特許 7455579 新規アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）クレードＦベクター及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-15

(45)【発行日】2024-03-26

(54)【発明の名称】新規アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）クレードＦベクター及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20240318BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240318BHJP

   C12N 15/35 20060101ALI20240318BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20240318BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240318BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

C12N7/01 ZNA

C12N15/35

C12N15/85 Z

C12N5/10

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2019547088

(86)(22)【出願日】2018-02-27

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-04-09

(86)【国際出願番号】 US2018019992

(87)【国際公開番号】W WO2018160582

(87)【国際公開日】2018-09-07

【審査請求日】2021-02-22

(31)【優先権主張番号】62/591,002

(32)【優先日】2017-11-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/614,002

(32)【優先日】2018-01-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/464,748

(32)【優先日】2017-02-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】502409813

【氏名又は名称】ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア

(74)【代理人】

【識別番号】110000741

【氏名又は名称】弁理士法人小田島特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ウイルソン，ジェームス・エム

(72)【発明者】

【氏名】ワン，チャン

(72)【発明者】

【氏名】ジャイルズ，エイプリル

(72)【発明者】

【氏名】ターナー，ケビン

【審査官】小倉 梢

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／０４９２３０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／１６４７５７（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００ － １５／９０

Ｃ１２Ｎ ７／００ － ７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（Ａ）
（１）配列番号２の１～７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生される、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質およびＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質の異種集団、または
（２）配列番号２の１～７３６のアミノ酸配列をコードし配列番号１と少なくとも７０％同一である核酸配列からの発現によって産生される、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質およびＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質の異種集団、または
（３）配列番号１のヌクレオチド１～２２１１を含む配列から産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質およびＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質の異種集団、
を含み、
前記（１）、（２）及び（３）のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２およびＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質の異種集団が、質量分析を用いて決定した場合に配列番号２の位置Ｎ５７、Ｎ３２９，Ｎ４５２又はＮ５１２において少なくとも２つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含有するものであり、かつ他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団をさらに含むものであり、
前記ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質およびＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質の異種集団が、アスパラギン酸、イソアスパラギン酸、相互変換されるアスパラギン酸／イソアスパラギン酸対またはそれらの組み合わせに脱アミド化されたアスパラギンを含み、前記ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１及びＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質の少なくとも１つの亜集団が、配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１カプシドの付番に基づいて、位置１５７にバリンを及び位置６７にグルタミン酸を含むものである、
ＡＡＶｈｕ６８カプシド；ならびに
（Ｂ）前記ＡＡＶｈｕ６８カプシド内のベクターゲノムであって、ＡＡＶ末端逆位反復配列と、産物をコードしており哺乳動物標的細胞における前記産物の発現を促す配列に機能可能に繋げられている非ＡＡＶ核酸配列とを含む核酸分子を含んでいる前記ベクターゲノム
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項2】

（Ａ）配列番号２のｖｐ１タンパク質の付番に基づく位置６７にグルタミン酸を及び位置１５７にバリンを有する、配列番号２のアミノ酸１～７３６を含んでいるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２のｖｐ１カプシドの付番に基づく位置１５７にバリンを含む、配列番号２のアミノ酸１３８～７３６を含んでいるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号２のアミノ酸２０３～７３６を含んでいるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質の異種集団を含む、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２およびＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質の異種集団を含み、
前記ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２およびＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質の異種集団が、さらに、アスパラギン酸、イソアスパラギン酸、相互変換されるアスパラギン酸／イソアスパラギン酸対またはそれらの組み合わせに脱アミド化された５０％～１００％のアスパラギンを配列番号２の位置Ｎ５７、Ｎ３２９，Ｎ４５２又はＮ５１２に含むものである、
ＡＡＶｈｕ６８カプシド；ならびに
（Ｂ）前記ＡＡＶｈｕ６８カプシド内のベクターゲノムであって、ＡＡＶ末端逆位反復配列と、産物をコードしており哺乳動物標的細胞における前記産物の発現を促す配列に機能可能に繋げられている非ＡＡＶ核酸配列とを含む核酸分子を含んでいる前記ベクターゲノム
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

【請求項3】

前記ＡＡＶｈｕ６８カプシドが、
（ｉ）（ａ）質量分析を用いて決定した場合に配列番号２の付番に基づいて前記ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質の位置５７に位置するアスパラギン－グリシン対のアスパラギン（Ｎ）の少なくとも６５％が脱アミド化されていること；
（ｂ）質量分析を用いて決定した場合に配列番号２のアミノ酸配列の残基付番に基づいて前記ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２及びＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質の位置３２９にあるアスパラギン－グリシン対のＮの少なくとも７５％が脱アミド化されていること、
（ｃ）質量分析を用いて決定した場合に配列番号２のアミノ酸配列の残基付番に基づいて前記ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２及びＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質の位置４５２にあるアスパラギン－グリシン対のＮの少なくとも５０％が脱アミド化されていること；及び／または
（ｄ）質量分析を用いて決定した場合に配列番号２のアミノ酸配列の残基付番に基づいて前記ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２及びＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質の位置５１２にあるアスパラギン－グリシン対のＮの少なくとも７５％が脱アミド化されていること
のうちの１つ以上を有する亜集団を含むか；
（ｉｉ）質量分析を用いて決定した場合に前記ｖｐ１タンパク質の位置５７にあるＮの７５～１００％が脱アミド化されているＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１の亜集団を含むか；
（ｉｉｉ）質量分析を用いて決定した場合に配列番号２の付番に基づく位置３２９にあるＮの７５～１００％が脱アミド化されているＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含むか；
（ｉｖ）質量分析を用いて決定した場合に配列番号２の付番に基づく位置４５２にあるＮの７５～１００％が脱アミド化されているＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含むか；
（ｖ）質量分析を用いて決定した場合に配列番号２の付番に基づく位置５１２にあるＮの７５～１００％が脱アミド化されているＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含むか；
（ｖｉ）質量分析を用いて決定した場合に
（ａ）配列番号２の位置Ｎ９４、Ｎ１１３、Ｎ２５２、Ｎ２５３、Ｑ２５９、Ｎ２７０、Ｎ３０３、Ｎ３０４、Ｎ３０５、Ｎ３１９、Ｎ３２８、Ｎ３３６、Ｎ４０９、Ｎ４１０、Ｎ４７７、Ｎ５１５、Ｎ５９８、Ｑ５９９、Ｎ６２８、Ｎ６５１、Ｎ６６３、Ｎ７０９またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つ以上における１％～４０％の脱アミド化；または
（ｂ）アセチル化リジン、リン酸化セリン及び／またはスレオニン、異性化アスパラギン酸、酸化トリプトファン及び／またはメチオニン、またはアミド化アミノ酸のうちの１つ以上における１つ以上の修飾から選択される１つ以上の修飾；をさらに含む、
ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含むか、及び／または
（ｖｉｉ）質量分析を用いて決定した場合にＮ５７、３２９、４５２及び５１２のうちの３つ以上における少なくとも５０～１００％の脱アミド化を含む配列番号２からのアミノ酸修飾を有している、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の少なくとも亜集団をさらに含む、
請求項１または２に記載のｒＡＡＶ。

【請求項4】

前記タンパク質をコードする前記核酸配列が、
配列番号１、または
配列番号２のアミノ酸配列をコードし配列番号１と少なくとも８０％～少なくとも９９％同一である配列
である、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ。

【請求項5】

前記ＡＡＶｈｕ６８カプシドが、位置Ｎ５７、３２９、４５２及び５１２のそれぞれにおける少なくともの５０～１００％の脱アミド化を含む配列番号２からのアミノ酸修飾を有するＡＡＶｈｕ６８ｖｐ１、ＡＡＶｈｕ６８ｖｐ２及び／又はＡＡＶｈｕ６８ｖｐ３タンパク質の亜集団を含み、脱アミド化されたアスパラギンは、質量分析を用いて決定した場合にアスパラギン酸、イソアスパラギン酸、相互変換されるアスパラギン酸／イソアスパラギン酸対、またはそれらの組み合わせに脱アミド化され、改変されたＡＡＶｈｕ６８ｖｐ１及びｖｐ２タンパク質は、配列番号２のｖｐ１カプシドの付番に基づいて位置１５７にバリンを及び位置６７にグルタミン酸を含み；および
前記カプシドは、質量分析を用いて決定した場合に、更に位置Ｎ９４、Ｎ１１３、Ｎ２５２、Ｎ２５３、Ｑ２５９、Ｎ２７０、Ｎ３０３、Ｎ３０４、Ｎ３０５、Ｎ３１９、Ｎ３２８、Ｎ３３６、Ｎ４０９、Ｎ４１０、Ｎ４７７、Ｎ５１５、Ｎ５９８、Ｑ５９９、Ｎ６２８、Ｎ６５１、Ｎ６６３、Ｎ７０９またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つ以上における１％～４０％の脱アミド化から選択される１つ以上のさらなる修飾か；及び／又はアセチル化リジン、リン酸化セリン及び／またはスレオニン、異性化アスパラギン酸、酸化トリプトファン及び／またはメチオニンオまたはアミド化アミノ酸の１つ以上の修飾を含む、ＡＡＶｈｕ６８ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質の亜集団をさらに含む、
請求項１または２に記載のｒＡＡＶ。

【請求項6】

組換えアデノ随伴ウイルスｈｕ６８（ｒＡＡＶｈｕ６８）の混合集団を含み、前記ｒＡＡＶｈｕ６８の各々が独立して請求項１～５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶから選択される、組成物。

【請求項7】

前記ＡＡＶのＩＴＲ配列がＡＡＶ２からの５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲである、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記組成物が
（ｉ）クモ膜下腔内送達のために製剤化され、且つ、前記ベクターゲノムが、中枢神経系への送達のための産物をコードする核酸配列を含むか；
（ｉｉ）静脈内送達のために製剤化されるか；または
（ｉｉｉ）鼻腔内または筋肉内送達のために製剤化される
請求項６に記載の組成物。

【請求項9】

治療に用いられるための請求項６～８のいずれか１項に記載の組成物であって、さらに水溶液、緩衝液および／または保存剤を含んでなり、任意に前記治療が遺伝子治療である、前記組成物。

【請求項10】

請求項１または２に記載の組換えＡＡＶｈｕ６８を生産するために有用となるｒＡＡＶ産生システムであって、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列をコードするＡＡＶｈｕ６８カプシド核酸配列を含む核酸分子；
（ｂ）前記ＡＡＶｈｕ６８カプシド内へのパッケージングに適した核酸分子であって、少なくとも１つのＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）と、遺伝子産物をコードしており宿主細胞における前記産物の発現を促す配列に機能可能に繋げられている非ＡＡＶ核酸配列とを含む前記核酸分子；ならびに
（ｃ）組換えＡＡＶｈｕ６８カプシド内への核酸分子のパッケージングを可能にするに足るＡＡＶ ｒｅｐ機能及びヘルパー機能
を含む、前記産生システム。

【請求項11】

（ｉ）（ａ）の前記核酸配列が少なくとも、 配列番号１か、または配列番号２のアミノ酸配列をコードし配列番号１と少なくとも７０％～少なくとも９９％同一である配列を含むか；及び／または
（ｉｉ）前記システムがさらに、配列番号２のアミノ酸２０３～アミノ酸７３６の前記ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３をコードする配列番号１のヌクレオチド６０７～ヌクレオチド２２１１の核酸分子を含む、
請求項１０に記載のシステム。

【請求項12】

細胞培養物がヒト胚性腎臓２９３細胞を含む、請求項１０または１１に記載のシステム。

【請求項13】

前記ＡＡＶ ｒｅｐが、
（ｉ）ＡＡＶ２からのものであるか；
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列によって特徴付けられるＡＡＶｈｕ６８ｒｅｐであるか；または
（ｉｉｉ）前記ＡＡＶ ｒｅｐが配列番号３の核酸配列によってコードされる
請求項１０～１２のいずれか１項に記載のシステム。

【請求項14】

前記ＡＡＶ ｒｅｐコード配列及びｃａｐ遺伝子が同じ核酸分子上にあり、任意に前記ｒｅｐ配列と前記ｃａｐ遺伝子との間にスペーサーが存在し；任意に前記スペーサーがａｔｇａｃｔｔａａａｃｃａｇｇｔ 配列番号９である、請求項１０～１３のいずれか１項に記載のシステム。

【請求項15】

ＡＡＶｈｕ６８ ｒｅｐタンパク質をコードし宿主細胞におけるその発現を促す外来調節制御配列の制御下にある核酸配列を含み、前記ｒｅｐタンパク質が配列番号４のアミノ酸配列を有する、核酸分子。

【請求項16】

配列番号２をコードする核酸配列を含むパッケージング宿主細胞。

【請求項17】

配列番号２をコードする核酸配列を含むプラスミド。

【請求項18】

前記核酸配列が配列番号１であるか又はそれと９９％同一であり配列番号２をコードする、請求項１６に記載の宿主細胞または請求項１７に記載のプラスミド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本願は、米国国防高等研究計画局（ＤＡＲＰＡ）によってＷ９１１ＮＦ－１３－２－００３６の下に支援された研究を含んでいる。米国政府は本発明に一定の権利を有し得る。

【背景技術】

【0002】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科のメンバーであり、長さ約４．７キロ塩基（ｋｂ）の一本鎖直鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを有する小さい無エンベロープ二十面体ウイルスである。野生型ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端部にある末端逆位反復配列（ＩＴＲ）ならびに２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐ及びｃａｐを含む。Ｒｅｐは、ＡＡＶ生活環に必要なｒｅｐタンパク質をコードする４つの重複遺伝子からなり、ｃａｐは、自己組織化して二十面体対称性のカプシドを形成するカプシドタンパク質の重複ヌクレオチド配列：ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を含有する。

【0003】

ＡＡＶは、精製アデノウイルス材料中の混入物としてウイルスが発見されたことから、Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に帰属される。ＡＡＶの生活環は、感染後にＡＡＶゲノムが部位特異的に宿主染色体中に組み込まれる潜伏期と、アデノウイルスか単純ヘルペスウイルスかのどちらかへの感染に続いて組み込まれていたゲノムが後に救出され複製され感染性ウイルス内にパッケージングされる感染期とを含む。非病原性、非分裂細胞を含む広い宿主範囲の感染力、及び潜在的に部位特異的な染色体組込みの特性はＡＡＶを遺伝子移入のための魅力的なツールにする。

【0004】

増殖能欠損型ヒトパルボウイルスに由来する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは遺伝子送達のための好適なビヒクルとして表されてきた。典型的には、機能性ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子がベクターから除去されて複製不能ベクターとなっている。これらの機能は、ベクター産生システムの間は提供されているが、最終ベクターには存在していない。

【0005】

現在までに、ヒトまたは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離され十分に特性評価されたいくつかの異なるＡＡＶがある。異なる血清型のＡＡＶは、異なるトランスフェクション効率を呈し、異なる細胞または組織への向性を呈することが分かっている。ＷＯ２００５／０３３３２１には、この中でＡＡＶ９とＡＡＶｈｕ３１とＡＡＶｈｕ３２との３つのメンバーだけを有するものとして同定されているクレードＦを含めて、多くの異なるＡＡＶクレードが記載されている。ＡＡＶ９の構造解析はＭ．Ａ．ＤｉＭａｔｔｉａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（Ｊｕｎｅ ２０１２）ｖｏｌ．８６ ｎｏ．１２ ６９４７－６９５８に提供されている。この論文は、ＡＡＶ９が、ｃａｐ遺伝子によってコードされ重複配列を有する３つの可変タンパク質（ｖｐ）を（合計で）６０コピー有する ことを報告している。これらはＶＰ１（８７ｋＤａ）、ＶＰ２（７３ｋＤａ）及びＶＰ３（６２ｋＤａ）を含み、これらがそれぞれ１：１：１０の予測比で存在している。ＶＰ３の配列全体はＶＰ２中に含まれており、ＶＰ２の全てがＶＰ１中に含まれている。ＶＰ１は固有のＮ末端ドメインを有する。ＲＣＳＢ ＰＤＢデータベースから受託番号３ＵＸ１の下に精密な座標及び構造係数を入手することができる。

【0006】

いくつかの異なるＡＡＶ９変異型は、種々の組織を非標的化または標的化すべく操作されている。例えば、Ｎ．Ｐｕｌｉｃｈｅｒｉａ，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌｉｖｅｒ－ｄｅｔａｒｇｅｔｅｄ ＡＡＶ９ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｒｄｉａｃ ａｎｄ
Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ，１９，ｎｏ．６，ｐ．１０７０－１０７８（Ｊｕｎｅ ２０１１）を参照されたい。血液脳関門を越えて遺伝子を送達するためのＡＡＶ９変異型の開発も報告されている。例えば、（２０１６年２月１日にオンライン公開された）Ｂ．Ｅ．Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．２，ｐ２０４－２１１、及びＣａｌｔｅｃｈプレスリリースであるＡ．Ｗｅｔｈｅｒｓｔｏｎの２０１６年５月１０日アクセスのｗｗｗ．ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ－ｃｅｎｔｒａｌ．ｃｏｍ／２０１６／０２／１０／ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ－ｄｅｌｉｖｅｒｙ－ｏｆ－ｇｅｎｅｓ－ｔｈｒｏｕｇｈ－ｔｈｅ－ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ－ｂａｒｒｉｅｒ／を参照されたい。また、ＷＯ２０１６／０４９２３０１及びＵＳ８，７３４，８０９も参照されたい。

【0007】

望ましいとされるのは、異種分子の送達のためのＡＡＶに基づく構築物である。

【発明の概要】

【0008】

製造、及び宿主細胞に核酸分子を送達するためのベクターに有用となる、新規ＡＡＶｈｕ６８カプシド及びｒｅｐ配列を記載する。特定の実施形態では、配列番号１の核酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列をコードし配列番号１と少なくとも７０％同一、配列番号１と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％もしくは少なくとも９９％同一である核酸配列によってコードされるＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する組換えＡＡＶが提供される。

【0009】

一実施形態では、（Ａ）（１）配列番号２の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、配列番号１から産生されるｖｐ１タンパク質、もしくは配列番号２の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードし配列番号１と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、もしくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測アミノ酸配列をコードし配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、もしくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測アミノ酸配列をコードし配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質を含む、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質；及び／または（２）位置１５７のバリン及び／または位置６７のグルタミン酸を場合によって含んでいるｖｐ１タンパク質の異種集団、位置１５７に場合によってバリンを含んでいるｖｐ２タンパク質の異種集団、及びｖｐ３タンパク質の異種集団を含み、少なくともｖｐ１及びｖｐ２タンパク質の亜集団が、配列番号２のｖｐ１カプシドの付番に基づく位置１５７にバリンを含むものでありかつ場合によってはさらに位置６７にグルタミン酸を含むものである、ＡＡＶカプシドタンパク質；及び／または（３）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号２の少なくともアミノ酸２０３～７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団のうち、１つ以上を含み、ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質が、配列番号２のアスパラギン－グリシン対において少なくとも２つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含有するものでありかつ場合によっては他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団をさらに含むものであり、脱アミド化がアミノ酸変化をもたらしている、ＡＡＶ６８カプシド；ならびに（Ｂ）ＡＡＶｈｕ６８カプシド内のベクターゲノムであって、ＡＡＶ末端逆位反復配列と、産物をコードしており宿主における当該産物の発現を促す配列に機能可能に繋げられている非ＡＡＶ核酸配列とを含む核酸分子を含んでいる当該ベクターゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供される。例えば、４つの残基（Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、Ｎ５１２）は通例、高レベルの脱アミド化を呈する。さらなる残基（Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７及びＱ５９９）も様々なロットにわたって約２０％以下の脱アミド化レベルを呈する。

【0010】

特定の実施形態では、脱アミド化アスパラギンは、脱アミド化されてアスパラギン酸、イソアスパラギン酸、相互変換されるアスパラギン酸／イソアスパラギン酸対、またはそれらの組み合わせとなっている。特定の実施形態では、脱アミド化グルタミン（複数可）は、脱アミド化されて（α）－グルタミン酸、γ－グルタミン酸、相互変換される（α）－グルタミン酸／γ－グルタミン酸対、またはそれらの組み合わせになっている。

【0011】

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、（ａ）配列番号２の付番に基づいてｖｐ１タンパク質の位置５７に位置するアスパラギン－グリシン対のアスパラギン（Ｎ）の少なくとも６５％が脱アミド化されていること；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列の残基付番に基づいてｖｐ１、ｖ２及びｖｐ３タンパク質の位置３２９にあるアスパラギン－グリシン対のＮの少なくとも７５％が脱アミド化されていること；（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列の残基付番に基づいてｖｐ１、ｖ２及びｖｐ３タンパク質の位置４５２にあるアスパラギン－グリシン対のＮの少なくとも５０％が脱アミド化されていること；及び／または（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列の残基付番に基づいてｖｐ１、ｖ２及びｖｐ３タンパク質の位置５１２にあるアスパラギン－グリシン対のＮの少なくとも７５％が脱アミド化されていることのうちの１つ以上を有する亜集団を含む。特定の実施形態では、ｈｕ６８カプシドは、質量分析を用いて決定した場合にｖｐ１タンパク質の位置５７にあるＮの７５～１００％が脱アミド化されているｖｐ１の亜集団を含む。特定の実施形態では、ｈｕ６８カプシドは、質量分析を用いて決定した場合に配列番号２の付番に基づく位置３２９にあるＮの７５～１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む。特定の実施形態では、ｈｕ６８カプシドは、質量分析を用いて決定した場合に配列番号２の付番に基づく位置４５２にあるＮの７５～１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む。特定の実施形態では、ｈｕ６８カプシドは、配列番号２の付番に基づく位置５１２にあるＮの７５～１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む。特定の実施形態では、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１、または配列番号２のアミノ酸配列をコードし配列番号１と少なくとも８０％～少なくとも９０％同一である配列である。特定の実施形態では、配列は配列番号１と少なくとも８０％～９７％同一である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドはさらに、Ｎ５７、３２９、４５２、５１２またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上から選択される少なくとも４つの位置における少なくとも約５０～１００％の脱アミド化を含む配列番号２からのアミノ酸修飾を有しているｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の少なくとも亜集団を含む。特定の実施形態では、ｈｕ６８カプシドは、位置Ｎ９４、Ｎ１１３、Ｎ２５２、Ｎ２５３、Ｑ２５９、Ｎ２７０、Ｎ３０３、Ｎ３０４、Ｎ３０５、Ｎ３１９、Ｎ３２８、Ｎ３３６、Ｎ４０９、Ｎ４１０、Ｎ４７７、Ｎ５１５、Ｎ５９８、Ｑ５９９、Ｎ６２８、Ｎ６５１、Ｎ６６３、Ｎ７０９またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つ以上における１％～約４０％の脱アミド化をさらに含むｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む。特定の実施形態では、ｈｕ６８カプシドは、以下のうちの１つ以上における１つ以上の修飾から選択される１つ以上の修飾をさらに含むｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む：アセチル化リジン、リン酸化セリン及び／またはスレオニン、異性化アスパラギン酸、酸化トリプトファン及び／またはメチオニン、またはアミド化アミノ酸。特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８は、合計約６０個のカプシドタンパク質をｖｐ１対ｖｐ２対ｖｐ３タンパク質の約１対約１～１．５対３～１０の比で含む。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、合計約６０個のカプシドタンパク質をｖｐ１対ｖｐ２対ｖｐ３タンパク質の約１対約１対３～９の比で含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶｈｕ６８以外のＡＡＶ源からのＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む。

【0012】

特定の実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルスｈｕ６８（ｒＡＡＶｈｕ６８）の混合集団を含む組成物が提供され、当該ｒＡＡＶｈｕ６８の各々は独立して、本明細書に記載のｒＡＡＶｈｕ６８から選択されるものである。特定の実施形態では、平均的なＡＡＶｈｕ６８カプシドは、合計約６０個のカプシドタンパク質をｖｐ１対ｖｐ２対ｖｐ３タンパク質の約１対約１～１．５対３～１０の比で含む。特定の実施形態では、平均的なＡＡＶｈｕ６８カプシドは、合計約６０個のカプシドタンパク質をｖｐ１対ｖｐ２対ｖｐ３タンパク質の約１対約１対３～６の比で含む。特定の実施形態では、組成物はクモ膜下腔内送達のために製剤化され、ベクターゲノムは、中枢神経系への送達のための産物をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態では、組成物は静脈内送達のために製剤化される。特定の実施形態では、ベクターゲノムは抗ＨＥＲ２抗体をコードする核酸配列を含む。特定の実施形態では、組成物は鼻腔内または筋肉内送達のために製剤化される。特定の実施形態では、組成物は少なくとも、ｒＡＡＶｈｕ６８ベクター材料ならびに、任意選択の担体、賦形剤及び／または保存剤を含む。

【0013】

特定の実施形態では、所望の遺伝子産物を、それを必要とする対象に送達するための、本明細書に記載のｒＡＡＶｈｕ６８または組成物の用途が提供される。

【0014】

特定の実施形態では、組換えＡＡＶｈｕ６８を生産するために有用となるｒＡＡＶ産生システムが提供される。産生システムは、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列をコードするＡＡＶｈｕ６８カプシド核酸配列；（ｂ）ＡＡＶｈｕ６８カプシド内へのパッケージングに適した核酸分子であって、少なくとも１つのＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）と、遺伝子産物をコードしており宿主細胞における当該産物の発現を促す配列に機能可能に繋げられている非ＡＡＶ核酸配列とを含む当該核酸分子；ならびに（ｃ）組換えＡＡＶｈｕ６８カプシド内への核酸分子のパッケージングを可能にするに足るＡＡＶ ｒｅｐ機能及びヘルパー機能を含む。特定の実施形態では、（ａ）の核酸配列は少なくとも、配列番号１、または配列番号２のアミノ酸配列をコードし配列番号１と少なくとも７０％～少なくとも９９％同一である配列を含む。特定の実施形態では、システムは場合によってさらに、配列番号２の約ａａ２０３～約アミノ酸７３６のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３をコードする配列番号１の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１の核酸配列を含む。特定の実施形態では、システムはヒト胚性腎臓２９３細胞またはバキュロウイルスシステムを含む。

【0015】

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドの脱アミド化を減少させる方法が提供される。方法は、改変されたＡＡＶｈｕ６８ ｖｐコドンを含有する核酸配列からＡＡＶｈｕ６８カプシドを産生させることを含み、当該核酸配列は、配列番号２の位置５８、３３０、４５３及び／または５１３に位置するアルギニン－グリシン対の１つ～３つにおいて独立して、グリシン以外のアミノ酸をコードするような改変されたグリシンコドンを含むものである。特定の実施形態では、方法は、改変されたＡＡＶｈｕ６８ ｖｐコドンを含有する核酸配列からＡＡＶｈｕ６８カプシドを産生させることを含み、当該核酸配列は、配列番号２の位置５７、３２９、４５２及び／または５１２に位置するアルギニン－グリシン対の１つ～３つにおいて独立して、アルギニン以外のアミノ酸をコードするような改変されたアルギニンコドンを含むものである。特定の実施形態では、改変された各コドンは異なるアミノ酸をコードする。特定の実施形態では、２つ以上の改変されたコドンが、同じアミノ酸をコードする。特定の実施形態では、本明細書に記載の突然変異ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、アルギニン－グリシン対において、グリシンがアラニンまたはセリンに変化しているような突然変異を含有する。突然変異ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、基準ＡＡＶｈｕ６８が本来４つのＮＧ対を含有するものである場合、１つ、２つまたは３つの突然変異体を含有し得る。特定の実施形態では、突然変異ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＮＧ対における突然変異をたった１つだけ含有する。特定の実施形態では、突然変異ＡＡＶカプシドは、２つの異なるＮＧ対において突然変異を含有する。特定の実施形態では、突然変異ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＡＡＶｈｕ６８カプシド中の構造的に離れた場所に位置する２つの異なるＮＧ対において突然変異を含有する。特定の実施形態では、突然変異はＶＰ１固有領域の中にはない。特定の実施形態では、突然変異の１つがＶＰ１固有領域の中にある。場合によって、突然変異ＡＡＶｈｕ６カプシドは、ＮＧ対には修飾を含有していないが、ＮＧ対の外側に位置する１つ以上のアスパラギンまたはグルタミンにおいて脱アミド化を最小限にするかまたはなくす突然変異を含有している。

【0016】

特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を用いて生産され、非改変型ＡＡＶｈｕ６８カプシドに比べて脱アミド化が低減された改変型ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドを含む、突然変異ｒＡＡＶｈｕ６８が提供される。

【0017】

さらに他の態様では、組換えアデノ随伴（ｒＡＡＶ）ベクターの収率及び／またはパッケージング効率を向上させる方法が提供される。アミノ酸残基の付番がＡＡＶｈｕ６８［配列番号２］の完全長ｖｐ１に基づいており、アミノ酸位置１５７においてＶａｌであるｖｐ１タンパク質を発現するようにＡＡＶカプシド遺伝子を操作することを含む、方法。特定の実施形態では、配列番号２の付番に基づくアミノ酸位置６７にグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）を有するクレードＦ ｒＡＡＶが提供される。

【0018】

さらに他の実施形態では、この方法に従って提供される操作型ｒＡＡＶが提供される。

【0019】

さらなる実施形態では、ＨＥＲ２＋がんの治療及び／または予防のために有用である抗ＨＥＲ２抗体を発現するＡＡＶｈｕ６８粒子が提供される。

【0020】

さらに他の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｒｅｐタンパク質またはその機能性断片をコードし宿主細胞におけるその発現を促す外来調節制御配列の制御下にある核酸配列を含む核酸分子が提供される。一実施形態では、ｒｅｐタンパク質は配列番号４のアミノ酸配列またはその機能性断片を有する。

【0021】

本発明のこれら及びその他の態様は、本発明の以下の詳細な説明から明らかとなろう。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】ＡＡＶｈｕ６８のｖｐ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列［配列番号１６］（アラインメントにｈｕ．６８．ｖｐ１と標記してある）をＡＡＶ９［配列番号６］、ＡＡＶｈｕ３１（アラインメントにｈｕ．３１と標記してある）［配列番号１０］及びＡＡＶｈｕ３２（アラインメントにｈｕ．３２と標記してある）［配列番号１１］と共に示したアラインメントを示す。ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ３１及びＡＡＶｈｕ３２に比べてＡＡＶｈｕ６８では２つの突然変異（Ａ６７Ｅ及びＡ１５７Ｖ）が必須であると見出され、図中で丸で囲まれている。

【図2】Ａ～Ｃは、ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ３１［配列番号１２］及びＡＡＶｈｕ３２［配列番号１３］と共に、ＡＡＶｈｕ６８のｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列のアラインメントを示す。

【図3】Ａ～Ｂは、ＡＡＶｈｕ．６８の収率をＡＡＶ９のそれと比較して示しているグラフを示す。実験は実施例２に記載のとおりに実施した。ｎ＝６。Ｐ値を算出して図に示した。Ａは全溶解物からのＡＡＶｈｕ．６８及びＡＡＶ９の収率を示す。Ｐ値は０．４１７３と算出され、有意ではないと判定された。Ｂは培養物上清からのＡＡＶｈｕ．６８及びＡＡＶ９の収率を示す。上清中のＡＡＶｈｕ．６８の収率はＡＡＶ９のそれに比べて有意に高く、ｐ値が０．０００３である。

【図4】Ａ～Ｃは、５×１０^１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｎＬａｃＺを投与したマウスからの様々な臓器（心臓、肝臓、肺及び筋肉）の免疫組織化学染色を示す。試料は実施例３に記載のとおりに準備及び処理した。赤色で示されるエオジンで試料を対比染色した。青色で示されるＬａｃＺの陽性染色はＡＡＶｈｕ６８の形質導入の成功を示唆している。Ａは、５×１０^１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｎＬａｃＺを静脈内（ＩＶ）投与したマウスからの様々な臓器（心臓、肝臓、肺及び筋肉）の免疫組織化学染色を示す。試験した全ての臓器はＡＡＶｈｕ６８形質導入を示したが、肺及び筋肉よりも心臓及び肝臓を好む向性が認められた。Ｂは、５×１０^１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｎＬａｃＺを筋肉内（ＩＭ）投与したマウスからの様々な臓器（心臓、肝臓、肺及び筋肉）の免疫組織化学染色を示す。心臓、肝臓及び筋肉がＡＡＶｈｕ６８の高い形質導入率を示した一方、肺における検出可能な形質導入は認められなかった。Ｃは、５×１０^１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｎＬａｃＺを鼻腔内（ＩＮ）投与したマウスからの様々な臓器（心臓、肝臓、肺及び筋肉）の免疫組織化学染色を示す。心臓、肝臓、筋肉及び肺において散在する形質導入が認められた。

【図5】Ａ～Ｃは、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰまたはＡＡＶ９．ＧＦＰを１×１０^１０ＧＣまたは１×１０^１１ＧＣの用量で投与したマウスからの様々な脳領域（海馬、図５Ａ；運動野、図５Ｂ；及び小脳、図５Ｃ）の蛍光顕微鏡画像を示す。試料は実施例４に記載のとおりに準備及び処理した。緑色で示されるＧＦＰからの陽性信号はＡＡＶベクターの形質導入の成功を示唆している。Ａは、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰまたはＡＡＶ９．ＧＦＰを１×１０^１０ＧＣまたは１×１０^１１ＧＣの用量で投与したマウスからの海馬スライドの蛍光顕微鏡画像を示す。青色で示される核酸染料で染色した未処置マウスからの対応する試料を陰性対照として提供した。１×１０^１０ＧＣのＡＡＶ９．ＧＦＰを注射したマウスからのものを除く全ての試験試料において、ＡＡＶベクターの形質導入が認められた。Ｂは、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰまたはＡＡＶ９．ＧＦＰを１×１０^１０ＧＣまたは１×１０^１１ＧＣの用量で投与したマウスからの運動野の蛍光顕微鏡画像を示す。ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰの形質導入はＡＡＶ９のそれに比べてより良好であることが認められた。Ｃは、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰまたはＡＡＶ９．ＧＦＰを１×１０^１０ＧＣまたは１×１０^１１ＧＣの用量で投与したマウスからの小脳スライドの蛍光顕微鏡画像を示す。ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰの形質導入は、マウスに１×１０^１１ＧＣのベクターを注射した場合に好結果であることが認められた。

【図6】Ａ～Ｄは、 ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰを静脈内投与したマウスからの様々な臓器（肝臓、腎臓、心臓及び膵臓）の顕微鏡画像を示す。試料は実施例４に記載のとおりに準備及び処理した。緑色で示されるＧＦＰからの陽性信号は上記ＡＡＶベクターの形質導入の成功を示唆している。白黒で示される明視野画像は臓器形態学のために提供した一方、対応する赤色の蛍光チャンネルは適用可能な場合の陰性対照として提供した。Ａは、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰを静脈内投与したマウスからの代表的な肝臓切片の顕微鏡画像を示す。緑色で示される陽性信号が観察された。Ｂは、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰを静脈内投与したマウスからの代表的な腎臓切片の顕微鏡画像を示す。緑色で示される陽性信号が観察された。Ｃは、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰを静脈内投与したマウスからの代表的な心臓切片の顕微鏡画像を示す。緑色で示される陽性信号が観察された。Ｄは、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰを静脈内投与したマウスからの代表的な膵臓切片の顕微鏡画像を示す。緑色で示される陽性信号が観察された。

【図7】１０ｃｃベクターシリンジ、１０ｃｃ充填済み洗浄シリンジ、Ｔ字形コネクタ延長セット、２２Ｇ×５インチ脊髄穿刺針、任意選択の１８Ｇ×３．５インチ誘導針を備えた、共軸挿入法のための任意選択の誘導針を含む脳槽内送達用の機器の画像である。

【図8】Ａ～Ｂは、小規模（図８Ａ）及び非常に大きい規模（巨大、図８Ｂ）で作製した２つの異なるＡＡＶｈｕ６８ベクターの生産収率を、異なるカプシドを有するベクターと比較して示す。小規模ベクター調製品のデータは、ＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８またはＡＡＶ８ｔｒｉｐｌｅカプシドを有しサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）、ホタルルシフェラーゼコード配列及びＳＶ４０ポリＡ（ＣＭＶ．ｆｆＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ．ＳＶ４０）を含むベクターゲノムを有するベクターを使用して生成された。巨大規模調製品は、ＣＭＶプロモーター、イントロン、イムノアドヘシンコード配列（２０１ＩｇＩＡ）及びＳＶ４０ポリＡを有するベクターゲノムを有するＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８またはＡＡＶ８ｔｒｉｐｌｅベクターを使用して評価された。

【図9】巨大規模で作製されたＡＡＶｈｕ６８ベクターの生産純度を、ＡＡＶ８ｔｒｉｐｌｅ、ＡＡＶ９及びＡＡＶ８を含めた異なるカプシドを有するベクターと比較して示す。調製品は、ＣＭＶプロモーター、イントロン、イムノアドヘシンコード配列（２０１ＩｇＩＡ）及びＳＶ４０ポリＡを含むベクターゲノムを有するＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８またはＡＡＶ８ｔｒｉｐｌｅベクターを使用して評価された。

【図10】Ａ～Ｂは、３×１０^１１ＧＣ／マウス（図１０Ａ）か３×１０^１０ＧＣ／マウス（図１０Ｂ）かのどちらかのベクターを筋肉内注射した雄のＲＡＧ ＫＯマウス（ｎ＝５／群）におけるＡＡＶｈｕ６８ベクターの導入遺伝子発現レベルを、ＡＡＶ８ｔｒｉｐｌｅ、ＡＡＶ９及びＡＡＶ８を含めた異なるカプシドを有するベクターのそれと比較して示す。ｒＡＡＶベクターによって発現する導入遺伝子はイムノアドヘシンコード配列（２０１ＩｇＩＡ）である。実験は実施例８に詳しく記載されるとおりに実施した。

【図11】Ａ～Ｂは、３×１０^１１ＧＣ／マウスのベクターを筋肉内注射した雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝５／群）の肝臓（図１１Ａ）か筋肉（図１１Ｂ）かのどちらかにおけるＡＡＶｈｕ６８ベクターの導入遺伝子発現レベルを、ＡＡＶ８ｔｒｉｐｌｅ、ＡＡＶ９及びＡＡＶ８を含めた異なるカプシドを有するベクターのそれと比較して示す。ｒＡＡＶベクターによって発現する導入遺伝子はホタルルシフェラーゼである。実験は実施例９に詳しく記載されるとおりに実施した。

【図12】１×１０^１３ＧＣ／ｋｇ体重のベクターを筋肉内注射した雄及び雌のカニクイザルにおけるＡＡＶｈｕ６８ベクターの導入遺伝子発現レベルを、ＡＡＶ８ｔｒｉｐｌｅ、ＡＡＶ９及びＡＡＶ８を含めた異なるカプシドを有するベクターのそれと比較して示す。ｒＡＡＶベクターによって発現する導入遺伝子はイムノアドヘシンコード配列（２０１ＩｇＩＡ）である。実験は実施例１０に詳しく記載されるとおりに実施した。

【発明を実施するための形態】

【0023】

クレードＦ内にあり本明細書中でＡＡＶｈｕ６８と呼称される新規に単離されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の核酸配列及びアミノ酸を本明細書に提供する。（以前に本明細書中でＡＡＶ３Ｇ２と呼称される）ＡＡＶｈｕ６８は、配列番号２のｖｐ１の位置６７及び１５７にコードする２つのアミノ酸が、別のクレードＦウイルス ＡＡＶ９（配列番号５）とは異なっている。対照的に、他のクレードＦ ＡＡＶ（ＡＡＶ９、ｈｕ３１、ｈｕ３１）は位置６７のＡｌａ及び位置１５７のＡｌａを有する。提供するのは、配列番号２の付番に基づく位置１５７にバリン（ＶａｌまたはＶ）を有しかつ場合によっては位置６７にグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）を有する新規ＡＡＶｈｕ６８カプシド及び／または操作型ＡＡＶカプシドである。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドのｖｐ３タンパク質のｖｐ１及びｖｐ２タンパク質に対する比率は、ＡＡＶ９及びその他のクレードＦ ＡＡＶのカプシドについて以前に教示されたものよりも低い。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１：ｖｐ２：ｖｐ３の約１：１～約１．５：３～約１０の比でＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質、及びＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質からなる。特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８ウイルス材料またはｒＡＡＶｈｕ６８の集団は、ＡＡＶｈｕ６８カプシド中にｖｐ１：ｖｐ２：ｖｐ３の約１：約１：約３～６の平均比で存在する合計約６０個のｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質を有する組成物である。本明細書に記載のこれらのＡＡＶカプシドは、良好な収率及び／またはパッケージング効率を提供する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを生み出すこと、ならびに種々様々な細胞及び組織種に形質導入するために有用となるｒＡＡＶベクターを提供することに役立つ。そのような細胞及び組織種には、限定されないが、肺、心臓、筋肉、肝臓、膵臓、腎臓、脳、海馬、運動野、小脳、鼻腔上皮細胞、心臓筋肉細胞すなわち心筋細胞、肝細胞、肺内皮細胞、筋細胞、肺上皮細胞、膵島細胞、腺房細胞、腎細胞及び運動ニューロンが含まれ得る。

【0024】

「組換えＡＡＶ」または「ｒＡＡＶ」は、ＡＡＶカプシドと、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされた非ＡＡＶコード配列を少なくとも含有するベクターゲノムとの２つの要素を含有するＤＮアーゼ耐性ウイルス粒子である。特に明記しない限り、この用語は「ｒＡＡＶベクター」という語句と交換可能に使用され得る。ｒＡＡＶは、いかなる機能性ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子または機能性ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子も欠き、子孫を生み出すことができないことから、「増殖能欠損型ウイルス」または「ウイルスベクター」である。特定の実施形態では、ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が唯一のＡＡＶ配列であり、これは、ＩＴＲ間に位置する遺伝子及び調節配列をＡＡＶカプシド内にパッケージングするのを可能にするためにベクターゲノムの最遠の５’及び３’端部に位置していることが典型的である。

【0025】

本明細書中で使用する場合、「ベクターゲノム」は、ウイルス粒子を形成するｒＡＡＶカプシドの内部にパッケージングされる核酸配列を指す。そのような核酸配列は、ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含有する。本明細書中の例では、ベクターゲノムは、５’から３’へと、最低でもＡＡＶ ５’ＩＴＲ、コード配列（複数可）及びＡＡＶ ３’ＩＴＲを含有する。カプシドとは異なるＡＡＶ源であるＡＡＶ２からのＩＴＲを選択してもよいし、または完全長ＩＴＲ以外のＩＴＲを選択してもよい。特定の実施形態では、ＩＴＲは、生産中にｒｅｐ機能を提供するＡＡＶまたは相互補完的なＡＡＶと同じＡＡＶ源からのものである。さらに、他のＩＴＲを使用してもよい。さらに、ベクターゲノムは、遺伝子産物の発現を促す調節配列を含有する。ベクターゲノムの好適な構成要素については本明細書中でより詳しく述べる。

【0026】

ｒＡＡＶｈｕ６８はＡＡＶｈｕ６８カプシド及びベクターゲノムからなる。ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１の異種集団、ｖｐ２の異種集団及びｖｐ３タンパク質の異種集団の集合体である。本明細書中で使用する「異種」という用語またはその任意の文法的変化形は、ｖｐカプシドタンパク質に言及するために使用される場合、同じでない要素、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２またはｖｐ３単量体（タンパク質）を有している要素からなる集団を指す。配列番号２は、コードされているＡＡＶｈｕ６８
ｖｐ１タンパク質のアミノ酸配列を提供する。

【0027】

ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２の予測アミノ酸残基からの修飾を有するｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内及びｖｐ３タンパク質内の亜集団を含有する。これらの亜集団は、最低でも、特定の脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は少なくとも１つ、２つ、３つまたは４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）位置を配列番号２のアスパラギン－グリシン対に含んでおり、場合によってはさらに他の脱アミド化アミノ酸を含んでおり、脱アミド化がアミノ酸変化及びその他の任意選択の修飾をもたらしている。配列番号１４は改変型ＡＡＶｈｕ６８カプシドのアミノ酸配列を示し、いくらかの百分率の脱アミド化あるいは修飾されたアミノ酸を有し得る位置を例示する。これら及びその他の修飾の様々な組み合わせが本明細書中に記載されている。

【0028】

本明細書中で使用する場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、特に明記しない限り、共通して少なくとも１つの定義された特質を有しかつ、基準となる群の少なくとも１つの群メンバー～全メンバー未満からなる、ｖｐタンパク質の群を指す。例えば、ｖｐ１タンパ
ク質の「亜集団」は、特に明記しない限り、組織化ＡＡＶカプシド中の少なくとも１つのｖｐ１タンパク質でありかつ全ｖｐ１タンパク質未満である。ｖｐ３タンパク質の「亜集団」は、特に明記しない限り、組織化ＡＡＶカプシド中の１つのｖｐ３タンパク質～全ｖｐ３タンパク質未満であり得る。例えば、ｖｐ１タンパク質はｖｐタンパク質の亜集団であり得、ｖｐ２タンパク質はｖｐタンパク質の別の亜集団であり得、ｖｐ３は組織化ＡＡＶカプシド中のｖｐタンパク質のさらに別の亜集団である。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質は、異なる修飾、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つまたは４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン、例えばアスパラギン－グリシン対を有する亜集団を含有し得る。

【0029】

特に明記しない限り、高度に脱アミド化されているとは、基準アミノ酸位置の予測アミノ酸配列と比較して基準アミノ酸位置において少なくとも４５％脱アミド化されていること、少なくとも５０％脱アミド化されていること、少なくとも６０％脱アミド化されていること、少なくとも６５％脱アミド化されていること、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９７％、９９％、約１００％以下が脱アミド化されていることを指す（例えば、全ｖｐ１タンパク質を基準として配列番号２のアミノ酸５７のアスパラギンの少なくとも８０％が脱アミド化されていてもよいし、またはｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質の全てを基準として配列番号２のアミノ酸４０９のアスパラギンの２０％が脱アミド化されていてもよい）。そのような百分率は、２Ｄゲル、質量分析技術または他の好適な技術を用いて決定され得る。

【0030】

理論に拘泥することは望まないが、少なくとも、ＡＡＶｈｕ６８カプシド中のｖｐタンパク質中の高度に脱アミド化された残基の脱アミド化は、選択されたアスパラギン残基の脱アミド化及びより低い程度でのグルタミン残基の脱アミド化をするカプシドタンパク質中の官能基によって引き起こされるため、主として非酵素的な性質のものであると考えられる。大半の脱アミド化ｖｐ１タンパク質の効率的なカプシド組織化は、これらの事象がカプシド組織化の後に起こるか、または個々の単量体（ｖｐ１、ｖｐ２またはｖｐ３）での脱アミド化が構造的に十分な耐性を有しかつ組織化動態に概して影響を及ぼさないかのどちらかであることを暗示する。細胞進入前には内部に位置していると一般に考えられているＶＰ１固有（ＶＰ１－ｕ）領域（約ａａ１～１３７）での広範囲に及ぶ脱アミド化は、ＶＰ脱アミド化がカプシド組織化に先立って起こっている可能性があることを示唆している。

【0031】

理論に拘泥することは望まないが、Ｎの脱アミド化は、そのＣ末端残基の主鎖窒素原子がＡｓｎの側鎖アミド基炭素原子に求核攻撃を行うことによって起こり得る。中間体の閉環スクシンイミド残基が形成すると考えられている。スクシンイミド残基はその後、速い加水分解を行って最終生成物であるアスパラギン酸（Ａｓｐ）またはイソアスパラギン酸（ＩｓｏＡｓｐ）をもたらす。したがって、特定の実施形態では、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）の脱アミド化はＡｓｐまたはＩｓｏＡｓｐをもたらすが、これらはスクシンイミド中間体を介して例えば以下に例示するように相互変換され得る。

【化1】

本明細書中で提供される場合、配列番号２の各脱アミド化Ｎは、独立してアスパラギン酸（Ａｓｐ）、イソアスパラギン酸（ｉｓｏＡｓｐ）、アスパルテート及び／または、ＡｓｐとｉｓｏＡｓｐとの相互変換ブレンド、またはそれらの組み合わせであり得る。α－及びイソアスパラギン酸がいかなる好適な比で存在していてもよい。例えば、特定の実施形態では、比は１０：１～１：１０のアスパラギン酸対イソアスパラギン酸、約５０：５０のアスパラギン酸：イソアスパラギン酸、または約１：３のアスパラギン酸：イソアスパラギン酸、または別の選択された比であり得る。

【0032】

特定の実施形態では、配列番号２中の１つ以上のグルタミン（Ｑ）は脱アミド化してグルタミン酸（Ｇｌｕ）、すなわち、α－グルタミン酸、γ－グルタミン酸（Ｇｌｕ）または、共通のグルタルイミド（ｇｌｕｔａｒｉｎｉｍｉｄｅ）中間体を介して相互変換され得るα－及びγ－グルタミン酸のブレンドとなる。α－及びγ－グルタミン酸はいかなる好適な比で存在していてもよい。例えば、特定の実施形態では、比は１０：１～１：１０のα対γ、約５０：５０のα：γ、または約１：３のα：γ、または別の選択された比であり得る。

【化2】

【0033】

したがって、ｒＡＡＶｈｕ６８は、脱アミド化アミノ酸を有するｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドの中の亜集団を含み、これは、最低でも、少なくとも１つの高度に脱アミド化されたアスパラギンを含んでいる少なくとも１つの亜集団を含む。加えて、他の修飾は異性化を含み得、詳しくは、選択されたアスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）残基位置に含み得る。さらに他の実施形態では、修飾はＡｓｐ位置でのアミド化を含み得る。

【0034】

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、少なくとも４個～少なくとも約２５個の脱アミド化アミノ酸残基位置を有するｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３の亜集団を含有しているが、このうちの少なくとも１～１０％が、コードされる配列番号２のアミノ酸配列と比較して脱アミド化されている。これらの大部分はＮ残基であり得る。しかしながら、Ｑ残基も脱アミド化されていることがある。

【0035】

特定の実施形態では、ＡＡＶ６８カプシドは、下記のうちの１つ以上によってさらに特徴付けられる。ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質は、配列番号２の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、配列番号１から産生されるｖｐ１タンパク質、もしくは配列番号２の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードし配列番号１と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質；配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、もしくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測アミノ酸配列をコードし配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質、及び／または、配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、もしくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測アミノ酸配列をコードし配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質を含む。

【0036】

さらに、またはあるいは、位置１５７にバリンを場合によって含んでいるｖｐ１タンパク質の異種集団、位置１５７にバリンを場合によって含んでいるｖｐ２タンパク質の異種集団、及びｖｐ３タンパク質の異種集団を含み、少なくともｖｐ１及びｖｐ２タンパク質の亜集団が、配列番号２のｖｐ１カプシドの付番に基づく位置１５７にバリンを含むものでありかつ場合によってはさらに位置６７にグルタミン酸を含むものである、ＡＡＶカプシドを提供する。さらに、またはあるいは、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号２の少なくともアミノ酸２０３～７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団を含み、ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質が、アミノ酸修飾を有する亜集団を含有するものである、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを提供する。

【0037】

ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質は典型的には、配列番号２の完全長ｖｐ１アミノ酸配列（アミノ酸１～７３６）をコードする同じ核酸配列によってコードされる代替スプライシング変異型として発現する。場合によってｖｐ１コード配列は、ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質を発現すべく単独で使用される。あるいは、この配列と、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）及び／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を含まずに配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ
もしくはｔＲＮＡ（配列番号１の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）、または配列番号２のａａ２０３～７３６をコードし配列番号１と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列のうちの１つ以上とを共発現させてもよい。さらに、またはあるいは、ｖｐ１コード及び／またはｖｐ２コード配列と、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）を含まずに配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号１のｎｔ４１２～２２１２１）、または配列番号２の約ａａ１３８～７３６をコードし配列番号１と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列とを共発現させてもよい。

【0038】

本明細書中に記載するように、ｒＡＡＶｈｕ６８は、配列番号２のｖｐ１アミノ酸配列をコードするＡＡＶｈｕ６８核酸から、及び場合によっては例えばｖｐ１及び／またはｖｐ２固有領域を含まずにｖｐ３タンパク質をコードする追加の核酸配列からカプシドを発現する産生システムで産生される、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する。単一の核酸配列ｖｐ１を使用した産生の結果として得られるｒＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及びｖｐ３タンパク質の異種集団を産生する。より詳しくは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２の予測アミノ酸残基からの修飾を有するｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内及びｖｐ３タンパク質内の亜集団を含有する。これらの亜集団は最低でも脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基を含む。例えば、アスパラギン－グリシン対のアスパラギンが高度に脱アミド化されている。

【0039】

一実施形態において、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１核酸配列は、配列番号１の配列またはそれに相補的な鎖、例えば対応するｍＲＮＡまたはｔＲＮＡを有する。さらに、またはあるいは、特定の実施形態ではｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質をｖｐ１とは異なる核酸配列から発現させて例えば選択された発現系におけるｖｐタンパク質の比を変化させてもよい。特定の実施形態ではさらに、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）及び／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を含まずに配列番号２のＡＡＶｈｕ６８
ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）をコードする核酸配列またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡまたはｔＲＮＡ（配列番号１の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）も提供される。特定の実施形態ではさらに、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）を含まずに配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をコードする核酸配列またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡまたはｔＲＮＡ（配列番号１のｎｔ４１２～２２１１）も提供される。

【0040】

しかしながら、配列番号２のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列を、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドの生産に使用するために選択してもよい。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の核酸配列、または配列番号２をコードする配列番号１と少なくとも７０％～９９％同一である、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一である配列を有する。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の核酸配列、または配列番号２のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３６）をコードする配列番号１の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２１１と少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一である配列を有する。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１の核酸配列、または配列番号２のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０３～７３６）をコードするｎｔ配列番号１と少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくと
も９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一である配列を有する。

【0041】

このＡＡＶｈｕ６８カプシドをコードするＤＮＡ（ゲノムまたはｃＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）を含めた核酸配列を設計することは当技術分野における技量の範囲内である。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は配列番号１に示される。図１Ｂ～Ｄも参照されたい。他の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質を発現させるために配列番号１との７０～９９．９％の同一性を有する核酸配列が選択され得る。他の特定の実施形態では、核酸配列は配列番号１と少なくとも約７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％～９９．９％同一である。そのような核酸配列は、選択されたシステム（例えば細胞種）における発現のためにコドン最適化されてもよく、様々な方法によって設計され得る。この最適化は、オンライン入手可能な方法（例えばＧｅｎｅＡｒｔ）、公開されている方法、またはコドン最適化サービスを提供する会社、例えばＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて実施され得る。１つのコドン最適化方法は例えば米国の国際特許公開第ＷＯ２０１５／０１２９２４号に記載されており、参照によりこの全体を本明細書に援用する。また、例えば米国特許公開第２０１４／００３２１８６号及び米国特許公開第２００６／０１３６１８４号も参照されたい。産物のためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の完全長を改変することが好適である。しかしながら、いくつかの実施形態ではＯＲＦの一部のみが変更されていてもよい。これらの方法のうちの１つを用いることによって、頻度を任意の所与のポリペプチド配列に適用することができ、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を産生させることができる。コドンに対する実際の変更を実施するためまたは本明細書に記載されているとおりに設計されたコドン最適化コード領域を合成するために、多くの選択肢が利用可能である。そのような改変または合成は、当業者によく知られている標準的及び慣例的な分子生物学的操作を用いて実施され得る。１つの手法では、長さが各々８０～９０ヌクレオチドであり所望の配列の長さにまたがる一連の相補的オリゴヌクレオチド対は、標準的な方法によって合成される。これらのオリゴヌクレオチド対は、それらがアニーリング時に付着末端を含有する８０～９０塩基対の二本鎖断片を形成するように合成され、例えば、対の各オリゴヌクレオチドは、対のもう一方のオリゴヌクレオチドに相補的な領域を越えて３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多い塩基を延出させるように合成される。各対のオリゴヌクレオチドの一本鎖端部は、別の対のオリゴヌクレオチドの一本鎖端部とアニーリングするように設計される。オリゴヌクレオチド対をアニーリングさせ、その後、これらの二本鎖断片のおよそ５～６個を付着一本鎖端部を介してアニーリングさせ、その後、それらをライゲートし合わせ、標準的な細菌クローニングベクター、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆから入手することができるＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングする。その後、構築物の配列決定を標準的な方法で行う。ライゲートされ合った５～６断片の８０～９０塩基対断片、すなわち約５００塩基対の断片からなるこれらの構築物のいくつかは、所望の配列の全体が一連のプラスミド構築物として表されるように作製される。その後、これらのプラスミドのインサートを適切な制限酵素で切断し、ライゲートし合わせて最終構築物を形成する。その後、最終構築物を標準的な細菌クローニングベクターにクローニングし、配列決定する。さらなる方法は当業者であればすぐに分かるであろう。加えて、遺伝子合成は商業的に容易に入手することができる。

【0042】

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質中のＮ－Ｇ対のアスパラギン（Ｎ）が高度に脱アミド化されている。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質中の高度に脱アミド化された少なくとも４つのアスパラギン（Ｎ）位置を有するＡＡＶ ｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３カプシドタンパク質の亜集団を含有する。特定の実施形態では、Ｎ－Ｎ対（Ｎ－Ｎ－
Ｎ三つ組を除く）の約２０～５０％は脱アミド化を示す。特定の実施形態では、最初のＮが脱アミド化されている。特定の実施形態では、２つ目のＮが脱アミド化されている。特定の実施形態では、脱アミド化は約１５％～約２５％の脱アミド化である。配列番号２の位置２５９にあるＱにおける脱アミド化は、ＡＡＶｈｕ６８タンパク質のＡＡＶｈｕ６８
ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３カプシドタンパク質の約８％～約４２％である。

【0043】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質のＤ２９７におけるアミド化によってさらに特徴付けられる。特定の実施形態では、配列番号２の付番に基づいて、ＡＡＶｈｕ６８カプシド中のｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の位置２９７にあるＤの約７０％～約７５％がアミド化されている。

【0044】

特定の実施形態では、カプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３において少なくとも１つのＡｓｐがＤ－Ａｓｐに異性化している。そのような異性体は通常、配列番号２の付番に基づく残基位置９７、１０７、３８４のうちの１つ以上にあるＡｓｐの約１％未満の量で存在する。

【0045】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８は、以下の表に示す位置にある１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の脱アミド化残基の組み合わせを含む亜集団を有するｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質を有しているＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する。ｒＡＡＶにおける脱アミド化は、２Ｄゲル電気泳動及び／または質量分析及び／またはタンパク質モデリング技術を用いて決定され得る。Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐカラム、及びＮａｎｏＦｌｅｘソースを備えたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と連結したＴｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ＲＳＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてオンラインクロマトグラフィーを実施してもよい。ＭＳデータは、検査スキャン（２００～２０００ｍ／ｚ）から最も豊富な配列未決定の前駆体イオンを動的に選択する、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦのためのデータ依存的上位２０位法を用いて取得される。配列決定は、予測自動ゲイン制御を用いて決定される目標値を１ｅ５イオンとする高エネルギー衝突解離フラグメンテーションによって実施し、前駆体の単離は余裕枠を４ｍ／ｚとして実施した。検査スキャンは、ｍ／ｚ２００で１２０，０００の分解能で取得した。ＨＣＤスペクトルの分解能は、最大イオン注入時間を５０ｍｓとし正規化衝突エネルギーを３０としてｍ／ｚ２００で３０，０００に設定され得る。Ｓ－レンズＲＦレベルは、消化物からのペプチドが占有するｍ／ｚ領域の透過を最適化するために５０に設定され得る。前駆体イオンは、単一の未帰属の、または６つ以上の荷電状態によってフラグメンテーション選択から除外され得る。取得データの解析のためにＢｉｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ １．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が使用され得る。ペプチドマッピングのためには単一入力タンパク質ＦＡＳＴＡデータベースを使用し、カルバミドメチル化を固定の修飾に設定し、酸化、脱アミド化及びリン酸化を可変の修飾に設定し、質量精度を１０ｐｐｍとし、高いプロテアーゼ特異性とし、信頼度レベルをＭＳ／ＭＳスペクトルのために０．８として、検索を実施する。好適なプロテアーゼの例には、例えばトリプシンまたはキモトリプシンが含まれ得る。脱アミド化は未処理の分子の質量に＋０．９８４Ｄａ（－ＯＨ基と－ＮＨ_２基との質量差）だけ足すので、質量分析による脱アミド化ペプチドの同定は比較的平易である。特定のペプチドの脱アミド化パーセントは、脱アミド化ペプチドの決定された質量面積を脱アミド化ペプチドと元のペプチドとの合計面積で割ったものである。脱アミド化可能な部位の数を考える場合、異なる部位で脱アミド化されている同重体種同士は、寄り合って１本のピークとなり得る。結果として、複数の潜在的脱アミド化部位を有するペプチドから発生するフラグメントイオンを用いて脱アミド化の複数の部位を突き止める、または区別することができる。これらの場合には、観察された同位体パターンの相対強度を用いて種々の脱アミド化ペプチド異性体の相対存在量を具体的に決定することができる。この方法は、全ての異性体種についてフラグメンテーション効率が同じであり脱アミド化の部位に無関係であることを仮定している。当業者であれば、これらの例示的方法に対する多くの変更を用いることができることを理解するであろう。例えば、好適な質量分析装置としては、Ｗａｔｅｒｓ ＸｅｖｏもしくはＡｇｉｌｅｎｔ ６５３０などの四重極型飛行時間質量分析装置（ＱＴＯＦ）または、Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＦｕｓｉｏｎもしくはＯｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）などのオービトラップ型装置が挙げられ得る。好適な液体クロマトグラフィーシステムとしては、例えば、ＷａｔｅｒｓからのＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステム、またはＡｇｉｌｅｎｔシステム（シリーズ１１００または１２００）が挙げられる。好適なデータ解析ソフトウェアは、例えば、ＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ ａｎｄ Ｐｅｐｆｉｎｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｐｅａｋｓ ＤＢ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を含み得る。さらに他の技術は、例えば、２０１７年６月１６日にオンライン公開されたＸ．Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．５，ｐｐ．２５５－２６７に記載されている可能性がある。

【表1-1】

【表1-2】

【0046】

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２のアミノ酸配列の付番に基づく位置Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２及び／またはＮ５１２のうちの少なくとも１つにおいてＮ残基の少なくとも４５％が脱アミド化されているカプシドタンパク質を有することによって特徴付けられる。特定の実施形態では、これらのＮ－Ｇ位置（すなわち、配列番号２のアミノ酸配列の付番に基づいてＮ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２及び／またはＮ５１２）のうちの１つ以上にあるＮ残基の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも９０％が脱アミド化されている。これら及びその他の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２のアミノ酸配列の付番に基づく位置Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７及び／またはＱ５９９のうちの１つ以上においてＮ残基の約１％～約２０％が脱アミド化を有しているタンパク質の集団を有することによってさらに特徴付けられる。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８は少なくとも、配列番号２のアミノ酸配列の付番に基づく位置Ｎ３５、Ｎ５７、Ｎ６６、Ｎ９４、Ｎ１１３、Ｎ２５２、Ｎ２５３、Ｑ２５９、Ｎ２７０、Ｎ３０３、Ｎ３０４、Ｎ３０５、Ｎ３１９、Ｎ３２８、Ｎ３２９、Ｎ３３６、Ｎ４０９、Ｎ４１０、Ｎ４５２、Ｎ４７７、Ｎ５１５、Ｎ５９８、Ｑ５９９、Ｎ６２８、Ｎ６５１、Ｎ６６３、Ｎ７０９、Ｎ７３５のうちの１つ以上またはその組み合わせにおいて脱アミド化されているｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は１つ以上のアミド化アミノ酸を有し得る。

【0047】

さらに他の修飾が認められるが、そのほとんどは、あるアミノ酸から別のアミノ酸残基への変換をもたらさない。場合によってはカプシドのｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３の少なくとも１つのＬｙｓがアセチル化されている。場合によってはカプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３の少なくとも１つのＡｓｐがＤ－Ａｓｐに異性化している。場合によってはカプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３の少なくとも１つのＳ（Ｓｅｒ、セリン）がリン酸化されている。場合によってはカプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３の少なくとも１つのＴ（Ｔｈｒ、スレオニン）がリン酸化されている。場合によってはカプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３の少なくとも１つのＷ（ｔｒｐ、トリプトファン）が酸化されている。場合によってはカプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３の少なくとも１つのＭ（Ｍｅｔ、メチオニン）が酸化されている。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は１つ以上のリン酸化を有する。例えば、特定のｖｐ１カプシドタンパク質が位置１４９においてリン酸化されている場合がある。

【0048】

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質であって位置６７のグルタミン酸（Ｇｌｕ）及び／または位置１５７のバリン（Ｖａｌ）を含んでいる当該ｖｐ１タンパク質の異種集団；位置１５７に場合によってバリン（Ｖａｌ）を含んでいるｖｐ２タンパク質の異種集
団；ならびにｖｐ３タンパク質の異種集団を含む。ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２のアミノ酸配列の残基付番に基づいてｖｐ１タンパク質の位置５７に位置するアスパラギン－グリシン対のアスパラギン（Ｎ）の少なくとも６５％、ならびにｖｐ１、ｖ２及びｖｐ３タンパク質の位置３２９、４５２及び／または５１２にあるアスパラギン－グリシン対のアスパラギン（Ｎ）の少なくとも７０％が脱アミド化されており、脱アミド化がアミノ酸変化をもたらしている、少なくとも１つの亜集団を含有する。

【0049】

本明細書中でより詳しく述べるように、脱アミド化アスパラギンは、脱アミド化されてアスパラギン酸、イソアスパラギン酸、相互変換されるアスパラギン酸／イソアスパラギン酸対、またはそれらの組み合わせとなったものであり得る。特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８は、（ａ）ｖｐ２タンパク質の各々が独立して、少なくとも配列番号２のｖｐ２タンパク質をコードする核酸配列の産物であること；（ｂ）ｖｐ３タンパク質の各々が独立して、少なくとも配列番号２のｖｐ３タンパク質をコードする核酸配列の産物であること；（ｃ）ｖｐ１タンパク質をコードする核酸配列が配列番号１、または配列番号２のアミノ酸配列をコードし配列番号１と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一である配列であることのうちの１つ以上によってさらに特徴付けられる。場合によってはその配列を単独で使用してｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質を発現させる。あるいは、この配列と、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）及び／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を含まずに配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号１の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）、または配列番号２のａａ２０３～７３６をコードし配列番号１と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列のうちの１つ以上とを共発現させてもよい。さらに、またはあるいは、ｖｐ１コード及び／またはｖｐ２コード配列と、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）を含まずに配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号１のｎｔ４１２～２２１１）、または配列番号２の約ａａ１３８～７３６をコードし配列番号１と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列とを共発現させてもよい。

【0050】

さらに、またはあるいは、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは少なくとも、配列番号２の付番に基づく位置Ｎ５７、Ｎ６６、Ｎ９４、Ｎ１１３、Ｎ２５２、Ｎ２５３、Ｑ２５９、Ｎ２７０、Ｎ３０３、Ｎ３０４、Ｎ３０５、Ｎ３１９、Ｎ３２８、Ｎ３２９、Ｎ３３６、Ｎ４０９、Ｎ４１０、Ｎ４５２、Ｎ４７７、Ｎ５１２、Ｎ５１５、Ｎ５９８、Ｑ５９９、Ｎ６２８、Ｎ６５１、Ｎ６６３、Ｎ７０９のうちの１つ以上またはその組み合わせにおいて脱アミド化されているｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む；（ｅ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２の付番に基づく位置Ｎ６６、Ｎ９４、Ｎ１１３、Ｎ２５２、Ｎ２５３、Ｑ２５９、Ｎ２７０、Ｎ３０３、Ｎ３０４、Ｎ３０５、Ｎ３１９、Ｎ３２８、Ｎ３３６、Ｎ４０９、Ｎ４１０、Ｎ４７７、Ｎ５１５、Ｎ５９８、Ｑ５９９、Ｎ６２８、Ｎ６５１、Ｎ６６３、Ｎ７０９のうちの１つ以上またはその組み合わせにおいて１～２０％の脱アミド化を含むｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む；（ｆ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２の付番に基づいてｖｐ１タンパク質の位置５７にあるＮの６５～１００％が脱アミド化されているｖｐ１の亜集団を含む；（ｇ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質の位置５７にあるＮの７５～１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質の亜集団を含む；（ｈ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２の付番に基づく位置３２９にあるＮの８０～１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む；（ｉ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２の付番に基づく位置４５２にあるＮの８０～１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む；（ｊ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２の付番に基づく位置５１２にあるＮの８０～１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む；（ｋ）ｒＡＡＶは、合計約６０個のカプシドタンパク質をｖｐ１対ｖｐ２対ｖｐ３タンパク質の約１対約１～１．５対３～１０の比で含む；（ｌ）ｒＡＡＶは、合計約６０個のカプシドタンパク質をｖｐ１対ｖｐ２対ｖｐ３タンパク質の約１対約１対３～９の比で含む。

【0051】

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８は、脱アミド化を減少させるべくアスパラギン－グリシン対のグリシンを変化させるように改変される。他の実施形態では、アスパラギンを、より遅い速度で脱アミド化される別のアミノ酸、例えばグルタミン；またはアミド基（例えば、グルタミン及びアスパラギンはアミド基を含有する）を欠くアミノ酸；及び／またはアミン基（例えば、リジン、アルギニン及びヒスチジンはアミド基を含有する）を欠くアミノ酸に変化させる。本明細書中で使用する場合、アミドまたはアミン側基を欠くアミノ酸は、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファン及び／またはプロリンを指す。記載しているような改変は、コードされるＡＡＶｈｕ６８アミノ酸配列にみられるアスパラギン－グリシン対のうちの１つ、２つまたは３つにおいてなされ得る。特定の実施形態では、４つ全てのアスパラギン－グリシン対においてそのような改変がなされるわけではない。このように、脱アミド化速度がより低い、ＡＡＶｈｕ６８及び／または操作型ＡＡＶｈｕ６８変異型の脱アミド化を減少させる方法。さらに、またはあるいは、他の１つ以上のアミドアミノ酸を非アミドアミノ酸に変えてＡＡＶｈｕ６８の脱アミド化を減少させてもよい。

【0052】

これらのアミノ酸修飾は従来の遺伝子操作技術によってなされ得る。例えば、配列番号２の位置５８、３３０、４５３及び／または５１３においてグリシン（アルギニン－グリシン対）をコードするコドンの１つ～３つが改変されてグリシン以外のアミノ酸をコードしている改変されたＡＡＶｈｕ６８ ｖｐコドンを含有する核酸配列が生み出され得る。特定の実施形態では、改変されたアルギニンコドンを含有する核酸配列は、配列番号２の位置５７、３２９、４５２及び／または５１２に位置するアルギニン－グリシン対の１つ～３つにおいて、改変されたコドンがアルギニン以外のアミノ酸をコードするように操作されていてもよい。改変された各コドンは、異なるアミノ酸をコードしていてもよい。あるいは、変更したコドンの１つ以上が同じアミノ酸をコードしていてもよい。特定の実施形態では、これらの改変型ＡＡＶｈｕ６８核酸配列は、天然ｈｕ６８カプシドよりも低い脱アミド化を有するカプシドを有している突然変異ｒＡＡＶｈｕ６８を生み出すために使用され得る。そのような突然変異ｒＡＡＶｈｕ６８は、低減された免疫原性を有し得、及び／または貯蔵時、特に懸濁液形態での貯蔵時の安定性を向上させ得る。本明細書中で使用する場合、「コドン」は、配列中のアミノ酸をコードする３つのヌクレオチドを指す。

【0053】

本明細書中で使用する場合、「コードされるアミノ酸配列」とは、アミノ酸に翻訳される基準核酸配列の既知ＤＮＡコドンの翻訳に基づいて予測されるアミノ酸を指す。以下の表はＤＮＡコドン及び２０個の一般的なアミノ酸を示し、一文字コード（ＳＬＣ）及び三文字コード（３ＬＣ）を両方とも示す。

【表2】

【0054】

ＡＡＶｈｕ６８カプシドは特定の実施形態に有用であり得る。例えば、そのようなカプシドは、モノクローナル抗体を生成する際、及び／または遺伝子療法患者のＡＡＶｈｕ６８濃度レベルを追跡評価するためのアッセイにおいて有用となる試薬を生成する際に使用され得る。有用な抗ＡＡＶｈｕ６８抗体を生み出す技術、そのような抗体または空のカプシドの標識付け、及び好適なアッセイ構成は当業者に知られている。

【0055】

特定の実施形態では、配列番号１の核酸配列、または本明細書に記載の修飾（例えば脱アミド化アミノ酸）を有する配列番号２のｖｐ１アミノ酸配列をコードし少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％である配列が提供される。特定の実施形態では、ｖｐ１アミノ酸配列は配列番号１４で再現される。

【0056】

本明細書中で使用する、ＡＡＶの群に関する「クレード」という用語は、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列のアラインメントに基づいて（少なくとも１０００個の複製物の）少なくとも７５％のブートストラップ値及び０．０５以下のポアソン補正距離測定値による近接結合アルゴリズムを用いて判定した場合に系統学的に互いに関連し合っているＡＡＶの群を指す。近接結合アルゴリズムは文献に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい。このアルゴリズムを実行するために使用することができるコンピュータプログラムは入手可能である。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムは改変Ｎｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実装している。これらの技術及びコンピュータプログラムならびにＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を用いて当業者は、選択されたＡＡＶが本明細書で特定されるクレードの１つに含まれているか、別のクレードに含まれているか、またはこれらのクレードから外れるかについて容易に判定することができる。例えば、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦを同定し新規ＡＡＶ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５５３～ＡＹ５３０６２９の核酸配列を提供しているＧ Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００４ Ｊｕｎ；７８（１０：６３８１－６３８８を参照されたい。また、ＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。

【0057】

一実施形態では、本発明は、スペーサー配列をＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１コード配列とＡＡＶｈｕ６８ ｒｅｐコード配列との間に含んでいる操作された分子を提供する。このコード配列は、ａｔｇａｃｔｔａａａｃｃａｇｇｔ、配列番号９である。ＡＡＶｈｕ６８のｒｅｐ５２のコード配列は配列番号３で再現される。ｒｅｐ５２タンパク質配列は配列番号４で再現される。

【0058】

一実施形態では、ｒＡＡＶの収率を向上させる、したがって細胞溶解の前に、またはそれを必要とせずに、上清中に存在するｒＡＡＶの量を増加させる方法が提供される。この方法は、ＡＡＶ ＶＰ１カプシド遺伝子を操作して、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１カプシドタンパク質のアミノ酸付番を有するアラインメントに基づく位置６７にＧｌｕを有しかつ位置１５７にＶａｌを有さないカプシドタンパク質を発現させることを含む。他の実施形態では、方法は、ＡＡＶｈｕ６８ ＶＰ１カプシド遺伝子を操作して、位置１５７にＶａｌを有しかつ位置６７にＧｌｕを有さないカプシドタンパク質を発現させることを含む。そのような他のＡＡＶは、他のクレードＦ ＡＡＶ、またはクレードＡ、Ｂ、Ｃ、ＤもしくはＥのＡＡＶから容易に選択され得る。特定の実施形態では、ＡＡＶは、クレードＣ、Ｄ、ＥまたはＦから選択される。他の実施形態では、ＡＡＶはクレードＣ、ＤまたはＥから選択される。

【0059】

他の実施形態では、方法は、ｒＡＡＶの収率を向上させる、したがって細胞溶解の前に、またはそれを必要とせずに、上清中に存在するｒＡＡＶの量を増加させることを含む。この方法は、ＡＡＶ ＶＰ１カプシド遺伝子を操作して、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１カプシドタンパク質のアミノ酸付番を有するアラインメントに基づく位置６７のＧｌｕ、位置１５７のＶａｌまたは両方ともを有するカプシドタンパク質を発現させることを含む。他の実施形態では、方法は、ＶＰ２カプシド遺伝子を操作して、位置１５７にＶａｌを有するカプシドタンパク質を発現させることを含む。さらに他の実施形態では、ｒＡＡＶは、位置６７においてＧｌｕであり位置１５７においてＶａｌであるｖｐ１及びｖｐ２カプシドタンパク質の両方を含む改変型カプシドを有する。

【0060】

さらに他の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１付番［配列番号２］を基準として位置６７にＳｅｒ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＴｈｒを有すると同時に位置１５７ではＶａｌを保持するように、操作され得る。さらに他の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１付番［配列番号２］を基準として位置１５７にＩｌｅまたはＬｅｕを有するように操作され得る。さらに別の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１付番［配列番号２］を基準として位置６７のＳｅｒ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＴｈｒ、及び位置１５７のＩｌｅまたはＬｅｕを有するように操作され得る。

【0061】

さらなる実施形態では、ＡＡＶ９と比較してパッケージングされるベクターの収率の少なくとも１５％の増加をもたらす、クレードＦ ＡＡＶの中に導入遺伝子をパッケージングする方法は、宿主細胞培養物を好適な条件によって培養することを含む。特定の実施形態では、増加は収率の少なくとも９０％の増加である。他の実施形態では、増加は収率の少なくとも２００％の増加である。

【0062】

ＡＡＶｈｕ６８とＡＡＶｒｈ１０とを比較した場合、脳室内投与後に低用量（例えば約１×１０^９）でＡＡＶｈｕ６８はＡＡＶｒｈ１０よりも良好な形質導入効率をもたらすことが見出された。さらにＡＡＶｈｕ６８とＡＡＶ９とを比較した場合、脳室内投与後に小脳、運動野及び脳の海馬において（例えば約１×１０^１１ＧＣで）ＡＡＶｈｕ６８はＡＡＶ９よりも良好な形質導入効率をもたらすことが見出された。

【0063】

特定の実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２受容体を指向する抗体を発現するベクターゲノムを含むＡＡＶｈｕ６８ベクターを提供する。そのようなベクターはがんの治療及び／または予防に有用である。

【0064】

本明細書中で使用する場合、「ＡＡＶ９カプシド」は、複数のＡＡＶ９ ｖｐタンパク質からなる自己組織化ＡＡＶカプシドである。ＡＡＶ９ ｖｐタンパク質は典型的には、配列番号５の核酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％であり配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋ受託：ＡＡＳ９９２６４）のｖｐ１アミノ酸配列をコードする配列によってコードされる、代替スプライシング変異型として発現する。これらのスプライシング変異型は、配列番号６の様々な長さのタンパク質となる。特定の実施形態では、「ＡＡＶ９カプシド」は、ＡＡＳ９９２６４と９９％同一であるかまたは配列番号６と９９％同一であるアミノ酸配列を有するＡＡＶを含む。ＵＳ７９０６１１１及びＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。本明細書中で使用する「ＡＡＶ９変異型」には、例えばＷＯ２０１６／０４９２３０、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／０３４４９１１及びＵＳ８，７３４，８０９に記載されているものが含まれる。

【0065】

カプシドを生み出す方法、そのためのコード配列、及びｒＡＡＶウイルスベクターを生産する方法については教示がなされている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）及びＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。

【0066】

核酸またはその断片に言及する場合、「実質的な相同性」または「実質的な類似性」という用語は、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って別の核酸（またはその相補鎖）との最適なアラインメントをしたときに、アラインメントされた配列の少なくとも約９５～９９％にヌクレオチド配列同一性があることを表す。相同性は、完全長配列またはそのオープンリーディングフレーム、または長さが少なくとも１５ヌクレオチドである別の好適な断片にわたっていることが好ましい。好適な断片の例は本明細書に記載されている。

【0067】

核酸配列に関する「配列同一性」、「配列同一性パーセント」または「パーセント同一」という用語は、最大限に対応させるためにアラインメントしたときに同一である、２つの配列の中の残基を指す。配列同一性比較の長さは、ゲノムの完全長、遺伝子コード配列の完全長に及び得、または少なくとも約５００～５０００ヌクレオチドの断片が望まれる。しかしながら、より小さい、例えば少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約２０～２４ヌクレオチド、少なくとも約２８～３２ヌクレオチド、少なくとも約３６またはそれより多いヌクレオチドの断片の同一性が望まれることもある。同様に、「配列同一性パーセント」は、アミノ酸配列に対してタンパク質の完全長またはその断片にわたって容易に決定され得る。好適な断片は長さが少なくとも約８アミノ酸であり、約７００アミノ酸以下であり得る。好適な断片の例は本明細書に記載されている。

【0068】

アミノ酸またはその断片に言及する場合、「実質的な相同性」または「実質的な類似性」という用語は、適切なアミノ酸挿入または欠失を伴って別のアミノ酸（またはその相補鎖）との最適なアラインメントをしたときに、アラインメントされた配列の少なくとも約９５～９９％にアミノ酸配列同一性があることを表す。相同性は、完全長配列またはそのタンパク質、例えば、ｃａｐタンパク質、ｒｅｐタンパク質、または長さが少なくとも８アミノ酸もしくはより好ましくは少なくとも１５アミノ酸であるその断片にわたっていることが好ましい。好適な断片の例は本明細書に記載されている。

【0069】

「高度に保存された」という用語は、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは９７％を上回る同一性を意味する。同一性は、当業者に知られているアルゴリズム及びコンピュータプログラムを利用することで当業者によって容易に決定される。

【0070】

一般に、２つの異なるアデノ随伴ウイルス同士の「同一性」、「相同性」または「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」または「類似性」は、「アラインメントされた」配列に関して決定される。「アラインメントされた」配列、または「アラインメント」とは、基準配列に比べて欠落しているかまたは追加されている塩基またはアミノ酸の補正をしばしば含有する複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。例では、公開されているＡＡＶ９配列を基準点として使用してＡＡＶアラインメントを実施する。アラインメントは、公的または商業的に入手することができる様々な多重配列アラインメントプログラムのいずれかを使用して実施される。そのようなプログラムの例としては、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＭＡＰ」及び「ＭＥＭＥ」が挙げられ、これらはインターネット上のウェブサービスを通じて入手可能である。そのようなプログラムの他の提供元は当業者に知られている。あるいは、ベクターＮＴＩユーティリティーも使用される。また、上記プログラムの中に含まれているものを含めて、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる当技術分野で知られている多くのアルゴリズムが存在する。別の例として、ＧＣＧ バージョン６．１の中のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を使用してポリヌクレオチド配列を比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、クエリー配列と検索配列との間で最もよく重複している領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する。例えば、参照により本明細書に援用するＧＣＧ バージョン６．１において提供されるようなデフォルトパラメータ（６のワードサイズ、スコア行列のためのＮＯＰＡＭ係数）でＦａｓｔａ（商標）を使用して核酸配列同士の配列同一性パーセントを決定することができる。また、複数の配列アラインメントプログラム、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムがアミノ酸配列に対しても利用可能である。一般的にはこれらのプログラムのいずれかをデフォルト設定で使用するが、当業者であればこれらの設定を必要に応じて変更することができる。あるいは、当業者であれば、もたらされる同一性またはアラインメントのレベルが基準アルゴリズム及びプログラムによってもたらされるそのレベルと少なくとも同程度である別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。

【0071】

Ｉ．ｒＡＡＶベクター
上に示したとおり、新規ＡＡＶｈｕ６８配列及びタンパク質は、ｒＡＡＶの生産において有用であり、アンチセンス送達ベクター、遺伝子療法ベクターまたはワクチンベクターであり得る組換えＡＡＶベクターにおいても有用である。さらに、本明細書に記載の操作型ＡＡＶカプシド、例えば配列番号２のｖｐ１カプシドタンパク質の付番に関する位置６７、１５７または両方に突然変異アミノ酸を有するものは、多くの好適な核酸分子の標的細胞及び組織への送達のためにｒＡＡＶベクターを操作するために使用され得る。

【0072】

ＡＡＶカプシド内にパッケージングされ宿主細胞に送達されるゲノム配列は、典型的には、最低でも、導入遺伝子及びその調節配列、ならびにＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）からなる。一本鎖ＡＡＶ及び自己相補性（ｓｃ）ＡＡＶはどちらもｒＡＡＶに包含される。導入遺伝子は、ベクター配列にとって異種である核酸コード配列であるが、これは、関心対象のポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害薬）またはその他の遺伝子産物をコードするものである。核酸コード配列は、標的組織の細胞における導入遺伝子の転写、翻訳及び／または発現を可能にするように調節性構成要素に機能的に繋げられる。

【0073】

ベクターのＡＡＶ配列は典型的には、シス作用性５’及び３’末端逆位反復配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照のこと）。ＩＴＲ配列は長さが約１４５ｂｐである。ＩＴＲをコードする配列の実質的に全体が分子に使用されることが好ましいが、これらの配列のある程度の小さな改変は容認される。これらのＩＴＲ配列を改変する能力は当業者の技量範囲内である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、及びＫ． Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）を参照のこと）。本発明において採用されるそのような分子の一例は、選択された導入遺伝子配列と関連する調節エレメントとが５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に挟まれた、導入遺伝子を含有する「シス作用性」プラスミドである。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給しているものとは異なるＡＡＶからのものである。一実施形態では、ＩＴＲ配列はＡＡＶ２からのものである。ΔＩＴＲと呼ばれる、Ｄ－配列及び末端分解部位（ｔｒｓ）が欠失している５’ＩＴＲの短縮形態について教示がなされている。他の実施形態では、完全長のＡＡＶ ５’及び３’ＩＴＲが使用される。しかしながら、他のＡＡＶ源からのＩＴＲを選択してもよい。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２でありＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ源からのものである場合、結果として得られるベクターは、偽型化されていると呼称され得る。しかしながら、これらの要素の他の配置が好適である場合がある。

【0074】

組換えＡＡＶベクターに関して上に特定した主要な要素に加えて、ベクターはさらに、本発明によって生産されプラスミドベクターがトランスフェクトされているかまたはウイルスに感染している細胞における導入遺伝子の転写、翻訳及び／または発現を可能にするように導入遺伝子に機能可能に繋げられた必要な一般的制御エレメントも含む。本明細書中で使用する場合、「機能可能に繋げられている」配列には、関心対象遺伝子と連続している発現制御配列と、トランスで、または遠くで作用して関心対象遺伝子を制御する発現制御配列との両方が含まれる。

【0075】

調節制御エレメントは典型的には、例えば選択された５’ＩＴＲ配列とコード配列との間に位置する、発現制御配列の一部としてのプロモーター配列を含有する。恒常的プロモーター、調節可能なプロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照のこと］、組織特異的プロモーター、または生理学的合図に応答するプロモーターを本明細書に記載のベクターに使用、利用してもよい。プロモーター（複数可）は種々の供給源、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時早期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０早期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリオーマウイルス（ｐｏｌｙｍｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）またはグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）潜伏関連プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、神経特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックスメタロプロテインプロモーター（ＭＰＰ）及びニワトリβ－アクチンプロモーターから選択することができる。プロモーターに加えて、ベクターは、１つ以上の他の適切な転写開始、転写終結、エンハンサー配列、効率的ＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、例えばＷＰＲＥ；翻訳効率を向上させる配列（すなわち、コザック共通配列）；タンパク質安定性を向上させる配列；ならびに、所望により、コード産物の分泌を増進する配列を含有していてもよい。好適なエンハンサーの一例はＣＭＶエンハンサーである。その他の好適なエンハンサーには、所望の標的組織兆候に適するものが含まれる。一実施形態では、発現カセットは１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、発現カセットは２つ以上の発現エンハンサーを含む。これらのエンハンサーは、同じであってもよいし、または互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーはＣＭＶ即時早期エンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２コピーとして存在していてもよい。あるいは、エンハンサーの二重コピーは１つ以上の配列によって互いに隔てられていてもよい。さらに別の実施形態では、発現カセットはさらにイントロン、例えばニワトリベータアクチンイントロンを含有する。他の好適なイントロンとしては、当技術分野で知られているもの、例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８に記載されているものなどが挙げられる。好適なポリＡ配列の例としては、例えば、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、及び合成ポリＡが挙げられる。場合によって、ｍＲＮＡを安定化させるために１つ以上の配列を選択してもよい。そのような配列の一例は改変型ＷＰＲＥ配列であるが、これは、ポリＡ配列の上流及びコード配列の下流において操作されたものであり得る［例えば、ＭＡ Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６：６０５－６１９を参照のこと］。

【0076】

これらのｒＡＡＶは、治療目的のための遺伝子送達、及び防御免疫性を誘導することを含めた免疫化に特によく適している。さらに、本発明の組成物を試験管内での所望の遺伝子産物の生産のために使用してもよい。試験管内生産の場合、所望の産物をコードする分子を含有するｒＡＡＶによる宿主細胞のトランスフェクション、及び発現を可能にする条件下での細胞培養物の培養の後に、所望の培養物から所望の産物（例えばタンパク質）が得られ得る。発現する産物はその後、所望により精製及び単離され得る。トランスフェクション、細胞培養、精製及び単離のための好適な技術は当業者に知られている。

【0077】

特定の実施形態では、本明細書において提供されるｒＡＡＶまたは組成物は抗インフルエンザ抗体または免疫グロブリン構築物を含有しない。特定の実施形態では、本明細書において提供されるｒＡＡＶまたは組成物はＳＭＮコード配列を含有しない。

【0078】

治療用遺伝子及び遺伝子産物
導入遺伝子によってコードされる有用な産物には、欠乏もしくは欠損遺伝子を置き換えるか、望ましくない高レベルで発現している遺伝子の発現を不活性化もしくは「ノックアウト」させる、または「ノックダウン」もしくは減少させるか、または所望の治療効果を有する遺伝子産物を送達する、様々な遺伝子産物が含まれる。ほとんどの実施形態において治療は「体細胞遺伝子療法」、すなわち精子または卵子を産生しない身体細胞への遺伝子の移入であろう。特定の実施形態では、タンパク質を発現する導入遺伝子は天然ヒト配列の配列を有する。しかしながら、他の実施形態では、合成タンパク質が発現される。そのようなタンパク質は、ヒトの治療のために意図され得、他の実施形態ではイヌもしくはネコ集団などの愛玩動物を含めた動物の治療のために、または家畜、もしくはヒト集団と接触するその他の動物の治療のために、設計され得る。

【0079】

好適な遺伝子産物の例には、家族性高コレステロール血症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、及び希少疾患またはオーファン疾患に関連するものが含まれ得る。そのような希少疾患の例には、数ある中でも、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン病、レット症候群（例えば、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ５１６０８）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症（例えばフラタキシン）、プログラニュリン（ＰＲＧＮ）（前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性非流暢性失語（ＰＮＦＡ）及び意味性認知症を含めた非アルツハイマー型脳変性症に関連する）が含まれ得る。例えば、ｗｗｗ．ｏｒｐｈａ．ｎｅｔ／ｃｏｎｓｏｒ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／Ｄｉｓｅａｓｅ＿Ｓｅａｒｃｈ＿Ｌｉｓｔ．ｐｈｐ；ｒａｒｅｄｉｓｅａｓｅｓ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｉｓｅａｓｅｓを参照されたい。

【0080】

好適な遺伝子の例には、限定されないが例えばインスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）（例えば、ヒト、イヌまたはネコのｅｐｏを含む）、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、神経栄養因子、例えば、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、形質転換増殖因子αのいずれか１つ、例えば、ＴＧＦα、アクチビン、インヒビン、または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）（ＢＭＰ１～１５のいずれか、成長因子のヘレグリン（ｈｅｒｅｇｌｕｉｎ）／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーのいずれか１つ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ－３及びＮＴ－４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのいずれか１つ、ネトリン－１及びネトリン－２、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグならびにチロシン水酸化酵素を含めたホルモンならびに成長及び分化因子が含まれ得る。

【0081】

その他の有用な導入遺伝子産物には、免疫系を調節するタンパク質が含まれ、これには、限定されないが、サイトカイン及びリンフォカイン、例えばトロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）ＩＬ－１～ＩＬ－３６（例えば、ヒトインターロイキンＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、ＩＬ－３１、ＩＬ－３５を含む）、単球走化性タンパク質、白血病抑制因子、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β及びγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンドが含まれる。免疫系によって産生される遺伝子産物も本発明において有用である。これらとしては、限定されないが、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ及びクラスＩＩ ＭＨＣ分子、ならびに操作型免疫グロブリン及びＭＨＣ分子が挙げられる。例えば、特定の実施形態では、ｒＡＡＶ抗体は、イヌまたはネコの抗体、例えば抗ＩｇＥ、抗ＩＬ３１、抗ＣＤ２０、抗ＮＧＦ、抗ＧｎＲＨなどを送達するように設計され得る。有用な遺伝子産物には、補体調節タンパク質、例えば、補体調節タンパク質、膜補助因子タンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２、ＣＤ５９及びＣ１エステラーゼ阻害薬（Ｃ１－ＩＮＨ）も含まれる。

【0082】

さらに他の有用な遺伝子産物は、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リンフォカイン
、調節タンパク質及び免疫系タンパク質の受容体のいずれか１つを含む。本発明は、コレステロール調節及び／または脂質調整のための受容体、例えば、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体、及びスカベンジャー受容体を包含する。本発明はさらに、グルココルチコイド受容体及びエストロゲン受容体を含めたステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバー、ビタミンＤ受容体ならびにその他の核内受容体などの遺伝子産物も包含する。加えて、有用な遺伝子産物には、転写因子、例えば、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ－１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤ及びｍｙｏｇｅｎｉｎ、ＥＴＳボックス含有タンパク質、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ－４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ－１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ－３、ならびに翼状らせんタンパク質のフォークヘッドファミリーが含まれる。

【0083】

他の有用な遺伝子産物としては、カルバモイル合成酵素Ｉ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、アルギノコハク酸合成酵素、アルギノコハク酸リアーゼ欠損症の治療のためのアルギノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸加水分解酵素、フェニルアラニン水酸化酵素、α１アンチトリプシン、アカゲザルαフェトタンパク質（ＡＦＰ）、アカゲザル絨毛性ゴナドトロフィン（ＣＧ）、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、シスタチオンβ合成酵素、分岐鎖ケト酸脱炭酸酵素、アルブミン、イソ吉草酸ＣｏＡ脱水素酵素、プロピオン酸ＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタル酸ＣｏＡ脱水素酵素、インスリン、β－グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシン脱炭酸酵素、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維症膜通過制御（ＣＦＴＲ）配列、及びジストロフィン遺伝子産物［例えば、ミニまたはマイクロジストロフィン］が挙げられる。さらに他の有用な遺伝子産物には、酵素活性の欠乏に起因する様々な症状に有用な酵素、例えば酵素補充療法において有用となり得るものが含まれる。例えば、マンノース－６－ホスフェートを含有する酵素はリソソーム蓄積疾患のための療法に利用され得る（例えば、好適な遺伝子にはβ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードするものが含まれる）。

【0084】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶは遺伝子編集システムにおいて使用され得、このシステムは、１つのｒＡＡＶ、または複数のｒＡＡＶ材料の共投与を含むものであり得る。例えば、ｒＡＡＶは、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＡＲＣＵＳ、Ｃｐｆ１及びその他の好適な遺伝子編集構築物を送達するように操作されていてもよい。

【0085】

さらに他の有用な遺伝子産物としては、血友病Ｂ（第ＩＸ因子を含む）及び血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子及びその変異型、例えば異種二量体の軽鎖及び重鎖ならびにＢ欠失ドメインを含む；米国特許第６，２００，５６０号及び米国特許第６，２２１，３４９号）を含めた血友病の治療のために使用されるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ミニ遺伝子は１０アミノ酸シグナル配列とヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列とをコードする第ＶＩＩＩ因子重鎖の最初の５７塩基対を含む。代替実施形態では、ミニ遺伝子はさらに、Ａ１及びＡ２ドメイン、ならびにＢドメインのＮ末端からの５アミノ酸、及び／またはＢドメインのＣ末端の８５アミノ酸、ならびにＡ３、Ｃ１及びＣ２ドメインを含む。さらに他の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子重鎖及び軽鎖をコードする核酸が、Ｂドメインの１４アミノ酸をコードする４２核酸によって隔てられて単一のミニ遺伝子として提供される［米国特許第６，２００，５６０号］。

【0086】

他の有用な遺伝子産物としては、非天然由来ポリペプチド、例えば、挿入、欠失または
アミノ酸置換を含んでいる非天然由来アミノ酸配列を有するキメラまたはハイブリッドポリペプチドが挙げられる。例えば、一本鎖操作型免疫グロブリンは特定の免疫不全患者に有用となり得る。他のタイプの非天然由来遺伝子配列としては、標的の過剰発現を軽減するために使用され得るアンチセンス分子及び触媒核酸、例えばリボザイムが挙げられる。

【0087】

遺伝子の発現の軽減及び／または調節は、がん及び乾癬のように過剰増殖細胞によって特徴付けられる過剰増殖性の症状を治療するために特に望ましい。標的ポリペプチドには、正常細胞に比べて過剰増殖細胞で専ら、またはより高いレベルで産生されるポリペプチドが含まれる。標的抗原としては、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎ、及び転座遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋ及びＥＧＲＦなどのがん遺伝子によってコードされるポリペプチドが挙げられる。標的抗原としてのがん遺伝子産物に加えて、抗がん治療及び保護的養生法のための標的ポリペプチドとしては、いくつかの実施形態において自己免疫疾患のための標的抗原としても使用される、Ｂ細胞リンパ腫によって作られる抗体の可変領域及びＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域が挙げられる。他の腫瘍関連ポリペプチドは、モノクローナル抗体１７－１Ａによって認識されるポリペプチド、及び葉酸結合ポリペプチドを含めて、腫瘍細胞においてより高いレベルでみられるポリペプチドなどの標的ポリペプチドとして使用され得る。

【0088】

他の好適な治療用ポリペプチド及びタンパク質としては、細胞受容体及び「自己」指向性抗体を産生する細胞を含めた自己免疫性に関連する標的に対する幅広い防御免疫応答を付与することによって自己免疫疾患及び障害に罹患している個体を治療するために有用となり得るものが挙げられる。Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患としては、関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存型真性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、クローン病及び潰瘍性大腸炎が挙げられる。これらの疾患の各々は、内因性抗原に結合して自己免疫疾患に関連する炎症カスケードを開始するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって特徴付けられる。

【0089】

ｒＡＡＶによって送達され得る遺伝子のさらなる例としては、限定されないが、グリコーゲン蓄積病または欠損症１Ａ型（ＧＳＤ１）に関連するグルコース－６－ホスファターゼ、ＰＥＰＣＫ欠損症に関連するホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）；てんかん及び重度の神経発達障害に関連するセリン／スレオニンキナーゼ９（ＳＴＫ９）としても知られるサイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５）；ガラクトース血症に関連するガラクトース－１リン酸ウリジルトランスフェラーゼ；フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に関連するフェニルアラニン水酸化酵素；メープルシロップ尿症に関連する分岐鎖α－ケト酸脱水素脱水素酵素；チロシン血症１型に関連するフマリルアセト酢酸加水分解酵素；メチルマロン酸血症に関連するメチルマロニルＣｏＡムターゼ；中鎖アセチルＣｏＡ欠損症に関連する中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素；オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症に関連するオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）；シトルリン血症に関連するアルギニノコハク酸合成酵素（ＡＳＳ１）；レシチン－コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）欠損症；メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）；ニーマン・ピック病Ｃ１型）；プロピオン酸血症（ＰＡ）；家族性高コレステロール血症（ＦＨ）に関連する低比重リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質；クリグラー・ナジャー病に関連するＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素；重症複合免疫不全疾患に関連するアデノシンデアミナーゼ；痛風及びレッシュ・ナイハン症候群に関連するヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；ビオチミダーゼ欠損症に関連するビオチミダーゼ；ファブリー病に関連するα－ガラクトシダーゼＡ（ａ－Ｇａｌ Ａ）；ウィルソン病に関連するＡＴＰ７Ｂ；ゴーシェ病２型及び３型に関連するβ－グルコセレブロシダーゼ；ツェルベーガー症候群に関連するペルオキシソーム膜タンパク質７０ｋＤａ；異染性白質ジストロフィーに関連するアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、クラッベ病に関連するガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）酵素、ポンペ病に関連するα－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）；ニーマン・ピック病Ａ型に関連するスフィンゴミエリナーゼ（ＳＭＰＤ１）遺伝子；成人発症ＩＩ型シトルリン血症（ＣＴＬＮ２）に関連するアルギニノコハク酸合成酵素；尿素サイクル異常症に関連するカルバモイルリン酸合成酵素１（ＣＰＳ１）；脊髄性筋萎縮症に関連する運動神経細胞生存（ＳＭＮ）タンパク質；ファーバー脂肪性肉芽腫症に関連するセラミダーゼ；ＧＭ２ガングリオシドーシス及びテイ・サックス病及びサンドホフ病に関連するｂ－ヘキソサミニダーゼ；アスパルチル－グルコサミン尿症に関連するアスパルチルグルコサミニダーゼ；フコシドーシスに関連するａ－フコシダーゼ；α－マンノシドーシスに関連するα－マンノシダーゼ；急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）に関連するポルフォビリノーゲンデアミナーゼ；α－１アンチトリプシン欠損症（気腫）の治療のためのα－１アンチトリプシン；サラセミアまたは腎不全による貧血の治療のためのエリスロポエチン；虚血性疾患の治療のための血管内皮成長因子、アンジオポエチン－１及び線維芽細胞増殖因子；例えばアテローム性動脈硬化、血栓症または塞栓にみられるような閉塞血管の治療のためのトロンボモジュリン及び組織因子経路阻害薬；パーキンソン病の治療のための芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）及びチロシン水酸化酵素（ＴＨ）；鬱血性心不全の治療のためのβアドレナリン受容体、ホスホランバンに対するアンチセンスまたは突然変異体形態、（筋）小胞体アデノシントリホスファターゼ－２（ＳＥＲＣＡ２）及び心臓型アデニル酸シクラーゼ；様々ながんの治療のためのｐ５３などの腫瘍抑制遺伝子；炎症性及び免疫障害ならびにがんの治療のためのサイトカイン、例えば様々なインターロイキンのうちの１つ；筋ジストロフィーの治療のためのジストロフィンまたはミニジストロフィン及びユートロフィンまたはミニユートロフィン；ならびに糖尿病の治療のためのインスリンまたはＧＬＰ－１が挙げられる。

【0090】

関心対象となるさらなる遺伝子及び疾患としては、例えば、ジストニン遺伝子関係の疾患、例えば、遺伝性感覚自律神経ニューロパチーＶＩ型（ＤＳＴ遺伝子はジストニンをコードする；タンパク質の大きさ（約７５７０ａａ）ゆえに二重にＡＡＶベクターが必要とされる場合がある；機能喪失突然変異体が痛覚を感じる能力の欠如を招き機能獲得突然変異体が痛覚症状を招くＳＣＮ９Ａ関係の疾患、例えば肢端紅痛症が挙げられる。もう１つの症状は、変わりやすい臨床的及び電気生理学的発現を伴う進行性の末梢運動感覚ニューロパチーによって特徴付けられる、ＮＥＦＬ遺伝子（ニューロフィラメント軽鎖）の突然変異に起因するシャルコー・マリー・トゥース病１Ｆ型及び２Ｅ型である。

【0091】

特定の実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶはムコ多糖症（ＭＰＳ）障害の治療に使用され得る。そのようなｒＡＡＶは、ＭＰＳ Ｉ（ハーラー、ハーラー・シャイエ及びシャイエ症候群）を治療するためのα－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードする核酸配列；ＭＰＳ ＩＩ（ハーラー症候群）を治療するためのイズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）をコードする核酸配列；ＭＰＳＩＩＩ Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ（サンフィリポ症候群）を治療するためのスルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）をコードする核酸配列；ＭＰＳ ＩＶ Ａ及びＢ（モルキオ症候群）を治療するためのＮ－アセチルガラクトサミン－６－スルフェートスルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）をコードする核酸配列；ＭＰＳ ＶＩ（マロト－・ラミー症候群）を治療するためのアリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）をコードする核酸配列；ＭＰＳＩ ＩＸ（ヒアルロニダーゼ欠損症）を治療するためのヒアルロニダーゼをコードする核酸配列；ならびにＭＰＳ ＶＩＩ（スライ症候群）を治療するためのβ－グルクロニダーゼをコードする核酸配列を含有し保有し得る。

【0092】

免疫原性導入遺伝子
いくつかの実施形態では、がんに関連する遺伝子産物（例えば腫瘍抑制因子）をコードする核酸を含むｒＡＡＶベクターは、がんを有する対象にｒＡＡＶベクターを内包するｒＡＡＶを投与することによってがんを治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では、がんに関連する遺伝子産物（がん遺伝子）の発現を阻害する低分子干渉核酸（例え
ば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸を含むｒＡＡＶベクターは、がんを有する対象にｒＡＡＶベクターを内包するｒＡＡＶを投与することによってがんを治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では、がんに関連する遺伝子産物をコードする核酸（またはがんに関連する遺伝子の発現を阻害する機能性ＲＮＡ）を含むｒＡＡＶベクターは、研究目的のために、例えばがんを研究するまたはがんを治療する療法を特定するために、使用され得る。がんの発症に関連することが知られている遺伝子（例えばがん遺伝子及び腫瘍抑制因子）の非限定的な例を以下に列挙する：ＡＡＲＳ、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＣ４、ＡＢＩ２、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＣＫ１、ＡＣＰ２、ＡＣＹ１、ＡＤＳＬ、ＡＫ１、ＡＫＲ１Ｃ２、ＡＫＴ１、ＡＬＢ、ＡＮＰＥＰ、ＡＮＸＡ５、ＡＮＸＡ７、ＡＰ２Ｍ１、ＡＰＣ、ＡＲＨＧＡＰ５、ＡＲＨＧＥＦ５、ＡＲＩＤ４Ａ、ＡＳＮＳ、ＡＴＦ４、ＡＴＭ、ＡＴＰ５Ｂ、ＡＴＰ５Ｏ、ＡＸＬ、ＢＡＲＤ１、ＢＡＸ、ＢＣＬ２、ＢＨＬＨＢ２、ＢＬＭＨ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＴＫ、ＣＡＮＸ、ＣＡＰ１、ＣＡＰＮ１、ＣＡＰＮＳ１、ＣＡＶ１、ＣＢＦＢ、ＣＢＬＢ、ＣＣＬ２、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＣＴ５、ＣＣＹＲ６１、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ２５、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＣ２５Ｂ、ＣＤＣ２Ｌ５、ＣＤＫ１０、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ９、ＣＤＫＬ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｄ、ＣＥＢＰＧ、ＣＥＮＰＣ１、ＣＧＲＲＦ１、ＣＨＡＦ１Ａ、ＣＩＢ１、ＣＫＭＴ１、ＣＬＫ１、ＣＬＫ２、ＣＬＫ３、ＣＬＮＳ１Ａ、ＣＬＴＣ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＯＸ６Ｃ、ＣＯＸ７Ａ２、ＣＲＡＴ、ＣＲＨＲ１、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＫ、ＣＳＮＫ１Ｇ２、ＣＴＮＮＡ１、ＣＴＮＮＢ１、ＣＴＰＳ、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＤ、ＣＵＬ１、ＣＹＲ６１、ＤＣＣ、ＤＣＮ、ＤＤＸ１０、ＤＥＫ、ＤＨＣＲ７、ＤＨＲＳ２、ＤＨＸ８、ＤＬＧ３、ＤＶＬ１、ＤＶＬ３、Ｅ２Ｆ１、Ｅ２Ｆ３、Ｅ２Ｆ５、ＥＧＦＲ、ＥＧＲ１、ＥＩＦ５、ＥＰＨＡ２、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＣＣ３、ＥＴＶ１、ＥＴＶ３、ＥＴＶ６、Ｆ２Ｒ、ＦＡＳＴＫ、ＦＢＮ１、ＦＢＮ２、ＦＥＳ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＲ、ＦＫＢＰ８、ＦＮ１、ＦＯＳ、ＦＯＳＬ１、ＦＯＳＬ２、ＦＯＸＧ１Ａ、ＦＯＸＯ１Ａ、ＦＲＡＰ１、ＦＲＺＢ、ＦＴＬ、ＦＺＤ２、ＦＺＤ５、ＦＺＤ９、Ｇ２２Ｐ１、ＧＡＳ６、ＧＣＮ５Ｌ２、ＧＤＦ１５、ＧＮＡ１３、ＧＮＡＳ、ＧＮＢ２、ＧＮＢ２Ｌ１、ＧＰＲ３９、ＧＲＢ２、ＧＳＫ３Ａ、ＧＳＰＴ１、ＧＴＦ２Ｉ、ＨＤＡＣ１、ＨＤＧＦ、ＨＭＭＲ、ＨＰＲＴ１、ＨＲＢ、ＨＳＰＡ４、ＨＳＰＡ５、ＨＳＰＡ８、ＨＳＰＢ１、ＨＳＰＨ１、ＨＹＡＬ１、ＨＹＯＵ１、ＩＣＡＭ１、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤＵＡ、ＩＥＲ３、ＩＦＩＴＭ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰ５、ＩＬ１Ｂ、ＩＬＫ、ＩＮＧ１、ＩＲＦ３、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＪＡＫ１、ＪＡＲＩＤ１Ａ、ＪＵＮ、ＪＵＮＢ、ＪＵＮＤ、Ｋ－ＡＬＰＨＡ－１、ＫＩＴ、ＫＩＴＬＧ、ＫＬＫ１０、ＫＰＮＡ２、ＫＲＡＳ２、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ２Ａ、ＫＲＴ９、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＰ２、ＬＣＫ、ＬＣＮ２、ＬＥＰ、ＬＩＴＡＦ、ＬＲＰＡＰ１、ＬＴＦ、ＬＹＮ、ＬＺＴＲ１、ＭＡＤＨ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ３Ｋ８、ＭＡＰＫ１２、ＭＡＰＫ１３、ＭＡＰＫＡＰＫ３、ＭＡＰＲＥ１、ＭＡＲＳ、ＭＡＳ１、ＭＣＣ、ＭＣＭ２、ＭＣＭ４、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＴ、ＭＧＳＴ１、ＭＩＣＢ、ＭＬＬＴ３、ＭＭＥ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ２、ＭＮＤＡ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＴ３、ＭＹＢ、ＭＹＢＬ１、ＭＹＢＬ２、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＭＹＤ８８、ＭＹＬ９、ＭＹＬＫ、ＮＥＯ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＮＦＳＦ７、ＮＩＤ、ＮＩＮＥ、ＮＭＢＲ、ＮＭＥ１、ＮＭＥ２、ＮＭＥ３、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ４、ＮＰＭ１、ＮＱＯ１、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲＡＳ、ＮＲＧ１、ＮＳＥＰ１、ＯＳＭ、ＰＡ２Ｇ４、ＰＡＢＰＣ１、ＰＣＮＡ、ＰＣＴＫ１、ＰＣＴＫ２、ＰＣＴＫ３、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＰＫ１、ＰＥＡ１５、ＰＦＤＮ４、ＰＦＤＮ５、ＰＧＡＭ１、ＰＨＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＭ１、ＰＫＭ２、ＰＫＭＹＴ１、ＰＬＫ２、ＰＰＡＲＤ、ＰＰＡＲＧ、ＰＰＩＨ、ＰＰＰ１ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ５Ａ、ＰＲＤＸ２、ＰＲＤＸ４、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＣＢＰ１、ＰＲＮＰ、ＰＲＳＳ１５、ＰＳＭＡ１、ＰＴＣＨ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ１、ＰＴＭＡ、ＰＴＮ、ＰＴＰＲＮ、Ｒ
ＡＢ５Ａ、ＲＡＣ１、ＲＡＤ５０、ＲＡＦ１、ＲＡＬＢＰ１、ＲＡＰ１Ａ、ＲＡＲＡ、ＲＡＲＢ、ＲＡＳＧＲＦ１、ＲＢ１、ＲＢＢＰ４、ＲＢＬ２、ＲＥＡ、ＲＥＬ、ＲＥＬＡ、ＲＥＬＢ、ＲＥＴ、ＲＦＣ２、ＲＧＳ１９、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＢ、ＲＨＯＣ、ＲＨＯＤ、ＲＩＰＫ１、ＲＰＮ２、ＲＰＳ６ ＫＢ１、ＲＲＭ１、ＳＡＲＳ、ＳＥＬＥＮＢＰ１、ＳＥＭＡ３Ｃ、ＳＥＭＡ４Ｄ、ＳＥＰＰ１、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＦＮ、ＳＦＰＱ、ＳＦＲＳ７、ＳＨＢ、ＳＨＨ、ＳＩＡＨ２、ＳＩＶＡ、ＳＩＶＡ ＴＰ５３、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＳＬＣ１６Ａ１、ＳＬＣ１Ａ４、ＳＬＣ２０Ａ１、ＳＭＯ、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１（ＳＭＰＤ１）、ＳＮＡＩ２、ＳＮＤ１、ＳＮＲＰＢ２、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ３、ＳＯＤ１、ＳＯＲＴ１、ＳＰＩＮＴ２、ＳＰＲＹ２、ＳＲＣ、ＳＲＰＸ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＣ１、ＴＡＦ１、ＴＢＬ３、ＴＢＲＧ４、ＴＣＦ１、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＦＡＰ２Ｃ、ＴＦＤＰ１、ＴＦＤＰ２、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨＢＳ１、ＴＩＥ、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ３、ＴＪＰ１、ＴＫ１、ＴＬＥ１、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ６、ＴＮＦＳＦ７、ＴＮＫ１、ＴＯＢ１、ＴＰ５３、ＴＰ５３ＢＰ２、ＴＰ５３１３、ＴＰ７３、ＴＰＢＧ、ＴＰＴ１、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＭ１、ＴＲＲＡＰ、ＴＳＧ１０１、ＴＵＦＭ、ＴＸＮＲＤ１、ＴＹＲＯ３、ＵＢＣ、ＵＢＥ２Ｌ６、ＵＣＨＬ１、ＵＳＰ７、ＶＤＡＣ１、ＶＥＧＦ、ＶＨＬ、ＶＩＬ２、ＷＥＥ１、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＷＴ１、ＸＲＣＣ１、ＹＥＳ１、ＹＷＨＡＢ、ＹＷＨＡＺ、ＺＡＰ７０及びＺＮＦ９。

【0093】

ｒＡＡＶベクターは、アポトーシスを調節するタンパク質または機能性ＲＮＡをコードする核酸を導入遺伝子として含み得る。アポトーシスに関連する遺伝子を以下に非限定的に列挙するが、これらの遺伝子及びそれらの相同体の産物をコードするならびにこれらの遺伝子及びそれらの相同体の発現を阻害する低分子干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸は、本発明の特定の実施形態において導入遺伝子として有用である：ＲＰＳ２７Ａ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＰＡＦ１、ＢＡＤ、ＢＡＧ１、ＢＡＧ３、ＢＡＧ４、ＢＡＫ１、ＢＡＸ、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ１０、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＢＣＬ２Ｌ１２、ＢＣＬ２Ｌ１３、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＣＬＡＦ１、ＢＦＡＲ、ＢＩＤ、ＢＩＫ、ＮＡＩＰ、ＢＩＲＣ２、ＢＩＲＣ３、ＸＩＡＰ、ＢＩＲＣ５、ＢＩＲＣ６、ＢＩＲＣ７、ＢＩＲＣ８、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ２、ＢＮＩＰ３、ＢＮＩＰ３Ｌ、ＢＯＫ、ＢＲＡＦ、ＣＡＲＤ１０、ＣＡＲＤ１１、ＮＬＲＣ４、ＣＡＲＤ１４、ＮＯＤ２、ＮＯＤ１、ＣＡＲＤ６、ＣＡＲＤＳ、ＣＡＲＤＳ、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ１４、ＣＡＳＰ２、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ４、ＣＡＳＰ５、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ９、ＣＦＬＡＲ、ＣＩＤＥＡ、ＣＩＤＥＢ、ＣＲＡＤＤ、ＤＡＰＫ１、ＤＡＰＫ２、ＤＦＦＡ、ＤＦＦＢ、ＦＡＤＤ、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＧＤＮＦ、ＨＲＫ、ＩＧＦ１Ｒ、ＬＴＡ、ＬＴＢＲ、ＭＣＬ１、ＮＯＬ３、ＰＹＣＡＲＤ、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ２、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＣＤ４０、ＦＡＳ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＣＤ２７、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１８、ＣＤ４０ＬＧ、ＦＡＳＬＧ、ＣＤ７０、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ９、ＴＰ５３、ＴＰ５３ＢＰ２、ＴＰ７３、ＴＰ６３、ＴＲＡＤＤ、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４及びＴＲＡＦ５。

【0094】

有用な遺伝子産物にはｍｉＲＮＡも含まれる。ｍｉＲＮＡ及びその他の低分子干渉核酸は、標的ＲＮＡ転写産物切断／分解または標的伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳抑制によって遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、典型的には最終的に１９～２５非翻訳ＲＮＡ産物として、天然に発現する。ｍｉＲＮＡはその活性を標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用によって発揮する。これらの内因的に発現するｍｉＲＮＡ
は、後にプロセシングされてｍｉＲＮＡ二本鎖となりさらには「成熟」一本鎖ｍｉＲＮＡ分子となるヘアピン前駆体を形成する。この成熟ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの例えば３’ＵＴＲ領域にある標的部位を成熟ｍｉＲＮＡとの相補性に基づいて認識するものである多重タンパク質複合体ｍｉＲＩＳＣを導く。

【0095】

以下に非限定的に列挙するｍｉＲＮＡ遺伝子及びそれらの相同体は、方法の特定の実施形態において遺伝子として、または遺伝子によってコードされる低分子干渉核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ、スポンジ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴｕＤ ＲＮＡ）の標的として、有用である：ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ^＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｂ^＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ^＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｄ^＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ^＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－１^＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－２^＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ^＊、ｈｓａ－ｌｅｔ－７１、ｈｓａ－ｌｅｔ－７１^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００、ｈｓａ－ｍｉＲ－１００^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０１^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０５^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１７８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１７９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１８５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１１９７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２００、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２０８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２６^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２８^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２２９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２３３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２３４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２３６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２３７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２３８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５５ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－１^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２５ｂ－２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７４ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７４ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２７９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８５、
ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２８９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２９９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３００、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３０ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３６^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８－１^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３８－２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４１^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４３^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４４^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４５^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４７ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４８ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４８ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４８ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４８ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４９^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５４^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－１^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１６－２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ａ－２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｃ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８１ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８２５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８２７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８５^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８６^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８７^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９１^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９３ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９４^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９５^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９８、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９９ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－１^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ｂ－２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ
－２００ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０２、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０３、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０４、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０６、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０８ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０８ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２０ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１１、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１２、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１４、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１４^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１７、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１８、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１８－１^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１８－２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１９－ｌ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１９－２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２１９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２０ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２１^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２３^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２３ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－１^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２４－２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２５、ｈｓａ－ｍｉＲ－２５^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－ｌ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ａ－２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２６ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２７ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９７、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９８、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９６－１^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９６－２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２９ｃ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３００、ｈｓａ－ｎｕＲ－３０１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０１ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ｃ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ｄ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ｅ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０２ｆ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ－ｌ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｃ－２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｄ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３０ｅ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２０ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２５、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３２９、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３５、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３５^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３ａ、ｈｓａ－ｎｕＲ－３３ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４０^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４５、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４６、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３４ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６３、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６３^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５、ｈｓａ－ｍｉＲ－３
６７、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６７^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７３、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７３^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７４ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７５、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７６ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７６ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７６ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７７、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７７^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７８^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７９、ｈｓａ－ｍｉＲ－３７９^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８０、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８０^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８１、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８３、ｈｓａ－ｍｉＲ－３８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４０９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４１０、ｈｓａ－ｍｉＲ－４１１、ｈｓａ－ｍｉＲ－４１１^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－４１２、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２１、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２４^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２５^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２９、ｈｓａ－ｍｉＲ－４３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－４３１^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－４３２、ｈｓａ－ｍｉＲ－４３２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－４３３、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４４９ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５０ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５０ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５０ｂ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５１、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５２、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５３、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５４、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５４^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８７ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８７ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８８、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８８^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－４８９、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９２、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９３、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９３^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９４、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９６、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９７、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９７^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９８、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４９９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５００、ｈｓａ－ｍｉＲ－５００^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０５^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９－３－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５０９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１３ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１３ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１３ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１６ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１６ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１７^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１７ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１７ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１７ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｃ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｄ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｅ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｅ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｆ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１８ｆ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９ｄ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９ｅ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５１９ｅ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－
５２０ｄ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｅ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｆ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｇ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２０ｈ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２６ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２６ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４１^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４５、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４５^＊．ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ａ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｂ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｃ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｃ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｄ－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｄ－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｅ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｆ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｇ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｈ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｉ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｊ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｋ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｍ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｎ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｏ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４８ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５４９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５０^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５ｌａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５１ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５１ｂ^＊．ｈｓａ－ｍｉＲ－５５２、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５７、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５８、ｈｓａ－ｍｉＲ－５５９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６２、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６７、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６８、ｈｓａ－ｍｉＲ－５６９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７２、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７５、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７７、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７８、ｈｓａ－ｍｉＲ－５７９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８０、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８２－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８４、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８５、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８７、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８８、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８９、ｈｓａ－ｍｉＲ－５８９^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９１、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９２、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９３、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９３^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９６、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９７、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９８、ｈｓａ－ｍｉＲ－５９９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６００、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０４、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０７、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６０９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１４、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１６^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１７、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６１９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２４^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２５^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２７、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６２９^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３４、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３７、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６３９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４４、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４
５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４７、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６４９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５４－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５４－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５６、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５７、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６５９、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６０、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６１、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６２、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６３、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６３ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６４、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６４^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６５、ｈｓａ－ｍｉＲ－６６８、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７１－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－６７５、ｈｓａ－ｍｉＲ－７、ｈｓａ－ｍｉＲ－７０８、ｈｓａ－ｍｉＲ－７０８^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－７－１^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－７－２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－７２０、ｈｓａ－ｍｉＲ－７４４、ｈｓａ－ｍｉＲ－７４４^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－７５８、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６０、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６５、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６６、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６７－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６７－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６８－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６８－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６９－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７６９－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－７７０－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８０２、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７３、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７４、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７７、ｈｓａ－ｍｉＲ－８７７^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８５－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８５－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８６－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８６－５ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８７、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８８、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８８^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－８８９、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９０、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９１ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９２ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９、ｈｓａ－ｍｉＲ－９^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２０、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２１、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２３、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－１^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ－２^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ｂ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３３、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３４、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３５、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３６、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３７、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３８、ｈｓａ－ｍｉＲ－９３９、ｈｓａ－ｍｉＲ－９４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－９４１、ｈｓａ－ｍｉＲ－９４２、ｈｓａ－ｍｉＲ－９４３、ｈｓａ－ｍｉＲ－９４４、ｈｓａ－ｍｉＲ－９５、ｈｓａ－ｍｉＲ－９６、ｈｓａ－ｍｉＲ－９６^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９８、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ａ^＊、ｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ、及びｈｓａ－ｍｉＲ－９９ｂ^＊。例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連するスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）を発現する８番染色体オープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ｏｒｆ７２）を標的とするｍｉＲＮＡは関心対象となり得る。

【0096】

ｍｉＲＮＡは、その標的となるｍＲＮＡの機能を阻害し、その結果、ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現を阻害する。したがって、ｍｉＲＮＡの活性を（部分的または完全に）遮断すること（ｍｉＲＮＡをサイレンシングすること）で、発現が阻害されているポリペプチドの発現を効果的に誘導または回復する（ポリペプチドの抑制解除をする）ことができる。一実施形態では、ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的によってコードされるポリペプチドの抑制解除は、様々な方法のうちのいずれか１つによって細胞におけるｍｉＲＮＡ活性を阻害することによって成し遂げられる。例えば、ｍｉＲＮＡの活性を遮断することは、ｍｉＲＮＡに相補的または実質的に相補的な低分子干渉核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡスポンジ、ＴｕＤ ＲＮＡ）によるハイブリダイゼーションを行いそれによってｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡとの相互作用を遮断することによって成し遂げられ得る。本明細書中で使用する場合、ｍｉＲＮＡに実質的に相補的な低分子干渉核酸とは、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズしてｍｉＲＮＡの活性を遮断することができるもののことである。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡに実質的に相補的な低分子干渉核酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１
４、１５、１６、１７または１８個の塩基を除く全てにおいてｍｉＲＮＡと相補的である低分子干渉核酸である。「ｍｉＲＮＡ阻害薬」は、ｍｉＲＮＡの機能、発現及び／またはプロセシングを遮断する薬剤である。例えば、これらの分子としては、限定されないが、マイクロＲＮＡ特異的アンチセンス、マイクロＲＮＡスポンジ、タフデコイＲＮＡ（ＴｕＤ ＲＮＡ）、及びｍｉＲＮＡとＤｒｏｓｈａ複合体との相互作用を阻害するマイクロＲＮＡオリゴヌクレオチド（二本鎖ヘアピンの短いオリゴヌクレオチド）が挙げられる。

【0097】

さらに他の有用な遺伝子には、病原体に受動免疫を付与する免疫グロブリンをコードするものが含まれ得る。「免疫グロブリン分子」は、共有結合的に連結され合った免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の免疫学的活性部分を含有し抗原に特異的に結合するタンパク質である。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）またはサブクラスのものである。「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において交換可能に使用され得る。

【0098】

「免疫グロブリン重鎖」は、免疫グロブリンの抗原結合ドメインの少なくとも一部と、免疫グロブリン重鎖の可変領域の少なくとも一部または免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも一部とを含有するポリペプチドである。したがって、免疫グロブリン由来重鎖は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーとのアミノ酸配列相同性を有する重要な領域を有する。例えば、Ｆａｂ断片中の重鎖は免疫グロブリン由来重鎖である。

【0099】

「免疫グロブリン軽鎖」は、免疫グロブリンの抗原結合ドメインの少なくとも一部と、免疫グロブリン軽鎖の可変領域の少なくとも一部または定常領域の少なくとも一部とを含有するポリペプチドである。したがって、免疫グロブリン由来軽鎖は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーとのアミノ酸相同性を有する重要な領域を有する。

【0100】

「イムノアドヘシン」は、大抵において受容体、リガンドまたは細胞接着分子である結合タンパク質の機能性ドメインと、ヒンジ及びＦｃ領域を大抵含んでいる免疫グロブリン定常ドメインとを結合させる、キメラ抗体様分子である。

【0101】

「抗原結合性断片」（Ｆａｂ）断片」は、抗原に結合する抗体上の領域である。それは、重軽鎖の各々の１つの定常ドメイン及び１つの可変ドメインからなる。

【0102】

抗病原体構築物は、防御が探究されている疾患の原因物質（病原体）に基づいて選択される。これらの病原体は、ウイルス、細菌または真菌に由来するものであり得、ヒト疾患に抗してヒトにおいて、または獣医学的疾患を予防するために非ヒト哺乳動物もしくはその他の動物において、感染を防止するために使用され得る。

【0103】

ｒＡＡＶは、抗体、詳しくはウイルス性病原体に対する中和抗体をコードする遺伝子を含み得る。そのような抗ウイルス抗体には、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ及びインフルエンザＣのうちの１つ以上を指向する抗インフルエンザ抗体が含まれ得る。Ａ型ウイルスは、最も毒性の強いヒト病原体である。流行病に関連付けられたインフルエンザＡの血清型としては、１９１８年のスペイン風邪及び２００９年の豚インフルエンザを引き起こしたＨ１Ｎ１；１９５７年にアジア風邪を引き起こしたＨ２Ｎ２；１９６８年に香港風邪を引き起こしたＨ３Ｎ２；２００４年に鳥インフルエンザを引き起こしたＨ５Ｎ１；Ｈ７Ｎ７；Ｈ１Ｎ２；Ｈ９Ｎ２；Ｈ７Ｎ２；Ｈ７Ｎ３及びＨ１０Ｎ７が挙げられる。その他の標的病原体ウイルスとしては、アレナウイルス（フニン、マチュポ及びラッサを含む）、フィロウイルス（マールブルグ及びエボラを含む）、ハンタウイルス、ピコルナウイルス科（ライノウイルス、エコーウイルスを含む）、コロナウイルス、パラミクソウイルス、モルビリウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、トガウイルス、コクサッキーウイルス、
ＪＣウイルス、パルボウイルスＢ１９、パラインフルエンザ、アデノウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス科由来の痘瘡（大痘瘡（天然痘））及びワクチニア（牛痘）、ならびに水痘帯状疱疹（仮性狂犬病）が挙げられる。ウイルス性出血熱はアレナウイルス科（この科はリンパ球性脈絡髄膜炎（ＬＣＭ）との関連もある）のメンバー（ラッサ熱）、フィロウイルス（エボラウイルス）及びハンタウイルス（プーマラ（ｐｕｒｅｍａｌａ））によって引き起こされる。ピコルナウイルス（ライノウイルスの亜科）のメンバーは、ヒトにおける一般的な風邪に関連している。コロナウイルス科は、感染性気管支炎ウイルス（家禽）、豚伝染性胃腸炎ウイルス（ブタ）、豚血液凝集性脳脊髄炎ウイルス（ブタ）、猫感染性腹膜炎ウイルス（ネコ）、猫腸コロナウイルス（ネコ）、犬コロナウイルス（イヌ）などの多くの非ヒトウイルスを含む。ヒト呼吸器コロナウイルスは、推定上は一般的な風邪、Ａ、ＢまたはＣ型でない肝炎、及び突発性急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）に関連付けられている。パラミクソウイルス科は、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス３型、ウシパラインフルエンザウイルス３型、ルブラウイルス（おたふく風邪ウイルス、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス４型、ニューカッスル病ウイルス（ニワトリ）、牛疫、モルビリウイルス（麻疹及び犬ジステンパーを含む）、及びニューモウイルス（呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を含む）を含む。パルボウイルス科は、猫パルボウイルス（猫腸炎）、猫汎白血球減少症ウイルス、犬パルボウイルス及び豚パルボウイルスを含む。アデノウイルス科は、呼吸器疾患を引き起こすウイルス（ＥＸ、ＡＤ７、ＡＲＤ、Ｏ．Ｂ．）を含む。かくして、特定の実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターは、抗エボラ抗体、例えば、２Ｇ４、４Ｇ７、１３Ｃ６、抗インフルエンザ抗体、例えば、ＦＩ６、ＣＦ８０３３、及び抗ＲＳＶ抗体、例えば、パリビズマブ、モタビズマブを発現するように操作され得る。

【0104】

また、細菌性病原体に対する中和抗体構築物を本発明における使用のために選択してもよい。一実施形態では、中和抗体構築物は細菌自体を指向する。別の実施形態では、中和抗体構築物は細菌によって産生される毒素を指向する。空気感染性細菌性病原体の例としては、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（肺炎）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（肺炎）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ（肺炎）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｌｅｉ（肺炎）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（肺炎）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｌａｃｕｎａｔａ、Ａｌｋａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（風邪）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（百日咳）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（肺炎／熱）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（レジオネラ病）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ（肺炎）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核（ＴＢ））、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ（ＴＢ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ（肺炎）、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ（肺炎）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽病）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ（肺炎）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（猩紅熱）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ（ジフテリア）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎）が挙げられる。

【0105】

ｒＡＡＶは、抗体、詳しくは、炭疽病の原因物質、Ｂａｃｉｌｌｉｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓによって産生される毒素などの細菌性病原体に対する中和抗体をコードする遺伝子を含み得る。類毒素を形成する３つのペプチドのうちの１つである防御物質（ＰＡ）に対する中和抗体についての教示はなされている。その他の２つのポリペプチドは、致死因子（ＬＦ）及び浮腫因子（ＥＦ）を構成する。抗ＰＡ中和抗体は、炭疽病に対する受動免疫
化において有効であることが教示されている。例えば、米国特許第７，４４２，３７３号、Ｒ．Ｓａｗａｄａ－Ｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｅ Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２００４；２：５（オンラインで２００４年５月１２日）を参照されたい。さらに他の抗炭疽病毒素中和抗体は教示がなされている、及び／または作り出される可能性がある。同様に、他の細菌及び／または細菌性毒素に対する中和抗体を使用して本明細書に記載のＡＡＶ送達される抗病原体構築物が作り出され得る。

【0106】

感染性疾患に対する抗体は、寄生虫または真菌、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ、Ｒｈｉｘｐｕｓ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ、Ｍｕｃｏｒ ｐｌｕｍｂｅａｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｍｉｃｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｆａｅｎｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔｅ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ種、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、及びＳｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ種によって引き起こされる得る。

【0107】

ｒＡＡＶは、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ＧＢＡ－パーキンソン病、関節リウマチ（ＲＡ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、がん、腫瘍、全身性強皮症、喘息及びその他の疾患などの疾患の病原性因子に対する抗体、詳しくは中和抗体をコードする遺伝子を含み得る。そのような抗体は、限定されないが例えば、α－シヌクレイン、抗血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（抗ＶＥＧＦ）、抗ＶＥＧＦＡ、抗ＰＤ－１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＴＮＦα、抗ＩＬ－１７、抗ＩＬ－２３、抗ＩＬ－２１、抗ＩＬ－６、抗ＩＬ－６受容体、抗ＩＬ－５、抗ＩＬ－７、抗第ＸＩＩ因子、抗ＩＬ－２、抗ＨＩＶ、抗ＩｇＥ、抗腫瘍壊死因子受容体－１（ＴＮＦＲ１）、抗ｎｏｔｃｈ２／３、抗ｎｏｔｃｈ１、抗ＯＸ４０、抗ｅｒｂ－ｂ２受容体チロシンキナーゼ３（ＥｒｂＢ３）、抗ＥｒｂＢ２、抗β細胞成熟抗原、抗Ｂリンパ球刺激因子、抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ２、抗顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、抗オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、抗リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）タンパク質、抗ＣＣＬ２０、抗血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ）、抗プロリン水酸化酵素阻害物質、抗ＣＤ３８、抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ、抗ＣＤ５２、抗ＣＤ３０、抗ＩＬ－１β、抗上皮成長因子受容体、抗ＣＤ２５、抗ＲＡＮＫリガンド、抗補体系タンパク質Ｃ５、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ３受容体、抗アルファ－４（α４）インテグリン、抗ＲＳＶ Ｆタンパク質、及び抗インテグリンα_４β_７であり得る。さらに他の病原体及び疾患は当業者に明らかであろう。他の好適な抗体には、アルツハイマー病を治療するために有用なもの、例えば、数ある中でも、抗βアミロイド（例えば、クレネズマブ、ソラネズマブ、アデュカヌマブ）、抗βアミロイド線維、抗βアミロイド斑、抗ｔａｕ、バピネオズマブなどが含まれ得る。様々な兆候を治療するための他の好適な抗体には、例えば、２０１６年１０月２７日に出願されＷＯ２０１７／０７５１１９Ａ１として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５８９６８に記載されているものが含まれる。

【0108】

ＩＩ．ｒＡＡＶベクター生産
ＡＡＶウイルスベクター（例えば組換え（ｒ）ＡＡＶ）の生産に使用するためには、発現カセットは、パッケージング宿主細胞へ送達される任意の好適なベクター、例えばプラスミドに保有され得る。本発明に有用なプラスミドは、数ある中でも原核細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞における試験管内での複製及びパッケージングに適するように操作され得る。好適なトランスフェクション技術及びパッケージング宿主細胞は知られている、及び／または当業者によって容易に設計され得る。

【0109】

ベクターとしての用途に適するＡＡＶを生成及び単離する方法は当技術分野で知られて
いる。例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３、及び以下で引用する参考文献を全体的に参照されたく、参照によりこれらの各々の全体を本明細書に援用する。遺伝子をビリオン内にパッケージングするためには、ＩＴＲは、発現カセット（複数可）を含有する核酸分子と同じ構築物においてシスで必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子はトランスで供給され得る。

【0110】

一実施形態では、本明細書に記載の発現カセットは、それが保有している免疫グロブリン構築物配列をウイルスベクター産生のためのパッケージング宿主細胞の中に移入させる遺伝要素（例えばシャトルプラスミド）となるように操作される。一実施形態では、選択された遺伝要素は、トランスフェクション、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染及びプロトプラスト融合を含めた任意の好適な方法によってＡＡＶパッケージング細胞へ送達され得る。安定なＡＡＶパッケージング細胞を作ることもできる。あるいは、ＡＡＶ以外のウイルスベクターを生み出すために、または試験管内で抗体の混合物を産生させるために、発現カセットを使用してもよい。そのような構築物を作るために用いる方法は、核酸操作の技量を有する者に知られており、これには遺伝子操作、組換え操作及び合成技術が含まれる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

【0111】

「ＡＡＶ中間体」または「ＡＡＶベクター中間体」という用語は、中にパッケージングされる所望のゲノム配列を欠いている組織化ｒＡＡＶカプシドを指す。これらは、「空」カプシドとも呼称され得る。そのようなカプシドは、検出可能な発現カセットのゲノム配列を含有し得ないかまたは、遺伝子産物の発現を達成するには不十分な部分的にのみパッケージングされたゲノム配列を含有し得る。これらの空カプシドは、関心対象の遺伝子を宿主細胞に移入させるには非機能的である。

【0112】

本明細書に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知の技術を用いて生成され得る。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。そのような方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列；機能性ｒｅｐ遺伝子；最低でもＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）と導入遺伝子とからなる発現カセット；及びＡＡＶカプシドタンパク質内への発現カセットのパッケージングを可能にするに足るヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することを含む。カプシドを生成する方法、そのためのコード配列、及びｒＡＡＶウイルスベクターを生産するための方法については教示がなされている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）及びＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。

【0113】

一実施形態では、組換えＡＡＶｈｕ６８を生産するために有用となる生産細胞培養物が提供される。そのような細胞培養物は、宿主細胞においてＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質を発現する核酸；ＡＡＶｈｕ６８カプシド内へのパッケージングに適した核酸分子、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲと、遺伝子産物をコードしており宿主細胞における当該産物の発現を促す配列に機能可能に繋げられている非ＡＡＶ核酸配列とを含有するベクターゲノム
；ならびに組換えＡＡＶｈｕ６８カプシド内への核酸分子のパッケージングを可能にするに足るＡＡＶ ｒｅｐ機能及びアデノウイルスヘルパー機能を含有する。一実施形態では、細胞培養物は、哺乳動物細胞（例えば、数ある中でもヒト胚性腎臓２９３細胞）または昆虫細胞（例えばバキュロウイルス）からなる。

【0114】

場合によって、ｒｅｐ機能はｈｕ６８以外のＡＡＶによって提供される。特定の実施形態では、ｒｅｐ機能の少なくとも一部はＡＡＶｈｕ６８からのものである。例えば、ｒｅｐ配列が配列番号４のｒｅｐタンパク質またはその機能性断片をコードすることを参照されたい。ＡＡＶ ｒｅｐは配列番号３の核酸配列によってコードされてもよい。別の実施形態では、ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶｈｕ６８ｒｅｐ以外の異種ｒｅｐタンパク質、例えば、限定されないが、ＡＡＶ１ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ３ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ４ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ５ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ６ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ７ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ８ ｒｅｐタンパク質；またはｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０、ｒｅｐ６８／７８、及びｒｅｐ４０／５２；またはその断片；または別の供給源である。場合によって、ｒｅｐ及びｃａｐ配列は細胞培養物中で同じ遺伝要素上にある。ｒｅｐ配列とｃａｐ遺伝子との間にスペーサーがあってもよい。場合によって、スペーサーは、ａｔｇａｃｔｔａａａｃｃａｇｇｔ、配列番号９である。これらのＡＡＶｈｕ６８または突然変異ＡＡＶカプシド配列のいずれかが、宿主細胞におけるその発現を促す外来調節制御配列の制御下にあり得る。

【0115】

一実施形態では、細胞は、好適な細胞培養（例えばＨＥＫ２９３）細胞で製造される。本明細書に記載の遺伝子療法ベクターを製造する方法には、当技術分野でよく知られている方法、例えば、遺伝子療法ベクターの生産のために使用するプラスミドＤＮＡの生成、ベクターの生成、及びベクターの精製が含まれる。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターはＡＡＶベクターであり、生成されるプラスミドは、ＡＡＶゲノム及び関心対象の遺伝子をコードするＡＡＶシスプラスミド、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶトランスプラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地との培地交換、ならびにベクター含有細胞及び培養培地の採集などの方法ステップを含み得る。採集されたベクター含有細胞及び培養培地のことを本明細書では粗細胞採集物と呼ぶ。さらに別のシステムでは、バキュロウイルス系ベクターによる感染によって昆虫細胞内に遺伝子療法ベクターを導入する。これらの産生システムに関する総説については例えばＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を全体的に参照されたく、参照によりこれらの各々の内容全体を本明細書に援用する。さらに、これら及びその他のＡＡＶ産生システムを作り使用する方法は以下の米国特許に記載されており、参照によりこれらの各々の内容全体を本明細書に援用する：第５，１３９，９４１号、第５，７４１，６８３号、第６，０５７，１５２号、第６，２０４，０５９号、第６，２６８，２１３号、第６，４９１，９０７号、第６，６６０，５１４号、第６，９５１，７５３号、第７，０９４，６０４号、第７，１７２，８９３号、第７，２０１，８９８号、第７，２２９，８２３号及び第７，４３９，０６５号。

【0116】

その後、粗細胞採集物を、ベクター採集物の濃縮、ベクター採集物の透析濾過、ベクター採集物の微小流動化、ベクター採集物のヌクレアーゼ消化、微小流動化中間物の濾過、クロマトグラフィーによる粗精製、超遠心分離による粗精製、タンジェンシャルフロー濾過による緩衝液交換、及び／または、一まとまりのベクターを調製するための製剤化及び
濾過などの方法ステップに供する。

【0117】

高塩濃度での２ステップの親和性クロマトグラフィー精製及びそれに続くアニオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いてベクター薬製品を精製し、空カプシドを除去する。これらの方法は、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７０号ならびにその優先権文書である２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０７１号及び「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ９」と題して２０１５年１２月１１日に出願された米国特許出願第６２／２２６，３５７号に記載されており、参照によりこれを本明細書に援用する。ＡＡＶ８の精製方法については、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７６号ならびにその優先権文書である２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０９８号及び２０１５年１２月１１日に出願された米国特許出願第６２／２６６，３４１号に記載されており、ｒｈ１０については、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６６０１３号ならびにその優先権文書である２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０５５号及び「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶｒｈ１０」と題しさらに２０１５年１２月１１日に出願された米国特許出願第６２／２６６，３４７号に記載されており、ＡＡＶ１については、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７４号ならびにその優先権文書である２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０８３号及び２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ１」の米国特許出願第６２／２６，３５１号に記載されており、参照により全てを本明細書に援用する。

【0118】

空及び充満粒子の含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書中の例ではイオジキサノール勾配精製されたＧＣ数＝粒子数の調製物）のＶＰ３バンド体積を、投入したＧＣ粒子に対してプロットする。結果として得た線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を使用して試験物品ピークのバンド体積中の粒子の数を算出する。その後、投入量２０μＬあたりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛けて粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで割ることで、粒子対ゲノムコピー（ｐｔ／ＧＣ）の比率が得られる。Ｐｔ／ｍＬ－ＧＣ／ｍＬによって空ｐｔ／ｍＬが得られる。空ｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割って１００を掛けることによって空粒子の百分率が得られる。

【0119】

一般に、空カプシド、及びパッケージングされたゲノムを含んでいるＡＡＶベクター粒子を検査する方法は当技術分野で知られている。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性カプシドを試験するために、方法は、処理したＡＡＶ材料を、３つのカプシドタンパク質を分離することができる任意のゲル、例えば緩衝液中３～８％のトリス－酢酸を含有する勾配ゲルからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、その後、試料材料が分離するまでゲルを流し、ゲルをナイロン製またはニトロセルロース製、好ましくはナイロン製の膜にブロッティングすることを含む。その後、抗ＡＡＶカプシド抗体、好ましくは抗ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくはＢ１抗ＡＡＶ－２モノクローナル抗体を、変性カプシドタンパク質に結合する一次抗体として使用する（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。その後、一次抗体との結合を検出するための手段を含有し一次抗体に結合する二次抗体、より好ましくは、検出分子を含有しそれと共有結合的に結合している抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼに供給結合的に繋げられたヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体を使用する。結合を検出する方法を用いて半定量的に一次抗体と二次抗体との結合を決定するが、検出方法は、放射性同位体放射、電磁波または比色変化を検出できることが好ましく、最も
好ましくは化学発光検出キットである。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのために試料はカラム画分から採取され得、還元剤（例えばＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥ装填用緩衝液中で加熱され得るが、カプシドタンパク質はプレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えばＮｏｖｅｘ）で分離された。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を製造者の使用説明書に従って使用して銀染色を実施してもよいし、他の好適な染色方法、すなわちＳＹＰＲＯルビーまたはクーマシー染色剤を使用してもよい。一実施形態では、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）によって測定することができる。試料を希釈し、ＤＮアーゼＩ（または別の好適なヌクレアーゼ）で消化して外来ＤＮＡを除去する。ヌクレアーゼを不活性化させた後、試料をさらに希釈し、プライマーと、プライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）発蛍光プローブとを使用して増幅する。定義されたレベルの蛍光に達するのに必要とされるサイクル数（閾値サイクル、Ｃｔ）を各試料についてＡｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システムで測定する。ＡＡＶベクターが含有しているのと同一である配列を含有するプラスミドＤＮＡを採用してＱ－ＰＣＲ反応の標準曲線を生成する。試料から得られたサイクル閾（Ｃｔ）値を使用して、それをプラスミド標準曲線のＣｔ値に対して正規化することによってベクターゲノム力価を決定する。デジタルＰＣＲに基づく終点分析法を用いることもできる。

【0120】

一態様では、広範なセリンプロテアーゼ、例えばプロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎから市販されているものなど）を理おうする最適化ｑ－ＰＣＲ法を用いる。より詳しくは、最適化ｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮアーゼＩ消化後に試料をプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテイナーゼＫで処理し、その後に熱不活性化させることを別とすれば、標準的アッセイに類似している。試料は試料サイズに等しい量のプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈することが好適である。プロテイナーゼＫ緩衝液は２倍以上に濃縮され得る。典型的には、プロテイナーゼＫ処理は約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬに変更してもよい。処理ステップは大抵約５５℃で約１５分間行われるが、より低い温度（例えば約３７℃～約５０℃）でより長い期間（例えば約２０分～約３０分）にわたって、またはより高い温度（例えば約６０℃以下）でより短い期間（例えば約５～１０分）にわたって実施してもよい。同様に、熱不活性化は大抵約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げ（例えば約７０～約９０℃）、時間を延長してもよい（例えば約２０分～約３０分）。その後、試料を（例えば１０００倍）希釈し、標準的アッセイにおいて記載したようなＴａｑＭａｎ分析に供する。

【0121】

さらに、またはあるいは、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いてもよい。例えば、一本鎖及び自己相補性ＡＡＶベクターゲノム力価をｄｄＰＣＲによって決定する方法は教示がなされている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。

【0122】

手短に述べると、パッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶｈｕ６８粒子をゲノム欠如ＡＡＶｈｕ６８中間体から分離する方法は、組換えＡＡＶｈｕ６８ウイルス粒子とＡＡＶｈｕ６８９カプシド中間体とを含む懸濁液を高速液体クロマトグラフィーに供することを含み、ここで、ＡＡＶｈｕ６８ウイルス粒子及びＡＡＶｈｕ６８中間体は、１０．２のｐＨに平衡させた強力なアニオン交換樹脂に結合するものであり、溶出液に約２６０及び約２８０の紫外線吸光度があるかどうか監視しつつ、塩勾配に供される。ｒＡＡＶ９ｈｕ６８には最適未満であるものの、ｐＨは約１０．０～１０．４の範囲であり得る。この方法では、ＡＡＶｈｕ６８充満カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比率が変曲点に到達する時に溶出する画分から回収される。一例において、透析濾過された生成物は、親和性クロマトグラフィーステップのために、ＡＡＶ２／ｈｕ６８血清型を効率的に捕捉する
Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９親和性樹脂（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に塗布され得る。これらのイオン性条件下では、かなりの百分率の残留細胞性ＤＮＡ及びタンパク質がカラムを流れる一方、ＡＡＶ粒子は効率的に捕捉される。

【0123】

ＩＩＩ．組成物及び用途
本明細書において提供するのは、少なくとも１つのｒＡＡＶ材料（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８材料または突然変異ｒＡＡＶ材料）ならびに任意選択の担体、賦形剤及び／または保存剤を含有する組成物である。ｒＡＡＶ材料とは、例えば濃度及び投薬量単位についての記述において以下に記載する量などが同じである、複数のｒＡＡＶベクターを指す。

【0124】

本明細書中で使用する場合、「担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。医薬活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の用途は当技術分野でよく知られている。補助的活性原料を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容できる」という語句は、宿主に投与されたときにアレルギー性または類似する望ましくない反応を生まない分子実体及び組成物を指す。送達ビヒクル、例えば、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、小胞などは、本発明の組成物を好適な宿主細胞の中に導入するために使用され得る。詳しくは、ｒＡＡＶベクターで送達するベクターゲノムは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェアまたはナノ粒子などのいずれかの中に封入された状態で送達のために製剤化され得る。

【0125】

一実施形態では、組成物は、対象への送達に適した最終製剤であり、例えば、生理学的に適合するｐＨ及び塩濃度に緩衝された水性液体懸濁液である。場合によって、１つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、凍結乾燥され得、投与時に再構成され得る。

【0126】

好適な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせは非毒性の非イオン性界面活性剤の中から選択され得る。一実施形態では、第一級ヒドロキシル基で終結している二官能性ブロックコポリマー界面活性剤、例えば、中性ｐＨを有しており平均分子量が８４００であるポロキサマー１８８としても知られるプルロニック（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などが選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、２つのポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の親水性鎖に挟まれた中央のポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（Ｍａｃｒｏｇｏｌ－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール及びポリエチレングリコールを選択してもよい。一実施形態では、製剤はポロキサマーを含有する。これらのコポリマーには共通して（ポロキサマーの）「Ｐ」の文字とそれに続く３つの数字で名前が付けられ、最初の２つの数字に１００を掛けるとポリオキシプロピレンコアのおおよその分子量が得られ、最後の数字に１０を掛けると百分率で表したポリオキシエチレン含有量が得られる。一実施形態ではポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は最大で懸濁液の約０．０００５％～約０．００１％の量で存在し得る。

【0127】

ベクターは、過度の有害作用を伴わないかまたは医学的に許容できる生理学的効果を伴って治療的利益をもたらすべく細胞にトランスフェクトしかつ十分なレベルの遺伝子移入及び発現をもたらすのに十分な量で投与されるが、この量は医学分野において技量を有する者であれば決定することができる。一般的な、及び薬学的に許容できる投与経路としては、限定されないが、所望の臓器（例えば、（場合によって肝動脈を介して）肝臓、肺、
心臓、眼、腎臓）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、クモ膜下腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内及びその他の非経口的投与経路が挙げられる。投与経路は所望により組み合わせてもよい。

【0128】

ウイルスベクターの投薬量は、主として患者の治療症状、年齢、体重及び健康状態などの因子に依存するであろうし、それゆえに患者間で異なり得る。例えば、ウイルスベクターの治療的に有効なヒト投薬量は大抵、約１×１０^９～１×１０^１６ゲノムウイルスベクターの濃度を含有する約２５～約１０００マイクロリットル～約１００ｍＬの範囲の溶液である。投薬量は、治療的利益と任意の副作用との釣り合いをとるように調節されることになり、そのような投薬量は、組換えベクターを採用する治療的用途に応じて様々であり得る。導入遺伝子産物の発現レベルは、ミニ遺伝子を含有するウイルスベクター、好ましくはＡＡＶベクターをもたらす投薬頻度を決定すべく追跡され得る。場合によっては、治療目的のために記載されているものに類似する投薬計画を、本発明の組成物を使用する免疫化のために利用してもよい。

【0129】

増殖能欠損型ウイルス組成物は、（７０ｋｇの体重の平均的対象を処置するために）約１．０×１０^９ＧＣ～約１．０×１０^１６ＧＣの範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて当該範囲内に入る量、好ましくは１．０×１０^１２～１．０×１０^１４ＧＣの範囲内に入る量の増殖能欠損型ウイルスを含有する投薬量単位でヒト患者のために製剤化され得る。一実施形態では、組成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９または９×１０^９ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０または９×１０^１０ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１または９×１０^１１ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２または９×１０^１２ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３または９×１０^１３ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４または９×１０^１４ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５または９×１０^１５ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。一実施形態において、ヒトに適用する場合、用量の範囲は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて１×１０^１０～約１×１０^１２ＧＣであり得る。

【0130】

これらの上記用量は、処置面積の大きさ、用いるウイルス力価、投与経路及び方法の所望の効果に応じて、範囲内のあらゆる数を含めた約２５～約１０００マイクロリットルの範囲またはそれより多い体積の様々な量の担体、賦形剤または緩衝液製剤の中に入って投与され得る。一実施形態では、担体、賦形剤または緩衝液の体積は少なくとも約２５μＬである。一実施形態では、体積は約５０μＬである。別の実施形態では、体積は約７５μＬである。別の実施形態では、体積は約１００μＬである。別の実施形態では、体積は約
１２５μＬである。別の実施形態では、体積は約１５０μＬである。別の実施形態では、体積は約１７５μＬである。さらに別の実施形態では、体積は約２００μＬである。別の実施形態では、体積は約２２５μＬである。さらに別の実施形態では、体積は約２５０μＬである。さらに別の実施形態では、体積は約２７５μＬである。さらに別の実施形態では、体積は約３００μＬである。さらに別の実施形態では、体積は約３２５μＬである。別の実施形態では、体積は約３５０μＬである。別の実施形態では、体積は約３７５μＬである。別の実施形態では、体積は約４００μＬである。別の実施形態では、体積は約４５０μＬである。別の実施形態では、体積は約５００μＬである。別の実施形態では、体積は約５５０μＬである。別の実施形態では、体積は約６００μＬである。別の実施形態では、体積は約６５０μＬである。別の実施形態では、体積は約７００μＬである。別の実施形態では、体積は約７００～１０００μＬである。

【0131】

特定の実施形態では、用量は約１×１０^９ＧＣ／ｇ脳質量～約１×１０^１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲内であり得る。特定の実施形態では、用量は約３×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲内であり得る。特定の実施形態では、用量は約５×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量～約１．８５×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲内であり得る。

【0132】

一実施形態では、ウイルス構築物は、少なくとも約１×１０^９ＧＣ～約１×１０^１５、または約１×１０^１１～５×１０^１３ＧＣの用量で送達され得る。これらの用量及び濃度を送達するのに適する体積は当業者によって決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの体積が選択され得、成人に対しては高い方の体積が選択される。典型的には、新生児に適する体積は約０．５ｍＬ～約１０ｍＬであり、より高い年齢の乳児に対しては約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択され得る。幼児に対しては約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの体積が選択され得る。子供に対しては約３０ｍＬ以下の体積が選択され得る。プレティーン及びティーンエイジャーに対しては約５０ｍＬ以下の体積が選択され得る。さらに他の実施形態では、患者のクモ膜下腔内に約５ｍＬ～約１５ｍＬ、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの体積の投与が与えられ得る。その他の好適な体積及び投薬量を決めてもよい。投薬量は、治療的利益と任意の副作用との釣り合いをとるように調節されることになり、そのような投薬量は、組換えベクターを採用する治療用途によって様々であり得る。

【0133】

上記組換えベクターは、公開されている方法に従って宿主細胞に送達され得る。ｒＡＡＶは、好ましくは生理学的に適合する担体の中に懸濁して、ヒト患者または非ヒト哺乳動物に投与され得る。特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、生理食塩水、界面活性剤、及び生理学的に適合する塩または塩の混合物を含有する水溶液の中にｒＡＡＶを懸濁させることが好適である。製剤は、生理学的に許容できるｐＨ、例えばｐＨ６～９またはｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７またはｐＨ７．２～７．８の範囲に調節されていることが好適である。脳脊髄液のｐＨは約７．２８～約７．３２であることから、クモ膜下腔内送達のためにはこの範囲に入るｐＨが望まれ得る一方、静脈内送達のためには約６．８～約７．２のｐＨが望まれ得る。しかしながら、最も広い範囲及びこれらの小範囲の中に入る他のｐＨを他の送達経路のために選択してもよい。

【0134】

別の実施形態では、組成物は、担体、希釈剤、賦形剤及び／または佐剤を含む。当業者であれば、移入ウイルスが対象としている適応症を考慮して好適な担体を容易に選択し得る。例えば、ある好適な担体は生理食塩水を含み、これは様々な緩衝溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）と共に製剤化され得る。他の例示的な担体としては、無菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油及び水が挙げられる。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが輸注管類に付着するのを防止するが生体内でのｒＡＡＶ結合活性を妨害しない成分を含むべきである。好適な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせは非毒性の非イオン性界面活性剤の中から選択され得る。一実施形態では、第一級ヒドロキシル基で終結している二官能性ブロッ
クコポリマー界面活性剤、例えば、中性ｐＨを有しており平均分子量が８４００であるポロキサマー１８８としても知られるプルロニック（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などが選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、２つのポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の親水性鎖に挟まれた中央のポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（Ｍａｃｒｏｇｏｌ－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ－オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール及びポリエチレングリコールを選択してもよい。一実施形態では、製剤はポロキサマーを含有する。これらのコポリマーには共通して（ポロキサマーの）「Ｐ」の文字とそれに続く３つの数字で名前が付けられ、最初の２つの数字に１００を掛けるとポリオキシプロピレンコアのおおよその分子量が得られ、最後の数字に１０を掛けると百分率で表したポリオキシエチレン含有量が得られる。一実施形態ではポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は最大で懸濁液の約０．０００５％～約０．００１％の量で存在し得る。一例において、製剤は、例えば、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム・７Ｈ_２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム・２Ｈ_２Ｏ）、二塩基性リン酸ナトリウム及びそれらの混合物のうちの１つ以上を水中に含む緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。クモ膜下腔内送達のためには浸透圧が、脳脊髄液に適合する範囲に入っていることが好適であり（例えば約２７５～約２９０）、例えば、ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６－ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照されたい。場合によっては、クモ膜下腔内送達のために市販の希釈剤を懸濁化剤として、または別の懸濁化剤及びその他の任意選択の賦形剤と組み合わせて使用してもよい。例えば、エリオットＢ（登録商標）溶液［Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ］を参照されたい。他の実施形態では、製剤は、１つ以上の浸透促進剤を含有し得る。好適な浸透促進剤の例には、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、またはＥＤＴＡが含まれ得る。

【0135】

場合によって本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び担体（複数可）以外にも他の一般的な医薬原料、例えば保存剤または化学安定剤を含有し得る。好適な保存剤の例としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール及びパラクロロフェノールが挙げられる。好適な化学安定剤としてはゼラチン及びアルブミンが挙げられる。

【0136】

本発明に係る組成物は、上に定義したものなどの薬学的に許容できる担体を含み得る。本明細書に記載の組成物は、薬学的に適する担体の中に懸濁させた、及び／または注射、浸透圧ポンプ、クモ膜下腔内カテーテルによる対象への送達のためまたは別の装置もしくは経路による送達のために設計された好適な賦形剤と混合した、１つ以上のＡＡＶを有効量含むことが好適である。一例において、組成物は、クモ膜下腔内送達のために製剤化される。

【0137】

本明細書中で使用する場合、「クモ膜下腔内送達」または「クモ膜下腔内投与」という用語は、薬物が脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するようにそれを脊柱管内、より具体的にはクモ膜下腔内への注射によって投与する経路を指す。クモ膜下腔内送達は腰椎穿刺、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）（脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／脳槽内、及び／またはＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料を腰椎穿刺によってクモ膜下腔全体にわたる拡散のために導入してもよい。別の例では大槽内に注射を行ってもよい。

【0138】

本明細書中で使用する場合、「脳槽内送達」または「脳槽内投与」という用語は、大槽小脳延髄槽の脳脊髄液の中に、より具体的には後頭下穿刺によって、または大槽内への直接注射によって、または永久配置された管を介して、薬物を直接投与する経路を指す。

【0139】

ＩＶ．脳脊髄液中への医薬組成物の送達のための機器及び方法
一態様において、本明細書に提供するベクターは、この節において提供され図７においてさらに説明される方法及び／または装置によってクモ膜下腔内に投与され得る。あるいは、他の装置及び方法を選択してもよい。方法は、患者の大槽の中へと脊椎穿刺針を前進させるステップと、ある長さの可撓性管類を脊椎穿刺針の近位ハブに連結し、可撓性管類の近位端に弁の排出ポートを連結するステップと、上記前進及び連結ステップの後であって管類を患者の脳脊髄液で初回自給させた後に、ある量の等張溶液が入った第１容器を弁の洗浄入口ポートに連結し、その後、ある量の医薬組成物が入った第２容器を弁のベクター入口ポートに連結するステップとを含む。第１及び第２容器を弁に連結した後、弁のベクター入口ポートと出口ポートとの間の流体流路を開き、医薬組成物を脊椎穿刺針に通して患者の中へと注入し、医薬組成物の注入後、弁の洗浄入口ポートと出口ポートとを通る流体流路を開き、等張溶液を脊椎穿刺針内へ注入して医薬組成物を患者の中に流し込む。

【0140】

別の態様では、医薬組成物の脳槽内送達のための装置が提供される。装置は、ある量の医薬組成物が入った第１容器、等張溶液が入った第２容器及び、装置から患者の大槽内の脳脊髄液中へと直接吐出され得る医薬組成物が通る脊椎穿刺針を含む。装置はさらに、第１容器に相互連結された第１入口ポートと、第２容器に相互連結された第２入口ポートと、脊椎穿刺針に相互連結された出口ポートと、脊髄穿刺針を通る医薬組成物及び等張溶液の流れを制御するためのルアーロックとを有する弁を含む。

【0141】

本明細書中で使用する場合、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）という用語は、軸に沿って作られた一連の平面断面画像からコンピュータによって身体構造の三次元画像を構築するＸ線撮影を指す。

【0142】

図７に示す機器または医療装置１０は、弁１６を介して相互連結した１つ以上の容器１２及び１４を備える。容器１２及び１４はそれぞれ、医薬組成物、薬物、ベクターまたは類似する物質の新鮮な供給源、及び生理食塩水などの等張溶液の新鮮な供給源を提供する。容器１２及び１４は、患者の中への流体の注入を可能にするいかなる形態の医療装置であってもよい。

【0143】

例として、各容器１２及び１４は、シリンジ、カニューレまたは類似するものの形態で提供され得る。例えば、図示されている実施形態において容器１２は、ある量の医薬組成物が入った別個のシリンジとして提供されており、本明細書中では「ベクターシリンジ」と呼ばれる。単に例示のために記すが、容器１２には、医薬組成物または類似するものが約１０ｃｃ収容され得る。

【0144】

同様に、容器１４は、ある量の生理食塩水溶液が入った別個のシリンジ、カニューレまたは類似するものの形態で提供され得、「洗浄シリンジ」と呼ばれ得る。単に例示のために記すが、容器１４には約１０ｃｃの生理食塩水溶液が収容され得る。

【0145】

代わりに、容器１２及び１４をシリンジ以外の形態で提供してもよく、単一の装置の中に組み込んでもよく、例えば一体化医療用注射装置は一対の別々になったチャンバを有し、１つは医薬組成物のためのものであり、１つは生理食塩水溶液のためのものである。さらに、チャンバまたは容器の大きさは、流体の所望の量を収容する必要に応じて提供され得る。

【0146】

図示されている実施形態において、弁１６は、スイベル式オスルアーロック１８を有する四方活栓として提供されている。弁１６は、容器１２と容器１４と（すなわち、図示されている実施形態のベクターシリンジと洗浄シリンジと）を相互連結させ、スイベル式オスルアーロックは弁１６の中を通る通路を容器１２及び１４の各々に対して開閉することを可能にする。このようにして、弁１６の中を通る通路をベクターシリンジ及び洗浄シリンジの両方に対して閉じてもよいし、またはベクターシリンジ及び洗浄シリンジのうち選択された１つに対して開いてもよい。四方活栓の代わりに弁は三方活栓であってもよいし、または流体制御装置であってもよい。

【0147】

図示されている実施形態において、弁１６は、延長管類２０または類似する流体用導管の長さの一端に連結されている。管類２０は、所望の長さまたは内部容積に基づいて選択され得る。単に例として記すが、管類の長さは約６～７インチであり得る。

【0148】

図示されている実施形態において、管類１２の反対側の端部２２はＴ字形コネクタ延長セット２４に連結されており、これが今度は脊髄穿刺針２６に連結されている。例として、針２６は、５インチ、２２または２５ゲージの脊椎穿刺針であり得る。さらに、任意選択で、脊椎穿刺針２６を誘導針２８、例えば３．５インチ、１８ゲージの誘導針に連結してもよい。

【0149】

使用時、脊椎穿刺針２６及び／または任意選択の誘導針２８を患者の中へ大槽に向かって前進させ得る。針を前進させた後、針２６及び／または２８ならびに関係する軟組織（例えば、傍脊柱筋、骨、脳幹及び脊髄）の可視化を可能にするコンピュータ断層撮影（ＣＴ）画像が取得され得る。針の正確な配置は針ハブ内の脳脊髄液（ＣＳＦ）の観察及び大槽内の針先端部の可視化によって確認される。その後、挿入された脊椎穿刺針２６に比較的短い延長管類２０が取り付けられ得、その後、管類２０の反対側の端部に四方活栓１６が取り付けられ得る。

【0150】

上記組立体を患者のＣＳＦで「初回自給」させる。その後、充填済み生理食塩水洗浄シリンジ１４を四方活栓１６の洗浄入口ポートに取り付け、その後、医薬組成物が入ったベクターシリンジ１２を四方活栓１６のベクター入口ポートに取り付ける。その後、活栓１６の排出ポートをベクターシリンジ１２に対して開き、ベクターシリンジの内容物は、弁１６及び組立済み機器を通り抜けて患者の中へとある期間を掛けてゆっくりと注入され得る。単に例示のために記すが、この期間はおよそ１～２分及び／またはその他の任意の所望の時間であり得る。

【0151】

ベクターシリンジ１２の内容物を注入した後、取り付けられている充填済み洗浄シリンジ１４を使用して活栓１６及び針組立体を所望の量の生理食塩水で洗浄することができるように活栓１６上のスイベル式ロック１８を第２位置まで回す。単なる例を記せば１～２ｃｃの生理食塩水が使用され得るが、より多いまたはより少ない量を必要に応じて用いてもよい。生理食塩水は、医薬組成物の全てまたはほとんどが組立済み装置を通り抜けて患者の中へと注入されるように促されその結果として医薬組成物が組立済み装置内にほとんどまたは全く残らないことを確保する。

【0152】

組立済み装置に生理食塩水を流した後、組立済み装置は針（複数可）、延長管類、活栓及びシリンジを含むその全体がゆっくりと対象から取り外されてバイオハザード廃棄物用の入れ物または（例えば針（複数可）のための）硬質容器の中への破棄のために外科用トレイ上に置かれる。

【0153】

最終的に脳槽内（ＩＣ）手技に至り得るスクリーニングプロセスは、研究責任者によって引き受けられ得る。研究責任者は、対象（または指名された介護人）に十分な情報を与
えるべくプロセス、手技、投与手順自体、及び起こり得るあらゆる安全性リスクについて説明し得る。医療歴、併用薬、身体検査、バイタルサイン、心電図（ＥＣＧ）、及び実験室検査結果が得られ、または実施され、そしてＩＣ手技のための対象の適格性のスクリーニング評価に使用するために神経放射線科医、神経外科医及び麻酔専門医に提供される。

【0154】

適格性を再検討する十分な時間を可能にするために、第１スクリーニング訪問から試験訪問の１週間前までの任意の時に以下の手順が実施され得る。例えば、「０日目」には、ガドリニウム（すなわち、ｅＧＦＲ＞３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２）を伴うかまたは伴わずに頭部／頚部磁気共鳴画像（ＭＲＩ）が取得され得る。頭部／頚部ＭＲＩに加えて研究者は屈曲／伸張試験によって頚部に関する何らかのさらなる評価の必要性を判断し得る。ＭＲＩプロトコールは、Ｔ１、Ｔ２、ＤＴＩ、ＦＬＡＩＲ及びＣＩＮＥプロトコール画像を含み得る。

【0155】

さらに、ＣＳＦ流の十分な評価、及びあり得るＣＳＦ空間同士の連通の遮断または欠如の同定を可能にする頭部／頚部ＭＲＡ／ＭＲＶが、施設プロトコールに従って取得され得る（つまり、硬膜内／経硬膜手術歴を有する対象は除外され得るかまたはさらなる検査（例えば放射性ヌクレオチド脳槽造影）が必要とされ得る）。

【0156】

神経放射線科医、神経外科医及び麻酔専門医は、利用可能なあらゆる情報（スキャン、医療歴、身体検査、研究など）に基づいてＩＣ手技に対する各対象の適格性を最終的に議論及び判断する。ＭＰＳ対象の特別な生理学的必要性を念頭に置いて、「－２８日目」～「１日目」まで、気道、（短い／厚い）頚部、及び頭部可動域（頚部屈曲の度合い）の詳細な評価を提供する麻酔の術前評価も取得され得る。

【0157】

ＩＣ手技に先立って、ＣＴ室に以下の装備及び医薬が存在することを確認することになる：別個の薬事マニュアルに従って準備されＣＴ／手術室（ＯＲ）に搬入される、成人用腰椎穿刺（ＬＰ）キット（施設によって供給される）；ＢＤ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）２２または２５ゲージ×３～７インチ脊椎穿刺針（Ｑｕｉｎｃｋｅ ｂｅｖｅｌ）；介入施与者の裁量で（脊椎穿刺針の導入のために）使用される共軸誘導針；スイベル（スピン）式オスルアーロックを備えた四方小孔活栓；メスルアーロックアダプタを備えた長さおよそ６．７インチのＴ字形コネクタ延長セット（管類）；クモ膜下腔内投与のためのＯｍｎｉｐａｑｕｅ１８０（イオヘキソール）；静脈内（ＩＶ）投与のためのヨウ素化造影剤；（成人用ＬＰキットに備わっていない場合の）注射用１％リドカイン溶液；充填済み１０ｃｃ生理食塩水（無菌）洗浄シリンジ；放射線不透過性マーカー（複数可）；外科準備用装備／剃毛用カミソリ；挿管される対象の適切な配置を可能にする枕／支持台；気管内挿管用装備、全身麻酔機及び機械式人工呼吸器；術中神経生理学的モニタリング（ＩＯＮＭ）装備（及び必要な人員）；ならびにベクター入り１０ｃｃシリンジ。

【0158】

手技のためのインフォームドコンセントを確認し、医療記録及び／または研究ファイルに載録する。放射線科及び麻酔学従事者による手技についての別個の同意を施設の要件に従って取得する。対象は、施設ガイドラインに従って適切な病院介護室内で静脈内へのアクセスが配備される（例えば、２つのＩＶアクセス部位）。静脈内用流体は麻酔専門医の裁量で投与される。麻酔専門医の裁量で、及び施設ガイドラインに従って、適切な患者介護室、待機場または外科／ＣＴ手技室の中で全身麻酔の施与と共に気管内挿管が対象に導入及び施与され得る。

【0159】

腰椎穿刺を実施して、まず５ｃｃの脳脊髄液（ＣＳＦ）を除去し、次いで、大槽の可視化に役立つ造影剤（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ １８０）をクモ膜下腔内に注射する。大槽内への造影剤の拡散を促進するために適切な対象配置操作が実施され得る。

【0160】

術中神経生理学的モニタリング（ＩＯＮＭ）装備を対象に取り付ける。対象をＣＴスキャナ台上に腹臥位または側臥位で配置する。搬送中及び配置中の対象の安全性を保障するためには適任の従事者が存在していなければならない。適切とみなされる場合には対象を、配置後に正常な神経モニタリング信号が記録され術前評価中に安全であると判断される程度に頚部屈曲をもたらすように配置してもよい。

【0161】

以下の従事者の存在が確認され得、現場で識別され得る：手技を実施する介入施与者／神経外科医；麻酔専門医及び呼吸器専門技術者（複数可）；看護師及び医師助手；ＣＴ（またはＯＲ）技術者；神経生理学専門技術者；及び現場取りまとめ役。正確な対象、手順、部位、配置、及び室内で必要となる全ての装備の存在を確認するための「タイムアウト」が合同審査会／院内プロトコールに従って完遂され得る。その後、先導現場研究者は従事者と共に、彼／彼女が対象の準備を進めてもよいことを確認し得る。

【0162】

対象の頭蓋骨より下の皮膚を適切に剃毛する。標的位置を突き止め脈管構造を撮像する必要があると介入施与者によってみなされる場合には、ＣＴスカウト像を実施し、続いて、ＩＶ用造影剤によるＣＴを計画する前手順を実施する。標的部位（大槽）が特定され針軌道が計画された後、施設ガイドラインに従って無菌技術を用いて皮膚の準備を整え覆布を掛ける。介入施与者が指示するとおりに放射線不透過性マーカーを標的皮膚位置に配置する。マーカーの下の皮膚に、１％リドカインの浸潤によって麻酔を掛ける。その後、共軸誘導針を場合によって使用して２２Ｇまたは２５Ｇの脊椎穿刺針を大槽に向かって前進させる。

【0163】

針前進後、施設装備を使用して実現可能な最も薄いＣＴスライス厚み（理想的には２．５ｍｍ以下）を用いてＣＴ画像を取得する。針及び関係する軟組織（例えば、傍脊柱筋、骨、脳幹及び脊髄）の十分な可視化の余地がある可能な最低放射線線量を用いて連続ＣＴ画像を取得する。針の正確な配置は、針ハブ内のＣＳＦの観察及び大槽内の針先端部の可視化によって確認される。

【0164】

介入施与者は、ベクターシリンジが無菌場の近くにではあるがその外側に配置されていることを確認する。ベクターシリンジ内の医薬組成物の取扱いまたは投与に先立ってグローブ、マスク及び目保護が無菌場内での手技を手伝う従事者によってなされる。

【0165】

挿入された脊椎穿刺針に延長管類を取り付け、次いでそれに四方活栓を取り付ける。機器が対象のＣＳＦで「初回自給」された時点で１０ｃｃ予備充填生理食塩水洗浄シリンジを四方活栓の洗浄入口ポートに取り付ける。その後、ベクターシリンジが介入施与者に提供され、四方活栓のベクター入口ポートに取り付けられる。

【0166】

活栓のスイベル式ロックを第１位置に配置することによって活栓の出口ポートをベクターシリンジに対して開いた後、注入中にシリンジのプランジャに過度の力が印加されないように配慮しながらベクターシリンジの内容物をゆっくりと（およそ１～２分掛けて）注入する。ベクターシリンジの内容物が注入された後、取り付けられている充填済み洗浄シリンジを使用して１～２ｃｃの生理食塩水で活栓及び針組立体を洗浄することができるように活栓のスイベル式ロックを第２位置まで回す。

【0167】

準備が整うと介入施与者は次に従事者に彼／彼女が機器を対象から除去することを通告する。１回の動作で針、延長管類、活栓及びシリンジを対象からゆっくりと取り外し、バイオハザード廃棄物用の入れ物または（針のための）硬質容器の中への破棄のために外科用トレイ上に置く。

【0168】

針挿入部位に出血またはＣＳＦ漏出の兆候がないかを調べ、研究者に指示されたとおり
に処置する。ガーゼ、外科用テープ及び／またはテガダーム被覆材を指示されるとおりに使用して部位を保護する。その後、対象をＣＴスキャナから移動させて担架に仰臥位で載せる。搬送中及び配置中の対象の安全性を保障するために適任の従事者が存在する。

【0169】

麻酔を中止し、対象を麻酔後介護についての施設ガイドラインに従って介護する。神経生理学的監視装置を対象から取り外す。回復の間、対象が横たわっている担架の頭側はわずかに（おおよそ３０度）高くするべきである。施設ガイドラインに従って対象を好適な麻酔後介護室へ搬送する。対象は、意識が十分に回復して安定な状態になった後、プロトコールが定める評価のための適切な階／部屋に受け入れられることになる。神経学的評価はプロトコールに従って見守られることになり、主任研究者は病院及び研究の従事者と協力して対象の介護を監督する。

【0170】

一実施形態では、本明細書において提供される組成物を送達する方法は、患者の大槽の中へと脊椎穿刺針を前進させるステップと、ある長さの可撓性管類を脊椎穿刺針の近位ハブに連結し、可撓性管類の近位端に弁の排出ポートを連結するステップと、上記前進及び連結ステップの後であって管類を患者の脳脊髄液で初回自給させた後に、ある量の等張溶液が入った第１容器を弁の洗浄入口ポートに連結し、その後、ある量の医薬組成物が入った第２容器を弁のベクター入口ポートに連結するステップと、上記第１及び第２容器を弁に連結した後、弁のベクター入口ポートと出口ポートとの間の流体流路を開き、医薬組成物を脊椎穿刺針に通して患者の中へと注入するステップと、医薬組成物の注入後、弁の洗浄入口ポートと出口ポートとを通る流体流路を開き、等張溶液を脊椎穿刺針内へ注入して医薬組成物を患者の中に流し込むステップとを含む。特定の実施形態では、方法はさらに、管類及び弁を脊椎穿刺針のハブに連結する前に脊椎穿刺針の遠位先端部の大槽内での適切な配置を確認することを含む。特定の実施形態では、確認ステップは、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）を行うことによって大槽内の脊椎穿刺針の遠位先端部を可視化することを含む。特定の実施形態では、確認ステップは、脊椎穿刺針のハブ内での患者の脳脊髄液の存在を観察することを含む。

【0171】

上記方法において、弁は、スイベルで第１位置まで回転してベクター入口ポートから出口ポートへの流れを可能にすると同時に洗浄入口ポートを通る流れを遮断すること、及びスイベルで第２位置まで回転して洗浄入口ポートから出口ポートへの流れを可能にすると同時にベクター入口ポートを通る流れを遮断することに適合したスイベル式ルアーロックを備えた活栓であり得、スイベル式ルアーロックは、上記医薬組成物を患者に注射するときには上記第１位置に配置され、上記医薬組成物を等張溶液で上記患者の中に流し込んでいるときには上記第２位置に配置される。特定の実施形態では、等張溶液を脊椎穿刺針の中に注入して医薬組成物を患者の中に流し込んだ後、脊椎穿刺針をそれが組立体として管類、弁ならびに第１及び第２容器に連結されている状態で患者から引き抜く。特定の実施形態では、弁は、スイベル式オスルアーロックを備えた四方活栓である。特定の実施形態では、第１及び第２容器は別個のシリンジである。特定の実施形態では、Ｔ字形コネクタは、脊椎穿刺針のハブに配置され、管類と脊椎穿刺針とを相互連結させる。場合によって脊椎穿刺針は脊椎穿刺針の遠位端に誘導針を含む。脊椎穿刺針は５インチ、２２または２４ゲージの脊椎穿刺針であり得る。特定の実施形態では、誘導針は３．５インチ、１８ゲージの誘導針である。

【0172】

特定の態様では、方法は、最低でも、ある量の医薬組成物を収容するための第１容器；等張溶液を収容するための第２容器；医薬組成物が装置から直接患者の大槽内の脳脊髄液中へと吐出され得るときに通る脊椎穿刺針；ならびに第１容器に相互連結された第１入口ポートと、第２容器に相互連結された第２入口ポートと、脊椎穿刺針に相互連結された出口ポートと、脊髄穿刺針を通る医薬組成物及び等張溶液の流れを制御するためのルアーロックとを有する弁からなる装置を利用する。特定の実施形態では、弁は、スイベルで第１
位置まで回転して第１入口ポートから出口ポートへの流れを可能にすると同時に第２入口ポートを通る流れを遮断すること、及びスイベルで第２位置まで回転して第２入口ポートから出口ポートへの流れを可能にすると同時に第１入口ポートを通る流れを遮断することに適合したスイベル式ルアーロックを備えた活栓である。場合によって、弁は、スイベル式オスルアーロックを備えた四方活栓である。特定の実施形態では、第１及び第２容器は別個のシリンジである。特定の実施形態では、脊椎穿刺針は、ある長さの可撓性管類を介して弁に相互連結される。Ｔ字形コネクタは管類と脊椎穿刺針とを相互連結させ得る。特定の実施形態では、脊椎穿刺針は５インチ、２２または２４ゲージの脊椎穿刺針であり得る。特定の実施形態では、装置はさらに、脊椎穿刺針の遠位端に連結された誘導針を含む。場合によって誘導針は３．５インチ、１８ゲージの誘導針である。

【0173】

この方法及びこの装置は各々場合によって、本明細書において提供される組成物のクモ膜下腔内送達のために用いられ得る。あるいは、他の方法及び装置をそのようなクモ膜下腔内送達のために用いてもよい。

【0174】

特定の実施形態では、ＡＡＶベクターが免疫グロブリン構築物をコードする核酸発現カセットと選択された細胞におけるその免疫グロブリンの発現を促す調節配列とを保有するようにｒＡＡＶｈｕ６８．抗ＨＥＲ２抗体を含む組成物が提供される。ＣＮＳ中へのベクターの投与後に、ベクターはＣＮＳに発現カセットを送達し、タンパク質性免疫グロブリン構築物を生体内で発現する。抗新生物方法における本明細書に記載の組成物の使用は、抗新生物薬投薬計画におけるこれらの組成物の使用と同様に教示されるが、場合によって１つ以上の他の抗新生物薬または他の活性剤の送達を含んでもよい。

【0175】

組成物は、抗新生物免疫グロブリン構築物を生体内で送達するための発現カセットを含有する本明細書に記載のＡＡＶｈｕ６８ベクターを１種類含有していてもよい。あるいは、組成物は、各々が中に異なる発現カセットをパッケージングしている２つ以上の異なるＡＡＶベクターを含有していてもよい。例えば、２つ以上の異なるＡＡＶは、生体内で組織化して単一の機能性免疫グロブリン構築物を形成する免疫グロブリンポリペプチドを発現する、異なる発現カセットを有し得る。別の例では、２つ以上のＡＡＶは、異なる標的に対する免疫グロブリンポリペプチドを発現する異なる発現カセットを有し得、例えば２つは、２つの機能性免疫グロブリン構築物（例えば、抗Ｈｅｒ２免疫グロブリン構築物と、もう１つの抗新生物免疫グロブリン構築物）を提供する。さらに別の代替形態では、２つ以上の異なるＡＡＶは同じ標的を指向する免疫グロブリン構築物を発現し得、免疫グロブリン構築物の１つはＦｃＲｎ結合を切断するように改変されており、もう１つの免疫グロブリン構築物は、その能力を保持するか、またはＦｃＲｎに結合する向上した能力を有する。そのような組成物は、脳領域における保持が増加した抗体と免疫グロブリン構築物の全身送達のための抗体とを同時に提供するために有用となり得る。

【0176】

場合によってこれらの免疫グロブリン構築物の片方または両方ともが、増強されたＡＤＣＣ活性を有する。本明細書に記載の療法計画は、本明細書に記載の組み合わせの１つ以上に加えて、抗新生物バイオ医薬品、抗新生物小分子薬、化学療法剤、免疫増強薬、放射線、外科手術などのうちの１つ以上とのさらなる組み合わせを含み得る。本明細書に記載のバイオ医薬品は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、核酸分子、ベクター（ウイルスベクターを含む）または同様のものに基づく

【0177】

本明細書に記載の組成物は、注射、浸透圧ポンプ、クモ膜下腔内カテーテルによる対象への送達のために、または別の装置もしくは経路による送達のために設計された、薬学的に適する担体の中に懸濁した抗新生物有効量の１つ以上のＡＡＶｈｕ６８を含むことが好適である。一例では、組成物はクモ膜下腔内送達のために製剤化される。本明細書中で使用する場合、クモ膜下腔内送達は、脊柱管内、より具体的にはクモ膜下腔内への注射を包
含する。しかしながら、数ある好適な直接または全身経路の中でも例えば頭蓋内、鼻腔内、脳槽内、脳脊髄液中への送達すなわちオンマヤリザーバーを含めて他の送達経路、及びＡＡＶ組成物のための薬学的に許容できる担体を選択してもよい。

【0178】

組成物は、（体重７０ｋｇの平均的対象を処置するために）約１×１０^９ゲノムコピー（ＧＣ）～約５×１０^１３ＧＣの範囲内の量のＡＡＶを含有する投薬量単位で製剤化され得る。一実施形態では、約１５ｍＬ（またはそれ未満）～約４０ｍＬのＣＳＦを取り出し、ベクターをＣＳＦと混合し、及び／または適合する担体の中に懸濁させ、対象に送達する、脊椎穿刺を実施する。一例では、ベクター濃度は約３×１０^１３ＧＣであるが、その他の量としては例えば、約１×１０^９ＧＣ、約５×１０^９ＧＣ、約１×１０^１０ＧＣ、約５×１０^１０ＧＣ、約１×１０^１１ＧＣ、約５×１０^１１ＧＣ、約１×１０^１２ＧＣ、約５×１０^１２ＧＣまたは約１．０×１０^１３ＧＣが挙げられる。

【0179】

一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、腫瘍の増殖を遅延させる方法において使用される。さらに別の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、対象の腫瘍サイズを減少させるのに有用である。さらなる実施形態では、本明細書に記載の組成物は、非固形腫瘍癌のがん細胞の数を減少させるのに有用である。別の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、患者の全生存率及び／または無増悪生存率を向上させる方法に使用される。抗新生物免疫グロブリン構築物は、治療する新生物を考慮して選択される。例えば、脳における転移乳癌の治療のためには、抗ＨＥＲ抗体の発現カセットを操作して本明細書に記載の組換えｒＡＡＶとしてもよい。場合によって、本明細書に記載のＡＡＶ組成物を、追加の外来性の薬剤もしくは化学剤または他の物理的な血液脳関門妨害の非存在下で投与する。併用療法では、本明細書に記載のＡＡＶ送達される免疫グロブリン構築物は、別の薬剤との療法を開始する前、間または後に、及びそれらの組み合わせで、つまり、抗新生物剤療法を開始する前及び間、前及び後、間及び後、または前、間及び後に投与される。例えば、ＡＡＶは、放射線療法の開始の１～３０日前、好ましくは３～２０日前、より好ましくは５～１２日前に投与され得る。本発明の別の実施形態では、ＡＡＶ媒介免疫グロブリン（抗体）療法と同時進行で、より好ましくはその次に化学療法を施す。さらに他の実施形態では、本発明の組成物は、他の生物製剤、例えば組換えモノクローナル抗体薬、抗体－薬物複合体、または同様のものと組み合わせられ得る。さらに、上に述べたような異なるＡＡＶ送達免疫グロブリン構築物の組み合わせをそのような療法計画に使用してもよい。いかなる好適な方法または経路を用いて本明細書に記載のＡＡＶｈｕ６８．抗Ｈｅｒ２含有組成物を投与することができ、場合によっては、抗新生物剤及び／または他の受容体の拮抗薬を共投与することができる。本発明に従って利用される抗新生物剤投薬計画は、患者の新生物症状の治療に最適であると考えられる任意の投薬計画を含む。種々の悪性腫瘍は特異的な抗腫瘍抗体及び特異的抗新生物剤の使用を必要とし得るが、これは患者ごとに決定されることになる。投与形態としては、例えば、全身、経口、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内投与が挙げられる。投与する拮抗薬の用量は、例えば、拮抗薬の種類、治療する腫瘍の種類及び重症度、ならびに拮抗薬の投与経路を含めた数々の因子に依存する。

【0180】

「ａ」または「ａｎ」という用語が１つ以上を指すことに留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は本明細書中で交換可能に使用される。

【0181】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる」という語は、排他的にではなく包括的に解釈されるべきである。「からなる」、「からなっている」という語及びその変化形は、包括的にではなく排他的に解釈されるべきである。明細書中の様々な実施形態が「含んでいる」表現を用いて表されているが、他の状況の下では関係する実施形態が「からなる」または「から本質的になる」表現を用いて解釈及
び説明されることも意図される。

【0182】

本明細書中で使用する場合、「約」という用語は、特に指定がない限り、所与の基準からの１０％（±１０％）の変動を意味する。

【0183】

本明細書中で使用する場合、「疾患」、「障害」及び「症状」は、対象の異常な状態を指して交換可能に使用される。

【0184】

本明細書中の他のどこかで定義していない限り、本明細書中で使用する科学技術用語は、当業者によって、及び本願で使用する用語の多くに対する一般的手引きを当業者に提供するものである公開文を参照することによって通常理解されるのと同じ意味を有する。

【0185】

「発現」という用語は、本明細書中ではその最も広い意味で使用され、ＲＮＡの産生、またはＲＮＡとタンパク質との産生を含む。ＲＮＡに関して「発現」または「翻訳」という用語は、詳しくは、ペプチドまたはタンパク質の産生に関する。発現は一過的である場合もあるし、または安定的である場合もある。

【0186】

本明細書中で使用する場合、「ＮＡｂ力価」という用語は、標的とするエピトープ（例えばＡＡＶ）の生理学的作用を中和する中和抗体（例えば抗ＡＡＶ Ｎａｂ）がどれくらい多く産生されるかについての測定結果である。抗ＡＡＶ ＮＡｂ力価は、例えば、Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００９．１９９（３）：ｐ．３８１－３９０に記載されているように測定され得る。

【0187】

本明細書中で使用する場合、「発現カセット」は、コード配列、プロモーター、を含む核酸分子を指し、そのための他の調節配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、２つ以上の発現カセットを含有し得る。他の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、「発現カセット」と交換可能に使用され得る。典型的には、ウイルスベクターを生成するためのそのような発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルと、他の発現制御配列、例えば本明細書中に記載されているものとに挟まれた、本明細書に記載の遺伝子産物のためのコード配列を含有する。

【0188】

「ｓｃ」という略語は自己相補性を指す。「自己相補性ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列が有するコード領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染時には、第２の鎖の細胞媒介合成を待つことなくｓｃＡＡＶの相補的な両半分が会合して、即時複製及び転写の準備が整った１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成することになる。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照されたい。自己相補性ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、第７，１２５，７１７号及び第７，４５６，６８３号に記載されており、参照によりこれらの各々の全体を本明細書に援用する。

【0189】

本明細書中で使用する場合、「機能可能に繋げられている」という用語は、関心対象の遺伝子と連続している発現制御配列を指すだけでなく、トランスで、または遠くで作用して関心対象の遺伝子を制御する発現制御配列も指す。

【0190】

「異種」という用語は、タンパク質または核酸に関して使用する場合、タンパク質または核酸が、互いに同じ関係性では天然に見つからない２つ以上の配列または小配列を含むことを表す。例えば、核酸は典型的には組換え的に生産され、無関係の遺伝子からの２つ以上の配列が配置されて新たな機能性核酸を作っている。例えば、一実施形態において核酸は、ある遺伝子からのプロモーターが別の遺伝子からのコード配列の発現を促すように配置されている。かくして、コード配列に関してプロモーターは異種である。

【0191】

「増殖能欠損型ウイルス」または「ウイルスベクター」とは、関心対象の遺伝子を含有している発現カセットがウイルスカプシドまたはエンベロープの中にパッケージングされており、ウイルスカプシドまたはエンベロープの中に同じくパッケージングされている任意のウイルスゲノム配列が増殖能欠損型である、つまりそれらが子孫ビリオンを生み出すことができないが標的細胞に影響を与える能力を保持している、合成または人工のウイルス粒子を指す。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製するのに必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とされるシグナルに挟まれた関心対象の遺伝子のみを含有して「ガットレス」になるように操作され得る）が、これらの遺伝子は生産中に供給され得るものである。したがってそれは、複製のために必要とされるウイルス酵素の存在下にある場合以外はウイルス酵素の子孫ビリオンによる複製及び感染が起こり得ないことから、遺伝子療法に使用するために安全であるとみなされる。

【0192】

多くの場合、ｒＡＡＶ粒子はＤＮアーゼ耐性と呼ばれる。しかしながら、このエンドヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）に加えて他のエンド－及びエキソ－ヌクレアーゼを本明細書に記載の精製ステップに使用して混入核酸を除去してもよい。そのようなヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡ及び／または二本鎖ＤＮＡならびにＲＮＡを分解するように選択され得る。そのようなステップは、単一のヌクレアーゼまたは、異なる標的を指向するエンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼであり得るヌクレアーゼの混合物を含有し得る。

【0193】

「ヌクレアーゼ耐性」という用語は、ＡＡＶカプシドが、宿主細胞に遺伝子を送達するように設計された発現カセットの周囲で完全に組織化し、生産プロセスゆえに存在している可能性がある汚染核酸を除去することを意図したヌクレアーゼインキュベーションステップの間これらのパッケージングされたゲノム配列を分解（消化）から保護する、ということを示す。

【0194】

本明細書中で使用する場合、「有効量」とは、ベクターゲノムからある量の遺伝子産物を標的細胞に送達及び発現するｒＡＡＶ組成物の量を指す。有効量は、ヒト患者ではなく動物モデルに基づいて決定され得る。好適なマウスモデルの例は本明細書中に記載されている。

【0195】

特定の実施形態では、本明細書において提供されるｒＡＡＶまたは組成物は、抗インフルエンザ抗体または免疫グロブリン構築物を除外する。特定の実施形態では、本明細書において提供されるｒＡＡＶまたは組成物は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）遺伝子またはＳＭＮコード配列を除外する。

【0196】

本発明との関連において、「翻訳」という用語は、ｍＲＮＡ鎖がアミノ酸配列の組立てを制御してタンパク質またはペプチドを生成する、リボソームにおけるプロセスに関する。

【0197】

本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して使用する「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、及びその変化形は、他
の成分、要素、整数、ステップ及び同様のものに対して包括的である。反対に、「からなる」という用語及びその変化形は、他の成分、要素、整数、ステップ及び同様のものに対して排他的である。

【0198】

「ａ」または「ａｎ」という用語が１つ以上を指すことに留意されたく、例えば、「エンハンサー（ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ）」は１つ以上のエンハンサー（複数可）を表すものと理解される。このように、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は本明細書中で交換可能に使用される。

【0199】

上記のとおり、数値を修飾する場合に使用する「約」という用語は、特に指定がない限り、±１０％の変動を意味する。

【0200】

以下の実施例は例示に過ぎず、本発明を限定することは意図されない。

【実施例】

【0201】

特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、同じくクレードＦ内に入るＡＡＶ９よりも良好な収率を有することが認められた。位置６７にあるグルタミン酸（Ｇｌｕ）及び位置１５７にあるバリン（Ｖａｌ）の片方または両方のアミノ酸変化がこの収率増加を付与する可能性がある。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを有するベクターは、ＡＡＶ９に基づくベクターと比較して、パッケージングされたベクターの収率の少なくとも１５％の増加をもたらす。ＡＡＶｈｕ６８とＡＡＶｒｈ１０とを比較すると、ＡＡＶｈｕ６８は、低用量（例えば約１×１０^９）で脳室内投与後にＡＡＶｒｈ１０よりも良好な形質導入効率をもたらすことが判明した。

【0202】

実施例１
Ａ．ＡＡＶｈｕ６８の同定
以下の改変を伴ってＱＩＡａｍｐカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の推奨に従って使用してヒト組織試料からＰＣＲ鋳型としての組織ＤＮＡを抽出した。Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ［Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００２ Ｓｅｐ ３，９９（１８）：１１８５４－１１８５９（電子公開２００２年８月２１日）］によって記載されているようにＱ５ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，ＮＥＢ）を、試料中の潜在的ＡＡＶの完全長ＶＰ１遺伝子を回収するその高い忠実度及び堅牢な効率ゆえに選択し、以下のとおりに改変されたプライマー組を使用した：ＡＶ１ＮＳの代わりにＧＣＴＧＣＧＹＣＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＧＡＡＣプライマーｐｒｍ５０４［配列番号７］を使用し、逆方向プライマーＡＶ２ＣＡＳの代わりにｐｒｍ５０５：ＣＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＡＣＧＡ［配列番号８］を使用した。ＰＣＲ条件を以下のとおりに改変した。

【表3】

ＰＣＲプログラム

【表4】

【0203】

ＰＣＲからの約３ｋｂのバンドをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを抽出し、Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングした。プラスミドを配列決定してＡＡＶ ＶＰ１遺伝子の完全長を得た。試料の大部分について少なくとも３つのプラスミドが完全に配列決定され、その試料の最終ＡＡＶ配列としての共通配列が導き出された。

【0204】

ＡＡＶｈｕ６８のｖｐ１カプシドタンパク質をコードする得られた核酸配列を配列番号１に示す。図２Ａ～Ｃも参照されたい。ＡＡＶｈｕ６８のｖｐ１アミノ酸配列を図１及び配列番号２に示す。ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ３１及びＡＡＶｈｕ３２と比較してＡＡＶｈｕ６８では２つの突然変異（Ａ６７Ｅ及びＡ１５７Ｖ）が必須であると同定された（図１中に丸で囲って示す）。

【0205】

この増幅方法は、ｖｐ１コード配列とｒｅｐコード配列との間にスペーサー配列も設けた。このコード配列は、ａｔｇａｃｔｔａａａｃｃａｇｇｔ、配列番号９である。ＡＡＶｈｕ６８のｒｅｐ５２のコード配列は配列番号３で再現される。また、ｒｅｐ５２タンパク質配列は配列番号４で再現される。

【0206】

その後、パッケージング効率、収率及び形質導入特性を評価するために、ｐＡＡＶ２／９主鎖のＡＡＶ９ ＶＰ１遺伝子の場所にｈｕ６８のＶＰ１遺伝子を搭載することによってｐＡＡＶ２／ｈｕ６８トランスプラスミドを作った。ｐＡＡＶ２／９プラスミドは、カプシド遺伝子を挟んでＡＡＶ２の５’及び３’ＩＴＲを含有し、Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ
Ｃｏｒｅ［Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ ＵＳ，ｐｅｎｎｖｅｃｔｏｒｃｏｒｅ．ｍｅｄ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ］から入手することができる。

【0207】

Ｂ．ＡＡＶｈｕ６８の特性評価
この現象はアデノ随伴ウイルスカプシドにおいて以前に観察または記載されたことがないが、他のタンパク質及びペプチドは試験管内だけでなく生体内でも様々な化学修飾に影響され易いことが見出されたことがある。最も頻度の高い修飾は、自発的な非酵素的反応であるアスパラギンの脱アミド化である。概して、生理学的条件下（ｐＨ７．４、３７℃）でのアスパラギニル脱アミド化の半減期は約１～１０００日の間で変動する。類似する一連の反応がグルタミンにおいて起こってグルタメート残基となるが、これらの反応はそれらのアスパラギン対応物の反応よりも遅い。

【0208】

短鎖ペプチドでは、環状中間体の形成は一次配列によって制御されるが、タンパク質では二次、三次及び四次構造がさらなる影響を与える。したがって、各タンパク質アミドの脱アミド化速度は固有に決まる。脱アミド化ペプチドの質量分析による同定は比較的簡単である、というのも、脱アミド化は完全分子の質量に＋０．９８４Ｄａ（－ＯＨと－ＮＨ_２基との質量差）を足すからである。脱アミド化は気相において安定な修飾であるため、
ＭＳ／ＭＳスペクトルはいくつかの潜在的脱アミド化部位が存在している場合でさえ脱アミド化の位置を明らかにすることができる。

【0209】

この研究に関係のない４つのベクターゲノムのうちの１つを使用して４つのＡＡＶｈｕ６８ベクターを、２９３細胞において各々従来の三重トランスフェクション法を用いて生産した。これらの技術の概要については、例えば、Ｂｅｌｌ ＣＬ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ＡＡＶ９ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ
ｉｍｐｒｏｖｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｌｕｎｇ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｍｉｃｅ．”，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１１；１２１：２４２７－２４３５を参照されたい。手短に述べると、ＡＡＶ２末端逆位反復配列に挟まれたパッケージングされる配列（ニワトリβ－アクチンプロモーター、イントロン及び成長ホルモンポリＡから発現される遺伝子産物）をコードするプラスミドを、ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドならびにアデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＡｄΔＦ６）と共にＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクションによってパッケージングした。結果として得られるＡＡＶウイルス粒子は、ＣｓＣｌ勾配遠心分離を用いて精製され得、濃縮され得、後の使用のために冷凍され得る。

【0210】

変性及びアルキル化：解凍したウイルス調製物（タンパク質溶液）１００μｇに２μｌの１Ｍのジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び２μｌの８Ｍのグアニジン塩酸塩（ＧｎｄＨＣｌ）を添加し、９０℃で１０分間インキュベートする。溶液を室温まで冷えさせ、その後、新たに調製した１Ｍのヨードアセタミド（ＩＡＭ）５μｌを添加し、暗所にて室温で３０分間インキュベートする。３０分後、１μｌの１ＭのＤＴＴの添加によってアルキル化反応を停止させる。

【0211】

消化：変性タンパク質溶液にｐＨ７．５～８の２０ｍＭの重炭酸アンモニウムを、最終ＧｎｄＨＣｌ濃度を希釈して８００ｍＭになる体積で添加する。プロテアーゼ溶液（トリプシンまたはキモトリプシン）をプロテアーゼ対タンパク質の１：２０の比で添加し、３７℃で一晩インキュベートする。消化後、ＴＦＡを最終的に０．５％になるまで添加して消化反応を停止させる。

【0212】

質量分析：合わせた消化混合物のおよそ１マイクログラムをＵＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析する。ＬＣはＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ＲＳＬＣｎａｎｏシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施する。移動相Ａは０．１％のギ酸を含むＭｉｌｌｉＱ水である。移動相Ｂは０．１％のギ酸を含むアセトニトリルである。ＬＣ勾配は４％のＢから６％のＢまでを１５分間にわたって流し、その後、１０％のＢを２５分間（合計４０分）流し、その後３０％のＢを４６分間（合計８６分）流す。試料はカラムに直接装填する。カラムサイズは７５ｃｍ×内径１５ｕｍであり、２ミクロンのＣ１８媒体（Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ）を充填する。ＬＣは、ソースを使用するｎａｎｏｆｌｅｘ電子スプレーイオン化を介して四重極オービトラップ型質量分析装置（Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とインターフェースで接続される。カラムは３５℃に加熱され、２．２ｋＶの電子スプレー電圧が印加される。質量分析は、上位２０位までのイオンからのタンデム質量分析スペクトルを取得するようにプログラムされる。最大限のＭＳ分解能は１２０，０００まで、ＭＳ／ＭＳ分解能は３０，０００までである。規格化された衝突エネルギーは３０に設定し、自動ゲイン制御は１ｅ５に設定し、最大充満ＭＳは１００ｍｓに設定し、最大充満ＭＳ／ＭＳは５０ｍｓ似設定する。

【0213】

データ処理：質量分析装置の生データファイルをＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ １．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で解析した。手短に述べると、全ての検索は１０ｐｐｍの前駆体質量許容誤差、５ｐｐｍのフラグメント質量許容誤差、トリプシン切断、１つまでの切断不足、システインアルキル化の固定修飾、メチオニン／トリプト
ファン酸化の可変の改変、アスパラギン／グルタミン脱アミド化、リン酸化、メチル化、及びアミド化を必要とした。

【0214】

以下の表の中でＴはトリプシンを指し、Ｃはキモトリプシンを指す。

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【0215】

ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質の場合、４つの残基（Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、Ｎ５１２）は通例高レベルの脱アミド化を呈し、大抵は様々なロットにわたって９０％を上回る。さらなるアスパラギン残基（Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７）及びＱ５９９）も様々なロットにわたっておよそ２０％以下のレベルの脱
アミド化を呈する。脱アミド化レベルは最初はトリプシン消化を用いて同定し、そしてキモトリプシン消化を用いて確認した。

【0216】

実施例２－ＡＡＶｈｕ６８ベクターの収率
ＧＦＰ及びＬａｃＺなどの様々なタグを保有しているＡＡＶｈｕ６８及びＡＡＶ９ベクターを生成及び評価した。Ｇａｏ ｅｔ ａｌ［Ｇａｏ，Ｇｕａｎｇ－Ｐｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｎｏｖｅｌ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ ａｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ
ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９９．１８（２００２）：１１８５４－１１８５９］によって記載されているように２９３細胞において三重トランスフェクションを用いてベクターの各々を生成した。

【0217】

Ａ．ｐＡＡＶｈｕ６８トランスプラスミドの生産
ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列を配列番号１に示す。
パッケージング効率、収率及び形質導入特性を評価するために、ｐＡＡＶ２／９主鎖のＡＡＶ９ ＶＰ１遺伝子の場所にｈｕ６８のＶＰ１遺伝子を搭載することによってｐＡＡＶ２／ｈｕ６８トランスプラスミドを作った。ｐＡＡＶ２／９プラスミドは、カプシド遺伝子を挟んでＡＡＶ２の５’及び３’ＩＴＲを含有し、Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ［Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ ＵＳ，ｐｅｎｎｖｅｃｔｏｒｃｏｒｅ．ｍｅｄ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ］から入手することができる。

【0218】

Ｂ．ＡＡＶｈｕ６８ベクターの収率
１０％のウシ胎仔血清を補充し４．５ｇ／Ｌのグルコース、Ｌ－グルタミン及びピルビン酸ナトリウムを含む１ＸのＤＭＥＭ（イーグル最小必須培地のダルベッコ改変）中で２９３細胞を５％のＣＯ_２の雰囲気下、３７℃で培養及び維持した。トランスフェクションは、ベクタープラスミドをｐＡＡＶ２／ｈｕ６８またはｐＡＡＶ２／９で置き換えてＧａｏ ｅｔ ａｌ［Ｇａｏ，Ｇｕａｎｇ－Ｐｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｎｏｖｅｌ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙｓ
ａｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ９９．１８（２００２）：１１８５４－１１８５９］によって記載されているように実施された。利用した導入遺伝子（発現カセット）はＣＢ７．ＣＩ．ｆｆＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ．ＲＢＧであった。トランスフェクトした細胞をさらに６ウェルプレートで培養した。Ｇａｏ ｅｔ ａｌ［Ｇａｏ，Ｇｕａｎｇｐｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂｙ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｉｎ ｖｉｖｏ．”Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ １１．１５（２０００）：２０７９－２０９１．］に記載されているように導入遺伝子（発現カセット）のウサギベータ－グロビンポリＡ領域を標的とするプローブ及びプライマーを使用することによるＴａｑＭａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）分析によってウイルス定量を行うために、細胞の全溶解物及び上清を回収した。上清の力価と全溶解物の力価との両方に関して６つのｐＡＡＶ２／９プラスミド及び６つのｐＡＡＶ２／ｈｕ．６８プラスミドの収率を６ウェルプレートで直接比較した。各プラスミドは個々の細菌コロニーから得たものであった。

【0219】

全溶解物に関してＡＡＶｈｕ６８の収率は、ＡＡＶ９のそれと類似していることが分かった（図３Ａ、ｎ＝６、ｐ＝０．４２）。しかしながら、上清ではＡＡＶｈｕ６８の収率がＡＡＶ９のそれよりも有意に高かった（図３Ｂ、ｎ＝６、ｐ＝０．０００３）。したが
って、生産の観点からＡＡＶｈｕ６８はＡＡＶ９に比べてより良好なベクターであることが実証された、というのも、セルスタック規模及びウイルス生産の最中には上清が採集されるからである。

【0220】

実施例３－ＡＡＶｈｕ６８．ＬａｃＺの生体内形質導入
核局在性細菌β－ガラクトシダーゼ（ｎＬａｃＺ）をコードする配列を挿入することによってＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｎＬａｃＺ（ＡＡＶｈｕ６８．ＬａｃＺとも呼ぶ）を生成し、その後、実施例２に記載するように生産した。パッケージング効率、収率、形質導入特性、形質導入効率、及びＡＡＶｈｕ６８の生体内での向性を評価するために、様々な投与方法、例えば、静脈内、筋肉内及び鼻腔内投与によってマウスに５×１０^１１ゲノムコピーのＡＡＶｈｕ６８．ＬａｃＺベクターを注射した。ベクター投与から２週間後にマウスを屠殺した後、筋肉、肺、肝臓及び心臓を採取した。各臓器の凍結切片を作製し、加工し、ＬａｃＺ遺伝子発現を検出する従来のプロトコールとして分析した［Ｂｅｌｌ，Ｐｅｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．“Ａｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｉｎ ｌｕｎｇ ｔｉｓｓｕｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．”Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １２４．１（２００５）：７７－８５．］。青色で示されるＬａｃＺの陽性染色（図４Ａ～Ｃ）は、ＡＡＶｈｕ６８の形質導入の成功を示唆している。

【0221】

図４Ａに示すように、静脈内注射（ＩＶ）によってマウスにベクターを導入した後、全ての臓器（心臓、肝臓、肺及び筋肉）はＡＡＶｈｕ６８の形質導入を実証したが、肺及び筋肉よりも心臓及び肝臓を好む向性が認められた。筋肉内注射（ＩＭ）によってマウスにベクターを導入した後、心臓、肝臓及び筋肉がＡＡＶｈｕ６８の高い形質導入率を実証した一方、肺における検出可能な形質導入は認められなかった。鼻腔内投与を実施した場合、心臓、肝臓、筋肉及び肺において散在する形質導入が観察された。

【0222】

これらの結果は、ＡＡＶｈｕ６８が高い形質導入効率と広い組織／臓器向性を実証したことを明らかにした。

【0223】

実施例４－ＡＡＶ９．ＧＦＰと比較されるＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰの生体内形質導入
遺伝子として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を挿入することによってＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰ及びＡＡＶ９．ＧＦＰを生成し、その後、実施例２に記載するようにこの遺伝子を生産した。パッケージング効率、収率、形質導入特性、形質導入効率、ならびにＡＡＶｈｕ６８及びＡＡＶ９の生体内での向性を評価するために、マウスに１×１０^１０ＧＣまたは１×１０^１１ＧＣの用量でＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰまたはＡＡＶ９．ＧＦＰを投与した。ベクター投与から２週間後にマウスを屠殺した後、脳、筋肉、肺、肝臓及び心臓を採取した。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ［Ｗａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ｎｏｖ；２２（１１）：１３８９－４０１、Ｗａｎｇ
Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｊａｎ；１８（１）：１２６－３４］によって記載されているように各臓器の凍結切片を作製及び加工してＧＦＰ発現を可視化した。緑色で示されるＧＦＰの陽性染色（図５Ａ～Ｃ及び図６Ａ～Ｄ）は、試験したベクターの形質導入の成功を示唆している。

【0224】

ベクターを脳室内に投与されたマウスの様々な脳領域（海馬、運動野及び小脳）からの切片を調査した。１×１０^１０ＧＣのＡＡＶ９．ＧＦＰを注射されたマウスからのものを除いて、試験した全ての海馬試料においてＡＡＶベクターの形質導入が認められた。運動野では、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰの形質導入がＡＡＶ９のそれよりも良好であることが認められた。さらに、小脳におけるＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰの形質導入は、マウスに１×１０^１１ＧＣのベクターを注射した場合にのみ認められた。したがって、ＡＡＶｈｕ６８は
ＡＡＶ９に比べてより高い形質導入効率及びより広い向性を脳において呈した。

【0225】

さらなる実験において、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰを静脈内に投与されたマウスからの様々な臓器、例えば、肝臓、腎臓、心臓及び膵臓を準備し、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ［Ｗａｎｇ Ｌ，Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ，Ｂｅｌｌ Ｐ，Ｌｉｎ Ｊ，Ｇｒａｎｔ ＲＬ，Ｓｉｅｇｅｌ ＤＬ，Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ｎｏｖ；２２（１１）：１３８９－４０１、Ｗａｎｇ Ｌ，Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ，Ｗａｎｇ Ｈ，Ｂｅｌｌ Ｐ，Ｇｒａｎｔ Ｒ，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ＬＨ，Ｓａｎｍｉｇｕｅｌ Ｊ，Ｍｏｒｉｚｏｎｏ Ｈ，Ｂａｔｓｈａｗ ＭＬ，Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｊａｎ；１８（１）：１２６－３４］によって記載されているように加工した。緑色で示されるＧＦＰの陽性シグナルは、上記ＡＡＶベクターの形質導入の成功を示唆している。白黒で示される明視野画像は臓器形態学のために提供した一方、対応する赤色の蛍光チャンネルは陰性対照として提供した。

【0226】

肝臓では緑色で示す強い陽性信号が観察されたが、腎臓、心臓及び膵臓は上記ベクターの形質導入も示し、ＡＡＶｈｕ６８ベクターの広い組織／臓器向性が示された。

【0227】

実施例５－Ａ６７Ｅ及びＡ１５７Ｖ突然変異を有するＡＡＶベクターの収率及び生体内での形質導入
組換えアデノ随伴（ｒＡＡＶ）ベクターの収率及び／またはパッケージング効率を向上させるために、アミノ酸位置６７のＧｌｕ及び／またはアミノ酸位置１５７のＶａｌを有するｖｐ１タンパク質を発現するＡＡＶカプシド遺伝子をＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ３１及びＡＡＶｈｕ３２に対して操作するが、ここでのアミノ酸残基の付番はＡＡＶｈｕ６８［配列番号５］に基づくものである。

【0228】

上記ＡＡＶベクターを生産し、実施例２に従って各ベクターについて収率を評価する。従来の方法、例えば実施例３に示す方法によって生体内での形質導入効率及び組織／臓器／領域向性をさらに評価する。

【0229】

実施例６－ヒトＨＥＲ２＋ 乳癌脳転移癌の予防のためのクモ膜下腔内ＡＡＶｈｕ６８．ＣＭＶ．ＰＩ．ｈｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ．ＳＶ４０

【表6】

【0230】

Ａ．概要
この研究の目的は、ヒトＨＥＲ２＋ 乳癌脳転移癌の予防のための、トラスツズマブ発現カセットを含有する血清型ＡＡＶｈｕ６８の組換えアデノ随伴ウイルスであるＡＡＶｈｕ６８．ＣＭＶ．ＰＩ．ｈｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ．ＳＶ４０（ＡＡＶｈｕ６８．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）の治療有効性を、異種移植マウスモデルにおいて試験することであった。トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）は、全身性ＨＥＲ２＋疾患を治療する化学療法と共に静脈内に使用した場合に患者の生存期間を延ばす、ＨＥＲ２を指向するヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。しかしながら、血液脳関門は、静脈内に投与されるハーセプチン（登録商標）が中枢神経系に入ることを遮り、ＨＥＲ２＋乳癌脳転移癌を効果的に治療することをできなくする。いくつかの症例報告は、クモ膜下腔内投与されたハーセプチン（登録商標）が、ＨＥＲ２＋ 軟髄膜疾患を有する患者の生存期間を増加させること、またはＨＥＲ２＋ 局所転移癌の進行を停止させることができることを示している［Ｊ．Ｃ．Ｂｅｎｄｅｌｌ，ｅｔ ａｌ，Ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｉｎ ｗｏｍｅｎ ｗｈｏ ｒｅｃｅｉｖｅ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ．９７，２９７２－２９７７（２００３）、Ｄ．Ｊ．Ｓｌａｍｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｕｓｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｐｌｕｓ ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ
ＨＥＲ２ ｆｏｒ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈａｔ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ＨＥＲ２．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４，７８３－７９２（２００１），Ｍ．Ａ．Ｃｏｂｌｅｉｇｈ，ｅｔ ａｌ，Ｍｕｌｔｉｎａｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｗｏｍｅｎ ｗｈｏ ｈａｖｅ ＨＥＲ２－ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｔｈａｔ ｈａｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｄ ａｆｔｅｒ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７，２６３９－２６４８（１９９９），Ｚａｇｏｕｒｉ Ｆ，ｅｔ ａｌ，（２０１３）．Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｎｉｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｔｏｓｉｓ ｉｎ ＨＥＲ２－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｐｏｏｌｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ，１３９（１）：１３－２２．，Ｂｏｕｓｑｕｅｔ Ｇ，ｅｔ
ａｌ．（２０１６）．Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ Ｈａｌｔｓ
Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＮＳ Ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ
Ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．３４（１６）：ｅ１５１－１５５］。しかしながら、ＣＳＦは急速に変化し、その結果、大きく変動するＣＳＦ薬理動態プロファイルのためにＩＴハーセプチン（登録商標）の治療効果が弱まる可能性がある。ＡＡＶｈｕ６８．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ処置の目的は、ＡＡＶｈｕ６８．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの脳実質自体において局在化された長期発現を提供することによって発生を防止し、増殖を遅延させ、生存率を改善し、またはＨＥＲ２＋ ＢＣＢＭに関連する臨床的生活の質の大きさを増加させることである

【0231】

４つの異なる用量（１．００×１０^１０、３．００×１０^１０、１．００×１０^１１、及び３．００×１０^１１ＧＣ／動物）のＡＡＶｈｕ６８．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂを６～９週齢のＲＡＧ１^－／－マウスに頭蓋脳室内注射（ＩＣＶ）によって投与した。ＨＥＲ２＋ ヒト管癌腫細胞株に由来するＢＴ４７４．Ｍ１．ｆｆｌｕｃ細胞を少なくとも２１日後に移植した。マウスを毎日観察し、試験の終点で安楽死させた。腫瘍体積を測定するために剖検時に脳組織を採取した。ＨＥＲ２＋ 乳癌脳転移癌のＲＡＧ１^－／－異種移植モデルにおけるＡＡＶｈｕ６８．ＣＭＶ．ＰＩ．ｈｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ．ＳＶ４０の予防的ＩＣＶ投与は、この実験の全ての用量試験において有意に減少した腫瘍体積をもたら
したと結論付けられた。まとめると、これらの結果は、ＨＥＲ２＋ ＢＣＢＭを有する患者の生存率を改善するＡＡＶｈｕ６８．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの潜在的な治療有効性を実証した。

【0232】

Ｂ．この研究の目的は、ＨＥＲ２＋ ＢＣＢＭのＲＡＧ１^－／－異種移植モデルにおいて腫瘍体積を試験することによって腫瘍予防のためのＡＡＶｈｕ６８．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの最小必須用量（ＭＥＤ）を調査することであった。ベクターはＡＡＶｈｕ６８．ＣＭＶ．ＰＩ．ｈｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ．ＳＶ４０またはＡＡＶｈｕ６８．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂである。
ｄｄＰＣＲ力価：７．３８×１０^１３ＧＣ／ｍｌ
内毒素：２．０ＥＵ／ｍｌ未満
純度：１００％
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（処置対照なし）

【0233】

腫瘍予防をもたらすＡＡＶｈｕ６８．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの能力を、ＨＥＲ２＋ ＢＣＢＭのＲＡＧ１^－／－マウス異種移植モデルを使用して評価した。免疫不全マウスモデルは、マウス免疫系による拒絶反応なしでマウスにおけるヒト由来の同所性腫瘍の増殖を可能にする。さらに、ＲＡＧ１^－／－マウスは固有のＩｇＧを有しておらず、トラスツズマブをプロテインＡ ＥＬＩＳＡによって定量することが可能である。
表：研究設計

【表7】

【0234】

試験品及び陰性対照を無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈して適切な濃度にした。ベクターを左側脳室内にＩＣＶ投与した。

【0235】

ＣＳＦアクセスのための様々な経路を使用してクモ膜下腔内ＡＡＶ送達を実施することができる。ＩＣＶ経路を選択した、というのも、それはマウスにおいて（頚部の皮膚及び筋肉の切開を必要とする大槽経路と比較して）侵襲性が最も小さく外科手技を必要としないからである。以前に本発明者らの実験室にて及び他の者によって、マウスにおいても大型動物において脳脊髄液（ＩＣＶまたは大槽）中へのＡＡＶ９ベクターの単回注射が脳全体のニューロンを指向することが実証された［Ｄｉｒｒｅｎ ａｔ ａｌ．（２０１４）．Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｄ
ｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ ６ Ａｎｄ ９ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ
Ｃｅｌｌ Ｔｙｐｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｉｎ Ｔｈｅ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２５，１０９－１２０，Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ Ｆｏｒ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ａｎｄ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２２，１１２９－１１３５，Ｂｕｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｏｆ ＡＡＶ９ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｎ Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ Ａｎｄ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｏｆ Ｃａｔｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
２１，５２２－５２８，Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｏｒｒｅｃｔｓ ＣＮＳ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｉｎ Ａ Ｆｅｌｉｎｅ Ｍｏｄｅｌ Ｏｆ Ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ Ｉ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ：２２，２０１８－２０２７］。

【0236】

Ｃ．ＲＡＧ１^－／－マウスにおける腫瘍細胞移植
ＨＥＲ２＋ ＢＣＢＭのマウス異種移植モデルを作出するために、ホタルルシフェラーゼＢＴ４７４－Ｍ１．ｆｆｌｕｃを形質導入したヒトＨＥＲ２＋ 管細胞癌腫細胞株を採用した。注射手技のためにマウスをケタミン／キシラジンで麻酔した。頭皮及び首にある毛は剃毛した。時間放出１７－βエストラジオールペレット（１．７ｍｇ、９０日放出、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を首の背の皮下に埋植し、研究の間９０日ごとに再投与した。マウスを定位固定装置に固定した。露出した皮膚をポビドンヨウ素及び７０％エタノールで浄化した。頭蓋頂部に１ｃｍの前後切開を行った。ブレグマを同定した。空圧式ドリルをブレグマに配置し、その後、頭蓋に穿頭孔を空ける場所でブレグマの０．８ｍｍ後方及び２．２ｍｍ左側に動かした。２５μＬのハミルトンシリンジに５μＬの腫瘍細胞懸濁液（ＭａｔｒｉＧｅｌ（登録商標）：ＰＢＳが５０：５０の合計１００，０００細胞）を装填した。針をブレグマに持ってきて上に示した座標に動かした後、脳実質中に４．０ｍｍ突き刺した。その後、針の軌跡において針を１．０ｍｍ戻し上げて、腫瘍細胞を注入する穴を作り出した。針を位置一定のまま５分間置いた。次に、モニター化注入装置を使用して５μＬの細胞懸濁液を１０分掛けて注入した。注入終了後、針を位置一定のまま５分間置き、その後、ゆっくりと取り除いた。頭蓋にわたる切開部を４．０ｖｉｃｒｙｌで縫合し、無菌ＰＢＳ中１５ｍｇ／ｋｇのエンロフロキサシン（Ｂａｙｅｒ）と併せて無菌ＰＢＳ中０．３ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンをどちらもマウスの皮下に与えた。

【0237】

マウスを毎日監視した。瀕死になった場合はマウスをＣＯ２の過剰曝露とそれに続く頚部脱臼によって安楽死させた。剖検時に脳を単離し、腫瘍注射針軌跡に沿って冠状に切断した。

【0238】

腫瘍体積：３５日目の腫瘍直径の測定を、デジタル副尺ノギス（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して実施した。剖検時に脳を採取した。腫瘍注射針軌跡における鈍的切開を用いて腫瘍を周囲の脳組織から単離した。その後、腫瘍直径を三次元（ｘ、ｙ及びｚ）に測定し、腫瘍体積を楕円の体積４／３＊π＊ｘ／２＊ｙ／２＊ｚ／２として算出した。ベクター注射及び腫瘍埋植の対側半球である右脳半球をホルマリン中に貯蔵した。切開した腫瘍を用量コホートごとにまとめ合わせてホルマリン中に貯蔵した。ＧｒａｐｈＰａｄ
Ｐｒｉｓｍ７でマン・ホイットニー検定を用いて腫瘍体積比較を行った

【0239】

Ｄ．結果
腫瘍体積：ＩＴ ＡＡＶｈｕ６８．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ腫瘍予防が腫瘍成長を遅延
させるか否かを判定するために、本発明者らは、埋植後３５日目に腫瘍直径を測定した。最高用量のＡＡＶｈｕ６８．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ腫瘍予防を受けた群からの腫瘍体積中央値（０．４ｍｍ^３、ｎ＝１０）は、処置を受けなかったマウスの場合（２６．１ｍｍ^３、ｎ＝９）よりも有意に小さかった。より低い用量のＡＡＶｈｕ６８．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂを受けたマウスはどれも無処置に比べて有意に腫瘍がより小さかった。１．００×１０^１０ＧＣ／マウスを与えたマウスの腫瘍体積中央値は、３．００×１０^１０ＧＣ／マウスを与えたマウスの腫瘍体積中央値と統計学的に同じであると算出された（ｐ＝０．６０２９）。留意すべきこととして、群１中の２匹のマウス、群２中の１匹のマウス、群３中の３匹のマウス、及び群４中の３匹のマウスは切開時に肉眼的に明らかな腫瘍を有していなかった。

【表8】

【0240】

ＨＥＲ２＋ ＢＴ４７４．Ｍ１ヒト管癌腫細胞株を使用するＨＥＲ２＋ ＢＣＢＭのＲＡＧ１^－／－マウス異種移植モデルに予防的に投与する場合、全ての用量において、ＡＡＶｈｕ６８．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂのＩＴ投与は腫瘍埋植後Ｄ３５に有意により小さい腫瘍体積中央値につながった。この研究で測定されたＡＡＶｈｕ６８．ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ＭＥＤは１．００×１０^１０ＧＣ／マウスであった。

【0241】

実施例７－ＡＡＶｈｕ６８ベクターの生産収率及び純度
異なるカプシドを有する組換えアデノ随伴（ｒＡＡＶ）ベクターの生産収率及び／または純度を比較するために、ＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶ８ｔｒｉｐｌｅ、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９を含めて異なるカプシドを有する２つの異なるベクター組を生成及び作製した。

【0242】

手短に述べると、示されているカプシドと、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）、ホタルルシフェラーゼコード配列及びＳＶ４０ポリＡを含むベクターゲノム（ＣＭＶ．ｆｆＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ．ＳＶ４０）とを有する１つのベクター組を小規模で生産し、各ベクターの収率を評価した。結果は、ＡＡＶ９ベクターが最高収率を示した一方でＡＡＶｈｕ６８ベクターが２番手として続いたことを示している（図８Ａ）。ＡＡＶ８及びＡＡＶ８ｔｒｉｐｌｅベクターも４×１０^１３ＧＣを上回る収率を示した（図８Ａ）。

【0243】

示されているカプシドと、ＣＭＶプロモーター、イントロン、イムノアドヘシンコード配列（２０１ＩｇＩＡ）及びＳＶ４０ポリＡを含むベクターゲノム（ＣＭＶ．ＰＩ．２０１ＩｇＩＡ．ＳＶ４０）とを有する他のベクター組を従来の方法に従って巨大規模で生産し、各ベクターの収率及び純度を評価した。結果を図８Ｂ及び図９に示す。

【0244】

小規模作製の収率に類似してＡＡＶ９ベクターが約５．７×１０^１４ＧＣで最高収率を
示した一方でＡＡＶｈｕ６８ベクターは約３．８×１０^１４ＧＣで２番手として続いた（図８Ｂ）。ＡＡＶ８ベクターは約３．６×１０^１４ＧＣの収率を示し、ＡＡＶ８ｔｒｉｐｌｅは約１．８×１０^１４ＧＣの収率を示した（図８Ｂ）。試験した調製物の純度は同程度であり、約９７．４％～約９８．６％の範囲であった。

【0245】

実施例８－雄のＲＡＧ ＫＯマウスでのｒＡＡＶベクター。
ＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶ８ｔｒｉｐｌｅ、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９を含めて異なるカプシドを有し分泌性導入遺伝子産物２０１ＩｇＩＡを発現するｒＡＡＶベクターを使用して遺伝子発現を生体内で試験した。

【0246】

６～８週齢の雄のＲＡＧ ＫＯマウス（ｎ＝５／群）の腓腹筋にハミルトンシリンジを使用して３×１０^１１ＧＣ／マウスまたは３×１０^１０ＧＣ／マウスの試験ベクターを筋肉内に導入した。分泌性タンパク質を発現するベクターを投与したマウスから血清を顎下出血によって血清採取管内に毎週採取した。Ｇｒｅｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ８ ｉｎ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｍａｃａｑｕｅｓ Ｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１４ Ｎｏｖ １３；９（１ｌ）：ｅ１１２２６８．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１１２２６８．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１４に記載されているように血清における導入遺伝子発現レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。

【0247】

図１０Ａ及び図１０Ｂに示すように、マウスのＩＭ注射の後、ＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９ベクターが導入遺伝子を類似するレベルで発現した一方でＡＡＶ８ｔｒｉｐｌｅベクターはより良好に発現する。試験した最低用量（すなわち３×１０^１０ＧＣ／マウス）ではＡＡＶ８ｔｒｉｐｌｅとの発現差はかなりのものである。

【0248】

実施例９－雄のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるｒＡＡＶベクターの導入遺伝子発現。
ＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶ８ｔｒｉｐｌｅ、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９を含めて異なるカプシドを有しホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）を導入遺伝子として発現するｒＡＡＶベクターを使用して生体内での肝臓及び筋肉における発現を試験した。

【0249】

６～８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝５／群）の腓腹筋にハミルトンシリンジを使用して３×１０^１１ＧＣ／マウスの試験ベクターを筋肉内に導入した。以前に教示（上に引用したＧｒｅｉｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏｓ Ｏｎｅ ２０１４）されているとおりに全身生物発光イメージングによってｆｆＬｕｃ発現を毎週可視化した。

【0250】

図１１Ａ及び図１１Ｂに示されているように、ＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９ベクターが筋肉でも肝臓でも類似するレベルで発現された一方、ＡＡＶ８ｔｒｉｐｌｅベクターは肝臓では発現が減少し、筋肉では発現が増進している。

【0251】

実施例１０－雄及び雌のカニクイザルでのｒＡＡＶベクター。
ＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶ８ｔｒｉｐｌｅ、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９を含めて異なるカプシドを有し分泌性導入遺伝子２０１ＩｇＩＡを発現するｒＡＡＶベクターを使用してカニクイザルにおける導入遺伝子発現を試験した。

【0252】

ベクター生体内分布試験のために、試験開始時にＮＡｂ力価が注射ベクターに対して１：５に満たない雄及び雌のカニクイザルに、４つのベクターカプシド（ＡＡＶ８ｔｒｉｐｌｅ、ＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶ９またはＡＡＶ８）のうちの１つからの２０１ＩｇＩＡを発現するベクターを１０^１３ＧＣ／ｋｇ体重の用量で体重１ｋｇあたり１ｍｌの注射（１
０^１３ＧＣ／ｍｌのベクター濃度）として左右両方の脚の外側広筋に筋肉内投与した。試験前に、及び試験の間毎週、大腿静脈の静脈穿刺によって血液試料を採取した。以前に教示（上に引用したＧｒｅｉｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏｓ Ｏｎｅ ２０１４）されているとおりに血清中の導入遺伝子発現レベルをＥＬＩＳＡによって測定した

【0253】

図１２に示すように、ＩＭ注射後にＡＡＶｈｕ６８及びＡＡＶ８ｔｒｉｐｌｅはＡＡＶ９及びＡＡＶ８ベクターに比べてより良好に発現する。

【0254】

本明細書中で引用する全ての文書を、２０１８年１月５日に出願された米国仮特許出願第６２／６１４，００２号、２０１７年１１月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／５９１，００１号、及び２０１７年２月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／４６４，７４８号と同様に参照により本明細書に援用する。「１７－７９８６ Ｓｅｑ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けて本明細書と共に提出される配列表ならびにその中の配列及びテキストを参照により援用する。本発明を特定の実施形態に関して記載してきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく改変を行うことができることは認識されよう。そのような改変は別記の請求項の範囲に入ることが意図される。

【0255】

（配列表フリーテキスト）
以下の情報は数字識別子＜２２３＞の下でフリーテキストを含んでいる配列のために提供される。

【表9-1】

【表9-2】

【表9-3】

【表9-4】

【表9-5】

【表9-6】

【表9-7】

【表9-8】

【表9-9】

【表9-10】

【表9-11】

【図1-1】

【図1-2】

【図2A-1】

【図2A-2】

【図2B-1】

【図2B-2】

【図2C】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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