:00
A61K135:00
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2023000929
(22)【出願日】2023-01-06
【審査請求日】2023-01-06
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０２２年３月２６日にＷＥＢ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｉｔ．ａｔｌａｓ．ｊｐ／ｇｕｉｄｅ／ｅｖｅｎｔ／ｐｈａｒｍ１４２／ｔｏｐ？ｌａｎｇ＝ｊａ）上で開催された「日本薬学会第１４２年会（名古屋）」で発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ２０２２年３月４日に公益社団法人日本薬学会がＷＥＢ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｉｔ．ａｔｌａｓ．ｊｐ／ｇｕｉｄｅ／ｅｖｅｎｔ／ｐｈａｒｍ１４２／ｔｏｐ？ｌａｎｇ＝ｊａ）上で公開した「日本薬学会第１４２年会（名古屋）」のＷｅｂ要旨集に発表
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】397036365
【氏名又は名称】株式会社アイビー化粧品
(74)【代理人】
【識別番号】100098545
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 伸一
(74)【代理人】
【識別番号】100189717
【弁理士】
【氏名又は名称】太田 貴章
(72)【発明者】
【氏名】竹入 雅敏
(72)【発明者】
【氏名】常陰 幸乃
(72)【発明者】
【氏名】新井 啓子
(72)【発明者】
【氏名】木村 吉秀
【審査官】松浦 安紀子
(56)【参考文献】
【文献】Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009年，Vol.57 No.4，p.1291-1298
【文献】Journal of Natural Products，2011年，Vol.74 No.5，p.1117-1125
【文献】Fitoterapia，2022年01月，Volume 156，Article.105097(p.1-7)
【文献】BioMed Research International，2015年，Vol.2015，Article.910453 (p.1-10)
【文献】Biological and Pharmaceutical Bulletin，2012年，Vol.35 No.11，p.1914-1925
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３６／３８
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ａ６１Ｐ １９／０２
Ａ６１Ｐ ２９／００
Ａ６１Ｐ ３７／０６
Ａ６１Ｐ ９／１０
Ａ６１Ｐ １／１６
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ ３／１０
Ａ６１Ｐ １７／００
Ａ６１Ｐ ３７／０８
Ａ６１Ｐ ７／００
Ａ６１Ｐ １７／０６
Ａ６１Ｐ １７／１４
Ａ２３Ｌ ３３／１０５
Ａ２１Ｄ １３／８０
Ａ２３Ｌ ２１／１０
Ａ６１Ｋ １２７／００
Ａ６１Ｋ １３３／００
Ａ６１Ｋ １３５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
水を含んでもよい有機溶媒を抽出溶媒とするオトギリソウの花と葉と茎からの抽出物を有効成分とするＮＦ－κＢ／ＪＡＫ１デュアル阻害剤（ただし有機溶媒はエタノールまたは１，３－ブチレングリコールである）。
【請求項2】
水を含んでもよい有機溶媒を抽出溶媒とするオトギリソウの花と葉と茎からの抽出物を有効成分とするＪＡＫ１阻害剤（ただし有機溶媒はエタノールまたは１，３－ブチレングリコールである）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用を併せ持つＮＦ－κＢ／ＪＡＫデュアル阻害剤に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、生体内において疾患の発症や憎悪に関与する転写因子や酵素の研究が盛んに行われていることは周知の通りであるが、そのような転写因子や酵素としてＮＦ－κＢとＪＡＫがある。
【0003】
ＮＦ－κＢ（核内因子κＢ：ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ－ｋａｐｐａ Ｂ）は、免疫反応において中心的役割を果たす転写因子の１つであり、ＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子α）やＩＬ－１（インターロイキン１）などの炎症性サイトカインの転写や、炎症や発がんなどに関与するＣｏｘ－２（シクロオキシゲナーゼ２）や糖尿病の発症や進展などに関与するｉＮＯＳ（誘導型一酸化窒素合成酵素）などの炎症誘発酵素の転写を活性化することが知られている。炎症性サイトカインや炎症誘発酵素は、関節リウマチなどの自己免疫疾患の他、動脈硬化、心筋梗塞、肝炎、がん、糖尿病といった疾患を引き起こす慢性炎症を誘導するため、ＮＦ－κＢの転写活性は、こうした疾患の原因となる。
【0004】
ＪＡＫ（ヤヌスキナーゼ：Ｊａｎｕｓ ｋｉｎａｓｅ）は、チロシンキナーゼの１つであり、細胞内の免疫活性化シグナル伝達に重要な役割を担っていることが知られている。ＪＡＫが関与するシグナル伝達は、炎症性サイトカインであるＩＬ－６の受容体コンポーネントであるｇｐ１３０の細胞内領域に結合しているＪＡＫが、ＩＬ－６が受容体に結合することで活性化され、ｇｐ１３０のリン酸化を介してＳＴＡＴ（シグナル伝達兼転写活性化因子）のリン酸化を誘導し、リン酸化されたＳＴＡＴが核内に移行することで行われる（ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路）。ＪＡＫの酵素活性は、関節リウマチなどの自己免疫疾患の他、アトピー性皮膚炎、骨髄線維症、悪性リンパ腫、膵癌、乾癬、円形脱毛症といった疾患の原因となる。
【0005】
従って、ＮＦ－κＢの転写活性に対する阻害作用（ＮＦ－κＢ阻害作用）を持つ成分とＪＡＫの酵素活性に対する阻害作用（ＪＡＫ阻害作用）を持つ成分のそれぞれは、それぞれＮＦ－κＢの転写活性が原因となる疾患とＪＡＫの酵素活性が原因となる疾患の予防や治療に有用であることから、それぞれの成分の探索が精力的に行われており、例えば特許文献１では、リンドウの根や根茎に含まれるゲンチオラクトンがＮＦ－κＢ阻害作用を持つことが報告されている。また、本発明者らの研究グループは、特許文献２において、ワレモコウやゲンノショウコの抽出物がＪＡＫ阻害作用を持つことを報告している。
【0006】
しかしながら、ＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用を併せ持つ成分があれば、１つの成分が単独で双方の作用を発揮することで、ＮＦ－κＢ阻害作用を持つ成分とＪＡＫ阻害作用を持つ成分の２つの成分によって得られる効果と同等ないしそれ以上の効果を１つの成分によって得られることや、より広範囲にわたる効果が１つの成分によって得られることなどを期待することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特開２０１５－１４０３２４号公報
【文献】特許第７０２３０２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
そこで本発明は、ＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用を併せ持つＮＦ－κＢ／ＪＡＫデュアル阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意検討を行った結果、オトギリソウ（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｅｒｅｃｔｕｍ）の抽出物が、ＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用を併せ持つことを見出した。
【0010】
上記の知見に基づいてなされた本発明は、請求項１記載の通り、水を含んでもよい有機溶媒を抽出溶媒とするオトギリソウの花と葉と茎からの抽出物を有効成分とするＮＦ－κＢ／ＪＡＫ１デュアル阻害剤（ただし有機溶媒はエタノールまたは１，３－ブチレングリコールである）である。
また、本発明は、請求項２記載の通り、水を含んでもよい有機溶媒を抽出溶媒とするオトギリソウの花と葉と茎からの抽出物を有効成分とするＪＡＫ１阻害剤（ただし有機溶媒はエタノールまたは１，３－ブチレングリコールである）である。
また、本発明は、請求項２記載の通り、水を含んでもよい有機溶媒を抽出溶媒とするオトギリソウの花と葉と茎からの抽出物を有効成分とするＪＡＫ１阻害剤（ただし有機溶媒はエタノールまたは１，３－ブチレングリコールである）である。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、ＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用を併せ持つＮＦ－κＢ／ＪＡＫデュアル阻害剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明のＮＦ－κＢ／ＪＡＫデュアル阻害剤は、オトギリソウの抽出物を有効成分とする。
【0014】
本発明において用いるオトギリソウは、オトギリソウ科（Ｇｕｔｔｉｆｅｒａｅ）に属する多年草の植物であり、地上部（花や葉や茎）を日干し乾燥したものは、小連翹（ショウレンギョウ）の名称で薬草として古くから用いられている。しかしながら、オトギリソウの抽出物が、ＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用を併せ持つことの報告はこれまでにない。なお、本発明において用いるオトギリソウは、天然に自生しているものであってもよいし、生産者によって栽培されているものであってもよい。
【0015】
本発明において、オトギリソウの抽出物は、例えば地上部（細断したり乾燥したり粉砕したりしてもよい）に、抽出溶媒としての水や各種の有機溶媒、例えばメタノールやエタノールやイソプロピルアルコールなどのモノアルコール、１，３－ブチレングリコールなどの多価アルコール、エーテル、ヘキサン、酢酸エチル、アセトニトリルなどを加え（有機溶媒は水を含んでもよい）、室温で１時間～１週間静置することで成分抽出したり、還流することで成分抽出したりしてからろ過することで、ろ液として得ることができる。抽出溶媒は、単一の溶媒を用いてもよいし複数の溶媒を混合して用いてもよい。得られたろ液は、そのまま液状抽出物として用いてもよいし、減圧濃縮や凍結乾燥を行って固形物や粉末にして用いてもよい。なお、ろ液をさらに硫安分画、ゲルろ過、イオンクロマトグラフィーなどによって精製し、得られた画分を液状抽出物として用いてもよい。また、例えば最初にヘキサンを用いて抽出操作を行った後、順次、酢酸エチル、アセトン、水といったように、用いる溶媒の極性を徐々に高くして抽出操作を行い、いずれかの溶媒を用いることで得られたろ液を液状抽出物として用いてもよい。
【0016】
本発明のＮＦ－κＢ／ＪＡＫデュアル阻害剤は、各種の製剤形態に製剤化することでそれ自体を医薬品や健康食品などとして服用や摂取することができることに加え、各種の飲食品に配合して摂取することができる。また、本発明のＮＦ－κＢ／ＪＡＫデュアル阻害剤は、軟膏、クリーム、ローションといった外用剤の形態で皮膚に塗布することもできる。その服用量や摂取量や塗布量は、適用対象者の年齢や性別や体重、症状の程度などに基づいて適宜決定することができ、適切量を服用や摂取や塗布することにより、そのＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用に基づいて、ＮＦ－κＢとＪＡＫの双方が発症や憎悪に関与する疾患（例えば関節リウマチなどの自己免疫疾患）に対する予防効果や治療効果や、ＮＦ－κＢとＪＡＫのいずれか一方が発症や憎悪に関与する疾患に対する予防効果や治療効果を期待することができる。
【実施例】
【0017】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【0018】
試験例１：オトギリソウの抽出物のＮＦ－κＢ阻害作用
１．ＮＦ－κＢの転写活性に対する阻害作用（その１）
Ｔｈｉ Ｖａｎ Ａｎｈ Ｔｒａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０１５，１５９，３６－４２に記載の方法を参考に、外用剤の形態で皮膚に塗布するＮＦ－κＢ阻害剤を念頭に置いて、その候補となる植物の抽出物のスクリーニングを行った。具体的には、まず、ヒト表皮角化細胞株ＨａＣａＴに対し、ｐＮＬ３．２．ＮＦ－κＢ－ＲＥ［ＮｌｕｃＰ／ＮＦ－κＢ－ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖ（Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、エレクトロポレーション法により導入し、２４時間後、終濃度６００μｇ／ｍＬのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎを添加することで薬剤耐性細胞セレクションを行い、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性能を有するＮＦ－κＢ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター安定発現ＨａＣａＴ細胞株を樹立した。次に、９６穴プレートに、１ウェルあたり約１００００個のＮＦ－κＢ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター安定発現ＨａＣａＴ細胞株を１００μＬの培地で播種し、３７℃で１６～２４時間培養した後、様々な植物抽出液をそれぞれ１μＬ（終濃度１％）添加し、さらに２４時間培養した。２４時間後、終濃度２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１α（Ｗａｋｏ，Ｊａｐａｎ）を表皮に多く存在する刺激物質として添加し、３７℃で４時間培養した。４時間後、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用い、プロトコルに従ってＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定することで、ＩＬ－１αによって刺激されるＮＦ－κＢの転写活性に対する阻害作用を評価した。その結果、優れたＮＦ－κＢ阻害作用を有する植物抽出液として、オトギリソウ抽出液を選抜することができた。なお、検体として用いたオトギリソウ抽出液は市販品であり、その組成（重量％）は、花と葉と茎のエキス：０．８５０、１，３－ブチレングリコール：４９．５７５、水：４９．５７５であった。
１．ＮＦ－κＢの転写活性に対する阻害作用（その１）
Ｔｈｉ Ｖａｎ Ａｎｈ Ｔｒａｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０１５，１５９，３６－４２に記載の方法を参考に、外用剤の形態で皮膚に塗布するＮＦ－κＢ阻害剤を念頭に置いて、その候補となる植物の抽出物のスクリーニングを行った。具体的には、まず、ヒト表皮角化細胞株ＨａＣａＴに対し、ｐＮＬ３．２．ＮＦ－κＢ－ＲＥ［ＮｌｕｃＰ／ＮＦ－κＢ－ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖ（Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、エレクトロポレーション法により導入し、２４時間後、終濃度６００μｇ／ｍＬのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎを添加することで薬剤耐性細胞セレクションを行い、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性能を有するＮＦ－κＢ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター安定発現ＨａＣａＴ細胞株を樹立した。次に、９６穴プレートに、１ウェルあたり約１００００個のＮＦ－κＢ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター安定発現ＨａＣａＴ細胞株を１００μＬの培地で播種し、３７℃で１６～２４時間培養した後、様々な植物抽出液をそれぞれ１μＬ（終濃度１％）添加し、さらに２４時間培養した。２４時間後、終濃度２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１α（Ｗａｋｏ，Ｊａｐａｎ）を表皮に多く存在する刺激物質として添加し、３７℃で４時間培養した。４時間後、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用い、プロトコルに従ってＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定することで、ＩＬ－１αによって刺激されるＮＦ－κＢの転写活性に対する阻害作用を評価した。その結果、優れたＮＦ－κＢ阻害作用を有する植物抽出液として、オトギリソウ抽出液を選抜することができた。なお、検体として用いたオトギリソウ抽出液は市販品であり、その組成（重量％）は、花と葉と茎のエキス：０．８５０、１，３－ブチレングリコール：４９．５７５、水：４９．５７５であった。
【0019】
２．ＮＦ－κＢの転写活性に対する阻害作用（その２）
（実験方法）
ＮＦ－κＢの転写活性に関与する経路は複数存在するので、上記のオトギリソウ抽出液について、各種の刺激物質によって刺激されるＮＦ－κＢの転写活性に対する阻害作用を評価した。具体的には、まず、マウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４に対し、ｐＮＬ３．２．ＮＦ－κＢ－ＲＥ［ＮｌｕｃＰ／ＮＦ－κＢ－ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖ（Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、エレクトロポレーション法により導入し、２４時間後、終濃度６００μｇ／ｍＬのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎを添加することで薬剤耐性細胞セレクションを行い、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性能を有するＮＦ－κＢ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター安定発現ＲＡＷ２６４細胞株を樹立した。次に、９６穴プレートに、１ウェルあたり約１００００個のＮＦ－κＢ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター安定発現ＲＡＷ２６４細胞株を１００μＬの培地で播種し、３７℃で１６～２４時間培養した後、オトギリソウ抽出液の３０％希釈液（培地を用いて希釈）またはオトギリソウ抽出液を１μＬ（終濃度０．３％、１％）添加し、さらに２４時間培養した。２４時間後、刺激物質を添加し、３７℃で４時間培養した。４時間後、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用い、プロトコルに従ってＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定することで、刺激物質によって刺激されるＮＦ－κＢの転写活性に対する阻害作用を評価した。刺激物質は以下の３種類を用いた。
・ 終濃度１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）
・ 終濃度２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１β（Ｗａｋｏ，Ｊａｐａｎ）
・ 終濃度５ｎＭのＲＡＮＫＬ（Ｏｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ，Ｊａｐａｎ）
（実験方法）
ＮＦ－κＢの転写活性に関与する経路は複数存在するので、上記のオトギリソウ抽出液について、各種の刺激物質によって刺激されるＮＦ－κＢの転写活性に対する阻害作用を評価した。具体的には、まず、マウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４に対し、ｐＮＬ３．２．ＮＦ－κＢ－ＲＥ［ＮｌｕｃＰ／ＮＦ－κＢ－ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖ（Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、エレクトロポレーション法により導入し、２４時間後、終濃度６００μｇ／ｍＬのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎを添加することで薬剤耐性細胞セレクションを行い、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性能を有するＮＦ－κＢ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター安定発現ＲＡＷ２６４細胞株を樹立した。次に、９６穴プレートに、１ウェルあたり約１００００個のＮＦ－κＢ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター安定発現ＲＡＷ２６４細胞株を１００μＬの培地で播種し、３７℃で１６～２４時間培養した後、オトギリソウ抽出液の３０％希釈液（培地を用いて希釈）またはオトギリソウ抽出液を１μＬ（終濃度０．３％、１％）添加し、さらに２４時間培養した。２４時間後、刺激物質を添加し、３７℃で４時間培養した。４時間後、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を用い、プロトコルに従ってＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定することで、刺激物質によって刺激されるＮＦ－κＢの転写活性に対する阻害作用を評価した。刺激物質は以下の３種類を用いた。
・ 終濃度１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）
・ 終濃度２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１β（Ｗａｋｏ，Ｊａｐａｎ）
・ 終濃度５ｎＭのＲＡＮＫＬ（Ｏｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ，Ｊａｐａｎ）
【0020】
（実験結果）
コントロールとした０．５％の１，３－ブチレングリコール（０．５％ＢＧ）のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を１とした相対値として図１に示す。図１には、ネガティブコントロールとした０．５％の１，３－ブチレングリコールの結果をあわせて示す。図１から明らかなように、オトギリソウ抽出液は、ＬＰＳ，ＩＬ－１β，ＲＡＮＫＬのいずれの刺激物質によって刺激した場合であっても、濃度依存的にＮＦ－κＢの転写活性に対する阻害作用を発揮した。
コントロールとした０．５％の１，３－ブチレングリコール（０．５％ＢＧ）のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を１とした相対値として図１に示す。図１には、ネガティブコントロールとした０．５％の１，３－ブチレングリコールの結果をあわせて示す。図１から明らかなように、オトギリソウ抽出液は、ＬＰＳ，ＩＬ－１β，ＲＡＮＫＬのいずれの刺激物質によって刺激した場合であっても、濃度依存的にＮＦ－κＢの転写活性に対する阻害作用を発揮した。
【0021】
試験例２：オトギリソウの抽出物のＪＡＫ阻害作用
１．ＩＬ－６によって誘導されるＳＴＡＴ３のリン酸化に対する抑制作用
Ｍｉｃｈａｅｌ Ｆｏｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１６，２３，１３３５－１３４０に記載の方法を参考に、ＩＬ－６によって誘導されるＳＴＡＴ３のリン酸化に対する抑制作用を指標にして、ＪＡＫ阻害剤の候補となる植物の抽出物のスクリーニングを行った。具体的には、外用剤の形態で皮膚に塗布するＪＡＫ阻害剤を念頭に置いて、９６穴プレートに、１ウェルあたり約２５００個のヒト表皮角化細胞株ＨａＣａＴを１００μＬの培地で播種し、３７℃で１６～２４時間培養した後、ＦＢＳ不含の培地１００μＬに変え、６時間培養することで、Ｓｔａｒｖａｔｉｏｎを行った。Ｓｔａｒｖａｔｉｏｎの後、様々な植物抽出液をそれぞれ１μＬ（終濃度１％）添加し、１時間前処理した後、終濃度２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６（Ｗａｋｏ，Ｊａｐａｎ）を添加し、３７℃で１５分間培養した。培養終了後、ＤＰＢＳで２回細胞を洗浄し、ｘ４ Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ ６．８］，８％ ＳＤＳ，４００ｍＭ ＤＴＴ，０．２％ ＢＰＢ，４０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を５０μＬ添加し、細胞を溶解した。細胞溶解液を９６穴ＰＣＲプレートに移し、９５℃にて２０分間加熱することで、ゲノムＤＮＡの分解と細胞内のタンパク質抽出を行った。その後、１０％ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ）を用い、１ウェルあたり５μＬの細胞抽出液を電気泳動した。ゲルをＰＶＤＦメンブレン（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に転写し、抗ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ３抗体（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）と抗ＳＴＡＴ３抗体（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）を用いてリン酸化されたＳＴＡＴ３とリン酸化されていないＳＴＡＴ３のバンドの検出を行い、ポジティブコントロールとした１００μＭのトファシチニブの結果（リン酸化されたＳＴＡＴ３のバンドの非存在とリン酸化されていないＳＴＡＴ３のバンドの存在）と同程度の結果を示す植物抽出液を絞り込んだ。その結果、オトギリソウ抽出液（試験例１において検体として用いたオトギリソウ抽出液と同じ）を、トファシチニブの結果と同程度の結果を示すＩＬ－６によって誘導されるＳＴＡＴ３のリン酸化に対する抑制作用を有する植物抽出液として選抜することができた。
１．ＩＬ－６によって誘導されるＳＴＡＴ３のリン酸化に対する抑制作用
Ｍｉｃｈａｅｌ Ｆｏｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１６，２３，１３３５－１３４０に記載の方法を参考に、ＩＬ－６によって誘導されるＳＴＡＴ３のリン酸化に対する抑制作用を指標にして、ＪＡＫ阻害剤の候補となる植物の抽出物のスクリーニングを行った。具体的には、外用剤の形態で皮膚に塗布するＪＡＫ阻害剤を念頭に置いて、９６穴プレートに、１ウェルあたり約２５００個のヒト表皮角化細胞株ＨａＣａＴを１００μＬの培地で播種し、３７℃で１６～２４時間培養した後、ＦＢＳ不含の培地１００μＬに変え、６時間培養することで、Ｓｔａｒｖａｔｉｏｎを行った。Ｓｔａｒｖａｔｉｏｎの後、様々な植物抽出液をそれぞれ１μＬ（終濃度１％）添加し、１時間前処理した後、終濃度２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６（Ｗａｋｏ，Ｊａｐａｎ）を添加し、３７℃で１５分間培養した。培養終了後、ＤＰＢＳで２回細胞を洗浄し、ｘ４ Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ ６．８］，８％ ＳＤＳ，４００ｍＭ ＤＴＴ，０．２％ ＢＰＢ，４０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を５０μＬ添加し、細胞を溶解した。細胞溶解液を９６穴ＰＣＲプレートに移し、９５℃にて２０分間加熱することで、ゲノムＤＮＡの分解と細胞内のタンパク質抽出を行った。その後、１０％ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ）を用い、１ウェルあたり５μＬの細胞抽出液を電気泳動した。ゲルをＰＶＤＦメンブレン（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に転写し、抗ｐｈｏｓｐｈｏ－ＳＴＡＴ３抗体（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）と抗ＳＴＡＴ３抗体（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）を用いてリン酸化されたＳＴＡＴ３とリン酸化されていないＳＴＡＴ３のバンドの検出を行い、ポジティブコントロールとした１００μＭのトファシチニブの結果（リン酸化されたＳＴＡＴ３のバンドの非存在とリン酸化されていないＳＴＡＴ３のバンドの存在）と同程度の結果を示す植物抽出液を絞り込んだ。その結果、オトギリソウ抽出液（試験例１において検体として用いたオトギリソウ抽出液と同じ）を、トファシチニブの結果と同程度の結果を示すＩＬ－６によって誘導されるＳＴＡＴ３のリン酸化に対する抑制作用を有する植物抽出液として選抜することができた。
【0022】
２．ＪＡＫ１の酵素活性に対する阻害作用
（実験方法）
上記のオトギリソウ抽出液のＪＡＫ１の酵素活性に対する阻害作用を、ＡＤＰ－Ｇｌｏ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）によって評価した。具体的には、５０ｎｇ／μＬのＪＡＫ１ ｋｉｎａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）２．５μＬ、滅菌精製水にて各濃度（０．３％、１％）に希釈したオトギリソウ抽出液０．１２５μＬ、ｘ１ ｋｉｎａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ ４．８７５μＬからなる酵素反応溶液を調製し、２５℃にて３０分間インキュベートした。インキュベート完了後、１μｇ／μＬの基質溶液２．５μＬと２５０μＭのＡＴＰ２．５μＬを添加し、２５℃にて６０分間インキュベートした。その後、ＡＤＰ－Ｇｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔ１２．５μＬを添加し、２５℃にて４０分間インキュベートした。続いて、Ｋｉｎａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ２５μＬを添加し、２５℃にて３０分間インキュベートした。インキュベート完了後、蛍光プレートリーダーにて蛍光強度を測定することで、ＪＡＫ１ ｋｉｎａｓｅの活性の検出を行った。
（実験方法）
上記のオトギリソウ抽出液のＪＡＫ１の酵素活性に対する阻害作用を、ＡＤＰ－Ｇｌｏ Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）によって評価した。具体的には、５０ｎｇ／μＬのＪＡＫ１ ｋｉｎａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）２．５μＬ、滅菌精製水にて各濃度（０．３％、１％）に希釈したオトギリソウ抽出液０．１２５μＬ、ｘ１ ｋｉｎａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ ４．８７５μＬからなる酵素反応溶液を調製し、２５℃にて３０分間インキュベートした。インキュベート完了後、１μｇ／μＬの基質溶液２．５μＬと２５０μＭのＡＴＰ２．５μＬを添加し、２５℃にて６０分間インキュベートした。その後、ＡＤＰ－Ｇｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔ１２．５μＬを添加し、２５℃にて４０分間インキュベートした。続いて、Ｋｉｎａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ２５μＬを添加し、２５℃にて３０分間インキュベートした。インキュベート完了後、蛍光プレートリーダーにて蛍光強度を測定することで、ＪＡＫ１ ｋｉｎａｓｅの活性の検出を行った。
【0023】
（実験結果）
コントロールとした０．５％の１，３－ブチレングリコール（０．５％ＢＧ）の蛍光強度を１００とした相対値として図２に示す。図２には、ネガティブコントロールとした０．５％の１，３－ブチレングリコールの結果をあわせて示す。図２から明らかなように、オトギリソウ抽出液は、濃度依存的にＪＡＫ１の酵素活性に対する阻害作用を発揮した。
コントロールとした０．５％の１，３－ブチレングリコール（０．５％ＢＧ）の蛍光強度を１００とした相対値として図２に示す。図２には、ネガティブコントロールとした０．５％の１，３－ブチレングリコールの結果をあわせて示す。図２から明らかなように、オトギリソウ抽出液は、濃度依存的にＪＡＫ１の酵素活性に対する阻害作用を発揮した。
【0024】
製剤例１：錠剤
以下の成分組成からなるＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用を併せ持つ錠剤を自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
試験例で用いたオトギリソウ抽出液の粉末 １
乳糖 ８０
ステアリン酸マグネシウム １９
以下の成分組成からなるＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用を併せ持つ錠剤を自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
試験例で用いたオトギリソウ抽出液の粉末 １
乳糖 ８０
ステアリン酸マグネシウム １９
【0025】
製剤例２：ビスケット
以下の成分組成からなるＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用を併せ持つビスケットを自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
試験例で用いたオトギリソウ抽出液 １
薄力粉 ３２
全卵 １６
バター １６
砂糖 ２４
水 １０
ベーキングパウダー １
以下の成分組成からなるＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用を併せ持つビスケットを自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
試験例で用いたオトギリソウ抽出液 １
薄力粉 ３２
全卵 １６
バター １６
砂糖 ２４
水 １０
ベーキングパウダー １
【0026】
製剤例３：ゼリー
以下の成分組成からなるＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用を併せ持つゼリーを自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
試験例で用いたオトギリソウ抽出液 ０．０１
ゲル化剤 １．３
砂糖 ２０
ｐＨ調整剤 ２．５
水 ７６．１９
以下の成分組成からなるＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用を併せ持つゼリーを自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
試験例で用いたオトギリソウ抽出液 ０．０１
ゲル化剤 １．３
砂糖 ２０
ｐＨ調整剤 ２．５
水 ７６．１９
【0027】
製剤例４：軟膏
以下の成分組成からなるＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用を併せ持つ軟膏を自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
試験例で用いたオトギリソウ抽出液の粉末 ５
白色ワセリン ９５
以下の成分組成からなるＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用を併せ持つ軟膏を自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
試験例で用いたオトギリソウ抽出液の粉末 ５
白色ワセリン ９５
【0028】
製剤例５：クリーム
以下の成分組成からなるＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用を併せ持つクリームを自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
試験例で用いたオトギリソウ抽出液の粉末 ５
白色ワセリン ３０
セタノール １５
ラウリル硫酸ナトリウム １
パラオキシ安息香酸エチル ０．１
パラオキシ安息香酸ブチル ０．１
水 ４８．８
以下の成分組成からなるＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用を併せ持つクリームを自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
試験例で用いたオトギリソウ抽出液の粉末 ５
白色ワセリン ３０
セタノール １５
ラウリル硫酸ナトリウム １
パラオキシ安息香酸エチル ０．１
パラオキシ安息香酸ブチル ０．１
水 ４８．８
【0029】
製剤例６：ローション
以下の成分組成からなるＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用を併せ持つローションを自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
試験例で用いたオトギリソウ抽出液 １０
ポリオキシエチレン（４０）硬化ヒマシ油 ０．５
エタノール ５
パラベン ０．２
水 ８４．３
以下の成分組成からなるＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用を併せ持つローションを自体公知の方法で製造した（単位：重量％）。
試験例で用いたオトギリソウ抽出液 １０
ポリオキシエチレン（４０）硬化ヒマシ油 ０．５
エタノール ５
パラベン ０．２
水 ８４．３
【産業上の利用可能性】
【0030】
本発明は、ＮＦ－κＢ阻害作用とＪＡＫ阻害作用を併せ持つＮＦ－κＢ／ＪＡＫデュアル阻害剤を提供することができる点において、産業上の利用可能性を有する。
【要約】
【図1】
【図2】
